JP2004506046A

JP2004506046A - 骨形成を促進するための方法及び組成物

Info

Publication number: JP2004506046A
Application number: JP2002520839A
Authority: JP
Inventors: ボワロー，ギイ
Original assignee: バイオメップ　インコーポレイティド
Priority date: 2000-08-23
Filing date: 2001-08-23
Publication date: 2004-02-26
Also published as: US20050069569A1; DE60123635D1; EP1311691A2; AU2001287429B2; US7399466B2; ATE341631T1; CA2418461A1; AU8742901A; DE60123635T2; WO2002015918A3; WO2002015918A2; EP1311691B1

Abstract

本発明の目的は、骨形成を必要とする病理又は症状のために損なわれている、哺乳動物における骨形成過程の改善のためにＰＨＥＸ活性を高めることである。オステオカルシンは、内因性のＰＨＥＸ活性の阻害剤である。従って、内因性の阻害剤の阻害活性を妨げることによりＰＨＥＸ活性を増強することができる物質の同定は、骨形成を改善する。ＰＨＥＸは、骨又は歯の成長水準に関係し、そしてオステオカルシンの不存在は、骨密度の増加に関係する。ＰＨＥＸ活性の増強は、骨の成長を促進する。高められたＰＨＥＸ活性は、酵素自身の投与により得ることもできる。

