JP2004508051A - エナンチオマーに富むアミンの製造法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、フェニル酢酸誘導体を、アルカリゲネス ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）由来のＰｅｎ−Ｇアシラーゼの存在下で、アミンＨ２ＮＣＲ１Ｒ２Ｒ３（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は互いに同じではなく、各々独立して、Ｈ、ＣＮ、置換されたまたは置換されていない（シクロ）アルキル、アリール、アルキルアリールまたはアリールアルキル基、１以上のＮ、ＯまたはＳ原子を有する環式または非環式のヘテロアルキルまたはヘテロアリール基を表す）と接触させる、エナンチオマーに富むアシル化されたアミンの製造法に関する。また、アシル化されたアミンをアルカリゲネス ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）由来のＰｅｎ−Ｇアシラーゼと接触させる、式Ｈ２ＮＣＲ１Ｒ２Ｒ３（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は上記で定義した通りである）の、エナンチオマーに富むアミンの製造法にも関する。好ましくは、フェニル酢酸誘導体として、エナンチオマーに富むフェニルグリシンまたはｐ−ヒドロキシフェニルグリシンのエステルが適用される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、式１：
【化３】
［上記式中、Ｒ４は、置換されたまたは置換されていないフェニル基であり、ＸはＨ、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、１〜３個の炭素原子を有するアルキルまたはアルコキシを表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は互いに同じではなく、各々独立して、Ｈ、ＣＮ、置換されたまたは置換されていない（シクロ）アルキル、アリール、アルキルアリールまたはアリールアルキル基、１以上のＮ、ＯまたはＳ原子を有する環式または非環式のヘテロアルキルまたはヘテロアリール基を表す。］の、エナンチオマーに富むアシル化されたアミンの製造法において、式２：
【化４】
［上記式中、Ｒ４およびＸは上記で定義した通りであり、ＺはＣ１〜Ｃ７アルコキシ基；ＮＲ６Ｒ７（Ｒ６およびＲ７は各々独立して、Ｈ、置換されたまたは置換されていない（シクロ）アルキルまたはアリール基を表す）；ＮＨＮＨ２；ＮＨＯＲ８（Ｒ８はＨまたはＣ１〜Ｃ７アルキル基を表す）を表す。］のフェニル酢酸誘導体を、アルカリゲネス ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）由来のＰｅｎ−Ｇアシラーゼの存在下で、対応するアミンＨ２ＮＣＲ１Ｒ２Ｒ３（Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は上記で定義した通りである）のエナンチオマーの混合物と接触させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
化合物Ｈ２ＮＣＲ１Ｒ２Ｒ３のＰｅｎ−Ｇアシラーゼによるアシル化は、文献に記載されていない。Ｄ． Ｒｏｓｓｉら、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． （１９７８）， Ｖｏｌ．４３， Ｎｏ．１３， ２５７６−２５８１には、大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）由来のＰｅｎ−Ｇアシラーゼによる式１の化合物の加水分解が記載されている。しかし、驚いたことに、アルカリゲネス ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）由来の酵素が上記したアミンの製造において適用されると、大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）由来のＰｅｎ−Ｇアシラーゼと比較して、より高いエナンチオマー選択性が、アミンのアシル化およびアシル化されたアミンの加水分解の両方において達成され得ることが分かった。本発明に従う方法の更なる利点は、アルカリゲネス ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）由来の酵素が上記方法に最適な高いｐＨ値でより高い安定性を有することである。驚いたことに、アルカリゲネス ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）由来の酵素が適用されると、より高いＳ／Ｈ比（アシル化された生成物の合成とフェニル酢酸誘導体の加水分解との比）がアシル化において達成され得ることも分かった。さらに、アルカリゲネス ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）由来の酵素を用いると、より高い酵素活性が達成され得ることも明白であった。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、式１の化合物の加水分解による、エナンチオマーに富むアミンの製造法にも関する。本発明に従う方法によって得られた（アシル化された）アミンは、好ましくは、＞９０％、特に＞９５％、さらには＞９８％のエナンチオマー過剰（ｅｅ）を有する。
【０００４】
【発明の実施の形態】
本発明に従う方法によって製造され得る、エナンチオマーに富むアミンは、式１のアミン（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＸは上記で定義した通りである）である。アシルドナーもキラル中心を含む場合、式１のアシル化されたアミンがジアステレオマーであることは明らかであろう。従って、本発明の構成範囲内における式１の、エナンチオマーに富むアシル化されたアミンは、そのようなジアステレオマーに富む式１のアシル化されたアミンであるとも理解される。ここで、上記の富化は特に、Ｎ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３に結合する炭素原子に関する。
