JP2004521614A

JP2004521614A - アンチセンスオリゴヌクレオチドを真核細胞に導入する方法

Info

Publication number: JP2004521614A
Application number: JP2002537851A
Authority: JP
Inventors: グリラットゲベユー; ドナケイ．フォックス; マーサケイ．オギルビー
Original assignee: インヴィトロジェンコーポレーション
Priority date: 2000-10-27
Filing date: 2001-10-26
Publication date: 2004-07-22
Also published as: EP1337664A4; US20020086849A1; AU2002232387A1; CA2427068A1; WO2002034879A3; US20060147514A1; WO2002034879A2; NZ525440A; EP1337664A2

Abstract

本発明は、一つまたは複数の式Ｉのカチオン性脂質および任意で少なくとも一つの中性脂質を含む一つまたは複数の脂質製剤を用いて、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを一つまたは複数の真核細胞に導入する方法に関する。特に、本発明は、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）および少なくとも一つの中性脂質、特にジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む脂質製剤を用いて、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを一つまたは複数の真核細胞に導入する方法に関する。本発明は、本発明を実施するためのキット、本発明を実施するための組成物、および本発明を実施している間に生成される組成物にも関する。さらに、本発明は、細胞の成長または増殖を阻害または防止する方法、および一つまたは複数の蛋白質の発現を阻害または防止する方法にも関する。

Description

【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、一つまたは複数の式Ｉのカチオン性脂質および任意で少なくとも一つの中性脂質を含む一つまたは複数の脂質製剤を用いて、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを一つまたは複数の真核細胞に導入する方法に関する。特に、本発明は、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）および少なくとも一つの中性脂質、特にジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む脂質製剤を用いて、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを一つまたは複数の真核細胞に導入する方法に関する。本発明は、本発明を実施するためのキット、本発明を実施するための組成物、および本発明を実施している間に生成される組成物にも関する。さらに、本発明は、細胞の成長または増殖を阻害または防止する方法、および一つまたは複数の蛋白質の発現を阻害または防止する方法にも関する。
【０００２】
関連技術
アンチセンスオリゴヌクレオチドは当技術分野において、原核生物（ミズノ（Ｍｉｚｕｎｏ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：１９６６〜１９７０（１９８４））および真核生物（ヘイウッド（Ｈｅｙｗｏｏｄ）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１４：６７７１〜６７７２（１９８６））両方における遺伝子発現の天然の生体阻害物質であると記載されており、これらの配列はおそらく、相補的ｍＲＮＡ配列にハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションによる翻訳の停止を引き起こすことによって機能する（ペイターソン（Ｐａｔｅｒｓｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：４３７０〜４３７４（１９８７））
【０００３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定の遺伝子またはＲＮＡメッセージに相補的となるように調製された短い合成ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド分子である。これらのオリゴマーと標的ＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列への結合を通じて、遺伝子の転写または翻訳を選択的に阻止することができ、その遺伝子によって生じる疾患プロセスを停止させることができる（例えば、ジャック・コーエン（ＪａｃｋＣｏｈｅｎ）、「オリゴデオキシヌクレオチド、遺伝子発現のアンチセンス阻害物質（Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、ＣＲＣＰｒｅｓｓ（１９８９）参照）。ｍＲＮＡは細胞質内に位置することから、細胞に入るアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドに容易に接近可能と考えられる標的が提供される。したがって、この分野の研究の多くは、標的としてＲＮＡに焦点をあてている。現在、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの使用は、インビトロおよび組織培養中での遺伝子発現の調節を探究するための有用なツールを提供する（ローゼンバーグ（Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．８１：１５３９〜１５４４（１９８９））。
【０００４】
アンチセンス療法は、細胞内に位置する標的ポリヌクレオチドに結合する外因性オリゴヌクレオチドの投与である。例えば、抗癌療法のためにアンチセンスオリゴヌクレオチドを全身投与することができる（国際公開公報第９０／０９１８０号）。対応する蛋白質の発現を阻害するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドが患者に投与される。
【０００５】
米国特許第５，２７９，８３３号は、核酸を動物細胞に導入するための試薬を記載している。その試薬は、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などの中性脂質、および下記の式のアンモニウム塩などのカチオン性脂質を含む：
【化５】

式中、Ｒ_１は飽和または不飽和のＣ_１４からＣ_１８直鎖炭化水素鎖であり、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４は互いに独立に水素、飽和もしくは不飽和のＣ_１〜Ｃ_１８直鎖炭化水素鎖またはアリール、例えば、ベンジルもしくはフェニルであり、Ａはアニオンである。この特許は、好ましいアンモニウム塩として、臭化セチルジメチルエチルアンモニウムおよび臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）を記載している。
【０００６】
リウ（Ｌｉｕ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１１６９０〜１１６９３（１９９７）は、薬物耐性ヒト乳癌（ＭＣＦ−７’ＡＤＲ）細胞のアンチセンスオリゴヌクレオチド治療を記載しており、アンチセンス混合物は、ＭｃＣｏｙの５Ａ無血清培地０．２５ｍｌ中に２０ｍｇ／ｍｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（商標）を含む溶液Ａと、ＭｃＣｏｙの５Ａ無血清培地０．２５ｍｌ中に４００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む溶液Ｂとを合わせることによって調製された。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（商標）はＤＤＡＢおよびＤＯＰＥを１：２．５の比で含む。しかし、開示されたＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（商標）試薬の濃度（２０ｍｇ／ｍｌ）は、溶解性の問題により達成不可能である。さらに、リウらは、トランスフェクションを製造者の指示に従って実施したと述べている。これに反して、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（商標）はアンチセンスオリゴヌクレオチドトランスフェクションのための説明書を含んでいない。
【０００７】
米国特許第５，７５３，６１３号は、下記式Ｉのカチオン性化合物を含む、ポリアニオン性物質を細胞に導入するための組成物を記載している：
【化６】

式中、Ｒ^１およびＲ^２は独立にＣ_１ _〜 _３アルキルであり、かつＹおよびＺは独立に−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＨ_２−、−ＣＨ＝ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ−、および−ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨ−であるが、ただしＹおよびＺが両方とも−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−であることはなく；ｎおよびｑは独立に３から７の整数であり；かつｍおよびｐは独立に４から９の整数であるが、ただしｎ＋ｍおよびｑ＋ｐの合計はそれぞれ１０から１４の整数であり、かつＸはアニオンである。米国特許第５，７５３，６１３号は、これらの組成物を、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に導入するために用いうることを記載している。さらに、ＤＤＡＢのトランスフェクション効率が低いことも記載されている。
【０００８】
遺伝子発現を調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用には大きな可能性がある。しかし、アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性を制限することが多い因子には、非効率的な細胞取り込み、送達物質の毒性、および対照オリゴヌクレオチドに見られる非特異的効果が含まれる（ネッカーズ（Ｎｅｃｋｅｒｓ）Ｌ．Ｍ．、「アンチセンス研究と応用（ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」、ＣＲＣＰｒｅｓｓ（１９９３）４５１およびジャイルズ（Ｇｉｌｅｓ）Ｒ．Ｖ．、ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ２：２３８〜２５２（２０００））。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドを真核細胞に導入するための効率的かつ非毒性の方法が、当技術分野において必要とされている。
【０００９】
発明の概要
出願人らは、一つまたは複数の式Ｉのカチオン性脂質（下記）を含む脂質製剤が、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを真核細胞に導入するために理想的であることを見いだした。出願人らは、一つまたは複数の式Ｉのカチオン性脂質および任意で少なくとも一つの中性脂質を含む脂質製剤をアンチセンスオリゴヌクレオチドに接触させると、アンチセンスオリゴヌクレオチドを真核細胞に効率的に送達することを可能にする、アンチセンスオリゴヌクレオチドとの安定な複合体が形成されることを見いだした。さらに、前述の製剤を用いてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの真核細胞への導入は、アンチセンス技術の分野における重大な問題である細胞毒性を誘導することなく達成することができる。したがって、本発明は、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを一つまたは複数の真核細胞に導入する方法であって、
（ａ）該一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、有効量の一つまたは複数の式Ｉのカチオン性脂質
【化７】

（式中、
Ｒ_１は飽和または不飽和のＣ_１０ _〜 _１００の直鎖または分枝炭化水素鎖であり；
Ｒ_２は電子対、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、Ｒ_５−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ_６、Ｒ_５−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｒ_６、アルキルアミノアルキル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、およびアリールからなり、そのすべてが任意で置換されていてもよい群より選択され；
Ｒ_３およびＲ_４は互いに独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、Ｒ_５−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ_６、Ｒ_５−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｒ_６、アルキルアミノアルキル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、およびアリールからなり、そのすべてが任意で置換されていてもよい群より選択され；ただしＲ_５およびＲ_６は独立にアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり；かつ
Ａは、Ｒ_２が電子対ではない場合に、薬学的に許容されるアニオンである）
および任意で少なくとも一つの中性脂質を含む一つまたは複数の脂質製剤と接触させて、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質凝集体複合体を形成する段階と、
（ｂ）該一つまたは複数の細胞を該一つまたは複数の複合体と接触させる段階とを含む方法を提供する。
【００１０】
好ましい局面において、Ｒ_１は飽和または不飽和のＣ_１０ _〜 _３０の直鎖または分枝炭化水素鎖である。もう一つの好ましい局面において、式ＩのＲ_３およびＲ_４がＣ_１ _〜 _３アルキルであり、かつＲ_１またはＲ_２の一つが不飽和Ｃ_１６ _〜 _２０アルキルである場合、Ｒ_１またはＲ_２の他の一つは不飽和または飽和Ｃ_１６ _〜 _２０アルキルではない。
【００１１】
さらに好ましい局面において、一つまたは複数の真核細胞は薬物耐性ヒト乳癌細胞ではない。
【００１２】
また、本発明は、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを一つまたは複数の真核細胞に導入する方法であって、
（ａ）該一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、有効量の一つまたは複数の式ＩＩのカチオン性脂質
【化８】

