【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、転写因子であるＯＡＳＩＳ（Ｏｌｄ Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）の発現による小胞体（ＥＲ：Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）ストレスによる細胞死、特に神経細胞死からの防御又は保護効果、及び、これを利用したアルツハイマー病やパーキンソン病など神経変性疾患の治療薬のスクリーニング方法などに関する。
【０００２】
【従来の技術】
【０００３】
脳の変性疾患であるアルツハイマー病の患者は現在約１００万人にのぼり、又、パーキンソン病患者は約１０００人に１人が発症しているが、これらに対する有効な治療方法がまだ開発されていない。
最近、このような神経変性疾患の発症に小胞体ストレスが密接に関与することが明らかと成った（アルツハイマー病（Ｋａｔａｙａｍａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １， ４７９−４８５， １９９９）；パーキンソン病（Ｉｍａｉ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １０５， ８９１−９０２））。
「小胞体ストレス」とは、細胞の小胞体で起こる蛋白質折り畳みが細胞内外からの各種ストレスにより撹乱され、非折り畳み蛋白質が蓄積した状態をいい、このような小胞体ストレスから生じる神経細胞死を人為的に制御することは現在点では不可能である。
【０００４】
従って、このような神経変性疾患の治療法開発のためにも、小胞体ストレス応答機構（又は、「非折り畳み蛋白質応答（ＵＰＲ：Ｕｎｆｏｌｄｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」）の全貌を解明することが強く望まれている。
これまでに、小胞体ストレス応答機構においては、小胞体ストレスに対して小胞体ストレス抵抗性シャペロンであるＧＲＰ７８等の遺伝子の発現を増加させて蛋白質の折り畳を促進させることが知られている。例えば、ＩＲＥ１， ＡＴＦ６ ， 及びＰＥＰＫが、一般的な細胞系に共通の小胞体ストレス応答に密接に関わるセンサー分子が同定され、それらのシグナル応答系の多くが解明されてきた。これらのセンサー分子は非折り畳み蛋白質の蓄積を感知し、小胞体ストレス応答を誘起することが知られている。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｋａｔａｙａｍａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １， ４７９−４８５， １９９９
【非特許文献２】
Ｉｍａｉ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １０５， ８９１−９０２
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、グリア細胞は脳虚血や低酸素刺激によって誘導される小胞体ストレスに対して、神経細胞に比べて圧倒的に抵抗性があることが知られている。そこで、グリア細胞には神経細胞には備わっていない特異的な小胞体ストレス応答の情報伝達系（ストレス刺激から分子シャペロンを誘導するシステム）が存在すると考えられる。
【０００７】
そこで、本発明者は、グリア細胞に特異的に備わっていると考えられる小胞体ストレスセンサーともいうべき新規な物質を見出すべく鋭意研究の結果、小胞体膜上に局在する転写因子であるオアシス（ＯＡＳＩＳ）蛋白質がグリア細胞において小胞体ストレスから回避するためのシグナル伝達に重要な役割を担う分子であることを見出した。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
ＯＡＳＩＳ蛋白質は、ＣＲＥＢ（Ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）／ＡＴＦ（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ） ファミリーに属する、膜一回貫通型の塩基性ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）転写因子であり、長期培養後のマウス星状神経膠細胞（アストロサイト）で特異的に発現している遺伝子として同定され、その配列及びコードする蛋白質が解析された（Ｈｏｎｍａ Ｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６９：９３−１０３， １９９９ ）。その後、ヒト由来のＯＡＳＩＳ遺伝子も単離され、その塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列も同定された（Ｏｍｏｒｉ Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ． ２６：２９３（１）： ４０７−７ （２００２））。
【０００９】
ＮＣＢＩのＰｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴ リサーチプログラムを用いて解析したＯＡＳＩＳ蛋白質の構造を図１に示す。中央部分に転写活性に関わるｂＺＩＰ配列を有し、Ｃ末端に膜貫通部位を有する。
【００１０】
これまでに、グリオーシス部位、又は、細胞分化や骨組織形成が盛んな部位でＯＡＳＩＳ遺伝子の発現が上昇していることが報告されている。
しかしながら、その機能については未だ充分な解明がなされてこなかった。
【００１１】
本発明者は、ＯＡＳＩＳ蛋白質は正常状態ではグリア細胞の小胞体膜上に存在するが、グリア細胞に小胞体ストレスが負荷されると、ＯＡＳＩＳ蛋白質はＲＩＰ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎｔｒａｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ）という現象（Ｂｒｏｗｎ， Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ， １００， ３９１−３９８， ２０００）によって膜内で切断され、切断された断片（ＣＲＥＢ／ＡＴＦ 転写因子に共通する塩基性ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）を含む）が核内に輸送され、核内では、こうして切断された断片が、小胞体ストレス応答要素（ＥＲＳＥ： ＥＲ Ｓｔｒｅｓｓ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ）（Ｍｏｒｉ， Ｋ． Ｃｅｌｌ， １０１， ４５１−４５４， ２０００）に結合して、小胞体ストレス抵抗性シャペロンであるＧＲＰ７８等の発現を誘導することを発見し、本発明を完成した。
本発明者は更に、ＯＡＳＩＳ蛋白質の活性化又は発現を促進することにより、小胞体ストレスから生じる神経細胞死を抑制し得ること、更には、神経変性疾患を治療する可能性を確認して本発明を完成した。
【００１２】
即ち、本発明は、第一の態様として、グリア細胞における小胞体ストレスが負荷されることにより、ＯＡＳＩＳ蛋白質から切断されて生じる、塩基性ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）ドメインを含むＮ末端断片からなる活性ポリペプチド、に係る。尚、切断は上記のＲＩＰによって行われると考えられる。
本発明の活性ポリペプチドは塩基性ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）ドメインを含むＮ末端断片であれば、特にその分子量に制限はないが、以下の実施例で示されるように、例えば、分子量が約５０ｋＤａであるポリペプチドを挙げることが出来る。
更に、本発明の活性ポリペプチドの好適例として、ＯＡＳＩＳ蛋白質の１〜３７３番目のアミノ酸配列からなる活性ポリペプチド、及び、ＯＡＳＩＳ蛋白質の１〜３７３番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる、活性ポリペプチドを挙げることが出来る。
【００１３】
本発明の活性ポリペプチドが有する活性とは、具体的には、例えば、ＯＡＳＩＳ蛋白質の標的配列である、小胞体ストレス応答要素（ＥＲＳＥ： ＥＲ Ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）又は環状ＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ：Ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）に対する結合活性、及び、小胞体ストレス抵抗性シャペロンの転写活性等を意味する。
【００１４】
グリア細胞は神経グリアとも呼ばれ、アストログリア、オリゴデンドグリア、ミクログリア、及び上衣細胞より成る。脳の形態維持、神経細胞の遊走、分化の調節などに働き、外傷の際には分裂増殖して脳の瘢痕であるグリオーシスを形成する。本発明において、グリア細胞の由来・種類に特に制限はなく、当業者に公知の任意の各種細胞、例えば、ヒト、マウス、ラット等の哺乳類由来の細胞、更に、樹立細胞株である各種グリオーマ細胞株（例えば、ラットＣ６グリオーマ細胞株）を挙げることが出来る。