【０００５】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３における（ヘテロ）アルキル基は好ましくは、１〜２０個、特に１〜１０個の炭素原子を有する。（ヘテロ）シクロアルキル、（ヘテロ）アリール、（ヘテロ）アルキルアリール、（ヘテロ）アルキルアリール、（ヘテロ）アリールアルキル基は好ましくは、３〜２０個、特に３〜１２個の炭素原子を有する。それらは、例えば１位以上のハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、チオ、アルキルチオ、アリールチオ、シアノ、ニトロ、アミノ、（ジ）アルキルアミノ、アミド基で置換され得る。好ましくは、基Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１が（ヘテロ）アリール、（ヘテロ）アラルキルまたは（ヘテロ）アルカリール基を表す。アラルキルまたはアルカリール基のアルキル部分は好ましくは１〜３個の炭素原子であり、アリール基は好ましくはフェニル基であり、それらは、例えばヒドロキシ、アルコキシ、ハロゲンまたはニトロで置換され得る。本発明での使用に特に適する化合物の群は、式１に従う、エナンチオマーに富むアシル化されたアミンの群、または対応するアミンＨ２ＮＣＲ１Ｒ２Ｒ３の群であり、ここで、Ｒ１はＣＨ３ＯＨ、ＣＨ３の群から選択され、Ｒ２はＨ、ＣＨ３の群から選択され、Ｒ３はアルキル、好ましくは２〜４の炭素原子を有するアルキル、アラルキルまたはアラルキル（ここで、アルキル部分は好ましくは１〜３個の炭素原子であり、アリール基は好ましくはフェニル基である）の群から選択され、これらは例えばヒドロキシ、アルコキシ、ハロゲンまたはニトロで置換され得る。本発明に従う方法によって製造されまたは分解されるのに特に適するアミンは、例えばフェニルアルキルアミン、特に、１−フェニルエチルアミン、１−（ｐ−Ｃｌ−フェニル）エチルアミン、１−（１−ナフチル）エチルアミン、１−（２−ナフチル）エチルアミン、２−アミノ−４−フェニルブタン、１，１，１−トリフルオロ−２−アミノ−３−フェニルプロパン、１−フェニル−１−アミノ−２−エタノールである。Ｒ４におけるフェニル基上のありうる置換基は例えば、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロゲンまたはニトロである。
【０００６】
本発明に従う方法におけるフェニル酢酸誘導体（アシルドナー）として、例えば置換されたまたは置換されていないアミドまたは（置換された）酢酸のアルキルエステルが適用され、好ましくは、フェニル酢酸アミド、フェニル酢酸メチルエステルまたはフェニルグリシンアミドが適用される。フェニル酢酸誘導体がキラル中心を含むならば、フェニル酢酸誘導体は、好ましくは、できるだけ高いエナンチオマー純度で、例えばｅｅ（エナンチオマー過剰）＞９０％、好ましくは＞９５％、特に＞９８％で適用される。
【０００７】
好ましくは、フェニルグリシンアミドまたはｐ−ヒドロキシフェニルグリシンのエステルがアシルドナーとして適用される。フェニルグリシンアミドまたはｐ−ヒドロキシフェニルグリシンのエステルをアシルドナーとして適用することの更なる利点は、ほとんどの場合に、式１のアシル化されたアミンが結晶性の生成物であることである。これは、完全にはジアステレオマー的に純粋でない化合物が、簡単な結晶化工程を経てエナンチオマー的に純粋な化合物に精製され得ることを意味する。従って本発明は、式１のアシル化されたアミンにも関する。ここで、Ｘ＝ＮＨ２およびＲ４＝フェニルまたはｐ−ＯＨ−フェニルであり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は上記で定義した通りである。
【０００８】
アシル化は好ましくは、高いｐＨ、例えば６〜１１のｐＨ、特に８〜１１のｐＨで行われる。
【０００９】
アシルドナーとアミンとのモル比は好ましくは、０．５〜５、特に１〜３である。
【００１０】
加水分解が行われるｐＨは好ましくは、４〜８、特に５〜８である。
【００１１】
アシル化および加水分解が行われる温度は特に重要でなく、例えば０〜５０℃、特に０〜３０℃である。好ましくは、それらの反応が室温で行われる。
【００１２】
本発明に従う方法では、アルカリゲネス ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、例えばＡＴＣＣ１９０１８由来のアルカリゲネス ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、に由来するＰｅｎ−Ｇアシラーゼが適用される。その酵素は、所望により、固定化された形態で適用され得る。
【００１３】
そのような酵素は、一般に公知の技術によって得られ得る。本発明によって使用されるような酵素調製物は、純度などによって限定されず、粗酵素溶液および精製された酵素の両方であり得るが、所望の活性を有する（透過性にされた（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ）および／または固定化された）細胞、またはそのような活性を有する細胞のホモジェネートからも成り得る。酵素は、固定化された形態で、または化学的に修飾された形態でも使用され得る。本発明は、酵素が本発明のために使用されるところの形態によって決して制限されない。本発明の構成範囲内では、組換えＤＮＡ技術が適用されようとされまいと、遺伝的に改変された微生物に由来する酵素またはその変種も使用され得る。
【００１４】
アシル化および加水分解は好ましくは水中で、所望により、有機溶媒、例えばアセトニトリルまたは低級（Ｃ１〜Ｃ５）アルコールと混合された水中で行われる。
【００１５】
本発明は、アミンの分解（例えば、下記反応図に示す）のために特に十分適用され得る。その目的のために、一実施態様では、最初に、本発明に従って分解されるべきアミンのエナンチオマーの混合物が、フェニル酢酸誘導体によってＰｅｎ−Ｇアシラーゼを用いてエナンチオマー選択的にアシル化され、次いで、エナンチオマーに富むアシル化されたアミンが、アシル化されていないアミンから分離され、次いで、本発明に従う、エナンチオマーに富むアシル化されたアミンが加水分解され、エナンチオマーに富むアミンと適用されたフェニル酢酸誘導体に対応するフェニル酢酸との混合物が生成され、アミンのエナンチオマー過剰が、アシル化されたアミンのエナンチオマーまたはジアステレオマー過剰に関して再び増加される。例えばフェニルグリシンアミドがアシルドナーとして適用されるならば、所望により、さらに高いエナンチオマー過剰を有するアミンを得るために、最初に式１の中間生成物、アシル化されたアミンを結晶化し、こうして、アシル化されたアミンのジアステレオマー過剰をさらに増加させることもさらに可能である。
【００１６】
【化５】
【００１７】
アシル化されたアミンとアシル化されていないアミンとの分離は、反応条件および選択された基質に応じて、公知の方法、例えば結晶化、抽出または相分離、によって行われ得る。
【００１８】
アミンを分解するための別の実施態様では、エナンチオマーの混合物が、例えば化学的にまたは有機溶媒中のリパーゼによって酵素的に、エナンチオマー選択的にアシル化され、そしてアシル化されたアミンが、アシル化されていないアミンから分離され、次いで本発明に従うアシル化されたアミンが、アルカリゲネス ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）から誘導される酵素によって加水分解される。
【００１９】
【実施例】
本発明を、下記実施例に基づいてさらに説明するが、本発明はそれらによって限定されない。
【００２０】
実施例Ｉ
Ａ ． ファエカリス（ Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ ）の助けによる、フェニルアセタミドによる（Ｒ，Ｓ）−１−フェニルエチルアミンの酵素的アシル化
