JP2005089301A - ウシの消化器疾患治療剤 - Google Patents

Abstract

【課題】 ウシの消化器疾患の治療剤及びその治療剤を用いるウシの消化器疾患の治療方法を提供するを提供する。
【解決手段】 インターフェロンを有効成分として含有する消化器疾患治療剤、及び、この消化器疾患治療剤を用いたウシの消化器疾患の治療方法を提供することにより解決する。
【選択図】 なし

Description

本発明は、ウシを対象とする動物医薬、とりわけ、ヒトインターフェロンα（以下、「ＨｕＩＦＮ−α」と略記することがある。）を有効成分とするウシの消化器疾患治療剤に関するものである。

米国特許第５９１０３０４号明細書 特開平６−３４０５４９号公報 特開２００２−２０１１４１号公報 『家畜診断』、第２７２号、第５〜１４行（１９８６年発行） 『臨床と微生物』、ジョセフ、エム、カミンズ アンドウイリアム、イー、スチュアートＩＩ（Ｊｅｓｅｐｈ Ｍ．Ｃｕｍｍｉｎｓ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｔ ＩＩ）、第１８巻、第５号、第６３１−６３５号（１９９１年）

ウシは、畜肉用或いは乳牛として広く飼育されており、長年に亙る品種改良により多様な品種が作出され、現在では驚くほど高価な品種も存在するようになった。ウシは、神経質で、トラックなどの交通手段による輸送、飼料や飼育環境の変化、病原性微生物の感染などにより、容易に下痢を主徴とする消化器疾患を発症する。なかでも、ロタウイルスやコロナウイルスをはじめとするウイルス性の消化器疾患は、これらのウイルスの病原性及び伝染力の強さから、その被害は甚大なものがあり、殊に、患畜が、子ウシの場合には、症状の発現が激しく、病気から回復しても、以後の成育に遅れが生じたり、死に至る場合も多々あるので、経済的な損失が大きな問題となっている。現在、ウシのウイルス疾患にはこれといった治療法が無く、消化器疾患の場合も、脱水症状を和らげ、体力を回復させるために補液による栄養療法を施したり、複合感染や二次感染をしないように抗生物質を投与したりといったような、専ら対症療法的な治療しか行なわれていないのが実状である（例えば、特許文献１参照）。これらのことから、ウシの消化器疾患を簡便且つ効果的に治療でき、飼主の経済的負担も少ない方法の開発が希求されている。

また、最近、ウシ、ネコ、ブタ、ラット、マウス、ニワトリなどの哺乳動物や鳥類の疾患に、比較的小量の同一種或いは異種由来のインターフェロンの経口投与が有効であることが報告されている（特許文献１、非特許文献２）。また、本出願人も、特許文献２において、小量のＨｕＩＦＮ−αを有効成分とするネコの呼吸器疾患の治療剤及び治療方法を開示し、特許文献３においては、ＨｕＩＦＮ−αにおけるサブタイプα２とサブタイプα８とを組み合わせる方法が、ＨｕＩＦＮ−αの作用効果の発現の点で優れていることを開示した。しかしながら、これらの文献には、インターフェロンの経口投与により、ウシのロタウイルスやコロナウイルスなどの感染に起因する下痢症状が改善できることや、特定のサブタイプで構成されたＨｕＩＦＮ−α製剤が、下痢を主徴とするこれらのウイルスに感染したウシの消化器疾患治療剤としてに著効を示すことは、なんら記載されていない。

本発明は、経口や経鼻などの注射以外の方法により投与しても著効を示し、治療担当者の労力・負担や飼主の経済的負担が少なくて済むウシの消化器疾患治療剤を提供することを第一の課題とし、その治療剤を用いるウシの消化器疾患の治療方法を提供することを第二の課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決する目的で、ヒトインターフェロン（以下、「ＨｕＩＦＮ」と略記することがある。）によるウシの消化器疾患の治療方法について長年に渡り研究を進めてきた。その結果、ＨｕＩＦＮ−α、とりわけ、そのサブタイプα８を総ＨｕＩＦＮ−α質量中に１０質量％（以下、本明細書では特に断らない限り、「質量％」を「％」と表記する。）以上含有する製剤が、子ウシを含むウシの下痢を主徴とする消化器疾患に著効を示すことを見出し、ウシの消化器疾患治療剤を確立すると共に、それを用いたウシの消化器疾患の治療方法を確立することにより、本発明を完成するに至った。

本発明によるＨｕＩＦＮを有効成分とするウシの消化器疾患治療剤及びその治療剤を用いるウシの消化器疾患の治療方法は、ウシのウイルス性の消化器疾患に伴なう下痢を主徴とする臨床症状の改善、或いは完治に著効を発揮する。

本発明でいうＨｕＩＦＮは、ウシのウイルス性の消化器疾患に対する治療効果が高く、通常、ウシの体重ｋｇ当たり約０．００５乃至５，０００国際単位と極めて小用量で事足りる。

