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JP2004501340A - オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子とその使用方法 - Google Patents

オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子とその使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は核酸の検出方法を提供する。該方法は、核酸を、オリゴヌクレオチドを付着した１または複数種類の粒子と接触させることから成る。該方法の１実施形態では、オリゴヌクレオチドがナノ粒子に取り付けられ、核酸の配列の一部と相補的な配列を有する。ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが核酸に対してハイブリダイズした結果として、検出可能な変化（好ましくは色の変化）が生じる。本発明は粒子を含む組成物およびキットも提供する。本発明はさらに、独自のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体の合成方法、該方法によって得られた共役体、該共役体の使用方法も提供する。その上、本発明はナノ粒子を含むナノ材料およびナノ構造とナノ粒子を使用したナノファブリケーションの方法を提供する。最後に、本発明は選択核酸を他の核酸から分離する方法を提供する。

Description

【０００１】
本発明は米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）助成番号ＧＭ１０２６５および陸軍研究所（ＡＲＯ）助成番号ＤＡＡＧ５５−０９６７−１−０１３３の下で政府支援によって完成されたものである。政府は本発明に関し一定の権利を有する。
【０００２】
本願は、係属中のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１２７８３号（１９９７年７月２１日出願）の一部継続出願であった、係属中の出願番号第０９／２４０，７５５号（１９９９年１月２９日出願）の一部継続出願であった、係属出願番号第０９／３４４，６６７号（１９９９年６月２５日出願）の一部継続出願である。上記の文献は引用により本願に組み込まれる。仮出願番号第６０／０３１，８０９号（１９９６年７月２９日出願）、第６０／２００，１６１号（２０００年４月２６日出願）、第６０／１７６，４０９号（２０００年１月１３日出願）の利益も主張する。上記文献の開示は引用により本願に組み込まれる。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、天然または合成の、かつ修飾または非修飾の、核酸を検出する方法に関する。また、本発明は、核酸を検出するための材料およびそれらの材料を調製する方法にも関する。本発明はさらに、ナノファブリケーション法に関する。最後に、本発明は、選択核酸を他の核酸から分離する方法に関する。
【０００４】
（発明の背景）
核酸を検出し、スクリーニングする方法の開発は、遺伝的、細菌性およびウイルス性疾患の診断に重要である。Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，Ｅ．Ｓ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ，第９巻，１４５−１５６ページ（１９９５年）参照。現在、特定の核酸配列の検出に使用されている方法には様々なものがある。同上。しかし、これらの方法は、複雑で、時間がかかり、かつ／または特殊化された高価な装置を必要とする。そのような装置を必要としない簡単で高速の核酸検出法が望ましいことは明らかである。
【０００５】
金属および半導体コロイドをナノ材料へと集合させるために様々な方法が開発されている。これらの方法は、対向する両端に対象コロイドに対して化学的親和性を持つ官能価を有する共有結合リンカー分子を使用することに焦点を合わせている。これまでに最も成功した方法の１つ、Ｂｒｕｓｔら，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，第７巻，７９５−７９７ページ（１９９５年）は、金コロイドと、十分に確立されたチオール吸着化学の使用を伴っている。Ｂａｉｎ　＆　Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，第２８巻，５０６−５１２ページ（１９８９年）およびＤｕｂｏｉｓ　＆　Ｎｕｚｚｏ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，第４３巻，４３７−４６４ページ（１９９２年）。この方法では、粒子リンカー分子として線状アルカンジチオールを用いる。リンカー分子の各末端のチオール基は、コロイド粒子に共有結合して凝集体構造を形成する。この方法の難点は、プロセスが制御しにくく、集合体が不可逆的に形成されることである。これらの構造の材料特性を十分に利用しようとするならば、集合プロセスを系統的に制御する方法が必要である。
【０００６】
医用生体材料の調製およびナノファブリケーション法におけるＤＮＡ利用の可能性が認識されている。この研究では、研究者らは、十分に決定された幾何学的形状およびサイズを有する印象的な構造を設計するために、オリゴヌクレオチドの配列特異的分子認識特性を用いることに焦点を当てている。Ｓｈｅｋｈｔｍａｎら，Ｎｅｗ　Ｊ．Ｃｈｅｍ．，第１７巻，７５７−７６３ページ（１９９３年）；Ｓｈａｗ　＆　Ｗａｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２６０巻，５３３−５３６ページ（１９９３年）；Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１１巻，６４０２−６４０７ページ（１９８９年）；Ｃｈｅｎ　＆　Ｓｅｅｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ，第３５０巻，６３１−６３３ページ（１９９１年）；Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｆｅｉｇｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，第３５６巻，１６４−１６８ページ（１９９２年）；Ｗａｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第３２巻，１８９９−１９０４ページ（１９９３年）；Ｃｈｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第３３巻，１３５４０−１３５４６ページ（１９９４年）；Ｍａｒｓｈら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，第２３巻，６９６−７００ページ（１９９５年）；Ｍｉｒｋｉｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖｉｅｗ　Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，第２３巻，５４１−５７６ページ（１９９４年）；Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２６３巻，１０９５−１０９８ページ（１９８８年）；Ｗａｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第３０巻，５６６７−５６７４ページ（１９９１年）。しかし、ＤＮＡ構造生成理論を実験的に確認するのはまだまだ先のことである。Ｓｅｅｍａｎら，Ｎｅｗ　Ｊ．Ｃｈｅｍ．，第１７巻，７３９−７５５ページ（１９９３年）。
【０００７】
（発明の要約）
本発明は、核酸を検出する方法を提供する。１実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチドを付着させたある種類のナノ粒子（ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体）を核酸と接触させるステップを含む。核酸は少なくとも２つの部分を有し、各ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、該核酸の少なくとも２つの部分の配列に相補的な配列を有している。接触は、核酸とナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる。ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸のハイブリダイズによって、検出可能な変化が生じる。
【０００８】
別の実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を核酸と接触させるステップを含む。第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有する。第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有する。接触は、核酸とナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で起こり、このハイブリダイゼーションによって生じた検出可能な変化を観察する。
【０００９】
さらなる実施形態では、方法は、第１種類のナノ粒子を付着させた基板を提供するステップを含む。第１種類のナノ粒子にはオリゴヌクレオチドが付着しており、該オリゴヌクレオチドは核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有する。基板を、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸を有効にハイブリダイズさせる条件下で核酸と接触させる。その後、オリゴヌクレオチドが付着した第２種類のナノ粒子を提供する。該オリゴヌクレオチドは核酸の配列の１または複数の他の部分に相補的な配列を有する。基板に結び付けられた核酸を、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で、第２種類のナノ粒子オリゴヌクレオチドと接触させる。検出可能な変化はこの時点で観察可能となる。方法は、少なくとも２つの部分を有する選択配列を有する結合オリゴヌクレオチドを提供するステップをさらに含む。該２つの部分の、第１部分は、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的である。結合オリゴヌクレオチドを、結合オリゴヌクレオチドをナノ粒子上のオリゴヌクレオチドに有効にハイブリダイズさせる条件下で、基板に結び付けられた第２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と接触させる。その後、結合オリゴヌクレオチドの第２部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させた第３種類のナノ粒子を、結合オリゴヌクレオチドをナノ粒子上のオリゴヌクレオチドに有効にハイブリダイズさせる条件下で、基板に結び付けられた結合オリゴヌクレオチドと接触させる。最後に、そのようなハイブリダイゼーションによって生じた検出可能な変化を観察する。
【００１０】
さらに別の実施形態では、方法は、核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させた基板と核酸を接触させるステップを含む。接触は、基板上のオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる。その後、基板に結び付けられた核酸を、核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させた第１種類のナノ粒子と接触させる。接触は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる。次に、基板に結び付けられた第１種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を、オリゴヌクレオチドを付着させた第２種類のナノ粒子と接触させる。第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも１つの部分に相補的な配列を有する。接触は、第１および第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる。最後に、そのようなハイブリダイゼーションによって生じた検出可能な変化を観察する。
【００１１】
別の実施形態では、方法は、核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させた基板と核酸を接触させるステップを含む。接触は、基板上のオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる。その後、基板に結び付けられた核酸を、核酸の配列の一部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させたリポソームと接触させる。接触は、リポソーム上のオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる。次に、基板に結び付けられたリポソーム−オリゴヌクレオチド共役体を、少なくとも第１種類のオリゴヌクレオチドを付着させた第１種類のナノ粒子と接触させる。第１種類のオリゴヌクレオチドの、ナノ粒子に付着していない端部には、疎水基が付いている。接触は、疎水的相互作用の結果としてナノ粒子上のオリゴヌクレオチドがリポソームに有効に付着する条件下で起こる。検出可能な変化はこの時点で観察可能となる。方法は、リポソームに結び付けられた第１種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を、オリゴヌクレオチドを付着させた第２種類のナノ粒子と接触させるステップをさらに含み得る。第１種類のナノ粒子には、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも１つの部分に相補的な配列を有する第２種類のオリゴヌクレオチドが付着する。第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、第１種類のナノ粒子上の第２種類のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有する。接触は、第１および第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる。その後、検出可能な変化を観察する。
【００１２】
別の実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチドを付着させた基板と、検出する核酸を接触させるステップを含む。オリゴヌクレオチドは、該核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有する。接触は、基板上のオリゴヌクレオチドを該核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる。次に、基板に結び付けられた核酸を、該核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させたある種類のナノ粒子と接触させる。接触は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる。その後、基板を銀染料と接触させて検出可能な変化を生成し、その検出可能な変化を観察する。
【００１３】
さらに別の実施形態では、方法は、第１種類のナノ粒子を付着させた基板を提供するステップを含む。ナノ粒子には、検出する核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。その後、核酸を、該核酸とナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で、基板に付けられたナノ粒子と接触させる。次に、オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を含む凝集体プローブを提供する。凝集体プローブのナノ粒子は、該ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。凝集体プローブの前記少なくとも２種類のナノ粒子のうちの少なくとも１種類には、核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。最後に、基板に結び付けられた核酸を、該核酸と凝集体プローブ上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で、凝集体プローブと接触させ、検出可能な変化を観察する。
【００１４】
さらなる実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチドを付着させた基板を提供するステップを含む。オリゴヌクレオチドは、検出する核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有する。オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を含む凝集体プローブを提供する。凝集体プローブのナノ粒子は、該ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。凝集体プローブの前記少なくとも２種類ナノ粒子のうちの少なくとも１種類には、前記核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有するそれにオリゴヌクレオチドが付着している。核酸、基板および凝集体プローブを、凝集体プローブ上のオリゴヌクレオチドおよび基板上のオリゴヌクレオチドと核酸とを有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させ、検出可能な変化を観察する。
【００１５】
さらなる実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチドを付着させた基板を提供するステップを含む。オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を含む凝集体プローブを提供する。凝集体プローブのナノ粒子は、該ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。凝集体プローブの前記少なくとも２種類ナノ粒子の少なくとも１種類には、検出する核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドを付着させたある種類のナノ粒子を提供する。第１種類のオリゴヌクレオチドは前記核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有し、第２種類のオリゴヌクレオチドは、基板に付着したオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有する。核酸、凝集体プローブ、ナノ粒子および基板を、凝集体プローブ上およびナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸を有効にハイブリダイズさせ、かつナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを基板上のオリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させ、検出可能な変化を観察する。
【００１６】