０．４０ｇ（３．３ミリモル）の（Ｒ，Ｓ）−１−フェニルエチルアミンを１４ｍｌの水に添加し、ｐＨを３ＮのＨＣｌによって１０にした。次いで、０．４１ｇ（３．０ミリモル）のフェニルアセタミドを添加し、次いで、少量の水を添加して総反応体積を１５ｍｌにした。反応混合物を次いで５分間撹拌した。そのプロセスにおいて（Ｒ，Ｓ）−１−フェニルエチルアミンが溶液になり、反応混合物の温度が２５℃にされた。次いで、水中のＡ．ファエカリス（Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ）の溶液（２．３ｘ１０−４Ｍ、１０６０Ｕ／ｍｌ；１Ｕは、ｐＨ＝８．０およびＴ＝３４℃で１分につき１μモルのＰｅｎ−Ｇを加水分解する酵素の量として定義される）の０．０７８ｍｌを添加した。酵素的アシル化の間、ｐＨは２ＭのＫＯＨ溶液により１０で保持された。５０分後、約５０％のアシル化が達成された。析出した生成物を濾取し、２ｘ２ｍｌの水で洗浄し、そして乾燥させて一定重量にした。
収量：０．５４ｇ（２．３ミリモル、４８％）のＮ−フェニルアセチル−（Ｒ）−１−フェニルエチルアミン、ｅ．ｅ．９８％、Ｅ＝約１００
【００２１】
比較例Ａ
大腸菌（ Ｅ． Ｃｏｌｉ ）の助けによる、フェニルアセタミドによる（Ｒ，Ｓ）−１−フェニルエチルアミンの酵素的アシル化
０．４８ｇ（４．０ミリモル）の（Ｒ，Ｓ）−１−フェニルエチルアミンを２０ｍｌの水に添加し、ｐＨを３ＭのＨ２ＳＯ４によって１０にした。次いで、１．３５ｇ（１０．０ミリモル）のフェニルアセタミドを添加し、反応混合物の温度を０℃にした。次いで、水中の大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）の溶液（５．７ｘ１０−４Ｍ、１５６０Ｕ／ｍｌ）の０．１ｍｌを添加した。酵素的アシル化の間、ｐＨは２ＭのＮａＯＨ溶液により１０で保持された。反応を、キラルＨＰＬＣ分析によって適時に追跡した。Ｎ−フェニルアセチル−（Ｒ）−１−フェニルエチルアミンに関してＥ＝約５であることが分かった。
【００２２】
実施例 ＩＩ
Ａ ． ファエカリス（ Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ ）の助けによる、Ｎ−フェニルアセチル−（Ｒ， Ｓ）−１−フェニルエチルアミンの酵素的脱アシル化
０．３３ｇ（１．４ミリモル）のＮ−フェニルアセチル−（Ｒ，Ｓ）−１−フェニルエチルアミンを１０ｍｌの水／メタノール（８０：２０Ｖ／Ｖ）に２５℃で添加し、ｐＨを７．５にした。次いで、水中のＡ．ファエカリス（Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ）の溶液（２．３ｘ１０−４Ｍ、１０６０Ｕ／ｍｌ）の２．０μｌを添加した。酵素的アシル化の間、ｐＨを３ＭのＨ２ＳＯ４溶液によって７．５で保持した。反応を、キラルＨＰＬＣ分析によって適時に追跡した。１時間後、約５０％の転化がＥ＝約３００とともに認められた。
【００２３】
比較例Ｂ
大腸菌（ Ｅ． Ｃｏｌｉ ）の助けによる、Ｎ−フェニルアセチル−（Ｒ，Ｓ）−１−フェニルエチルアミンの酵素的脱アシル化
０．３３ｇ（１．４ミリモル）のＮ−フェニルアセチル−（Ｒ，Ｓ）−１−フェニルエチルアミンを１０ｍｌの水／メタノール（８０：２０Ｖ／Ｖ）に２５℃で添加し、ｐＨを７．５にした。次いで、水中の大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）の溶液（５．７ｘ１０−４Ｍ、１５６０Ｕ／ｍｌ）の０．５μｌを添加した。酵素的アシル化の間、ｐＨを３ＭのＨ２ＳＯ４溶液によって７．５で保持した。反応を、キラルＨＰＬＣ分析によって適時に追跡した。８時間後、約５０％の転化がＥ＝約１０とともに認められた。
【００２４】
実施例 ＩＩＩ
Ａ ． ファエカリス（ Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ ）の助けによる、フェニルアセタミドによる（Ｒ，Ｓ）−２−アミノ−４−フェニルブタンの酵素的アシル化
０．３３ｇ（２．２ミリモル）の（Ｒ，Ｓ）−２−アミノ−４−フェニルブタンおよび０．３７ｇ（２．７ミリモル）のフェニルアセタミドを１０ｍｌの水に添加した。次いで、ｐＨを３ＮのＨＣｌによって１０にし、そして、少量の水を添加して総反応体積を１２ｍｌにした。反応混合物を次いで５分間撹拌した。その間に、反応混合物の温度が２５℃にされた。次いで、水中のＡ．ファエカリス（Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ）の溶液（２．３ｘ１０−４Ｍ、１０６０Ｕ／ｍｌ）の０．０９６ｍｌを添加した。酵素的アシル化の間、ｐＨは２ＭのＫＯＨ溶液により１０で保持された。８〜９分後、約５０％のアシル化が達成された。析出した生成物を濾取し、２ｘ２ｍｌの水で洗浄し、そして乾燥させて一定重量にした。
収量：２．７ｇ（１．０ミリモル、４５％）のＮ−フェニルアセチル−（Ｒ）−２−アミノ−４−フェニルブタン、ｅ．ｅ．＝９８％、Ｅ＝約１００
【００２５】
比較例Ｃ
大腸菌（ Ｅ． Ｃｏｌｉ ）の助けによる、フェニルアセタミドによる（Ｒ，Ｓ）−２−アミノ−４−フェニルブタンの酵素的アシル化
０．６０ｇ（４．０ミリモル）の（Ｒ，Ｓ）−２−アミノ−４−フェニルブタンを２０ｍｌの水に添加し、ｐＨを３ＭのＨ２ＳＯ４によって１０にした。次いで、１．３５ｇ（１０．０ミリモル）のフェニルアセタミドを添加し、反応混合物の温度を０℃にした。次いで、水中の大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）の溶液（５．７ｘ１０−４Ｍ、１５６０Ｕ／ｍｌ）の０．１ｍｌを添加した。酵素的アシル化の間、ｐＨは２ＭのＮａＯＨ溶液により１０で保持された。反応を、キラルＨＰＬＣ分析によって適時に追跡した。Ｎ−フェニルアセチル−（Ｒ）−２−アミノ−４−フェニルブタンに関してＥ＝約２であることが分かった。
【００２６】
実施例ＩＶ
Ａ ． ファエカリス（ Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ ）の助けによる、Ｎ−フェニルアセチル−（Ｒ，Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−アミノ−３−フェニルプロパンの酵素的脱アシル化
０．１２ｇ（０．４ミリモル）のＮ−フェニルアセチル−（Ｒ，Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−アミノ−３−フェニルプロパンを１０ｍｌの水／メタノール（７０：３０Ｖ／Ｖ）に２５℃で添加し、ｐＨを７．５にした。次いで、水中のＡ．ファエカリス（Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ）の溶液（２．３ｘ１０−４Ｍ、１０６０Ｕ／ｍｌ）の１．７μｌを添加した。酵素的アシル化の間、ｐＨを３ＭのＨ２ＳＯ４溶液によって７．５で保持した。反応を、キラルＨＰＬＣ分析によって適時に追跡した。２時間後、約５０％の転化がＥ＝約１００とともに認められた。
【００２７】
比較例Ｄ
大腸菌（ Ｅ． Ｃｏｌｉ ）の助けによる、Ｎ−フェニルアセチル−（Ｒ，Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−アミノ−３−フェニルプロパンの酵素的脱アシル化
