JP2005040060A

JP2005040060A - 細胞を多孔性生体親和性材料に高効率で播種する方法

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Publication number: JP2005040060A
Application number: JP2003277949A
Authority: JP
Inventors: Shinji Higashiyama; 真二東山; Yukihiro Hirose; 志弘廣瀬; Hajime Ogushi; 始大串; Kiyohito Yagi; 清仁八木
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2003-07-23
Filing date: 2003-07-23
Publication date: 2005-02-17

Abstract

【課題】本発明は、細胞を用いて傷害された臓器を治療する再生医療技術の範囲で、培養細胞を多孔性の生体材料の孔内に効率高く播種・保持する方法を提供することを課題とする。
【解決手段】本発明では、多孔性生体親和性材料の孔内に細胞を播種する方法であって、外力を用いて細胞を多孔性生体材料の孔内に導入する方法により細胞に障害を与えずに多孔性材料の孔内に効率高く細胞を保持させた。この細胞／多孔性生体材料複合体を生体内に移植することにより、孔内への新生血管構築に起因する細胞の長期機能維持を実現した。
【選択図】図１

Description

本発明は、通常の細胞播種法では実現できない多孔性生体親和性材料の孔内に細胞を効率良く播種し、その孔内に細胞を保持する技術に属する。

本発明の方法により得られる細胞組込型デバイスは、移植後に人工臓器として良好にヒトないし哺乳動物の体内に移植することができ、移植後においても細胞の機能を長期間保持することができる。

種々の臓器傷害を細胞を用いて治療する再生医療が発展してきている。根本治療として臓器移植が考慮されるが、ドナー不足は深刻である。人工臓器も重要な選択肢であるが、生物機能を有さないのでその治療効果は短期的である。

この解決策として、細胞そのものを移植する細胞療法が試みられているが、そのレシピエントへの生着率の低さのため大量の細胞数を確保しなくてはならない問題がある。そのため、細胞を材料に組み込み、その代謝機能を利用するハイブリッド型人工臓器の開発が求められている。これまで、生体外で機能するバイオリアクターに代表される細胞組込型デバイスが用いられてきたが、大量の細胞数を必要としながら、その機能が短期間しか持続しない欠点があった。
細胞を播種・保持するための多孔性生体材料は数多く知られているが（特許文献１〜５）、多孔性生体材料に通常の自由落下により細胞を播種する方法では、その孔内に細胞を有効に播種・保持することが困難であった。

また、特許文献６は、遠心力、減圧、加圧等を利用して細胞を播種する方法を開示しているが、その具体的な条件についての開示はなく、常圧下での播種方法と比較して細胞の機能が保持されていたのかどうかについても記載していない。
特開2003-010309 特開2002-146086 特開2002-146084 特開2002-143291 特開2002-143290 特開2002-282285

本発明は、多数の細胞を播種・保持させることで、その機能を長期間持続可能なバイオリアクターに代表される細胞組込型デバイスを提供することを目的とする。

本発明者は上記課題に鑑み検討を重ねた結果、遠心、減圧、加圧、振動などにより細胞に外力を加えることで多孔性材料の孔内に多数の培養細胞を密に充填することができ、細胞機能が長期間持続可能であることを見出した。

