JP2004504059A - 転写された遺伝子を分析、及び同定するための方法、及びフインガープリント法 - Google Patents

Abstract

試料中に存在するｍＲＮＡを同定するため、さらにｍＲＮＡの発現レベルを定量化するための方法である。遺伝子のプロファイルの同定、及び／又は発現レベルが、試料中に発現されるｍＲＮＡ分子集団の特徴的な２つの固有なパターンを形成することにより創り出され、組み合わせアルゴリズムを用いてこれらパターンを分析する。異なる条件下にて異なる細胞型、又は同一細胞型による遺伝子の発現を比較することができる。外部因子、発生、疾患に対する罹病性を含め、種々の細胞処理及び状態を決定する際に重要な役割をはたす遺伝子が、この方法において同定することができる。

Description

【０００１】
発明の背景
本発明は、発現される遺伝子、及び遺伝子のパターン（形状）を同定するための方法に関する。より具体的に、本発明は、転写される遺伝子の分析、及び異なる条件下又は発生の段階の下に、異なる細胞又は同じ細胞において、転写による形状（ｐａｔｔｅｒｎｓ）の比較、さらに多くの違う遺伝子からプールされたＲＮＡの発現レベルを定量化することができる。
【０００２】
ヒト、及びげっ歯類のゲノムに対する配列が、数年以内に完成されることになる。しかしながら、数万と推定される遺伝子のそれぞれの役割を明確にすることが、主な仕事となってくる。これからの極めて大きな仕事として、生きた生体の全体としてのゲノム機能の発現方法を理解することである。
【０００３】
ゲノム中に存在する総遺伝子数のある画分だけが、所定の細胞中に発現される。細胞中に発現される遺伝子の総数の内、比較的小さな画分が、たとえば発生及び分化を含む細胞の内在的及び外在的な性質、恒常性、傷害に対するその応答、細胞サイクルの調節、加齢、アポトーシスなど、その生命過程を決定する。遺伝子発現の変化が、正常な細胞の形成経路、及びガンなどの疾患状態の外観を決定する。所定の細胞における遺伝子発現のプロファイルが、その性質に対する以後の結果を導くことから、全体的な尺度における遺伝子発現を分析するための方法が、極めて重要である。
【０００４】
遺伝子発現のプロファイルを同定することが、生体における正常な生物学的過程をさらに理解するばかりか、遺伝子発現の変化と関連してヒト、動物及び植物の種々の疾患や病状を回復させること、及び治療に対するキーを提供する。さらに、異なる遺伝子発現が、病気への素質、感染物質、及び外部治療に対する鋭敏性（Ａｌｉｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．、２０００；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．、１９９８；Ｄｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９８；Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９９；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ、１９９９；Ｓｚａｌｌａｓｉ、１９９８）と関連していることから、こうした遺伝子発現プロファイルを同定することが、病気に対する強力な診断ツールを、そしてこうした病気を治療又は防止するため、新しい薬剤を同定するツールとして提供することができる。この技術は、遺伝子の発見に極めて力強いものとなろう。
【０００５】
これを実現する唯一の手段は、大規模にて好ましくは１実験において、特定組織／細胞における特定時間にて、発現される全遺伝子を測定することである。１０年にの満たない前では、単一実験において、細胞中のあらゆる転写濃度を同時に測定できるということが、実行不可能である考えられていた。しかしながら、過去数年来ＤＮＡマイクロアレイの使用や他の技術的進歩により、この分野が刺激され極めて大きな関心となっている（Ｂｏｗｔｅｌｌ、１９９９；Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｂｏｔｓｔｅｉｎ、１９９９；Ｄｕｇｇａｎら、１９９９；Ｌａｎｄｅｒ、１９９９；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ら、１９９９）。
【０００６】
ＤＮＡマイクロアレイが、固体支持体をベースにしている。周知の種の同定された配列（ｃＤＮＡまたは合成オリゴヌクレオチド）を、高密度グリッド状の固体支持体に付着させて、そして細胞又は組織から標識化されたＲＮＡ又はｃＤＮＡの溜め量（ａ ｐｏｏｌ ｏｆ）を、ハイブリッドした（Ｄｕｇｇａｎ ら、１９９９；Ｌｉｐｓｈｕｔｓ ら、１９９９）。各グリッドのハイブリダイゼーション・シグナルの強度を測定し、発現に対する評価を与えた。この方法は、研究に基づく遺伝子の予備知識が必要である。小さなスライド上に高密度に配列された約３０，０００の固有遺伝子の配列（すなわち全遺伝子の約１／３から１／４）をカバーするガラス表面に付着されたオリゴヌクレオチドを基盤とするＤＮＡマイクロアレイが、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘから現段階で入手することができる（Ｌｉｐｓｈｕｔｚら、１９９９）。従って、マイクロアレイは、多くの遺伝子発現を高感度に並行に監視する高容量なシステムを基盤としている。ｃＤＮＡマイクロアレイは、ガラス上にｃＤＮＡｓを高速ロボット操作（ｒｏｂｏｔｉｃ）による移植によって調製され（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，１９９９；Ｄｕｇｇａｎら、１９９９；Ｓｃｈｅｎａら、１９９５；Ｓｃｈｅｎａら、１９９６）、上記ガラスでは、問題のあるＲＮＡのプールをハイブリダイゼーション後の該当遺伝子における定量的発現を測定することを提供する。遺伝子の異なる発現の測定が、ＲＮＡの異なるプールを同時にハイブリダイゼーションすることにより行われる。オリゴヌクレオチド・アレイは、ＲＮＡの標的プール（ｑｕｅｒｙ　ｐｏｏｌ）がハイブリダイズされる固体支持体上にｃＤＮＡ又は発現される配列タグの配列に相当するオリゴヌクレオチドをアレイ状に高密度に合成することを基盤としている（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９）
同様にどの技術も極めて強力であるが、それには幾つかの障害を有する、すなわち、（ｉ）発現が研究されている遺伝子における予備知識を必要とする、（ｉｉ）それが、ＲＮＡのハイブリット化によるか、又は取り付け鋳型に等しいというように、間接的である（ｉｉｉ）大部分再生できる方法にて利用でき、合成したオリゴヌクレオチド・アレイが、極めて高価であり（３０，０００遺伝子の各決定に対して約４０００ＵＳＤ），（ｉｖ）室内にてアレイを製造するには、個々の増幅、及び技術的に関心のある各実験に対して、必ずしも不可能でない場合を前提として、研究すべき各遺伝子をアレイする必要がある。
【０００７】
遺伝子発現を検出及び定量化するその他の多くの方法を利用することができる。これらには、たとえば、ノーザンブロット法（Ａｌｗｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９７７）、Ｓ１ヌクレアーゼ・プロテクションアッセイ（Ｂｅｒｋ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，１９７７）、遺伝子発現のシリアル分析（ＳＡＧＥ）（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ　ｅｔａｌ．，１９９５）及びｃＤＮＡライブラリーの配列決定（Ｏｋｕｂｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２）などがあげられる。しかしながら、これらすべてが、処理効率の低い方式であり、遺伝子全体を発現する分析として適切ではない。デファレンシャル・デスプレイ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ）（Ｌｉａｎｇ ａｎｄ Ｐａｒｄｅｅ，１９９２）及び関連技術が、固体支持体を基盤としていないマイクロアレイ技術と対照的である。マイクロアレイに対しこれらの技術的利点は、実験を行うために前もって配列情報を必要ないということである。しかしながら、デファレンシャル・デスプレイ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ）及び関係技術が、大規模な遺伝子発現分析に適さない２つの欠点を有し、つまり（ｉ）各実験の研究下にある遺伝子の同定には、全ての実験における各ｃＤＮＡのクローニング及び配列決定分析の後にのみ決定することができ、そして、（ｉｉ）ｍＲＮＡｓが、全ての実験において複数回同定される、ということである。
【０００８】
ゲノムＤＮＡの大規模な制限酵素断片長多型の方法（ＫｅｙＧｅｎｅ ＥＰ０９６９１０２）が、１又は２種の制限酵素によりゲノムＤＮＡを酵素的な切断、そしてその断片に特定アダプターを結合することに関与している。２種の異なる制限酵素を使用する場合、２つのアダプターが用いられ、各酵素に対して１つ用いられる。これら２種のアダプターのうち１つが、ビオチン化される。次に固相支持体が、ビオチン化されたアダプターが相補的である少なくとも１つの制限酵素部位を含む断片を分離するために用いられる。この方法は、ＰＣＲにおける分解能を改良し、バックグラウンド減少させる強化する方向に導く。多重ＰＣＲが、各プライマーに固有なヌクレオチドによりアダプターに相対して向けられるプライマーを用いて行われる。
【０００９】
セレラ・ジーンタグ技術（Ｃｅｌｅｒａ ＧｅｎＴａｇ）は、前もって既知であろうと未知であろうと、細胞又は組織中の実際に全てのＲＮＡ転写の発現レベルを定量的に測定するためである。これは、周知の遺伝子を同時に監視し、新規な遺伝子を発見を可能にし、有意的に時間、及び配列決定又はチップを基盤とする戦略に対するコストを節約することができる。ジーンタグ技術（Ｃｅｌｅｒａ ＧｅｎＴａｇ）が、生物学的な内容におけるこれらの情報を提供し、従って発見される遺伝子は、生物学的経路、病状の形状、研究されている薬物に対する応答に特異的である。
【００１０】
ジーンタグ方法（ＧｅｎｅＴａｇ ｐｒｏｃｅｓｓ）は、固有のＰＣＲ断片が、各ｃＤＮＡとして生成される原理に基づいている。その断片が、蛍光キャピラリー電気泳動により分離され、次にセレラの（Ｃｅｌｅｒａ’ｓ）の所有権のあるアルゴリズムを用いて、サイズと称され、定量化される。特定のｍＲＮＡの量が、次にその同系のＰＣＲ断片の蛍光強度によって決定される。セルラの（Ｃｅｌｅｒａ’ｓ）所有権のあるジーンタグ（ＧｅｎｅＴａｇ）データベースを用いて、ｃＤＮＡ断片のピークが、これらに相当する遺伝子名と照合される。
【００１１】
この方法において、全ＲＮＡが、関心ある細胞株又は組織から単離される。ジーンタグ（商標）（ＧｅｎｅＴａｇ^ＴＭ）方法は、全ＲＮＡが少なくとも２００μｇ必要である。
【００１２】
相補的ＤＮＡが、全ＲＮＡ試料がら調製され、次に段階的な方式において２回制限酵素切断される。３’末端のキャプチアーが、関心のある断片を単離するために、それぞれ消化した後に使用される。これらの方法を用いると、そのアダプターが、ＰＣＲプライマー部位として利用するためにその断片の両端に結合される。従って、複数の断片を各遺伝子に対して有意的に調製することができる。
【００１３】
アダプターに結合したｃＤＮＡ試料が、一組みのプライマーを用いて増幅され、そのプライマーは、各端部が（＋２／＋２）である２種類の選択可能な塩基対を有する。これら４つの塩基対を組み合わせることにより、全部で１２８の固有なＰＣＲプライマー塩基対を生成する。
【００１４】
各試料から１２８ＰＣＲの反応は、キャピラリー電気泳動によって、キャピラリープラス内部レーン標準当り１反応によってそれぞれ分析される。各遺伝子が、そのサイズ（ｂｐ）により及びそれを生成するために用いられる特定プライマー対に基づいて収容「バイン（ｂｉｎｎｅｄ）」することのできる１つの固有の断片を表している。このビンニング方法（ｂｉｎｎｉｎｇ　ｐｒｏｃｅｓｓ）は、迅速なデータ分析及び遺伝子の同定を可能にする。
【００１５】
セレラの所有権（Ｃｅｌｅｒａ’ｓ　ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）を有するソフトウエアにより割り当てるサイジング及び定量化が、電気泳動図における各ピークに対して測定する。内部サイズ基準により、処理試料及びコントロールから電気泳動図の比較を導くことができる。