ＨｕＩＦＮは、経口投与しても、非経口投与しても、ウシの消化器疾患の治療に著効を発揮する。

本発明でいうウシとは、いわゆるウシ科に属する動物であって、本発明の治療剤を予防的に使用する場合には、ウシの消化器疾患の主因の一つであるロタウイルス、コロナウイルス、ウイルス性下痢症ウイルスなどに感染して消化器疾患を発症するウシ全般が対象となり、治療を目的とする場合には、これらのウイルスに感染しているか、さらに、これら以外のウイルス、マイコプラズマ、細菌、寄生虫などに複合乃至二次感染して、下痢を主徴とする症状を呈する動物を意味し、食欲減退、活力減退、被毛の失沢や立毛、脱水症状などの一般臨床症状を示す動物もこれに含まれる。

本発明によるウシの消化器疾患治療剤は、ヒト由来の細胞が産生するＨｕＩＦＮか、ヒト由来の細胞から採取したＨｕＩＦＮ関連遺伝子を導入した微生物若しくは動物細胞が産生するＨｕＩＦＮを有効成分とするものである。今日、ＨｕＩＦＮは、その抗原性の違いに基づき、主としてＨｕＩＦＮ−α、ＨｕＩＦＮ−β、ＨｕＩＦＮ−γなる三種類の型に分類されているが、これらは、何れもウシの消化器疾患に対する治療効果においてやや違いはあるものの、この発明で使用することができる。その際、ただ一種の型のＨｕＩＦＮを使用してもよいし、型の違う二種以上のＨｕＩＦＮを組合せて使用してもよい。また、ＨｕＩＦＮ−αは複数のサブタイプの存在が知られており、これらの１種又は２種以上を組み合わせて使用することも自由である。何れのＨｕＩＦＮの場合でも、比活性ができるだけ高いものを使用するのが望ましく、経口投与には、比活性が約１０^５国際単位／ｍｇ蛋白質以上の精製品が、また、非経口投与には、約１０^７国際単位／ｍｇ蛋白質以上の精製品が望ましい。

本発明者等が試験したところ、これらＨｕＩＦＮのうち、ＨｕＩＦＮ−α、とりわけ、ＢＡＬＬ−１細胞やナマルバ細胞などのヒトリンパ芽球様細胞株が産生する、いわゆる、「天然型ＨｕＩＦＮ−α」はウシの消化器疾患に対する治療効果が高く、副作用も僅少という特徴がある。ことに、効果の点で、ＨｕＩＦＮ−αのサブタイプα８（以下、「サブタイプα８」という）をＨｕＩＦＮ−αの総質量の１０％以上含有する製剤が望ましく、サブタイプα８をＨｕＩＦＮ−αの総質量の１０乃至８０％含有し、且つ、ＨｕＩＦＮ−αのサブタイプα２（以下、「サブタイプα２」という）をＨｕＩＦＮ−αの総質量の２０乃至９０％以下含有する製剤が強い治療効果を示すことから、さら望ましく、サブタイプα８をＨｕＩＦＮ−αの総質量の２０乃至４０％含有し、且つ、サブタイプα２をＨｕＩＦＮ−αの総質量の６０乃至８０％含有する製剤が著効を示すことから、特に望ましい。ＢＡＬＬ−１細胞由来のＨｕＩＦＮ−αは、サブタイプα２をＨｕＩＦＮ−αの総質量の約７５％と、サブタイプα８をＨｕＩＦＮ−αの総質量の約２５％とを含有し、そのバランスは極めて良く、この発明に使用して最も優れた効果をもたらした。また、ＨｕＩＦＮ−αとＨｕＩＦＮ−βを組み合わせて使用すると、ＨｕＩＦＮ−αの持つ治療効果が相乗的に増強されることが確認された。

本発明によるウシの消化器疾患治療剤は、ＨｕＩＦＮ単独の形態はもとより、ＨｕＩＦＮとそれ以外の生理的及び製剤学的に許容される、例えば、担体、賦形剤、希釈剤、免疫助成剤、安定剤、さらには、必要に応じて、解熱剤、抗炎症剤、抗菌剤、消化剤、栄養剤、餌料などとの組成物としての形態を包含する。さらに、この発明の治療剤は、投薬単位形態の薬剤をも包含し、その投薬単位形態の薬剤とは、この発明の有効成分たるＨｕＩＦＮの、例えば、一日当たりの用量又はその整数倍（４倍まで）若しくはその約数（１／４まで）に相当する量を含有し、投与に適する物理的に分離可能な剤型にある薬剤を意味する。また、型及び／又はＨｕＩＦＮ−αの異なるサブタイプの２種以上を組み合わせて使用する場合には、個々の型のＨｕＩＦＮ及び／又はＨｕＩＦＮ−αのサブタイプの単剤を組み合わせて使用すること、２種以上の型のＨｕＩＦＮを混合して１剤として使用すること、或いは、これらの製剤を組み合わせて使用することも随意である。このような投薬形態の薬剤としては、散剤、ゲル状経口用剤、顆粒剤、液剤、錠剤、カプセル剤、舌下剤、注射剤、フィルム状経口用剤などが挙げられる。また、散剤や顆粒剤などを用時に、その投与経路に応じて、蒸留水、生理食塩水、ミルク、代用ミルクなどに溶解してして使用することも随意である。

