JP2004520004A - 核酸配列のポリプライムド増幅 - Google Patents
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Abstract
高速ではあるが高い特異性と制御で選択された核酸の増幅のための方法が、二次、三次、四次、またはそれ以上の高次のプラットフォーム、とりわけ線型または対数のローリングサークル増幅の一次産物の範囲内で、選択された配列を増幅するように特に設計されたものを使用して開示され、また更に増幅産物を検出する能力を高めるのに役立つ特定の検出またはレポーター分子と共に前記配列を増幅する事が開示される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本出願は、２０００年５月１２日に受理された合衆国暫定特許出願番号第６０／２０４０５７の利益を主張し、その開示は全体としてここに組み込まれている。
【０００２】
本発明は、従来のローリングサークル法を上回る量と反応速度の利点を持つ生産物種の検出の向上を提供するように、ローリングサークル増幅で多段プラットフォームを確立するためのプロセスに関する。
【０００３】
【発明の背景】
標的ＤＮＡ分子を増幅する手段は、このような増幅ＤＮＡが、続くＤＮＡ配列化、クローニング、地図化、遺伝子型化、プローブの生成、および診断による同定を含む方法にしばしば利用されることが多い。
【０００４】
これまでの所、核酸の検出に基づき感受性診断検定を可能にするようにいくつかの方法が開発されてきた。その大部分はＤＮＡより成る選択された標的およびまたはプローブの増幅の周辺で設計されたものであり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自給配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、およびＱβレプリカーゼでの増幅などが含まれている（バーケンマイヤーおよびマシャヴァール，ウイルス学方法ジャーナル，３５巻：１１７−１２６ページ（１９９１年）；ランディグレン，トレンズ・ジェネティクス，９巻：１９９−２０２ページ（１９９３年））。これらの方法のいくつかは、相対的に低い量的測定の精度、とりわけ多重検定（１個以上の標的が同時に検定される場合、マルチプレックスシークエンス法）での精度の低いことに難点がある。これらの欠点は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）法により殆んど解決された。
【０００５】
これまでに、Ｍ１３などのバクテリオファージからのプラスミドまたはＤＮＡなどの環状ＤＮＡ分子を増幅するいくつかの方法が使用されてきた。その一つは、大腸菌の適切な宿主菌株でのこれら分子の増殖であり、それに続く十分立証されたプロトコルによるＤＮＡの増幅であった。（サムブルック，Ｊ．，フリッツ，Ｅ．Ｆ．，マニエイタス，Ｔ．，分子クローニング，ラボラトリーマニュアル，１９８９年，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，コールド・スプリング・ハーバー ニューヨーク）。またＰＣＲは、Ｍ１３などのバクテリオファージからのプラスミドおよびＤＮＡなどのようなＤＮＡ標的において、決まった配列を増幅するためにしばしば使用された方法であった。（ＰＣＲプロトコルズ，１９９０年，Ｍ．Ａ．イニス，Ｄ．Ｈ．ゲルファンド，Ｊ．Ｊ．スニンスキー編，アカデミック・プレス，サンディエゴ）。これらの方法のいくつかは、労力を要し、費用が高く、時間がかかり、効率が悪く、また感受性を欠いていることで難点がある。
【０００６】
これらの方法を改良したものとして、線型ローリングサークル増幅（ＬＲＣＡ）は、環状標的ＤＮＡ分子にアニーリングされたプライマーを使用し、ＤＮＡポリメラーゼが付加される。ＬＲＣＡに対する改良は、ＬＲＣＡ産物鎖に対してアニーリングする付加プライマーと共に指数ＲＣＡ（ＥＲＣＡ）の使用である。従って二本鎖ＤＮＡを産出することができ、指数増幅はＨＲＣＡとして引用される鎖置換反応を経由して起こすことができる（ライザーディ，Ｐ．Ｍ．他，ネイチャー・ジェネティクス，（１９９８年）１９巻，２２５−２３１ページ）。
【０００７】
多重検定の複合標的は、例えばウイルスまたは他の微生物である。かくしてウイルス感染患者の臨床状態は、ウイルス負荷に（例えばＨＩＶ感染で）大きく依存しており、従ってこのようなウイルス負荷を量的に決定する手段は、とりわけ価値がある。このような多重検定においては、異なる標的、例えば異なるウイルス、またはウイルスの異なる菌株の測定が正確に決定されねばならず、また異なる標的の比率が、標的配列の比率の真のインジケーターでなければならないということが重要である。このような目的のために、多重、指数核酸増幅法がしばしば用いられたが、多重ローリングサークル増幅法のみが、多重検定システムの多くの目標に合致して成功を遂げている［ライザーディ，合衆国特許番号５，８５４，０３３号参照、その開示はここで全体として引用例として組み込まれている］。
【０００８】
しかしこのような方法には過誤の源が存在し、例えば構造的差異が異なる効率に導く場合ならば、異なる事象は異なる標的配列を伴い、または産物鎖アニーリングの速度の差は、異なる標的配列で異なり、前記プライミング事象と競争する速度を変えることに導くであろう。すなわちその構造と安定性を異にする種を同時に発生する多重連続反応効果を持つ作用（その事象が連続反応の反復により拡大されるもの）、および一つのサイクルから他のサイクルへの増幅からの産出での小さな差が最終産物の比率の望ましくない大きな差に帰着するように指数的に拡大される可能性などのプライミング事象と競争する速度の変化に導くことができる。ＲＣＡ法は信号収率の故で誤りを克服した。というのは増幅収率が標的の量に比例するからである（すなわち検出効率は標的ＤＮＡの十分な量を利用できるかどうかには依存せず、そのため標的のほんの僅かな量でさえ非常に大きな信号感受性を提供することができる）。
【０００９】
ＤＮＡ増幅のためのもっとも初期の方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、これはＤＮＡの線型セグメントのみで操作し、その増幅が望ましいＤＮＡのセグメントの５′−および３′−末端の特異的プライマー配列を用いて線型セグメントを産出した。この方法を改良したものとして、線型ローリングサークル増幅法（ＬＲＣＡ）は、開環状プローブに雑種形成する標的ＤＮＡ配列を使用して複合体を形成し、それは次いで連結されて増幅標的サークルを産出し、プライマー配列とＤＮＡポリメラーゼが加えられた。増幅標的サークル（ＡＴＣ）は、そのように新しいＤＮＡが作られる鋳型を形成し、それによりＡＴＣに相補である反復配列の連続配列としてプライマー配列を伸長したが、１時間当り約数千の複製のみが生成されるだけにとどまった。ＬＲＣＡの改良は、複製補体配列に結合する追加のプライミング配列での指数ＲＣＡ（ＥＲＣＡ）の使用で増幅の新しいセンターを提供し、これにより指数的反応速度と大きく増加した増幅を提供される。指数ローリングサークル増幅（ＥＲＣＡ）は鎖置換反応のカスケードを利用するが、それは当初の一本鎖ＲＣＡ産物を鋳型として使用することに限定され、更なるＤＮＡ合成には前記産物に付着するけれども、追加のローリングサークル増幅のない個別の一本鎖プライマーを使用する。
【００１０】
これらの方法すべては、とりわけ稀有遺伝事象、例えばまれな突然変異に対し、ならびにマルチプレックス化に関する制限および柔軟な検出手順に対しての感受性の欠除という難点がある。
【００１１】
本発明の方法（ここでポリプライムドローリングサークル増幅法−ＰＰＲＣＡとして引用されるもの）は、線型ローリングサークル増幅の感受性を改良する手順を採用し、一方ＲＣＡの追加のステージ、またはプラットフォームを使用する正確な指数増幅を採用する（従ってそれによりより大きな感受性をもたらす）ことによる高い特異性を保持し、連続反応段階への信頼性を除去するが、指数ＲＮＡの利点と固相に増幅する能力を保持することにより前記の不利益を避ける。本発明は、ローリングサークル増幅法の新しい適用に高度に有用である低コスト、稀有事象に対する感受性、柔軟性、とりわけ検出試薬の使用の際の柔軟性、および汚染の低いリスクなどの利点を持つ。
【００１２】
【発明の概要】
本発明は、単一ヌクレオチド（単一ヌクレオチド多型−ＳＮＰ）としてできるだけ小さな変化、または突然変異を含む標的ＤＮＡ分子の遺伝子型での差異を検出し、同じくＤＮＡの与えられたサンプルでこのような突然変異の相対的存在の量的測定を提供する手段としての前記標的ＤＮＡ分子の選択的増幅のプロセスに関する。
【００１３】
本発明は、更に線型または指数ローリングサークル増幅の一次産物内で選択された配列を増幅するように特に設計された二次、三次、四次またはより高次の位のプラットフォームを用い、また増幅産物を検出する能力を高めるのに役立つ特化されたデテクターまたはレポーター分子と共に前記配列を増幅するその選択的増幅により、標的ＤＮＡ分子の選択的検出のための方法を提供する。
【００１４】
別個の実施例においては、本発明の方法内で有用なレポーター分子は、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテンおよび質量標識またはこれらのいずれかの組合せなどの分子を含む。
【００１５】
他の実施例においては、本発明は、異なる種類のデテクターおよびレポーター結合分子のための連続反応を提供するために、選択されたヌクレオチドを採用し、この連続反応は、生成するローリングサークル産物を検出するのに利点を提供するように選択的に構築され構成された異なるデオキシヌクレオシドリン酸、同じく無塩基ヌクレオチドを及びヌクレオシドを利用する。レポーター分子は更に酵素、フルオロフォアおよび各種の抱合体を含む。
【００１６】
本発明の更なる見地は、環状ＤＮＡ標的の増幅を高めるプロセスに関する。それは線型ローリングサークル増幅の単一プライムド鋳型環状ＤＮＡ分子への感受性を改良する。
【００１７】
【発明の説明】
本発明の方法は、一次タンデム配列（ＴＳ−ＤＮＡ）産物から発生する二次、三次、四次、およびより高次の位の増幅プロセスに起因して、非常に多く増加した増幅を提供する。このようなＤＮＡは、ローリングサークル増幅の最初または一次産物であり、またローリングサークル、または鋳型として使用される増幅標的サークル（ＡＴＣ）で見出される配列のタンデム反復を含有する無傷の一本鎖を含む。このようなタンデム配列それぞれは、それ自身をＴＳ−ＤＮＡに沿って次いで複製される追加のプライマーと結合するように役立たせることができ、各複製フォークは、その前にあるプライマーを置換し、それにより１種の指数ＲＣＡ（ローリングサークル増幅）を提供する。
【００１８】
本発明において、このようなプライマーは付着のためだけに使用され、タンデム配列と結合した後では、一次または後のＴＳ−ＤＮＡ産物のいずれかであるＤＮＡ産物は、真に指数増幅のための追加鋳型として作用する追加増幅標的サークルに付着のための追加配列を提供する。かくして増幅の速度と範囲は最初のＴＳ−ＤＮＡ産物に結合できるプライマー数に限定されず、代って、各ステージ、またはプラットフォームで増幅の追加のステージの核として作用するステージに進行する。かくして本発明に基づいて、最初または一次ＴＳ−ＤＮＡ産物に依存する各タンデム配列は、タンデム配列増幅の新しい全世代の種子として機能し、また、それから形成された各二次ＴＳ−ＤＮＡ産物も無限に追加の種子を含む。他のものと同じように、単一ヌクレオチド多型を含む増幅および稀有遺伝さえ検出する本発明のユニークな感受性を提供することが本特徴である。
【００１９】
前記に従って、本発明の一つの実施例は、一次ＲＣＡ産物に固定されたまま残り、これにより増幅の増加、同じく検出の感受も増加、および汚染の機会の減少を提供する二次増幅を持つ。他の実施例では、二次増幅は一次増幅反応と同時に起こり、適切な増幅に必要とされる数多くのステップで速度と経済性の増大を来たしている。本発明のプロセスは、ポリメラーゼリードスルー（すなわち複製フォークを進めることによる続くプライマーとその新しく合成された尾部の取り替え）に起因する二次増幅鎖の取り替えから起こる所謂高分枝ＲＣＡの不利益を克服する。
【００２０】
現在使用されるＲＣＡ手順においては、多分標的ＤＮＡ配列と結合するプライマー配列は、増幅標的サークルを形成するために追加配列との反応を許され、その大部分は図１の初期段階（Ａ乃至Ｄ段階）で示される。しかし高分枝鎖は、次いでタンデム配列ＤＮＡに沿って依存する配列に結合するプライマーを加えることで形成される（図１、Ｄ）。それらのプライマーは、ＤＮＡ合成の追加のラウンドを開始し、ＤＮＡポリメラーゼと反応して（鋳型として）ＴＳ−ＤＮＡに沿って合成される新しい鎖を形成し、新しく形成された各鎖はその前方（すなわち３′−方向で）雑種形成鎖を置換し、その結果、鋳型としてＤＮＡの長い配列が存在し、数多くの配列がその上に合成され、一方このような新規に形成された各配列は、その５′末端でその後に合成された配列により置換される。ＴＳ−ＤＮＡの新しい各セグメントは、もとのＡＴＣから予定どおりに起こるので、新しいプライマーは、そのセグメントを結合し、新しいＤＮＡ鎖を開始し、かくして新規に形成された鎖は、それが更にＡＴＣの近辺から更に除かれているように長さを増加している（例えば、図１１に示された合衆国特許番号５，８５４，０３３号を参照されたい）。
【００２１】
ここで開示されたプロセスに従って、１個またはそれ以上のプライマーを、雑種形成、共存結合またはポリヌクレオチド三倍体より成るグループから選択された化学的連結反応を通じてＴＳ−ＤＮＡ産物に付加することができる。
【００２２】
本発明のポリプライムドローリングサークル増幅法（ＰＰＲＣＡ）は、線型または高分枝ローリングサークル増幅法よりも優れた改良を提供し、そこでは、反応速度は真に事実上、指数的であり（製品が形成され、または多重出発部位から幾何学的増加量で増幅され）、一方ＲＣＡ ＴＳ−ＤＮＡ産物に結合し、または少なくとも１個の実施例では、もとのまたは一次ＴＳ−ＤＮＡ産物に類似し、または類似していない追加のタンデム配列ＤＮＡ産物を産出するために、追加の増幅標的サークルに結合する追加のセットのプライマー（Ｐ２）を使用することで鎖の置換を避ける。かくして本発明のこの方法は、増幅の一次およびその後のすべてのラウンドを効果的に分離する。
【００２３】
視点を変えて、他のＲＣＡ法においては、第２ＤＮＡ増幅は、当初のＴＳ−ＤＮＡを鋳型として使用するＤＮＡ合成を開始するプライマーから誘導され、かくしてすべての二次ＴＳ−ＤＮＡは、必ず構造的に当初の一次ＴＳ−ＤＮＡ産物の配列に関連する事になり、またそのように鎖置換が必要とされる。本発明のポリプライムドＲＣＡにおいて、二次プライマー（すなわちＰ２）は別のセグメントを持つことができ、その一つは一次ＴＳ−ＤＮＡに結合する（固定させる目的のみのための）ものであり、またすべての二次、および多分三次、四次、および高次の位のラウンドの増幅がＰ２プライマー、またはＰ３プライマー、もしくはＰ４プライマー等に結合するＡＴＣｓを増幅するように完全に異なる完全に異なった増幅標的サークル（ＡＴＣ）に相補であるプライマーとして役立つ追加のセグメントを持つことができる。ここで開示されたＰＰＲＣＡ法を使用して、反応条件が許す条件下で、望ましいできるだけ多くのステージの増幅を生成することが可能であり、ここで各ステージの増幅は、各組がヌクレオチド配列において異なるＡＴＣの潜在的に異なる組のＡＴＣｓを複製し、またここで各ステージは、そのそれぞれが複製されるＡＴＣ鋳型の組に基づいて、タンデム反復のそれ自身のコンカテマー（鎖状体）である新しいＴＳ−ＤＮＡを生成する。
【００２４】
本発明のこの方法の見本実施例は図１に記載され、これは本発明のポリプライムドローリングサークル増幅（ＰＰＲＣＡ）法の一つの実施例を図形で示している。ここでオリゴヌクレオチドプライマー（長さ約２０−５０塩基）は、増幅標的サークルに相補の領域（長さ約６５−１５０塩基）（（Ａ）参照）と、短い非相補領域を持つオリゴヌクレオチドプライマーである。Ｂでは、オリゴヌクレオチドプライマー（長さ２０−５０塩基）の相補領域は、ＬＲＣＡ（Ｃ）に記載されたように、酵素、ｄＮＴＰｓ、等を加えて増幅標的サークルに特異的に雑種形成する。（Ｄ）は初期のセグメントに置換するＤＮＡポリメラーゼを持つＲＣＡプライマーの伸長を示す。Ｅでは、標的サークル（長さ１６−５０塩基）に同一の領域と非相補領域（長さ２−１０塩基）を持つ第２オリゴヌクレオチドプライマー（長さ２０−５０塩基）が、タンデム反復ＲＣＡ産物に雑種形成する。Ｆでは、プライマー２の３′末端に相補である領域を持つ第２増幅標的サークル（長さ約７０−１５０塩基）が、プライマー２に雑種形成し、（環状鋳型に沿って）その３′末端からＲＣＡを開始する。ある実施例においては、第２増幅標的サークルは、一次ＡＴＣに配列で同一または類似である。Ｇでは、その結果は、線型ローリングサークル足場から形成され、かくして指数増幅を産出する一連の線型ＲＣＡ ＴＳ−ＤＮＡ産物になることが見られる。本発明に基づく方法は、更に三次合成および更なる増幅産物の更なる累乗法を提供する二次鎖のプライマー相補配列を採用することができる。
【００２５】