本発明は、以下の方法を提供するものである。
項１．多孔性生体親和性材料の孔内に細胞を播種する方法であって、外力を用いて細胞を多孔性生体材料の孔内に導入する方法。
項２．前記生体親和性材料が、
(1)ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、カルシウム欠損型アパタイト、非晶
質リン酸カルシウム、リン酸四カルシウム、リン酸八カルシウム、フッ素化アパタイト、炭酸アパタイト、炭酸カルシウム、ピロリン酸カルシウム、モネタイト、生体内でリン酸カルシウム類を吸着することができる無機化合物を包含するセラミックス系材料；
(2)コラーゲン、ゼラチン、キチン、キトサン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、
コンドロイチン硫酸、フィブリン、アルギン酸、フィブロイン、デンプン、ペクチン、ペクチン酸、アガロース並びにこれらの部分分解物、酸化物、アルキレンオキシド付加物、カルボキシメチル化物及び架橋体を包含する天然高分子；及び
(3)ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリメタクリル酸メチル、メタク
リル酸エステル系ポリマー、シリコーン樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリε−カプロラクトンなどの生体吸収性高分子の単独重合体又は共重合体を包含する合成高分子；からなる群から選ばれる少なくとも１種である項１に記載の方法。
項３．前記生体親和性材料が、ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、カルシウム欠損型アパタイト、非晶質リン酸カルシウム、リン酸四カルシウム、リン酸八カルシウム、フッ素化アパタイト、炭酸アパタイト、炭酸カルシウム、ピロリン酸カルシウム、モネタイト、生体内でリン酸カルシウム類を吸着することができる無機化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種のセラミックス系材料を含み、任意成分としてコラーゲン、ゼラチン、キチン、キトサン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、フィブリン、アルギン酸、フィブロイン、デンプン、ペクチン、ペクチン酸、アガロース並びにこれらの部分分解物、酸化物、アルキレンオキシド付加物、カルボキシメチル化物及び架橋体を包含する天然高分子又はポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリメタクリル酸メチル、メタクリル酸エステル系ポリマー、シリコーン樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリε−カプロラクトンなどの生体吸収性高分子の単独重合体又は共重合体を包含する合成高分子からなる群から選ばれる少なくとも１種をさらに含んでいてもよい項１または２に記載の方法。
項４．細胞を多孔性生体材料の孔内に導入する外力が、1Gより大きく、200G以下である項１〜３のいずれかに記載の方法。
項５．前記外力が遠心力、加圧、減圧及び振動からなる群から選ばれる項１〜４のいずれかに記載の方法。
項６．前記多孔性生体親和性材料の気孔率は20%から95%、気孔径の範囲は、50 μmから600 μmである項１〜５のいずれかに記載の方法。
項７．前記多孔性生体親和性材料に細胞を有効播種するときの気孔率と外力の条件は、気孔率95%〜65%のとき外力1G超かつ30G以下、気孔率65%〜40%のとき外力30G〜120G、気孔率40%〜20%のとき外力120G〜200Gである項１〜６のいずれかに記載の方法。
項８．前記多孔性生体親和性材料に細胞を有効播種するときの気孔径と外力の条件は、気孔径600 μm〜500 μmのとき外力1G超かつ30G以下、気孔径500 μm〜200 μmのとき外
力30G〜120G、気孔径200 μm〜50 μmのとき外力120G〜200Gである項１〜６のいずれかに記載の方法。
項９．前記多孔性生体親和性材料の形状が、塊状、シート状、ビーズ状、ディスク状またはスポンジ状の形状である項１〜８のいずれかに記載の方法。
項１０．項１〜９のいずれかの方法により得られた細胞を孔内に導入した多孔性生体材料をヒト又は哺乳動物に移植することを特徴とする移植方法。

本発明において、多孔性生体親和性材料の気孔率（空隙率）は、通常20〜95%程度、好
ましくは30〜80％程度、より好ましくは40〜65%程度である。気孔率が大きすぎると十分
な強度が得られず、気孔率が小さすぎると十分な数の細胞を保持できなくなる。

多孔性生体親和性材料の気孔径は、十分な数の細胞が保持できる限り特に限定されないが、通常50〜600 μm程度、好ましくは100〜500 μm程度、より好ましくは200〜400 μm
程度である。孔径が小さすぎると外力を作用させても細胞が入り難くなり、孔径が大きすぎると、細胞の出入りが容易になり、細胞が内部に定着し難くなる。

多孔性生体親和性材料は無機系材料及び有機系材料のいずれでもよく、１種又は２種以上の材料を組み合わせて使用することができる。

無機系材料としては、ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、カルシウム欠損型アパタイト、非晶質リン酸カルシウム、リン酸四カルシウム、リン酸八カルシウム、フッ素化アパタイト、炭酸アパタイト、炭酸カルシウム、ピロリン酸カルシウム、モネタイト、生体内でリン酸カルシウム類を吸着することができる無機化合物が例示される。「生体内でリン酸カルシウム類を吸着することができる無機化合物」としては、チタン、チタン化合物、ガラスセラミックス、ゼオライト、シリカが例示される。