【００１６】
処理試料とコントロール試料の両方から、全１２８の電気泳動図うを、自動的に分析しそして比較する。試料とコントロール間の統計的な有意差を示すピーク（ｃＤＮＡ断片）に、フラッグをつけ定量化する。
【００１７】
２工程による精製のため、多量の開始材料が必要となる（すなわち＞２００μｇ）。少数のサブ−反応又はサブデビジョン（１２８）により、断片に周知な配列を割り付けるという問題点を形成する（多くの遺伝子が、他の遺伝子と２重に発現される、すなわち同じサイズの断片として現れることから）。フレームの数が増大すると、開始材料の必要量が同時に極めて多く増大することになる。
【００１８】
米国特許第６０１０８５０号及び第５７１２１２６号に記載の別の方法が、ＰＣＲにおける非３’断片を防止するためにＹ型アダプターを使用する。従ってこのｃＤＮＡが、制限酵素により消化され、Ｙ型アダプターにより結合される。このＹ型アダプターが、３’断片の選択的な増幅を可能にする。しかしながら、プール全体のｃＤＮＡが存在することから、プライマーが非特異的にハイブリダイズするには多くの機会がある。
【００１９】
デジタル遺伝技術（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｇｔ．ｃｏｍ／） が、固有の３’断片の画像を提供する。この方法（米国特許第５４５９０３７号）は、３’断片の単離、及びサブクローニング、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるライブラリーとしてサブクローンされた断片の増殖、プラスミドの抽出、挿入物をｃＤＮＡに転換し、さらにＤＮＡに戻し変換、さらにＰＣＲへの増幅があげられる。大部分の帯域（ｂａｎｄｓ）をたがいに分離できる十分な領域にその反応物を分離するために、上記及びこの方法は共に、多重ＰＣＲの使用に基づいている（すなわち未知の配列に２−３の塩基を突き出している各特定プライマー；複数の反応にわたって変化するこれらの塩基；ゲル又キャピラリー上にて別々に分析されるこれらそれぞれの反応）。この方法は、開始材料を比較的わずかな量しか必要とせず、さらに３’断片を精製しながら、よりストリジェントなＰＣＲを可能にするという目的を実現する。しかしながら、これは、極めて複雑にてコスト高、そして時間を消費する方法が必要なサブクローニング、ライブラリーの製造、及び細菌からｃＤＮＡ断片の再精製がある。
【００２０】
さらなる方法 （ＷＯ　９７／２９２１１）が，単一の制限酵素にて消化することにより、全ＲＮＡ試料から調製される相補的ＤＮＡのプロファイリングを記載している。アダプターが、断片の両端にてハイブリダイズされ、その後その断片が、相補的ＤＮＡ分子のサブセットに特異的にハイブリダイズする１、２又は３のヌクレオチドを有するプライマーＤＮＡ配列を用いて増幅される。特定のヌクレオチド数が増大するにつれて、サブデビジョン数が増大する。しかしながら、プライマーのミスマッチが起こると、断片を同定する精度が低下してくる。ＷＯ　９７／２９２１１では、ミスマッチを減少させるために用できる特定方法を記載している。増幅の初期段階において、単一の特定塩基を含むプライマーが用いられ、続いて後のサイクルにおいて、選択性を極めて強く増大するように、２つの特異的塩基を伴うプライマーが導入される。
【００２１】
ＷＯ　９９／４２６１０は、ある程度のサブデビジョンがアダプターそれ自体によって行われる方法を開示している。制限酵素による初期消化が、認識部位（タイプＩＩＳ酵素）からはっきり識別できる部位にて切断する酵素により行われ、そして標的ｃＤＮＡ配列により突き出し部（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を変動可能な状態にする。変動可能な配列を伴うアダプターを、これらの突き出した（ｏｖｅｒｈａｎｇ）部位に結合し、従ってその反応をサブデバイデングすることができる。
【００２２】
他の種々の技術が、いわゆるＤＮＡフィンガープリントにおいて用いられてきた。
【００２３】
ＰＣＲを基盤とする方法は、特に単一のプライマー対により増幅される試料として、ハイブリッド化を基盤とする方法のものより著しく高い感受性及び再生成性により極めて適切な定量データを与えることは、明らかである。以前これは、定量化される遺伝子を高い信頼性により同定することができないという犠牲を払うことになった。デファレンシャル・デスプレイ（ｄｉｆｆｅｒｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ）（Ｌｉａｎｇ　ａｎｄ　Ｐａｒｄｅｅ，１９９２）が、断片を切除しそれを配列決定することにより物理的な同定に依存する。最近の改良では （たとえばデジタル遺伝子技術）、同定を試みるために簡単なデータベース検索を導入した。上記のような簡単なデータベース検索による主な問題点の１は、断片を同定するために複数の遺伝子が生ずることである。サブ反応数を増大させることによりこの問題を克服するため種々の試みが、行われてきた。しかしながら、サブデビジョン数を増大させることによって、十分にアドレス化されない簡単なデータベース検索のさらに多くの問題点がある。最初に、キャピラリーまたはゲル電気泳動における断片の呼び出しサイズが、約＋／−３塩基対の順序に関する断片長について完全ではなく、不確定性を導入してくる。第２には、データベース配列の３’末端の正確な位置について不確定性となる場合がある。こうした不確定性の程度が、１０塩基対を越えことが良くあり、時には数百塩基対ほど長くなる場合がある。
【００２４】
所定の細胞における遺伝子発現のプロファイルが、その生命過程を決定し、それにより、細胞だけ、あるいは複数細胞器官の性質及び機能を直接反映する。発生期、及び成人におて、異なる組織及び細胞における大規模な全体的発現パターンの分析が、その細胞／組織において発現される全遺伝子の発現地図（ａｔｌａｓｅｓ）を提供する。こうした地図（ａｔｌａｓｅｓ）が、遺伝子機能に関する重要な情報、さらに生体の正常な生物学的過程を理解する重要な情報を提供する。これらは、さらに特定の運命（すなわち、たとえばドーパミン作用性神経細胞（ｎｅｕｒｏｎ）の特異化、及び分化の過程にて排他的に発現される全ての遺伝子を同定すること）に細胞を誘導するために必要なものに関する情報を提供する。
【００２５】
有意的に多くの疾患の挙動が、数百から数千の遺伝子発現の変化によって、追跡され、全体の遺伝子発現をプロファイルすることが、疾患の挙動及び臨床結果、違う薬剤に対する応答性、及び予測される病気の結果を特徴付けるための強力なツールを提供することが、一般的に考えられる。これは、ガンに対しても極めて正しいことがわかった（Ａｌｉｚａｄｅｈら、２０００；Ｇｏｌｕｂら、１９９９；Ｐｅｒｏｕら、１９９９）。
【００２６】
迅速で安価な全体的遺伝子発現のプロファイリング技術が、臨床診断としての遺伝子を迅速に同定する手段を提供することになる。こうした情報が、例えば実時間ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる小規模分析を使用する診断として以後使用することができる。
【００２７】
薬剤は、高処理性能スクリーンにて、単一／２−３の特性を選択することによりしばしば同定される。従って、一次分子標的が同定されるが、薬剤の全経路及び２次標的が知られていない。薬剤の別の作用及び結果が、適切な場合又は有害な場合がある。そのため、薬剤又は薬剤候補の全生物学的な作用経路の同定には、市場として、あるいはヒトへの重要性という問題がある。全体の遺伝子発現をプロファイルすることが、薬剤の作用の特徴付けに対する迅速で安価な方法、及び薬剤により影響される細胞経路を提供することになろう。
【００２８】
本発明において、２本鎖ｃＤＮＡを試料中のｍＲＮＡから生成される。この２本鎖ｃＤＮＡを、消化された２本鎖ｃＤＮＡ分子を提供し、それぞれが制限酵素の消化により提供される付着末端を有するように、制限酵素による消化を受ける。
【００２９】
アダプターの集団が、消化された２本鎖ｃＤＮＡ分子のそれぞれの付着末端に結合され、これにより、各本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の第１鎖が、３’末端アダプターオリゴヌクレオチドを含み、そして各２本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の第２鎖が、３’末端ポリＡ配列を含んでいる、第１鎖と第２鎖を含む各２本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子を提供する。
【００３０】
次にこれらの２本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子が精製される。従って、ｍＲＮＡの３’末端に相補的な配列を有するｃＤＮＡ断片の実質的に純正な集団を提供する。
【００３１】
２本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の精製は、当業者が利用可能な適切な手段によって行うことができる。たとえば、ｃＤＮＡ分子の末端の１にてポリＡあるいはポリＴ配列が、ビオチンにより標識化（ｔａｇ）され、スプレプトアビジン被覆ビーズに結合することにより、これら２本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子を精製することができる。別の選択肢として、これらの２本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の分離は、ＰＣＲの前にオリゴＴ及び／又はオリゴＡプローブと結合することに基づいて、ハイブリダイゼーションによる選択によって行うことができる。
【００３２】
好ましくは、この方法はさらに、アダプターオリゴヌクレオチドを結合させる前に、３’末端ポリＡ配列を有する鎖を含んでいる消化された２本鎖ｃＤＮＡを精製することを含む。これは、アダプターの非特異的な結合を阻止するという利点がある。再度、これは、上記のようにビオチン標識（ｔａｇｇｉｎｇ）による精製を含み、当業者に利用できる任意の方法を用いてもよい。
【００３３】
本発明の好ましい例において、ｃＤＮＡ配列の３’末端が、制限酵素による消化の前に固定化される。この例において、ｍＲＮＡから生成されるｃＤＮＡの１端が、固体支持体に（たとえば電磁又はプラスチックなどのビーズ、又は、たとえば遠心分離や磁気作用により洗浄して保持することのできる他のいずれかの固体支持体、あるいはサブデビジョン方法としてサブチエンバーを伴う微小成形反応チエンバー、この場合化学物質がチエンバーを介して洗浄される）ｍＲＮＡ分子の３’末端に元のポリＡに対して相補的な、５’末端のオリゴＴによって固定される。ｃＤＮＡ配列のもう一方の末端が、制限酵素による消化を受けて、そしてアダプターが遊離（消化された）末端に結合される。従って上記の消化された２本鎖ｃＤＮＡ分子又は２本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の精製が、固体支持体上の所望の分子を保持しながら過剰な物質を洗浄により除去して行うことができる。
【００３４】
ＰＣＲを、ｃＤＮＡの両端にてアニールする、１端が、ｃＤＮＡの１方の鎖における３’末端にてアダプターにアニールするよう設計され、もう１端がｃＤＮＡのもう１方の鎖の３’末端にて （ｍＲＮＡの元のポリＡに相当する） ポリＡにアニールするようにオリゴｄＴを含んでいる、プライマーを用いて行われる。酵素ＩＩ型を使用するために、各プライマーが、一方の鎖に対するアダプターに隣接するか、もう一方の鎖に対するポリＡに隣接するかいずれかである、相補的配列によりｃＤＮＡのサブセットを増幅する変異可能なヌクレオチド、又はヌクレオチド配列を含んでいる。酵素ＩＩＳ型としては、酵素が２本鎖ＤＮＡを切断する場合、生成される付着末端の相違する可能性のある両端と結合されるアダプターが、用いられる。従って、アダプターの集団が、酵素ＩＩＳ型により切断／消化した後、ＤＮＡ集団内に、付着末端の可能性のある全てに相補的になるように用いることができる。プライマーを、アダプターによりアニールするＰＣＲにおいて使用する。
【００３５】
プライマーを標識化することができ、そしてその標識を、関連するプライマー変異領域における相当する位置にて、関連するＡ，Ｔ，Ｃ又はＧヌクレオチドに相当することができる。これは、ＰＣＲにおいて生成される２本鎖ＮＤＡが、標識化され、そしてその標識化剤と産生ＤＮＡの長さを組み合わせることが、特徴付けされたシグナルを提供することを意味する。そうでなければ、産生物の長さと、（ｉ）酵素ＩＩ型の消化のために用いられるＰＣＲプライマー、又は（ｉｉ）酵素ＩＩＳ型の消化のために用いられるアダプターとの組み合わせが、特徴付けとなるシグナルを提供する。
