JP2005065661A - ROLE OF Id IN ACTIVATION OF VEGF-INDUCING PROPERTY IN HUMAN BLOOD VESSEL ENDOTHELIAL CELL AND IN ANGIOGENESIS - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、内皮細胞におけるIdタンパク質の発現調節を行なうことにより血管新生を促進又は阻害する方法に関する。 The present invention relates to a method for promoting or inhibiting angiogenesis by regulating the expression of Id protein in endothelial cells.
関節リウマチ (Rheumatoid arthritis: RA)は、関節の炎症と、それに続いて起こる骨や軟骨の破壊によって特徴付けられ、自己免疫の関与が想定される疾患である。RAにおいては、線維芽細胞様滑膜の異常増殖とそれに伴う炎症性細胞の関節部位への遊走(非特許文献１）及び滑膜への浸潤、炎症性サイトカインの産生(非特許文献２）、血管新生(非特許文献３）等の現象が関節破壊の場で生じることが知られている。 Rheumatoid arthritis (RA) is a disease characterized by joint inflammation followed by bone and cartilage destruction and is expected to involve autoimmunity. In RA, abnormal proliferation of fibroblast-like synovium and accompanying migration of inflammatory cells to the joint site (Non-patent Document 1) and infiltration into the synovium, production of inflammatory cytokines (Non-patent Document 2), It is known that phenomena such as angiogenesis (Non-patent Document 3) occur in the field of joint destruction.
本発明者は、以前の研究において、RA及び変形性関節症（osteoarthritis: OA）の滑膜組織におけるmRNA発現プロフィールの比較によって、RA滑膜組織におけるID（inhibitor of DNA binding/differentiation）遺伝子群の発現が増強すること、並びにId1及びId3タンパク質がRA滑膜組織内の血管内皮細胞に局在することを見出した(非特許文献４）。Idタンパク質は、Id1〜Id4で構成される分子群であり、いずれもへリックスループ-へリックス（HLH）ドメインを有するが、DNAへの結合に必要な塩基性領域を欠いている(非特許文献５）。元来、Idタンパク質は、その構造上の理由からMyoDやRbなどの塩基性HLH転写因子に対するドミナントネガティブな拮抗分子として同定されており(非特許文献５、６）、分化の過程において非常に重要な働きをすると考えられている(非特許文献７、８、９、10、11）。これらの分子は胎生期の組織やいくつかの癌細胞中において強い発現が確認されているのに対し(非特許文献12）、分化段階ではその発現が抑えられていることが知られている(非特許文献13、14）。また、Idは細胞増殖や細胞周期の前進（例えばG1期からS期への移行）も司っている(非特許文献15）。
In a previous study, the present inventor has compared the mRNA expression profiles in RA and osteoarthritis (OA) synovial tissues to identify the ID (inhibitor of DNA binding / differentiation) genes in RA synovial tissues. It was found that expression is enhanced, and Id1 and Id3 proteins are localized in vascular endothelial cells in RA synovial tissue (Non-patent Document 4). The Id protein is a molecular group composed of Id1 to Id4, all having a helix loop-helix (HLH) domain, but lacking a basic region necessary for binding to DNA (Non-Patent Document) 5). Originally, Id protein has been identified as a dominant negative antagonist molecule against basic HLH transcription factors such as MyoD and Rb for structural reasons (Non-Patent Documents 5 and 6) and is very important in the process of differentiation. (Non-Patent Documents 7, 8, 9, 10, and 11). These molecules are known to be strongly expressed in embryonic tissues and some cancer cells (Non-patent Document 12), but their expression is known to be suppressed at the differentiation stage ( Non-patent
これまでに、Idは細胞周期の制御を行うp16遺伝子のプロモーター領域の転写を促進するEts1、Ets2又はbHLH転写因子に直接結合してその作用を阻害し、p16タンパク質(非特許文献16）の発現を抑えることによって、細胞周期の停止を阻害することが知られている。これまでの報告によれば、Ras-ERK MAPKカスケード(非特許文献17）やSmad1/5のシグナル(非特許文献18）を受けてId3の転写が誘導されるということが知られている。 So far, Id directly binds to Ets1, Ets2, or bHLH transcription factors that promote transcription of the promoter region of the p16 gene that regulates the cell cycle and inhibits its action, and expression of p16 protein (Non-patent Document 16) It is known to inhibit cell cycle arrest by suppressing. According to previous reports, it is known that transcription of Id3 is induced by receiving a Ras-ERK MAPK cascade (Non-patent Document 17) and a signal of Smad1 / 5 (Non-patent Document 18).
近年の研究によって、上記以外のIdの新たな機能が明らかになっている。例えば、Id1+/-Id3-/-マウスでは移植された腫瘍組織の増殖にとって必要な血管新生が起きず(非特許文献19）、癌の進行は進まなかった。このことは、成熟した組織内での血管新生にはId1及びId3の存在が必須であるということを示している。成人の組織において、血管新生は、癌にのみ起こる現象ではなく、RAのような慢性炎症疾患についても同様に観察される現象である。 Recent research has revealed new functions of Id other than the above. For example, in Id1 +/− Id3 − / − mice, angiogenesis necessary for the growth of transplanted tumor tissue did not occur (Non-patent Document 19), and cancer progression did not progress. This indicates that the presence of Id1 and Id3 is essential for angiogenesis in mature tissues. In adult tissues, angiogenesis is not only a phenomenon that occurs in cancer, but is also a phenomenon that is observed for chronic inflammatory diseases such as RA.
一方、ID遺伝子ノックアウトマウスでは癌において血管新生が抑制されたことから、ID遺伝子は、血管新生を伴う増殖性疾患の治療標的の可能性を有することが記載されている（WO01/66784号：特許文献１）。また、ID遺伝子を標的としたアンチセンス化合物も開示されている（米国特許第6372433号：特許文献２）。 On the other hand, since angiogenesis was suppressed in cancer in ID gene knockout mice, it has been described that the ID gene has a potential therapeutic target for proliferative diseases associated with angiogenesis (WO01 / 66784: Patent) Reference 1). An antisense compound targeting the ID gene is also disclosed (US Pat. No. 6,372,433: Patent Document 2).
しかし、ヒトの炎症性疾患に関連するIdの重要性は知られていない。
本発明は、内皮細胞における血管新生を促進又は阻害する方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for promoting or inhibiting angiogenesis in endothelial cells.
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行なった結果、Idタンパク質の発現を促進又は阻害することにより上記課題を解決し得ることに成功し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor succeeded in solving the above problems by promoting or inhibiting the expression of Id protein, thereby completing the present invention.
すなわち、本発明は以下の通りである。 That is, the present invention is as follows.
(1) 血管内皮細胞（例えばヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞(HUVEC)、以下同様）においてIdタンパク質の発現を抑制することを特徴とする血管新生の阻害方法。 (1) A method for inhibiting angiogenesis, comprising suppressing the expression of Id protein in vascular endothelial cells (for example, human umbilical vein-derived vascular endothelial cells (HUVEC), the same applies hereinafter).
この場合、Idタンパク質の発現抑制はRNA干渉(RNAi)を利用することができ、例えばショートヘアピンRNA(shRNA)を用いることができる。shRNAによってId1及び/又はId3タンパク質の発現が抑制される。 In this case, suppression of Id protein expression can utilize RNA interference (RNAi), for example, short hairpin RNA (shRNA). The expression of Id1 and / or Id3 protein is suppressed by shRNA.
上記shRNAとしては、ID1 shRNA及び/又はID3 shRNAが挙げられる。ID1 shRNAは、配列番号１〜５に示されるいずれかの塩基配列を含むものからなる群から選択される少なくとも１つを例示することができ、ID3 shRNAは、配列番号６〜８に示されるいずれかの塩基配列を含むものからなる群から選択される少なくとも１つを例示することができる。
(2) 血管内皮細胞（例えばHUVEC）においてIdタンパク質の発現を誘導することを特徴とする血管新生の促進方法。
Examples of the shRNA include ID1 shRNA and / or ID3 shRNA. The ID1 shRNA can be exemplified by at least one selected from the group consisting of any of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 5, and the ID3 shRNA can be any of those shown in SEQ ID NOs: 6-8. Examples thereof include at least one selected from the group consisting of those containing the nucleotide sequence.
(2) A method for promoting angiogenesis, which comprises inducing expression of Id protein in vascular endothelial cells (for example, HUVEC).
血管内皮細胞を血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）等の血管新生促進因子を作用させると、Idタンパク質の発現を誘導することができる。発現が誘導されるIdタンパク質は、例えばId1タンパク質及び/又はId3タンパク質である。 When angiogenesis promoting factors such as vascular endothelial growth factor (VEGF) and transforming growth factor β (TGFβ) are allowed to act on vascular endothelial cells, the expression of Id protein can be induced. The Id protein from which expression is induced is, for example, an Id1 protein and / or an Id3 protein.
(3) 発現を阻害する対象mRNAにおける５’末端近傍から“aa”又は“a”で始まる配列を標的配列として設計されたshRNA。 (3) shRNA designed using a sequence beginning with “aa” or “a” from the vicinity of the 5 ′ end in the target mRNA to inhibit expression as a target sequence.