【００１５】
小胞体ストレスは、当業者に公知の様々な方法によって細胞内外からの各種ストレスにより引き起こすことが出来る。例えば、サプシガルジン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）又はツニカミシン（ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ）等の薬剤をＯＡＳＩＳ遺伝子を構成的に発現する細胞の培養上清に適当量添加し、その後該細胞を適当時間培養することによって引き起こすことが出来る。
【００１６】
更に、本発明は第二の態様として、上記の活性ポリペプチドをコードする核酸分子に係る。
「核酸分子」の化学構造及び取得経路に特に制限はなく、例えば、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ及びｍＲＮＡ等を含むものである。以上の核酸分子は、具体的には、ｃＤＮＡライブラリーから、前出の文献記載の配列に基づいて、当業者に公知の任意の方法、例えば、ハイブリダイゼーションにより、あるいはポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ） 技術により単離・増幅されうる。
【００１７】
本発明の核酸分子には、ＯＡＳＩＳ蛋白質の１〜３７３番目のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、本発明の活性ポリペプチドが有する上記の活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子、及び、ＯＡＳＩＳ蛋白質の１〜３７３番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、上記活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列から成る核酸分子も含まれる。
【００１８】
ＯＡＳＩＳ蛋白質の１〜３７３番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡとハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、該ＤＮＡの全塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で、約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上である塩基配列を含有するＤＮＡ等を挙げることが出来る。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， １９８９）に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ （ベーリンガー・マンハイム社製Ｃａｔ Ｎｏ． １１７５０３３）でプローブをラベルした場合に、３２℃のＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液（ベーリンガー・マンハイム社製Ｃａｔ Ｎｏ． １６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、４０℃の０．１ｘＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１ｘＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）でのサザンブロットハイブリダイゼーションで上記ＤＮＡプローブにハイブリダイズする程度の条件である。
【００１９】
更に、本発明は第三の態様として、上記のようなＯＡＳＩＳ蛋白質及び遺伝子の機能に基づいた以下の各種方法に係る。
（１）ＯＡＳＩＳ遺伝子の転写を促進させることから成る、小胞体ストレスに対する細胞の抵抗性を増加させる方法；
（２）ＯＡＳＩＳ遺伝子を構成的に発現させることから成る、小胞体ストレスに対する細胞の抵抗性を増加させる方法；及び
（３）ＯＡＳＩＳ遺伝子の転写を促進させるか、又は、ＯＡＳＩＳ遺伝子を構成的に発現させることから成る、神経細胞死の防御方法。
具体的には、例えば、以下に記載する各種の組換えベクターを使用して各細胞を形質転換することによって、小胞体ストレスに対する細胞の抵抗性を増加させたり、神経細胞死から防御することが出来る。
【００２０】
同様に、本発明は第四の態様として、以下の各種のスクリーニング方法にかかる。
（１）ＯＡＳＩＳ遺伝子のプロモーター領域の調節下でリポーター遺伝子を構成的に発現することのできる形質転換細胞株を調製し、該細胞株を被験化合物で処理し、リポーター遺伝子の発現の増減を指標としてＯＡＳＩＳ遺伝子のプロモーターを活性化する化合物を選択することから成る、ＯＡＳＩＳ遺伝子の転写を促進させる化合物のスクリーニング方法；及び
（２）ＯＡＳＩＳ蛋白質の標的（ＤＮＡ）配列の調節下でリポーター遺伝子を構成的に発現することのできる形質転換細胞株を調製し、該細胞株を被験化合物で処理し、リポーター遺伝子の発現の増減を指標としてＯＡＳＩＳ蛋白質又はその切断された活性ポリペプチドの転写活性を増大する化合物を選択することから成る、ＯＡＳＩＳ蛋白質の転写活性を増大させる化合物のスクリーニング方法。
【００２１】
上記の各スクリーニング方法において、リポーター遺伝子としては、当業者に公知の任意の遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子）使用することが出来、使用する遺伝子の種類に応じて、指標となる活性の測定方法等も適宜選択することが出来る。具体的には、例えば、リポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を使用した場合には、ルシフェラーゼの蛍光活性の増減（蛍光発光量の増減）を指標としてＯＡＳＩＳ蛋白質の転写誘導活性を活性化する化合物やＯＡＳＩＳ遺伝子のプロモーターを活性化する化合物を選択することが出来る。
又、上記スクリーニング方法（２）で使用する標的ＤＮＡ配列としては、ＯＡＳＩＳ蛋白質又はその切断断片が特異的に結合する配列として当業者に公知の任意の配列、例えば、小胞体ストレス応答要素、又は、環状ＡＭＰ応答要素を挙げることが出来る。
【００２２】
上記の各方法で使用する形質転換細胞株は、既に記載したような当業者に公知の適当な方法を用いて、公知であるＯＡＳＩＳ遺伝子配列に基づき調製した、ＯＡＳＩＳ遺伝子のプロモーター領域を含む適当な組換えベクター、又は、ＯＡＳＩＳ遺伝子若しくはその一部等の所望の核酸分子を含む適当な組換えベクターを作成し、該組換えベクターで宿主細胞を形質転換することにより得ること出来る。
【００２３】
このようなベクターは、適切な宿主中で ＤＮＡ配列を発現するように、適切な制御配列（ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）とそれが機能するように（ｏｐｅｒａｂｌｙ）（即ち、外来ＤＮＡが発現できるように）連結せしめられたＤＮＡ配列を含有する。そうした制御配列としては、転写させるためのプロモーター、そうした転写を制御するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードしている配列、エンハンサー、リアデニル化配列、及び転写や翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ） の終了を制御する配列等が挙げられる。更にベクターは、当業者に公知の各種の配列、例えば、制限酵素切断部位、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子（選択遺伝子）、シグナル配列、リーダー配列等を必要に応じて適宜含むことが出来る。これらの各種配列又は要素は、外来ＤＮＡの種類、使用する宿主細胞、培養培地等の条件に応じて、当業者が適宜選択して使用することが出来る。
【００２４】
該ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、あるいは単純にゲノムの挿入体（ｇｅｎｏｍｉｃ ｉｎｓｅｒｔ）等の任意の形態が可能である。一旦、適切な宿主の中に形質転換で導入せしめられると、該ベクターは宿住のゲノムとは独立して複製したり機能するものであり得る。又は、該ベクターはゲノムの中に組み込まれるものであってもよい。
組換えベクターは、当該技術分野で公知の方法に従って作成することが出来る。例えば、（１）本発明のＤＮＡを含有するＤＮＡ断片を切り出し、（２）該ＤＮＡ断片を適当な組換えベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。組換えベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＲＳＥＴ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、あるいはＳＶ４０、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、ウシパピローマウイルスなどの動物ウイルス由来配列を使用した組換えベクター等を利用することが出来る。
【００２５】
