JP2004529158A - Mixed tumoricidal herpesvirus vector - Google Patents
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Abstract
高度に有効かつ安全なＨＳＶ由来の混成殺腫瘍ベクターを、個体中の充実性腫瘍の治療に提供する。該ベクターは、それぞれ細胞破壊能力をもつ誘導可能な毒性遺伝子を担持するアンプリコン型反復単位の複数の反復をもつ欠損ウイルスゲノム、および第二の成分としての非分裂細胞中で複製が不能であるＨＳＶ突然変異体ヘルパーウイルスである、２個の主成分を含んで成る。該ベクターは、脳の悪性病変ならびに肺、膵、腎、結腸、胃および他の型の癌を包含する多様な種類の充実性腫瘍の治療に使用してよい。提供されるベクターはまた、付加的な治療と組合せでの個体への投与にも適する。A highly effective and safe HSV-derived hybrid tumor killing vector is provided for the treatment of solid tumors in an individual. The vector has a defective viral genome with multiple repeats of an amplicon-type repeat unit each carrying an inducible toxic gene with cell-destroying ability, and is incapable of replication in non-dividing cells as a second component The HSV mutant helper virus comprises two main components. The vectors may be used in the treatment of various types of solid tumors, including malignant lesions of the brain and lung, pancreas, kidney, colon, stomach and other types of cancer. The provided vectors are also suitable for administration to an individual in combination with additional therapies.
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）由来ベクター、および悪性疾患の治療におけるそれらの使用に関する。
参考文献の一覧
以下は、本願明細書にて引用される従来技術の刊行物の一覧である。
【０００２】
【表１】
上記の技術の本明細書により認容は、本技術が添付されたクレームで特定される本発明の特許性に何らかの様式で関連することの表示として解釈されるべきでない。
【背景技術】
【０００４】
ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２（顔および性器系統のＨＳＶ）に感染した細胞は、典型的に、重大なウイルス複製前の細胞を破壊するよう運命づけられた自殺遺伝子を発現するよう誘導される。この影響を克服しかつウイルス複製のための細胞を確保するために、ウイルスは、強力なｍＲＮＡ不安定化／分解活性をもつＨＳＶ−１ビリオンの５８ｋＤａの構造的成分、ビリオン宿主シャットオフ（ｖｉｒｉｏｎ ｈｏｓｔ ｓｈｕｔｏｆｆ）（ｖｈｓ）（ＵＬ４１）遺伝子を発現することにより、即座の反撃に着手する。ｖｈｓタンパク質は、細胞中へのウイルスの進入の間に、ウイルスの脱殻に際して細胞の細胞質中に出される（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。最近の実験に基づけば、ｖｈｓタンパク質は、ハウスキーピング遺伝子およびウイルス後感染に誘導されるストレス関連自殺遺伝子を包含する、感染した細胞のｍＲＮＡの即座の不活性化／分解により細胞の自殺機能を無効にし、また、抗アポトーシス遺伝子をコードするかもしれないと思われる。ｍＲＮＡ分解活性の結果、宿主細胞のタンパク質合成が止められ、自殺タンパク質が産生されず、そして細胞はある時間の期間の間生き延びて、標的細胞の死亡の前にウイルス複製を可能にする。
【０００５】
ｖｈｓ遺伝子中に１個の突然変異を担持するＨＳＶ−１突然変異体が開発された。野性型ＨＳＶ−１の感染は宿主ｍＲＮＡの分解を伴う一方、ビリオン宿主シャットオフ（ｖｈｓ）機能に欠陥のあるＨＳＶ突然変異体（「ｖｈｓ１突然変異体」）は継続される細胞タンパク質合成を可能にする。細胞へのその感染が複製しかつ潜伏から再活性化するその能力において減弱されることが示された、ＵＬ４１ＮＨＢと命名される１個のこうした突然変異体が開発された（特許文献１）。
【０００６】
ヘルパーＨＳＶとともにプロモーターの制御下に最低１種の挿入された遺伝子を含んで成るＨＳＶ由来アンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）が開示されている（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。こうした系の一例において、関連するヘルパーウイルスは正常宿主細胞中で制限された複製能力のものである（特許文献２）。別の例において、組換えＨＳＶベクターは選択された細胞型に標的を定めかつそれを感染させるよう改変されている（特許文献３）。
【０００７】
脳腫瘍の発生率は１００，０００人あたり５〜１４．１であると推定される。神経膠腫は原発性腫瘍の４０〜６０％に上り、その７５％は悪性である。神経膠種はヒト脳で生じる最も普遍的な原発性腫瘍である。悪性神経膠腫は成人の原発性脳腫瘍の３０％に上り、そして等級により２つの範疇すなわち未分化星状細胞腫および膠芽腫に分割される。米国における悪性神経膠種の推定される発生率は１００，０００人あたり１４．７であり、年間およそ１０，０００〜１５，０００の新たな症例を表す。改良された攻撃的外科治療、放射線治療および化学療法にもかかわらず、悪性神経膠種はほぼ常に致死的であり；膠芽腫（大部分の悪性神経膠種）の全体の５年生存率は５．５％未満であり、そして生存の中央値はおよそ５２週間である。これらの数字は過去３０年にわたって事実上変えられないままである。全身腫瘍の治療は、中枢神経系の転移の発生のためしばしば失敗する。進行した段階は治癒可能性を示さない。大部分の神経膠腫は、いかなる完全に有効な治療も伴わない乏しい予後を有する。
【０００８】
最近、ＨＳＶウイルスベクターがヒトでの臨床使用におけるそれらの有効性および安全性について評価された。一研究において、３４．５タンパク質（神経病理学の主要な一決定子）をコードする遺伝子に欠陥のあるＨＳＶ突然変異体ウイルスを含んで成るＨＳＶ由来ベクターを、再発性神経膠腫を伴う患者で試験した。この突然変異は、非分裂細胞中での複製に必要とされる３４．５遺伝子座およびＩＣＰ６（リボヌクレオチド還元酵素（ＲＲ））中の双方の枯渇を有する「Ｇ２０７」と命名される多突然変異された条件付きで複製するＨＳＶベクターである（非特許文献７）。Ｇ２０７突然変異体は現在、再発性膠芽腫についてフェーズＩ臨床試験で試験されており、ここで、それが非毒性でありかつ重大な有害事象を伴わないことが示されたが、しかしその有効性は未だ示されていない。加えて、突然変異されたベクター中への抗腫瘍形成遺伝子（とりわけサイトカイン遺伝子）の挿入が提案されている（非特許文献８）。
【０００９】
別の研究において、ＨＳＶタイプ１のチミジンキナーゼおよびガンシクロビル遺伝子治療が、以前に未治療の多形膠芽腫を伴う成人において、外科的切除および放射線に対する補助療法として評価された（非特許文献９）。フェーズＩＩＩ試験において、未治療の多形膠芽腫を伴う患者は、標準的な外科および放射線治療、もしくは標準的治療および外科手術の間の補助遺伝子治療のいずれかを受領した。該治療の臨床的安全性が決定され、かつ、双方の群で比較に値したが、しかし、遺伝子治療と対照患者との間で有意の臨床的差異は存在しなかった。
【００１０】
それらの安全性をなお維持する、ヒト腫瘍の治療に対する高い有効性を有するＨＳＶ由来のウイルス殺腫瘍（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）ベクターが望ましい。
【特許文献１】
Ｌｅｉｂ，Ｄ．，１９９７
【特許文献２】
Ｅｆｓｔａｔｈｉｏｕ Ｓ．ら，１９９９
【特許文献３】
Ｓｐｅａｒ，Ｍ．Ａ．２０００
【非特許文献１】
ＲｅａｄとＦｒｅｎｋｅｌ，１９８３
【非特許文献２】
Ｋｗｏｎｇら １９８８
【非特許文献３】
ＫｗｏｎｇとＦｒｅｎｋｅｌ，１９８７
【非特許文献４】
ＳｐａｅｔｅとＦｒｅｎｋｅｌ，１９８２
【非特許文献５】
Ｆｒｅｎｋｅｌら，１９９４
【非特許文献６】
Ｖｌａｚｎｙ，Ｄ．Ａ．ら，１９８１
【非特許文献７】
Ｒａｂｋｉｎ，Ｓら ２０００
【非特許文献８】
ｍａｒｋｅｒｔ，Ｊ，２００１
【非特許文献９】
Ｒａｎｏｖ，Ｎ．Ｇ．，２０００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
悪性疾患の治療のための安全かつ高度に有効なＨＳＶ由来ベクターを提供するために、標的腫瘍細胞を排除することの機会を高め、それが分裂しない非悪性細胞中で複製しないよう設計されるためになお安全のままであることができる、最低１種の二元的なウイルス武器（ｄｕａｌ ｖｉｒａｌ ｗｅａｐｏｎｒｙ）をこうしたベクター中で提供することが望ましい。
【００１２】
本発明により、こうした配合（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）ベクターが提供される。本発明のＨＳＶ由来ベクターは２つの主成分、すなわち、それぞれが細胞破壊能力をもつ誘導可能な毒性遺伝子を担持する、アンプリコン型の反復単位（ｒｅｐｅａｔ ｕｎｉｔ）の複数の反復（ｒｅｉｔｅｒａｔｉｏｎ）をもつ欠損ウイルスゲノムである一成分（「アンプリコン」）、および、第二の成分、非分裂細胞中での複製が不能であるか、もしくは少なくともこうした細胞中で有意に低い複製能力を有するＨＳＶ突然変異体ヘルパーウイルス（「ヘルパーウイルス」）を含んで成る。本発明のこうした混成ベクターは、本明細書でときに「混成殺腫瘍ベクター」と称することができる。
【００１３】
好ましくは、ヘルパーウイルスはビリオン宿主シャットオフ（ｖｈｓ−ＵＬ４１）遺伝子中で突然変異される。より好ましくは、ヘルパーウイルスは、ｖｈｓ遺伝子ならびにリボヌクレオチド還元酵素（ＲＲ）遺伝子双方中で二重突然変異される。
【００１４】
