JP2004538330A - 免疫応答増強剤 - Google Patents

Abstract

本発明は免疫原性組成物ならびに当該組成物の作製方法および使用方法に関する。免疫原性組成物は、指示分子、刺激因子および免疫原を含有する。刺激因子および指示分子は化学的に異なる。刺激因子および免疫原は、免疫原と、指示分子または刺激因子の一方だけとから生じる免疫応答に対して改善された免疫応答をもたらすために対応する量で存在する。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫学の分野に関し、詳細には、病原体、哺乳動物抗原および他の臨床的に重要な標的に対する改善されたインビボ抗体応答を生じさせることにおいて宿主を助けるための、異なるクラスのアジュバントの組合せに関する。
【背景技術】
【０００２】
７５年前に、Ｒａｍｏｎは、発熱性細菌によるワクチンを投与することによってジフテリアおよび破傷風に対する抗毒素応答を高めることが可能であることを明らかにした。そのときから、ヒトにおけるその使用を妨げる、しばしば存在する毒性副作用を最小限に抑えることを試みながら、アジュバントによる免疫応答を増強するための努力が臨床家および免疫学者によって現在まで続けられている。
【０００３】
一般に、抗原は、ＡＰＣの表面の主要組織適合抗原複合体分子（ＭＨＣ）に関連して、Ｂ細胞、樹状細胞およびマクロファージを含む抗原提示細胞によって免疫系に「提示」される。通常、免疫原として与えられた合成抗原および天然抗原は、ＡＰＣによって取り込まれ、部分的に消化され、これにより、元の無傷の抗原のより小さい要素が細胞表面に発現させられると考えられている。
【０００４】
現在、Ｂリンパ球に対して、Ｔリンパ球は、可溶性の抗原と相互作用することが比較的できないと理解されている。典型的には、Ｔリンパ球は、上記に記されたように、抗原がプロセシングされ、その後、ＭＨＣ分子に関連してＡＰＣの細胞表面に発現されることを要求する。Ｔ細胞、具体的にはＴ細胞の受容体は、抗原を、プロセシングされた抗原と、１つまたは複数のＭＨＣ分子とから構成される二分子リガンドの形態で認識する。ＡＰＣは、Ｔ細胞の効果的な初回抗原刺激が生じ得る前に同時刺激分子を発現するために活性化されなければならないと考えられている。
【０００５】
樹状細胞についてさらに詳しく述べると、ＤＣは、最も強力な抗原提示細胞であり、そして明らかに、（以前に刺激されていない）本来のＴ細胞を一次免疫応答において活性化することができる唯一の細胞であると考えられる（非特許文献１参照）。ワクチンが、完全なＴ細胞免疫性および最適な抗体応答を生じるようになるには、ナイーブＴ細胞の活性化が必要である。残念ながら、樹状細胞は数が少ない。樹状細胞は、二次的なリンパ様器官では４００個の細胞に１個、ＷＢＣでは５００個に１個、そしてほとんどの非リンパ様組織では１０００個の細胞に１個含まれるにすぎない。数が少ないことは、任意の個々の抗原エピトープ、すなわちＭＨＣ−ペプチド複合体に応答することができるナイーブＴ細胞の低い頻度（これは、１０，０００に１つ程の低さであると見積もられる）によってさらに度合いを強めることになる（非特許文献２参照）。要約すれば、最も良い免疫応答を生じさせることは、結局のところ、抗原を１つの稀な細胞に到達させ、引き続いて、これが別の稀な免疫細胞と相互作用しなければならないということである。
【０００６】
ナイーブＴ細胞は、血流によってリンパ節を通って連続して再循環しており（非特許文献３参照）、これに対して、未成熟な樹状細胞は非リンパ様器官に比較的安定的に存在している（非特許文献４参照）。未成熟な樹状細胞は、低レベルの表面ＭＨＣ分子および同時刺激分子を発現しており、そのため、Ｔ細胞の弱い細胞性活性化因子にすぎない。しかしながら、これらの細胞は飲作用性および食作用性であり、これにより、潜在的な病原体の存在についてそれらの環境を絶えずサンプリングすることが可能である。適切な「刺激」（刺激性アジュバント）にさらされたとき、未成熟な樹状細胞が動員され、局所的な組織から解放され、異なるリンパ管を経て移動してリンパ節に流出する（非特許文献１参照）。リンパ節に移動している間に、ＤＣは成熟し、強力なＴ細胞活性化因子になる。ランゲルハンス細胞が、おそらくはＤＣの最も研究されている細胞である。ランゲルハンス細胞は、他の非リンパ様器官で見出される未成熟の樹状細胞よりも高頻度でランゲルハンス細胞が存在する皮膚および粘膜の表皮層に存在する。アジュバントを各タイプの免疫細胞および特にランガヘルン（Ｌａｎｇａｈｅｒｎ）タイプのＤＣに適合させる能力は、大きい利益を有しうるであろう。
【０００７】
上記に示された理由のために、多くの免疫原およびその一部分（エピトープ）は、外来性および内因性の両方を含めて、多くの場合、免疫系によって認識されないか、または弱く認識されるにすぎない。そのような標的に対する抗体を生じさせることはこれまで困難であり、場合により不可能であった。この問題は、小さいハプテンを用いて研究しているときに、または小さい非免疫原性ペプチドからなるサブユニットワクチンを開発しているときに遭遇することが多い。そのようなワクチンを調製するための従来の方法では、これらの抗原は、より大きい免疫原性を有し、かつワクチン標的でもあるタンパク質キャリアとコンジュゲート化することによって高分子として提示される（複合ワクチン（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｖａｃｃｉｎｅｓ））。しかし、非常に多くの場合、コンジュゲートは、免疫原性がより低い物質に対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘導することが依然としてできない。これらの場合、アジュバントが必要とされる。残念ながら、（承認済みおよび治験中の）現在のアジュバントの多くは、免疫応答の幾つかの局面を高めることができるが、あまりにも一般的なことではあるが、必要なレベルのＣＴＬ応答、血清応答を誘発することができず、および／または、幾つかのタイプの毒性を示す。ウイルス感染に関する現在の見解では、保護は、長期記憶および細胞傷害性Ｔ細胞を含む液性の免疫性および細胞媒介による免疫性の両方によって最も良く達成されることが示唆されている。
【０００８】
特許文献１には、刺激因子としてこの発明で分類されるいくつかの作用因子とともに免疫原を局所投与することが記載されている。発明者らは、ＤＣ成熟化の優れた概要、および刺激因子に対する必要性を示しているが、指示分子（ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）および刺激因子の組合せは何ら述べていない。
【０００９】
特許文献２には、様々な局所的な前処理剤および前処理アジュバントが記載されている。この発明はそれらの一部を刺激因子として分類しているが、この発明では、抗原の標的化は議論されてない。送達経路は、ＩＭ、経口、鼻腔および直腸的に限定されている。
【００１０】
特許文献３では、その発明者らはサポニンをα２−ＭおよびＨＳＰと組み合わせることを記載している。この文書には、この発明が刺激因子として分類する他の応答修飾因子が列記されている。データは示されず、相乗的な関係の証拠も示されなかったが、単一刺激因子（サポニン）を２つの異なる指示分子と組み合わせることが記載された。両方の指示分子は同じ受容体（ＣＤ９１）に対するものであったので、発明者らは、２つのクラスのアジュバントの間におけるより広い関係を認識し、明らかにすることができなかった。さらに、ＨＳＰは、ストレスを受けた細胞に関連しており、「刺激因子」タイプのエピトープを有することが予想されるので、サポニンからの寄与は明かではない。発明者らは、抗体の使用については何ら言及していなかった。
【００１１】
特許文献４には、抗原標的化が議論されているが、２つのクラスのアジュバントを組み合わせたときに達成され得る協同性の説明が不足している。研究はＤＮＡ抗原に集中しており、抗原および指示分子はＰＥＩのような試薬とコンジュゲート化されなければならないことが暗示される。わずかに２倍の増強が第１の送達経路によって観測されただけであり、これは、第２の送達経路により指示分子を伴うことなく抗原を送達することと釣り合うようであった。本出願明細書において前記で議論されたように、従来の免疫原のようなＤＮＡ抗原は刺激因子を依然として要求する。この国際公開の書類には、この発明においてい、そのくつかが分類される他の指示分子が列記される。標的化分子を伴う遺伝子送達複合体を抗レトロウイルス薬療法と一緒に送達する方法が論じられている（特許文献５）。
【００１２】
別の観点から、研究者および試薬開発者がインビボおよびインビトロでの適用のために抗体を作製しようとするとき、動物がさらされる毒性を低下させることもまた求められている。１９８５年に、米国公衆保健サービスは、施設内の動物管理および使用委員会（ＩＡＣＵＣ）を設立することを動物施設に命じるガイドラインを策定した。ＩＡＣＵＣは、その施設に関して、完全フロイントアジュバントなどの毒性剤の動物実験における削減を確実にする責任を有する。今日まで、何らかのレベルの毒性を局所的または全身的のいずれでも示さない、ＣＦＡの有効性を代替する物は存在しない。
【００１３】
歴史的には、指示分子および刺激因子は別々に使用されてきた。これは、あるクラスのアジュバントはそれ以外のクラスのアジュバントを損ない得ると免疫学者は考えていたからである。実際、抗原指向化法の多くは、刺激因子に対する必要性を回避することが特に意図されており、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）などの刺激因子が、かつては、完全フロイントに対する非依存的な選択肢であると勧められていた。本発明では、免疫原および刺激因子が、指向性（提示）抗体および／またはα２−マクログロブリンとともに意図的に用いられる。
【００１４】
数が少ない未成熟な抗原提示細胞（ＡＰＣ）による抗原の補足、ＡＰＣの成熟化および取り込み、そして最後に、抗原特異的Ｔ細胞とのＡＰＣ相互作用の増大を促進するアジュバントおよびそのようなアジュバントの選択方法が求められている。これらのアジュバント属性は、従来の免疫原に対して、ならびに、同じ制約を受けるより新しいＤＮＡ／ＲＮＡ免疫原に対しても必要とされる（非特許文献５）。１つだけの役割を果たすアジュバントと組み合わせられた抗原では、最も良い可能な免疫応答が実現されない。
【００１５】
【特許文献１】
米国特許出願公開第２００１／００２４６４９号明細書
【特許文献２】
国際公開第９９／４３３５０号パンフレット
【特許文献３】
国際公開第０２／１１６６９号パンフレット
【特許文献４】
国際公開第９９／１３９１５号パンフレット
【特許文献５】
米国特許出願公開第２００２／００２２０３４号明細書
【非特許文献１】
Banchereau and Steinman 1998 Nature 392: 245-252
【非特許文献２】
Mason 1998 Immunol. Today 19: 395-404
【非特許文献３】
Gretz et al 1996 J Immunol. 157: 495-499
【非特許文献４】
Cowing and Gilmore 1992 J. Immunol. 148: 1072-1079
【非特許文献５】
Iwasaki et al 1997. J. Immunol. 159: 11
【非特許文献６】
Stockinger, B. 1992
【非特許文献７】
Fossum, S., et al., 1992. "Targeting Antigens to Antigen Presenting Cells". Semin. In Immunol. 4: 275
【非特許文献８】
Chattergoon M. A. et al., 2000
【非特許文献９】
Kensil R. C., 1996
【非特許文献１０】
Kawamura and Berzofsky, 1986
【非特許文献１１】
Manca et al., 1991
【非特許文献１２】
Bahr et al., 1985
【非特許文献１３】
Balsap et al., 2000
【非特許文献１４】
Harte et al., 1983
【非特許文献１５】
Rock et al., 1984
【非特許文献１６】
Binder, R. J. et al., J of Immunol, 2001, 166: 4968-4972
【非特許文献１７】
Unanvel, 1981
【非特許文献１８】
Barret and Starkey, 1973
【非特許文献１９】
Pizzo et al., 1984
【非特許文献２０】
R. C. Brunham et al., 2000. J. of Infectious Disease 538-543
【非特許文献２１】
J. J Donnelly, et al., 1997. Ann. Review of Immunology 15: 617-648
【非特許文献２２】
R. A. Reid and J. J. Hemperly, 1992. J of Mol Neuroscience 3: 127-135
【非特許文献２３】
R. P. Morrison et al., 1995. Infection and Immunity 4661-4668
【非特許文献２４】
A. L. Baron et al., 1984 Infection and Immunity 82-85
【非特許文献２５】
Mitragori et al. 1995 Science 269: 850-853
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
完全フロイント（ＣＦＡ）のアジュバント性に、ＣＦＡに関連する毒性を伴うことなく匹敵し、理想的には勝るアジュバントが求められている。広範囲の送達経路およびマイクロデバイスをベースとするデバイスと適合し得る新しいアジュバント配合物が求められている。新しいアジュバントは、より少ない免疫原、および免疫原性の乏しい標的とともに機能し、かつ「添加および混合」を越える何れの処理も要求せず、かつ活性の喪失を伴うことなく、凍結およびおそらくは凍結乾燥に耐えることができることが必要である。したがって、下記の研究では、受容体により媒介されるアジュバントカクテルの効果をも制限し得るリポソームおよびオイルなどのデポー体は意図的に避けられる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、免疫原性組成物ならびに該組成物の作製方法および使用方法に関する。
【００１８】
免疫原性組成物は、指示分子、刺激因子および免疫原を含有する。刺激因子および指示分子は化学的に異なる。刺激因子および免疫原は、免疫原と、指示分子または刺激因子の一方だけとから生じる免疫応答に対して改善された免疫応答をもたらすために対応する量で存在する。
【００１９】
本発明はさらに、目に見える外的の毒性症状またはアレルギー症状を生じさせる因子を含まない免疫原性組成物に関する。好ましくは、組成物はミョウバンを含まない。成分をカプセル化すること、またはリポソームを用いることは要求されない。組成物は、凍結または凍結乾燥された状態で貯蔵することができる。第１のアジュバントおよび第２のアジュバントが相互に混合されることが意図される。組成物は、所望する場合には、免疫原に対して特異的でない抗体または断片の添加を含むことができる。より明確には、組成物は、抗体または断片の添加を含むことができ、したがって、その相補性決定領域（ＣＤＲ）は、免疫原に対して特異的であり、ＡＰＣに対して特異的であり、および／または刺激因子に対して特異的である。それに対して、ＣＤＲが、ＡＰＣ、刺激因子または免疫原に対して特異的であることは必ずしも必要でない。
【００２０】
本発明はさらに、抗体の産生を誘導するための組成物に関する。抗体は、診断的使用、研究的使用および治療的使用のために好適である。組成物はワクチンとして使用することができる。任意の薬学上許容可能なキャリアをこれに関連して組成物に添加することができる。組成物は、粘膜的を含む任意の従来の投与モードを用いて対象に投与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明者らによって考察されるように、「アジュバント」は、その機能により分類されるように少なくとも３つのカテゴリーの物質を取り込むと考えられる幅広い用語である。１つのカテゴリーの物質は、デポー体として機能するものである。デポー体の例には、ミョウバンおよび不完全フロイントが含まれ、これらは、免疫原を濃縮されたままで保ち、放出を制御する。別のカテゴリーは、刺激因子であり、これにより、生物（Ｃ．Ｐａｒｖｕｍなど）に由来する表面抗原および植物抽出物が、抗原提示細胞および最終的にはより広い免疫応答を誘起する。第３のカテゴリーは、免疫抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に抗原を濃縮し、それにより取り込みを高めることを助ける免疫原指向分子または抗原標的化分子である。この第３のタイプの物質の例には、抗体およびα２−マクログロブリンなどの分子がある。すべてのアジュバントは認識可能な一次機能を有しているが、一部のアジュバントは、あまり明かでない二次的特質を有している。例えば、いくつかのオイルは、主にデポー体として作用し、そして、より小さい程度ではあるが、刺激因子として機能する。弱い、穏やかおよび強いなどの用語は、歴史的には毒性と相関したアジュバント効力を記載するために使用されていることが多い。
【００２２】
免疫原の選択
免疫原は、任意の病原体、ガンおよび他の臨床的に重要な標的に関連するか、またはそれらに由来する任意の天然抗原または合成抗原であり得る。より好ましい抗原性の材料には、全細胞、タンパク質、炭水化物、脂質またはＤＮＡが含まれる。全細胞の「抗原」には、クラミジア、具体的には、トラコーマクラミジア（ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、肺炎クラミジア（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）またはオウム病クラミジア（ｐｓｉｔｔａｃｉ）が含まれ得る。適する場合または所望する場合には、多数のタイプの免疫原を用いることができる（例えば、多価ワクチン）。
【００２３】
５つの異なった免疫原が、これらの２つのクラスのアジュバントが適切に対にされたときに生じ得る相乗的な応答を明らかにするために選択された。ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）の精製タンパク質調製物がα２−Ｍと組み合わせられた。全細胞免疫原であるトラコーマクラミジア基本小体が、ある種の処理が指示分子の選択に対して有し得る影響を明らかにするために、３つの異なる方法によって不活性化され、そして特異的なマウス抗体および非特異的なマウス抗体に適合された。さらに、異なる組織に関して生じ得る、能力の変化を示すために、クラミジア、サポニンおよび非特異的な抗体から構成される接種物が調製され、３つの異なる方法によって送達された。最後に、存在する抗体が、類似する性質および異なる性質を有する新規な抗体を生じさせるためにどのように影響され得るかを明らかにするために、哺乳動物膜タンパク質の混合物がヒト小島始原細胞から抽出され、市販の抗体と組み合わせられた。
【００２４】
抗原標的化および刺激因子