（式中、
Ｒ_１は飽和または不飽和のＣ_１０ _〜 _１００の直鎖または分枝炭化水素鎖であり；
Ｒ_２は電子対、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、Ｒ_５−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ_６、Ｒ_５−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｒ_６、アルキルアミノアルキル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、およびアリールからなり、そのすべてが任意で置換されていてもよい群より選択され；ただしＲ_５およびＲ_６は独立にアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり；かつ
Ａは、Ｒ_２が電子対ではない場合に、薬学的に許容されるアニオンである）
および任意で少なくとも一つの中性脂質を含む一つまたは複数の脂質製剤と接触させて、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質凝集体複合体を形成する段階と、
（ｂ）該一つまたは複数の細胞を該一つまたは複数の複合体と接触させる段階とを含む方法を提供する。
【００１３】
好ましい局面において、Ｒ_１は飽和または不飽和のＣ_１０ _〜 _３０の直鎖または分枝炭化水素鎖である。もう一つの好ましい局面において、式ＩＩのＲ_１またはＲ_２の一つが不飽和Ｃ_１６ _〜 _２０アルキルである場合、他の一つは不飽和または飽和Ｃ_１６ _〜 _２０アルキルではない。
【００１４】
特に、本発明は、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを一つまたは複数の真核細胞に導入する方法であって、
（ａ）該一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、有効量の臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）および少なくとも一つの中性脂質を含む脂質製剤と接触させて、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質凝集体複合体を形成する段階と、
（ｂ）該一つまたは複数の細胞を該一つまたは複数の複合体と接触させる段階とを含む方法を提供する。
【００１５】
本発明は、好ましくは一つまたは複数のオリゴヌクレオチドを一つまたは複数の真核細胞に導入するために用いられるキットにも関し、そのようなキットは好ましくは一つまたは複数の細胞、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド、一つまたは複数の本発明の脂質製剤、一つまたは複数の緩衝塩、一つまたは複数の培地、および一つまたは複数のトランスフェクション賦活剤からなる群より選択される少なくとも一つの成分を含む。
【００１６】
本発明は、本発明の方法を実施するための組成物、および本発明を実施している間に生成される組成物にも関する。そのような組成物は、一つまたは複数の細胞、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド、一つまたは複数の本発明の脂質製剤、一つまたは複数の緩衝塩、一つまたは複数の培地、および一つまたは複数のトランスフェクション賦活剤からなる群より選択される少なくとも一つの成分を含んでいてもよい。
【００１７】
さらに、本発明は、細胞の成長または増殖を阻害または防止する方法であって、
（ａ）一つまたは複数の真核細胞を、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドならびに有効量の一つまたは複数の式Ｉのカチオン性脂質および任意で少なくとも一つの中性脂質を含む有効量の一つまたは複数の脂質製剤と接触させて、組成物を提供する段階と、
（ｂ）該組成物を細胞の成長または増殖を阻害または防止するのに十分な条件下でインキュベートする段階とを含む方法を提供する。
【００１８】
さらに、本発明は、一つまたは複数の蛋白質の発現を阻害または防止する方法であって、
（ａ）一つまたは複数の真核細胞を、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドならびに有効量の一つまたは複数の式Ｉのカチオン性脂質および任意で少なくとも一つの中性脂質を含む有効量の一つまたは複数の脂質製剤と接触させて、組成物を提供する段階と、
（ｂ）該組成物を該一つまたは複数の蛋白質の発現を阻害または防止するのに十分な条件下でインキュベートする段階とを含む方法を提供する。
【００１９】
本発明の他の態様および利点は、一部は下記の説明中に示され、一部は説明から明らかとなるか、または本発明の実施によって明らかになると思われる。本発明の態様および利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される成分および組み合わせによって実現および達成されると思われる。
【００２０】
前述の一般的説明および下記の詳細な説明はいずれも、主張されるように、例示および説明のためのものにすぎず、本発明を制限するものではないことが理解されるべきである。
【００２１】
好ましい態様の詳細な説明
出願人らは驚いたことに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを真核細胞に導入するための、効率的かつ非毒性の方法を見いだした。したがって、本発明は、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを一つまたは複数の真核細胞に導入する方法であって、
（ａ）該一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、一つまたは複数の式Ｉのカチオン性脂質
【化９】

（式中、
Ｒ_１は飽和または不飽和のＣ_１０ _〜 _１００の直鎖または分枝炭化水素鎖であり；
Ｒ_２は電子対、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、アリールアルキル、Ｒ_５−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ_６、Ｒ_５−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｒ_６、アルキルアミノアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、およびアリールからなり、そのすべてが任意で置換されていてもよい群より選択され；
Ｒ_３およびＲ_４は互いに独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、Ｒ_５−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ_６、Ｒ_５−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｒ_６、アルキルアミノアルキル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、およびアリールからなり、そのすべてが任意で置換されていてもよい群より選択され、ただしＲ_５およびＲ_６は独立にアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり；かつ
Ａは、Ｒ_２が電子対ではない場合に、薬学的に許容されるアニオンである）
および任意で少なくとも一つの中性脂質を含む一つまたは複数の脂質製剤と接触させて、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質凝集体複合体を形成する段階と、
（ｂ）該一つまたは複数の細胞を該一つまたは複数の複合体と接触させる段階とを含む方法に関する。
【００２２】
好ましくは、式ＩのＲ_３およびＲ_４がＣ_１ _〜 _３アルキルであり、かつＲ_１またはＲ_２の一つが不飽和Ｃ_１６ _〜 _２０アルキルである場合、Ｒ_１またはＲ_２の他の一つは不飽和または飽和Ｃ_１６ _〜 _２０アルキルではない。好ましくは、一つまたは複数の細胞は薬物耐性ヒト乳癌細胞ではない。好ましくは１〜５個のアンチセンスオリゴヌクレオチド、より好ましくは１〜３個のアンチセンスオリゴヌクレオチド、特に一つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを一つまたは複数の脂質製剤と接触させる。
【００２３】
好ましくは、Ｒ_１は飽和または不飽和のＣ_１０ _〜 _３０の直鎖または分枝炭化水素鎖である。好ましくは、Ｒ_１は飽和または不飽和のＣ_１２ _〜 _２４の直鎖炭化水素鎖であり；かつＲ_２、Ｒ_３およびＲ_４は独立に水素、Ｃ_１ _〜 _２０アルキル、Ｃ_２ _〜 _２０アルケニル、Ｃ_２ _〜 _２０アルキニル、Ｃ_４ _〜 _２０ヘテロアルキル、Ｃ_４ _〜 _２０ヘテロアルケニル、Ｃ_４ _〜 _２０ヘテロアルキニル、Ｃ_６ _〜 _１２アリール（Ｃ_１ _〜 _２０）アルキルおよびＣ_６ _〜 _１２アリールからなり、そのすべてが任意で置換されていてもよい群より選択される。より好ましくは、Ｒ_１は飽和または不飽和のＣ_１４ _〜 _２０の直鎖炭化水素鎖であり；Ｒ_２は水素、Ｃ_６ _〜 _１８アルキル、Ｃ_６ _〜 _１８アルケニル、Ｃ_６ _〜 _１８アルキニル、Ｃ_６ _〜 _１８ヘテロアルキル、Ｃ_６ _〜 _１８ヘテロアルケニル、Ｃ_６ _〜 _１８ヘテロアルキニル、フェニル（Ｃ_６ _〜 _１８）アルキルおよびフェニルからなる群より選択され；かつＲ_３およびＲ_４は独立に水素、Ｃ_１ _〜 _５アルキル、Ｃ_２ _〜 _６アルケニル、Ｃ_２ _〜 _６アルキニル、Ｃ_２ _〜 _５ヘテロアルキル、Ｃ_２ _〜 _５ヘテロアルケニル、Ｃ_２ _〜 _５ヘテロアルキニル、フェニル（Ｃ_１ _〜 _５）アルキル、特にベンジル、およびフェニルからなり、そのすべてが任意で置換されていてもよい群より選択される。
【００２４】
式Ｉのカチオン性脂質の有用な群には、Ｒ_１およびＲ_２がいずれもＣ_１０ _〜 _２０飽和アルキル基である脂質が含まれる。
【００２５】
式Ｉに含まれる本発明において有用なカチオン性脂質は下記式ＩＩのカチオン性脂質である：
【化１０】