本発明によるウシの消化器疾患治療剤の用量、用法について説明すると、本発明の治療剤は、経口的に投与しても非経口的に投与しても、所期の予防及び／又は治療効果が得られる。具体的には、ウシの種類、原因ウイルスの種類、症状、用量、用法、使用するＨｕＩＦＮの型などに依っても変わるけれども、患畜の症状や様子を観察しながら、通常、ウシ体重ｋｇ当たり約０．００５乃至５，０００国際単位／回、望ましくは、約０．０５乃至１００国際単位／回、より望ましくは、約０．１乃至５０国際単位／回のＨｕＩＦＮを１日１乃至３回若しくは１週間に１乃至５回、約１日乃至６カ月間投与すればよい。

本発明の治療剤を経口或いは経鼻投与するには、治療剤を、例えば、散剤、トローチ剤、顆粒剤、液剤、錠剤、舌下剤、飼料などの経口投与可能な形態に調製し、そのままで、或いは、必要に応じて、餌、ミルク、代用ミルクなどに混合・溶解したり、経口投与器、スプレー、胃ゾンデなどの適宜投与補助器具を使いながら、常法にしたがって口腔内、鼻腔内、食道内若しくは胃内に挿入すればよい。また、非経口投与するには、この発明による注射剤をウシの皮内、皮下、筋肉内、血管（静脈又は動脈をいう）内若しくは腹腔内に注射すればよい。本発明者等が試験したところ、用量が上記の範囲を下回ると所期の治療効果が得られ難くなり、逆に、上回ると、抗体産生や副作用が顕著になったり、治療効果に比べて飼主の経済的負担が大きくなることがあり、上記範囲を以って最良とした。

治療効果と投与のし易さという観点から個々の投与経路を比較すると、経口投与は一般の飼育場やウシの集積場でも容易に実施できるという利点がある。所定量のＨｕＩＦＮを正確に投与する場合には、血管内、皮内、皮下若しくは筋肉内に投与することも随意である。

本発明の治療剤は、ウシの消化器疾患の治療、予防効果に加えて、ウシの呼吸器疾患の予防や治療、輸送時の体重の低下の抑制、子ウシの肥育促進などの作用効果を有している。また、ウマ、ブタ、ネコ、イヌ、ネズミ、ニワトリをはじめとする哺乳類や鳥類などの動物に対しても、ウシの場合と同様の作用効果を有している。したがって、本発明の治療剤は、ウシの消化器疾患の治療剤としてのみでなく、これら動物全般の各種疾患の予防剤や治療剤、輸送時の体重低下抑制剤、肥育促進剤などとしても利用することができる。この場合の、用法、用量も、ウシの消化器疾患の治療の場合に準じればよい。

なお、本明細書を通じて、ＨｕＩＦＮの活性は、ＨｕＩＦＮがシンドビスウイルスによるＦＬ細胞の細胞変性を抑制する度合をマイクロタイター法により測定し、その測定値を世界保健機関によるＨｕＩＦＮの国際標準品「Ｇａ２３−９０１−５３２」を標準として決定される「国際単位」に換算して表示している。