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主が枯草菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。更に、哺乳動物細胞用のプロモーターとして、例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、ウシパピローマウイルス、及びセムリキフォレストウィルスなどの動物ウイルス由来のプロモーターを挙げることが出来る。
【００２６】
宿主細胞としては当業者に公知の任意の細胞を使用することができるが、例えば、代表的な宿主細胞としては、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） 等の原核細胞、及び、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞） 、ラットＣ６グリオーマ、ヒト由来細胞などの哺乳動物細胞、酵母、昆虫細胞等の真核細胞が挙げることができる。
【００２７】
被験化合物による細胞株の処理は、被験化合物及び細胞株の種類等に応じて当業者に公知の任意の方法で行うことが出来る。例えば、被験化合物を処理細胞の培養上清に適当量添加し、その後該細胞を適当な条件下で培養する方法を挙げることが出来る。
【００２８】
このような各種のスクリーニング方法で同定された化合物は、神経変性疾患治療剤として有用である。
従って、本発明の第五の態様として、こうしたスクリーニング方法で同定された化合物、該化合物から成る神経変性疾患治療剤、及び、この神経変性疾患治療剤を活性成分として含む医薬組成物に係る。
【００２９】
本発明の活性成分の有効量は、例えば治療目的、腫瘍の種類、部位及び大きさ等の投与対象における病状、患者の諸条件、及び投与経路等によって当業者が適宜決めることが出来る。典型的な１回の投与量又は日用量は、上記の条件に応じ、可能ならば、例えば当分野で既知の細胞の生存又は生長についての検定法を使用して、まずインビトロで、そして次に、ヒト患者の為の用量範囲を外挿し得る適切な動物モデルで、適当な用量範囲を決定することもできる。
【００３０】
本発明の医薬組成物には、活性成分の種類、薬剤形態、投与方法・目的、投与対象の病態等の各種条件に応じて、活性成分に加えて当業者に周知の薬学上許容し得る各種成分（例えば、担体、賦形剤、緩衝剤、安定化剤、等）を適宜添加することが出来る。
【００３１】
本発明の医薬組成物は、上記各種条件に応じて、錠剤、液剤、粉末、ゲル、及び、噴霧剤、或いは、マイクロカプセル、コロイド状分配系（リポソーム、マイクロエマルジョン等）、及びマクロエマルジョン等の種々薬剤形態をとり得る。
【００３２】
投与方法としては、静脈内、腹腔内、脳内、脊髄内、筋肉内、眼内、動脈内、特には胆管内、又は病変内経路による注入又は注射、及び持続放出型システム製剤による方法が挙げられる。本発明の活性成分は、輸液により連続的に、または大量注射により投与されることができる。
【００３３】
持続放出製剤は、一般的には、そこから本発明の活性物質をある程度の時間放出することのできる形態のものであり、持続放出調製物の好適な例は、蛋白質を含む固体疎水性ポリマーの半透過性担体を含み、該担体は、例えばフィルムまたはマイクロカプセル等の成型物の形態のものである。
【００３４】
本発明の医薬組成物は、当業者に公知の方法、例えば日本薬局方解説書編集委員会編、第十三改正 日本薬局方解説書、平成８年７月１０日発行、株式会社廣川書店などの記載を参考にしてそれらのうちから必要に応じて適宜選択して製造することができる。
【００３５】
本発明は第六の態様として、ＯＡＳＩＳ蛋白質と結合するトレーサーを用いる、脳虚血又は低酸素ストレス等の各種疾患の診断方法に係る。トレーサーの代表的な例としては、ＯＡＳＩＳ蛋白質又は本発明の活性ポリペプチドに対する抗体を挙げることが出来る。該抗体は、例えば、ポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体、又はその一部のドメインなどから抗体断片のような当業者に公知の任意の形態とすることが出来る。このような各種抗体は当業者に公知の適当な方法で調製することが出来る。
このようなトレーサーには、測定方法に応じて、任意の適当な物質で標識することが好ましい。該診断方法は、当業者に公知の任意の装置を使用して行うことが出来るが、例えば、ポジトロンＣＴ（ＰＥＴ）により測定することが可能である。
【００３６】
本発明は第七の態様として、治療対象に、ＯＡＳＩＳ蛋白質又は本発明の活性ポリペプチドをコードする遺伝子を投与し、該治療対象内で該遺伝子を発現させることからなる、神経変性疾患の遺伝子治療方法に係る。
該遺伝子が細胞に導入可能な担体に組み込まれていることが好ましい。具体的には、該担体として適当なリポソーム内に該遺伝子を包埋させたり、又は、遺伝子を有する適当なベクターを作成して、それを標的細胞に導入することにより該遺伝子を発現させることが可能である。
遺伝子の投与方法、投与形態等は当業者に公知であり、既に本発明の医薬組成物に関して記載した内容に準じるものである。
【００３７】
該ベクターに含まれるプロモーターとして、例えば、上記のような哺乳動物細胞用の各種動物ウイルス由来のプロモーターを使用することが出来る。該ベクターには、更に、例えば、神経細胞のような標的細胞の染色体上の標的部位（例えば、ＳＭＮ遺伝子のイントロン７等）との相同組換えを可能にする為に、このような相同組換えに適した配列を組み込むことが好ましい。
【００３８】
以下、実施例を挙げて本発明を詳述する。尚、これらの実施例は本発明の技術的範囲を何等限定するものではない。又、特記がない限り、各操作方法は当該技術分野において公知の標準的な方法で実施した。
【００３９】
実施例１：ＯＡＳＩＳの膜近傍での切断
マウス生直後（７日目）脳から抽出したＲＮＡをＭＭＬＶ逆転写酵素で逆転写したｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。使用したプライマーは以下のとおりである。
５’プライマー； ５’−ＡＴＧＧＡＣＧＣＣＧＴＣＴＴＧＧＡＡＣＣＴＴ−３’（配列番号１）
３’プライマー； ５’−ＣＴＡＧＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＧ−３’（配列番号２）
こうして増幅したマウスＯＡＳＩＳ遺伝子をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にＴＡクローニングによりクローニングし、マウスＯＡＳＩＳ遺伝子を構成的に発現するように構築された哺乳類細胞発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）を得た。この発現ベクターをラットＣ６グリオーマにリポフェクトアミン（ＧＩＢＣＯ） を用いて遺伝子導入し、ＣＭＶプロモーター制御下でＯＡＳＩＳ遺伝子を構成的に発現するラットＣ６グリオーマ細胞株を樹立した。
その後に、選択剤Ｇ４１８を用いて、ＯＡＳＩＳ遺伝子を構成的に発現する細胞株を取得した。得られた細胞に小胞体ストレスを引き起こす薬剤（サプシガルジン）１μＭを培養上清に添加し各時間後に回収した。細胞を可溶化バッファー（０．９％ ＳＤＳ， １５ｍＭＥＤＴＡ， ８ｍＭ Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ， １０００Ｕ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）で可溶化した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ を実施した。膜に転写した後、一次抗体として抗ＯＡＳＩＳ抗体を用いたウエスターンブロッティングを行った。
尚、一次抗体はマウスＯＡＳＩＳのＮ末端部分（１−２９２）を抗原としてラビットに免疫して作成し、ａｆｆｉｎｉｔｙ精製したものを実験に使用した。
その結果を図２に示す。図２に示されるように、小胞体ストレスを負荷するとＯＡＳＩＳ蛋白質の約５０ｋＤａ切断断片が観察された。この結果から、小胞体ストレス下で、ＯＡＳＩＳ蛋白質が膜近傍で切断され、活性化ポリペプチドが生成することが明らかとなった。尚、ＯＡＳＩＳ蛋白質の全長は約８０ｋＤａである。
【００４０】
実施例２：ＯＡＳＩＳ発現細胞における小胞体ストレス抵抗性の増加
実施例１と同様に、ＯＡＳＩＳ遺伝子を構成的に発現するラットＣ６グリオーマ細胞株に小胞体ストレスを引き起こす薬剤（サプシガルジン）１μＭを培養上清に添加し、その後に経時的な形態変化を位相差顕微鏡（型式： ＮＩＫＯＮ ＤＩＡＰＨＯＴ３００ 倍率：ｘ １００）を用いて観察した。
その結果を図３に示す。図３から、ＯＡＳＩＳ遺伝子を発現していないコントロールと比較して、ＯＡＳＩＳ発現細胞では小胞体ストレスに対して明らかに抵抗性が増加し、細胞死が抑制されたことが確認された。
【００４１】
実施例３：ＯＡＳＩＳ蛋白質のＮ末端断片発現によるＧＬＡＳＴ遺伝子の発現上昇
ＣＲＥを有することが知られているＧＬＡＳＴ遺伝子（Ｓｃｈｌｕｔｅｒ， Ｋ．，ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．， １６， ８３６−８４２， ２００２）の５’ 上流５ｋｂｐをｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ ｖｅｃｔｏｒ （Ｐｒｏｍｅｇａ 社）にクローニングしたリポーターベクターを作成した。
