JP2005075790A

JP2005075790A - Apoptosis-inducing agent

Info

Publication number: JP2005075790A
Application number: JP2003309580A
Authority: JP
Inventors: Norioki Ko; 徳興侯; Fumio Hashimoto; 文雄橋本; Makoto Fujii; 信藤井; Yusuke Sakata; 祐介坂田
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-09-02
Filing date: 2003-09-02
Publication date: 2005-03-24

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To clarify that a polyphenol-inducing substance induces apoptosis to a cancer cell and provide the polyphenol-inducing substance as a new medicine and a health supplement. <P>SOLUTION: As a result of researching induction of apoptosis with respect to a human acute anterior myelogenic leukemia disease cell (HL-60 cell) of the polyphenol-inducing substance and a human colon cancer cell (LoVo cell), it was found that the polyphenol-inducing substance induces the apoptosis and it was found to be able to induce apoptosis with respect to the cancer cell. The polyphenol-inducing substance is a synthesized polyphenol-inducing substance. It was found to be able to induce the apoptosis also with respect to the human acute anterior myelogenic leukemia disease cell (HL-60 cell) and the human colon cancer cell (LoVo cell). <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

本発明は、ポリフェノール（ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ）誘導体を有効成分として含有する、癌細胞に対するアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）誘導剤に関する。すなわち、ヒトまたは動物の癌細胞内にあるプロテアーゼ、特に、カスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）が不活性化されることにより増殖する癌細胞に対するアポトーシスの誘導に有効であって、ヒトまたは動物の癌細胞内のカスパーゼを活性化することによりアポトーシスを誘導し、癌細胞を死滅させることに関する。より詳しくは、茶の抽出物であって、環式炭化水素の環と６員芳香環とを含有する環式炭化水素の中の６員環をもつものに関する。 The present invention relates to an apoptosis inducer for cancer cells, which contains a polyphenol derivative as an active ingredient. That is, it is effective in inducing apoptosis of cancer cells proliferating by inactivation of proteases in human or animal cancer cells, in particular, caspases, and caspases in human or animal cancer cells. It is related to inducing apoptosis by activating and killing cancer cells. More specifically, the present invention relates to a tea extract having a 6-membered ring among cyclic hydrocarbons containing a cyclic hydrocarbon ring and a 6-membered aromatic ring.

アポトーシスは、細胞内の核の破壊を伴う細胞死である。癌細胞におけるアポトーシスの死分子機構として、カルシウム経路、死のシグナル経路、セラミド経路、ミトコンドリア経路、及びｐ５３アポトーシス経路の５つの経路を介して誘導される分子機構が知られている（非特許文献１、橋本嘉幸：新アポトーシスの分子医学、羊土社、２００１年４月：１０−５８）。 Apoptosis is cell death with destruction of the nucleus inside the cell. As a death molecular mechanism of apoptosis in cancer cells, a molecular mechanism induced through five pathways of calcium pathway, death signal pathway, ceramide pathway, mitochondrial pathway, and p53 apoptosis pathway is known (Non-patent Document 1). Hashimoto Yoshiyuki: Molecular Medicine for New Apoptosis, Yodosha, April 2001: 10-58).

カルシウム経路では、アポトーシス誘導刺激によりグルココルチコイドがマウスの胸腺細胞の細胞外膜に存在するグルココルチコイド受容体に作用して細胞内のアイピー３アール３（ＩＰ３Ｒ３）が活性化され、引き続き細胞内のカルシウムイオン（Ｃａ^２＋）濃度が上昇し、プロテアーゼであるカルパインを活性化する。カルパインは、カスパーゼ１／インターロイキン−１β−変換酵素（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅ、ＩＣＥ）、カスパーゼ３を順次活性化、更に、カスパーゼ３はエンドヌクレアーゼを活性化し、活性化エンドヌクレアーゼの作用により核ＤＮＡが切断を受け、結果としてアポトーシスを誘導する（非特許文献１）。 In the calcium pathway, glucocorticoid acts on the glucocorticoid receptor present in the extracellular membrane of mouse thymocytes by apoptosis-inducing stimulation to activate intracellular IP 3R3 (IP3R3), followed by intracellular calcium. The ion (Ca ²⁺ ) concentration rises and activates the protease calpain. Calpain sequentially activates caspase 1 / interleukin-1β-converting enzyme (ICE) and caspase 3, and caspase 3 activates endonuclease, which is activated by the action of activated endonuclease. DNA undergoes cleavage and, as a result, induces apoptosis (Non-patent Document 1).

死のシグナル経路では、アポトーシス誘導刺激により腫瘍壊死因子−α（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ−α、ＴＮＦ−α）、ファスリガンド（ＦＳ−７−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎ、ＦａｓＬ）などの細胞外タンパク質分子が、胸腺細胞やリンパ球の細胞外膜に存在するそれぞれの受容体に接触する。これらの受容体から細胞内のアダプター分子、即ち、ドメインに会合するタンパク分子、トラッド（ＴＮＦＲ１−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｄｅａｔｈｄｏｍａｉｎｐｒｏｔｅｉｎ、ＴＲＡＤＤ）並びにファッド（ｆａｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｄｅａｔｈｄｏｍａｉｎｐｒｏｔｅｉｎ、ＦＡＤＤ）を介してカスパーゼ８を活性化する。活性型カスパーゼ８はカスパーゼ１／ＩＣＥを活性化、更に、活性型カスパーゼ１／ＩＣＥがカスパーゼ３を順次活性化し、アポトーシスを誘導する（非特許文献１）。 In the signal pathway of death, extracellular protein molecules such as tumor necrosis factor-α (TNF-α) and fasligand (FS-7-associated cell surface antigen, FasL) are induced by apoptosis-inducing stimulation, It contacts each receptor present on the outer cell membrane of cells and lymphocytes. From these receptors, caspase 8 is activated through intracellular adapter molecules, that is, protein molecules associated with the domain, trad (TNFR1-associated death protein, TRADD) and fad (fass-associated death domain protein, FADD). Turn into. Activated caspase 8 activates caspase 1 / ICE, and activated caspase 1 / ICE sequentially activates caspase 3 to induce apoptosis (Non-patent Document 1).

セラミド経路では、アポトーシス誘導刺激により細胞間の情報伝達を司るスフィンゴ脂質が細胞内に入り、スフィンゴミエリナーゼの酵素分解を受け、細胞内セラミドが増加する。これがサップキナーゼ／ジュン−Ｎ末端キナーゼ（ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ／ｃ−ｊｕｎＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌｋｉｎａｓｅ、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ）を活性化し、更に、活性型ＳＡＰＫ／ＪＮＫはカスパーゼ１／ＩＥＣを活性化し、アポトーシスを誘導する（非特許文献１）。 In the ceramide pathway, sphingolipids that control information transmission between cells enter the cell by apoptosis-inducing stimulation, undergo enzymatic degradation of sphingomyelinase, and increase intracellular ceramide. This activates sap kinase / June-N-terminal kinase (stress-activated protein kinase / c-jun N-terminal kinase, SAPK / JNK), and activated SAPK / JNK activates caspase 1 / IEC and induces apoptosis. It induces (nonpatent literature 1).

ミトコンドリア経路では、アポトーシス誘導刺激によりミトコンドリア膜上に存在するタンパク質であるアポトーシス促進因子のバックス（Ｂｃｌ−２ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＸｐｒｏｔｅｉｎ、ｂａｘ）が活性化され、アント（ａｄｅｎｉｎｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ、ＡＮＴ）とピーティーピーシー（ｐｅｒｍｉａｂｉｌｉｔｙｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｐｏｒｅｃｏｍｐｌｅｘ、ＰＴＰＣ）のタンパク質と会合後、ミトコンドリア膜に細孔を開ける。ミトコンドリア内から細孔を通してチトクロームｃが細胞質内に放出され、チトクロームｃはアポトーシス誘導因子−１（ａｐｏｐｔｏｓｉｓｐｒｏｔｅａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ−１、Ａｐａｆ−１）を活性化、活性化Ａｐａｆ−１はカスパーゼ９を活性化し、アポトーシスを誘導する（非特許文献１）。 In the mitochondrial pathway, apoptosis-promoting factor Bax (Bcl-2 associated X protein, bax), which is a protein present on the mitochondrial membrane, is activated by apoptosis-inducing stimulation, and ant (permitability) with ant (adenine nucleotide translocator, ANT). After associating with the protein of the transition pore complex (PTPC), a pore is opened in the mitochondrial membrane. Cytochrome c is released from the mitochondria through the pore into the cytoplasm, cytochrome c activates apoptosis-inducing factor-1, and activated Apaf-1 activates caspase-9 And induces apoptosis (Non-patent Document 1).

ｐ５３アポトーシス経路について、抗癌剤を用いた場合では、癌抑制遺伝子であるｐ５３が活性化を受け、次に、カスパーゼ１、カスパーゼ３を順次活性化し、アポトーシスを誘導する。一方、抗癌剤耐性細胞においては、癌制御遺伝子であるｐ５３が突然変異を受けていることが多いため、ミトコンドリア経路でのチトクロームｃの放出が妨げられ、アポトーシスの誘導が困難であることも報告されている（非特許文献１）。 Regarding the p53 apoptotic pathway, when an anticancer agent is used, p53 which is a tumor suppressor gene is activated, and then caspase 1 and caspase 3 are sequentially activated to induce apoptosis. On the other hand, in anticancer drug-resistant cells, p53, which is a cancer regulatory gene, is often mutated, and thus it has been reported that the release of cytochrome c in the mitochondrial pathway is hindered and it is difficult to induce apoptosis. (Non-Patent Document 1).

ポリフェノールは、タンパク質やアルカロイド等と結合して、その結果難溶化の傾向を示す多価フェノール類であり、タンニンなどの化合物を含む（非特許文献２、川崎敏男、他：天然薬物化学、廣川書店、１９８６年４月：１２４）。茶ポリフェノールは通称カテキン類とも言われており、近年では多くの生理活性が報告されている。例えば、抗酸化作用（非特許文献３、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．ｅｔａｌ．：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６７：３９６−４０１、２００３）、抗ＨＩＶ作用（非特許文献４、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．ｅｔａｌ．：Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、６：６９５−７００、１９９６）、抗アレルギー作用（非特許文献５、Ｙａｍａｄａ、Ｋ．ｅｔａｌ．：ＦｏｏｄＳｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｒｅｓ．、５：１−８、１９９９）、ＤＮＡ切断作用（非特許文献６、Ｏｈａｓｈｉ、Ｙ．ｅｔａｌ．：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６６：７７０−７７６、２００２）、抗トポイソメラーゼＩ及びＩＩ作用（非特許文献７、Ｓｕｚｕｋｉ、Ｋ．ｅｔａｌ．：Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、２４：１０８８−１０９０、２００１）、突然変異抑制作用（非特許文献８、Ｙｅｎ、Ｇ．Ｃ．ａｎｄＣｈｅｎ，Ｈ．Ｙ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．、４３：２７−３２、１９９５）、抗癌作用（非特許文献９、中村好志：茶の抗突然変異・抗癌作用、朝倉書店、１９９７年９月：１３１−１４３）など、たくさんの報告がある。 Polyphenols are polyphenols that bind to proteins, alkaloids, etc., and as a result tend to be poorly soluble, and include compounds such as tannin (Non-Patent Document 2, Toshio Kawasaki, et al .: Natural Drug Chemistry, Yodogawa Shoten) 1986 April: 124). Tea polyphenols are also known as catechins, and many physiological activities have been reported in recent years. For example, an antioxidant action (nonpatent literature 3, Hashimoto, F. et al .: Biosci. Biotechnol. Biochem., 67: 396-401, 2003), an anti-HIV action (nonpatent literature 4, Hashimoto, F. et al. Bioorg.Med.Chem.Lett., 6: 695-700, 1996), anti-allergic action (Non-patent document 5, Yamada, K. et al .: Food Sci. Technol. Res., 5: 1-8. 1999), DNA cleaving action (Non-Patent Document 6, Ohashi, Y. et al .: Biosci. Biotechnol. Biochem., 66: 770-776, 2002), anti-topoisomerase I and II action (Non-Patent Document 7, Suzuki) K. et al .: Bio Pharm.Bull., 24: 1088-1090, 2001), mutation suppression (Non-Patent Document 8, Yen, GC and Chen, HY: J. Agric. Food Chem., 43:27. -32, 1995), anticancer activity (Non-patent Document 9, Nakamura Yoshishi: Antimutagenic / anticancer activity of tea, Asakura Shoten, September 1997: 131-143).