＜実験１＞
＜ＨｕＩＦＮ−α標品及びＨｕＩＦＮ−α製剤の調製＞
後述の実施例１に記載の方法に基づき、ＢＡＬＬ−１細胞由来のＨｕＩＦＮ−α（以下、「ＢＡＬＬ−１インターフェロン」と略記する場合がある）の精製品（比活性２×１０^８国際単位／ｍｇ蛋白質）を、また、実施例２の方法に基づき、組換え型サブタイプα８（比活性２×１０^８国際単位／ｍｇ蛋白質）及び組換え型サブタイプα２（比活性７×１０^７国際単位／ｍｇ蛋白質）の精製標品を、それぞれ調製した。また、これらとは別に、常法により、人抹梢血から分離した白血球にセンダイウイルスを作用させて誘発させたＨｕＩＦＮ−α（以下、「白血球インターフェロン」と略記する場合がある。）をケー・カンテル（Ｋ．Ｃａｎｔｅｌｌ）等、『ザ ジャーナル オブ ジェネラル バイロロジー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）』、第３９巻、第５４１〜５４３頁（１９７８年）に記載された方法に準じて精製し、比活性約２×１０^６国際単位／ｍｇ蛋白質の部分精製白血球インターフェロンを得た。次いで、この部分精製ＨｕＩＦＮを、後述の実施例１と同様に、モノクローナル抗ＨｕＩＦＮ−α抗体を用いる抗体クロマトグラフィーによりさらに精製した後、ヒトアルブミン約０．１ｍｇ／ｍｌを含有する燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたゲル濾過クロマトグラフィーを適用することにより、精製白血球インターフェロン（比活性約２×１０^８国際単位／ｍｇ蛋白質）溶液を得た。これら２種類のＨｕＩＦＮと、組換え型サブタイプα８及び組換え型サブタイプα２を使用して、後述の実施例５の方法に準じて、無水結晶マルトース（株式会社林原商事販売、商標『ファイントース』）を賦形剤として使用し、各々２００国際単位／ｇのＨｕＩＦＮ−αを含有する粉末状の製剤を調製した。なお、組換え型サブタイプα８及び組換え型サブタイプα２に付いては、サブタイプα８とサブタイプα２を質量比で、１０：０、９：１、８：２、４：６、２：８、１：９、０：１０含有する７種類の粉末状の製剤を調製した。

＜実験２＞
ロタウイルスに感染し、且つ、下痢症状を呈するウシ１００頭に、実験１で調製した、ＨｕＩＦＮ−α製剤を、消化器疾患治療剤として一日１回、経口投与し、その経過を観察することにより、この発明による治療剤の治療効果と副作用を評価した。

すなわち、初診時に下痢の症状を呈し、且つ、常法のウイルス検査の結果、糞便中にロタウイルス抗原が検出された１乃至６歳と推定される雄ウシ５０頭と雌ウシ５０頭を対象とし、無作為に選択した雄５頭、雌５頭を１群として、上記ＨｕＩＦＮ−α製剤の何れかを、経口的に、約０．５国際単位／ｋｇ体重／回の用量で、実験１で調製した製剤を毎日１回、投与開始の日（１日目）から５日間に亙って投与した。投与開始の日から１２日間の経過を注意深く観察し、用量と共に、下痢の症状、糞便の色調の他に、活力、食欲、被毛、脱水の６項目の一般臨床所見を記録した。なお、対照として、無水結晶マルトース０．１ｇを１日１回ウシに経口投与した。また、ウシの飼育は、抗菌剤無添加の飼料を使用し、飲水は自由摂取とした。

実験は主として獣医師が行ない、患畜の様子や症状、副作用などを観察しながら、各個体の体重に基づきＨｕＩＦＮ製剤の用量を調節した。そして、投与開始の日を１日目とし、投与開始の日から１２日目の観察結果に基づき、治療剤の有効性を判定した。すなわち、前記一般臨床所見６項目につき、表１に示す基準に基づき、スコア化して、各ウシの総合臨床スコアを求め、各投与群の平均総合臨床スコアを求めた。投与開始の日の平均総合臨床スコアから投与開始の日から１２日目の平均総合臨床スコアを減じた数値を投与開始の日の平均総合臨床スコアで除したものを１００倍して改善率（％）を求めた。実験結果は、この改善率が８５〜１００％の症例を「著効」、改善率が７０〜８５％未満の症例を「有効」、改善率が５０〜７０％未満の症例を「やや有効」、改善率が５０％未満及び投与開始３日目に下痢の改善が認められず、悪化が予見され、他の治療剤を併用した症例を「無効」とする４段階で評価し、「著効」と「有効」と判定された場合を、治療効果有りと評価した。また、各ＨｕＩＦＮ製剤投与群において、著効及び有効と判定されたウシの頭数をその試験群で使用したウシの総頭数で除し、１００倍して、奏功率（％）を求めた。さらに、総合臨床スコアのうち、糞便に関するスコアのみを、別途集計して、各群の平均便性状スコアを求めて、便性状の改善の指標とした。なお、本実験における総合臨床スコアの算出は、日本国農林水産省への動物用医薬品製造承認申請における、ウシの大腸菌性下痢に対する抗菌剤の臨床試験実施基準に準じて行った。その結果を表２に示した。

