JP2004508340A - Ｈｌａ結合ペプチドおよびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、選択されたＭＨＣ対立遺伝子と特異的に結合し、ＭＨＣ対立遺伝子によって制限されるＴ細胞におけるＴ細胞活性化を誘導できるペプチド組成物を提供する。本ペプチドは、所望の抗原に対する免疫応答を誘起するために有用である。
Description
【０００１】
本出願は、米国特許出願第０８／５８９，１０７号の一部継続出願であり、米国特許出願第６０／０１３，８３３号、米国特許出願第０８／４５１，９１３号、および米国特許出願第０８／３４７，６１０号に関するものであり、米国特許出願第０７／９２６，６６６号の一部継続出願である米国特許出願第０８／０２７，７４６号の一部継続出願である米国特許出願第０８／１０３，３９６号の一部継続出願である米国特許出願第０８／１５９，３３９号の一部継続出願である。本出願は、米国特許出願第０８／１８６，２６６号、米国特許出願第０８／８２１，７３９号、および米国特許出願第０８／７５８，４０９号にも関するものである。上記の出願すべては参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の背景
本発明は、ウイルス性疾患および癌のような多くの病理状態の予防、治療または診断のための組成物ならびに方法に関するものである。特に、本発明は、選択性主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子を結合し、免疫応答を誘導することのできる新規のペプチドを提供する。
【０００３】
ＭＨＣ分子は、クラスＩ分子またはクラスＩＩ分子のどちらかに分類される。クラスＩＩ ＭＨＣ分子は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、マクロファージ等のような免疫応答の開始および持続に関わる細胞に主に発現する。クラスＩＩ ＭＥＣ分子は、ヘルパーＴリンパ球によって認識され、ヘルパーＴリンパ球の増殖および示される特定の免疫原性ペプチドに対する免疫応答の増幅を誘導する。クラスＩ ＭＨＣ分子は、ほとんどすべての有核細胞に発現し、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識され、その後、抗原を有する細胞を破壊する。ＣＴＬは、特に腫瘍拒絶とウイルス感染と闘う際に重要である。ＣＴＬは、無傷の外来抗原そのものよりもＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチド断片という形で抗原を認識する。抗原は、通常、細胞によって内因的に合成される必要があり、タンパク質抗原の一部は、細胞質においてペプチド小断片に分解される。これらの小ペプチドには、前ゴルジ区画に転位し、クラスＩ重鎖と相互作用して正しい折りたたみとサブユニットＪ３２ミクログロブリンとの会合を促進するものもある。その後、ペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体は、発現と可能性のある特異的なＣＴＬによる認識のために細胞表面に送達される。
【０００４】
ヒトＭＨＣクラスＩ分子であるＨＬＡ−Ａ２．１の結晶構造の研究により、ペプチド結合溝がクラスＩ重鎖のａ１ドメインとａ２ドメインの折りたたみによって形成されることが示されている（Ｂｊｏｒｋｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３２９：５０６（１９８７））。しかしながら、これらの研究では、溝へ結合するペプチドは同定されなかった。
【０００５】
ブース（Ｂｕｕｓ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：１０６５（１９８８）は、はじめにＭＨＣ由来の結合ペプチドの酸溶出のための方法を記載した。続いて、ラメンシー（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ）と彼の共同研究者（Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ、３５１：２９０（１９９１））は、クラスＩ分子に結合する自然にプロセシングされるペプチドを特徴付けるためのアプローチを開発した。他の研究者らは、質量分析法によるＢ型（Ｊａｒｄｅｔｚｋｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３５３：３２６（１９９１））およびＡ２．１型（Ｈｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２５：１２６１（１９９１））のクラスＩ分子から溶出されるペプチドについての従来の自動配列決定によって様々なＨＰＬＣ画分中のより大量のペプチドについて直接的なアミノ酸配列決定を成功させた。ＭＨＣクラスＩにおける自然にプロセシングされるペプチドの特徴付けについての総説は、ロツシュケ（Ｒｏｔｚｓｃｈｋｅ）とフォーク（Ｆａｌｋ）によって発表された（ＲｏｔｚｓｃｈｋｅとＦａｌｋ、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ、１２：４４７（１９９１））。
【０００６】
セッテ（Ｓｅｔｔｅ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＵＳＡ、８６：３２９６（１９８９）は、ＭＨＣ対立遺伝子特異的なモチーフも用いてＭＨＣ結合能を予想することができることを示した。シャエファー（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＵＳＡ、８６：４６４９（１９８９）は、ＭＨＣ結合が免疫原性に関連していることを示した。数人の著者（Ｄｅ Ｂｒｕｉｊｉｎら、Ｅｕｒ． Ｉ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２１：２９６３−２９７０（１９９１））；Ｐａｍｅｒら、９９１ Ｎａｔｕｒｅ、３５３：８５２−９５５（１９９１））は、クラスＩ結合モチーフを動物モデルにおいて可能性のある免疫原性ペプチドの同定に適用できるという予備的な証拠を提供した。所定のクラスＩイソ型の多くのヒト対立遺伝子に特異的なクラスＩモチーフは、これから説明されなければならない。これらの様々な対立遺伝子の組み合わせ頻度がヒト非近交系集団の大部分またはおそらくほとんどに及ぶ程十分高いことが望ましい。
【０００７】
当技術分野において発展しているにも関わらず、先行技術では、この研究に基づく有用なヒトペプチドを用いるワクチンまたは治療薬がいまだに提供されていない。本発明は、これらの利点または他の利点を提供する。
【０００８】
発明の概要
本発明は、ＭＨＣクラスＩ分子についての結合モチーフを有する免疫原性ペプチドを含む組成物を提供する。免疫原性ペプチドは、典型的には約８〜約１１残基であり、適切なＭＨＣ対立遺伝子によってコードされるタンパク質の結合に関わる保存残基を含む。多くの対立遺伝子特異的なモチーフが同定されている。
【０００９】
例えば、ＨＬＡ−Ａ３．２についてモチーフは、Ｎ末端からＣ末端まで、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ａ、ＴおよびＦの第１の保存残基を２番目の位置に含み、Ｋ、ＲまたはＹの第２の保存残基をＣ末端に含む。他の第１の保存残基は、Ｃ、ＧもしくはＤ、またはＥである。他の第２の保存残基は、ＨまたはＦである。第１と第２の保存残基は好ましくは６〜７残基によって隔てられている。
【００１０】
ＨＬＡ−Ａ１についてのモチーフは、Ｎ末端からＣ末端までＴ、ＳまたはＭの第１の保存残基、ＤまたはＥの第２の保存残基、およびＹの第３の保存残基を含む。他の第２の保存残基は、Ａ、ＳまたはＴである。第１と第２の保存残基は隣接しており、好ましくは６〜７残基によって第３の保存残基と隔てられている。第１と第２の保存残基が５〜６残基によって隔てられている場合に第２のモチーフは、ＥまたはＤの第１の保存残基およびＹの第２の保存残基を含む。
【００１１】
ＨＬＡ−Ａ１１についてのモチーフは、Ｎ末端からＣ末端まで、Ｔ、Ｖ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｎ、Ｃ、ＤまたはＦの第１の保存残基を二番目の位置に含み、Ｋ、Ｒ、ＹまたはＨのＣ末端保存残基を含む。第１と第２の保存残基は、好ましくは６〜７残基によって隔てられている。
【００１２】
ＨＬＡ−Ａ２４．１についてのモチーフは、Ｎ末端からＣ末端まで、Ｙ、ＦまたはＷの第１の保存残基を二番目の位置に含み、Ｆ、Ｉ、Ｗ、ＭまたはＬのＣ末端保存残基を含む。第１と第２の保存残基は、好ましくは６〜７残基によって隔てられている。
【００１３】
多くの可能性のある標的タンパク質のエピトープをこの方法で同定できる。適切な抗原の例には、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、Ｂ型肝炎コア抗原およびＢ型肝炎表面抗原（ＨＢＶｃ、ＨＢＶｓ）、Ｃ型肝炎抗原、悪性黒種抗原（ＭＡＧＥ−１）、エプスタイン・バーウイルス抗原、１型ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ １）、パピローマウイルス抗原、ラッサ熱ウイルス、結核菌（ＭＴ）、ｐ５３、ＣＥＡ、およびＨｅｒ２／ｎｅｕが含まれる。従って、ペプチドは、インビトロおよびエキソビボの両方における治療用途と診断用途用の薬学的組成物に有用である。
【００１４】
定義
「ペプチド」という用語は、本明細書において「オリゴペプチド」と互換的に用いられ、典型的には隣接するアミノ酸のαアミノ基とカルボニル基間のペプチド結合によってある残基を別の残基に結合した一連の残基を示し、典型的にはＬ−アミノ酸を示す。本発明のオリゴペプチドは長さが約１５残基未満であり、通常は約８〜約１１残基、好ましくは９残基または１０残基からなる。
【００１５】
「免疫原性ペプチド」は、ペプチドがＭＨＣ対立遺伝子を結合し、ＣＴＬ応答を誘導できるような対立遺伝子特異的なモチーフを含むペプチドである。従って免疫原性ペプチドは適切なクラスＩ ＭＨＣ分子に結合し、免疫原性ペプチドの由来となる抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導することができる。
【００１６】
「保存残基」は、ペプチドモチーフにおける特定の位置において無作為分布によって予想されるものより有意に高い頻度で出現するアミノ酸である。典型的には保存残基は、免疫原性ペプチドがＭＨＣ分子との接触点を提供しうるアミノ酸である。規定の長さのペプチド内の少なくとも１〜３個またはそれ以上、好ましくは２個の保存残基は、免疫原性ペプチドについてのモチーフを決定する。これらの残基は典型的には、ペプチド結合溝と、すなわち溝そのものの特異的なポケットに埋め込まれたそれらの側鎖とほとんど接触している。典型的には、免疫原性ペプチドは最大３個の保存残基、より通常は２個の保存残基を含む。
【００１７】
本明細書に用いられる場合の、「負の結合残基」とは、ある特定の位置において存在する場合に非結合剤または不十分な結合剤であるペプチドになり、その結果ペプチド内に適切な保存残基が存在するにも関わらずＣＴＬ応答を誘導できないアミノ酸である。
【００１８】
「モチーフ」という用語は、規定の長さ、通常約８〜約１１個のアミノ酸のペプチドにおける残基のパターンを意味し、特定のＭＨＣ対立遺伝子により認識される。各々のヒトＭＨＣ対立遺伝子についてのペプチドモチーフは、典型的には異なり、高度に保存された残基のパターンにおいて異なる。
【００１９】
対立遺伝子についての結合モチーフを高い精度で定義することができる。ある場合には、保存残基すべてがペプチドにおける適切な位置に存在し、負の結合残基が存在しない。
【００２０】
「単離した」または「生物学的に純粋な」という表現は、その天然の状態で見出される場合にそれに通常伴う構成成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を意味する。従って、本発明のペプチドは、インサイチュー環境と通常関連する物質、例えば抗原提示細胞のＭＨＣ Ｉ分子を含まない。タンパク質が同質のバンドまたは優性なバンドにまで単離された場合でさえ、所望のタンパク質とともに同時に精製される５〜１０％の範囲の非変性タンパク質の微量混入物がある。本発明の単離ペプチドは、このような内因性の同時精製されたタンパク質を含まない。
【００２１】
「残基」という用語は、アミド結合またはアミド結合模倣体によってオリゴペプチドに組み込まれるアミノ酸またはアミノ酸模倣体を意味する。
【００２２】
具体的な態様の説明
本発明は、ヒトクラスＩ ＭＨＣ（ＨＬＡと呼ぶ場合もある）対立遺伝子サブタイプの対立遺伝子特異的ペプチドモチーフの決定に関する。次いで、これらのモチーフを使用して、任意の望ましい抗原、特に抗原または自己抗原標的の可能性を有するものについてアミノ酸配列が既知である、ヒトウィルス疾患、癌または自己免疫疾患に関連する抗原からＴ細胞エピトープを規定する。
【００２３】
数多くの標的タンパク質の可能性を有するものについて、エピトープをこの方法で同定することができる。好適な抗原の例として、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、Ｂ型肝炎コア抗原および表面抗原（ＨＢＶｃ、ＨＢＶｓ）、Ｃ型肝炎抗原、エプスタイン‐バーウィルス抗原、黒色腫抗原（例、ＭＡＧＥ−１）、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）抗原およびヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）抗原、ラッサ熱ウィルス、結核菌（ＭＴ）、ｐ５３、ＣＥＡおよびＨｅｒ２／ｎｅｕが挙げられる。
【００２４】
これらの抗原のエピトープを含むペプチドを合成し、次いで、例えば、精製クラスＩ分子および放射性ヨウ素化ペプチドおよび／または空の（ｅｍｐｔｙ）クラスＩ分子を発現する細胞を使用するアッセイ法において、例えば、免疫蛍光染色およびフローマイクロ蛍光定量法、ペプチド−依存クラスＩアセンブリーアッセイ法およびペプチド競合によるＣＴＬ認識の阻害によって、適当なＭＨＣ分子に結合するそれらの能力について試験する。クラスＩ分子に結合するそのようなペプチドを、感染個体または免疫化された個体由来のＣＴＬの標的として作用する能力についてさらに評価し、またウィルス感染した標的細胞または腫瘍細胞と反応することができるＣＴＬ集団を生じることができるインビトロまたはインビトロにおける一次ＣＴＬ応答を誘発するキツネのそれらの能力を治療薬の可能性のあるものとして評価する。
【００２５】
ＭＨＣクラスＩ抗原はＨＬＡ−Ａ、ＢおよびＣ遺伝子座によってコードされる。ＨＬＡ−ＡおよびＢ抗原はほぼ等しい密度で細胞表面において発現されるが、ＨＬＡ−Ｃの発現は有意に低い（１０倍程度低い）。これらの遺伝子座は各々数多くの対立遺伝子を有する。本発明のペプチド結合モチーフは、各対立遺伝子サブタイプに比較的特異的である。
【００２６】
ペプチド系ワクチンでは、本発明のペプチドは、好ましくは、ヒト集団に広範に分布するＭＨＣ Ｉ分子によって認識されるモチーフを含む。ＭＨＣ対立遺伝子は民族および人種ごとに出現頻度が異なるので、標的ＭＨＣ対立遺伝子の選択は標的集団に依存することができる。表１は、異なる人種間のＨＬＡ−Ａ遺伝子座産物における種々の対立遺伝子頻度を示す。例えば、白人種集団の大半は４つのＨＬＡ−Ａ対立遺伝子サブタイプ、詳細にはＨＬＡ−Ａ２．１、Ａ１、Ａ３．２およびＡ２４．１に結合するペプチドでカバーできる。同様に、アジア集団の大半は第５の対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ１１．２に結合するペプチドの付加を含む。
【００２７】
【表１】
Ｂ． ＤｕＰｏｎｔ、「ＨＬＡの免疫生物学（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＨＬＡ）」、１巻、組織適合性試験（Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ） １９８７、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク１９８９から列挙した表。
＊Ｎ−黒人種、Ａ＝アジア人種、Ｃ＝白人種。括弧内の数字は分析の対象とした個体数を示す。
【００２８】
ペプチド化合物を記載するために使用する命名法は、従来の方法に従い、アミノ基を各アミノ酸残基の左側（Ｎ末端）に、カルボキシル基を右側（Ｃ末端）に示す。本発明の選択された具体的な態様を示す式において、アミノ末端基およびカルボキシル末端基は、具体的には示していないが、特に明記しない限り、生理的なｐＨ値において取ると思われる形態で存在する。アミノ酸構造式において、各残基は、一般に、標準的な３文字表記または１文字表記で表される。Ｌ型のアミノ酸残基は大文字１文字または３文字記号の最初の大文字で表され、Ｄ型のそのようなアミノ酸は小文字１文字または小文字３文字記号で表される。グリシンは非対称炭素原子がなく、単純に「Ｇｌｙ」またはＧと呼ばれる。
【００２９】
本発明のペプチドを同定するために使用される手法は、一般に、Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ， ３５１：２９０（１９９１）に開示されている方法に準拠し、これは参照として本明細書に組み入れられる。簡単に説明すると、この方法は、適当な細胞または細胞系統から、典型的には、免疫沈降または親和性クロマトグラフィーによってＭＨＣクラスＩ分子を大規模単離することを含む。当業者に同じく既知の所望のＭＨＣ分子を単離するための他の方法の例には、イオン交換クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、高速リガンドクロマトグラフィーおよび上記技術全ての組み合わせが挙げられる。
【００３０】
規定のＭＨＣ分子、特にＭＨＣクラスＩ分子を有する細胞は数多く知られており、容易に入手可能である。例えば、ヒトＥＢＶ−形質転換したＢ細胞系統は、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子の分取的単離の優れた供給源であることが示されている。十分に特徴付けられた細胞系統は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（「細胞系統およびハイブリドーマのカタログ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）」、第６版（１９８８） メリーランド州ロックビル、米国）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １９９０／１９９１ 細胞系統のカタログ（Ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ）（ＮＩＧＭＳ） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｕｔａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、ニュージャージー州カンデン；およびＡＳＨＩ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ， Ｂｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， ７５ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｓｔｒｅｅｔ Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ ０２１１５などの個人的および市販の供給元から入手可能である。表２は、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の供給源として使用するのに好適なＢ細胞系統をいくつか列挙する。これらの細胞系統は全て大規模バッチで増殖させることができるので、ＭＨＣ分子の大規模産生に有用である。当業者は、これらは単に例示的にすぎない細胞系統であること、および多数の他の細胞起源を使用することができることを認識している。ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃの同型接合体である同様のＥＢＶ Ｂ細胞系統は、それぞれＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子起源として働くと思われる。
【００３１】
【表２】ヒト細胞系統（ＬＩＬＡ−Ａ起源）
【００３２】