上記shRNAは、72塩基以下の長さの配列からなるものが好ましい。本発明において使用されるshRNAとしては、例えばID1 shRNA又はID3 shRNAが挙げられる。ID1 shRNAは、配列番号１〜５に示されるいずれかの塩基配列を含むものからなる群から選択される少なくとも１つであり、ID3 shRNAは、配列番号６〜８に示されるいずれかの塩基配列を含むものからなる群から選択される少なくとも１つである。これらのshRNAは、RNAiにより標的mRNAの発現を阻害することが可能である。
(4) 前記(3)記載のshRNAを含む医薬組成物。
The shRNA is preferably composed of a sequence having a length of 72 bases or less. Examples of the shRNA used in the present invention include ID1 shRNA and ID3 shRNA. ID1 shRNA is at least one selected from the group consisting of any one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 5, and ID3 shRNA is any one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 6 to 8. Is at least one selected from the group consisting of: These shRNAs can inhibit target mRNA expression by RNAi.
(4) A pharmaceutical composition comprising the shRNA according to (3).
上記医薬組成物は、例えば遺伝子治療剤として用いることができる。治療の対象となる疾患は、例えば関節リウマチが挙げられる。
(5) Idタンパク質をコードする遺伝子を含む医薬組成物。
The pharmaceutical composition can be used, for example, as a gene therapy agent. Examples of the disease to be treated include rheumatoid arthritis.
(5) A pharmaceutical composition comprising a gene encoding an Id protein.
上記医薬組成物は、例えば遺伝子治療剤として用いることができる。治療の対象となる疾患は、例えば循環器系疾患である。 The pharmaceutical composition can be used, for example, as a gene therapy agent. The disease to be treated is, for example, a circulatory system disease.
本発明により、Idタンパク質の発現調節（促進又は阻害）方法が提供される。Idタンパク質の発現を阻害することは、血管新生の阻害又は抑制を引き起こすことができるため、例えばRAに対する新規治療法として有用である。 The present invention provides a method for regulating (promoting or inhibiting) the expression of Id protein. Inhibiting the expression of Id protein is useful as a novel therapeutic method for RA, for example, because it can cause inhibition or suppression of angiogenesis.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明は、血管内皮細胞においてIdタンパク質（単にIdともいう）の発現を誘導することによって血管新生を促進させる方法を提供する。また、内皮細胞においてIdタンパク質の発現を抑制することで血管新生を阻害する方法も提供する。
１．概要
関節リウマチ(RA)病変の主座である関節では滑膜組織の異常増殖が認められ、血管新生が滑膜細胞増殖の重要なステップであることが知られている。以前、本発明者はRA患者由来滑膜組織中の血管内皮細胞において、Idタンパク質をコードする遺伝子（ID遺伝子（単にIDともいう））の発現が上昇していることを報告した。そこで本発明において、血管新生におけるIdの役割を明らかにするために、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞(HUVEC)を用いてIdの機能解析を行なうことによって、RAの病態上重要である慢性炎症及び血管新生と、Idの血管内皮細胞中での働きとの関連を検討した。
The present invention provides a method of promoting angiogenesis by inducing the expression of Id protein (also simply referred to as Id) in vascular endothelial cells. Also provided is a method of inhibiting angiogenesis by suppressing Id protein expression in endothelial cells.
1. Overview Abnormal growth of synovial tissue is observed in joints, which are the mainstay of rheumatoid arthritis (RA) lesions, and angiogenesis is known to be an important step in synovial cell proliferation. Previously, the present inventor reported that the expression of an Id protein-encoding gene (ID gene (also simply referred to as ID)) is elevated in vascular endothelial cells in RA patient-derived synovial tissue. Therefore, in the present invention, in order to clarify the role of Id in angiogenesis, by performing functional analysis of Id using human umbilical vein-derived vascular endothelial cells (HUVEC), chronic inflammation that is important in the pathology of RA and We investigated the relationship between angiogenesis and the action of Id in vascular endothelial cells.
本発明者は、RA滑膜内の血管内皮細胞内にIdが過剰発現することは、RAの滑膜組織で典型的に見られる炎症や血管新生にIdが関与していることを意味すると考えた。そして、Idは増殖性の細胞以外での成人の各組織において、非常に弱い発現しか観察されていないという理由から、Idの制御による血管新生の抑制がRAの有効な治療ターゲットになりうると考えた。 The present inventor believes that the overexpression of Id in vascular endothelial cells in the RA synovium means that Id is involved in inflammation and angiogenesis typically seen in RA synovial tissue. It was. And, because Id is observed only in very weak expression in adult tissues other than proliferating cells, I think that suppression of angiogenesis by controlling Id could be an effective therapeutic target for RA. It was.
そこで、本発明では、Idの強制発現が培養血管内皮細胞の活性化及び血管新生を誘導しうるのか、また反対に、Idの発現抑制がVEGFによる血管内皮細胞の活性化及び血管新生を阻害できるのかの二点につき検討した。 Therefore, in the present invention, whether forced expression of Id can induce activation and angiogenesis of cultured vascular endothelial cells, and conversely, suppression of Id expression can inhibit activation of vascular endothelial cells and angiogenesis by VEGF. We examined two points.
本発明において使用する内皮細胞は、血管やリンパ管の内壁を覆う一層の扁平な細胞の総称であり、その種類に限定されるものではない。例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）、ヒト臍帯動脈内皮細胞(HUAEC)、腫瘍内微小血管などが挙げられる。 Endothelial cells used in the present invention are a generic term for a single layer of flat cells covering the inner walls of blood vessels and lymphatic vessels, and are not limited to these types. For example, human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), human umbilical artery endothelial cells (HUAEC), intratumoral microvessels and the like can be mentioned.
本発明において、HUVECを用いてモデル実験を行なった結果によれば、以下の事項を説明することができる。 In the present invention, the following matters can be explained by the results of model experiments using HUVEC.
HUVECなどの血管内皮細胞を血管内皮細胞増殖因子(VEGF)やトランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)などの血管新生促進因子で刺激すると、Id3の発現が誘導される。血管新生促進因子であるVEGFやTGF-βの刺激によってId3の発現が誘導されるということは、血管新生の機序にはIdが関与していることを示すものである。更に、Idを過剰発現させると、Id単独でHUVECの増殖、活性化及び血管新生特性を誘導することができ、その誘導はIDをトランスフェクトしていないHUVECをVEGFで刺激した時と同程度である。 Stimulation of vascular endothelial cells such as HUVEC with vascular endothelial growth factor (VEGF) or transforming growth factor β (TGF-β) induces Id3 expression. Induction of Id3 expression by stimulation of angiogenesis-promoting factors VEGF and TGF-β indicates that Id is involved in the mechanism of angiogenesis. In addition, overexpression of Id can induce HUVEC proliferation, activation and angiogenic properties with Id alone, comparable to that induced when VEGF stimulated HUVECs not transfected with ID. is there.
そして、Id3の強制発現によって、HUVECの増殖の上昇に加えてICAM-1及びE-セレクチン（E-selectin）の細胞表面発現増強、さらに細胞遊走能の増加、コラーゲンを分解するマトリクスメタロプロテアーゼ(MMP)2及びMMP9の発現誘導や管腔形成の増加といった血管新生の表現型の亢進が導かれる。 In addition to the increased proliferation of HUVEC, forced expression of Id3 enhances cell surface expression of ICAM-1 and E-selectin, further increases cell migration ability, and matrix metalloprotease (MMP) that degrades collagen ) 2 and MMP9 expression induction and increased angiogenesis phenotype, such as increased lumen formation.
これに対し、HUVECにおけるId1、Id3の発現をRNA干渉(RNA interference, RNAi)等によって抑制すると、VEGF刺激下においても、HUVECの細胞増殖の増加や血管新生表現型の誘導は抑えられる。すなわち、HUVECにおけるID1 及びID3をノックダウンさせると、VEGFによって誘導される増殖、活性化及び血管新生を殆ど完全に消失させることができる。これらの結果は、HUVECのVEGFシグナル伝達経路においてIdが重要な役割を果たすことを示すものである。そして、RAの滑膜組織の内皮細胞にはIdが発現するが変形性関節症（OA）の内皮細胞には発現しないことから(Sakurai, D. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 284, 436-442 (2001))、本発明により得られた知見は、RAの滑膜における炎症及び血管新生にIdが強く関与することを示すものである。 In contrast, when the expression of Id1 and Id3 in HUVEC is suppressed by RNA interference (RNAi), etc., the increase in HUVEC cell proliferation and the induction of angiogenic phenotype can be suppressed even under VEGF stimulation. That is, knocking down ID1 and ID3 in HUVEC can almost completely eliminate the proliferation, activation and angiogenesis induced by VEGF. These results indicate that Id plays an important role in the VEGF signaling pathway of HUVEC. Since Id is expressed in endothelial cells of RA synovial tissue but not in osteoarthritis (OA) endothelial cells (Sakurai, D. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 284 436-442 (2001)), the findings obtained by the present invention indicate that Id is strongly involved in inflammation and angiogenesis in RA synovium.