０．１２ｇ（０．４ミリモル）のＮ−フェニルアセチル−（Ｒ，Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−アミノ−３−フェニルプロパンを１０ｍｌの水／メタノール（７０：３０Ｖ／Ｖ）に２５℃で添加し、ｐＨを７．５にした。次いで、水中の大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）の溶液（５．７ｘ１０−４Ｍ、１５６０Ｕ／ｍｌ）の３．６μｌを添加した。酵素的アシル化の間、ｐＨを３ＭのＨ２ＳＯ４溶液によって７．５で保持した。反応を、キラルＨＰＬＣ分析によって適時に追跡した。１．５時間後、約５０％の転化がＥ＝約１．３とともに認められた。
【００２８】
実施例Ｖ
Ａ ． ファエカリス（ Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ ）の助けによる、フェニルアセタミドによる（Ｒ，Ｓ）−１−（Ｐ−クロロフェニル）エチルアミンの酵素的アシル化
０．３１ｇ（２．０ミリモル）の（Ｒ，Ｓ）−１−（Ｐ−クロロフェニル）エチルアミンおよび０．２２ｇ（１．６ミリモル）のフェニルアセタミドを１７ｍｌの水および２ｍｌのメタノールに添加した。ｐＨを３ＮのＨＣｌによって１０にした後、反応混合物に水を添加して最終体積を２０ｍｌにした。反応混合物を次いで５分間撹拌し、反応混合物の温度は２５℃にされた。次いで、水中のＡ．ファエカリス（Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ）の溶液（２．３ｘ１０−４Ｍ、１０６０Ｕ／ｍｌ）の０．１４８ｍｌを添加した。酵素的アシル化の間、ｐＨは２ＭのＫＯＨ溶液により１０で保持された。１０分後、約５０％のアシル化が達成された。４０分後、キラルＨＰＬＣによって、生成物のエナンチオマー過剰ｅｅ＝９９．３％であることが測定された。これは、Ｅ＝約１６００に相当する。
【００２９】
比較例Ｅ
大腸菌（ Ｅ． Ｃｏｌｉ ）の助けによる、フェニルアセタミドによる（Ｒ，Ｓ）−１−（Ｐ−クロロフェニル）エチルアミンの酵素的アシル化
実施例Ｉに記載したものに匹敵する条件下で、０．１９ｇ（１．２ミリモル）の（Ｒ，Ｓ）−１−（Ｐ−クロロフェニル）エチルアミンおよび０．１３ｇ（０．９６ミリモル）のフェニルアセタミドを１０ｍｌの水および１．２ｍｌのメタノールに添加した。ｐＨを３ＮのＨＣｌによって１０にした後、反応混合物に水を添加して最終体積を１２ｍｌにした。反応混合物を次いで５分間撹拌し、反応混合物の温度は２５℃にされた。次いで、水中の大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）の溶液（５．７ｘ１０−４Ｍ、１５６０Ｕ／ｍｌ）の０．３３０ｍｌを添加した。酵素的アシル化の間、ｐＨは２ＭのＫＯＨ溶液により１０で保持された。４０分後、約０．５％のアシル化が測定された。
【００３０】
実施例ＶＩ
Ａ ． ファエカリス（ Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ ）由来のｐｅｎ−Ｇアシラーゼ（１．１μＭ）によって触媒される、一定ｐＨ１０での、アシルドナーとしてのフェニルアセタミド（０．２Ｍ）による（Ｒ，Ｓ）−１−（２−ナフチル）エチルアミン（０．２Ｍ）の酵素的アシル化
０．２７４ｇの（Ｒ，Ｓ）−１−（２−ナフチル）エチルアミン（ＭＷ１７１）を７．５ｍｌの水に添加し、ｐＨを３ＮのＨＣｌによって１０に調整した。０．２１６ｇのフェニルアセタミド（ＭＷ１３５）をその溶液に添加し、７．９６ｍｌの最終溶液を有するために、何らかの追加量の水を添加した。一定温度（２５℃）に達し、そして試薬の飽和溶液を得るために、サーモスタット付きのセル中で反応混合物を５〜１０分混合し、最初の酵素溶液（２．３ｘ１０−４Ｍ ＰＡ−Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ）の３９μｌを添加して酵素的アシル化を開始した。ＫＯＨ溶液によって反応混合物を滴定することにより一定ｐＨ値（ｐＨ１０）で、ｐＨ安定装置付きセル中で反応を行った。
アシル化の立体特異性２５０（Ｒ）、合成速度２４０ｓ−１、初期Ｓ／Ｈ比６．５。
２０分で、転化が４６．８％に達した。生成物のｅｅは９８．１％であった。
【００３１】
比較例Ｆ
大腸菌（ Ｅ． Ｃｏｌｉ ）由来のｐｅｎ−Ｇアシラーゼ（１０μＭ）によって触媒される、一定ｐＨ１０での、アシルドナーとしてのフェニルアセタミド（０．２Ｍ）による（Ｒ，Ｓ）−１−（２−ナフチル）エチルアミン（０．２Ｍ）の酵素的アシル化
０．２７４ｇの（Ｒ，Ｓ）−１−（２−ナフチル）エチルアミン（ＭＷ１７１）を７．５ｍｌの水に添加し、ｐＨを３ＮのＨＣｌによって１０に調整した。０．２１６ｇのフェニルアセタミド（ＭＷ１３５）をその溶液に添加し、７．７３５ｍｌの最終溶液を有するために、何らかの追加量の水を添加した。一定温度（２５℃）に達し、そして試薬の飽和溶液を得るために、サーモスタット付きのセル中で反応混合物を５〜１０分混合し、最初の酵素溶液（３．０ｘ１０−４Ｍ ＰＡ−Ｅ． Ｃｏｌｉ）の２６５μｌを添加して酵素的アシル化を開始した。ＫＯＨ溶液によって反応混合物を滴定することにより一定ｐＨ値（ｐＨ１０）で、ｐＨ安定装置付きセル中で反応を行った。
アシル化の立体特異性２２（Ｒ）、合成速度約１１ｓ−１、初期Ｓ／Ｈ比０．４２。
酵素は１５分で全ての活性を失った。このときまでに、約１８％のアミンのアシル化が達成されたにすぎず、生成物のｅｅは８９．７％であった。
【００３２】
実施例Ｖ ＩＩ
Ａ ． ファエカリス（ Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ ）の助けによる、フェニルアセタミドによる（Ｒ，Ｓ）−フェニルグリシノールの酵素的アシル化
０．４１ｇ（３．０ミリモル）の（Ｒ，Ｓ）−フェニルグリシノールおよび０．５１ｇ（３．７ミリモル）のフェニルアセタミドを１５ｍｌの水に添加した。ｐＨを１０にした。次いで、反応混合物を５分間撹拌し、反応混合物の温度は２５℃にされた。次いで、水中のＡ．ファエカリス（Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ）の溶液（１．５ｘ１０−４Ｍ、６９０Ｕ／ｍｌ）の０．１４４ｍｌを添加した。酵素的アシル化の間、ｐＨは２ＭのＫＯＨ溶液により１０で保持された。４５分後、ＨＰＬＣによって、５０．６％の最大転化が測定された。この非常に高いＥ値の正確な見積もりは、これらの実験に基づいては不可能である。従って、Ｅ値は、別個のエナンチオマーの動的定数に基づいて決定された（実施例ＶＩＩＩを参照）。
【００３３】
実施例Ｖ ＩＩＩ
Ａ ． ファエカリス（ Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ ）および大腸菌（ Ｅ． Ｃｏｌｉ ）の助けによる、フェニルアセタミドおよび（Ｄ）フェミルグリシンアミドによる（Ｒ，Ｓ）−フェニルグリシノールのアシル化のＥ値の、別個のエナンチオマーの動的定数の決定に基づく決定
０． ０６９ｇ（０．５ミリモル）の（Ｒ）または（Ｓ）フェニルグリシノールおよび０．１４ｇ（１．０ミリモル）のフェニルアセタミドまたは０．１５ｇ（１．０ミリモル）の（Ｄ）フェニルフリシンアミドを約４ｍｌの水に添加した。ｐＨを３ＮのＨＣｌによって９．５〜１０にした後、体積を５．０ｍｌの最終体積にした。次いで、反応混合物を２５℃で５分間、インキュベートした。Ａ．ファエカリス（Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ）の溶液（１．５ｘ１０−４Ｍ、６９０Ｕ／ｍｌ）の０．０５ｍｌまたは大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）の溶液（３．３ｘ１０−４Ｍ、９００Ｕ／ｍｌ）の０．３ｍｌを添加することにより反応を開始した。酵素的アシル化の間、ｐＨを２ＭのＫＯＨ溶液によって９．５〜１０で保持した。種々の反応のＥ値を、別個のエナンチオマーの初期アシル化速度の測定による動的定数に基づいて決定した。