抗原標的化は、ヒトでの適用についてそれらのいずれもが承認されていない完全フロイントおよびＴｉｔｅｒＭａｘなどの最強のアジュバントで経験する毒性作用を避けることに対する一般的な方法になっていた。研究のほとんどは１９７０年代後半に始まり、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって１９７５年に導入されたモノクローナル抗体技術を増強することに集中していた。応答が増強され、毒性が除去されたが、力価に対する全体的な増大は十分とはいえなかった。驚くべきことに、その時およびそれ以降、多くの研究室の努力が、指示分子の独立した使用に集中したが、これらは、指示分子が、毒性をまったく示さないか、または毒性の限られた症状を示すある種の「より弱いアジュバント」と組み合わせられた場合に生じ得る相乗的な作用に対して検討することなく行われていた。
【００２５】
「より弱いアジュバント」の多くは、刺激因子として分類することができ、ＣＦＡに対して広範囲に報告されているような皮膚の持続する壊死性皮膚炎または触診可能なしこりまたは潰瘍形成を生じない。単独で使用されたとき、これらのより弱いアジュバントは、使用が制限されることが見出された。免疫学者は、効力を増大させるために、典型的には、そのようなアジュバントをオイルと組み合わせること、またはリポソーム内に取り込むことに頼った。残念なことに、これらのカクテルは、より多くの処理を必要とし、（広範囲の商業化のために必要とされるような）凍結または凍結乾燥することがほとんどできず、送達経路／デバイスとの適合性がほとんどなく、そして場合により、アジュバントカクテルがより複雑になるに従い、毒性が上昇している。
【００２６】
異なるＡＰＣによる抗原細胞内取り込みに対する能力は、提示効率と相関するようであり（非特許文献６）、抗原の集中化または細胞内シグナル伝達を伴うことがある。一般に、ＡＰＣ表面への抗原の標的化は免疫応答を増強するようである。ＡＰＣへの抗原の標的化はインビトロおよびインビボで広範囲に研究されている。抗原標的化の総説については、非特許文献７を参照のこと。より近年（非特許文献８）には、抗原提示が、アポトーシスカスケードを利用することによって樹状細胞に対して直接、抗原を標的化することを介して改善されている。
【００２７】
刺激因子は、そのような特性を有する通常のアジュバントから、例えば、ＣｐＧ ＤＮＡ、核酸、サポニン、サポニン誘導体、または必要な活性を有するサポニン成分から選択される。サポニン誘導体には、サポニン構造および刺激活性を有する化合物（例えば、塩）が含まれる。サポニン成分は、活性が程度において異なり得るとしても、天然化合物の同じ刺激活性を有するそのようなサポニン部分である。これらのサポニン化合物は合成することができる。
【００２８】
サポニン化合物、特にトリテレペングリコシドサポニン化合物は、キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）から採取することができる天然に存在する物質である。それらのアジュバント的性質が広く報告されており、そのような性質には、ＣＴＬ応答、Ｔ依存性抗原およびＴ非依存性抗原に対する強い応答の刺激が含まれる（非特許文献９）。
【００２９】
サポニンが、誘起することができる応答の範囲、および不純物が非常に多い抽出物で観測される比較的低レベルの毒性のために、刺激因子クラスのアジュバントから選択された。この研究は精製サポニンを用いて行われたが、より規定された調製物および合成体（Ｓｔｉｍｕｌｏｎ ＱＳ−２１など）が、増大した効果により、現在、臨床試験が進められている。
【００３０】
ＣｐＧは、メチル化されていないシトシン−グアニンジヌクレオチドを特定の塩基コンテクスト内に含有する短いＤＮＡ配列（オリゴヌクレオチド）である。哺乳動物の免疫系は、感染の指標として、細菌ＤＮＡにおいて自然に見出されるこれらの配列を認識するように進化してきた。
【００３１】
本明細書内の刺激因子の例には、グリコシド（サポニン）および核酸（ＣｐＧ）が含まれるが、他のタイプの分子が、指示分子とともに類似する様式で機能することが予想され得る。具体的には、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１Ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、３−Ｑ−デスアシル−４’−モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＬＡ）、ホルミル化されたｍｅｔ−ｌｅｕ−ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）、およびＩＬ−１βの１６３〜１７１ペプチド（「Ｓｃｌａｖｏペプチド」）。前記はすべてが、「刺激」、「刺激性」、「免疫刺激性」、「刺激剤」または「刺激因子」として記載されている。さらに、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトール）、カルシチニン遺伝子により調節されるペプチド、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−（Ｐ１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン（ＧＭＤＰ）／ジメチルジオクタデシル若しくはジステアリルアンモニウム臭化物（ＤＤＡ）／亜鉛Ｌ−プロリン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−（Ｐ１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン（ＧＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（トレオニル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−（ヒドロキシ−ホスホリルオキシ）エチルアミドモノナトリウム塩（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｎ−ＯＣＨ３、Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｎ−ｓｎ−グリセロール ジパルミトイル、Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｎ−ｓｎ−グリセロール ジパルミトイル、１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン、４−アミノ−ｏｔｅｃ−ジメチル−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−グリセロールジパルミタート（ＤＴＰ−ＧＤＰ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルイヌラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（ＤＴＰ−ＤＰＰ）、γ−インターフェロン、７−アリル−８−オキソグアノシン、ポリアデニル酸−ポリウリジル酸複合体、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−３ａ、ＲＡＮＴＥＳ、フタル酸ジブチルおよびフタル酸ジブチル類似体、ならびにＣ５ａが、指示分子と共同的に機能することが予想される。上記は、それぞれが（単独で）アジュバント的性質を有し、かつ水溶性である様々な化合物群である。幾つかの場合には、上記の刺激因子は、水溶液中で凝集物またはミセルを自発的に形成し、したがって、リポソームを構築するために使用することができる。しかしながら、この分野で使用される濃度は、下記のサポニンの例に対する場合がそうであったように、常に臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）よりも低い。カプセル化を達成するための処理は、デポー体について以前に記載された制限のために行われなかった。Ｃ５ａ補体およびその断片が予想されるが、補体タンパク質は抗体のようなオプソニン化性質を有することが示されているので、これらは好ましくない。下記で議論されるように、標的化性質および刺激性質の両方を有する天然物質は、１つの役割に特化しているものと競合し得る。それぞれの役割について特有の分子を有することにより、最大の調節がもたらされる。この理論的根拠を裏付ける証拠は、強力な確立されたアジュバントを上回る２５０倍のこれまでにない血清Ｉｇ増強が明らかにされるように、本明細書中にある。
【００３２】
本明細書中に記載される刺激因子は、ヒトに対するその関係によって特徴づけられており、したがって、ＣｐＧおよびサポニン化合物は外因性刺激因子の例である。ＩＬ−２およびＧＭ−ＣＳＦは、内因性刺激因子の例、すなわち、免疫カスケードの一部であり、ヒトにおいて産生される。
【００３３】
サポニンおよびＣｐＧはそれぞれ良好な溶解性を有し、それらは非常に異なる分子であるのでこれらの研究のために選択され、それにより、適切に対にされたとき、刺激因子と標的化分子との間に存在する幅広い関係を明らかにすることに成功した。
【００３４】
本発明はさらに、刺激因子を、組織からのＡＰＣ遊離、リンパ節に向かうＡＰＣ遊走、およびＡＰＣ成熟化に寄与する物質として定義する。刺激因子は、多くの場合、サイトカインであり、より具体的には、ケモカインであり、すなわち、化学誘引性を有するものである。
【００３５】
抗体を用いた抗原標的化
それぞれの指示分子、および抗原提示細胞におけるその対応する受容体は、異なる効率で結合し、続いて異なる速度で免疫カスケードを促進することが予測され得る。いくつかの指示分子は、多数のタイプのＡＰＣに受容体を有しており、この場合、それぞれのタイプの細胞における受容体頻度が特徴的であることが予想される。以前に議論されたように、提示細胞のタイプおよび数は組織タイプにより異なり得る。また、それぞれの免疫原と指示分子との相互作用は異なる。したがって、指示分子の選択は、細胞内取り込みを容易にする能力が免疫原および投与経路により変化するので慎重にしなければならない。刺激因子の選択についても同様である。
【００３６】
抗体を用いた抗原標的化に関する刊行物の長いリストが存在する。以前の抗体研究では、表面タンパク質に対して指向される抗原を架橋すること（非特許文献１０）、およびＦｃＲにより認識される免疫複合体を形成させること（非特許文献１１）などの天然および合成の両方を係留する方策が含まれる。より初期の研究においてモデル化された免疫原には、アジュバント成分（抗ムラミルジペプチド）に対する抗体が使用された場合のＳｔｒｅｐ Ｍ糖ペプチド（非特許文献１２）、抗原特異的なＩｇＭが関与する場合の肝炎抗原（非特許文献１３）、そして特異的なＩｇＭとも組み合わせられたマラリア抗原（非特許文献１４）が含まれた。最も初期の抗原標的化研究が、モノクローナル抗体（ＭＡＢ）試薬を作製することに集中していた場合、タンパク質（特に抗体）をヒト化することが現在できることにより、（抗体による）抗原標的化をワクチンのために使用するという見込みがより現実に近づいている。下記は、様々なヒト化度を有する、ＦＤＡにより承認された抗体治療薬である：
【００３７】
Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ（抗ＣＤ３）、ＲｅｏＰｒｏ（抗１１ｂ／１１１ａ）、Ｒｉｔｕｘａｎ（抗ＣＤ２０）、Ｚｅｎａｐａｘ（抗ＩＬ２受容体）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（抗Ｈｅｒ２受容体）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（抗ＴＮＦ）、Ｓｙｎａｇｉｓ（抗ＲＳＶ）、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（抗ＩＬ２）、Ｍｖｌｏｔａｒａ（抗ＣＤ３３）、Ｃａｍｐａｔｈ（抗ＣＤ５２）。
【００３８】
本発明により教示される組成物または配合物は、抗体を誘導するために用いることができる。組成物は、抗体形成を誘導するために、任意の所望する部位において対象に投与される。免疫原は、追加免疫あたり４０ｎｇもの低い量またはさらにより少ない量（例えば、追加免疫あたり約８ｎｇ）で存在させることができる。所望する場合には、組成物の成分の１つまたは複数を別々に対象に投与することができ、または、いずれかの成分が、別途、所望する部位において対象に存在する場合、組成物は、所望する効果が達成されるように改変することができる。誘導される抗体は、Ｋａ値が１０^４〜１０^１３モル／リットルの間であり、対象から回収することができる。回収された抗体は、その後、抗原エピトープに対するその親和性について分析される。さらに、抗体の保護的力価が達成される。組成物はワクチンとして使用することができる。任意の薬学上許容可能なキャリアをこれに関連して組成物に加えることができる。組成物は、粘膜的を含む任意の通常的な投与モードを用いて対象に投与することができる。さらなる投与を、２つ以上の経路によって、そして同時または連続的のいずれかでの２つ以上の経路によって行うことができる。連続したワクチン接種も可能である。
【００３９】
α２マクログロブリンを用いた抗原標的化
本明細書中で使用された指示分子には、種々の方法によって調製されたα２−マクログロブリン（α２−ＭまたはＡ２Ｍ）、および様々な特異性を有する種々の純度での抗体が含まれる。補体および他のオプソニン化分子が予想される。免疫原と結合することができる、これらの分子の断片もまた、指示分子として考えられる。指示分子は、組成物中に存在する免疫原に対して特異的である必要はない。本明細書における抗体複合体は、免疫原に対して特異的であり、並びに、非特異的である。指示分子は、ＡＰＣ受容体に対して特異的であり得る。あるいは、標的化分子をＡＰＣ受容体に直接的または間接的に連結することができる。抗体およびα２−Ｍは好ましい指示分子であるが、トランスフェリン、マンノースおよびアシアロ糖タンパク質受容体に結合する分子が予想される。哺乳動物の熱ショックタンパク質が予想されるが、ＨＳＰはストレスタンパク質であり、「刺激性」エピトープを有し得ることがよく確立されているので、哺乳動物の熱ショックタンパク質は好ましくない。標的化性質および刺激性質の両方を有する天然物質は、そのような役割に特化しているものと競合し得る。前に詳述されたように、それぞれの役割について特有な分子を有することにより、最大の調節がもたらされる。
【００４０】
Ｂ細胞はＩｇに対する特異的な受容体を有する（非特許文献１５）が、マクロファージおよび他の非Ｂ細胞ＡＰＣは、食作用およびエンドサイトーシスを含む他の機構を使用することが知られている。マクロファージによる可溶性抗原の細胞内取り込みおよび提示は十分には理解されていない。しかしながら、同じ受容体が熱ショックタンパク質によって使用されているので、α２−マクログロブリンおよびＣＤ９１に関して受容体媒介機構を支持する主張がなされている（非特許文献１６）。
【００４１】
免疫細胞の中で、マクロファージは、より広範囲の免疫系においてマクロファージが果たす極めて重要な役割のために特に注目されている。免疫学的相互作用の範囲を調節するマクロファージの能力は、部分的には、それらがｌａ表面抗原を発現しているためである。膜ｌａ抗原の発現は、抗原に対する特異的なＴ細胞応答を誘導するためには必須である（非特許文献１７）。これらの理由のために、α２−マクログロブリン系は、現在、多くの関心を集めており、α２−Ｍによる増強が、抗体を用いて得られたより初期の抗原標的化データと比較されている。
【００４２】
ヒトα２−Ｍは、血漿に多量に存在するタンパク質（２〜５ｍｇ／ｍｌ）である。ヒトα２−Ｍは、二面分子「トラップ」を形成するように配置される４つの同一サブユニットからなる。このトラップは、酵素またはメチルアミンが、非常に感受性の高いアミノ酸の範囲（「餌領域」）を活性化し、これにより、追跡可能な立体配座的変化が生じたときに引き金が引かれる（非特許文献１８）。生じた受容体で認識されたα２−Ｍが、マクロファージ、樹状細胞、およびα２−Ｍ受容体を発現する他の細胞によって効率的に取り込まれる（非特許文献１９）。今日まで、天然物または合成物のいずれかであっても、非タンパク質分解性のタンパク質に対するα２−Ｍの結合は、ＡＰＣによる細胞内取り込みを生じさせないようであるが、サイズおよび電荷は結合の程度に影響を及ぼし得る。α２−Ｍは、抗原標的化の将来の適用において幅広い使用が見出される可能性がある。
【００４３】
抗体およびα２−Ｍのそれぞれが全身の循環および組織に正常な状態で高濃度に存在し、それにより、結果を混乱させる刺激因子タイプのエピトープを有することが予想されないので、抗体およびα２−Ｍがこれらの研究のために選択された。さらに、α２−Ｍおよび抗体は、構造が非常に異なる分子であり、そして異なるＡＰＣ受容体を利用しており、それにより、適切に対にされたとき、刺激因子と標的化分子との間に存在する幅広い関係を明らかにすることに成功している。
【００４４】
（実施例）
抗体指示分子、全細胞免疫原（クラミジアＥＢ）およびサポニン刺激因子
ヒトに感染する３つのクラミジア種は、トラコーマクラミジア、肺炎クラミジアおよびオウム病クラミジアである。トラコーマクラミジアによる眼および生殖管の感染症は、世界中における病的状態の主要な原因の１つであり、処置するために費用がかかる。感染または重篤な疾患からの保護が可能であるワクチンの開発は特別な課題を提供しているが、クラミジア疾患の蔓延防止に対する最も効果的な長期間の選択肢である。
【００４５】
肺炎クラミジア（ＴＷＡＲ）は、約１５年前に呼吸器感染症者から最初に単離され、続いて、肺炎、気管支炎、副鼻腔炎および咽頭炎の一般的原因であることが示されている。より近年には、冠状動脈のアテロームに肺炎クラミジアが存在することにより、多くの製薬企業は、従来のワクチン法を、アテローム性動脈硬化を処置することに対して採用している。クラミジアは血清学的に類似しているので、１つのワクチンが直接的および間接的なクラミジア障害からの保護を提供し得ることが可能である。
【００４６】
クラミジアは、免疫系を逃れる能力を発達させている。これらの病原体からの保護には、強い液性応答および細胞媒介応答が必要であると考えられている。これらの感染症の病理学を理解することおよび保護において進歩がある。最も有望なデータが、全細胞、主外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）およびＭＯＭＰ ＤＮＡを用いて得られている。ワクチン法を選択するとき、全細胞の免疫原は、一般に、サブユニットワクチンよりも免疫原が大きい。このことはクラミジアについても正しい。しかしながら、クラミジア粒子全体が不活性化されたとき、粒子は、歴史的にはその免疫原性を失っている。実施例１には、不活性化されたクラミジア粒子の免疫原性が、指示分子および刺激因子クラスのアジュバントと組み合わせることによっていかに増強され得るかが示される。
【実施例１】
【００４７】
免疫原 ＝全細胞（トラコーマクラミジア）
指示分子＝抗体（マウス、クラミジアＬＰＳに対して特異的）
刺激因子 ＝サポニン
免疫原の調製
約１０^８個のホルマリン固定トラコーマクラミジア（Ｌ２血清型）の基本小体（ＥＢ）を１００ｕｌのＨＢＳＳに分注した。このＥＢストック液に、９０マイクログラムの精製された＃４０３マウス抗体を、２５ｕｌのリン酸塩緩衝化生理的食塩水中で加えた。最後に、２ｕｌ（１０ｕｇ）の精製サポニンを加えた。上記を混合し、室温で１０分間インキュベーションした。その後、体積を１ｍｌにし、それぞれの動物に２００ｕｌの調製された接種物を与えた。
【００４８】
免疫化
５匹のｂａｌｂ／ｃマウスを従来のＣＦＡ免疫化のために指定し、５匹を新規なアジュバント組合せのために指定し、それぞれの可能な成分の組合せを対照とした。すべての動物は、ハンクス緩衝化生理的食塩水の２００ｕｌ中それぞれ２×１０^７で、２週間の間隔を置いて４回のＩＰ免疫化を受けた。総接種量は常に２００ｕｌであった。
【００４９】
【表１】