表２から明らかなように、何れのＨｕＩＦＮ製剤を投与した場合にも、対照群に比して有意の臨床スコアの改善が認められ、ＨｕＩＦＮの経口投与により、ロタウイルスに感染したウシにおける消化器疾患に伴う下痢などの臨床症状が改善されることが確認された。この改善効果は、ＢＡＬＬ−１インターフェロン（サブタイプα８を総ＨｕＩＦＮ−α質量中に約２５％とサブタイプα２を総ＨｕＩＦＮ−α質量中に約７５％含有）を投与した場合に最も顕著であり、その奏功率は８０％に達した。白血球インターフェロン或いは組換え型サブタイプα２のみの投与群では、奏功率が４０％と、低くい結果となったのに対して、ＢＡＬＬ−１インターフェロン、及び、組換え型サブタイプα８を総ＨｕＩＦＮ−α質量中の１０％或いはそれ以上含有するＨｕＩＦＮ製剤（サブタイプα８：サブタイプα２の比が１：９〜１０：０）を投与した群では、何れも、白血球インターフェロン或いは組換え型サブタイプα２のみの投与した群よりも高い奏功率が得られた。なかでも、ＢＡＬＬ−１インターフェロン、及び、組換え型サブタイプα８を総ＨｕＩＦＮ−α質量中のＨｕＩＦＮ−α１０乃至８０％含有し、且つ、組換え型サブタイプα２を総ＨｕＩＦＮ−α質量中の２０乃至９０％含有するＨｕＩＦＮ製剤を投与した群（サブタイプα８：サブタイプα２の比が１：９〜８：２）で、高い奏功率が得られ、ＢＡＬＬ−１インターフェロン、及び、組換え型サブタイプα８を総ＨｕＩＦＮ−α質量中の２０乃至４０％含有し、且つ、組換え型サブタイプα２を総ＨｕＩＦＮ−α質量中の６０乃至８０％含有するＨｕＩＦＮ製剤を投与した群（サブタイプα８：サブタイプα２の比が１：９〜４：６）で、特に高い奏功率が得られた。なお、便性状スコアのデータは、具体的には示さないが、便性状スコアの改善も、奏功率と同一の結果を示した。また、本発明のＨｕＩＦＮ製剤は、コロナウイルスに感染したウシにおける消化器疾患に対しても、ロタウイルスに感染したウシの消化器疾患の場合と同等の治療効果を示すことが確認された。

本試験の期間中、ＨｕＩＦＮ製剤の投与に起因する、特段の副作用は全く認められず、この発明による治療剤がウシの消化器疾患の治療に極めて効果的、且つ、安全であることを裏付けていた。さらに、これらのウシの一部について、投与開始の日から３０日目と６０日目に、血液検査を実施したところ、ＨｕＩＦＮ−αに起因すると思われる抗体産生は全く検出されなかった。このことは、この発明による治療剤が、ウシの消化器疾患を治療する目的で、同一のウシに反復投与しても安全なことを示唆している。

＜実験３＞
上記知見に基づき、ロタウイルスの感染の影響を最も強く受け、畜産業において経済性の点で最も問題とされている、生後間もない子ウシに対する、本発明の治療剤の治療効果を確認するための実験を行った。すなわち、ロタウイルスの感染が確認され、且つ、下痢の症状を呈している生後６ヶ月以内の子ウシ１４０頭（雄雌各７０頭）に対して、実験２と同一のプロトコールで、ＨｕＩＦＮ製剤（２００国際単位／ｇ）を投与し、実験２と同一の効果の評価方法により、その効果と副作用を評価した。なお、本実験では、実験２で最も高い奏功率を示したＢＡＬＬ−１インターフェロン製剤を使用し、投与量は、０．５国際単位／ｋｇ体重と２０国際単位／ｋｇ体重とした。対照群として無水結晶マルトース０．１ｇを１日１回ウシに経口投与した。ＢＡＬＬ−１インターフェロン製剤投与群は各６０頭の子ウシ（雄雌各３０頭）を使用し、対照群は２０頭の子ウシ（雄雌各１０頭）を使用した。その平均総合臨床スコアの推移を表３に、平均便性状スコアの推移を表４に、治療効果判定の結果を表５に示した。

表３から明らかなように、平均総合臨床スコアは、対照群では、実験期間中変動はあったものの、改善は認められなかった。これに対して、ＢＡＬＬ−１インターフェロンの０．５国際単位／ｋｇ体重投与群では投与開始の日から３日目から、対照群に比して有意の改善を示し、投与開始の日から１２日目でも総合臨床スコアの悪化は認められなかった。また、ＢＡＬＬ−１インターフェロンの２０国際単位／ｋｇ体重投与群では投与開始の日から４日目から、対照群と比して有意の改善を示し、投与を開始の日から１２日目でも総合臨床スコアの悪化は認められなかった。

表４から明らかなように、平均便性状スコアは、対照群では、実験期間中変動はあったものの、改善は認められなかった。これに対して、ＢＡＬＬ−１インターフェロンの０．５国際単位／ｋｇ体重投与群及び２０国際単位／ｋｇ体重投与群の何れにおいても、投与開始の日から２日目から、対照群と比して有意の改善を示し、投与開始の日から１２日目でも悪化は認められなかった。