本発明に従って、オリゴヌクレオチドプライマー（プライマー１またはＰ１）は、ローリングサークル複製プライマーとして作用し、ＡＴＣに対する「プライマー相補部分」に相補である配列を持つ単なるオリゴヌクレオチドである。この配列はプライマーＰ１の「相補部分」として引用される。オリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１など）の相補部分および増幅標的サークルのプライマー補体部分は、それらが相互に相補である限り、いずれか望ましい配列を持つことができる。Ｐ１のこのような配列は、増幅標的サークルのいずれか他の部分には相補ではなく、あるいはプライマーが完全に前記ＡＴＣに結合するＡＴＣの配列の殆んどに対して相補である場合もあり、望ましくはプライマーに結合しないＡＴＣの小さなセグメントを持つこともある。
【００２６】
本発明に有用であるローリングサークル複製（ＲＣＡ）プライマー（Ｐ１）の相補部分は、プライマーとプライマー補体部分の間で、特異的また安定した雑種形成を支持するいずれかの長さのものであることができる。一般にこの長さは１０乃至３５のヌクレオチド、しかし望ましくは１６乃至２０の長さのヌクレオチドである。
【００２７】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記のとおり、ＡＴＣの部分、またはすべてに対して非相補のセグメントを持つこともある。このような非相補部分が存在する時には、ＲＣＡの間の鎖置換を促進するのに役立つ。このようなオリゴヌクレオチドプライマーの非相補部分は、いろいろな長さのものがあるが、一般的には長さ１乃至１００のヌクレオチドであり、望ましくは４乃至８ヌクレオチドの長さである。
【００２８】
本発明のプロセスに有用な増幅標的サークル（ＡＴＣ）は、環状一本鎖ＤＮＡ分子であり、一般には４０乃至１０００のヌクレオチド、望ましくは約５０乃至１５０のヌクレオチド、またもっとも望ましくは約５０乃至１００のヌクレオチドを含む。ここで開示されるプロセスに有用なＡＴＣｓは、異なる部分、またはセグメントを持つことができ、それらを異なる目的のために特に有用なものにする。このような部分の少なくとも１個は、１個またはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーに相補となるであろう。
【００２９】
ここで開示されたプロセスに有用なＡＴＣｓとして、プライマー補体部分は、増幅標的サークルの必要とされる要素である。他の部分は随意のものであり、任意に決定された配列を持つように選択することができる。不適合またはギャップなしで長さ約６個のヌクレオチド以上の相補領域のない場合という条件に合致して、ＡＴＣｓが自己相補性であるいずれの配列も持たないことが望ましい。このプロセスで有用なＡＴＣは、ライザーディ、合衆国特許第５，８５４，０３３号（その開示はここで全体として引用例で組み込まれている）、およびライザーディ他、等温ローリングサークル増幅を用いる突然変異検出と単一分子計数、ネイチャー・ジェネティクス，１９巻，２２５−２３２ページ（１９９８年）。
【００３０】
ある実施例では、例えばオリゴヌクレオチドの一つは、２個のアーム部（すなわち標的認識を随意に提供する一つのアーム部と、サークルを用いてＲＣＡの開始のためのプライマーとして随意に作用するも一つのアーム部を持つ３′−５′−３′オリゴヌクレオチド）を持つ。その源を持つこのような「双極性」（３′−５′−３′）オリゴヌクレオチドは、ライザーディ他（１９９８年前掲同書）で示されている。このような双極性プライマーは、ここで使用されるプライマーＰ１が双極性プライマーである場合のような固形基質に付着するものとしての用途を見出している。現在利用できるＲＣＡ法などとは異なり、このような双極性プライマーは本発明の方法に有用である。というのは、本発明はプライマー置換を避けるためである。かくしてもしこのようなプライマーが、指数または高分技ＲＣＡで、例えばＰ２プライマーとして採用されたとすると（高分技ＲＣＡの処置の説明についてはライザーディ他（１９９８年）参照）、置換されるべき５′末端がないために鎖置換作用は失敗するであろう（すなわち、この結果は、プライマーの双極性の故で間違った配向でＴＳ−ＤＮＡと結合するプライマーになるであろう）し、またその結果は増幅が起きないであろう。このようなＲＣＡ法において、双極性プライマーは、Ｐ１プライマーとしてのみ用途を見出す。本発明のプロセスでは、使用されるプライマーのいずれも双極性のものである。
【００３１】
ＰＰＲＣＡにおいては、増幅は各プライマーで起こり、これにより各プライマーにより複製される一次ＡＴＣ（またはＡＴＣ１）に相補であるセグメントのタンデム反復（すなわちＴＳ−ＤＮＡ）のコンカテマーを形成する。その双極性プライマーはＰ２プライマーとしての使用が利用でき、何故なら本発明の方法は鎖置換を避け、また、双極性プライマーがその各端部に３′−ＯＨを持つために、それが増幅の追加のステージでプライマーとして使用されると自動的に適切な配向にあるようにするためである。加えて、双極性プライマーが各端部に３′−ＯＨを持つために、それはややもすれば生じるかもしれない鎖の置換を短縮するのに役立つ。更に、双極性プライマーの各端部の３′−ＯＨが存在するために、ＴＳ−ＤＮＡおよび二次、またはより高い位のＡＴＣｓ（ＡＴＣ２、ＡＴＣ３、ＡＴＣ４、およびその他）の相補配列はプライマー配列内でどのような形状にも配列することができる。
【００３２】
増幅サークルのサイズ、および使用されるＤＮＡに依存して、ＰＰＲＣＡは、サークルの数（採用される特定のプライマーおよび標的配列のためにしばしば特別に決定される）、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓおよびＭｇ２＋を最適化することができる増幅（および感受性）のきわめて高い度合を達成する。この反応の産物は、（例えばサークルの領域に同一の蛍光標識オリゴヌクレオチド、または他の標識オリゴヌクレオチドを用いて）随意に装飾され検出される。
【００３３】
ＲＣＡを用いて増幅される核酸の検出と量的評価を助けるために、検出標識を増幅核酸にとり込むことができ、または検出分子のために標識を連結することができる。このような検出標識は、直接または間接的に増幅核酸と会合できるいずれかの分子であり、それはまた直接または間接的に測定および検出可能な信号となって現れる。核酸へのとり込みまたは核酸プローブに結合する多くのこのような標識は、従来の技術に習熟した者にとって既知である。その例としては，放射性同位元素、蛍光分子、酵素、抗体、およびリガンドを含む。
【００３４】
適切な蛍光標識の例は、フルオレセイン、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１、３−ジアゾル−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、ダンシルクロリド、およびローダミンを含む。望ましい蛍光標識はフルオレセイン（５−カルボキシフルオロセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）およびローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）である。これらはモレキュラー・プローブ，ユージン，オレゴンおよびリサーチ・オーガニクス，クリーブランド，オハイオなどの各種の商業源から得ることができる。
【００３５】
標識ヌクレオチドは、検出標識の望ましい形態であり、その理由は、それらが合成の間に直接ＲＣＡの産物にとり込むことができるからである。増幅ＤＮＡにとり込むことのできる検出標識の例は、ＢｒｄＵｒｄ（ホイおよびシムケ，突然変異研究，２９０巻：２１７−２３０ページ（１９９３年））、ＢｒＵＴＰ（ウォンシック他，細胞生物学ジャーナル，１２２巻：２８３−２９３ページ（１９９３年））、およびビオチンで修飾されたヌクレオチド（ランガー他、全米科学アカデミー紀要，７８巻：６６３３ページ（１９８１年））、またはジゴキシゲニンなどのような適切なハプテン（カークホーフ，アナリティカル・バイオケミストリー，２０５巻：３５９−３６４ページ（１９９２年）などのようなヌクレオチド類似体を含む。適切な蛍光標識ヌクレオチドは、フルオレセイン−イソチオシアネート−ｄＵＴＰ、シアニン−３−ｄＵＴＰおよびシアニン−５−ｄＵＴＰである（ユー他，核酸研究，２２巻：３２２６−３２３２ページ，（１９９４年））。ＤＮＡの望ましいヌクレオチド類似体検出標識は、ＢｒｄＵｒｄ（ＢＵＤＲ三リン酸、シグマ）、および望ましいヌクレオチド類似体検出標識は、ビオチン−１６−ウリジン−５′−三リン酸、（ビオチン−１６−ｄＵＴＰ、ベーリンガー・マンハイム）である。
【００３６】
かくして本発明に従って、レポーター分子は、同じプライマーまたはＴＳ−ＤＮＡの部分としてか、あるいは別個のプライマーまたはＴＳ−ＤＮＡｓの部分のいずれかとして、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、酵素、および質量標識またはこれらのいずれかの組合せより成るグループから選択される部材を含むことができる。かくしてこれは、プライマー、ＡＴＣｓまたはＴＤ−ＤＮＡ産物のいずれかの異なるＤＮＡｓを含み、ここで１個またはそれ以上のこのような構造は、標識の異なる型、または同じ型の異なる標識を、もしくは異なるが同一標識のそれぞれで標識される。例えば、１個の構造は質量標識で、また他のものは蛍光標識で、あるいはあるものは質量標識でまた他のものは異なる質量標識で、もしくはそれぞれが同じ質量標識に結合されて標識化することができた。追加として、２個またはそれ以上のポリヌクレオチド、または本発明の範囲内のオリゴヌクレオチドは、本発明の方法に従って開示されたように、同一反応混合物内で、または同じシリーズの範囲内で、このように標識される。
【００３７】
も一つの実施例において、本発明はｄＮＴＰに付着するレポーター分子の用途を特徴付け、ここで前記レポーター分子はポリメラーゼの作用によりタンデム配列ＤＮＡにとり込まれる。このようなレポーター分子は、従来の技術に記載されたもののいずれかである。例えば、ジゴキシゲニンなどのハプテン、ビオチン、エストラジオール、フルオレセイン、または他のものが抱合体化されたデオキシヌクレオチド三リン酸であり、高分子量ＤＮＡに取り込みのためのポリメラーゼの基質として採用されている。同様にＮ７−またはＮ９−デアザプリンヌクレオチドまたは２′フルオロ２′デオキシヌクレオチドなどの所謂普遍ヌクレオチドなどを含む修飾ヌクレオチドは、酵素ＤＮＡ合成に採用された。同じように本発明は、本発明のプロセスにより産生される各種のタンデム配列ＤＮＡの同定および定量化のための各種の決定方法に同じく適用できる。このような検出方法の例は、必ずしもそれに限定されないが、顕微鏡または蛍光スキャナーによる蛍光検出、酵素検出、またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光計などを含む。質量標識ジデオキシＮＴＰｓは核酸研究，１９９８年６月１日；２６巻（１１号）：２８２７−８ページ）に記載されており、ここに引用例としてとり込まれている。
【００３８】
他の実施例において、本発明はレポーター分子に結合しまたタンデム配列ＤＮＡの検出に役立つ反応性分子を記載する。代替的実施例において、前記反応性分子のレポーター分子への結合は可逆性である。従来の技術に記載された可逆分子相互作用の例は、酵素：基質および抗体：ハプテン相互作用、金属イオン、温度または補因子依存性相互作用でタンパク質およびまたはＤＮＡ抱合体を伴なうもの、金属イオン：キレーター相互作用、などを含む。本発明に採用できる酵素の例は、従来の技術に習熟した者にとっては公知であり、また西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、およびルシフェラーゼを含む。
【００３９】
本発明に従って、レポーター分子の検出は、レポーターと結合しそれを認識するタンパク質部分と、追加の検出標識を含む、ＤＮＡ部分とを含有する抱合体で前記レポーター分子を結合することで達成される。代替実施例においては、前記ＤＮＡ部分は、１個またはそれ以上の検出標識を含み、または追加のポリメラーゼ伸長反応のイニシエーターとして役立つ。代替実施例においては、前記タンパク質は、二本鎖または一本鎖結合タンパク質またはアプタマーを含む。アプタマーは、標的分子と結合する一本鎖オリゴヌクレオチドである。それらは数多くの文献、例えばＭｏｌ，Ｄｉａｇｎ，１９９９年１２月，４（４）３８１−３８８ページに記載されている。
【００４０】
増幅核酸、例えばビオチンなどにとり込まれる検出標識は、従来の技術で周知の感受性法を用いて連続して検出できる。例えば、ビオチンは、ストレプトアビジンアルカリ性ホスファターゼ抱合体（トロピックス，インコーポレイテッド）を用いて検出でき、これはビオチンと結合し適当な基質の化学発光により次いで検出される（例えば化学発光基質は、ＣＳＰＤ（Ｒ）（ジソジウム３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオクスエタン−３−２′−（５′−クロロ）トリシクロ［デクロン］−４−イル｝フェニルホスフェート）；ＣＤＰ−スター（Ｒ）（ジソジウム２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオクスエタン−３−２′−（５′−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）フェニルホスフェート）、およびＡＭＰＰＤ（Ｒ）（ジソジウム３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオクスエンタン−３−２′−トリシクロ［３．３．１．１３，７］フェニルホスフェートなどがある）。（これらすべてはトロピックス，インコーポレイテッドから利用可能である。ｗｗｗ．ｔｒｏｐｉｘ．ｃｏｍ参照）。
【００４１】
これらの検出標識の２個またはそれ以上と結合する分子もまた検出標識であると考えられる。検出標識により生成される信号を検出し測定する方法は、従来の知識を有する者には公知である。例えば、放射性同位元素はシンチレーション計数または直接視覚化により検出することができ、また蛍光分子は分光光度計で検出できる。このような検出分子は増幅核酸と相互作用し、１個またはそれ以上の検出標識がそこに結合される。
【００４２】
本発明に従って形成されたタンデム配列ＤＮＡ産物のいずれかを検出するのに使用される分子の例は、必ずしもそれに限定されないが、雑種形成プローブを含むデコレーターまたは装飾作用薬、ここで開示された蛍光剤のいずれかのもの、リガンド結合分子（例えばアビジンなど）、抗体、ＦＫＢＰフォールド結合分子（例えばラパマイシンなど）、酵素、レセプター、核酸結合タンパク質（例えば転写因子など）、リボソームまたは他のＲＮＡ結合タンパク質、アフィニティー剤（例えばアプタマー、すなわちは、分子リガンドにアフィニティーを持つ核酸［マーシャル他，カレント・バイオロジー，５巻，７２９−７３４ページ（１９９７年）を検討のために参照のこと］、および従来の技術に習熟した者に公知でかつＲＣＡプライマーまたは検出標識との抱合に適した他の薬剤、などを含む。
【００４３】
本発明の一つの実施例は、図１（ステップＥ）で図形により記載されている。ここで二次ＤＮＡプライマー（Ｐ２）は、タンデムＤＮＡ産物に結合する。このようなプライマーは、前記プライマーＰ２の５′末端またはその近くに位置する配列を持ち、また当初の線型ＲＣＡにより産生されるタンデム配列ＤＮＡの部分、またはセグメントに相補である第１部分、または５′−部分を一般に持つ。二次プライマーもまた、前記プライマーＰ２の３′末端に、またはその近くに位置し、増幅標的サークル（ＡＴＣ）の部分に相補である配列を持つ第２部分または３′−部分を一般に所有し、そのＡＴＣは、本プロセスの当初の段階で使用されたＡＴＣと同じ、または類似した、もしくはそれと異なる配列を持つことができる。二次プライマーのＴＳ−ＤＮＡ相補部分は、ＴＳ−ＤＮＡのいずれの配列にも相補であることができる。しかし相互のプライマーの雑種形成を予防するために、ローリングサークル複製プライマーに適合するＴＳ−ＤＮＡ配列には相補であるべきではないことが望ましい。二次ＤＮＡプライマー（Ｐ２）の相補部分は、ＴＳ−ＤＮＡまたはＡＴＣでのいずれかで、プライマーとその相補配列の間の特異的かつ安定した雑種形成を支持するどのような長さのものであってもよい。一般には、これは長さで１２乃至３５ヌクレオチドであるが、望ましくは長さで１８乃至２５ヌクレオチドである。
【００４４】