以上の結果から、Idは、血管内皮細胞における、VEGF誘導性血管内皮細胞の活性化や血管新生において、必須の役割を持つと考えられ、RAの新たな治療標的となるものである。
２．Idの発現制御
ところで、Id1+/-Id3-/-マウス（ID1ノックアウトをヘテロに、ID3ノックアウトをホモに有するマウス）を用いた実験により、以下のことが示されている。すなわち、(1)腫瘍における血管新生を維持するためにはId発現が必要であること(Lyden, D. et al. Nature 401, 670-617 (1999))、及び(2) Idを発現するVEGFR1+ BM由来内皮前駆体細胞（VEGF受容体１陽性の骨髄由来内皮前駆体細胞）の補充が腫瘍増殖にとって必要であること(Lyden, D. et al. Nat. Med. 7, 1194-1201 (2001))である。しかし、リウマチなど、ヒトの炎症性疾患に関連するIdの重要性は、これまで知られていない。
From the above results, Id is considered to have an essential role in VEGF-induced vascular endothelial cell activation and angiogenesis in vascular endothelial cells, and is a new therapeutic target for RA.
2. By the way, experiments using Id1 +/− Id3 − / − mice (mice having ID1 knockout hetero and ID3 knockout homo) have shown the following. (1) Id expression is required to maintain angiogenesis in tumors (Lyden, D. et al. Nature 401, 670-617 (1999)), and (2) VEGFR1 expressing Id + Supplementation of BM-derived endothelial progenitor cells (VEGF receptor 1-positive bone marrow-derived endothelial progenitor cells) is necessary for tumor growth (Lyden, D. et al. Nat. Med. 7, 1194-1201 (2001) )). However, the importance of Id associated with human inflammatory diseases such as rheumatism has not been known so far.
以前の報告によれば、Idがいくつかの方法で細胞周期を制御することが示されている(Zebedee, Z. & Hara, E. Oncogene 20, 8317-8325 (2001))。例えば、Rbタンパク質に結合して、その腫瘍抑制因子機能をブロックする方法(Bain, G. et al. Nat. Immunol. 2, 165-171 (2001))、並びにp16遺伝子プロモーター領域の転写を促進するEst1及びEst2転写因子のp16プロモーターとの結合を抑制することでp16の発現を抑制し、細胞周期の停止を阻害する方法(Ohtani, N. et al. Nature 22, 1067-1070 (2001))等である。本発明においては、少なくとも後者の作用機構がHUVECにおいて機能していることを示した。
Previous reports have shown that Id regulates the cell cycle in several ways (Zebedee, Z. & Hara,
前述のように、Idの強制発現によって細胞表面での発現が上昇するICAM-1及びE-セレクチンは、RAの滑膜内の内皮細胞において強く発現されることが知られている(Szekanecz, Z. et al. Arthritis Rheum. 37, 221-231 (1994)、Koch, A.E. et. al. Lab Invest. 64, 313-320 (1991))。これらの分子は、滑膜組織に炎症性細胞を補充するにあたって重要な分子である(Cutolo, M. et. al. Clin. Exp. Rheumatol. 11, 331-339 (1993))。 As described above, ICAM-1 and E-selectin, whose expression on the cell surface is increased by forced expression of Id, are known to be strongly expressed in endothelial cells in RA synovium (Szekanecz, Z et al. Arthritis Rheum. 37, 221-231 (1994), Koch, AE et. al. Lab Invest. 64, 313-320 (1991)). These molecules are important in recruiting inflammatory cells to synovial tissue (Cutolo, M. et. Al. Clin. Exp. Rheumatol. 11, 331-339 (1993)).
したがって、滑膜の内皮細胞におけるIdの発現は、血管新生に関与しているばかりではなく、慢性炎症の開始及び/又は永続化にも関与している可能性がある。 Thus, Id expression in synovial endothelial cells is not only involved in angiogenesis, but may also be involved in the initiation and / or perpetuation of chronic inflammation.
HUVECをVEGF又はTGF-βで処理すると、Idの発現が誘導される。Id3の発現は、胸腺細胞においてはRas-ERK経路によって誘導され(Bain, G. et al. Nat. Immunol. 2, 165-171 (2001))、HUVECにおいてはTGF-β経路のI型受容体を介しSmad1/5シグナル伝達によって誘導される(Ota, T. et al. J. Cell Physiol. 193, 299-318 (2002))。他方、Id1の発現は、ヒト前立腺癌細胞系においてはRaf/MEK1/2活性化に関連しており(Ling, M.T. et. al. Oncogene 21, 8498-8505 (2002))、HUVECにおいてはSmad1/5シグナル伝達に関連する(Ota, T. et al. J. Cell Physiol. 193, 299-318 (2002))。また、VEGFシグナル伝達経路の下流にはMAPKカスケードが存在する(Takahashi, T. et. al. Oncogene 18, 2221-2230 (1999))。他方、IL-1β、IL-8又はTNF-αによる刺激はHUVECにId3を誘導しない。これは、Idが遍在的な炎症メディエーターではなく、血管新生をもたらすシグナル伝達経路により特異的に関連していることを示すものである。
３．ID遺伝子の発現抑制用RNAの設計
ID遺伝子の発現を抑制するためには、RNA干渉(RNAi)を利用することができる。RNAiとは、dsRNA(double-strand RNA)が標的遺伝子に特異的かつ選択的に結合し、当該標的遺伝子を切断することによりその発現を効率よく阻害する現象である。例えば、dsRNAを細胞内に導入すると、そのRNAと相同配列の遺伝子の発現が抑制（ノックダウン）される。
Treatment of HUVEC with VEGF or TGF-β induces Id expression. Id3 expression is induced by the Ras-ERK pathway in thymocytes (Bain, G. et al. Nat. Immunol. 2, 165-171 (2001)) and in TUV-β pathway type I receptors in HUVEC Is induced by Smad1 / 5 signaling (Ota, T. et al. J. Cell Physiol. 193, 299-318 (2002)). On the other hand, Id1 expression is associated with Raf / MEK1 / 2 activation in human prostate cancer cell lines (Ling, MT et. Al. Oncogene 21, 8498-8505 (2002)) and Smad1 / in HUVEC. 5 is associated with signal transduction (Ota, T. et al. J. Cell Physiol. 193, 299-318 (2002)). In addition, the MAPK cascade exists downstream of the VEGF signaling pathway (Takahashi, T. et. Al.
3. Design of RNA for suppression of ID gene expression
In order to suppress the expression of the ID gene, RNA interference (RNAi) can be used. RNAi is a phenomenon in which dsRNA (double-strand RNA) specifically and selectively binds to a target gene and efficiently cleaves the target gene by cleaving the target gene. For example, when dsRNA is introduced into a cell, expression of a gene having a homologous sequence with that RNA is suppressed (knocked down).
IDのノックダウンに際し、本発明においてはID1及びID3のいずれか一方をノックダウンすることができるが、両者をノックダウン（ダブルノックダウン）してもよい。ID1及びID3は類似したプロモーター領域配列を有し、そして相互に共通する生化学的機能・役割を果たすことが示されているため、ダブルノックダウンが好ましい。 When knocking down ID, in the present invention, either ID1 or ID3 can be knocked down, but both may be knocked down (double knockdown). Double knockdown is preferred because ID1 and ID3 have similar promoter region sequences and have been shown to play common biochemical functions and roles.
ID1及びID3の両者をダブルノックダウンすると、VEGFによってHUVEC中に誘導される全血管新生特性の殆ど全てをブロックする。このことは、Id2及びId4がVEGFによって誘導される血管新生シグナル伝達とは無関係であることを意味する。 Double knockdown of both ID1 and ID3 blocks almost all of the total angiogenic properties induced by VEGF in HUVEC. This means that Id2 and Id4 are independent of angiogenesis signaling induced by VEGF.
ID遺伝子の発現を抑制するには、たとえばID遺伝子に対するshRNA(short hairpin RNA)、あるいはsiRNA(small interfering RNA)を設計及び合成し、これを作用させてRNAiを起こさせればよい。shRNAはヘアピン構造に折り畳まれた小さなRNA分子であり、センス鎖とアンチセンス鎖をループでつないだステムループ構造を持つ。一方、siRNAは、細胞内でDicerによってプロセッシングを受けて産生される短鎖RNAである。shRNA及びsiRNAは、いずれもRNAiのエフェクターとして用いられる。 In order to suppress the expression of the ID gene, for example, shRNA (short hairpin RNA) or siRNA (small interfering RNA) for the ID gene may be designed and synthesized, and this may be used to cause RNAi. shRNA is a small RNA molecule folded into a hairpin structure and has a stem-loop structure in which the sense strand and antisense strand are connected by a loop. On the other hand, siRNA is a short RNA produced by processing by Dicer in cells. Both shRNA and siRNA are used as RNAi effectors.
shRNAの設計基準は以下の通りである。 The design criteria for shRNA are as follows.
(a) RNAiに使用するID1及びID3 shRNA配列は、各遺伝子に特異的な5'末端領域から300塩基までの間で設計する (Elbashir, S.M. et. al. Genes Dev. 15, 188-200 (2001))。 (a) ID1 and ID3 shRNA sequences used for RNAi are designed from the 5 ′ end region specific to each gene to 300 bases (Elbashir, SM et. al. Genes Dev. 15, 188-200 ( 2001)).
(b) それぞれの遺伝子転写産物の5'末端に近い領域から、aa又はaから始まるmRNA配列を標的配列として選択及び設計する。標的領域の長さは特に限定されるものではなく、好ましくは30bp以下、より好ましくは18〜25bp程度である。 (b) From the region near the 5 ′ end of each gene transcript, an mRNA sequence starting from aa or a is selected and designed as a target sequence. The length of the target region is not particularly limited, and is preferably 30 bp or less, more preferably about 18 to 25 bp.