【００３４】
【表１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、式１：
【化３】
【化４】
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
化合物Ｈ２ＮＣＲ１Ｒ２Ｒ３のＰｅｎ−Ｇアシラーゼによるアシル化は、文献に記載されていない。Ｄ． Ｒｏｓｓｉら、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． （１９７８）， Ｖｏｌ．４３， Ｎｏ．１３， ２５７６−２５８１には、大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）由来のＰｅｎ−Ｇアシラーゼによる式１の化合物の加水分解が記載されている。しかし、驚いたことに、アルカリゲネス ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）由来の酵素が上記したアミンの製造において適用されると、大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）由来のＰｅｎ−Ｇアシラーゼと比較して、より高いエナンチオマー選択性が、アミンのアシル化およびアシル化されたアミンの加水分解の両方において達成され得ることが分かった。本発明に従う方法の更なる利点は、アルカリゲネス ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）由来の酵素が上記方法に最適な高いｐＨ値でより高い安定性を有することである。驚いたことに、アルカリゲネス ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）由来の酵素が適用されると、より高いＳ／Ｈ比（アシル化された生成物の合成とフェニル酢酸誘導体の加水分解との比）がアシル化において達成され得ることも分かった。さらに、アルカリゲネス ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）由来の酵素を用いると、より高い酵素活性が達成され得ることも明白であった。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、式１の化合物の加水分解による、エナンチオマーに富むアミンの製造法にも関する。本発明に従う方法によって得られた（アシル化された）アミンは、好ましくは、＞９０％、特に＞９５％、さらには＞９８％のエナンチオマー過剰（ｅｅ）を有する。
【０００４】
【発明の実施の形態】
本発明に従う方法によって製造され得る、エナンチオマーに富むアミンは、式１のアミン（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＸは上記で定義した通りである）である。アシルドナーもキラル中心を含む場合、式１のアシル化されたアミンがジアステレオマーであることは明らかであろう。従って、本発明の構成範囲内における式１の、エナンチオマーに富むアシル化されたアミンは、そのようなジアステレオマーに富む式１のアシル化されたアミンであるとも理解される。ここで、上記の富化は特に、Ｎ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３に結合する炭素原子に関する。
【０００５】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３における（ヘテロ）アルキル基は好ましくは、１〜２０個、特に１〜１０個の炭素原子を有する。（ヘテロ）シクロアルキル、（ヘテロ）アリール、（ヘテロ）アルキルアリール、（ヘテロ）アルキルアリール、（ヘテロ）アリールアルキル基は好ましくは、３〜２０個、特に３〜１２個の炭素原子を有する。それらは、例えば１位以上のハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、チオ、アルキルチオ、アリールチオ、シアノ、ニトロ、アミノ、（ジ）アルキルアミノ、アミド基で置換され得る。好ましくは、基Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の少なくとも１が（ヘテロ）アリール、（ヘテロ）アラルキルまたは（ヘテロ）アルカリール基を表す。アラルキルまたはアルカリール基のアルキル部分は好ましくは１〜３個の炭素原子であり、アリール基は好ましくはフェニル基であり、それらは、例えばヒドロキシ、アルコキシ、ハロゲンまたはニトロで置換され得る。本発明での使用に特に適する化合物の群は、式１に従う、エナンチオマーに富むアシル化されたアミンの群、または対応するアミンＨ２ＮＣＲ１Ｒ２Ｒ３の群であり、ここで、Ｒ１はＣＨ３ＯＨ、ＣＨ３の群から選択され、Ｒ２はＨ、ＣＨ３の群から選択され、Ｒ３はアルキル、好ましくは２〜４の炭素原子を有するアルキル、アラルキルまたはアラルキル（ここで、アルキル部分は好ましくは１〜３個の炭素原子であり、アリール基は好ましくはフェニル基である）の群から選択され、これらは例えばヒドロキシ、アルコキシ、ハロゲンまたはニトロで置換され得る。本発明に従う方法によって製造されまたは分解されるのに特に適するアミンは、例えばフェニルアルキルアミン、特に、１−フェニルエチルアミン、１−（ｐ−Ｃｌ−フェニル）エチルアミン、１−（１−ナフチル）エチルアミン、１−（２−ナフチル）エチルアミン、２−アミノ−４−フェニルブタン、１，１，１−トリフルオロ−２−アミノ−３−フェニルプロパン、１−フェニル−１−アミノ−２−エタノールである。Ｒ４におけるフェニル基上のありうる置換基は例えば、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロゲンまたはニトロである。
【０００６】
本発明に従う方法におけるフェニル酢酸誘導体（アシルドナー）として、例えば置換されたまたは置換されていないアミドまたは（置換された）酢酸のアルキルエステルが適用され、好ましくは、フェニル酢酸アミド、フェニル酢酸メチルエステルまたはフェニルグリシンアミドが適用される。フェニル酢酸誘導体がキラル中心を含むならば、フェニル酢酸誘導体は、好ましくは、できるだけ高いエナンチオマー純度で、例えばｅｅ（エナンチオマー過剰）＞９０％、好ましくは＞９５％、特に＞９８％で適用される。
【０００７】
好ましくは、フェニルグリシンアミドまたはｐ−ヒドロキシフェニルグリシンのエステルがアシルドナーとして適用される。フェニルグリシンアミドまたはｐ−ヒドロキシフェニルグリシンのエステルをアシルドナーとして適用することの更なる利点は、ほとんどの場合に、式１のアシル化されたアミンが結晶性の生成物であることである。これは、完全にはジアステレオマー的に純粋でない化合物が、簡単な結晶化工程を経てエナンチオマー的に純粋な化合物に精製され得ることを意味する。従って本発明は、式１のアシル化されたアミンにも関する。ここで、Ｘ＝ＮＨ２およびＲ４＝フェニルまたはｐ−ＯＨ−フェニルであり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は上記で定義した通りである。