こうしたベクターの二元的なウイルスアーム（ｄｕａｌ ｖｉｒａｌ ａｒｍ）は、その安全性を維持しつつ該ベクターの有効性を実質的に高める。短い時間の期間に多コピーで発現されるアンプリコン上の細胞傷害性外来遺伝子の効果的発現、ならびに、（見かけ上アポトーシスを誘導することにより）細胞を細胞死に駆動する突然変異されたヘルパーの能力の双方により標的の悪性細胞を攻撃する、本発明のベクターの二元的な成分は、その安全性を維持しつつ該ベクターの有効性を実質的に高める。「高められた有効性」という用語は、該ベクターの１成分のみ（すなわち毒性遺伝子を含んで成るアンプリコンもしくはヘルパーベクター）の有効性より高い有効性を意味すると理解されるべきである。
【００１５】
アンプリコンおよびＨＳＶの突然変異体の組合せを含んで成るこうした混成殺腫瘍ベクターは記述されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の一態様によれば、有効量の、最低１種の毒性外来遺伝子を担持するＨＳＶ由来アンプリコン欠損ウイルスゲノム、およびＨＳＶ由来の突然変異体ヘルパーウイルス、ならびに製薬学的に許容できる担体、賦形剤もしくは希釈剤を含んで成る、個体における充実性腫瘍の治療での使用のための製薬学的組成物が提供される。
【００１７】
「有効量」という用語は、個体への投与に際して所望の治療効果を達成することができるＨＳＶ由来のウイルス成分のそれぞれの量を指す。アンプリコンに関して、有効量は、短い時間の期間に外来毒性遺伝子の所望の発現量をもたらすようであることができる。ヘルパー成分の有効量は、（遺伝子発現に必要な機能を提供することにより）アンプリコンの効果を高めるような、および、好ましくは、ヘルパーウイルスを細胞に対し細胞傷害性にする量であることができる。ヘルパーウイルスがｖｈｓ突然変異体である場合、有効量は標的細胞の死亡に至るようであることができる。
【００１８】
該混成ベクターのアンプリコン成分において、欠損ゲノムは外来毒性遺伝子を担持するよう工作される。「外来毒性遺伝子」という用語は、標的細胞により天然に発現されずかつ制御された様式で細胞を破壊するよう設計される遺伝子に関する。いかなるこうした毒性遺伝子も本発明により使用してよく、そして、該遺伝子は、治療されるべき腫瘍の種類ならびに付加的な因子に基づき当業者により選ばれてよい。アンプリコン中のこうした毒性遺伝子の一例はチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする遺伝子であり、これは細胞中で発現される場合にそれらをガンシクロビルに対して感受性にして、宿主ＤＮＡの複製の完全な阻害および分裂細胞の破壊を生じさせる。アンプリコン中に配置されるべき他の型の毒性外来遺伝子は、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）およびＰ５３である。こうした毒性遺伝子はＴｅｔ Ｏｎ系の制御下に置くことができ、テトラサイクリンで治療される場合にのみ毒性遺伝子の発現を可能にする。他の毒性遺伝子を、他の適するプロモーターもしくは誘導物質の制御下で発現されるように構築してよい。本発明のアンプリコンはまた、１種もしくはそれ以上のプロモーターの制御下の多数の毒性遺伝子を含んでもよい。こうした毒性遺伝子を、所望の細胞もしくは組織中でのみ発現される細胞もしくは組織特異的プロモーター（例えば、前立腺細胞のみでの前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の発現を制御するプロモーター）の制御下に構築してもまたよい。
【００１９】
本発明はまた、個体における充実性腫瘍の治療のための製薬学的組成物の製造のための、最低１種の毒性外来遺伝子を担持するＨＳＶ由来のアンプリコン欠損ウイルスゲノムおよびＨＳＶ由来の突然変異体ヘルパーウイルスの使用も提供する。
【００２０】
その局面の別のものにより、本発明は、有効量の、最低１種の毒性外来遺伝子を担持するＨＳＶ由来のアンプリコン欠損ウイルスゲノム、およびＨＳＶ由来の突然変異体ヘルパーウイルスの組合せ剤を含んで成るＨＳＶ由来ウイルスベクターの投与を含んで成る、充実臓器の腫瘍を有する個体の治療方法を提供する。好ましくは、ヘルパーウイルスはｖｈｓ遺伝子中に１個の突然変異を含んで成る。最も好ましくは、突然変異体ヘルパーウイルスはＲＲ遺伝子中にもまた１個の突然変異を担持する。
【００２１】
本発明の「治療」という用語は、充実性腫瘍に罹っている患者の病状のいかなる軽減も意味すると理解されるべきである。こうした軽減は、腫瘍の大きさの低下、腫瘍の成長速度の低下、腫瘍関連の症状の軽減、転移の予防などであるかもしれない。
【００２２】
好ましい一態様により、本発明のヘルパーウイルスは、突然変異されたビリオン宿主シャットオフ（ｖｈｓ）遺伝子を担持するよう構築され、こうしたベクターはときに「ｖｈｓ突然変異体」と称される。ｖｈｓ突然変異体ウイルスの細胞傷害性効果は、感染した細胞における顕著な細胞のアポトーシスの誘導に関連することが示された。加えて、突然変異されたｖｈｓ遺伝子により、該混成ベクターのアンプリコン成分により担持される毒性遺伝子の転写されたｍＲＮＡは、（突然変異されないｖｈｓ遺伝子の場合でのとおり）即座に分解かつ不活性化されず、従って、毒性遺伝子の発現およびｖｈｓ成分のアポトーシス効果の増強を可能にし、全体として該混成ベクターの高められた有効性をもたらす。
【００２３】
本発明のヘルパーウイルスはＲＲ遺伝子中にもまた１個の突然変異を含んでよい。ＲＲ酵素は休止中の非分裂細胞中でのウイルス複製に不可欠である一方、ウイルスは成長する細胞中で活性である細胞のＲＲを使用することができる。ＲＲ突然変異が、該酵素の小さなＲＲサブユニット（ＩＬ３９遺伝子）中に導入された。これはそれを不活性にする。ＲＲ突然変異の使用は、いかなる複製するウイルスも隣接する正常細胞に広がらせないことにより、該ベクターを遺伝子治療における使用により安全にさせる。該ヘルパーベクターは、ＲＲ突然変異を単独でもしくは突然変異体ｖｈｓと一緒に含有してよい。とは言え、（下の図３に示されるとおり）、ニューロン細胞中でのｖｈｓ突然変異体の成長は該ベクターをより安全にすることに制限され、ｖｈｓヘルパーの機械装置中へのＲＲ突然変異体の導入は、遺伝子治療における潜在的使用にそれをなおより安全にすることができる。
【００２４】
本発明の混成ベクターの２成分は、細胞をヘルパーウイルスに感染させること、および同一の細胞をアンプリコンプラスミドでトランスフェクトすることによるか、もしくは、ヘルパーウイルスＤＮＡおよびアンプリコンプラスミドでの細胞の二重トランスフェクション、次いで、その後個体に投与することができる双方の成分を含んで成る細胞のストックを生成させるためのウイルスおよびアンプリコンの混合物の反復される連続的繁殖によるかのいずれかで得られるかもしれない。あるいは、アンプリコンを、最初に、Ｐａｃ−１およびＰａｃ−２シグナルを欠きそして従ってパッケージングされることが可能でない非感染性のｖｈｓ突然変異されたＨＳＶヘルパーウイルスを含んで成る細胞系の細胞中で成長させてもよい。この様式で、感染性のヘルパーウイルスなしにエクスビボで大量のアンプリコンを調製することが可能であり、ｖｈｓ突然変異体ウイルスのビリオン中にパッケージングされたアンプリコンをもたらす。こうしたパッケージングされたアンプリコンは感染性である。すなわち、それらは細胞中に進入しかつ外来細胞傷害性遺伝子ならびにｖｈｓ−１突然変異体遺伝子双方を導入することができる。こうしたアンプリコンを、ヘルパーウイルスを伴わずに個体に投与してよい。すなわち、本発明のベクターの双方の成分が、パッケージングされたアンプリコン中に存在することができる。
【００２５】
本発明のＨＳＶ由来の混成殺腫瘍ベクターは、上皮、線維芽細胞およびニューロン細胞を包含する広範な宿主範囲を有し、そして従って、例えば、神経芽腫および多形膠芽腫を包含する脳の悪性病変、肺、膵、腎、結腸および胃癌のような多様な充実臓器の腫瘍の治療に適する。
【００２６】
典型的には、本発明により、該ベクターは腫瘍中に直接局所注入により個体に投与することができる。しかしながら、ときに、ベクターの成分を、全身で、静脈内に（ｉ．ｖ．）、皮下に（ｓ．ｃ．）、筋肉内に（ｉ．ｍ．）、腹腔内に（ｉ．ｐ．）もしくは経口でを包含する他の投与経路により投与してもまたよい。こうした成分は、当業者により選ばれる特定の投与経路に適する当該技術分野で既知の製剤のいずれかで製造することができる。
【００２７】
本発明のＨＳＶ由来の混成ベクターは、典型的には、以下の特徴を有することができる：（ＳｐａｅｔｅとＦｒｅｎｋｅｌ，１９８２，Ｆｒｅｎｋｅｌら，１９９４）
（ｉ）ＨＳＶアンプリコンは、線維芽細胞、上皮およびニューロン細胞に標的を定めることができる用途の広いベクターである。
（ｉｉ）該系は、ヘルパーウイルス、およびアンプリコンＤＮＡ配列の複数の反復を含有する構築された欠損ゲノムよりなる。
（ｉｉｉ）２個のｃｉｓに作用するシグナル、すなわちＤＮＡ複製起点および切断パッケージングシグナルが、ヘルパーウイルスの存在下でのアンプリコンの繁殖に必要とされる。
【００２８】
該アンプリコンは、ＯｒｉＳもしくはＯｒｉＬいずれかの複製起点を使用することができる。
（ｉｖ）該欠損ウイルスゲノムは、クローン化されたトランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｇｅ）配列を包含するアンプリコン配列の複数の頭から尾の（ｈｅａｄ ｔｏ ｔａｉｌ）反復を伴う「循環（ｅｎｄｌｅｓｓ）」コンカテマーＤＮＡ分子を生じる回転する環の機構（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）により複製する。
（ｖ）該ヘルパーウイルスは、ｔｒａｎｓに、複製酵素（例えばウイルスのＤＮＡポリメラーゼ、ヘリカーゼ、プライマーゼ、リガーゼおよびＤＮＡ結合タンパク質）を包含するＤＮＡ複製およびパッケージングの機械装置、ならびにＨＳＶビリオンのタンパク質および糖タンパク質を包含するパッケージング機能を供給する。
（ｖｉ）長い複製されたＤＮＡコンカテマーは、パッケージング過程の間に切断される。ＨＳＶにおいて、切断／パッケージングシグナル「ｐａｃ−１」および「ｐａｃ−２」が配列中に存在する。
（ｖｉｉ）切断されたＤＮＡ分子は、大きさが単一から複数の反復単位までの範囲にわたる（それらの全体の大きさが個々のアンプリコンの大きさから無傷のＨＳＶ−１ゲノム（１５２ｋｂ）までに対応する）。切断／パッケージング過程の詳細を決定するために、われわれは、異なる大きさのアンプリコンを受領した細胞中に存在するウイルスＤＮＡ分子をパルスフィールド電気泳動により分析した。これらの実験の結果は、切断／パッケージングがｈｅａｄｆｕｌの拘束もまた必要としたことを示し、パッケージングされた分子の大多数はそれらの大きさが１３６−１５０ｋｂの範囲のおおよそゲノム長のＤＮＡにわたった。切断は、ウイルスゲノムがパッケージングの過程で構造的ビリオンに「供給」される際に起こる。
（ｖｉｉｉ）切断の正確な位置、およびその結果のパッケージングは、全部のヘルペスウイルス中で良好に保存されるｐａｃ−１およびｐａｃ−２シグナルにより決定される（Ｒｏｍｉら、１９９９）。切断はｐａｃ−１シグナルから４０〜４４ｂｐ、およびｐａｃ−２シグナルから３５〜３５ｂｐ離れて起こることが示されている。