次に、実施例１で作成した哺乳類細胞発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）を鋳型に、以下のプライマー を使用して、ＯＡＳＩＳ蛋白質のＮ末端断片（アミノ酸１−３７３）をコードする塩基配列を調製し、そのＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングした。
５’プライマー； ５’−ＡＴＧＧＡＣＧＣＣＧＴＣＴＴＧＧＡＡＣＣＴＴ−３’（配列番号３）
３’プライマー； ５’−ＧＧＴＧＣＣＧＧＴＣＴＧＣＧＴＧＧＣＴＧＣＣＡＴ−３’（配列番号４）
これらの２種類のベクターでラットＣ６グリオーマ細胞株を共形質転換し、遺伝子導入後３０時間目に、実施例１と同様に、回収して可溶化し、その後、ルシフェラーゼ発光量をルミノメーターで測定した。
その結果を図４に示した。図４から、ＯＡＳＩＳ蛋白質のＮ末端断片を発現させると、ＧＬＡＳＴのリポーター活性が有意に上昇したことが分かった。一方、ＡＴＦ６のＮ末端部分を導入してもそのような効果は観察されなかった。これらのことから、ＯＡＳＩＳ蛋白質のＮ末端断片がＣＲＥ配列を有する遺伝子の発現を上昇ないし増加させることが確認された。
【００４２】
実施例４：ＯＡＳＩＳ蛋白質のＮ末端断片発現によるＧＲＰ７８／ＢｉＰに含まれる小胞体ストレス応答要素（ＥＲＳＥ）に制御されるリポーター遺伝子の発現上昇
ＥＲＳＥを有することが知られているＧＲＰ７８／Ｂｉｐ遺伝子（Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２７３， ３３７４１−３３７４９， １９９８）の５’ 上流１３２ｂｐをｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ ｖｅｃｔｏｒ （Ｐｒｏｍｅｇａ 社）にクローニングしたリポーターベクターと、実施例３で作成したＯＡＳＩＳ蛋白質のＮ末端断片（ＯＡＳＩＳ（３７４）：アミノ酸１−３７３）を含む発現ベクターをラットＣ６グリオーマ細胞株に導入し、遺伝子導入後３０時間目に、実施例３と同様に、回収して可溶化し、その後、ルシフェラーゼ発光量をルミノメーターで測定した。
その結果を図５（Ａ）に示した。図５（Ａ）から、ＯＡＳＩＳ蛋白質のＮ末端断片を発現させると、ＧＲＰ７８／Ｂｉｐのリポーター活性が有意に上昇したことが分かる。ＡＴＦ６のＮ末端部分およびＸＢＰ−１もＯＡＳＩＳと同様の効果を示した。また、ＯＡＳＩＳのドミナントネガティブとして働くＯＡＳＩＳ（Δ５６：ＯＡＳＩＳのＮ末端から５６番目までが欠失したミュータント）はＧＲＰ７８／Ｂｉｐのリポーター活性を亢進させる活性は認められなかった。
次に実際にＯＡＳＩＳ蛋白質のＮ末端断片がＧＲＰ７８／Ｂｉｐ ｍＲＮＡの発現を亢進するか否かを調べるため、上記２種類の発現ベクターを２９３Ｔ細胞に導入し、ＯＡＳＩＳ蛋白質のＮ末端断片を２９３Ｔ細胞に一過性に発現させた後、ノザンブロッティングを行った。
その結果を図５（Ｂ）に示した。ＯＡＳＩＳ蛋白質のＮ末端断片を発現させると、ＧＲＰ７８／Ｂｉｐ ｍＲＮＡの発現上昇したことが分かる。ＡＴＦ６のＮ末端部分もＧＲＰ７８／Ｂｉｐ ｍＲＮＡの強い発現上昇を引き起こした。一方、ドミナントネガティブとして働くＯＡＳＩＳ（Δ５６）はＧＲＰ７８／ＢｉｐｍＲＮＡ発現を亢進させる活性は認められなかった。
尚、本発明の各実施例において、Ｃ６グリオーマ細胞および２９３Ｔ細胞とも、培養液はＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ ｃａｌｆｓｅｒｕｍ）を使用し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。
【００４３】
【発明の効果】
本発明によって、小胞体膜上に局在する転写因子であるＯＡＳＩＳ蛋白質及びそのＮ末端断片がグリア細胞において小胞体ストレスから回避するためのシグナル伝達に重要な役割を担う分子であることが見出された。このＯＡＳＩＳにより小胞体ストレス抵抗性が増加し、又、小胞体ストレス起因となる細胞死を防御する上でＯＡＳＩＳが効果的に作用することも確認された。
従って、本発明は、神経疾患の中でも患者数が多いと考えられるアルツハイマー病やパーキンソン病など神経変性疾患に対する根本的な治療薬を開発するための有力なスクリーニング方法等を提供するものである。
【００４４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴ リサーチプログラムを用いて解析したＯＡＳＩＳ蛋白質の構造を示す。
【図２】小胞体ストレス下で、ＯＡＳＩＳ蛋白質が膜近傍で切断され、活性化ポリペプチドが生成することを示す、ウエスターンブロッティングにより得られた写真である。
【図３】位相差顕微鏡による、ＯＡＳＩＳ発現細胞等の経時的な形態変化を示す写真である。
【図４】ＯＡＳＩＳ蛋白質のＮ末端断片によるＧＬＡＳＴ遺伝子の発現上昇を示すグラフである。
【図５】ＯＡＳＩＳ蛋白質のＮ末端断片によるＧＲＰ７８／Ｂｉｐ遺伝子の発現上昇を示すグラフ（Ａ）及び電気泳動の写真（Ｂ）である。
尚、図４及び図５中の記号の意味は以下のとおりである。
ｐｃＤＮＡ：ベクターのみ； ＴＧ：サプシガルジン１μＭ； ＯＡＳＩＳ（３７４）：ＯＡＳＩＳ蛋白質のＮ末端断片（アミノ酸１−３７３）； ＡＴＦ６：ＡＴＦ６のＮ末端部分； ＸＢＰ１：転写因子ＸＢＰ−１。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention utilizes a protective effect or protective effect against cell death caused by endoplasmic reticulum (ER: Endoplasmic Reticulum) stress caused by expression of transcription factor OASIS (Old Astrocytic Specific-Induced Substance), particularly neuronal cell death. The present invention relates to a screening method for therapeutic agents for neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease.
[0002]
[Prior art]
[0003]
There are currently about 1 million patients with Alzheimer's disease, a degenerative brain disease, and approximately 1 in 1000 patients with Parkinson's disease, but no effective treatment has yet been developed. .
Recently, it has become clear that endoplasmic reticulum stress is closely involved in the development of such neurodegenerative diseases (Alzheimer's disease (Katayama, T. et al., Nature Cell Biology, 1, 479-485, 1999); Parkinson's disease (Imai, Y. et al., Cell, 105, 891-902)).
“Endoplasmic reticulum stress” refers to the state in which protein folding that occurs in the endoplasmic reticulum of cells is disturbed by various stresses from inside and outside the cell, and unfolded protein accumulates. It is not possible to control automatically.
[0004]
Therefore, in order to develop a therapeutic method for such neurodegenerative diseases, it is strongly desired to elucidate the whole picture of the endoplasmic reticulum stress response mechanism (or "Unfolded Protein Response (UPR)"). Yes.