Description

【０００１】
本発明の分野
本発明は、骨形成過程を促進するための新しい方法に関し、骨形成過程の欠乏は、様々な病理に起因する。より特に、本発明は、ＰＨＥＸを投与するか、又はオステオカルシンを阻害することにより存在しているＰＨＥＸの活性を増加させるかのいずれかにより、ＰＨＥＸの活性を高めることによる骨形成の促進に着目する。本発明は、さらにオステオカルシンの阻害活性を取り除くことができる物質のスクリーニング方法を提供する。
【０００２】
本発明の背景
骨．骨の固体マトリックスは、有機相、コラーゲン、並びにカルシウム及びリン酸塩（ヒドロキシアパタイト）から構成されている無機相で作られる。骨は、骨基質の分解（骨吸収）及び再構築を組み合わせた過程で、絶えずそれら自身を作り変えている。骨は、作り変え過程のための２の細胞タイプ：骨吸収を担う破骨細胞、及び骨形成を促進する骨芽細胞に依存している。正常な骨において、両過程は、骨質量を規定の制限内に維持するために厳密に調整されている。より特に、特定の部位において、まず骨吸収が最初にそして骨形成より短い期間生じる。形成段階の終わりに、ほとんどの骨芽細胞は、アポトーシス過程により消滅する。約１０％が骨中に取り込まれ、骨細胞を形成するためにそこに残っている。骨細胞は、力学的ストレス感知機構の何れかの形態に関係すると一般に考えられている。骨吸収過程が形成よりも頻繁に起こされた場合、骨粗鬆症が起こり、徐々により壊れやすい骨に至る（Ｈａｒｉｓｓｏｎ１４^ｔｈＥｄ）。
【０００３】
ＰＨＥＸ．ＰＨＥＸ遺伝子（以前は、ＰＥＸ；Ｘ染色体上のエンドペプチダーゼと同一性を持つリン酸調節遺伝子）は、ポジショナル・クローニング・アプローチにより、ヒトＸ連鎖低リン酸血（ＸＬＨ）（１）に関する候補遺伝子として同定された。ＸＬＨは、リン酸ホメオスタシスのメンデル型遺伝病であり、成長遅延、くる病、及び骨軟化症性骨障害、低リン酸血症、並びにリン酸の再吸収及びビタミンＤ代謝における腎臓の欠陥により特徴づけられる（２）。いくつかのグループが、ヒト及びマウスＰＨＥＸ／ＰｈｅｘｃＤＮＡｓをクローン化して、そして配列決定した（ＰＨＥＸ／Ｐｈｅｘは、それぞれ、ヒト及びマウス遺伝子に関する）（３−７）。アミノ酸配列比較は、候補遺伝子の部分配列中で先に観察されたようなＰＨＥＸ／Ｐｈｅｘタンパク質とＭ１３エンドペプチダーゼ・ファミリーのメンバーの間の同一性を証明した（１）。Ｍ１３エンドペプチダーゼは、比較的に短い細胞質アミノ末端部位、１つの膜貫通ドメイン、及び酵素活性部位を含んでいる長い細胞外ドメインを持つ亜鉛含有タイプＩＩ内在性膜糖タンパク質である（８）。ＰＨＥＸに加えて、このファミリーは、いくつかの生理活性ペプチドの分解に関係している広く分布するペプチダーゼであるネプリリシン（ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ）（ＮＥＰ、中性エンドペプチダーゼ２４．１１）（９）、不活性な巨大エンドセリンを活性なエンドセリンへの変換を担うエンドセリン変換酵素１、及び２（ＥＣＥ−１及びＥＣＥ−２）（１０）、機能が知られていない赤血球膜タンパク質である、ケル血液型タンパク質（１１）、並びにネプリリシン・ファミリーとの同一性を有する２の最近報告されたペプチダーゼである、ＥＣＥＬ／ＤＩＮＥ（１２，１３）、及びＳＥＰ／ＮＬ１（１４，１５）を含んでいる。
【０００４】
ＰＨＥＸの正確な生理学的な役割は知られておらず、ＰＨＥＸ機能の損失が、腎臓によるリン酸の消耗、ビタミンＤ代謝の異常な調節、及び骨石灰化の低下を引き起こす機構は完全に理解されていない。亜鉛メタロペプチダーゼのＭ１３ファミリーのメンバーとＰＨＥＸの同一性は、オートクライン、パラクライン、又はエンドクライン様式で働く細胞外生理活性ペプチドの活性を調節する役割を示唆する。この仮説を支持して、Ｌａｊｅｕｎｅｓｓｅら（１６）、そしてＮｅｓｂｉｔｔら（１７）は、ヒトＸＬＨの動物のモデルであるＨｙｐマウスから単離した骨芽細胞の培地中の腎臓のリン酸塩輸送の阻害因子の存在を報告している（１８）。ＰＨＥＸの役割は、この循環因子を不活性にするものであると考えられる。しかし、今のところ、この因子（ホスファトニン（ｐｈｏｓｐｈａｔｏｎｉｎ））の分子同定を、確立する必要がある。
【０００５】
ＰＨＥＸと石灰化．マウス胚及び新生仔切片で実施したｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、骨芽細胞と象牙芽細胞にＰｈｅｘメッセンジャーＲＮＡの存在を示した（３２）。Ｐｈｅｘ遺伝子発現は、胎児発生の１５日目に検出可能であり、それは骨への細胞内マトリックス沈着の始まりと一致する。しかも、３日齢及び成体マウスの頭蓋冠及び歯からの全ＲＮＡノーザンブロット解析は、Ｐｈｅｘ転写量が成体の骨及び成長していない歯で減少しているが、門歯の成長において一生涯にわたり維持されることを示した。この結果は、新生仔及び成体の骨のＰｈｅｘタンパク質の存在をヒトＰＨＥＸに対して産生させたモノクローナル抗体を使ったウェスタンブロッティングにより調査した時に確認された。２ヶ月齢のマウスの免疫組織化学的調査は、骨中の成熟した骨芽細胞と骨細胞、そして歯の象牙芽細胞における独占的な標識を示した（２７）。まとめるとこれらの結果は、ＰＥＸ／Ｐｈｅｘが発生、並びにこれらの組織の石灰化の維持において重要な役割を担っていること示唆する。
【０００６】
Ｐｈｅｘ遺伝子の３’部位に大きな欠失を有し（５）、そしてＸＬＨの患者を特徴づけるのと同じ表現型の特徴を示す（１８）動物モデルである、Ｈｙｐマウスで実施された調査は、未知の方法で、ＰＨＥＸが石灰化過程に関係していることを示唆した。Ｈｙｐマウスは、異常なマトリックス沈着によるものではないことを示す（３４，３５）が、損なわれた石灰化によるものであることを示す（３３）、拡大した骨様領域を骨中に示す（２７、３３）。
【０００７】
オステオカルシン．オステオカルシンは、非コラーゲン性骨タンパク質の中で最も豊富なものであり、骨芽細胞によってのみ発現される。この成熟ペプチドは、３のＧｌａ残基と１のジスルフィド結合を持つ４９アミノ酸の長さである。ビタミンＫ依存ガンマ−カルボキシラーゼは、特定のＧｌｕのＧｌａ残基への変換を担っている。これらのＧｌａ残基は、カルシウム・イオン及びヒドロキシアパタイト結晶に対するそれらの親和性のために周知である。骨質量の約８０％は、ヒドロキシアパタイト、カルシウムから成る鉱質、及びリン酸塩で作り上げられている。オステオカルシン・メッセンジャーＲＮＡの増加は、石灰化段階と骨芽細胞の骨細胞への変換に関係する（３９）。
【０００８】
インビトロにおいて、オステオカルシンは、無機質結晶の成長を抑え（３６、３７）、インビボにおいて、両方のマウス・オステオカルシン遺伝子の分裂のための遺伝子ターゲッティングは、オステオカルシン欠損動物の発生をもたらす（３８）。これらのオステオカルシン−ノックアウト突然変異マウスは、骨形成速度の増加、骨質量の増加、並びに総体的に改善された骨の機能特性により特徴づけられもする”骨粗鬆症と対照的な”表現型を表わす。
【０００９】
本発明の概要
上で示されるように、ＰＨＥＸ活性は、適切な骨形成のために必要とされる。意外にも、オステオカルシンが、インビトロでＰＨＥＸの酵素活性を阻害すると判明した。本発明の対象は、オステオカルシンの阻害活性を減らすか、又はＰＨＥＸの投与を通じてかのいずれかによりインビボにおけるＰＨＥＸ活性を増加させ、骨の特性を改善することである。本発明は、ＰＨＥＸに対するオステオカルシンの阻害活性を妨げることによりＰＨＥＸ活性を増加させる（効果を増す）ことできる物質の同定方法をさらに提供する。本発明は、改善されたＰＨＥＸの製造及び精製手段、並びに注射による可溶性ＰＨＥＸ酵素の投与、治療用遺伝子が可溶性タンパク質をコードする遺伝子治療、あるいは治療用細胞が可溶性タンパク質を産生する細胞療法によるＰＨＥＸ活性を増加させる手段のために提供される。
【００１０】
より特に、本発明は、ＰＨＥＸ活性に対するオステオカルシンの阻害能力を国際出願番号第ＣＡＯＯ／００２０１号に開示された発明（以下「２０１の方法」と称する）と組み合わせ、ＰＨＥＸ活性を有意に増加させうる物質を同定する。２０１の方法は、必要な試薬とＰＨＥＸ活性の測定法を提供する。本発明は、２０１の方法をオステオカルシンの存在下でオステオカルシンの阻害活性を妨げることができる物質のスクリーニングに使用する。その結果、オステオカルシンの阻害の活性が減少する時、ＰＨＥＸ酵素活性が増加する（又は効果が増す）。この目的のために、様々な試薬を用意し、そして酸素アッセイを組み立てるように道具を設計した。２０１の方法に対するいくつかの改良が、本明細書中に記載される。これらの改良は、ｓｅｃＰＨＥＸを産生するための新しいベクターの使用、及びより高い純度を持つＰＨＥＸを得るための第２精製ステップとしての疎水性カラムの使用を含んでいる。新しいベクターは、ＰＨＥＸ配列がＮＬ１のｆｕｒｉｎ分割部位のすぐ下流に存在するような様式に構築されたＮＬ１−ＰＨＥＸ融合を含んでいる。ＮＬ１は、その細胞外のドメイン（１５）中のｆｕｒｉｎ分割部位（４２）により細胞によって分泌されるペプチダーゼである。融合タンパク質の生合成において、ＰＨＥＸは、ｆｕｒｉｎ分割により分泌される。２０１の方法に記載のものを上回るこのシステムの利点は、外因性アミノ酸残基がｓｅｃＰＨＥＸのＮ−末端に存在しないことである。
【００１１】
ＰＨＥＸ酵素活性は、２０１の方法において、そして本明細書中の改良法で提供された可溶形態の投与によって効果を増すこともできる。しかも、ＰＨＥＸ酵素活性は、不活性なＰＨＥＸ（ｉＰＨＥＸ）がオステオカルシンに結合するおとりの役を果たして、それにより遊離オステオカルシンの濃度を減らす、本明細書中に提供される不活性な酵素の可溶形態の投与で効果を増すことができる。同様に、オステオカルシン活性は、オステオカルシンのＰＨＥＸへの結合を防げるような方法で調製された抗体によりに減らされうる。
【００１２】
さらに、本発明は、ＰＨＥＸの酵素活性の測定法に必要ないくつかの新しい基質を提供する。他の改良は、１つの分割部位を有するＰＨＥＸ基質の使用を含む。これは、酵素の活性を計測するために要求される計算を簡単にする。ＰＨＥＸ基質は、以下の順列から選ばれうる：選ばれたペプチドがＤＴ又はＤＳアミノ酸ペアの各々の側面に少なくとも２、しかし好ましくは少なくとも４の残基を含む、ヒトＰＴＨｒＰ１０７−１３９により表された配列から選ばれるいずれかのペプチド。あらゆる選択が、さらに保存的なアミノ酸置換で修飾されることができる：どんな疎水性アミノ酸も他の疎水性アミノ酸と交換されることができ、どんな酸性アミノ酸も他の酸性アミノ酸と交換されることができ、どんな塩基性アミノ酸も他の塩基性アミノ酸と交換されることができ、セリンをトレオニンと交換することができて、逆も同様であり、アスパラギンをグルタミンと交換することができ、そして逆も同様である。当業者は、アミノ酸置換が、特にプロリン又はグリシンに関与する置換により酸素的過程が不利に妨げられないような方法で成されるべきであることを認識している。基質の１つの例は、ヒトＰＴＨｒＰ１１０−１１６に対応するＡＷＬＤＳＧＶである（配列番号１）。
【００１３】
本発明は、ヒト及び動物の骨に関係がある障害を治療するための組成物にも関する。本発明は、その最も頻繁な症状発現を含む低下した骨質量、骨減少症、及び骨粗鬆症、並びにＸ連鎖低リン血症性くる病を含むくる病の様々な形態の治療のために特に提供される。また、本発明は、骨折、整形外科のプロテーゼの挿入術、及び義歯の挿入術後の骨質量のより速い再生のために特に提供される。
【００１４】
本発明の特定の態様の説明
本発明は、以下の特定の態様及び図面に関する言及によりここに説明されるが、その目的は、本発明の説明であって、その範囲を制限するものではない。
【００１５】
本記載で使われた用語の明確な、そして一貫した理解を提供するために、相当数の定義を以下に提供する。
【００１６】
それ以外に定義されない限り、科学的、及び技術的用語、並びに本明細書中に使用された命名法は、本願発明が関連する当業者により一般に理解されているのと同じ意味を持つ。一般的に、細胞培養、感染、分子生物学的方法などのための手順は、本技術分野で使用される一般法である。このような標準法は、参照マニュアル、例えばＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．（１９８９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ − ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、及びＡｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．（１９９４，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ）中に見ることができる。