本発明で有用なオリゴヌクレオチドとＡＴＣｓは、確立したオリゴヌクレオチド合成法を用いて合成することができる。オリゴヌクレオチドの合成法は、従来の知識で公知である。このような方法は、標準の酵素消化法からヌクレオチド断片分離までにわたることができる（例えば、サムブルック他，分子クローニング：ラボラトリーマニュアル，第二版，コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク，（１９８９年），ウー他，遺伝子バイオテクノロジーの方法（ＣＲＣプレス，ニューヨーク，ニューヨーク，１９９７年）、および組換え遺伝子発現プロトコル、分子生物学第６２巻所収、（トゥアン，編，ファーナ・プレス，トトワ，ニュージャージー，１９９７年）これらの開示は引用例としてここにとり込まれている）他、純粋に合成法としては、例えばミリゲンまたはベックマンシステム１プラスＤＮＡ合成機を使用するシアノエチルホスホルアミダイト法によるものもある（例えばミリゲン・バイオリサーチ，バーリントン，マサチューセッツのモデル８７００自動合成機、またはＡＢ１モデル３８０Ｂ）。オリゴヌクレオチドを作るのに有用な合成法は、更に生田他，マニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー，５３巻：３２３−３５６ページ（１９８４年）（ホスホトリエステルとホスファイト法）、およびナラン他，酵素学の方法，６５巻：６１０−６２０ページ（１９８０年）、（ホスホトリエステル法）により記載されている。タンパク質核酸分子は、ニールセン他，バイオコンジュゲートケミカルズ，５巻 ３−７ページ（１９９４年）に記載されたものなどの既知の方法を用いて作ることができる。
【００４５】
ここに記載されたオリゴヌクレオチドの多くのものは、安定したハイブリッド（雑種細胞）がその間に形成できるように、他のオリゴヌクレオチドまたは核酸のある部分に相補であるように設計されている。これらのハイブリッドの安定性については、レスニックおよびフライヤー・バイオケミストリー，３４巻：１０８０７−１０８１５ページ（１９９５年）、マグロー他，バイオテクニック，８巻：６７４−６７８ページ（１９９０年）、およびリシュリック他，核酸研究，１８巻：６４０９−６４１２ページ（１９９０年）に記載されたもののような既知の方法を使用して計算することができる。
【００４６】
本発明のＡＴＣ、またはオリゴヌクレオチドプライマーでさえもいずれの手段が便利であれば、それを利用してある型の固定支持部に付着する形で使用することができる。このような支持部への付着は、本発明の方法（すなわちＰＰＲＣＡ）を使用してローリングサークル増幅により産生されるタンデム配列ＤＮＡの検出を容易にするように、固定支持部に対し前記のプライマーまたはＡＴＣを付着するのに役立つある種の型の生物または他のもののポリマーなどのある分子種であることができる。
【００４７】
本発明の方法に有用なこのような固定支持部は、オリゴヌクレオチドが結合できるいずれの固定物質をも含むことができる。これはアクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタアクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキサイド、ガラス、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（Ｒ）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリアンハイドライド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、フマール酸ポリプロビル、コラーゲン、グリコサミノグリカン、およびポリアミノ酸などの物質を含む。固定相基質は、薄層フィルムまたは膜、ビート、びん、皿、繊維、織布、形状ポリマー、粒子および微粒子を含むいずれかの有用な形態を持つことができる。固定型基質の望ましい形態は、ガラススライドまたはマイクロタイタ皿（例えば標準９６ウエル皿）である。更なる準備のためには、合衆国特許第５，８５４，０３３号に記載されたものを参照されたい。
【００４８】
オリゴヌクレオチドを固定相基質に固定する方法は十分に確立されている。アドレスプローブおよび検出プローブを含むオリゴヌクレオチドは、確立された結合法を用いて、基質と結合することができる。例えば、適切な付着法は、ピーズ他，全米科学アカデミー紀要，９１巻（１１号）：５０２２−５０２６ページ（１９９４年）に記載されている。オリゴヌクレオチドを固定相基質に付着させる望ましい方法は、グオ他，核酸研究，２２巻，５４５６−５４６５ページ（１９９４年）に記載されている。
【００４９】
ＲＣＡのローリングサークル複製段階で有用なＤＮＡポリメラーゼは、プライムド一本鎖サークルのローリングサークルの複製を実行しなければならない。このようなポリメラーゼは、ここでローリングサークルＤＮＡポリメラーゼとして引用されている。ローリングサークル複製に関しては、ＤＮＡポリメラーゼが鋳型鎖に相補である鎖を置換できることが望ましく、この置換は鎖置換と名付けられ、５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を欠いている。鎖置換は、ＡＴＣの多重タンデム複製の合成をもたらすのに必要である。５′→３′のエキソヌクレアーゼ活性は、もしそれが存在するなら、合成鎖の破壊を来たすことになるであろう。開示された方法で使用されるＤＮＡポリメラーゼが、高度に進んでいることも望ましい。開示された方法での使用にＤＮＡポリメラーゼの適合性は、ローリングサークルに複製を実行するその能力を評価することにより、容易に決定することができる。望ましいローリングサークルＤＮＡポリメラーゼはバクテリオファージφ−２９ ＤＮＡポリメラーゼ（合衆国特許番号５，１９８，５４３号、５，００１，０５０号，ブランコ他）、ファージＭ２ ＤＮＡポリメラーゼ（松本他，遺伝子８４巻：２４７ページ，（１９８９年）、ファージφ−ＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ（ジャン他，全米科学アカデミー紀要，８４巻：８２８７ページ（１９８７年））、ＶＥＮＴ．ＲＴＭ．ＤＮＡポリメラーゼ（コン他，生物学化学ジャーナル．２６８巻：１９６５−１９７５（１９９３年））、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレウノ断片（ジェイコブセン他，生化学ヨーロピアン・ジャーナル４５巻：６２３−６２７ページ（１９７４年））、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ（チャタージー他，遺伝子９７巻：１３−１９ページ（１９９１年））、ＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ（ズーおよび伊藤，バイオキミカルバイオフィジカル・アクタ，１２１９巻：２６７−２７６ページ，（１９９４年）およびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素（カブードおよびベンコビッチ，カレント・バイオロジー：５巻１４９−１５７ページ（１９９５年））。φ−２９ ＤＮＡポリメラーゼがもっとも望ましい。同じく望ましいポリメラーゼは、Ｔ７生のポリメラーゼおよびＢｓｔポリメラーゼを含む。
【００５０】
ＲＣＡ期間中の鎖置換は、鎖置換因子、例えばヘリカーゼなどのようなものの使用を通じて促進することができる。一般に、例えばＤＮＡポリメラーゼがこのような因子の不在下でローリングサークル複製を実行しないとしても、鎖置換因子の存在下でローリングサークル複製を実行できるＤＮＡポリメラーゼはいずれも本発明のプロセスでの使用に適している。ＲＣＡで有用な鎖置換因子はＢＭＲＦ１ポリメラーゼアクセサリーサブユニット（鶴見他，ウイルス学ジャーナル，６７巻（１２号）７６４８−７６５３ページ（１９９３年））、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質（ツァイーデルヘルト，およびファン・デル・フリート，ウイルス学ジャーナル，６８巻（２号）：１１５８−１１６４ページ（１９９４年参照）。ヘルペス単純性ウイルスタンパク質ＩＣＰ８（ベーマーおよびレーマン，ウイルス学ジャーナル，６７巻（２号）：７１１−７１５ページ（１９９３年）；スケーライター，およびレーマン，全米科学アカデミー紀要，９１巻（２２号），１０６６５−１０６６９ページ（１９９４年））、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ；リグラーおよびロマーノ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６７巻：１３６２９−１３６３５ページを含む。
【００５１】
ローリングサークル複製を実行するためのポリメラーゼの能力は、ファイアーおよびスー，全米科学アカデミー紀要，９２巻：４６４１−４６４５ページ（１９９５年）、およびライザーディ（合衆国特許番号５，８５４，０３３号、例えば実施例１など）に記載されたものなどのような、ポリメラーゼをローリングサークル複製で使用することにより決定することができる。
【００５２】
前記に従って、本発明は核酸を選択的に増幅するためのプロセスに関し、
（ａ）プライマーＡＴＣサンプル混合物を産出するために、少なくとも１個の一本鎖非環状第１ステージオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１）と、少なくとも１個の一本鎖第１ステージ増幅標的サークル（ＡＴＣ１）を混合し、
（ｂ）雑種形成プライマー−ＡＴＣ１サンプル混合物を形成するために、オリゴヌクレオチドプライマーと増幅標的サークルの間で雑種形成を促進する条件下で前記プライマー−ＡＴＣ１サンプル混合物を培養し、また雑種形成プライマー−ＡＴＣ１複合体を形成するのに十分な時間を与え、
（ｃ）ポリメラーゼ−プライマー−ＡＴＣ１サンプル混合物を産出するために、ＤＮＡポリメラーゼと少なくとも２個のデオキシヌクレオチド三リン酸を前記雑種形成プライマー−ＡＴＣ１サンプル混合物と混合し、また一次タンデム配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ）を形成するために増幅標的サークルの複製を促進する条件下でポリメラーゼ−プライマー−ＡＴＣ１混合物を培養し、
（ｄ）Ｐ２の第１部分の一次ＴＳ−ＤＮＡへの雑種形成を促進しこれによりＴＳ−ＤＮＡ−Ｐ２複合体を形成するという条件下で、前記一次ＴＳ−ＤＮＡに存在する１個またはそれ以上の配列に相補である配列を持つ第１部分、またはセグメント、および前記一次ＴＳ−ＤＮＡに相補でない配列を持つ遊離３′−ＯＨ末端を含む第２部分、より成る少なくとも１個の第２ステージプライマーオリゴヌクレオチド（Ｐ２）を、前記ポリメラーゼ−プライマー−ＡＴＣ１混合物に加え、
（ｅ）タンデム配列−Ｐ２−ＡＴＣ混合物を形成するために、Ｐ２の前記第２部分への前記ＡＴＣ２の雑種形成を促進するという条件下で、１個またはそれ以上の第２ステージ増幅標的サークル（ＡＴＣ２）を（ｄ）の混合物に加え、ここで（ｅ）の増幅標的サークルの複製が、追加の、ここでは二次タンデム配列ＤＮＡ（つまり２０−ＴＳ−ＤＮＡ）の形成に帰着する、
ことを含むプロセスに関する。
【００５３】
本発明に従ってここで開示されるように、「第１ステージ」という用語は、一次タンデム配列ＤＮＡを形成するための線型ＲＣＡ反応の当初のステップを引用する。
【００５４】
更に本発明に従って、ここで開示された方法は増幅の一つの水準に限定するものではなく、追加のステージを容易に促進する。かくして、本発明は更に追加ステージのプライマーおよび増幅標的サークルが採用され、唯一の制約が使用者の性向と必要性に見出される増幅の追加のラウンド、またはステージに関する。
【００５５】
これらに基づいて、本発明は、選択されたＤＮＡ配列の増幅に対し既に列挙したプロセスに加えて、更に以下に述べるステップ、すなわち、
（ｆ）Ｐ３の第１部分の二次ＴＳ−ＤＮＡへの雑種形成を促進しこれによりＴＳ−ＤＮＡ−Ｐ３複合体を形成するという条件下で、前記二次ＴＳ−ＤＮＡに存在する１個またはそれ以上の配列に相補である配列を持つ第１部分、またはセグメント、および前記二次ＴＳ−ＤＮＡに相補でない配列を持つ３′−ＯＨ末端を含む第２部分、より成る少なくとも１個の第３ステージプライマーオリゴヌクレオチド（Ｐ３）を、前記ポリメラーゼ−プライマー−ＡＴＣ２混合物に加え、
（ｇ）タンデム配列−Ｐ３−ＡＴＣ３混合物を形成するために、Ｐ３の前記第２部分への前記ＡＴＣ３の雑種形成を促進するという条件下で、１個またはそれ以上の第３ステージ増幅標的サークル（ＡＴＣ３）を（ｆ）の混合物に加え、ここで（ｆ）の増幅標的サークルの複製が、三次タンデム配列ＤＮＡの形成に帰着する、
ステップを含む。
【００５６】
増幅の追加のステージまたは水準に対し、本発明は更に以下の追加のステップ、すなわち
（ｈ）Ｐ４の第１部分の三次ＴＳ−ＤＮＡへの雑種形成を促進しこれによりＴＳ−ＤＮＡ−Ｐ４複合体を形成するという条件下で、前記三次ＴＳ−ＤＮＡに存在する１個またはそれ以上の配列に相補である配列を持つ第１部分、またはセグメント、および前記三次ＴＳ−ＤＮＡに相補でない配列を持つ３′−ＯＨ末端を含む第２部分、より成る少なくとも１個の第４ステージプライマーオリゴヌクレオチド（Ｐ４）を、前記ポリメラーゼ−プライマー−ＡＴＣ３混合物を加え、
（ｉ）タンデム配列−Ｐ４−ＡＴＣ４混合物を形成するために、Ｐ４の前記第２部分への前記ＡＴＣ４の雑種形成を促進するという条件下で、１個またはそれ以上の第４ステージ増幅標的サークル（ＡＴＣ４）を（ｈ）の混合物に加え、ここで（ｈ）の増幅標的サークルの複製が、四次タンデム配列ＤＮＡの形成に帰着する、
ステップを含む。
【００５７】
もち論これは、ここに特に記載されたもの以外にも十分に通用し続けることができる。
【００５８】
このような一つの実施例において、本発明はすぐ前に記載したもののようなプロセスに関し、ここで複製を促進する前記ステップ（ｃ）の条件は、第１レポーター分子に結合するｄＮＴＰ基質の前記混合物での存在を含み、また前記第１レポーター分子がこれにより前記タンデム配列ＤＮＡにとり込まれる。このような実施例において、プライマーオリゴヌクレオチドＰ２は、前記第１レポーター分子に結合できる第１反応性分子に結合するであろう。
【００５９】
本発明のプロセスは、更に実施例を含み、この実施例では、プライマーＰ２を伸長するために使用され、そのためｄＮＴＰｓは第２レポーター分子に結合し、こうして前記第２レポーター分子は、二次タンデム配列ＤＮＡにとり込まれることになる。この実施例では、プライマーオリゴヌクレオチドＰ３は、前記第２レポーター分子に結合できる第２反応性分子に結合するであろう。
【００６０】
更なる実施例において、本発明のプロセスは状況を含み、ここでプライマーＰ３を伸長するために使用されるｄＮＴＰｓは、第３レポーター分子に結合し、このようにして前記第３レポーター分子は前に記載の三次タンデム配列ＤＮＡにとり込まれる。更にこのような実施例において、プライマーオリゴヌクレオチドＰ４は、前記第３レポーター分子に結合できる第３反応性分子に結合するであろう。
【００６１】
このプロセスは、もち論ここで記載されたように、ＰＰＲＣＡの望ましいラウンドを何回となく続けることができる。
【００６２】
本発明の実施例のいずれにおいても、ｄＮＴＰｓは、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、前記のものとは異なる自然発生ｄＮＴＰ、およびｄＮＴＰの類似体および普遍塩基を持つｄＮＴＰより成るグループから選択される部材である。
【００６３】
本発明に基づき開示されたプロセスは、多重標的配列とプライマーが使用されるような多重適用に対しきわめて有用である。最初に、プライマー（Ｐ１）は、増幅標的サークル（ＡＴＣ１）の配列のすべてまたは一部がそうであるように、お互いに異なるであろう。ここでプライマーまたはＡＴＣの後でのディジットの利用は、多数のステージでの増幅のステージ、あるいは本発明のポリプライムドＲＣＡ（またはＰＰＲＣＡ）の増幅のステージを示す。かくしてプライマーと増幅標的サークルは、与えられたステージで使用される集団内で異なることもあり、また与えられたステージで同一であるが、ステージからステージへ変る際に異なることもある。更にＰ１より後のプライマー（すなわちＰ２より先のプライマー）はすべて少なくとも２個の部分と、あるいはセグメント、または配列を持ち、その内１つは第１部分と名付けられ、実行される特定のプロセスの初期段階で合成されるＴＳ−ＤＮＡに相補的であり、また、このような初期段階で合成されたＴＳ−ＤＮＡに付着のためのプローブとして役立つ。後期のプライマーも同じく典型的には第２部分を有し、通常第１のものに隣接し、また第２のものは典型的には３′−ＯＨ基を持ち、前記プライマーの３′末端を示し、ここで前記第２部分は増幅標的サークルの少なくとも一部分に相補的である。かくして前記プライマーの第１および第２部分は、一般に異なる構造あるいは配列のものであり、もっともこれはここで開示された方法の絶対的条件ではない。
【００６４】
本発明の多重ステージプライマーは、与えられたステージまたはステージ間で同一または異なっている。同じことがここで使用された増幅標的サークルにとっても言える。
【００６５】
特異的な実施例において、与えられたステージのプライマーオリゴヌクレオチドは、すべて同じ構造（すなわち同じ配列）を持つこともある。このような場合には、この同じステージの増幅標的サークルは、同じまたは類似の構造を持つであろう。何故なら、それらはプライマーに対して相補的であるからである。Ｐ１の後では、プライマーオリゴヌクレオチドの第２部分にのみＡＴＣｓが結合するために、プライマーにとっては与えられたステージで同一の第１部分でしかし異なる第２部分を持ち、かくして同じタンデム配列ＤＮＡに結合するか、その第２部分の配列が異なる故で、ＡＴＣｓの集団を分離することが可能となる。増幅の各ラウンドがプライマーとＡＴＣの第２部分のみを使用することで生じる故に、第１部分は随意にそれまでのラウンドのＴＳ−ＤＮＡに結合して残り、本発明の方法では鎖またはプライマーの置換は必要でなくなる。