（ｉｘ）ｐａｃ−１およびｐａｃ−２要素はヘルパーウイルスのパッケージングにもまた必要とされる。ＨＳＶ−１欠損ゲノムの反復単位はそれらの大きさが１７ｋｂに達する可能性がある。より大きな大きさのウイルスアンプリコンは、反復単位の大きさが１７ｋｂに達するまで、ＤＮＡ複製の過程で無作為に欠失される（ＫｗｏｎｇとＦｒｅｎｋｅｌ，１９８５）。１７ｋｂより小さい大きさの反復を含有する欠損ウイルスゲノムは、５０回以上の連続継代の間、ウイルスストック中で安定繁殖することができる。
【００２９】
ＨＳＶ由来のアンプリコンはまた、該ベクターの検出を可能にするマーカー遺伝子も担持してよい。こうした遺伝子は、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マーカー遺伝子のような既知のマーカー遺伝子のいずれであってもよい。
【００３０】
本発明により、２種の上述された成分を含んで成る混成殺腫瘍ＨＳＶ由来ベクターを、付加的な治療もしくは成分と組合せで個体に投与してよい。こうした一成分は、例えば、治療される個体の免疫活性を高めるペプチドをコードする遺伝子を含んで成る付加的なウイルスベクターであるかもしれない。こうしたベクターの一例は、「免疫原性」遺伝子を含有するヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）もしくはＨＨＶ−７由来のアンプリコン（Ｒｏｍｉら、１９９９）のようなリンパ球向性細胞を感染させることが可能なものである。免疫原性遺伝子は、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０もしくはインターフェロンのようなインターロイキンをコードしかつ投与に際して細胞中のこうしたペプチドの発現を高める遺伝子であるかもしれない。「免疫原性」ベクターは、ＨＳＶ由来ベクターとの多様な組合せで投与してよい。付加的な成分は、上述された投与経路のいずれかにより、かつ、混成殺腫瘍ＨＳＶ由来ベクターの投与の前、間もしくは後の多様な時点で個体に投与してよい。
【００３１】
従って、本発明はさらに、有効量の、ＨＳＶ由来の突然変異体ヘルパーベクターと一緒の、最低１種の毒性外来遺伝子を担持するＨＳＶ由来の欠損ウイルスアンプリコンゲノムを含んで成る第一の製薬学的組成物、および、有効量の、治療される個体の免疫系を高めることが可能なペプチドをコードする遺伝子を担持するウイルス由来のアンプリコンを含んで成る第二の製薬学的組成物を包含する、２種の製薬学的組成物の組合せ剤を提供し、該組合せ剤は充実性腫瘍の治療のために個体に投与することを意図しており、この治療において、前記第二の組成物は時間Ｔに投与され、前記時間Ｔは前記第一の製薬学的組成物の投与の前、間もしくは後である。
【００３２】
上の組合せ剤は、前記第一および前記第二の製薬学的組成物を包含する包装の形態であってよい。
【００３３】
本発明は、さらに、有効量の、ＨＳＶ由来の突然変異体ヘルパーベクターと一緒の、最低１種の毒性外来遺伝子を担持するＨＳＶ由来の欠損ウイルスアンプリコンゲノムを含んで成る、有効量の第一の製薬学的組成物を前記個体に投与すること、および、前、間もしくはその後の時間Ｔに、有効量の、治療される個体の免疫系を高めることが可能なペプチドをコードする遺伝子を担持するウイルス由来アンプリコンを含んで成る第二の製薬学的組成物を前記個体に投与することを含んで成る、個体における充実性腫瘍の治療方法を提供する。
【００３４】
本発明は、さらに、個体における充実性腫瘍の治療のための、有効量の、ＨＳＶ由来の突然変異体ヘルパーベクターと一緒の、最低１種の毒性外来遺伝子を担持するＨＳＶ由来の欠損ウイルスアンプリコンゲノムを含んで成る第一の製薬学的組成物の使用を提供し、この治療は、前記第一の組成物を個体に投与すること、および前、間もしくはその後の時間Ｔに、有効量の、治療される個体の免疫系を高めることが可能なペプチドをコードする遺伝子を担持するウイルス由来のアンプリコンを含んで成る第二の製薬学的組成物を前記個体に投与することを包含する。
【００３５】
なおさらに、本発明は、使用のための指示書（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）と一緒に、有効量の、ＨＳＶ由来の突然変異体ヘルパーベクターと一緒の、最低１種の毒性外来遺伝子を担持するＨＳＶ由来の欠損ウイルスアンプリコンゲノムを含んで成る第一の製薬学的組成物、および、有効量の、治療される個体の免疫系を高めることが可能なペプチドをコードする遺伝子を担持するウイルス由来のアンプリコンを含んで成る第二の製薬学的組成物を含んで成るキットを提供する。
【００３６】
さらに、治療される個体に投与される付加的な治療は、例えば免疫応答のレベルを高めることが意図される治療（例えばインターフェロン）、または放射線もしくは化学療法のような腫瘍細胞の治療およびターゲッティングのような、充実性腫瘍を有する個体に典型的に投与されるいずれの他の治療であってもよい。
【００３７】
以下において、本発明は以下の制限しない実施例に関して例示されることができる。
【００３８】
実施例
実施例１
材料および方法
細胞培養物：−小脳顆粒ニューロン（ｇｒａｎｕｌａｒ ｎｅｕｒｏｎ）について高度に濃縮された初代培養物を、８日齢のＢＡＬＢ−Ｃマウスから調製した。培養物はマウス脳から作成した。細胞をトリプシン処理し、そして標準培地（１ｍｇ／ｍｌブドウ糖を補充されたイーグル基礎培地、１０％ウシ胎児血清、２５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭグルタミン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび２５０ｎｇ／ｍｌアムホテリシンＢ）中のポリ−Ｌ−リシンで被覆された皿上に置いた。シトシン−β−アラビノフラモシド［Ｃｙｔｏｓｉｎｅ−β−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｍｏｓｉｄｅ：（Ａｒａ−Ｃ）］（１０μＭ）を、プレーティングの１８〜２２時間後に培地に添加して、非ニューロン細胞の複製を予防した。
ウイルス：−ＨＳＶ−１（ＫＯＳ）が野性型ウイルスとしてはたらいた。ビリオン関連宿主シャットオフ（ｖｉｒｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｏｓｔ ｓｈｕｔｏｆｆ）突然変異体を、一般的ＢｕｄＲ突然変異誘発、および、これが感染性ビリオン内で細胞中にもたらされるビリオン機能であることを再保証するためのアクチノマイシンＤの存在下で宿主タンパク質合成を止めなかった突然変異体の選択により、−１（ＫＯＳ）からわれわれの研究室で生じさせた（ＲｅａｄとＦｒｅｎｋｅｌ，１９８３）。ウイルスストックを、０．０１ｐｆｕ／細胞の入力（ｉｎｐｕｔ）感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）でＶｅｒｏ細胞を使用して制限継代を用いて作成した。
小脳顆粒細胞のＨＳＶ感染：−顆粒ニューロンを、ニューロンをプレーティングした後に４日感染させた。生存可能な細胞の数を、トリパンブルー排除アッセイを使用する各実験で測定した。ニューロンを馴化培地で２回洗浄してＡｒａ−Ｃを除去し、そしてその後、本文中に述べられたとおり適切なウイルスのｍ．ｏ．ｉ．に曝露させた。感染は１％胎児血清を含む１９９Ｖ培地中でであった。細胞を３７℃で２時間感染させた。その後、接種を除去し、そして、馴化培地を、３７℃でさらなるインキュベーション前に添加した。
感染性ウイルス収量のアッセイ：−異なるｐ．ｉ．時間で、感染した小脳顆粒ニューロンを収穫し、そして、３周期の凍結および融解により破壊してウイルスを放出させた。感染性ウイルスを、Ｖｅｒｏ細胞でのプラークアッセイにより力価測定した（ｔｉｔｅｒｅｄ）。
トリパンブルー生存率アッセイ：−ニューロンの生存はトリパンブルー排除アッセイにより測定した。細胞を、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４中０．１％のトリパンブルーの溶液中で１０分間インキュベートし、そしてその後ＰＢＳで２回洗浄した。それぞれおよそ５００個の細胞を含有した３個の無作為に選ばれた野を、位相差および明視野顕微鏡検査により分析した。暗青色色素を排除する細胞を生存可能として計数した一方、青色に染色された細胞を死亡として評価した。
ＭＴＴアッセイ：−以前に記述された手順の一変法を使用した。すなわち、ニューロン培養物（９６穴プレート中）を、標準培地中０．５ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴとともに３７℃で６０分間インキュベートした。ＭＴＴ溶液を吸引し、そして細胞を２００ｍｌ ＤＭＳＯ中で溶解した。ＭＴＴホルマザンの量を、バイオテック（Ｂｉｏ−ｔｅｋ）マイクロプレートリーダー（Ｗｉｏｏｓｋｉ、米国バーモント州）にて４９０／６９０での吸光度を測定することにより定量した。
ＤＡＰＩでのＤＮＡ染色：−細胞をポリ−ｌ−リシンで被覆されたカバーガラス上で成長させた。細胞を感染させた。実験の完了に際して、細胞をリン酸緩衝生理的食塩水ｐＨ−７．４（ＰＢＳ）で洗浄し、そして４％ホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）中で１０分間固定した。固定後に、ニューロンをＰＢＳで洗浄し、１０μｇ／ｍｌ ＤＡＰＩ（４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール）で５分間染色し、そしてＰＢＳで２回洗浄し；一滴の没食子酸Ｎ−プロピルもしくはグリセロールのいずれかを添加して蛍光を増強し、それをＵＶ光学顕微鏡検査により検出した。完了した場合に、細胞をＰＢＳで洗浄し、そしてＰＢＳ中４５ホルムアルデヒド中で固定した。固定および洗浄した後に、１０ｍｇ／ｍｌ ＤＡＰＩで染色し、洗浄し、そして一滴のグリセロールを添加して蛍光を増強し、それをＵＶ光学顕微鏡検査により検出した。
結果
マウス小脳顆粒ニューロン中の野性型（ｗｔ）およびｖｈｓ−１突然変異体ウイルスの複製：
マウス小脳顆粒ニューロン中でのｗｔ ＨＳＶ−１（ＫＯＳ）およびｖｈｓ−１突然変異体ウイルスの複製を多様な感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）で分析した。図３は、０．１、１および１０ＰＦＵ／細胞の入力ｍ．ｏ．ｉ．での感染後（ｐ．ｉ．）４８時間までのニューロン細胞中の感染性ウイルスの収量を比較する。結果として生じるウイルスストックの力価測定はＶｅｒｏ細胞で行った。該結果は、ｗｔウイルスがニューロン細胞中で豊富に複製したことを示した。感染性ウイルスの収量は、０．１ｐｆｕ／細胞の入力ｍ．ｏ．ｉ．に感染した培養物で最高であった（入力ウイルスの１４２８倍増幅）。それらは１および１０ＰＦＵ／細胞の入力ｍ．ｏ．ｉ．でより低かった（ｐ．ｉ．４８時間までに入力ウイルスのそれぞれ６２および４．６倍増幅。対照的に、ｖｈｓ−１突然変異体はニューロンサンプル中で十分に複製せず、感染性ウイルスの収量は、それぞれ、０．１ＰＦＵ／細胞のｖｈｓ−１突然変異体ウイルスに感染した細胞で２倍の入力ウイルス、ならびに１および１０ＰＦＵ／細胞に感染した細胞でウイルス増幅なしに対応した。該データに基づけば、ｖｈｓ−１突然変異体が脳細胞中で複製する制限された能力のみを所有すると結論することができる。