【００３６】
このことから各遺伝子が、単一断片を生成し、従って各完了パターンが各遺伝子を同時に示すことを理解すべきである。上記パターンが、その試料を特徴付けすることができる。
【００３７】
試料として生成されるシグナルのパターン、又は試料間の違いとして同定される１または複数の個々のシグナルパターンを、関心のある配列を同定するために周知の配列をデータベースから形成されるパターンと比較することができる。分化、細胞サイクルの異なる条件又は段階下に異なる細胞又は同じ細胞から、あるいは形質転換された（腫瘍形成された）細胞及び正常な細胞から生成されるパターンを比較することができ、そしてパターンにおける違いを同定することができる。これは、配列を同定することができ、その配列の発現が、分化又は細胞サイクルの異なる条件又は段階の下に細胞間又は同一細胞において相違するか、あるいは正常な細胞と腫瘍形成細胞間に相違する細胞過程に関与している。
【００３８】
しかしながら、パターンにおける各断片が、同じサブ反応中に現れる同一長の断片を形成する複数の遺伝子に相当する場合がある。分析中に二重として現れるこれらの複数の遺伝子が、簡単なデータベースの検索により区別することができない。
【００３９】
上記方法によって不明性なく同定できる遺伝子数を増大させるために、第２の、独立したパターンを、異なる制限酵素を用いて得ることができる。これは、上記パターンが、組み合わせ同定アルゴリズムを用いて周知のｍＲＮＡｓとして決定、又は想定されるシグナルのデータベースと比較することができる。これは、本節「断片の同定化」に基づいて記載されている理由のため、不明でなく同定できる遺伝子数を有意的に増大する。
【００４０】
組み合わせアルゴニズムは、以下のようにコンピュータによって行うことができる。
【００４１】
１．　各実験における断片に相当するデータベース中の全遺伝子が、一覧に記載されている。これは、各実験に対して発現可能な遺伝子の一覧を形成している。
【００４２】
２．　次に各実験に対して、断片に明らかに対応していない遺伝子を、一覧として表している（すなわち実験中に見出されなかった長さの断片を与えるべき遺伝子）。これは、各実験に対し明確に発現されない遺伝子の一覧を形成している。
【００４３】
３．　次に各実験における発現されない遺伝子が、他の各実験において発現の可能性のある遺伝子を一覧から取り除かれる。
【００４４】
４．　この結果は、ほとんどの場合に各断片が、単一の候補遺伝子の同定を保持する各実験に対する一覧である。
【００４５】
好ましいアルゴリズムでは、その断片の同定及び定量化共に可能である。この例では、生体内の全て又はほとんどの遺伝子が同定され、下記の様に行うことができる場合特に好ましい：
１．　各実験における断片に相当するデータベース中の全ての遺伝子が、一覧として記載されている。これは、各実験に対して発現される可能性のある遺伝子の一覧を形成している。各実験における各断片に対して、式は、Ｆｉ ＝ ｍ_１ ＋ ｍ_２ ＋ ｍ_３であり、１，２，３などは、遺伝子のｉｄ’ｓであり、Ｆｉは、断片からのシグナル強度である。電気泳動における断片ピークに相当する各遺伝子は、右側の語句として表している。
【００４６】
たとえば、１６２ｂｐのピークが、データベース中の遺伝子２３４、６４７及び７８に相当し、それが２５４６の強度を有する場合、相当する式は、
２５４６ ＝ ｍ_２３４ ＋ ｍ_６７４ ＋ ｍ_７８
と表される。
【００４７】
２．　次に各実験に対して、同一性が断片に対応しない遺伝子が、一覧として記載される（すなわち、実験において見出されない長さの断片を与えるべきもの）。これは、各遺伝子に対して明らかに発現されない遺伝子の一覧を形成している。
【００４８】
Ｏ ＝ ｍ_６５７
上記のように、６５７は、遺伝子ｉｄである。
【００４９】
３．　従って連立式の系が、未知のｍ（＝生体における遺伝子数）、及びｎ ≦ ｋｍ式（この場合ｋが実験数）である。全遺伝子が、全実験において単独にて作用する場合ｎ ＝ ｋｍである、それは各遺伝子が、それ自身の式において表されることになるからである。これらが二重または多重としての作用が多くなるにつれ、ｎが少なくなってくる。しかしながら、ｎ ＞ ｍであるかぎり、この系は過剰に判定され、従って、最少二乗解（ｌｅａｓｔ−ｓｑｕａｒｅｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を見出すために、標準的な数値方法を用いて解くことができる。たとえば、ＭＡＴＬＡＢにおけるバックスラッシュ操作を用いることができる。
【００５０】
４．　系の解が、その発現レベルの最良の近似値を各遺伝子に与えることになる。その解は、最少二乗解にて可能である。実施される実験が多いと、それだけ良好な近似値となる。誤差は、残留物を計算することにより想定することができる（つまり、式中に想定される遺伝子作用を挿入し、計算によるピーク強度を得、これらを、測定された強度と比較するすることにより）。５０，０００の未知の系において１００，０００の式の系が、通常のＰＣにて１６時間にて解くことができることを、シュミレーションが示している。
【００５１】
そのアルゴリズムが、試料中に存在するｍＲＮＡｓのプロファイルを生成することになる。細胞サイクルの異なる条件か、又は異なる段階の下に、２つの異なる細胞型か又は同じ細胞型に対するプロファイルを、比較することができる。これは、２種の細胞型において異なって発現される配列を同定することができる。さらに、発現における定量化及び定性化の相違を同定することができる。
【００５２】
本明細書に記載されているように本発明の方法において、制限酵素が、用いられる断片分析方法により容易に分離され、長さが決定できるサイズ分布を獲得できるよう、通常選択される。制限酵素により切断することによって、得られる単離された３’末端断片の分布は、１／ｘに比例する、この場合ｘは長さである。分布状態の尺度は、切断の確率に依存する。酵素が一度に４０９６（６塩基対認識配列）に切断すると、その分布状態が、新しいキャピラリー電気泳動法としてあまりにも広がりすぎる。１／１０２４又は１／５１２が好ましい。ＨａｅＩＩは、その変性認識モチーフから１／１０２４に切断する。それが順方向または逆方向のいずれにおいても５塩基対を認識することから、ＦｏｋＩが、１／５１２に切断する。４ｂｐ−切断物質が１／２５６に切断し、それが、２重化を有意的に起こるような極めに圧縮された分布状態を創り出す。従って、ＨａｅＩＩ及びＦｏｋＩのような酵素が好ましい。
【００５３】
従って好ましい例において用いられる酵素は、切断頻度が１／２５６−１／４０９６ｂｐ，好ましくは１／５１２又は１／１０２４ｂｐにて２本鎖ＤＮＡを切断することができる。
【００５４】
制限酵素が、制限酵素ＩＩ型である場合、ＨａｅＩＩ，ＡｐｏＩ，ＸｈｏＩＩまたはＨｓｐ９２１を使用することが好ましい。制限酵素が、制限酵素ＩＩＳ型である場合、ＦｏｋＩ，ＢｂｖＩ又はＡｌｗ２６１を用いることが好ましい。別の適切な酵素は、ＲＥＢＡＳＥ（ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍ）により同定される。
【００５５】
好ましくは、制限酵素が、２−４のヌクレオチドの付着末端を提供するために、２本鎖ＤＮＡを消化する。制限酵素ＩＩＳ型として、４ヌクレオチドの付着末端が好ましい。
【００５６】
記載のように、第２、又は第２及び第３の異なるＩＩ型あるいはＩＩＳ型制限酵素又は複数の酵素を用いて、試料として付加パターンを形成することにより有意的な情報を得ることができる。
【００５７】
酵素ＩＩ型により消化された後にＰＣＲのために用いられる各第１のプライマーおいて、単一の変動可能なヌクレオチド、又は２個以上の、たとえば２又は３個の変動可能なヌクレオチド配列でよい。変動可能な配列の各位置において、第１のプライマーを、Ａ，Ｃ，Ｇ及びＴのそれぞれが集団に表されるように提供することができる。
【００５８】
各第２のプライマー（オリゴｄＴを含む）において、ｎは、０，１あるいは２で良い。
【００５９】
変動可能なヌクレオチドが、ＰＣＲとして用いられるプライマーにおいて必要されなく、その場合アダプター配列の変動性が付着末端により提供されることから、制限酵素ＩＩＳ型が用いられる。
【００６０】
一般的に制限酵素ＩＩＳ型が用いられる場合、制限酵素に対して全て可能な付着末端が、集団内にて表されるようにアダプターの集団が提供され、そして各アダプターが、別々の反応容器における試料の画分に結合することができる。次に各反応容器に用いられるアダプターが知られることになり、２本鎖産生物ＤＮＡ分子の長さとこの情報を組み合わせて、所望の特徴付けとなるパターンを提供する。
【００６１】
好ましい例において、アダプターを結合する場合、アダプターを１本鎖に、例えば化学的にブロックすることができる。これは、リン酸基が、窒素、水酸基、又は別のブロッキング成分により置き換えられた３’ジオキシオリゴヌクレオチド、又は５’オリゴヌクレオチドなどのブロッキング基を用いて行うことができる。これは、他の、ブロックされない鎖と結合可能であり、そして特異性を改良するために用いることができる。２５０：１より大きな特異性を得ることができる。ＰＣＲが、単一の結合鎖から進めることができる。さらに、材料やび方法が記載されているように、結合における特異性及び／又は効率性を改良する結合条件が、同定されてきた。これらの条件が、４種の変異可能な塩基対によりアダプターの結合において特異性を実現する際に好適であることが見出されてきた。
【００６２】
都合の良いことに、複数のアダプターが、単一の反応容器内にて結合することができ、所定容器内のそれぞれ異なるアダプターの場合（制限酵素ＩＩＳ型の消化により提供される付着末端の可能性のある集団内の付着末端に相補的な異なる末端配列を伴い）、そこに、異なるプライマーアニーリング配列を含んでいる。たとえば、３種の異なるアダプターが、１つの反応容器において組み合わせることができる。
【００６３】
次に、対応する第１のプライマーが用いられ、これらが、それぞれ異なるアダプターオリゴヌクレオチドから生成する産生物を区別するために、標識化することができる。
【００６４】
酵素ＩＩ型が用いられる場合、第１のプライマーを標識化することができる、個々のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅が、別々の反応容器にて行われる場合、第１のプライマーが用いられることがすでに解っているが、第１のプライマーを標識化することができる。他の点で標識化は、第１のプライマー配列が、どこの２本鎖ＤＮＡ生成物分子を提供していることに関する適切な情報を提供する。
【００６５】
都合のよい事に、３種の異なる第１のプライマーの増幅が、各第１のプライマーが、適切に標識化された状態にて（所望により標識化されたサイズマーカを用いて） 各反応容器内にて行うことができる。
【００６６】
分離には、キャピラリー又はゲル電気泳動を用いても良い。単一の標識が反応につき用いられ、キャピラリー又はレーン当り４染色体を伴い、その内の１つがサイズマーカーを伝達する。
【００６７】
従って、第１試料中のｍＲＮＡｓ集団のパターン特性が得られる。
【００６８】
別のところにて記載されているように、第１試料中に存在するｍＲＮＡｓ分子集団の第１のパターン特性が、第２の試料中に存在するｍＲＮＡｓ分子集団の第２のパターン特性と比較することができる。その違いが、前記第１のパターンと前記第２のパターンとを同定することができ、且つ、その発現が前記第１のパターンと前記第２のパターンとを相違に導く核酸が、同定及び／又は獲得することが出来る。
【００６９】
追加的に又は他の選択肢として、２本鎖産生物ＤＮＡの長さ、及び用いられる第１のプライマー又はアダプターのオリゴヌクレオチドを組み合わせることにより、２本鎖産生物ＤＮＡに対して提供されるシグナルが、周知の発現ｍＲＮＡ’のシグナルとしてのデータベースと比較することができる。試料中の周知の発現ｍＲＮＡを同定することができる。
【００７０】
次にその手順は、第１の試料に対し、第２の独立したパターンを得ることのできるように、異なる制限酵素を用いて繰り返すことができる。異なる実験において、ＩＩ型又はＩＩＳ型の少なくとも２つの異なる制限酵素により生成されるパターンを、上記アルゴリズムにより周知のｍＲＮＡのものとして決定、あるいは想定されるシグナルのデータベースとを比較することにより、有意的に有効な断片の同定を提供することができる。次に２種類の細胞集団により発現される配列の定量的又は定性的な差を同定できるよう、異なる条件又は分化の異なる段階にて、得られたプロファイルを、異なる細胞型か又は同じ細胞型からの試料のプロファイルと比較することが可能である。