【００５０】
試験用採血物が、４回目のＩＰ注射の後に採取され、固相ＥＬＩＳＡでＣＴＬ２感染ＭｅＣｏｙ細胞に対して力価測定された。
【００５１】
クラミジア免疫原に対する抗体レベルを定量するために使用された方法および材料
材料：ＰＶＣプレート、Ｌ２トラコーマクラミジア（ＣＴ）ＭｅＣｏｙ溶解物、ウシ血清アルブミン、リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）、炭酸塩緩衝液、０．５％ツイーン２０を含むリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ−Ｔ）、２０％血清を含むＤＭＥＭ培地、５ｍｌガラス管、４０日目に各ケージから採取された試験用採血物（ｔｅｓｔ ｂｌｅｅｄ）のプール、ヤギ抗マウスＩｇＧ（完全分子）ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ Ａ−４４１６）、リン酸塩−クエン酸塩緩衝液カプセル（Ｓｉｇｍａ Ｐ−４９２２）、ＯＰＤ基質（３０ｍｇ錠剤、Ｓｉｇｍａ Ｐ−８４１２）、４．５Ｍ硫酸。
【００５２】
ＥＬＩＳＡ手順：
１．ＰＶＣプレートを、１０^６個のトラコーマクラミジア粒子／ｍｌで、ウエルあたり１００μｌのｐＨ９．５の炭酸塩緩衝液により３７℃で１時間までコーティングする。
【００５３】
２．コーティング液を捨て、３％ＢＳＡ／ＰＢＳでウエルを満たし、３７℃でインキュベーションすることによって１時間ブロッキングする。
【００５４】
３．ブロッキング液を捨て、ウエルを満たすことによってＰＢＳ−Ｔで２回洗浄する。
【００５５】
４．それぞれの試験用／事前採血（ｐｒｅ−ｂｌｅｅｄ）プール希釈物の５０μｌを加え、３７℃で１時間インキュベーションする。それぞれの希釈物は、９０％ＰＢＳ−Ｔおよび１０％ＤＭＥＭ培地（２０％血清を含む）である溶液を用いて作製される。
【００５６】
５．液を捨て、ウエルを毎回満たすことによって３回洗浄する。
【００５７】
６．ＰＢＳ−Ｔを用いて１：１０Ｋで希釈されたヤギ抗マウスＩｇＧＨＲＰの５０ｕｌを加え、３７℃で１時間インキュベーションする。
【００５８】
７．液を捨て、ウエルを毎回満たすことによって３回洗浄する。
【００５９】
８．２ｍｇ／ｍｌのＯＰＤであるクエン酸塩−リン酸塩緩衝液の５０ｕｌを加え、４９５ｎｍで走査したときに、最も高い応答の最低希釈物が１ＯＤに達することが見積もられるまでインキュベーションする。
【００６０】
９．５０ｕｌの４．５Ｍ硫酸で反応を停止させ、最終的な記録のために、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリーダーを用いて４９５ｎｍで読み取りを行う。
【００６１】
クラミジア結果のまとめ
一連の実験において、１つの刺激因子（精製サポニンの「Ｑｕｉｌ Ａ」）は、Ｃ−ＬＰＳ特異的抗体と複合体化させた不活性化トラコーマクラミジア（ＣＴ）粒子と混合されたとき、血清力価の即時的な増大および持続した増大をもたらすことが見出された。この結果は、増強が、免疫原単独を上回っただけでなく、完全フロイントアジュバントを上回ったので、特に驚くべきものであった。
【００６２】
発表された文献には、マウス（免疫化後）およびヒト（感染後）が約１：５００の対クラミジア力価を有することが示されている。上記および図１に記載された新規な組合せによって刺激された力価は、抗体、抗原：抗体比または免疫化経路を変化させることなどの最適化を何ら行うことなく１：５，０００以上で観測されていた。
【００６３】
希釈物を１：１００から開始し、事前採血物の応答および代表的なＣＦＡ応答に対して比較した。事前採血物は１：１００でＣＴ抗体に対して陰性であり、ＣＦＡ処理は、有効な値を最大シグナルの３０％に低下させることによって最低希釈度で陽性であると呼ぶことができるだけであった。特異的抗体および免疫原の組合せは、フロイントを上回る改善を示さなかったことには留意すること。同様に、Ｑｕｉｌ−Ａおよび免疫原の組合せは、フロイントを上回る改善を示さなかった。
【００６４】
α２−マクログロブリン指示分子、精製タンパク質の免疫原（ＨＣＧ）およびサポニン刺激因子
ＨＣＧは、分子量が３８，０００ダルトンの糖タンパク質である。ＨＣＧは、α鎖およびβ鎖の２つのサブユニットから構成される。αサブユニットは９２ａａの配列からなり、これは下垂体の糖タンパク質（ＦＳＨ、ＬＨおよびＴＳＨ）と同一である。βサブユニットは、Ｎ末端の１１５ａａ部分がβ−ＬＨサブユニットと同じであり、しかし、Ｃ末端の３０ａａの配列が特徴的であり、この分子の仕事末端（ｂｕｓｉｎｅｓ ｅｎｄ）と呼ばれることが多い。ＨＣＧは胎盤によって分泌され、レベルが妊娠の第１トリメスターのときに増大する。
【００６５】
ＨＣＧは、ＨＣＧ−Ａ２Ｍ免疫原を用いてもたらされ得る何らかの増強を評価するための優れた候補物である。多くの学術研究室および診断研究室により、この２０年間、ＨＣＧに対する力価が、ＯＴＣ妊娠試験のための試薬を作製する途中で追跡されており、それにより、比較用の多数の血清力価データが得られている。
【００６６】
α２−マクログロブリンは別の利点をもたらし得る。抗原がＡＰＣによって取り込まれると、タンパク質分解的な部分的分解がエンドソーム内で行われ、抗原のプロセシングされたペプチド断片がＭＨＣ分子と結合する。しかし、抗原のタンパク質分解的な部分的分解は、そのペプチド断片に結合する適切なＭＨＣおよびＴ細胞を生じさせることに対して不可欠であり得る一方で、過度な分解は免疫応答に対して有害であることがわかる。完全なタンパク質分解はプロセシングのために必須ではなく、α２−Ｍの遮蔽は、細胞内取り込みおよび保護のために必要とされる重要なエピトープを保護することができる。
【００６７】
今日まで、α２−Ｍが、研究室動物に対して典型的に負わされる毒性を避けながら、診断的適用のために必要なＫａ値（１０^４〜１０^１３モル／リットルの範囲である）を有する抗体を生じさせることに寄与し得ることは立証されていない。さらに、開示されたアジュバント配合物に関して、低濃度で与えられた免疫原は機能的な抗体力価を刺激することができる。用語「機能的な力価」はそれぞれの分野で異なる意味を有する。ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって開発されたモノクローナル抗体ツールを実施する場合に対する機能的な力価は、一般には１：１０，０００である。１０，０００未満の力価を有する動物は、典型的には、融合のために意図される抗原刺激されたＢ細胞のための良好な供給源ではない。機能的な力価はまた、中和抗体または保護抗体を含有することなどの、体内の抗体の量によって記載されることがある。
【実施例２】
【００６８】
免疫原 ＝精製タンパク質（ＨＣＧ）
指示分子＝マクログロブリン（マウス、α２）
刺激因子 ＝サポニン
免疫原の調製
ＨＣＧをＢｉｏＰａｃｉｆｉｃ（４２４０ Ｈｏｌｌｉｓ Ｓｔｒｅｅｔ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ ＣＡ、９４６０８）から得た。これは、５０ｍＭ炭酸アンモニウム溶液からの凍結乾燥粉末として提供された。
【００６９】
いくつかの研究室は、様々な物質をα２−Ｍにコンジュゲート化することに関する経験がある。一般的なタンパク質−タンパク質カップリングのためのリンカーもまた使用することができ、そのようなリンカーはＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから容易に入手することができ、説明書に従うことができる。Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｉｎｃ．は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ’ｓ ＲＴＰに置かれた「インキュベーターカンパニー」（ＮＣ施設）であり、コンジュゲート化ステップを実施するために選択された。
【００７０】
免疫化および血清サンプリング
すべての免疫化は２週間の間隔で腹腔内（ＩＰ）に施された。再度ではあるが、ＩＰ経路が選択され、それにより、脾臓のＢ細胞を後に集め、個々の抗体分析のためにＭＡＢを作製するための選択肢がもたらされた。各動物には、追加免疫あたり１ｕｇのＨＣＧが２００ｕｌのハンクス緩衝化生理的食塩水で与えられた。血清サンプルが試験群の各動物から採取され、力価測定のためにプールされた。
【００７１】
【表２】