別の実施形態では、方法は、検出する核酸を、オリゴヌクレオチドを付着させた基板と接触させるステップを含む。オリゴヌクレオチドは、前記核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有する。接触は、基板上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる。基板に結び付けられた核酸を、前記核酸の配列の一部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させたリポソームと接触させる。接触は、リポソーム上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる。オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を含む凝集体プローブを提供する。凝集体プローブのナノ粒子は、該ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。凝集体プローブの前記少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類には、ナノ粒子に付着しない端部に疎水基が付いたオリゴヌクレオチドが付着する。基板に結び付けられたリポソームを、疎水的相互作用の結果として凝集体プローブ上のオリゴヌクレオチドがリポソームに付着するのに有効な条件下で、凝集体プローブと接触させ、検出可能な変化を観察する。
【００１７】
さらに別の実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチドを付着させた基板を提供するステップを含む。該オリゴヌクレオチドは、検出する核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有する。少なくとも２種類のナノ粒子を含むコアプローブを提供する。各種類のナノ粒子には、他の種類のナノ粒子の少なくとも１つの上のオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドが付着している。凝集体プローブのナノ粒子は、該ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。次に、２種類のオリゴヌクレオチドを付着したある種類のナノ粒子を提供する。第１種類のオリゴヌクレオチドは、該核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有する。第２種類のオリゴヌクレオチドは、コアプローブの前記少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類に付着したオリゴヌクレオチドの配列の一部分に相補的な配列を有する。核酸、ナノ粒子、基板およびコアプローブを、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとおよび基板上のオリゴヌクレオチドと該核酸を有効にハイブリダイズさせ、かつコアプローブ上のオリゴヌクレオチドをナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させ、検出可能な変化を観察する。
【００１８】
方法の別の実施形態は、検出する核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させた基板を提供するステップを含む。少なくとも２種類のナノ粒子を含むコアプローブを提供する。各種類のナノ粒子には、少なくとも１つの他の種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドが付着している。凝集体プローブのナノ粒子は、該ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。前記核酸の配列の第２部分に相補的な配列と、コアプローブの前記少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類に付着したオリゴヌクレオチドの配列の一部分に相補的な配列とを含む、ある種類の連結オリゴヌクレオチドを提供する。核酸、連結オリゴヌクレオチド、基板およびコアプローブを、連結オリゴヌクレオチドおよび基板上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせ、かつコアプローブ上のオリゴヌクレオチドを連結オリゴヌクレオチド上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させ、検出可能な変化を観察する。
【００１９】
さらに別の実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子を提供するステップと、１または複数の種類の結合オリゴヌクレオチドを提供するステップを含む。各結合オリゴヌクレオチドは２つの部分を有しており、１つの部分の配列は、核酸の複数の部分の１つの配列に相補的である。また、もう１つの部分の配列は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的である。ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と結合オリゴヌクレオチドを、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを結合オリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させる。核酸と結合オリゴヌクレオチドを、結合オリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させる。その後、検出可能な変化を観察する。ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を、核酸との接触に先立って、結合オリゴヌクレオチドと接触させてもよいし、または３つすべてを同時に接触させてもよい。
【００２０】
別の実施形態では、方法は、核酸をオリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類の粒子と接触させるステップを含む。第１種類の粒子上のオリゴヌクレオチドは、核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、該粒子に付けられない端部にエネルギー供与体分子を有する。第２種類の粒子上のオリゴヌクレオチドは、核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有し、該粒子に付けられない端部にエネルギー受容体分子を有する。接触は、粒子上のオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる。また、そのようなハイブリダイゼーションによって生じた検出可能な変化を観察する。エネルギー供与体および受容体分子は蛍光分子であってよい。
【００２１】
さらなる実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチドを付着させたある種類のマイクロスフェアを提供するステップを含む。オリゴヌクレオチドは、核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、蛍光分子で標識される。核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させた、検出可能な変化を生成するある種類のナノ粒子を提供する。核酸を、ラテックスマイクロスフェア上およびナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせる条件下でマイクロスフェアおよびナノ粒子と接触させ、その後、蛍光の変化、別の検出可能な変化またはその両方を観察する。
【００２２】
別の実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチドを付着させた第１種類の金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子を提供するステップを含む。オリゴヌクレオチドは、核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、蛍光分子で標識される。オリゴヌクレオチドを付着させた第２種類の金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子も提供する。該オリゴヌクレオチドは、核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有し、蛍光分子で同様に標識される。核酸を、核酸と該２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で、２種類のナノ粒子と接触させ、その後、蛍光の変化を観察する。
【００２３】
さらなる実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチドを付着させたある種類の粒子を提供するステップを含む。該オリゴヌクレオチドは第１部分と第２部分を有し、両部分は、核酸の配列の一部分に相補的である。第１部分と第２部分を含むある種類のプローブオリゴヌクレオチドも提供する。該第１部分は、粒子に付着させたオリゴヌクレオチドの該第１部分に相補的な配列を有し、また、両部分は核酸の配列の一部分に相補的である。またプローブオリゴヌクレオチドは、その一端を、リポーター分子で標識される。その後、粒子およびプローブオリゴヌクレオチドを、粒子上のオリゴヌクレオチドをプローブオリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせてサテライトプローブを生成する条件下で接触させる。その後、サテライトプローブを、プローブオリゴヌクレオチドと核酸を有効にハイブリダイズさせる条件下で核酸と接触させる。粒子は除去し、リポーター分子を検出する。
【００２４】
本発明の方法のさらに別の実施形態では、核酸を、オリゴヌクレオチドを付着させた基板と核酸を接触させることにより検出する。該オリゴヌクレオチドは核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有する。該オリゴヌクレオチドは、基板に置かれた一対の電極の間に配置される。接触は、基板上のオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる。その後、基板に結び付けられた核酸をある種類のナノ粒子と接触させる。ナノ粒子は、電気を伝導可能な材料で形成されている。ナノ粒子には１または複数の種類のオリゴヌクレオチドが付着しており、該１または複数の種類オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有する。接触は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる。核酸が存在する場合、導電率の変化を検出することが可能である。好ましい実施形態では、基板上には、１つの核酸中の複数の部分の検出、複数の異なる核酸の検出、またはその両方の検出を可能にするようアレイ状に複数対の電極が配置されている。アレイ中の各電極対は、２つの電極間に、基板に付着されたある種類のオリゴヌクレオチドを有するだろう。
【００２５】
本発明は、方法が基板上で行われる、核酸の検出方法をさらに提供する。該方法は、光学式スキャナで核酸の存在、量またはその両方を検出するステップを含む。
【００２６】
本発明は、核酸を検出するためのキットをさらに提供する。１実施形態では、キットは、オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を入れた少なくとも１つの容器を含む。第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有する。第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有する。
【００２７】
代わりに、キットは少なくとも２つの容器を含んでもよい。第１容器には、核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着されたナノ粒子が入る。第２容器には、核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子が入る。
【００２８】
さらなる実施形態では、キットは少なくとも１つの容器を含む。該容器には、オリゴヌクレオチドを付着させた金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子が入っている。オリゴヌクレオチドは核酸の一部分に相補的な配列を有し、ナノ粒子に付着されないオリゴヌクレオチドの端部には蛍光分子が付いている。
【００２９】
さらに別の実施形態では、キットは基板を含む。基板にはナノ粒子が付着し、該ナノ粒子には、核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。キットはさらに、核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子を入れた、第１容器も含む。キットは、少なくとも２つの部分を有する選択配列を有する結合オリゴヌクレオチドを入れた第２容器もさらに含む。２つの部分のうちの第１部分は、第１容器中のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも１つの部分に相補的である。キットはさらに、結合オリゴヌクレオチドの第２部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子を入れた第３容器も含む。
【００３０】
別の実施形態では、キットは、核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させた基板と、核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着したナノ粒子を入れた第１容器と、第１容器中のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着したナノ粒子を入れた第２容器とを含む。
【００３１】
さらに別の実施形態では、キットは、基板と、ナノ粒子を入れた第１容器と、核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有する第１種類のオリゴヌクレオチドを入れた第２容器と、核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有する第２種類のオリゴヌクレオチドを入れた第３容器と、第２種類のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部と相補的な配列を有する第３の種類のオリゴヌクレオチドを入れた第４容器とを含む。
【００３２】
さらなる実施形態では、キットは、核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させた基板を含む。キットはまた、核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させたリポソームを入れた第１容器と、少なくとも第１種類のオリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子を入れた第２容器とを有する。第１種類のオリゴヌクレオチドは、疎水的相互作用によりナノ粒子をリポソームに付着できるように、そのナノ粒子に付着されない端部に疎水基を有する。キットは、第１種類のナノ粒子に付着された第２種類のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも１つの部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着された第２種類のナノ粒子を入れた第３容器をさらに含み得る。第１種類のナノ粒子に付着された第２種類のオリゴヌクレオチドは、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有する。
【００３３】
別の実施形態では、キットは、ナノ粒子を付着させた基板を含む。ナノ粒子には、核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。キットはまた、凝集体プローブを入れた第１容器も含む。凝集体プローブは、オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を含む。凝集体プローブのナノ粒子は、その各々に付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。凝集体プローブの前記少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類には、核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。
【００３４】
さらに別の実施形態では、キットは、オリゴヌクレオチドを付着させた基板を含む。オリゴヌクレオチドは核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有する。キットはさらに、凝集体プローブを入れた第１容器を含む。凝集体プローブは、オリゴヌクレオチドが付着した少なくとも２種類のナノ粒子を含む。凝集体プローブのナノ粒子は、その各々に付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。凝集体プローブの前記少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類には、核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。
【００３５】
さらなる実施形態では、キットは、オリゴヌクレオチドを付着させた基板と、凝集体プローブを入れた第１容器とを含む。凝集体プローブは、オリゴヌクレオチドが付着した少なくとも２種類のナノ粒子を含む。凝集体プローブのナノ粒子は、その各々に付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。凝集体プローブの前記少なくとも１種類のナノ粒子の少なくとも１種類には、核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。キットはまた、ナノ粒子を入れた第２容器も含む。該ナノ粒子には、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドが付着している。第１種類のオリゴヌクレオチドは核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有する。第２種類のオリゴヌクレオチドは基板に付着したオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有する。
【００３６】
別の実施形態では、キットは、オリゴヌクレオチドが付着した基板を含む。オリゴヌクレオチドは核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有する。キットはまた、オリゴヌクレオチドが付着したリポソームを入れた第１容器も含む。オリゴヌクレオチドは核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有する。キットはさらに、オリゴヌクレオチドが付着した少なくとも２種類のナノ粒子を含む凝集体プローブを入れた、第２容器も含む。凝集体プローブのナノ粒子は、その各々に付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。凝集体プローブの前記少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類には、ナノ粒子に付着しない端部に疎水基を有するオリゴヌクレオチドが付着している。
【００３７】