【００７１】
準備及び最適工程を、通常の実施に従って当業者によって行うことができる。
【００７２】
標識は従来の蛍光染料でよく、電気泳動（例えばゲル上）後の関係シグナルが、標準的な配列決定器を用いて読み込まれる長さの塩基の２本鎖産生物ＤＮＡ分子を分離できるようにする。
【００７３】
３’末端ｃＤＮＡ断片のライブラリーが、固体の支持体上にて調製され、その場合各転写が固有の断片により表される。蛍光プライマーを伴うＰＣＲ増幅処理後、キャピラリー電気泳動装置上に前記ライブラリーを表示することができる。各電気泳動図におけるバンド数を減少させるために、初期ライブラリーを、例えば以下２つの方法の１つを用いて、サブデバイド（ｓｕｂｄｉｖｉｄｅｄ）することができる。
【００７４】
通常の酵素ＩＩ型により生成されたライブラリーに対して、アダプターを各断片の付着末端に結合させることができる。アダプターが、制限酵素により生成される付着末端に相補的部分及びプライマーがアニールへの部分を含んでいる。単一の反応容器中に少数の独立した反応を進めることができるように、１つのプライマーアニール配列を使用することができか、又は最少交差ハイブリット化を示す少数の、たとえば２又は３の異なる配列を使用することができる。
【００７５】
次にライブラリーを、多くの異なる反応容器に分けて、各容器中の細分化した（ｓｕｂｓｅｔ）断片を、未知の配列に突出しているわずかに余分にある塩基を搬送する３’（オリゴ−Ｔ）及び５’（標準（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）アダプター）末端と融合可能なプライマーを用いて、ＰＣＲにて増幅される。したがって、各反応において、突出している塩基の異なる組み合わせにより、細分化した（ｓｕｂｓｅｔ）断片を選択的に増幅することができる。
【００７６】
遺伝子に特異的な付着末端を与えるこれらの認識配列の外側を切断する、酵素ＩＩＳ型により生成されるライブラリーとして、前記ライブラリーが、多くの異なる反応容器に分けられる。全て可能性のある付着末端が、上記集合体において表されるような標準（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）的な不変部及び可変付着末端を含むように、任意の組みのアダプターが設計される。各反応容器においてこうした単一のアダプターが結合される。次にアダプターを搬送する各容器中の細分化した（ｓｕｂｓｅｔ）断片が、標準（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）的な高ストリンジェンシーなプライマーにより増幅される。
【００７７】
元の試料中に相当するｍＲＮＡｓの相対存在量を示すために、両方の方法における生成反応を、断片の長さ及び存在量を定量するキャピラリー電気泳動装置にて別々に行うことができる。
【００７８】
各断片に対しては、以下の点が知られている、すなわち
−生成のために用いられる制限酵素部位（たとえば４−８の塩基数）；
−その長さ；
−サブ反応（ｓｕｂ−ｒｅａｃｔｉｏｎ）（サブデビジョン（ｓｕｂｄｉｖｉｓｉｏｎ）法により与えられるが一般的に追加的な４−６塩基に相当する）、である。
【００７９】
サブデビジョン（ｓｕｂｄｉｖｉｓｉｏｎ）が適切に行われる場合、十分な情報が形成されて、データベースから周知な配列により各断片を同定することができる。これは、断片長の分布（酵素により与えられる）及びサブデビジョン（ｓｕｂｄｉｖｉｓｉｏｎ）（突出している塩基により、及び／又は付着末端により与えられる（ＩＩＳ型））の組み合わせを選択することにより行うことができる。２塩基程度のわずかの塩基対（１６のサブ・反応（ｓｕｂ−ｒｅａｃｔｉｏｎ））又は８塩基もの数の塩基数（６５５３６のサブ・反応（ｓｕｂ−ｒｅａｃｔｉｏｎ））を用いることができる；少ゲノムが分析される場合、少数のサブ・反応（ｓｕｂ−ｒｅａｃｔｉｏｎ）にて十分である；高スループットの分析法が利用できる場合、極めて多数のサブ・反応（ｓｕｂ−ｒｅａｃｔｉｏｎ）にて、非常に多数の遺伝子の分離することができる。実際には、４から６の間の塩基数が通常用いられる。
【００８０】
実施例１
方法Ｉ、サブセット（フレーム）を形成するために、未知の配列に突き出している１又は複数の塩基を伴うＰＣＲプライマーを使用。
【００８１】
ＲＮＡを標準技術より精製した。前記ＲＮＡを６５℃１０分間変性して、オリゴテックス・ビーズ（（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ　ｂｅａｄｓ）Ｑｉａｇｅｎ）に加え、そのビーズに共有結合されるオリゴｄＴ鋳型にアニールした。鋳型としてオリゴテックス・ビーズ（（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ　ｂｅａｄｓ） Ｑｉａｇｅｎ）に結合されるｍＲＮＡを用いて、第１鎖ｃＤＮＡ合成が行われた。したがって、この第１鎖のｃＤＮＡが、オリゴテックス・ビーズ（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ　ｂｅａｄｓ）に共有結合することになる（Ｈａｒａら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９，７０９７）。第２鎖の合成を、上記Ｈａｒａら記載のように行った。簡単に述べると第１の鎖が、オリゴｄＴにより誘導される（ｐｒｉｍｅｄ）ｍＲＮＡから逆転写酵素（ＲＴ）により合成された。第２の鎖が、ｍＲＮＡを切断するＲＮａｓｅにより、そしてＲｎａｓｅにより残された小ＲＮＡ断片を伸長停止（ｐｒｉｍｅｓ　ｏｆｆ）するＤＮＡポリメラーゼによって産生され、それが進行するに従い他のＲＮＡ断片を置き換えていく。オリゴテックス・ビーズ（（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ　ｂｅａｄｓ）Ｑｉａｇｅｎ）に結合された２本鎖ｃＤＮＡが、精製され、ＨａｅＩＩにより制限酵素的に消化される。ＨａｅＩＩが用いられた。それぞれの酵素としては、ＡｐｏＩ，ＸｊｏＩＩ，Ｈｓｐ９２１（ＩＩ型）及びＦｏｋＩ，ＢｂｖＩ及びＡｌｗ２６１（ＩＩＳ型）があげられる。ＣＤＮＡを、オリゴテックス（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ）に結合されたｃＤＮＡ画分を維持しながら、再度精製した。
【００８２】
アダプターをｃＤＮＡのＨａｅＩＩ部位に結合した。上記アダプターが、全ｃＤＮＡｓのＰＣＲとして標準的な鋳型を提供するために、ＨａｅＩＩ部位及び余分なヌクレオチドに対して相補的な配列を含んだ。次にｃＤＮＡを、塩、タンパク質及び未結合なアダプターを除去するために再度精製した。
【００８３】
ｃＤＮＡを９６ウエルの皿（ｗｅｌｌ　ｄｉｓｈ）に、９６の等価なプールに分割した。各ウエル中の精製された断片のサブセットだけを、ＰＣＲ増幅するために、複数のＰＣＲを以下のように設計した。
【００８４】
５’プライマーが、標準（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）鋳型に対して相補的であるが、未知の配列に２塩基を伸張していた。これらの塩基の最初が、ＨａｅＩＩ部位においてゆらぎ塩基（ｗｏｂｂｌｉｎｇ　ｂａｓｅ）に相当するチミンかシトシンのいずれかであるが、２番目が、グアニン、シトシン、チミン又はアデノシンのいずれかであった。各５’プライマーを、ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍキャピラリー配列決定装置によって検出可能な蛍光色素に、炭素スペーサーによって蛍光するように結合させた。蛍光色素を２番目の塩基に照合した。各ウエルが、全てにて４種の蛍光色素（さらには４種の２番目の塩基） を伴う４つのプライマーを受ける、すなわち半分のウエルが、１番目の塩基チミンを伴うプライマーを、後の半分のウエルが１番目の塩基シトシンを伴うプライマーを受けた。
【００８５】
３’プライマーが、オリゴｄＴであり、従って元のｍＲＮＡのポリアデニール化配列に対して相補的であった。各プライマーが未知の配列に伸張する３つの塩基により設計され、その１番目がグアニン、アデノシンまたはシトシンのいずれかであり、他の２つが、４種の塩基のいずれかであった。各ウエルが単一の３’プライマーを受けた。従って、ＰＣＲ反応が、それぞれに４種の蛍光色素チャンネルを伴った９６のウエルにて３８４のサブ・反応（ｓｕｂ−ｒｅａｃｔｉｏｎ）に多重化された。
【００８６】
緩衝液、ヌクレオチド、ポリメラーゼを含んでいる、標準的なＰＣＲ反応混合物を加えた。ＰＣＲを、Ｐｅｌｔｉｅｒ　ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ（ＰＴＣ−２００）にて行った。この実験に用いられる各プライマー対が、そのプライマー対固有の４ヌクレオチドの組み合わせを含んでいる遺伝子のみを認識し増幅する。これら各遺伝子のＰＣＲ断片のサイズが、ポリアデニール部位と最も隣接するＨａｅＩＩ部位との間の長さに相当する。
【００８７】
得られるＰＣＲ産物をイソプロパノールにて沈積させ、ＡＢＩ　ｐｒｉｓｍキャピラリーシーケンサー上に負荷した。従って発現した遺伝子を表すＰＣＲ断片を、サイズにより分離し、各断片の蛍光度を検出器及びＡＢＩ　ｐｒｉｓｍにより適用されるソフトウエアを用いて定量化した。
【００８８】
用いられるプライマーとの組み合わせにより、各蛍光チャンネル及び試料において（所定の試料中の発現される２０％の遺伝子にて、そして総数１４０，０００の遺伝子により）〜７０のＰＣＲ産物の理論的平均値を引き出した。ＨａｅＩＩ制限酵素の消化の後に周知の遺伝子から生成されるポリアデニールを含め３’断片の統計的なサイズ分布の分析が、断片のフレーム及び長さにのみに基づいて、想定される８０％が固有に同定することができることを示した。ＡＢＩ　ｐｒｉｓｍが、１−２０００ヌクレオチド間を０．５％の解像度を有している。この不正確性を考慮しても、発現遺伝子の〜６０％を、固有に同定することができる。同じ手順を用いるが他の５塩基切断制限酵素によりＨａｅＩＩ制限酵素を置き換える付加的な並行実験を用いると、理論的限界よりゲノム中の全転写における〜９６％まで、そして、実施限界 （ＡＢＩ　ｐｒｉｓｍの与えられた分解能）よりそれの〜８５％まで増大する。
【００８９】
試料中の各ｍＲＮＡのレベルが、ＡＢＩ　ｐｒｉｓｍのシグナル強度に相当する。従ってこの分析における各断片に、すなわち８．５ヌクレオチド（ＨａｅＩＩ認識配列を含む）とポリアデニールからＨａｅＩＩ制限酵素部位へのサイズに等しい情報を組み合わせることにより、各ｍＲＮＡの同定（ＥＳＴ、遺伝子又はｍＲＮＡの同定）を確立することができる。全て周知な遺伝子と固有のＥＳＴクラスターに関する検索可能なデータベースが以下の様に構成された。
【００９０】
一部相同する断片のクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒｓ）を含む単一遺伝子（ｕｎｉｇｅｎｅ）の、公的データベースをダウンロードした（そのアルゴリズムが、単一、あるいはクラスター化された（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ）断片の任意の組み合わせ体により処理することになるが）。各群（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ）に対しポリＡシグナル及びポリＡ配列を含む全ての断片を、上流のＨａｅＩＩ部位を求めて走査した。ＨａｅＩＩ部位が見出されない場合、ＨａｅＩＩ部位が見出されるまで同じ群（ｃｌｕｓｔｅｒ）からの配列を用いて、その断片を５’の方向に伸長した。次にそのフレームを、ＨａｅＩＩ部位に隣接する塩基対とポリＡ配列から決定し、そしてＨａｅＩＩ消化の長さを計算した。フレーム及び長さを、検索を迅速にするためにデータベースの指標として使用した。
【００９１】
ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍからの出力がデータベースに対して行われ、従って本研究のＲＮＡにおいて発現される全て周知な遺伝子及びＥＳＴｓの発現レベルを同定することができる。実質的に発現される全ての遺伝子の細胞又は組織における同定、及びこれらの発現レベルの定量化が、単一の２本鎖ｃＤＮＡ反応により且つ９６キャピラリー配列決定装置における３時間の作動により行われた。