【００６６】
本発明に基づくプロセスは、更にタンデム配列ＤＮＡの存在を検出することを含む。この検出は必ずしもそれに限定されないが、複製を促進する前記（ｃ）のステップの条件が、レポーター分子に結合するｄＮＴＰ基質の混合物に存在し、また前記レポーター分子が、それにより前記タンデム配列ＤＮＡにとり込まれるプロセスを含む。望ましいレポーター分子はビオチンであり、またｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＵＴＰを含むことができる。もち論増幅の各ラウンドは、更にいずれか与えられた標的配列を検出する能力を高め、とりわけ複合標的配列か高度に特異的ではあるが、別個の検出分子またはレポーター分子を用いて同時に検出される場合にその検出能力を高める。
【００６７】
本発明は更に前に記載のプロセスに関し、しかし更にステップ（ｄ）、（ｆ）または（ｈ）のプライマーオリゴヌクレオチドを含み、ここで前記プライマーオリゴヌクレオチドは、前記レポーター分子と結合できる反応性分子と結合する。本発明の一つの実施例では、前記反応性分子は抱合体であり、望ましい実施例では抗ビオチンＤＮＡ抱合体である。
【００６８】
本発明は、更に一つのプロセスに関し、ここで前に記載した（ここに記載された方法の内ステップ（ｅ）、または（ｇ）、あるいは（ｉ）などの）複製を促進する条件は、レポーター分子に結合するｄＮＴＰ基質の混合物に存在することを含み、またここで前記レポーター分子は、これにより本発明のプロセスにより産生されるタンデム配列ＤＮＡにとり込まれる。望ましい実施例では、前記レポーター分子はＣｙ５またはＣｙ３である。ここで再度、ｄＮＴＰは、ｄＵＴＰを含む一般のｄＮＴＰｓである。
【００６９】
図２で記載したように、本発明の一実施例において、サンプルＰＰＲＣＡは、抗ビオチンＤＮＡ抱合体を使用して環化される。ここでもとのＴＳ−ＤＮＡ産物へのｄＵＴＰ（または他の適切なデオキシヌクレオシド三リン酸）での抱合体としてビオチン（または他の適切なハプテン）のとり込みは、固定化産物オリゴヌクレオチドからの産物を生じる。ＴＳ−ＤＮＡに結合する抗体ＤＮＡ抱合体を加え、これにより結合抱合体で信号検出の増加を生じ、これが一次増幅産物を検出する第２ＲＣＡ反応のための架台として役立つ。図のステップ２で示されるように、検出の第２水準は、複合タンデム配列ＤＮＡに、別の異なる信号検出分子またはレポーター分子、ここではＣｙ５を持つプライマーを加えることで与えられ、このＣｙ５は、ＲＣＡの追加のラウンドで信号増幅の増加を提供する。本発明の一つの重要な見地は、指数ＲＣＡで使用されるポリメラーゼ読み通しの間での多分枝化プライマーの鎖置換を除去することである。
【００７０】
このような一つの実施例において、増幅により検出される標的ヌクレオチドは、同じＡＴＣの部分として一緒に一本鎖環状ＤＮＡにとり込まれる。これらの同じＡＴＣｓは、次いで各連続ステージの増幅に使用することができ、また標的配列のそれぞれは、他の標的配列と同時に増幅される。
【００７１】
前記に加えて、本発明のプライマーオリゴヌクレオチドは、分枝鎖となっており、そのため単一プライマーは、数多くの分枝点の末端で１個またはそれ以上の同じまたは別個の配列を持っており、そのそれぞれは同じまたは、異なる増幅標的サークルに相補であり、もっとも有利なものとしては、前記分枝化オリゴヌクレオチドプライマーの一つの末端であり、例えば後者がここに記載された固定支持材などのようなある型の固定支持材に付着されたデンドリマーなどである。このような分枝化鎖プライマーオリゴヌクレオチドの使用は、これにより本発明の方法を用い増幅の追加の水準を提供する。
【００７２】
本発明の方法を実行するに当り、前記環状ＤＮＡは、パドロックプローブから誘導することができ、また標的配列の部分はパドロックギャップフィル手続から誘導される［ニルソン他，「パドロックプローブ：局在ＤＮＡ検出のための環状化オリゴヌクレオチド」サイエンス，２６５巻：２０８５−２０８８ページ（１９９４年），ライザーディ，合衆国特許第５，８５４，０３１号］。
【００７３】
前記の通り、本発明のこれらの実施例は、更に本発明のプロセスにより産生されるタンデム配列ＤＮＡを検出することを含む。ここで更に、前記産物を検出する際に、複製を促進するステップ（ｃ）の条件は、レポーター分子に結合する例えばｄＵＴＰを含むｄＮＴＰ基質の前記混合物での存在を含み、ここで前記レポーター分子は、これにより前記タンデム配列ＤＮＡにとり込まれる。特定の実施例において、レポーター分子はビオチンである。
【００７４】
本発明はここで直前に記載された実施例を含み、ここでステップ（ｄ）のプライマーオリゴヌクレオチドは、前記レポーター分子に結合できる反応性分子に結合する。望ましい実施例において、この反応性分子は抱合体であり、とりわけ抗ビオチンＤＮＡ抱合体である。もっとも望ましい実施例では、レポーター分子はＣｙ５である。
【００７５】
本発明の手順を実行するにあたり、特定の緩衝液、培地、試薬、細胞、培養条件その他への言及は、それを限定することを意図するものではなく、議論が提示される特殊な前後関係で、通常の知識を有する者が関心があるまたは価値があるものとして認識するすべての関連する物質を含むように読み取られるべきであることは理解されねばならない。例えば、この一つの緩衝液または培養培地をも一つのものに置換して、しかも同一ではないにしても類似の結果を達成することはしばしば可能である。従来の技術に習熟した者は、無駄な実験を行うことなく、ここで開示された方法と手順を使用して、その目的に最適に役立つようにそのような置換を行うことができるようなシステムと方法論についての十分な知識を有するであろう。
【００７６】
本発明は、これから以下の限定されない実施例にしてより更に詳細に記載されるであろう。これらの実施例の開示を適用するに際して、本発明に基づき開示される方法の他の異なる実施例も、関連する技術に習熟した者に間違いなくそれら自身を提示するものとなるであろうことは十分に留意しておかなければならない。
【００７７】
【発明を実施するための最良の形態】
（実施例１）
抗ビオチン抱合体を使用するＰＰＲＣＡ
ＰＢＳ内で５０ｎＭのＤＮＡサークルがアニーリングされ、ガラススライドでプライマーを固定された。スライドは１分、４０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、２５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭ、ＭｇＣｌ２で洗浄され、臨床デスクトップ遠心機で１分１０００ｒｐｍで遠心脱水された。
【００７８】
下記のＰＰＲＣＡ反応混合物が使用された：１Ｘシークエナーゼ反応緩衝液０．４ｍＭ ｄＡＴＰ、０．４ｍＭ ｄＣＴＰ、０．４ｍＭ ｄＧＴＰ、０．３ｍＭ ｄＴＴＰ、０．１ｍＭビオチン−１６−ｄＵＴＰ、０．０１Ｕ／μｌ Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、０．０３ｕｇ／ｍｌ ＳＳＢ、０．０５ｕＭ装飾オリゴ（５′−Ｃｙ５および３′−Ｃｙ５）。
【００７９】
ＰＰＲＣＡ反応混合物は次いでガラススライドに加えられ、３７℃で３０分培養された。約５０ｎＭのサークルが、ＰＢＳの１ｎｇ／ｕｌ、抗ビオチンＤＮＡ抱合体、０．０５％トウィーン２０、１ｍＭのＥＤＴＡで３７℃、３０分予備アニーリングされた。スライドは次いで２分、ＰＢＳ、０．０５％トウィーン２０、室温で２度洗浄され、ＰＢＳ／０．０５％トウィーン２０でリンスされた。
【００８０】
サークルと抗ビオチン抱合体の予備アニーリング混合物が次いでスライドに加えられ、３７℃で３０分培養され、スライドは２度それぞれ２分間、ＰＢＳ、０．０５％トウィーン２０で洗浄された。
【００８１】
下記のＰＰＲＣＡ反応混合物が用意された。：１Ｘシークエナーゼ反応緩衝液、０．４ｍＭ ｄＡＴＰ、０．４ｍＭ ｄＣＴＰ、０．４ｍＭ ｄＧＴＰ、０．３ｍＭ ｄＴＴＰ、０．１ｍＭ Ｃｙ５−ｄＵＴＰ、０．０１Ｕ／ｕｌ Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、０．０３ｕｇ／ｍｌ ＳＳＢ（一本鎖結合タンパク質）。
【００８２】
この混合物はスライドに加えられ、３７℃で３０分培養された。スライドは次いで２回２分２Ｘ ＳＳＣ／０．０５％トウィーン２０で室温で１０００ｒｐｍ、１分で遠心脱水された。
【００８３】
（実施例２）
装飾プライマーでのＰＰＲＣＡ
ＰＢＳ内で約５０ｎＭのサークルがガラススライド上で固定プライマーにアニーリングされ、スライドは１分、４０ｍＭトリスｐＨ７．５、２５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌで１分洗浄され、次いで臨床デスクトップ遠心機で１０００ｒｐｍ、１分遠心脱水された。
【００８４】
下記のＰＰＲＣＡ反応混合物が用意された：１Ｘシークエナーゼ反応緩衝液、０．４ｍＭ ｄＡＴＰ、０．４ｍＭ ｄＣＴＰ、０．４ｍＭ ｄＧＴＰ、０．３ｍＭ ｄＴＴＰ、０．１ｍＭ Ｃｙ５−ｄＵＴＰ、１Ｕ／ｕｌシークエナーゼ、０．０３ｕｇ／ｍｌ ＳＳＢ（一本鎖結合タンパク質）および０．０５ｕＭ装飾プライマー（５′−Ｃｙ５）。
【００８５】
この反応混合物は次いでガラススライドに加えられ、３７℃で３０分培養された。スライドは次いで２回２分、２Ｘ ＳＳＣ／０．０５％トウィーン２０で室温で洗浄され、また１Ｘ ＳＳＣでリンスされた。これは前記の通り遠心脱水された。
【図面の簡単な説明】
【図１（ａ）】本発明のポリプライムドローリングサークル増幅（ＰＰＲＣＡ）法の１実施例の概要を示す図。ここで、増幅標的サークル（ＡＴＣ）に相補である領域を持つオリゴヌクレオチドプライマーは、ＡＴＣと結合される。Ｂでは、２個が酵素、ｄＮＴＰｓなどの追加で雑種形成し、プライマーを鋳型（ｃ）としてＡＴＣに沿って伸長する。ＤはＤＮＡポリメラーゼが初期のセグメントを置換したＲＣＡプライマーの伸長を示す。Ｅでは、標的サークルと同一の領域を持つ追加のオリゴヌクレオチドプライマーと、非相補性領域とが、タンデム反復ＲＣＡ産物に雑種形成する。Ｆでは、第２増幅標的サークルがプライマー２に雑種形成し、その３′末端からＲＣＡを開始する。Ｇでは、線型ＲＣＡ産物が線型ローリングサークル足場から形成され、かくして増幅の追加の水準を提供する。
【図１（ｂ）】図１（ａ）と同じ。
【図２】抗ビオチンＤＮＡ抱合体を使用するサンプルＰＰＲＣＡ運転を示す図。ここで最初のＴＳ−ＤＮＡ産物へのｄＵＴＰ（または他の適切なデオキシヌクレオシド三リン酸）で抱合体としてビオチン（または他の適切なハプテン）のとり込みは、固定された産物からの産物に帰着する。追加抗体ＤＮＡ抱合体は、ＴＳ−ＤＮＡと結合し、これにより、一次増幅産物を検出するため第２ＲＣＡ反応の架台として役立つ結合抱合体での信号検出の増加を生じる。図のステップ２で示されるように、第２水準の検出は、複合タンデム配列ＤＮＡ産物に、異なる信号検出分子またはレポーター分子、ここでＣｙ５を所有するプライマーの追加により与えられ、このＣｙ５はＲＣＡの追加のラウンドのための信号増幅の増加を提供する。本発明の重要な見地は、それが指数ＲＣＡで使用されるポリメラーゼ読み取りの間の多分枝プライマーの鎖置換を排除することである。
【図３】本発明（ここでは抗ビオチン抱合体システム）のＰＰＲＣＡプロセスにより提供される信号強度の増加を示すプロット。ＰＰＲＣＡの信号強度は、従来の線型ローリングサークル増幅（図の左側のカラム１におけるＬＲＣＡ制御）法（Ｃｙ５−ｄＵＴＰとり込みを使用するもの）の約１００倍大きい。
【図４】蛍光標識装飾プライマーを用いる分枝ＲＣＡとタンデム配列ＤＮＡへの蛍光ｄＵＴＰとり込みを示す図。装飾プライマーはＲＣＡ産物に直接アニーリングされ、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。蛍光標識ｄＵＴＰのとり込みは、装飾プライマーの伸長と鎖置換により形成される当初のＴＳ−ＤＮＡ産物と分枝配列の両方で修飾ヌクレオチドのとり込みにより、信号強度の増加を可能にするが、ここで最初のＲＣＡでのＴＳ−ＤＮＡに結合するｄＵＴＰは、二次および高次のステージで結合したものとは異なる。
【図５】装飾プライマーを用いるＬＲＣＡ信号の増加を示すグラフ（図３と同じく左側のカラム１でのＬＲＣＡ制御）。
【発明の属する技術分野】
本出願は、２０００年５月１２日に受理された合衆国暫定特許出願番号第６０／２０４０５７の利益を主張し、その開示は全体としてここに組み込まれている。
【０００２】
本発明は、従来のローリングサークル法を上回る量と反応速度の利点を持つ生産物種の検出の向上を提供するように、ローリングサークル増幅で多段プラットフォームを確立するためのプロセスに関する。
【０００３】
【発明の背景】
標的ＤＮＡ分子を増幅する手段は、このような増幅ＤＮＡが、続くＤＮＡ配列化、クローニング、地図化、遺伝子型化、プローブの生成、および診断による同定を含む方法にしばしば利用されることが多い。
【０００４】
これまでの所、核酸の検出に基づき感受性診断検定を可能にするようにいくつかの方法が開発されてきた。その大部分はＤＮＡより成る選択された標的およびまたはプローブの増幅の周辺で設計されたものであり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自給配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、およびＱβレプリカーゼでの増幅などが含まれている（バーケンマイヤーおよびマシャヴァール，ウイルス学方法ジャーナル，３５巻：１１７−１２６ページ（１９９１年）；ランディグレン，トレンズ・ジェネティクス，９巻：１９９−２０２ページ（１９９３年））。これらの方法のいくつかは、相対的に低い量的測定の精度、とりわけ多重検定（１個以上の標的が同時に検定される場合、マルチプレックスシークエンス法）での精度の低いことに難点がある。これらの欠点は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）法により殆んど解決された。
【０００５】
これまでに、Ｍ１３などのバクテリオファージからのプラスミドまたはＤＮＡなどの環状ＤＮＡ分子を増幅するいくつかの方法が使用されてきた。その一つは、大腸菌の適切な宿主菌株でのこれら分子の増殖であり、それに続く十分立証されたプロトコルによるＤＮＡの増幅であった。（サムブルック，Ｊ．，フリッツ，Ｅ．Ｆ．，マニエイタス，Ｔ．，分子クローニング，ラボラトリーマニュアル，１９８９年，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，コールド・スプリング・ハーバー ニューヨーク）。またＰＣＲは、Ｍ１３などのバクテリオファージからのプラスミドおよびＤＮＡなどのようなＤＮＡ標的において、決まった配列を増幅するためにしばしば使用された方法であった。（ＰＣＲプロトコルズ，１９９０年，Ｍ．Ａ．イニス，Ｄ．Ｈ．ゲルファンド，Ｊ．Ｊ．スニンスキー編，アカデミック・プレス，サンディエゴ）。これらの方法のいくつかは、労力を要し、費用が高く、時間がかかり、効率が悪く、また感受性を欠いていることで難点がある。
【０００６】
これらの方法を改良したものとして、線型ローリングサークル増幅（ＬＲＣＡ）は、環状標的ＤＮＡ分子にアニーリングされたプライマーを使用し、ＤＮＡポリメラーゼが付加される。ＬＲＣＡに対する改良は、ＬＲＣＡ産物鎖に対してアニーリングする付加プライマーと共に指数ＲＣＡ（ＥＲＣＡ）の使用である。従って二本鎖ＤＮＡを産出することができ、指数増幅はＨＲＣＡとして引用される鎖置換反応を経由して起こすことができる（ライザーディ，Ｐ．Ｍ．他，ネイチャー・ジェネティクス，（１９９８年）１９巻，２２５−２３１ページ）。
【０００７】
多重検定の複合標的は、例えばウイルスまたは他の微生物である。かくしてウイルス感染患者の臨床状態は、ウイルス負荷に（例えばＨＩＶ感染で）大きく依存しており、従ってこのようなウイルス負荷を量的に決定する手段は、とりわけ価値がある。このような多重検定においては、異なる標的、例えば異なるウイルス、またはウイルスの異なる菌株の測定が正確に決定されねばならず、また異なる標的の比率が、標的配列の比率の真のインジケーターでなければならないということが重要である。このような目的のために、多重、指数核酸増幅法がしばしば用いられたが、多重ローリングサークル増幅法のみが、多重検定システムの多くの目標に合致して成功を遂げている［ライザーディ，合衆国特許番号５，８５４，０３３号参照、その開示はここで全体として引用例として組み込まれている］。
【０００８】