典型的な場合には、所望の対立遺伝子を単離するために免疫沈降を使用する。使用する抗体の特異性に依存して、数多くのプロトコールを使用することができる。例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ分子を親和性精製するために、対立遺伝子特異的ｍＡｂ試薬を使用することができる。ＨＬＡ−Ａ分子を単離するためのｍＡｂ試薬はいくつか入手可能である（表３）。従って、標的とするＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の各々について、ＨＬＡ−Ａ分子を直接単離するために使用することができる試薬が入手可能である。標準的な技術を使用してこれらのｍＡｂを用いて調製される親和性カラムをうまく使用して、それぞれのＨＬＡ−Ａ対立遺伝子産物を精製する。
【００３３】
以下の実施例のセクションに記載されているように、対立遺伝子−特異的なｍＡｂ以外に、Ｗ６／３２およびＢ９．１２．１などの反応性の広い抗ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ ｍＡｂ並びに１つの抗ＨＬＡ−Ｂ、Ｃ ｍＡｂ、Ｂ１．２３．２を別の親和性精製プロトコールに使用してもよい。
【００３４】
【表３】抗体試薬
【００３５】
単離されたＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合したペプチドは、典型的には、酸処理を使用して溶出される。ペプチドはまた、加熱、ｐＨ、界面活性剤、塩、カオトロピック剤、またはそれらの組み合わせなどの種々の標準的な変性手段によってクラスＩ分子から解離させることができる。
【００３６】
ペプチド分画は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってＭＨＣ分子からさらに分離され、配列が決定される。ろ過、限外ろ過、電気泳動、サイズクロマトグラフィー、特異的な抗体による沈降、イオン交換クロマトグラフィー、等電点分画電気泳動法等を含む、当業者に既知の他の種々の標準的な手段によってペプチドを分離することができる。
【００３７】
単離したペプチドの配列決定は、エドマン（Ｅｄｍａｎ）分解（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ， Ｍ． Ｗ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ９１， ３９９ （１９８３））などの標準的な技術により実施することができる。配列決定するのに好適な他の方法には、以前に記載されている個々のペプチドの質量分析法による配列決定が挙げられる（参照として本明細書に組み入れられている、Ｈｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２５： １２６１ （１９９２））。異なるクラスＩ分子からバルク状の不均質なペプチドのアミノ酸配列決定すると（例えば、プールされたＨＰＬＣ分画）、典型的には、各クラスＩ対立遺伝子の特徴的な配列モチーフが明らかにされる。
【００３８】
異なるクラスＩ対立遺伝子に特異的なモチーフが規定されると、そのアミノ酸配列が既知である抗原タンパク質からペプチドエピトープの可能性を有するものを単離することができる。典型的には、ペプチドエピトープの可能性を有するものの同定は、最初に、モチーフの存在について所望の抗原のアミノ酸配列をスキャンするためのコンピュータを使用して実施される。次いで、エピトープ配列を合成する。ＭＨＣクラス分子に結合する能力を種々の異なる方法で測定する。１つの手段は、例えば、上記の関連する用途に記載されているクラスＩ分子結合アッセイ法である。文献に記載されている別法には、抗原提示の阻害（Ｓｅｔｔｅら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４１： ３８９３ （１９９１））、インビトロアセンブリーアッセイ法（Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、Ｃｅｌｌ， ６２： ２８５ （１９９０））およびＲＭＡ．Ｓなどの変異細胞を使用するＦＡＣＳに基づいたアッセイ法（Ｍｅｌｉｅｆら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２１： ２９６３ （１９９１））が挙げられる。
【００３９】
次に、ＭＨＣクラスＩ結合アッセイ法において陽性の試験結果を示すペプチドを、インビトロにおいて特異的なＣＴＬ応答を誘導するペプチドの能力についてアッセイする。例えば、ペプチドと共にインキュベーションされた抗原提示細胞を、応答細胞集団におけるＣＴＬ応答を誘導する能力についてアッセイすることができる。抗原提示細胞は末梢血液単核細胞または樹状細胞などの正常な細胞であってもよい（Ｉｎａｂａら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １６６： １８２（１９８７）、Ｂｏｏｇ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １８： ２１９ （１９８８））。
【００４０】
または、インビトロにおける一次ＣＴＬ応答を誘導するペプチドの能力を試験するために、ペプチドを添加する場合には、マウス細胞系統ＲＭＡ−Ｓ（Ｋａｒｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ， ３１９： ６７５ （１９８６）；Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２１： ２９６３−２９７０ （１９９１））およびヒト体細胞Ｔ細胞ハイブリドーマ、Ｔ−２（Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏら、Ｎａｔｕｒｅ， ３４５： ４４９−４５２（１９９０））などの、内部的に処理されたペプチドを有するクラスＩ分子を負荷する能力が欠損し、適当なヒトクラスＩ遺伝子がトランスフェクトされている突然変異哺乳類細胞系統が便利に使用される。使用可能な他の真核細胞系統には、蚊の幼虫（ＡＴＣＣ 細胞系統 １２５， １２６， １６６０， １５９１， ６５８５， ６５８６）、カイコ（ＡＴＴＣ ＣＲＬ ８８５１）、ヨトウムシ（ａｒｍｙｗｏｒｍ）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）、ガ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８０）およびシュナイダー細胞系統（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｊ． Ｅｍｂｒｙｏｌ． Ｅｘｐ． Ｍｏｒｐｈｏｌ．， ２７： ３５３−３６５［１９２７］）などのショウジョウバエ細胞系統などの種々の昆虫細胞系統が挙げられる。それは、適当なヒトクラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子をコードする遺伝子およびヒトＢ２マイクログロブリン遺伝子でトランスフェクトされている。
【００４１】
末梢血リンパ球は、便利なことに、正常なドナーまたは患者の単純な静脈穿刺または白血球分離により単離され、ＣＴＬ前駆体の応答細胞起源として使用される。一態様において、適当な抗原提示細胞を、適当な培養条件下において無血清培地で１０〜１００μＭのペプチドと共に４時間インキュベーションする。次いで、ペプチド負荷した抗原提示細胞を、最適な培養条件下において応答細胞集団と共にインビトロにおいて７〜１０日間インキュベーションする。放射性標識した標的細胞を死滅させるＣＴＬの存在、特異的なペプチド−パルス標識した（ｐｕｌｓｅｄ）標的並びにペプチド配列を誘導する関連ウィルスまたは腫瘍抗原の内因的に処理された形態を発現する標的細胞について、培養物をアッセイすることによって陽性のＣＴＬ活性化を測定することができる。
【００４２】
ＣＴＬの特異性およびＭＨＣ制限性は、適当または不適当なヒトＭＨＣクラスＩを発現する異なるペプチド標的細胞に対して試験することによって測定される。ＭＨＣ結合アッセイ法において陽性の試験結果を示し、特異的なＣＴＬ応答を生じるペプチドは本明細書において免疫原性ペプチドと呼ぶ。
【００４３】
免疫原性ペプチドは合成もしくは組換えＤＮＡ技術によって作製することも、またはウィルス全体または腫瘍などの天然起源から単離することもできる。ペプチドは、好ましくは、他の天然型宿主細胞タンパク質およびそれらの断片を実質的に含有しないが、ある態様では、ペプチドを未変性の断片または粒子に合成により結合させることもある。ポリペプチドまたはペプチドは種々の鎖長であっても、中性（非荷電）の形態または塩である形態であってもよく、グリコシル化、側鎖の酸化もしくはリン酸化などの改変を含有しなくても、または本明細書に記載するように改変がポリペプチドの生物学的活性を破壊しない状態を条件としてこれらの改変を含有してもよい。
【００４４】
望ましくは、大型のペプチドの生物学的活性の実質的に全てを維持する限りは、ペプチドは可能な限り小型であると考えられる。可能な場合には、本発明のペプチドを鎖長９または１０のアミノ酸残基、ＣＣＬ １２５、１２６、１６６０、１５９１、６５８５， ６５８６）、カイコ（ＡＴＴＣ ＣＲＬ ８８５１）、ヨトウムシ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）、ガ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８０）およびシュナイダー細胞系統（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｊ． Ｅｍｂｒｙｏｌ． Ｅｘｐ． Ｍｏｒｐｈｏｌ．， ２７： ３５３−３６５ （１９２７）参照）などのショウジョウバエ細胞系統に最適化することが望ましいことがある。それは、適当なヒトクラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子をコードする遺伝子およびヒトＢ２マイクログロブリン遺伝子でトランスフェクトされている。
【００４５】
末梢血リンパ球は、便利なことに、正常なドナーまたは患者の単純な静脈穿刺または白血球分離により単離され、ＣＴＬ前駆体の応答細胞起源として使用される。一態様において、適当な抗原提示細胞を、適当な培養条件下において無血清培地で１０〜１００μＭのペプチドと共に４時間インキュベーションする。次いで、ペプチド負荷した抗原提示細胞を、最適な培養条件下において応答細胞集団と共にインビトロにおいて７〜１０日間インキュベーションする。放射性標識した標的細胞を死滅させるＣＴＬの存在、特異的なペプチド−パルス標識した（ｐｕｌｓｅｄ）標的並びにペプチド配列を誘導する関連ウィルスまたは腫瘍抗原の内因的に処理された形態を発現する標的細胞について、培養物をアッセイすることによって陽性のＣＴＬ活性化を測定することができる。
【００４６】
ＣＴＬの特異性およびＭＨＣ制限性は、適当または不適当なヒトＭＨＣクラスＩを発現する異なるペプチド標的細胞に対して試験することによって測定される。ＭＨＣ結合アッセイ法において陽性の試験結果を示し、特異的なＣＴＬ応答を生じるペプチドは本明細書において免疫原性ペプチドと呼ぶ。
【００４７】
免疫原性ペプチドは合成もしくは組換えＤＮＡ技術によって作製することも、またはウィルス全体または腫瘍などの天然起源から単離することもできる。ペプチドは、好ましくは、他の天然型宿主細胞タンパク質およびそれらの断片を実質的に含有しないが、ある態様では、ペプチドを未変性の断片または粒子に合成により結合させることもある。ポリペプチドまたはペプチドは種々の鎖長であっても、中性（非荷電）の形態または塩である形態であってもよく、グリコシル化、側鎖の酸化もしくはリン酸化などの改変を含有しなくても、または本明細書に記載するように改変がポリペプチドの生物学的活性を破壊しない状態を条件としてこれらの改変を含有してもよい。
【００４８】
望ましくは、大型のペプチドの生物学的活性の実質的に全てを維持する限りは、ペプチドは可能な限り小型であると考えられる。可能な場合には、細胞表面のＭＨＣクラスＩ分子に結合する内因的に処理されたウィルスペプチドまたは腫瘍細胞ペプチドとサイズが同じである、鎖長９または１０のアミノ酸残基に本発明のペプチドを最適化することが望ましいことがある。
【００４９】
所望の活性を有するペプチドは、適宜、改変して、ある種の所望の特性を提供することができる、例えば、薬理学的な特性が改善されるが、所望のＭＨＣ分子に結合し、適当なＴ細胞を活性化する未改変ペプチドの生物学的活性の実質的に全てを増加または少なくとも維持する。例えば、ペプチドに保存的はまた非保存的置換などの種々の変化を実施することができ、この場合には、このような変化は、ＭＨＣ結合の改善などの使用時の利点を提供すると思われる。保存的置換は、アミノ酸残基を、生物学的および／または化学的に類似した別のアミノ酸残基と置換する、例えば、疎水性残基を別の疎水性残基と置換し、または極性残基を別の極性残基と置換することを意味する。置換には、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組み合わせが挙げられる。１つのアミノ酸置換の影響はまた、Ｄ−アミノ酸を使用して探索することができる。このような改変は、例えば、参照として本明細書に組み入れられているＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３２： ３４１−３４７（１９８６）、ＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， 「ペプチド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」， ＧｒｏｓｓおよびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編（Ｎ．Ｙ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）， ｐｐ． １−２８４（１９７９）；ならびにＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ， 「固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」， （Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌ．， Ｐｉｅｒｃｅ）， 第２版（１９８４）に記載されているように、既知のペプチド合成手法を使用して実施することができる。
【００５０】
ペプチドは、例えば、アミノ酸の付加または欠損によって、化合物のアミノ酸配列を伸長または減少することによっても改変することができる。本発明のペプチドまたは類似物はある種の残基の順序または組成を変更することによっても改変することができ、例えば、重要な接触部位におけるものまたは保存された残基のような、生物学的活性に必須なある種のアミノ酸残基は、生物学的活性に有害な影響を与えない限り、一般に変更しなくてもよいことは容易に理解される。重要でないアミノ酸はＬ−α−アミノ酸またはそれらのＤ−異性体などのタンパク質に天然に生ずるものに限られる必要はなく、β−γ−δ−アミノ酸およびＬ−α−アミノ酸の多数の誘導体などの非天然型アミノ酸を同様に含んでもよい。
【００５１】
典型的には、１つのアミノ酸置換を有する一連のペプチドを使用して、結合に対する静電荷、疎水性等の影響を求める。例えば、一連の正電荷（例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ）または負電荷（例えば、Ｇｌｕ）アミノ酸置換はペプチド鎖に実施され、種々のＭＨＣ分子およびＴ細胞受容体に対する感受性の異なるパターンを明らかにする。また、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏまたは同様の残基などの小型で比較的中性の部分を使用する多重置換を使用することができる。置換はホモ−オリゴマーまたはヘテロ−オリゴマーであってもよい。置換または付加される残基の数および種類は、必須の接触点の間に必要な空間および検討されるある種の機能的特質（例えば、疎水性および親水性）に依存する。親ペプチドの親和性と比較したとき、ＭＨＣ分子またはＴ細胞受容体に対する高い結合親和性もこのような置換によって達成することができる。任意の事象において、このような置換は、結合を妨害する可能性のある、例えば、立体障害および荷電障害を回避するために選択されるアミノ酸残基または他の分子断片を使用するべきである。
【００５２】
アミノ酸置換は典型的には、１残基である。置換、欠損、挿入または任意のそれらの組み合わせを組み合わせて、最終的なペプチドに到達することができる。置換種は、ペプチドの少なくとも１つの残基が除去されており、異なる残基がその位置に挿入されるものである。ペプチドの特徴を微妙に調節することが望ましい場合には、このような置換は、一般に、以下の表４により実施される。
【００５３】
【表４】
【００５４】
機能の実質的な変化（例えば、ＭＨＣ分子またはＴ細胞受容体に対する親和性）は、表４のものより保存性の低い置換を選択することによって、すなわち、（ａ）例えば、シートまたはヘリックス立体配座のような、置換領域のペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の荷電もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさばりを維持することに対する影響がより大きく異なる残基を選択することによって実施される。ペプチドの特性の最も大きな変化を生ずることが期待される置換は、（ａ）親水性残基、例えば、セリルが疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルもしくはアラニルから（または、によって）置換される、（ｂ）正電荷側鎖を有する残基、例えば、リジル、アルギニルもしくはヒスチジルが負電荷残基、例えば、グルタミルもしくはアスパルチルから（または、によって）置換される、または（ｃ）かさの高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが側鎖のないもの、例えば、グリシンから（または、によって）置換されるものである。
【００５５】
ペプチドは、免疫原性ペプチド中に２つまたはそれ以上の残基の同配体を含んでもよい。本明細書において規定する同配体は、第１の配列の立体配座は第２の配列に特異的な結合部位に適合するので、第２の配列と置換することができる２つまたはそれ以上の残基の配列である。この用語は、具体的には、当業者に既知のペプチド骨格改変を含む。このような改変は、アミド窒素、α−炭素、アミドカルボニルの改変、アミド結合の完全な置換、伸長、欠損または骨格架橋を含む。一般に、Ｓｐａｔｏｌａ， 「アミノ酸、ペプチド、およびタンパク質の化学および生化学（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ， ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」 ＶＩＩ巻（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、１９８３）参照のこと。
【００５６】
種々のアミノ酸模倣物または非天然型アミノ酸によるペプチドの改変は、インビトロにおけるペプチドの安定性を増加する上で特に有用である。安定性は、多数の方法によりアッセイされる。例えば、ペプチダーゼ並びにヒト血漿および血清などの種々の生物学的媒体は安定性を試験するために使用されている。例えば、Ｖｅｒｈｏｅｆら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ， １１： ２９１−３０２ （１９８６）を参照のこと。本発明のペプチドの半減期は、便利なことに、２５％ヒト血清（ｖ／ｖ）アッセイ法を使用して決定される。プロトコールは、一般に、以下のようである。ヒトプール血清（ＡＢ型、非加熱不活性化）を使用前に遠心分離によって脱脂する。次いで、血清をＲＰＭＩ組織培養培地で希釈して、ペプチドの安定性を試験するために使用する。所与の時間間隔で、少量の反応溶液を取り出して、６％のトリクロロ酢酸またはエタノールに添加する。濁った反応試料を１５分間冷却し（４℃）、次いで遠心して、沈降した血清タンパク質をペレット化する。次いで、安定性−特異性クロマトグラフィー条件を使用して、ペプチドの存在を逆相ＨＰＬＣによって測定する。
【００５７】