【００７２】
ＨＣＧに対する抗体の血清レベルを定量するために使用された方法および材料
材料：ＰＶＣプレート、ＨＣＧ、ウシ血清アルブミン、リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）、炭酸塩緩衝液、０．５％ツイーン２０を含むリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ−Ｔ）、２０％血清を含むＤＭＥＭ培地、５ｍｌガラス管、３３日目に各ケージから採取された試験用採血物のプール、ヤギ抗マウスＩｇＧ（完全分子）ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ Ａ−４４１６）、リン酸塩−クエン酸塩緩衝液カプセル（Ｓｉｇｍａ Ｐ−４９２２）、ＯＰＤ基質（３０ｍｇ錠剤、Ｓｉｇｍａ Ｐ−８４１２）、４．５Ｍ硫酸。
【００７３】
手順：
１．ＰＶＣプレートを、１ｕｇ／ｍｌの濃度で、ｐＨ９．５の炭酸塩緩衝液中のＨＣＧ１００ｕｌにより３７℃で１時間までコーティングする。
【００７４】
２．コーティング液を捨て、３％ＢＳＡ／ＰＢＳでウエルを満たし、３７℃でインキュベーションすることによって１時間ブロッキングする。
【００７５】
３．ブロッキング液を捨て、ウエルを満たすことによってＰＢＳ−Ｔで２回洗浄する。
【００７６】
４．それぞれの試験用／事前採血プール希釈物の５０μｌを加え、３７℃で１時間インキュベーションする。それぞれの希釈物は、９０％ＰＢＳ−Ｔおよび１０％ＤＭＥＭ培地（２０％血清を含む）である溶液を用いて作製される。
【００７７】
５．液を捨て、ウエルを毎回満たすことによって３回洗浄する。
【００７８】
６．ＰＢＳ−Ｔを用いて１：１０Ｋで希釈されたヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰの５０ｕｌを加え、３７℃で１時間インキュベーションする。
【００７９】
７．液を捨て、ウエルを毎回満たすことによって３回洗浄する。
【００８０】
８．２ｍｇ／ｍｌのＯＰＤを含むクエン酸塩−リン酸塩緩衝液の５０ｕｌを加え、４９２ｎｍで走査したときに、最大応答の最低希釈物が１ＯＤに達することが見積もられるまでインキュベーションする。
【００８１】
９．５０ｕｌの４．５Ｍ硫酸で反応を停止させ、最終的な記録のために、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリーダーを用いて４９２ｎｍで読み取りを行う。
【００８２】
力価および毒性試験
図２は、事前採血物が、被覆ＨＣＧ抗原に対して活性を有しないことを示している。ＨＣＧは単独で、３×バックグラウンドの基準を用いたとき、１：３，３３３の希釈度で陽性であると呼ぶことができなかった。ＨＣＧ＋サポニンの組合せは、ＨＣＧ単独を上回る改善であった。ＨＣＧおよびα２−マクログロブリンの組合せはさらなる改善をもたらしたが、際だったものは、明らかに、ＨＣＧ（免疫原）＋α２−マクログロブリン（指示分子）＋サポニン（刺激因子）の組合せであった。本発明の組合せはまた、ＨＣＧおよびフロインドアジュバントの組合せにも勝っていた（データは示されず）。
【００８３】
より重要なことは、群１および群３（上記）に与えられた接種物が再び調製され、毒性をモニターするだけの目的のために、５匹のマウスからなる別の群に対して皮下に送達された。再度ではあるが、すべての動物には、２００ｕｌの接種物が与えられたが、今回は、接種物は６つの部位に分けられた。動物は２週間にわたってモニターされ、その後、明敏な結果が大腿四頭筋および足蹠に現れていた。表３には、観察結果がまとめられる。
【００８４】
【表３】