So far, it has been known that, in the endoplasmic reticulum stress response mechanism, protein folding is promoted by increasing the expression of a gene such as GRP78, which is an endoplasmic reticulum stress-resistant chaperone, with respect to endoplasmic reticulum stress. For example, IRE1, ATF6, and PEPK have been identified sensor molecules that are closely related to the endoplasmic reticulum stress response common to common cell systems, and many of these signal response systems have been elucidated. These sensor molecules are known to sense unfolded protein accumulation and induce an endoplasmic reticulum stress response.
[0005]
[Non-Patent Document 1]
Katayama, T .; et al. , Nature Cell Biology, 1, 479-485, 1999.
[Non-Patent Document 2]
Imai, Y .; et al. , Cell, 105, 891-902
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
By the way, it is known that glial cells are overwhelmingly resistant to endoplasmic reticulum stress induced by cerebral ischemia or hypoxic stimulation as compared with nerve cells. Thus, it is considered that glial cells have a specific endoplasmic reticulum stress response information transmission system (a system that induces molecular chaperones from stress stimulation) that is not provided in neurons.
[0007]
Therefore, as a result of intensive research to find a novel substance that should be referred to as an endoplasmic reticulum stress sensor that is considered to be specifically provided in glial cells, the present inventor has conducted an oasis that is a transcription factor localized on the endoplasmic reticulum membrane. It has been found that (OASIS) protein is a molecule that plays an important role in signal transduction to avoid endoplasmic reticulum stress in glial cells.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
OASIS protein is a single-transmembrane basic leucine zipper (bZIP) transcription factor belonging to CREB (Cyclic AMP response element) / ATF (activating transcription factor) family, and is a mouse astrocyte after long-term culture It was identified as a gene specifically expressed in (astrocytes), and the sequence and the encoded protein were analyzed (Honma Y, et al., Molecular Brain Research 69: 93-103, 1999). Subsequently, a human-derived OASIS gene was also isolated, and the nucleotide sequence and the amino acid sequence encoded by the gene were also identified (Omori Y. et al., Biochem Biophysic Res Commun. 26: 293 (1): 407-7 ( 2002)).
[0009]
The structure of the OASIS protein analyzed using NCBI's Protein BLAST research program is shown in FIG. It has a bZIP sequence related to transcriptional activity in the central part and a transmembrane site at the C-terminus.
[0010]
So far, it has been reported that the expression of the OASIS gene is increased at a gliosis site or a site where cell differentiation or bone tissue formation is active.
However, the function has not been fully elucidated.
[0011]
The present inventor has found that the OASIS protein is present on the endoplasmic reticulum membrane of the glial cell in a normal state, but when the endoplasmic reticulum stress is applied to the glial cell, the OASIS protein becomes a phenomenon called Browned Mprobe (RIP). S. et al., Cell, 100, 391-398, 2000), and the cleaved fragment (including the basic leucine zipper (bZIP) common to CREB / ATF transcription factor) in the nucleus In the nucleus, the fragment thus cleaved binds to the ER Stress Response Element (ERSE) (Mori, K. Cell, 101, 451-454, 2000) to form the endoplasmic reticulum. Stress resistance The present invention was completed by discovering that it induces the expression of GRP78, which is a sex chaperone.
The present inventor further confirmed that neuronal cell death resulting from endoplasmic reticulum stress can be suppressed by promoting activation or expression of OASIS protein, and further confirmed the possibility of treating neurodegenerative diseases. Was completed.
[0012]
That is, the present invention provides, as a first aspect, an active poly- mer composed of an N-terminal fragment containing a basic leucine zipper (bZIP) domain, which is generated by being cleaved from OASIS protein by being loaded with endoplasmic reticulum stress in glial cells. Peptides. Note that the cutting is considered to be performed by the above RIP.