式中、
Ｒ_１は飽和または不飽和のＣ_１０ _〜 _１００の直鎖または分枝炭化水素鎖であり；
Ｒ_２は電子対、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、Ｒ_５−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ_６、Ｒ_５−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｒ_６、アルキルアミノアルキル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、およびアリールからなり、そのすべてが任意で置換されていてもよい群より選択され、ただしＲ_５およびＲ_６は独立にアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり；かつ
Ａは、Ｒ_２が電子対ではない場合に、薬学的に許容されるアニオンである。
【００２６】
好ましくは、式ＩＩのＲ_１またはＲ_２の一つが不飽和Ｃ_１６ _〜 _２０アルキルである場合、他の一つは不飽和または飽和Ｃ_１６ _〜 _２０アルキルではない。
【００２７】
好ましくは、式ＩＩのＲ_１は飽和または不飽和のＣ_１０ _〜 _３０の直鎖または分枝炭化水素鎖である。好ましくは、式ＩＩのＲ_１は飽和または不飽和のＣ_１２ _〜 _２４の直鎖炭化水素鎖であり；かつＲ_２は水素、Ｃ_１ _〜 _２０アルキル、Ｃ_２ _〜 _２０アルケニル、Ｃ_２ _〜 _２０アルキニル、Ｃ_４ _〜 _２０ヘテロアルキル、Ｃ_４ _〜 _２０ヘテロアルケニル、Ｃ_４ _〜 _２０ヘテロアルキニル、Ｃ_６ _〜 _１２アリール（Ｃ_１ _〜 _２０）アルキルおよびＣ_６ _〜 _１２アリールからなり、そのすべてが任意で置換されていてもよい群より選択される。より好ましくは、Ｒ_１は飽和のＣ_１４ _〜 _２０の直鎖炭化水素鎖であり、かつＲ_２はＣ_６ _〜 _１８アルキル、Ｃ_６ _〜 _１８ヘテロアルキル、Ｃ_６ _〜 _１８ヘテロアルケニル、Ｃ_６ _〜 _１８ヘテロアルキニル、およびフェニル（Ｃ_６ _〜 _１８）アルキルからなり、そのすべてが任意で置換されていてもよい群より選択される。
【００２８】
Ａは任意の薬学的に許容されるアニオンである。これらのアニオンは有機でも無機でもよい。Ａは好ましくはハロゲン、すなわちＢｒ⁻、Ｃｌ⁻、Ｆ⁻、Ｉ⁻であるか、またはＡは硫酸塩、亜硝酸塩または亜硝酸塩である。
【００２９】
好ましくは、式Ｉのカチオン性脂質は臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）である。
【００３０】
好ましくは、脂質製剤は少なくとも一つの中性脂質を含む。本発明の製剤において用いることができる中性脂質の例は、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ホスファチジン酸、およびコレステロールである。好ましくは、本発明の製剤は、ジオレイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、パルミトイルオレイルホスファチジルコリン、レシチンおよびリゾレシチンなどのジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ならびにコレステロールからなる群より選択される、少なくとも一つの中性脂質を含む。より好ましくは、中性脂質はアシル基に１０〜２４個の炭素原子を有するジアシルホスファチジルエタノールアミンである。より好ましくは、アシル基はラウロイル、ミリストイル、ヘプタデカノイル、パルミトイル、ステアロイルまたはオレイルである。特に、中性脂質はジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレイルホスファチジルエタノールアミン、ジヘプタデカノイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ベータ−リノレイル−ガンマ−パルミトイルホスファチジルエタノールアミン、およびベータ−オレイル−ガンマ−パルミトイルホスファチジルエタノールアミン、特にジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。
【００３１】
式ＩまたはＩＩのカチオン性脂質の中性脂質に対する比は、用いる特定のカチオン性脂質に応じて広範に変動しうる。例えば、比は約１：１０から約１：１、好ましくは約１：５から約１：２．５でありうる。
【００３２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの式ＩまたはＩＩのカチオン性脂質に対する比は、脂質凝集体上の正電荷を飽和するほど高くてはならず、正電荷が飽和していると脂質凝集体の細胞表面への結合が欠如することになりうる。
【００３３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが脂質製剤に接触する際に、一つまたは複数の式Ｉのカチオン性脂質および任意で少なくとも一つの中性脂質を含む脂質製剤は約０．１μｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの量で存在していてもよい。好ましくは、脂質製剤は０．１５μｇ／ｍｌ〜４．５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１５μｇ／ｍｌ〜４．２ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１５μｇ／ｍｌ〜４．０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２μｇ／ｍｌ〜３．７ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２μｇ／ｍｌ〜３．５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２μｇ／ｍｌ〜３．２ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２５μｇ／ｍｌ〜３．０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２５μｇ／ｍｌ〜２．８ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２５μｇ／ｍｌ〜２．５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２５μｇ／ｍｌ〜２．３ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．３μｇ／ｍｌ〜２．０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．３μｇ／ｍｌ〜１．８ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．３μｇ／ｍｌ〜１．６ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．３μｇ／ｍｌ〜１．４ｍｇ／ｍｌ、０．３μｇ／ｍｌ〜１．１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．３５μｇ／ｍｌ〜０．８ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．３５μｇ／ｍｌ〜０．５ｍｇ／ｍｌ、０．３５μｇ／ｍｌ〜０．３ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．３５μｇ／ｍｌ〜０．１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．３５〜９０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．３５〜７５μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．３５〜６０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．３５〜４５μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．３５〜３０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．３５〜２０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．３５〜１４μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．７〜１４μｇ／ｍｌ、より好ましくは約１〜１４μｇ／ｍｌ、より好ましくは約２〜１３μｇ／ｍｌ、より好ましくは約３〜１３μｇ／ｍｌ、より好ましくは約４〜１２μｇ／ｍｌ、特に約４．５〜１２μｇ／ｍｌの量で存在する。
【００３４】
好ましい態様において、本発明は、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを一つまたは複数の真核細胞に導入する方法であって、
（ａ）該一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、有効量の臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）および少なくとも一つの中性脂質を含む脂質製剤と接触させて、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質凝集体複合体を形成する段階と、
（ｂ）該一つまたは複数の細胞を該一つまたは複数の複合体と接触させる段階とを含む方法に関する。
【００３５】
好ましくは、中性脂質はアシル基に１０〜２４個の炭素原子を有するジアシルホスファチジルエタノールアミンであり、より好ましくは、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。好ましくは、本発明の方法におけるＤＤＡＢ：ＤＯＰＥの比は約１：５から約１：１、より好ましくは約１：２．５である。好ましくは、ＤＤＡＢおよびＤＯＰＥを１：２．５の比で含む脂質製剤の最終濃度は、５．６〜１１．２μｇ／ｍｌである。
【００３６】
本発明は、好ましくは一つまたは複数のオリゴヌクレオチドを一つまたは複数の真核細胞に導入するために用いられるキットにも関する。そのようなキットは好ましくは一つまたは複数の細胞、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド、一つまたは複数の本発明の脂質製剤、一つまたは複数の緩衝塩、一つまたは複数の培地、および一つまたは複数のトランスフェクション賦活剤からなる群より選択される少なくとも一つの成分を含む。より好ましくは、そのようなキットは、有効量の一つまたは複数の式Ｉのカチオン性脂質および任意で少なくとも一つの中性脂質を含む一つまたは複数の脂質製剤と、一つまたは複数の細胞、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド、一つまたは複数の緩衝塩、一つまたは複数の培地、および一つまたは複数のトランスフェクション賦活剤からなる群より選択される少なくとも一つの追加の成分とを含む。そのようなキットは、一つまたは複数の細胞標的化賦活剤、取り込み賦活剤、内部移行賦活剤、核標的化賦活剤および発現賦活剤をさらに含むこともできる。
【００３７】
本発明は、本発明の方法を実施するための組成物、および本発明を実施している間に生成される組成物にも関する。そのような組成物は、一つまたは複数の細胞、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド、一つまたは複数の本発明の脂質製剤、一つまたは複数の緩衝塩、一つまたは複数の培地、および一つまたは複数のトランスフェクション賦活剤からなる群より選択される少なくとも一つの成分を含んでいてもよい。好ましくは、そのような組成物は、有効量の一つまたは複数の式Ｉのカチオン性脂質および任意で少なくとも一つの中性脂質を含む一つまたは複数の脂質製剤と、一つまたは複数の細胞、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド、一つまたは複数の緩衝塩、一つまたは複数の培地、および一つまたは複数のトランスフェクション賦活剤からなる群より選択される一つまたは複数の追加の成分とを含む。そのような組成物は、一つまたは複数の細胞標的化賦活剤、取り込み賦活剤、内部移行賦活剤、核標的化賦活剤および発現賦活剤をさらに含むこともできる。
【００３８】
さらに、本発明は、細胞の成長または増殖を阻害または防止する方法であって、
（ａ）一つまたは複数の真核細胞を、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドならびに有効量の一つまたは複数の式Ｉのカチオン性脂質および任意で少なくとも一つの中性脂質を含む有効量の一つまたは複数の脂質製剤と接触させて、組成物を提供する段階と、