プログラムされた細胞死（アポトーシス）の誘導：ＭＴＴアッセイ：
ｖｈｓ機能は宿主細胞のｍＲＮＡの不安定化／分解を引き起こすため、感染した細胞がプログラムされた細胞死を経験するよう誘導されたかどうか、および、ｖｈｓ−１突然変異体が小脳顆粒ニューロンに対しより毒性であったかどうかを決定することは興味深かった。精製された小脳ニューロン培養物の二重の９６穴の培養物をＨＳＶ−１（ＫＯＳ）もしくはｖｈｓ−１突然変異体ウイルスに感染させた。細胞の生存率を、ｐ．ｉ．１２、２４、３６および４８時間にＭＴＴホルマザンの取り込みにより測定し、バイオテック（Ｂｉｏ−ｔｅｋ）マイクロプレートリーダーでの４９０／６９０の吸光度により定量した。該実験を、異なる入力ｍ．ｏ．ｉ．を使用して類似の結果を伴い、数回反復した。例示的一実験は、１、５および１０ＰＦＵ／細胞のＨＳＶ−１（ＫＯＳ）もしくはｖｈｓ−１突然変異体ウイルスの入力ｍ．ｏ．ｉ．での精製された顆粒ニューロン培養物の９６穴単層の感染を伴った。図４に示されるとおり、ｗｔ ＨＳＶ−１（ＫＯＳ）でのニューロンの感染はｐ．ｉ．４８時間までにアポトーシスを引き起こさなかった一方、ｖｈｓ−１突然変異体ウイルスの感染は顕著な（５０％まで）アポトーシスに付随された。
トリパンブルーアッセイ：
ＭＴＴアッセイと平行して、ニューロンの生存率をトリパンブルー排除アッセイにより測定した。暗青色色素を排除する細胞を生存として計数した一方、青色に染色された細胞を死亡として評価した。図５に示されるとおり、３ＰＦＵ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．でのＫＯＳウイルス感染はｐ．ｉ．４８時間までに実質的な細胞死を引き起こさなかった一方、５０および７０％近い死亡ニューロン細胞が、ｖｈｓ−１に感染した細胞中で死亡していた。
細胞死の特徴づけ：ＤＡＰＩアッセイ
感染がアポトーシス死を生じさせたかどうかを検査するために、ニューロンの培養物を、ポリ−Ｌ−リシン支持体を伴うカバーガラス上で成長させた。異なる時間の長さの間のｗｔおよびｖｈｓ突然変異体ウイルスでの感染後に、細胞をホルムアルデヒドで固定し、ＤＡＰＩ（４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール）で染色し、そして蛍光顕微鏡で検査した。図６は、未感染の顆粒ニューロンの核が楕円形状を伴い大きさが均一に見え、そして、マウス細胞に典型的な、中程度の強度でむしろ均一に染色されかつ光る領域で斑点を付けられたことを示す。ＫＯＳへの曝露の１２時間後に、細胞は変化されないように見えた一方、ｖｈｓウイルスに曝露された細胞では、いくつかのニューロンの核がそれらの楕円形状を喪失し、そして明るい円形の点のように見えた。死亡過程が進行した際に、分解された核（円形区画）の数が増大した。ｖｈｓウイルスへの曝露の２４時間後に、全部の核は辺縁化、断片化、および個々の粒子への凝集を受けた一方、ＫＯＳに曝露された細胞のいくつかが、劣化過程の最初の兆候を示した。これらの結果は、アポトーシスのニューロン死につながる高カリウムを枯渇された小脳顆粒ニューロンのＤＡＰＩ染色の観察結果と区別できない。一緒にすれば、われわれの結果は、ウイルス感染に誘発される死亡がアポトーシスの特徴を有することを示す。
【００３９】
偽感染した細胞、もしくはＨＳＶ−１（ＫＯＳ）、ＨＳＶ−２（６）およびｖｈｓ−１突然変異体に感染した細胞中の、ハウスキーピング遺伝子ならびに感染後に誘導されるストレス関連遺伝子（チューブリンおよび熱ショック７０タンパク質（ＨＳＰ−７０）のような）のｍＲＮＡの分解に対するウイルス感染の影響を分析した（結果は示されない）。いくつかの結論をこの例示的実験から引き出すことができる。すなわち、（ｉ）ｖｈｓ機能は、細胞をアクチノマイシンＤの存在下で感染させた場合もまたｍＲＮＡの分解が起きて一緒になって宿主ウイルス遺伝子の感染後の転写を予防するために、感染後のウイルス遺伝子発現を必要としない。（ｉｉ）ｖｈｓ機能はチューブリンのような遺伝子を分解する。（ｉｉｉ）熱ショック「ストレス」ｍＲＮＡは、ウイルス感染に応答して誘導される７０タンパク質を感染後に誘導した。アクチノマイシンＤ処理は、ＫＯＳ中のその蓄積およびｖｈｓ−１突然変異体ウイルス感染を予防した。
【００４０】
上の図に示されるとおり、８日齢のＢａｌｂＣマウスの小脳顆粒ニューロンを使用する上の実験は：（ｉ）ｗｔウイルスは小脳顆粒ニューロン中で良好に複製する一方、ｖｈｓ−１突然変異体の複製は感染後４８時間まででさえ起こらなかった（ｉｉ）ｗｔウイルス感染はアポトーシスを誘導しない一方、突然変異体ウイルス感染は、細胞生存率のミトコンドリアＭＴＴ（臭化３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェンルテトラゾリウム）アッセイにより測定されるところの誘導された顕著な細胞死を有する（ｉｉｉ）同様に、トリパンブルーアッセイは、ｖｈｓ−１感染での顕著な死亡に比較して、ｗｔウイルス感染後に細胞死を示さなかった。（ｉｖ）ニューロン細胞死は、Ｄａｐｉ蛍光により判断されるところの細胞の劣化および核の破壊を伴うアポトーシスを反映した、ことを示す。ｖｈｓ−１突然変異体ウイルス感染は、より顕著なアポトーシス、およびより早期にｗｔウイルスにより引き起こされる制限されたアポトーシスを引き起こす。
【００４１】
上の結果はまた、ｗｔウイルスが、ウイルス感染に応答して誘導される宿主の死亡遺伝子を包含する感染した細胞のｍＲＮＡの不安定化／分解をｖｈｓのＲＮアーゼに開始させることにより、感染後の宿主遺伝子発現を阻害することも示す。対照的に、細胞のｍＲＮＡはｖｈｓ−１突然変異体ウイルス感染において効率的に発現されて顕著なアポトーシスをもたらす。上に示されたとおり、細胞の生存はウイルス複製に有利であり、また、アポトーシスを引き起こさなかったｗｔウイルスは小脳ニューロン中で良好に複製した一方、細胞を殺すｖｈｓ−１突然変異体は、感染後４８時間まででさえマウスニューロン中で複製しなかった。
【００４２】
実施例２
材料および方法
Ｈ１２９９ヒト肺癌細胞系の細胞を、１および１０ｐｆｕ／細胞の感染多重度でＨＳＶ−１突然変異体（ｖｈｓ−１、γ３４．５および３４．５、ｖｈｓ二重突然変異体により例示される）に感染させた。肺細胞中で、ヘルパーウイルスは、安全であるためにその複製を予防する突然変異を担持しなければならない。生存可能および死亡した細胞の数を、トリパンブルーアッセイにより感染後１４、２４、３６、４８、７２および９６時間に測定した。
トリパンブルーアッセイ
細胞を、リン酸緩衝生理的食塩水中０．１％のトリパンブルーを含有する溶液中で１分インキュベートした。その後、５００個の細胞を明視野顕微鏡により計数した。青色色素を排除する細胞を生存可能として計数した一方、青色に染色された細胞を死亡として評価した。
結果
結果は図７〜９に示し、そして以下のとおり要約することができる：
（１）肺細胞中の（アンプリコンを含有する全部のサンプル中の）ｐ５３遺伝子の良好な発現が、ヒト肺癌細胞中でのウェスタンブロットで示される。
（２）感染における細胞死に関して：
（ｉ）１（図７Ａ）および１０（図７Ｂ）ｐｆｕ／細胞のｖｈｓ−１感染（図７）は、感染後３および４日にピーク（それぞれ９０、および９３％の細胞死）に達する、指数的に作用する顕著な細胞死をもたらした。
（ｉｉ）ｐ５３を含有するアンプリコンの添加は細胞死を増大させた。すなわち、図に示されるとおり、ｖｈｓ−１ヘルパーおよびｐ５３アンプリコンの二重感染は、各時点で増大された細胞死を伴い生じた（例えば、感染後（ｐ．ｉ．）２日に、ｖｈｓおよびｖｈｓ＋ｐ５３に感染した培養物中でそれぞれ２０および４０％の細胞死が存在した）。
（ｉｉｉ）図８に示されるとおり、１および１０ｐｆｕ／細胞での３４．５での感染は不完全な死をもたらし、それは徐々に増大して、１ｐｆｕ／細胞の感染で３０％の死亡、および３ｐｆｕ／細胞の感染で６０％の死亡に達した。死亡は感染後３ないし４日にゆっくりとプラトーに達していた。
（ｉｖ）３４．５突然変異体ヘルパーおよびｐ５３アンプリコンでの細胞の二重感染は、有意に増大された死亡をもたらした。死亡は感染後２と３日との間に指数的に増大して、ｐ．ｉ．３日に８８％に達し、また、ｐ．ｉ．４日に９０％でプラトーに達した。
（ｖ）図９に示されるとおり、二重突然変異体３４．５×ｖｈｓに感染した肺癌細胞は、ｐ．ｉ．２と３日との間で既に指数的な細胞死を受けた。死亡は、感染後２日までに１０％であり、そしてｐ．ｉ．３日までに指数的に９０％まで増大した。
（ｖｉ）死亡は、ｐ５３アンプリコンの添加により、より迅速に増大しかつ付加的な有効性に達し、ｐ．ｉ．３および４日にそれぞれ９３および１００％に達した。
（３）類似の結果が、ＭＴＴアッセイ（ミトコンドリアの機能性により細胞の生存率を測定する）を使用して得られた（示されない）。
【００４３】
実施例３
チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を含有するＨＳＶ−１アンプリコンを構築した。該アンプリコンを多様な細胞に感染させ、そして、感染した細胞中でのｔｋ遺伝子発現を、上述されたところのウェスタンブロット分析により評価する。
【００４４】
加えて、単独、もしくは突然変異されたｈｖｓ遺伝子を含有するＨＳＶヘルパーウイルスと組合せの、ｔｋを含んで成るアンプリコンに感染した細胞のガンシクロビル誘導性の死亡を、上述されたところのトリパンブルーもしくはＭＴＴアッセイを使用して評価する。
【００４５】
実施例４
ＴＮＦをコードする遺伝子を含有するＨＳＶ−１アンプリコンを構築した。多様な感染した細胞中でのＴＮＦ遺伝子の発現、ならびに、単独、もしくは突然変異されたｈｖｓ遺伝子を含有するＨＳＶ由来のヘルパーベクターと組合せの、ＴＮＦを含んで成るアンプリコンに感染した細胞の細胞死を、上述されたとおり評価する。
【００４６】
実施例５
インビボでの腫瘍の成長に対するＨＳＶ ｖｈｓ突然変異体ベクターのインビボでの影響
ヌードマウスに、ヒト膠芽腫細胞系の細胞を皮下で注入する。腫瘍の成長の多様な段階で、マウスを以下の群に分割する：
（ａ）偽注入を受領する対照マウス。
（ｂ）ｖｈｓ−１突然変異体ＨＳＶベクターの注入を受領するマウス；
（ｃ）１種もしくはそれ以上の毒性遺伝子を担持するＨＳＶアンプリコンおよびｖｈｓ−１突然変異体ＨＳＶヘルパーウイルスの組合せ剤の注入を受領するマウス；