As long as the active polypeptide of the present invention is an N-terminal fragment containing a basic leucine zipper (bZIP) domain, its molecular weight is not particularly limited. For example, as shown in the following examples, the molecular weight is about 50 kDa. A certain polypeptide can be mentioned.
Furthermore, as a preferred example of the active polypeptide of the present invention, one or several amino acids in the active polypeptide consisting of the 1st to 373rd amino acid sequences of the OASIS protein and the 1st to 373rd amino acid sequences of the OASIS protein are Mention may be made of active polypeptides consisting of deleted, substituted or added amino acid sequences.
[0013]
Specifically, the activity of the active polypeptide of the present invention is, for example, an endoplasmic reticulum stress response element (ERSE) or a cyclic AMP response element (CRE) that is a target sequence of the OASIS protein. It means binding activity to response element), transcriptional activity of endoplasmic reticulum stress-resistant chaperone, and the like.
[0014]
Glial cells, also called neuroglia, consist of astroglia, oligodendria, microglia, and ependymal cells. It works to maintain brain morphology, nerve cell migration, and regulation of differentiation. During trauma, it divides and proliferates to form gliosis, the scar of the brain. In the present invention, the origin and type of glial cells are not particularly limited, and various cells known to those skilled in the art, for example, cells derived from mammals such as humans, mice, rats, and various glioma cells that are established cell lines. Strains (eg, rat C6 glioma cell line).
[0015]
Endoplasmic reticulum stress can be caused by various stresses from inside and outside the cell by various methods known to those skilled in the art. For example, it can be caused by adding an appropriate amount of a drug such as thapsigargin or tunicamycin to the culture supernatant of cells that constitutively express the OASIS gene, and then culturing the cells for an appropriate time.
[0016]
Furthermore, this invention relates to the nucleic acid molecule which codes said active polypeptide as 2nd aspect.
The chemical structure and acquisition route of the “nucleic acid molecule” is not particularly limited, and includes, for example, gDNA, cDNA, chemically synthesized DNA, mRNA, and the like. Specifically, the above nucleic acid molecule is obtained from a cDNA library, based on the sequence described in the above-mentioned literature, by any method known to those skilled in the art, for example, by hybridization, or by the polymerase chain reaction (PCR) technique. Can be isolated and amplified.
[0017]
The nucleic acid molecule of the present invention comprises an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the 1st to 373rd amino acid sequences of the OASIS protein, and the active polypeptide of the present invention has the above-mentioned It hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid molecule encoding a polypeptide having activity and a DNA consisting of a base sequence encoding the amino acid sequence 1 to 373 of the OASIS protein under stringent conditions. Nucleic acid molecules consisting of a base sequence encoding a polypeptide having the same are also included.
[0018]
Examples of DNA capable of hybridizing with DNA consisting of a base sequence encoding the amino acid sequence 1 to 373 of the OASIS protein and complementary DNA include, for example, the degree of homology with the entire base sequence of the DNA. And a DNA containing a base sequence of about 85% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more. Hybridization can be performed according to a method known in the art such as the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) or a method analogous thereto. Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual. Here, “stringent conditions” means, for example, when a probe is labeled with DIG DNA Labeling (Cat No. 1175033, manufactured by Boehringer Mannheim), a DIG Easy Hyb solution (Cat manufactured by Boehringer Mannheim) at 32 ° C. No. 1603558) and washing the membrane in 0.1 × SSC solution (containing 0.1% [w / v] SDS) at 40 ° C. (1 × SSC is 0.15 M NaCl, 0.015 M Quench) The condition is such that it hybridizes to the DNA probe by Southern blot hybridization with sodium acid.
[0019]
Furthermore, the present invention relates to the following various methods based on the functions of the OASIS protein and gene as described above as a third aspect.
(1) A method for increasing cellular resistance to endoplasmic reticulum stress, comprising promoting transcription of an OASIS gene;
(2) a method of increasing cellular resistance to endoplasmic reticulum stress comprising constitutively expressing an OASIS gene; and
(3) A method for preventing neuronal cell death, which comprises promoting transcription of the OASIS gene or constitutively expressing the OASIS gene.
Specifically, for example, by transforming each cell using the various recombinant vectors described below, it is possible to increase cell resistance to endoplasmic reticulum stress or to protect against neuronal cell death. I can do it.
[0020]
Similarly, the present invention relates to the following various screening methods as a fourth embodiment.
(1) A transformed cell line capable of constitutively expressing a reporter gene under the control of the promoter region of the OASIS gene is prepared, the cell line is treated with a test compound, and the increase or decrease in expression of the reporter gene is used as an index. A method of screening for a compound that promotes transcription of the OASIS gene, comprising selecting a compound that activates the promoter of the OASIS gene; and
(2) preparing a transformed cell line capable of constitutively expressing a reporter gene under the control of the target (DNA) sequence of the OASIS protein, treating the cell line with a test compound, and increasing or decreasing the expression of the reporter gene A method for screening a compound that increases the transcriptional activity of an OASIS protein, comprising selecting a compound that increases the transcriptional activity of the OASIS protein or its cleaved active polypeptide using as an index.
[0021]
In each of the above screening methods, any gene known to those skilled in the art (for example, a luciferase gene) can be used as a reporter gene. Depending on the type of gene used, a method for measuring activity as an index can also be used. It can be selected as appropriate. Specifically, for example, when a luciferase gene is used as a reporter gene, an increase or decrease in the fluorescence activity of luciferase (increase or decrease in the amount of fluorescence emission) is used as an index, and a compound or OASIS gene that activates the transcription-inducing activity of OASIS protein. A compound that activates the promoter can be selected.
The target DNA sequence used in the screening method (2) is any sequence known to those skilled in the art as a sequence to which the OASIS protein or its cleaved fragment specifically binds, such as an endoplasmic reticulum stress response element, or A cyclic AMP response element can be mentioned.
[0022]
The transformed cell line used in each of the above methods is an appropriate one containing an OASIS gene promoter region prepared based on a known OASIS gene sequence using an appropriate method known to those skilled in the art as described above. It can be obtained by preparing a recombinant vector or a suitable recombinant vector containing a desired nucleic acid molecule such as OASIS gene or a part thereof, and transforming a host cell with the recombinant vector.
[0023]
Such a vector is ligated so that it can be expressed in a suitable host with an appropriate control sequence so that it can function (ie, so that foreign DNA can be expressed). Containing the resulting DNA sequence. Such control sequences include a promoter for transcription, any operator sequence to control such transcription, sequences encoding appropriate mRNA ribosome binding sites, enhancers, reardenylation sequences, and transcription and translation. And an array for controlling the termination of. Further, the vector can appropriately contain various sequences known to those skilled in the art, for example, restriction enzyme cleavage sites, marker genes (selection genes) such as drug resistance genes, signal sequences, leader sequences, and the like as necessary. These various sequences or elements can be appropriately selected and used by those skilled in the art according to conditions such as the type of foreign DNA, the host cell used, the culture medium, and the like.