しかしこのような方法には過誤の源が存在し、例えば構造的差異が異なる効率に導く場合ならば、異なる事象は異なる標的配列を伴い、または産物鎖アニーリングの速度の差は、異なる標的配列で異なり、前記プライミング事象と競争する速度を変えることに導くであろう。すなわちその構造と安定性を異にする種を同時に発生する多重連続反応効果を持つ作用（その事象が連続反応の反復により拡大されるもの）、および一つのサイクルから他のサイクルへの増幅からの産出での小さな差が最終産物の比率の望ましくない大きな差に帰着するように指数的に拡大される可能性などのプライミング事象と競争する速度の変化に導くことができる。ＲＣＡ法は信号収率の故で誤りを克服した。というのは増幅収率が標的の量に比例するからである（すなわち検出効率は標的ＤＮＡの十分な量を利用できるかどうかには依存せず、そのため標的のほんの僅かな量でさえ非常に大きな信号感受性を提供することができる）。
【０００９】
ＤＮＡ増幅のためのもっとも初期の方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、これはＤＮＡの線型セグメントのみで操作し、その増幅が望ましいＤＮＡのセグメントの５′−および３′−末端の特異的プライマー配列を用いて線型セグメントを産出した。この方法を改良したものとして、線型ローリングサークル増幅法（ＬＲＣＡ）は、開環状プローブに雑種形成する標的ＤＮＡ配列を使用して複合体を形成し、それは次いで連結されて増幅標的サークルを産出し、プライマー配列とＤＮＡポリメラーゼが加えられた。増幅標的サークル（ＡＴＣ）は、そのように新しいＤＮＡが作られる鋳型を形成し、それによりＡＴＣに相補である反復配列の連続配列としてプライマー配列を伸長したが、１時間当り約数千の複製のみが生成されるだけにとどまった。ＬＲＣＡの改良は、複製補体配列に結合する追加のプライミング配列での指数ＲＣＡ（ＥＲＣＡ）の使用で増幅の新しいセンターを提供し、これにより指数的反応速度と大きく増加した増幅を提供される。指数ローリングサークル増幅（ＥＲＣＡ）は鎖置換反応のカスケードを利用するが、それは当初の一本鎖ＲＣＡ産物を鋳型として使用することに限定され、更なるＤＮＡ合成には前記産物に付着するけれども、追加のローリングサークル増幅のない個別の一本鎖プライマーを使用する。
【００１０】
これらの方法すべては、とりわけ稀有遺伝事象、例えばまれな突然変異に対し、ならびにマルチプレックス化に関する制限および柔軟な検出手順に対しての感受性の欠除という難点がある。
【００１１】
本発明の方法（ここでポリプライムドローリングサークル増幅法−ＰＰＲＣＡとして引用されるもの）は、線型ローリングサークル増幅の感受性を改良する手順を採用し、一方ＲＣＡの追加のステージ、またはプラットフォームを使用する正確な指数増幅を採用する（従ってそれによりより大きな感受性をもたらす）ことによる高い特異性を保持し、連続反応段階への信頼性を除去するが、指数ＲＮＡの利点と固相に増幅する能力を保持することにより前記の不利益を避ける。本発明は、ローリングサークル増幅法の新しい適用に高度に有用である低コスト、稀有事象に対する感受性、柔軟性、とりわけ検出試薬の使用の際の柔軟性、および汚染の低いリスクなどの利点を持つ。
【００１２】
【発明の概要】
本発明は、単一ヌクレオチド（単一ヌクレオチド多型−ＳＮＰ）としてできるだけ小さな変化、または突然変異を含む標的ＤＮＡ分子の遺伝子型での差異を検出し、同じくＤＮＡの与えられたサンプルでこのような突然変異の相対的存在の量的測定を提供する手段としての前記標的ＤＮＡ分子の選択的増幅のプロセスに関する。
【００１３】
本発明は、更に線型または指数ローリングサークル増幅の一次産物内で選択された配列を増幅するように特に設計された二次、三次、四次またはより高次の位のプラットフォームを用い、また増幅産物を検出する能力を高めるのに役立つ特化されたデテクターまたはレポーター分子と共に前記配列を増幅するその選択的増幅により、標的ＤＮＡ分子の選択的検出のための方法を提供する。
【００１４】
別個の実施例においては、本発明の方法内で有用なレポーター分子は、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテンおよび質量標識またはこれらのいずれかの組合せなどの分子を含む。
【００１５】
他の実施例においては、本発明は、異なる種類のデテクターおよびレポーター結合分子のための連続反応を提供するために、選択されたヌクレオチドを採用し、この連続反応は、生成するローリングサークル産物を検出するのに利点を提供するように選択的に構築され構成された異なるデオキシヌクレオシドリン酸、同じく無塩基ヌクレオチドを及びヌクレオシドを利用する。レポーター分子は更に酵素、フルオロフォアおよび各種の抱合体を含む。
【００１６】
本発明の更なる見地は、環状ＤＮＡ標的の増幅を高めるプロセスに関する。それは線型ローリングサークル増幅の単一プライムド鋳型環状ＤＮＡ分子への感受性を改良する。
【００１７】
【発明の説明】
本発明の方法は、一次タンデム配列（ＴＳ−ＤＮＡ）産物から発生する二次、三次、四次、およびより高次の位の増幅プロセスに起因して、非常に多く増加した増幅を提供する。このようなＤＮＡは、ローリングサークル増幅の最初または一次産物であり、またローリングサークル、または鋳型として使用される増幅標的サークル（ＡＴＣ）で見出される配列のタンデム反復を含有する無傷の一本鎖を含む。このようなタンデム配列それぞれは、それ自身をＴＳ−ＤＮＡに沿って次いで複製される追加のプライマーと結合するように役立たせることができ、各複製フォークは、その前にあるプライマーを置換し、それにより１種の指数ＲＣＡ（ローリングサークル増幅）を提供する。
【００１８】
本発明において、このようなプライマーは付着のためだけに使用され、タンデム配列と結合した後では、一次または後のＴＳ−ＤＮＡ産物のいずれかであるＤＮＡ産物は、真に指数増幅のための追加鋳型として作用する追加増幅標的サークルに付着のための追加配列を提供する。かくして増幅の速度と範囲は最初のＴＳ−ＤＮＡ産物に結合できるプライマー数に限定されず、代って、各ステージ、またはプラットフォームで増幅の追加のステージの核として作用するステージに進行する。かくして本発明に基づいて、最初または一次ＴＳ−ＤＮＡ産物に依存する各タンデム配列は、タンデム配列増幅の新しい全世代の種子として機能し、また、それから形成された各二次ＴＳ−ＤＮＡ産物も無限に追加の種子を含む。他のものと同じように、単一ヌクレオチド多型を含む増幅および稀有遺伝さえ検出する本発明のユニークな感受性を提供することが本特徴である。
【００１９】
前記に従って、本発明の一つの実施例は、一次ＲＣＡ産物に固定されたまま残り、これにより増幅の増加、同じく検出の感受も増加、および汚染の機会の減少を提供する二次増幅を持つ。他の実施例では、二次増幅は一次増幅反応と同時に起こり、適切な増幅に必要とされる数多くのステップで速度と経済性の増大を来たしている。本発明のプロセスは、ポリメラーゼリードスルー（すなわち複製フォークを進めることによる続くプライマーとその新しく合成された尾部の取り替え）に起因する二次増幅鎖の取り替えから起こる所謂高分枝ＲＣＡの不利益を克服する。
【００２０】
現在使用されるＲＣＡ手順においては、多分標的ＤＮＡ配列と結合するプライマー配列は、増幅標的サークルを形成するために追加配列との反応を許され、その大部分は図１の初期段階（Ａ乃至Ｄ段階）で示される。しかし高分枝鎖は、次いでタンデム配列ＤＮＡに沿って依存する配列に結合するプライマーを加えることで形成される（図１、Ｄ）。それらのプライマーは、ＤＮＡ合成の追加のラウンドを開始し、ＤＮＡポリメラーゼと反応して（鋳型として）ＴＳ−ＤＮＡに沿って合成される新しい鎖を形成し、新しく形成された各鎖はその前方（すなわち３′−方向で）雑種形成鎖を置換し、その結果、鋳型としてＤＮＡの長い配列が存在し、数多くの配列がその上に合成され、一方このような新規に形成された各配列は、その５′末端でその後に合成された配列により置換される。ＴＳ−ＤＮＡの新しい各セグメントは、もとのＡＴＣから予定どおりに起こるので、新しいプライマーは、そのセグメントを結合し、新しいＤＮＡ鎖を開始し、かくして新規に形成された鎖は、それが更にＡＴＣの近辺から更に除かれているように長さを増加している（例えば、図１１に示された合衆国特許番号５，８５４，０３３号を参照されたい）。
【００２１】
ここで開示されたプロセスに従って、１個またはそれ以上のプライマーを、雑種形成、共存結合またはポリヌクレオチド三倍体より成るグループから選択された化学的連結反応を通じてＴＳ−ＤＮＡ産物に付加することができる。
【００２２】
本発明のポリプライムドローリングサークル増幅法（ＰＰＲＣＡ）は、線型または高分枝ローリングサークル増幅法よりも優れた改良を提供し、そこでは、反応速度は真に事実上、指数的であり（製品が形成され、または多重出発部位から幾何学的増加量で増幅され）、一方ＲＣＡ ＴＳ−ＤＮＡ産物に結合し、または少なくとも１個の実施例では、もとのまたは一次ＴＳ−ＤＮＡ産物に類似し、または類似していない追加のタンデム配列ＤＮＡ産物を産出するために、追加の増幅標的サークルに結合する追加のセットのプライマー（Ｐ２）を使用することで鎖の置換を避ける。かくして本発明のこの方法は、増幅の一次およびその後のすべてのラウンドを効果的に分離する。
【００２３】
視点を変えて、他のＲＣＡ法においては、第２ＤＮＡ増幅は、当初のＴＳ−ＤＮＡを鋳型として使用するＤＮＡ合成を開始するプライマーから誘導され、かくしてすべての二次ＴＳ−ＤＮＡは、必ず構造的に当初の一次ＴＳ−ＤＮＡ産物の配列に関連する事になり、またそのように鎖置換が必要とされる。本発明のポリプライムドＲＣＡにおいて、二次プライマー（すなわちＰ２）は別のセグメントを持つことができ、その一つは一次ＴＳ−ＤＮＡに結合する（固定させる目的のみのための）ものであり、またすべての二次、および多分三次、四次、および高次の位のラウンドの増幅がＰ２プライマー、またはＰ３プライマー、もしくはＰ４プライマー等に結合するＡＴＣｓを増幅するように完全に異なる完全に異なった増幅標的サークル（ＡＴＣ）に相補であるプライマーとして役立つ追加のセグメントを持つことができる。ここで開示されたＰＰＲＣＡ法を使用して、反応条件が許す条件下で、望ましいできるだけ多くのステージの増幅を生成することが可能であり、ここで各ステージの増幅は、各組がヌクレオチド配列において異なるＡＴＣの潜在的に異なる組のＡＴＣｓを複製し、またここで各ステージは、そのそれぞれが複製されるＡＴＣ鋳型の組に基づいて、タンデム反復のそれ自身のコンカテマー（鎖状体）である新しいＴＳ−ＤＮＡを生成する。
【００２４】
本発明のこの方法の見本実施例は図１に記載され、これは本発明のポリプライムドローリングサークル増幅（ＰＰＲＣＡ）法の一つの実施例を図形で示している。ここでオリゴヌクレオチドプライマー（長さ約２０−５０塩基）は、増幅標的サークルに相補の領域（長さ約６５−１５０塩基）（（Ａ）参照）と、短い非相補領域を持つオリゴヌクレオチドプライマーである。Ｂでは、オリゴヌクレオチドプライマー（長さ２０−５０塩基）の相補領域は、ＬＲＣＡ（Ｃ）に記載されたように、酵素、ｄＮＴＰｓ、等を加えて増幅標的サークルに特異的に雑種形成する。（Ｄ）は初期のセグメントに置換するＤＮＡポリメラーゼを持つＲＣＡプライマーの伸長を示す。Ｅでは、標的サークル（長さ１６−５０塩基）に同一の領域と非相補領域（長さ２−１０塩基）を持つ第２オリゴヌクレオチドプライマー（長さ２０−５０塩基）が、タンデム反復ＲＣＡ産物に雑種形成する。Ｆでは、プライマー２の３′末端に相補である領域を持つ第２増幅標的サークル（長さ約７０−１５０塩基）が、プライマー２に雑種形成し、（環状鋳型に沿って）その３′末端からＲＣＡを開始する。ある実施例においては、第２増幅標的サークルは、一次ＡＴＣに配列で同一または類似である。Ｇでは、その結果は、線型ローリングサークル足場から形成され、かくして指数増幅を産出する一連の線型ＲＣＡ ＴＳ−ＤＮＡ産物になることが見られる。本発明に基づく方法は、更に三次合成および更なる増幅産物の更なる累乗法を提供する二次鎖のプライマー相補配列を採用することができる。
【００２５】
本発明に従って、オリゴヌクレオチドプライマー（プライマー１またはＰ１）は、ローリングサークル複製プライマーとして作用し、ＡＴＣに対する「プライマー相補部分」に相補である配列を持つ単なるオリゴヌクレオチドである。この配列はプライマーＰ１の「相補部分」として引用される。オリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１など）の相補部分および増幅標的サークルのプライマー補体部分は、それらが相互に相補である限り、いずれか望ましい配列を持つことができる。Ｐ１のこのような配列は、増幅標的サークルのいずれか他の部分には相補ではなく、あるいはプライマーが完全に前記ＡＴＣに結合するＡＴＣの配列の殆んどに対して相補である場合もあり、望ましくはプライマーに結合しないＡＴＣの小さなセグメントを持つこともある。
【００２６】
本発明に有用であるローリングサークル複製（ＲＣＡ）プライマー（Ｐ１）の相補部分は、プライマーとプライマー補体部分の間で、特異的また安定した雑種形成を支持するいずれかの長さのものであることができる。一般にこの長さは１０乃至３５のヌクレオチド、しかし望ましくは１６乃至２０の長さのヌクレオチドである。
【００２７】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記のとおり、ＡＴＣの部分、またはすべてに対して非相補のセグメントを持つこともある。このような非相補部分が存在する時には、ＲＣＡの間の鎖置換を促進するのに役立つ。このようなオリゴヌクレオチドプライマーの非相補部分は、いろいろな長さのものがあるが、一般的には長さ１乃至１００のヌクレオチドであり、望ましくは４乃至８ヌクレオチドの長さである。
【００２８】
本発明のプロセスに有用な増幅標的サークル（ＡＴＣ）は、環状一本鎖ＤＮＡ分子であり、一般には４０乃至１０００のヌクレオチド、望ましくは約５０乃至１５０のヌクレオチド、またもっとも望ましくは約５０乃至１００のヌクレオチドを含む。ここで開示されるプロセスに有用なＡＴＣｓは、異なる部分、またはセグメントを持つことができ、それらを異なる目的のために特に有用なものにする。このような部分の少なくとも１個は、１個またはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーに相補となるであろう。
【００２９】
ここで開示されたプロセスに有用なＡＴＣｓとして、プライマー補体部分は、増幅標的サークルの必要とされる要素である。他の部分は随意のものであり、任意に決定された配列を持つように選択することができる。不適合またはギャップなしで長さ約６個のヌクレオチド以上の相補領域のない場合という条件に合致して、ＡＴＣｓが自己相補性であるいずれの配列も持たないことが望ましい。このプロセスで有用なＡＴＣは、ライザーディ、合衆国特許第５，８５４，０３３号（その開示はここで全体として引用例で組み込まれている）、およびライザーディ他、等温ローリングサークル増幅を用いる突然変異検出と単一分子計数、ネイチャー・ジェネティクス，１９巻，２２５−２３２ページ（１９９８年）。
【００３０】
ある実施例では、例えばオリゴヌクレオチドの一つは、２個のアーム部（すなわち標的認識を随意に提供する一つのアーム部と、サークルを用いてＲＣＡの開始のためのプライマーとして随意に作用するも一つのアーム部を持つ３′−５′−３′オリゴヌクレオチド）を持つ。その源を持つこのような「双極性」（３′−５′−３′）オリゴヌクレオチドは、ライザーディ他（１９９８年前掲同書）で示されている。このような双極性プライマーは、ここで使用されるプライマーＰ１が双極性プライマーである場合のような固形基質に付着するものとしての用途を見出している。現在利用できるＲＣＡ法などとは異なり、このような双極性プライマーは本発明の方法に有用である。というのは、本発明はプライマー置換を避けるためである。かくしてもしこのようなプライマーが、指数または高分技ＲＣＡで、例えばＰ２プライマーとして採用されたとすると（高分技ＲＣＡの処置の説明についてはライザーディ他（１９９８年）参照）、置換されるべき５′末端がないために鎖置換作用は失敗するであろう（すなわち、この結果は、プライマーの双極性の故で間違った配向でＴＳ−ＤＮＡと結合するプライマーになるであろう）し、またその結果は増幅が起きないであろう。このようなＲＣＡ法において、双極性プライマーは、Ｐ１プライマーとしてのみ用途を見出す。本発明のプロセスでは、使用されるプライマーのいずれも双極性のものである。
【００３１】
ＰＰＲＣＡにおいては、増幅は各プライマーで起こり、これにより各プライマーにより複製される一次ＡＴＣ（またはＡＴＣ１）に相補であるセグメントのタンデム反復（すなわちＴＳ−ＤＮＡ）のコンカテマーを形成する。その双極性プライマーはＰ２プライマーとしての使用が利用でき、何故なら本発明の方法は鎖置換を避け、また、双極性プライマーがその各端部に３′−ＯＨを持つために、それが増幅の追加のステージでプライマーとして使用されると自動的に適切な配向にあるようにするためである。加えて、双極性プライマーが各端部に３′−ＯＨを持つために、それはややもすれば生じるかもしれない鎖の置換を短縮するのに役立つ。更に、双極性プライマーの各端部の３′−ＯＨが存在するために、ＴＳ−ＤＮＡおよび二次、またはより高い位のＡＴＣｓ（ＡＴＣ２、ＡＴＣ３、ＡＴＣ４、およびその他）の相補配列はプライマー配列内でどのような形状にも配列することができる。
【００３２】