ＣＴＬ刺激活性を有する本発明のペプチドまたはそれらの類似物を改変して、血清半減期の改善以外の所望の特質を提供することができる。例えば、Ｔヘルパー細胞応答を誘導することができる少なくとも１つのエピトープを含有する配列に結合することによって、ＣＴＬ活性を誘導するペプチドの能力を増強することができる。特に好ましい免疫原性ペプチド／Ｔヘルパー複合体にはスペーサー分子が結合している。スペーサーは、典型的には、生理学的条件下において実質的に非荷電であるアミノ酸またはアミノ酸模倣物などの比較的小型で中性の分子を含む。スペーサーは、典型的には、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙまたは非極性アミノ酸もしくは中性の極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択される。必要に応じて存在するスペーサーは同一の残基を含む必要がなく、従ってヘテロ−またはホモ−オリゴマーであってもよいことが理解される。存在する場合には、スペーサーは、通常は、少なくとも１残基または２残基であり、さらに通常は、３〜６残基である。または、ＣＴＬペプチドは、スペーサーなしで、Ｔヘルパーペプチドに結合してもよい。
【００５８】
免疫原性ペプチドは、直接またはＣＴＬペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端のスペーサーを介してＴヘルパーペプチドに結合することができる。免疫原性ペプチドまたはＴヘルパーペプチドのアミノ末端はアシル化されてもよい。
【００５９】
ある態様では、ＣＴＬを抗原刺激する際に助力となる少なくとも１つの成分を本発明の薬学的組成物中に含むことが望ましいことがある。脂質は、ウィルス抗原に対するインビトロにおけるＣＴＬの抗原刺激を助力することができる物質として同定されている。例えば、パルミチン酸残基は、Ｌｙｓ残基のαおよびεアミノ基に結合することができ、次いでＧｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ等などの１つ以上の結合残基を介して免疫原性ペプチドに結合される。次いで、脂質を結合したペプチドをミセル形態で直接注射しても、リポソームに導入しても、例えば、フロイントの不完全アジュバントのようなアジュバントの形態に乳化してもよい。好ましい態様において、特に有効な免疫原は、免疫原性ペプチドのアミノ末端に、Ｓｅｒ−Ｓｅｒのような結合を介して結合している、Ｌｙｓのαおよびεアミノ基に結合したパルミチン酸を含む。
【００６０】
ＣＴＬ応答の脂質抗原刺激の別の例として、適当なペプチドに共有結合している場合には、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステインリセリル−セリン（ｐ３ＣＳＳ）などの大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）リポタンパク質を使用して、ウィルス特異的ＣＴＬを抗原刺激することができる。参照として本明細書に組み入れられているＤｅｒｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ， ３４２： ５６１−５６４ （１９８９）を参照のこと。本発明のペプチドを例えば、ｐ３ＣＳＳに結合し、リポペプチドを個体に投与して、標的抗原に対するＣＴＬ応答を特異的に抗原刺激することができる。さらに、中和抗体の誘導も、適当なエピトープを示すペプチドに結合したｐ３ＣＳＳで抗原刺激することができるので、２つの組成物を組み合わせて、感染に対する液性および細胞性応答をさらに効果的に誘導することができる。
【００６１】
また、追加のアミノ酸をペプチドの末端に付加して、担体の支持体に結合するために、ペプチドの互いの結合を容易にするか、またはペプチドもしくはオリゴペプチドの物理的もしくは化学的特性を改良するためにより長いペプチドとの結合を容易にする等が可能である。チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸またはアスパラギン酸等などのアミノ酸を、ペプチドまたはオリゴペプチドのＣ末端またはＮ末端に導入することができる。いくつかの場合には、Ｃ末端の改変がペプチドの結合特性を変更することがある。また、末端−ＮＨ２アシル化、例えば、アルカノイル（Ｃ１〜Ｃ２０）またはチオグリコリルアセチル化、末端−カルボキシルアミド化、例えば、アンモニア、メチルアミン等によって改変されることによって、ペプチドまたはオリゴペプチド配列は天然の配列と異なることがある。いくつかの場合において、これらの改変は、支持体または他の分子に結合する部位を提供することができる。
【００６２】
本発明のペプチドは多種多様の方法で作製することができる。ペプチドは、サイズが比較的短いので、従来の技術により溶液中または固相支持体上で合成することができる。種々の自動合成装置を購入可能であり、既知のプロトコールにより使用することができる。例えば、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、「固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． （１９８４）、上記参照。
【００６３】
または、関心対象の免疫原性ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、適当な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトし、発現に好適な条件下において培養する組換えＤＮＡ技術を使用することができる。参照として本明細書に組み入れられているＳａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ）」， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）に一般に記載されているように、これらの手法は一般に当技術分野において既知である。従って、本発明の１つまたは複数のペプチド配列を含む融合タンパク質を使用して、適当なＴ細胞エピトープを発現することができる。
【００６４】
本明細書において考慮される鎖長のペプチドのコード配列は、化学的技術、例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １０３： ３１８５（１９８１）のホスホトリエステル方法によって合成することができるので、適当な塩基を、未変性のペプチド配列をコードするものと置換することによって改変を簡単に実施することができる。次いで、コード配列に適当なリンカーを提供し、当技術分野において通常入手可能な発現ベクターにライゲーションし、そのベクターを使用して、所望の融合タンパク質を作製するために好適な宿主を形質転換することができる。現在、このようなベクターおよび好適な宿主系は数多く入手可能である。融合タンパク質を発現させるためには、機能的に結合した開始コドンおよび停止コドン、プロモーター領域およびターミネーター領域、並びに通常複製系をコード配列に提供して、望ましい細胞宿主中で発現させるための発現ベクターを提供する。例えば、細菌宿主と適合性のプロモーター配列を、所望のコード配列を挿入するための便利な制限酵素切断部位を含有するプラスミドに提供する。得られた発現ベクターを好適な細菌宿主に形質転換する。当然のことながら、好適なベクターおよび制御配列を使用して、酵母または哺乳類細胞宿主を使用することもできる。
【００６５】
本発明のペプチド、並びにそれらの薬学的組成物およびワクチン組成物は、ウィルス感染症および癌を治療および／または予防するために、哺乳類、特にヒトに投与するのに有用である。本発明の免疫原性ペプチドを使用して治療することができる疾患の例には、前立腺癌、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＡＩＤＳ、腎臓癌、子宮頸癌、リンパ腫、ＣＭＶ、および尖圭コンジロームが挙げられる。
【００６６】
薬学的組成物については、本発明の免疫原性ペプチドを、すでに癌に罹患している個体または関心対象のウィルスに感染している個体に投与する。潜伏期の個体または感染の急性期の個体は、適宜、別個にまたは他の治療法と併用して免疫原性ペプチドで治療することができる。治療的用途では、ウィルスまたは腫瘍抗原に対する効果的なＣＴＬ応答を誘導し、症状および／または合併症を治癒または少なくとも一部阻止するのに十分な量の組成物を患者に投与する。これを実施するのに十分な量は、「治療的に有効な用量」として規定される。このように使用するのに有効な量は、例えば、ペプチド組成物、投与方法、被治療疾患の病期および重症度、患者の体重および全身の健康状態、並びに処方する医師の判断に依存するが、一般に初回免疫では（すなわち、治療的または予防的投与のため）、７０ｋｇの患者に対して約１．０μｇ〜約５０００μｇのペプチドを投与し、次に患者の血液中の特異的なＣＴＬ活性を測定することによって、患者の応答および状態に応じて、数週間〜数ヶ月にわたって追加免疫投与療法に従って、約１．０μｇ〜約１０００μｇのペプチドを追加免疫投与する。本発明のペプチドおよび組成物は、一般に、重篤な疾患状態、すなわち、生命を脅かすか、または生命を脅かす可能性のある状況に使用することができることを留意するべきである。このような症例では、外来物質が最小であることおよびペプチドが比較的低毒性であることを考慮すると、実質的に過剰量のこれらのペプチド組成物を投与することが可能であり、望ましいと治療医が考えることがある。
【００６７】
治療的用途では、ウィルス感染症の最初の徴候が出現した時、または腫瘍検出時もしくは外科的切除時、急性感染症の症例では診断直後に投与を開始するべきである。この次に、少なくとも症状が実質的に軽減するまで、およびその後の期間にわたって追加免疫投与する。慢性感染症では、初回負荷投与、次に追加免疫投与が必要になることがある。
【００６８】
本発明の組成物による感染個体の治療は、急性感染個体では感染症の消炎を早めることができる。慢性感染症を発症しやすい（または、発症する素因のある）個体では、本発明の組成物は、急性から慢性感染症への移行を予防する方法において特に有用である。例えば、本明細書に記載されているように、罹患しやすい個体が感染前または感染時に同定される場合には、本発明の組成物をそのような個体に標的化することができ、大集団に投与する必要性を小さくすることができる。
【００６９】
本発明のペプチド組成物は、慢性感染症を治療するため、および免疫系を刺激して保菌者のウィルス感染細胞を排除するためにも使用することができる。細胞障害性Ｔ細胞応答を効果的に刺激するのに十分な量の免疫賦活ペプチドを製剤および投与様式に提供することは重要である。従って、慢性感染症を治療するためには、代表的な用量は、７０ｋｇの患者の投与あたり約１．０μｇ〜約５０００μｇ、好ましくは約５μｇ〜１０００μｇの範囲である。個体を効果的に免疫化するためには、免疫投与の次におそらく長期間にわたって一定の期間、例えば、１〜４週間追加免疫投与が必要になることがある。慢性感染症の症例では、少なくとも臨床症状または臨床試験が、ウィルス感染が排除されたか、または実質的に軽減されたことを示すまで、およびその後の期間も投与を継続するべきである。
【００７０】
治療的治療のための薬学的組成物は、非経口、局所、経口、または局部的投与が意図されている。好ましくは、薬学的組成物は、非経口的、例えば、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内に投与される。従って、本発明は、許容される担体、好ましくは水性担体に溶解または懸濁させた免疫原性ペプチド溶液を含む非経口投与用組成物を提供する。種々の水性担体、例えば、水、緩衝液、０．９％食塩液、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等を使用することができる。これらの組成物は、従来の既知の滅菌技術で滅菌されても、またはろ過滅菌されてもよい。得られた水溶液はそのままの使用または凍結乾燥して使用するように包装してもよく、凍結乾燥製剤は投与前に滅菌溶液と組み合わせる。本発明の組成物は、ｐＨ調節剤および緩衝剤、張性調節剤、湿潤剤等、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン等などの適当な生理的条件に必要な薬学的に許容される補助物質を含有してもよい。
【００７１】
薬学的製剤中の本発明のＣＴＬ刺激ペプチドの濃度は大きく、すなわち、約０．１重量パーセント未満から、通常約２重量パーセントまたは少なくとも約２重量パーセント、２０重量パーセント〜５０重量パーセント以上まで異なってもよく、選択した特定の投与様式により体液の容量、粘性等によって主に選択される。
【００７２】
本発明のペプチドはまた、リンパ組織などの特定の細胞組織にペプチドを標的化する、リポソームにより投与することもできる。リポソームはまた、ペプチドの半減期を延長する上でも有用である。リポソームには、エマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散物、層状の層等が挙げられる。これらの製剤において、送達されるペプチドは、単独で、または例えば、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体などのリンパ系細胞に多く見られる受容体に結合する分子または他の治療的組成物もしくは免疫原性組成物と併用して、リポソームの一部として組み入れられる。従って、本発明の所望のペプチドを充填したリポソームをリンパ系細胞部位に誘導することができ、リポソームは選択された治療的／免疫原性ペプチド組成物を送達する。本発明に使用するためのリポソームは、一般に、中性および負荷電のリン脂質並びにコレステロールなどのステロールを含む、標準的な小胞形成脂質から形成される。脂質の選択は、一般に、血流中の例えば、リポソームシュー（ｓｕｅ）、酸不安定性、およびリポソームの安定性を考慮することによって誘導される。参照として本明細書に組み入れられている、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ９： ４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号に記載されているように、リポソームを作製するために種々の方法を利用可能である。
【００７３】
免疫細胞を標的化するためには、リポソームに組み入れるリガンドは、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定因子に特異的な抗体またはその断片を含んでもよい。ペプチドを含有するリポソーム懸濁液は、特に投与方法、送達されるペプチド、および被治療疾患の病期により様々な用量で、静脈内、局部的に、局所的等で投与することができる。
【００７４】
固形組成物では、例えば、薬学等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、ブドウ糖、ショ糖、炭酸マグネシウム等を含む従来の無毒性固形担体を使用することができる。経口投与では、以前に掲載したような担体などの通常使用される賦形剤のいずれかを、一般に作用成分、すなわち、本発明の１つまたは複数のペプチドの１０％〜９５％、さらに好ましくは２５％〜７５％の濃度で組み入れることによって、薬学的に許容される無毒性の組成物が形成される。
【００７５】
エアゾール投与では、免疫原性ペプチドは、好ましくは、細粒化された形態で、界面活性剤および噴射剤と共に供給される。ペプチドの典型的な割合は０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは１重量％〜１０重量％である。界面活性剤は、当然のことながら、無毒性でなければならず、好ましくは噴射剤に可溶性でなければならない。このような薬剤の代表は、脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物を有するカプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸（ｓｔｅａｍｉｃ ａｃｉｄ）、リノール酸、リノレン酸、オレステリック−アシッド（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ）およびオレイン酸などの炭素原子数６〜２２個の脂肪酸のエステルまたは部分的なエステルである。混合または天然グリセリドなどの混合エステルを使用することができる。界面活性剤は組成物の０．１重量％〜２０重量％、好ましくは０．２５％〜５％を構成してもよい。組成物の平衡は通常推進的である。例えば、鼻腔内送達のためのレシチンの場合と同様に、望ましい場合には、担体を含めることができる。
【００７６】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載する免疫原性ペプチドの免疫学的に有効な量を作用成分として含有する。ペプチドは、それ自身の担体に結合して、または活性なペプチド単位のホモポリマーもしくはヘテロポリマーとして、ヒトを含む宿主に導入することができる。このようなポリマーは、免疫学的反応が高いという利点を有し、また、異なるペプチドを使用してポリマーを作製する場合には、ウィルスまたは腫瘍細胞の異なる抗原決定因子と反応する抗体および／またはＣＴＬを誘導する追加の能力という利点を有する。有用な担体は当技術分野において既知であり、例えば、サイログロブリン、ウシ血清アルブミンなどのアルブミン、破傷風トキソイド、ポリ（リジン：グルタミン酸）などのポリアミノ酸、Ｂ型肝炎ウィルスコアタンパク質、Ｂ型肝炎ウィルス組換えワクチン等を含む。ワクチンはまた、水、リン酸緩衝食塩液、または食塩液などの生理学的に耐えられる（許容される）希釈剤を含有してもよく、典型的には、アジュバントをさらに含んでもよい。フロイントの不完全アジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバンなどのアジュバントは当技術分野に既知の物質である。また、上記のように、本発明のペプチドをＰ３ＣＳＳなどの脂質に結合することによってＣＴＬ応答を刺激することができる。本明細書に記載したようにペプチド組成物で、注射、エアゾール、経口、経皮、または他の経路により免疫化すると、宿主の免疫系は、所望の抗原に特異的な大量のＣＴＬを産生することによってワクチンに応答し、宿主は後の感染に対して少なくとも部分的に免疫を有するか、または慢性感染症を発症しない。
【００７７】
本発明のペプチドを含有するワクチン組成物は、抗原に対する免疫応答を誘発し、患者自身の免疫応答能力を増強するために、ウィルス感染または癌に罹患しやすい患者またはそのリスクのある患者に投与される。このような量は、「免疫学的に有効な用量」と規定される。このように使用する際にも、正確な量は患者の健康状態および体重、投与様式、製剤の性質等に依存するが、一般に７０キログラムの患者あたり約１．０μｇ〜約５０００μｇの範囲であり、さらに通常は体重７０ｋｇあたり約１０μｇ〜約５００μｇ ｍｇの範囲である。
【００７８】
いくつかの例において、本発明のペプチドワクチンを、関心対象のウィルス、特にウィルスの外被抗原に対する中和抗体応答を誘導するワクチンと組み合わせることが望ましいことがある。
【００７９】
治療的目的または免疫目的のためには、本発明のペプチドの１つまたは複数をコードする核酸を患者に投与することもできる。患者に核酸を送達するために、数多くの方法が便利なことに使用される。例えば、核酸を「裸のＤＮＡ」として直接送達することができる。この方法は、例えば、Ｗｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７： １４６５−１４６８ （１９９０）、並びに米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号に記載されている。例えば、米国特許第５，２０４，２５３号に記載されているように、弾道的（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）送達を使用して、核酸を投与することもできる。ＤＮＡのみを含む粒子を投与してもよい。または、ＤＮＡを金粒子などの粒子に接着してもよい。核酸はまた、陽イオン脂質などの陽イオン化合物と複合体を形成して送達することもできる。脂質を介する遺伝子送達方法は、例えば、国際公開公報第９６／１８３７２号、国際公開公報第９３／２４６４０号、ＭａｎｎｉｎｏおよびＧｏｕｌｄ−Ｆｏｒｅｒｉｔｅ （１９８８） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（７）：６８２−６９１、Ｒｏｓｅの米国特許第５，２７９，８３３号、国際公開公報第９１／０６３０９号、およびＦｅｌｇｎｅｒら（１９８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４： ７４１３−７４１４に記載されている。本発明のペプチドはまた、ワクシニアまたは鶏痘などの弱毒化ウィルス宿主によっても発現させることができる。本発明の方法は、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するベクターとしてワクシニアウィルスを使用することを含む。急性もしくは慢性感染宿主または非感染宿主に導入すると、組換えワクシニアウィルスは免疫原性ペプチドを発現し、それによって宿主ＣＴＬ応答を誘導する。免疫化プロトコールに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば、参照として本明細書に組み入れられている米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌：Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）である。ＢＣＧベクターは、参照として本明細書に組み入れられている、Ｓｔｏｖｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ ３５１： ４５６−４６０ （１９９１））に記載されている。本発明のペプチドの治療的投与または免疫化に有用な多種多様な他のベクター、例えば、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）ベクター等は本明細書の説明から当業者に明らかになると思われる。