さらなる実施形態では、キットは、オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子を入れた第１容器を含み得る。キットはまた、１または複数の追加の容器も含み、各容器には結合オリゴヌクレオチドを入れる。各結合オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有する第１部分と、検出する核酸の一部分の配列に相補的な配列を有する第２部分とを有する。各配列が検出する核酸の配列の一部分に相補的である限り、結合オリゴヌクレオチドの第２部分の配列は異なっていてもよい。別の実施形態では、キットは、オリゴヌクレオチドを付着させた１種類のナノ粒子と、１または複数の種類の結合オリゴヌクレオチドとを入れた容器を含む。該１または複数の種類の結合オリゴヌクレオチドの各々は、少なくとも２つの部分を含む配列を有している。第１部分は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的であり、そのため、容器内で結合オリゴヌクレオチドはナノ粒子上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。第２部分は、核酸の一部分の配列に相補的である。
【００３８】
別の実施形態では、キットは、２種類の粒子を入れた１または２つの容器を含み得る。第１種類の粒子には、核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着している。オリゴヌクレオチドは、その粒子に付着しない端部が、エネルギー供与体で標識される。第２種類の粒子には、核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。オリゴヌクレオチドは、その粒子に付着しない端部が、エネルギー受容体で標識される。エネルギー供与体と受容体は蛍光分子であってよい。
【００３９】
さらなる実施形態では、キットは、オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子を入れた第１容器を含む。キットはまた、各容器に結合オリゴヌクレオチドを入れた、１または複数の追加の容器も含む。各結合オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有する第１部分と、検出する核酸の部分の配列に相補的な配列を有する第２部分とを有する。各配列が検出する核酸の配列の部分に相補的である限り、結合オリゴヌクレオチドの第２部分の配列は異なっていてもよい。さらに別の実施形態では、キットは、オリゴヌクレオチドを付着させた１種類のナノ粒子と、１または複数の種類の結合オリゴヌクレオチドとを入れた容器を含む。該１または複数の種類の結合オリゴヌクレオチドの各々は、少なくとも２つの部分を含む配列を有する。その第１部分は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的であり、そのため、容器内で結合オリゴヌクレオチドはナノ粒子上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。第２部分は、核酸の一部分の配列に相補的である。
【００４０】
別の代替実施形態では、キットは少なくとも３つの容器を含む。第１容器にはナノ粒子が入っている。第２容器は、核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有する第１のオリゴヌクレオチドが入っている。第３容器には、核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有する第２のオリゴヌクレオチドが入っている。キットはさらに、少なくとも２つの部分（第１部分は第２のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも１つの部分に相補的）を有する選択配列を有する結合オリゴヌクレオチドを入れた第４容器と、結合オリゴヌクレオチドの第２部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを入れた第５の容器も含む。
【００４１】
別の実施形態では、キットは２種類の粒子を入れた１または２つの容器を含む。第１種類の粒子には、核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、かつナノ粒子に付着しない端部にエネルギー供与体分子が付いた、オリゴヌクレオチドが付着している。第２種類の粒子には、核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有し、かつナノ粒子に付着しない端部にエネルギー受容体分子が付いた、オリゴヌクレオチドが付着している。エネルギー供与体と受容体は蛍光分子であってよい。
【００４２】
さらなる実施形態では、キットは、オリゴヌクレオチドを付着させたある種類のマイクロスフェアを入れた第１容器を含む。該オリゴヌクレオチドは、核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、蛍光分子で標識される。オリゴヌクレオチドを付着させたある種類のナノ粒子を入れた第２容器を含む。該オリゴヌクレオチドは、キットは、核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有する。
【００４３】
別の実施形態では、キットは、オリゴヌクレオチドを付着させた第１種類の金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子を入れた第１容器を含む。該オリゴヌクレオチドは、核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、蛍光分子で標識される。キットはまた、オリゴヌクレオチドを付着させた第２種類の金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子を入れた第２容器を含む。該オリゴヌクレオチドは、核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有し、蛍光分子で標識される。
【００４４】
別の実施形態では、キットは、凝集体プローブを入れた容器を含む。凝集体プローブは、オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を含む。凝集体プローブのナノ粒子は、その各々に付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。凝集体プローブの前記少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類には、核酸の配列の一部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。
【００４５】
さらなる実施形態では、キットは、凝集体プローブを入れた容器を含む。凝集体プローブは、オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を含む。凝集体プローブのナノ粒子は、その各々に付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。凝集体プローブの前記少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類には、ナノ粒子に付着しない端部に疎水基が付いた、オリゴヌクレオチドが付着している。
【００４６】
さらなる実施形態では、キットは、サテライトプローブを入れた容器を含む。サテライトプローブは、オリゴヌクレオチドが付着した粒子を含む。オリゴヌクレオチドは第１部分と第２部分を有し、両部分は核酸の配列の部分に相補的な配列を有する。サテライトプローブは、ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするプローブオリゴヌクレオチドも含む。プローブオリゴヌクレオチドは第１部分と第２部分を有する。該第１部分は、粒子に付着したオリゴヌクレオチドの第１部分の配列に相補的な配列を有する。また、両部分は、核酸の配列の部分に相補的な配列を有する。プローブオリゴヌクレオチドはさらに、その一端にリポーター分子を有する。
【００４７】
別の実施形態では、キットはコアプローブを入れた容器を含む。コアプローブは、オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を含む。コアプローブのナノ粒子は、該ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。
【００４８】
さらに別の実施形態では、キットは、少なくとも１対の電極が付着された基板であって、該電極間で基板に対してオリゴヌクレオチドが付着された基板を含む。オリゴヌクレオチドは、検出する核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有する。
【００４９】
本発明はさらに、サテライトプローブ、凝集体プローブおよびコアプローブを提供する。
本発明はさらに、ナノ粒子を付着させた基板を提供する。該ナノ粒子には、核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着され得る。
【００５０】
本発明はさらに、オリゴヌクレオチドを付着させた金属または半導体ナノ粒子を提供する。オリゴヌクレオチドはナノ粒子に付着しない端部が蛍光分子で標識される。
【００５１】
本発明はさらに、ナノファブリケーションの方法を提供する。方法は、選択配列を有する少なくとも１種類の連結オリゴヌクレオチドを提供するステップであって、各種類の連結オリゴヌクレオチドの配列が少なくとも２つの部分を有するステップを含む。方法は、オリゴヌクレオチドを付着させた１または複数の種類のナノ粒子を提供するステップであって、各種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが連結オリゴヌクレオチドの配列の部分に相補的な配列を有するステップをさらに含む。連結オリゴヌクレオチドとナノ粒子を、所望のナノ材料かナノ構造が形成されるように、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを連結オリゴヌクレオチドに有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させる。
【００５２】
本発明は、ナノファブリケーションの別の方法を提供する。方法は、オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を提供するステップを含む。第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有する。第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、第１種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有する。第１および第２種類のナノ粒子を、所望のナノ材料かナノ構造が形成されるように、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを互いに有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させる。
【００５３】
本発明はさらに、オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子から構成されたナノ材料またはナノ構造であって、該ナノ粒子がオリゴヌクレオチドコネクタによって一緒に纏められたナノ材料またはナノ構造を提供する。
【００５４】
本発明はさらに、オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を含む組成物を提供する。第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、核酸の第１部分か連結オリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有する。第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、核酸の第２部分か連結オリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有する。
【００５５】
本発明はさらに、オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子を入れた第１容器とオリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子を入れた第２容器を含む容器のアセンブリを提供する。第１容器中のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドは、第２容器中のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有する。第２容器中のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドは、第１容器中のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有する。
【００５６】
本発明はさらに、複数の異なるオリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子を提供する。
本発明は、少なくとも２つの部分を有する選択核酸を他の核酸から分離する方法をさらに提供する。方法は、オリゴヌクレオチドを付着させた１または複数の種類のナノ粒子を提供するステップであって、該１または複数のナノ粒子の各々の上のオリゴヌクレオチドは選択核酸の前記少なくとも２つの部分のうちの１つの配列に相補的な配列を有するステップを含む。選択核酸および他の核酸を、選択核酸とハイブリダイズしたナノ粒子が凝集して沈降するように、選択核酸とナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で、ナノ粒子と接触させる。
【００５７】
さらに、本発明は、ユニークなナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を作製する方法を提供する。第１のそのような方法は、安定したナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成するために荷電ナノ粒子へオリゴヌクレオチドを結合させるステップを含む。そうするために、ナノ粒子に結合可能な官能基を有する部分が共有結合で結び付いているオリゴヌクレオチドを、少なくともオリゴヌクレオチドの一部が該官能基によってナノ粒子に結び付けられるのに十分な時間、ナノ粒子と水中で接触させる。次に、少なくとも１つの塩を水に加えて、塩溶液を作製する。塩溶液のイオン強度は、オリゴヌクレオチドの互いに対する静電斥力と、正に帯電したナノ粒子に対する負に帯電したオリゴヌクレオチドの静電引力か、負に帯電したナノ粒子に対する正に帯電したオリゴヌクレオチドの静電引力かの一方とを少なくとも部分的に克服するのに十分な強度でなければならない、塩を加えた後、オリゴヌクレオチドとナノ粒子を、追加オリゴヌクレオチドがナノ粒子に結合して安定したナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成するのに十分な追加期間、塩溶液中でインキュベートされる。本発明はさらに、安定したナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体、核酸を検出かつ分離するための該共役体の使用方法、該共役体を含むキット、該共役体を使用したナノファブリケーションの方法、ならびに、該共役体を含むナノ材料およびナノ構造を包含する。
【００５８】
本発明は、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成するためにオリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させる別の方法を提供する。方法は、ある種類の認識オリゴヌクレオチドとある種類の希釈剤オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを提供するステップを含む。オリゴヌクレオチドとナノ粒子を、該ある種類のオリゴヌクレオチドの各々の少なくとも一部がナノ粒子と結合して共役体を生成するのに有効な条件下で接触させる。本発明はさらに、該方法によって生成されたナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体、核酸を検出かつ分離するために該共役体を使用する方法、該共役体を含むキット、該共役体を使用したナノファブリケーションの方法、ならびに、該共役体を含むナノ材料およびナノ構造を包含する。「認識オリゴヌクレオチド」とは、核酸またはオリゴヌクレオチド標的の配列の少なくとも一部分に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドである。「希釈剤オリゴヌクレオチド」は、認識オリゴヌクレオチドがナノ粒子に結び付けられる能力または、認識オリゴヌクレオチドがその標的に結び付く能力に干渉しない任意の配列を有し得る。
【００５９】
本発明はさらに、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成するためにオリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させる別の方法を提供する。方法は、少なくとも１種類の認識オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを提供するステップを含む。認識オリゴヌクレオチドは認識部分とスペーサー部分を含む。認識オリゴヌクレオチドの認識部分は、核酸またはオリゴヌクレオチド標的の配列の少なくとも１部分に相補的な配列を有する。認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分は、スペーサー部分がナノ粒子に結合可能であるように設計される。ナノ粒子に認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分が結合した結果、認識部分はナノ粒子の表面から離れ、その標的とのハイブリダイズのためによりアクセス可能とある。共役体を生成するために、少なくとも認識オリゴヌクレオチドの一部がナノ粒子に結合するのに有効な条件下で、認識オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドとナノ粒子を接触させる。本発明はさらに、この方法によって生成されたナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体、核酸を検出かつ分離するために該共役体を使用する方法、該共役体を含むキット、該共役体を使用したナノファブリケーションの方法、ならびに、該共役体を含むナノ材料およびナノ構造を包含する。
【００６０】
本発明は、環式ジスルフィドを含むリンカーによって、ナノ粒子にオリゴヌクレオチドを付着させる方法を含む。適切な環式ジスルフィドは、その環内に２つの硫黄原子を含めた５つまたは６つの原子を有する。適切な環式ジスルフィドは市販されている。環式のジスルフィドの還元形も使用することが可能である。好ましくは、リンカーは、環式ジスルフィドに付着された炭化水素部分をさらに含む。適切な炭化水素は市販されており、（例えば付表に記述されるように）環式ジスルフィドに取り付けられる。好ましくは、炭化水素部分はステロイド残基である。リンカーがオリゴヌクレオチドに付けられ、オリゴヌクレオチドリンカーが本明細書に記載したようにナノ粒子に付着される。
【００６１】
本明細書に使用する場合、ある「〜種類のオリゴヌクレオチド」とは、同じ配列を有する複数のオリゴヌクレオチド分子を表す。オリゴヌクレオチドが付着している、ある「種類の」ナノ粒子、共役体、粒子、ラテックスミクロスフェアなどは、同種類のオリゴヌクレオチドが付着している複数の上記物質を指す。また、「オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子」は、「ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体」、または、本発明の検出法の場合には、「ナノ粒子−オリゴヌクレオチドプローブ」、「ナノ粒子プローブ」もしくは単に「プローブ」と称されることもある。