【００１７】
本発明を実行するための核酸（例えば、ＤＮＡかＲＮＡ）は、周知の方法に従って得られうる。
【００１８】
「ＤＮＡ」分子又は配列という用語（並びに時々、「オリゴヌクレオチド」という用語）は、しばしば二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドを構成する、アデニン（Ａ）、グアニン（ｇ）、チミン（Ｔ）、及び／又はシトシン（Ｃ）分子を意味し、本明細書中に定義される、本発明による「制御的な要素」を構成するか、又は含んでいる。「オリゴヌクレオチド」、又は「ＤＮＡ」という用語は、線状のＤＭＡ分子か断片、ウイルス、プラスミド、ベクター、染色体、又は合成的に得られたＤＮＡにおいて見ることができる。本明細書中に使用されるとき、特定の２本鎖ＤＮＡ配列が、５’→３’方向で配列だけを与える一般の慣習に従って記載される。
【００１９】
本発明のプローブは、天然の糖リン酸塩骨格、並びにホスホロチオエート、ジチオン酸塩、アルキルホスホン酸塩、及びα−ヌクレオチドなどを含む修飾された骨格と利用されることができる。修飾された糖リン酸塩骨格が一般にＭｉｌｌｅｒ，１９８８，Ａｎｎ．ＲｅｐｏｒｔｓＭｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：２９５ａｎｄＭｏｒａｎｅｔａｌ．，１９８７，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１４：５０１９．により教示される。本発明のプローブは、リボ核酸（ＲＮＡ）かデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、そして好ましくはＤＮＡで組み立てられることができる。
【００２０】
プローブが使用されうる検出方法の種類は、サザンブロット（ＤＮＡ検出）、ドット又はスロット・ブロット（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、及びノーザンブロット（ＲＮＡ検出）を含んでいる。より好ましくないが、標識されているタンパク質が、それが結合する特定の核酸配列を検出するために使用されることもできる。他の検出方法は、ディップスティック・セットアップなどのプローブを含むキットを含んでいる。
【００２１】
本発明が特定の核酸配列の検出のための標識の使用に特に依存しているわけではないが、そのような標識が検出の感度を増加させることにより有益であるかもしれない。さらに、それは自動化を可能にする。プローブは、多数の周知の方法に従って標識されることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９、前記）。制限されることのない、標識の例は、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、及び^３５Ｓを含んでいる。制限されることのない、検出可能なマーカーの例は、リガンド、蛍光、化学発光物質、酵素、及び抗体を含んでいる。本発明の方法の感度の増加を可能にすることができる、プローブでの使用のための他の検出可能なマーカーは、ビオチンと放射性ヌクレオチドを含んでいる。特定の標識の選択がプローブへの結合様式を決定することは当業者に明らかになる。
【００２２】
選択された又はターゲット核酸配列の増幅は、相当数の好適な方法により実行されうる。一般に、Ｋｗｏｈｅｔａｌ．，１９９０Ａｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌａｂ．８：１４−２５を参照のこと。多数の増幅技術が記載されて、容易に当業者の特定の要求に合うように適合させることができる。制限されることのない、増幅技術の例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖転位増幅（ＳＤＡ）、転写ベースの増幅、Ｑβレプリカーゼ・システム、及びＮＡＳＢＡを含んでいる（Ｋｗｏｈｅｔａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６，１１７３−１１７７；Ｌｉｚａｒｄｉｅｔａｌ．，１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：１１９７−１２０２；Ｍａｌｅｋｅｔａｌ．，１９９４，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８：２５３−２６０；及びＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９、前記）。好ましくは、ＰＣＲを使って増幅が実行される。
【００２３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、既知の技術に従って実行される。例えば、米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８００，１５９号；そして同第４，９６５，１８８号を参照のこと（３つの米国特許全ての開示を本明細書中に援用する）。概して、ＰＣＲは、検出されるべき特定の配列の各々の鎖に対する１つのオリゴヌクレオチド・プライマーを用いて（例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で）ハイブリダイズする条件下、核酸サンプルを処理することを伴う。それとハイブリダイズする特定の配列の各々の鎖に十分に相補的なプライマーによる、合成される各々のプライマーの伸長産物は、各々２の核酸鎖に相補的である。各々のプライマーから合成された伸長産物は、同じプライマーを使った伸長産物のさらなる合成のための鋳型として働くこともできる。伸長産物の合成の十分な数のラウンドに続いて、検出すべき配列があるかどうか評価するためにサンプルが分析される。ゲル電気泳動に続いてのＤＮＡのＥｔＢｒ染色、又は既知の技術に従った検出可能な標識の使用などに続いて、増幅された配列の検出が可視化により実行されうる。ＰＣＲ技術の総説のために（ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍｉｃｈａｅｌｅｔａｌ．Ｅｄｓ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，１９９０を参照のこと）。
【００２４】
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、既知の技術に従って実行される（Ｗｅｉｓｓ，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１２９２）。所望の要件を満たすためのプロトコールの適応が、当業者により実行されることができる。鎖転位増幅（ＳＤＡ）が既知の技術又は特定の要件を満たすためのそれらの応用に従って実行される（Ｗａｌｋｅｒｅｔａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：３９２−３９６；及び同じく１９９２，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０：１６９１−１６９６）。
【００２５】
本明細書中に使用されるとき、「遺伝子」という用語は、本技術分野で周知であり、単一のタンパク質かポリペプチドを定義している核酸配列に関する。「構造遺伝子」は、ＲＮＡに転写され、そしてそれにより特定なポリペプチド又はタンパク質を生じる特定のアミノ酸配列を有するタンパク質に翻訳されるＤＮＡ塩基配列を定義する。、本発明の核酸配列が本技術分野で知られる多数の確立されたキット様式のいずれかに組み入れられることができることは、当業者に容易に認識される。
【００２６】
ＤＮＡ分子の「異種」部分（例えば、異種遺伝子）は、天然でそれらに関連して発見されない大きな分節内のＤＮＡサブセグメントである。「異種」という用語は、同じように天然では一緒に連結されていない２つのポリペプチド・セグメントを定義することにも使用されうる。制限されることのない、異種遺伝子の例は、異種の制御部位か異種のポリペプチドと並列、又は連結されうるルシフェラーゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、又はβ−ガラクトシダーゼなどのようなリポーター遺伝子を含んでいる。
【００２７】
「ベクター」という用語は、一般に本技術分野で知られていて、本発明のＤＭＡがクローン化されることができるＤＮＡ媒体となりうるプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ウイルスＤＮＡなどを定義する。多数の種類のベクターが存在し、本技術分野で周知である。
【００２８】
「発現」という用語は、遺伝子がメッセンジャーＲＮＡ転写され（転写）、次にこのメッセンジャーＲＮＡが、１のポリペプチド（又はタンパク質）、あるいはそれ以上に翻訳されて（翻訳）される過程を定義する。
【００２９】
術語「発現ベクター」はベクター又は先に記載の媒体を定義するが、ホストへ形質転換に続いて挿入された配列の発現を可能にするように設計されている。クローン化された遺伝子（挿入された配列）は、通常、プロモーター配列のような制御要素配列のコントロールの下に置かれる。そのような制御配列下へのクローン化された遺伝子の配置は、使用できるように制御要素又は配列と連結されているとしばしば呼ばれる。
【００３０】
使用できるように連結された（又は「フレーム内」）配列は、同じＲＮＡ転写産物に転写される２つの分節をも含んでいるかもしれない。このように、プロモーターによる転写の開始がリポーター配列のＲＮＡ転写物を産生する時、２つの配列、例えばプロモーターと「リポーター配列」は使用できるように連結されている。「使用できるように連結される」ために、２つの配列は互いにすぐ隣接している必要はない。
【００３１】
発現制御配列は、ベクターが、原核、又は真核生物宿主、あるいはその両方（シャトルベクター）において、使用できるように連結された遺伝子を発現するように設計されているかどうかに依存して変更され、さらに、エンハンサー因子、終止配列、組織特異性要素、及び／又は転写開始及び終止部位のような転写要素を含むことができる。
【００３２】
原核生物発現は、着目のＤＮＡ塩基配列によりコードされた大量のタンパク質の調製に役立つ。このタンパク質は、それについて本質的な性質、例えばサイズと電荷を利用する標準的なプロトコールに従って精製されることができる（例えば、ＳＤＳゲル電気泳動法、ゲル濾過、遠心沈殿、イオン交換クロマトグラフィー．．．）。さらに、着目のタンパク質は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体を使ったアフィニティー・クロマトグラフィにより精製することができる。精製されたタンパク質は、治療用途のために使用されうる。
【００３３】
ＤＮＡ構築物は、使用できるように本発明のオリゴヌクレオチド配列と使用できるように結び付けられた、言い換えると、ルシフェラーゼ・リポーター分子に関する遺伝子のような異種遺伝子と使用できるように結び付けられたプロモーターを含んでいるベクターであるかもしれない。「プロモーター」は、細胞内でＲＮＡ合成酵素に直接的又は間接的に結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することができるＤＮＡ制御部位に関する。本発明の目的のために、プロモーターは、その３’末端で転写イニシエーション部位に結合し、そして検出可能なレベルでの転写開始のために必要な最小限の数の塩基又は要素を含む上流（５’方向）に伸びる。プロモーター内に、ＲＮＡ合成酵素の結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）と共に転写開始部位（都合よくＳ１ヌクレアーゼでのマッピングにより定義されている）が見られる。常にではないが、真核生物プロモーターは、しばしば「ＴＡＴＡ」ボックスと「ＣＣＡＴ」ボックスを含む。原核生物プロモーターは、転写開始に役立つ、−１０、及び−３５での共通塩基配列を含み、そして転写産物は、翻訳開始中のリボソーム結合配列として役立つシャイン・ダルガルノ配列を含んでいる。
【００３４】