【００８０】
本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好ましい手段では、本発明の多重エピトープをコードするミニ遺伝子構築物を使用する。ヒト細胞において発現させるために選択されたＣＴＬエピトープ（ミニ遺伝子）をコードするＤＮＡ配列を作製するために、エピトープのアミノ酸配列を逆翻訳する。ヒトコドン利用表を使用して、各アミノ酸のコドン選択をガイドする。これらのエピトープ−コードＤＮＡ配列を直接隣接させて、連続ポリペプチド配列を作製する。発現および／または免疫原性を最適化するために、追加の要素をミニ遺伝子デザインに組み入れてもよい。逆翻訳して、ミニ遺伝子配列に含めてもよいアミノ酸配列の例には、ヘルパーＴリンパ球エピトープ、リーダー（シグナル）配列、および小胞体保持シグナルが挙げられる。また、ＣＴＬエピトープに隣接する合成（例えば、ポリ−アラニン）または天然型隣接配列を含めることによって、ＣＴＬエピトープのＭＨＣ発現を改善することができる。
【００８１】
ミニ遺伝子のプラス鎖およびマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドを集成することによって、ミニ遺伝子配列をＤＮＡに変換する。既知の技術を使用して、適当な条件下において、重複オリゴヌクレオチド（鎖長３０〜１００塩基）を合成し、リン酸化し、精製し、アニーリングする。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、オリゴヌクレオチドの末端が接続される。ＣＴＬエピトープポリペプチドをコードするこの合成ミニ遺伝子を、次いで所望の発現ベクターにクローニングすることができる。
【００８２】
当業者に既知の標準的な調節配列をベクターに挿入して、標的細胞において確実に発現させる。いくつかのベクター要素が必要とされる：ミニ遺伝子挿入のための下流のクローニング部位を有するプロモーター、効率的な転写停止のためのポリアデニル化シグナル、大腸菌複製開始点、および大腸菌選択マーカー（例えば、アンピシリンまたはカナマイシン耐性）。例えば、ヒトサイトメガロウィルス（ｈＣＭＶ）プロモーターのような数多くのプロモーターを本発明の目的のために使用することができる。他の好適なプロモーター配列は、米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号を参照のこと。
【００８３】
ミニ遺伝子発現および免疫原性を最適化するために、追加のベクター改変が望ましいことがある。いくつかの場合において、イントロンは効率的な遺伝子発現のために必要とされ、１つまたは複数の合成または天然型イントロンがミニ遺伝子の転写領域に組み込まれてもよい。ミニ遺伝子発現を増加するためにｍＲＮＡ安定化配列の挿入を考慮することもできる。免疫刺激配列（ＩＳＳまたはＣｐＧ）がＤＮＡワクチンの免疫原性に役割を果たしていることが最近提案されている。これらの配列は、免疫原性を増強することが判明している場合には、ベクターのミニ遺伝子コード配列の外側に挿入されてもよい。
【００８４】
いくつかの態様において、ミニ遺伝子がコードするエピトープの産生を可能にするためのバイシストロン性発現ベクターおよび免疫原性を増強または低下させるために挿入される第２のタンパク質を使用することができる。同時発現される場合に、免疫応答を有用に増強すると思われるタンパク質またはポリペプチドの例には、サイトカイン（例えば、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘導分子（例えば、ＬｅＩＦ）、または共刺激分子が挙げられる。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープを細胞内標的シグナルに結合して、ＣＴＬエピトープとは別個に発現してもよい。こうすることにより、ＨＴＬエピトープを、ＣＴＬエピトープとは別の細胞コンパートメントに誘導することができる。必要な場合には、これにより、ＨＴＬエピトープがＭＨＣクラスＩＩ経路にさらに効率的に流入しやすくなり、それによってＣＴＬ誘導を改善すると思われる。ＣＴＬ誘導とは異なり、免疫抑制分子（例えば、ＴＧＦ−β）の同時発現による免疫応答を特異的に低下させることは、ある種の疾患に恩典を有することがある。
【００８５】
発現ベクターが選択されると、ミニ遺伝子が、プロモーターの下流のポリリンカー領域にクローニングされる。このプラスミドを適当な大腸菌株に形質転換し、標準的な技術を使用してＤＮＡを作製する。制限酵素マッピングおよびＤＮＡ配列分析を使用して、ミニ遺伝子の配向およびＤＮＡ配列、並びにベクターに含まれる他の全ての要素を確認する。適切なプラスミドを保有する細菌細胞を、マスター細胞バンクおよび検討用細胞バンクとして保管することができる。
【００８６】
治療量のプラスミドＤＮＡは、大腸菌における発酵、それに続く精製によって作製される。検討用の細胞バンクのアリコートを使用して、（テリフィック培地（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）などの）発酵培地に接種し、既知の技術により振とうフラスコまたはバイオリアクターで飽和するまで増殖する。キアゲン社（Ｑｕｉａｇｅｎ）によって供給される固相陰イオン交換樹脂などの標準的な生物分離技術を使用して、プラスミドＤＮＡを精製することができる。必要な場合には、ゲル電気泳動または他の方法を使用して、超コイルＤＮＡを開環状体および直鎖状体から単離することができる。
【００８７】
種々の製剤を使用して、精製プラスミドＤＮＡを注射用に製剤化することができる。これらのうち最も簡単なものは、滅菌リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で凍結乾燥したＤＮＡを溶解することである。種々の方法が記載されており、新規な技術が利用可能になることもある。上記のように、核酸は、便利なことに、陽イオン脂質を用いて製剤化される。また、糖脂質、フソゲンリポソーム、ペプチドおよび集合的に保護的、対話的、非凝縮（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ， ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ， ｎｏｎ−ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ）（ＰＩＮＣ）と呼ばれる化合物を精製プラスミドＤＮＡと複合体化し、安定性、筋肉内分散または特異的な器官もしくは細胞種との相互作用（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）などの変数に影響を与えてもよい。
【００８８】
標的細胞感受性を、ミニ遺伝子がコードするＣＴＬエピトープの発現およびＭＨＣクラスＩ発現の機能的アッセイ法として使用することができる。標準的なＣＴＬクロム放出アッセイ法の標的として好適である哺乳類細胞系統にプラスミドＤＮＡを導入する。使用するトランスフェクション方法は、最終的な製剤に依存する。エレクトロポレーションは「裸の」ＤＮＡに使用することができるが、陽イオン脂質はインビトロにおけるトランスフェクションに向けることができる。緑色の蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプラスミドを同時トランスフェクトして、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）を使用して、トランスフェクトした細胞を濃縮することができる。次いで、これらの細胞をクロム−５１標識し、エピトープ特異的ＣＴＬ系統の標的細胞として使用される。５１Ｃｒ放出で検出するとき、細胞溶解は、ミニ遺伝子がコードするＣＴＬエピトープのＭＨＣ発現が生じたことを示す。
【００８９】
インビトロにおける免疫原性は、ミニ遺伝子ＤＮＡ製剤の機能的試験の第２の方法である。適当なヒトＭＨＣ分子を発現する遺伝子組換えマウスをＤＮＡ産物で免疫化する。用量および投与経路は製剤依存的である（例えば、ＤＮＡのＰＢＳ溶液は筋肉内注射であり、脂質−複合体ＤＮＡは腹腔内注射である）。免疫から２１日後、脾臓を採取し、試験対象の各エピトープをコードするペプチドの存在下において１週間再度刺激する。標準的な技術を使用して、ペプチド負荷したクロム−５１標識標的細胞の細胞溶解についてこれらのエフェクター細胞（ＣＴＬ）をアッセイする。ミニ遺伝子がコードするエピトープに相当するペプチドのＭＨＣ負荷によって感作される標的細胞の溶解は、ＣＴＬをインビトロにおいて誘導するためのＤＮＡワクチン機能を証明している。
【００９０】
同様に、抗原性ペプチドを使用して、エクスビボでＣＴＬを誘導することができる。得られたＣＴＬを使用して、従来の他の形態の治療に応答しない、またはペプチドワクチン治療方法に応答しない患者の慢性感染症（ウィルスまたは細菌）または腫瘍を治療することができる。特定の病因（感染性物質または腫瘍抗原）に対するエクスビボのＣＴＬ応答は、組織培養において、患者のＣＴＬ前駆細胞（ＣＴＬｐ）を抗原提示細胞（ＡＰＣ）および適当な免疫原性ペプチドと共にインキュベーションすることによって誘導される。ＣＴＬｐが活性化されて成熟し、エフェクターＣＴＬに増殖する適当なインキュベーション期間（典型的には、１〜４週）後、細胞を患者に注入し、患者の生体内で、細胞は特異的な標的細胞（感染細胞または腫瘍細胞）を破壊する。特異的な細胞障害性Ｔ細胞を作製するためのインビトロにおける条件を最適化するために、刺激細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｃｅｌｌ）培養物を適当な無血清培地で維持する。
【００９１】
刺激細胞を被活性細胞、例えば、前駆ＣＤ８＋細胞と共にインキュベーションする前に、刺激細胞表面上で発現されるヒトクラスＩ分子に負荷されるのに十分な量の抗原性ペプチドを刺激細胞培養物に添加する。本発明では、十分な量のペプチドは、約２００、好ましくは２００以上のヒトクラスＩ ＭＨＣ分子に、刺激細胞のそれぞれの表面上で発現されるペプチドを負荷できる量である。好ましくは、刺激細胞は＞２０μｇ／ｍｌのペプチドと共にインキュベーションされる。
【００９２】
次いで、静止または前駆ＣＤ８＋細胞を、ＣＤＳ＋細胞を活性化するのに十分な期間、適当な刺激細胞と共にインキュベーションする。好ましくは、ＣＤ８＋細胞は抗原特異的に活性化される。刺激細胞に対する静止または前駆ＣＤ８＋（エフェクター）細胞の比は、個体によって異なってもよく、個体のリンパ球の培養条件への適応性並びに本明細書に記載する治療方法を使用する疾患状態または他の状態の性質および重症度などの可変要因にさらに依存することがある。しかしながら、好ましくはリンパ球：刺激細胞比は約３０：１〜３００：１の範囲である。エフェクター／刺激物質培養物は、治療的に使用可能または有効な数のＣＤ８＋細胞を刺激する必要がある期間だけ維持することができる。
【００９３】
インビトロにおけるＣＴＬの誘導には、ＡＰＣ上の対立遺伝子特異的なＭＨＣクラスＩ分子に結合させたペプチドの特異的な認識が必要である。ＡＰＣあたりの特異的なＭＬＩＣ／ペプチド複合体の数は、特に一次免疫応答ではＣＴＬの刺激にとって重要である。細胞あたりのペプチド／ＭＨＣ複合体の量が少量で細胞をＣＴＬによる溶解に感受性にするのに十分であっても、または二次的なＣＴＬ応答を刺激するのに十分であっても、一次応答中のＣＴＬ前駆体（ｐＣＴＬ）の活性化を成功させるためには、有意に多量のＭＨＣ／ペプチド複合体が必要である。細胞の空の（ｅｍｐｔｙ）主要組織適合性抗原複合体分子のペプチド負荷により、一次細胞障害性Ｔリンパ球応答を誘導することができる。細胞の空の主要組織適合性抗原複合体分子のペプチド負荷により、一次細胞障害性Ｔリンパ球応答を誘導することができる。
【００９４】
突然変異細胞系統は全てのヒトＭＨＣ対立遺伝子について存在しないので、ＡＰＣの表面から内因性ＭＨＣ結合ペプチドを除去し、次に得られた空のＭＨＣ分子に関心対象の免疫原性ペプチドを負荷する技術を使用することは有利である。非形質転換（非腫瘍形成）、非感染細胞、好ましくは患者の自己由来の細胞をＡＰＣとして使用することは、エクスビボのＣＴＬ治療の開発をめざすＣＴＬ誘導プロトコールの設計に望ましい。本出願は、ＡＰＣ表面から内因性ＭＨＣ結合ペプチドを除去し、次に所望のペプチドを負荷する方法を開示している。
【００９５】
安定なＭＨＣクラスＩ分子は、以下の要素から形成されるトリマー複合体である：１）通常８〜１０残基のペプチド、２）α１およびα２ドメインにペプチド結合部位を保有する膜貫通重鎖多型タンパク質、および３）共有結合以外で結合した非多型軽鎖、β２マイクログロブリン。複合体からの結合ペプチドの除去および／またはβ２マイクログロブリンの解離によりＭＨＣクラスＩ分子は機能せず、不安定になり、その結果迅速な分解を生じる。ＰＢＭＣから単離される全てのＭＨＣクラスＩ分子には、内因性ペプチドが結合している。従って、第１の段階は、外因性ペプチドを添加する前に、分解を生じることなく、ＡＰＣ上のＭＨＣクラスＩ分子に結合した全ての内因性ペプチドを除去することである。
【００９６】
結合ペプチドからＭＨＣクラスＩ分子を遊離する２つの可能な方法は、培養温度を３７℃から２６℃に低下させて一晩培養し、β２マイクログロブリンを不安定化することと、弱酸処理を使用して、細胞から内因性ペプチドを除去することとを含む。この方法は、以前に結合したペプチドを細胞外環境に放出し、新たな外因性ペプチドを空のクラスＩ分子に結合させる。低温インキュベーション方法により、外因性ペプチドはＭＨＣ複合体に効率的に結合できるが、細胞の代謝速度を遅くしうる２６℃における一晩のインキュベーションを必要とする。活発にＭＨＣ分子を合成していない細胞（例えば、静止ＰＢＭＣ）は、低温手法により空の表面ＭＬＩＣ分子を大量に産生しないと思われる。
【００９７】
強酸による除去には、トリフルオロ酢酸、ｐＨ ２によるペプチドの抽出または免疫親和性精製したクラスＩ−ペプチド複合体の酸変性が含まれる。これらの方法は、内因性ペプチドを除去するが、抗原提示に不可欠であるＡＰＣの生存性および最適な代謝速度を保存することが重要なため、ＣＴＬ誘導には適さない。グリシンまたはクエン酸−リン酸緩衝液などのｐＨ３の弱酸溶液が、内因性ペプチドを同定し、腫瘍関連Ｔ細胞エピトープを同定するために使用されている。ＭＨＣクラスＩ分子だけが不安定化される（および結合しているペプチドは放出される）が、ＭＨＣクラスＩＩ分子を含む他の表面抗原は無傷のままであるという点において、この処理は特に効果的である。最も重要なことには、弱酸溶液による細胞の処理は細胞の生存性および代謝状態に影響しない。弱酸処理は迅速である。その理由は、内因性ペプチドの除去は４℃では２分で生じ、ＡＰＣは、適当なペプチドが負荷されると、容易にその機能を発揮するからである。一次抗原特異的ＣＴＬを作製するためのペプチド特異的ＡＰＣを作製するためにの技術が本明細書において使用される。得られたＡＰＣは、ペプチド特異的ＣＤ８＋ ＣＴＬを誘導するのに効率的である。
【００９８】
活性化されたＣＤ８＋細胞は、種々の既知の方法の１つを使用して刺激細胞から効果的に分離することができる。例えば、刺激細胞、刺激細胞に負荷されたペプチドまたはＣＤ８＋細胞に特異的なモノクローナル抗体（またはその断片）を、適当な相補的なリガンドに結合するために使用することができる。次いで、例えば、既知の免疫沈降または免疫アッセイ法のような適当な手段によって、刺激物質−エフェクター細胞混合物から抗体標識した分子を抽出することができる。
【００９９】
効果的な、細胞障害性のある活性化されたＣＤ８＋細胞の量はインビトロ用途およびインビトロ用途で異なることがあり、また、これらのキラー細胞の最終的な標的である細胞の量および種類によって異なることがある。この量はまた、患者の状態によっても変わり、適当な要因全てを担当医が考慮することによって決定されるべきである。しかしながら、マウスに使用される約５×１０６〜５×１０８細胞と比較して、好ましくは、約１×１０６〜約１×１０１２、さらに好ましくは約１×１０８〜約１×１０１１、よりさらに好ましくは約１×１０〜〜１×１０１０の活性化ＣＤ８＋が成人に使用される。
【０１００】
好ましくは、上記に考察するように、被治療個体にＣＤ８＋細胞を投与する前に、活性化ＣＤ８＋を細胞培養物から採取する。しかしながら、現在の提案されている他の治療方法とは異なり、本発明の方法は腫瘍形成性でない細胞培養系を使用することに注目することは重要である。従って、刺激細胞および活性化ＣＤ８＋細胞の完全な分離が実施されない場合、小数の刺激細胞の投与に関連することが既知の本質的な危険がないが、哺乳類の腫瘍−促進細胞の投与は極めて危険になることがある。
【０１０１】
細胞成分を再導入する方法は当技術分野において既知であり、Ｈｏｎｓｉｋらに付与された米国特許第４，８４４，８９３号およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇに付与された米国特許第４，６９０，９１５号に例示されているものなどの手法を含む。例えば、静脈内注入による活性化ＣＤ８＋の投与が適当である。
【０１０２】
本発明の免疫原性ペプチドはまた、モノクローナル抗体を作製するためにも使用することができる。このような抗体は、診断薬または治療薬の可能性のあるものとして有用となりうる。
【０１０３】
ペプチドはさらに診断試薬としての用途を見出すことができる。例えば、本発明のペプチドを使用して、本発明のペプチドまたは関連ペプチドを使用する治療方法に対する特定の個体の感受性を判定することができ、従って既存の治療プロトコールを改良する際または罹患個体の予後を判定する際に有用となりうる。また、ペプチドは、どの個体が慢性感染症を発症する実質的な危険状態にあるかを予測するためにも使用することができる。
【０１０４】
本発明のペプチドを同定するためには、クラスＩ抗原単離並びに天然に処理されたペプチドの単離および配列決定を関連する出願に記載されているように実施した。次いで、これらのペプチドを使用して、以下の対立遺伝子Ａ３．２、Ａ１、Ａ１１およびＡ２４．１の各々に特異的な結合モチーフを規定した。これらのモチーフは３頁（前頁）に記載されている。以下の表５〜８に記載するモチーフは、関連する用途に記載されている天然に処理されたペプチドの配列決定プールデータから規定される。
【０１０５】
【表５】ＨＬＡ−Ａ３．２対立遺伝子特異的モチーフの要約
【０１０６】
【表６】ＨＬＡ−Ａ１対立遺伝子特異的モチーフの要約
【０１０７】
【表７】ＨＬＡ−Ａ１１対立遺伝子特異的モチーフの要約
【０１０８】
【表８】ＨＬＡ−Ａ２４．１対立遺伝子特異的モチーフの要約
【０１０９】
実施例 １
免疫原性ペプチドの同定
種々のＭＨＣクラスＩ対立遺伝子について上記に同定したモチーフを使用して、種々の病原菌および腫瘍−関連タンパク質由来のアミノ酸配列をこれらのモチーフの存在について分析した。スクリーニングは関連する用途に記載するように実施した。表９〜１０は抗原の検索結果を提供する。
【０１１０】
【表９】
【０１１１】
表１０に掲載するペプチドは上記のように同定し、それらが由来する病原菌または抗原により分類される。
【０１１２】
【表１０】
【０１１３】
上記の説明は本発明を例示するために提供されているが、本発明の範囲を限定するために提供されるものではない。本発明の他の形態は当業者に容易に明らかになり、添付の特許請求の範囲内に含まれる。本明細書に引用されている刊行物、特許、および特許出願は全て参照として本明細書に組み入れられる。