【００６２】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明の実施に有用なナノ粒子としては、金属（例えば、金、銀、銅および白金）、半導体（例えば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、およびＣｄＳまたはＺｎＳでコートしたＣｄＳｅ）ならびに磁性（例えば、強磁性）コロイド材料が挙げられる。本発明の実施に有用な他のナノ粒子には、ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＴｉＯ２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓ、およびＧａＡｓが含まれる。ナノ粒子のサイズは、好ましくは約５〜約１５０ｎｍ（平均直径）、より好ましくは約５〜約５０ｎｍ、最も好ましくは約１０〜約３０ｎｍである。ナノ粒子はロッドであってもよい。
【００６３】
金属、半導体および磁気ナノ粒子の調製法は当該技術分野において周知である。例えば、Ｓｃｈｍｉｄ，Ｇ．（編），Ｃｌｕｓｔｅｒｓ　ａｎｄ　Ｃｏｌｌｏｉｄｓ（ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，１９９４年）；Ｈａｙａｔ，Ｍ．Ａ．（編），Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ　Ｇｏｌｄ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，１９９１年）；Ｍａｓｓａｒｔ，Ｒ．，ＩＥＥＥ　Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ　Ｏｎ　Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ，第１７巻，１２４７ページ（１９８１年）；Ａｈｍａｄｉ，Ｔ．Ｓ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２７２巻，１９２４ページ（１９９６年）；Ｈｅｎｇｌｅｉｎ，Ａ．ら，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，第９９巻，１４１２９ページ（１９９５年）；Ｃｕｒｔｉｓ，Ａ．Ｃ．ら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，第２７巻，１５３０ページ（１９８８年）参照。
【００６４】
ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＴｉＯ２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓ、およびＧａＡｓナノ粒子の調製法も当該技術分野において公知である。例えば、Ｗｅｌｌｅｒ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，第３２巻，４１ページ（１９９３年）；Ｈｅｎｇｌｅｉｎ，Ｔｏｐ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．，第１４３巻，１１３ページ（１９８８年）；Ｈｅｎｇｌｅｉｎ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，第８９巻，１８６１ページ（１９８９年）；Ｂｒｕｓ，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ａ．，第５３巻，４６５ページ（１９９１年）；Ｂａｈｎｃｍａｎｎ，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｓｔｏｒａｇｅ　ｏｆ　Ｓｏｌａｒ　Ｅｎｅｒｇｙ（ＰｅｌｉｚｅｔｔｉおよびＳｃｈｉａｖｅｌｏ編、１９９１年），２５１ページ；ＷａｎｇおよびＨｅｒｒｏｎ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，第９５巻，５２５ページ（１９９１年）；Ｏｌｓｈａｖｓｋｙら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１２巻，９４３８ページ（１９９０年）；Ｕｓｈｉｄａら，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，第９５巻，５３８２ページ（１９９２年）参照。
【００６５】
適当なナノ粒子は、例えば、テッド・ペラ社（Ｔｅｄ　Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．）（金）、アマーシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（金）およびナノプローブス社（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）（金）からも市販されている。
【００６６】
核酸の検出に用いるのに好ましいのは金ナノ粒子である。金コロイド粒子は、美しい色を発するバンドに対して高い吸光係数を有する。これらの印象的な色は、粒度、濃度、粒子間間隔や、凝集体の凝集度および形状（幾何学）に応じて変化し、それが、これらの材料を比色アッセイ用に特に魅力的なものとしている。例えば、金ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドおよび核酸とがハイブリダイズすると直ぐに、肉眼にも見える変色が生じる（例えば、実施例参照）。
【００６７】
金ナノ粒子は、上記に挙げたのと同じ理由で、また、それらの安定性、電子顕微鏡検査による画像化の容易さや、十分に特性決定されたチオール官能基による修飾（以下参照）などの理由から、ナノファブリケーションに用いるのにも特に好ましい。また、半導体ナノ粒子も、それらの固有の電子特性および発光特性のゆえにナノファブリケーション用に好ましい。
【００６８】
オリゴヌクレオチドをナノ粒子に付着させるために、ナノ粒子もしくはオリゴヌクレオチドまたは両者を官能化する。そのような方法は当該技術分野では公知である。例えば、３′末端または５′末端がアルカンチオールにより官能化されたオリゴヌクレオチドは、金ナノ粒子に容易に付着する。Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｒｏｂｅｒｔ　Ａ．Ｗｅｌｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　３９ｔｈ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　Ｏｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｎａｎｏｐｈａｓｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，１０９−１２１ページ（１９９５年）参照。さらに、Ｍｕｃｉｃら，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，５５５−５５７ページ（１９９６年）（平らな金表面に３′チオールＤＮＡを付着させる方法を記載している；この方法は、オリゴヌクレオチドをナノ粒子に付着させるのに用い得る）参照。アルカンチオール法は、オリゴヌクレオチドを、他の金属、半導体および磁性コロイドや、上記にリストした他のナノ粒子に付着させるのにも用い得る。オリゴヌクレオチドを固体表面に付着させるための他の官能基には、ホスホロチオエート基（例えば、オリゴヌクレオチド−ホスホロチオエートを金表面に結合させることに関しては、米国特許第５，４７２，８８１号参照）、置換アルキルシロキサン（例えば、シリカおよびガラス表面へのオリゴヌクレオチドの結合に関しては、Ｂｕｒｗｅｌｌ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第４巻，３７０−３７７ページ（１９７４年）ならびにＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１０３巻，３１８５−３１９１ページ（１９８１年）、アミノアルキルシロキサンおよび類似のメルカプトアルキルシロキサンの結合に関しては、Ｇｒａｂａｒら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，第６７巻，７３５−７４５ページ参照）が含まれる。オリゴヌクレオチドを固体表面に付着させるには、５′チオヌクレオシドまたは３′チオヌクレオシドを末端基とするオリゴヌクレオチドを用いてもよい。以下の参考文献はオリゴヌクレオチドをナノ粒子に付着させるのに用い得る他の方法を記載している：Ｎｕｚｚｏら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１０９巻，２３５８ページ（１９８７年）（金上のジスルフィド）；ＡｌｌａｒａおよびＮｕｚｚｏ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第１巻，４５ページ（１９８５年）（アルミニウム上のカルボン酸）；ＡｌｌａｒａおよびＴｏｍｐｋｉｎｓ，Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　Ｓｃｉ．，第４９巻，４１０−４２１ページ（１９７４年）（銅上のカルボン酸）；Ｉｌｅｒ，Ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｏｆ　Ｓｉｉｃａ，第６章，（Ｗｉｌｅｙ，１９７９年）（シリカ上のカルボン酸）；Ｔｉｍｍｏｎｓ　ａｎｄ　Ｚｉｓｍａｎ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，第６９巻，９８４−９９０ページ（１９６５年）（白金上のカルボン酸）；ＳｏｒｉａｇａおよびＨｕｂｂａｒｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１０４巻，３９３７ページ（１９８２年）（白金上の芳香環化合物）；Ｈｕｂｂａｒｄ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，第１３巻，１７７ページ（１９８０年）（白金上のスルホラン、スルホキシドおよび他の官能化溶剤）；Ｈｉｃｋｍａｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１１巻，７２７１ページ（１９８９年）（白金上のイソニトリル）；ＭａｏｚおよびＳａｇｉｖ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第３巻，１０４５ページ（１９８７年）（シリカ上のシラン）；ＭａｏｚおよびＳａｇｉｖ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第３巻，１０３４ページ（１９８７年）（シリカ上のシラン）；Ｗａｓｓｅｒｍａｎら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第５巻，１０７４ページ（１９８９年）（シリカ上のシラン）；ＥｌｔｅｋｏｖａおよびＥｌｔｅｋｏｖ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第３巻，９５１ページ（１９８７年）（二酸化チタンおよびシリカ上の芳香族カルボン酸、アルデヒド、アルコールおよびメトキシ基）；Ｌｅｃら，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，第９２巻，２５９７ページ（１９８８年）（金属上の硬質ホスフェート）。
【００６９】
環式ジスルフィドで官能化されたオリゴヌクレオチドは本発明の範囲内にある。環式ジスルフィドは、好ましくは、その環の中に２つの硫黄原子を含めて５または６つの原子を有している。適切な環式ジスルフィドは市販されているか、既知の方法によって合成される。環式ジスルフィドの還元形も使用することができる。
【００７０】
好ましくは、リンカーは、環式ジスルフィドに付けられた炭化水素部分をさらに含む。適切な炭化水素は市販されており、環式ジスルフィドに付けられる。好ましくは炭化水素部分はステロイド残基である。環式ジスルフィドに付けられたステロイド残基を含むリンカーを使用して調製されたオリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体は、期せずしてアルカンチオールまたは非環式ジスルフィドをリンカーとして使用して調製した共役体と比較して、チオール（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）溶液中で使用されるジチオスレイトール）に対して著しく安定であることが分かった。確かに、本発明のオリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体は３００倍安定していることがわかった。この予期しなかった安定性は、恐らく各オリゴヌクレオチドが、１つの硫黄原子ではなく、２つの硫黄原子によってナノ粒子に固定されているという事実による。詳しく説明すると、環式ジスルフィドの２つの隣接した硫黄原子が、オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体の安定化に有効なキレート化効果を有することが考えられる。リンカーの大きな疎水性ステロイド残基も、ナノ粒子の表面への水溶性分子の接近からナノ粒子を遮ることにより、共役体の安定性に寄与するように思われる。
【００７１】
以上を考慮すると、両方の硫黄原子がナノ粒子に同時にくっ付くことができるように、環式ジスルフィドの２つの硫黄原子は好ましくは十分に接近しなければならない。より好ましくは、２つの硫黄原子は互いに隣接する。また、炭化水素部分は、ナノ粒子の表面を遮る大きな疎水性表面を示すように大きくなくてはならない。
【００７２】
環式ジスルフィドリンカーを使用したオリゴヌクレオチド−環式ナノ粒子共役体は、核酸検出用の診断アッセイや本明細書に記載したナノファブリケーションの方法において、プローブとして使用され得る。本発明のそのような共役体は、それを使用した診断アッセイの感度を向上させることが期せずして分かった。特に、環式ジスルフィドに付けられたステロイド残基を含むリンカーを使用して調製されたオリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体を使用したアッセイは、約１０倍アルカンチオールまたは非環式ジスルフィドをリンカーとして使用して調製された共役体を使用したアッセイよりも１０倍感度が高いと分かった。
【００７３】
上記のチオールに対する本発明のオリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体の驚くべき安定性は、それらをＰＣＲ溶液中で直接使用することを可能にする。したがって、ＰＣＲによって増幅されるＤＮＡ標的に対してプローブとして加えられた本発明のオリゴヌクレオチド−ナノ粒子は、３０または４０回のＰＣＲの加熱−冷却サイクルを受け、チューブを開かなくてもなおアンプリコンを検出することができる。ＰＣＲ後にプローブ追加のためにサンプルチューブを開くと、後のテストに使用する機器の汚染による深刻な問題が起こる可能性がある。
【００７４】
最後に、本発明は、本発明のある種類のオリゴヌクレオチド環式ジスルフィドリンカーが入った容器または本発明のある種類のオリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体が入った容器を含むキットを提供する。該キットは、核酸検出またはナノファブリケーションに有効な他の試薬や品目をさらに含んでもよい。
【００７５】
各ナノ粒子には多数のオリゴヌクレオチドが付着する。その結果、各ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体は、相補的配列を有する多数のオリゴヌクレオチドまたは核酸に結合し得る。
【００７６】
本発明の実施に際して、規定配列を有するオリゴヌクレオチドが様々な目的に使用される。予め決定した配列を有するオリゴヌクレオチドを調製する方法は周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（第２版，１９８９年）およびＦ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（編）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，第１版（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９１年）参照。オリゴヌクレオチドとオリゴデオキシリボヌクレオチドの合成には、共に固相合成法が好ましい（周知のＤＮＡ合成法は、ＲＮＡの合成にも有用である）。オリゴリボヌクレオチドとオリゴデオキシリボヌクレオチドは、酵素的に調製することもできる。
【００７７】
本発明は核酸検出法を提供する。これらの方法はまた、どの種類の核酸をも検出し得るし、例えば、病気の診断や核酸の配列決定にも用い得る。本発明の方法により検出し得る核酸の例としては、遺伝子（例えば、特定の疾患に関与する遺伝子）、ウイルスＲＮＡおよびＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、菌類ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡフラグメント、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖および二本鎖核酸、天然および合成核酸などがある。例えば、核酸検出法の用途例には、ウイルス性疾患（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルスおよびエプスタイン−バー・ウイルス）、細菌性疾患（例えば、結核、ライム病、Ｈ．ピロリ、大腸菌感染症、レジオネラ感染症、マイコプラズマ感染症、サルモネラ感染症）性的伝染病（例えば、淋病）、遺伝性疾患（例えば、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、フェニルケトン尿症、鎌状赤血球貧血）、ならびにガン（例えば、ガン発症に関与する遺伝子）の診断および／またはモニター用；法医学用；ＤＮＡ配列決定用；親子鑑定テスト用；細胞系確認用；遺伝子療法のモニター用；ならびに他の多くの目的が含まれる。
【００７８】
肉眼による変色の観察に基づく核酸検出法は、安価、高速、簡単、強靭（試薬が安定している）であり、特殊化装置または高価な装置を必要とせず、かつ計器による計測がほとんど不要である。これらの点から、上記方法は、例えば、ＤＮＡ配列決定における研究および解析実験において、特定病原体の存在を検出する分野において、治療薬の処方を支援するために感染症の迅速な同定を必要とする医院において、また費用のかからない最前線のスクリーニングをするために家庭や保険センターにおいて用いるのに特に適している。
【００７９】
検出すべき核酸は、公知方法で単離することもできるし、細胞、組織試料、生物流体（例えば、唾液、尿、血液、血清）、ＰＣＲ成分を含有する溶液、大過剰量のオリゴヌクレオチドまたは高分子量ＤＮＡを含有する溶液、および当該技術分野においても既知の他の試料中で直接検出することもできる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（第２版，１９８９年）ならびにＢ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，Ｇｅｎｅ　Ｐｒｏｂｅｓ　１（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９５年）参照。ハイブリダイズ用プローブを用いて検出するための核酸の調製法は当該技術分野では周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（第２版，１９８９年）ならびにＢ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編；Ｇｅｎｅ　Ｐｒｏｂｅｓ　１（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９５年）参照。