【００８５】
表３に示されるように、ＨＣＧ＋α２−Ｍ＋サポニンが与えられた動物は、広く報告されている膿瘍を生じさせるフロイント中に乳化されたＨＣＧが与えられた動物に対して、毒性の局所的徴候を何ら示していなかった。
【００８６】
α２−マクログロブリン指示分子、精製タンパク質免疫原（ＨＣＧ）およびＣｐＧ刺激因子
【実施例３】
【００８７】
免疫原 ＝精製タンパク質（ＨＣＧ）
指示分子＝マクログロブリン（マウス、α２）
刺激因子 ＝ＣｐＧ ＤＮＡ
免疫原の調製
本実施例で使用されたＣｐＧ刺激因子は、Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．（２８１５９ Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ａｖｅｎｕｅ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ９１３５５）から購入されたＩｍｍｕｎｏＥａｓｙ（商標）であった。ＣｐＧ刺激因子は、メチル化されていないシトシンおよびグアイシンのジヌクレオチドを特異的な塩基内容で含有する短いＤＮＡ片である。再度ではあるが、ＨＣＧはＢｉｏＰａｃｉｆｉｃによって提供され、研究室内でさらに処理された。ＨＣＧ＋α２−Ｍの複合体が、以前に示されたように、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｉｎｃ．によって調製された。
【００８８】
免疫化および血清サンプリング
機能的な力価を生じさせるための以前の実施例はもっぱらＩＰ注射であったので、この研究では、皮下（ＳＱ）免疫化のみを含んでいた。したがって、この研究により、本発明は特定の経路に限定されないことが明らかにされる。各動物には、２００ｕｌの体積で４０ｎｇのＨＣＧが毎週与えられた。希釈が必要とされたときには、ハンクス緩衝化生理的食塩水が使用された。血清サンプルが試験群の各動物から採取され、力価測定のためにプールされた。
【００８９】
【表４】

【００９０】
ＨＣＧに対する血清抗体レベルを定量するために使用された方法および材料は、実施例２に示された方法および材料と同一であった。
【００９１】
血清力価の結果
図３には、ＨＣＧおよび指示分子（α２−Ｍ）の組合せは、アッセイされた最低希釈度で活性（３×バックグラウンド）を生じさせることができなかったことが示される。ＨＣＧ＋刺激因子（ＱｉａｇｅｎのＣｐＧ）の組合せは活性を示したが、それは、１：２７０の希釈度に及んだときにだけであった。これに対して、指示分子（α２−Ｍ）および刺激因子（ＣｐＧ）とのＨＣＧの組合せは、モノクローナル抗体適用のために十分な機能的な力価をもたらした。
【００９２】
膵臓細胞膜抗原に対する応答を増強するために使用された、サイトケラチンに対するマウス抗体（指示分子）およびＣｐＧ ＤＮＡ刺激因子
膵臓細胞膜抗原（ＰＣＭＡ）は、主に管および腺房タイプの細胞から構成されるヒト膵臓細胞から集められたタンパク質の複合体である。糖尿病のような疾患を処置するために幹細胞または始原細胞を使用することを試みている企業は、機能するインスリン産生細胞への小島始原細胞の進化をモニターし、そのような進化を行わせるためにこれらの膜タンパク質を使用している。これらの膜タンパク質マーカーは、多くのガンマーカーのように、一時的に発現していることが多く、最大産生時に低濃度で存在するに過ぎない。ヒト起源で、一時的に発現し、最大発現時に低コピーであることは、そのような標的に対する抗体を作製することを困難にしており、多くの場合には不可能にしている。したがって、ヒトＰＣＭＡは、刺激因子および指示分子タイプのアジュバントを組み合わせることからもたらされ得る何らかの増強を評価するための別の優れた候補物である。免疫化から産生される抗体はどれも、小島細胞治療に関して機能するものとして有益な研究試薬および／または開発試薬になると考えられる。
【実施例４】
【００９３】
免疫原 タンパク質複合体（膵臓細胞膜抗原）
指示分子 抗体（マウス、ＣＫ１９に対して特異的）
刺激因子 ＣｐＧ
免疫原の調製
試験および対照の免疫化スケジュールのために調製された総免疫原は、ヒト膵臓細胞の（置床後２日目の）１つの１５０ｃｍ^２フラスコに由来した。血清含有培地を接着細胞のフラスコから吸引し、フラスコの内部をＨＢＳＳで４回洗浄し、その後、細胞を表面からかき取った。採取された細胞を５０ｍｌの円錐チューブに入れ、２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を捨て、２０ｍｌの新鮮なＨＢＳＳを使用して、細胞を再懸濁した。この操作を３回繰り返して、残留培地成分のすべてを除いた。４回目の遠心分離の後、ペレットを１０ｍｌの溶解緩衝液（ｐＨ８；１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭ ＰＭＳＦを含有する）に懸濁した。混合物を軽くボルテックス処理し、氷上で１０分間インキュベーションした。その後、溶解物を３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を除き、１００ｘｇで９０分間再び遠心分離した。上清を捨て、ペレットを１，３００ｕｌの溶解緩衝液に溶解した。１４．３ｕｇ／ｍｌの最終的なストック液濃度がＬｏｗｒｙタンパク質アッセイによって決定された。本実施例で使用されたＣｐＧ刺激因子は、Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．から購入されたＩｍｍｕｎｏＥａｓｙ（商標）であった。ＣＫ１９マウス抗体はＢｉｏｇｅｎｅｘ（Ｃａｔ．ＡＭ２４６−５Ｍ）から得られ、完全な腹水形態で使用された。
【００９４】
免疫化
５匹のＢａｌｂ／ｃマウスには、免疫原＋ＣｐＧが与えられ、５匹には、免疫原＋ＣｐＧとＣＫ１９抗体との新規なアジュバントの組合せが与えられた。両群とも、毎週、ＩＰ免疫化が４週間の期間にわたって施され、その後、５回目の追加免疫の３日後に試験用採血が行われた。試験用採血以降、動物は４０日目および４６日目に免疫化された。脾臓が４９日目にＰＥＧ融合のために摘出された。試験群および対照群における各動物には、追加免疫あたり２０ｕｌ、すなわち、２８６ｎｇの総タンパク質が与えられた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ＰＣＭＡが等しい割合の少なくとも１０個の異なるタンパク質または抗原の混合物であることが確認された。このことは、免疫化された各タンパク質は約２８ｎｇで存在したことを示唆する。ＣｐＧの動物には、５０ｕｌのＱｉａｇｅｎ ＣｐＧと、１５０ｕｌのハンクス緩衝化生理的食塩水と、２０ｕｌの上記に記載される免疫原ストック液との混合物が与えられた。本発明のカクテルを受ける動物には、５０ｕｌのＱｉａｇｅｎ ＣｐＧと、１０ｕｌのＢｉｏｇｅｎｅｘ腹水（ＣＫ１９特異的抗体が１０ｕｇ〜１００ｕｇの間で存在する）と、１２０ｕｌのＨＢＳＳと、２０ｕｌの免疫原ストック液とが与えられた。
【００９５】
【表５】

【００９６】
３１日目の試験用採血物は、類似する膵臓細胞膜調製物を固相ＥＬＩＳＡで使用して力価測定された。
【００９７】
膵臓細胞膜抗原に対する血清抗体レベルを定量するために使用された方法および材料
材料：ＰＶＣプレート、膵臓細胞膜抗原、ウシ血清アルブミン、リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）、炭酸塩緩衝液、０．５％ツイーン２０を含むリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ−Ｔ）、２０％血清を含むＤＭＥＭ培地、５ｍｌガラス管、３１日目に各ケージから採取された試験用採血物のプール、ヤギ抗マウスＩｇＧ（完全分子）ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ Ａ−４４１６）、リン酸塩−クエン酸塩緩衝液カプセル（Ｓｉｇｍａ Ｐ−４９２２）、ＯＰＤ基質（３０ｍｇ錠剤、Ｓｉｇｍａ Ｐ−８４１２）、４．５Ｍ硫酸。
【００９８】
ＥＬＩＳＡ手順：
１．ＰＶＣプレートを、３．３４ｕｇ／ｍｌの濃度の膵臓細胞膜抗原で、ウエルあたり１００μｌの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）により３７℃で１時間までコーティングする。
【００９９】
２．コーティング液を捨て、ＰＢＳ中３％ＢＳＡでウエルを満たし、３７℃でインキュベーションすることによって１時間ブロッキングする。
【０１００】
３．ブロッキング液を捨て、ウエルを満たすことによってＰＢＳ−Ｔで２回洗浄する。
【０１０１】
４．それぞれの試験／非免疫血清希釈物の５０μｌを加え、３７℃で１時間インキュベーションする。それぞれの希釈物は、９０％ＰＢＳ−Ｔおよび１０％ＤＭＥＭ培地（２０％の血清を含む）である溶液を用いて作製される。
【０１０２】
５．液を捨て、ウエルを毎回満たすことによって３回洗浄する。
【０１０３】
６．ＰＢＳ−Ｔを用いて１：１０Ｋで希釈されたヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰの５０ｕｌを加え、３７℃で１時間インキュベーションする。
【０１０４】
７．液を捨て、ウエルを毎回満たすことによって３回洗浄する。
【０１０５】
８．２ｍｇ／ｍｌのＯＰＤを含むクエン酸塩−リン酸塩緩衝液の５０ｕｌを加え、４９５ｎｍで走査したときに、最大応答の最低希釈物が１ＯＤに達することが見積もられるまでインキュベーションする。
【０１０６】
９．５０ｕｌの４．５Ｍ硫酸で反応を停止させ、最終的な記録のために、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリーダーを用いて４９５ｎｍで読み取りを行う。
【０１０７】
稀な標的に対するＭＡＢのＰＥＧ融合および回収
力価データは、ＣｐＧスケジュールから得られるＭＡＢを続行するために十分ではなかったが、脾臓細胞をＣｐＧスケジュールおよびＣｐＧ−Ｃｋ１９スケジュールの両方から採取した。それぞれのスケジュールに由来する約２×１０^８個の脾臓細胞を融合した。１０日後、それぞれのスケジュールに由来するプレート（１０枚）を、総ハイブリッド、および特異的抗体を産生するハイブリッドの数についてスクリーニングした。
【０１０８】
【表６】