本明細書中に使用されるとき、「機能的誘導体」は、本来の配列のそれに実質的に類似した生物活性（機能か構造のいずれか）を維持することを定義し、この分子は、機能的誘導体配列との関係で核酸又はアミノ酸配列である。この機能的誘導体、又は同等物は、天然、又は合成的に調製されうる。そのような誘導体は、タンパク質の生物活性が保存される、１以上のアミノ酸の置換、欠失、又は付加があるアミノ酸配列を含んでいる。同じものが、その配列の生物活性が全体的に維持されれる、１以上のヌクレオチドの置換、削除、又は付加を持ちうる核酸配列誘導体に適用される。タンパク質配列に関連する時、置換アミノ酸は、一般に置換されたアミノ酸のそれと類似した物理化学の性質を持っている。似通った物理化学の性質は、荷電、方法、疎水性、親水性などの類似を含んでいる。「機能的誘導体」という用語は、本発明の主題の「断片」、「セグメント」、「変異体」、「アナログ」、又は「化学的な誘導体」を含むように意図される。
【００３５】
このように、「変異体」という用語は、本明細書中で、本発明の核酸又はタンパク質に構造及び生物活性が実質的に類似したタンパク質、又は核酸分子を意味する。
【００３６】
本発明の機能的誘導体は、化学的に合成されるか、又は組み換えＤＮＡ技術を通して産生されることができる。これらの全ての方法が本技術分野で周知である。
【００３７】
本明細書中に使用されるとき、「化学的な誘導体」は、本発明の本質の本来の部分ではない追加の化学的な部分をカバーすることが意味される。そのような部分は誘導体の物理化学の特徴（例えば、可溶性、溶解、半減期、毒性の減少など）に影響しうる。そのような部分は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ（１９８０年）で例証される。ポリペプチド又は核酸配列にこれらの化学的−物理的部分を連結する方法は、本技術分野で周知である。
【００３８】
一般に知られるように、「突然変異」は、娘細胞に伝えられることができる遺伝物質の検出可能な変化である。周知のように、例えば突然変異は、１以上のデオキシリボヌクレオチドの検出可能な変化であるかもしれない。例えば、ヌクレオチドは、加えられるか、削除されるか、置換されるか、逆にされるか、又は新しい位置に置き換えられうる。自然発生的な突然変異と実験的に誘発された突然変異が存在する。突然変異体ポリペプチドは、この突然変異体核酸分子からコードされうる。
【００３９】
本明細書中に使用されるとき、「精製された」という用語は、細胞の成分から分離れた分子を意味する。このように、例えば、「精製されたタンパク質」は、天然に見られないレベルに精製される。「実質的に純粋な」分子は、ほとんどの他の細胞の成分を欠く分子である。
【００４０】
本明細書中に使用されるとき、「分子」、「化合物」、「物質」、又は「リガンド」という用語は、互換的にそして総体的に天然、合成、又は半合成の分子か化合物を意味するために使用される。従って、「分子」という用語は、例えば化学物質、高分子、（植物か動物からの）細胞、又は組織抽出物などを意味する。制限されることのない、分子の例は、核酸分子、ペプチド、抗体、炭水化物、及び医薬物質を含んでいる。物質は、ランダム・スクリーニング、理論的選択、そして、例えばタンパク質又はリガンドのモデリング方法、例えばコンピュータモデリングを使用した理論的デザインを含めた種々の手段により選択及びスクリーニングされることができる。用語「理論的に選ばれる」か「理論的に設計される」は、本発明の領域に相互作用する立体配位に基づいて選ばれた化合物を定義することを意味する。当業者に理解されるとおり、天然に生じない修飾された高分子は、「分子」という用語の範囲内にもある。例えば偽ペプチドは、製薬工業で周知であり、一般ペプチド相似体と呼ばれ、先に言及されるようにモデリングにより生じる。同じように、好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、それらの安定性及び官能性を高めるために修飾される。多くの場合で、この修飾が、相互作用ドメインの生物活性を変えるべきでないことが理解されている。本発明の教示に従って同定された分子は、活性なＰＨＥＸの減少により細胞及び／又は組織の生理又はホメオスタシスが支障を来たした病気又は症状において治療的価値を持つ。あるいは、本発明の教示に従って同定された分子は、高められたＰＨＥＸ活性の発生に有用性が見られる。
【００４１】
本明細書中に使用されるとき、ＰＨＥＸの効果増強物質（ｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒ）は、分子の相互作用からもたらされ、ＰＨＥＸ活性を高める。１の態様において、一定期間の間、化合物、若しくは混合物、又は分子ライブラリーによる指示薬アッセイに接触することにより、効果増強物質は発見されうる。本発明に従った指示薬アッセイは、効果増強物質の同定に使用されうる。例えば、テスト分子は、一定の濃度で保持された１以上の分子とともに宿主細胞と一緒にインキュベートされる。表示と前記分子の効果増強特性の相対的な強さは、アゴニストの存在、テスト分子の不存在、対それらの存在における指示薬アッセイによるペプチド加水分解レベルを比較することにより提供されうる。もちろん、分子効果を増強する効果は、アゴニストの不存在下、テスト分子（ｓ）の存在と不存在における加水分解産物のレベルを比較することにより決定されうる。
【００４２】
「インビボ」実験モデルは、「インビトロ」アッセイの実行に使用されうることが知られる。
【００４３】
本明細書中で以下に例証されるように、それについて構造機能関係を分析するために、そして調節化合物の優れた設計と同定をもたらすために、本発明の相互作用領域は、例えばインビトロ突然変異誘発により修飾されうる。しかし、それらのそれぞれの相互作用パートナーと相互作用する生物学的機能を失ったいくつかの誘導体又は相似体は、例えば、抗体産生のためにまだ有用性が見られるかもしれない。そのような相似体又は誘導体は、例えば本発明の相互作用領域に対する抗体の産生に使用することができた。これらの抗体は、検出か精製目的のために使用されることができる。さらに、これらの抗体は、拮抗、又は非拮抗阻害剤として作用する、ＰＨＥＸ又はオステオカルシン相互作用のモジュレーターであると判明した。
【００４４】
そのようなＤＮＡが細胞中に導入された時、宿主細胞は、外因性、又は異種のＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ構築物）により「トランスフェクトされた」。トランスフェクトＤＮＡは、細胞のゲノムを作っている染色体ＤＮＡ中に統合され（共有結合され）るか又はされない。原核生物、酵母、哺乳類の細胞において、例えばトランスフェクトＤＮＡは、プラスミドのようなエピソーム要素内に維持されうる。真核生物細胞に関して、安定的に細胞にトランスフェクトされたトランスフェクトＤＮＡは、染色体複製を通して娘細胞により受け継がれるように、染色体に統合されたものである。この安定性は、トランスフェクトＤＮＡを含んでいる娘細胞の細胞系、又は集団に含まれたクローンを確立する真核生物細胞の能力により説明される。トランスフェクション法は、本技術分野で周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９、前記；Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，１９９４、前記）。指示物質としての哺乳類細胞の使用は、例えば下等な真核生物又は原核生物には存在しない、テストされる２つのポリペプチドの相互作用を可能にする中間の因子を供給する利点を提供する。両方の試験されるポリペプチドが直接相互作用すれば、そのような利点が、理論上、当然与えられる。例えば、哺乳類の細胞からの抽出物は、ある態様において、ある因子の不足を償うために使用されることができることが知られる。
【００４５】
概して、（モノクローナル抗体とハイブリドーマを含む）抗体を調製するための、そして抗原を、抗体を使って検出するための技術は、本技術分野で周知である。（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，１９８４，Ｉｎ ”ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”，ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、及びｉｎＨａｒｌｏｗｅｔａｌ．，１９８ｂ（ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ− ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣＳＨＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。本発明は、それぞれの相互作用ドメインを阻害、又は中和するか、及び／又はそれらに特異的なポリクローナル、モノクローナル抗体、又はそれらのヒト化異形、キメラ抗体などを提供する。
【００４６】
明細書及び添付の請求項からの、治療剤という用語は、少なくとも２つのそのような治療剤の組み合わせを含むような広い意味に取られるべきである。さらに、本発明によるＤＮＡセグメント又はタンパク質は、相当数の方法で個体に導入されうる。例えば、赤血球産生性細胞は、罹患個体から分離されて、ＤＮＡ構築物により本発明に従って形質転換され、静脈内注射を含む相当数の方法により罹患個体に再導入されうる。あるいは、ＤＮＡ構築物は罹患個体に直接的に、例えば骨髄への注射により与えられうる。ＤＮＡ構築物は、特定の細胞タイプを狙うように設計されうるリポソームのような媒体を通して、異なるルートを通って投与されるようにも設計されうる。
【００４７】
ヒトへの投与のために、医療従事者の処方は、適切な形式と投与量を最終的に決定し、そしてこれは選ばれた治療計画（例えば、ＤＮＡ構築物、タンパク質、細胞）、与えられた患者応答及び状態、並びに病気の重さに従って変わることが見込まれうる。
【００４８】
不都合な副作用を避けながら所望の治療効果を達成するために、本発明の範囲内の組成物は、有効量で活性物質（例えば、融合タンパク質、核酸、及び分子）を含むべきである。一般に、本発明による核酸は、１日につき、治療される哺乳動物の体重１ｋｇにつき０．００５〜１ｍｇの範囲の量で哺乳動物（例えばヒト）に与えられうる。医薬として許容される製剤及び活性物質の塩は、本発明の範囲内にあり、本技術分野で周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，１６ｔｈＥｄ．，ＭａｃｋＥｄ．）。ポリペプチド、アンタゴニスト、アゴニストなどの投与のために、投与される量は、不都合な副作用を避けるために選ばれるべきである。投与量決定は、病気の範囲のような伝統的な因子と患者からのその他の指標に従って臨床医により適合される。一般に、０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日が哺乳動物に与えられる。
【００４９】
材料及び方法
２０１の方法に用いた試薬の製造方法を、当業者がこの方法における有用な改良を認識することができるようにここに要約する。
【００５０】
ＤＮＡ操作
全てのＤＮＡ操作を標準的プロトコール（１９，２０）に従って実施した（Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，１９８８；Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９）（Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，１９８８；Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９）。先にに記載（２１）されるようにＰＣＲベースの戦略を使って部位指定突然変異誘発を実施した。
【００５１】
発現ベクターの構築
ヒトＰＨＥＸｃＤＮＡを前もってクローン化した（５）。培養した哺乳類の細胞によるＰＨＥＸの発現のために、全ＰＨＥＸコード配列を含む制限断片（ＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＶ）を消化し、平滑にし、哺乳類の発現ベクターｐＣＤＮＡ３／ＲＳＶ（２２）中にサブクローニングした。このベクターは、それを発現する細胞に抗生物質ネオマイシン（Ｇ４１８）への抵抗を授ける細菌ｎｅｏ遺伝子をも含んでいる。ｐＣＤＮＡ３／ＲＳＶＰＨＥＸと呼ばれる得られたベクターは、ＰＨＥＸの膜結合形態をコードした。
【００５２】