[0024]
The vector can be in any form such as a plasmid, a phage particle, or simply a genomic insert. Once introduced into a suitable host by transformation, the vector can replicate or function independently of the resident genome. Alternatively, the vector may be one that is integrated into the genome.
A recombinant vector can be prepared according to a method known in the art. For example, it can be produced by (1) excising a DNA fragment containing the DNA of the present invention and (2) ligating the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate recombinant vector. Recombinant vectors include plasmids derived from E. coli (eg, pRSET, pBR322, pBR325, pUC18, pUC118), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), A recombinant vector using a bacteriophage such as λ phage, or an animal virus-derived sequence such as SV40, cytomegalovirus (CMV), retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, bovine papilloma virus, or the like can be used.
[0025]
The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression. For example, when the host is Escherichia coli, T7 promoter, trp promoter, lac promoter, recA promoter, λPL promoter, lpp promoter, etc., and when the host is Bacillus subtilis, SPO1, SPO2, promoter, penP promoter, etc. When Y is yeast, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable. Furthermore, examples of promoters for mammalian cells include promoters derived from animal viruses such as CMV, SV40, retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, bovine papilloma virus, and Semliki Forest virus.
[0026]
As the host cell, any cell known to those skilled in the art can be used. For example, typical host cells include Escherichia coli.(E. coliAnd the like, and mammalian cells such as Chinese hamster ovary cells (CHO cells), rat C6 glioma, and human-derived cells, and eukaryotic cells such as yeast and insect cells.
[0027]
Treatment of the cell line with the test compound can be performed by any method known to those skilled in the art depending on the type of the test compound and the cell line. For example, a method of adding an appropriate amount of a test compound to the culture supernatant of treated cells and then culturing the cells under appropriate conditions can be mentioned.
[0028]
Compounds identified by such various screening methods are useful as therapeutic agents for neurodegenerative diseases.
Accordingly, the fifth aspect of the present invention relates to a compound identified by such a screening method, a therapeutic agent for neurodegenerative disease comprising the compound, and a pharmaceutical composition comprising the therapeutic agent for neurodegenerative disease as an active ingredient.
[0029]
An effective amount of the active ingredient of the present invention can be appropriately determined by those skilled in the art depending on, for example, the therapeutic purpose, the type of tumor, the site and size of the subject to be administered, the conditions of the patient, the administration route, and the like. A typical single dose or daily dose will depend on the above conditions and, if possible, first in vitro, and then, for example, using assays known in the art for cell survival or growth. Appropriate dose ranges can also be determined with appropriate animal models that can extrapolate dose ranges for human patients.
[0030]
The pharmaceutical composition of the present invention contains various pharmaceutically acceptable pharmacological agents well known to those skilled in the art in addition to the active ingredient, depending on various conditions such as the type of active ingredient, pharmaceutical form, administration method / purpose, and pathological condition of the administration target. Components (eg, carriers, excipients, buffers, stabilizers, etc.) can be added as appropriate.
[0031]
The pharmaceutical composition of the present invention is a tablet, solution, powder, gel, spray, or microcapsule, colloidal distribution system (liposome, microemulsion, etc.), macroemulsion, etc., depending on the above various conditions. Various drug forms are possible.
[0032]
Examples of administration methods include intravenous, intraperitoneal, intracerebral, intraspinal, intramuscular, intraocular, intraarterial, in particular intrabiliary or intralesional injection or injection, and sustained release system formulations. It is done. The active ingredients of the present invention can be administered continuously by infusion or by bulk injection.
[0033]
Sustained release formulations are generally of a form from which the active substance of the present invention can be released for a period of time, and suitable examples of sustained release preparations include solid hydrophobic polymers containing proteins. A semipermeable carrier is included, which is in the form of a molded product, such as a film or microcapsule.
[0034]
The pharmaceutical composition of the present invention can be prepared by methods known to those skilled in the art, such as the Japanese Pharmacopoeia Manual Editorial Committee, 13th revised Japanese Pharmacopoeia, July 10, 1996, Yodogawa Shoten Co., Ltd. In view of the description, it can be appropriately selected and manufactured from among them.
[0035]
As a sixth aspect, the present invention relates to a method for diagnosing various diseases such as cerebral ischemia or hypoxic stress using a tracer that binds to an OASIS protein. Representative examples of tracers include antibodies to the OASIS protein or the active polypeptide of the present invention. The antibody can be in any form known to those skilled in the art, such as an antibody fragment from, for example, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, or a partial domain thereof. Such various antibodies can be prepared by an appropriate method known to those skilled in the art.
Such a tracer is preferably labeled with any appropriate substance depending on the measurement method. The diagnostic method can be performed using any device known to those skilled in the art, and can be measured by, for example, positron CT (PET).
[0036]
The present invention provides, as a seventh aspect, gene therapy for neurodegenerative diseases, comprising administering a gene encoding the OASIS protein or the active polypeptide of the present invention to a treatment subject and expressing the gene in the treatment subject. Related to the method.
The gene is preferably incorporated in a carrier that can be introduced into cells. Specifically, the gene can be expressed by embedding the gene in a liposome suitable as the carrier, or by creating an appropriate vector having the gene and introducing it into a target cell. Is possible.
Gene administration methods, administration forms, and the like are known to those skilled in the art, and are similar to those already described for the pharmaceutical composition of the present invention.
[0037]
As the promoter contained in the vector, for example, promoters derived from various animal viruses for mammalian cells as described above can be used. The vector further includes such homologous recombination in order to allow homologous recombination with a target site on the chromosome of the target cell such as a neuron (eg, intron 7 of the SMN gene). It is preferable to incorporate a sequence suitable for.
[0038]
The present invention will be described in detail below with reference to examples. These examples do not limit the technical scope of the present invention. Unless otherwise specified, each operation method was carried out by a standard method known in the art.
[0039]
Example 1: Cutting near the OASIS membrane
Immediately after the mouse was born (day 7), PCR was performed using as a template a cDNA obtained by reverse transcription of RNA extracted from the brain with MMLV reverse transcriptase. The used primers are as follows.
5 'primer; 5'-ATGACGCGCCGTCTTGGAACCTT-3' (SEQ ID NO: 1)
3 'primer; 5'-CTAGGAGAGTTTGATGGGTGGTTG-3' (SEQ ID NO: 2)
The mouse OASIS gene thus amplified was cloned into the pGEM-T vector (Promega) by TA cloning to obtain a mammalian cell expression vector (pcDNA3.1) constructed to constitutively express the mouse OASIS gene. This expression vector was introduced into rat C6 glioma using lipofectamine (GIBCO) to establish a rat C6 glioma cell line that constitutively expresses the OASIS gene under the control of the CMV promoter.