表５から明らかなように、ＢＡＬＬ−１インターフェロンの０．５国際単位／ｋｇ体重投与群では奏功率が６３％となり、２０国際単位／ｋｇ体重投与群では奏功率が５７％となった。しかも、投与期間中、特段の副作用は全く認められず、この発明による治療剤がウシの消化器疾患の治療に極めて効果的、且つ、安全であることを裏付けていた。また、一部の患畜について、実験２と同様に、投与開始の日から３０日目及び６０日目に血液検査を実施したところ、ＢＡＬＬ−１インターフェロンに起因すると思われる抗体産生は全く検出されなかった。

これらの実験から、本発明のＨｕＩＦＮ製剤は、経口投与により、投与開始から２日目で、すでに下痢の症状を改善することのできる、優れた、下痢症状の改善剤であることが確認され、また、投与開始の日から１２日目でも、臨床症状の増悪は認められないことから、ロタウイルスやコロナウイルスなどの感染したウシの消化器疾患治療剤として、優れた治療効果を有することが確認された。

＜急性毒性試験＞
０．０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を含む生理食塩水に、ウシ血清アルブミンを０．１％となるように溶解した溶液、この溶液に、実施例１で調製したＢＡＬＬ−１細胞由来の部分精製ＨｕＩＦＮ−α、精製ＨｕＩＦＮ−α、実験１で調製したヒト白血球由来の部分精製ＨｕＩＦＮ−α、精製ＨｕＩＦＮ−α、又は、後述する実施例２で調製した精製したサブタイプα２或いはサブタイプα８の何れか１種を、１×１０^６国際単位／ｍｌになるよう溶解した溶液を調製した。かくして得られる７種類の溶液を生後２乃至３年と推定される健常なウシ５匹／群からなる７群に対して、体重ｋｇ当たり、この発明における最大投与量の２万倍に当たる１×１０^６国際単位のＨｕＩＦＮに相当する量の生理食塩水を皮下若しくは経口投与し、投与後の経過を観察した。さらに、対照群には、ＨｕＩＦＮを溶解しなかったこと以外、前記と同様に調製した同量の生理食塩水を同じ経路で投与した。

その結果、いずれのＨｕＩＦＮでを投与した試験群、燐酸緩衝液を含む生理食塩水に、ウシ血清アルブミンを０．１％となるように溶解した溶液を投与した群、及び、生理食塩水を投与した群において、副作用と認められる臨床症状は認められなかった。また、これらのうしは、投与後においても死亡例や、一般状態、体重、摂餌量にも特段の変化は認められなかった。この急性毒性試験、及び、上記実験２、実験３の結果は、ＨｕＩＦＮが、ウシに投与して、極めて毒性の低いことを示唆している。

以下、実施例に基づき、本発明を具体的に説明する。但し、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。

特公昭５６−５４１５８号公報に記載された方法に準じ、ハムスター体内で増殖させたＢＡＬＬ−１細胞に培養培地中でセンダイウイルスを作用させてＨｕＩＦＮ−αを誘発させた。この培養培地を遠心分離して得られた上清を濃縮し、濃縮物にフェニルセファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーを適用することにより、比活性約１０^６国際単位／ｍｇ蛋白質の部分精製ＨｕＩＦＮ−αを得た。次に、この部分精製ＨｕＩＦＮ−αを、常法により、モノクローナル抗ＨｕＩＦＮ−α抗体を水不溶性担体に結合させたセルテック社製『ＮＫ−２セファロース』を用いるアフィニティークロマトグラフィーによりさらに精製した後、ウシ血清アルブミン約０．１ｍｇ／ｍｌを含有する燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたゲル濾過クロマトグラフィーを適用することにより、比活性約２×１０^８国際単位／ｍｇの精製ＨｕＩＦＮ−αを含有するＢＡＬＬ−１インターフェロン溶液を得た。本品を、高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、ＨｕＩＦＮ−αの総質量に対して、サブタイプα８を約２５％とサブタイプα２を約７５％含有していた。

このようにして調製したＢＡＬＬ−１由来の精製ＨｕＩＦＮ−αを約５ｍｇ蛋白質／ｍｌにまで膜濃縮し、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンと０．０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を含有する生理食塩水にＨｕＩＦＮ−α濃度が１５０国際単位／ｍｌになるよう希釈し、膜濾過して滅菌した後、バイアルに１ｍｌずつ無菌的に充填し、凍結乾燥した。

本品は、有効成分としてＢＡＬＬ−１細胞由来の精製ＨｕＩＦＮ−αを含有し、賦形剤たる血清アルブミンはウシ由来のものを使用しているので、ウシの消化器疾患治療用注射剤として有用である。

＜組換え型インターフェロンα２及びα８＞
特許文献３の実験１−１（ａ）及び実験１−１（ｂ）の方法に準じて、組換え型サブタイプα８（比活性、約３×１０^８国際単位／ｍｇ蛋白質）及び組換え型サブタイプα２（比活性、約８×１０^７国際単位／ｍｇ蛋白質）の精製標品を調製した。