有機系材料としては、コラーゲン、ゼラチン、キチン、キトサン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、フィブリン、アルギン酸、フィブロイン、デンプン、ペクチン、ペクチン酸、アガロース並びにこれらの部分分解物、酸化物、アルキレンオキシド付加物、カルボキシメチル化物及び架橋体を包含する天然高分子、及び、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリメタクリル酸メチル、メタクリル酸エステル系ポリマー、シリコーン樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリε−カプロラクトンなどの生体吸収性高分子の単独重合体又は共重合体を包含する合成高分子が例示される。

多孔性生体親和性材料は無機系材料からなるか、無機系材料と有機系材料を組み合わせて使用するのが好ましい。無機系材料と有機系材料を組み合わせ使用する場合では、多孔質の無機系材料表面に有機系材料をコーティングする構成を好ましく例示できる。

前記材料の多孔質体は、公知の方法により製造することができる。例えば、前記有機系材料の多孔質体は、発泡剤を利用する発泡成形法、あるいは多孔質化剤除去法等周知の方法により得ることができる。この多孔質体の発泡成型法においては、高分子化合物に発泡剤を添加し発泡剤を発泡させた後、上記高分子を硬化させる。高分子溶液中に、水溶性の糖類あるいは塩類を添加し、硬化後、該水溶性物質を水で洗浄除去すればよい。また、前記無機系材料の多孔質体は、無機系材料粉末を有機系バインダーと共に混合、造形し、焼結して製造することができる。

生体親和性材料が無機系材料と有機系材料を含む場合、無機系材料の表面に有機系材料をコーティングすることができる。また有機高分子材料をカルシウム塩又はその溶液とリン酸塩又はその溶液で処理することによりリン酸カルシウムを析出させるなどの任意の方法により有機系材料の表面を無機系材料で処理することも可能である。

前記多孔性生体親和性材料の形状としては、塊状、シート状、ビーズ状、ディスク状またはスポンジ状などの形状が例示される。

多孔性生体親和性材料には、細胞が播種される。播種される細胞としては、肝臓、腎臓、膵臓、脳、脊髄、胆嚢、副腎、脾臓、胃、甲状腺などの臓器由来細胞が挙げられ、好ましくは、肝実質細胞、尿細管上皮細胞、膵β細胞、ドパミン産生細胞、神経細胞、グリア細胞、クロマフィン細胞、甲状腺上皮細胞などが例示される。細胞は、１種のみの細胞を播種しても良く、複数の細胞を同時に又は順次播種してもよい。複数の細胞を用いる場合、同一臓器の細胞を用いても良く、異なる臓器の細胞を使用してもよい。また、多孔質体内に血管を導入するために、線維芽細胞、血管内皮細胞等を他の細胞と混合してもよい。

細胞は、ヒト又は動物、特に哺乳動物由来の細胞が使用できる。また、細胞は、２種以上の細胞を融合した融合細胞を使用してもよい。

本発明の方法により得られた細胞を孔内に導入した多孔性生体材料をヒトに移植する場合には、ヒト又は他の動物由来の細胞、特にヒト由来の細胞が好ましく使用できる。

本発明では、前記多孔性材料に外力を利用して前記細胞を播種して効率よく細胞を導入して細胞密度の高い多孔性材料を得る。

外力としては、遠心力、加圧、減圧及び振動が例示される。

本発明において、細胞を播種するとは、多孔体の内部に高密度の細胞群を形成することをいう。細胞は、多孔体の空間の20%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは70%以上
、特に80%以上を占める。細胞内に栄養分が供給される限り、多孔体の空間のほぼ100%が
細胞で占められていてもよい。