【００８０】
核酸が少量で存在する場合、当該技術分野において公知の方法を用い得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（第２版，１９８９年）ならびにＢ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，Ｇｅｎｅ　Ｐｒｏｂｅｓ　１（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９５年）参照。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅が好ましい。
【００８１】
本発明の１つの核酸検出法は、核酸とオリゴヌクレオチドが付着している１つ以上の種類のナノ粒子とを接触させるステップを含む。検出すべき核酸は少なくとも２つの部分を有している。これらの部分の長さと、もしあれば、それらの間隔は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが核酸とハイブリダイズしたときに検出可能な変化が生じるように選択される。これらの長さと間隔は、経験的に決定可能であり、用いられる粒子の種類およびそのサイズ、ならびにアッセイに用いられる溶液中に存在する電解質の種類（当該技術分野では公知のように、ある種の電解質は、核酸のコンホメーションに影響を与える）に依存するであろう。
【００８２】
また、核酸を他の核酸の存在下に検出しようとする場合、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが結合すべき核酸部分は、核酸の検出を特異的にするのに十分なユニーク配列を含むように選択しなければならない。そのようにするためのガイドラインは当該技術分野では周知である。
【００８３】
核酸は、１種類のオリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体を用いればすむように互いに十分に近接した反復配列を含んでいることがあるが、このようなことはめったに起こらない。一般に、核酸の選択した複数の部分は異なる配列を有し、好ましくは異なるナノ粒子に付着している、該選択部分は、２つ以上の異なるオリゴヌクレオチドを担持するナノ粒子と接触することになろう。核酸を検出するための系の１つの例が図２に示されている。図で分るように、第１ナノ粒子に付着している第１オリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ中の標的配列の第１部分に対して相補的な配列を有している。第２ナノ粒子に付着している第２オリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ中の標的配列の第２部分に対して相補的な配列を有している。ＤＮＡの追加部分は対応ナノ粒子の標的となり得る。図１７参照。核酸のいくつかの部分を標的とすると、検出可能な変化の大きさが増大する。
【００８４】
ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と核酸との接触ステップは、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸の標的配列とをハイブリダイズさせるのに有効な条件下に行う。これらのハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野では周知であり、用いられる特定の系に合わせて容易に最適化し得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（第２版，１９８９年）参照。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いるのが好ましい。
【００８５】
検出すべき核酸とナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を含有する溶液を凍結解凍することにより、ハイブリダイゼーションをより高速にすることができる。溶液は、ドライアイス−アルコール浴中に凍結させるのに十分な時間（一般に、１００μｌの溶液の場合、約１分）入れる方法などの任意の慣用法で凍結し得る。溶液は、熱変性温度より低い温度で解凍しなければないが、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と核酸とのほとんどの組合せに対しては、室温が好都合であろう。溶液の解凍後、ハイブリダイゼーションが完了し、溶液解凍後に検出可能な変化が観察される。
【００８６】
検出すべき核酸およびナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を含有する溶液を、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと標的核酸とで形成された複合体の解離温度（Ｔｍ）より低い温度まで温めて、ハイブリダイゼーション速度を増大させることもできる。あるいは、解離温度（Ｔｍ）以上に加熱し、溶液を冷却することにより、高速ハイブリダイゼーションを達成することもできる。
【００８７】
ハイブリダイゼーションの速度は、塩濃度を（例えば、０．１Ｍから０．３Ｍ　ＮａＣｌに）高めることにより、増大させることも可能である。
ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸とがハイブリダイズすると生じる検出可能な変化は、変色、ナノ粒子凝集体の形成、または凝集したナノ粒子の沈殿であり得る。変色は、肉眼または分光分析により観察し得る。ナノ粒子凝集体の形成は、電子顕微鏡検査または比濁分析によって観察し得る。凝集したナノ粒子の沈殿は、肉眼でも顕微鏡検査によっても観察し得る。好ましいのは、肉眼で観察し得る変化である。特に好ましいのは、肉眼で観察し得る変色である。
【００８８】
肉眼による変色の観察は、対照的な色を背景にするとより容易に実施し得る。例えば、金ナノ粒子を用いる場合、変色の観察は、（シリカまたはアルミナＴＬＣプレート、濾紙、セルロイドメンブレン、およびナイロンメンブレン、好ましくはＣ−１８シリカＴＬＣプレートなどの）固体白色表面上にハイブリダイゼーション溶液をスポットし、スポットを乾燥させることにより容易になる。初めは、スポットは、（ハイブリダイゼーション不在下のピンク／赤色から、ハイブリダイゼーション存在下の紫がかった赤／紫色の範囲の）ハイブリダイゼーション溶液の色を呈する。室温下または８０℃（温度は重要ではない）下に乾燥させたとき、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体がスポットする前に標的核酸とハイブリダイズして結合していると、青色スポットが生じる。（例えば、標的核酸が存在しないために）ハイブリダイゼーションが起こらないと、スポットはピンク色である。青色スポットとピンク色スポットは安定であり、のちに冷却しても、加熱しても、経時的にも、変化しない。それらのスポットはテストの便利な永久記録を提供する。変色を観察するのに、（ハイブリダイズしたナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体とハイブリダイズしていないものの分離などの）他のステップは不要である。
【００８９】
アッセイ結果を容易に視覚化するための代替法は、液体を吸引してフィルターに通過させながら、標的核酸にハイブリダイズしたナノ粒子プローブ試料をガラス繊維フィルター（例えば、サイズが１３ｎｍの金ナノ粒子と共に用いる場合には、細孔サイズ０．７μｍ、グレードＦＧ７５のホウケイ酸塩ミクロファイバーフィルター）に対してスポットする方法である。その後、（フィルターの細孔より大きいために保持された）ナノ粒子プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションにより生成した凝集体を含む観察可能なスポットを残して、過剰なハイブリダイズしていないプローブをフィルターに通して水で洗い流す。この技術は、過剰なナノ粒子プローブを使用し得るので、高い感度を提供し得る。残念ながら、ナノ粒子プローブは、試みた他の多くの固体表面（シリカスライド、逆相プレート、ナイロン、ニトロセルロース、セルロースおよび他のメンブレン）には粘着するために、これらの表面は使用できない。
【００９０】
図２に示されている検出系の重要な側面は、検出可能な変化を得るステップが、２つの異なるオリゴヌクレオチドと核酸中の所与の標的配列との協同ハイブリダイゼーションによって決まることである。２つのオリゴヌクレオチドのいずれにおける誤対合も、粒子間の結合を不安定にするであろう。塩基対における誤対合が、長いオリゴヌクレオチドプローブの結合よりも短いオリゴヌクレオチドプローブの結合に対してはるかに大きな不安定化作用を及ぼすことは周知である。図２に示されている系の利点は、この系が、長い標的配列およびプローブ（図２に示されている実施例では１８塩基対）に関連する塩基識別を利用するにも拘わらず、短いオリゴヌクレオチドプローブ（図２に示されている実施例では９塩基対）に特徴的な感度を有することである。
【００９１】
核酸の標的配列は、図２のように連続的なこともあるし、図３に示されているように、標的配列の２つの部分がナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと相補的ではない第３部分によって分離されていることもある。後者の場合、溶液中で遊離すると共にこの第３部分の配列に対して相補的な配列を有する、フィラー（ｆｉｌｌｅｒ、充填）オリゴヌクレオチドを用いるというオプションもある（図３参照）。フィラーオリゴヌクレオチドが核酸の第３部分とハイブリダイズすると、二本鎖セグメントができ、それによってナノ粒子間の平均間隔が変化し、その結果、色が変わる。図３に示されている系は、検出法の感度を高め得る。
【００９２】
核酸検出法の実施態様のなかには基板を利用するものもある。基板を用いることにより、検出可能な変化（シグナル）を増幅し、アッセイの感度を高めることができる。
【００９３】
検出可能な変化を観察し得る任意の基板を用いてよい。適当な基板としては、透明固体表面（例えば、ガラス、石英、プラスチックおよび他のポリマー類）、不透明固体表面（例えば、ＴＬＣシリカプレート、濾紙、ガラス繊維フィルター、セルロイドメンブレン、ナイロンメンブレンなどの白色固体表面）、および導電性固体表面（例えば、インジウム−スズ−オキシド（ＩＴＯ））が挙げられる。基板は、任意の形状または厚さであってよいが、一般的には、平坦で薄い。好ましいのは、ガラス（例えば、ガラス製スライド）またはプラスチック（例えば、マイクロタイタープレートのウエル）などの透明な基板である。
【００９４】
１つの実施態様において、オリゴヌクレオチドを基板に付着させる。オリゴヌクレオチドは、例えば、Ｃｈｒｉｓｅｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，第２４巻，３０３１−３０３９ページ（１９９６年）；Ｃｈｒｉｓｅｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，第２４巻，３０４０−３０４７ページ（１９９６年）；Ｍｕｃｉｃら，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，第５５５巻（１９９６年）；ＺｉｍｍｅｒｍａｎｎおよびＣｏｘ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，第２２巻，４９２ページ（１９９４年）；Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙら，Ｊ．Ｖａｃ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ａ，第１０巻，５９１ページ（１９９２年）；およびＨｅｇｎｅｒら，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．，第３３６巻，４５２ページ（１９９３年）に記載のように、基板に付着させることができる。
【００９５】
基板に付着しているオリゴヌクレオチドは、検出すべき核酸の第１部分の配列に対して相補的な配列を有している。核酸と基板とを、基板上のオリゴヌクレオチドと核酸とをハイブリダイズさせるのに有効な条件下に接触させる。このようにして、核酸は基板と結合した状態になる。結合しなかった核酸は、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を加える前に基板から洗い流すのが好ましい。
【００９６】
次いで、基板に結合した核酸と、オリゴヌクレオチドが付着している第１種類のナノ粒子とを接触させる。オリゴヌクレオチドは、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有しており、接触ステップは、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸とをハイブリダイズさせるのに有効な条件下に行う。このようにして、第１種類のナノ粒子は基板に結合した状態になる。ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を基板に結合させた後、基板を洗浄して、結合していないナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体および核酸を除去する。
【００９７】
第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、すべて同じ配列を有してもよいし、検出すべき核酸の異なる部分とハイブリダイズする異なる配列を有してもよい。異なる配列を有するオリゴヌクレオチドを用いる場合、各ナノ粒子に、すべての異なるオリゴヌクレオチドが付着してもよいが、異なるオリゴヌクレオチドが異なるナノ粒子に付着するのが好ましい。図１７は、核酸の複数の部分にハイブリダイズするように設計されたナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体の使用を示している。代わりに、各第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは複数の異なる配列を有していてもよいが、そのうちの少なくとも１つは、検出すべき核酸の一部とハイブリダイズしなければならない（図２５Ｂ参照）。
【００９８】
最後に、基板に結合した第１種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と、オリゴヌクレオチドが付着している第２種類のナノ粒子とを接触させる。該オリゴヌクレオチドは、第１種類のナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドの少なくとも一部の配列に対して相補的な配列を有しており、接触ステップは、第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせるのに有効な条件下に行う。ナノ粒子を結合させ後、結合しなかったナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を除去するために基板を洗浄するのが好ましい。
【００９９】
ハイブリダイゼーションの組合せにより、検出可能な変化が生じる。検出可能な変化は上述のものと同じであるが、但し、多重ハイブリダイゼーションにより、検出可能な変化が増幅される。特に、各第１種類のナノ粒子には、（同一または異なる配列を有する）複数のオリゴヌクレオチドが付着しているので、各第１種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体は、複数の第２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体にハイブリダイズし得る。また、第１種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体は、検出すべき核酸の２つ以上の部分にハイブリダイズし得る。多重ハイブリダイゼーションにより得られる増幅は、変化を初めて検出し得るものとしたり、または検出可能な変化の大きさを増大させたりし得る。この増幅によって、アッセイの感度が高められ、少量の核酸の検出が可能になる。
【０１００】
所望の場合には、第１および第２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を連続付加して、追加のナノ粒子層を堆積することができる。この方法で、標的核酸１分子当たりの固定化ナノ粒子の数を増加させると同時に、対応するシグナル強度を増強させることができる。
【０１０１】
また、互いに直接ハイブリダイズするように設計された第１および第２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体の代わりに、連結オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの結果としてナノ粒子を共に結合させる働きをするオリゴヌクレオチドを担持するナノ粒子を用いてもよい。
【０１０２】
ナノ粒子およびオリゴヌクレオチドの調製法ならびにオリゴヌクレオチドをナノ粒子に付着させる方法は上記に説明されている。ハイブリダイゼーション条件は当該技術分野では周知であり、用いられる特定の系に合わせて容易に最適化し得る（上記参照）。
【０１０３】
この核酸（検体ＤＮＡ）検出法の１つの実施例が図１３Ａに示されている。図に示されているように、ハイブリダイゼーションの組合せにより、ナノ粒子凝集体が検体ＤＮＡを介して基板に結合している暗色領域が生じる。これらの暗色領域は、周囲光を使って肉眼で、好ましくは白い背景を背に基板を見れば容易に観察し得る。図１３Ａから容易に分るように、この方法は、検出可能な変化を増幅させる手段を提供する。
【０１０４】
この核酸検出法の別の実施例が図２５Ｂに示されている。図１３Ａに示されている実施例と同じように、ハイブリダイゼーションの組合せにより、ナノ粒子凝集体が検体ＤＮＡを介して基板に結合している暗色領域ができ、これは肉眼で観察することができる。
【０１０５】
別の実施態様では、ナノ粒子を基板に付着させる。ナノ粒子は、例えば、Ｇｒａｂａｒら，Ａｎａｌｙｔ．Ｃｈｅｍ．，第６７巻，７３−７４３ページ（１９９５年）；Ｂｅｔｈｅｌｌら，Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，第４０９巻，１３７ページ（１９９６年）；Ｂａｒら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第１２巻，１１７２ページ（１９９６年）；Ｃｏｌｖｉｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１４巻，５２２１ページ（１９９２年）に記載のように基板に付着させることができる。
【０１０６】
ナノ粒子を基板に付着させた後、オリゴヌクレオチドをナノ粒子に付着させる。これは、溶液中でオリゴヌクレオチドをナノ粒子に付着させるための上記方法と同じ方法で達成し得る。ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドは、核酸の第１部分の配列に対して相補的な配列を有している。
【０１０７】
基板と核酸とを、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸とをハイブリダイズさせるのに有効な条件下に接触させる。このようにして、核酸は基板に結合した状態になる。結合しなかった核酸は、さらにナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を加える前に基板から洗い流すのが好ましい。
【０１０８】