茶ポリフェノールは、緑茶、紅茶、烏龍茶、黒茶から単離され、７０種以上ものポリフェノール類が含有され、それらの化学構造が既に明らかにされている（非特許文献１０、橋本文雄：各種茶のポリフェノールに関する化学的研究、１９８８年２月：１−２２２；非特許文献１１、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．ｅｔａｌ．：Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、３５：６１１−６１６、１９８７；非特許文献１２、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．ｅｔａｌ．：Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、３６：１６７６−１６８４、１９８８；非特許文献１３、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．ｅｔａｌ．：Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、３７：７７−８５、１９８９；非特許文献１４、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．ｅｔａｌ．：Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、３７：３２５５−３２６３、１９８９；非特許文献１５、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．ｅｔａｌ．：Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、４０：１３８３−１３８９、１９９２）。 Tea polyphenols are isolated from green tea, black tea, oolong tea, and black tea, contain more than 70 polyphenols, and their chemical structures have already been clarified (Non-Patent Document 10, Motoo Hashi: Various teas) Chemical Study on Polyphenols, February 1988: 1-222; Non-Patent Document 11, Hashimoto, F. et al .: Chem. Pharm. Bull., 35: 611-616, 1987; Non-Patent Document 12, Hashimoto, F. et al .: Chem. Pharm.Bull., 36: 1676-1684, 1988; Non-Patent Document 13, Hashimoto, F. et al .: Chem.Pharm.Bull., 37: 77-85, 1989; Patent Document 14, Hashimoto, F. et al .: Chem. m.Bull, 37:. 3255-3263,1989; Non-Patent Document 15, Hashimoto, F.et al.:Chem.Pharm.Bull.,40:1383-1389,1992).

茶ポリフェノールは、その生合成機構の違いにより、二つに分類されている。即ち、生葉中に元来含まれる一次ポリフェノールと、紅茶、烏龍茶等の製造工程（萎凋、発酵）で、フラバン３−オール（ｆｌａｖａｎ−３−ｏｌ）類から変換した二次ポリフェノールとに大別される。一次ポリフェノールには、フラバン３−オール（ｆｌａｖａｎ−３−ｏｌ）類、プロアントシアニジン（ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ）類、加水分解型タンニン（ｈｙｄｒｏｌｙｚａｂｌｅｔａｎｎｉｎ）類、チャルカン−フラバン二量体（ｃｈａｌｃａｎ−ｆｌａｖａｎｄｉｍｅｒ）類、ウーロンホモビスフラバン（ｏｏｌｏｎｇｈｏｍｏｂｉｓｆｌａｖａｎ）類が含まれる。一方、二次ポリフェノールとして、テアシネンシン（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ）類、テアフラガリン（ｔｈｅａｆｌａｇａｌｌｉｎ）類、テアフラビン（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ）類が含まれる（非特許文献９）。 Tea polyphenols are classified into two types depending on the biosynthetic mechanism. That is, it is roughly classified into primary polyphenols originally contained in fresh leaves and secondary polyphenols converted from flavan-3-ols in the production process (wilt, fermentation) of black tea, oolong tea, and the like. The Primary polyphenols include flavan-3-ols, proanthocyanidins, hydrolyzable tannins, charcan-flavan dimers, oolongs Homobisflavans are included. On the other hand, the secondary polyphenols include theasinensins, theaflavalins, and theaflavins (Non-patent Document 9).

いわゆる茶カテキン類と称する主ポリフェノールの、エピガロカテキン３−ガレート（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ３−Ｏ−ｇａｌｌｔｅ、ＥＧＣＧ）、エピガロカテキン（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ、ＥＧＣ）、エピカテキン３−ガレート（（−）−ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ、ＥＣＧ）、エピカテキン（（−）−ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ、ＥＣ）、ガロカテキン（（＋）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ、ＧＣ）、カテキン（（＋）−ｃａｔｅｃｈｉｎ、ＣＡ）を除く、種々のポリフェノール類は、茶葉からの単離が容易ではなかったこともあって、種々の生物活性試験を行うことが困難であった問題点がある。 The main polyphenols called so-called tea catechins are epigallocatechin 3-gallate ((−)-epigallocatechin 3-O-galte, EGCG), epigallocatechin ((−)-epigallocatechin, EGC), epicatechin 3-gallate ( Except (−)-epicatechin 3-O-gallate, ECG), epicatechin ((−)-epicatechin, EC), gallocatechin ((+)-galcatechin, GC), catechin ((+)-catechin, CA), Various polyphenols have a problem that it was difficult to conduct various biological activity tests because they were not easily isolated from tea leaves.

茶ポリフェノールが抗癌作用を有するという事実が明らかにされたものの、ポリフェノールの癌細胞増殖抑制効果と、癌細胞のアポトーシス誘導による細胞死との関係は、明らかではなかったなどの問題点がある（非特許文献１；非特許文献９）。 Although the fact that tea polyphenol has an anticancer activity has been clarified, there is a problem such as that the relationship between the inhibitory effect of polyphenol on cancer cell proliferation and the cell death caused by apoptosis induction of cancer cells has not been clarified ( Non-patent document 1; Non-patent document 9).

Ｕ９３７のリンパ球癌細胞を用いたアポトーシスの誘導には、茶ポリフェノールの化学構造のピロガロール環が重要であることが明らかにされている（非特許文献１６、Ｓａｅｋｉ、Ｋ．ｅｔａｌ．：Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５３：３９１−３９４、２０００）。また、二次ポリフェノールであるテアシネンシン類やテアフラビン類がＵ９３７のリンパ球がん細胞に対して、アポトーシスを誘導することが報告されているが、他のがん細胞を用いたアポトーシス誘導の報告例はない（非特許文献１７、Ｐａｎ、Ｍ．−Ｈ．ｅｔａｌ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．、４８：６３３７−６３４６、２０００）。 It has been clarified that the pyrogallol ring of the chemical structure of tea polyphenol is important for the induction of apoptosis using lymphocyte cancer cells of U937 (Non-patent Document 16, Saeki, K. et al .: Phytochistry, 53: 391-394, 2000). In addition, it has been reported that theasinensins and theaflavins, which are secondary polyphenols, induce apoptosis of lymphocyte cancer cells of U937, but reported examples of apoptosis induction using other cancer cells are as follows. (Non-patent Document 17, Pan, M.-H. et al .: J. Agric. Food Chem., 48: 6337-6346, 2000).

その他、特開平２０００−２２６３２９号（以下、特許文献１という）に、ＭＭＰ阻害剤（特許文献１の第０００１〜００１４段落）の記載がある。「カテキン化合物の抗酸化活性や抗ウィルス活性、など多様な生物活性に着目し、カテキン化合物がＭＭＰｓに対して阻害作用を有するかもしれないと推測し、カテキンのＭＭＰｓ阻害活性を調べた結果、カテキンが、その多様な生物活性と併せて、ＭＭＰ阻害作用を示し、結果として、ＭＭＰｓ活性の調節不能に起因する難治性疾患の治療及び予防に対する有用性が期待できることを見出した」という記載がある（特許文献１の第００１３段落）。
特開平２０００−３４４６７２号（以下、特許文献２という）には、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤（特許文献２の第０００１〜００１４段落）の記載がある。「ポリフェノール類であるタンニン化合物についても、ＭＭＰｓ阻害活性を調べた結果、該化合物が、優れたＭＭＰ阻害作用を示し、結果として、ＭＭＰｓ活性の調節不能に起因する難治性疾患の治療および予防に対して有用性が期待できることを見出し、本発明を完成した」という記載がある（特許文献２の第００１３段落）。 In addition, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-226329 (hereinafter referred to as Patent Document 1) describes MMP inhibitors (paragraphs 0001 to 0014 of Patent Document 1). “As a result of investigating the biological activity such as antioxidant activity and antiviral activity of catechin compounds, catechin compounds may have an inhibitory effect on MMPs, and investigating the MMPs inhibitory activity of catechins, However, it has been found that it exhibits MMP inhibitory action in combination with its various biological activities, and as a result, can be expected to be useful for the treatment and prevention of intractable diseases caused by the inability to regulate MMPs activity ”( (Paragraph 0013 of Patent Document 1).
Japanese Unexamined Patent Publication No. 2000-344672 (hereinafter referred to as Patent Document 2) describes a matrix metalloproteinase inhibitor (paragraphs 0001 to 0014 of Patent Document 2). “As a result of examining MMPs inhibitory activity of tannin compounds which are polyphenols, the compound showed excellent MMP inhibitory activity, and as a result, the treatment and prevention of refractory diseases caused by dysregulation of MMPs activity. In other words, the present invention has been completed by finding that usefulness can be expected (paragraph 0013 of Patent Document 2).

特願２００２−０８４６６６号（以下、特許文献３という）には、抗癌剤（特許文献３の第０００１〜０００６段落）の記載がある。「発癌プロモーターＴＰＡによる細胞癌化実験を行ったところ、アントシアニジン誘導体、特に、ブルーベリーの果実から抽出したアントシアニジン配糖体であるアントシアニンを含有した培地においては、細胞癌化が抑制されることを見出した」という記載がある（特許文献３の第０００５段落）。
特願２００３−１５７８６２号（以下、特許文献４という）には、アポトーシス誘導剤（特許文献４の第００１５、００１６段落）と記載した。「紅茶から抽出されたプルプロガリン誘導体並びにその合成したプルプロガリン誘導体のヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）に対するアポトーシス誘導を調べた結果、プルプロガリン（ｐｕｒｐｕｒｏｇａｌｌｉｎ）が濃度依存的および経時的にアポトーシスを誘導することと併せて、テアフラビン（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ）類も同様にＨＬ−６０細胞に対してアポトーシスを誘導することを見出し、結果として、正常細胞に対してアポトーシス誘導を起こさせなくて、癌細胞に対してのみアポトーシスを誘導できることを見出した。」、「プルプロガリン（Ｐｕｒｐｕｒｏｇａｌｌｉｎ）がＨＬ−６０細胞に対してカスパーゼ８を活性化し、カスパーゼ８の直接作用によりカスパーゼ３を活性化し、引き続いてＤＮＡが断片化され、アポトーシスが誘導されることを見出した。また、カスパーゼ８からはビッド（Ｂｉｄ）は切断されず、ミトコンドリアからも細胞質へチトクロームｃは放出されず、カスパーゼ９は結果として活性化されないことを見出した。この細胞死機構は、ＨＬ−６０細胞内の活性酸素の増加を伴わないでアポトーシスを誘導することを見出し、本発明を完成した。」という記載がある。 Japanese Patent Application No. 2002-084666 (hereinafter referred to as Patent Document 3) describes an anticancer agent (paragraphs 0001 to 0006 of Patent Document 3). “When an oncogenic promoter TPA was used, a cell canceration experiment was conducted, and in an anthocyanidin derivative, particularly an anthocyanin glycoside extracted from blueberry fruit, anthocyanin was found to inhibit cell carcinogenesis. (Patent Document 3, paragraph 0005).
In Japanese Patent Application No. 2003-157862 (hereinafter referred to as Patent Document 4), it was described as an apoptosis inducer (paragraphs 0015 and 0016 of Patent Document 4). “As a result of investigating the induction of apoptosis in human acute promyelocytic leukemia disease cells (HL-60 cells) by purpurogallin derivatives extracted from black tea and the synthesized purprogalin derivatives, purpurogallin was apoptotic in a concentration-dependent manner and over time. And theaflavins have also been found to induce apoptosis in HL-60 cells, and as a result, they do not induce apoptosis in normal cells. It was found that apoptosis can only be induced against "," Purpurogallin activates caspase 8 on HL-60 cells, activates caspase 3 by the direct action of caspase 8, and subsequently DNA breaks. It was found that apoptosis was induced, caspase 8 was not cleaved by bid (Bid), cytochrome c was not released from mitochondria into the cytoplasm, and caspase 9 was not activated as a result. This cell death mechanism has been found to induce apoptosis without an increase in active oxygen in HL-60 cells, and the present invention has been completed. "

特開平２０００−２２６３２９号公報（第３頁）JP 2000-226329 A (page 3) 特開平２０００−３４４６７２号公報（第３頁）JP 2000-344672 A (page 3) 特願２００２−０８４６６６号Japanese Patent Application No. 2002-084666 特願２００３−１５７８６２号Japanese Patent Application No. 2003-157862 橋本嘉幸、「アポトーシスとは」、新アポトーシスの分子医学、羊土社、２００１年４月、Ｐ．１０−５８。Yoshiyuki Hashimoto, “What is Apoptosis”, Molecular Medicine for New Apoptosis, Yodosha, April 2001, p. 10-58. 川崎敏男、他１０名、「タンニン」、天然薬物化学、廣川書店、１９８６年４月、Ｐ．１２４。Toshio Kawasaki and 10 others, “Tannin”, Natural Drug Chemistry, Yodogawa Shoten, April 1986, P.A. 124. Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．、他９名、「ＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＡｎｔｉ−ｏｘｉｄａｔｉｖｅＥｆｆｅｃｔ（ｉｎｖｉｔｒｏ）ｏｆＴｅａＰｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ」、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００３年、第６７巻、Ｐ．３９６−４０１。Hashimoto, F.H. , And nine others, “Evaluation of the Anti-oxidative Effect (in vitro) of Tea Polyphenols”, Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003, vol. 67, p. 396-401. 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しかしながら、ポリフェノール誘導体の癌細胞増殖を抑制する分子機構が、その細胞を自死に至らしめたかどうかについては不明であることから、日常的に飲茶として摂取しているポリフェノール類を医薬品、または健康補助食品として実用化することに問題点がある。また、特許文献１及び特許文献２に記載のある、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤としての効果・効能についても、臨床的有用性は明らかにされておらず、実用化には至っていない。さらに、正常細胞には安全で癌細胞に対してアポトーシスを誘導する医薬品の供給が必要であるなどの問題点がある。 However, since it is unclear whether the molecular mechanism that suppresses cancer cell growth of polyphenol derivatives has caused the cells to die, polyphenols that are ingested as dim sum on a daily basis are used as pharmaceuticals or health supplements. There is a problem in putting it into practical use. In addition, as to the effects and efficacy as matrix metalloprotease inhibitors described in Patent Document 1 and Patent Document 2, clinical usefulness has not been clarified and has not yet been put into practical use. Furthermore, there is a problem that normal cells need to be supplied with a medicine that is safe and induces apoptosis of cancer cells.