多孔体内で細胞は一群の集団ないし密集体として存在することができる。

外力を用いて細胞を播種する方法は、
(1)加圧：例えば細胞懸濁液（液体培地又はバッファー等）と多孔性生体親和性材料を
底部が多孔質の容器内に入れ、例えば容器に密着する注射用シリンジ等を用いて、容器内を加圧状態にし、培養液を容器外に押し出すと共に細胞を多孔性材料内部に導入する方法；
(2)減圧：細胞懸濁液と多孔性生体親和性材料を底部が多孔質の容器内に入れ、例えば
底部側を減圧して、容器内の培養液を容器底部から抜き出すと共に細胞を多孔性材料内部に導入する方法；
(3)遠心力：細胞懸濁液及び多孔性生体親和性材料を容器内に入れ、通常の遠心機を用
いて、細胞の種類及び多孔性材料の材質、孔径等に応じて細胞に傷害を与えない範囲の遠心力をかけることにより多孔性材料内部に細胞を導入する方法；
(4)振動：細胞懸濁液を底部に多孔性材料を含む容器内に入れ、機械的振動や音波等を
加えることにより、重力を利用して細胞を多孔性材料内に導入する方法；
が例示される。

本発明の特に好ましい実施形態において、前記多孔性生体親和性材料に細胞を有効播種するときの気孔率または気孔径と外力の条件は、
・気孔率95%〜65%のとき外力1G超かつ30G以下、
・気孔率65%〜40%のとき外力30G〜120G、
・気孔率40%〜20%のとき外力120G〜200G、
・気孔径600 μm〜500 μmのとき外力1G超かつ30G以下、
・気孔径500 μm〜200 μmのとき外力30G〜120G、
・気孔径200 μm〜50 μmのとき外力120G〜200Gである。

このような条件を満たす場合、細胞の播種によりその活性が低下しないため特に好ましい。

１回外力をかけた場合に細胞が多孔性材料の片側に偏って播種される場合、多孔性材料をひっくり返し、複数回外力を加えることで、多孔質材料の細胞密度をより高めることが可能である。

本発明の播種方法により得られる、細胞を高密度に含む多孔性材料は、細胞を外力によ
り強制的に高密度で多孔性材料内に導入したにもかかわらず、細胞の機能は培養細胞と同等以上を維持している。従って、生体内に移植された場合にも、その臓器の一部の機能を十分に発揮することができる。

移植部位としては、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内などが例示される。

例えば、肝実質細胞を多孔性材料に播種後、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内等の適切な生体内部位に移植した場合、アルブミン等のタンパク質・酵素の産生や各種物質代謝などの機能を発揮することができる。また、インシュリン産生細胞を播種した多孔性材料であれば、インシュリンの産生により血糖値を低下させることが可能である。

肝細胞などの各種細胞をバラバラの培養細胞として、或いは細胞塊として移植したとしても、これらの細胞は周辺の組織に吸収されて、その機能を発揮させることはできない。

一方、本発明のように、細胞を高密度で多孔性生体親和性材料に播種後に移植した場合には、細胞は周辺の組織と独立してその機能を長期間持続できるだけでなく、細胞数（細胞密度）が大きいため、十分な程度でその機能を発揮することができる。

細胞を多孔性生体親和性材料の孔内に高密度で播種する手法により、細胞数の低減を実現するとともに、生体内での細胞の長期機能維持を実現した。

実施例１
本発明の実施例１として、遠心操作によりラット肝細胞を高密度に含むラット肝細胞／ハイドロキシアパタイトセラミックス複合体の作製方法、作製した複合体をモデル動物に移植後の結果について記述する。

１．細胞培養
肝実質細胞は、雄SDラット肝臓よりSeglenの方法に従い単離した。単離した肝実質細胞を、Williams E培地に10%ウシ胎児血清（以下FBSとする）、100 ng/mLアプロチニン、1 nM
インスリン、1 nMデキサメサゾン、50 U/mLペニシリンＧ、100μg/mLストレプトマイシン、50 ng/mLアンホテリシンＢを加えたもの（IDSA培地）で懸濁した。細胞懸濁液を直径5

mm、高さ2 mm、平均孔径200 μmのハイドロキシアパタイトセラミックス上に、3X10⁵個播種した。肝細胞／ハイドロキシアパタイトセラミックス複合体を、37？C、5% CO₂存在下I
DSA培地で６時間培養後、Williams E培地に10% FBS、50 U/mLペニシリンＧ、100μg/mLストレプトマイシン、50 ng/mLアンホテリシンＢを加えた培地で培養した。培地交換は24時間おきにおこなった。