【０００８】
アシル化は好ましくは、高いｐＨ、例えば６〜１１のｐＨ、特に８〜１１のｐＨで行われる。
【０００９】
アシルドナーとアミンとのモル比は好ましくは、０．５〜５、特に１〜３である。
【００１０】
加水分解が行われるｐＨは好ましくは、４〜８、特に５〜８である。
【００１１】
アシル化および加水分解が行われる温度は特に重要でなく、例えば０〜５０℃、特に０〜３０℃である。好ましくは、それらの反応が室温で行われる。
【００１２】
本発明に従う方法では、アルカリゲネス ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、例えばＡＴＣＣ１９０１８由来のアルカリゲネス ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、に由来するＰｅｎ−Ｇアシラーゼが適用される。その酵素は、所望により、固定化された形態で適用され得る。
【００１３】
そのような酵素は、一般に公知の技術によって得られ得る。本発明によって使用されるような酵素調製物は、純度などによって限定されず、粗酵素溶液および精製された酵素の両方であり得るが、所望の活性を有する（透過性にされた（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ）および／または固定化された）細胞、またはそのような活性を有する細胞のホモジェネートからも成り得る。酵素は、固定化された形態で、または化学的に修飾された形態でも使用され得る。本発明は、酵素が本発明のために使用されるところの形態によって決して制限されない。本発明の構成範囲内では、組換えＤＮＡ技術が適用されようとされまいと、遺伝的に改変された微生物に由来する酵素またはその変種も使用され得る。
【００１４】
アシル化および加水分解は好ましくは水中で、所望により、有機溶媒、例えばアセトニトリルまたは低級（Ｃ１〜Ｃ５）アルコールと混合された水中で行われる。
【００１５】
本発明は、アミンの分解（例えば、下記反応図に示す）のために特に十分適用され得る。その目的のために、一実施態様では、最初に、本発明に従って分解されるべきアミンのエナンチオマーの混合物が、フェニル酢酸誘導体によってＰｅｎ−Ｇアシラーゼを用いてエナンチオマー選択的にアシル化され、次いで、エナンチオマーに富むアシル化されたアミンが、アシル化されていないアミンから分離され、次いで、本発明に従う、エナンチオマーに富むアシル化されたアミンが加水分解され、エナンチオマーに富むアミンと適用されたフェニル酢酸誘導体に対応するフェニル酢酸との混合物が生成され、アミンのエナンチオマー過剰が、アシル化されたアミンのエナンチオマーまたはジアステレオマー過剰に関して再び増加される。例えばフェニルグリシンアミドがアシルドナーとして適用されるならば、所望により、さらに高いエナンチオマー過剰を有するアミンを得るために、最初に式１の中間生成物、アシル化されたアミンを結晶化し、こうして、アシル化されたアミンのジアステレオマー過剰をさらに増加させることもさらに可能である。
【００１６】
【化５】
アシル化されたアミンとアシル化されていないアミンとの分離は、反応条件および選択された基質に応じて、公知の方法、例えば結晶化、抽出または相分離、によって行われ得る。
【００１８】
アミンを分解するための別の実施態様では、エナンチオマーの混合物が、例えば化学的にまたは有機溶媒中のリパーゼによって酵素的に、エナンチオマー選択的にアシル化され、そしてアシル化されたアミンが、アシル化されていないアミンから分離され、次いで本発明に従うアシル化されたアミンが、アルカリゲネス ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）から誘導される酵素によって加水分解される。
【００１９】
【実施例】
本発明を、下記実施例に基づいてさらに説明するが、本発明はそれらによって限定されない。
【００２０】
実施例Ｉ
Ａ ． ファエカリス（ Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ ）の助けによる、フェニルアセタミドによる（Ｒ，Ｓ）−１−フェニルエチルアミンの酵素的アシル化
０．４０ｇ（３．３ミリモル）の（Ｒ，Ｓ）−１−フェニルエチルアミンを１４ｍｌの水に添加し、ｐＨを３ＮのＨＣｌによって１０にした。次いで、０．４１ｇ（３．０ミリモル）のフェニルアセタミドを添加し、次いで、少量の水を添加して総反応体積を１５ｍｌにした。反応混合物を次いで５分間撹拌した。そのプロセスにおいて（Ｒ，Ｓ）−１−フェニルエチルアミンが溶液になり、反応混合物の温度が２５℃にされた。次いで、水中のＡ．ファエカリス（Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ）の溶液（２．３ｘ１０−４Ｍ、１０６０Ｕ／ｍｌ；１Ｕは、ｐＨ＝８．０およびＴ＝３４℃で１分につき１μモルのＰｅｎ−Ｇを加水分解する酵素の量として定義される）の０．０７８ｍｌを添加した。酵素的アシル化の間、ｐＨは２ＭのＫＯＨ溶液により１０で保持された。５０分後、約５０％のアシル化が達成された。析出した生成物を濾取し、２ｘ２ｍｌの水で洗浄し、そして乾燥させて一定重量にした。
収量：０．５４ｇ（２．３ミリモル、４８％）のＮ−フェニルアセチル−（Ｒ）−１−フェニルエチルアミン、ｅ．ｅ．９８％、Ｅ＝約１００
【００２１】
比較例Ａ
大腸菌（ Ｅ． Ｃｏｌｉ ）の助けによる、フェニルアセタミドによる（Ｒ，Ｓ）−１−フェニルエチルアミンの酵素的アシル化
０．４８ｇ（４．０ミリモル）の（Ｒ，Ｓ）−１−フェニルエチルアミンを２０ｍｌの水に添加し、ｐＨを３ＭのＨ２ＳＯ４によって１０にした。次いで、１．３５ｇ（１０．０ミリモル）のフェニルアセタミドを添加し、反応混合物の温度を０℃にした。次いで、水中の大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）の溶液（５．７ｘ１０−４Ｍ、１５６０Ｕ／ｍｌ）の０．１ｍｌを添加した。酵素的アシル化の間、ｐＨは２ＭのＮａＯＨ溶液により１０で保持された。反応を、キラルＨＰＬＣ分析によって適時に追跡した。Ｎ−フェニルアセチル−（Ｒ）−１−フェニルエチルアミンに関してＥ＝約５であることが分かった。
【００２２】
実施例 ＩＩ
Ａ ． ファエカリス（ Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ ）の助けによる、Ｎ−フェニルアセチル−（Ｒ， Ｓ）−１−フェニルエチルアミンの酵素的脱アシル化
０．３３ｇ（１．４ミリモル）のＮ−フェニルアセチル−（Ｒ，Ｓ）−１−フェニルエチルアミンを１０ｍｌの水／メタノール（８０：２０Ｖ／Ｖ）に２５℃で添加し、ｐＨを７．５にした。次いで、水中のＡ．ファエカリス（Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ）の溶液（２．３ｘ１０−４Ｍ、１０６０Ｕ／ｍｌ）の２．０μｌを添加した。酵素的アシル化の間、ｐＨを３ＭのＨ２ＳＯ４溶液によって７．５で保持した。反応を、キラルＨＰＬＣ分析によって適時に追跡した。１時間後、約５０％の転化がＥ＝約３００とともに認められた。