増幅サークルのサイズ、および使用されるＤＮＡに依存して、ＰＰＲＣＡは、サークルの数（採用される特定のプライマーおよび標的配列のためにしばしば特別に決定される）、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓおよびＭｇ２＋を最適化することができる増幅（および感受性）のきわめて高い度合を達成する。この反応の産物は、（例えばサークルの領域に同一の蛍光標識オリゴヌクレオチド、または他の標識オリゴヌクレオチドを用いて）随意に装飾され検出される。
【００３３】
ＲＣＡを用いて増幅される核酸の検出と量的評価を助けるために、検出標識を増幅核酸にとり込むことができ、または検出分子のために標識を連結することができる。このような検出標識は、直接または間接的に増幅核酸と会合できるいずれかの分子であり、それはまた直接または間接的に測定および検出可能な信号となって現れる。核酸へのとり込みまたは核酸プローブに結合する多くのこのような標識は、従来の技術に習熟した者にとって既知である。その例としては，放射性同位元素、蛍光分子、酵素、抗体、およびリガンドを含む。
【００３４】
適切な蛍光標識の例は、フルオレセイン、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１、３−ジアゾル−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、ダンシルクロリド、およびローダミンを含む。望ましい蛍光標識はフルオレセイン（５−カルボキシフルオロセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）およびローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）である。これらはモレキュラー・プローブ，ユージン，オレゴンおよびリサーチ・オーガニクス，クリーブランド，オハイオなどの各種の商業源から得ることができる。
【００３５】
標識ヌクレオチドは、検出標識の望ましい形態であり、その理由は、それらが合成の間に直接ＲＣＡの産物にとり込むことができるからである。増幅ＤＮＡにとり込むことのできる検出標識の例は、ＢｒｄＵｒｄ（ホイおよびシムケ，突然変異研究，２９０巻：２１７−２３０ページ（１９９３年））、ＢｒＵＴＰ（ウォンシック他，細胞生物学ジャーナル，１２２巻：２８３−２９３ページ（１９９３年））、およびビオチンで修飾されたヌクレオチド（ランガー他、全米科学アカデミー紀要，７８巻：６６３３ページ（１９８１年））、またはジゴキシゲニンなどのような適切なハプテン（カークホーフ，アナリティカル・バイオケミストリー，２０５巻：３５９−３６４ページ（１９９２年）などのようなヌクレオチド類似体を含む。適切な蛍光標識ヌクレオチドは、フルオレセイン−イソチオシアネート−ｄＵＴＰ、シアニン−３−ｄＵＴＰおよびシアニン−５−ｄＵＴＰである（ユー他，核酸研究，２２巻：３２２６−３２３２ページ，（１９９４年））。ＤＮＡの望ましいヌクレオチド類似体検出標識は、ＢｒｄＵｒｄ（ＢＵＤＲ三リン酸、シグマ）、および望ましいヌクレオチド類似体検出標識は、ビオチン−１６−ウリジン−５′−三リン酸、（ビオチン−１６−ｄＵＴＰ、ベーリンガー・マンハイム）である。
【００３６】
かくして本発明に従って、レポーター分子は、同じプライマーまたはＴＳ−ＤＮＡの部分としてか、あるいは別個のプライマーまたはＴＳ−ＤＮＡｓの部分のいずれかとして、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、酵素、および質量標識またはこれらのいずれかの組合せより成るグループから選択される部材を含むことができる。かくしてこれは、プライマー、ＡＴＣｓまたはＴＤ−ＤＮＡ産物のいずれかの異なるＤＮＡｓを含み、ここで１個またはそれ以上のこのような構造は、標識の異なる型、または同じ型の異なる標識を、もしくは異なるが同一標識のそれぞれで標識される。例えば、１個の構造は質量標識で、また他のものは蛍光標識で、あるいはあるものは質量標識でまた他のものは異なる質量標識で、もしくはそれぞれが同じ質量標識に結合されて標識化することができた。追加として、２個またはそれ以上のポリヌクレオチド、または本発明の範囲内のオリゴヌクレオチドは、本発明の方法に従って開示されたように、同一反応混合物内で、または同じシリーズの範囲内で、このように標識される。
【００３７】
も一つの実施例において、本発明はｄＮＴＰに付着するレポーター分子の用途を特徴付け、ここで前記レポーター分子はポリメラーゼの作用によりタンデム配列ＤＮＡにとり込まれる。このようなレポーター分子は、従来の技術に記載されたもののいずれかである。例えば、ジゴキシゲニンなどのハプテン、ビオチン、エストラジオール、フルオレセイン、または他のものが抱合体化されたデオキシヌクレオチド三リン酸であり、高分子量ＤＮＡに取り込みのためのポリメラーゼの基質として採用されている。同様にＮ７−またはＮ９−デアザプリンヌクレオチドまたは２′フルオロ２′デオキシヌクレオチドなどの所謂普遍ヌクレオチドなどを含む修飾ヌクレオチドは、酵素ＤＮＡ合成に採用された。同じように本発明は、本発明のプロセスにより産生される各種のタンデム配列ＤＮＡの同定および定量化のための各種の決定方法に同じく適用できる。このような検出方法の例は、必ずしもそれに限定されないが、顕微鏡または蛍光スキャナーによる蛍光検出、酵素検出、またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光計などを含む。質量標識ジデオキシＮＴＰｓは核酸研究，１９９８年６月１日；２６巻（１１号）：２８２７−８ページ）に記載されており、ここに引用例としてとり込まれている。
【００３８】
他の実施例において、本発明はレポーター分子に結合しまたタンデム配列ＤＮＡの検出に役立つ反応性分子を記載する。代替的実施例において、前記反応性分子のレポーター分子への結合は可逆性である。従来の技術に記載された可逆分子相互作用の例は、酵素：基質および抗体：ハプテン相互作用、金属イオン、温度または補因子依存性相互作用でタンパク質およびまたはＤＮＡ抱合体を伴なうもの、金属イオン：キレーター相互作用、などを含む。本発明に採用できる酵素の例は、従来の技術に習熟した者にとっては公知であり、また西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、およびルシフェラーゼを含む。
【００３９】
本発明に従って、レポーター分子の検出は、レポーターと結合しそれを認識するタンパク質部分と、追加の検出標識を含む、ＤＮＡ部分とを含有する抱合体で前記レポーター分子を結合することで達成される。代替実施例においては、前記ＤＮＡ部分は、１個またはそれ以上の検出標識を含み、または追加のポリメラーゼ伸長反応のイニシエーターとして役立つ。代替実施例においては、前記タンパク質は、二本鎖または一本鎖結合タンパク質またはアプタマーを含む。アプタマーは、標的分子と結合する一本鎖オリゴヌクレオチドである。それらは数多くの文献、例えばＭｏｌ，Ｄｉａｇｎ，１９９９年１２月，４（４）３８１−３８８ページに記載されている。
【００４０】
増幅核酸、例えばビオチンなどにとり込まれる検出標識は、従来の技術で周知の感受性法を用いて連続して検出できる。例えば、ビオチンは、ストレプトアビジンアルカリ性ホスファターゼ抱合体（トロピックス，インコーポレイテッド）を用いて検出でき、これはビオチンと結合し適当な基質の化学発光により次いで検出される（例えば化学発光基質は、ＣＳＰＤ（Ｒ）（ジソジウム３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオクスエタン−３−２′−（５′−クロロ）トリシクロ［デクロン］−４−イル｝フェニルホスフェート）；ＣＤＰ−スター（Ｒ）（ジソジウム２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオクスエタン−３−２′−（５′−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）フェニルホスフェート）、およびＡＭＰＰＤ（Ｒ）（ジソジウム３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオクスエンタン−３−２′−トリシクロ［３．３．１．１３，７］フェニルホスフェートなどがある）。（これらすべてはトロピックス，インコーポレイテッドから利用可能である。ｗｗｗ．ｔｒｏｐｉｘ．ｃｏｍ参照）。
【００４１】
これらの検出標識の２個またはそれ以上と結合する分子もまた検出標識であると考えられる。検出標識により生成される信号を検出し測定する方法は、従来の知識を有する者には公知である。例えば、放射性同位元素はシンチレーション計数または直接視覚化により検出することができ、また蛍光分子は分光光度計で検出できる。このような検出分子は増幅核酸と相互作用し、１個またはそれ以上の検出標識がそこに結合される。
【００４２】
本発明に従って形成されたタンデム配列ＤＮＡ産物のいずれかを検出するのに使用される分子の例は、必ずしもそれに限定されないが、雑種形成プローブを含むデコレーターまたは装飾作用薬、ここで開示された蛍光剤のいずれかのもの、リガンド結合分子（例えばアビジンなど）、抗体、ＦＫＢＰフォールド結合分子（例えばラパマイシンなど）、酵素、レセプター、核酸結合タンパク質（例えば転写因子など）、リボソームまたは他のＲＮＡ結合タンパク質、アフィニティー剤（例えばアプタマー、すなわちは、分子リガンドにアフィニティーを持つ核酸［マーシャル他，カレント・バイオロジー，５巻，７２９−７３４ページ（１９９７年）を検討のために参照のこと］、および従来の技術に習熟した者に公知でかつＲＣＡプライマーまたは検出標識との抱合に適した他の薬剤、などを含む。
【００４３】
本発明の一つの実施例は、図１（ステップＥ）で図形により記載されている。ここで二次ＤＮＡプライマー（Ｐ２）は、タンデムＤＮＡ産物に結合する。このようなプライマーは、前記プライマーＰ２の５′末端またはその近くに位置する配列を持ち、また当初の線型ＲＣＡにより産生されるタンデム配列ＤＮＡの部分、またはセグメントに相補である第１部分、または５′−部分を一般に持つ。二次プライマーもまた、前記プライマーＰ２の３′末端に、またはその近くに位置し、増幅標的サークル（ＡＴＣ）の部分に相補である配列を持つ第２部分または３′−部分を一般に所有し、そのＡＴＣは、本プロセスの当初の段階で使用されたＡＴＣと同じ、または類似した、もしくはそれと異なる配列を持つことができる。二次プライマーのＴＳ−ＤＮＡ相補部分は、ＴＳ−ＤＮＡのいずれの配列にも相補であることができる。しかし相互のプライマーの雑種形成を予防するために、ローリングサークル複製プライマーに適合するＴＳ−ＤＮＡ配列には相補であるべきではないことが望ましい。二次ＤＮＡプライマー（Ｐ２）の相補部分は、ＴＳ−ＤＮＡまたはＡＴＣでのいずれかで、プライマーとその相補配列の間の特異的かつ安定した雑種形成を支持するどのような長さのものであってもよい。一般には、これは長さで１２乃至３５ヌクレオチドであるが、望ましくは長さで１８乃至２５ヌクレオチドである。
【００４４】
本発明で有用なオリゴヌクレオチドとＡＴＣｓは、確立したオリゴヌクレオチド合成法を用いて合成することができる。オリゴヌクレオチドの合成法は、従来の知識で公知である。このような方法は、標準の酵素消化法からヌクレオチド断片分離までにわたることができる（例えば、サムブルック他，分子クローニング：ラボラトリーマニュアル，第二版，コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク，（１９８９年），ウー他，遺伝子バイオテクノロジーの方法（ＣＲＣプレス，ニューヨーク，ニューヨーク，１９９７年）、および組換え遺伝子発現プロトコル、分子生物学第６２巻所収、（トゥアン，編，ファーナ・プレス，トトワ，ニュージャージー，１９９７年）これらの開示は引用例としてここにとり込まれている）他、純粋に合成法としては、例えばミリゲンまたはベックマンシステム１プラスＤＮＡ合成機を使用するシアノエチルホスホルアミダイト法によるものもある（例えばミリゲン・バイオリサーチ，バーリントン，マサチューセッツのモデル８７００自動合成機、またはＡＢ１モデル３８０Ｂ）。オリゴヌクレオチドを作るのに有用な合成法は、更に生田他，マニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー，５３巻：３２３−３５６ページ（１９８４年）（ホスホトリエステルとホスファイト法）、およびナラン他，酵素学の方法，６５巻：６１０−６２０ページ（１９８０年）、（ホスホトリエステル法）により記載されている。タンパク質核酸分子は、ニールセン他，バイオコンジュゲートケミカルズ，５巻 ３−７ページ（１９９４年）に記載されたものなどの既知の方法を用いて作ることができる。
【００４５】
ここに記載されたオリゴヌクレオチドの多くのものは、安定したハイブリッド（雑種細胞）がその間に形成できるように、他のオリゴヌクレオチドまたは核酸のある部分に相補であるように設計されている。これらのハイブリッドの安定性については、レスニックおよびフライヤー・バイオケミストリー，３４巻：１０８０７−１０８１５ページ（１９９５年）、マグロー他，バイオテクニック，８巻：６７４−６７８ページ（１９９０年）、およびリシュリック他，核酸研究，１８巻：６４０９−６４１２ページ（１９９０年）に記載されたもののような既知の方法を使用して計算することができる。
【００４６】
本発明のＡＴＣ、またはオリゴヌクレオチドプライマーでさえもいずれの手段が便利であれば、それを利用してある型の固定支持部に付着する形で使用することができる。このような支持部への付着は、本発明の方法（すなわちＰＰＲＣＡ）を使用してローリングサークル増幅により産生されるタンデム配列ＤＮＡの検出を容易にするように、固定支持部に対し前記のプライマーまたはＡＴＣを付着するのに役立つある種の型の生物または他のもののポリマーなどのある分子種であることができる。
【００４７】
本発明の方法に有用なこのような固定支持部は、オリゴヌクレオチドが結合できるいずれの固定物質をも含むことができる。これはアクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタアクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキサイド、ガラス、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（Ｒ）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリアンハイドライド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、フマール酸ポリプロビル、コラーゲン、グリコサミノグリカン、およびポリアミノ酸などの物質を含む。固定相基質は、薄層フィルムまたは膜、ビート、びん、皿、繊維、織布、形状ポリマー、粒子および微粒子を含むいずれかの有用な形態を持つことができる。固定型基質の望ましい形態は、ガラススライドまたはマイクロタイタ皿（例えば標準９６ウエル皿）である。更なる準備のためには、合衆国特許第５，８５４，０３３号に記載されたものを参照されたい。
【００４８】
オリゴヌクレオチドを固定相基質に固定する方法は十分に確立されている。アドレスプローブおよび検出プローブを含むオリゴヌクレオチドは、確立された結合法を用いて、基質と結合することができる。例えば、適切な付着法は、ピーズ他，全米科学アカデミー紀要，９１巻（１１号）：５０２２−５０２６ページ（１９９４年）に記載されている。オリゴヌクレオチドを固定相基質に付着させる望ましい方法は、グオ他，核酸研究，２２巻，５４５６−５４６５ページ（１９９４年）に記載されている。
【００４９】
ＲＣＡのローリングサークル複製段階で有用なＤＮＡポリメラーゼは、プライムド一本鎖サークルのローリングサークルの複製を実行しなければならない。このようなポリメラーゼは、ここでローリングサークルＤＮＡポリメラーゼとして引用されている。ローリングサークル複製に関しては、ＤＮＡポリメラーゼが鋳型鎖に相補である鎖を置換できることが望ましく、この置換は鎖置換と名付けられ、５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を欠いている。鎖置換は、ＡＴＣの多重タンデム複製の合成をもたらすのに必要である。５′→３′のエキソヌクレアーゼ活性は、もしそれが存在するなら、合成鎖の破壊を来たすことになるであろう。開示された方法で使用されるＤＮＡポリメラーゼが、高度に進んでいることも望ましい。開示された方法での使用にＤＮＡポリメラーゼの適合性は、ローリングサークルに複製を実行するその能力を評価することにより、容易に決定することができる。望ましいローリングサークルＤＮＡポリメラーゼはバクテリオファージφ−２９ ＤＮＡポリメラーゼ（合衆国特許番号５，１９８，５４３号、５，００１，０５０号，ブランコ他）、ファージＭ２ ＤＮＡポリメラーゼ（松本他，遺伝子８４巻：２４７ページ，（１９８９年）、ファージφ−ＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ（ジャン他，全米科学アカデミー紀要，８４巻：８２８７ページ（１９８７年））、ＶＥＮＴ．ＲＴＭ．ＤＮＡポリメラーゼ（コン他，生物学化学ジャーナル．２６８巻：１９６５−１９７５（１９９３年））、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレウノ断片（ジェイコブセン他，生化学ヨーロピアン・ジャーナル４５巻：６２３−６２７ページ（１９７４年））、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ（チャタージー他，遺伝子９７巻：１３−１９ページ（１９９１年））、ＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ（ズーおよび伊藤，バイオキミカルバイオフィジカル・アクタ，１２１９巻：２６７−２７６ページ，（１９９４年）およびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素（カブードおよびベンコビッチ，カレント・バイオロジー：５巻１４９−１５７ページ（１９９５年））。φ−２９ ＤＮＡポリメラーゼがもっとも望ましい。同じく望ましいポリメラーゼは、Ｔ７生のポリメラーゼおよびＢｓｔポリメラーゼを含む。