(c) 標的のセンス鎖-ループ-標的のアンチセンス鎖の二次構造予測を行い、安定なステムループ構造を形成することができるように適宜設計する。ループ配列は7〜12塩基とすることができる。 (c) Predict the secondary structure of the target sense strand-loop-target antisense strand and design appropriately so that a stable stem-loop structure can be formed. The loop sequence can be 7-12 bases.
具体的には、以下の塩基配列を標的配列とし、この標的配列を含み、かつ、全体では72塩基以下、例えば43〜72塩基の長さ（好ましくは45〜67塩基の長さ）の配列をshRNAとして使用することができる。下記塩基配列のうち、ID1 shRNAについては(iii)、ID3 shRNAについては(i)の配列を標的とすることが、最も阻害効率が高い点で好ましい。 Specifically, the following base sequence is used as a target sequence, and the entire target sequence is 72 bases or less, for example, 43 to 72 bases in length (preferably 45 to 67 bases in length). Can be used as shRNA. Of the following base sequences, it is preferable to target the sequence (iii) for ID1 shRNA and the sequence (i) for ID3 shRNA in terms of the highest inhibition efficiency.
ID1 shRNA
(i) aacuguuccauuuuccguauc（配列番号1）
(ii)aaucaugaaagucgccagugg（配列番号2）
(iii)aagaaucaugaaagucgccag（配列番号3）
(iv)aaggccggcaagacagcgagc（配列番号4）
(v)aagucgccaguggcagcaccg（配列番号5）
ID3 shRNA
(i) aaccucacagcaccucacuu（配列番号6）
(ii) aaggcgcugagcccggugcgc（配列番号7）
(iii) aauggauccugcaccacggga（配列番号8）
また、siRNAの設計基準は以下の通りである。
ID1 shRNA
(i) aacuguuccauuuuccguauc (SEQ ID NO: 1)
(ii) aaucaugaaagucgccagugg (SEQ ID NO: 2)
(iii) aagaaucaugaaagucgccag (SEQ ID NO: 3)
(iv) aaggccggcaagacagcgagc (SEQ ID NO: 4)
(v) aagucgccaguggcagcaccg (SEQ ID NO: 5)
ID3 shRNA
(i) aaccucacagcaccucacuu (SEQ ID NO: 6)
(ii) aaggcgcugagcccggugcgc (SEQ ID NO: 7)
(iii) aauggauccugcaccacggga (SEQ ID NO: 8)
The design criteria for siRNA are as follows.
(a) Idをコードする遺伝子の開始コドンの下流の領域を選択する。開始コドンより下流の配列であれば特に限定されるものではなく、任意の領域を全て候補にすることが可能である。 (a) Select a region downstream of the start codon of the gene encoding Id. The sequence is not particularly limited as long as it is a sequence downstream from the start codon, and any region can be used as a candidate.
(b) 選択した領域から、aaで始まる連続する15〜30塩基、好ましくは18〜25塩基の配列を選択し、その配列のGC含量が、例えば20〜80%となるものを選択する。本発明においては、上記shRNAとして挙げた配列は、全てsiRNAの標的配列とすることができる。 (b) From the selected region, a sequence of 15 to 30 bases, preferably 18 to 25 bases starting from aa is selected, and a sequence having a GC content of, for example, 20 to 80% is selected. In the present invention, all the sequences listed as the shRNA can be used as siRNA target sequences.
siRNA及びshRNAを血管内皮細胞に導入するには、in vitroで合成したsiRNA及びshRNAをプラスミドDNAに連結してこれを細胞に導入する方法、２本のRNAをアニールする方法などを採用することができる。 In order to introduce siRNA and shRNA into vascular endothelial cells, it is possible to adopt a method in which siRNA and shRNA synthesized in vitro are linked to plasmid DNA and introduced into cells, or two RNAs are annealed. it can.
上記の通り、IDをダブルノックダウンしたHUVECは、血管形成を顕著に抑制する。血管形成の抑制は、マトリゲルの主成分であるラミニンをリガンドとするα2及びβ1インテグリンの発現低下によって説明できる (Dickeson, S.K. et. al. Cell Adhes. Commun. 5, 273-281 (1998)、Davis, G.E. et. al. Exp. Cell Res. 216, 113-123 (1995))。このように、Idは内皮細胞の活性化及び血管新生をもたらす複数の経路に関与していると考えられる。Id1及びId3の機能は実質的に共通するため(Yokota, Y. Oncogene 20, 8290-8298 (2001)、Norton, J.D. et. al. Trends Cell Biol. 8, 58-65 (1998))、各Idタンパク質から多数の内皮細胞活性化及び血管新生特性への経路を描くことができる。
As described above, HUVEC with double knockdown of ID significantly suppresses angiogenesis. Inhibition of angiogenesis can be explained by decreased expression of α 2 and β 1 integrins with laminin, the main component of Matrigel (Dickeson, SK et. Al. Cell Adhes. Commun. 5, 273-281 (1998) Davis, GE et. Al. Exp. Cell Res. 216, 113-123 (1995)). Thus, Id is thought to be involved in multiple pathways leading to endothelial cell activation and angiogenesis. Since the functions of Id1 and Id3 are substantially common (Yokota, Y.
Id1は、血管新生の抑制因子であるトロンボスポンジン１(TSP-1)の発現をダウンレギュレーションすることが最近報告された(Volpert, O.V. et. al. Cancer Cell 2, 473-483 (2002))。従って、Idに関連する全ての血管新生プロセスは、TSP-1のダウンレギュレーションの観点から検討することも可能である。
Id1 was recently reported to down-regulate the expression of thrombospondin 1 (TSP-1), an inhibitor of angiogenesis (Volpert, OV et. Al.
結論として、本発明者は、VEGFによって誘導されるHUVECの活性化及び血管新生にIdが不可欠な役割を果たすことを示した。(a)内皮細胞活性化及び血管新生がRNAiにより抑制されること、(b)健常な成体組織では、その殆どにおいてIdの発現が低いこと、及び(c)関節内注射によってIdを疾患組織に投与することが可能であることから、Idは、RA等の細胞増殖性疾患に対する新規治療法を開発するための標的であると考えられる。
４．医薬組成物
本発明において作製されたshRNA、siRNA等の核酸は、免疫系疾患、細胞増殖性疾患、あるいは糖尿病性網膜症や黄斑変性症などの血管新生疾患を治療するための医薬組成物として使用することができる。
In conclusion, the inventor has shown that Id plays an essential role in VEGF-induced HUVEC activation and angiogenesis. (a) Endothelial cell activation and angiogenesis are inhibited by RNAi, (b) in healthy adult tissues, the expression of Id is low in most of them, and (c) Id is converted into diseased tissue by intra-articular injection. Since it can be administered, Id is considered to be a target for developing new therapies for cell proliferative diseases such as RA.
4). Pharmaceutical Composition Nucleic acids such as shRNA and siRNA produced in the present invention are used as a pharmaceutical composition for treating immune system diseases, cell proliferative diseases, or angiogenic diseases such as diabetic retinopathy and macular degeneration. can do.
本発明の核酸を細胞増殖性疾患の遺伝子治療剤として使用する場合は、例えば、以下の組織に生じる疾患について治療又は予防を特異目的として用いることができる。 When the nucleic acid of the present invention is used as a gene therapy agent for a cell proliferative disease, for example, a disease occurring in the following tissues can be used for the specific purpose of treatment or prevention.
消化器系：口腔、咽頭、食道、胃、小腸、大腸、肝臓、すい臓など
呼吸器系：気管、気管支、肺など
泌尿器系：腎臓、膀胱など
心臓血管系：心臓、動脈、静脈
リンパ系：リンパ管、リンパ節、脾臓、胸腺
感覚器系：視覚器、聴覚器
中枢神経系：脳（大脳、間脳、中脳、小脳）、延髄、脊髄
骨格系：頭蓋骨、脊柱、肋骨、胸骨、上肢骨、上腕骨、下肢骨、大腿骨、関節等
筋：骨格筋、平滑筋等
その他：皮膚、歯、歯肉
これらの疾患は、単独であっても、併発したものであっても、上記以外の他の疾病を併発したものであってもよく、いずれも本発明の医薬組成物の使用対象とすることができる。本発明においては、例えば関節リウマチの予防又は治療目的とすることが好ましい。
Digestive system: oral cavity, pharynx, esophagus, stomach, small intestine, large intestine, liver, pancreas, etc. Respiratory system: trachea, bronchi, lung, etc. Urinary system: kidney, bladder, etc. Cardiovascular system: heart, artery, vein Lymphatic system: lymph Tube, lymph node, spleen, thymus Sensory system: visual organ, auditory organ Central nervous system: brain (cerebrum, diencephalon, midbrain, cerebellum), medulla, spinal cord Skeletal system: skull, spine, rib, sternum, upper limb bone , Humerus, lower limb bone, femur, joint, etc. Muscle: Skeletal muscle, smooth muscle, etc. Other: Skin, teeth, gingiva These diseases may be isolated or combined, other than those mentioned above The above-mentioned diseases may be combined, and any of them can be used for the pharmaceutical composition of the present invention. In the present invention, for example, it is preferable to prevent or treat rheumatoid arthritis.