本発明は、緑茶、烏龍茶、紅茶から抽出されたポリフェノール誘導体並びにその合成したポリフェノール誘導体が癌細胞に対してアポトーシスを誘導することを明らかにした上で、緑茶、烏龍茶、紅茶から抽出されたポリフェノール誘導体並びにそれらを合成したポリフェノール誘導体を新規な医薬品および健康補助食品として提供するものである。 The present invention clarifies that polyphenol derivatives extracted from green tea, oolong tea and black tea and the synthesized polyphenol derivatives induce apoptosis in cancer cells, and then polyphenol derivatives extracted from green tea, oolong tea and black tea. In addition, the present invention provides polyphenol derivatives obtained by synthesizing them as novel pharmaceuticals and health supplements.

本発明者らは、上記の課題を解決するために、紅茶から抽出されたポリフェノール誘導体並びにその合成したポリフェノール誘導体のヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）、ヒト大腸癌細胞（ＬｏＶｏ細胞）に対するアポトーシス誘導を調べた結果、プロデルフィニジンＢ−２（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎＢ−２）が濃度依存的および経時的にアポトーシスを誘導することと併せて、ポリフェノール（ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ）類も同様にＨＬ−６０細胞、ＬｏＶｏ細胞に対してアポトーシスを誘導すること、癌細胞に対してアポトーシスを誘導できることを見出した。より詳しくは、 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have made use of a polyphenol derivative extracted from black tea and a synthesized polyphenol derivative of human acute promyelocytic leukemia disease cells (HL-60 cells), human colon cancer cells (LoVo). As a result of examining apoptosis induction on cells), it was found that prodelphinidin B-2 induces apoptosis in a concentration-dependent and time-dependent manner, and polyphenols similarly produced HL-60 cells. It has been found that apoptosis can be induced on LoVo cells and apoptosis can be induced on cancer cells. More details

プロデルフィニジンＢ−２（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎＢ−２）がＨＬ−６０細胞に対してカスパーゼ８を活性化し、カスパーゼ８の直接作用によりカスパーゼ３を活性化し、引き続いてＤＮＡが断片化され、アポトーシスが誘導されることを見出した。また、カスパーゼ９も活性化されることを見出した。この細胞死機序は、ＨＬ−６０細胞内の活性酸素の増加を伴いアポトーシスを誘導することを見出し、本発明を完成した。 Prodelphinidin B-2 activates caspase 8 on HL-60 cells, activates caspase 3 by direct action of caspase 8, and subsequently DNA is fragmented to induce apoptosis I found out. It was also found that caspase 9 is also activated. This cell death mechanism was found to induce apoptosis accompanied by an increase in active oxygen in HL-60 cells, and completed the present invention.

本発明のＡｐｏｐｔｏｓｉｓ誘導剤は、ポリフェノール誘導体を有効成分として含有する。このポリフェノール誘導体とは、緑茶、烏龍茶、紅茶から抽出、単離、精製されたポリフェノール類、例えば、（−）−エピガロカテキン（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（１）、（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（２）、（−）−エピガロカテキン−３、５−ジ−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ３、５−ｄｉ−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（３）、（＋）−ガロカテキン（ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（４）、８−Ｃ−アスコルビルエピガロカテキン（８−Ｃ−ａｓｃｏｒｂｙｌｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（５）、プロデルフィニジンＢ−２（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎＢ−２）（６）、プロデルフィニジンＢ−２３'−Ｏ−ガレート（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎＢ−２３'−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（７）、プロデルフィニジンＢ−２３、３'−ジ−Ｏ−ガレート（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎＢ−２３、３'−ｄｉ−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（８）、（−）−エピガロカテキン（４β−８）（−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ（４β−８）ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（９）、（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（４β−８）（−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ（４β−８）ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（１０）、プロシアニジンＢ−４（ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎＢ−４）（１１）、（＋）−ガロカテキン（４α−８）（−）−エピカテキン（ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ（４α−８）ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ）（１２）、（＋）−カテキン（４α−８）（−）−エピガロカテキン（ｃａｔｅｃｈｉｎ（４α−８）ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（１３）、プロデルフィニジンＢ−４（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎＢ−４）（１４）、プロデルフィニジンＢ−４３'−Ｏ−ガレート（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎＢ−４３'−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（１５）、ウーロンホモビスフラバンＡ（ｏｏｌｏｎｇｈｏｍｏｂｉｓｆｌａｖａｎＡ）（１６）、モノデスガロイルウーロンホモビスフラバンＡ（ｍｏｎｏｄｅｓｇａｌｌｏｙｌｏｏｌｏｎｇｈｏｍｏｂｉｓｆｌａｖａｎＡ）（１７）、アッサミカインＡ（ａｓｓａｍｉｃａｉｎＡ）（１８）、アッサミカインＢ（ａｓｓａｍｉｃａｉｎＢ）（１９）、テアシネンシンＡ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎＡ）（２０）、テアシネンシンＢ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎＢ）（２１）、テアシネンシンＣ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎＣ）（２２）、テアシネンシンＤ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎＤ）（２３）、テアシネンシンＥ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎＥ）（２４）、ストリクティニン（ｓｔｒｉｃｔｉｎｉｎ）（２５）、没食子酸（ｇａｌｌｉｃａｃｉｄ）（２６）であり、ヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）、ヒト大腸癌細胞（ＬｏＶｏ）の癌細胞、癌細胞、または抗癌剤耐性細胞などの疾患細胞に対してアポトーシスを誘導することのできる化合物である。
ポリフェノール誘導体（化合物（１）〜（２４））は、一般式（Ｉ）で示す（式中Ｒ_１〜Ｒ_６は表１〜表６にそれぞれ対応する化学式を示す）。表１には、単量体ポリフェノール類、表２には、プロアントシアニジン類（ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ）、表３には、プロアントシアニジン類（ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ）、表４には、ウーロンホモビスフラバン、表５には、アッサミカイン類（ａｓｓａｍｉｃａｉｎ）、表６には、テアシネンシン類（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ）を示す。化２にストリクティニン（ｓｔｒｉｃｔｉｎｉｎ）（２５）を示す。化３に没食子酸（ｇａｌｌｉｃａｃｉｄ）（２６）を示す。 The apoptosis inducer of the present invention contains a polyphenol derivative as an active ingredient. This polyphenol derivative is a polyphenol extracted, isolated and purified from green tea, oolong tea, black tea, for example, (−)-epigallocatechin (1), (−)-epigallocatechin-3-O. -Gallate (epigallocatechin-3-O-gallate) (2), (-)-epigallocatechin-3,5-di-O-gallate (epigallocatechin 3, 5-di-O-gallate) (3), (+ ) -Gallocatechin (4), 8-C-ascorbyl epigallocatechin (5), prodelphinidin B-2 (6), prodelphinidin B-2 3 ' O-gallate (prodelphidin B-2 3'-O-gallate) (7), prodelphinidin B-2 3,3'-di-O-gallate (prodelphidin B-2 3, 3'-di-O-gallate) (8), (−)-epigallocatechin (4β-8) (−)-epicatechin-3-O-gallate (epigallocatechin (4β-8) epicatechin-3-O-gallate) (9), (−) -Epigallocatechin-3-O-gallate (4β-8) (-)-Epicatechin-3-O-gallate (4β-8) epicatechin-3-O-gallate (10) ), Procyanidin B-4 (11) (+)-Gallocatechin (4α-8) (−)-epicatechin (4α-8) epicatechin (12), (+)-catechin (4α-8) (−)-epigallocatechin (catechin ( 4α-8) epigallocin (13), prodelphinidin B-4 (prodelphindin B-4) (14), prodelphinidin B-4 3′-O-gallate (15) ), Oolonghomobisflavan A (16), monodesgalloyl oolongobisflavan A (17), assamikine A assamicin A) (18), assamicin B (19), theasinensin A (20), theasinensin B (21), theasinensin C (theassinsin C) (22), theassininsin D) (23), theasinensin E (24), strictinin (25), gallic acid (26), human acute promyelocytic leukemia disease cells (HL-) 60 cells), human colon cancer cells (LoVo) cancer cells, cancer cells, or compounds capable of inducing apoptosis on disease cells such as anticancer drug resistant cells.
The polyphenol derivative (compounds (1) to (24)) is represented by the general formula (I) (wherein R _{1 to} R ₆ represent chemical formulas corresponding to Tables 1 to 6, respectively). Table 1 shows monomeric polyphenols, Table 2 shows proanthocyanidins, Table 3 shows proanthocyanidins, Table 4 shows oolong homobisflavans, Table 5 shows Assamicains, Table 6 shows theasinensins. Chemical formula 2 shows strictinin (25). Chemical formula 3 shows gallic acid (26).

本発明のアポトーシス誘導剤とは、ポリフェノール誘導体を有効成分として含有する。 The apoptosis inducer of the present invention contains a polyphenol derivative as an active ingredient.

本発明のアポトーシス誘導剤には、ポリフェノール誘導体が、（−）−エピガロカテキン（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（１）、（−）−エピガロカテキン−３、５−ジ−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ３、５−ｄｉ−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（３）、（＋）−ガロカテキン（ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（４）、８−Ｃ−アスコルビルエピガロカテキン（８−Ｃ−ａｓｃｏｒｂｙｌｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（５）、プロデルフィニジンＢ−２（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎＢ−２）（６）、プロデルフィニジンＢ−２３'−Ｏ−ガレート（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎＢ−２３'−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（７）、プロデルフィニジンＢ−２３、３'−ジ−Ｏ−ガレート（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎＢ−２３、３'−ｄｉ−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（８）、（−）−エピガロカテキン（４β−８）（−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ（４β−８）ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（９）、（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（４β−８）（−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ（４β−８）ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（１０）、プロシアニジンＢ−４（ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎＢ−４）（１１）、（＋）−ガロカテキン（４α−８）（−）−エピカテキン（ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ（４α−８）ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ）（１２）、（＋）−カテキン（４α−８）（−）−エピガロカテキン（ｃａｔｅｃｈｉｎ（４α−８）ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（１３）、プロデルフィニジンＢ−４（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎＢ−４）（１４）、プロデルフィニジンＢ−４３'−Ｏ−ガレート（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎＢ−４３'−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（１５）、ウーロンホモビスフラバンＡ（ｏｏｌｏｎｇｈｏｍｏｂｉｓｆｌａｖａｎＡ）（１６）、モノデスガロイルウーロンホモビスフラバンＡ（ｍｏｎｏｄｅｓｇａｌｌｏｙｌｏｏｌｏｎｇｈｏｍｏｂｉｓｆｌａｖａｎＡ）（１７）、アッサミカインＡ（ａｓｓａｍｉｃａｉｎＡ）（１８）、アッサミカインＢ（ａｓｓａｍｉｃａｉｎＢ）（１９）、テアシネンシンＢ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎＢ）（２１）、テアシネンシンＣ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎＣ）（２２）、テアシネンシンＤ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎＤ）（２３）、テアシネンシンＥ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎＥ）（２４）、ストリクティニン（ｓｔｒｉｃｔｉｎｉｎ）（２５）、没食子酸（ｇａｌｌｉｃａｃｉｄ）（２６）、が含まれる。また、これらのポリフェノール誘導体は緑茶、ウーロン茶、紅茶などのいわゆる茶葉から抽出されたものであって、癌疾患細胞に対するものである。 In the apoptosis inducer of the present invention, polyphenol derivatives include (−)-epigallocatechin (1), (−)-epigallocatechin-3, 5-di-O-gallate (epigallocatechin 3, 5- di-O-gallate (3), (+)-gallocatechin (4), 8-C-ascorbyl epigallocatechin (5), prodelphinidin B-2 (prodelphindin B) -2) (6), prodelphinidin B-2 3'-O-gallate (7), prodelphinidin B-2 3,3'-di-O-gallate (7) prodelp inidin B-2 3,3′-di-O-gallate) (8), (−)-epigallocatechin (4β-8) (−)-epicatechin-3-O-gallate (epigallocatechin (4β-8)) epicatechin-3-O-gallate (9), (−)-epigallocatechin-3-O-gallate (4β-8) (−)-epicatechin-3-O-gallate (epigallocatechin-3-O-gallate) (4β-8) epicatechin-3-O-gallate) (10), procyanidin B-4 (procyanidin B-4) (11), (+)-gallocatechin (4α-8) (−)-epicatechin (4α -8) epicatechin) (12), (+)-cate Kin (4α-8) (−)-epigallocatechin (13α) epigallocatechin (13), prodelphinidin B-4 (14), prodelphinidin B-4 3′-O -Gallate (prodelphindin B-4 3'-O-gallate) (15), oolonghomobisflavan A (16), monodesgalloyl oolong homobisflavan A (monodesgalloylholangafismovar) 17 (Assamicain A) (18), assamicin B (19), theasinensin B (theasinensin B) ) (21), theasinensin C (22), theasinensin D (23), theasinensin E (24), strictinin (25), gallic acid (gallic acid) ) (26). These polyphenol derivatives are extracted from so-called tea leaves such as green tea, oolong tea and black tea, and are for cancer disease cells.