ヒトＰＨＥＸの可溶性形態を得るために、シグナルペプチド／膜アンカー領域（ＳＡドメイン）のタンパク質を、ＮＥＰ（２３）の可溶性形態を製造するために先に記載した類似の戦略に従い、分割能力があるシグナル配列内に形質転換した。しかし、ＰＨＥＸの場合には、より多くの遺伝子操作を必要とした。ＮＥＰのために実行した戦略に加えて、親水性アミノ酸残基を導入することに加えて、４つのコドンがＰＨＥＸのＳＡ領域で削除されなければならなかった。これらの修飾を、ベクターｐＣＤＮＡ３／ＲＳＶ／ＰＨＥＸに部位指定突然変異（８つのコドン）を導入することにより、そして先に記載（２１）の適切なオリゴヌクレオチド・プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により削除（４つのコドン）を成し遂げられた（図１Ａ）。
【００５３】
突然変異Ｇｌｕ５８１Ｖａｌを持つ不活性なｓｅｃＰＨＥＸタンパク質をコードするベクターｐＣＤＮＡ３／ＲＳＶ／ｓｅｃＰＨＥＸＥ５８１Ｖを、先に参照した同じＰＣＲベースの戦略及び適当なオリゴヌクレオチド・プライマーを使用した部位指定突然変異誘発により得た。
【００５４】
ＮＬ１、ｆｕｒｉｎ分裂シグナルペプチドと融合したｓｅｃＰＨＥＸをコードするベクターｐＣＤＮＡ３／ＲＳＶ／ＮＬ１−ＰＨＥＸを、アミノ酸残基４６〜７５０に相当するＰＨＥＸヌクレオチド配列（５）に先行し、そしてフレーム単位でアミノ酸残基１〜６３に相当するＮＬ１ヌクレオチド配列（１５）を、ベクターｐＣＤＮＡ３／ＲＳＶ中にクローン化することにより得た。
【００５５】
Ｅ．コリによりヒト・オステオカルシンを産生させるために、全ＲＮＡをヒト骨芽細胞様ＳａＯＳ２細胞から分離し、そして適切なオリゴヌクレオチド・プライマーを使ってオステオカルシン配列をＲＴ−ＰＣＲにより製造した。オステオカルシン配列を配列決定により確認し、ベクターｐＧＥＸ−ＯＳＴを得るためにｐＧＥＸベクター（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）に導入した。
【００５６】
Ｅ．コリによるタンパク質産生
Ｅ．コリによるオステオカルシンの産生のために、ｐＧＥＸ−ＯＳＴベクターを、菌株ＡＰ４０１に導入し、誘導し、そしてｐＧＥＸベクター（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）の製造業者により推薦されるようにタンパク質の精製を実施した。
【００５７】
トランスフェクション及び細胞培養
ヒトＰＨＥＸ、ｓｅｃＰＨＥＸ、及びｓｅｃＰＨＥＸＥ５８１ＶをＬＬＣ−ＰＫ_１細胞（豚の腎臓細胞；ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ−１３９２）で発現させた。これらの組み換えタンパク質の安定した発現を誘発するために、適切なベクターをＣａＰＯ_４沈殿方法（２４）によりＬＬＣ−ＰＫ_１細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を、４００ μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を培地に加えることにより選択し、先に記載（２５）のとおり培養した。
【００５８】
細胞及び培地中のＰＨＥＸ関連タンパク質のイムノブロット解析
イムノブロット解析のために、集密細胞培養を、ＲＳＶプロモーター制御下のｃＤＮＡの発現を高めるために１０ｍＭ酪酸ナトリウムを含む、ＤＭＥＭ培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）中で１６時間インキュベートした。細胞タンパク質を前記（２６）のとおり可溶性にした。培地中で回収された分泌タンパク質を、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−５０カラム（Ａｍｉｃｏｎ）により約１０倍に濃縮した。タンパク質（細胞のタンパク質、又は１つのペトリ皿からの培地に存在したタンパク質の１／５０^ｔｈ）を、前記（２７）のとおり７．５％のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲルで分離し、ヒトＰＨＥＸに特異的なモノクローナル抗体を用いたイムノブロッティングにより検出した。
【００５９】
タンパク質のグリコシル化状態を確認するために、サンプルを、電気泳動前に、エンドグリコシダーゼＨ（ｅｎｄｏＨ）又はペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）と一緒に製造業者により提案されるとおりインキュベートした（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓｉｎｃ．Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）。
【００６０】
ｓｅｃＰＨＥＸ又はｓｅｃＰＨＥＸＥ５８１Ｖの産生
大量のｓｅｃＰＨＥＸ又はｓｅｃＰＨＥＸＥ５８１Ｖを産生するために、集密細胞を、２．５ μｇ／ｍｌのインシュリン、１７．５ μｇ／ｍｌのトランスフェリン、２ μｇ／ｍｌのエタノールアミン、１００ μｇ／ｍｌのダイズ・トリプシン阻害因子、及び１０ μｇ／ｍｌのアプロチニンを補った１９９培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）中で４日間インキュベートした。酪酸ナトリウムが１０ｍＭの濃度で存在した。４日後、培地を回収し、遠心分離し、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−５０カラムにより濃縮した。一般に、精製のためのイオン交換カラムに添加する前に、トランスフェクトＬＬＣ−ＰＫＴ_１細胞からの６００ｍｌの未精製の使用済み培地を、３０ｍｌに濃縮した。
【００６１】
ＳｅｃＰＨＥＸ又はｓｅｃＰＨＥＸＥ５８１Ｖの精製
濃縮した培地を、５０ｍＭＮａＣｌ含有５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６．６により前もって平衡化した８ｍｌのＳＰ−セファロース陽イオン交換カラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈｉｎｃ．Ｂａｉｅｄ’Ｕｒｆｅｅ，ＱＣ，Ｃａｎａｄａ）に、２ｍｌ／分の流量で添加した。このカラムを、カラムの１０倍量の同じバッファーにより同じ流速で洗浄し、そして５０ｍＭ→１ＭＮａＣｌのグラジエントを用いてタンパク質を溶出した。画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分析して、先に記載されるようにイムノブロットし、そしてｓｅｃＰＨＥＸ又はｓｅｃＰＨＥＸＥ５８１Ｖを含む画分を、銀染色により可視化した。
【００６２】
あるいは、精製方法において２０１の方法よりむしろ、以下の修飾が推薦される。ｓｅｃＰＨＥＸ又はｓｅｃＰＨＥＸＥ５８１Ｖを含んでいる画分をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−５０カラムを使って約１．５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。次に、タンパク質溶液を０．１ｍｇ／ｍｌまでバッファーＡ（５０ｍＭのリン酸塩ｐＨ７．０と１Ｍの硫酸アンモニウム）中で希釈し、１５分間９０００ｇで遠心分離して、そして１ｍｌのブチル・セファロース４ＦａｓｔＦｌｏｗカラム（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈｉｎｃ．Ｂａｉｅｄ’Ｕｒｆｅｅ，ＱＣ，Ｃａｎａｄａ）に、１ｍｌ／分の流量で添加した。バッファーＡにより同じ流速で安定したベースラインまでカラムを洗浄し、タンパク質を、１００％のバッファーＡ／０％のバッファーＢ（５０ｍＭリン酸塩ｐＨ７．０）から０％のバッファーＡ／１００％のバッファーＢへの４０ｍｌのグラジエントにより溶出した。先に記載されるように、画分を分析して、ｓｅｃＰＨＥＸ又はｓｅｃＰＨＥＸＥ５８１Ｖを含んでいるものを銀染色により可視化した。純粋なｓｅｃＰＨＥＸ又はｓｅｃＰＨＥＸＥ５８１Ｖを含んでいる画分をプールし、濃縮して、そしてＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−５０カラムを使って５０ｍＭリン酸塩ｐＨ６．５、１５０ｍＭＮａＣｌに対して透析した。ブラッドフォード法（ＤＣタンパク質アッセイ・キット；Ｂｉｏｒａｄ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を使ってタンパク質濃度を決定した。
【００６３】
酸素アッセイ
１ｎｇの精製したｓｅｃＰＨＥＸ又はｓｅｃＰＨＥＸＥ５８１Ｖを、５ μｇのペプチド基質と一緒に２００ μｌの量の５０ｍＭのＭＥＳ（２−（Ｎ−モルフィリン）エタンスルホン酸）ｐＨ６．５、１５０ｍＭＮａＣｌ中、３７℃で３０分間インキュベートした。基質として使われる、ペプチドＰＴＨｒＰ１０７−１３９（ヒトの起源、Ｂａｃｈｅｍ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．又はＰｅｎｉｎｓｕｌａＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．から得られる）を、１ μｇ／μｌのトリペプチドＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙをも含む、１ μｇ／μｌ溶液として準備した。ＰＨＥＸ基質ではない後者のペプチドを、内部標準として使用した。ペプチド基質ＡＷＬＤＳＧＶ（ＤｒＧｉｌｌｅｓＬａｊｏｉｅ，ＷａｔｅｒｌｏｏＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓＣ２−３６０ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷａｔｅｒｌｏｏ，Ｗａｔｅｒｌｏｏ，ＯＮＣａｎａｄａ）（配列番号１）を、先にＰＴＨｒＰ１０７−１３９のために記載したのと同じやり方でｓｅｃＰＨＥＸを消化した。ｓｅｃＰＨＥＸ活性に対するオステオカルシンの阻害効果を測定するために、オステオカルシン（ＰｅｐｔｉｄｅＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｊａｐａｎ又はＥ．コリに産生された）を、１０^−８〜５ｘ１０^−４Ｍで変えた終濃度で反応混合物に加えた。オステオカルシンの阻害活性に対する物質の効果を測定するために、物質を、ｓｅｃＰＨＥＸ、ペプチド基質、及び５ｘ１０^−６Ｍのオステオカルシンを含む反応混合物に加えた。オステオカルシンのこの濃度は、ｓｅｃＰＨＥＸ活性の約７５％の抑制作用を与えた。インキュベーション時間に続いて、５ｍＭの終濃度までＥＤＴＡを添加することで加水分解を止めた。原形のままの基質が、効果増強物質（図６を参照のこと）の不存在よりも低い濃度で存在することを確認した時、効果増強物質を同定した。結果を、サンプル中に存在するペプチドＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙの量に対して、基質のピーク下の面積を正規化した後に比較することにより定量化した。
【００６４】
ＰＴＨｒＰ_{１０７−１３９}ペプチドに対するｓｅｃＰＨＥＸの酵素活性の同定と定量化を、２１４ｎｍにセットしたＵＶ検出器によるＣ１８ μＢｏｎｄａｐａｋ分析的なカラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）での逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を実施した。ペプチドを、５％のＢ→８５％のＢの線形グラジエントにより０．４ｍｌ／分の流量で４５分溶出した［移動相Ａ＝０．１％のトリフルオロ酢酸；移動相Ｂ＝８０％のアセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）、０．１％のトリフルオロ酢酸］。
【００６５】
ＡＷＬＤＳＧＶペプチド（配列番号１）に対するＰＨＥＸの酸素の働きの同定と定量化を、４０℃に維持され、２２０ｎｍにセットしたＵＶ検出器による５ μｍＺＯＲＢＡＸ３００ＳＢ−Ｃ１８分析的なカラム（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）での逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を実施した。ペプチドを、３０％のＢ→４５％のＢの線形グラジエントにより１．０ｍｌ／分の流量で１０分溶出した［移動相Ａ＝０．１％のトリフルオロ酢酸；移動相Ｂ＝８０％アセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）、０．１％のトリフルオロ酢酸］。