【０１０９】
血清力価および融合の結果
図４には、ＣｐＧ刺激因子は、アッセイされた最低希釈度で活性（３×バックグラウンド）を生じさせることができなかったことが示される。これに対して、指示分子（マウスＣＫ１９抗体）および刺激因子（ＣｐＧ）の組合せは、１：３０Ｋの力価（３×Ｂｋｇｄ）をもたらした。これは、モノクローナル抗体を回収しようとする努力とともに先に進めるための研究室内の基準（１：１０Ｋ）を容易に満たしている。表６では、ほぼ５倍のハイブリッドが、ＣｐＧで抗原刺激された細胞からスクリーニングされたが、ＰＣＭＡに対して特異的な抗体を産生するハイブリッドは見出されなかった。これに対して、特異的な抗体を産生する４個のクローンが、ちょうど９８個のハイブリッドをスクリーニングした後に見出された。さらに、４個のハイブリドーマはすべてが、安定なＩｇＧ１アイソタイプであった。
【０１１０】
前記の実施例では、新規なアジュバントカクテルは、モノクローナル抗体適用のために十分な力価を最初の追加免疫から１カ月以内にもたらした。ＰＣＭＡ免疫原を用いた本実施例において、従来のアジュバントで抗体を産生させることができないとき、本発明のカクテルは、所望する標的に対する抗体（モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方）を産生させることができることはまったく疑いのないことである。最も重要なことであるが、ＣＫ１９抗体は、完全な腹水形態で接種物に加えられたので、使用前の精製を必要としなかった。完全な血清形態、組織培養の完全な上清形態、または半精製形態での抗体もまた機能することが予想される。
【０１１１】
クラミジア粒子に対する血清応答を増強するための、指示分子としての非特異的抗体およびサポニン刺激因子の使用
今日まで、単一の遺伝子または遺伝子産物は、クラミジアの細胞全体で達成される保護に匹敵させることができていない（非特許文献２０）。より詳細には、発表された研究の大部分は、クラミジアの生菌のみが保護的な力価をもたらすことを示唆している（非特許文献２１）。いくつかの研究室では、弱毒化されたクラミジア株が探し求められているが、そのような努力から得られる成果は少なくともあと１０年かかるようである。実施例１に記載されるように、不活性化されたクラミジアは、典型的には、その免疫原的特性を失っている。実施例１、実施例５および実施例６には、不活性化されたクラミジア粒子の免疫原性が、指示分子および刺激因子クラスのアジュバントと組み合わせることによってどのように回復され得るかが示される。
【０１１２】
下記の実施例では、不活性化されたクラミジア粒子が、刺激因子および抗体（免疫原に対して特異的でない）と組み合わせられたとき、実質的な血清Ｉｇ力価をどのようにもたらし得るかが示される。
【実施例５】
【０１１３】
免疫原 トラコーマクラミジア感染ＭｅＣｏｙ細胞、溶解物
指示分子 抗体（マウス、免疫原に対して非特異的）
刺激因子 サポニン
免疫原の調製
約３６ｕｇのＵＶ不活性化トラコーマクラミジア（ＬＧＶタイプ２）ＭｅＣｏｙ細胞溶解物を１ｍｌのＮｕｎｃバイアルに分注した。９０マイクログラムの精製されたＬＩ特異的マウス抗体を７７ｕｌの体積で加え、その後、２ｕｌ（１０ｕｇ）の精製サポニンを加えた。上記を混合し、室温で１０分間インキュベーションした。その後、体積をＨＢＳＳで１ｍｌにし、５匹の動物のそれぞれに２００ｕｌの調製された接種物を与えた。このクラミジアはＭｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（３４１ Ｂｅｒｉｎｇ Ａｖｅｎｕｅ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ、Ｍ８Ｚ ３Ａ８）から得られた。精製サポニンはＳｕｐｅｒｆｏｓ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（ａ／ｓ Ｆｒｙｄｅｎｌｕｎｄｓｖｅｊ ３０、ＤＫ−２９５０ Ｖｅｄｂａｅｋ、デンマーク）から得られた。ＬＩ特異的抗体は研究室内で作製され、プロテインＡ樹脂で使用前に精製された。Ｌ１は、脳組織で見出された細胞接着分子である。Ｌ１細胞接着分子は、最初、ニューロン−ニューロン細胞接着およびニューロン−シュワン細胞接着を媒介する細胞表面の糖タンパク質としてマウスで同定され、特徴づけられた。Ｌ１の転写物が神経芽細胞腫（ＩＭＲ−３２）細胞株および網膜芽細胞腫（Ｙ−７９）細胞株で検出されている。Ｌ１はまた、横紋筋肉腫細胞株のＲＤおよびＡ−２０４でも発現されている（非特許文献２２）。本実施例で使用されたクラミジアはＵＶ照射によって不活性化され、これに対して、以前のクラミジア研究（実施例１）でのクラミジア粒子はホルマリンによって不活性化されたことに留意すること。本実施例で使用されたクラミジアは精製されず（宿主細胞溶解物として存在）、Ｌ１抗体はクラミジアに対して特異的ではなかった。
【０１１４】
免疫化
５匹のＢａｌｂ／ｃマウスをＣＦＡで免疫化し、５匹には、刺激因子および指示分子の新規なアジュバントの組合せが与えられた。すべての動物は、２週間の間隔を置いた３回のＩＰ免疫化を受けた。試験用採血物が３９日目に採取された。
【０１１５】
【表７】

【０１１６】
３回目のＩＰ注射の後に採取された試験用採血物は、固相ＥＬＩＳＡで、精製ＣＴ ＥＢに対して力価測定された。
【０１１７】
クラミジア免疫原に対する抗体レベルを定量するために使用された方法および材料
材料：Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂ９６ウエルプレート、ＬＧＶ２トラコーマクラミジア（Ｅａｓｔ Ｃｏａｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓから得られたヒトＨｅｐ２（Ｃａｔ＃Ｖ５０１−Ｄ３２７１）で培養されたもの）、乾燥粉ミルク、リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）、炭酸塩緩衝液、ツイーン−２０、５ｍｌガラス管、試験用採血物、ＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ Ｔ−８６６５）、Ｈ_２ＳＯ_４、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌから得られる、血清サンプルを力価測定するためのヤギ抗マウスＩｇＧ（１、２Ａ、２Ｂおよび３）ＨＲＰコンジュゲートのプール。
【０１１８】
ＥＬＩＳＡ手順：
１．ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｂプレートを、Ｅａｓｔ Ｃｏａｓｔクラミジア粒子によりウエルあたり約１×１０^７個のＥＢで、３７℃で１時間コーティングする。
【０１１９】
２．コーティング液を除き、ウエルあたりＰＢＳ／ツイーン２０中の５％粉ミルク２５０ｕｌにより３７℃で２時間ブロッキングする。
【０１２０】
３．ブロッキング液を除き、ＰＢＳ−ツイーン２０で３回洗浄する。
【０１２１】
４．０．５〜０．７５％の乾燥粉ミルクで希釈された各血清サンプルの１００μｌを加え、３７℃で１時間インキュベーションする。
【０１２２】
５．ＰＢＳ／ツイーン２０で３回洗浄する。
【０１２３】
６．ＰＢＳ／ツイーン２０中に４〜１０Ｋで希釈されたヤギ抗マウスＩｇ ＨＲＰ試薬の１００ｕｌを加え、３７℃で４５分間インキュベーションする。
【０１２４】
７．ＰＢＳ／ツイーン２０で３回洗浄する。
【０１２５】
８．１００ｕｌのＴＭＢ基質を各ウエルに加え、（暗所で）３０分間インキュベーションする。
【０１２６】
９．１００ｕｌの０．５Ｍ硫酸で反応を停止させ、記録のためにプレートリーダーで４５０ｎｍにおける読み取りを行う。
【０１２７】
サンプルの採取および処理
すべての血清サンプルは、ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｃａｔ．５３４３２−９２１）から得られる１００ｕｌのマイクロピペットを用いた眼窩採血によって得られた。血清サンプルは一晩凝固させられ、その後、凍結前に細胞を除くために遠心分離された。アッセイ希釈度は１：１２３から１：９０Ｋの範囲であった。
【０１２８】
血清の結果
図５には、フロイントアジュバントが１０Ｋの血清力価に寄与していること、そして非特異的抗体およびサポニンから構成されるアジュバントカクテルが９０Ｋの力価（＞３×ｂｇｒｄ）に寄与していることが示される。非免疫の血清対照は、予想されるとおり陰性であった。上記の結果は、免疫原投薬量、アジュバント対免疫原の比率、送達経路またはサンプル採取時期を最適化することにおける何れの試みを何ら行うことなく得られた。
【０１２９】
クラミジアでの結果のまとめ
一連の実験において、１つの刺激因子（精製サポニンの「ＱｕｉｌＡ」）は、不活性化されたトラコーマクラミジア（ＣＴ）粒子およびＬ１非特異的抗体と混合されたとき、フロイントアジュバントと混合された同じ免疫原で惹起される力価を越える血清力価をもたらした。血清抗体の増強は９倍であると見積もられた。これらの結果は、粗製クラミジア調製物を用いて得られ、増強が、精製された免疫原を用いることなく達成され得ることを明らかにしている。実施例１に記載されるクラミジア特異的抗体が、（ホルマリン処理に対して）ＵＶ不活性化粒子およびサポニンと組み合わされ、その後、ＩＰ送達されたとき、クラミジア粒子およびサポニンだけを含有する接種物を上回る増強は観測されなかった。また、上記の接種物（ＵＶクラミジア−Ｌ１ＡＢ−サポニン）がＩＭおよびＩＤで送達されたとき、クラミジア粒子およびサポニンだけを含有する接種物を上回る増強は観測されなかった（データは示されず）。最後の２つの結果は、免疫原処理および送達経路によってカクテルを目的などに合わせることが必要であることを強調している。
【０１３０】
膣粘膜におけるクラミジア特異的ＩｇＡを生じさせるための、指示分子としての非特異的抗体およびサポニン刺激因子の使用
ワクチンを設計するときの１つの重要な検討事項は、感染部位を考慮に入れることである。クラミジアは、典型的には粘膜組織に感染するので、粘膜的免疫化が、最も良い保護を達成するために必要とされ得る。したがって、下記の実験は、本発明において記載される新規なアジュバントが、粘膜に送達されたときに増強を示すかどうかを決定するために設計された。
【０１３１】
例外なく、科学的文献は、局所的（膣）な抗クラミジアＩｇ（具体的にはＩｇＡ）が感染の消散と一致することを示している（非特許文献２３および非特許文献２４）。
【０１３２】
不活性化されたクラミジア粒子を用いて達成されるクラミジアに対する局所的な抗体応答を増強する機構は、一般集団に対する多大な利益をもたらし、これにより、合衆国で毎年発生する約１００万人の新規患者がおそらくは治療されると考えられる。
【０１３３】
実施例６では、不活性化されたクラミジア粒子の鼻腔内送達が、刺激因子および指示分子アジュバントと組み合わせられたとき、膣粘膜ＩｇＡ力価をどのようにもたらし得るかが示される。
【実施例６】
【０１３４】
免疫原 トラコーマクラミジア感染ＭｅＣｏｙ細胞、溶解物
指示分子 抗体（マウス、免疫原に対して非特異的）
刺激因子 サポニン
免疫原の調製
約３６ｕｇのＵＶ不活性化トラコーマクラミジア（ＬＧＶタイプ２）ＭｅＣｏｙ細胞溶解物をエッペンドルフチューブに分注した。４５マイクログラムの精製されたＬＩ特異的マウス抗体を加え、その後、５ｕｇの精製サポニンを加えた。総体積は３５ｕｌであり、各動物には、７ｕｌの調製された接種物が与えられた。クラミジア溶解物、サポニンおよびＬ１抗体は、前記に記載されたような起源を有する。
【０１３５】
免疫化
５匹のＢａｌｂ／ｃマウスには、クラミジア抗原だけが与えられ、５匹には、クラミジア抗原がサポニンとともに与えられ、５匹には、クラミジア抗原がＬ１抗体とともに与えられ、５匹には、クラミジア、サポニンおよびＬ１抗体から構成される接種物が与えられた。すべての動物は、４回の免疫化を２カ月の期間にわたって受け、その後、２週間後に膣洗浄を受けた。鼻腔免疫化は、それぞれの鼻孔の端部に約３．５ｕｌをつけることによって行われた。
【０１３６】
【表８】