【００９２】
実施例２
サブセット（フレーム）を生成するために酵素ＩＩＳ型により、その後標準プライマーを伴うＰＣＲにより形成される付着末端に複合アダプターの結合
別の組みの実施例において、その方法が簡単になり、多くの解決法実現した。例１記載のように固体支持体上にＣＤＮＡを合成したが、こと時に磁気ＤｙｎａＢｅａｄｓ（材料及び方法において記載されているように）を使用した。次にｃＤＮＡを、４又は５のヌクレオチドの認識配列を伴うＩＩＳ型エンドヌクレアーゼにより切断した。
【００９３】
ＩＩＳ型制限酵素エンドヌクレアーゼが、これらの認識配列から正確な距離にて（ＩＩＳ型制限酵素エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの試料において認識配列から９及び１３ヌクレオチドにて） ２本鎖ＤＮＡを切断する。ＩＩＳ型制限酵素エンドヌクレアーゼの別の例としては、ＢｂｖＩ，ＳｆａＮＩ，及びＡｌｗ２６Ｉ及びＳｚｙｂａｋｓｋｉら、（１９９１）Ｇｅｎｅ、１００、１３−２６記載のその他のものを含んでいる。次にｃＤＮＡの３’部分を、上記のように固体支持体を用いて精製した。次にｃＤＮＡを、２５６の画分に分割し、そして違ったアダプターを各画分の断片に結合した。
【００９４】
例えばＦｏｋＩの切断では、各突き出しが、遺伝子に特異的であるが塩基の任意の組み合わせ成る５’に突き出した４ヌクレオチドを形成する。これら４つの位置に組み合わされる可能性のある単一ヌクレオチドを搬送する１つのアダプターが、それぞれの画分において、すなわち総数２５６のアダプター及び画分に用いられる。
【００９５】
集団的な断片における相補的ヌクレオチド配列に組み合わされる所定のヌクレオチドを有するアダプターを極めて特異的に結合させることが、デオキシオリゴヌクレオチドを用いて、１本鎖上にアダプターを化学的に停止させることによって実現される。結果として、結合には、他の鎖にしか形成されないことになる。
【００９６】
結合の特異性を、４塩基対突き出しを有する、単一の鋳型を用いて試験した。この突き出し部に実際的に相補的であるか、又は１、２、又は３に照合エラーを有するか、いずれかであるアダプターが、設計された。アダプターを鋳型に結合させ、ＰＣＲを行い、そして各アダプター配列から得られた産生物の相対量を評価した。
【００９７】
上側鎖の３’末端に、（そしてまた、ＰＣＲ工程において干渉を防止するために下側鎖の３’末端においても）、デオキシヌクレオチドを含むことによって停止されるアダプターに対し、高い特異性が実現することが見出された。その結果を図３に示す。配列ＧＣＣＧが、鋳型オリゴヌクレオチドの配列に対して実際に相補的である。この配列より形成する産生物の量が、１又は複数の組み合わせエラーを伴う配列より形成る産生物の量より約２５０倍多いことを見出すことができる。一方結合反応が、高い特異性により進んでいることを見出すことができる。
【００９８】
改良の程度が、上記アダプターによるより少なくなることを見出したが，リン酸基が、チッソ基により置換されるオリゴブクレオチドを下側鎖の５’末端に導入することによって化学的にブロックされるアダプターが、結合の特異性を改良するためにさらに見出された。
【００９９】
加えて、高い反応効率を与える結合条件が、用いられた（材料及び方法において記載されているように）。
【０１００】
固体支持体を再度利用するために、次に過剰な非結合アダプターを除去するため、ｃＤＮＡを精製した。アダプター配列の一定部分に相補的なものと、ポリＡ尾部に相補的なものの標準的プライマーを用いて２５６の画分にて、ＰＣＲが行われた。
【０１０１】
３’プライマーがオリゴｄＴであり、従って元のｍＲＮＡのポリアデニール配列に相補的である。各プライマーを、未知の配列に伸長する塩基、グアニン、アデノシン又はシトシンにより設計した。（第２又はさらなる塩基を含むことができ、グアニン、アデノシン、チミン又はシトシンのいずれかである）。各ウエルが、３種の可能性のある３’プライマーの混合物を受けた。これは、３’プライマーが、画定された、再生成可能な断片長を与えるために、ポリＡ尾部の開始部にポリメラーゼを常に向けることを、確実にする。
【０１０２】
この第２の方法による利点は、複数のフレームに分けることが、結合段階において生じ、ＰＣＲにおいて発生しなく、ＰＣＲにおいて高いストレンジェンシーな標準プライマーを使用することができる。このことが、特異性及び再生成能の改良を誘導する。別の利点は、突き出している任意な４種の塩基と適合可能な２５６のうちのある組みのアダプターが、異なる配列を認識するが、さらに４種の塩基の突き出しを与える酵素ＩＩＳ型により、複数の実験において再使用することができるということである。従って突き出しの各長さに対して、単一組みのアダプターが十分となる。
【０１０３】
得られるＰＣＲ産生物を精製し、ＡＢＩプリズム・キャピラリーシーケンサー（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）上に置いた。従って発現された遺伝子を表しているＰＣＲ断片を、サイズに従って分離し、そして各断片の蛍光度を、検出器及びＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ．により適用されるソフトウエアを用いて定量化した。
【０１０４】
ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍが４つの検出チャンネルを有していることから、４種の分かれたフレームを、異なる蛍光発色素を用いて各反応容器において行うことができる。４種の異なる標準の順方向プライマー（５’末端）が、その間を交差ハイブリダイセーションのない状態にて設計された。これらのプライマーの使用により、２５６通りの反応が、６４通りの反応に低減することができた。別の選択肢の例において、３種のプライマー及び３種のアダプターが用いられ、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍにおいて１チャンネル対し、サイズを参照するために用いることができる。従って反応の総数が８６である。
【０１０５】
オリゴ−ｄＴプライマーのアニーリング温度を増大させることが、さらに好ましいことである。これは、あいまいな配列を伴う尾部を付加（任意の順方向プライマーによる交差ハイブリダイセーションのない）し、そしてあいまいな配列と同一性のある短いプライマーとオリゴ−ｄＴを含む長いプライマーとを混合させ、そして高い融点を有することによって可能となった。次に最初わずかなサイクルを低温にて行い、その時オリゴｄＴプライマーだけをアニールし、その後全ての断片に尾部を付加するようにした。これは、次に存在している有意的に長い尾部により、有意的に高い温度（その時、短いプライマーのみアニール）にて後のサイクルを行うことを可能にした。この方法が、ＰＣＲの特異性を増大させ、背景を減少させた。
【０１０６】
用いられるプライマーの組み合わせが、各蛍光チャンネル及び試料（所定の試料中発現される２０％の遺伝子、そして総数１００，０００の転写に基づき）において〜８０ＰＣＲ産生物の理論的手段を導びいている。ＦｏｋＩ制限酵素による消化後に、周知の遺伝子から生成されるポリアデニールを含めて３’断片における統計的サイズ分布を分析することにより、想定された６７％が、断片だけのフレーム及び長さに基づいて固有に同定できるということを提供している。同じ手順を用いるが別の５塩基を切断する制限酵素ＩＩＳ型とＦｏｋＩ酵素を置き換える、付加的に並行実験を用いて、理論値の限度に〜８９％まで増大し、第３の実験において、ゲノムにおける全転写の〜９９％の収率である。
【０１０７】
これらの数が想定より少ない、それは本発明の組み合わせアルゴリズムを使用すると、２つの実験において実際に重複として処理する遺伝子が、その重複する相手（ｐａｒｔｎｅｒｓ）の少なくとも１つのが，発現されない （９６％の機会（ｃｈａｎｃｅ））場合、固有であるとしてさらに同定することができることからである。この効果及び同様の効果が、上記計算と関連性がなかった。
【０１０８】
この分析における各断片に、すなわち９ヌクレオチド（ＦｏｋＩ認識配列及び切断部位を含め）、及びキャピラリー・シケンサーから得られるポリアデニールからＦｏｋＩ制限酵素部位までのサイズ対して固有の情報を組み合わせると、各ｍＲＮＡの同定（ＥＳＴ、遺伝子又はｍＲＮＡの同定）を、確立することができる。周知な遺伝子及び固有のＥＳＴクラスターの全てに関する検索可能なデータベースが、上記のように構成される。
【０１０９】
断片の同定
試料に対する複数の独立したパターン（ｐａｔｔｅｒｎ）に基づく、本発明による組み合わせアルゴリズムが、遺伝子を同定化するために多くの利点を提供する。
【０１１０】
第１に、実験が有為的に多く行われれば、それだけ所定の遺伝子がそれらの少なくとも１つに単一の断片として働き、従ってあいまい性のない同定をすることのできるようになってくる。たとえ所定の遺伝子が全ての実験において重複体として働いたとしても、その実験の１つにおいて、その重複体の相手（ｐａｒｔｎｅｒｓ）の１つが、別の実験の単量体として作用しなければならず、そこに存在しない場合でも、さらに同定することができる。
【０１１１】
たとえば、実験Ｉにおいて遺伝子Ａ及びＢに相当する１６２ｂｐの断片があり、そして実験ＩＩにおいて、遺伝子Ａ及びＣに相当する３６７ｂｐの断片があり、次にそれを、実験Ｉにて遺伝子Ｃを検索することができる（そこを単量体として、つまり２１４ｂｐにて処理するが、そこに存在しない、すなわち２１４ｂｐにピークがない場合、実験Ｉにおける１６２におけるピークが、遺伝子Ａとして同定することができる）、そして実験ＩＩにおいて遺伝子Ｂを検索することができる。この簡単な方法では、わずか２つの実験が行われた場合でさえ、明確に同定することのできる遺伝子数が著しく増大する。
【０１１２】
ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ｃａｐｉｌｌａｒｙ 電気泳動装置から推定される誤差率を用いるコンピュータシュミレーションにより、全ての遺伝子の８５−９９％が、通常における断片長の誤差が存在する場合でも、正しく同定することができる。
【０１１３】
第２として、これら両方の組み合わせアルゴリズムが、断片サイズ又は遺伝子３’末端の長の不明確性を克服するために用いることができる。これは、試料から得られる断片ピークの数、及び明らかに発現されないものとして除去される遺伝子の数が、候補遺伝子（すなわち生体の遺伝子数）の総数より多い限り、これは、上記アルゴリズムが、各断片に対する遺伝子を割り当てる際にうまくいくという理由である。このアルゴリズムが数学的な系のために、式の数が、候補遺伝子の数より多い場合、この系を解くことができる。
【０１１４】
従って、候補遺伝子の数が、各断片に対して正しい候補をうまく選択する能力を失うことなくある地点まで増大させることができる。断片の長さが未知の場合、断片の可能性のある長さをそれぞれ有する断片に一致すると、存在できる遺伝子の一覧に加えることが可能である。同様に、データベースにおいて３’末端の位置が未知の場合、断片によって示される位置に３’末端を有することのできる全ての遺伝子を、存在可能な遺伝子の一覧に加えることができる。偽の陽性（ｆａｌｓｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）物が、上記条件を満たさない場合、アルゴリズムによって後で自動的に除去される。
【０１１５】
偽の陽性（ｆａｌｓｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）体を除去するためのこの系の能力が、独立したプロファイルを有意的に多くの数を実現することにより増大させることができ、それは、明らかに存在しないものとして除去できる断片数と遺伝子数を共に増大することになるからである。
【０１１６】
サブデビジョンの最適な数を決定することができる。
【０１１７】
反応をサブデバイドする目的は、複数の遺伝子に対応する断片のピーク数を減少させることである。
【０１１８】
２つの要因が、重複体（ｄｏｕｂｌｅｔｓ）の数を決定する、すなわちサブ反応数と断片のサイズ分布である。
【０１１９】
最適なサイズ分布は、検出方法に依存する。キャピラリー電気泳動が、５００ｂｐまでの単一塩基対の解像能と、その後約０．１５％の解像能を有している。従って、あまりに広く分布範囲を広げることが、全く有益でない。狭い分布状態も同様に問題点を存在することなり、その理由は、次に遺伝子が、真の重複体（ｄｏｕｂｌｅｔｓ）として作用し始め（実際同じ長さにより）、どのような解像度であったとしても、解決することのできなくなる。