また、本発明においては、Idタンパク質をコードする遺伝子を、循環器系疾患を治療するための医薬組成物（例えば遺伝子治療剤）として使用することができる。 In the present invention, a gene encoding Id protein can be used as a pharmaceutical composition (for example, gene therapy agent) for treating cardiovascular diseases.
循環器系疾患としては、例えば冠動脈狭窄症、四肢虚血性疾患、閉塞性動脈硬化症、虚血性潰瘍・壊死、バージャー病などが挙げられる。 Examples of circulatory diseases include coronary artery stenosis, limb ischemic disease, obstructive arteriosclerosis, ischemic ulcer / necrosis, and Buerger's disease.
Idタンパク質をコードする遺伝子（ID遺伝子）は、以下の通り公知であり、NCBI（National Center for Biotechnology Information：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) に開示されている情報をもとにして、通常のクローニング手法により（J. Sambrook, Molecular cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, CSHL Press, 2001)、当業者が容易に取得することができる。 The gene encoding the Id protein (ID gene) is known as follows and includes information disclosed in NCBI (National Center for Biotechnology Information: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). In addition, it can be easily obtained by those skilled in the art by ordinary cloning techniques (J. Sambrook, Molecular cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, CSHL Press, 2001).
ID1 遺伝子：NCBIアクセッション番号ＮＭ_181353
Homo sapiens inhibitor of DNA binding 1, dominant negative helix-loop-helix protein (ID1), transcript variant 2, mRNA
ID3 遺伝子： NCBIアクセッション番号ＮＭ_002167
Homo sapiens inhibitor of DNA binding 3, dominant negative helix-loop-helix protein, mRNA
上記ID1遺伝子の塩基配列を配列番号23に、Id1タンパク質のアミノ酸配列を配列番号24に示す。また、上記ID3遺伝子の塩基配列を配列番号25に、Id3タンパク質のアミノ酸配列を配列番号26に示す。
ID1 gene: NCBI accession number NM_181353
Homo sapiens inhibitor of DNA binding 1, dominant negative helix-loop-helix protein (ID1),
ID3 gene: NCBI accession number NM_002167
Homo sapiens inhibitor of DNA binding 3, dominant negative helix-loop-helix protein, mRNA
The base sequence of the ID1 gene is shown in SEQ ID NO: 23, and the amino acid sequence of the Id1 protein is shown in SEQ ID NO: 24. The base sequence of the ID3 gene is shown in SEQ ID NO: 25, and the amino acid sequence of the Id3 protein is shown in SEQ ID NO: 26.
本発明の医薬組成物を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の医薬組成物を注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。また、本発明の医薬組成物をリポソームなどのリン脂質小胞に導入し、そのリポソームを投与する方法を採用してもよい。リポソームは、生体適合性材料（脂質膜）を含む小胞であるため、リポソームと本発明の医薬組成物とを混合することにより、リポソーム内部又は脂質二分子層に核酸を保持させることができる。次に、核酸を保持したリポソームを細胞とともに培養すると複合体中の遺伝子が細胞内に取り込まれる（リポフェクション法）。そして、得られる細胞を以下の投与方法で投与すればよい。 When the pharmaceutical composition of the present invention is used as a gene therapy agent, a method of administering a vector in which a nucleic acid is incorporated may be mentioned in addition to a method of directly administering the pharmaceutical composition of the present invention by injection. Examples of the vector include an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a herpes virus vector, a vaccinia virus vector, a retrovirus vector, a lentivirus vector, and the like, and can be efficiently administered by using these virus vectors. In addition, a method of introducing the pharmaceutical composition of the present invention into a phospholipid vesicle such as a liposome and administering the liposome may be employed. Since the liposome is a vesicle containing a biocompatible material (lipid membrane), the nucleic acid can be held in the liposome or in the lipid bilayer by mixing the liposome and the pharmaceutical composition of the present invention. Next, when the liposome retaining the nucleic acid is cultured with the cell, the gene in the complex is taken into the cell (lipofection method). Then, the obtained cells may be administered by the following administration method.
本発明の医薬組成物の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内等の全身投与のほか、患部、筋肉、皮下、皮内等に局所投与することができる。さらに、カテーテル技術、外科的手術等と組み合わせた投与形態を採用することも可能である。本発明の医薬組成物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、例えばアデノウイルスの場合の投与量は1日1回あたり1010から1011PFU程度であり、1週〜4週間隔で投与される。 As the administration form of the pharmaceutical composition of the present invention, it can be administered locally to the affected area, muscle, subcutaneous, intracutaneous, etc., in addition to the usual intravenous, intraarterial and other systemic administration. Furthermore, it is possible to adopt a dosage form combined with catheter technique, surgical operation, and the like. The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on age, sex, symptom, administration route, frequency of administration, dosage form, for example, the dosage in the case of adenovirus is about 10 10 to 10 11 PFU per day And administered at 1 to 4 week intervals.
なお、ID遺伝子の発現においては、腫瘍化との関連が示唆されている（Norton JD. Journal of Cell Science 113, 3897-3905, 2000)。従って、ID遺伝子を発現させる場合（循環器系疾患の治療目的として使用する場合）は、腫瘍化に留意しつつ、投与量を調節し、あるいはリポソーム等を用いたドラッグデリバリーシステム(DDS)を適用することによって、安全性に関する最適条件を決定し得ることが期待される。 In addition, the expression of ID gene has been suggested to be associated with tumorigenesis (Norton JD. Journal of Cell Science 113, 3897-3905, 2000). Therefore, when expressing the ID gene (when used for the treatment of cardiovascular diseases), the dosage is adjusted while paying attention to tumorigenicity, or a drug delivery system (DDS) using liposomes is applied. By doing so, it is expected that the optimum condition regarding safety can be determined.
ID遺伝子を、プラスミドDNAを用いた遺伝子治療剤として使用する場合は、プラスミドDNAの直接注射法を採用することができる。プラスミドDNAは短時間で大量に調製することが可能であり、取り扱いが容易であること、注入時の濃度は特に限定がないこと、さらに、プラスミドDNAは安定性が高い分子であるため目的の組織に到達した後でも安定に発現することができることなどの種々の利点を有する。 When the ID gene is used as a gene therapy agent using plasmid DNA, a direct injection method of plasmid DNA can be employed. Plasmid DNA can be prepared in large quantities in a short time, is easy to handle, has no particular concentration at the time of injection, and is a highly stable molecule, so the target tissue It has various advantages such as being able to be stably expressed even after reaching.
DNAの注射方法は、精製したプラスミドDNAを生理食塩水などに溶解し、直接筋肉内に注射するというものである。プラスミドDNAを筋肉内注射するときの用量は、0.1μg〜1mg、好ましくは5μg〜100μgである。その結果、注射部位周辺にプラスミドDNAが取り込まれて、注射後にIdタンパク質遺伝子の発現産物が作られる。これにより、虚血性疾患の治療又は改善効果を得ることができる。 The DNA injection method involves dissolving purified plasmid DNA in physiological saline and directly injecting it into muscle. The dose for intramuscular injection of plasmid DNA is 0.1 μg to 1 mg, preferably 5 μg to 100 μg. As a result, plasmid DNA is taken up around the injection site, and an expression product of the Id protein gene is produced after injection. Thereby, the treatment or improvement effect of an ischemic disease can be acquired.
ID遺伝子又はshRNAを目的の組織又は器官に導入するために、市販の遺伝子導入キット（例えばGenomONE: 石原産業）を用いることもできる。 In order to introduce the ID gene or shRNA into the target tissue or organ, a commercially available gene introduction kit (for example, GenomONE: Ishihara Sangyo) can also be used.