本出願は、米国特許出願第０８／５８９，１０７号の一部継続出願であり、米国特許出願第６０／０１３，８３３号、米国特許出願第０８／４５１，９１３号、および米国特許出願第０８／３４７，６１０号に関するものであり、米国特許出願第０７／９２６，６６６号の一部継続出願である米国特許出願第０８／０２７，７４６号の一部継続出願である米国特許出願第０８／１０３，３９６号の一部継続出願である米国特許出願第０８／１５９，３３９号の一部継続出願である。本出願は、米国特許出願第０８／１８６，２６６号、米国特許出願第０８／８２１，７３９号、および米国特許出願第０８／７５８，４０９号にも関するものである。上記の出願すべては参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の背景
本発明は、ウイルス性疾患および癌のような多くの病理状態の予防、治療または診断のための組成物ならびに方法に関するものである。特に、本発明は、選択性主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子を結合し、免疫応答を誘導することのできる新規のペプチドを提供する。
【０００３】
ＭＨＣ分子は、クラスＩ分子またはクラスＩＩ分子のどちらかに分類される。クラスＩＩ ＭＨＣ分子は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、マクロファージ等のような免疫応答の開始および持続に関わる細胞に主に発現する。クラスＩＩ ＭＥＣ分子は、ヘルパーＴリンパ球によって認識され、ヘルパーＴリンパ球の増殖および示される特定の免疫原性ペプチドに対する免疫応答の増幅を誘導する。クラスＩ ＭＨＣ分子は、ほとんどすべての有核細胞に発現し、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識され、その後、抗原を有する細胞を破壊する。ＣＴＬは、特に腫瘍拒絶とウイルス感染と闘う際に重要である。ＣＴＬは、無傷の外来抗原そのものよりもＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチド断片という形で抗原を認識する。抗原は、通常、細胞によって内因的に合成される必要があり、タンパク質抗原の一部は、細胞質においてペプチド小断片に分解される。これらの小ペプチドには、前ゴルジ区画に転位し、クラスＩ重鎖と相互作用して正しい折りたたみとサブユニットＪ３２ミクログロブリンとの会合を促進するものもある。その後、ペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体は、発現と可能性のある特異的なＣＴＬによる認識のために細胞表面に送達される。
【０００４】
ヒトＭＨＣクラスＩ分子であるＨＬＡ−Ａ２．１の結晶構造の研究により、ペプチド結合溝がクラスＩ重鎖のａ１ドメインとａ２ドメインの折りたたみによって形成されることが示されている（Ｂｊｏｒｋｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３２９：５０６（１９８７））。しかしながら、これらの研究では、溝へ結合するペプチドは同定されなかった。
【０００５】
ブース（Ｂｕｕｓ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：１０６５（１９８８）は、はじめにＭＨＣ由来の結合ペプチドの酸溶出のための方法を記載した。続いて、ラメンシー（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ）と彼の共同研究者（Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ、３５１：２９０（１９９１））は、クラスＩ分子に結合する自然にプロセシングされるペプチドを特徴付けるためのアプローチを開発した。他の研究者らは、質量分析法によるＢ型（Ｊａｒｄｅｔｚｋｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３５３：３２６（１９９１））およびＡ２．１型（Ｈｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２５：１２６１（１９９１））のクラスＩ分子から溶出されるペプチドについての従来の自動配列決定によって様々なＨＰＬＣ画分中のより大量のペプチドについて直接的なアミノ酸配列決定を成功させた。ＭＨＣクラスＩにおける自然にプロセシングされるペプチドの特徴付けについての総説は、ロツシュケ（Ｒｏｔｚｓｃｈｋｅ）とフォーク（Ｆａｌｋ）によって発表された（ＲｏｔｚｓｃｈｋｅとＦａｌｋ、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ、１２：４４７（１９９１））。
【０００６】
セッテ（Ｓｅｔｔｅ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＵＳＡ、８６：３２９６（１９８９）は、ＭＨＣ対立遺伝子特異的なモチーフも用いてＭＨＣ結合能を予想することができることを示した。シャエファー（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＵＳＡ、８６：４６４９（１９８９）は、ＭＨＣ結合が免疫原性に関連していることを示した。数人の著者（Ｄｅ Ｂｒｕｉｊｉｎら、Ｅｕｒ． Ｉ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２１：２９６３−２９７０（１９９１））；Ｐａｍｅｒら、９９１ Ｎａｔｕｒｅ、３５３：８５２−９５５（１９９１））は、クラスＩ結合モチーフを動物モデルにおいて可能性のある免疫原性ペプチドの同定に適用できるという予備的な証拠を提供した。所定のクラスＩイソ型の多くのヒト対立遺伝子に特異的なクラスＩモチーフは、これから説明されなければならない。これらの様々な対立遺伝子の組み合わせ頻度がヒト非近交系集団の大部分またはおそらくほとんどに及ぶ程十分高いことが望ましい。
【０００７】
当技術分野において発展しているにも関わらず、先行技術では、この研究に基づく有用なヒトペプチドを用いるワクチンまたは治療薬がいまだに提供されていない。本発明は、これらの利点または他の利点を提供する。
【０００８】
発明の概要
本発明は、ＭＨＣクラスＩ分子についての結合モチーフを有する免疫原性ペプチドを含む組成物を提供する。免疫原性ペプチドは、典型的には約８〜約１１残基であり、適切なＭＨＣ対立遺伝子によってコードされるタンパク質の結合に関わる保存残基を含む。多くの対立遺伝子特異的なモチーフが同定されている。
【０００９】
例えば、ＨＬＡ−Ａ３．２についてモチーフは、Ｎ末端からＣ末端まで、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ａ、ＴおよびＦの第１の保存残基を２番目の位置に含み、Ｋ、ＲまたはＹの第２の保存残基をＣ末端に含む。他の第１の保存残基は、Ｃ、ＧもしくはＤ、またはＥである。他の第２の保存残基は、ＨまたはＦである。第１と第２の保存残基は好ましくは６〜７残基によって隔てられている。
【００１０】
ＨＬＡ−Ａ１についてのモチーフは、Ｎ末端からＣ末端までＴ、ＳまたはＭの第１の保存残基、ＤまたはＥの第２の保存残基、およびＹの第３の保存残基を含む。他の第２の保存残基は、Ａ、ＳまたはＴである。第１と第２の保存残基は隣接しており、好ましくは６〜７残基によって第３の保存残基と隔てられている。第１と第２の保存残基が５〜６残基によって隔てられている場合に第２のモチーフは、ＥまたはＤの第１の保存残基およびＹの第２の保存残基を含む。
【００１１】
ＨＬＡ−Ａ１１についてのモチーフは、Ｎ末端からＣ末端まで、Ｔ、Ｖ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｎ、Ｃ、ＤまたはＦの第１の保存残基を二番目の位置に含み、Ｋ、Ｒ、ＹまたはＨのＣ末端保存残基を含む。第１と第２の保存残基は、好ましくは６〜７残基によって隔てられている。
【００１２】
ＨＬＡ−Ａ２４．１についてのモチーフは、Ｎ末端からＣ末端まで、Ｙ、ＦまたはＷの第１の保存残基を二番目の位置に含み、Ｆ、Ｉ、Ｗ、ＭまたはＬのＣ末端保存残基を含む。第１と第２の保存残基は、好ましくは６〜７残基によって隔てられている。
【００１３】
多くの可能性のある標的タンパク質のエピトープをこの方法で同定できる。適切な抗原の例には、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、Ｂ型肝炎コア抗原およびＢ型肝炎表面抗原（ＨＢＶｃ、ＨＢＶｓ）、Ｃ型肝炎抗原、悪性黒種抗原（ＭＡＧＥ−１）、エプスタイン・バーウイルス抗原、１型ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ １）、パピローマウイルス抗原、ラッサ熱ウイルス、結核菌（ＭＴ）、ｐ５３、ＣＥＡ、およびＨｅｒ２／ｎｅｕが含まれる。従って、ペプチドは、インビトロおよびエキソビボの両方における治療用途と診断用途用の薬学的組成物に有用である。
【００１４】
定義
「ペプチド」という用語は、本明細書において「オリゴペプチド」と互換的に用いられ、典型的には隣接するアミノ酸のαアミノ基とカルボニル基間のペプチド結合によってある残基を別の残基に結合した一連の残基を示し、典型的にはＬ−アミノ酸を示す。本発明のオリゴペプチドは長さが約１５残基未満であり、通常は約８〜約１１残基、好ましくは９残基または１０残基からなる。
【００１５】
「免疫原性ペプチド」は、ペプチドがＭＨＣ対立遺伝子を結合し、ＣＴＬ応答を誘導できるような対立遺伝子特異的なモチーフを含むペプチドである。従って免疫原性ペプチドは適切なクラスＩ ＭＨＣ分子に結合し、免疫原性ペプチドの由来となる抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導することができる。
【００１６】
「保存残基」は、ペプチドモチーフにおける特定の位置において無作為分布によって予想されるものより有意に高い頻度で出現するアミノ酸である。典型的には保存残基は、免疫原性ペプチドがＭＨＣ分子との接触点を提供しうるアミノ酸である。規定の長さのペプチド内の少なくとも１〜３個またはそれ以上、好ましくは２個の保存残基は、免疫原性ペプチドについてのモチーフを決定する。これらの残基は典型的には、ペプチド結合溝と、すなわち溝そのものの特異的なポケットに埋め込まれたそれらの側鎖とほとんど接触している。典型的には、免疫原性ペプチドは最大３個の保存残基、より通常は２個の保存残基を含む。
【００１７】
本明細書に用いられる場合の、「負の結合残基」とは、ある特定の位置において存在する場合に非結合剤または不十分な結合剤であるペプチドになり、その結果ペプチド内に適切な保存残基が存在するにも関わらずＣＴＬ応答を誘導できないアミノ酸である。
【００１８】
「モチーフ」という用語は、規定の長さ、通常約８〜約１１個のアミノ酸のペプチドにおける残基のパターンを意味し、特定のＭＨＣ対立遺伝子により認識される。各々のヒトＭＨＣ対立遺伝子についてのペプチドモチーフは、典型的には異なり、高度に保存された残基のパターンにおいて異なる。
【００１９】
対立遺伝子についての結合モチーフを高い精度で定義することができる。ある場合には、保存残基すべてがペプチドにおける適切な位置に存在し、負の結合残基が存在しない。
【００２０】
「単離した」または「生物学的に純粋な」という表現は、その天然の状態で見出される場合にそれに通常伴う構成成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を意味する。従って、本発明のペプチドは、インサイチュー環境と通常関連する物質、例えば抗原提示細胞のＭＨＣ Ｉ分子を含まない。タンパク質が同質のバンドまたは優性なバンドにまで単離された場合でさえ、所望のタンパク質とともに同時に精製される５〜１０％の範囲の非変性タンパク質の微量混入物がある。本発明の単離ペプチドは、このような内因性の同時精製されたタンパク質を含まない。
【００２１】
「残基」という用語は、アミド結合またはアミド結合模倣体によってオリゴペプチドに組み込まれるアミノ酸またはアミノ酸模倣体を意味する。
【００２２】
具体的な態様の説明
本発明は、ヒトクラスＩ ＭＨＣ（ＨＬＡと呼ぶ場合もある）対立遺伝子サブタイプの対立遺伝子特異的ペプチドモチーフの決定に関する。次いで、これらのモチーフを使用して、任意の望ましい抗原、特に抗原または自己抗原標的の可能性を有するものについてアミノ酸配列が既知である、ヒトウィルス疾患、癌または自己免疫疾患に関連する抗原からＴ細胞エピトープを規定する。
【００２３】
数多くの標的タンパク質の可能性を有するものについて、エピトープをこの方法で同定することができる。好適な抗原の例として、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、Ｂ型肝炎コア抗原および表面抗原（ＨＢＶｃ、ＨＢＶｓ）、Ｃ型肝炎抗原、エプスタイン‐バーウィルス抗原、黒色腫抗原（例、ＭＡＧＥ−１）、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）抗原およびヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）抗原、ラッサ熱ウィルス、結核菌（ＭＴ）、ｐ５３、ＣＥＡおよびＨｅｒ２／ｎｅｕが挙げられる。
【００２４】
これらの抗原のエピトープを含むペプチドを合成し、次いで、例えば、精製クラスＩ分子および放射性ヨウ素化ペプチドおよび／または空の（ｅｍｐｔｙ）クラスＩ分子を発現する細胞を使用するアッセイ法において、例えば、免疫蛍光染色およびフローマイクロ蛍光定量法、ペプチド−依存クラスＩアセンブリーアッセイ法およびペプチド競合によるＣＴＬ認識の阻害によって、適当なＭＨＣ分子に結合するそれらの能力について試験する。クラスＩ分子に結合するそのようなペプチドを、感染個体または免疫化された個体由来のＣＴＬの標的として作用する能力についてさらに評価し、またウィルス感染した標的細胞または腫瘍細胞と反応することができるＣＴＬ集団を生じることができるインビトロまたはインビトロにおける一次ＣＴＬ応答を誘発するキツネのそれらの能力を治療薬の可能性のあるものとして評価する。
【００２５】
ＭＨＣクラスＩ抗原はＨＬＡ−Ａ、ＢおよびＣ遺伝子座によってコードされる。ＨＬＡ−ＡおよびＢ抗原はほぼ等しい密度で細胞表面において発現されるが、ＨＬＡ−Ｃの発現は有意に低い（１０倍程度低い）。これらの遺伝子座は各々数多くの対立遺伝子を有する。本発明のペプチド結合モチーフは、各対立遺伝子サブタイプに比較的特異的である。
【００２６】
ペプチド系ワクチンでは、本発明のペプチドは、好ましくは、ヒト集団に広範に分布するＭＨＣ Ｉ分子によって認識されるモチーフを含む。ＭＨＣ対立遺伝子は民族および人種ごとに出現頻度が異なるので、標的ＭＨＣ対立遺伝子の選択は標的集団に依存することができる。表１は、異なる人種間のＨＬＡ−Ａ遺伝子座産物における種々の対立遺伝子頻度を示す。例えば、白人種集団の大半は４つのＨＬＡ−Ａ対立遺伝子サブタイプ、詳細にはＨＬＡ−Ａ２．１、Ａ１、Ａ３．２およびＡ２４．１に結合するペプチドでカバーできる。同様に、アジア集団の大半は第５の対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ１１．２に結合するペプチドの付加を含む。
【００２７】
【表１】
＊Ｎ−黒人種、Ａ＝アジア人種、Ｃ＝白人種。括弧内の数字は分析の対象とした個体数を示す。
【００２８】
ペプチド化合物を記載するために使用する命名法は、従来の方法に従い、アミノ基を各アミノ酸残基の左側（Ｎ末端）に、カルボキシル基を右側（Ｃ末端）に示す。本発明の選択された具体的な態様を示す式において、アミノ末端基およびカルボキシル末端基は、具体的には示していないが、特に明記しない限り、生理的なｐＨ値において取ると思われる形態で存在する。アミノ酸構造式において、各残基は、一般に、標準的な３文字表記または１文字表記で表される。Ｌ型のアミノ酸残基は大文字１文字または３文字記号の最初の大文字で表され、Ｄ型のそのようなアミノ酸は小文字１文字または小文字３文字記号で表される。グリシンは非対称炭素原子がなく、単純に「Ｇｌｙ」またはＧと呼ばれる。
【００２９】
本発明のペプチドを同定するために使用される手法は、一般に、Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ， ３５１：２９０（１９９１）に開示されている方法に準拠し、これは参照として本明細書に組み入れられる。簡単に説明すると、この方法は、適当な細胞または細胞系統から、典型的には、免疫沈降または親和性クロマトグラフィーによってＭＨＣクラスＩ分子を大規模単離することを含む。当業者に同じく既知の所望のＭＨＣ分子を単離するための他の方法の例には、イオン交換クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、高速リガンドクロマトグラフィーおよび上記技術全ての組み合わせが挙げられる。
【００３０】
規定のＭＨＣ分子、特にＭＨＣクラスＩ分子を有する細胞は数多く知られており、容易に入手可能である。例えば、ヒトＥＢＶ−形質転換したＢ細胞系統は、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子の分取的単離の優れた供給源であることが示されている。十分に特徴付けられた細胞系統は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（「細胞系統およびハイブリドーマのカタログ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）」、第６版（１９８８） メリーランド州ロックビル、米国）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １９９０／１９９１ 細胞系統のカタログ（Ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ）（ＮＩＧＭＳ） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｕｔａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、ニュージャージー州カンデン；およびＡＳＨＩ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ， Ｂｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， ７５ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｓｔｒｅｅｔ Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ ０２１１５などの個人的および市販の供給元から入手可能である。表２は、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の供給源として使用するのに好適なＢ細胞系統をいくつか列挙する。これらの細胞系統は全て大規模バッチで増殖させることができるので、ＭＨＣ分子の大規模産生に有用である。当業者は、これらは単に例示的にすぎない細胞系統であること、および多数の他の細胞起源を使用することができることを認識している。ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃの同型接合体である同様のＥＢＶ Ｂ細胞系統は、それぞれＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子起源として働くと思われる。
【００３１】
【表２】ヒト細胞系統（ＬＩＬＡ−Ａ起源）
典型的な場合には、所望の対立遺伝子を単離するために免疫沈降を使用する。使用する抗体の特異性に依存して、数多くのプロトコールを使用することができる。例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ分子を親和性精製するために、対立遺伝子特異的ｍＡｂ試薬を使用することができる。ＨＬＡ−Ａ分子を単離するためのｍＡｂ試薬はいくつか入手可能である（表３）。従って、標的とするＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の各々について、ＨＬＡ−Ａ分子を直接単離するために使用することができる試薬が入手可能である。標準的な技術を使用してこれらのｍＡｂを用いて調製される親和性カラムをうまく使用して、それぞれのＨＬＡ−Ａ対立遺伝子産物を精製する。
【００３３】
以下の実施例のセクションに記載されているように、対立遺伝子−特異的なｍＡｂ以外に、Ｗ６／３２およびＢ９．１２．１などの反応性の広い抗ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ ｍＡｂ並びに１つの抗ＨＬＡ−Ｂ、Ｃ ｍＡｂ、Ｂ１．２３．２を別の親和性精製プロトコールに使用してもよい。
【００３４】
【表３】抗体試薬