（ｂ）該組成物を細胞の成長または増殖を阻害または防止するのに十分な条件下でインキュベートする段階とを含む方法に関する。
【００３９】
さらに、本発明は、一つまたは複数の蛋白質の発現を阻害または防止する方法であって、
（ａ）一つまたは複数の真核細胞を、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドならびに有効量の一つまたは複数の式Ｉのカチオン性脂質および任意で少なくとも一つの中性脂質を含む有効量の一つまたは複数の脂質製剤と接触させて、組成物を提供する段階と、
（ｂ）該組成物を該一つまたは複数の蛋白質の発現を阻害または防止するのに十分な条件下でインキュベートする段階とを含む方法に関する。
【００４０】
ＤＤＡＢなどのいくつかの式Ｉの化合物は市販されている。式Ｉの化合物は、当業者には公知の方法により、標準的合成反応を用いて調製することができる（マーチ（Ｍａｒｃｈ）、「上級有機化学（ＡｄｖａｎｃｅｄＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、第４版、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク州ニューヨーク（１９９２）参照）。例えば、Ｒ_１〜Ｒ_４が同じまたは異なる式Ｉの化合物は、Ｃ_１０ _〜 _１００アミン、好ましくはＣ_１０ _〜 _３０アミンを、アミンの還元的アルキル化を引き起こす条件下、ホルムアルデヒドおよびシアノボロ水素化ナトリウムで処理して三級アミンとし、これをさらに、例えば任意で置換された臭化アルキルと反応させて四級アンモニウム塩とすることにより調製可能である。さらに、式Ｉの化合物は、脂肪酸を、例えば塩化オキサリル、塩化チオニル、ｐ−ＴｓＣｌ、ＰＣｌ_３またはＰＣｌ_５により対応する酸塩化物に変換し、酸塩化物を任意で置換されたアミンと反応させて対応するアミドとすることにより調製可能である。アミドの、例えば水素化アルミニウムリチウムによる還元により、二級アミンが得られる。二級アミンをさらに、任意で置換されたハロゲン化アルキルで処理して、四級アンモニウム塩とする。次いで、アニオン交換を実施して、所望の薬学的に許容されるアニオンを有するカチオン性脂質を得ることができる。
【００４１】
特定の式Ｉのカチオン性脂質は、本発明の方法に用いるためには、生理的溶媒への溶解性が不十分な場合がある。当業者であれば、そのような化合物の水性溶媒中への溶解性を高めるために、エタノールを共溶媒として用いるなどの、当技術分野で利用可能な様々な技術があることを理解すると思われる。そのような方法は、過度の実験を行わずとも、本明細書に記載の化合物に容易に適用することができる。
【００４２】
本発明の方法において、一つまたは複数の式Ｉのカチオン性脂質を、任意で少なくとも一つの中性脂質と組み合わせて用いて、アンチセンスオリゴヌクレオチドを標的細胞にインビトロまたはインビボのいずれかで導入するのに適したリポソーム、ミセルおよび他の脂質凝集体を調製する。そのような脂質凝集体はポリカチオン性であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドと安定な複合体を形成することができる。脂質凝集体オリゴヌクレオチド複合体は細胞と相互作用し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞による吸収および取り込みを可能にする。
【００４３】
一つまたは複数の式Ｉのカチオン性脂質および任意で少なくとも一つの中性脂質を含むリポソームおよびミセルは、当技術分野において公知の方法によって調製することができる。中性脂質の選択は一般に、例えばリポソームのサイズおよび血流中のリポソームの安定性を考慮して行う。リポソームは一般に、脂質を水性溶媒中で超音波処理することにより、乾燥脂質層の緩衝液への再懸濁により、または有機溶媒に溶解した脂質の最適な緩衝液に対する透析により形成することができる。リポソーム調製のもう一つの方法は、マイクロフラダイゼーション（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を用いることである。この方法では、一つまたは複数の式Ｉのカチオン性脂質および任意で少なくとも一つの中性脂質を、クロロホルムなどの有機溶媒中で混合する。有機溶媒を蒸発により除去して、脂質フィルムとする。脂質フィルムを水で水和し、マイクロフラダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を通過させる。適当な比率を選択することにより、様々なサイズのリポソームを調製することができる。例えば、リポソームは、ソカ（Ｓｚｏｋａ）ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、および第４，８３７，０２８号、教科書の「リポソーム（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）」、マルクＪ．オストロ（ＭａｒｃＪ．Ｏｓｔｒｏ）編、ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９８３、第１章、ならびにホープ（Ｈｏｐｅ）ら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐ．４０：８９（１９８６）に記載のとおりに調製することができる。
【００４４】
リポソーム調製の後、所望の範囲で、比較的狭い分布のリポソームサイズを得るために、リポソームのサイズを揃えることもできる。リポソームを所望のサイズに揃えるために、いくつかの技術が利用可能である。サイズを揃える一つの方法が、例えば、米国特許第４，７３７，３２３号に記載されている。リポソームは典型的には、直径２５０オングストローム単位から数マイクロメートルの範囲であり（赤血球の直径はおよそ１０マイクロメートルである）、通常は溶液中に懸濁される。リポソームは二つの標準形を有している：すなわち、液体によって分離されたいくつかの脂質二重層で形成された「タマネギ様」多重層小胞（ＭＬＶ）、および完全に液体の核を取り囲む単一の二重層を有する単層小胞である。単層小胞は典型的には小さい（ＳＵＶ）か、または大きい（ＬＵＶ）かで特徴付けられる。
【００４５】
適当な環境では、リポソームはほとんどいかなる細胞種にも吸着することができる。いったん吸着されれば、リポソームはいくつかの細胞によってエンドサイトーシスにより取り込まれるか、または飲み込まれうる。吸着されたリポソームはまた、脂質を細胞膜と交換することもでき、時には細胞と融合しうることもある。融合が起これば、リポソーム膜は細胞膜に統合され、リポソームの水性内容物は細胞内液に溶け込む。
【００４６】
リポソームのエンドサイトーシスは限定された細胞群、すなわち食細胞または異物粒子を摂取することができる細胞で起こる。食細胞がリポソームを取り込むと、細胞は球体をリソソームとして知られる細胞下小器官に移動させ、そこでリポソーム膜は分解されると考えられる。リソソームから、リポソーム脂質成分は外向きに移動して細胞膜の一部となり、リソソームでの分解に抵抗性の他のリポソーム成分（特定の医薬品など）は細胞質に入ると考えられる。
【００４７】
脂質交換は個々の脂質分子のリポソームから原形質膜中への移動を含む（逆もまた同じ）。脂質交換では、リポソームの水性内容物は細胞に入らない。脂質交換が起こるためには、リポソームの脂質は標的細胞に関して特定の化学的性質を有していなければならない。リポソームの脂質が細胞膜に連結した後は、脂質は膜中に長期間とどまることもでき、または様々な細胞内の膜に再分布することもできる。
【００４８】
非常に薄い溶液中では、リポソームの代わりに脂質ミセルが生成する。
【００４９】
本発明の方法において、式Ｉのカチオン性脂質は、細胞標的化、取り込み、内部移行、核標的化および発現を増強するために、さらに蛋白質、ペプチド、成長因子などの様々な有用な分子および物質に結合する、それらと混合する、またはそれらと共に用いることができる。例えば、米国特許第５，５２１，２９１号、第５，５４７，９３２号、および第５，６９３，５０９号を参照のこと。
【００５０】
本発明の方法は、動物細胞、ヒト細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞、哺乳類細胞などを含む真核細胞または組織のインビトロおよびインビボトランスフェクションに適用することができる。本発明の方法は、オリゴヌクレオチドの細胞または組織への導入を必要とする、いかなる治療法においても有用である。本発明の方法において、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドをまず、有効量の一つまたは複数の式Ｉのカチオン性脂質および任意で少なくとも一つの中性脂質を含む一つまたは複数の脂質製剤と接触させて、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質凝集体複合体を形成する。例えば、接触は凝集体形成（カチオン性および中性脂質から）前または最初の脂質凝集体形成後に行うことができる。好ましい態様において、カチオン性脂質および任意の中性脂質の脂質凝集体をまず形成し、次いで一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは典型的には、負に荷電したアンチセンスオリゴヌクレオチドと正に荷電した脂質凝集体表面との間のイオン引力の結果、脂質凝集体表面に結合すると考えられる。典型的には、複合体を形成することになるアンチセンスオリゴヌクレオチドと脂質凝集体との間の接触は、約１５℃から約４５℃の温度、好ましくは室温で実施する。複合体形成を完了するのに要する時間は、温度ならびにアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび脂質凝集体自体の性質に応じて異なると考えられる。ほぼ室温の接触温度を用いた場合、複合体を形成する時間は約１５分から約１時間である。または、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、本発明のカチオン性脂質および任意の中性脂質から調製されたリポソームの内部に、当業者には公知の方法によって組み込むこともできる。一つの方法はカプセル封入を含み、様々な技術によって実施することができる。
【００５１】
アンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質凝集体複合体の形成後、複合体をトランスフェクトする細胞に接触させる。いったん吸着されれば、複合体を含む脂質凝集体は、前述のとおり細胞の一部によってエンドサイトーシスされるか、細胞膜と脂質を交換するか、または細胞と融合することができる。複合体のオリゴヌクレオチド部分の移動または組込みは、前述の経路の一つを介して起こりうる。特に、リポソームの融合が起こる場合、リポソームの膜およびアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質凝集体複合体は細胞内液と一緒になる。細胞とアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質凝集体複合体との間の接触は、インビトロで実施する場合には、生物学的に適合性の培地中で行うことになる。脂質の濃度は大きく変動しうる。細胞のアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質凝集体複合体での処理は一般に、生理的温度（約３７℃）で１時間から約６時間、好ましくは２時間から４時間実施することになる。インビトロでの適用のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、培養で増殖されたいかなる真核細胞に対しても送達することができる。細胞は好ましくは哺乳類細胞、より好ましくはヒト細胞である。
【００５２】
定義
有用なアルキル基には、直鎖および分枝Ｃ_１ _〜 _１８アルキル基、好ましくはＣ_１ _〜 _１０アルキル基、より好ましくはＣ_１ _〜 _５アルキル基が含まれる。典型的なＣ_１ _〜 _１８アルキル基には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、３−ペンチル、ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシルおよびオクタデシル基が含まれる。
【００５３】
有用なアルケニル基は、Ｃ_２ _〜 _１８アルケニル基、好ましくはＣ_２ _〜 _１０アルケニル基、より好ましくはＣ_２ _〜 _６アルケニル基である。典型的なＣ_２ _〜 _１８アルケニル基には、エテニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、ｓｅｃ−ブテニル、ヘキセニル、オクテニル、デセニル、ドデセニル、テトラデセニル、特に９−テトラデセニル、ヘキサデセニル、特に９−ヘキサデセニル、およびオクタデセニル、特に９−オクタデセニル基が含まれる。
【００５４】
有用なアルキニル基は、Ｃ_２ _〜 _１８アルキニル基、好ましくはＣ_２ _〜 _１０アルキニル基、より好ましくはＣ_２ _〜 _６アルキニル基である。典型的なＣ_２ _〜 _１８アルキニル基には、エチニル、プロピニル、ブチニル、２−ブチニル、ヘキシニル、オクチニル、デシニル、ドデシニル、テトラデシニル、ヘキサデシニル、およびオクタデシニル基が含まれる。