【０１２０】
確率１／５１２にて切断する酵素により切断する場合、長さｎの断片を見出す確率は、
Ｐ_１（ｎ） ＝ （５１１／５１２）^ｎ（１／５１２）
であり、
その反応が、１９２のサブ反応に分割される場合，所定のサブ反応において長さｎの断片を見出す確率は、
Ｐ_２（ｎ） ＝ （５１１／５１２）^ｎ（１／５１２）（１／１９２）
であり、
Ｍの可能性のある遺伝子から単一遺伝子に相当するこの断片の確率は、
Ｐ_{ｕｎｉｑｕｅ}（ｎ） ＝ Ｐ_２（ｎ）（１−Ｐ_２（ｎ））^{（Ｍ−１）}
であり、
換言すると、これは、１つの遺伝子がその長さの断片を与えるが、その他全ての遺伝子が与えないとする確率である。
【０１２１】
単一の実験において固有に同定することのできる遺伝子の総数が、検出可能な長さ全てにわたる総合計により得ることができる。
【０１２２】
装置による不正確性を考慮に入れると、Ｐ_{ｕｎｉｑｕｅ}が、
Ｐ_{ｕｎｉｑｕｅ}（ｎ） ＝ Ｐ_２（ｎ） （（１−Ｐ_２（ｎ））^{（Ｍ−１）}）^{（１＋２Ｅｎ）}
となり、Ｅか不正確性の大きさである。これは、他の遺伝子が、同じ長さ ＋／− 因子Ｅを有していない場合、固有の遺伝子を同定することができることを、述べている。
【０１２３】
たとえば、ヒトに５０，０００の遺伝子があると、本装置が０．２％の誤差を有し、１０００ｂｐまでの断片を検出することができ、そして全ての配列を１／５１２に切断する酵素を用いて切断し、１９２のサブ反応によりサブ分割し、さらに単一の実験において全遺伝子の５６％、２回では８０％、そして３回では９６％を固有に同定することができる。
【０１２４】
数学的に、固有に同定できる遺伝子の数を、以下のように計算することができる、
Ｐｒｏｂ［ｎ＿］ ＝ （５１１／５１２）＾ｎ＊１／５１２＊１／１９２
Ｓｕｍ［５０，０００＊Ｐｒｏｂ［ｎ］（（１−Ｐｒｏｂ［ｎ］＾１＋０．００２ｎ），｛ｎ，１，１０００｝）＊１９２
であり、
パラメータを変えることによって、同定化の確率に及ぼす影響を迅速に見出だすことができる。
【０１２５】
上記のように、より多くの実験が行われる場合、より強力な組み換え同定方法が使用できるが、これら全ては、単一遺伝子数が増大することからの利益である。
【０１２６】
考察
大部分のマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘを除く）が、ガラス又は膜表面上にスポットされたｃＤＮＡにハイブリダイゼーションすることに基づいている。これには、本発明における実施例を用いて、わずか１日以内にて行うことのできる比較可能な分析に対して、ゲノム中の各遺伝子のｃＤＮＡをクローニング、増幅及びスポッテングする必要がある。
【０１２７】
全てのマイクロアレイでは、ｃＤＮＡのクローニング及び配列決定又は発現された配列タグなど各遺伝子の予備知識が必要である。本発明の例では、これらの存在に関する予備的な情報によらなく、ゲノム中に発現される全ての遺伝子の同定及び定量化を可能にする。
【０１２８】
哺乳動物における最大数の遺伝子の発現を現段階にて定量化できるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイが、ほぼ３２，０００の遺伝子をカバーする。本発明の例では、ゲノム中の全ての遺伝子に適用することができる。
【０１２９】
マイクロアレイを基盤とするあらゆる技術が、種に対して限定され、そのアレイが、関心のある種から形成され、関心のある種に対する配列情報の利用性に依存している。本発明の例は、ｃＤＮＡ又はＤＮＡの任意の予備的情報を必要とすることなく、植物から哺乳動物まであらゆる種に適用することができる。
【０１３０】
マイクロアレイは、スプライス変異体間を区別できないことがしばしばあり、そしてレア対立遺伝子を必ずしも検出できないことができない。本発明の例において、試料中に存在する実際の転写物を検出することができる。
【０１３１】
マイクロアレイを基盤とするあらゆる技術が、ＤＮＡハイブリダイセーション後の定量の間接的な測定を基盤としている。本発明を用いて実際のコピー数を、定量することができる。
【０１３２】
ハイブリダイセーションを基盤とする技術は、ハイブリダイセーションの反応速度として極めて予測が難しく、非線形な性質により、本発明の例においては、指数的な、再生成可能な競合的ポリメラーゼ連鎖反応を用いる。
【０１３３】
本発明の実施例が、ある種の競合ＰＣＲに基づいており、すなわち反応における全ての断片が、同じプライマー対（又は少数の極めて類似するプライマー対）によって増幅され、誤差が最少とされる。本発明では、当業者が広い動的な範囲（約２．５のオーダの規模）を交差する遺伝子発現において約２倍の違いを再現可能に検出することができ、すなわち他の技術と極めて競合的である。
【０１３４】
本発明の例がＰＣＲを基盤としていることから、開始材料のため、感受性を交換することができる。換言すると、有意的に少量のＲＮＡにより開始することができるため、わずかでも余分なＰＣＲサイクルを実行することができる。ＰＣＲが指数的であることから、余分なサイクルが、要件となる材料を約半分に切断し、一方にて実験的な変動に対して２−３％しか付加されない。従って有益なデータが、わずかな、あるいは単一の細胞ほどの少数から産生することができるが、その精度が、有意的に大きい試料を用いるほど増大することができる。
【０１３５】
遺伝子における実質的割合（ｐｅｒｃｅｎｔ）の遺伝子発現を定量化できるマイクロアレイ技術が、極めて費用がかかる。要求される３２，０００の固有のＥＳＴｓをカバーするＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイは、４０００ＵＳＤ／実験のコストがかかる。
【０１３６】
本発明の観点及び実施例が、以下の実験の引例として示すことにする。さらに本発明の観点及び実施例が、当業者に明らかになるであろう。
【０１３７】
材料及び方法
第１節−制限酵素ＩＩ型の使用
全 ＲＮＡ から ｍＲＮＡ を単離する
Ｏｌｉｇｏｔｅｘ手順により全ＲＮＡを２０μｇから単離して、その後その精製ｍＲＮＡをビーズに結合させ、洗浄により清浄にした。回転を低くして（ｓｐｉｎ　ｄｏｗｎ）、２０μｌの蒸留水にて再懸濁した。懸濁には、０．５ｍｇのＯｌｉｇｏｔｅｘを含むべきである。反応物を２ｘ１０μｌに分ける。７０℃で１０分間熱変性して、氷上にて急冷する。以下の各手順を用いて第１鎖ｃＤＮＡを合成する。
【０１３８】
ＡＭＶ を用いて第 １ 鎖 ｃＤＮＡ の合成
第１鎖緩衝液の付加：５μｌ ５ｘのＡＭＶ緩衝液、２．５μｌ １０ｍＭのｄＮＴＰ、２．５μｌ ４０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、０．５μｌのＲｎａｓｅ阻害剤、２μｌのＡＭＶ ＲＴ、２．５μｌ ５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ。
【０１３９】
４２℃、６０分にてインキュベート。総用量が２５μｌである。
【０１４０】
［注：有意的に希釈したＯｌｉｇｏｔｅｘ懸濁液を得るために、１００μｌにて行うことが有意的に良い。］
ＡＭＶ を用いて第 ２ 鎖 ｃＤＮＡ の合成
１２．５μｌ １０ｘのＡＭＶ第２鎖緩衝液（５００ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）ｐＨ７．２、９００ｍＭのＫＣｌ、３０ｍＭのＭｇＣｌ_２、３０ｍＭのＤＴＴ、５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）、２９ｕ 大腸菌（Ｅ Ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、１ｕ Ｒｎａｓｅ Ｈ，を付加し、ｄＨ_２０を伴い最終用量１２５μｌにする。
【０１４１】
１４℃、２時間インキュベートする。
【０１４２】
制限酵素による切断及び脱リン酸化
Ｏｌｉｏｔｅｘ／ｃＤＮＡ複合体に回転を下げて、１．８μｌ １０ｘ ＦｏｋＩ緩衝液、１６．２μｌのＨ_２Ｏ、２μｌのＦｏｋＩ、１ｕの胎児ウシ小腸ホスファターゼ（次の段階において自己結合を防止するために、接着端末を脱ホスホリル化のため含まれる）にて再懸濁した。
【０１４３】
３７℃にて、１時間インキュベートする。
【０１４４】
品質を管理するために回転を下げて、上澄液を除去する。
【０１４５】
ホスファターゼの不活性化
７０μｌのＴＥを添加する。７０℃にて、１０分間加熱する。室温まで冷却し、１０分間放置する。
【０１４６】
結合
２μｌ １０ｘの結合緩衝液、１００Ｘのアダプター、２μｌのリガーゼ、Ｈ_２Ｏ、にて２０μｌに合わせ、再懸濁する。
【０１４７】
ＲＴにて、２時間インキュベートする。
【０１４８】
回転を止めて、１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．６）にて洗浄する。
【０１４９】
プライマー及びアダプターの設計
アダプターは、以下のようである（５’から３’の方に示される）。それは、相補的な長鎖、及び短鎖から構成される。長鎖は、ＨａｅＩＩ酵素の切断により生成されるＧＣＧＣ付着端末に相補的な余分の４塩基を有している。
【０１５０】
５’−ＧＴＣＣＴＣＧＡＴＧＴＧＣＧＣ−３’
５’−ＡＣＡＴＣＧＡＧＧＡＣ−３’
５’プライマーが、５’−ＧＴＣＣＴＣＧＡＴＧＴＧＣＧＣＷＮ−３’であり、Ｗが、Ａ又はＴ、及びＮが、Ａ，Ｃ，Ｇ又はＴである。最後の塩基に対応した蛍光色素にて標識化された８種の異なる５’プライマーがある。
【０１５１】
３’プライマーが、Ｔ_２０ＶＮＮであり、ＶがＡ，Ｇ，又はＣで、Ｎが、Ａ，Ｇ，Ｃ又はＴである。つまり、示されるように２５のチミンの後に３個の塩基がある。
【０１５２】
４８の異なる３’プライマーがある。
【０１５３】
３’と５’プライマーの全ての組み合わせが用いられ、すなわち総数において３８４の組み合わせにて用いられる。５’プライマーが、最後の塩基に対してプール（すなわち４種の蛍光色素全てが同一反応にて作用する）され、総数９６通りの反応を与える。
【０１５４】
プライマーを組み合わせ体が、ＰＣＲプレートの９６−ウエルに予め配分される。
【０１５５】
ＰＣＲ の増幅
７６８μｌのＰＣＲ緩衝液（緩衝液、酵素、ｄＮＴＰ）にて再懸濁し、ウエル当り２μｌのプライマーの混合物（４種の５’プライマー及び１つの３’プライマー）を含んでいる予め作成されたプライマー・プレートの各ウエルに８μｌを添加する。
【０１５６】
加熱開始タッチダウン方式のＰＣＲを用いて、以下のように各画分を増幅する。
【０１５７】
加熱開始
７０℃まで加熱
Ｔａｑポリメラーゼを添加
１０サイクル
９４℃にて３０秒
６０℃にて３０秒、各サイクル０．５℃刻みにて減少
７２℃にて１分間
２５サイクル
９４℃にて３０秒
５５℃にて３０秒
７２℃にて１分間
最終
７２℃にて５分間
４℃まで冷却
タッチダウンランプ方式のアニーリング温度（ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ　ｒａｍｐ　ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を、上下に調整しなければならない。安定期（ｐｌａｔｅａｕ　ｐｈａｓｅ）に到達するまでこの反応だけを進行すべきであり、すなわち２５サイクルは、調整しなければならない。
【０１５８】
回転式実時間ＰＣＲ装置が、温度の変動を最少にし、安定期を監視できるために好ましい。こうした装置により、Ｔａｑポリメラーゼが各チューブの頭部に投入され、ロータが開始する前に、加熱の開始が行われ、Ｏｌｉｇｏｔｅｘから第２鎖を溶離させる。ロータが開始すると、ビーズ及び第１鎖がペレット化され、同時にＴａｑを反応混合物中に降下する。
【０１５９】
キャピラリー電気泳動による定量化
長いキャピラリーと長い実行時間による断片の分析のため、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００に負荷される９６ウエルのプレートを設定する。その出力は、断片長（塩基対おいて）及び検出される各ピークに対するピーク高さ／面積の一覧表である。
【０１６０】
例えば上記のように、データベースとして参照して同定化を進めていく。
【０１６１】
第２節−制限酵素ＩＩＳ型を使用
ストレプトアビジン・ダイナビーズ （ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（ ビーズにオリ ゴを結合 ） の調整