単離されたＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合したペプチドは、典型的には、酸処理を使用して溶出される。ペプチドはまた、加熱、ｐＨ、界面活性剤、塩、カオトロピック剤、またはそれらの組み合わせなどの種々の標準的な変性手段によってクラスＩ分子から解離させることができる。
【００３６】
ペプチド分画は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってＭＨＣ分子からさらに分離され、配列が決定される。ろ過、限外ろ過、電気泳動、サイズクロマトグラフィー、特異的な抗体による沈降、イオン交換クロマトグラフィー、等電点分画電気泳動法等を含む、当業者に既知の他の種々の標準的な手段によってペプチドを分離することができる。
【００３７】
単離したペプチドの配列決定は、エドマン（Ｅｄｍａｎ）分解（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ， Ｍ． Ｗ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ９１， ３９９ （１９８３））などの標準的な技術により実施することができる。配列決定するのに好適な他の方法には、以前に記載されている個々のペプチドの質量分析法による配列決定が挙げられる（参照として本明細書に組み入れられている、Ｈｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２５： １２６１ （１９９２））。異なるクラスＩ分子からバルク状の不均質なペプチドのアミノ酸配列決定すると（例えば、プールされたＨＰＬＣ分画）、典型的には、各クラスＩ対立遺伝子の特徴的な配列モチーフが明らかにされる。
【００３８】
異なるクラスＩ対立遺伝子に特異的なモチーフが規定されると、そのアミノ酸配列が既知である抗原タンパク質からペプチドエピトープの可能性を有するものを単離することができる。典型的には、ペプチドエピトープの可能性を有するものの同定は、最初に、モチーフの存在について所望の抗原のアミノ酸配列をスキャンするためのコンピュータを使用して実施される。次いで、エピトープ配列を合成する。ＭＨＣクラス分子に結合する能力を種々の異なる方法で測定する。１つの手段は、例えば、上記の関連する用途に記載されているクラスＩ分子結合アッセイ法である。文献に記載されている別法には、抗原提示の阻害（Ｓｅｔｔｅら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４１： ３８９３ （１９９１））、インビトロアセンブリーアッセイ法（Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、Ｃｅｌｌ， ６２： ２８５ （１９９０））およびＲＭＡ．Ｓなどの変異細胞を使用するＦＡＣＳに基づいたアッセイ法（Ｍｅｌｉｅｆら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２１： ２９６３ （１９９１））が挙げられる。
【００３９】
次に、ＭＨＣクラスＩ結合アッセイ法において陽性の試験結果を示すペプチドを、インビトロにおいて特異的なＣＴＬ応答を誘導するペプチドの能力についてアッセイする。例えば、ペプチドと共にインキュベーションされた抗原提示細胞を、応答細胞集団におけるＣＴＬ応答を誘導する能力についてアッセイすることができる。抗原提示細胞は末梢血液単核細胞または樹状細胞などの正常な細胞であってもよい（Ｉｎａｂａら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １６６： １８２（１９８７）、Ｂｏｏｇ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １８： ２１９ （１９８８））。
【００４０】
または、インビトロにおける一次ＣＴＬ応答を誘導するペプチドの能力を試験するために、ペプチドを添加する場合には、マウス細胞系統ＲＭＡ−Ｓ（Ｋａｒｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ， ３１９： ６７５ （１９８６）；Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２１： ２９６３−２９７０ （１９９１））およびヒト体細胞Ｔ細胞ハイブリドーマ、Ｔ−２（Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏら、Ｎａｔｕｒｅ， ３４５： ４４９−４５２（１９９０））などの、内部的に処理されたペプチドを有するクラスＩ分子を負荷する能力が欠損し、適当なヒトクラスＩ遺伝子がトランスフェクトされている突然変異哺乳類細胞系統が便利に使用される。使用可能な他の真核細胞系統には、蚊の幼虫（ＡＴＣＣ 細胞系統 １２５， １２６， １６６０， １５９１， ６５８５， ６５８６）、カイコ（ＡＴＴＣ ＣＲＬ ８８５１）、ヨトウムシ（ａｒｍｙｗｏｒｍ）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）、ガ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８０）およびシュナイダー細胞系統（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｊ． Ｅｍｂｒｙｏｌ． Ｅｘｐ． Ｍｏｒｐｈｏｌ．， ２７： ３５３−３６５［１９２７］）などのショウジョウバエ細胞系統などの種々の昆虫細胞系統が挙げられる。それは、適当なヒトクラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子をコードする遺伝子およびヒトＢ２マイクログロブリン遺伝子でトランスフェクトされている。
【００４１】
末梢血リンパ球は、便利なことに、正常なドナーまたは患者の単純な静脈穿刺または白血球分離により単離され、ＣＴＬ前駆体の応答細胞起源として使用される。一態様において、適当な抗原提示細胞を、適当な培養条件下において無血清培地で１０〜１００μＭのペプチドと共に４時間インキュベーションする。次いで、ペプチド負荷した抗原提示細胞を、最適な培養条件下において応答細胞集団と共にインビトロにおいて７〜１０日間インキュベーションする。放射性標識した標的細胞を死滅させるＣＴＬの存在、特異的なペプチド−パルス標識した（ｐｕｌｓｅｄ）標的並びにペプチド配列を誘導する関連ウィルスまたは腫瘍抗原の内因的に処理された形態を発現する標的細胞について、培養物をアッセイすることによって陽性のＣＴＬ活性化を測定することができる。
【００４２】
ＣＴＬの特異性およびＭＨＣ制限性は、適当または不適当なヒトＭＨＣクラスＩを発現する異なるペプチド標的細胞に対して試験することによって測定される。ＭＨＣ結合アッセイ法において陽性の試験結果を示し、特異的なＣＴＬ応答を生じるペプチドは本明細書において免疫原性ペプチドと呼ぶ。
【００４３】
免疫原性ペプチドは合成もしくは組換えＤＮＡ技術によって作製することも、またはウィルス全体または腫瘍などの天然起源から単離することもできる。ペプチドは、好ましくは、他の天然型宿主細胞タンパク質およびそれらの断片を実質的に含有しないが、ある態様では、ペプチドを未変性の断片または粒子に合成により結合させることもある。ポリペプチドまたはペプチドは種々の鎖長であっても、中性（非荷電）の形態または塩である形態であってもよく、グリコシル化、側鎖の酸化もしくはリン酸化などの改変を含有しなくても、または本明細書に記載するように改変がポリペプチドの生物学的活性を破壊しない状態を条件としてこれらの改変を含有してもよい。
【００４４】
望ましくは、大型のペプチドの生物学的活性の実質的に全てを維持する限りは、ペプチドは可能な限り小型であると考えられる。可能な場合には、本発明のペプチドを鎖長９または１０のアミノ酸残基、ＣＣＬ １２５、１２６、１６６０、１５９１、６５８５， ６５８６）、カイコ（ＡＴＴＣ ＣＲＬ ８８５１）、ヨトウムシ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）、ガ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８０）およびシュナイダー細胞系統（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｊ． Ｅｍｂｒｙｏｌ． Ｅｘｐ． Ｍｏｒｐｈｏｌ．， ２７： ３５３−３６５ （１９２７）参照）などのショウジョウバエ細胞系統に最適化することが望ましいことがある。それは、適当なヒトクラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子をコードする遺伝子およびヒトＢ２マイクログロブリン遺伝子でトランスフェクトされている。
【００４５】
末梢血リンパ球は、便利なことに、正常なドナーまたは患者の単純な静脈穿刺または白血球分離により単離され、ＣＴＬ前駆体の応答細胞起源として使用される。一態様において、適当な抗原提示細胞を、適当な培養条件下において無血清培地で１０〜１００μＭのペプチドと共に４時間インキュベーションする。次いで、ペプチド負荷した抗原提示細胞を、最適な培養条件下において応答細胞集団と共にインビトロにおいて７〜１０日間インキュベーションする。放射性標識した標的細胞を死滅させるＣＴＬの存在、特異的なペプチド−パルス標識した（ｐｕｌｓｅｄ）標的並びにペプチド配列を誘導する関連ウィルスまたは腫瘍抗原の内因的に処理された形態を発現する標的細胞について、培養物をアッセイすることによって陽性のＣＴＬ活性化を測定することができる。
【００４６】
ＣＴＬの特異性およびＭＨＣ制限性は、適当または不適当なヒトＭＨＣクラスＩを発現する異なるペプチド標的細胞に対して試験することによって測定される。ＭＨＣ結合アッセイ法において陽性の試験結果を示し、特異的なＣＴＬ応答を生じるペプチドは本明細書において免疫原性ペプチドと呼ぶ。
【００４７】
免疫原性ペプチドは合成もしくは組換えＤＮＡ技術によって作製することも、またはウィルス全体または腫瘍などの天然起源から単離することもできる。ペプチドは、好ましくは、他の天然型宿主細胞タンパク質およびそれらの断片を実質的に含有しないが、ある態様では、ペプチドを未変性の断片または粒子に合成により結合させることもある。ポリペプチドまたはペプチドは種々の鎖長であっても、中性（非荷電）の形態または塩である形態であってもよく、グリコシル化、側鎖の酸化もしくはリン酸化などの改変を含有しなくても、または本明細書に記載するように改変がポリペプチドの生物学的活性を破壊しない状態を条件としてこれらの改変を含有してもよい。
【００４８】
望ましくは、大型のペプチドの生物学的活性の実質的に全てを維持する限りは、ペプチドは可能な限り小型であると考えられる。可能な場合には、細胞表面のＭＨＣクラスＩ分子に結合する内因的に処理されたウィルスペプチドまたは腫瘍細胞ペプチドとサイズが同じである、鎖長９または１０のアミノ酸残基に本発明のペプチドを最適化することが望ましいことがある。
【００４９】
所望の活性を有するペプチドは、適宜、改変して、ある種の所望の特性を提供することができる、例えば、薬理学的な特性が改善されるが、所望のＭＨＣ分子に結合し、適当なＴ細胞を活性化する未改変ペプチドの生物学的活性の実質的に全てを増加または少なくとも維持する。例えば、ペプチドに保存的はまた非保存的置換などの種々の変化を実施することができ、この場合には、このような変化は、ＭＨＣ結合の改善などの使用時の利点を提供すると思われる。保存的置換は、アミノ酸残基を、生物学的および／または化学的に類似した別のアミノ酸残基と置換する、例えば、疎水性残基を別の疎水性残基と置換し、または極性残基を別の極性残基と置換することを意味する。置換には、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組み合わせが挙げられる。１つのアミノ酸置換の影響はまた、Ｄ−アミノ酸を使用して探索することができる。このような改変は、例えば、参照として本明細書に組み入れられているＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３２： ３４１−３４７（１９８６）、ＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， 「ペプチド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」， ＧｒｏｓｓおよびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編（Ｎ．Ｙ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）， ｐｐ． １−２８４（１９７９）；ならびにＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ， 「固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」， （Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌ．， Ｐｉｅｒｃｅ）， 第２版（１９８４）に記載されているように、既知のペプチド合成手法を使用して実施することができる。
【００５０】
ペプチドは、例えば、アミノ酸の付加または欠損によって、化合物のアミノ酸配列を伸長または減少することによっても改変することができる。本発明のペプチドまたは類似物はある種の残基の順序または組成を変更することによっても改変することができ、例えば、重要な接触部位におけるものまたは保存された残基のような、生物学的活性に必須なある種のアミノ酸残基は、生物学的活性に有害な影響を与えない限り、一般に変更しなくてもよいことは容易に理解される。重要でないアミノ酸はＬ−α−アミノ酸またはそれらのＤ−異性体などのタンパク質に天然に生ずるものに限られる必要はなく、β−γ−δ−アミノ酸およびＬ−α−アミノ酸の多数の誘導体などの非天然型アミノ酸を同様に含んでもよい。
【００５１】
典型的には、１つのアミノ酸置換を有する一連のペプチドを使用して、結合に対する静電荷、疎水性等の影響を求める。例えば、一連の正電荷（例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ）または負電荷（例えば、Ｇｌｕ）アミノ酸置換はペプチド鎖に実施され、種々のＭＨＣ分子およびＴ細胞受容体に対する感受性の異なるパターンを明らかにする。また、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏまたは同様の残基などの小型で比較的中性の部分を使用する多重置換を使用することができる。置換はホモ−オリゴマーまたはヘテロ−オリゴマーであってもよい。置換または付加される残基の数および種類は、必須の接触点の間に必要な空間および検討されるある種の機能的特質（例えば、疎水性および親水性）に依存する。親ペプチドの親和性と比較したとき、ＭＨＣ分子またはＴ細胞受容体に対する高い結合親和性もこのような置換によって達成することができる。任意の事象において、このような置換は、結合を妨害する可能性のある、例えば、立体障害および荷電障害を回避するために選択されるアミノ酸残基または他の分子断片を使用するべきである。
【００５２】
アミノ酸置換は典型的には、１残基である。置換、欠損、挿入または任意のそれらの組み合わせを組み合わせて、最終的なペプチドに到達することができる。置換種は、ペプチドの少なくとも１つの残基が除去されており、異なる残基がその位置に挿入されるものである。ペプチドの特徴を微妙に調節することが望ましい場合には、このような置換は、一般に、以下の表４により実施される。
【００５３】
【表４】
機能の実質的な変化（例えば、ＭＨＣ分子またはＴ細胞受容体に対する親和性）は、表４のものより保存性の低い置換を選択することによって、すなわち、（ａ）例えば、シートまたはヘリックス立体配座のような、置換領域のペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の荷電もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさばりを維持することに対する影響がより大きく異なる残基を選択することによって実施される。ペプチドの特性の最も大きな変化を生ずることが期待される置換は、（ａ）親水性残基、例えば、セリルが疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルもしくはアラニルから（または、によって）置換される、（ｂ）正電荷側鎖を有する残基、例えば、リジル、アルギニルもしくはヒスチジルが負電荷残基、例えば、グルタミルもしくはアスパルチルから（または、によって）置換される、または（ｃ）かさの高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが側鎖のないもの、例えば、グリシンから（または、によって）置換されるものである。
【００５５】
ペプチドは、免疫原性ペプチド中に２つまたはそれ以上の残基の同配体を含んでもよい。本明細書において規定する同配体は、第１の配列の立体配座は第２の配列に特異的な結合部位に適合するので、第２の配列と置換することができる２つまたはそれ以上の残基の配列である。この用語は、具体的には、当業者に既知のペプチド骨格改変を含む。このような改変は、アミド窒素、α−炭素、アミドカルボニルの改変、アミド結合の完全な置換、伸長、欠損または骨格架橋を含む。一般に、Ｓｐａｔｏｌａ， 「アミノ酸、ペプチド、およびタンパク質の化学および生化学（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ， ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」 ＶＩＩ巻（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、１９８３）参照のこと。
【００５６】
種々のアミノ酸模倣物または非天然型アミノ酸によるペプチドの改変は、インビトロにおけるペプチドの安定性を増加する上で特に有用である。安定性は、多数の方法によりアッセイされる。例えば、ペプチダーゼ並びにヒト血漿および血清などの種々の生物学的媒体は安定性を試験するために使用されている。例えば、Ｖｅｒｈｏｅｆら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ， １１： ２９１−３０２ （１９８６）を参照のこと。本発明のペプチドの半減期は、便利なことに、２５％ヒト血清（ｖ／ｖ）アッセイ法を使用して決定される。プロトコールは、一般に、以下のようである。ヒトプール血清（ＡＢ型、非加熱不活性化）を使用前に遠心分離によって脱脂する。次いで、血清をＲＰＭＩ組織培養培地で希釈して、ペプチドの安定性を試験するために使用する。所与の時間間隔で、少量の反応溶液を取り出して、６％のトリクロロ酢酸またはエタノールに添加する。濁った反応試料を１５分間冷却し（４℃）、次いで遠心して、沈降した血清タンパク質をペレット化する。次いで、安定性−特異性クロマトグラフィー条件を使用して、ペプチドの存在を逆相ＨＰＬＣによって測定する。
【００５７】
ＣＴＬ刺激活性を有する本発明のペプチドまたはそれらの類似物を改変して、血清半減期の改善以外の所望の特質を提供することができる。例えば、Ｔヘルパー細胞応答を誘導することができる少なくとも１つのエピトープを含有する配列に結合することによって、ＣＴＬ活性を誘導するペプチドの能力を増強することができる。特に好ましい免疫原性ペプチド／Ｔヘルパー複合体にはスペーサー分子が結合している。スペーサーは、典型的には、生理学的条件下において実質的に非荷電であるアミノ酸またはアミノ酸模倣物などの比較的小型で中性の分子を含む。スペーサーは、典型的には、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙまたは非極性アミノ酸もしくは中性の極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択される。必要に応じて存在するスペーサーは同一の残基を含む必要がなく、従ってヘテロ−またはホモ−オリゴマーであってもよいことが理解される。存在する場合には、スペーサーは、通常は、少なくとも１残基または２残基であり、さらに通常は、３〜６残基である。または、ＣＴＬペプチドは、スペーサーなしで、Ｔヘルパーペプチドに結合してもよい。
【００５８】
免疫原性ペプチドは、直接またはＣＴＬペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端のスペーサーを介してＴヘルパーペプチドに結合することができる。免疫原性ペプチドまたはＴヘルパーペプチドのアミノ末端はアシル化されてもよい。
【００５９】