次いで、オリゴヌクレオチドが付着している第２種類のナノ粒子を用意する。これらのオリゴヌクレオチドは、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有しており、基板に結合した核酸と第２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体とを、第２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体上のオリゴヌクレオチドと核酸とをハイブリダイズさせるのに有効な条件下に接触させる。このようにして、第２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体は基板と結合した状態になる。ナノ粒子を結合させた後、結合しなかったナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と核酸を基板から洗い流す。この時点で、ある変化（例えば、変色）を検出し得る。
【０１０９】
第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドはすべて同じ配列を有してもよいし、検出すべき核酸の異なる部分とハイブリダイズする異なる配列を有してもよい。異なる配列を有するオリゴヌクレオチドを用いる場合、各ナノ粒子に、すべての異なるオリゴヌクレオチドが付着してもよいが、異なるオリゴヌクレオチドが異なるナノ粒子に付着するのが好ましい。図１７を参照されたい。
【０１１０】
次いで、第１部分が第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部の配列と相補的である少なくとも２つの部分を含む選択された配列を有する結合オリゴヌクレオチドと、基板に結合した第２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体とを、結合オリゴヌクレオチドとナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせるのに有効な条件下に接触させる。このようにして、結合オリゴヌクレオチドは基板と結合した状態になる。結合オリゴヌクレオチドを結合させた後、結合しなかった結合オリゴヌクレオチドを基板から洗い流す。
【０１１１】
最後に、オリゴヌクレオチドが付着している第３種類のナノ粒子を用意する。これらのオリゴヌクレオチドは、結合オリゴヌクレオチドの第２部分の配列に対して相補的な配列を有している。ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と、基板に結合した結合オリゴヌクレオチドとを、結合オリゴヌクレオチドとナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせるのに有効な条件下に接触させる。ナノ粒子を結合させた後、結合しなかったナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を基板から洗い流す。
【０１１２】
ハイブリダイゼーションの組合せにより、検出可能な変化が生じる。検出可能な変化は上述のものと同じであるが、但し、多重ハイブリダイゼーションにより、検出可能な変化が増幅される。特に、各第２種類のナノ粒子には、（同一または異なる配列を有する）多数のオリゴヌクレオチドが付着するので、各第２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体は、（結合オリゴヌクレオチドを介して）複数の第３種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体にハイブリダイズし得る。また、第２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体は、検出すべき核酸の２つ以上の部分にハイブリダイズし得る。多重ハイブリダイゼーションによりもたらされる増幅は、変化を初めて検出可能なものとしたり、または検出可能な変化の大きさを増大させたりし得る。この増幅により、アッセイの感度が高められ、少量の核酸の検出が可能になる。
【０１１３】
所望の場合には、結合オリゴヌクレオチドと第２および第３種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体とを連続付加して、追加のナノ粒子層を堆積することができる。このようにして、標的核酸１分子当たりの固定化ナノ粒子の数をさらに増強させると同時に、対応するシグナル強度を増強させることができる。
【０１１４】
また、結合オリゴヌクレオチドの使用を排除することも可能であり、第２および第３種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体は、直接互いにハイブリダイズするように設計し得る。
【０１１５】
ナノ粒子およびオリゴヌクレオチドの調製法ならびにオリゴヌクレオチドをナノ粒子に付着させる方法は上記に説明されている。ハイブリダイゼーション条件は当該技術分野では周知であり、用いられる特定の系に合わせて容易に最適化し得る（上記参照）。
【０１１６】
この核酸（検体ＤＮＡ）検出法の１つの実施例が図１３Ｂに示されている。その図に示されているように、ハイブリダイゼーションの組合せにより、ナノ粒子凝集体が検体ＤＮＡを介して基板に結合している暗色領域が生じる。これらの暗色領域は、上述したように肉眼で容易に観察し得る。図１３Ｂから分るように、本発明の方法のこの実施態様は、検出可能な変化を増幅させる別の手段を提供する。
【０１１７】
別の増幅計画はリポソームの使用である。この計画では、オリゴヌクレオチドを基板に付着させる。適当な基板は上述のものであり、オリゴヌクレオチドは上述のように基板に付着させることができる。例えば、基板がガラスの場合、これは、ホスホリルまたはカルボン酸基を介してオリゴヌクレオチドを基板表面上のアミノアルキル基に縮合させることにより達成し得る（関連化学に関しては、Ｇｒａｂａｒら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，第６７巻，７３５−７４３ページ（１９９５年）参照）。
【０１１８】
基板に付着したオリゴヌクレオチドは、検出すべき核酸の第１部分の配列に対して相補的な配列を有している。核酸と基板とを、基板上のオリゴヌクレオチドと核酸とをハイブリダイズさせるのに有効な条件下に接触させる。このようにして、核酸は基板と結合した状態になる。結合しなかった核酸は、この系の追加成分を加える前に基板から洗い流すのが好ましい。
【０１１９】
次いで、基板に結合した核酸をオリゴヌクレオチドが付着しているリポソームと接触させる。オリゴヌクレオチドは、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有しており、接触ステップは、リポソーム上のオリゴヌクレオチドと核酸とをハイブリダイズさせるのに有効な条件下に行う。このようにして、リポソームは基板と結合した状態になる。リポソームを基板に結合させた後、基板を洗浄して、結合しなかったリポソームと核酸を除去する。
【０１２０】
リポソーム上のオリゴヌクレオチドはすべて同じ配列を有してもよいし、検出すべき核酸の異なる部分とハイブリダイズする異なる配列を有してもよい。異なる配列を有するオリゴヌクレオチドを用いる場合、各リポソームに、すべての異なるオリゴヌクレオチドが付着するか、異なるオリゴヌクレオチドが異なるナノ粒子に付着し得る。
【０１２１】
オリゴヌクレオチド−リポソーム共役体を調製するために、オリゴヌクレオチドを、コレステリルなどの疎水基に結合させ（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１５巻，７５３５−７５３６ページ（１９９３年）参照）、疎水基−オリゴヌクレオチド共役体をリポソーム溶液と混合して、疎水基−オリゴヌクレオチド共役体が膜に固定化された状態のリポソームを形成する（Ｚｈａｎｇら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．，第３７巻，６２４３−６２４６ページ（１９９６年）参照）。リポソーム表面上での疎水基−オリゴヌクレオチド共役体の充填は、混合物中の疎水基−オリゴヌクレオチド共役体とリポソームの比率を調節することにより制御し得る。コレステリル側基の疎水性相互作用によって付着しているオリゴヌクレオチドを担持するリポソームは、ニトロセルロース膜上に固体化されたポリヌクレオチドを標的とするのに有効であることが認められた（同上）。リポソーム膜内に固定化されたフルオレセイン基をレポーター基として用いた。フルオレセイン基は効果的な働きをしたが、（例えば、リポソーム表面上の）高局所濃度領域のフルオレセイン由来のシグナルが自己消光により弱められるという事実により感度が制限される。
【０１２２】
リポソームは当該技術分野で周知の方法により調製される。Ｚｈａｎｇら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．，第３７巻，６２４３ページ（１９９６年）参照。一般にリポソームの大きさは、サイズ（直径）が、後続ステップで用いられるナノ粒子の約５〜５０倍である。例えば、直径約１３ｎｍのナノ粒子には、直径約１００ｎｍのリポソームを用いるのが好ましい。
【０１２３】
基板に結合したリポソームと、少なくとも１つの第１種類のオリゴヌクレオチドが付着している第１種類のナノ粒子とを接触させる。第１種類のオリゴヌクレオチドのナノ粒子に付着していない末端には疎水基が付着しており、接触ステップは、疎水性相互作用の結果として、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドをリポソームに付着させるのに有効な条件下に行う。この時点で、検出可能な変化を観察し得る。
【０１２４】
この方法はさらに、リポソームに結合した第１種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体とオリゴヌクレオチドが付着している第２種類のナノ粒子とを接触させるステップを含む。第１種類のナノ粒子には、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着しており、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、第１種類のナノ粒子上の第２種類のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部の配列に対して相補的な配列を有している。接触ステップは、第１および第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるのに有効な条件下に行う。このハイブリダイゼーションは、一般に、穏和な温度（例えば、５〜６０℃）下に実施され、したがって、室温下にハイブリダイゼーションを導き得る条件（例えば、０．３〜１．０Ｍ　ＮａＣｌ）が用いられる。ハイブリダイゼーション後、結合しなかったナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を基板から洗い流す。
【０１２５】
ハイブリダイゼーションの組合せにより、検出可能な変化が生じる。検出可能な変化は上述のものと同じであるが、但し、多重ハイブリダイゼーションにより、検出可能な変化が増幅される。特に、各リポソームには、（同一または異なる配列を有する）複数のオリゴヌクレオチドが付着しているので、各リポソームは、複数の第１種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体にハイブリダイズし得る。同様に、各第１種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体には、多重オリゴヌクレオチドが付着しているので、各第１種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体は、複数の第２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体とハイブリダイズし得る。また、リポソームは、検出すべき核酸の２つ以上の部分にハイブリダイズし得る。多重ハイブリダイゼーションによりもたらされる増幅は、変化を初めて検出し得るものとしたり、または検出可能な変化の大きさを増大させたりし得る。この増幅により、アッセイの感度が高められ、少量の核酸の検出が可能になる。
【０１２６】
所望の場合には、第１および第２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を連続付加して、追加のナノ粒子層を堆積することができる。この方法で、標的核酸１分子当たりの固定化ナノ粒子の数をさらに増加させると同時に、対応するシグナル強度を増強させることができる。
【０１２７】
また、互いに直接ハイブリダイズするように設計された第２および第３種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体の代わりに、結合オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの結果としてナノ粒子を結合させる働きをするオリゴヌクレオチドを担持するナノ粒子を用いてもよい。
【０１２８】
ナノ粒子およびオリゴヌクレオチドの調製法ならびにオリゴヌクレオチドをナノ粒子に付着させる方法は上記に説明されている。ナノ粒子と結合させるために一方の末端を官能化した、他方の末端に疎水基を有するかまたは有さないオリゴヌクレオチド混合物を、第１種類のナノ粒子上に用いてもよい。平均的なナノ粒子に結合したこれらのオリゴヌクレオチドの相対比は、混合物中の２種のオリゴヌクレオチドの濃度比によって制御される。ハイブリダイゼーション条件は当該技術分野では周知であり、用いられる特定の系に合わせて容易に最適化し得る（上記参照）。
【０１２９】
この核酸検出法の１つの例が図１８に示されている。第１種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体とリポソームとのハイブリダイゼーションにより、検出可能な変化が生じ得る。金ナノ粒子の場合、ピンク／赤色が観察され得るし、ナノ粒子が互いに十分に近接していれば、紫／青色が観察され得る。第２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と第１種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体がハイブリダイズすると、検出可能な変化が生じる。金ナノ粒子の場合、紫／青色が観察されるであろう。これらの変色はいずれも肉眼で観察し得る。
【０１３０】
基板を利用するさらに他の実施態様では、「凝集体プローブ」を用い得る。凝集体プローブは、相補的オリゴヌクレオチド（ａおよびａ′）が付着している２種類のナノ粒子をハイブリダイズさせて（図２８Ａに示されている）コアを形成することにより調製し得る。各種類のナノ粒子には、複数のオリゴヌクレオチドが付着しているので、各種類のナノ粒子は、複数の他の種類のナノ粒子にハイブリダイズし得る。ゆえに、コアは両種類の多数のナノ粒子を含む凝集体である。次いで、コアに、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドが付着している第３種類のナノ粒子でキャップ形成する。第１種類のオリゴヌクレオチドは、検出すべき核酸の一部の配列ｂ′に対して相補的な配列ｂを有している。第２種類のオリゴヌクレオチドは、第３種類のナノ粒子がコアの外側のナノ粒子にハイブリダイズするように配列ａまたはａ′を有している。凝集体プローブは、２つの種類のナノ粒子を利用して調製することもできる（図２８Ｂ参照）。各種類のナノ粒子には、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドが付着している。２つの種類のナノ粒子それぞれの上に存在する第１種類のオリゴヌクレオチドは、検出すべき核酸の一部の配列ｂ′に対して相補的な配列ｂを有している。第１種類のナノ粒子上の第２種類のオリゴヌクレオチドは、２つの種類のナノ粒子が互いにハイブリダイズして凝集体プローブを形成するように第２種類のナノ粒子上の第２種類のオリゴヌクレオチドの配列ａ′に対して相補的な配列ａを有している（図２８Ｂ参照）。各種類のナノ粒子には、複数のオリゴヌクレオチドが付着しているので、各種類のナノ粒子は、複数の他の種類のナノ粒子とハイブリダイズして、両種類の多数のナノ粒子を含む凝集体を形成するであろう。
【０１３１】
凝集体プローブは、基板上で実施される上記の任意のアッセイ形式における核酸の検出にも利用可能であり、それによって、検出可能な変化を得たり増強したりするために個別のナノ粒子層を堆積する必要がなくなる。検出可能な変化をさらにもっと増強するために、２つの種類の凝集体プローブを用いて凝集体プローブ層を堆積することができ、第１種類の凝集体プローブには、他方の種類の凝集体プローブ上のオリゴヌクレオチドと相補的なオリゴヌクレオチドが付着している。特に、凝集体プローブを図２８Ｂに示されているように調製すると、凝集体プローブは、互いにハイブリダイズして多重層を形成し得る。凝集体プローブを利用するいくつかの可能なアッセイ形式が図２８Ｃ−Ｄに示されている。例えば、配列ｃを含む１種類のオリゴヌクレオチドを基板に付着させる（図２８Ｃ参照）。配列ｃは、検出すべき核酸の一部の配列ｃ′と相補的である。標的核酸を加え、基板に付着しているオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた後、凝集体プローブを加え、配列ｂ′を有する標的核酸部分にハイブリダイズさせると、検出可能な変化が生じる。あるいは、先ず、溶液中で標的核酸を凝集体プローブとハイブリダイズさせ、その後、基板上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせてもよいし、標的核酸を凝集体プローブと基板上のオリゴヌクレオチドとに同時にハイブリダイズさせてもよい。別の実施態様では、溶液中で、標的核酸を凝集体プローブおよび別の種類のナノ粒子と反応させる（図２８Ｄ参照）。この追加種類のナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドのなかには、それらが標的核酸の配列ｃ′にハイブリダイズするように配列ｃを有しているものがあるし、この追加種類のナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドのなかには、それらが基板に付着している配列ｄ′を有するオリゴヌクレオチドにのちにハイブリダイズし得るように配列ｄを含んでいるものもある。
【０１３２】
コア自体も核酸検出用のプローブとして用い得る。１つの可能なアッセイ形式が図２８Ｅに示されている。この図に示されているように、配列ｂを含む１種類のオリゴヌクレオチドを基板に付着させる。配列ｂは、検出すべき核酸の一部の配列ｂ′と相補的である。標的核酸を基板と接触させ、基板に付着しているオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。次いで、別の種類のナノ粒子を加える。この追加種類のナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドのなかには、ナノ粒子が基板に結合している標的核酸とハイブリダイズするように標的核酸の配列ｃ′に対して相補的な配列ｃを有するものがある。また、追加種類のナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドのなかには、コアプローブ上の配列ａおよびａ′に対して相補的な配列ａまたはａ′を含むものがある。コアプローブを加え、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。各コアプローブは、コアを含むナノ粒子に付着している配列ａおよびａ′を有しているので、コアプローブは、互いにハイブリダイズして、基板に付着した多重層を形成して、検出可能な変化を大きく増強させることができる。代替実施態様では、標的核酸を基板と接触させる前に溶液中で追加種類のナノ粒子と接触させるか、標的核酸、ナノ粒子、および基板をすべて同時に接触させ得る。さらに別の実施態様では、追加種類のナノ粒子を、配列ｃと配列ａまたはａ′を共に含む連結オリゴヌクレオチドに置き換え得る。