【００５５】
典型的なヘテロアルキル基には、一つまたは複数のＣＨ_２基がＯまたはＳで置き換わっている前述のＣ_１ _〜 _１８アルキル基のいずれかが含まれる。
【００５６】
典型的なヘテロアルケニル基には、一つまたは複数のＣＨ_２基がＯまたはＳで置き換わっている前述のＣ_２ _〜 _１８アルケニル基のいずれかが含まれる。
【００５７】
典型的なヘテロアルキニル基には、一つまたは複数のＣＨ_２基がＯまたはＳで置き換わっている前述のＣ_２ _〜 _１８アルキニル基のいずれかが含まれる。
【００５８】
典型的なアルキルアミノアルキル基は、Ｒ_７−ＮＨ−Ｒ_８（Ｒ_７およびＲ_８は前述のアルキレン基である）である。
【００５９】
有用なアリール基は、Ｃ_６ _〜 _１４アリール、特にＣ_６ _〜 _１０アリールである。典型的なＣ_６ _〜 _１４アリール基には、フェニル、ナフチル、フェナントリル、アントラニル、インデニル、アズレニル、ビフェニル、ビフェニレニルおよびフルオレニル基が含まれる。
【００６０】
有用なアリールアルキル基には、前述のＣ_６ _〜 _１４アリール基のいずれかで置換された前述のＣ_１ _〜 _１８アルキル基のいずれかが含まれる。有用な値にはベンジル、フェネチルおよびナフチルメチルが含まれる。
【００６１】
有用なアリールアルケニル基には、前述のＣ_６ _〜 _１４アリール基のいずれかで置換された前述のＣ_２ _〜 _１８アルケニル基のいずれかが含まれる。
【００６２】
有用なアリールアルキニル基には、前述のＣ_６ _〜 _１４アリール基のいずれかで置換された前述のＣ_２ _〜 _１８アルキニル基のいずれかが含まれる。有用な値にはフェニルエチニルおよびフェニルプロピニルが含まれる。
【００６３】
有用なハロまたはハロゲン基には、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素が含まれる。
【００６４】
有用なハロアルキル基には、一つまたは複数のフッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子で置換されたＣ_１ _〜 _１０アルキル基、例えばフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、ペンタフルオロメチル、１，１−ジフルオロエチルおよびトリクロロメチル基が含まれる。
【００６５】
有用なヒドロキシアルキル基には、ヒドロキシで置換されたＣ_１ _〜 _１０アルキル基、例えばヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピルおよびヒドロキシブチル基が含まれる。
【００６６】
有用なアルコキシ基には、前述のＣ_１ _〜 _１０アルキル基の一つで置換された酸素が含まれる。
【００６７】
有用なアルキルチオ基には、前述のＣ_１ _〜 _１０アルキル基の一つで置換された硫黄が含まれる。
【００６８】
有用なアシルアミノ基は、アミノ窒素に結合された任意のアシル基、特にＣ_２ _〜 _６アルカノイルまたはＣ_６ _〜 _１０アリール（Ｃ_２ _〜 _６）アルカノイル、例えばアセトアミド、プロピオンアミド、ブタノイルアミド、ペンタノイルアミド、ヘキサノイルアミド、およびベンゾイルである。
【００６９】
有用なアシルオキシ基は、オキシ（−Ｏ−）基に結合された任意のＣ_１ _〜 _６アシル（アルカノイル）基、例えばアセトキシ、プロピオノイルオキシ、ブタノイルオキシ、ペンタノイルオキシ、ヘキサノイルオキシなどである。
【００７０】
有用なアルキルアミノおよびジアルキルアミノ基は−ＮＨＲ_９および−ＮＲ_９Ｒ_１０（Ｒ_９およびＲ_１０はＣ_１ _〜 _１０アルキル基である）である。
【００７１】
アミノカルボニル基は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２である。
【００７２】
有用なアルキルチオール基には、−ＳＨ基で置換された前述のＣ_１ _〜 _１０アルキル基のいずれかが含まれる。
【００７３】
カルボキシ基は−ＣＯＯＨである。
【００７４】
ウレイド基は−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ_２である。
【００７５】
アミノ基は−ＮＨ_２である。
【００７６】
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３よびＲ_４上の任意の置換基には、前述のハロゲン、ハロ（Ｃ_１ _〜 _６）アルキル、Ｃ_１ _〜 _６アルキル、Ｃ_２ _〜 _６アルケニル、Ｃ_２ _〜 _６アルキニル、ヒドロキシ（Ｃ_１ _〜 _６）アルキル、アミノ（Ｃ_１ _〜 _６）アルキル、カルボキシ（Ｃ_１ _〜 _６）アルキル、アルコキシ（Ｃ_１ _〜 _６）アルキル、ニトロ、アミノ、ウレイド、アシルアミノ、ヒドロキシ、チオール、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシ、アミノカルボニル、およびＣ_１ _〜 _６アルキルチオール基のいずれかが含まれる。好ましい任意の置換基には：ヒドロキシ（Ｃ_１ _〜 _６）アルキル、アミノ（Ｃ_１ _〜 _６）アルキル、ヒドロキシ、カルボキシ、ニトロ、Ｃ_１ _〜 _６アルキル、アルコキシ、チオールおよびアミノが含まれる。
【００７７】
薬学的に許容されるアニオン：薬学的調製物において非毒性の塩を提供する、無機または有機酸のアニオン。
【００７８】
アンチセンスオリゴヌクレオチド：アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のｍＲＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を含むＤＮＡもしくはＲＮＡ分子またはＤＮＡもしくはＲＮＡ分子の誘導体である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは特定のｍＲＮＡの相補的配列に結合し、ｍＲＮＡの翻訳を阻害または防止する。そのようなＤＮＡおよびＲＮＡ分子の誘導体が多数知られている。例えば、米国特許第６，０３１，０８６号、第５，９２９，２２６号、第５，８８６，１６５号、第５，６９３，７７３号、第６，０５４，４３９号、第５，９１９，７７２号、第５，９８５，５５８号、第５，５９５，０９６号、第５，９１６，８０７号、第５，８８５，９７０号、第５，８７７，３０９号、第５，６８１，９４４号、第５，６０２，２４０号、第５，５９６，０９１号、第５，５０６，２１２号、第５，５２１，３０２号、第５，５４１，３０７号、第５，５１０，４７６号、第５，５１４，７８７号、第５，５４３，５０７号、第５，５１２，４３８号、第５，５１０，２３９号、第５，５１４，５７７号、第５，５１９，１３４号、第５，５５４，７４６号、第５，２７６，０１９号、第５，２８６，７１７号、第５，２６４，４２３号、ならびに国際公開公報第９６／３５７０６号、国際公開公報第９６／３２４７４号、国際公開公報第９６／２９３３７号（チオノトリエステル修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドホスホロチオエート）、国際公開公報第９４／１７０９３号（オリゴヌクレオチドアルキルホスホネートおよびアルキルホスホチオエート）、国際公開公報第９４／０８００４号（オリゴヌクレオチドホスホチオエート、メチルホスフェート、ホスホラミデート、ジチオエート、架橋ホスホロチオエート、架橋ホスホラミデート、スルホン、スルフェート、ケト、ホスフェートエステルおよびホスホロブチルアミン（ファンデルクロール（ｖａｎｄｅｒＫｒｏｌ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．６：９５８〜９７６（１９８８）；ウールマン（Ｕｈｌｍａｎｎ）ら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４２〜５８５（１９９０））、国際公開公報第９４／０２４９９号（オリゴヌクレオチドアルキルホスホノチオエートおよびアリールホスホノチオエート）、および国際公開公報第９２／２０６９７号（３’末端キャップ構造を有するオリゴヌクレオチド）参照。さらに、有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドには、Ｓ−オリゴヌクレオチド（ホスホロチオエート誘導体またはＳ−オリゴ（ジャック・コーエン、「オリゴデオキシヌクレオチド、遺伝子発現のアンチセンス阻害剤（Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」ＣＲＣＰｒｅｓｓ（１９８９）参照）などの誘導体が含まれ、これらは例えばアイヤー（Ｉｙｅｒ）ら（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：４６９３〜４６９８（１９９０）およびＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：１２５３〜１２５４（１９９０））によって記載されたとおりに調製することができる。
【００７９】
相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）：「相補的ＤＮＡ」または「ｃＤＮＡ」遺伝子には、ｍＲＮＡの逆転写によって合成され、介在配列（イントロン）が除去された組換え遺伝子が含まれる。
【００８０】
真核細胞：真核細胞は、任意の種および任意の起源由来であってもよい。真核細胞の種類には、一次細胞、腫瘍細胞または不死化細胞株由来の上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、造血細胞などが含まれる。そのような細胞の起源には、ヒト、イヌ、マウス、ハムスター、ネコ、ウシ、ブタ、サル、類人猿、ヒツジ、魚類、昆虫、真菌などの任意の動物、ならびに作物、観賞植物および樹木を含む任意の植物が含まれる。
【００８１】
送達とは、所望の化合物が最終的に標的細胞内、または標的細胞膜内もしくは膜上に位置するように、所望の化合物が標的細胞に輸送される方法を意味する。本発明の化合物の多くの使用において、所望の化合物は標的細胞によって容易には取り込まれず、脂質凝集体を介しての送達が所望の化合物を細胞内に運ぶ手段である。特定の使用において、特にインビボ条件下で、特定の種類の標的細胞への送達が好ましく、本発明の化合物によって促進することができる。
【００８２】
脂質凝集体とは、中性脂質と混合されたカチオン性脂質の、単層および多重層両方のすべての種類のリポソーム、ならびにミセルおよびより無定型の凝集体を含む包括的用語である。
【００８３】
標的細胞とは、脂質凝集体を所望の化合物の担体として用い、所望の化合物を送達する任意の細胞を意味する。
【００８４】
導入とは、例えばトランスフェクション、形質転換、および送達を含むことが意図される。
【００８５】
トランスフェクション：トランスフェクションは、本明細書においてアンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞中で発現されるか、または細胞中で生物機能を有するような、アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的細胞への送達を意味するために用いられる。「発現」という用語は、一過的発現および安定発現の両方を含むが、これらに限定されることはない、細胞内での核酸の機能的存在のいかなる出現も意味する。機能的局面は、オリゴヌクレオチドまたは蛋白質送達による発現の阻害を含む。
【００８６】
キットとは、トランスフェクションまたは蛋白質発現キットを意味する。そのようなキットは好ましくは、一つまたは複数のオリゴヌクレオチドを一つまたは複数の真核細胞に導入するために用いられる。そのようなキットは好ましくは、一つまたは複数の細胞、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド、一つまたは複数の本発明の脂質製剤、一つまたは複数の緩衝塩、一つまたは複数の培地、一つまたは複数のトランスフェクション賦活剤などからなる群より選択される少なくとも一つの化合物を含む。そのようなキットは、バイアル、試験管などの一つまたは複数の容器手段を密封状態で受け取るための、区画化された運搬手段を含んでいてもよい。そのような容器手段はそれぞれ、トランスフェクションを実施するために必要な成分または成分の混合物を含む。
【００８７】
本発明は、下記の実施例によってさらに明らかになると思われるが、これらは純粋に本発明を例示するためのものである。実施例で用いられるすべての試薬および培地は、特に記載がない限り、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＤｉｖｉｓｉｏｎ（メリーランド州ロックビル）から入手した。
【００８８】
実施例
オリゴヌクレオチドの合成
ヒトｃ−ｍｙｃｍＲＮＡの開始コドンに相補的なアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド

および同一の塩基組成物を無作為の順に含むスクランブルホスホロチオエートオリゴヌクレオチド

の合成および高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）精製を、ウィックストロム（Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ）ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：１０２８〜１０３２（１９８８）およびＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５２：６７４１〜６７４５（１９９２））によって記載されたとおりに実施した。
【００８９】
ヒトｃ−ｒａｆの開始コドンに相補的なアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド

および７ｂｐミスマッチホスホロチオエートオリゴヌクレオチド

の合成および高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）精製を、モニア（Ｍｏｎｉａ）ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１５４８１〜１５４８４（１９９６））によって記載されたとおりに実施した。
【００９０】
細胞培養
すべての細胞株は、記載されたすべての実験で５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃の加湿インキュベーター中、サブコンフルエントなレベルで、２０継代未満で維持した。トランスフェクションのために、細胞を血清含有培地中、特定の培養密度（Ｈｅｌａ＆ＨｅＬａＳ３：２０００細胞／ウェル、ＨＥＫ２９３：３０００細胞／ウェル、ＣＨＯＫＩ＆ＣＨＯ−Ｓ：１０００細胞／ウェル、Ｋ５６２：１２００細胞／ウェル）で９６穴マイクロプレートに播種した。接着細胞はトランスフェクションの２４時間前に播種し、懸濁細胞はトランスフェクションの４時間前に播種した。ＨｅＬａ細胞以外、すべての細胞を無血清増殖培地で一回洗浄し、次いで無血清増殖培地または試験されたトランスフェクション試薬およびオリゴヌクレオチドを含む混合物で４時間処理した。４時間後、３Ｘ血清を含む適当な増殖培地を細胞に加えた。
【００９１】
ＨｅＬａ細胞は、１０％（ｖ／ｖ）熱不活化保証ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む高グルコースダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）改変イーグル培地（ＤＭＥＭ：４５００ｍｇ／Ｌグルコース、８６２ｍｇ／ＬＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン、１１０ｍｇ／Ｌピルビン酸ナトリウム）中で増殖させた。
【００９２】
ヒト上皮性腎（ＨＥＫ２９３）細胞は、１０％（ｖ／ｖ）熱不活化保証ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）を含む高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で平板培養した。
【００９３】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−Ｋ１、接着性）細胞および懸濁培養用に適合させた（ＣＨＯ−Ｓ）細胞は、０．１ｍＭＮＥＡＡ、１％プロリン、および１０％（ｖ／ｖ）熱不活化保証ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む高グルコースＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ中で増殖させた。
【００９４】
ＨｅＬａＳ３（懸濁培養用に適合）は、アール（Ｅａｒｌｅ）塩、１０％（ｖ／ｖ）熱不活化ウマ血清、および４ｍＭＬ−グルタミンを含む最小必須培地（Ｓ−ＭＥＭ）中で増殖させた。
【００９５】
Ｋ５６２は、１０％（ｖ／ｖ）熱不活化保証ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むイスコフ（Ｉｓｃｏｖｅ）改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ：４５００ｍｇ／Ｌグルコース、８６２ｍｇ／ＬＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン、１１０ｍｇ／Ｌピルビン酸ナトリウム）中で増殖させた。
【００９６】
実施例１
細胞株ＨｅＬａ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｓ、２９３Ｆ、Ｋ５６２およびＨｅＬａＳ３をトランスフェクトし、ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチドに対する特異的反応を試験して、アンチセンスオリゴヌクレオチドの非毒性で特異的な送達手段としてのＴＲ０（カチオン性脂質、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）およびジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の１：２．５ｗ／ｗリポソーム製剤）の効力を調べた。ＴＲ０はＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（商標）として市販されている。
【００９７】
トランスフェクション法
トランスフェクションの前日に、細胞を９６穴プレート中、前述の各細胞株に従い、最適な播種密度で平板培養した。これらの実験中、抗生物質は用いなかった。オリゴヌクレオチド２００ｎＭ（最終量１００μｌで計算した濃度）をＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ還元血清培地１６μｌに加えた。第二のチューブで、ＴＲ０をＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ還元血清培地中で１：５に希釈し、室温で５〜１０分間インキュベートした。希釈したＴＲ０を希釈したオリゴヌクレオチドに加え（ウェルごとに加えたＴＲ０の最終濃度は８．４μｇ／ｍｌ）、ゆっくり混合し、室温で１５分間インキュベートした。複合したＴＲ０およびオリゴヌクレオチド２０μｌを、新鮮無血清培地８０μｌを含む洗浄細胞に加えた。複合体を無血清培地中、３７℃で４時間インキュベートした。３Ｘ血清含有培地を加えて、最終濃度を１Ｘ血清とした。トランスフェクション後４８時間の時点で複合体を除去し、細胞を洗浄し、新鮮増殖培地を加えた。トランスフェクション後２４時間、４８時間、および７２時間の時点で、細胞の増殖阻害について試験した。アンチセンスおよびスクランブルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドをいずれも前述のとおりにトランスフェクトした。対照試料をオリゴヌクレオチドなし、またはオリゴヌクレオチドおよびＴＲ０なしで、同様に調製した。ＴＲ０の至適濃度は５．６μｇ／ｍｌから１１．２μｇ／ｍｌの間であることが判明した。
【００９８】
細胞増殖の測定
増殖を、代謝活性に反応して蛍光または吸光度いずれかの計測器で検出可能なシグナルを生じる非毒性酸化還元指示薬のａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）（ＴｒｅｋＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、オハイオ州ウエストレーク）により測定した。ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）をトランスフェクション後４８時間の時点で反応物の最終量の１０％で細胞に加えた。各ウェルの吸光度を、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓＶｍａｘ（登録商標）マイクロプレート読み取り機およびＳＯＦＴｍａｘ（登録商標）Ｐｒｏ３．１ソフトウェア（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール）を用いて５７０ｎｍおよび６００ｎｍの２波長で読み取った。プレートをＣＯ_２インキュベーターに入れ、ボイティック−ハービン（Ｖｏｙｔｉｋ−Ｈａｒｂｉｎ）ら（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：４７８〜４９１（１９９７））に従って２４時間、４８時間、および７２時間の時点で読み取りを行った。細胞増殖阻害の割合（％）を、未処理対照細胞に対する試料の相対吸光度で求めた。
【００９９】
結果
トランスフェクション後７２時間の読み取り結果を図１に示している。数字はａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）のプロトコルに従って示している。結果は平均±ＳＥＭで表している。各試験は最低三つの別々の実験で行った８回の重複測定の平均を示している。
【０１００】
結果は、ｃ−ｍｙｃ開始コドンを標的とするＴＲ０複合ＯＤＮにより、細胞の増殖および生存の著しい低下が引き起こされることを示す。六つの異なる細胞株において、ＴＲ０は未処理細胞に比べて一貫して増殖の特異的阻害を示した。ＨｅＬａ細胞では、阻害は未処理試料の９５％にもおよんだ。細胞株間で見られた効果の大きさのばらつきは、特定の細胞株のｃ−ｍｙｃダウンレギュレーションに対する感受性に相関するものとして理解することができる。重要なことに、ＴＲ０またはスクランブルＯＤＮ複合ＴＲ０のいずれでも、これらの複合体で細胞毒性は見られなかった。
【０１０１】
実施例２
下記のトランスフェクション試薬を用いて、ＨｅＬａ細胞株をトランスフェクトし、ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチドへの特異的反応について試験した。
【０１０２】
ＴＲ１（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標））：ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）（カチオン性脂質、塩化Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）およびジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ膜ろ過水溶液）の１：１ｗ／ｗリポソーム製剤）をＯＰＴＩ−ＭＥＭＩで希釈し、複合体形成前に室温で３０分間インキュベートした。加えたＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）の最終濃度は０．３μｌ／ｍＬであった。
【０１０３】
ＴＲ２（ＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ（商標））：ウェルごとに加えたＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ（商標）（カチオン性脂質、テトラメチルパルミチルスペルミン（ＴＭＴＰＳ）およびＤＯＰＥの１：１．５Ｍ／Ｍリポソーム製剤）の最終濃度は０．２μｇ／ｍＬであった。
【０１０４】
ＴＲ３（ＤＭＲＩＥ−Ｃ（商標））：ウェルごとに加えたＤＭＲＩＥ−Ｃ（商標）（カチオン性脂質、臭化Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（テトラデシルオキシ）−１−プロパンアミニウム（ＤＭＲＩＥ）およびコレステロールの１：１Ｍ／Ｍリポソーム製剤）の最終濃度は０．１５μｇ／ｍＬであった。
【０１０５】
ＴＲ４（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標））：ウェルごとに加えたＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）（ポリカチオン性脂質、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウム（ＤＯＳＰＡ）およびＤＯＰＥの３：１ｗ／ｗリポソーム製剤）の最終濃度は０．３μｇ／ｍＬであった。
【０１０６】
ＴＲ５（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（商標））：ウェルごとに加えたＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（商標）の最終濃度は０．２μｇ／ｍＬであった。
【０１０７】
トランスフェクションおよび細胞増殖の測定は、実施例１に記載の方法に従った。トランスフェクション後７２時間の読み取り結果を図２に示している。数字はａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）のプロトコルに従って示している。結果は平均±ＳＥＭで表している。各試験は最低三つの別々の実験で行った８回の重複測定の平均を示している。比較のために実施例１からのＴＲ０の結果を図２に示している。
【０１０８】
図２には、ＴＲ０は細胞の増殖および生存の最大の低下が引き起こされ、毒性効果はほとんど、またはまったくなかったことが示される。試験した他の五つのトランスフェクション試薬のうち、ＴＲ１のみが増殖の特異的阻害を示した。しかし、ＴＲ１は未処理試料に比べて増殖を４０％阻害したにすぎなかった（ＴＲ０では９５％の阻害が見られた）。ＴＲ２およびＴＲ３は、アンチセンス／ＴＲ複合体およびスクランブル／ＴＲ複合体の両方で増殖阻害を示した。この結果より、非特異的効果は望ましくないため、これらの試薬はアンチセンス研究で生育可能であるとして効果的に排除される。ＴＲ４およびＴＲ５と形成された複合体はアンチセンスの標的化に対して反応を示さなかった。
【０１０９】
実施例３
ウェスタンブロット分析
ＴＲ０／ＯＤＮ複合体のｃ−Ｒａｆ蛋白質発現を阻害する能力を、ウェスタンブロット分析により試験した。トランスフェクションは、６穴プレートで、６０，０００細胞／ウェルで培養したＨｅＬａ細胞を用いて実施した。細胞を２００ｎＭのＴＲ０複合ｃ−ｒａｆアンチセンスまたはミスマッチオリゴヌクレオチド（希釈していない試薬を最終量３μｌ／ウェルで加えた）で６時間処理した。ラウ（Ｌａｕ）ら（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１６：１８９９〜１９０２（１９９８））によって記載された方法に従い、同じ処理を２４時間後に繰り返した。上清を新しい微量遠心管に移した。
【０１１０】
免疫ブロット分析のために、細胞を２４時間および４８時間の時点で回収し、Ｃａ^＋＋およびＭｇ^＋＋を含まない１ＸＰＢＳで洗浄した。細胞抽出物を沸騰溶解緩衝液１ｍＬ（１％ＳＤＳ、１．０ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）、および１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて調製した。典型的には、次いで約４００ｎｇの蛋白質を４〜１２％ＮｕＰａｇｅ（登録商標）Ｂｉｓ−トリスＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲル（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールスバッド）上の電気泳動により分離した。ニトロセルロースに転写後、膜をｃ−Ｒａｆキナーゼ蛋白質を特異的に認識するモノクローナル抗体（ＢＤＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ニュージャージー州フランクリンレークス）を１：１，０００希釈で用いて１時間処理した。検出は、ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅ（商標）キット（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールスバッド）およびヤギ抗マウス抗体（ＢＤＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ニュージャージー州フランクリンレークス）で実施した。オリゴヌクレオチドなしのＴＲ０だけで処理した対照試料を適宜に調製した。
【０１１１】
処理後４８時間の結果を図３に示している。ｃ−Ｒａｆの阻害はＴＲ０／アンチセンスｃ−ｒａｆ複合体存在下でのみ認められた。未処理試料、ＴＲ０単独、またはＴＲ０／ミスマッチＯＤＮ複合体で処理した試料では、ｃ−Ｒａｆ発現の阻害は見られなかった。
【０１１２】
当業者であれば、特定の態様が例示および記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な改変および変更が加えられうることを理解すると思われる。
【０１１３】
本明細書に開示された本発明の明細および実施を考慮することにより、本発明の他の態様が当業者には明らかになると思われる。明細および実施例は例示にすぎないと考えられ、本発明の真の範囲および精神は添付の特許請求の範囲によって示されることが意図される。本明細書において引用されるすべての刊行物、特許出願、および特許は全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】異なる細胞株におけるＴＲ０／ａｎｔｉ−ｃ−−ｍｙｃ複合体の増殖阻害を示すグラフである。黒い棒は未処理試料を示す。白い棒は脂質のみを投与し、オリゴヌクレオチドは投与していない細胞を表す。網掛け棒は混合対照を投与した細胞を表す。斑点棒はアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した棒を表す。
【図２】様々なトランスフェクション試薬の機能的オリゴヌクレオチドトランスフェクションを仲介する能力を比較した図である。黒い棒は未処理試料を示す。白い棒は脂質のみを投与し、オリゴヌクレオチドは投与していない細胞を表す。網掛け棒は混合対照を投与した細胞を表す。斑点棒はアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した棒を表す。
【図３】アンチセンス（ＡＳ）またはミスマッチ（ＭＭ）オリゴヌクレオチドで処理したＨｅＬａ細胞におけるｃ−Ｒａｆ蛋白質発現の免疫ブロット分析を、未処理対照と比較して示す図である。レーン１は未処理ＨｅＬａ細胞からの細胞抽出物である。レーン２はＴＲ０を投与したが、ＯＤＮは投与していない細胞抽出物である。レーン３はＴＲ０／ｃ−ｒａｆへのアンチセンスＯＤＮ複合体を投与した細胞抽出物で、レーン４はＴＲ０／ミスマッチ対照ＯＤＮ複合体である。