本発明のアポトーシス誘導剤には、ポリフェノール誘導体が、（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（２）、テアシネンシンＡ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎＡ）（２０）、が含まれる。また、これらのポリフェノール誘導体は緑茶、ウーロン茶、紅茶などのいわゆる茶葉から抽出されたものであって、癌疾患細胞（Ｕ９３７のリンパ球癌細胞を除く）に対するものである。 In the apoptosis inducer of the present invention, polyphenol derivatives include (−)-epigallocatechin-3-O-gallate (2), theasinensin A (20), included. These polyphenol derivatives are extracted from so-called tea leaves such as green tea, oolong tea and black tea, and are for cancer disease cells (excluding lymphocyte cancer cells of U937).

本発明のアポトーシス誘導剤は、ポリフェノール誘導体が緑茶、ウーロン茶、紅茶などのいわゆる茶葉から抽出されたものであって、ヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）、ヒト大腸癌細胞（ＬｏＶｏ）に対するものである。本発明のアポトーシス誘導剤は、胃癌、肺癌、すい臓癌、腎臓癌、大腸癌、血液癌などの癌疾患細胞に対するものである。 The apoptosis-inducing agent of the present invention is obtained by extracting a polyphenol derivative from so-called tea leaves such as green tea, oolong tea, black tea, etc., and comprises human acute promyelocytic leukemia disease cells (HL-60 cells), human colon cancer cells (LoVo). ). The apoptosis inducer of the present invention is for cancer disease cells such as stomach cancer, lung cancer, pancreatic cancer, kidney cancer, colon cancer, blood cancer and the like.

本発明のアポトーシス誘導剤は、ポリフェノール誘導体が合成されたものであって、癌疾患細胞に対するものである。また、ポリフェノール誘導体が合成されたものであって、ヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）、ヒト大腸癌細胞（ＬｏＶｏ細胞）に対するものである。 The apoptosis inducer of the present invention is a compound in which a polyphenol derivative is synthesized and is for cancer disease cells. In addition, polyphenol derivatives are synthesized and are for human acute promyelocytic leukemia disease cells (HL-60 cells) and human colon cancer cells (LoVo cells).

ポリフェノール誘導体の癌細胞増殖を抑制する分子機構が、その細胞を自死に至らしめたかどうかについて明らかにした。日常的に飲茶として摂取しているポリフェノール類を医薬品、または健康補助食品として実用化できる。
本発明は、緑茶、烏龍茶、紅茶から抽出されたポリフェノール誘導体が癌細胞に対してアポトーシスを誘導することを明らかにした上で、緑茶、烏龍茶、紅茶から抽出されたポリフェノール誘導体を新規な医薬品および健康補助食品として提供できる。
本発明によって、ヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）、ヒト大腸癌細胞（ＬｏＶｏ細胞）に対する優れたアポトーシス誘導剤として、ポリフェノール誘導体を提供できる。 We clarified whether the molecular mechanism of polyphenol derivatives that suppress cancer cell growth caused the cells to die. Polyphenols taken as dim sum on a daily basis can be put into practical use as pharmaceuticals or health supplements.
The present invention clarifies that polyphenol derivatives extracted from green tea, oolong tea, and black tea induce apoptosis of cancer cells, and uses polyphenol derivatives extracted from green tea, oolong tea, black tea as novel pharmaceuticals and health Can be provided as a supplement.
According to the present invention, a polyphenol derivative can be provided as an excellent apoptosis inducer for human acute promyelocytic leukemia disease cells (HL-60 cells) and human colon cancer cells (LoVo cells).

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
本発明において、例えば、紅茶の茶葉から、水、低級アルコール、アセトン、酢酸エチルなどの有機溶媒を用いてテアフラビン類を抽出することができる。また、紅茶など市販茶葉中のテアフラビン類は０．７〜１．５％含まれている（非特許文献３）。
本発明のポリフェノール（ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ）類を、文献記載の方法を用いて単離した（非特許文献１０）。
また、テアシネンシン類、ウーロンホモビスフラバン（ｏｏｌｏｎｇｈｏｍｏｂｉｓｆｌａｖａｎ）類を合成した。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention concretely, this invention is not limited to these Examples.
In the present invention, for example, theaflavins can be extracted from tea leaves of black tea using an organic solvent such as water, lower alcohol, acetone, and ethyl acetate. Moreover, theaflavins in commercially available tea leaves such as black tea are contained in an amount of 0.7 to 1.5% (Non-patent Document 3).
The polyphenols of the present invention were isolated using methods described in literature (Non-patent Document 10).
In addition, theacinensins and oolong homobisflavans were synthesized.

［ヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）の調整］
ＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）倍地の作成：
ＲＭＰＩ１６４０を２．０４ｇ秤取し、蒸留水にて全量を２００ｍｌとし、攪拌して溶解した後、溶液をオートクレーブで滅菌した（１２１℃、２０分）。冷後、これに、１０％炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）を４ｍｌ、ＦＢＳ（予め非動化したもの）を２０ｍｌ、抗生物質溶液（ペニシリン・ストレプトマイシン）２ｍｌを加え、４℃で保存した。 [Adjustment of human acute promyelocytic leukemia disease cells (HL-60 cells)]
Creation of RMPI 1640 (10% FBS +) medium:
After 2.04 g of RMPI 1640 was weighed and made up to 200 ml with distilled water and dissolved by stirring, the solution was sterilized with an autoclave (121 ° C., 20 minutes). After cooling, 4 ml of 10% sodium hydrogen carbonate (NaHCO ₃ ), 20 ml of FBS (previously immobilized), and 2 ml of antibiotic solution (penicillin / streptomycin) were added and stored at 4 ° C.

ＨＬ−６０細胞の融解と増殖：
予め−８０℃で凍結させておいたＨＬ−６０細胞を３７℃で溶解し、予め３７℃で保温したＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）倍地５ｍｌに混入し、よく混合した。培地を、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上澄みを除去した。これにＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）倍地１ｍｌを加え、軽く攪拌し、さらにＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地５ｍｌを加え、混合した後、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）を行い、上澄みを除去した。これにＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地１ｍｌを加え、軽く攪拌し、さらにＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地５ｍｌを加え、混合した後、シャーレ（６ｃｍ）に培地を流し込み、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件で、インキュベーターでＨＬ−６０細胞を培養した。 Thawing and proliferation of HL-60 cells:
HL-60 cells that had been frozen at -80 ° C in advance were lysed at 37 ° C, mixed in 5 ml of RMPI 1640 (10% FBS +) medium that had been kept warm at 37 ° C, and mixed well. After centrifuging the medium (1200 rpm, 5 minutes), the supernatant was removed. To this, 1 ml of RMPI 1640 (10% FBS +) medium was added, stirred gently, and further 5 ml of RMPI 1640 (10% FBS +) medium was added and mixed, followed by centrifugation (1200 rpm, 5 minutes), and the supernatant was removed. To this, 1 ml of RMPI 1640 (10% FBS +) medium was added, stirred gently, and further 5 ml of RMPI 1640 (10% FBS +) medium was added and mixed, and then the medium was poured into a petri dish (6 cm) and 37% in an atmosphere containing 5% carbon dioxide. HL-60 cells were cultured in an incubator under the condition of ° C.

ＨＬ−６０細胞の継代：
培養し、増殖されたＨＬ−６０細胞を１５ｍｌチューブで回収し、丁寧に拡販した後、その少量を血球計算盤に採取し、細胞数をカウントした。１５ｍｌチューブで回収したＨＬ−６０細胞を、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上澄みを除去した。これに予め３７℃で保温したＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地１ｍｌを加え、軽く攪拌し、先の細胞数を計算した値から、倍地中の細胞の濃度が２ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／６ｍｌとなるように、ＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地で濃度を調整した。調整した培地を、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件で、インキュベーターで培養し、ＨＬ−６０細胞を継代した。 Passage of HL-60 cells:
Cultured and proliferated HL-60 cells were collected in a 15 ml tube and carefully expanded, then a small amount was collected on a hemocytometer and the number of cells was counted. HL-60 cells collected in a 15 ml tube were centrifuged (1200 rpm, 5 minutes), and then the supernatant was removed. To this, 1 ml of RMPI 1640 (10% FBS +) medium preliminarily kept at 37 ° C. was added, stirred gently, and the concentration of cells in the medium was 2 × 10 ⁶ cells / ⁶ ml based on the previous cell count calculation. The concentration was adjusted with RMPI1640 (10% FBS +) medium. The prepared medium was cultured in an incubator at 37 ° C. in an atmosphere containing 5% carbon dioxide, and HL-60 cells were passaged.

ＨＬ−６０細胞の保存：
継代されたＨＬ−６０細胞を１５ｍｌチューブで回収し、丁寧に拡販した後、その少量を血球計算盤に採取し、細胞数をカウントした。１５ｍｌチューブで回収したＨＬ−６０細胞を、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上澄みを除去した。これに予め３７℃で保温したＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地１ｍｌを加え、軽く攪拌し、先の細胞数を計算した値から、倍地中の細胞の濃度が２ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／１ｍｌとなるように、ＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地を８０％、ＦＢＳを１０％、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を１０％の組成を有する培地で、濃度を調整した。これをセラムチューブに１ｍｌずつ分注し、−２０℃で一夜保存後、翌日より−８０℃にて保存した。 Storage of HL-60 cells:
The subcultured HL-60 cells were collected in a 15 ml tube and carefully expanded, and a small amount thereof was collected on a hemocytometer and the number of cells was counted. HL-60 cells collected in a 15 ml tube were centrifuged (1200 rpm, 5 minutes), and then the supernatant was removed. To this, 1 ml of RMPI 1640 (10% FBS +) medium preliminarily kept at 37 ° C. was added, stirred gently, and the concentration of cells in the medium was 2 × 10 ⁶ cells / 1 ml from the value obtained by calculating the previous cell number. The concentration was adjusted with a medium having a composition of 80% RMPI 1640 (10% FBS +), 10% FBS, and 10% dimethyl sulfoxide (DMSO). 1 ml of this was dispensed into a serum tube, stored overnight at -20 ° C, and then stored at -80 ° C from the next day.

［エムエムティ・アッセイ（ＭＴＴａｓｓａｙ）；ＨＬ−６０細胞の５０％生存率の検定方法］
本法は、文献記載の方法を参考にした（Ｍｏｓｍａｎｎ、Ｔ．：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、６５：５５−６３、１９８３）。２ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／１ｍｌのＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地で継代したＨＬ−６０細胞を、平底の１ｐｌａｔｅ９６ｗｅｌｌの１ｗｅｌｌあたり２ｘ１０^４ｃｅｌｌｓ／１００μｌのＨＬ−６０細胞数になるように培地でＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地で希釈し、２ｘ１０^４ｃｅｌｌｓ／１００μｌのＨＬ−６０細胞を各ｗｅｌｌへ分注した。これを５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件で、インキュベーターで２４時間培養した。 [MMT assay; assay method for 50% viability of HL-60 cells]
This method was based on a method described in the literature (Mosmann, T .: J. Immunol. Methods, 65: 55-63, 1983). HL-60 cells subcultured with 2 × 10 ⁶ cells / 1 ml of RMPI 1640 (10% FBS +) medium were added to the medium so that the number of HL-60 cells was 2 × 10 ⁴ cells / 100 μl per well of 1 plate 96 well of flat bottom. The solution was diluted with RMPI 1640 (10% FBS +) medium, and 2 × 10 ⁴ cells / 100 μl of HL-60 cells were dispensed into each well. This was cultured in an incubator for 24 hours under conditions of 37 ° C. in an atmosphere containing 5% carbon dioxide.