（ｄ）感染性ヘルパーウイルスを欠くがしかしアンプリコンを被包化するビリオン中に１種もしくはそれ以上の毒性遺伝子およびｖｈｓ−１突然変異体タンパク質を担持する、純粋なＨＳＶアンプリコン（ｐａｃ−１、ｐａｃ−２欠失およびｖｈｓ突然変異体ヘルパーウイルスを含んで成る細胞中で成長される）の注入を受領するマウス；
（ｅ）ＨＳＶベクターの注入の前、それと一緒にもしくは後の多様な時点で、ＩＬ−２をコードする遺伝子を含有するＨＶＶ−６もしくはＨＶＶ−７由来アンプリコンの全身注入と一緒に（ａ）−（ｄ）の治療のそれぞれを受領するマウス。
【００４７】
ウイルスベクターをマウスの腫瘍中に直接注入し、そして、群のそれぞれでの腫瘍の成長を、注入後の多様な時点で測定し、かつ、対照群の腫瘍の成長と比較する。
【００４８】
付加的なインビボ実験において、前述のベクターを、内的臓器内の高度に悪性の腫瘍に対する別の例としての、ヌードマウスの膵悪性細胞もしくは肺悪性細胞（ｌｏｎｇ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｃｅｌｌ）から成長された腫瘍に注入する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】発明にかかる、本発明の混成殺腫瘍ＨＳＶ−１由来ベクターの２成分の一例を示す図解である。示される一成分は、最低１種の毒性遺伝子の複数の反復を担持するＨＳＶ−１アンプリコンであり、そして、第二の成分は、分裂細胞中での複製能力をもちかつ細胞の自殺死機能を誘導するビリオン宿主シャットオフ（ｖｈｓ）機能中の１個の突然変異ならびにリボヌクレオチド還元酵素（ＲＲ）遺伝子中の１個の突然変異を担持する、突然変異体のＨＳＶ−１由来ヘルパーウイルスである。
【図２】発明にかかる、ｐ５３、ウイルスの複製起点（ｏｒｉ）およびパッケージングシグナル（ｐａｃ）を担持するＨＳＶ由来の殺腫瘍ＨＳＶ−１アンプリコンである、本発明の混成殺腫瘍ベクターの一成分の一例を示す図解である。
【図３】発明にかかる、こうした細胞中に感染した野性型ＨＳＶ（ＫＯＳ）ベクターに比較した、マウス小脳顆粒ニューロン中への感染後のｖｈｓ−１突然変異体ヘルパーウイルスの複製を示す図解である。複製を、多様な感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）および感染後多様な時点で測定した。
【図４】発明にかかる、非感染マウスニューロン細胞（偽対照）、および多様な感染多重度での細胞の感染後多様な時点のかつＭＴＴアッセイにより測定されるところのｖｈｓ−１突然変異体ベクターでの感染後のマウスニューロン細胞の生存率を示す図解である。
【図５】発明にかかる、非感染（偽）対照細胞と比較した、細胞の感染後多様な時点でのかつトリパンブルーアッセイにより測定されるところの、ＨＳＶ由来ベクター（ＫＯＳ）もしくはｖｈｓ−１突然変異体ベクターのいずれかでの細胞の感染後のニューロン細胞の生存率を示す図解である。
【図６】発明にかかる、感染およびＤＡＰＩ染色後多様な時点での、ＫＯＳもしくはｖｈｓ−１ウイルスベクターに感染したマウスニューロン細胞培養物の写真を示す。アポトーシスが、ｖｈｓ−１に感染した細胞でみられる。
【図７】発明にかかる、単独、もしくはｐ５３遺伝子を担持するＨＳＶ−１アンプリコンベクターと組合せの、ｖｈｓ−１突然変異体ヘルパーウイルスに感染したＨ１２９９ヒト肺癌細胞の細胞死のパーセントを示す図解である。ベクターを、１プラーク形成単位（ｐｆｕ）／細胞（図７Ａ）および１０ｐｆｕ／細胞（図７Ｂ）の感染多重度で感染させ、そして、生存可能な死細胞の数を、感染後多様な時点でトリパンブルーアッセイにより測定した。
【図８】発明にかかる、１ｐｆｕ／細胞（図８Ａ）もしくは３ｐｆｕ／細胞（図８Ｂ）の感染多重度の単独、もしくはｐ５３遺伝子を含んで成るＨＳＶ−１由来アンプリコンと組合せの、３４．５突然変異を担持するＨＳＶ由来ベクターで感染後の、細胞の感染後多様な時点でのかつトリパンブルーアッセイにより測定されるところの、Ｈ１２９９ヒト肺癌細胞の細胞死を示す図解である。
【図９】発明にかかる、１ｐｆｕ／細胞（図９Ａ）もしくは１０ｐｆｕ／細胞（図９Ｂ）の感染多重度での、ｐ５３細胞傷害性遺伝子を担持するＨＳＶ−１アンプリコンと組合せの３４．５およびｖｈｓ突然変異体遺伝子を担持する二重に突然変異されたＨＳＶ−１ベクターでの感染後の、細胞の感染後多様な時点でのかつトリパンブルーアッセイにより測定されるところの、Ｈ１２９９ヒト肺癌細胞の生存率を示す図解である。【Technical field】
[0001]
The present invention relates to herpes simplex virus (HSV) derived vectors and their use in the treatment of malignancies.
List of references
The following is a list of prior art publications cited herein.
[0002]
[Table 1]
No admission by this specification of the above technology is to be construed as an indication that the technology relates in any way to the patentability of the present invention as specified in the appended claims.
[Background Art]
[0004]
Cells infected with HSV-1 and HSV-2 (HSV of the face and genital lineage) are typically induced to express a suicide gene that is destined to destroy cells before critical viral replication. To overcome this effect and ensure cells for virus replication, the virus uses a 58 kDa structural component of the HSV-1 virion with potent mRNA destabilizing / degrading activity, the virion host shutoff (virion host). An immediate counterattack is undertaken by expressing the shutoff) (vhs) (UL41) gene. The vhs protein is released into the cytoplasm of a cell upon unhulling of the virus during entry of the virus into the cell (Non-Patent
[0005]
An HSV-1 mutant carrying one mutation in the vhs gene has been developed. Infection of wild-type HSV-1 involves degradation of host mRNA, whereas HSV mutants defective in virion host shut-off (vhs) function ("vhs1 mutants") enable continued cellular protein synthesis. I do. One such mutant, designated UL41NHB, has been developed that has been shown to have its infection in cells replicating and attenuated in its ability to re-activate from latency (US Pat. No. 6,059,059).
[0006]
HSV-derived amplicons comprising a helper HSV and at least one inserted gene under the control of a promoter have been disclosed (Non-Patent
[0007]
The incidence of brain tumors is estimated to be 5-14.1 per 100,000 people. Glioma accounts for 40-60% of primary tumors, 75% of which are malignant. Glioma is the most common primary tumor that occurs in the human brain. Malignant gliomas account for 30% of primary brain tumors in adults and are divided by grade into two categories: anaplastic astrocytomas and glioblastomas. The estimated incidence of malignant glioblasts in the United States is 14.7 per 100,000, representing approximately 10,000 to 15,000 new cases annually. Despite improved aggressive surgical treatment, radiation therapy and chemotherapy, malignant glioblasts are almost always fatal; overall 5-year survival of glioblastomas (most malignant glia) is It is less than 5.5% and the median survival is approximately 52 weeks. These numbers have remained virtually unchanged over the past three decades. Treatment of systemic tumors often fails due to the development of central nervous system metastases. Advanced stages show no cure potential. Most gliomas have a poor prognosis without any completely effective treatment.