２．遠心操作を用いた細胞播種
肝細胞を高密度に充填するため、肝細胞懸濁液（2.5X10⁶個/mL）5 mLの入った50 mL遠心
管にハイドロキシアパタイトセラミックスを４個入れ、遠心操作（50G、 1分）を三回お
こなった。この肝細胞／ハイドロキシアパタイトセラミックス複合体を、37？C、5% CO₂
存在下IDSA培地で６時間培養後、Williams E培地に10% FBS、50 U/mLペニシリンＧ、100

μg/mLストレプトマイシン、50 ng/mLアンホテリシンＢを加えた培地で培養した。培地交換は24時間おきにおこなった。

培養６日目に解析したところ、この遠心操作によりハイドロキシアパタイトセラミックスに保持された細胞数は、遠心操作をおこなわなかったコントロールと比較して、セラミックス当たり約４倍であった（図１A）。

３．尿素合成活性測定
培養肝細胞による、尿素合成活性の測定は、培養開始後６日目に、肝細胞／ハイドロキシアパタイトセラミックス複合体の培養系に1 mM 塩化アンモニウムを添加し、4時間後までに培養液中に生成される尿素量を定量することによりおこなった。評価は１時間に生成される尿素量をハイドロキシアパタイトセラミックス１個当たりに換算した。

遠心操作によりハイドロキシアパタイトセラミックスに保持される肝細胞の数は、遠心操作をおこなわなかったコントロールと比較して４倍に増加したので、尿素合成活性もハイドロキシアパタイト１個当たり４倍になった（図１B）。

４．肝細胞／ハイドロキシアパタイトセラミックス複合体の無アルブミンラットへの移植
遠心操作により作製した肝細胞／ハイドロキシアパタイトセラミックス複合体を、37？C、5% CO₂存在下IDSA培地で６時間培養後、この複合体をSDラット由来の雄の無アルブミ
ンラットの腹腔内に移植した。移植操作をおこなわなかった無アルブミンラットをコントロールに用いた。

５．血清アルブミン濃度測定法
前項４による移植後１、２、３週目に無アルブミンの尾静脈から採血し、抗ラットアルブミン抗体を用いたサンドイッチELISAにより、血清アルブミン濃度を定量した。

移植後１、２、３週目の血清アルブミン濃度は、移植操作をおこなわなかったコントロールと比較して有意に高値を示した（図２）。このことは、少なくとも移植後３週目までは肝細胞が生体内で生存し、機能を果たしていたことを示している。

６．組織化学的解析
前項４による移植後３週目に無アルブミンラット腹腔内より肝細胞／ハイドロキシアパタイトセラミックス複合体を取り出した。この複合体を、10%ホルマリン溶液で固定し、
脱灰後に薄切切片を作製した。この切片をヘマトキシリン／エオジン溶液で染色後、光学顕微鏡で観察した。

移植後３週間目の複合体を観察したところ、ハイドロキシアパタイト孔内で肝細胞が生着していた。その孔内に明らかな血管新生が観察された（図３）。遠心操作によりハイドロキシアパタイト孔内に生着した肝細胞が、この新生血管による血流により、その生存と機能発現が可能となったものと推察された。