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は実施例に限定されるものではない。
１．方法
(1) トランスフェクション
初代培養のHUVECを常法のごとく単離し、10%FCS、ヘパリン500μl/ml、ｂFGF 2ng/mlを添加したMCDB151培養液を用いて、0.1％のゼラチンで前処理をしたプレート上で培養を行なった。トランスフェクションはEffectene transfection reagent (QIAGEN)を用いて行なった。IDの強制発現はpBLASTベクター(InvivoGen)を用いて行なった。陰性対照としてpBLAST49-mcsを用いた。ID1とID3の発現をノックダウンするためにshRNAの配列をデザインした。配列は以下の通りである。それぞれの配列の3'末端はRNA発現ベクター（ID1用は psiRNA-hH1neo(InvivoGen)、ID3用はpSilencer 2.0-U6(Ambion))に組み込むための突出配列である。下線部は、標的RNA領域及びその相補領域である。
ID1：TCCCAAAGAA TCATGAAAGT CGCCAGTTCA AGAGACTGGC GACTTTCATG ATTCTTTT（配列番号９）
及び
ID3：TCGGATCCAA CCTCACAGCA CCTCACTTCT TCAAGAGAGA AGTGAGGTGC TGTGAGGTTT TTTTTGGAAA AGCTTGG（配列番号10）
(2) RT-PCR
Total RNAはRNeasy miniキット(QIAGEN)を用いて抽出し、DNase処理をした。RNAからの初めのcDNA合成はImProm-II逆転写酵素システム(Promega)を用いた。定量的RT-PCRはLightCycler (登録商標）DNA master SYBR Green Iとそれぞれの特異的プライマーとを用いてリアルタイムRT-PCRマシーンで行なった。データ解析はLightCycler analysis software (Roche Diagnostics)を用いて、フィットポイント法(fit-points method)で行なった。それぞれのcDNAサンプルは、βアクチン又はGAPDHを用いてtotal RNAレベルで標準化した。HUVECでのVEGFとTGFβによるId3の発現誘導の解析は、通常のRT-PCRで行なった。RT-PCRに用いたプライマー対は以下の通りである。
Id3:
フォワード：5'-CTCCACGCTCTGAAAAGACC-3' （配列番号11）
リバース：5'-ACTCAGATTAAGCCAGGTGGA-3' （配列番号12）
p16:
フォワード：5'-AGCCTTCGGCTGACTGGCTGG-3' （配列番号13）
リバース：5'-GCAGTTAAGGGGGCACGAGTG-3' （配列番号14）
ICAM-1:
フォワード：5'-ACCTGGCAATGCCCAGACATCTGTGT-3' （配列番号15）
リバース：5'-GTACACGGTGAGGAAGGTTTTAGCTGTTG-3' （配列番号16）
E-セレクチン:
フォワード：5'-AAAACTTCCATGAGGCCAAA-3' （配列番号17）
リバース：5'-GCATTCCTCTCTTCCAGAGC-3' （配列番号18）
MMP2:
フォワード：5'-ATGACAGCTGCACCACTGAG-3' （配列番号19）
リバース：5'-TGATGTCATCCTGGGACAGA-3' （配列番号20）
MMP9:
フォワード：5'-GGCGCTCATGTACCCTATGT-3' （配列番号21）
リバース：5'-CCCTCAGTGAAGCGGTACAT-3' （配列番号22）
PCRは、LightCycler (登録商標）DNA master SYBR Green Iを用いて、はじめに95°C 10分反応させ、その後 95°C 5 秒、58°C 10 秒72°C 秒のサイクルを45サイクル行なった。
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to the examples.
1. Method
(1) Transfection Primary HUVEC was isolated as usual, and pretreated with 0.1% gelatin using MCDB151 culture medium supplemented with 10% FCS, heparin 500 μl / ml, and
ID1: TCCCA AAGAA TCATGAAAGT CGCCAG TTCA AGAGA CTGGC GACTTTCATG ATTCTT TT (SEQ ID NO: 9)
as well as
ID3: TCGGATCC AA CCTCACAGCA CCTCACTT CT TCAAGAGAG A AGTGAGGTGC TGTGAGGTT T TTTTTGGAAA AGCTTGG (SEQ ID NO: 10)
(2) RT-PCR
Total RNA was extracted using the RNeasy mini kit (QIAGEN) and treated with DNase. The initial cDNA synthesis from RNA used the ImProm-II reverse transcriptase system (Promega). Quantitative RT-PCR was performed on a real-time RT-PCR machine using LightCycler® DNA master SYBR Green I and each specific primer. Data analysis was performed with the Fit-points method using LightCycler analysis software (Roche Diagnostics). Each cDNA sample was standardized at the total RNA level using β-actin or GAPDH. The analysis of Id3 expression induction by VEGF and TGFβ in HUVEC was performed by ordinary RT-PCR. The primer pairs used for RT-PCR are as follows.
Id3:
Forward: 5'-CTCCACGCTCTGAAAAGACC-3 '(SEQ ID NO: 11)
Reverse: 5'-ACTCAGATTAAGCCAGGTGGA-3 '(SEQ ID NO: 12)
p16:
Forward: 5'-AGCCTTCGGCTGACTGGCTGG-3 '(SEQ ID NO: 13)
Reverse: 5'-GCAGTTAAGGGGGCACGAGTG-3 '(SEQ ID NO: 14)
ICAM-1:
Forward: 5'-ACCTGGCAATGCCCAGACATCTGTGT-3 '(SEQ ID NO: 15)
Reverse: 5'-GTACACGGTGAGGAAGGTTTTAGCTGTTG-3 '(SEQ ID NO: 16)
E-selectin:
Forward: 5'-AAAACTTCCATGAGGCCAAA-3 '(SEQ ID NO: 17)
Reverse: 5'-GCATTCCTCTCTTCCAGAGC-3 '(SEQ ID NO: 18)
MMP2:
Forward: 5'-ATGACAGCTGCACCACTGAG-3 '(SEQ ID NO: 19)
Reverse: 5'-TGATGTCATCCTGGGACAGA-3 '(SEQ ID NO: 20)
MMP9:
Forward: 5'-GGCGCTCATGTACCCTATGT-3 '(SEQ ID NO: 21)
Reverse: 5'-CCCTCAGTGAAGCGGTACAT-3 '(SEQ ID NO: 22)
PCR was performed by using LightCycler (registered trademark) DNA master SYBR Green I for 95 minutes at 95 ° C for 10 minutes, followed by 45 cycles of 95 ° C for 5 seconds, 58 ° C for 10 seconds and 72 ° C for 45 cycles.
PCR産物を電気泳動にかけ、SYBR Goldによって染色後、mRNA発現量の相対値をバンドの濃さを図り、計算することによって、Id3及びβアクチンの発現量を測定した。
(3) 細胞増殖アッセイ
HUVECの増殖をWST-1細胞増殖アッセイ（タカラバイオ）によって計測した。細胞をゼラチンでコートした96穴のプレートにまいた。10μlのWST-1溶液を各ウェルに混ぜ、4時間37℃で静置した。溶液を96穴プレートに移し変えて480nmの吸光を測定した。
(4) フローサイトメトリー
プレート上で培養しているHUVECをトリプシン-EDTAと0.02% EDTA-PBSを用いて回収し、0.1% BSA 、0.1%アジ化ナトリウムを含むPBSに再溶解させ、50ng/mlのヒトガンマグロブリンで30分室温で処理した。直接免疫蛍光を用いる場合は細胞を蛍光標識されたモノクローナル抗体とアイソタイプコントロール抗体で30分処理した。間接免疫蛍光を用いる場合は非標識のモノクローナル抗体とアイソタイプコントロール抗体で30分氷上で処理後、洗浄し、PE標識のヤギ抗マウスIgGで処理を行なった。蛍光はEPICS XL(Beckman Coulter)を用いて解析した。使用したモノクローナル抗体は、FITC標識化抗ヒトαvインテグリン、PE標識化抗ヒトICAM-1、PE標識化抗ヒトβ1インテグリン、Cy-クロム標識化抗ヒトE-セレクチン、及び未標識の抗ヒトα2インテグリンであった。アイソタイプ対照として、マウスIgG1-RD1/マウスIgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-Cy-クロム及び非標識IgG1を用いた。
(5) 遊走アッセイ
遊走アッセイは8μ孔のトランスウェルチャンバー(Corning)を用いて行なった。細胞を回収後血清の入っていない培養液に再浮遊させ、各ウェル1×104個になるようにゼラチンで処理した上のチャンバーに播いた。下のチャンバーには10% FCSとそれぞれサイトカインが入っている培養液で満たした。上下のチャンバーをあわせ、37℃で8時間静置した後、トリプシン-EDTAを用いて下層にある細胞を回収し、EPICSを用いて細胞数を計測した。
(6) ザイモグラフィー
HUVECを100mmのプレート上にまき、DMEMとF-12 HAM培養液が1:1の比率で混合した培養液中で37℃、8時間静置した。上清を回収しCentricon YM-10で濃縮した。MMPを0.1%のゼラチンを含むSDSポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、ゲルを5mM CaCl2 と1μM ZnCl2を含む緩衝液に浸すことによって酵素活性を展開させた。ゲルをクマシーブルーで染色し、メタノールと酢酸で脱色した。ゼラチン分解部位は染色されていないバンドとして検出される。
(7) In vitro管腔形成
In vitro管腔形成はマトリゲルを用いて行なった。マトリゲルを氷上で6ウェルプレートにまき、37℃で30分静置することによって固まらせた。ここに各ウェル5×104になるようにマトリゲル上に細胞をまき、VEGF存在、非存在それぞれの条件下で37℃で24時間静置した。顕微鏡下でゲル上での管腔形成を観察した。
２．結果
(1) VEGF、TGFβによるHUVECのIdの発現誘導
Idが生理的な血管新生に関与するか否かを検討するために、HUVECのVEGF、TGF(刺激によるId3の発現誘導を検討した。VEGF又はTGF(で刺激した、又は刺激していないHUVEC中におけるID3 mRNAレベルをRT-PCRによって測定した。陽性対照として、ID3 でトランスフェクトしたHUVEC (Id3-t)を用いた。
After the PCR product was electrophoresed and stained with SYBR Gold, the expression level of Id3 and β-actin was measured by calculating the relative value of the mRNA expression level and calculating the relative density of the band.
(3) Cell proliferation assay
HUVEC proliferation was measured by WST-1 cell proliferation assay (Takara Bio). Cells were seeded in a 96-well plate coated with gelatin. 10 μl of WST-1 solution was mixed in each well and allowed to stand at 37 ° C. for 4 hours. The solution was transferred to a 96-well plate and the absorbance at 480 nm was measured.