【０１３７】
膣サンプルの採取および処理
膣サンプルを、２５ｕｌのハンクス緩衝化生理的食塩水で膣円蓋を２回洗浄することによって得た。５０ｕｌのサンプルに１２．５ｕｌのアプロチニン（２０ｕｇ／ｍｌ）および１２．５ｕｌの０．０１Ｍ ＤＴＴを加えた。膣サンプルをボルテックス処理し、直ちに凍結した。アッセイ当日に、サンプルを解凍し、清澄化のために１０Ｋ ｒｐｍで遠心分離した。
【０１３８】
クラミジア特異的ＩｇＡのレベルを定量するために使用された方法および材料
膣液サンプルを、下記の例外だけを伴って、実施例５について記載されるように、精製されたＣＴ ＥＢに対して力価測定した。１：８の単一スクリーニング希釈度が膣液サンプルについて使用され、二次コンジュゲートが、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈから得られるヤギ抗マウスＩｇＡ ＨＲＰ（ｃａｔ１０４０−０５）に変更された。希釈物は、０．５％乾燥粉ミルクおよび１０％培地（２０％血清が存在する）を含有する希釈剤で作製された。
【０１３９】
膣液の結果
図６には、５群のマウスに対する個々の応答が示される。粘膜サンプルのスクリーニングにより、感染細胞溶解物−Ｌ１抗体−サポニンで免疫化された動物は、５匹中３匹がクラミジア特異的ＩｇＡを産生したことが示された。免疫原から構成される接種物、サポニンと混合された免疫原から構成される接種物、およびＬＩ抗体と混合された免疫原から構成される接種物は、１：８のスクリーニング希釈度で陽性のシグナル（＞２×ｂｋｇｄおよび≧０．３ＯＤ）を生じさせることができなかった。３つの非免疫サンプルはバックグラウンドとして供された。
【０１４０】
クラミジアでの結果のまとめ
一連の鼻腔内送達実験では、１つの接種物のみが、すなわち、刺激因子（精製サポニンの「Ｑｕｉｌ Ａ」）、不活性化されたトラコーマクラミジア感染細胞の溶解物、およびＬ１抗体（これは免疫原に対して特異的でない）から構成される接種物が膣ＩｇＡ力価をもたらした。これらの結果は、不純物を含むクラミジア調製物を用いて得られ、増強が、精製された免疫原を用いることなく達成され得ることを明らかにしている。上記の結果は、免疫原投薬量、アジュバント対免疫原の比率またはサンプル採取時期もしくは免疫化間隔を最適化することにおけるいずれの試みを何ら行うことなく得られた。粘膜におけるＩｇＡ応答を可能にするアジュバントカクテルは、接種物がＩＰ投与された実験である実施例５において最初に示されたことには留意すること。実施例５および実施例６により、粘膜適用のために意図されたそのようなアジュバントカクテルを腹膜内でスクリーニングすることができ、それにより、応答が血清においてより精密に測定されるという証拠がもたらされる。
【０１４１】
膣粘膜におけるクラミジア特異的ＩｇＡを生じさせるための、指示分子としてのα２−マクログロブリンおよびサポニン刺激因子の使用
実施例７では、凍結乾燥前のマウスα２−Ｍ、サポニン、および不活性化された凍結乾燥前のクラミジア粒子からなる配合物が鼻腔送達された。この配合物は、抗体含有接種物で達成された膣ＩｇＡレベルと類似する膣ＩｇＡレベルをもたらした。
【実施例７】
【０１４２】
【表９】

【０１４３】
免疫原の調製
エッペンドルフチューブに、約８×１０^８個のＵＶ−プソラレン不活性化トラコーマクラミジア（ＬＧＶタイプ２）、２０ｕｇの精製サポニン、および１１５ｕｇの精製ＬＩマウス抗体または１０ｕｇのマウスα２−マクログロブリンを分注した。総体積は５０ｕｌであり、各動物には、１０ｕｌの調製された接種物が与えられた。サポニンおよびＬＩ抗体は、前記に記載されたような起源を有する。クラミジアＥＢは、Ｅａｓｔ Ｃｏａｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓから得られ、実施例５、実施例６および実施例７のＥＬＩＳＡで使用された材料と同等である。マウスα２−マクログロブリンは、Ｂａｌｂ／ｃマウスから採取された全血清を、ウサギ抗マウスα２−マクログロブリンが固定化されたアフィニティー樹脂に通すことによって研究室内で調製された。クラミジア粒子、α２−Ｍ、Ｌ１抗体およびサポニンは、以前に凍結乾燥されており、接種物を調製する直前に水和された。α２−Ｍは、実施例２および実施例３で行われたような免疫原に対するコンジュゲート化が行われなかった。
【０１４４】
免疫化
５匹のＢａｌｂ／ｃマウスには、クラミジア、サポニンおよびＬ１抗体から構成される接種物が与えられた。５匹の第２群には、クラミジア、サポニンおよびα２−マクログロブリンから構成される接種物が与えられた。両群はともに、３回の鼻腔内免疫化を１カ月間にわたって受け、その後、８日後に膣洗浄を受けた。鼻腔免疫化は、それぞれの鼻孔の端部に約５ｕｌをつけることによって行われた。
【０１４５】
【表１０】

【０１４６】
膣サンプルは、実施例６に記載されるように、採取され、処理され、希釈され、そして精製ＣＴ ＥＢに対して力価測定された。
【０１４７】
膣液の結果
図７には、２つのマウス群に対する個々の応答が示される。それぞれの棒は２つのＥＬＩＳＡウエルの平均値であった。Ｌ１を含有する接種物で免疫化された動物は、５匹中５匹がクラミジア特異的ＩｇＡを産生した。α２−Ｍを含有する接種物で免疫化された動物もまた、５匹中５匹がクラミジア特異的ＩｇＡを産生した。サンプルはスクリーニングのために再び１：８で希釈された。サンプルは、＞２×ｂｋｇｄおよび≧０．３ＯＤのシグナルが観測されたとき、陽性であると呼ばれた。シグナル強度によって示されるように、α２−Ｍを含有する接種物は、対照群によってもたらされる力価に競合し得る力価をもたらした。３つの非免疫サンプルはバックグラウンドとして使用された。
【０１４８】
クラミジアでの結果のまとめ
先の実施例６では、サポニンおよびＬ１抗体とともに鼻腔送達されたクラミジア抗原により、膣ＩｇＡ力価がもたらされた。実施例７では、α２−Ｍが抗体の代わりになり得ることが明らかにされる。これらの結果は、凍結乾燥および不活性化されたクラミジア調製物を用いて得られた。このことは、これらの配合物を商業化に関してより行いやすくする。
【０１４９】
本明細書におけるデータは、刺激因子と指示分子との組合せの６つの異なる組合せが、様々な経路によって送達されたとき、毒性の徴候を伴うことなく、血清抗体力価に対する相加的および相乗的な改善をもたらすことを示している。
【０１５０】
まとめると、提供された実施例により、刺激因子および指示分子が組み合わせられたとき、予想外の相乗的な増強が示される。実施例には、５つの異なる免疫原、４つの異なる指示分子、２つの独特な刺激因子、６つのアジュバント対（７つの実施例のすべてが指示分子および刺激因子から構成された）、および３つの異なる経路が含まれる。これらの刺激因子と指示分子との間における正の相互作用は、幅広い予測可能な機構が関与し、他の免疫原に対して容易に利用されることを示唆している。さらに、（受容体をＡＰＣ上に有する）指示分子はどれも、類似する増強をもたらすに違いない。使用された例は皮下および腹腔内および鼻腔内であったが、類似する増強が、膣、筋肉内、皮内によって観測されている（データは示されず）。静脈内経路、局所的経路、脈管内経路および他の粘膜経路（経口経路および直腸経路のような経路）が、本発明の実施のために好適であることが予想される。ウイルス粒子および破壊されたビリオンを用いてもまた成功が得られている（データは示されず）。
【０１５１】
刺激因子および指示分子から構成される安全なカクテルが得られることは、ミョウバンなどのデポー体が除外される経路によるワクチン接種における改善に繋がり得る。これらの新しいカクテルは、ミョウバンおよび他の大きい粒子が制限される新しいマイクロニードルデバイスおよびマイクロアブレーダーデバイスとの適合性がより大きいと考えられる。
【０１５２】
他の研究室における以前の研究は、指示分子とのデポー体の組合せ、または刺激因子とのデポー体の組合せが、それらの構成成分を上回る単なる「相加的な増強」をもたらすことを示していた。本明細書では、指示分子および刺激因子を組み合わせることは、実施例１で明らかにされるように、相乗的な増強に繋がる。
【０１５３】
実施例２では、刺激因子と指示分子の組合せにより、毒性を伴うことなく、機能的な力価を生じさせることができた。力価の相乗的な増強により、刺激因子の濃度を、局所的または全身的な毒性の何らかの徴候が消失する安全なレベルに下げることができる。
【０１５４】
最後に、指示分子またはいくつかの刺激因子の独立した使用を唱える者は、それらの試薬はより少ない免疫原を必要とすることを主張する。しかし、実施例３では、単独で使用された市販のα２−ＭおよびＣｐＧ ＤＮＡは、４０ｎｇの免疫原を用いて機能的な力価を誘発することができなかったことが明確に明らかにされている。これに対して、組合せは、モノクローナル抗体適用のために十分な力価を最初の追加免疫から１カ月以内にもたらした。極めて少ない量の免疫原とともに機能するこの新しい能力は、多くのガンマーカーのような少量でしか存在しない臨床的標的に対する抗体を生じさせるという期待を改善する。
【０１５５】
粘膜経路によるトラコーマクラミジアに関する成功は、肺炎クラミジアおよびオウム病クラミジアなどの関連する生物に対する明瞭な方法論を提供する。クラミジアを鼻腔に投与し、膣円蓋においてＩｇＡを得ることによって得られた経粘膜の結果は特に有益である。これは、鼻腔免疫化はあまり熟練を必要とせず、ディスポーザブル器具はニードルを伴わないからである。腹膜における成功により、腹腔の悪性腫瘍が、本明細書に記載される本発明のアジュバントカクテルに対する最も重要な候補物になる。直ちに、抗体会社および学術研究室は、研究規格および商業規格の抗体試薬を作製するために典型的に使用されている完全フロイントアジュバントおよび他の毒性物質を廃止することができる。
【０１５６】
例えば、モノクローナル抗体試薬を作製するとき、実施者は、体内におけるＢ細胞の最大の単一供給源である脾臓を刺激するアジュバントカクテルおよび経路を選択したいと望むことができる。目的が、下層粘膜の病原体からの保護を生じさせることである場合、実施者は、鼻腔送達されたとき（経粘膜）、膣ＩｇＡ力価をもたらし得るアジュバントカクテルについて選択したいと望むことができる。
【０１５７】
本発明は、免疫原、免疫原の処理、送達経路、および求められている免疫応答のタイプに依存して、それぞれの刺激因子および指示分子が様々な効率で機能することが本発明により予想することを免疫学者に教示する。しかし、最も良い性能をもたらすアジュバントは、刺激因子および指示分子の特質を常に有する。本発明は、市販の材料を、機能に基づいて有用なカテゴリーへ配置し、そして最も良い可能な結果に向けて各カテゴリーから候補物を対にする方法を教示する。本明細書中の実施例は、結果を実現させるために必要とされる免疫原の純度レベルおよび指示分子の純度レベルに関する詳細を提供する。数タイプの免疫原、指示分子および刺激因子に対する濃度は、所望する免疫応答を達成するための示唆された比率と一緒に提供される。
【０１５８】
本発明の範囲内の実施例を検討した後、当業者は増強の大きさを理解し、そしてまた、指示分子／刺激因子タイプアジュバントの１つの対が、すべての免疫原および適用に対して最も良い成果をもたらさないことがあることを理解するであろう。
【０１５９】
免疫原組成物またはワクチン組成物を調製するための従来の方法はどれも、本発明の組成物を調製する際に用いることができる。組成物の有益な効果を増強するために免疫原および指示分子の複合体を調製することは望ましいことであり得る。
【０１６０】
本発明のワクチンまたは接種物は、改善された保護および／または処置をもたらすことが期待される。さらに、本発明の組成物の使用は、ヒトおよび動物に対する毒性副作用を伴うことなく、確立されたモノクローナル技術、ポリクローナル技術および組換え技術によって作製されるような、診断および治療のために意図される抗体の発見頻度および品質を高める。
【０１６１】
刺激性および指向性の両方の性質を有するアジュバントは局所的送達もまた増強することが期待される。これは、Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉらが、本明細書中に記載されるアジュバントのサイズ範囲に含まれる分子は、低い振動数の超音波を使用して角質層を横断させることができることを報告しているからである（非特許文献２５）
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】抗体、抗原：抗体比または免疫化経路を変化させることなどの最適化を何ら行うことなく１：５，０００の希釈度で本発明の組成物によって刺激される活性を示す。
【図２】事前採血物は、被覆ＨＣＧ抗原に対する活性を有しないことを示す。ＨＣＧは単独で、３×バックグラウンドの基準を用いたとき、１：３，３３３の希釈度で陽性であると呼ぶことができなかった。ＨＣＧ＋サポニンの組合せは、ＨＣＧ単独を上回る改善であった。ＨＣＧおよびα２−マクログロブリンの組合せはさらなる改善をもたらしたが、際だったものは、明らかに、ＨＣＧ（免疫原）＋α２−マクログロブリン（指示分子）＋サポニン（刺激因子）の組合せであった。本発明の組合せはまた、ＨＣＧおよびフロインドアジュバントの組合せに勝っていた（データは示されず）。
【図３】ＨＣＧおよび指示分子（α２−Ｍ）の組合せは、アッセイされた最低希釈度で活性（３×バックグラウンド）を生じさせることができなかったことを示す。ＨＣＧ＋刺激因子（ＱｉａｇｅｎのＣｐＧ）の組合せは活性を示したが、それは、１：２７０の希釈度に及んだときにだけであった。これに対して、指示分子（α２−Ｍ）および刺激因子（ＣｐＧ）とＨＣＧの組合せは、モノクローナル抗体適用のために十分な機能的な力価をもたらした。
【図４】いずれの希釈度でも活性を有しない膵臓膜抗原（非免疫）が与えられなかった動物から得られた代表的な試験用採血物を示す。膵臓膜抗原およびＣｐＧで免疫化されたマウスから得られた血清プールはすべての希釈度で非免疫とかろうじて区別可能であった。これに対して、指示分子（ＣＫ１９抗体）および刺激因子（ＣｐＧ）との膵臓膜抗原の組合せは１：３０Ｋの力価をもたらした。これは、ＣｐＧおよび膵臓抗原を含有する接種物を上回る、最低限でも２５０×の増強であった。ＰＣＭＡおよびＰＭＡは同じ物質であることに留意すること。
【図５】いずれの希釈度でも活性を有しない不活性化クラミジア抗原（非免疫）が与えられなかった動物から得られた代表的な試験用採血物を示す。２×ｂｋｇｄ＋≧０．３ＯＤのカットオフ基準を使用したとき、クラミジアおよびＣＦＡで抗原刺激された動物から得られた血清プールは１０Ｋの力価を示した。これに対して、クラミジアＥＢ、Ｌ１ＡＢおよびサポニンから構成されるアジュバントで免疫化された動物から得られた血清プールは９０Ｋの力価を示した。９倍の増強である。
【図６】１：８のスクリーニング希釈度における各動物に対する個々の組織液応答を示す。３匹の動物（非免疫１〜３）は、免疫原が何ら投与されず、陰性対照として供された。クラミジアＥＢ粒子だけが投与された５匹の動物はどれも、陽性シグナル（２×ｂｋｇｄ＋≧０．３ＯＤ）をもたらさなかった。クラミジアＥＢ粒子およびサポニンが投与された５匹の動物はすべてが陰性であった。クラミジアＥＢ粒子およびＬ１抗体が投与された５匹の動物もまたすべてが陰性であった。これに対して、クラミジアＥＢ粒子、Ｌ１ＡＢおよびサポニンから構成される接種物が投与された５匹の動物は３匹が、明白な特異的ＩｇＡシグナルをもたらした。
【図７】１：８の希釈度における各動物に対する個々の組織液応答を示す。３匹の動物（非免疫１〜３）は、免疫原が何ら投与されず、陰性対照として供された。クラミジアＥＢ粒子、Ｌ１ＡＢおよびサポニンから構成される接種物が投与された５匹の動物はすべて、クラミジアＥＢ粒子、α２−マクログロブリンおよびサポニンから構成される接種物が投与された５匹の動物のすべてがそうであったように、明白な特異的ＩｇＡシグナル（２×ｂｋｇｄ＋≧０．３ＯＤ）をもたらした。