Thereafter, a cell line constitutively expressing the OASIS gene was obtained using the selection agent G418. To the obtained cells, 1 μM of an agent (sapargardine) that causes endoplasmic reticulum stress was added to the culture supernatant and collected after each time. The cells were solubilized with a solubilization buffer (0.9% SDS, 15 mM EDTA, 8 mM Methionine, 1000 U Protease Inhibitor Cocktail), and then SDS-PAGE was performed. After transfer to the membrane, Western blotting using an anti-OASIS antibody as the primary antibody was performed.
The primary antibody was prepared by immunizing rabbits using the N-terminal part (1-292) of mouse OASIS as an antigen, and using the antibody purified for affinity.
The result is shown in FIG. As shown in FIG. 2, an approximately 50 kDa fragment of OASIS protein was observed when endoplasmic reticulum stress was applied. From this result, it became clear that under endoplasmic reticulum stress, the OASIS protein is cleaved in the vicinity of the membrane and an activated polypeptide is produced. The full length of the OASIS protein is about 80 kDa.
[0040]
Example 2: Increased endoplasmic reticulum stress resistance in OASIS expressing cells
In the same manner as in Example 1, 1 μM of a drug (sapsigargin) that causes endoplasmic reticulum stress was added to the rat C6 glioma cell line that constitutively expresses the OASIS gene to the culture supernatant. (Model: NIKON DIAPHOT300 Magnification: x100).
The result is shown in FIG. From FIG. 3, it was confirmed that OASIS-expressing cells clearly increased resistance to endoplasmic reticulum stress and suppressed cell death compared to controls that did not express the OASIS gene.
[0041]
Example 3: Increased expression of GLAST gene by expression of N-terminal fragment of OASIS protein
PGL3-Basic vector (Promega) 5 ′ upstream 5 kbp of GLAST gene (Schluter, K., et al., Eur. J. Neurosci., 16, 836-842, 2002) known to have CRE A reporter vector cloned in was prepared.
Next, using the mammalian cell expression vector (pcDNA3.1) prepared in Example 1 as a template, the following primers are used to prepare a base sequence encoding the N-terminal fragment (amino acids 1-373) of OASIS protein. The PCR product was cloned into the pGEM-T vector.
5 'primer; 5'-ATGGACCGCCGTCTTGGAACCTT-3' (SEQ ID NO: 3)
3 'primer; 5'-GGTGCCGGTCTGCGGTGGCTGCCAT-3' (SEQ ID NO: 4)
A rat C6 glioma cell line was co-transformed with these two types of vectors and recovered and solubilized in the same manner as in Example 1 at 30 hours after gene introduction, and then the luciferase luminescence was measured with a luminometer. did.
The results are shown in FIG. From FIG. 4, it was found that when the N-terminal fragment of OASIS protein was expressed, the reporter activity of GLAST was significantly increased. On the other hand, no such effect was observed when the N-terminal part of ATF6 was introduced. From these facts, it was confirmed that the N-terminal fragment of OASIS protein increases or increases the expression of a gene having a CRE sequence.
[0042]
Example 4: Increased expression of reporter gene controlled by endoplasmic reticulum stress response element (ERSE) contained in GRP78 / BiP due to expression of N-terminal fragment of OASIS protein
PGL3-Basic vector (Promega, Inc.) 5 ′ upstream 132 bp of the GRP78 / Bip gene known to have ERSE (Yoshida, H. et al., J. Biol. Chem., 273, 33741-33749, 1998) ) And an expression vector containing the N-terminal fragment of the OASIS protein (OASIS (374): amino acid 1-373) prepared in Example 3 was introduced into a rat C6 glioma cell line, and 30 hours after gene introduction. Eyes were collected and solubilized in the same manner as in Example 3, and then the luciferase luminescence was measured with a luminometer.
The results are shown in FIG. FIG. 5 (A) shows that when the N-terminal fragment of the OASIS protein is expressed, the reporter activity of GRP78 / Bip is significantly increased. The N-terminal part of ATF6 and XBP-1 also showed the same effect as OASIS. In addition, OASIS (Δ56: mutant lacking from the N-terminal to the 56th position of OASIS) acting as a dominant negative of OASIS did not have an activity to enhance the reporter activity of GRP78 / Bip.
Next, in order to investigate whether the N-terminal fragment of OASIS protein actually enhances the expression of GRP78 / Bip mRNA, the above two types of expression vectors were introduced into 293T cells, and the N-terminal fragment of OASIS protein was introduced into 293T cells. After being expressed transiently, Northern blotting was performed.
The result is shown in FIG. It can be seen that the expression of GRP78 / Bip mRNA was increased when the N-terminal fragment of OASIS protein was expressed. The N-terminal part of ATF6 also caused a strong increase in GRP78 / Bip mRNA expression. On the other hand, OASIS (Δ56), which acts as a dominant negative, was not found to have an activity to enhance GRP78 / Bip mRNA expression.
In each Example of the present invention, the culture solution for both C6 glioma cells and 293T cells was DMEM + 10% FCS (Fetal calf serum) at 37 ° C., 5% CO 2.2Cultured in the presence.
[0043]
【The invention's effect】
According to the present invention, the OASIS protein, which is a transcription factor localized on the endoplasmic reticulum membrane, and its N-terminal fragment are found to be molecules that play an important role in signal transduction to avoid ER stress in glial cells. It was done. It has been confirmed that OASIS increases resistance to endoplasmic reticulum stress, and that OASIS acts effectively in protecting cell death caused by endoplasmic reticulum stress.
Therefore, the present invention provides an effective screening method for developing a fundamental therapeutic agent for neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease, which are considered to have a large number of patients among neurological diseases.
[0044]
[Sequence Listing]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the structure of an OASIS protein analyzed using the Protein BLAST research program.
FIG. 2 is a photograph obtained by Western blotting showing that an OASIS protein is cleaved in the vicinity of the membrane under the endoplasmic reticulum stress to produce an activated polypeptide.
FIG. 3 is a photograph showing morphological changes of OASIS-expressing cells and the like over time using a phase contrast microscope.
FIG. 4 is a graph showing the increase in expression of the GLAST gene by the N-terminal fragment of OASIS protein.
FIG. 5 is a graph (A) showing an increase in expression of GRP78 / Bip gene by an N-terminal fragment of OASIS protein and a photograph (B) of electrophoresis.
The meanings of symbols in FIGS. 4 and 5 are as follows.
pcDNA: vector only; TG: sapigargin 1 μM; OASIS (374): N-terminal fragment of OASIS protein (amino acids 1-373); ATF6: N-terminal part of ATF6; XBP1: transcription factor XBP-1.