２００μｌのＢ ＆ Ｗ緩衝液（ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ））において２００μｌのダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）を２回洗浄し、次いで４００μｌのＢ ＆ Ｗ緩衝液にてビーズを再懸濁する。
【０１６２】
４００μｌのＨ_２Ｏ中にて１２５０ｐｍｏｌのビオチンＴ２５プライマーを懸濁し、そしてビーズと混合する。ＲＴにて１５分間インキュベートする。僅かに回転させた後６００μｌの浮遊物を除去する。ビーズを配分して、少なくとも３０秒間マグネット上に置いた。
【０１６３】
２００μｌのＢ ＆ Ｗにてビーズを２回洗浄し、さらに２００μｌのＢ ＆ Ｗ緩衝液にて再懸濁する。
【０１６４】
総 ＲＮＡ からビーズに ｍＲＮＡ を結合
１．５ｍｌのエッペンドルフ・チューブに２００μｌの再懸濁されたビーズを移す。少なくとも３０秒間マグネットに置く。浮遊物を除去し、１００μｌの結合緩衝液（２０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１．０ＭのＬｉＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ）にて再懸濁する。洗浄を繰り返し、そして１００μｌの結合緩衝液にてビーズを再懸濁する。
【０１６５】
総量が〜７５μｇのＲＮＡ，又は２．５μｇのｍＲＮＡを、Ｒｎａｓｅの無い水１００μｌ、又１０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌにて調整する。６５℃にて２分間加熱。
【０１６６】
予熱したＲＮＡ溶液にて十分にビーズを混合。
【０１６７】
回転によりアニールするか、又はそうでなければ室温（ｒｔ）にて３−５分間混合する。少なくとも３０秒間マグネット上に置く。２００μｌの洗浄緩衝液Ｂ（１０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１５ＭのＬｉＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）にて２回洗浄する。
【０１６８】
第 １ 鎖の合成
前に記載されているマグネットを用いて、２００μｌの１ ｘ ＡＭＶ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｒａ）により、少なくとも２回ビーズを洗浄する。５μｌの５Ｘ ＡＭＶ緩衝液、２．５μｌ １０ｍＭのｄＮＴＰ、２．５μｌ ４０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、０．５μｌのＲＮａｓｅ阻害剤、２μｌのＡＭＶ ＲＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１．２５μｌ １０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、１１．２５μｌのＨ_２Ｏ（Ｒｎａｓｅの無い）（総用量２５μｌ）を合わせて混合する。
【０１６９】
この混合状態にてビーズを再懸濁する。
【０１７０】
４２℃、１時間、混合しながらインキュベートする。
【０１７１】
第 ２ 鎖の合成
１００μｌの第２鎖の混合物（６．２５μｌ １Ｍのトリス（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ７．５、１１．２５μｌ １Ｍ のＫＣｌ、１５μｌのＭｇＣｌ_２、３．７５μｌのＤＴＴ、６．２５μｌのＢＳＡ、１μｌのＲｎａｓｅ Ｈ、３μｌのＤＮＡ ｐｏｌ Ｉ、５３．５μｌのＨ_２Ｏ）（総用量１００μｌ）を第１鎖の反応に直接添加する。
【０１７２】
４２℃、１時間、混合しながらインキュベートする。
【０１７３】
切断
マグネット上のビーズを、ＴＥ（１０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）により２ｘ、および１００−２００μｌのＮＥＢ緩衝液により２ｘにて洗浄する。３０μｌのＮＥＢ緩衝液にて再懸濁する。
【０１７４】
１μｌの適切な酵素ＩＩＳ型を添加し、そして混合する。
【０１７５】
頻繁に混合しながら、３７℃、１−２時間インキュベートする。
【０１７６】
上に記載のマグネットを用いて、１３５０μｌのＴＥにより３回、そして１３５０μｌ ２ｘ 結合緩衝液にて２回洗浄する。
【０１７７】
１６０６μｌ ２ｘ リガーゼ緩衝液において、リガーゼ酵素を伴い再懸濁する。
【０１７８】
アダプターの結合 （２５６ の異なる容器において ）
総用量１０μｌに対して４μｌ中に３０ｐｍｏｌのアダプターを含めて、２５６のウエル中るウエル当たり６μｌの切断鋳型を等分に滴下する。３７℃にて１時間、混合しながらインキュベートする。ＴＥ ８０μｌ ２ｘにて洗浄し、そして２０μｌのＨ_２Ｏにて希釈する。
【０１７９】
アダプター及びプライマーの設計
これらの例におけるアダプターが、以下のようである（５’から３’に示される）。各塩基対は、相補的である短鎖、及び長鎖が組み合わされている。長鎖が、ＦｏｋＩ切断（総数４ｘ４ｘ４ｘ４ ＝ ２５６の可能性のあるアダプター）により生成される付着末端に相補的な４種のヌクレオチドを有する。
【０１８０】
上側の、標識化されたもので、短鎖が、順方向ＰＣＲプライマーとしても働く。
【０１８１】
５’−ＣＣＡＡＡＣＣＣＧＣＴＴＡＴＴＣＴＣＣＧＣＡＧＴＡ−３’
５’−ＮＮＮＮＴＡＣＴＧＣＧＧＡＧＡＡＴＡＡＧＣＧＧＧＴＴＴＧＧ−３’
５’−ＧＴＧＣＴＣＴＧＧＴＧＣＴＡＣＧＣＡＴＴＴＡＣＣＧ−３’
５’−ＮＮＮＮＣＧＧＴＡＡＡＴＧＣＧＴＡＧＣＡＣＣＡＧＡＧＣＡＣ−３’
５’−ＣＣＧＴＧＧＣＡＡＴＴＡＧＴＣＧＴＣＴＡＡＣＧＣＴ−３’
５’−ＮＮＮＮＡＧＣＧＴＴＡＧＡＣＧＡＣＴＡＡＴＴＧＣＣＡＣＧＧ−３’
各アダプターか、１本鎖上にてブロックされる。これは、下記に示すように、デオキシ（ｄｄ）オリゴヌクレオチドを用いて、３’末端の上側鎖をブロックすることにより実現される。
【０１８２】
５’（ＯＨ）−ＣＣＡＡＡＣＣＣＧＣＴＴＡＴＴＣＴＣＣＧＣＡＧＴｄｄＡ−３’
５’（Ｐ）−ＮＮＮＮＴＡＣＴＧＣＧＧＡＧＡＡＴＡＡＧＣＧＧＧＴＴＴＧＧ−（ＯＨ）３’
５’（ＯＨ）−ＧＴＧＣＴＣＴＧＧＴＧＣＴＡＣＧＣＡＴＴＴＡＣＣｄｄＧ−３’
５’（Ｐ）−ＮＮＮＮＣＧＧＴＡＡＡＴＧＣＧＴＡＧＣＡＣＣＡＧＡＧＣＡＣ−（ＯＨ）３’
５’（ＯＨ）−ＣＣＧＴＧＧＣＡＡＴＴＡＧＴＣＧＴＣＴＡＡＣＧＣｄｄＴ−３’
５’（Ｐ）−ＮＮＮＮＡＧＣＧＴＴＡＧＡＣＧＡＣＴＡＡＴＴＧＣＣＡＣＧＧ−（ＯＨ）３’
選択肢として、ブロックキングは、窒素、ヒドロキシ、又は他のブロックキング成分により下側鎖の５’末端部にて燐酸基を置き換えることにより実現することができる。
【０１８３】
逆プライマーは、以下のようである。
【０１８４】
５’−ＣＴＧＧＧＴＡＧＧＴＣＣＧＡＴＴＴＡＧＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶ−３’
５’−ＣＴＧＧＧＴＡＧＧＴＣＣＧＡＴＴＴＡＧＧＣ−３’
この場合、全部で３種の長鎖逆プライマーに対してＶ ＝ Ａ，Ｃ又はＧ、である。
【０１８５】
標準的なＰＣＲ
１８μｌのＰＣＲ緩衝液 （緩衝液、酵素、ｄＮＴＰ、３種の１般的アダプター・プライマー、固定化されたオリゴ−Ｔプライマー） を添加する。
【０１８６】
以下のように各画分を増幅させる。
【０１８７】
加熱開始
加熱
７０℃にてＴａｑを添加。
【０１８８】
（又は熱活性作用Ｔａｑを使用）
９４℃、３０秒、５０℃、３０秒、７２℃、１分にて２サイクル、
９４℃、３０秒、６１℃、３０秒、７２℃、１分にて２５サイクル、
最終的に７２℃、５分間、４℃まで冷却。
【０１８９】
回転式実時間ＰＣＲ装置が、温度の変動を最少にし、安定期を監視できるために好ましい。こうした装置の場合、Ｔａｑポリメラーゼが、各チューブの頭部に投入され、ロータを開始する前に、加熱を開始し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘから第２鎖を溶離させる。ロータが開始すると、ビーズ及び第１鎖がペレット化され、同時にＴａｑが反応混合物中に降下する。
【０１９０】
キャピラリー電気泳動による定量化
長いキャピラリーと長い実行時間による断片の分析のため、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００に負荷される９６ウエルのプレートを設定する。その出力が、断片長（塩基対おいて）及び検出される各ピークに対するピーク高さ／面積の一覧となる。
【０１９１】
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Ｐａａｂｏ（１９９９） Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９，Ｍ１３−６．
Ｐｅｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６，９２１２−７．
Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０，４６７−７０．
Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３，１０６１４−９．
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２１，５−９．
Ｓｔｏｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６，１５１２１−６．
Ｓｚａｌｌａｓｉ（１９９８） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６，１２９２−３．
Ｔｈｏｍｓｏｎ ａｎｄ Ｅｓｐｏｓｉｔｏ（１９９９） Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９，Ｍ１７−２０．
Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．（１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０，４８４−７．
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、制限酵素ＩＩ型（ＨａｅＩＩ）を用いて、試料の特徴的な単一パターンの製造方法の概要を示す。
【図２】
図２は、制限酵素ＩＩＳ型（ＦｏｋＩ）を用いて、試料の特徴的な単一パターンの製造方法の概要を示す。
【図３】
図３は、１本鎖上にてブロックされるアダプターに特異的な結合を評価する実験結果を示している。単一鎖を突き出した４塩基対を有する単一の鋳型オリゴヌクレオチドが用いられ、そしてアダプターが、これに確実に相補的、又は１，２又は３の照合誤差の伴う１本鎖領域を有するように設計された。アダプターを鋳型オリゴヌクレオチドに結合して、その産生物を、ＰＣＲを用いて増幅した。
【図４】
図４は、本発明の組み合わせ式アルゴリズムを用いて、試料中に存在するｍＲＮＡ分子の全プロファイルを生成するための方法の実施例における概要を示す。工程ＩからＶＩＩ が示されている。
工程Ｉにおいて、ｍＲＮＡがオリゴｄＴ尾部を搬送する磁気ビーズ上に捕捉される。
工程ＩＩにおいて、相補的ＤＮＡ鎖が合成され、さらにビーズに結合される。
工程ＩＩＩ において、ｍＲＮＡが除去され、そして第２のｃＤＮＡ鎖が合成される。２本鎖ｃＤＮＡがビーズに共有結合により保持される。
工程ＩＶにおいて、２本鎖ｃＤＮＡが、２つの別々のプールに分けられる。各プールが、異なる制限酵素により消化される。ｍＲＮＡの３’末端に相当するｃＤＮＡの配列が、ビーズに結合された状態を保持している。
工程Ｖにおいて、アダプターを、ｃＤＮＡの消化された末端に結合させる。本発明の本例において、２５６の異なるアダプターが、２５６の別々の反応により結合される。さらに本発明の本例において、アダプターが、ＰＣＲがもう一方の鎖からのみ進行できるように、一方の本鎖上にブロックされる。
工程ＶＩにおいて、各画分が、単一のＰＣＲプライマー対により増幅される。
工程ＶＩＩ において、前記ＰＣＲ産生物が、キャピラリー電気泳動法にかけられる。これは、各制限酵素によって消化され、プールのそれぞれに独自なパターンを形成する。次にこれらのパターンが、本発明の組み合わせアルゴリズムを用いて比較され、試料中に発現される遺伝子を同定することができる。

Claims (29)

1. 試料中に存在するｍＲＮＡ分子のプロファイルを提供する方法において、
   鋳型としてｍＲＮＡを使用し各ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ鎖を合成し、それにより、第１のｃＤＮＡ鎖の集団を提供する工程；