(4) Flow cytometry HUVECs cultured on the plate are collected using trypsin-EDTA and 0.02% EDTA-PBS, redissolved in PBS containing 0.1% BSA and 0.1% sodium azide, and 50 ng / ml For 30 minutes at room temperature. When using direct immunofluorescence, the cells were treated with a fluorescently labeled monoclonal antibody and an isotype control antibody for 30 minutes. When using indirect immunofluorescence, treatment with unlabeled monoclonal antibody and isotype control antibody for 30 minutes on ice, followed by washing and treatment with PE-labeled goat anti-mouse IgG. The fluorescence was analyzed using EPICS XL (Beckman Coulter). The monoclonal antibodies used were FITC-labeled anti-human α v integrin, PE-labeled anti-human ICAM-1, PE-labeled anti-human β 1 integrin, Cy-chromium-labeled anti-human E-selectin, and unlabeled anti-human It was α 2 integrin. As an isotype control, mouse IgG1-RD1 / mouse IgG1-FITC, IgG1-PE, IgG1-Cy-chrome and unlabeled IgG1 were used.
(5) Migration assay The migration assay was performed using an 8 μ-hole transwell chamber (Corning). After the cells were collected, they were resuspended in a culture medium without serum, and seeded in a chamber after being treated with gelatin so that 1 × 10 4 wells were obtained. The lower chamber was filled with culture medium containing 10% FCS and each cytokine. The upper and lower chambers were combined and allowed to stand at 37 ° C. for 8 hours, and then cells in the lower layer were collected using trypsin-EDTA, and the number of cells was counted using EPICS.
(6) Zymography
HUVEC was plated on a 100 mm plate and allowed to stand at 37 ° C. for 8 hours in a culture solution in which DMEM and F-12 HAM culture solution were mixed at a ratio of 1: 1. The supernatant was collected and concentrated with Centricon YM-10. Enzyme activity was developed by electrophoresis of MMP in SDS polyacrylamide gel containing 0.1% gelatin and immersing the gel in a buffer containing 5 mM CaCl 2 and 1 μM ZnCl 2 . The gel was stained with Coomassie blue and decolorized with methanol and acetic acid. Gelatin degradation sites are detected as unstained bands.
(7) In vitro tube formation
In vitro tube formation was performed using Matrigel. Matrigel was spread on a 6-well plate on ice and allowed to set by standing at 37 ° C. for 30 minutes. Here, cells were plated on Matrigel so that each well had 5 × 10 4, and allowed to stand at 37 ° C. for 24 hours in the presence or absence of VEGF. The formation of lumens on the gel was observed under a microscope.
2. result
(1) Induction of Id expression of HUVEC by VEGF and TGFβ
To investigate whether Id is involved in physiological angiogenesis, we examined the induction of Id3 expression by stimulating VEGF, TGF (stimulated with HUVEC. In HUVECs stimulated or not stimulated with VEGF or TGF ( ID3 mRNA levels were measured by RT-PCR, HUVEC (Id3-t) transfected with ID3 was used as a positive control.
VEGF (20ng/ml)（図１a、b）、及びTGFβ(0.5ng/ml)（図１c、d）で血管内皮細胞を刺激したときにId1、Id3の有意な発現増強が認められた（図１b、d、P<0.05）。図１b及び図１dは、それぞれ図１a及び図１cに示されたバンドの相対強度を示す。この結果から、上記の因子による血管新生誘導シグナル系路にIdが位置することが示された。一方IL-1、IL-8、TNFα等の血管新生促進因子ではIdの発現は誘導できなかった。
(2) Id3強制発現によるHUVEC増殖の誘導
次に、Idのみの刺激でHUVECの活性化及び血管新生を誘導しうるか否かを検討するために、遺伝子導入により、HUVECにId3を過剰発現させた。pBLAST49-hId3(c) (Id3-t)又はpBLAST49-mcs (Mock-t)ベクターをHUVEC中に導入した。各導入細胞から全RNAを単離し、リアルタイムRT-PCRによってID3 mRNAレベルを連続的に定量した。また、細胞増殖は、MTTアッセイによって測定した。
When vascular endothelial cells were stimulated with VEGF (20 ng / ml) (FIGS. 1a and b) and TGFβ (0.5 ng / ml) (FIGs. 1c and d), significant expression enhancement of Id1 and Id3 was observed (FIG. 1). 1b, d, P <0.05). 1b and 1d show the relative intensities of the bands shown in FIGS. 1a and 1c, respectively. From this result, it was shown that Id is located in the angiogenesis induction signal pathway by the above factors. On the other hand, angiogenesis-promoting factors such as IL-1, IL-8, and TNFα could not induce Id expression.
(2) Induction of HUVEC proliferation by forced expression of Id3 Next, in order to investigate whether HUVEC activation and angiogenesis can be induced by stimulation with Id alone, IUV3 was overexpressed in HUVEC by gene transfer. . The pBLAST49-hId3 (c) (Id3-t) or pBLAST49-mcs (Mock-t) vector was introduced into HUVEC. Total RNA was isolated from each transduced cell and ID3 mRNA levels were continuously quantified by real-time RT-PCR. Cell proliferation was also measured by MTT assay.
遺伝子導入24時間後、陰性対照との比較では、遺伝子導入細胞においてmRNAレベルで4.1倍のId3の発現増強が観察された（図２a）。ID3導入細胞では24時間で陰性対照に比べて1.9倍の増殖能の上昇が見られ、VEGF刺激後の遺伝子非導入細胞とほぼ同等の増殖を示した（図２b）。図２ｂにおいて、ID3導入細胞（黒塗りの棒）はベクターのみ導入した細胞(白抜きの棒)と比較して有意に高い増殖を示した。ID3導入細胞の増殖は、導入していないHUVEC（陰影を付けた棒）の増殖（10 ng/mlのVEGFで刺激）に匹敵した。従って、ID3過剰発現はHUVECの増殖を誘導することが示された。 24 hours after gene transfer, a 4.1-fold increase in the expression of Id3 at the mRNA level was observed in the transfected cells compared with the negative control (FIG. 2a). In the cells transfected with ID3, the proliferation ability was increased by 1.9 times compared to the negative control at 24 hours, showing almost the same proliferation as the non-gene-transfected cells after VEGF stimulation (FIG. 2b). In FIG. 2b, ID3-introduced cells (black bars) showed significantly higher proliferation compared to cells in which only the vector was introduced (open bars). Growth of ID3 transduced cells was comparable to that of untransfected HUVEC (shaded bars) (stimulated with 10 ng / ml VEGF). Thus, ID3 overexpression was shown to induce HUVEC proliferation.
Idはp16の発現調節を行なうことによって細胞周期を調節していることがすでに知られているが、本実験では、図２cに示すようにp16とId3のmRNAレベルでの発現が逆相関の関係にあり、この機序がHUVECにおいても機能していることが示された。
(3) Id3強制発現によるHUVEC活性化の誘導
Id3の強制発現がHUVECの活性化を誘導できるか否かを調べるために、血管内皮細胞の活性化マーカーとしてICAM-1とE-selectinの発現を測定した。トランスフェクションの24時間後にフローサイトメトリーを実施した。
Although it is already known that Id regulates the cell cycle by regulating the expression of p16, in this experiment, the expression of p16 and Id3 at the mRNA level is inversely related, as shown in Fig. 2c. It was shown that this mechanism is functioning in HUVEC.
(3) Induction of HUVEC activation by forced expression of Id3
In order to examine whether forced expression of Id3 can induce HUVEC activation, the expression of ICAM-1 and E-selectin was measured as an activation marker of vascular endothelial cells. Flow cytometry was performed 24 hours after transfection.
Id3強制発現により、mRNAレベルでICAM-1、E-selectin共にそれぞれ4.8倍（図３a）及び4.2倍（図３b）の発現の上昇が見られ、細胞表面の発現も増加した（図３a、b）。ID3トランスフェクタントにおいては、両方の活性化マーカーが有意にアップレギュレーションされていた。以上の結果からId3の強制発現のみでHUVECの活性化を誘導しうることが示された。
(4) Id3強制発現による血管新生の誘導
次にId3の強制発現によってHUVECで血管新生が誘導できるか否かを検討した。Id3強制発現血管内皮細胞では遊走能が亢進しており、ID3導入細胞は、特にIL-1β (0.5 ng/ml)又はVEGF (20 ng/ml)で刺激したときに、顕著な遊走活性の増大を示した（図４a）。Id3強制発現により、非刺激下において、MMP2とMMP9の発現量は、mRNAレベルで3.2倍、3.7倍とそれぞれ上昇しており、VEGF刺激による遺伝子非導入細胞のMMPs産生能上昇と同等であった（図４b）。MMP2とMMP9の酵素活性レベルでの上昇も、ザイモグラフィーにより確認された。両分子ともに活性化MMP2、MMP9量が増加しており、MMP2及びMMP9活性のアップレギュレーションが確認された。（図４c）。さらにマトリゲルを用いて管腔形成を検討したところ、ID3導入細胞ではVEGF刺激無しでも充分な管腔形成が誘導された（図４d）。この血管形成の程度は、VEGF (10 ng/ml)の存在下で培養した、Mock導入細胞の血管形成に匹敵した。これらの結果を合わせて考えると、HUVECでのId3の強制発現によって血管新生が誘導されることが明らかになった。
(5) HUVECのVEGF誘導性の増殖、活性化はID1 とID3 shRNAによって阻害される
次に、Id3はVEGF刺激によって誘導されるHUVECの細胞増殖、活性化、血管新生にとって必須であるか否かを検証した。Id1とId3の発現を阻害するためにRNAiを用いた。HUVECにID1とID3のsmall hairpin RNA (shRNA)を発現するベクターを1.25、5、10ng/mlの濃度で導入した。VEGF (20 ng/ml)の存在下又は非存在下でHUVECを24時間培養した後、ID3及びGAPDHのmRNAを定量した。
By forced expression of Id3, expression of both ICAM-1 and E-selectin was increased 4.8 times (Fig. 3a) and 4.2 times (Fig. 3b) at the mRNA level, and cell surface expression was also increased (Figs. 3a, b). ). In ID3 transfectants, both activation markers were significantly upregulated. These results indicate that HUVEC activation can be induced only by forced expression of Id3.