【００６６】
ＰＴＨｒＰ_{１０７−１３９}のｓｅｃＰＨＥＸ消化産物を、ＭｃＧｉｌｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙＣｅｎｔｅｒにおける質量分析（ＭＡＬＤＩＴｏｆ）により特徴づけした。
【００６７】
ｓｅｃＰＨＥＸの投与
１ｍＭのリン酸ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ中に可溶化した精製ｓｅｃＰＨＥＸを、鎖骨下静脈を通じてＨｙｐ雄（１２週齢）に４又は１４日間連続して毎日静脈内投与した。対照として年齢が一致した同数のＨｙｐ雄マウスを媒質のみで処置した。
【００６８】
結果
ＰＨＥＸの可溶性形態の構築と発現
組み換えヒトＰＨＥＸの可溶性形態を得るために、我々は、初めにＮＥＰの可溶性形態の製造に使用された前記の戦略（２３）を用いて、分割の能力があるシグナルペプチド内に、ＰＨＥＸのシグナルペプチド／膜貫通アンカー（ＳＡ）領域を形質転換することを試みた。この戦略は、トランスフェクト細胞（結果未掲載）の粗面小胞体に捕捉されたままの誤って折りたたまれたＰＨＥＸタンパク質の産生をもたらす。従って、親水性アミノ酸残基の疎水性のものへの置換に加えてＰＨＥＸのＳＡ領域の選ばれたアミノ酸の削除から成る置換戦略を開発した（図１Ａ）。
【００６９】
ＬＬＣ−ＰＫ_１細胞を、ＰＨＥＸの膜又は可溶性形態に関するｃＤＮＡを含むｐＣＤＮＡ３／ＲＳＶ発現ベクターによりトランスフェクトし、そして材料及び方法に記載のとおり永久的な細胞系を設立した（膜結合及び可溶性形態に関する、それぞれ、ＬＬＣ−ＰＫ_１／ＰＨＥＸ及びＬＬＣ−ＰＫ_１／ｓｅｃＰＨＥＸ細胞）。ＬＬＣ−ＰＫ_１／ＰＨＥＸ細胞の抽出物のＰＨＥＸに特有なモノクローナル抗体でのイムノブロッティング法（２７）は、１０５ｋＤａの主要なバンドと９５ｋＤａの小さいバンドを明らかにした（図１Ｂレーン３）。完全な膜タンパク質が期待されるようなタンパク質は、培地中では見つからなかった（図１Ｂレーン４）。対照的に、ｓｅｃＰＨＥＸは、細胞抽出物中の非常に小さい酵素を伴う（図１Ｂレーン５）、培地中の１００ｋＤａの化学種として現われた（図１Ｂレーン６）。ＰＨＥＸとｓｅｃＰＨＥＸのグリコシル化状態を特徴づけるために、我々は次に、組み換えタンパク質をペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）及びエンドグリコシダーゼＨ（ｅｎｄｐＨ）による脱グリコシル化に供した。ＰＮＧａｓｅＦは、高次マンノース、並びにゴルジ複合体に付加されたほとんどの複合Ｎ結合オリゴ糖を取り除く。対照的に、ｅｎｄｏＨは、まだゴルジ複合体を通過していないＲＥＲのタンパク質で見られる高次マンノース型のＮ結合オリゴ糖側鎖を取り除く；このように、ｅｎｄｏＨへの抵抗性は、タンパク質がゴルジ複合体を通って移動したという兆候として使用されうる。ＰＮＧａｓｅＦ処理は、それらの電気泳動移動度が消化により増加する場合に、全てのＰＨＥＸ及びｓｅｃＰＨＥＸ化学種がＮ−グリコシル化されていることを示した（図１Ｂレーン、７と８、１０と１１、１３と１４を比較のこと）。ｅｎｄｏＨにより処理されたＰＨＥＸは、このＰＨＥＸ化学種が多分、グリコシル化を受けたＲＥＲ関連形態であることを示す、９５ｋＤａバンドより速い移動をもたらす（図１Ｂレーン９）。先に示したようにタグを付けられているＰＨＥＸ形態である、酵素の細胞表面発現と一致する、主要な１０５ｋＤａバンドは、ｅｎｄｏＨ消化に抵抗性がある（図１Ｂレーン９）（７）。酵素の本当の分泌を示唆する、培地に存在するｓｅｃＰＨＥＸも、ｅｎｄｏＨ消化に抵抗性があった（図１Ｂレーン１２）。対照的に、細胞抽出物からのｓｅｃＰＨＥＸは、ｅｎｄｏＨ処理に感受性だった（図１Ｂレーン１５）。この結果は、培地と細胞の抽出物からのｓｅｃＰＨＥＸのグリコシル化状態の相違を示し、そしてｓｅｃＰＨＥＸの細胞に付属した形態がゴルジ複合体を通過していない細胞内の化学種であることを示唆する。
【００７０】
ＮＬ１は、その細胞外のドメインのｆｕｒｉｎ分割部位により細胞によって分泌されるペプチダーゼである（１５）。我々は、ＮＬ１Ｎ末端部位（ｆｕｒｉｎ分割部位まで、かつ、それを含めて（４２を参照のこと））とＰＨＥＸの細胞外のドメインで形成した融合タンパク質を組み立てるために、ＮＬ１のこの特徴を利用した。同様に、ベクターｐＣＤＮＡ３／ＲＳＶ／ＮＬ１−ＰＨＥＸが、ＰＨＥＸの可溶性形態の分泌を高めた（ウェスタンブロット未掲載）。先に記載のものを上回るこの方法の利点は、免疫応答を引き出す可能性があるｓｅｃＰＨＥＸのＮ−末端のために少ない外因性アミノ酸残基しか持たせないことを可能にする。
【００７１】
ｓｅｃＰＨＥＸの精製
ｓｅｃＰＨＥＸを、ツーステップ手順を使って均質に精製することができた（図２）。初めに、濃縮した培地（図２レーン１）を、ＳＰセファロース・カラムに添加し、そしてタンパク質を０．０５〜１ＭＮａＣｌグラジエントにより溶出した。ｓｅｃＰＨＥＸを１５０〜２００ｍＭＮａＣｌで溶出した。我々は、この第１ステップ後で回収したｓｅｃＰＨＥＸの量を１リットルの培地につき約２ｍｇと概算した。１種類の夾雑タンパク質がｓｅｃＰＨＥＸと一緒に溶出された（図２レーン２）。この夾雑タンパク質をブチル・セファロース４カラムによりｓｅｃＰＨＥＸから分離した（図２レーン３）。この精製手順の最終収量は、培地１リットルにつき約１ｍｇの精製ｓｅｃＰＨＥＸと概算した。
【００７２】
ｓｅｃＰＨＥＸの活性
ｓｅｃＰＨＥＸ活性を、１５０ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭのＭＥＳｐＨ６．５でアッセイした（２６）。我々は、５０ｍＭ未満の塩しか含んでいない溶液中でのｓｅｃＰＨＥＸの沈澱を観察したので塩化ナトリウムを反応混合物に加えた。
【００７３】
ｓｅｃＰＨＥＸの不存在で、ＰＴＨｒＰ_{１０７−１３９}の消化がない（配列番号４）（溶出時間３１．５分）のは明白だった（図３Ａ）。しかし、ｓｅｃＰＨＥＸの存在で、ペプチドの約７５〜８０％の分解を観察した（図３Ｂ）。（７分での溶出ピークが内部標準として使ったＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙに相当する）。ｓｅｃＰＨＥＸによるＰＴＨｒＰ１０７−１３９の消化は、２３．５、２４．２、２７．０、及び２９．４分（図３Ｂ）で溶出される４つの分解産物をもたらす。亜鉛メタロペプチダーゼに期待されるように、ｓｅｃＰＨＥＸ活性は、１ｍＭＥＤＴＡ（図３Ｃ）又は１ｍＭの１，１０−フェナントロリンの反応混合物への添加により完全に阻害された（結果未掲載）。
【００７４】
ｓｅｃＰＨＥＸの活性がそれと一緒に精製された夾雑プロテアーゼによらないことを確認するために、極めて重要な触媒のＧｌｕ_５８１をＶａｌ残基と交換する、ｓｅｃＰＨＥＸ、ｓｅｃＰＨＥＸＥ５８１Ｖの突然変異体を構築した。ＮＥＰ（２８）又はＥＣＥ−１（２９）に導入した同様の突然変異は、触媒活性の完全な喪失をもたらした。ｓｅｃＰＨＥＸＥ５８１ＶをＬＬＣ−ＰＫ_１細胞で産生し、そしてｓｅｃＰＨＥＸのそれと本質的に同じ発現パターンを示した（図１Ｂ、レーン１０、１１、及び１２をレーン１６、１７、及び１８とそれぞれ比較のこと）。しかし、分泌酵素の野生型形態とは対照的に、精製したｓｅｃＰＨＥＸＥ５８１Ｖは、似通った条件下のＰＴＨｒＰ_{１０７−１３９}の分解に失敗した（図３Ｄ）。
【００７５】
ＰＨＥＸ選択性
ｓｅｃＰＨＥＸの分割部位特異性を決定するために、ＰＴＨｒＰ_{１０７−１３９}の分解物に相当する逆相ＨＰＬＣピークを回収し、質量分析（ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ）により分析した。図４は、確認されたＰＴＨｒＰ_{１０７−１３９}断片を表す（配列番号５〜８）。確認された分割部位から分かるように、ｓｅｃＰＨＥＸによるペプチドの加水分解は、アスパルテート残基のアミノ末端で生じた。
【００７６】
ＭＥＳバッファーのｐＨを５．０〜７．０に、又はＴｒｉｓバッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ．ＨＣｌ、１５０ｍＭＮａＣｌ）のｐＨを７．０〜９．０に徐々に増加させることにより、反応のためのｐＨ最適条件を決定した。最大の活性がｐＨ６．５（図５）で観察されて、ｓｅｃＰＨＥＸ活性は、より塩基性のｐＨ値で急速に減少した。
【００７７】
ｓｅｃＰＨＥＸ活性の阻害
先の調査において、我々はＮＥＰ活性がインキュベーション培地（未発表の結果）のＰｉの存在に感受性があることに気付いた。ｓｅｃＰＨＥＸがＰｉに同様の感受性を持っているかどうかを確認するために、我々は、ｓｅｃＰＨＥＸ活性について０．１〜５０ｍＭのＰｉの効果を調べて、５０％の阻害作用が３．５ｍＭＰｉにより達成されると分かった。ＰｉがｓｅｃＰＨＥＸの効果的な阻害剤であることが分かり、そしてピロリン酸塩、アルカリホスファターゼ基質が骨に豊富なため（４１）、我々は、ｓｅｃＰＨＥＸ活性へのその効果をも調査した。０．１から５０ｍＭへのピロリン酸塩濃度の増加は、酵素活性の５０％の阻害作用が２．５ｍＭで達成されることを証明した（図６Ａ）。
【００７８】
アスパルテート残基（図４）に対するｓｅｃＰＨＥＸ特異性は、Ｓ_１’ポケットがアミノ酸残基の陰性荷電側鎖を収容しうることを示唆した。３つの陰性荷電したγ−カルボキシ・グルタミン酸残基（Ｇｌａ）を含んでいる、オステオカルシンは、ｓｅｃＰＨＥＸ（データ未掲載）により分解されないが、それは、ｓｅｃＰＨＥＸ介在ＰＴＨｒＰ_{１０７−１３９}加水分解の有効な阻害剤である。ｓｅｃＰＨＥＸ活性の５０パーセントの阻害作用が、３．６ｘ１０^−６Ｍのオステオカルシンで達成された（図６Ａ）。
【００７９】
ＰＨＥＸ活性の回復
オステオカルシンのＧｌａ残基がカルシウム・イオンに結合することが知られている（３０）。よって、我々は、オステオカルシンの阻害作用に対するＣａ^２＋の効果を調査した。アッセイにおいてＣａＣｌ_２濃度を１０^−６〜１０^−２Ｍまでの変えることにより、我々は、５ｘ１０^−３ＭのＣａ^２＋濃度がオステオカルシンの阻害効力を５０％まで減らすのに必要であることを示した（図６Ｂ）。Ｃａ^２＋は、オステオカルシン不存在下で、ｓｅｃＰＨＥＸ活性に対して効果がなかった（データ未掲載）。
【００８０】
ＰＨＥＸ阻害剤としてのオステオカルシン及び無機的なピロリン酸塩の機能による機構はまだ知られていない。しかし、どちらの分子も酵素で同じ様式で相互作用する陰性荷電化学基（オステオカルシンのＧｌａ残基とピロリン酸塩のリン酸基）を持つ。Ｃａ^２＋がオステオカルシンによるＰＨＥＸ阻害作用を妨げることができるという観察は、Ｇｌａ残基がオステオカルシン／ＰＨＥＸ相互作用に関係しているという仮説を示唆する。実際、オステオカルシン・グルタミン酸残基１７、２１、及び２４のビタミンＫ依存性γ−カルボキシル化がＣａ^２＋を必要とすることが示されている（３１）。Ａｔｋｉｎｓｏｎら（４０）は、Ｇｌａ残基へのＣａ^２＋に結合が、ＰＨＥＸ活性の回復を担う構造変化を誘発することを示した。この仮説を試験するために、Ｇｌａ残基なしのヒト・オステオカルシンをＥ．コリにより産生し、ヒトの骨から取り出したオステオカルシン（Ｇｌａ残基あり）のそれと、Ｃａ^２＋の不存在又は存在下のその阻害効果を比較した。Ｅ．コリ産生オステオカルシンは、骨からのオステオカルシンと類似した阻害効果を持つが（図７Ａ）、しかし、その活性はＣａ^２＋で調節されなかった（図７Ｂ）。これらの観察は、Ｇｌａ残基がオステオカルシン／ＰＨＥＸ相互作用に不可欠ではないが、そのＰＨＥＸ阻害を不可能する、カルシウムにより誘発される分子の構造変化にとって重要であることを示す。
【００８１】
ＨｙｐマウスへのｓｅｃＰＨＥＸ注射
Ｈｙｐ雄マウスへの４日間にわたる精製ｓｅｃＰＨＥＸの毎日の注射は、用量の関数として血清リン酸を有意に（スチューデントｔテストｐ＜０．０５）減少させた（表１を参照のこと）。Ｈｙｐマウス及びＸＬＨ患者はすでに低い血清リン酸塩及び低い骨質量を有する。ｓｅｃＰＨＥＸ投与により血清レベルをさらに減少させうるという我々の結果を証明する。この結果は、入手可能なリン酸塩が血清から石灰化を受けている骨まで動員される「空腹の骨（ｈｕｎｇｒｙｂｏｎｅｓ）」の概念と一致している。
【００８２】
【表１】