【０１３３】
基板を用いると、複数の初期種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体またはオリゴヌクレオチドを、１つの標的核酸中の複数の部分を検出するため、多数の異なる核酸を検出するため、またはその両方の目的のために、基板にアレイ状に付着させることができる。例えば、１つの基板に、各スポットが標的核酸の一部に結合するように設計された、異なる種類のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体を含む幾列ものスポットを設け得る。１種以上の核酸を含有する試料を各スポットに加え、適切なオリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体、オリゴヌクレオチド−リポソーム共役体、凝集体プローブ、コアプローブおよび結合オリゴヌクレオチドを用いて、上述の方法の１つでアッセイの残りの部分を実施する。
【０１３４】
最後に、基板を用いると、検出可能な変化を生成させたり、銀染色法によって検出可能な変化を強化したりことができる。銀染色法は、銀の還元を触媒する任意の種類のナノ粒子と共に用い得る。好ましいのは、貴金属（例えば、金および銀）製ナノ粒子である。Ｂａｓｓｅｌｌら，Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，第１２６巻，８６３−８７６ページ（１９９４年）；Ｂｒａｕｎ−Ｈｏｗｌａｎｄら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第１３巻，９２８−９３１ページ（１９９２年）参照。核酸の検出に用いられているナノ粒子が銀の還元を触媒しない場合、還元を触媒させるために、銀イオンと核酸との複合体を形成させ得る。Ｂｒａｕｎら，Ｎａｔｕｒｅ，第３９１巻，７７５ページ（１９９８年）参照。また、核酸上のリン酸基と反応し得る銀染料は公知である。
【０１３５】
銀染色法を用いて、上述のものを含めた基板上で実施される任意のアッセイにおける検出可能な変化を生成または増強することができる。特に、銀染色法は、図２５Ａに示されているものなどの単１種類のナノ粒子を用いるアッセイの感度を著しく増強させることが判明しており、そのために、ナノ粒子層、凝集体ブローブおよびコアプローブを使わなくてすむことが多い。
【０１３６】
基板上で実施される核酸検出アッセイにおいて、検出可能な変化は、光学式スキャナを用いて観察し得る。適当なスキャナには、反射モードで操作し得るコンピュータに文書をスキャンするのに用いられるもの（例えば、平台型スキャナ）、この機能を果たし得るか、または同種類の光学を利用する他のデバイス、任意の種類のグレースケール感受性測定デバイス、および本発明にしたがって基板をスキャンするように改変された標準型スキャナ（例えば、基板用容器を含むように改変された平台型スキャナ）（現在までのところ、透過モードで操作するスキャナを用いるのは不可能であることが判明している）が含まれる。スキャナの解像度は、基板上の反応領域をスキャナの１ピクセルより大きくするのに十分大きくなければならない。スキャナは、任意の基板と共に用い得るが、但し、アッセイによって生じた検出可能な変化は、基板を背景にして観察しなければならない（例えば、銀染色法によって生成したようなグレースポットは、白を背景にすると観察し得るが、灰色を背景にすると観察できない）。スキャナは、白黒スキャナでもよいが、カラースキャナが好ましい。スキャナは、文書をコンピュータにスキャンするのに使用されるタイプの標準型カラースキャナが最も好ましい。そのようなスキャナは安価であり、容易に購入し得る。例えば、Ｅｐｓｏｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　６３６（６００×６００ｄｐｉ）、ＵＭＡＸ　Ａｓｔｒａ　１２００（３００×３００ｄｐｉ）、またはＭｉｃｒｏｔｅｃ　１６００（１６００×１６００ｄｐｉ）を用い得る。スキャナは、基板をスキャンして得た画像をプロセスするためのソフトウエアをロードしたコンピュータにつなぐ。ソフトウエアは、容易に購入し得る、Ａｄｏｂｅ　Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ　５．１およびＣｏｒｅｌ　Ｐｈｏｔｏｐａｉｎｔ　８．０などの標準ソフトウエアであってよい。グレースケール測定値計算ソフトウエアを用いることにより、アッセイ結果の定量手段が得られる。このソフトウエアで、カラースポットの色数を得ることもできるし、核酸の存在、核酸の量、またはその両方を定量するために観察することができるスキャン画像（例えば、プリントアウト）を生成することができる。また、実施例５に記載したようなアッセイを初めとするアッセイの感度は、陰性結果を表す色（実施例５では赤色）を陽性結果を表す色（実施例５では青色）から減色して改良することができる。コンピュータは、容易に購入し得る標準パーソナルコンピュータであってよい。このように、標準ソフトウエアがロードされている標準コンピュータにつないだ標準スキャナを用いることにより、アッセイを基板上で実施する際に核酸を検出かつ定量する便利かつ容易で安価な手段が得られる。スキャン画像および計算結果は、その後の参照および使用のために結果の記録を維持するべくコンピュータに記憶させることができる。もちろん、所望の場合には、より精密な機器やソフトウエアを使用することが可能である。
【０１３７】
任意の核酸用アッセイに用い得るナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体が、図１７Ｄ−Ｅに示されている。この「万能プローブ」（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｐｒｏｂｅ）には、単一配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。これらのオリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの部分を含む配列を有する結合オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし得る。第１部分は、ナノ粒子上の少なくとも一部の配列と相補的である。第２部分は、検出すべき核酸の一部の配列と相補的である。同一の第１部分と異なる第２部分を有する複数の結合オリゴヌクレオチドを用いることができ、その場合、「万能プローブ」は、結合オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした後、検出すべき核酸の多重部分または異なる核酸標的に結合し得る。
【０１３８】
本発明の他の多くの実施態様において、検出可能な変化は、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子、またはその両方を、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと標的核酸とがハイブリダイズすると検出可能な変化を生成する分子（例えば、蛍光分子および染料）で標識することにより生じる。例えば、金属および半導体ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドの、ナノ粒子に付着していない末端には、蛍光分子が付着され得る。金属および半導体ナノ粒子は、公知の蛍光消光物質であり、その消光効果の大きさは、ナノ粒子と蛍光分子との間隔に依存する。ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズしていない状態では、ナノ粒子と相互作用し、その結果、有意な消光が観察される。蛍光分子は、標的核酸とハイブリダイズすると、ナノ粒子から間隔が離れた状態になり、それによって、蛍光の消光が減少する。図２０Ａ参照。オリゴヌクレオチドが長くなるにつれ、少なくとも変化の増大がもはや観察し得ない程遠くに蛍光基がナノ粒子表面から離れて移動するまで、蛍光の変化は大きくなる筈である。オリゴヌクレオチドの有用な長さは経験的に決定し得る。蛍光標識オリゴヌクレオチドが付着している金属および半導体ナノ粒子は、溶液中または基板上で実施されるものを含めた上述のいずれのアッセイ形式にも用い得る。
【０１３９】
オリゴヌクレオチドを蛍光分子で標識する方法および蛍光を測定する方法は当該技術分野では周知である。適当な蛍光分子も当該技術分野では周知であり、それにはフルオレセイン、ローダミンおよびテキサスレッドが含まれる。オリゴヌクレオチドは上述のようにナノ粒子に付着するであろう。
【０１４０】
さらに別の実施態様においては、２つの異なる粒子に付着している２つの種類の蛍光標識オリゴヌクレオチドを用い得る。適当な粒子としては、（ポリスチレン粒子、ポリビニル粒子、アクリレートおよびメタクリレート粒子などの）ポリマー粒子、ガラス粒子、ラテックス粒子、セファロースビーズおよび当該技術分野では周知の他の同様な粒子が挙げられる。そのような粒子にオリゴヌクレオチドを付着させる方法は当該技術分野では周知である。Ｃｈｒｉｓｅｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第２４巻，３０３１−３０３９ページ（１９９６年）（ガラス）およびＣｈａｒｒｅｙｒｅら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第１３巻，３１０３−３１１０ページ（１９９７年），Ｆａｈｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第２１巻，１８１９−１８２６ページ（１９９３年），Ｅｌａｉｓｓａｒｉら，Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　Ｓｃｉ．，第２０２巻，２５１−２６０ページ（１９９８年），Ｋｏｌａｒｏｖａら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第２０巻，１９６−１９８ページ（１９９６年）およびＷｏｌｆら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第１５巻，２９１１−２９２６ページ（１９８７年）（ポリマー／ラテックス）参照。特に、多様な官能基がこれらの粒子上に対して利用可能であり、そのような粒子に組み込むことができる。官能基には、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基などがある。金属および半導体ナノ粒子を含めたナノ粒子を用いてもよい。
【０１４１】
２種の発蛍光団は、供与体および受容体としてｄおよびａと称される。そのような組合せに有用な種々の蛍光分子は当該技術分野では周知であり、例えば、モレキュラー・プローブス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）から入手できる。魅力的な組合せは、供与体としてのフルオレセインと、受容体としてのテキサスレッドである。ｄおよびａが付着している２つの種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を標的核酸と混合し、蛍光光度計で蛍光を測定する。ｄを励起する波長の光で混合物を励起させ、混合物をａ由来の蛍光についてモニターする。ハイブリダイズすると、ｄとａは近接するであろう（図２０Ｂ参照）。非金属、非半導体粒子の場合、ハイブリダイゼーションは、蛍光がｄのものからａのものにシフトすること、またはａの蛍光に加えてｄの蛍光が出現することによって示されるであろう。ハイブリダイゼーションがない場合、発蛍光団は離れ過ぎていて有意なエネルギー伝達が起こらず、ｄの蛍光のみが観察されるであろう。金属および半導体ナノ粒子の場合、ハイブリダイゼーションの欠如は、ｄまたはａに帰因する消光による蛍光の欠如によって示されるであろう（上記参照）。ハイブリダイゼーションはａに帰因する蛍光の増大により示される。
【０１４２】
受容体および供与体蛍光分子で標識されたオリゴヌクレオチドが付着している上述の粒子およびナノ粒子は、溶液中および基板上で実施されるものを含めた上述のアッセイ形式に使用し得る。溶液形式の場合、オリゴヌクレオチド配列は、図１５Ａ−Ｇに示されているように標的核酸に結合するように好ましくは選択する。図１３Ａ−Ｂおよび図１８に示されている形式では、結合オリゴヌクレオチドを使って、２つのナノ粒子上の受容体および供与体蛍光分子を近接させ得る。また、図１３Ａに示されている形式では、基板に付着しているオリゴヌクレオチドはｄで標識し得る。さらに、蛍光分子以外の他の標識、例えば、ハイブリダイズすると検出可能なシグナルを生成するかまたは検出可能なシグナルに変化をもたらす化学発光分子を用いてもよい。
【０１４３】
本発明の検出法の別の実施態様は、（図２１に示されている）蛍光および変色の検出を利用する極めて感度の高い系である。この系は、蛍光分子で標識したオリゴヌクレオチドを付着させたラテックスミクロスフェアと、オリゴヌクレオチドを付着させた金ナノ粒子とを用いる。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体は、上述のように調製し得る。オリゴヌクレオチドをラテックスミクロスフェアに付着させる方法（例えば、Ｃｈａｒｒｅｙｒｅら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第１３巻，３１０３−３１１０ページ（１９９７年）；Ｅｌａｉｓｓａｒｉら，Ｊ．Ｃｌｌｏｉｏｄ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　Ｓｃｉ．，第２０２巻，２５１−２６０ページ（１９９８年）参照）は、オリゴヌクレオチドを蛍光分子で標識する方法（上記参照）と同様に周知である。ラテックスミクロスフェア上のオリゴヌクレオチドと金ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、標的核酸の配列の異なる部分とハイブリダイズし得るが互いにはハイブリダイズし得ない配列を有している。ラテックスミクロスフェアおよび金ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に対して相補的な配列を含む標的核酸と２つのプローブを接触させると、網目構造が形成される（図２１参照）。金ナノ粒子の消光特性のために、ラテックスミクロスフェアに付着しているオリゴヌクレオチドの蛍光は、この網目構造の一部の間で消光される。実際、金ナノ粒子は極めて大きい吸収係数を有しているために、１つの金ナノ粒子が多くの発蛍光団分子を消光し得る。したがって、核酸および２種の粒子を含有する溶液の蛍光をモニターして結果を検出することが可能であり、蛍光の減少または排除は陽性結果を示す。しかし、アッセイ結果は、溶液の小滴を微孔質材料上に並べて検出するのが好ましい（図２１参照）。微孔質材料は、金ナノ粒子のピンク／赤色を検出できる透明またはカラー（例えば、白）でなければならない。また、微孔質材料は、微孔質材料を洗浄したときに、金ナノ粒子が細孔を通過し得る程大きく、かつ微孔質材料表面上のラテックスミクロスフェアを保持するのに十分な程小さい細孔サイズをも有していなければならない。したがって、そのような微孔質材料を用いる場合、ラテックスミクロスフェアのサイズ（直径）は、金ナノ粒子のサイズ（直径）より大きくなければならない。また、微孔質材料は生物媒体に対して不活性でなければならない。多くの適当な微孔質材料は当該技術分野では公知であり、そのような材料としては、種々のフィルターや膜、例えば、改質ポリフッ化ビニリデン（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ．）から市販されているＤｕｒａｐｏｒｅＴＭメンブレンフィルターなどのＰＶＤＦ）や、（ミクロン・セパレーションズ社（Ｍｉｃｒｏｎ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　Ｉｎｃ．）から市販されているＡｃｅｔａｔｅＰｌｕｓＴＭメンブレンフィルターなどの）純粋酢酸セルロースが挙げられる。そのような微孔質材料は、標的核酸と２種のプローブからなる網目構造を保持し、陽性結果（標的核酸の存在）は、（金ナノ粒子の存在に帰する）赤／ピンク色と、（金ナノ粒子による蛍光の消光に帰する）蛍光の欠如によって証明される（図２１参照）。陰性結果（標的核酸の不在）は、微孔質材料を洗浄したときに金ナノ粒子が微孔質材料の細孔を通過し（したがって、蛍光の消光が起こらない）、かつ白色ラテックスミクロスフェアがその上に捕捉されるために、白色および蛍光によって証明される（図２１参照）。さらに、陽性結果の場合、蛍光および変色は温度の関数として観察し得る。例えば、温度を上昇させて行くと、デハイブリダイゼーション温度に達すると同時に蛍光が観察されるであろう。したがって、温度の関数として色または蛍光を見れば、オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸との相補性の程度についての情報を得ることができる。上述のように、この検出法は高感度を示す。長さ２４塩基の３ｆｍｏｌ（フェムトモル）の一本鎖標的核酸と、長さ２４塩基の２０ｆｍｏｌの二本鎖標的核酸という少量が、肉眼で検出された。この方法は、その使用法も極めて簡単である。蛍光は、ただＵＶランプで溶液または微孔質材料を照明するだけで生成させることができ、蛍光シグナルおよび比色シグナルは肉眼でモニターし得る。代わりに、より定量的な結果を得るために、蛍光光度計を前面モード（ｆｒｏｎｔ−ｆａｃｅ　ｍｏｄｅ）を用いて、短経路長で溶液の蛍光を測定してもよい。
【０１４４】
上記実施態様は、特に、ラテックスミクロスフェアおよび金ナノ粒子に関連して説明した。これらの粒子の代わりに、上述の他の特性を有すると共にオリゴヌクレオチドを付着させ得る任意の他のミクロスフェアまたはナノ粒子を用いてもよい。多くの適当な粒子およびナノ粒子が、それらにオリゴヌクレオチドを付着させる方法と共に上述されている。さらに、他の測定可能な特性を有するミクロスフェアおよびナノ粒子も用い得る。例えば、ポリマーを蛍光、色または電気化学的活性などの任意の所望特性を有するように改質し得るポリマー改質粒子およびナノ粒子を用いてもよい。Ｗａｔｓｏｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１２１巻，４６２−４６３ページ（１９９９年）（ポリマー改質金ナノ粒子）。また、磁性粒子、ポリマーコート磁性粒子、および半導体粒子も使用し得る。Ｃｈａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２８１巻，２０１６ページ（１９９８年）；Ｂｒｕｃｈｅｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２８１巻，２０１３ページ（１９９８年）；Ｋｏｌａｒｏｖａら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第２０巻，１９６−１９８ページ（１９９６年）参照。
【０１４５】