培養後各ｗｅｌｌに、各ポリフェノール誘導体の濃度が０、２５、５０、７５、１００、１２５μＭの濃度になるように、また、各ｗｅｌｌの培地量が全量で３０μｌとなるように添加した。添加後、プレート毎に規定した時間について、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件下、インキュベーターで培養した。 After culturing, each well was added to each well so that the concentration of each polyphenol derivative was 0, 25, 50, 75, 100, and 125 μM, and the medium amount of each well was 30 μl in total. After the addition, the cells were cultured in an incubator at 37 ° C. in an atmosphere containing 5% carbon dioxide for the time specified for each plate.

培養後、各ｗｅｌｌにＭＴＴ溶液（３-（４，５−ジメチルチアゾ−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド；３-（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ、ＭＴＴ、の１５０ｍｇをＰＢＳの３０ｍｌに溶解したもの）を１０μｌずつ分注した。プレート毎に４時間、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件下、インキュベーターで培養した。培養終了後、各ｗｅｌｌに０．０４ＮＨＣｌ−イソプロパノール（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏl）溶液を１００μｌずつ分注した。室温で１０分間放置した後、マイクロプレートリーダーのマルチラベルカウンター（５９５ｎｍ）で吸光度を測定した。細胞生存率（％）として、ポリフェノールを添加していない（コントロール細胞の）吸光度から各ポリフェノールを添加した細胞の吸光度を引いたものを、コントロール細胞の吸光度で割った値に１００を乗じて算出した。 After the culture, MTT solution (3- (4,5-dimethylthiazo-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide; 3- (4,5-dimethylthiazo-2-yl) -2,5-diphenyl was added to each well. (Tetrazolium bromide, MTT, 150 mg dissolved in 30 ml of PBS) was dispensed in 10 μl aliquots. Each plate was cultured for 4 hours in an incubator at 37 ° C. in an atmosphere containing 5% carbon dioxide. After completion of the culture, 100 μl of 0.04N HCl-isopropanol solution was dispensed to each well. After standing at room temperature for 10 minutes, the absorbance was measured with a multi-label counter (595 nm) of a microplate reader. The cell viability (%) was calculated by subtracting the absorbance of cells to which each polyphenol was added from the absorbance to which no polyphenol was added (control cells), and multiplying by 100 by the absorbance of the control cells. .

［ＨＬ−６０細胞に対するアポトーシスの誘導方法］
ＨＬ−６０細胞の継代と各ポリフェノール誘導体の添加：
ＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地中のＨＬ−６０細胞の濃度が１ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／１ｍｌの濃度で継代された培養細胞液１ｍｌとＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地２ｍｌをシャーレ中で混合し（これを３ｍｌ細胞液という）、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件下、インキュベーターで２４時間培養した。これに各ポリフェノール誘導体を倍地中の濃度が０、２５、５０、７５、１００、１２５μＭとなるように添加し、規定時間について、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件下、インキュベーターで培養した。 [Induction of apoptosis for HL-60 cells]
Passage of HL-60 cells and addition of each polyphenol derivative:
1 ml of the cultured cell solution in which the concentration of HL-60 cells in the RMPI1640 (10% FBS +) medium was subcultured at a concentration of 1 × 10 ⁶ cells / 1 ml and 2 ml of the RMPI1640 (10% FBS +) medium were mixed in a petri dish (this The cells were cultured in an incubator for 24 hours under conditions of 37 ° C. in an atmosphere containing 5% carbon dioxide. To this, each polyphenol derivative was added so that the concentration in the medium would be 0, 25, 50, 75, 100, 125 μM, and cultured in an incubator at 37 ° C. in an atmosphere containing 5% carbon dioxide for a specified time. did.

アポトーシス誘導後のＨＬ−６０細胞からの核ＤＮＡの回収：
各ポリフェノール誘導体で規定時間処理した後、培地から細胞液を１５ｍｌチューブに回収した。１５ｍｌチューブで回収したＨＬ−６０細胞を、遠心分離（２０００ｒｐｍ、８分間）した後、上澄みを除去した。これに、予め氷冷しておいた滅菌ＰＢＳ溶液１ｍｌを加え、ＨＬ−６０細胞を懸濁し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに分注して遠心分離（２０００ｒｐｍ、８分間、４℃）を行った後、上澄みを除去した。各１．５ｍｌのエッペンドルフチューブにライシスバッファー（ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ）を２０μｌ加え、よく混和した。次に、各１．５ｍｌのエッペンドルフチューブにＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ、１ｍｇ／ｍｌ濃度）を５μｌ加え、よく混和し、水浴で加温（５０℃、３０分）した。加温後、各１．５ｍｌのエッペンドルフチューブにプロテイン分解酵素Ｋ（ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＫ、１０ｍｇ／ｍｌ濃度）を４０μｌ加え、よく混和し、水浴で加温（５０℃、３時間）し、冷後、-２０℃で保存した。 Recovery of nuclear DNA from HL-60 cells after induction of apoptosis:
After the treatment with each polyphenol derivative for a specified time, the cell solution was collected from the medium into a 15 ml tube. HL-60 cells collected in a 15 ml tube were centrifuged (2000 rpm, 8 minutes), and then the supernatant was removed. To this was added 1 ml of a sterile PBS solution that had been ice-cooled in advance, the HL-60 cells were suspended, dispensed into a 1.5 ml Eppendorf tube, and centrifuged (2000 rpm, 8 minutes, 4 ° C.). Thereafter, the supernatant was removed. 20 μl of lysis buffer was added to each 1.5 ml Eppendorf tube and mixed well. Next, 5 μl of RNase (RNase, 1 mg / ml concentration) was added to each 1.5 ml Eppendorf tube, mixed well, and heated in a water bath (50 ° C., 30 minutes). After heating, add 40 μl of protease K (proteinkinase K, 10 mg / ml concentration) to each 1.5 ml Eppendorf tube, mix well, warm in a water bath (50 ° C., 3 hours), cool, Stored at 20 ° C.

電気泳動法によるＨＬ−６０細胞の核ＤＮＡ断片化の観察法：
ＨＬ−６０細胞のＤＮＡ断片化については文献記載の方法で測定した（Ｈｏｕ、Ｄ．Ｘ．、ｅｔ．ａｌ．：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．、２３：２００３）。各１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに保存したＨＬ−６０細胞の処理溶液にローディングバッファーを添加し、よく混和後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１分間）を行い、核ＤＮＡ以外のたんぱく質を沈殿、除去した。予め電気泳動槽内にタエバッファー（ＴＡＥｂｕｆｆｅｒ）を満たしたアガロースゲルの各レーンに、遠心分離して除タンパクした核ＤＮＡを含む上澄み溶液を分注し、１００Ｖで泳動を開始した。電気泳動後、アガロースゲルを取り出し、シーソー上で揺らしながらエチジウムブロミドで１５分間染色する。染色した後、紫外線（ＵＶ、ＵＶトランスイルーミネーター）照射により、ＤＮＡの断片の様子を観察した。 Method for observing nuclear DNA fragmentation of HL-60 cells by electrophoresis:
The DNA fragmentation of HL-60 cells was measured by a method described in the literature (Hou, DX, et.al .: Int. J. Oncol., 23: 2003). A loading buffer was added to the treatment solution of HL-60 cells stored in each 1.5 ml Eppendorf tube, and after mixing well, centrifugation (10000 rpm, 1 minute) was performed to precipitate and remove proteins other than nuclear DNA. The supernatant solution containing nuclear DNA deproteinized by centrifugation was dispensed to each lane of an agarose gel in which an electrophoresis tank was previously filled with TAE buffer, and electrophoresis was started at 100V. After electrophoresis, the agarose gel is removed and stained with ethidium bromide for 15 minutes while shaking on a seesaw. After staining, the state of DNA fragments was observed by irradiation with ultraviolet rays (UV, UV transilluminator).

［抗酸化剤を用いたＨＬ−６０細胞の核ＤＮＡ断片化の阻害実験］
方法は前記したＨＬ−６０細胞に対するアポトーシスの誘導方法と同様である。各ポリフェノール誘導体の添加の１時間前に抗酸化剤を添加し、電気泳動法によるＨＬ−６０細胞の核ＤＮＡ断片化を観察した。添加した酸化剤は、３種類であった。抗酸化剤であるＮ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎ、ＮＡＣ）の１Ｍ溶液を３ｍｌ細胞液に１５μｌ添加した。抗酸化剤であるカタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ、ＣＡＴ）の１００Ｕ／μｌ溶液を３ｍｌ細胞液に３μｌ添加した。抗酸化剤であるアスコルビン酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ、ＡＡ）の４０ｍＭ溶液を３ｍｌ細胞液に４．５μｌ添加した。 [Inhibition experiment of nuclear DNA fragmentation of HL-60 cells using antioxidants]
The method is the same as the method for inducing apoptosis of HL-60 cells described above. Antioxidants were added 1 hour before the addition of each polyphenol derivative, and nuclear DNA fragmentation of HL-60 cells was observed by electrophoresis. Three kinds of oxidizing agents were added. 15 μl of a 1M solution of an antioxidant, N-acetyl-L-cysteine (NAC), was added to 3 ml cell solution. 3 μl of a 100 U / μl solution of catalase (CATalase, CAT), an antioxidant, was added to 3 ml cell solution. 4.5 μl of a 40 mM solution of ascorbic acid (AA), an antioxidant, was added to 3 ml cell solution.

［ＨＬ−６０細胞が産生する特異タンパク質の検出］
ＨＬ−６０細胞の継代と各ポリフェノール誘導体の添加：
ＨＬ−６０細胞が産生する特異タンパク質の検出については文献記載の方法で測定した（Ｈｏｕ、Ｄ．Ｘ．、ｅｔ．ａｌ．：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．、２３：２００３）。ＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地中のＨＬ−６０細胞の濃度が２ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／６ｍｌの濃度で継代された培養細胞液６ｍｌ（以下、６ｍｌ細胞液という）をシャーレに注入し、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件下、インキュベーターで２４時間培養した。これに各ポリフェノール誘導体を倍地中の濃度が０、２５、５０、７５、１００、１２５μＭとなるように添加し、規定時間について、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件下、インキュベーターで培養した。 [Detection of specific protein produced by HL-60 cells]
Passage of HL-60 cells and addition of each polyphenol derivative:
Detection of a specific protein produced by HL-60 cells was measured by a method described in the literature (Hou, DX, et.al .: Int. J. Oncol., 23: 2003). ⁶ ml of cultured cell solution (hereinafter referred to as 6 ml cell solution) in which the concentration of HL-60 cells in RMPI1640 (10% FBS +) medium was subcultured at a concentration of 2 × 10 ⁶ cells / ⁶ ml was injected into the petri dish, and 5% carbon dioxide. The cells were cultured for 24 hours in an incubator under conditions of 37 ° C. in the atmosphere. To this, each polyphenol derivative was added so that the concentration in the medium would be 0, 25, 50, 75, 100, 125 μM, and cultured in an incubator at 37 ° C. in an atmosphere containing 5% carbon dioxide for a specified time. did.

ＨＬ−６０細胞由来のタンパク質の回収：
各ポリフェノール誘導体で規定時間処理した後、培地から細胞液を５０ｍｌチューブに回収した。５０ｍｌチューブで回収したＨＬ−６０細胞を、遠心分離（２０００ｒｐｍ、８分間）した後、上澄みを除去した。これに、予め氷冷しておいた滅菌ＰＢＳ溶液１ｍｌを加え、ＨＬ−６０細胞を懸濁し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに分注して遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間、４℃）を行った後、上澄みを除去した。これに懸濁バッファー溶液（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｂｕｆｆｅｒ）を８０μｌ加え、超音波洗浄装置にてよく懸濁した。これにＳＤＳ溶液（５０％ＳＤＳを０．３ｍｌ、２００μＭＤＴＴを１２０μｌ、蒸留水を１８０μｌ混合した溶液）を８０μｌ加え、よく攪拌し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブの蓋をよく閉めたまま、加熱（１００℃、５分間）した。冷後、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブごと−８０℃で保存した。 Recovery of protein from HL-60 cells:
After treatment with each polyphenol derivative for a specified time, the cell solution was collected from the culture medium in a 50 ml tube. HL-60 cells collected in a 50 ml tube were centrifuged (2000 rpm, 8 minutes), and then the supernatant was removed. To this was added 1 ml of a sterile PBS solution that had been ice-cooled in advance, the HL-60 cells were suspended, dispensed into a 1.5 ml Eppendorf tube, and centrifuged (2000 rpm, 5 minutes, 4 ° C.). Thereafter, the supernatant was removed. To this, 80 μl of a suspension buffer solution (suspension buffer) was added and well suspended in an ultrasonic washing apparatus. Add 80 μl of SDS solution (mixed with 0.3 ml of 50% SDS, 120 μl of 200 μM DTT and 180 μl of distilled water), stir well, and heat (with the lid of the 1.5 ml Eppendorf tube well closed) (100 ° C., 5 minutes). After cooling, the entire 1.5 ml Eppendorf tube was stored at -80 ° C.