[0008]
Recently, HSV viral vectors have been evaluated for their efficacy and safety in clinical use in humans. In one study, an HSV-derived vector comprising an HSV mutant virus defective in the gene encoding the 34.5 protein (a major determinant of neuropathology) was used in patients with recurrent glioma. Tested. This mutation is a multiple mutation named "G207" with depletion at both the 34.5 locus and ICP6 (ribonucleotide reductase (RR)) required for replication in non-dividing cells. It is an HSV vector that replicates under the specified conditions (Non-Patent Document 7). The G207 mutant is currently being tested in a Phase I clinical trial for recurrent glioblastoma, where it was shown to be non-toxic and without significant adverse events, but its efficacy Sex has not yet been shown. In addition, insertion of an anti-tumorigenic gene (particularly a cytokine gene) into a mutated vector has been proposed (Non-Patent Document 8).
[0009]
In another study,
[0010]
HSV-derived viral oncolytic vectors with high efficacy for the treatment of human tumors that still maintain their safety are desirable.
[Patent Document 1]
Leib, D .; , 1997
[Patent Document 2]
Efstathiou S. Et al., 1999
[Patent Document 3]
Spear, M .; A. 2000
[Non-patent document 1]
Read and Frenkel, 1983
[Non-patent document 2]
Kwang et al. 1988
[Non-Patent Document 3]
Kwon and Frenkel, 1987
[Non-patent document 4]
Spaete and Frenkel, 1982
[Non-Patent Document 5]
Frenkel et al., 1994.
[Non-Patent Document 6]
Vlazy, D .; A. Et al., 1981
[Non-Patent Document 7]
Rabkin, S et al 2000
[Non-Patent Document 8]
markart, J, 2001
[Non-Patent Document 9]
Ranov, N .; G. FIG. , 2000
DISCLOSURE OF THE INVENTION
[Problems to be solved by the invention]
[0011]
To provide a safe and highly effective HSV-derived vector for the treatment of malignant diseases, which increases the chance of eliminating target tumor cells and is designed to not replicate in non-dividing non-malignant cells It is desirable to provide at least one dual viral weapon in such a vector, which can still remain safe.
[0012]
The present invention provides such a composite vector. The HSV-derived vectors of the present invention have two major components, a defect with multiple repetitions of amplicon-type repeat units, each carrying an inducible toxic gene with cell-destroying ability. One component that is the viral genome ("amplicon") and the second component, an HSV mutant that is incapable of replicating in non-dividing cells or at least has a significantly lower replication capacity in such cells A helper virus ("helper virus"). Such hybrid vectors of the present invention may sometimes be referred to herein as "hybrid tumoricidal vectors."
[0013]
Preferably, the helper virus is mutated in the virion host shutoff (vhs-UL41) gene. More preferably, the helper virus is double mutated in both the vhs gene as well as the ribonucleotide reductase (RR) gene.
[0014]
The dual viral arm of such a vector substantially increases the effectiveness of the vector while maintaining its safety. Effective expression of foreign cytotoxic genes on amplicons expressed in multiple copies over a short period of time, as well as the ability of mutated helpers to drive cells to cell death (by apparently inducing apoptosis) The dual component of the vector of the present invention, which attacks the target malignant cells by both, substantially enhances the effectiveness of the vector while maintaining its safety. The term "enhanced efficacy" is to be understood as meaning an efficacy which is higher than the efficacy of only one component of the vector (ie an amplicon or a helper vector comprising a toxic gene).
[0015]
Such a hybrid tumoricidal vector comprising a combination of an amplicon and a mutant of HSV has not been described.
[Means for Solving the Problems]
[0016]
According to one aspect of the present invention, an effective amount of an HSV-derived amplicon-deficient virus genome carrying at least one toxic foreign gene, and a mutant helper virus derived from HSV, and a pharmaceutically acceptable carrier, Provided is a pharmaceutical composition for use in the treatment of a solid tumor in an individual, comprising a vehicle or diluent.
[0017]
The term "effective amount" refers to the respective amount of the HSV-derived viral component that can achieve the desired therapeutic effect upon administration to an individual. With respect to the amplicon, an effective amount can be such as to provide a desired expression level of the foreign toxic gene in a short period of time. An effective amount of a helper component is such that it enhances the effect of the amplicon (by providing the necessary function for gene expression) and, preferably, renders the helper virus cytotoxic to cells. it can. If the helper virus is a vhs mutant, an effective amount can be such as to result in death of the target cell.
[0018]
In the amplicon component of the hybrid vector, the defective genome is engineered to carry the foreign toxic gene. The term "foreign toxic gene" relates to a gene that is not naturally expressed by the target cell and is designed to destroy the cell in a controlled manner. Any such toxic gene may be used in accordance with the present invention, and the gene may be selected by one of skill in the art based on the type of tumor to be treated as well as additional factors. One example of such a toxic gene in the amplicon is the gene encoding thymidine kinase (TK), which renders them susceptible to ganciclovir when expressed in cells, resulting in complete inhibition of host DNA replication. And the destruction of dividing cells. Other types of toxic foreign genes to be placed in the amplicon are, for example, tumor necrosis factor (TNF), TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) and P53. Such a toxic gene can be placed under the control of the Tet On system, allowing expression of the toxic gene only when treated with tetracycline. Other toxic genes may be constructed to be expressed under the control of other suitable promoters or inducers. The amplicon of the present invention may also contain a number of virulence genes under the control of one or more promoters. Such toxic genes are constructed under the control of a cell or tissue specific promoter that is expressed only in the desired cell or tissue (eg, a promoter that controls the expression of prostate specific antigen (PSA) in prostate cells only). Also good.
[0019]
The present invention also provides a HSV-derived amplicon-deficient virus genome and HSV-derived mutations carrying at least one toxic foreign gene for the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of a solid tumor in an individual. Also provided is the use of a body helper virus.
[0020]
According to another of its aspects, the invention comprises a combination of an effective amount of an HSV-derived amplicon-deficient viral genome carrying at least one toxic foreign gene, and a mutant helper virus from HSV. A method of treating an individual having a tumor of a solid organ, comprising administering an HSV-derived viral vector. Preferably, the helper virus comprises one mutation in the vhs gene. Most preferably, the mutant helper virus also carries one mutation in the RR gene.
[0021]
The term “treatment” of the present invention should be understood to mean any alleviation of the condition of a patient suffering from a solid tumor. Such alleviation may include reducing tumor size, decreasing tumor growth rate, reducing tumor-related symptoms, or preventing metastasis.
[0022]
According to one preferred aspect, the helper virus of the invention is constructed to carry a mutated virion host shut-off (vhs) gene, such vectors are sometimes referred to as "vhs mutants". The cytotoxic effect of the vhs mutant virus has been shown to be associated with the induction of significant cell apoptosis in infected cells. In addition, the mutated vhs gene causes the transcribed mRNA of the toxic gene carried by the amplicon component of the hybrid vector to be immediately degraded and inactivated (as in the case of the unmutated vhs gene). However, it allows the expression of toxic genes and the apoptotic effect of the vhs component to be enhanced, resulting in an overall enhanced efficacy of the hybrid vector.
[0023]
The helper virus of the invention may also contain one mutation in the RR gene. While the RR enzyme is essential for virus replication in resting non-dividing cells, the virus can use the cell RR that is active in growing cells. The RR mutation causes the small RR subunit (I L 39 genes). This makes it inactive. The use of an RR mutation makes the vector safer for use in gene therapy by not spreading any replicating virus to neighboring normal cells. The helper vector may contain the RR mutation alone or together with the mutant vhs. Nevertheless, the growth of the vhs mutant in neuronal cells was limited to making the vector safer (as shown in FIG. 3 below), and the RR mutation into the machinery of the vhs helper. Introduction of the body can make it even safer for potential use in gene therapy.
[0024]
The two components of the hybrid vector of the invention can be obtained by infecting cells with a helper virus and transfecting the same cells with an amplicon plasmid, or by duplicating cells with a helper virus DNA and an amplicon plasmid. It may be obtained either by transfection, and then by repeated continuous propagation of a mixture of virus and amplicon to generate a stock of cells comprising both components which can then be administered to an individual. unknown. Alternatively, the amplicon is first introduced into cells of a cell line comprising a non-infectious vhs mutated HSV helper virus that lacks the Pac-1 and Pac-2 signals and thus cannot be packaged. May be grown. In this manner, it is possible to prepare large quantities of amplicons ex vivo without infectious helper virus, resulting in amplicons packaged in virions of the vhs mutant virus. These packaged amplicons are infectious. That is, they can enter the cell and introduce both the foreign cytotoxic gene as well as the vhs-1 mutant gene. Such amplicons may be administered to an individual without a helper virus. That is, both components of the vector of the present invention can be present in a packaged amplicon.
[0025]
The HSV-derived hybrid tumoricidal vector of the present invention has a broad host range including epithelial, fibroblast and neuronal cells, and is therefore, for example, cerebral, including neuroblastoma and glioblastoma multiforme. Suitable for treating various solid organ tumors such as malignant lesions, lung, pancreatic, renal, colon and gastric cancers.
[0026]
Typically, according to the invention, the vector can be administered to the individual by local injection directly into the tumor. However, sometimes the components of the vector are administered systemically, intravenously (iv), subcutaneously (sc), intramuscularly (im), and intraperitoneally (ip. ) Or by other routes of administration including orally. Such components may be manufactured in any of the formulations known in the art which are suitable for the particular route of administration chosen by one skilled in the art.
[0027]
The HSV-derived hybrid vectors of the present invention can typically have the following characteristics: (Spaete and Frenkel, 1982, Frenkel et al., 1994).
(I) HSV amplicons are versatile vectors that can target fibroblasts, epithelial and neuronal cells.
(Ii) The system consists of a helper virus and an assembled defective genome containing multiple repeats of the amplicon DNA sequence.
(Iii) Signals acting on the two cis, a DNA origin of replication and a cleavage packaging signal, are required for amplicon propagation in the presence of helper virus.
[0028]
The amplicon can use either the OriS or OriL origin of replication.
(Iv) the defective viral genome contains an "endless" concatemer DNA molecule with multiple head to tail repeats of the amplicon sequence, including the cloned transgene sequence. Replicate by the resulting rolling circle mechanism.
(V) the helper virus transduces machinery for DNA replication and packaging, including replication enzymes (eg, viral DNA polymerases, helicases, primases, ligases and DNA binding proteins), and HSV virion proteins and sugars. Provides a packaging function that includes proteins.