ある態様では、ＣＴＬを抗原刺激する際に助力となる少なくとも１つの成分を本発明の薬学的組成物中に含むことが望ましいことがある。脂質は、ウィルス抗原に対するインビトロにおけるＣＴＬの抗原刺激を助力することができる物質として同定されている。例えば、パルミチン酸残基は、Ｌｙｓ残基のαおよびεアミノ基に結合することができ、次いでＧｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ等などの１つ以上の結合残基を介して免疫原性ペプチドに結合される。次いで、脂質を結合したペプチドをミセル形態で直接注射しても、リポソームに導入しても、例えば、フロイントの不完全アジュバントのようなアジュバントの形態に乳化してもよい。好ましい態様において、特に有効な免疫原は、免疫原性ペプチドのアミノ末端に、Ｓｅｒ−Ｓｅｒのような結合を介して結合している、Ｌｙｓのαおよびεアミノ基に結合したパルミチン酸を含む。
【００６０】
ＣＴＬ応答の脂質抗原刺激の別の例として、適当なペプチドに共有結合している場合には、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステインリセリル−セリン（ｐ３ＣＳＳ）などの大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）リポタンパク質を使用して、ウィルス特異的ＣＴＬを抗原刺激することができる。参照として本明細書に組み入れられているＤｅｒｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ， ３４２： ５６１−５６４ （１９８９）を参照のこと。本発明のペプチドを例えば、ｐ３ＣＳＳに結合し、リポペプチドを個体に投与して、標的抗原に対するＣＴＬ応答を特異的に抗原刺激することができる。さらに、中和抗体の誘導も、適当なエピトープを示すペプチドに結合したｐ３ＣＳＳで抗原刺激することができるので、２つの組成物を組み合わせて、感染に対する液性および細胞性応答をさらに効果的に誘導することができる。
【００６１】
また、追加のアミノ酸をペプチドの末端に付加して、担体の支持体に結合するために、ペプチドの互いの結合を容易にするか、またはペプチドもしくはオリゴペプチドの物理的もしくは化学的特性を改良するためにより長いペプチドとの結合を容易にする等が可能である。チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸またはアスパラギン酸等などのアミノ酸を、ペプチドまたはオリゴペプチドのＣ末端またはＮ末端に導入することができる。いくつかの場合には、Ｃ末端の改変がペプチドの結合特性を変更することがある。また、末端−ＮＨ２アシル化、例えば、アルカノイル（Ｃ１〜Ｃ２０）またはチオグリコリルアセチル化、末端−カルボキシルアミド化、例えば、アンモニア、メチルアミン等によって改変されることによって、ペプチドまたはオリゴペプチド配列は天然の配列と異なることがある。いくつかの場合において、これらの改変は、支持体または他の分子に結合する部位を提供することができる。
【００６２】
本発明のペプチドは多種多様の方法で作製することができる。ペプチドは、サイズが比較的短いので、従来の技術により溶液中または固相支持体上で合成することができる。種々の自動合成装置を購入可能であり、既知のプロトコールにより使用することができる。例えば、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、「固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． （１９８４）、上記参照。
【００６３】
または、関心対象の免疫原性ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、適当な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトし、発現に好適な条件下において培養する組換えＤＮＡ技術を使用することができる。参照として本明細書に組み入れられているＳａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ）」， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）に一般に記載されているように、これらの手法は一般に当技術分野において既知である。従って、本発明の１つまたは複数のペプチド配列を含む融合タンパク質を使用して、適当なＴ細胞エピトープを発現することができる。
【００６４】
本明細書において考慮される鎖長のペプチドのコード配列は、化学的技術、例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １０３： ３１８５（１９８１）のホスホトリエステル方法によって合成することができるので、適当な塩基を、未変性のペプチド配列をコードするものと置換することによって改変を簡単に実施することができる。次いで、コード配列に適当なリンカーを提供し、当技術分野において通常入手可能な発現ベクターにライゲーションし、そのベクターを使用して、所望の融合タンパク質を作製するために好適な宿主を形質転換することができる。現在、このようなベクターおよび好適な宿主系は数多く入手可能である。融合タンパク質を発現させるためには、機能的に結合した開始コドンおよび停止コドン、プロモーター領域およびターミネーター領域、並びに通常複製系をコード配列に提供して、望ましい細胞宿主中で発現させるための発現ベクターを提供する。例えば、細菌宿主と適合性のプロモーター配列を、所望のコード配列を挿入するための便利な制限酵素切断部位を含有するプラスミドに提供する。得られた発現ベクターを好適な細菌宿主に形質転換する。当然のことながら、好適なベクターおよび制御配列を使用して、酵母または哺乳類細胞宿主を使用することもできる。
【００６５】
本発明のペプチド、並びにそれらの薬学的組成物およびワクチン組成物は、ウィルス感染症および癌を治療および／または予防するために、哺乳類、特にヒトに投与するのに有用である。本発明の免疫原性ペプチドを使用して治療することができる疾患の例には、前立腺癌、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＡＩＤＳ、腎臓癌、子宮頸癌、リンパ腫、ＣＭＶ、および尖圭コンジロームが挙げられる。
【００６６】
薬学的組成物については、本発明の免疫原性ペプチドを、すでに癌に罹患している個体または関心対象のウィルスに感染している個体に投与する。潜伏期の個体または感染の急性期の個体は、適宜、別個にまたは他の治療法と併用して免疫原性ペプチドで治療することができる。治療的用途では、ウィルスまたは腫瘍抗原に対する効果的なＣＴＬ応答を誘導し、症状および／または合併症を治癒または少なくとも一部阻止するのに十分な量の組成物を患者に投与する。これを実施するのに十分な量は、「治療的に有効な用量」として規定される。このように使用するのに有効な量は、例えば、ペプチド組成物、投与方法、被治療疾患の病期および重症度、患者の体重および全身の健康状態、並びに処方する医師の判断に依存するが、一般に初回免疫では（すなわち、治療的または予防的投与のため）、７０ｋｇの患者に対して約１．０μｇ〜約５０００μｇのペプチドを投与し、次に患者の血液中の特異的なＣＴＬ活性を測定することによって、患者の応答および状態に応じて、数週間〜数ヶ月にわたって追加免疫投与療法に従って、約１．０μｇ〜約１０００μｇのペプチドを追加免疫投与する。本発明のペプチドおよび組成物は、一般に、重篤な疾患状態、すなわち、生命を脅かすか、または生命を脅かす可能性のある状況に使用することができることを留意するべきである。このような症例では、外来物質が最小であることおよびペプチドが比較的低毒性であることを考慮すると、実質的に過剰量のこれらのペプチド組成物を投与することが可能であり、望ましいと治療医が考えることがある。
【００６７】
治療的用途では、ウィルス感染症の最初の徴候が出現した時、または腫瘍検出時もしくは外科的切除時、急性感染症の症例では診断直後に投与を開始するべきである。この次に、少なくとも症状が実質的に軽減するまで、およびその後の期間にわたって追加免疫投与する。慢性感染症では、初回負荷投与、次に追加免疫投与が必要になることがある。
【００６８】
本発明の組成物による感染個体の治療は、急性感染個体では感染症の消炎を早めることができる。慢性感染症を発症しやすい（または、発症する素因のある）個体では、本発明の組成物は、急性から慢性感染症への移行を予防する方法において特に有用である。例えば、本明細書に記載されているように、罹患しやすい個体が感染前または感染時に同定される場合には、本発明の組成物をそのような個体に標的化することができ、大集団に投与する必要性を小さくすることができる。
【００６９】
本発明のペプチド組成物は、慢性感染症を治療するため、および免疫系を刺激して保菌者のウィルス感染細胞を排除するためにも使用することができる。細胞障害性Ｔ細胞応答を効果的に刺激するのに十分な量の免疫賦活ペプチドを製剤および投与様式に提供することは重要である。従って、慢性感染症を治療するためには、代表的な用量は、７０ｋｇの患者の投与あたり約１．０μｇ〜約５０００μｇ、好ましくは約５μｇ〜１０００μｇの範囲である。個体を効果的に免疫化するためには、免疫投与の次におそらく長期間にわたって一定の期間、例えば、１〜４週間追加免疫投与が必要になることがある。慢性感染症の症例では、少なくとも臨床症状または臨床試験が、ウィルス感染が排除されたか、または実質的に軽減されたことを示すまで、およびその後の期間も投与を継続するべきである。
【００７０】
治療的治療のための薬学的組成物は、非経口、局所、経口、または局部的投与が意図されている。好ましくは、薬学的組成物は、非経口的、例えば、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内に投与される。従って、本発明は、許容される担体、好ましくは水性担体に溶解または懸濁させた免疫原性ペプチド溶液を含む非経口投与用組成物を提供する。種々の水性担体、例えば、水、緩衝液、０．９％食塩液、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等を使用することができる。これらの組成物は、従来の既知の滅菌技術で滅菌されても、またはろ過滅菌されてもよい。得られた水溶液はそのままの使用または凍結乾燥して使用するように包装してもよく、凍結乾燥製剤は投与前に滅菌溶液と組み合わせる。本発明の組成物は、ｐＨ調節剤および緩衝剤、張性調節剤、湿潤剤等、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン等などの適当な生理的条件に必要な薬学的に許容される補助物質を含有してもよい。
【００７１】
薬学的製剤中の本発明のＣＴＬ刺激ペプチドの濃度は大きく、すなわち、約０．１重量パーセント未満から、通常約２重量パーセントまたは少なくとも約２重量パーセント、２０重量パーセント〜５０重量パーセント以上まで異なってもよく、選択した特定の投与様式により体液の容量、粘性等によって主に選択される。
【００７２】
本発明のペプチドはまた、リンパ組織などの特定の細胞組織にペプチドを標的化する、リポソームにより投与することもできる。リポソームはまた、ペプチドの半減期を延長する上でも有用である。リポソームには、エマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散物、層状の層等が挙げられる。これらの製剤において、送達されるペプチドは、単独で、または例えば、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体などのリンパ系細胞に多く見られる受容体に結合する分子または他の治療的組成物もしくは免疫原性組成物と併用して、リポソームの一部として組み入れられる。従って、本発明の所望のペプチドを充填したリポソームをリンパ系細胞部位に誘導することができ、リポソームは選択された治療的／免疫原性ペプチド組成物を送達する。本発明に使用するためのリポソームは、一般に、中性および負荷電のリン脂質並びにコレステロールなどのステロールを含む、標準的な小胞形成脂質から形成される。脂質の選択は、一般に、血流中の例えば、リポソームシュー（ｓｕｅ）、酸不安定性、およびリポソームの安定性を考慮することによって誘導される。参照として本明細書に組み入れられている、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ９： ４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号に記載されているように、リポソームを作製するために種々の方法を利用可能である。
【００７３】
免疫細胞を標的化するためには、リポソームに組み入れるリガンドは、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定因子に特異的な抗体またはその断片を含んでもよい。ペプチドを含有するリポソーム懸濁液は、特に投与方法、送達されるペプチド、および被治療疾患の病期により様々な用量で、静脈内、局部的に、局所的等で投与することができる。
【００７４】
固形組成物では、例えば、薬学等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、ブドウ糖、ショ糖、炭酸マグネシウム等を含む従来の無毒性固形担体を使用することができる。経口投与では、以前に掲載したような担体などの通常使用される賦形剤のいずれかを、一般に作用成分、すなわち、本発明の１つまたは複数のペプチドの１０％〜９５％、さらに好ましくは２５％〜７５％の濃度で組み入れることによって、薬学的に許容される無毒性の組成物が形成される。
【００７５】
エアゾール投与では、免疫原性ペプチドは、好ましくは、細粒化された形態で、界面活性剤および噴射剤と共に供給される。ペプチドの典型的な割合は０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは１重量％〜１０重量％である。界面活性剤は、当然のことながら、無毒性でなければならず、好ましくは噴射剤に可溶性でなければならない。このような薬剤の代表は、脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物を有するカプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸（ｓｔｅａｍｉｃ ａｃｉｄ）、リノール酸、リノレン酸、オレステリック−アシッド（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ）およびオレイン酸などの炭素原子数６〜２２個の脂肪酸のエステルまたは部分的なエステルである。混合または天然グリセリドなどの混合エステルを使用することができる。界面活性剤は組成物の０．１重量％〜２０重量％、好ましくは０．２５％〜５％を構成してもよい。組成物の平衡は通常推進的である。例えば、鼻腔内送達のためのレシチンの場合と同様に、望ましい場合には、担体を含めることができる。
【００７６】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載する免疫原性ペプチドの免疫学的に有効な量を作用成分として含有する。ペプチドは、それ自身の担体に結合して、または活性なペプチド単位のホモポリマーもしくはヘテロポリマーとして、ヒトを含む宿主に導入することができる。このようなポリマーは、免疫学的反応が高いという利点を有し、また、異なるペプチドを使用してポリマーを作製する場合には、ウィルスまたは腫瘍細胞の異なる抗原決定因子と反応する抗体および／またはＣＴＬを誘導する追加の能力という利点を有する。有用な担体は当技術分野において既知であり、例えば、サイログロブリン、ウシ血清アルブミンなどのアルブミン、破傷風トキソイド、ポリ（リジン：グルタミン酸）などのポリアミノ酸、Ｂ型肝炎ウィルスコアタンパク質、Ｂ型肝炎ウィルス組換えワクチン等を含む。ワクチンはまた、水、リン酸緩衝食塩液、または食塩液などの生理学的に耐えられる（許容される）希釈剤を含有してもよく、典型的には、アジュバントをさらに含んでもよい。フロイントの不完全アジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバンなどのアジュバントは当技術分野に既知の物質である。また、上記のように、本発明のペプチドをＰ３ＣＳＳなどの脂質に結合することによってＣＴＬ応答を刺激することができる。本明細書に記載したようにペプチド組成物で、注射、エアゾール、経口、経皮、または他の経路により免疫化すると、宿主の免疫系は、所望の抗原に特異的な大量のＣＴＬを産生することによってワクチンに応答し、宿主は後の感染に対して少なくとも部分的に免疫を有するか、または慢性感染症を発症しない。
【００７７】
本発明のペプチドを含有するワクチン組成物は、抗原に対する免疫応答を誘発し、患者自身の免疫応答能力を増強するために、ウィルス感染または癌に罹患しやすい患者またはそのリスクのある患者に投与される。このような量は、「免疫学的に有効な用量」と規定される。このように使用する際にも、正確な量は患者の健康状態および体重、投与様式、製剤の性質等に依存するが、一般に７０キログラムの患者あたり約１．０μｇ〜約５０００μｇの範囲であり、さらに通常は体重７０ｋｇあたり約１０μｇ〜約５００μｇ ｍｇの範囲である。
【００７８】
いくつかの例において、本発明のペプチドワクチンを、関心対象のウィルス、特にウィルスの外被抗原に対する中和抗体応答を誘導するワクチンと組み合わせることが望ましいことがある。
【００７９】
治療的目的または免疫目的のためには、本発明のペプチドの１つまたは複数をコードする核酸を患者に投与することもできる。患者に核酸を送達するために、数多くの方法が便利なことに使用される。例えば、核酸を「裸のＤＮＡ」として直接送達することができる。この方法は、例えば、Ｗｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７： １４６５−１４６８ （１９９０）、並びに米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号に記載されている。例えば、米国特許第５，２０４，２５３号に記載されているように、弾道的（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）送達を使用して、核酸を投与することもできる。ＤＮＡのみを含む粒子を投与してもよい。または、ＤＮＡを金粒子などの粒子に接着してもよい。核酸はまた、陽イオン脂質などの陽イオン化合物と複合体を形成して送達することもできる。脂質を介する遺伝子送達方法は、例えば、国際公開公報第９６／１８３７２号、国際公開公報第９３／２４６４０号、ＭａｎｎｉｎｏおよびＧｏｕｌｄ−Ｆｏｒｅｒｉｔｅ （１９８８） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（７）：６８２−６９１、Ｒｏｓｅの米国特許第５，２７９，８３３号、国際公開公報第９１／０６３０９号、およびＦｅｌｇｎｅｒら（１９８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４： ７４１３−７４１４に記載されている。本発明のペプチドはまた、ワクシニアまたは鶏痘などの弱毒化ウィルス宿主によっても発現させることができる。本発明の方法は、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するベクターとしてワクシニアウィルスを使用することを含む。急性もしくは慢性感染宿主または非感染宿主に導入すると、組換えワクシニアウィルスは免疫原性ペプチドを発現し、それによって宿主ＣＴＬ応答を誘導する。免疫化プロトコールに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば、参照として本明細書に組み入れられている米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌：Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）である。ＢＣＧベクターは、参照として本明細書に組み入れられている、Ｓｔｏｖｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ ３５１： ４５６−４６０ （１９９１））に記載されている。本発明のペプチドの治療的投与または免疫化に有用な多種多様な他のベクター、例えば、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）ベクター等は本明細書の説明から当業者に明らかになると思われる。
【００８０】