ウェスタンブロッティング：
予め電気泳動槽内にランニングバッファー（ｒｕｎｎｉｎｇｂｕｆｆｅｒ）を満たしたランニングゲル（ｒｕｎｎｉｎｇｇｅｌ）の各レーンに、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブごと−８０℃で保存し、解凍した溶液を分注し、１００Ｖ（１０〜２０ｍＡ）で泳動を開始した。電気泳動後、ランニングゲルを取り出し、目的としたタンパク質が泳動されたランニングゲルをカッターで切り出した。トランスファー装置にろ紙を３枚重ね、この上に切り出したランニングゲルを静置し、さらにこの上に、メンブラン、ろ紙を３枚重ね、蓋をした後、電流を流した（メンブラン面積ｘ２ｍＡの電流で２時間）。トランスファーの終了後、シーソー上で軽く揺らしながらメンブランをＴＢＳ（２５ｍｌ）に５分間浸漬し、次に、固定バッファー溶液（ｂｌｏｃｋｉｎｇｂｕｆｆｅｒ）の３０ｍｌに浸漬し（２時間）、タンパク質を固定化する。予め一次抗体を添加した一次抗体希釈バッファー溶液（ｐｒｉｍａｒｙａｎｔｉｂｏｄｙｄｉｌｕｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ）の１０ｍｌにタンパク質を固定化したメンブランをシーソー上で軽く揺らしながら１２時間以上反応した。反応後、ＴＢＳ−Ｔ（３０ｍｌ）でメンブランを洗浄し（５分間、３回）、予め２次抗体を添加した固定バッファー溶液（ｂｌｏｃｋｉｎｇｂｕｆｆｅｒ）の３０ｍｌに浸漬し（１時間）、２次抗体と反応した。反応後、ＴＢＳ−Ｔ（３０ｍｌ）でメンブランを洗浄し（５分間、３回）、自動化学発光検出装置でオートモニタリングを行い、メンブラン上のタンパク質を検出した。 Western blotting:
Store the 1.5 ml Eppendorf tube at −80 ° C. in each lane of a running gel previously filled with a running buffer in an electrophoresis tank, dispense the thawed solution, and add 100V ( The electrophoresis was started at 10-20 mA). After electrophoresis, the running gel was taken out, and the running gel on which the target protein was migrated was cut out with a cutter. Three pieces of filter paper are stacked on the transfer device, and the running gel cut out on this is left to stand. Further, three membranes and filter paper are stacked on the transfer device, and after covering, a current is passed (at a current of membrane area x 2 mA). 2 hours). After completion of the transfer, the membrane is immersed in TBS (25 ml) for 5 minutes while gently shaking on a seesaw, and then immersed in 30 ml of a blocking buffer (2 hours) to immobilize the protein. The reaction was performed for 12 hours or more while lightly shaking the membrane on which the protein was immobilized in 10 ml of a primary antibody dilution buffer solution (primary antibody dilution buffer) to which a primary antibody had been added in advance. After the reaction, the membrane was washed with TBS-T (30 ml) (5 minutes, 3 times), and immersed in 30 ml of a blocking buffer solution added with a secondary antibody in advance (1 hour). Reacted. After the reaction, the membrane was washed with TBS-T (30 ml) (5 minutes, 3 times), and auto-monitoring was performed with an automatic chemiluminescence detector to detect proteins on the membrane.

［抗酸化剤を用いたＨＬ−６０細胞の産生する特異タンパク質の活性阻害実験］
方法は前記したＨＬ−６０細胞が産生する特異タンパク質の検出と同様である。また、方法は、文献記載の方法で測定した（Ｈｏｕ、Ｄ．Ｘ．、ｅｔ．ａｌ．：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．、２３：２００３）。各ポリフェノール誘導体の添加の１時間前に抗酸化剤を添加し、ＨＬ−６０細胞が産生する特異タンパク質の活性阻害をウェスタンブロッティングにより観察した。添加した酸化剤は、３種類であった。抗酸化剤であるＮ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎ、ＮＡＣ）の１Ｍ溶液を６ｍｌ細胞液に３０μｌ添加した。抗酸化剤であるカタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ、ＣＡＴ）の１００Ｕ／μｌ溶液を６ｍｌ細胞液に６μｌ添加した。抗酸化剤であるアスコルビン酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ、ＡＡ）の４０ｍＭ溶液を６ｍｌ細胞液に９μｌ添加した。 [Experiment for Inhibiting Specific Protein Activity Produced by HL-60 Cells Using Antioxidants]
The method is the same as the detection of the specific protein produced by HL-60 cells described above. Moreover, the method was measured by the method of literature description (Hou, DX, et.al.:Int.J.Oncol., 23: 2003). Antioxidants were added 1 hour before the addition of each polyphenol derivative, and inhibition of the activity of specific proteins produced by HL-60 cells was observed by Western blotting. Three kinds of oxidizing agents were added. 30 μl of a 1 M solution of an antioxidant, N-acetyl-L-cysteine (NAC), was added to 6 ml cell solution. 6 μl of a 100 U / μl solution of catalase (CATalase, CAT), an antioxidant, was added to 6 ml cell solution. 9 μl of a 40 mM solution of ascorbic acid (AA), an antioxidant, was added to a 6 ml cell solution.

［ＨＬ−６０細胞内の過酸化水素発生によるアポトーシスの発現実験］
２ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／１ｍｌのＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地で継代したＨＬ−６０細胞を、平底の１ｐｌａｔｅ４８ｗｅｌｌの１ｗｅｌｌあたり２ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／４００μｌのＨＬ−６０細胞数になるように培地でＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地で希釈し、２ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／４００μｌのＨＬ−６０細胞を各ｗｅｌｌへ分注した。これを５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件で、インキュベーターで２４時間培養した。 [Experimental expression of apoptosis by hydrogen peroxide generation in HL-60 cells]
HL-60 cells subcultured with 2 × 10 ⁶ cells / 1 ml of RMPI 1640 (10% FBS +) medium were added to the medium so that the number of HL-60 cells was 2 × 10 ⁵ cells / 400 μl per well of 1 plate 48 well of flat bottom. The solution was diluted with RMPI1640 (10% FBS +) medium, and 2 × 10 ⁵ cells / 400 μl of HL-60 cells were dispensed into each well. This was cultured in an incubator for 24 hours under conditions of 37 ° C. in an atmosphere containing 5% carbon dioxide.

培養後各ｗｅｌｌに、各ポリフェノール誘導体の濃度が０、２５、５０、７５、１００、１２５μＭの濃度になるように、また、各ｗｅｌｌの培地量が全量で３０μｌとなるように添加した。添加後、プレート毎に規定した時間について、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件下、インキュベーターで１５分培養した。 After culturing, each well was added to each well so that the concentration of each polyphenol derivative was 0, 25, 50, 75, 100, and 125 μM, and the medium amount of each well was 30 μl in total. After the addition, the cells were cultured for 15 minutes in an incubator at 37 ° C. in an atmosphere containing 5% carbon dioxide for the time specified for each plate.

培養後、各ｗｅｌｌにＤＣＦＡ−ＤＡ溶液（ジクロロフルオレシン−ジアセテート；ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｃｉｎ−ｄｉａｃｅｔａｔｅ、の１ｍｇをエタノールの４１３μｌに溶解したもの）を１．６μｌずつ分注した。プレート毎に３０分間、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件下、インキュベーターで培養した。培養終了後、マイクロプレートリーダーで蛍光を測定した（励起波長：４８５ｎｍ、エミッション波長：５３０ｎｍ）。ポリフェノールを添加することによってＨＬ−６０細胞で発生する活性酸素量は次のようにして算出した。ポリフェノールを添加した、ＤＣＦＡ−ＤＡ溶液を加えたものと加えなかったものの蛍光を引いた値を分子として、ポリフェノールを添加しなかった細胞で、ＤＣＦＡ−ＤＡ溶液を加えたものと加えなかったものの蛍光を引いた値を分母として、これらの数値で計算した値を、活性酸素量として算出した。 After culturing, 1.6 μl of DCFA-DA solution (dichlorofluorescein-diacetate; 1 mg of dichlorofluorecin-diacetate) dissolved in 413 μl of ethanol was dispensed into each well. Each plate was cultured in an incubator for 30 minutes in an atmosphere containing 5% carbon dioxide at 37 ° C. After completion of the culture, fluorescence was measured with a microplate reader (excitation wavelength: 485 nm, emission wavelength: 530 nm). The amount of active oxygen generated in HL-60 cells by adding polyphenol was calculated as follows. Fluorescence of polyphenol-added and non-added DCFA-DA solutions, and cells with and without DCFA-DA solution, with the value obtained by subtracting the fluorescence of those with and without DCFA-DA solution as molecules. The value calculated by these values was calculated as the amount of active oxygen using the value obtained by subtracting as the denominator.

ポリフェノール誘導体のＨＬ−６０細胞のＤＮＡ断片化について検討した（Ｈｏｕ、Ｄ．Ｘ．、ｅｔ．ａｌ．：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．、２３：２００３）。各ポリフェノール誘導体（１）〜（２６）を１００μＭ濃度用いて、ＨＬ−６０細胞を６時間処理し、細胞核からＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡについてアガロースゲル電気泳動を行い、その結果を図１〜図３に示した。 The DNA fragmentation of polyphenol derivatives in HL-60 cells was examined (Hou, DX, et.al .: Int. J. Oncol., 23: 2003). HL-60 cells were treated with 100 μM concentration of each of the polyphenol derivatives (1) to (26) for 6 hours, and DNA was extracted from the cell nucleus. The obtained DNA was subjected to agarose gel electrophoresis, and the results are shown in FIGS.

化合物１１であるプロシアニジンＢ−４を除く、全てのポリフェノール誘導体によってＨＬ−６０細胞のＤＮＡが断片化されたことがわかる。図中Ｍと記載してあるものはＤＮＡマーカーを示す。図中Ｃと記載してあるものはコントロールを示す。図１中、ｅｃｇは（−）−エピカテキン３−ガレート、ｅｃは（−）−エピカテキン、ｃａは（＋）−カテキン、ｍｇは（−）−エピカテキン３−メチルガレートを示し、いずれも茶葉より単離されたものである。図２中、ｐＱと記載されてあるものは３−Ｏ−ｐ−クマロイルキナ酸、ｃａｆと記載されてあるものはカフェインで、いずれも茶葉より単離されたものである。図３中、ｔｒｉＧと記載されてあるものは、１，４，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコースであり、茶葉より単離されたものである。 It can be seen that the DNA of HL-60 cells was fragmented by all polyphenol derivatives except for compound 11, procyanidin B-4. What is described as M in the figure indicates a DNA marker. What is described as C in the figure indicates a control. In FIG. 1, ecg represents (−)-epicatechin 3-gallate, ec represents (−)-epicatechin, ca represents (+)-catechin, mg represents (−)-epicatechin 3-methylgallate, It is isolated from tea leaves. In FIG. 2, what is described as pQ is 3-Op-coumaroylquinic acid, and what is described as caf is caffeine, both of which are isolated from tea leaves. In FIG. 3, what is described as triG is 1,4,6-tri-O-galloyl-β-D-glucose, which is isolated from tea leaves.

プロアントシアニジン誘導体（６）〜（１０）（４β−８結合のプロアントシアニジン類）（表２）を、２５、５０、７５、１００、１２５μＭの濃度でＭＴＴａｓｓａｙを行い、ＨＬ−６０細胞に対する細胞増殖の抑制効果を調べた。その結果を表７に示した。表中のＩＣ_５０は、ＨＬ−６０細胞生存率に対する５０％抑制濃度を示す。 MTT assay of proanthocyanidin derivatives (6) to (10) (4β-8-linked proanthocyanidins) (Table 2) at concentrations of 25, 50, 75, 100, and 125 μM and cell growth on HL-60 cells The inhibitory effect of was investigated. The results are shown in Table 7. IC ₅₀ in the table indicates the 50% inhibitory concentration for HL-60 cell viability.