図１は、ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）中で、遠心法により播種された生存肝細胞のディスクあたりの生存数の維持を示す。「Ａ」は培養６日後のトリパンブルー排除試験によりカウントされた生存細胞数を示す。「Ｂ」は培養６日後のディスクあたりの値として表される尿素合成量を示す。値は３回の実験の平均±SD（標準偏差）である。アステリスク（＊＊）は統計手法による有意差（^**ｐ＜0.01）を示す。図２は、肝細胞が播種されたＨＡディスクを移植されたナガセ無アルブミンラット（NAR）血清アルブミン濃度の増加を示す。移植されたラットの血清アルブミンレベル（◆）と移植されていないラットの血清アルブミンレベル（■）をサンドイッチELISAで１週間に１度測定した。値は３回の実験の平均±SD（標準偏差）である。アステリスク（＊）は非移植コントロールからの有意差（^*ｐ＜0.05）を示す。ナガセ無アルブミンラット(NAR)中に移植されたＨＡディスクの血管形成を示す。ＨＡディスクは、移植３週間後に取り出された。矢頭は形成された血管の断面図である。

Claims

多孔性生体親和性材料の孔内に細胞を播種する方法であって、外力を用いて細胞を多孔性生体材料の孔内に導入する方法。
前記生体親和性材料が、
(1)ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、カルシウム欠損型アパタイト、非
晶質リン酸カルシウム、リン酸四カルシウム、リン酸八カルシウム、フッ素化アパタイト、炭酸アパタイト、炭酸カルシウム、ピロリン酸カルシウム、モネタイト、生体内でリン酸カルシウム類を吸着することができる無機化合物を包含するセラミックス系材料；
(2)コラーゲン、ゼラチン、キチン、キトサン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸
、コンドロイチン硫酸、フィブリン、アルギン酸、フィブロイン、デンプン、ペクチン、ペクチン酸、アガロース並びにこれらの部分分解物、酸化物、アルキレンオキシド付加物、カルボキシメチル化物及び架橋体を包含する天然高分子；及び
(3)ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリメタクリル酸メチル、メタ
クリル酸エステル系ポリマー、シリコーン樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリε−カプロラクトンなどの生体吸収性高分子の単独重合体又は共重合体を包含する合成高分子；
からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の方法。
前記生体親和性材料が、ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、カルシウム欠損型アパタイト、非晶質リン酸カルシウム、リン酸四カルシウム、リン酸八カルシウム、フッ素化アパタイト、炭酸アパタイト、炭酸カルシウム、ピロリン酸カルシウム、モネタイト、生体内でリン酸カルシウム類を吸着することができる無機化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種のセラミックス系材料を含み、任意成分としてコラーゲン、ゼラチン、キチン、キトサン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、フィブリン、アルギン酸、フィブロイン、デンプン、ペクチン、ペクチン酸、アガロース並びにこれらの部分分解物、酸化物、アルキレンオキシド付加物、カルボキシメチル化物及び架橋体を包含する天然高分子又はポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリメタクリル酸メチル、メタクリル酸エステル系ポリマー、シリコーン樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリε−カプロラクトンなどの生体吸収性高分子の単独重合体又は共重合体を包含する合成高分子からなる群から選ばれる少なくとも１種をさらに含んでいてもよい請求項１または２に記載の方法。
細胞を多孔性生体材料の孔内に導入する外力が、1G（Gは重力加速度）より大きく、200G
以下である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
前記外力が遠心力、加圧、減圧及び振動からなる群から選ばれる請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
前記多孔性生体親和性材料の気孔率は20%から95%、気孔径の範囲は、50 μmから600 μm
である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
前記多孔性生体親和性材料に細胞を有効播種するときの気孔率と外力の条件は、気孔率95
%〜65%のとき外力1G超かつ30G以下、気孔率65%〜40%のとき外力30G〜120G、気孔率40%〜2
0%のとき外力120G〜200Gである請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
前記多孔性生体親和性材料に細胞を有効播種するときの気孔径と外力の条件は、気孔径60
0 μm〜500 μmのとき外力1G超かつ30G以下、気孔径500 μm〜200 μmのとき外力30G〜12
0G、気孔径200 μm〜50 μmのとき外力120G〜200Gである請求項１〜６のいずれかに記載
の方法。
前記多孔性生体親和性材料の形状が、塊状、シート状、ビーズ状、ディスク状またはスポンジ状の形状である請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
請求項１〜９のいずれかの方法により得られた細胞を孔内に導入した多孔性生体材料をヒト又は哺乳動物に移植することを特徴とする移植方法。