(Vi) Long replicated DNA concatemers are cleaved during the packaging process. In HSV, the cleavage / packaging signals "pac-1" and "pac-2" are present in the sequence.
(Vii) Cleaved DNA molecules range in size from single to multiple repeat units (their overall size ranges from the size of individual amplicons to the intact HSV-1 genome (152 kb)). Corresponding to). To determine the details of the cleavage / packaging process, we analyzed viral DNA molecules present in cells that received different sized amplicons by pulse field electrophoresis. The results of these experiments indicate that cleavage / packaging also required headful restriction, and the majority of the packaged molecules were reduced to approximately genomic-length DNA whose size ranged from 136 to 150 kb. I passed. Cleavage occurs when the viral genome is "supplied" to structural virions during the packaging process.
(Viii) The exact location of the cleavage, and the resulting packaging, is determined by pac-1 and pac-2 signals that are well conserved in all herpesviruses (Romi et al., 1999). Cleavage has been shown to occur 40-44 bp away from the pac-1 signal and 35-35 bp away from the pac-2 signal.
(Ix) The pac-1 and pac-2 elements are also required for helper virus packaging. The repeat units of the HSV-1 deficient genome can reach 17 kb in size. Larger size viral amplicons are randomly deleted during DNA replication until the size of the repeating unit reaches 17 kb (Kwong and Frenkel, 1985). Defective viral genomes containing repeats smaller than 17 kb can stably propagate in the virus stock for over 50 consecutive passages.
[0029]
The HSV-derived amplicon may also carry a marker gene that allows detection of the vector. Such a gene may be any of the known marker genes such as, for example, a green fluorescent protein (GFP) marker gene.
[0030]
According to the present invention, a hybrid tumoricidal HSV-derived vector comprising two of the above-described components may be administered to an individual in combination with additional therapies or components. One such component may be, for example, an additional viral vector comprising a gene encoding a peptide that enhances the immune activity of the individual to be treated. One example of such a vector is to infect lymphotropic cells such as herpes virus 6 (HHV-6) or an amplicon derived from HHV-7 (Romi et al., 1999) containing an "immunogenic" gene. It is possible. An immunogenic gene may be, for example, a gene that encodes an interleukin such as IL-2, IL-4, IL-10 or interferon and increases the expression of such a peptide in cells upon administration. "Immunogenic" vectors may be administered in various combinations with HSV-derived vectors. The additional components may be administered to the individual by any of the routes of administration described above and at various times before, during, or after administration of the hybrid tumoricidal HSV-derived vector.
[0031]
Accordingly, the present invention further provides a first pharmaceutical composition comprising an HSV-derived defective viral amplicon genome carrying at least one toxic foreign gene together with an effective amount of an HSV-derived mutant helper vector. And a second pharmaceutical composition comprising an effective amount of an amplicon from a virus carrying a gene encoding a peptide capable of enhancing the immune system of the individual to be treated. Providing a combination of two pharmaceutical compositions, wherein the combination is intended to be administered to an individual for the treatment of a solid tumor, wherein in said treatment the second composition Is administered at time T, wherein said time T is before, during or after administration of said first pharmaceutical composition.
[0032]
The above combination may be in the form of a package containing the first and second pharmaceutical compositions.
[0033]
The present invention further provides an effective amount of a first virus comprising a defective viral amplicon genome from HSV carrying at least one toxic foreign gene, together with an effective amount of a mutant helper vector derived from HSV. Administering to the individual a pharmaceutical composition of the invention, and at a time T before, during or after that, carries an effective amount of a gene encoding a peptide capable of enhancing the immune system of the individual to be treated. A method of treating a solid tumor in an individual, comprising administering to said individual a second pharmaceutical composition comprising said virus-derived amplicon.
[0034]
The present invention further provides an HSV-derived defective viral amplicon carrying at least one toxic foreign gene together with an effective amount of a HSV-derived mutant helper vector for the treatment of a solid tumor in an individual. There is provided use of a first pharmaceutical composition comprising a genome, the treatment comprising administering to the individual said first composition, and at a time T before, during, or after, an effective amount of the first composition. Administering to said individual a second pharmaceutical composition comprising an amplicon from a virus carrying a gene encoding a peptide capable of enhancing the immune system of the individual to be treated.
[0035]
Still further, the present invention provides an HSV-derived deletion carrying at least one toxic foreign gene, together with an effective amount of a HSV-derived mutant helper vector, along with directions for use. A first pharmaceutical composition comprising a viral amplicon genome and an effective amount of a virus-derived amplicon carrying a gene encoding a peptide capable of enhancing the immune system of the treated individual. A kit comprising a second pharmaceutical composition comprising the composition is provided.
[0036]
In addition, additional therapies administered to the individual to be treated include, for example, therapies intended to increase the level of the immune response (eg, interferons), or the treatment and targeting of tumor cells such as radiation or chemotherapy. Any other treatment typically administered to individuals with solid tumors.
[0037]
In the following, the invention can be illustrated with reference to the following non-limiting examples.
[0038]
Example
Example 1
Materials and methods
Cell culture:-Primary cultures highly enriched for cerebellar granule neurons were prepared from 8 day old BALB-C mice. Cultures were made from mouse brain. Cells are trypsinized and poly-L in standard medium (Eagle's basal medium supplemented with 1 mg / ml glucose, 10% fetal calf serum, 25 mM KCl, 2 mM glutamine, 50 μg / ml gentamicin and 250 ng / ml amphotericin B). -Placed on a dish covered with ricin. Cytosine-β-arabinofuramoside [(Ara-C)] (10 μM) was added to the medium 18-22 hours after plating to prevent non-neuronal cell replication.
Virus: -HSV-1 (KOS) worked as a wild-type virus. Virion-associated host shutoff mutants were transformed into common BudR mutagenesis and actinomycin D to reassure that this is a virion function brought into cells within infectious virions. -1 (KOS) was generated in our lab by selection of mutants that did not arrest host protein synthesis in the presence of (Read and Frenkel, 1983). Virus stocks were made with restriction passage using Vero cells at an input multiplicity of infection (moi) of 0.01 pfu / cell.
HSV infection of cerebellar granule cells:-Granule neurons were infected 4 days after plating the neurons. The number of viable cells was determined in each experiment using a trypan blue exclusion assay. Neurons were washed twice with conditioned medium to remove Ara-C, and then the appropriate virus m.p. as described herein. o. i. Was exposed. Infection was in 199V medium with 1% fetal serum. Cells were infected at 37 ° C. for 2 hours. Thereafter, the inoculum was removed and conditioned medium was added at 37 ° C. before further incubation.
Assay for infectious virus yield:-different p. i. At time, infected cerebellar granule neurons were harvested and disrupted by three cycles of freezing and thawing to release the virus. Infectious virus was titered by plaque assay on Vero cells.
Trypan blue viability assay:-Neuronal survival was measured by trypan blue exclusion assay. The cells were incubated for 10 minutes in a solution of 0.1% trypan blue in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, and then washed twice with PBS. Three randomly selected fields, each containing approximately 500 cells, were analyzed by phase contrast and bright field microscopy. Cells that excluded the dark blue dye were counted as viable, while cells that stained blue were assessed as dead.
MTT assay:-A variation of the procedure described previously was used. Briefly, neuronal cultures (in 96-well plates) were incubated with 0.5 mg / ml MTT in standard medium at 37 ° C. for 60 minutes. The MTT solution was aspirated and the cells were lysed in 200 ml DMSO. The amount of MTT formazan was quantified by measuring the absorbance at 490/690 on a Bio-tek microplate reader (Wioski, Vermont, USA).
DNA staining with DAPI:-Cells were grown on coverslips coated with poly-l-lysine. Cells were infected. Upon completion of the experiment, cells were washed with phosphate-buffered saline pH-7.4 (PBS) and fixed in 4% formaldehyde (in PBS) for 10 minutes. After fixation, neurons were washed with PBS, stained with 10 μg / ml DAPI (4,6-diamino-2-phenylindole) for 5 minutes, and washed twice with PBS; one drop of N-propyl gallate or glycerol. Either was added to enhance the fluorescence, which was detected by UV light microscopy. When completed, cells were washed with PBS and fixed in 45 formaldehyde in PBS. After fixation and washing, it was stained with 10 mg / ml DAPI, washed, and a drop of glycerol was added to enhance fluorescence, which was detected by UV light microscopy.
result
Wild-type (wt) and vhs-1 mutant virus replication in mouse cerebellar granule neurons:
The replication of wt HSV-1 (KOS) and vhs-1 mutant viruses in mouse cerebellar granule neurons was analyzed at various multiplicity of infection (moi). FIG. 3 shows input m.s. of 0.1, 1 and 10 PFU / cell. o. i. Compare the yield of infectious virus in neuronal cells up to 48 hours after infection with (pi). The titration of the resulting virus stock was performed on Vero cells. The results indicated that the wt virus replicated abundantly in neuronal cells. The yield of infectious virus was 0.1 pfu / cell input m. o. i. Was highest in cultures infected with C. (a 1428-fold amplification of the input virus). They have an input of 1 and 10 PFU / cell m. o. i. (62 and 4.6 fold amplification of the input virus, respectively, by 48 h pi. In contrast, the vhs-1 mutant did not replicate well in neuronal samples and Yields corresponded to twice as much input virus in cells infected with 0.1 PFU / cell of the vhs-1 mutant virus and no virus amplification in cells infected with 1 and 10 PFU / cell, respectively. On the basis it can be concluded that the vhs-1 mutant possesses only a limited ability to replicate in brain cells.
Induction of programmed cell death (apoptosis): MTT assay:
Because vhs function causes destabilization / degradation of host cell mRNA, whether infected cells were induced to undergo programmed cell death, and whether vhs-1 mutants were more responsive to cerebellar granule neurons It was interesting to determine if it was toxic. Duplicate 96-well cultures of purified cerebellar neuron cultures were infected with HSV-1 (KOS) or the vhs-1 mutant virus. Cell viability was determined by p. i. Measured by incorporation of MTT formazan at 12, 24, 36 and 48 hours and quantified by absorbance at 490/690 on a Bio-tek microplate reader. The experiment was performed with different inputs m. o. i. Was repeated several times with similar results. One exemplary experiment was performed with 1, 5 and 10 PFU / cell HSV-1 (KOS) or vhs-1 mutant virus input m. o. i. Was accompanied by infection of a 96-well monolayer of purified granule neuron cultures. As shown in FIG. 4, infection of neurons with wt HSV-1 (KOS) was p. i. While not causing apoptosis by 48 hours, infection with the vhs-1 mutant virus was significantly (up to 50%) associated with apoptosis.