(4) Induction of angiogenesis by forced expression of Id3 Next, it was examined whether an angiogenesis could be induced by HUVEC by forced expression of Id3. Id3 forced expression vascular endothelial cells have enhanced migration ability, and ID3 transduced cells have markedly increased migration activity, especially when stimulated with IL-1β (0.5 ng / ml) or VEGF (20 ng / ml) (FIG. 4a). Due to forced expression of Id3, the expression level of MMP2 and MMP9 increased 3.2 times and 3.7 times at the mRNA level under non-stimulation, which was equivalent to the increase in MMPs production capacity of non-gene-transduced cells by VEGF stimulation. (Figure 4b). Increases in the enzyme activity levels of MMP2 and MMP9 were also confirmed by zymography. In both molecules, the amount of activated MMP2 and MMP9 increased, and up-regulation of MMP2 and MMP9 activities was confirmed. (Figure 4c). Furthermore, when the tube formation was examined using matrigel, sufficient tube formation was induced in the cells transfected with ID3 even without VEGF stimulation (FIG. 4d). This degree of angiogenesis was comparable to that of Mock-introduced cells cultured in the presence of VEGF (10 ng / ml). Together, these results indicate that angiogenesis is induced by forced expression of Id3 in HUVEC.
(5) VEGF-induced proliferation and activation of HUVEC are inhibited by ID1 and ID3 shRNA. Next, whether Id3 is essential for HUVEC cell proliferation, activation and angiogenesis induced by VEGF stimulation. Verified. RNAi was used to inhibit the expression of Id1 and Id3. Vectors expressing ID1 and ID3 small hairpin RNA (shRNA) were introduced into HUVEC at concentrations of 1.25, 5, and 10 ng / ml. HUVECs were cultured for 24 hours in the presence or absence of VEGF (20 ng / ml), and then mRNA of ID3 and GAPDH was quantified.
図５aに示すように、VEGFで誘導されるID3の発現が、ベクターの用量依存的に阻害された。なお、ID1誘導もID3と同様に抑制された。この結果から、以降の実験ではID1、ID3shRNAベクターとも10ng/mlを使用濃度とした。 As shown in FIG. 5a, VEGF-induced ID3 expression was inhibited in a dose-dependent manner in the vector. ID1 induction was also suppressed in the same way as ID3. From this result, the concentration used in the subsequent experiments was 10 ng / ml for both ID1 and ID3 shRNA vectors.
また、shRNAの強制発現を行なってから24時間後に、WST-1を用いてHUVECの増殖を分析した。Id1/Id3ノックダウン細胞は、VEGFで刺激しても、対照と比べると細胞増殖が有意に阻害された（図５b、P<0.05）。 Further, 24 hours after forced expression of shRNA, proliferation of HUVEC was analyzed using WST-1. Id1 / Id3 knockdown cells, even when stimulated with VEGF, significantly inhibited cell proliferation compared to controls (FIG. 5b, P <0.05).
また、VEGF (20 ng/ml)で刺激した、又は刺激していないモックトランスフェクタント、及びVEGFで刺激したID1/ID3 shRNAダブルノックアウト細胞におけるICAM-1、E-セレクチン及びαvインテグリンの表面発現を測定した。 Also surface of ICAM-1, E-selectin and α v integrin in mock transfectants stimulated with or without VEGF (20 ng / ml) and ID1 / ID3 shRNA double knockout cells stimulated with VEGF Expression was measured.
ID1/ID3ダブルノックダウンにより、VEGFによって誘導されるICAM-1及びE-セレクチンの発現を殆ど完全に抑制し、またαvインテグリンの基底発現レベルを低下させた。ICAM-1（図５c）やE-selectin（図５d）のVEGFによる発現上昇も抑制された。さらに他の活性化マーカーであるαvインテグリンの発現も、shRNA非導入細胞と比較して低下していた（図５e）。ID1又はID3 shRNA単独の発現を阻害した場合は、ICAM-1の発現は抑制されたが、他の活性化マーカーであるE-selectinやαvインテグリンの発現を阻害することはできなかった。
(6) VEGF誘導性血管新生はID1 とID3 shRNAによって阻害される
本発明者は、ID1/ID3 ダブルノックダウンHUVECにおいて、VEGF誘導性血管新生が阻害されるか否かを検討した。
ID1 / ID3 double knockdown almost completely suppressed the expression of ICAM-1 and E-selectin induced by VEGF, and reduced the basal expression level of α v integrin. The increase in the expression of ICAM-1 (FIG. 5c) and E-selectin (FIG. 5d) by VEGF was also suppressed. Furthermore, the expression of αv integrin, which is another activation marker, was also reduced as compared with non-shRNA-introduced cells (FIG. 5e). When the expression of ID1 or ID3 shRNA alone was inhibited, the expression of ICAM-1 was suppressed, but the expression of other activation markers such as E-selectin and αv integrin could not be inhibited.
(6) VEGF-induced angiogenesis is inhibited by ID1 and ID3 shRNA The present inventors examined whether VEGF-induced angiogenesis is inhibited in ID1 / ID3 double knockdown HUVEC.
VEGF (20 ng/ml)で8時間刺激した後のID1/ID3 shRNA導入細胞では、VEGF誘導性の遊走能の活性化が抑制された（図６a）。また、ID1/ID3ノックダウン細胞では、VEGF刺激下において、MMP9の産生は下がらなかったのに対し、MMP2の発現は有意に抑制された（図６b）。 In the ID1 / ID3 shRNA-introduced cells after stimulation with VEGF (20 ng / ml) for 8 hours, activation of VEGF-induced migration ability was suppressed (FIG. 6a). In the ID1 / ID3 knockdown cells, MMP9 production did not decrease under VEGF stimulation, whereas MMP2 expression was significantly suppressed (FIG. 6b).
また、遺伝子非導入HUVEC、Mock導入HUVEC、並びにID1及びID3 shRNAのダブル導入HUVEC細胞をVEGF (20 ng/ml)の存在下で24時間培養した。 In addition, non-gene-introduced HUVEC, Mock-introduced HUVEC, and ID1 and ID3 shRNA double-introduced HUVEC cells were cultured in the presence of VEGF (20 ng / ml) for 24 hours.
ID1/ID3ダブルノックダウンによって、管腔形成の顕著な抑制が観察された。VEGF存在下における管腔形成も、ID1及びID3 shRNA導入細胞では減少した（図６c）。これらの血管新生の阻害の理由の一つとして、図６d、eに示すようにID1、ID3 shRNA導入細胞におけるα2及びβ1インテグリンの発現抑制（両インテグリンともダウンレギュレーションされた）が考えられる。 A marked inhibition of lumen formation was observed with ID1 / ID3 double knockdown. Tube formation in the presence of VEGF was also reduced in cells transfected with ID1 and ID3 shRNA (FIG. 6c). As one of the reasons for the inhibition of these angiogenesis, suppression of the expression of α2 and β1 integrin in ID1 and ID3 shRNA-introduced cells (both integrins were down-regulated) as shown in FIGS.
以上の結果から、VEGFによって誘導されるHUVECの血管新生において、Idは必須の役割を果たしていることが示された。 These results indicate that Id plays an essential role in VEGF-induced HUVEC angiogenesis.
IdがVEGFで活性化される血管内皮細胞の活性化、血管新生の誘導に重要なこと、成人の組織ではIdの強い発現があまり見られないことなどから、IdのRNAiを用いた抑制法がRAの治療の新たなターゲットとなりうる。 Inhibition method using Id RNAi because Id is important for vascular endothelial cell activation activated by VEGF, angiogenesis is important, and strong expression of Id is not seen in adult tissues. It can be a new target for the treatment of RA.
配列番号１：合成RNA
配列番号２：合成RNA
配列番号３：合成RNA
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Claims (22)
22. The pharmaceutical composition according to claim 20 or 21, which is used for the treatment of cardiovascular disease.
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Cited By (4)
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|---|---|---|---|---|
| WO2008109450A3 (en) * | 2007-03-02 | 2008-11-20 | Nastech Pharm Co | Nucleic acid compounds for inhibiting id-1 gene expression and uses thereof |
| WO2012000036A1 (en) * | 2010-06-30 | 2012-01-05 | Garvan Institute Of Medical Research | Treatment of abnormalities of glucose metabolism with an antagonist of inhibitor of differentiation 1 |
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-
2003
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