このようにして調製したサブタイプα８標品とサブタイプα２標品を各々約５ｍｇ蛋白質／ｍｌにまで膜濃縮後、１質量部のサブタイプα８と４質量部のサブタイプα２を混合し、１％（ｗ／ｖ）局方精製ゼラチンと０．０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を含有する生理食塩水にＨｕＩＦＮ−α濃度が２００国際単位／ｍｌになるよう希釈し、膜濾過して滅菌した後、バイアルに１ｍｌずつ無菌的に充填し、凍結乾燥した。

有効成分として組換え型の精製サブタイプα８とサブタイプα２を含有せしめた本品は、治療効果及び副作用において実施例１の注射剤よりやや劣るものの、ウシの消化器疾患治療用注射剤として有用である。

実施例１と同様にしてＢＡＬＬ−１細胞にセンダイウイルスを作用させて調製した精製ＢＡＬＬ−１インターフェロンを、３％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンと０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を含有する生理食塩水にＨｕＩＦＮ−α濃度が２，０００国際単位／ｍｌとなるように希釈し、膜濾過して滅菌した後、バイアルに１ｍｌずつ充填し、凍結乾燥した。

本品は、実施例１の注射剤と同様、有効成分としてＢＡＬＬ−１細胞由来の精製ＨｕＩＦＮ−αを含有し、賦形剤たる血清アルブミンはウシ由来のものを使用しているので、ウシの消化器疾患治療用注射剤として有用である。

蒸留水にウシ血清アルブミンを１％（ｗ／ｖ）溶解し、溶液に実施例１の方法で調製したＢＡＬＬ−１細胞由来の部分精製ＨｕＩＦＮ−αを含有する溶液を加え、１ｇ当たりＨｕＩＦＮ−αを３００国際単位含有するＨｕＩＦＮ−α溶液を得た。この溶液３２．０質量部に０．５質量部の『ツイーン８０』を１５．０質量部のエタノールに溶解して混合し、さらに、その混合物に０．５質量部のトリエタノールアミンを１５．０質量部のグリセリンに溶解して混合した後、小量のトリエタノールアミンを加えて、ｍｌ当たりＨｕＩＦＮ−αを約１００国際単位含む、ほぼ中性のゲル状製剤を得た。

有効成分としてＢＡＬＬ−１細胞由来のＨｕＩＦＮ−αを含有する本品は、適度の口腔内滞留時間を有し、患畜に飲ませ易い消化器疾患治療用ゲル状経口用剤である。

無水結晶マルトース（株式会社林原商事販売、商標『ファイントース』）１００質量部に実施例１の方法で調製したＢＡＬＬ−１細胞由来の精製ＨｕＩＦＮ−α（約１０^８国際単位／ｍｌ）２質量部を均一に噴霧し、真空乾燥し、粉砕した後、篩にかけて粒度１００乃至５００ミクロンの粉状物を得た。粉状物にさらに適当量の『ファイントース』を均一に混合し、１ｇ当たりＨｕＩＦＮ−αを約２００国際単位含む散剤を得た。

本品は適度の口腔内滞留時間と優れた保存安定性を有し、ウシの消化器疾患治療剤として有用である。本品は適度の甘味を有し、ウシの口腔内に投与しても刺激が少なく、患畜に飲ませ易い散剤である。

無水結晶マルトース（株式会社林原商事販売、商標『ファイントース』）１００質量部に実施例１の方法で調製したＢＡＬＬ−１細胞由来の部分精製ＨｕＩＦＮを含有する水溶液（約１，０００国際単位／ｍｌ）１５質量部を均一に混ぜた後、打錠機にかけて顆粒剤を得た。

本品は、１ｇ当たりＨｕＩＦＮ−αを約１２５国際単位含み、優れた保存安定性を有し、ウシの消化器疾患治療用散剤として有用である。また、本品は適度の甘味を有し、ウシの口腔内に投与しても刺激が少なく、患畜に飲ませ易い顆粒剤である。

無水結晶マルトース（株式会社林原商事販売、商標『ファイントース』）１００質量部に市販のＨｕＩＦＮ−β製剤（持田製薬株式会社販売、商品名「ＩＦＮβ注射用６００万Ｉ．Ｕ．」）を蒸留水１ｍｌに溶解したもの２質量部を均一に噴霧し、真空乾燥し、粉砕した後、篩にかけて粒度１００乃至５００ミクロンの粉状物を得た。粉状物にさらに適当量の『ファイントース』を均一に混合し、１ｇ当たりＨｕＩＦＮ−βを約５０国際単位含む散剤を得た。

本品を使用して、実験３の方法に準じてロタウイルスに感染し、下痢症状を呈する１乃至６歳と推定されるウシ３０頭を使用して、２０国際（Ｉ．Ｕ．）単位／ｋｇ体重を１４日間投与したところ、奏功率は４３％となり、本品は、無投与群（２０頭、奏功率３０％）に比して、有意に高いの奏功率を示したことから、下痢の改善を含む消化器疾患に対する治療効果があると判断された。