【００８３】
同様の実験において、Ｈｙｐ雄マウスに、１４日間、１ｍｇ／ｋｇの日用量のｓｅｃＰＨＥＸを注射した。この実験において、血清アルカリホスファターゼ・レベルが、骨の生理学的特性の正常化の過程を示す、正常レベル（７１＋／−１１単位）の方向へ大幅に減少した（表２を参照のこと、スチューデントｔテストｐ＜０．０５）。
【００８４】
【表２】

【００８５】
同じ時期の血清リン酸塩レベルを観察し、そして７及び１４日目の処理前と同じレベルであることが判明した。先の４日の実験と合わせてこの情報は、ｓｅｃＰＨＥＸ投与により、リン酸塩レベルは、最初、「空腹の骨」効果のために減し、続いて正常なレベルの方向へ緩やかに増加することを示す。ここで示した正常化へのこの経時的な過程は、骨の治癒が長い期間にわたり生じるという一般的な知識と一致している。
【００８６】
これらの結果は、Ｘ連鎖低リン酸血症と骨粗鬆症の管理を含めた低い骨質量に関連する哺乳動物の症状を改善するため、又は整形外科又は歯の処置から起こる骨形成を要する患者のために、ｓｅｃＰＨＥＸが使用されうることを確認する。
【００８７】
本発明は、それらの特定の態様に関連して説明される一方、さらなる修飾が可能であることが知られ、そして、この出願は、下記の本発明、普通、本発明の原理の、そして本発明が付随する本技術分野で既知又は慣行的な実施の範囲内で行われるような、並びに先に示された本質的特徴が適合されうるような、並びに添付の請求項の範囲に従うような、本開示からの上述の逸脱を含めた、あらゆる変形型、使用、又は適応をカバーすることが意図される。
【００８８】
【化１】