本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好ましい手段では、本発明の多重エピトープをコードするミニ遺伝子構築物を使用する。ヒト細胞において発現させるために選択されたＣＴＬエピトープ（ミニ遺伝子）をコードするＤＮＡ配列を作製するために、エピトープのアミノ酸配列を逆翻訳する。ヒトコドン利用表を使用して、各アミノ酸のコドン選択をガイドする。これらのエピトープ−コードＤＮＡ配列を直接隣接させて、連続ポリペプチド配列を作製する。発現および／または免疫原性を最適化するために、追加の要素をミニ遺伝子デザインに組み入れてもよい。逆翻訳して、ミニ遺伝子配列に含めてもよいアミノ酸配列の例には、ヘルパーＴリンパ球エピトープ、リーダー（シグナル）配列、および小胞体保持シグナルが挙げられる。また、ＣＴＬエピトープに隣接する合成（例えば、ポリ−アラニン）または天然型隣接配列を含めることによって、ＣＴＬエピトープのＭＨＣ発現を改善することができる。
【００８１】
ミニ遺伝子のプラス鎖およびマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドを集成することによって、ミニ遺伝子配列をＤＮＡに変換する。既知の技術を使用して、適当な条件下において、重複オリゴヌクレオチド（鎖長３０〜１００塩基）を合成し、リン酸化し、精製し、アニーリングする。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、オリゴヌクレオチドの末端が接続される。ＣＴＬエピトープポリペプチドをコードするこの合成ミニ遺伝子を、次いで所望の発現ベクターにクローニングすることができる。
【００８２】
当業者に既知の標準的な調節配列をベクターに挿入して、標的細胞において確実に発現させる。いくつかのベクター要素が必要とされる：ミニ遺伝子挿入のための下流のクローニング部位を有するプロモーター、効率的な転写停止のためのポリアデニル化シグナル、大腸菌複製開始点、および大腸菌選択マーカー（例えば、アンピシリンまたはカナマイシン耐性）。例えば、ヒトサイトメガロウィルス（ｈＣＭＶ）プロモーターのような数多くのプロモーターを本発明の目的のために使用することができる。他の好適なプロモーター配列は、米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号を参照のこと。
【００８３】
ミニ遺伝子発現および免疫原性を最適化するために、追加のベクター改変が望ましいことがある。いくつかの場合において、イントロンは効率的な遺伝子発現のために必要とされ、１つまたは複数の合成または天然型イントロンがミニ遺伝子の転写領域に組み込まれてもよい。ミニ遺伝子発現を増加するためにｍＲＮＡ安定化配列の挿入を考慮することもできる。免疫刺激配列（ＩＳＳまたはＣｐＧ）がＤＮＡワクチンの免疫原性に役割を果たしていることが最近提案されている。これらの配列は、免疫原性を増強することが判明している場合には、ベクターのミニ遺伝子コード配列の外側に挿入されてもよい。
【００８４】
いくつかの態様において、ミニ遺伝子がコードするエピトープの産生を可能にするためのバイシストロン性発現ベクターおよび免疫原性を増強または低下させるために挿入される第２のタンパク質を使用することができる。同時発現される場合に、免疫応答を有用に増強すると思われるタンパク質またはポリペプチドの例には、サイトカイン（例えば、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘導分子（例えば、ＬｅＩＦ）、または共刺激分子が挙げられる。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープを細胞内標的シグナルに結合して、ＣＴＬエピトープとは別個に発現してもよい。こうすることにより、ＨＴＬエピトープを、ＣＴＬエピトープとは別の細胞コンパートメントに誘導することができる。必要な場合には、これにより、ＨＴＬエピトープがＭＨＣクラスＩＩ経路にさらに効率的に流入しやすくなり、それによってＣＴＬ誘導を改善すると思われる。ＣＴＬ誘導とは異なり、免疫抑制分子（例えば、ＴＧＦ−β）の同時発現による免疫応答を特異的に低下させることは、ある種の疾患に恩典を有することがある。
【００８５】
発現ベクターが選択されると、ミニ遺伝子が、プロモーターの下流のポリリンカー領域にクローニングされる。このプラスミドを適当な大腸菌株に形質転換し、標準的な技術を使用してＤＮＡを作製する。制限酵素マッピングおよびＤＮＡ配列分析を使用して、ミニ遺伝子の配向およびＤＮＡ配列、並びにベクターに含まれる他の全ての要素を確認する。適切なプラスミドを保有する細菌細胞を、マスター細胞バンクおよび検討用細胞バンクとして保管することができる。
【００８６】
治療量のプラスミドＤＮＡは、大腸菌における発酵、それに続く精製によって作製される。検討用の細胞バンクのアリコートを使用して、（テリフィック培地（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）などの）発酵培地に接種し、既知の技術により振とうフラスコまたはバイオリアクターで飽和するまで増殖する。キアゲン社（Ｑｕｉａｇｅｎ）によって供給される固相陰イオン交換樹脂などの標準的な生物分離技術を使用して、プラスミドＤＮＡを精製することができる。必要な場合には、ゲル電気泳動または他の方法を使用して、超コイルＤＮＡを開環状体および直鎖状体から単離することができる。
【００８７】
種々の製剤を使用して、精製プラスミドＤＮＡを注射用に製剤化することができる。これらのうち最も簡単なものは、滅菌リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で凍結乾燥したＤＮＡを溶解することである。種々の方法が記載されており、新規な技術が利用可能になることもある。上記のように、核酸は、便利なことに、陽イオン脂質を用いて製剤化される。また、糖脂質、フソゲンリポソーム、ペプチドおよび集合的に保護的、対話的、非凝縮（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ， ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ， ｎｏｎ−ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ）（ＰＩＮＣ）と呼ばれる化合物を精製プラスミドＤＮＡと複合体化し、安定性、筋肉内分散または特異的な器官もしくは細胞種との相互作用（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）などの変数に影響を与えてもよい。
【００８８】
標的細胞感受性を、ミニ遺伝子がコードするＣＴＬエピトープの発現およびＭＨＣクラスＩ発現の機能的アッセイ法として使用することができる。標準的なＣＴＬクロム放出アッセイ法の標的として好適である哺乳類細胞系統にプラスミドＤＮＡを導入する。使用するトランスフェクション方法は、最終的な製剤に依存する。エレクトロポレーションは「裸の」ＤＮＡに使用することができるが、陽イオン脂質はインビトロにおけるトランスフェクションに向けることができる。緑色の蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプラスミドを同時トランスフェクトして、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）を使用して、トランスフェクトした細胞を濃縮することができる。次いで、これらの細胞をクロム−５１標識し、エピトープ特異的ＣＴＬ系統の標的細胞として使用される。５１Ｃｒ放出で検出するとき、細胞溶解は、ミニ遺伝子がコードするＣＴＬエピトープのＭＨＣ発現が生じたことを示す。
【００８９】
インビトロにおける免疫原性は、ミニ遺伝子ＤＮＡ製剤の機能的試験の第２の方法である。適当なヒトＭＨＣ分子を発現する遺伝子組換えマウスをＤＮＡ産物で免疫化する。用量および投与経路は製剤依存的である（例えば、ＤＮＡのＰＢＳ溶液は筋肉内注射であり、脂質−複合体ＤＮＡは腹腔内注射である）。免疫から２１日後、脾臓を採取し、試験対象の各エピトープをコードするペプチドの存在下において１週間再度刺激する。標準的な技術を使用して、ペプチド負荷したクロム−５１標識標的細胞の細胞溶解についてこれらのエフェクター細胞（ＣＴＬ）をアッセイする。ミニ遺伝子がコードするエピトープに相当するペプチドのＭＨＣ負荷によって感作される標的細胞の溶解は、ＣＴＬをインビトロにおいて誘導するためのＤＮＡワクチン機能を証明している。
【００９０】
同様に、抗原性ペプチドを使用して、エクスビボでＣＴＬを誘導することができる。得られたＣＴＬを使用して、従来の他の形態の治療に応答しない、またはペプチドワクチン治療方法に応答しない患者の慢性感染症（ウィルスまたは細菌）または腫瘍を治療することができる。特定の病因（感染性物質または腫瘍抗原）に対するエクスビボのＣＴＬ応答は、組織培養において、患者のＣＴＬ前駆細胞（ＣＴＬｐ）を抗原提示細胞（ＡＰＣ）および適当な免疫原性ペプチドと共にインキュベーションすることによって誘導される。ＣＴＬｐが活性化されて成熟し、エフェクターＣＴＬに増殖する適当なインキュベーション期間（典型的には、１〜４週）後、細胞を患者に注入し、患者の生体内で、細胞は特異的な標的細胞（感染細胞または腫瘍細胞）を破壊する。特異的な細胞障害性Ｔ細胞を作製するためのインビトロにおける条件を最適化するために、刺激細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｃｅｌｌ）培養物を適当な無血清培地で維持する。
【００９１】
刺激細胞を被活性細胞、例えば、前駆ＣＤ８＋細胞と共にインキュベーションする前に、刺激細胞表面上で発現されるヒトクラスＩ分子に負荷されるのに十分な量の抗原性ペプチドを刺激細胞培養物に添加する。本発明では、十分な量のペプチドは、約２００、好ましくは２００以上のヒトクラスＩ ＭＨＣ分子に、刺激細胞のそれぞれの表面上で発現されるペプチドを負荷できる量である。好ましくは、刺激細胞は＞２０μｇ／ｍｌのペプチドと共にインキュベーションされる。
【００９２】
次いで、静止または前駆ＣＤ８＋細胞を、ＣＤＳ＋細胞を活性化するのに十分な期間、適当な刺激細胞と共にインキュベーションする。好ましくは、ＣＤ８＋細胞は抗原特異的に活性化される。刺激細胞に対する静止または前駆ＣＤ８＋（エフェクター）細胞の比は、個体によって異なってもよく、個体のリンパ球の培養条件への適応性並びに本明細書に記載する治療方法を使用する疾患状態または他の状態の性質および重症度などの可変要因にさらに依存することがある。しかしながら、好ましくはリンパ球：刺激細胞比は約３０：１〜３００：１の範囲である。エフェクター／刺激物質培養物は、治療的に使用可能または有効な数のＣＤ８＋細胞を刺激する必要がある期間だけ維持することができる。
【００９３】
インビトロにおけるＣＴＬの誘導には、ＡＰＣ上の対立遺伝子特異的なＭＨＣクラスＩ分子に結合させたペプチドの特異的な認識が必要である。ＡＰＣあたりの特異的なＭＬＩＣ／ペプチド複合体の数は、特に一次免疫応答ではＣＴＬの刺激にとって重要である。細胞あたりのペプチド／ＭＨＣ複合体の量が少量で細胞をＣＴＬによる溶解に感受性にするのに十分であっても、または二次的なＣＴＬ応答を刺激するのに十分であっても、一次応答中のＣＴＬ前駆体（ｐＣＴＬ）の活性化を成功させるためには、有意に多量のＭＨＣ／ペプチド複合体が必要である。細胞の空の（ｅｍｐｔｙ）主要組織適合性抗原複合体分子のペプチド負荷により、一次細胞障害性Ｔリンパ球応答を誘導することができる。細胞の空の主要組織適合性抗原複合体分子のペプチド負荷により、一次細胞障害性Ｔリンパ球応答を誘導することができる。
【００９４】
突然変異細胞系統は全てのヒトＭＨＣ対立遺伝子について存在しないので、ＡＰＣの表面から内因性ＭＨＣ結合ペプチドを除去し、次に得られた空のＭＨＣ分子に関心対象の免疫原性ペプチドを負荷する技術を使用することは有利である。非形質転換（非腫瘍形成）、非感染細胞、好ましくは患者の自己由来の細胞をＡＰＣとして使用することは、エクスビボのＣＴＬ治療の開発をめざすＣＴＬ誘導プロトコールの設計に望ましい。本出願は、ＡＰＣ表面から内因性ＭＨＣ結合ペプチドを除去し、次に所望のペプチドを負荷する方法を開示している。
【００９５】
安定なＭＨＣクラスＩ分子は、以下の要素から形成されるトリマー複合体である：１）通常８〜１０残基のペプチド、２）α１およびα２ドメインにペプチド結合部位を保有する膜貫通重鎖多型タンパク質、および３）共有結合以外で結合した非多型軽鎖、β２マイクログロブリン。複合体からの結合ペプチドの除去および／またはβ２マイクログロブリンの解離によりＭＨＣクラスＩ分子は機能せず、不安定になり、その結果迅速な分解を生じる。ＰＢＭＣから単離される全てのＭＨＣクラスＩ分子には、内因性ペプチドが結合している。従って、第１の段階は、外因性ペプチドを添加する前に、分解を生じることなく、ＡＰＣ上のＭＨＣクラスＩ分子に結合した全ての内因性ペプチドを除去することである。
【００９６】
結合ペプチドからＭＨＣクラスＩ分子を遊離する２つの可能な方法は、培養温度を３７℃から２６℃に低下させて一晩培養し、β２マイクログロブリンを不安定化することと、弱酸処理を使用して、細胞から内因性ペプチドを除去することとを含む。この方法は、以前に結合したペプチドを細胞外環境に放出し、新たな外因性ペプチドを空のクラスＩ分子に結合させる。低温インキュベーション方法により、外因性ペプチドはＭＨＣ複合体に効率的に結合できるが、細胞の代謝速度を遅くしうる２６℃における一晩のインキュベーションを必要とする。活発にＭＨＣ分子を合成していない細胞（例えば、静止ＰＢＭＣ）は、低温手法により空の表面ＭＬＩＣ分子を大量に産生しないと思われる。
【００９７】
強酸による除去には、トリフルオロ酢酸、ｐＨ ２によるペプチドの抽出または免疫親和性精製したクラスＩ−ペプチド複合体の酸変性が含まれる。これらの方法は、内因性ペプチドを除去するが、抗原提示に不可欠であるＡＰＣの生存性および最適な代謝速度を保存することが重要なため、ＣＴＬ誘導には適さない。グリシンまたはクエン酸−リン酸緩衝液などのｐＨ３の弱酸溶液が、内因性ペプチドを同定し、腫瘍関連Ｔ細胞エピトープを同定するために使用されている。ＭＨＣクラスＩ分子だけが不安定化される（および結合しているペプチドは放出される）が、ＭＨＣクラスＩＩ分子を含む他の表面抗原は無傷のままであるという点において、この処理は特に効果的である。最も重要なことには、弱酸溶液による細胞の処理は細胞の生存性および代謝状態に影響しない。弱酸処理は迅速である。その理由は、内因性ペプチドの除去は４℃では２分で生じ、ＡＰＣは、適当なペプチドが負荷されると、容易にその機能を発揮するからである。一次抗原特異的ＣＴＬを作製するためのペプチド特異的ＡＰＣを作製するためにの技術が本明細書において使用される。得られたＡＰＣは、ペプチド特異的ＣＤ８＋ ＣＴＬを誘導するのに効率的である。
【００９８】
活性化されたＣＤ８＋細胞は、種々の既知の方法の１つを使用して刺激細胞から効果的に分離することができる。例えば、刺激細胞、刺激細胞に負荷されたペプチドまたはＣＤ８＋細胞に特異的なモノクローナル抗体（またはその断片）を、適当な相補的なリガンドに結合するために使用することができる。次いで、例えば、既知の免疫沈降または免疫アッセイ法のような適当な手段によって、刺激物質−エフェクター細胞混合物から抗体標識した分子を抽出することができる。
【００９９】
効果的な、細胞障害性のある活性化されたＣＤ８＋細胞の量はインビトロ用途およびインビトロ用途で異なることがあり、また、これらのキラー細胞の最終的な標的である細胞の量および種類によって異なることがある。この量はまた、患者の状態によっても変わり、適当な要因全てを担当医が考慮することによって決定されるべきである。しかしながら、マウスに使用される約５×１０６〜５×１０８細胞と比較して、好ましくは、約１×１０６〜約１×１０１２、さらに好ましくは約１×１０８〜約１×１０１１、よりさらに好ましくは約１×１０〜〜１×１０１０の活性化ＣＤ８＋が成人に使用される。
【０１００】
好ましくは、上記に考察するように、被治療個体にＣＤ８＋細胞を投与する前に、活性化ＣＤ８＋を細胞培養物から採取する。しかしながら、現在の提案されている他の治療方法とは異なり、本発明の方法は腫瘍形成性でない細胞培養系を使用することに注目することは重要である。従って、刺激細胞および活性化ＣＤ８＋細胞の完全な分離が実施されない場合、小数の刺激細胞の投与に関連することが既知の本質的な危険がないが、哺乳類の腫瘍−促進細胞の投与は極めて危険になることがある。
【０１０１】
細胞成分を再導入する方法は当技術分野において既知であり、Ｈｏｎｓｉｋらに付与された米国特許第４，８４４，８９３号およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇに付与された米国特許第４，６９０，９１５号に例示されているものなどの手法を含む。例えば、静脈内注入による活性化ＣＤ８＋の投与が適当である。
【０１０２】
本発明の免疫原性ペプチドはまた、モノクローナル抗体を作製するためにも使用することができる。このような抗体は、診断薬または治療薬の可能性のあるものとして有用となりうる。
【０１０３】
ペプチドはさらに診断試薬としての用途を見出すことができる。例えば、本発明のペプチドを使用して、本発明のペプチドまたは関連ペプチドを使用する治療方法に対する特定の個体の感受性を判定することができ、従って既存の治療プロトコールを改良する際または罹患個体の予後を判定する際に有用となりうる。また、ペプチドは、どの個体が慢性感染症を発症する実質的な危険状態にあるかを予測するためにも使用することができる。
【０１０４】
本発明のペプチドを同定するためには、クラスＩ抗原単離並びに天然に処理されたペプチドの単離および配列決定を関連する出願に記載されているように実施した。次いで、これらのペプチドを使用して、以下の対立遺伝子Ａ３．２、Ａ１、Ａ１１およびＡ２４．１の各々に特異的な結合モチーフを規定した。これらのモチーフは３頁（前頁）に記載されている。以下の表５〜８に記載するモチーフは、関連する用途に記載されている天然に処理されたペプチドの配列決定プールデータから規定される。
【０１０５】
【表５】ＨＬＡ−Ａ３．２対立遺伝子特異的モチーフの要約
【表６】ＨＬＡ−Ａ１対立遺伝子特異的モチーフの要約
【表７】ＨＬＡ−Ａ１１対立遺伝子特異的モチーフの要約
【表８】ＨＬＡ−Ａ２４．１対立遺伝子特異的モチーフの要約
実施例 １
免疫原性ペプチドの同定
種々のＭＨＣクラスＩ対立遺伝子について上記に同定したモチーフを使用して、種々の病原菌および腫瘍−関連タンパク質由来のアミノ酸配列をこれらのモチーフの存在について分析した。スクリーニングは関連する用途に記載するように実施した。表９〜１０は抗原の検索結果を提供する。
【０１１０】
【表９】
表１０に掲載するペプチドは上記のように同定し、それらが由来する病原菌または抗原により分類される。
【０１１２】
【表１０】
上記の説明は本発明を例示するために提供されているが、本発明の範囲を限定するために提供されるものではない。本発明の他の形態は当業者に容易に明らかになり、添付の特許請求の範囲内に含まれる。本明細書に引用されている刊行物、特許、および特許出願は全て参照として本明細書に組み入れられる。
Claims (11)
- 配列番号：１〜４２からなる群より選択される免疫原性ペプチドを含む組成物。
- 免疫原性ペプチドがＢ型肝炎ウイルス由来の配列を有し、配列番号：２０〜２４からなる群より選択される、請求項１記載の組成物。
- 免疫原性ペプチドがＣ型肝炎ウイルス由来の配列を有し、配列番号：２５〜２７からなる群より選択される、請求項１記載の組成物。
- 免疫原性ペプチドがヒト免疫不全症ウイルス由来の配列を有し、配列番号：２８〜３５からなる群より選択される、請求項１記載の組成物。
- 免疫原性ペプチドがＣＥＡ由来の配列を有し、配列番号：３６〜４２からなる群より選択される、請求項１記載の組成物。
- 薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１記載の組成物。
- ペプチドが第２の分子と混合または結合される、請求項１記載の組成物。
- リポソームをさらに含む、請求項１記載の組成物。
- ペプチドが抗原提示細胞に存在するＨＬＡ分子と複合体形成する、請求項１記載の組成物。
- 配列番号：１〜４２からなる群より選択される免疫原性ペプチドをコードする組換え核酸配列。
- 選択されたＨＬＡ分子を発現する患者においてあらかじめ選択された抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導する方法であって、患者由来の細胞傷害性Ｔ細胞を配列番号：１〜４２からなる群より選択される免疫原性ペプチドを含む組成物に接触させる段階を含む方法。
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