また、実験３の方法に準じてロタウイルスに感染し、下痢症状を呈する１乃至６歳と推定されるウシ３０頭を使用して、本品を１０国際（Ｉ．Ｕ．）単位／ｋｇ体重と実験１で調製したサブタイプα８の製剤を１０国際単位／ｋｇ体重、１０日間投与したところ、奏功率は５２％となり、本品及びＢＡＬＬ−１インターフェロンの併用は、３０頭のウシにサブタイプα８の製剤を２０国際単位／ｋｇ体重投与した群（奏功率４５％）、及び、無投与群（２０頭、奏功率３０％）に比して、有意に高い奏功率を示したことから、下痢の改善を含む消化器疾患に対する治療効果があると判断された。

本品は適度の口腔内滞留時間と優れた保存安定性を有している。しかも、上記の試験結果は、本品がウシの消化器疾患治療剤として有用であること、及び、本品は、ＨｕＩＦＮ−α製剤と併用すると、ＨｕＩＦＮ−α製剤の治療効果を増強させることができることが判明した。また、本品は適度の甘味を有し、ウシの口腔内に投与しても刺激が少なく、患畜に飲ませ易い散剤である。

本発明の治療剤が有効成分として含有するＨｕＩＦＮは、患畜に小用量でも著効を発揮するので、小用量投与の場合は、飼主の経済的負担を大幅に低減する。同じ理由により、本発明の治療剤によるときには、インターフェロンを必ずしも患畜の血管内に投与する必要が無くなり、経口投与や、皮内、皮下、筋肉内などの血管以外の経路より非経口的に投与することによっても、所期の効果が得られる。これにより、神経質で警戒心が強いウシに所定量のＨｕＩＦＮを確実、且つ、容易に投与できることとなり、獣医師等の治療担当者の労力・負担も大幅に低減する。また、本発明の治療剤は子ウシにおいても顕著な治療効果を発揮することから、子ウシの下痢による経済的損失を大きく軽減することができる。このような優れた効果を有する本発明は、畜産分野に貢献することとなり、その産業的意義は極めて大きい。

Claims (17)

1. 有効成分としてインターフェロンを含んでなるウシの消化器疾患治療剤。
2. インターフェロンがヒトインターフェロンαである請求項１記載のウシの消化器疾患治療剤。
3. インターフェロンがヒトインターフェロンα及びヒトインターフェロンβである請求項１記載のウシの消化器疾患治療剤。
4. ヒトインターフェロンαにおけるサブタイプα８の含量が総インターフェロンα質量中の１０質量％を越える請求項２又は３に記載のウシの消化器疾患治療剤。
5. ヒトインターフェロンαにおけるサブタイプα２の含量が総インターフェロンα質量中の８０質量％を以下である請求項２乃至４の何れかに記載の消化器疾患治療剤。
6. インターフェロンが、治療剤１ｇ当たり約０．００５乃至５，０００国際単位含有せしめられている請求項１乃至５の何れかに記載のウシの消化器疾患治療剤。
7. 投薬形態が経口投与形態、経鼻投与形態または非経口投与形態から選ばれる何れかである請求項１乃至６の何れかに記載のウシの消化器疾患治療剤。
8. 消化器疾患がウイルス性の下痢であることを特徴とする請求項１乃至７の何れかに記載の消化器疾患治療剤。
9. ウイルスがロタウイルス及び／又はコロナウイルスであることを特徴とする請求項８に記載のウシの消化器疾患治療剤。
10. インターフェロンをウシ体重１ｋｇ当たり約０．００５乃至５，０００国際単位／回投与することを特徴とするウイルスに感染したウシの消化器疾患の治療方法。
11. インターフェロンがヒトインターフェロンαである請求項１０記載のウシの消化器疾患の治療方法。
12. インターフェロンがヒトインターフェロンα及びヒトインターフェロンβである請求項１０記載のウシの消化器疾患の治療方法。
13. インターフェロンαにおけるサブタイプα８の含量が総インターフェロンα質量中の１０質量％を越える請求項１１又は１２に記載のウシの消化器疾患の治療方法。
14. インターフェロンαにおけるサブタイプα２の含量が総インターフェロンα質量中の８０質量％を以下である請求項１１乃至１３に記載の消化器疾の患治療方法。
15. 投薬形態が経口投与形態、経鼻投与形態または非経口投与形態から選ばれる何れかである請求項１１乃至１４の何れかに記載のウシの消化器疾患の治療方法。
16. ウシの消化器疾患がウイルス性の下痢であることを特徴とする請求項１１乃至１５記載の消化器疾患の治療方法。
17. ウイルスがロタウイルス及び／又はコロナウイルスであることを特徴とする請求項１６記載のウシの消化器疾患治療方法。