【００２３】
比較例Ｂ
大腸菌（ Ｅ． Ｃｏｌｉ ）の助けによる、Ｎ−フェニルアセチル−（Ｒ，Ｓ）−１−フェニルエチルアミンの酵素的脱アシル化
０．３３ｇ（１．４ミリモル）のＮ−フェニルアセチル−（Ｒ，Ｓ）−１−フェニルエチルアミンを１０ｍｌの水／メタノール（８０：２０Ｖ／Ｖ）に２５℃で添加し、ｐＨを７．５にした。次いで、水中の大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）の溶液（５．７ｘ１０−４Ｍ、１５６０Ｕ／ｍｌ）の０．５μｌを添加した。酵素的アシル化の間、ｐＨを３ＭのＨ２ＳＯ４溶液によって７．５で保持した。反応を、キラルＨＰＬＣ分析によって適時に追跡した。８時間後、約５０％の転化がＥ＝約１０とともに認められた。
【００２４】
実施例 ＩＩＩ
Ａ ． ファエカリス（ Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ ）の助けによる、フェニルアセタミドによる（Ｒ，Ｓ）−２−アミノ−４−フェニルブタンの酵素的アシル化
０．３３ｇ（２．２ミリモル）の（Ｒ，Ｓ）−２−アミノ−４−フェニルブタンおよび０．３７ｇ（２．７ミリモル）のフェニルアセタミドを１０ｍｌの水に添加した。次いで、ｐＨを３ＮのＨＣｌによって１０にし、そして、少量の水を添加して総反応体積を１２ｍｌにした。反応混合物を次いで５分間撹拌した。その間に、反応混合物の温度が２５℃にされた。次いで、水中のＡ．ファエカリス（Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ）の溶液（２．３ｘ１０−４Ｍ、１０６０Ｕ／ｍｌ）の０．０９６ｍｌを添加した。酵素的アシル化の間、ｐＨは２ＭのＫＯＨ溶液により１０で保持された。８〜９分後、約５０％のアシル化が達成された。析出した生成物を濾取し、２ｘ２ｍｌの水で洗浄し、そして乾燥させて一定重量にした。
収量：２．７ｇ（１．０ミリモル、４５％）のＮ−フェニルアセチル−（Ｒ）−２−アミノ−４−フェニルブタン、ｅ．ｅ．＝９８％、Ｅ＝約１００
【００２５】
比較例Ｃ
大腸菌（ Ｅ． Ｃｏｌｉ ）の助けによる、フェニルアセタミドによる（Ｒ，Ｓ）−２−アミノ−４−フェニルブタンの酵素的アシル化
０．６０ｇ（４．０ミリモル）の（Ｒ，Ｓ）−２−アミノ−４−フェニルブタンを２０ｍｌの水に添加し、ｐＨを３ＭのＨ２ＳＯ４によって１０にした。次いで、１．３５ｇ（１０．０ミリモル）のフェニルアセタミドを添加し、反応混合物の温度を０℃にした。次いで、水中の大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）の溶液（５．７ｘ１０−４Ｍ、１５６０Ｕ／ｍｌ）の０．１ｍｌを添加した。酵素的アシル化の間、ｐＨは２ＭのＮａＯＨ溶液により１０で保持された。反応を、キラルＨＰＬＣ分析によって適時に追跡した。Ｎ−フェニルアセチル−（Ｒ）−２−アミノ−４−フェニルブタンに関してＥ＝約２であることが分かった。
【００２６】
実施例ＩＶ
Ａ ． ファエカリス（ Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ ）の助けによる、Ｎ−フェニルアセチル−（Ｒ，Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−アミノ−３−フェニルプロパンの酵素的脱アシル化
０．１２ｇ（０．４ミリモル）のＮ−フェニルアセチル−（Ｒ，Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−アミノ−３−フェニルプロパンを１０ｍｌの水／メタノール（７０：３０Ｖ／Ｖ）に２５℃で添加し、ｐＨを７．５にした。次いで、水中のＡ．ファエカリス（Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ）の溶液（２．３ｘ１０−４Ｍ、１０６０Ｕ／ｍｌ）の１．７μｌを添加した。酵素的アシル化の間、ｐＨを３ＭのＨ２ＳＯ４溶液によって７．５で保持した。反応を、キラルＨＰＬＣ分析によって適時に追跡した。２時間後、約５０％の転化がＥ＝約１００とともに認められた。
【００２７】
比較例Ｄ
大腸菌（ Ｅ． Ｃｏｌｉ ）の助けによる、Ｎ−フェニルアセチル−（Ｒ，Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−アミノ−３−フェニルプロパンの酵素的脱アシル化
０．１２ｇ（０．４ミリモル）のＮ−フェニルアセチル−（Ｒ，Ｓ）−１，１，１−トリフルオロ−２−アミノ−３−フェニルプロパンを１０ｍｌの水／メタノール（７０：３０Ｖ／Ｖ）に２５℃で添加し、ｐＨを７．５にした。次いで、水中の大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）の溶液（５．７ｘ１０−４Ｍ、１５６０Ｕ／ｍｌ）の３．６μｌを添加した。酵素的アシル化の間、ｐＨを３ＭのＨ２ＳＯ４溶液によって７．５で保持した。反応を、キラルＨＰＬＣ分析によって適時に追跡した。１．５時間後、約５０％の転化がＥ＝約１．３とともに認められた。
【００２８】
実施例Ｖ
Ａ ． ファエカリス（ Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ ）の助けによる、フェニルアセタミドによる（Ｒ，Ｓ）−１−（Ｐ−クロロフェニル）エチルアミンの酵素的アシル化
０．３１ｇ（２．０ミリモル）の（Ｒ，Ｓ）−１−（Ｐ−クロロフェニル）エチルアミンおよび０．２２ｇ（１．６ミリモル）のフェニルアセタミドを１７ｍｌの水および２ｍｌのメタノールに添加した。ｐＨを３ＮのＨＣｌによって１０にした後、反応混合物に水を添加して最終体積を２０ｍｌにした。反応混合物を次いで５分間撹拌し、反応混合物の温度は２５℃にされた。次いで、水中のＡ．ファエカリス（Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ）の溶液（２．３ｘ１０−４Ｍ、１０６０Ｕ／ｍｌ）の０．１４８ｍｌを添加した。酵素的アシル化の間、ｐＨは２ＭのＫＯＨ溶液により１０で保持された。１０分後、約５０％のアシル化が達成された。４０分後、キラルＨＰＬＣによって、生成物のエナンチオマー過剰ｅｅ＝９９．３％であることが測定された。これは、Ｅ＝約１６００に相当する。
【００２９】
比較例Ｅ
大腸菌（ Ｅ． Ｃｏｌｉ ）の助けによる、フェニルアセタミドによる（Ｒ，Ｓ）−１−（Ｐ−クロロフェニル）エチルアミンの酵素的アシル化
実施例Ｉに記載したものに匹敵する条件下で、０．１９ｇ（１．２ミリモル）の（Ｒ，Ｓ）−１−（Ｐ−クロロフェニル）エチルアミンおよび０．１３ｇ（０．９６ミリモル）のフェニルアセタミドを１０ｍｌの水および１．２ｍｌのメタノールに添加した。ｐＨを３ＮのＨＣｌによって１０にした後、反応混合物に水を添加して最終体積を１２ｍｌにした。反応混合物を次いで５分間撹拌し、反応混合物の温度は２５℃にされた。次いで、水中の大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）の溶液（５．７ｘ１０−４Ｍ、１５６０Ｕ／ｍｌ）の０．３３０ｍｌを添加した。酵素的アシル化の間、ｐＨは２ＭのＫＯＨ溶液により１０で保持された。４０分後、約０．５％のアシル化が測定された。
【００３０】
実施例ＶＩ