【００８９】
【化２】

【００９０】
【化３】

【００９１】
【化４】

【図面の簡単な説明】
【図１】
ＰＨＥＸ、ｓｅｃＰＨＥＸ、及びｓｅｃＰＨＥＸＥ５８１Ｖの構造と発現
Ａ．ＰＨＥＸタンパク質（ＰＨＥＸ）の略図、並びに野生型（ＴＭ）及び突然変異（ｓｅｃ）膜貫通ドメインのアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２、及び配列番号３）。斜線のボックスは、膜貫通部位を示し、そして黒べたのボックスの位置が亜鉛を結合するアミノ酸の位置を示す。アミノ酸配列方法は、１文字コードで示される。ｓｅｃ配列中で、太字は突然変異アミノ酸の位置を示し、それに対しダッシュ（−）は欠失した残基を表している。
Ｂ．ＰＨＥＸ、ｓｅｃＰＨＥＸ、及びｓｅｃＰＨＥＸＥ５８１Ｖ発現のイムノブロット解析。細胞抽出物（ｃ）、あるいはｍｏｃｋトランスフェクトＬＬＣ−ＰＫ_１細胞（Ｍｏｃｋ）（ｍ）、並びにＰＨＥＸ、ｓｅｃＰＨＥＸ、、又はｓｅｃＰＨＥＸＥ５８１Ｖ（ｓｅｃＰＨＥＸｍｕｔ）のいずれかによりトランスフェクトした細胞の培養上清からのタンパク質を、７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分解し、そして材料及び方法に記載のＰＨＥＸ特異的抗体で可視化した。電気泳動の前に、いくつかのサンプルをＰＮＧａｓｅＦ（Ｆ）又はｅｎｄｏＨ（Ｈ）により処理した。（−）は未処理のサンプルを参照する。分子量マーカーの位置を示した（Ｍｒ）。
【図２】
ｓｅｃＰＨＥＸの精製。ｓｅｃＰＨＥＸ産生ＬＬＣ−ＰＫ_１細胞の培地中に存在するタンパク質（レーン１）、又はＳＰ−セファロースカラム後（レーン２）、若しくはブチル・セファロース４後にプールした画分に存在するタンパク質（レーン３）を７．５％のアクリルアミドで分け、そして銀染色した。分子量マーカーの位置を示した（Ｍｒ）。
【図３】
ｓｅｃＰＨＥＸ活性。ＰＴＨｒＰ１０７−１３９消化断片のＨＰＬＣ解析。（Ａ）ｓｅｃＰＨＥＸ不存在下のＰＴＨｒＰ１０７−１３９；（Ｂ）ｓｅｃＰＨＥＸ存在下のＰＴＨｒＰ１０７−１３９；（Ｃ）ｓｅｃＰＨＥＸ及び１ｍＭＥＤＴＡの存在下のＰＴＨｒＰ１０７−１３９；（Ｄ）ｓｅｃＰＨＥＸＥ５８１Ｖ存在下のＰＴＨｒＰ１０７−１３９。矢印はＰＴＨｒＰ１０７−１３９の溶出位置を示し、そして星印は内部標準として使ったＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙの溶出位置を示す。
【図４】
ＰＴＨｒＰ１０７−１３９中のｓｅｃＰＨＥＸ分割位置の同定。ＰＴＨｒＰ１０７−１３９配列、及び質量分析による断片の確認を示す（配列番号４〜配列番号８）。分割部位を矢印により示す。１文字コードを、アミノ酸残基を表すために使用した。
【図５】
ｓｅｃＰＨＥＸ活性のｐＨ依存性。ｓｅｃＰＨＥＸとＰＴＨｒＰ１０７−１３９を本明細書中に記載のさまざまなｐＨ条件でインキュベートし、そして基質の加水分解の程度をＨＰＬＣにより決定した。最も高い加水分解を得た条件を任意に１００％と定めた。四角：ＭＥＳバッファー中で実施されたアッセイ；三角：Ｔｒｉｓバッファー中で実施したアッセイ。
【図６】
オステオカルシン存在下、精製されたｓｅｃＰＨＥＸによるＰＴＨｒＰ１０７−１３９分解に対するピロリン酸塩、オステオカルシン、及びカルシウムの濃度増加の効果。（２ｘ１０^−６Ｍの一定のオステオカルシン濃度を伴い）ピロリン酸塩、又はオステオカルシン（Ａ）、及びＣａＣｌ_２（Ｂ）の濃度増加の存在下でｓｅｃＰＨＥＸ活性を計測した。（Ａ）において、１００％は阻害剤の不存在下でのｓｅｃＰＨＥＸの活性に相当する。（Ｂ）において、オステオカルシンの阻害効果が計測され、１００％は２ｘ１０^−６Ｍオステオカルシンの存在下で観察された抑制作用とＣａＣｌ_２の不存在下に相当する。
【図７】
精製ｓｅｃＰＨＥＸによるＰＴＨｒＰ１０７−１３９分解に対するヒト産生とＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生オステオカルシンの濃度増加の効果の比較。（Ａ）濃度を増加させたヒト産生（白抜きシンボル）かＥ．コリ産生（黒塗りシンボル）オステオカルシンの存在下でｓｅｃＰＨＥＸ活性を計測した。１００％は、オステオカルシン不存在下のｓｅｃＰＨＥＸ活性に相当する。（Ｂ）オステオカルシンの阻害の効力が計測され、そして１００％は、２ｘ１０^−６Ｍヒト産生（白抜きシンボル）又はＥ．コリ産生（黒塗りシンボル）オステオカルシンの存在下及びＣａＣｌ_２の不存在下で観察されている抑制作用に相当する。

Claims

有効量のｓｅｃＰＨＥＸを投与することを含む、哺乳動物における骨形成を必要とする、骨に関係がある障害又は症状の予防又は治療方法。
前記骨に関係がある障害が、以下の：骨減少症、骨粗鬆症、くる病、Ｘ連鎖低リン血症性くる病、又は整形外科の処置及び歯科の処置を含む症状のうちの１つである、請求項１に記載の方法。
有効量のｓｅｃＰＨＥＸ及び医薬として許容される担体を含む、骨形成を必要とする、骨に関係がある障害又は症状を予防するか、又は治療するための組成物。
骨に関係がある障害を予防するか、又は治療するための請求項３に記載の組成物の使用。
ｓｅｃＰＨＥＸを含む整形外科用の移植片。
ｓｅｃＰＨＥＸを含む義歯。
有効量の、オステオカルシンに結合することができる物質を投与することを含む、哺乳動物における骨形成を必要とする、骨に関係がある障害又は症状の予防又は治療方法。
有効量のｓｅｃＰＨＥＸＥ５８１Ｖを投与することを含む、哺乳動物における骨形成を必要とする、骨に関係がある障害、又は症状の予防又は治療方法。
有効量の、オステオカルシンに特異的な抗体を投与することを含む、哺乳動物における骨形成を必要とする、骨に関係がある障害、又は症状の予防又は治療方法。
前記骨に関係がある障害が、以下の：骨減少症、骨粗鬆症、くる病、Ｘ連鎖低リン血症性くる病、又は整形外科の処置及び歯科の処置を含む症状のうちの１つである、請求項７に記載の方法。
有効量のｓｅｃＰＨＥＸＥ５８１Ｖ及び医薬として許容される担体を含む、骨形成を必要とする骨に関係がある障害又は症状を予防するか、又は治療するための組成物。
骨に関係がある障害を予防するか、又は治療するための請求項１１に記載の組成物の使用。
ｓｅｃＰＨＥＸＥ５８１Ｖを含む整形外科用の移植片。
ｓｅｃＰＨＥＸＥ５８１Ｖを含む義歯。
オステオカルシンの阻害作用を廃することができる物質のスクリーニング方法であって、以下の：
上記物質を選択し；
上記物質、及び計測可能な阻害作用、好ましくは７５％の阻害作用を引き起こしうる濃度のオステオカルシンの存在下、精製ｓｅｃＰＨＥＸをペプチド基質と反応させ；
加水分解反応を生じさせ；
反応産物を定量化し；そして
同一条件下、上記ペプチド基質又は上記反応産物の濃度を、上記物質の存在下で計測し、そしてそれを上記物質の不存在下で計測した上記ペプチド基質又は上記反応産物の濃度と比較し、上記ペプチド基質の濃度が減少するか、又は反応産物が増加する時、物質が確信をもって同定される、
を含む上記スクリーニング方法。
前記反応産物の定量化が、逆相高速液体クロマトグラフィーにより実施される、請求項１５に記載の方法。
前記反応が、約５０ｍＭのＭＥＳ及び約１５０ｍＭのＮａＣｌを含む溶液中で実施される、請求項１５に記載の方法。
前記基質が、ＤＳ又はＤＴモチーフを含み、かつ、それがｓｅｃＰＨＥＸにより分割される、請求項１５に記載の方法。
ＮＬ１の第１〜第６３アミノ酸残基に相当するヌクレオチド配列とＰＨＥＸの第４６〜第７５０アミノ酸残基に相当するヌクレオチド配列のフレーム単位の融合物を発現させることを含む、ｓｅｃＰＨＥＸの製造方法。
ＮＬ１の第１〜第６３アミノ酸残基に相当するヌクレオチド配列とＰＨＥＸの第４６〜第７５０アミノ酸残基に相当するヌクレオチド配列のフレーム単位の融合物を含んだベクター。
インビボにおける細胞内でのｓｅｃＰＨＥＸの発現方法であって、以下の：
ＮＬ１の第１〜第６３アミノ酸残基に相当するヌクレオチド配列とＰＨＥＸの第４６〜第７５０アミノ酸残基に相当するヌクレオチド配列のフレーム単位の融合物をコードする発現ベクターを準備し；
インビボにおいて上記ベクターを細胞内に導入し；そして
細胞内にｓｅｃＰＨＥＸを発現させる条件下、インビボにおいて上記細胞を維持する、
を含む上記発現方法。
疎水性クロマトグラフィー・カラムを使用した他の成分からのｓｅｃＰＨＥＸの分離方法。
前記クロマトグラフィー・カラムが、ブチル・セファロース４ｆａｓｔｆｌｏｗカラムである、請求項２２に記載の方法。
イオン交換クロマトグラフィー・カラムを使用した他の成分からのｓｅｃＰＨＥＸの分離方法。
前記クロマトグラフィー・カラムが、ＳＰ−セファロース・カラムである、請求項２４に記載の方法。