【００５０】
ＲＣＡ期間中の鎖置換は、鎖置換因子、例えばヘリカーゼなどのようなものの使用を通じて促進することができる。一般に、例えばＤＮＡポリメラーゼがこのような因子の不在下でローリングサークル複製を実行しないとしても、鎖置換因子の存在下でローリングサークル複製を実行できるＤＮＡポリメラーゼはいずれも本発明のプロセスでの使用に適している。ＲＣＡで有用な鎖置換因子はＢＭＲＦ１ポリメラーゼアクセサリーサブユニット（鶴見他，ウイルス学ジャーナル，６７巻（１２号）７６４８−７６５３ページ（１９９３年））、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質（ツァイーデルヘルト，およびファン・デル・フリート，ウイルス学ジャーナル，６８巻（２号）：１１５８−１１６４ページ（１９９４年参照）。ヘルペス単純性ウイルスタンパク質ＩＣＰ８（ベーマーおよびレーマン，ウイルス学ジャーナル，６７巻（２号）：７１１−７１５ページ（１９９３年）；スケーライター，およびレーマン，全米科学アカデミー紀要，９１巻（２２号），１０６６５−１０６６９ページ（１９９４年））、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ；リグラーおよびロマーノ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６７巻：１３６２９−１３６３５ページを含む。
【００５１】
ローリングサークル複製を実行するためのポリメラーゼの能力は、ファイアーおよびスー，全米科学アカデミー紀要，９２巻：４６４１−４６４５ページ（１９９５年）、およびライザーディ（合衆国特許番号５，８５４，０３３号、例えば実施例１など）に記載されたものなどのような、ポリメラーゼをローリングサークル複製で使用することにより決定することができる。
【００５２】
前記に従って、本発明は核酸を選択的に増幅するためのプロセスに関し、
（ａ）プライマーＡＴＣサンプル混合物を産出するために、少なくとも１個の一本鎖非環状第１ステージオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１）と、少なくとも１個の一本鎖第１ステージ増幅標的サークル（ＡＴＣ１）を混合し、
（ｂ）雑種形成プライマー−ＡＴＣ１サンプル混合物を形成するために、オリゴヌクレオチドプライマーと増幅標的サークルの間で雑種形成を促進する条件下で前記プライマー−ＡＴＣ１サンプル混合物を培養し、また雑種形成プライマー−ＡＴＣ１複合体を形成するのに十分な時間を与え、
（ｃ）ポリメラーゼ−プライマー−ＡＴＣ１サンプル混合物を産出するために、ＤＮＡポリメラーゼと少なくとも２個のデオキシヌクレオチド三リン酸を前記雑種形成プライマー−ＡＴＣ１サンプル混合物と混合し、また一次タンデム配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ）を形成するために増幅標的サークルの複製を促進する条件下でポリメラーゼ−プライマー−ＡＴＣ１混合物を培養し、
（ｄ）Ｐ２の第１部分の一次ＴＳ−ＤＮＡへの雑種形成を促進しこれによりＴＳ−ＤＮＡ−Ｐ２複合体を形成するという条件下で、前記一次ＴＳ−ＤＮＡに存在する１個またはそれ以上の配列に相補である配列を持つ第１部分、またはセグメント、および前記一次ＴＳ−ＤＮＡに相補でない配列を持つ遊離３′−ＯＨ末端を含む第２部分、より成る少なくとも１個の第２ステージプライマーオリゴヌクレオチド（Ｐ２）を、前記ポリメラーゼ−プライマー−ＡＴＣ１混合物に加え、
（ｅ）タンデム配列−Ｐ２−ＡＴＣ混合物を形成するために、Ｐ２の前記第２部分への前記ＡＴＣ２の雑種形成を促進するという条件下で、１個またはそれ以上の第２ステージ増幅標的サークル（ＡＴＣ２）を（ｄ）の混合物に加え、ここで（ｅ）の増幅標的サークルの複製が、追加の、ここでは二次タンデム配列ＤＮＡ（つまり２０−ＴＳ−ＤＮＡ）の形成に帰着する、
ことを含むプロセスに関する。
【００５３】
本発明に従ってここで開示されるように、「第１ステージ」という用語は、一次タンデム配列ＤＮＡを形成するための線型ＲＣＡ反応の当初のステップを引用する。
【００５４】
更に本発明に従って、ここで開示された方法は増幅の一つの水準に限定するものではなく、追加のステージを容易に促進する。かくして、本発明は更に追加ステージのプライマーおよび増幅標的サークルが採用され、唯一の制約が使用者の性向と必要性に見出される増幅の追加のラウンド、またはステージに関する。
【００５５】
これらに基づいて、本発明は、選択されたＤＮＡ配列の増幅に対し既に列挙したプロセスに加えて、更に以下に述べるステップ、すなわち、
（ｆ）Ｐ３の第１部分の二次ＴＳ−ＤＮＡへの雑種形成を促進しこれによりＴＳ−ＤＮＡ−Ｐ３複合体を形成するという条件下で、前記二次ＴＳ−ＤＮＡに存在する１個またはそれ以上の配列に相補である配列を持つ第１部分、またはセグメント、および前記二次ＴＳ−ＤＮＡに相補でない配列を持つ３′−ＯＨ末端を含む第２部分、より成る少なくとも１個の第３ステージプライマーオリゴヌクレオチド（Ｐ３）を、前記ポリメラーゼ−プライマー−ＡＴＣ２混合物に加え、
（ｇ）タンデム配列−Ｐ３−ＡＴＣ３混合物を形成するために、Ｐ３の前記第２部分への前記ＡＴＣ３の雑種形成を促進するという条件下で、１個またはそれ以上の第３ステージ増幅標的サークル（ＡＴＣ３）を（ｆ）の混合物に加え、ここで（ｆ）の増幅標的サークルの複製が、三次タンデム配列ＤＮＡの形成に帰着する、
ステップを含む。
【００５６】
増幅の追加のステージまたは水準に対し、本発明は更に以下の追加のステップ、すなわち
（ｈ）Ｐ４の第１部分の三次ＴＳ−ＤＮＡへの雑種形成を促進しこれによりＴＳ−ＤＮＡ−Ｐ４複合体を形成するという条件下で、前記三次ＴＳ−ＤＮＡに存在する１個またはそれ以上の配列に相補である配列を持つ第１部分、またはセグメント、および前記三次ＴＳ−ＤＮＡに相補でない配列を持つ３′−ＯＨ末端を含む第２部分、より成る少なくとも１個の第４ステージプライマーオリゴヌクレオチド（Ｐ４）を、前記ポリメラーゼ−プライマー−ＡＴＣ３混合物を加え、
（ｉ）タンデム配列−Ｐ４−ＡＴＣ４混合物を形成するために、Ｐ４の前記第２部分への前記ＡＴＣ４の雑種形成を促進するという条件下で、１個またはそれ以上の第４ステージ増幅標的サークル（ＡＴＣ４）を（ｈ）の混合物に加え、ここで（ｈ）の増幅標的サークルの複製が、四次タンデム配列ＤＮＡの形成に帰着する、
ステップを含む。
【００５７】
もち論これは、ここに特に記載されたもの以外にも十分に通用し続けることができる。
【００５８】
このような一つの実施例において、本発明はすぐ前に記載したもののようなプロセスに関し、ここで複製を促進する前記ステップ（ｃ）の条件は、第１レポーター分子に結合するｄＮＴＰ基質の前記混合物での存在を含み、また前記第１レポーター分子がこれにより前記タンデム配列ＤＮＡにとり込まれる。このような実施例において、プライマーオリゴヌクレオチドＰ２は、前記第１レポーター分子に結合できる第１反応性分子に結合するであろう。
【００５９】
本発明のプロセスは、更に実施例を含み、この実施例では、プライマーＰ２を伸長するために使用され、そのためｄＮＴＰｓは第２レポーター分子に結合し、こうして前記第２レポーター分子は、二次タンデム配列ＤＮＡにとり込まれることになる。この実施例では、プライマーオリゴヌクレオチドＰ３は、前記第２レポーター分子に結合できる第２反応性分子に結合するであろう。
【００６０】
更なる実施例において、本発明のプロセスは状況を含み、ここでプライマーＰ３を伸長するために使用されるｄＮＴＰｓは、第３レポーター分子に結合し、このようにして前記第３レポーター分子は前に記載の三次タンデム配列ＤＮＡにとり込まれる。更にこのような実施例において、プライマーオリゴヌクレオチドＰ４は、前記第３レポーター分子に結合できる第３反応性分子に結合するであろう。
【００６１】
このプロセスは、もち論ここで記載されたように、ＰＰＲＣＡの望ましいラウンドを何回となく続けることができる。
【００６２】
本発明の実施例のいずれにおいても、ｄＮＴＰｓは、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、前記のものとは異なる自然発生ｄＮＴＰ、およびｄＮＴＰの類似体および普遍塩基を持つｄＮＴＰより成るグループから選択される部材である。
【００６３】
本発明に基づき開示されたプロセスは、多重標的配列とプライマーが使用されるような多重適用に対しきわめて有用である。最初に、プライマー（Ｐ１）は、増幅標的サークル（ＡＴＣ１）の配列のすべてまたは一部がそうであるように、お互いに異なるであろう。ここでプライマーまたはＡＴＣの後でのディジットの利用は、多数のステージでの増幅のステージ、あるいは本発明のポリプライムドＲＣＡ（またはＰＰＲＣＡ）の増幅のステージを示す。かくしてプライマーと増幅標的サークルは、与えられたステージで使用される集団内で異なることもあり、また与えられたステージで同一であるが、ステージからステージへ変る際に異なることもある。更にＰ１より後のプライマー（すなわちＰ２より先のプライマー）はすべて少なくとも２個の部分と、あるいはセグメント、または配列を持ち、その内１つは第１部分と名付けられ、実行される特定のプロセスの初期段階で合成されるＴＳ−ＤＮＡに相補的であり、また、このような初期段階で合成されたＴＳ−ＤＮＡに付着のためのプローブとして役立つ。後期のプライマーも同じく典型的には第２部分を有し、通常第１のものに隣接し、また第２のものは典型的には３′−ＯＨ基を持ち、前記プライマーの３′末端を示し、ここで前記第２部分は増幅標的サークルの少なくとも一部分に相補的である。かくして前記プライマーの第１および第２部分は、一般に異なる構造あるいは配列のものであり、もっともこれはここで開示された方法の絶対的条件ではない。
【００６４】
本発明の多重ステージプライマーは、与えられたステージまたはステージ間で同一または異なっている。同じことがここで使用された増幅標的サークルにとっても言える。
【００６５】
特異的な実施例において、与えられたステージのプライマーオリゴヌクレオチドは、すべて同じ構造（すなわち同じ配列）を持つこともある。このような場合には、この同じステージの増幅標的サークルは、同じまたは類似の構造を持つであろう。何故なら、それらはプライマーに対して相補的であるからである。Ｐ１の後では、プライマーオリゴヌクレオチドの第２部分にのみＡＴＣｓが結合するために、プライマーにとっては与えられたステージで同一の第１部分でしかし異なる第２部分を持ち、かくして同じタンデム配列ＤＮＡに結合するか、その第２部分の配列が異なる故で、ＡＴＣｓの集団を分離することが可能となる。増幅の各ラウンドがプライマーとＡＴＣの第２部分のみを使用することで生じる故に、第１部分は随意にそれまでのラウンドのＴＳ−ＤＮＡに結合して残り、本発明の方法では鎖またはプライマーの置換は必要でなくなる。
【００６６】
本発明に基づくプロセスは、更にタンデム配列ＤＮＡの存在を検出することを含む。この検出は必ずしもそれに限定されないが、複製を促進する前記（ｃ）のステップの条件が、レポーター分子に結合するｄＮＴＰ基質の混合物に存在し、また前記レポーター分子が、それにより前記タンデム配列ＤＮＡにとり込まれるプロセスを含む。望ましいレポーター分子はビオチンであり、またｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＵＴＰを含むことができる。もち論増幅の各ラウンドは、更にいずれか与えられた標的配列を検出する能力を高め、とりわけ複合標的配列か高度に特異的ではあるが、別個の検出分子またはレポーター分子を用いて同時に検出される場合にその検出能力を高める。
【００６７】
本発明は更に前に記載のプロセスに関し、しかし更にステップ（ｄ）、（ｆ）または（ｈ）のプライマーオリゴヌクレオチドを含み、ここで前記プライマーオリゴヌクレオチドは、前記レポーター分子と結合できる反応性分子と結合する。本発明の一つの実施例では、前記反応性分子は抱合体であり、望ましい実施例では抗ビオチンＤＮＡ抱合体である。
【００６８】
本発明は、更に一つのプロセスに関し、ここで前に記載した（ここに記載された方法の内ステップ（ｅ）、または（ｇ）、あるいは（ｉ）などの）複製を促進する条件は、レポーター分子に結合するｄＮＴＰ基質の混合物に存在することを含み、またここで前記レポーター分子は、これにより本発明のプロセスにより産生されるタンデム配列ＤＮＡにとり込まれる。望ましい実施例では、前記レポーター分子はＣｙ５またはＣｙ３である。ここで再度、ｄＮＴＰは、ｄＵＴＰを含む一般のｄＮＴＰｓである。
【００６９】
図２で記載したように、本発明の一実施例において、サンプルＰＰＲＣＡは、抗ビオチンＤＮＡ抱合体を使用して環化される。ここでもとのＴＳ−ＤＮＡ産物へのｄＵＴＰ（または他の適切なデオキシヌクレオシド三リン酸）での抱合体としてビオチン（または他の適切なハプテン）のとり込みは、固定化産物オリゴヌクレオチドからの産物を生じる。ＴＳ−ＤＮＡに結合する抗体ＤＮＡ抱合体を加え、これにより結合抱合体で信号検出の増加を生じ、これが一次増幅産物を検出する第２ＲＣＡ反応のための架台として役立つ。図のステップ２で示されるように、検出の第２水準は、複合タンデム配列ＤＮＡに、別の異なる信号検出分子またはレポーター分子、ここではＣｙ５を持つプライマーを加えることで与えられ、このＣｙ５は、ＲＣＡの追加のラウンドで信号増幅の増加を提供する。本発明の一つの重要な見地は、指数ＲＣＡで使用されるポリメラーゼ読み通しの間での多分枝化プライマーの鎖置換を除去することである。
【００７０】
このような一つの実施例において、増幅により検出される標的ヌクレオチドは、同じＡＴＣの部分として一緒に一本鎖環状ＤＮＡにとり込まれる。これらの同じＡＴＣｓは、次いで各連続ステージの増幅に使用することができ、また標的配列のそれぞれは、他の標的配列と同時に増幅される。
【００７１】
前記に加えて、本発明のプライマーオリゴヌクレオチドは、分枝鎖となっており、そのため単一プライマーは、数多くの分枝点の末端で１個またはそれ以上の同じまたは別個の配列を持っており、そのそれぞれは同じまたは、異なる増幅標的サークルに相補であり、もっとも有利なものとしては、前記分枝化オリゴヌクレオチドプライマーの一つの末端であり、例えば後者がここに記載された固定支持材などのようなある型の固定支持材に付着されたデンドリマーなどである。このような分枝化鎖プライマーオリゴヌクレオチドの使用は、これにより本発明の方法を用い増幅の追加の水準を提供する。
【００７２】
本発明の方法を実行するに当り、前記環状ＤＮＡは、パドロックプローブから誘導することができ、また標的配列の部分はパドロックギャップフィル手続から誘導される［ニルソン他，「パドロックプローブ：局在ＤＮＡ検出のための環状化オリゴヌクレオチド」サイエンス，２６５巻：２０８５−２０８８ページ（１９９４年），ライザーディ，合衆国特許第５，８５４，０３１号］。
【００７３】
前記の通り、本発明のこれらの実施例は、更に本発明のプロセスにより産生されるタンデム配列ＤＮＡを検出することを含む。ここで更に、前記産物を検出する際に、複製を促進するステップ（ｃ）の条件は、レポーター分子に結合する例えばｄＵＴＰを含むｄＮＴＰ基質の前記混合物での存在を含み、ここで前記レポーター分子は、これにより前記タンデム配列ＤＮＡにとり込まれる。特定の実施例において、レポーター分子はビオチンである。
【００７４】
本発明はここで直前に記載された実施例を含み、ここでステップ（ｄ）のプライマーオリゴヌクレオチドは、前記レポーター分子に結合できる反応性分子に結合する。望ましい実施例において、この反応性分子は抱合体であり、とりわけ抗ビオチンＤＮＡ抱合体である。もっとも望ましい実施例では、レポーター分子はＣｙ５である。
【００７５】