Ａ ． ファエカリス（ Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ ）由来のｐｅｎ−Ｇアシラーゼ（１．１μＭ）によって触媒される、一定ｐＨ１０での、アシルドナーとしてのフェニルアセタミド（０．２Ｍ）による（Ｒ，Ｓ）−１−（２−ナフチル）エチルアミン（０．２Ｍ）の酵素的アシル化
０．２７４ｇの（Ｒ，Ｓ）−１−（２−ナフチル）エチルアミン（ＭＷ１７１）を７．５ｍｌの水に添加し、ｐＨを３ＮのＨＣｌによって１０に調整した。０．２１６ｇのフェニルアセタミド（ＭＷ１３５）をその溶液に添加し、７．９６ｍｌの最終溶液を有するために、何らかの追加量の水を添加した。一定温度（２５℃）に達し、そして試薬の飽和溶液を得るために、サーモスタット付きのセル中で反応混合物を５〜１０分混合し、最初の酵素溶液（２．３ｘ１０−４Ｍ ＰＡ−Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ）の３９μｌを添加して酵素的アシル化を開始した。ＫＯＨ溶液によって反応混合物を滴定することにより一定ｐＨ値（ｐＨ１０）で、ｐＨ安定装置付きセル中で反応を行った。
アシル化の立体特異性２５０（Ｒ）、合成速度２４０ｓ−１、初期Ｓ／Ｈ比６．５。
２０分で、転化が４６．８％に達した。生成物のｅｅは９８．１％であった。
【００３１】
比較例Ｆ
大腸菌（ Ｅ． Ｃｏｌｉ ）由来のｐｅｎ−Ｇアシラーゼ（１０μＭ）によって触媒される、一定ｐＨ１０での、アシルドナーとしてのフェニルアセタミド（０．２Ｍ）による（Ｒ，Ｓ）−１−（２−ナフチル）エチルアミン（０．２Ｍ）の酵素的アシル化
０．２７４ｇの（Ｒ，Ｓ）−１−（２−ナフチル）エチルアミン（ＭＷ１７１）を７．５ｍｌの水に添加し、ｐＨを３ＮのＨＣｌによって１０に調整した。０．２１６ｇのフェニルアセタミド（ＭＷ１３５）をその溶液に添加し、７．７３５ｍｌの最終溶液を有するために、何らかの追加量の水を添加した。一定温度（２５℃）に達し、そして試薬の飽和溶液を得るために、サーモスタット付きのセル中で反応混合物を５〜１０分混合し、最初の酵素溶液（３．０ｘ１０−４Ｍ ＰＡ−Ｅ． Ｃｏｌｉ）の２６５μｌを添加して酵素的アシル化を開始した。ＫＯＨ溶液によって反応混合物を滴定することにより一定ｐＨ値（ｐＨ１０）で、ｐＨ安定装置付きセル中で反応を行った。
アシル化の立体特異性２２（Ｒ）、合成速度約１１ｓ−１、初期Ｓ／Ｈ比０．４２。
酵素は１５分で全ての活性を失った。このときまでに、約１８％のアミンのアシル化が達成されたにすぎず、生成物のｅｅは８９．７％であった。
【００３２】
実施例Ｖ ＩＩ
Ａ ． ファエカリス（ Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ ）の助けによる、フェニルアセタミドによる（Ｒ，Ｓ）−フェニルグリシノールの酵素的アシル化
０．４１ｇ（３．０ミリモル）の（Ｒ，Ｓ）−フェニルグリシノールおよび０．５１ｇ（３．７ミリモル）のフェニルアセタミドを１５ｍｌの水に添加した。ｐＨを１０にした。次いで、反応混合物を５分間撹拌し、反応混合物の温度は２５℃にされた。次いで、水中のＡ．ファエカリス（Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ）の溶液（１．５ｘ１０−４Ｍ、６９０Ｕ／ｍｌ）の０．１４４ｍｌを添加した。酵素的アシル化の間、ｐＨは２ＭのＫＯＨ溶液により１０で保持された。４５分後、ＨＰＬＣによって、５０．６％の最大転化が測定された。この非常に高いＥ値の正確な見積もりは、これらの実験に基づいては不可能である。従って、Ｅ値は、別個のエナンチオマーの動的定数に基づいて決定された（実施例ＶＩＩＩを参照）。
【００３３】
実施例Ｖ ＩＩＩ
Ａ ． ファエカリス（ Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ ）および大腸菌（ Ｅ． Ｃｏｌｉ ）の助けによる、フェニルアセタミドおよび（Ｄ）フェミルグリシンアミドによる（Ｒ，Ｓ）−フェニルグリシノールのアシル化のＥ値の、別個のエナンチオマーの動的定数の決定に基づく決定
０． ０６９ｇ（０．５ミリモル）の（Ｒ）または（Ｓ）フェニルグリシノールおよび０．１４ｇ（１．０ミリモル）のフェニルアセタミドまたは０．１５ｇ（１．０ミリモル）の（Ｄ）フェニルフリシンアミドを約４ｍｌの水に添加した。ｐＨを３ＮのＨＣｌによって９．５〜１０にした後、体積を５．０ｍｌの最終体積にした。次いで、反応混合物を２５℃で５分間、インキュベートした。Ａ．ファエカリス（Ａ． Ｆａｅｃａｌｉｓ）の溶液（１．５ｘ１０−４Ｍ、６９０Ｕ／ｍｌ）の０．０５ｍｌまたは大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）の溶液（３．３ｘ１０−４Ｍ、９００Ｕ／ｍｌ）の０．３ｍｌを添加することにより反応を開始した。酵素的アシル化の間、ｐＨを２ＭのＫＯＨ溶液によって９．５〜１０で保持した。種々の反応のＥ値を、別個のエナンチオマーの初期アシル化速度の測定による動的定数に基づいて決定した。
【００３４】
【表１】
Claims (9)
- 式１：
- Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１が（ヘテロ）アリール、（ヘテロ）アラルキルまたは（ヘテロ）アルカリール基を表す、請求項１記載の方法。
- ｐＨが６〜１１である、請求項１または２記載の方法。
- 式Ｈ２ＮＣＲ１Ｒ２Ｒ３（Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は上記で定義した通りである）の、エナンチオマーに富むアミンの製造法において、式（１）の化合物（ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は上記で定義した通りであり、Ｘは上記で定義した通りである）をアルカリゲネス ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）由来のＰｅｎ−Ｇアシラーゼと接触させる方法。
- ｐＨが４〜８である、請求項４記載の方法。
- 最初に請求項１記載の方法に従ってエナンチオマーに富むアシル化されたアミンを製造し、アミンのアシル化されていないエナンチオマーをアシル化されたアミンから分離し、次いでアシル化されたアミンをアルカリゲネス ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）由来のＰｅｎ−Ｇアシラーゼと接触させる、請求項４または５記載の方法。
- フェニル酢酸誘導体として、エナンチオマーに富むフェニルグリシンアミドまたはｐ−ヒドロキシフェニルグリシンのエステルが適用される、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
- Ｘ＝ＮＨ２であり、Ｒ４＝フェニルまたはｐ−ＯＨ−フェニルであり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が上記で定義した通りである、式１のアシル化されたアミン。
- ジアステレオマー過剰が＞９０％、好ましくは＞９５％、特に＞９８％である、請求項８記載のアシル化されたアミン。
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