Claims

一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを一つまたは複数の真核細胞に導入する方法であって、
（ａ）該一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、有効量の一つまたは複数の式Ｉのカチオン性脂質

（式中、
Ｒ_１は飽和または不飽和のＣ_１０ _〜 _１００の直鎖または分枝炭化水素鎖であり；
Ｒ_２は電子対、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、Ｒ_５−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ_６、Ｒ_５−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｒ_６、アルキルアミノアルキル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、およびアリールからなり、そのすべてが任意で置換されていてもよい群より選択され；
Ｒ_３およびＲ_４は互いに独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、Ｒ_５−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ_６、Ｒ_５−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｒ_６、アルキルアミノアルキル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、およびアリールからなり、そのすべてが任意で置換されていてもよい群より選択され；ただしＲ_５およびＲ_６は独立にアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり；かつ
Ａは、Ｒ_２が電子対ではない場合に、薬学的に許容されるアニオンである）
および任意で少なくとも一つの中性脂質を含む一つまたは複数の脂質製剤と接触させて、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質凝集体複合体を形成する段階と、
（ｂ）該一つまたは複数の細胞を該一つまたは複数の複合体と接触させる段階とを含む方法。
Ｒ_３およびＲ_４がＣ_１ _〜 _３アルキルであり、かつＲ_１またはＲ_２の一つが不飽和Ｃ_１６ _〜 _２０アルキルである場合、Ｒ_１またはＲ_２の他の一つは不飽和または飽和Ｃ_１６ _〜 _２０アルキルではない、請求項１に記載の方法。
一つまたは複数の細胞が薬物耐性ヒト乳癌細胞ではない、請求項１に記載の方法。
Ｒ_１が飽和または不飽和のＣ_１０ _〜 _３０の直鎖または分枝炭化水素鎖である、請求項１に記載の方法。
Ｒ_１が飽和または不飽和のＣ_１２ _〜 _２４の直鎖炭化水素鎖であり；かつＲ_２、Ｒ_３およびＲ_４が独立に水素、Ｃ_１ _〜 _１８アルキル、Ｃ_２ _〜 _１８アルケニル、Ｃ_２ _〜 _１８アルキニル、Ｃ_４ _〜 _１８ヘテロアルキル、Ｃ_４ _〜 _１８ヘテロアルケニル、Ｃ_４ _〜 _１８ヘテロアルキニル、Ｃ_６ _〜 _１２アリール（Ｃ_１ _〜 _１８）アルキルおよびＣ_６ _〜 _１２アリールからなり、そのすべてが任意で置換されていてもよい群より選択される、請求項４に記載の方法。
Ｒ_１が飽和または不飽和のＣ_１４ _〜 _２０の直鎖炭化水素鎖であり；Ｒ_２が水素、Ｃ_６ _〜 _１８アルキル、Ｃ_６ _〜 _１８アルケニル、Ｃ_６ _〜 _１８アルキニル、Ｃ_６ _〜 _１８ヘテロアルキル、Ｃ_６ _〜 _１８ヘテロアルケニル、Ｃ_６ _〜 _１８ヘテロアルキニル、フェニル（Ｃ_６ _〜 _１８）アルキル、およびフェニルからなる群より選択され；かつＲ_３およびＲ_４は独立に水素、Ｃ_１ _〜 _５アルキル、Ｃ_２ _〜 _６アルケニル、Ｃ_２ _〜 _６アルキニル、Ｃ_２ _〜 _５ヘテロアルキル、Ｃ_２ _〜 _５ヘテロアルケニル、Ｃ_２ _〜 _５ヘテロアルキニル、フェニル（Ｃ_１ _〜 _５）アルキル、およびフェニルからなり、そのすべてが任意で置換されていてもよい群より選択される、請求項５に記載の方法。
式Ｉのカチオン性脂質が臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）である、請求項６に記載の方法。
脂質製剤が中性脂質を含む、請求項１に記載の方法。
中性脂質がアシル基に１０〜２４個の炭素原子を有するジアシルホスファチジルエタノールアミンである、請求項８に記載の方法。
中性脂質がジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項９に記載の方法。
カチオン性脂質が下記式ＩＩのカチオン性脂質である、請求項１に記載の方法：