Trypan blue assay:
In parallel with the MTT assay, neuronal viability was measured by a trypan blue exclusion assay. Cells that excluded the dark blue dye were counted as viable, while cells that stained blue were scored as dead. As shown in FIG. 5, 3 PFU / cell m.d. o. i. KOS virus infection in p. i. While not causing substantial cell death by 48 hours, nearly 50 and 70% of the dead neuronal cells had died in vhs-1 infected cells.
Characterizing cell death: DAPI assay
To test whether infection resulted in apoptotic death, neuronal cultures were grown on coverslips with poly-L-lysine support. After infection with wt and vhs mutant viruses for different lengths of time, cells were fixed with formaldehyde, stained with DAPI (4,6-diamino-2-phenylindole) and examined by fluorescence microscopy. . FIG. 6 shows that the nuclei of uninfected granule neurons appear uniform in size with an elliptical shape and are spotted in areas of moderate intensity but rather uniformly stained and glow typical of mouse cells. Indicates that After 12 hours of exposure to KOS, cells appeared unchanged, while in cells exposed to vhs virus, some neuron nuclei lost their elliptical shape and appeared as bright circular dots. Looked like. As the death process progressed, the number of disassembled nuclei (circular compartments) increased. After 24 hours of exposure to the vhs virus, all nuclei underwent marginalization, fragmentation, and aggregation into individual particles, while some of the cells exposed to KOS showed the first signs of the degradation process. showed that. These results are indistinguishable from the observations of DAPI staining of cerebellar granule neurons depleted of high potassium leading to apoptotic neuronal death. Taken together, our results indicate that deaths induced by viral infection have apoptotic characteristics.
[0039]
Housekeeping genes and post-infection induced stress-related genes (tubulin and heat) in mock-infected cells or cells infected with HSV-1 (KOS), HSV-2 (6) and vhs-1 mutants. The effect of viral infection on mRNA degradation of
[0040]
As shown in the above figure, the above experiments using cerebellar granule neurons from 8-day-old BalbC mice: (i) wt virus replicates well in cerebellar granule neurons, while vhs-1 mutant Replication did not occur even up to 48 hours post-infection (ii) wt virus infection did not induce apoptosis, while mutant virus infection was associated with mitochondrial MTT (3- (4,5-dimethylthia bromide) cell viability. Similarly, the trypan blue assay has a significant effect on vhs-1 infection, with (iii) induced significant cell death as measured by the (sol-2-yl) -2,5-difenltetrazolium) assay. Did not show cell death after infection with the wt virus as compared to significant death. (Iv) shows that neuronal cell death reflected apoptosis with cell degradation and nuclear destruction as judged by Dapi fluorescence. Vhs-1 mutant virus infection causes more pronounced apoptosis and earlier, limited apoptosis caused by wt virus.
[0041]
The above results also indicate that the wt virus causes vhs RNase to initiate destabilization / degradation of the mRNA of infected cells, including the host death gene, which is induced in response to viral infection. Inhibition of host gene expression. In contrast, cellular mRNA is efficiently expressed in vhs-1 mutant virus infection resulting in significant apoptosis. As indicated above, cell survival favored viral replication, and the wt virus that did not cause apoptosis replicated well in cerebellar neurons, whereas the vhs-1 mutant that killed cells was infected. It did not replicate in mouse neurons even up to 48 hours later.
[0042]
Example 2
Materials and methods
Cells of the H1299 human lung cancer cell line were transformed into HSV-1 mutants (vhs-1, γ34.5 and 34.5, exemplified by the vhs double mutant) at a multiplicity of infection of 1 and 10 pfu / cell. Infected. In lung cells, helper viruses must carry mutations that prevent their replication to be safe. The number of viable and dead cells was determined by trypan blue assay at 14, 24, 36, 48, 72 and 96 hours post infection.
Trypan blue assay
Cells were incubated for 1 minute in a solution containing 0.1% trypan blue in phosphate buffered saline. Thereafter, 500 cells were counted with a bright field microscope. Cells that excluded the blue dye were counted as viable, while cells that stained blue were assessed as dead.
result
The results are shown in FIGS. 7-9 and can be summarized as follows:
(1) Good expression of the p53 gene in lung cells (in all samples containing amplicons) is shown by Western blot in human lung cancer cells.
(2) Regarding cell death in infection:
(I) vhs-1 infection of 1 (FIG. 7A) and 10 (FIG. 7B) pfu / cell (FIG. 7) peaks at 3 and 4 days post infection (90 and 93% cell death, respectively). Resulting in exponentially significant cell death.
(Ii) Addition of amplicon containing p53 increased cell death. Thus, as shown in the figure, dual infection of the vhs-1 helper and p53 amplicon occurred with increased cell death at each time point (eg, two days after infection (pi), two days after vpi And 20 and 40% cell death, respectively, in cultures infected with vhs + p53).
(Iii) As shown in FIG. 8, infection at 34.5 at 1 and 10 pfu / cell resulted in incomplete death, which gradually increased to 30% death at 1 pfu / cell infection, and Infection of 3 pfu / cell reached 60% death. Deaths slowly plateaued 3-4 days after infection.
(Iv) Dual infection of cells with the 34.5 mutant helper and p53 amplicon resulted in significantly increased mortality. Deaths increased exponentially between two and three days after infection, with p. i. Reached 88% on
(V) As shown in FIG. 9, lung cancer cells infected with the double mutant 34.5 × vhs were p. i. Already suffered exponential cell death between
(Vi) death increased more rapidly and reached additional efficacy with the addition of p53 amplicon; i. It reached 93 and 100% on
(3) Similar results were obtained using the MTT assay (measuring cell viability by mitochondrial functionality) (not shown).
[0043]
Example 3
An HSV-1 amplicon containing the thymidine kinase (tk) gene was constructed. The amplicon is infected into various cells and tk gene expression in the infected cells is assessed by Western blot analysis as described above.
[0044]
In addition, ganciclovir-induced death of cells infected with amplicons comprising tk, alone or in combination with the HSV helper virus containing a mutated hvs gene, was demonstrated by trypan blue or MTT as described above. Evaluate using the assay.
[0045]
Example 4
An HSV-1 amplicon containing the gene encoding TNF was constructed. Expression of the TNF gene in a variety of infected cells, and cell death of cells infected with an amplicon comprising TNF, alone or in combination with an HSV-derived helper vector containing a mutated hvs gene Is evaluated as described above.
[0046]
Example 5
In vivo effects of HSV vhs mutant vectors on tumor growth in vivo
Nude mice are injected subcutaneously with cells of the human glioblastoma cell line. At various stages of tumor growth, mice are divided into the following groups:
(A) Control mice receiving sham injection.
(B) a mouse that receives an injection of the vhs-1 mutant HSV vector;
(C) a mouse receiving injection of a combination of an HSV amplicon carrying one or more virulence genes and a vhs-1 mutant HSV helper virus;
(D) A pure HSV amplicon (pac-1) that lacks an infectious helper virus but carries one or more virulence genes and a vhs-1 mutant protein in a virion that encapsulates the amplicon. A mouse that receives an injection of pac-2 deletion and grown in cells comprising the vhs mutant helper virus);
(E) At various times before, with or after injection of the HSV vector, together with a systemic injection of HVV-6 or HVV-7 derived amplicons containing the gene encoding IL-2 (a). -Mice receiving each of the treatments in (d).
[0047]
The viral vector is injected directly into the tumors of the mice, and tumor growth in each of the groups is measured at various time points after injection and compared to the control group tumor growth.
[0048]
In an additional in vivo experiment, the aforementioned vector was added to tumors grown from pancreatic or lung malignant cells of nude mice as another example for highly malignant tumors in internal organs. inject.
[Brief description of the drawings]
[0049]
FIG. 1 is an illustration showing one example of two components of the hybrid tumoricidal HSV-1 derived vector of the present invention according to the present invention. One component shown is the HSV-1 amplicon carrying multiple repeats of at least one virulence gene, and the second component is capable of replicating in dividing cells and has a suicide function of the cell. Is a mutant HSV-1 derived helper virus carrying one mutation in the virion host shut-off (vhs) function as well as one mutation in the ribonucleotide reductase (RR) gene. .
FIG. 2 is a component of the hybrid tumoricidal vector of the invention, which is an HSV-derived tumoricidal HSV-1 amplicon carrying p53, the origin of replication (ori) of the virus and the packaging signal (pac) according to the invention. 4 is an illustrative view showing one example.
FIG. 3 is an illustration showing replication of a vhs-1 mutant helper virus after infection into mouse cerebellar granule neurons as compared to a wild-type HSV (KOS) vector infected in such cells according to the invention. . Replication was measured at various multiplicities of infection (moi) and at various time points post-infection.
FIG. 4 shows uninfected mouse neuron cells according to the invention (sham control) and vhs-1 mutant vectors at various time points after infection of cells at various multiplicities of infection and as measured by MTT assay. Fig. 3 is an illustration showing the survival rate of mouse neuron cells after infection with a mouse.
FIG. 5. HSV-derived vector (KOS) or vhs-1 mutant at various time points after infection of cells and as measured by trypan blue assay, compared to uninfected (sham) control cells according to the invention. FIG. 4 is an illustration showing neuronal cell viability after infection of cells with any of the mutant vectors.
FIG. 6 shows photographs of mouse neuron cell cultures infected with KOS or vhs-1 viral vector at various time points after infection and DAPI staining according to the invention. Apoptosis is seen in cells infected with vhs-1.
FIG. 7 is a diagram showing the percentage of cell death of H1299 human lung cancer cells infected with the vhs-1 mutant helper virus, alone or in combination with the HSV-1 amplicon vector carrying the p53 gene, according to the invention. is there. The vector was infected at a multiplicity of infection of 1 plaque forming unit (pfu) / cell (FIG. 7A) and 10 pfu / cell (FIG. 7B), and the number of viable dead cells was determined at various time points post-infection by trypan. Measured by blue assay.
FIG. 8 shows a multiplicity of infection of 1 pfu / cell (FIG. 8A) or 3 pfu / cell (FIG. 8B) alone or in combination with an HSV-1-derived amplicon comprising the p53 gene according to the invention. FIG. 2 is a diagram showing cell death of H1299 human lung cancer cells after infection with HSV-derived vectors carrying the mutation, at various time points after infection of the cells and as measured by trypan blue assay.
FIG. 9 shows a combination of 34.5 and HSV-1 amplicon carrying the p53 cytotoxic gene at a multiplicity of infection of 1 pfu / cell (FIG. 9A) or 10 pfu / cell (FIG. 9B) according to the invention. H1299 human lung cancer cells at various time points post infection and as measured by trypan blue assay after infection of the cells with a doubly mutated HSV-1 vector carrying the vhs mutant gene It is an illustration showing a survival rate.
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