本発明の手順を実行するにあたり、特定の緩衝液、培地、試薬、細胞、培養条件その他への言及は、それを限定することを意図するものではなく、議論が提示される特殊な前後関係で、通常の知識を有する者が関心があるまたは価値があるものとして認識するすべての関連する物質を含むように読み取られるべきであることは理解されねばならない。例えば、この一つの緩衝液または培養培地をも一つのものに置換して、しかも同一ではないにしても類似の結果を達成することはしばしば可能である。従来の技術に習熟した者は、無駄な実験を行うことなく、ここで開示された方法と手順を使用して、その目的に最適に役立つようにそのような置換を行うことができるようなシステムと方法論についての十分な知識を有するであろう。
【００７６】
本発明は、これから以下の限定されない実施例にしてより更に詳細に記載されるであろう。これらの実施例の開示を適用するに際して、本発明に基づき開示される方法の他の異なる実施例も、関連する技術に習熟した者に間違いなくそれら自身を提示するものとなるであろうことは十分に留意しておかなければならない。
【００７７】
【発明を実施するための最良の形態】
（実施例１）
抗ビオチン抱合体を使用するＰＰＲＣＡ
ＰＢＳ内で５０ｎＭのＤＮＡサークルがアニーリングされ、ガラススライドでプライマーを固定された。スライドは１分、４０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、２５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭ、ＭｇＣｌ２で洗浄され、臨床デスクトップ遠心機で１分１０００ｒｐｍで遠心脱水された。
【００７８】
下記のＰＰＲＣＡ反応混合物が使用された：１Ｘシークエナーゼ反応緩衝液０．４ｍＭ ｄＡＴＰ、０．４ｍＭ ｄＣＴＰ、０．４ｍＭ ｄＧＴＰ、０．３ｍＭ ｄＴＴＰ、０．１ｍＭビオチン−１６−ｄＵＴＰ、０．０１Ｕ／μｌ Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、０．０３ｕｇ／ｍｌ ＳＳＢ、０．０５ｕＭ装飾オリゴ（５′−Ｃｙ５および３′−Ｃｙ５）。
【００７９】
ＰＰＲＣＡ反応混合物は次いでガラススライドに加えられ、３７℃で３０分培養された。約５０ｎＭのサークルが、ＰＢＳの１ｎｇ／ｕｌ、抗ビオチンＤＮＡ抱合体、０．０５％トウィーン２０、１ｍＭのＥＤＴＡで３７℃、３０分予備アニーリングされた。スライドは次いで２分、ＰＢＳ、０．０５％トウィーン２０、室温で２度洗浄され、ＰＢＳ／０．０５％トウィーン２０でリンスされた。
【００８０】
サークルと抗ビオチン抱合体の予備アニーリング混合物が次いでスライドに加えられ、３７℃で３０分培養され、スライドは２度それぞれ２分間、ＰＢＳ、０．０５％トウィーン２０で洗浄された。
【００８１】
下記のＰＰＲＣＡ反応混合物が用意された。：１Ｘシークエナーゼ反応緩衝液、０．４ｍＭ ｄＡＴＰ、０．４ｍＭ ｄＣＴＰ、０．４ｍＭ ｄＧＴＰ、０．３ｍＭ ｄＴＴＰ、０．１ｍＭ Ｃｙ５−ｄＵＴＰ、０．０１Ｕ／ｕｌ Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、０．０３ｕｇ／ｍｌ ＳＳＢ（一本鎖結合タンパク質）。
【００８２】
この混合物はスライドに加えられ、３７℃で３０分培養された。スライドは次いで２回２分２Ｘ ＳＳＣ／０．０５％トウィーン２０で室温で１０００ｒｐｍ、１分で遠心脱水された。
【００８３】
（実施例２）
装飾プライマーでのＰＰＲＣＡ
ＰＢＳ内で約５０ｎＭのサークルがガラススライド上で固定プライマーにアニーリングされ、スライドは１分、４０ｍＭトリスｐＨ７．５、２５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌで１分洗浄され、次いで臨床デスクトップ遠心機で１０００ｒｐｍ、１分遠心脱水された。
【００８４】
下記のＰＰＲＣＡ反応混合物が用意された：１Ｘシークエナーゼ反応緩衝液、０．４ｍＭ ｄＡＴＰ、０．４ｍＭ ｄＣＴＰ、０．４ｍＭ ｄＧＴＰ、０．３ｍＭ ｄＴＴＰ、０．１ｍＭ Ｃｙ５−ｄＵＴＰ、１Ｕ／ｕｌシークエナーゼ、０．０３ｕｇ／ｍｌ ＳＳＢ（一本鎖結合タンパク質）および０．０５ｕＭ装飾プライマー（５′−Ｃｙ５）。
【００８５】
この反応混合物は次いでガラススライドに加えられ、３７℃で３０分培養された。スライドは次いで２回２分、２Ｘ ＳＳＣ／０．０５％トウィーン２０で室温で洗浄され、また１Ｘ ＳＳＣでリンスされた。これは前記の通り遠心脱水された。
【図面の簡単な説明】
【図１（ａ）】本発明のポリプライムドローリングサークル増幅（ＰＰＲＣＡ）法の１実施例の概要を示す図。ここで、増幅標的サークル（ＡＴＣ）に相補である領域を持つオリゴヌクレオチドプライマーは、ＡＴＣと結合される。Ｂでは、２個が酵素、ｄＮＴＰｓなどの追加で雑種形成し、プライマーを鋳型（ｃ）としてＡＴＣに沿って伸長する。ＤはＤＮＡポリメラーゼが初期のセグメントを置換したＲＣＡプライマーの伸長を示す。Ｅでは、標的サークルと同一の領域を持つ追加のオリゴヌクレオチドプライマーと、非相補性領域とが、タンデム反復ＲＣＡ産物に雑種形成する。Ｆでは、第２増幅標的サークルがプライマー２に雑種形成し、その３′末端からＲＣＡを開始する。Ｇでは、線型ＲＣＡ産物が線型ローリングサークル足場から形成され、かくして増幅の追加の水準を提供する。
【図１（ｂ）】図１（ａ）と同じ。
【図２】抗ビオチンＤＮＡ抱合体を使用するサンプルＰＰＲＣＡ運転を示す図。ここで最初のＴＳ−ＤＮＡ産物へのｄＵＴＰ（または他の適切なデオキシヌクレオシド三リン酸）で抱合体としてビオチン（または他の適切なハプテン）のとり込みは、固定された産物からの産物に帰着する。追加抗体ＤＮＡ抱合体は、ＴＳ−ＤＮＡと結合し、これにより、一次増幅産物を検出するため第２ＲＣＡ反応の架台として役立つ結合抱合体での信号検出の増加を生じる。図のステップ２で示されるように、第２水準の検出は、複合タンデム配列ＤＮＡ産物に、異なる信号検出分子またはレポーター分子、ここでＣｙ５を所有するプライマーの追加により与えられ、このＣｙ５はＲＣＡの追加のラウンドのための信号増幅の増加を提供する。本発明の重要な見地は、それが指数ＲＣＡで使用されるポリメラーゼ読み取りの間の多分枝プライマーの鎖置換を排除することである。
【図３】本発明（ここでは抗ビオチン抱合体システム）のＰＰＲＣＡプロセスにより提供される信号強度の増加を示すプロット。ＰＰＲＣＡの信号強度は、従来の線型ローリングサークル増幅（図の左側のカラム１におけるＬＲＣＡ制御）法（Ｃｙ５−ｄＵＴＰとり込みを使用するもの）の約１００倍大きい。
【図４】蛍光標識装飾プライマーを用いる分枝ＲＣＡとタンデム配列ＤＮＡへの蛍光ｄＵＴＰとり込みを示す図。装飾プライマーはＲＣＡ産物に直接アニーリングされ、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。蛍光標識ｄＵＴＰのとり込みは、装飾プライマーの伸長と鎖置換により形成される当初のＴＳ−ＤＮＡ産物と分枝配列の両方で修飾ヌクレオチドのとり込みにより、信号強度の増加を可能にするが、ここで最初のＲＣＡでのＴＳ−ＤＮＡに結合するｄＵＴＰは、二次および高次のステージで結合したものとは異なる。
【図５】装飾プライマーを用いるＬＲＣＡ信号の増加を示すグラフ（図３と同じく左側のカラム１でのＬＲＣＡ制御）。
Claims (31)
- 核酸配列を選択的に増幅する一つのプロセスであって、
（ａ）少なくとも１個の一本鎖非環状第１ステージオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１）と少なくとも１個の一本鎖第１ステージ増幅標的サークル（ＡＴＣ１）を混合してプライマー−ＡＴＣサンプル混合物を産生し、
（ｂ）前記プライマー−ＡＴＣ１サンプル混合物を、オリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ）と増幅標的サークル（ＡＴＣ１）の間で雑種形成を促進する条件の下で培養して雑種化プライマー−ＡＴＣ１サンプル混合物を形成し、また雑種化プライマー−ＡＴＣ１複合体への形成を通過するのに十分な時間を与え、
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼと少なくとも２個のデオキシヌクレオチド三リン酸を前記雑種化プライマー−ＡＴＣ１サンプル混合物と混合してポリメラーゼ−プライマー−ＡＴＣ１サンプル混合物を産生し、更にポリメラーゼ−プライマー−ＡＴＣ１混合物を、増幅標的サークルの複製を促進する条件の下で培養して一次タンデム配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ）を形成し、
（ｄ）前記ポリメラーゼ−プライマー−ＡＴＣ１混合物に少なくとも１個の第２ステージプライマーオリゴヌクレオチド（Ｐ２）を付加し、前記Ｐ２は前記一次ＴＳ−ＤＮＡに存在する１個またはそれ以上の配列に相補である配列を持つ第１部分、またはセグメントと、３′−ＯＨ末端を含み、前記一次ＴＳ−ＤＮＡに相補でない配列を持つ第２部分より成り、その条件の下でＰ２の前記第１部分の雑種形成を促進し、これによりＴＳ−ＤＮＡ−Ｐ２複合体を形成し、
（ｅ）１個またはそれ以上の第２ステージ増幅標的サークル（ＡＴＣ２）を（ｄ）の混合物に付加し、その条件の下で前記ＡＴＣ２の前記Ｐ２の第２部分への雑種形成を促進してタンデム配列−Ｐ２−ＡＴＣ２混合物を形成し、ここで（ｅ）の増幅標的サークルの複製が二次タンデム配列ＤＮＡの形成を生じる、
ことを含むことを特徴とするプロセス。 - 請求項１記載のプロセスであって、更に以下の追加のステップ、すなわち
（ｆ）前記ポリメラーゼ−プライマー−ＡＴＣ２混合物に少なくとも１個の第３ステージプライマーオリゴヌクレオチド（Ｐ３）を付加し、前記Ｐ３は前記二次ＴＳ−ＤＮＡに存在する１個またはそれ以上の配列に相補である配列を持つ第１部分、またはセグメントと、３′−ＯＨ末端を含み、前記二次ＴＳ−ＤＮＡに相補でない配列を持つ第２部分より成り、その条件の下でＰ３の前記第１部分の前記二次ＴＳ−ＤＮＡへの雑種形成を促進し、これによりＴＳ−ＤＮＡ−Ｐ３複合体を形成し、
（ｇ）１個またはそれ以上の第３ステージ増幅標的サークル（ＡＴＣ３）を（ｆ）の混合物に付加し、その条件の下でＰ３の前記第２部分に対して前記ＡＴＣ３の雑種形成を促進してタンデム配列−Ｐ３−ＡＴＣ３混合物を形成し、ここで（ｆ）の増幅標的サークルの複製が三次タンデム配列ＤＮＡの形成を生じる、
ステップを含むことを特徴とするプロセス。 - 請求項２記載のプロセスであって、更に以下の追加のステップ、すなわち
（ｈ）前記ポリメラーゼ−プライマー−ＡＴＣ３混合物に少なくとも１個の第４ステージプライマーオリゴヌクレオチド（Ｐ４）を付加し、前記Ｐ４は前記三次ＴＳ−ＤＮＡに存在する１個またはそれ以上の配列に相補である配列を持つ第１部分、またはセグメントと、３′−ＯＨ末端を含み、前記三次ＴＳ−ＤＮＡに相補でない配列を持つ第２部分より成り、その条件の下でＰ４の前記第１部分の前記三次ＴＳ−ＤＮＡへの雑種形成を促進し、これによりＴＳ−ＤＮＡ−Ｐ４複合体を形成し、
（ｉ）１個またはそれ以上の第４ステージ増幅標的サークル（ＡＴＣ４）を（ｈ）の混合物に付加し、その条件の下でＰ４の前記第２部分に対して前記ＡＴＣ４の雑種形成を促進してタンデム配列−Ｐ４−ＡＴＣ４混合物を形成し、ここで（ｈ）の増幅標的サークルの複製が、四次タンデム配列ＤＮＡの形成を生じる、ステップを含むことを特徴とするプロセス。 - 請求項１、２、または３記載のプロセスであって、ここで増幅標的サークルが、同一であることを特徴とするプロセス。
- 請求項１、２、または３記載のプロセスであって、ここで増幅標的サークルが、与えられたステージ内で同一であることを特徴とするプロセス。
- 請求項１、２、または３記載のプロセスであって、ここで１個のステージの増幅標的サークルが、１個またはそれ以上の他のステージの増幅標的サークルと異なることを特徴とするプロセス。
- 請求項１、２、または３記載のプロセスであって、ここで前記二次または高次ステージプライマーの第１の部分が、相互に同一であることを特徴とするプロセス。
- 請求項１、２、または３記載のプロセスであって、ここで与えられたステージ内での前記二次または高ステージプライマーの第２部分が、相互に同一であることを特徴とするプロセス。
- 請求項１、２、または３記載のプロセスであって、更にタンデム配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ）の存在を検出することを含むことを特徴とするプロセス。
- 請求項９記載のプロセスであって、ここで複製を促進するステップ（ｃ）の状態が、前記混合物内に第１レポーター分子と結合するｄＮＴＰ基質の存在を含み、またここで前記第１レポーター分子が、これにより前記タンデム配列ＤＮＡにとり込まれることを特徴とするプロセス。
- 請求項１０記載のプロセスであって、ここでプライマーオリゴヌクレオチドＰ２が、前記第１レポーター分子に結合できる第１反応性分子に結合することを特徴とするプロセス。
- 請求項１１記載のプロセスであって、ここでプライマーＰ２を伸長するのに使用されるｄＮＴＰｓが、第２レポーター分子と結合し、このようにして前記第２レポーター分子が二次タンデム配列ＤＮＡにとり込まれることになることを特徴とするプロセス。
- 請求項１２記載のプロセスであって、ここでプライマーオリゴヌクレオチドＰ３が、前記第２レポーター分子に結合できる第２反応性分子と結合することを特徴とするプロセス。
- 請求項１３記載のプロセスであって、ここでプライマーＰ３を伸張するために使用されるｄＮＴＰｓが、第３レポーター分子と結合し、このようにして前記第３レポーター分子が三次タンデム配列ＤＮＡにとり込まれることになることを特徴とするプロセス。
- 請求項１４記載のプロセスであって、ここでプライマーオリゴヌクレオチドＰ４が、前記第３レポーター分子に結合できる第３反応性分子に結合することを特徴とするプロセス。
- 請求項１、１０、１２または１４記載のプロセスであって、ここで前記ｄＮＴＰが、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、前記のものとは異なる自然発生ｄＮＴＰ、ｄＮＴＰの類似体、及び普遍塩基を持つｄＮＴＰより成るグループより選択される部材であることを特徴とするプロセス。
- 請求項１０、１２、または１４記載のプロセスであって、ここで前記レポーター分子が、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、酵素、質量標識およびこれらを組み合わせたものより成るグループから選択されることを特徴とするプロセス。
- 請求項１７記載のプロセスであって、ここで少なくとも２個の第１、第２および第３レポーター分子が、化学的に別個のものであることを特徴とするプロセス。
- 請求項１１、１３、または１５記載のプロセスであって、ここで少なくとも２個の前記第１、第２および第３反応性分子が、化学的に別個のものであることを特徴とするプロセス。
- 請求項１９記載のプロセスであって、ここで前記反応性分子が、酵素および抱合体より成るグループから選択されることを特徴とするプロセス。
- 請求項２０記載のプロセスであって、ここで前記抱合体が、抗ビオチンＤＮＡ、抗ジオキシゲニンＤＮＡ、二本鎖結合タンパク質、一本鎖結合タンパク質、およびアプタマーより成るグループから選択される部材を含むことを特徴とするプロセス。
- 請求項２１記載のプロセスであって、ここで前記結合タンパク質が、ＤＮＡまたはＲＮＡと結合することを特徴とするプロセス。
- 請求項１０、１２、または１４記載のプロセスであって、ここで前記レポーター分子が、Ｃｙ５またはＣｙ３であることを特徴とするプロセス。
- 請求項１０、１２、または１４記載のプロセスであって、ここで前記レポーター分子が、フルオロフォアであることを特徴とするプロセス。
- 請求項１、２、または３記載のプロセスであって、ここで前記プライマーが、長さで２乃至１５ヌクレオチドからのものであることを特徴とするプロセス。
- 請求項１、２、または３記載のプロセスであって、ここで前記１個またはそれ以上のプライマーが、雑種形成、共有結合またはポリヌクレオチドの三重式の形成より成るグループから選択される化学連鎖を通じてＴＳ−ＤＮＡに付着することを特徴とするプロセス。
- 請求項１、２、または３記載のプロセスであって、ここで少なくとも１個のプライマーが、双極性であることを特徴とするプロセス。
- 請求項１、２、または３記載のプロセスであって、ここで少なくとも１個のプライマーが、固体支持材に付着されることを特徴とするプロセス。
- 請求項２８記載のプロセスであって、ここで前記固体支持材が、ガラスまたはプラスチックで作られていることを特徴とするプロセス。
- 請求項１、２、または３記載のプロセスであって、ここで１個、またはそれ以上のタンデム配列ＤＮＡ産物が、検出されることを特徴とするプロセス。
- 請求項３０記載のプロセスであって、ここで前記検出が、雑種形成プローブ、フルオロフォア、リガンド結合分子、抗体、ＦＫＢＰフォールド結合分子、酵素、受容体、核酸結合タンパク質、リボソ−ムまたは他のＲＮＡ結合タンパク質、アフィニティー作用薬およびアプタマーより成るグループから選択されるデコレーターの使用により達成されることを特徴とするプロセス。
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