   ｍＲＮＡを除去する工程；
   各第１の鎖に相補的な第２のｃＤＮＡ鎖を合成し、それにより２本鎖ｃＤＮＡ分子の集団を提供する工程；
   制限酵素の消化作用により付着末端を有する各消化された２本鎖ｃＤＮＡ分子の集団を提供するために、制限酵素ＩＩ型又はＩＩＳ型により２本鎖ｃＤＮＡ分子を消化させる工程；
   アダプターオリゴヌクレオチドが付着末端に相補的な末端配列、及びプライマーのアニーリング配列を含んでいる、前記アダプターオリゴヌクレオチドの集団を、消化された各２本鎖ｃＤＮＡ分子の付着末端に結合させ、それにより２本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の各第１の鎖が、３’末端アダプターオリゴヌクレオチドを含み、２本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の各第２の鎖が、３’末端ポリＡ配列を含む、前記第１の鎖、及び第２の鎖を含む各２本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子を提供する工程；
   前記２本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子を精製する工程；
   第１のプライマーの集団及び第２のプライマーの集団を用いてｍＲＮＡの３’末端に相補的な配列を有する前記２本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を行う工程において、
   前記各第１のプライマーが、アダプターオリゴヌクレオチドのプライマーアニーリング配列にアニールする配列を含み；及び
   前記制限酵素が酵素ＩＩ型である場合、各第１のプライマーが、３’末端に少なくとも１つの変異可能なヌクレオチドを、所望により３’末端に２以上の変異可能なヌクレオチドを含んでおり、前記変異可能なヌクレオチドが、Ａ，Ｔ，Ｃ及びＧから選択されるヌクレオチドであるか、又は変異可能なヌクレオチドに相当する位置にて、各第１のプライマーが、Ａ，Ｔ，Ｃ及びＧから選択されるヌクレオチドを有するかによって、第１のプライマー集団が、鋳型ｃＤＮＡ分子の第１鎖に相補的である各第１鎖産生物ＤＮＡ分子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において合成を先導し、その鋳型ｃＤＮＡ分子の第１鎖が、第１のプライマー集団内における第１のプライマーの変異可能なヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドに相補的なヌクレオチド又はヌクレオチド配列を、鋳型ｃＤＮＡ分子の第１鎖内におけるプライマーのアニーリング配列に隣接することを含む；あるいは
   制限酵素が酵素ＩＩＳ型である場合、第１のプライマーが、鋳型ｃＤＮＡ分子の第１鎖に相補的である各第１鎖産生物ＤＮＡ分子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライム合成を先導する工程にて、前記鋳型ｃＤＮＡ分子の第１鎖が、アダプター・オリゴヌクレオチドの集団におけるアダプター・オリゴヌクレオチドの末端配列に相補的なヌクレオチド配列を、鋳型ｃＤＮＡ分子の第１鎖内に含む；
   第２のプライマーが、オリゴＴ配列を含み、そして以下の式（Ｇ／Ｃ／Ａ）（Ｘ）_ｎ、Ｘは任意のヌクレオチド、ｎは、ゼロ、少なくとも１又は２以上、と一致する３’可変部、これにより第２プライマーの集合体が、鋳型ｃＤＮＡ分子の第２鎖内のポリＡに隣接し、第２のプライマー集合体内の第２のプライマー可変部位に相補的ヌクレオチド又はヌクレオチド類を含む鋳型ｃＤＮＡの第２鎖に相補的である各第２鎖産生物ＤＮＡ分子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、合成を先導する工程；これによりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅は、第１鎖生成物ＤＮＡ分子と第２鎖産生物ＤＮＡ分子を含む各２本鎖産生物ＤＮＡ分子の集団を提供し；
   塩基の長さにより２本鎖産生物ＤＮＡ分子を分離する工程；及び
   前記２本鎖産生物ＤＮＡ分子を検出する工程；
   これにより上記試料中に存在するｍＲＮＡ分子集団に対するパターンが、前記２本鎖産生物ＤＮＡ分子長、及びそして（ｉ）制限酵素がＩＩ型使用される第１プライマー変異ヌクレオチド又は複数のヌクレオチド、又は（ｉｉ）制限酵素ＩＩＳ型が使用されるアダプターオリゴヌクレオチド末端配列を組み合わせることにより提供され、
   第２の異なるＩＩ型又はＩＩＳ型制限酵素を用いて、試料としての付加的にパターン生成し、そして周知のｍＲＮＡ’ｓとして決定されるか、又は想定されるシグナルのデータベースと別々の実験により少なくとも２つの異なるＩＩ型又はＩＩＳ型制限酵素を用いて生成されるパターンを比較する工程；
   （ｉ）　各実験における２本鎖産生物ＤＮＡに相当できるデータベース中に全ｍＲＮＡ’ｓの一覧を記載し、各実験に対して存在する可能性のあるｍＲＮＡ分子の一覧を作成する工程、及び
   （ｉｉ）　各実験に対して、２本鎖産生物のＤＮＡ分子に対し明確には相当しないｍＲＮＡ’ｓの一覧を作成し、各実験に対して、明らかに存在しないｍＲＮＡ分子の一覧を作成する工程、次に
   （ｉｉｉ）　各実験に対して、存在する可能性のある前記ｍＲＮＡ分子の一覧から明らかに存在しないｍＲＮＡ分子を取り除く工程、及び
   （ｉｖ）　（ｉｉｉ）において各実験のため作成された一覧をそれぞれ組み合わせることにより、存在する可能性のあるｍＲＮＡ分子と明らかに存在しないｍＲＮＡ分子の一覧を作成する工程、
   これによって試料中に存在する１構成体から成るｍＲＮＡ分子を提供する工程、
   を含んでいる方法。
2. 周知のｍＲＮＡ’ｓとして決定されるか、あるいは想定されるシグナルのデータベースと別々の実験において少なくとも２つの異なるＩＩ型又はＩＩＳ型の制限酵素を用いて生成されるパターンを：
   （ｉ）　各実験における２本鎖産生物のＤＮＡに相当できるデータベースにおいて全ｍＲＮＡ’ｓを一覧にして、それを形成する１組の式Ｆｉ＝ｍ_１＋ｍ_２＋ｍ_３を形成し、この場合Ｆｉが断片からのシグナル強度、その数はｍＲＮＡの同定数であり、２本鎖産生物のＤＮＡに相当できる各ｍＲＮＡが、右手側の１語として表している；
   （ｉｉ）　各実験における２本鎖産生物のＤＮＡに明確に相当しないｍＲＮＡ’ｓを、各実験のために一覧にして、そして各実験において２本鎖産生物のＤＮＡに明確に相当しない、フォームＯ＝ｍ_４の式で、この場合その数はｍＲＮＡの同定数である、各遺伝子として記載すること；
   （ｉｉｉ）　場合式の数が生体の遺伝子の数より多い、数組の式を結び付け連立式の系を形成すること；
   （ｉｖ）　連立方程式の系を解くことにより、各遺伝子の発現レベルの評価を決定し、それにより試料中に存在するｍＲＮＡ分子のプロファイルを提供すること；
   によって比較することを含む請求項１記載の方法。
3. アダプターオリゴヌクレオチドを結合させる前に、３’末端ポリＡ配列を含んでいる鎖を含む消化された２重鎖ｃＤＮＡ分子を精製する工程を含む請求項１又は請求項２のいずれか記載の方法。
4. （ｉ）　前記第１のｃＤＮＡ鎖を合成する前に、支持体に結合されるポリＴオリゴヌクレオチドに、各ｍＲＮＡ分子のポリＡ尾部をアニーリングすることいより、固体支持体上に、試料中のｍＲＮＡを固定化し、ｍＲＮＡを取り除き、そして前記第２のｃＤＮＡを合成し、それにより前記支持体に結合された２本鎖ｃＤＮＡ分子の集団を提供する工程；及び
   （ｉｉ）　２本鎖ｃＤＮＡ分子を消化した後、支持体に結合された消化２本鎖ｃＤＮＡ分子の集団を提供し、消化された２本鎖ｃＤＮＡ分子の各付着端末に前記アダプターオリゴヌクレオチドの集団を結合させる前に、支持体に結合されない物質を洗浄により除去することにより支持体に結合した前記消化された２本鎖ｃＤＮＡ分子を精製する工程；及び
   （ｉｉｉ）　前記２本鎖ｃＤＮＡ鋳型分子を提供するために、消化された２本鎖ｃＤＮＡ分子の各付着端末にアダプターオリゴヌクレオチドの集団を結合させた後、２本鎖ｃＤＮＡ分子に前記ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の増幅を行う前に、支持体に結合されない物質を洗浄により除去することにより、２本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子を精製する工程、　を含む請求項３記載の方法。
5. 前記制限酵素が、１／２５６−１／４０９６ｂｐの切断頻度により２本鎖ＤＮＡを切断する前記請求項のいずれか１項記載の方法。
6. 前記切断頻度が、１／５１２又は１／１０２４ｂｐである請求項５記載による方法。
7. 前記制限酵素が、制限酵素ＩＩ型である前記請求項のいずれか１項記載の方法。
8. 前記制限酵素が、２−４ヌクレオチドの付着末端を提供するために２本鎖ＤＮＡを消化する請求項７記載の方法。
9. 前記制限酵素が、ＨａｅＩＩ、ＡｐｏＩ、ＸｈｏＩＩ、及びＨｓｐ９２１から成る群から選択される請求項８記載の方法。
10. 前記第１のプライマーのそれぞれが、１つの変異可能なヌクレイチドを有する請求項７から９のいずれか１項記載の方法。
11. 前記第１のプライマーのそれぞれが、２つの変異可能なヌクレイチドを有し、そのそれぞれが、Ａ，Ｔ，Ｃ，又はＧで良い請求項７から９のいずれか１項記載の方法。
12. 前記第１のプライマーのそれぞれが、３つの変異可能なヌクレイチドを有し、そのそれぞれが、Ａ，Ｔ，Ｃ，又はＧで良い請求項７から９のいずれか１項記載の方法。
13. 各第１プライマーが、前記変動可能ヌクレオチドが、Ａ，Ｔ，Ｃ，又はＧからであるか、又は第１のプライマーの変異可能なヌクレオチド内の前記相当する位置に存在することを指示する標識により標識化される請求項７から１２のいずれか１項記載の方法。
14. 前記制限酵素が、制限酵素ＩＩＳ型である請求項１から６のいずれか１項記載の方法。
15. 前記制限酵素が、２−４のヌクレオチドの付着末端を提供するために２本鎖ＤＮＡを消化する請求項１４記載の方法。
16. 前記制限酵素が、ＦｏｋＩ、ＢｂｖＩ、ＳｆａＮＩ及びＡｌｗ２６１から成る群から選択される請求項１５記載の方法。
17. アダプターオリゴヌクレオチドの集団におけるアダプターオリゴヌクレオチドが、異なる末端配列を伴う異なるアダプターオリゴヌクレオチドから別々の反応容器における消化された２本鎖ｃＤＮＡ分子の付着末端に結合される請求項１４から１６のいずれか１項記載の方法。
18. 各反応容器が、単一のアダプターオリゴヌクレオチド末端配列を含む請求項１７記載の方法。
19. 各反応容器が、複数のアダプターオリゴヌクレオチド末端配列を含み、反応容器における各アダプターオリゴヌクレオチド配列が、異なる末端配列、及び末端配列からプライマーアニーリング配列、及び同じ反応容器における他のアダプターオリゴヌクレオチド配列のプライマーアニーリング配列を含んでおり、各反応容器におけるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いられている複数の第１プライマーに相当する、請求項１７記載の方法。
20. ｎがゼロ（０）である前記請求項のいずれか１項記載の方法。
21. ｎが１である請求項１から１９のいずれか１項記載の方法。
22. ｎが２である請求項１から１９のいずれか１項記載の方法。
23. 第１のプライマーが標識化される前記請求項のいずれか１項記載の方法。
24. 標識剤が、シーケンシング装置により読み込むことのできる蛍光染料である請求項２３記載の方法。
25. ２本鎖ＤＮＡ分子が、配列決定ゲル又はキャピラリー電気泳動にて塩基の長さにより分離され、そのパターンが電気泳動図として形成される請求項１から２４のいずれか１項記載の方法。
26. 第１の試料中に存在するｍＲＮＡ分子の第１のプロファイルが、第２の試料中に存在するｍＲＮＡ分子の第２のプロファイルと比較される前記請求項のいずれか１項記載の方法。
27. これらの発現から前記第１のプロファイルと第２のプロファイルとの間の違いが、同定される請求項２６記載の方法。
28. 発現が、前記第１のプロファイルと第２のプロファイルとの間の違いを誘導する核酸を、同定し、及び／又は獲得する請求項２７記載の方法。
29. 試料中における周知ｍＲＮＡの存在が同定される前記請求項のいずれか１項記載の方法。

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