表７から、化合物９の（−）−エピガロカテキン（４β−８）（−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレートが最も低いＩＣ_５０の値を与え、したがって、最も強いＨＬ−６０細胞増殖抑制効果を有した。他のプロアントシアニジン誘導体（６）〜（８）、（１０）も強い抑制効果を示すことがわかる。 From Table 7, it can be seen that (−)-epigallocatechin (4β-8) (−)-epicatechin-3-O-gallate of compound 9 gave the lowest IC ₅₀ value and therefore the strongest HL-60 cell proliferation. Has a suppressive effect. It can be seen that the other proanthocyanidin derivatives (6) to (8) and (10) also show a strong inhibitory effect.

プロアントシアニジン誘導体（１１）〜（１５）（４α−８結合のプロアントシアニジン類）（表３）を、２５、５０、７５、１００、１２５μＭの濃度でＭＴＴａｓｓａｙを行い、ＨＬ−６０細胞に対する細胞増殖の抑制効果を調べた。その結果を表８に示した。表中のＩＣ_５０は、ＨＬ−６０細胞生存率に対する５０％抑制濃度を示す。 MTT assay of proanthocyanidin derivatives (11) to (15) (4α-8-linked proanthocyanidins) (Table 3) at concentrations of 25, 50, 75, 100, and 125 μM, and cell proliferation on HL-60 cells The inhibitory effect of was investigated. The results are shown in Table 8. IC ₅₀ in the table indicates the 50% inhibitory concentration for HL-60 cell viability.

表８から、化合物１４のプロデルフィニジンＢ−４が最も低いＩＣ_５０の値を与え、したがって、最も強いＨＬ−６０細胞増殖抑制効果を有した。プロシアニジンＢ−４（１１）はＨＬ−６０細胞に対する細胞増殖の抑制効果を示さない。他のプロアントシアニジン誘導体（１２）、（１３）、（１５）も強い抑制効果を示すことがわかる。 From Table 8, compound 14 prodelphinidin B-4 gave the lowest IC ₅₀ value and therefore had the strongest HL-60 cell growth inhibitory effect. Procyanidin B-4 (11) does not show an inhibitory effect on cell proliferation on HL-60 cells. It can be seen that the other proanthocyanidin derivatives (12), (13) and (15) also show a strong inhibitory effect.

表７と表８の結果から、プロアントシアニジン二量体の化学構造について、上部ユニットが２Ｒ、３Ｓ構造を有するものが、より強いＨＬ−６０細胞増殖の抑制効果を示した。また、上部ユニットのＢ環はピロガロールタイプであり、下部ユニットのＢ環はカテコールタイの化学構造を有するものが、より強いＨＬ−６０細胞増殖の抑制効果を示した。一方、上部と下部が同一ユニットであるプロアントシアニジンでは、ガロイル基の結合する数が増加するとＨＬ−６０細胞増殖の抑制効果が減少することがわかる。 From the results of Tables 7 and 8, regarding the chemical structure of the proanthocyanidin dimer, the upper unit having a 2R, 3S structure showed a stronger inhibitory effect on HL-60 cell proliferation. In addition, the ring B of the upper unit is a pyrogallol type, and the ring B of the lower unit having a chemical structure of catechol tie showed a stronger inhibitory effect on HL-60 cell proliferation. On the other hand, in the case of proanthocyanidins in which the upper and lower parts are the same unit, it can be seen that the inhibitory effect on the growth of HL-60 cells decreases as the number of galloyl group binding increases.

プロアントシアニジン誘導体のＨＬ−６０細胞のＤＮＡ断片化について検討した（Ｈｏｕ、Ｄ．Ｘ．、ｅｔ．ａｌ．：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．、２３：２００３）。各プロアントシアニジン誘導体（６）〜（１５）を７５μＭ濃度用いて、ＨＬ−６０細胞を６時間処理し、細胞核からＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡについてアガロースゲル電気泳動を行い、その結果を図４に示した。 The DNA fragmentation of proanthocyanidin derivatives in HL-60 cells was examined (Hou, DX, et.al .: Int. J. Oncol., 23: 2003). HL-60 cells were treated with 75 μM of each proanthocyanidin derivative (6) to (15) for 6 hours, and DNA was extracted from the cell nucleus. The obtained DNA was subjected to agarose gel electrophoresis, and the results are shown in FIG.

化合物１１であるプロシアニジンＢ−４を除く、全てのプロアントシアニジン誘導体によってＨＬ−６０細胞のＤＮＡが断片化されたことがわかる。中でも、化合物６のプロデルフィニジンＢ−２と化合物７のプロデルフィニジンＢ−２３−Ｏ−ガレートは、特に強くＨＬ−６０細胞のＤＮＡを断片化した。 It can be seen that the DNA of HL-60 cells was fragmented by all proanthocyanidin derivatives except for compound 11, procyanidin B-4. Among them, prodelphinidin B-2 of compound 6 and prodelphinidin B-2 3-O-gallate of compound 7 particularly strongly fragmented DNA of HL-60 cells.

プロデルフィニジンＢ−２（６）によるＨＬ−６０細胞のＤＮＡ断片化について、アポトーシスを誘導する最適時間と最適濃度を詳しく調べた。プロデルフィニジンＢ−２（６）を７５μＭで固定し、ＨＬ−６０細胞を０、２、４、６、１２、１８時間処理し、細胞核からＤＮＡを抽出した。一方、プロデルフィニジンＢ−２（６）を０、２５、５０、７５、１００、１２５μＭの濃度でＨＬ−６０細胞を６時間処理し、細胞核からＤＮＡを抽出した。各々得られた核由来のＤＮＡについて、アガロースゲル電気泳動を行い、その結果を図５に示した。プロデルフィニジンＢ−２（６）は、図５の（１）に示すようにＨＬ−６０細胞のＤＮＡを４時間以降に断片化を誘導し、その誘導は６時間で最大となった。図５の（２）に示すように濃度が上昇するに伴いＤＮＡを強く断片化し、７５μＭ以上からその誘導は最大となった。この結果から、プロデルフィニジンＢ−２（６）のアポトーシス誘導能は、図５の時間（１）と濃度（２）に依存した。図中Ｍと記載してあるものはＤＮＡマーカーを示す。 With respect to DNA fragmentation of HL-60 cells by prodelphinidin B-2 (6), the optimal time and optimal concentration for inducing apoptosis were examined in detail. Prodelphinidin B-2 (6) was fixed at 75 μM, HL-60 cells were treated for 0, 2, 4, 6, 12, 18 hours, and DNA was extracted from the cell nucleus. On the other hand, HL-60 cells were treated with prodelphinidin B-2 (6) at concentrations of 0, 25, 50, 75, 100, and 125 μM for 6 hours, and DNA was extracted from the cell nucleus. Each obtained nuclear DNA was subjected to agarose gel electrophoresis, and the results are shown in FIG. Prodelphinidin B-2 (6) induced fragmentation of the DNA of HL-60 cells after 4 hours as shown in (1) of FIG. 5, and the induction reached its maximum after 6 hours. As shown in (2) of FIG. 5, the DNA was strongly fragmented as the concentration increased, and the induction was the maximum from 75 μM or more. From these results, the ability of prodelphinidin B-2 (6) to induce apoptosis depended on time (1) and concentration (2) in FIG. What is described as M in the figure indicates a DNA marker.

プロデルフィニジンＢ−２（６）によるＨＬ−６０細胞のカスパーゼ３、ポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ、ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、カスパーゼ９、カスパーゼ８の活性について調べた。方法は、文献記載の方法で測定した（Ｈｏｕ、Ｄ．Ｘ．、ｅｔ．ａｌ．：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．、２３：２００３）。その結果を図６に示す。図６の（１）に示すように、プロデルフィニジンＢ−２（６）により４時間後、カスパーゼ３が切断され、活性化された。また、図６の（２）および（３）に示すように、ＰＡＲＰおよびカスパーゼ９も同様に４時間後切断され、活性化された。図６の（４）に示すように、カスパーゼ９は２時間後に切断が起こり、活性化された。この結果、プロデルフィニジンＢ−２（６）は、カスパーゼ８を活性化し、続いてカスパーゼ３を活性化する。また、ミトコンドリアを経由してカスパーゼ９を刺激し、同様にカスパーゼ３を活性化し、ＤＮＡが断片化されてアポトーシスを発現することがわかる。 The activity of caspase 3 in HL-60 cells, poly ADP-ribose polymerase (PARP, poly (ADP-ribose) polymerase), caspase 9 and caspase 8 by prodelphinidin B-2 (6) was examined. The method was measured by the method described in the literature (Hou, DX, et.al .: Int. J. Oncol., 23: 2003). The result is shown in FIG. As shown in (1) of FIG. 6, caspase 3 was cleaved and activated after 4 hours by prodelphinidin B-2 (6). Further, as shown in (2) and (3) of FIG. 6, PARP and caspase 9 were similarly cleaved after 4 hours and activated. As shown in (4) of FIG. 6, caspase 9 was cleaved after 2 hours and activated. As a result, prodelphinidin B-2 (6) activates caspase 8 and subsequently caspase 3. It can also be seen that caspase 9 is stimulated via mitochondria, caspase 3 is similarly activated, and DNA is fragmented to express apoptosis.

プロデルフィニジンＢ−２（６）がＨＬ−６０細胞内の過酸化水素を発生するかどうかについて、ＤＣＦＨ−ＤＡを用いて調べた。その結果を図４に示した。図７の（１）に示すように、プロデルフィニジンＢ−２（６）の添加濃度が上がるにつれて、細胞内の相対活性酸素量も増加した。また、図７の２に示すように、プロデルフィニジンＢ−２（６）の濃度を７５μＭに固定して経時的変化を観察したところ、細胞内の相対活性酸素量は１５分の誘導時間で約１１倍量となることがわかる。 Whether prodelphinidin B-2 (6) generates hydrogen peroxide in HL-60 cells was examined using DCFH-DA. The results are shown in FIG. As shown in (1) of FIG. 7, the amount of relative active oxygen in the cell increased as the concentration of prodelphinidin B-2 (6) increased. Further, as shown in FIG. 7-2, when the concentration of prodelphinidin B-2 (6) was fixed at 75 μM and the change with time was observed, the intracellular relative active oxygen amount was about 15 minutes after the induction time of 15 minutes. It turns out that it becomes 11 times amount.

プロデルフィニジンＢ−２（６）によるＨＬ−６０細胞のＤＮＡ断片化が活性酸素を介して発現するかどうかを確かめるため、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、カタラーゼ、およびアスコルビン酸の三つの抗酸化剤を用いて調べた。ＮＡＣとカタラーゼは、プロデルフィニジンＢ−２（６）処理の１時間前に培地に添加した。その結果を図８に示す。ＮＡＣ処理区とカタラーゼ処理区では、プロデルフィニジンＢ−２によるＨＬ−６０細胞のＤＮＡ断片化は認められなかった。また、アスコルビン酸処理区では、ＤＮＡ断片化が認められた。この結果、ＮＡＣとカタラーゼの抗酸化剤がプロデルフィニジンＢ−２によるＤＮＡ断片化を抑制したことが分かり、結果として、プロデルフィニジンＢ−２（６）が活性酸素を介してカスパーゼ８を活性化し、ＨＬ−６０細胞のＤＮＡを断片化したことがわかる。 To determine whether DNA fragmentation of HL-60 cells by prodelphinidin B-2 (6) is expressed via active oxygen, three antioxidants, N-acetylcysteine (NAC), catalase, and ascorbic acid It investigated using. NAC and catalase were added to the medium 1 hour before treatment with prodelphinidin B-2 (6). The result is shown in FIG. In the NAC treatment group and the catalase treatment group, DNA fragmentation of HL-60 cells by prodelphinidin B-2 was not observed. Further, DNA fragmentation was observed in the ascorbic acid-treated section. As a result, it was found that the antioxidants of NAC and catalase suppressed DNA fragmentation by prodelphinidin B-2. As a result, prodelphinidin B-2 (6) activated caspase 8 via active oxygen, It can be seen that the DNA of HL-60 cells was fragmented.

Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、カタラーゼ、およびアスコルビン酸の三つの抗酸化剤が、プロデルフィニジンＢ−２（６）のＨＬ−６０細胞内の過酸化水素の発生を阻害するかどうかについて、ＤＣＦＨ−ＤＡを用いて調べた。その結果を図９に示した。ＮＡＣ処理区とカタラーゼ処理区では、プロデルフィニジンＢ−２によるＨＬ−６０細胞内の過酸化水素の発生を阻害した。また、アスコルビン酸処理区でも、プロデルフィニジンＢ−２によるＨＬ−６０細胞内の過酸化水素の発生を阻害した。この結果、プロデルフィニジンＢ−２（６）がＨＬ−６０細胞内の活性酸素を産生することがわかる。 Regarding whether three antioxidants of N-acetylcysteine (NAC), catalase, and ascorbic acid inhibit the generation of hydrogen peroxide in HL-60 cells of prodelphinidin B-2 (6), DCFH − Investigated using DA. The results are shown in FIG. In the NAC treatment group and the catalase treatment group, generation of hydrogen peroxide in HL-60 cells by prodelphinidin B-2 was inhibited. Moreover, also in the ascorbic acid treatment group, generation | occurrence | production of the hydrogen peroxide in HL-60 cell by prodelphinidin B-2 was inhibited. As a result, it can be seen that prodelphinidin B-2 (6) produces active oxygen in HL-60 cells.

テアシネンシン誘導体（２０）〜（２４）（表６）とエピガロカテキン３−Ｏ−ガレート（２）を、２５、５０、１００、２００μＭの濃度でＭＴＴａｓｓａｙを行い、ＬｏＶｏ細胞に対する細胞増殖の抑制効果を調べた。その結果を図１０に示した。テアシネンシンＥ（２４）を除く全てのテアシネンシン類にＬｏＶｏ細胞の増殖を抑制する効果があることがわかる。この結果より、ＩＣ_５０を算出した。その結果を表９に示す。表中のＩＣ_５０は、ＬｏＶｏ細胞生存率に対する５０％抑制濃度を示す。 The effect of inhibiting cell proliferation on LoVo cells by performing MTT assay with theacinensin derivatives (20) to (24) (Table 6) and epigallocatechin 3-O-gallate (2) at concentrations of 25, 50, 100 and 200 μM I investigated. The results are shown in FIG. It can be seen that all theasinensins except theacinensin E (24) have an effect of suppressing the growth of LoVo cells. From this result, IC ₅₀ was calculated. The results are shown in Table 9. IC ₅₀ in the table indicates a 50% inhibitory concentration for LoVo cell viability.

表８から、化合物２０のテアシネンシンＡが最も低いＩＣ_５０の値を与えた。したがって、最も強いＬｏＶｏ細胞増殖抑制効果を有した。フラバン骨格の３位にガロイル基の結合する数が増すにつれて活性がつよくなることがわかる。 From Table 8, theasinensin A of compound 20 gave the lowest IC ₅₀ value. Therefore, it had the strongest LoVo cell proliferation inhibitory effect. It can be seen that the activity increases as the number of galloyl groups bonded to the 3-position of the flavan skeleton increases.

テアシネンシンＡ（２０）によるＬｏＶｏ細胞のＤＮＡ断片化について、アポトーシスを誘導する最適濃度を詳しく調べた。テアシネンシンＡ（２０）を０、２５、５０、１００μＭの濃度でＬｏＶｏ細胞を４８時間処理し、細胞核からＤＮＡを抽出した。各々得られた核由来のＤＮＡについて、アガロースゲル電気泳動を行い、その結果を図１１に示した。図１１に示すように、濃度が上昇するに伴いＬｏＶｏ細胞のＤＮＡを強く断片化することがわかる。図中Ｍと記載してあるものはＤＮＡマーカーを示す。図中Ｃと記載してあるものはコントロールを示す。 Regarding the DNA fragmentation of LoVo cells by theacinensin A (20), the optimal concentration for inducing apoptosis was examined in detail. LoVo cells were treated with theasinensin A (20) at concentrations of 0, 25, 50, and 100 μM for 48 hours, and DNA was extracted from the cell nuclei. Each obtained nuclear DNA was subjected to agarose gel electrophoresis, and the results are shown in FIG. As shown in FIG. 11, it can be seen that the DNA of LoVo cells is strongly fragmented as the concentration increases. What is described as M in the figure indicates a DNA marker. What is described as C in the figure indicates a control.

テアシネンシンＡ（２０）によるＬｏＶｏ細胞のポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ、ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）の活性について調べた。方法は、文献記載の方法で測定した（Ｈｏｕ、Ｄ．Ｘ．、ｅｔ．ａｌ．：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．、２３：２００３）。その結果を図１２に示す。図１２に示すように、ＰＡＲＰは４８時間後切断され、活性化された。また、テアシネンシンＡ（２０）の濃度が上昇すると強くＰＡＲＰを活性化することがわかる。 The activity of polyADP-ribose polymerase (PARP, poly (ADP-ribose) polymerase) in LoVo cells by theacinensin A (20) was examined. The method was measured by the method described in the literature (Hou, DX, et.al .: Int. J. Oncol., 23: 2003). The result is shown in FIG. As shown in FIG. 12, PARP was cleaved after 48 hours and activated. It can also be seen that PARP is strongly activated when the concentration of theacinensin A (20) increases.

［ウーロンホモビスフラバンＡ（１６）およびモノデスガロイルウーロンホモビスフラバンＡ（１７）の合成］
５ｇの（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（２）を４０ｍｌのエタノールに溶解する。これに、１規定塩酸−エタノール溶液を加える。これを室温下攪拌しながら、４％ホルマリン−エタノール溶液７０ｍｌを約１時間かけて滴下する。反応液は直接、デキストランゲル（セファデックスＬＨ−２０）のカラムクロマトグラフィーに付し、分画した。各分画はさらにポリスチレンゲル（ＭＣＩｇｅｌＣＨＰ−２０Ｐ）、オーディーエス（ＯＤＳ）のカラムクロマトを繰り返し行い、３４４ｍｇの化合物（１６）と１８８ｍｇの化合物（１７）とを合成した。 [Synthesis of oolong homobisflavan A (16) and monodesgaloyl oolong homobisflavan A (17)]
5 g of (−)-epigallocatechin-3-O-gallate (2) is dissolved in 40 ml of ethanol. To this, 1N hydrochloric acid-ethanol solution is added. While stirring this at room temperature, 70 ml of 4% formalin-ethanol solution is added dropwise over about 1 hour. The reaction mixture was directly subjected to dextran gel (Sephadex LH-20) column chromatography and fractionated. Each fraction was further subjected to polystyrene chromatography (MCI gel CHP-20P) and ODDS (ODS) column chromatography to synthesize 344 mg of compound (16) and 188 mg of compound (17).

［テアシネンシンＡ（２０）とテアシネンシンＤ（２３）の合成］
１０ｇの（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（２）を５００ｍｌの蒸留水に溶解する。予め、フェリシアン化カリウム（Ｋ_３Ｆｅ（ＣＮ）_６）（６ｇ）と炭酸水素ナトリウム（６ｇ）を１００ｍｌの蒸留水に溶解した溶液を、氷冷下攪拌しながら１時間かけて滴下した。反応液は直接、ポリスチレンゲル（ＭＣＩｇｅｌＣＨＰ−２０Ｐ）に付し、分画した。各分画はさらにデキストランゲル（セファデックスＬＨ−２０）、オーディーエス（ＯＤＳ）のカラムクロマトを繰り返し行い、３９２ｍｇの化合物（２０）と８９ｍｇの化合物（２３）とを合成した。 [Synthesis of Theasinensin A (20) and Theasinensin D (23)]
10 g of (−)-epigallocatechin-3-O-gallate (2) is dissolved in 500 ml of distilled water. A solution prepared by previously dissolving potassium ferricyanide (K ₃ Fe (CN) ₆ ) (6 g) and sodium hydrogen carbonate (6 g) in 100 ml of distilled water was added dropwise over 1 hour with stirring under ice cooling. The reaction solution was directly applied to polystyrene gel (MCI gel CHP-20P) and fractionated. Each fraction was further subjected to column chromatography of dextran gel (Sephadex LH-20) and ODS (ODS) to synthesize 392 mg of compound (20) and 89 mg of compound (23).

アガロースゲル電気泳動の図である。（実施例８）It is a figure of agarose gel electrophoresis. (Example 8) アガロースゲル電気泳動の図である。（実施例８）It is a figure of agarose gel electrophoresis. (Example 8) アガロースゲル電気泳動の図である。（実施例８）It is a figure of agarose gel electrophoresis. (Example 8) アガロースゲル電気泳動の図である。（実施例１１）It is a figure of agarose gel electrophoresis. (Example 11) アガロースゲル電気泳動の図である。（実施例１２）（１）ＤＮＡ断片化の経時的変化（２）ＤＮＡ断片化の濃度的変化It is a figure of agarose gel electrophoresis. (Example 12) (1) Change with time of DNA fragmentation (2) Concentration change of DNA fragmentation ウエスタンブロッティングの図である。（実施例１３）（１）カスパーゼ３の活性化ＰＡＲＰの活性化（３）カスパーゼ９の活性化（４）カスパーゼ８の活性化It is a figure of western blotting. Example 13 (1) Activation of caspase 3 Activation of PARP (3) Activation of caspase 9 (4) Activation of caspase 8 相対活性酸素量の図である。（実施例１４）（１）活性酸素の濃度的変化（２）活性酸素の経時的変化It is a figure of a relative active oxygen amount. Example 14 (1) Concentration change of active oxygen (2) Change of active oxygen over time アガロースゲル電気泳動の図である。（実施例１５）It is a figure of agarose gel electrophoresis. (Example 15) 相対活性酸素量の図である。（実施例１６）It is a figure of a relative active oxygen amount. (Example 16) ＬｏＶｏ細胞生存率（％）の図である。（実施例１７）It is a figure of LoVo cell viability (%). (Example 17) アガロースゲル電気泳動の図である。（実施例１８）It is a figure of agarose gel electrophoresis. (Example 18) ウエスタンブロッティングの図でＰＡＲＰの活性化の図である。（実施例１９）It is a figure of activation of PARP in the figure of Western blotting. (Example 19)

Claims

An apoptosis inducer containing a polyphenol derivative as an active ingredient.

Polyphenol derivatives are (-)-epigallocatechin (1), (-)-epigallocatechin-3, 5-di-O-gallate (5-)-epigallocatechin 3, 5-di-O-gallate (3) , (+)-Gallocatechin (4), 8-C-ascorbyl epigallocatechin (5), prodelphinidin B-2 (6), prodelphinidin B-2 3'-O-gallate (prodelphidin B-2 3'-O-gallate) (7), prodelphinidin B-2 3, 3'-di-O-gallate (prodelphindin B-2 3, 3'- d i-O-gallate) (8), (−)-epigallocatechin (4β-8) (−)-epicatechin-3-O-gallate (epigallocatechin (4β-8) epicatechin-3-O-gallate) ( 9), (−)-epigallocatechin-3-O-gallate (4β-8) (−)-epicatechin-3-O-gallate (4β-8) epicatechin-3- O-gallate (10), procyanidin B-4 (procyanidin B-4) (11), (+)-gallocatechin (4α-8) (−)-epicatechin (4α-8) epicatechin (12), (+)-Catechin (4α-8) (−)-epiga Catechin (4α-8) epigallocin (13), prodelphinidin B-4 (prodelphindin B-4) (14), prodelphinidin B-4 3′-O-gallate (prodelphindin B-4 3′-O—) gallate) (15), oolong homobisflavan A (16), monodesgalloyl oolong homobisflavan A (17), assamicaine Aminassain A B) (19), theasinensin B (21), theasinensin C (t Heasinensin C) (22), theasinensin D (23), theasinensin E (24), strictinin (25), gallic acid (26) Item 1. The apoptosis inducer according to Item 1.

The apoptosis-inducing agent according to claim 1 or 2, wherein the polyphenol derivative is extracted from so-called tea leaves such as green tea, oolong tea, and black tea, and is used for cancer disease cells.

The apoptosis-inducing agent according to claim 1, wherein the polyphenol derivative is (-)-epigallocatechin-3-O-gallate (2), theasinensin A (20). .

The apoptosis-inducing agent according to claim 1 or 4, wherein the polyphenol derivative is extracted from so-called tea leaves such as green tea, oolong tea, and black tea, and is used for cancer disease cells (excluding lymphocyte cancer cells of U937).

The polyphenol derivative is extracted from so-called tea leaves such as green tea, oolong tea, black tea, and the like for human acute promyelocytic leukemia disease cells (HL-60 cells) and human colon cancer cells (LoVo). 6. The apoptosis inducer according to any one of 5 above.

The apoptosis-inducing agent according to any one of claims 1 to 6, wherein the cancer disease cell is gastric cancer, lung cancer, pancreatic cancer, kidney cancer, colon cancer, or blood cancer.

The apoptosis-inducing agent according to any one of claims 1 to 7, wherein a polyphenol derivative is synthesized and is used for cancer disease cells.

Induction of apoptosis according to any one of claims 1 to 8, wherein a polyphenol derivative is synthesized, which is for human acute promyelocytic leukemia disease cells (HL-60 cells) and human colon cancer cells (LoVo cells). Agent.