Claims (41)

1. 免疫原、指示分子として機能する第１のアジュバント、および刺激因子として機能する第２のアジュバントを含む免疫原性組成物であって、第１のアジュバントおよび第２のアジュバントは化学的に異なる分子であり、免疫原ならびに第１のアジュバントおよび第２のアジュバントは、免疫原と、第１のアジュバントまたは第２のアジュバントの一方だけとから生じる免疫応答に対して、改善された免疫応答をもたらすのに十分な量で存在することを特徴とする免疫原性組成物。
2. 刺激因子は弱い刺激因子であることを特徴とする請求項１に記載の免疫原性組成物。
3. 目に見える外的な毒性症状またはアレルギー症状を生じさせる因子を含まないことを特徴とする請求項１に記載の免疫原性組成物。
4. 鼻腔内送達、腹腔内送達、または、皮下送達、皮内送達、筋肉内送達、静脈内送達、脈管内送達、膣送達、直腸送達、経口送達、局所送達または粘膜送達に好適であることを特徴とする請求項１に記載の免疫原性組成物。
5. 刺激因子は、サポニン、またはサポニン成分を含むその誘導体であることを特徴とする請求項１に記載の免疫原性組成物。
6. サポニンは合成品であることを特徴とする請求項５に記載の免疫原性組成物。
7. 刺激因子は、ＣｐＧ ＤＮＡ、核酸、サイトカインまたはケモカインであることを特徴とする請求項１に記載の免疫原性組成物。
8. 免疫原は抗原であることを特徴とする請求項１に記載の免疫原性組成物。
9. 抗原は核酸の発現産物であることを特徴とする請求項８に記載の免疫原性組成物。
10. 抗原は、全細胞、タンパク質、タンパク質混合物、膜抽出物、哺乳動物細胞、ウイルスまたは細菌であることを特徴とする請求項８に記載の免疫原性組成物。
11. 細菌はクラミジアであることを特徴とする請求項１０に記載の免疫原性組成物。
12. クラミジアは、トラコーマクラミジア（ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、肺炎クラミジア（ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）またはオウム病クラミジア（ｐｓｉｔｔａｃｉ）であることを特徴とする請求項１１に記載の免疫原性組成物。
13. クラミジアは基本小体であることを特徴とする請求項１１に記載の免疫原性組成物。
14. クラミジアの基本小体は不活性化されていることを特徴とする請求項１３に記載の免疫原性組成物。
15. 指示分子は、α２−マクログロブリン（α２−Ｍ）、またはＡ２ＭのＣＤ９１結合性断片であることを特徴とする請求項１に記載の免疫原性組成物。
16. 指示分子は抗体またはその免疫原特異的断片であることを特徴とする請求項１に記載の免疫原性組成物。
17. 抗体またはその断片は抗原提示細胞（ＡＰＣ）受容体に対して特異的であることを特徴とする請求項１６に記載の免疫原性組成物。
18. 抗体またはその断片は、ＡＰＣ受容体に結合することができるエピトープを有することを特徴とする請求項１６に記載の免疫原性組成物。
19. 抗体または免疫原特異的断片は免疫原に対して特異的でないことを特徴とする請求項１６に記載の免疫原性組成物。
20. 抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、ＡＰＣ、免疫原または刺激因子に対して特異的であることを特徴とする請求項１６に記載の免疫原性組成物。
21. 抗体のＣＤＲが、ＡＰＣ、免疫原または刺激因子に対して特異的でないことを特徴とする請求項１６に記載の免疫原性組成物。
22. 抗体は刺激因子に対して特異的であることを特徴とする請求項１６に記載の免疫原性組成物。
23. 抗体は刺激因子に対して特異的でないことを特徴とする請求項１６に記載の免疫原性組成物。
24. 指示分子は、トランスフェリン、マンノース、アシアロ糖タンパク質受容体またはＣＤ９１に結合することを特徴とする請求項１に記載の免疫原性組成物。
25. 指示分子は、ＡＰＣに結合することができる補体または熱ショックタンパク質またはそれらの断片であることを特徴とする請求項１に記載の免疫原性組成物。
26. 指示分子はオプソニン化分子であることを特徴とする請求項１に記載の免疫原性組成物。
27. 指示分子は、ＡＰＣ受容体に直接的または間接的に連結された分子を含むことを特徴とする請求項１に記載の免疫原性組成物。
28. 指示分子および免疫原は複合体を形成することを特徴とする請求項１に記載の免疫原性組成物。
29. 組成物がワクチンであることを特徴とする請求項１に記載の免疫原性組成物。
30. 組成物が凍結されるか、凍結乾燥されるか、フリーズドライされるか、または、そうでなければ再構成可能であることを特徴とする請求項１に記載の免疫原性組成物。
31. リポソームを実質的に含まないことを特徴とする請求項１に記載の免疫原性組成物。
32. ミョウバンを実質的に含まないことを特徴とする請求項１に記載の免疫原性組成物。
33. 免疫原に対して特異的であるか、または免疫原に対して特異的でないかのいずれかである、少なくとも１つの抗体またはその断片をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の免疫原性組成物。
34. 刺激因子は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、３−Ｑ−デスアシル−４’−モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＬＡ）、ＩＬ−１βの１６３〜１７１ペプチド（Ｓｃｌａｖｏペプチド）、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、カルシチニン遺伝子により調節されるペプチド、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−（Ｐ１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン（ＧＭＤＰ）、ジメチルジオクタデシルまたはジステアリルアンモニウム臭化物（ＤＤＡ）／亜鉛Ｌ−プロリン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、ホルミル化されたＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（トレオニル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−（ヒドロキシ−ホスホリルオキシ）エチルアミドモノナトリウム塩（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｎ−ＯＣＨ３、Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｎ−ｓｎ−グリセロール ジパルミトイル、Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｎ−ｓｎ−グリセロール ジパルミトイル、１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン、４−アミノ−ｏｔｅｃ−ジメチル−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−グリセロールジパルミタート（ＤＴＰ−ＧＤＰ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルイヌラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（ＤＴＰ−ＤＰＰ）、γ−インターフェロン、７−アリル−８−オキソグアノシン、ポリアデニル酸−ポリウリジル酸複合体、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−３ａ、フタル酸ジブチル、フタル酸ジブチル類似体、およびＣ５ａからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の免疫原性組成物。
35. 免疫原性組成物を所望部位で対象に投与することによって免疫応答を誘導するための方法であって、免疫原性組成物が、免疫原と、指示分子として機能する第１のアジュバントと、刺激因子として機能する第２のアジュバントとを含み、第１のアジュバントおよび第２のアジュバントは化学的に異なる分子であり、免疫原ならびに第１のアジュバントおよび第２のアジュバントは、免疫原と、第１のアジュバントまたは第２のアジュバントの一方だけとから生じる免疫応答に対して、改善された免疫応答をもたらすのに十分な量で存在することを特徴とする方法。
36. 免疫応答には、抗体を生じさせることが含まれることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
37. 抗体を対象から回収するステップをさらに含むことを特徴とする請求項３６に記載の方法
38. 抗体は１０^４〜１０^１３モル／リットルの間のＫａ値を有することを特徴とする請求項３７に記載の方法。
39. 刺激因子はＡＰＣの遊走に寄与することを特徴とする請求項１に記載の免疫原性組成物。
40. 刺激因子はＡＰＣの成熟化に寄与することを特徴とする請求項１に記載の免疫原性組成物。
41. 刺激因子はＡＰＣを誘引することを特徴とする請求項１に記載の免疫原性組成物。

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