式中、
Ｒ_１は飽和または不飽和のＣ_１０ _〜 _１００の直鎖または分枝炭化水素鎖であり；
Ｒ_２は電子対、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、Ｒ_５−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ_６、Ｒ_５−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｒ_６、アルキルアミノアルキル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、およびアリールからなり、そのすべてが任意で置換されていてもよい群より選択され；ただしＲ_５およびＲ_６は独立にアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり；かつ
Ａは、Ｒ_２が電子対ではない場合に、薬学的に許容されるアニオンである。
Ｒ_１またはＲ_２の一つが不飽和Ｃ_１６ _〜 _２０アルキルである場合、他の一つは不飽和または飽和Ｃ_１６ _〜 _２０アルキルではない、請求項１１に記載の方法。
Ｒ_１が飽和または不飽和のＣ_１０ _〜 _３０の直鎖または分枝炭化水素鎖である、請求項１１に記載の方法。
Ｒ_１が飽和または不飽和のＣ_１２ _〜 _２４の直鎖炭化水素鎖であり；かつＲ_２が水素、Ｃ_１ _〜 _１８アルキル、Ｃ_２ _〜 _１８アルケニル、Ｃ_２ _〜 _１８アルキニル、Ｃ_４ _〜 _１８ヘテロアルキル、Ｃ_４ _〜 _１８ヘテロアルケニル、Ｃ_４ _〜 _１８ヘテロアルキニル、Ｃ_６ _〜 _１２アリール（Ｃ_１ _〜 _１８）アルキルおよびＣ_６ _〜 _１２アリールからなり、そのすべてが任意で置換されていてもよい群より選択される、請求項１３に記載の方法。
Ｒ_１が飽和または不飽和のＣ_１４ _〜 _２０の直鎖炭化水素鎖であり；かつＲ_２が水素、Ｃ_６ _〜 _１８アルキル、Ｃ_６ _〜 _１８アルケニル、Ｃ_６ _〜 _１８アルキニル、Ｃ_６ _〜 _１８ヘテロアルキル、Ｃ_６ _〜 _１８ヘテロアルケニル、Ｃ_６ _〜 _１８ヘテロアルキニル、フェニル（Ｃ_６ _〜 _１８）アルキルからなり、そのすべてが任意で置換されていてもよい群より選択される、請求項１４に記載の方法。
Ｒ_１が飽和のＣ_１４ _〜 _２０の直鎖炭化水素鎖であり、かつＲ_２がＣ_６ _〜 _１８アルキル、Ｃ_６ _〜 _１８ヘテロアルキル、Ｃ_６ _〜 _１８ヘテロアルケニル、Ｃ_６ _〜 _１８ヘテロアルキニル、およびフェニル（Ｃ_６ _〜 _１８）アルキルからなり、そのすべてが任意で置換されていてもよい群より選択される、請求項１５に記載の方法。
Ａがハロゲン、硫酸塩、または亜硝酸塩からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
Ａが臭素である、請求項１７に記載の方法。
任意の置換基がハロゲン、ハロ（Ｃ_１ _〜 _６）アルキル、Ｃ_１ _〜 _６アルキル、Ｃ_２ _〜 _６アルケニル、Ｃ_２ _〜 _６アルキニル、ヒドロキシ（Ｃ_１ _〜 _６）アルキル、アミノ（Ｃ_１ _〜 _６）アルキル、カルボキシ（Ｃ_１ _〜 _６）アルキル、アルコキシ（Ｃ_１ _〜 _６）アルキル、ニトロ、アミノ、ウレイド、アシルアミノ、ヒドロキシ、チオール、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシ、アミノカルボニル、およびＣ_１ _〜 _６アルキルチオールからなる群より選択される、請求項１または１１に記載の方法。
任意の置換基がヒドロキシ（Ｃ_１ _〜 _６）アルキル、アミノ（Ｃ_１ _〜 _６）アルキル、ヒドロキシ、カルボキシ、ニトロ、Ｃ_１ _〜 _６アルキル、アルコキシ、チオールおよびアミノからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
脂質製剤が約０．１μｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの量で存在する、請求項１に記載の方法。
脂質製剤が約０．３５μｇ／ｍｌ〜約１４μｇ／ｍｌの量で存在する、請求項２１に記載の方法。
脂質製剤が約２μｇ／ｍｌ〜約１３μｇ／ｍｌの量で存在する、請求項２２に記載の方法。
脂質製剤が約４．５μｇ／ｍｌ〜約１２μｇ／ｍｌの量で存在する、請求項２３に記載の方法。
脂質製剤が約５．６μｇ／ｍｌ〜約１１．２μｇ／ｍｌの量で存在する、請求項２４に記載の方法。
一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを一つまたは複数の真核細胞に導入する方法であって、
（ａ）該一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、有効量の臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）および少なくとも一つの中性脂質を含む脂質製剤と接触させて、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質凝集体複合体を形成する段階と、
（ｂ）該一つまたは複数の細胞を該一つまたは複数の複合体と接触させる段階とを含む方法。
ＤＤＡＢと中性脂質との比が約１：５から約１：１である、請求項２６に記載の方法。
比が１：２．５である、請求項２７に記載の方法。
中性脂質がアシル基に１０〜２４個の炭素原子を有するジアシルホスファチジルエタノールアミンである、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
中性脂質がジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項２９に記載の方法。
脂質製剤が約２μｇ／ｍｌ〜約１３μｇ／ｍｌの量で存在する、請求項３０に記載の方法。
脂質製剤が約４．５μｇ／ｍｌ〜約１２μｇ／ｍｌの量で存在する、請求項３１に記載の方法。
脂質製剤が約５．６μｇ／ｍｌ〜約１１．２μｇ／ｍｌの量で存在する、請求項３２に記載の方法。
一つまたは複数のオリゴヌクレオチドを一つまたは複数の真核細胞に導入するためのキットであって、一つまたは複数の細胞、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド、有効量の一つまたは複数の式Ｉのカチオン性脂質および任意で少なくとも一つの中性脂質を含む一つまたは複数の脂質製剤、一つまたは複数の緩衝塩、一つまたは複数の培地、ならびに一つまたは複数のトランスフェクション賦活剤からなる群より選択される少なくとも一つの成分を含むキット。
有効量の一つまたは複数の式Ｉのカチオン性脂質

（式中、
Ｒ_１は飽和または不飽和のＣ_１０ _〜 _１００の直鎖または分枝炭化水素鎖であり；
Ｒ_２は電子対、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、Ｒ_５−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ_６、Ｒ_５−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｒ_６、アルキルアミノアルキル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、およびアリールからなり、そのすべてが任意で置換されていてもよい群より選択され；
Ｒ_３およびＲ_４は互いに独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、Ｒ_５−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ_６、Ｒ_５−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｒ_６、アルキルアミノアルキル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、およびアリールからなり、そのすべてが任意で置換されていてもよい群より選択され；ただしＲ_５およびＲ_６は独立にアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり；かつ
Ａは、Ｒ_２が電子対ではない場合に、薬学的に許容されるアニオンである）
および任意で少なくとも一つの中性脂質を含む一つまたは複数の脂質製剤と、一つまたは複数の細胞、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド、一つまたは複数の緩衝塩、一つまたは複数の培地、および一つまたは複数のトランスフェクション賦活剤からなる群より選択される少なくとも一つの追加の成分とを含む、請求項３４に記載のキット。
一つまたは複数の細胞、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド、有効量の一つまたは複数の式Ｉのカチオン性脂質および任意で少なくとも一つの中性脂質を含む一つまたは複数の脂質製剤、一つまたは複数の緩衝塩、一つまたは複数の培地、ならびに一つまたは複数のトランスフェクション賦活剤からなる群より選択される少なくとも一つの成分を含む組成物。
有効量の一つまたは複数の式Ｉのカチオン性脂質

（式中、
Ｒ_１は飽和または不飽和のＣ_１０ _〜 _１００の直鎖または分枝炭化水素鎖であり；
Ｒ_２は電子対、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、Ｒ_５−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ_６、Ｒ_５−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｒ_６、アルキルアミノアルキル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、およびアリールからなり、そのすべてが任意で置換されていてもよい群より選択され；
Ｒ_３およびＲ_４は互いに独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、Ｒ_５−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｒ_６、Ｒ_５−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−Ｒ_６、Ｒ_５−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｒ_６、アルキルアミノアルキル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、およびアリールからなり、そのすべてが任意で置換されていてもよい群より選択され；ただしＲ_５およびＲ_６は独立にアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり；かつ
Ａは、Ｒ_２が電子対ではない場合に、薬学的に許容されるアニオンである）
および任意で少なくとも一つの中性脂質を含む一つまたは複数の脂質製剤と、一つまたは複数の細胞、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド、一つまたは複数の緩衝塩、一つまたは複数の培地、および一つまたは複数のトランスフェクション賦活剤からなる群より選択される一つまたは複数の追加の成分とを含む、請求項３６に記載の組成物。
細胞の成長または増殖を阻害または防止する方法であって、
（ａ）一つまたは複数の真核細胞を、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドならびに有効量の一つまたは複数の式Ｉのカチオン性脂質および任意で少なくとも一つの中性脂質を含む有効量の一つまたは複数の脂質製剤と接触させて、組成物を提供する段階と、
（ｂ）該組成物を細胞の成長または増殖を阻害または防止するのに十分な条件下でインキュベートする段階とを含む方法。
一つまたは複数の蛋白質の発現を阻害または防止する方法であって、
（ａ）一つまたは複数の真核細胞を、一つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドならびに有効量の一つまたは複数の式Ｉのカチオン性脂質および任意で少なくとも一つの中性脂質を含む有効量の一つまたは複数の脂質製剤と接触させて、組成物を提供する段階と、
（ｂ）該組成物を該一つまたは複数の蛋白質の発現を阻害または防止するのに十分な条件下でインキュベートする段階とを含む方法。