さらに別の実施態様において、蛍光分子で標識したオリゴヌクレオチドが付着している金属または半導体ナノ粒子を含む２つのプローブを用いる（図２２に示されている）。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体は、上述のように調製しかつ蛍光分子で標識し得る。２つの種類のオリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体上のオリゴヌクレオチドは、標的核酸の配列の異なる部分とハイブリダイズし得るが互いにはハイブリダイズし得ない配列を有している。ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に対して相補的な配列を含む標的核酸を２つのプローブと接触させると、網目構造が形成される（図２２参照）。金属または半導体ナノ粒子の消光特性のために、ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドの蛍光は、この網目構造の一部の間で消光される。したがって、核酸および２つのプローブを含有する溶液の蛍光をモニターして結果を検出することが可能であり、蛍光の減少または排除は陽性結果を示す。しかし、アッセイ結果は、溶液の小滴を微孔質材料上に並べて検出するのが好ましい（図２２参照）。微孔質材料は、洗浄したときに、ナノ粒子がその細孔を通過し得る程大きくかつその表面上に網目構造を保持するのに十分な程小さい細孔サイズを有していなければならない（図２２参照）。多くの適当な微孔質材料が当該技術分野では公知であり、そのような材料には上述のものが含まれる。そのような微孔質材料は、標的核酸と２つのプローブとからなる網目構造を保持し、陽性結果（標的核酸の存在）は、（金属または半導体ナノ粒子による蛍光の消光に起因する）蛍光の欠如によって証明される（図２２参照）。陰性結果（標的核酸の不在）は、微孔質材料を洗浄したときにナノ粒子が微孔質材料の細孔を通過する（したがって、蛍光の消光が起こらない）ために、蛍光によって証明される（図２２参照）。結合しなかったプローブが検出領域から洗い流されるので、バックグラウンド蛍光は低い。さらに、陽性結果の場合、蛍光の変化は温度の関数として観察され得る。例えば、温度を上昇させて行くと、デハイブリダイゼーション温度に達すると同時に蛍光が観察されるであろう。したがって、温度の関数として蛍光を見れば、オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸との相補性度についての情報を得ることができる。蛍光は、ＵＶランプで溶液または微孔質材料を照明するだけで生成させることができ、蛍光シグナルは肉眼でモニターし得る。代わりに、より定量的な結果を得るために、蛍光光度計を前面モードで用いて、短経路長で溶液の蛍光を測定してもよい。
【０１４６】
さらに別の実施態様では、「サテライトプローブ」を用いる（図２４参照）。サテライトプローブは、核酸用アッセイにおける検出に用い得る１種または数種の物性（例えば、濃色、蛍光消光能、磁性）を有する中心粒子を含んでいる。適当な粒子としては、ナノ粒子や上述の他の粒子などがある。粒子には、オリゴヌクレオチド（すべて同じ配列を有する）が付着している（図２４参照）。粒子にオリゴヌクレオチドを付着させる方法は上記に説明されている。オリゴヌクレオチドは、少なくとも第１部分と第２部分を含んでおり、これらの部分はどちらも標的核酸の配列の部分と相補的である（図２４参照）。サテライトプローブはさらに、プローブオリゴヌクレオチドを含んでいる。各プローブオリゴヌクレオチドは、少なくとも第１部分と第２部分を有している（図２４参照）。プローブオリゴヌクレオチドの第１部分の配列は、中心粒子上に固定化されているオリゴヌクレオチドの第１部分の配列と相補的である（図２４参照）。その結果、中心粒子とプローブオリゴヌクレオチドとを接触させると、中心粒子上のオリゴヌクレオチドは、プローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしてサテライトプローブを形成する（図２４参照）。プローブオリゴヌクレオチドの第１および第２部分は共に、標的核酸の配列の部分と相補的である（図２４参照）。各プローブオリゴヌクレオチドは、以下に詳細に説明するように、レポーター分子で標識されている（図２４参照）。プローブオリゴヌクレオチドと標的との間のハイブリダイゼーションオーバーラップの量（ハイブリダイズしている部分の長さ）は、プローブオリゴヌクレオチドと粒子に付着しているオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションオーバーラップと同じかそれより大きい（図２４参照）。したがって、デハイブリダイゼーションおよびリハイブリダイゼーションをもたらす温度循環により、プローブオリゴヌクレオチドの中心粒子から標的への移動が促進される。次いで、標的にハイブリダイズしたプローブオリゴヌクレオチドから粒子を分離し、レポーター分子を検出する。
【０１４７】
サテライトプローブは種々の検出法に用い得る。例えば、中心粒子が磁性コアを有し、かつ周囲のプローブオリゴヌクレオチドに付着している発蛍光団の蛍光を消光し得る材料で被覆されている場合、この系は、核酸用のｉｎ　ｓｉｔｕ蛍光光度検出計画に用い得る。官能化ポリマーコート磁性粒子（Ｆｅ３Ｏ４）は、ディナール社（Ｄｙｎａｌ）（ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ）およびバングス・ラボラトリーズ社（Ｂａｎｇｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ＥｓｔａｐｏｒＴＭ）を含めたいくつかの調製業者から入手可能であり、シリカコート磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子は、十分に開発されたシリカ表面化学（Ｃｈｒｉｓｅｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第２４巻，３０３１−３０３９ページ（１９９６年））を用いて改質し（Ｌｉｕら，Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．，第１０巻，３９３６−３９４０ページ（１９９８年）、磁性プローブとしても用い得る。さらに、染料分子、４−（（４−（ジメチルアミノ）フェニル）−アゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）は、オリゴヌクレオチドに付加された多様な発蛍光団に対して有能な蛍光消光物質であることが証明されている（Ｔｙａｇｉら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．，第１６巻，４９−５３ページ（１９９８年））。市販のＤＡＢＣＹＬスクシンイミジルエステル（分子プローブ）は、第一級アルキルアミノ基と反応すると極めて安定なアミド結合を形成する。このように、任意の磁性粒子または第一級アルキルアミノ基でポリマーコートされた磁性粒子は、両オリゴヌクレオチドに加えてこれらの消光物質分子を用いて改質し得る。あるいは、ＤＡＢＣＹＬ消光物質は、アルキルアミノ改質表面の代わりに、表面結合オリゴヌクレオチドに直接付着させてもよい。プローブオリゴヌクレオチドを含むサテライトプローブを標的と接触させる。デハイブリダイゼーションおよび再ハイブリダイゼーションを起こすように温度を循環させ、それによって、プローブオリゴヌクレオチドを中心粒子から標的に移動させる。磁場を印加、粒子を溶液から除去し、標的にハイブリダイズした溶液中に残留するプローブオリゴヌクレオチドの蛍光を測定することにより検出が達成される。
【０１４８】
この方法は、染料コーティングを有する磁性粒子と共に、磁気ナノ粒子上の染料とは異なる光学特性を有するか、または磁気ナノ粒子上の染料の光学特性を摂動させる染料で標識したプローブオリゴヌクレオチドを用いて比色アッセイにも応用することができる。粒子およびプローブオリゴヌクレオチドが共に溶液中に存在する場合、この溶液は、２種の染料の組合せに由来する１つの色を呈するであろう。しかし、標的核酸の存在下に温度を循環させると、プローブオリゴヌクレオチドは、サテライトプローブから標的に移動するであろう。一旦これが起こると、磁場の印加により、標的にハイブリダイズした、単一染料で標識されたプローブオリゴヌクレオチドを残して、染料コート磁性粒子が溶液から除去される。この系は、標的レベルまたは色の濃さに応じて、比色計または肉眼で追うことができる。
【０１４９】
また、この方法は、オリゴヌクレオチド−磁性粒子共役体と共に、レドックス活性分子が付着しているプローブオリゴヌクレオチドを用いることにより、電気化学アッセイにも応用することもできる。十分に研究が進んだレドックス活性フェロセン誘導体などの任意の改質可能なレドックス活性種を用い得る。標準ホスホロアミダイト化学を用いて、フェロセン誘導体化ホスホロアミダイトを直接オリゴヌクレオチドに付着させることができる。Ｍｕｃｉｃら，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，第５５５巻（１９９６年）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，第１版，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９１年）。フェロセニルホスホロアミダイトは、６−ブロモヘキシルフェロセンから２段階合成法で調製する。通常の調製においては、６−ブロモヘキシルフェロセンを水性ＨＭＰＡ溶液中１２０℃で６時間攪拌して、６−ヒドロキシヘキシルフェロセンを生成する。精製後、６−ヒドロキシヘキシルフェロセンをＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンおよびβ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミドのＴＨＦ溶液に加えてフェロセニルホスホロアミダイトを生成する。ポリマーが電気化学活性フェロセン分子を含有するオリゴヌクレオチド改質ポリマーコート金ナノ粒子を利用してもよい。Ｗａｔｓｏｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１２１巻，４６２−４６３ページ（１９９９年）。アミノ修飾オリゴヌクレオチドと反応させるために、このポリマーにアミノ反応性部位のコポリマー（例えば、無水物）を組み込んでもよい。Ｍｏｌｌｅｒら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．，第６巻，１７４−１７８ページ（１９９５年）。標的の存在下に温度を循環させると、レドックス活性プローブオリゴヌクレオチドは、サテライトプローブから標的に移動するであろう。一旦これが起こると、磁場の印加により、標的核酸にハイブリダイズしたレドックス活性プローブオリゴヌクレオチドを残して、磁性粒子が溶液から除去されるであろう。次いで、レッドクス活性分子を調べることができるサイクリックボルタンメトリーまたは任意の電気化学的技術により標的の量を定量し得る。
【０１５０】
本発明のさらに別の実施態様において、核酸は、核酸とオリゴヌクレオチドが付着している基板とを接触させて検出する。オリゴヌクレオチドは、核酸の第１部分の配列に対して相補的な配列を有している。オリゴヌクレオチドは、基板上に配置されている１対の電極間に配置されている。基板は、導電体ではない材料（例えば、ガラス、石英、ポリマー、プラスチック）製でなければならない。電極は、任意の標準材料（例えば、金、白金、酸化スズなどの金属）製であってよい。電極は、慣用のミクロファブリケーション技術を用いて作製することができる。例えば、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｏ　Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ（Ｌ．Ｆ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎら編，ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８３年）参照。基板の上には、単一の核酸の多重部分、複数の異なる核酸、またはその両方を検出できるように複数の電極対をアレイ状に配置し得る。電極アレイは、（例えば、アブテック・サイエンティフィック社、バージニア州リッチモンド所在（Ａｂｂｔｅｃｈ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から）購入することもできるし、慣用のミクロファブリケーション技術を用いて作製することもできる。例えば、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｏ　Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ（Ｌ．Ｆ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎら編，ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９８３年）参照。アレイを作製するのに適したフォトマスクは、（例えば、フォトロニクス社、カリフォルニア州ミルピタス所在（Ｐｈｏｔｒｏｎｉｃｓ，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡ）から）購入し得る。各アレイ電極対は、２つの電極間で基板に付着したある種類のオリゴヌクレオチドを有している。接触ステップは、基板上のオリゴヌクレオチドと核酸とをハイブリダイズさせるのに有効な条件下に行う。次いで、基板に結合した核酸をある種類のナノ粒子と接触させる。ナノ粒子は導電性でなければならない。そのようなナノ粒子としては、金ナノ粒子のように金属でできたナノ粒子や、半導体材料製でできたナノ粒子が含まれる。ナノ粒子には、少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドが核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有する、１つ以上の種類のオリゴヌクレオチドが付着しているであろう。接触ステップは、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸とをハイブリダイズさせるのに有効な条件下に行う。核酸が存在する場合、電極間の回路は、ナノ粒子が基板の電極間に付着するために閉鎖するはずであり、導電率の変化が検出される。１種類のナノ粒子が結合すると、回路の閉鎖は起こらず、この状況は、もっと狭い電極間間隔を用いるか、もっと大きいナノ粒子を用いるか、または回路を閉鎖する別の材料を用いる（但し、ナノ粒子が基板の電極間に結合した場合のみ）ことにより対応し得る。例えば、金ナノ粒子を用いる場合、基板を（上述のように）銀染料と接触させて銀を電極間に堆積させることにより回路を閉鎖し、導電率の検出可能な変化を生成させる。１種類のナノ粒子の付加が十分ではない場合に回路を閉鎖させる別の方法は、基板に結合している第１種類のナノ粒子を、第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している第２種類のナノ粒子と接触させる方法である。接触ステップは、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるのに有効な条件下に行う。必要または所望なら、回路の閉鎖に十分な数のナノ粒子が基板に付着するまで、第１および第２種類のナノ粒子を交互に加えて、追加のナノ粒子層を堆積することができる。個々のナノ粒子を堆積する別の代替法は、凝集体プローブの使用である（上記参照）。
【０１５１】
本発明はさらに、核酸を検出するためのキットも提供する。キットは、１つの実施態様において、少なくとも１つの容器を含み、この容器は、オリゴヌクレオチドが付着している少なくとも２種類のナノ粒子を保持している。第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、核酸の第１部分の配列に対して相補的な配列を有している。第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有している。容器はさらに、核酸の第３部分に対して相補的な配列を有するフィラーオリゴヌクレオチドを含むこともあり、この第３部分は、第１部分と第２部分の間に配置されている。フィラーオリゴヌクレオチドは別個の容器中に入れておいてもよい。
【０１５２】
第２の実施態様において、キットは少なくとも２つの容器を含む。第１容器は、核酸の第１部分の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を保持している。第２容器は、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を保持している。キットはさらに、核酸の第３部分に対して相補的な配列を有するフィラーオリゴヌクレオチドが入った第３容器を含むこともあり、第３部分は第１部分と第２部分の間に配置されている。
【０１５３】
別の代替実施態様において、キットは、別々の容器に入ったオリゴヌクレオチドとナノ粒子を有し、オリゴヌクレオチドは核酸検出アッセイの実施前にナノ粒子に付着させる必要がある。オリゴヌクレオチドおよび／またはナノ粒子は、オリゴヌクレオチドがナノ粒子に付着し得るように官能化させ得る。あるいは、オリゴヌクレオチドおよび／またはナノ粒子は、キット中に官能基を有さない状態で供給してもよいが、その場合、オリゴヌクレオチドはアッセイの実施前に官能化しなければならない。
【０１５４】
別の実施態様において、キットは、少なくとも１つの容器を含む。容器は、オリゴヌクレオチドが付着している金属または半導体ナノ粒子を保持している。オリゴヌクレオチドは核酸の一部に対して相補的な配列を有しており、オリゴヌクレオチドのナノ粒子には付着していない末端には蛍光分子が付着している。
【０１５５】
さらに別の実施態様において、キットは基板を含み、基板にはナノ粒子が付着している。ナノ粒子には、核酸の第１部分の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。キットはさらに、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子が入った第１容器を含んでいる。オリゴヌクレオチドは、同一または異なる配列を有していてよいが、各オリゴヌクレオチドは、核酸の一部に対して相補的な配列を有している。キットはさらに、少なくとも２つの部分を含む選択された配列を有する結合オリゴヌクレオチドが入った第２容器を含んでおり、選択配列の第１部分は、第１容器中のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部と相補的である。また、キットは、結合オリゴヌクレオチドの第２部分の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子が入った第３容器を含む。
【０１５６】
別の実施態様において、キットは、核酸の第１部分の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している基板を含んでいる。キットはさらに、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子が入った第１容器を含んでいる。オリゴヌクレオチドは、同一または異なる配列を有していてよいが、各オリゴヌクレオチドは核酸の一部に対して相補的な配列を有している。キットはさらに、第１容器中のナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子が入った第２容器を含んでいる。
【０１５７】
さらに別の実施態様において、キットは、別々の容器に入った基板、オリゴヌクレオチドおよびナノ粒子を有していてよい。基板、オリゴヌクレオチドおよびナノ粒子は、核酸検出アッセイを実施する前に互いに適切に付着させなければならない。基板、オリゴヌクレオチドおよび／またはナノ粒子は、この付着を促進するために官能化し得る。あるいは、基板、オリゴヌクレオチドおよび／またはナノ粒子は、キット中に官能基を有さない状態で提供してもよいが、その場合、アッセイ実施前に官能化しなければならない。
【０１５８】
さらなる実施態様において、キットは、核酸の第１部分の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している基板を含んでいる。また、キットは、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着しているリポソームが入った第１容器と、少なくとも第１種類のオリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子が入った第２容器を含んでおり、第１種類のオリゴヌクレオチドのナノ粒子に付着していない末端には、ナノ粒子が疎水性相互作用によりリポソームに付着し得るように、コレステリル基が付着されている。キットは、さらに、オリゴヌクレオチドが付着している第２種類のナノ粒子が入った第３容器を含んでおり、オリゴヌクレオチドは第１種類のナノ粒子に付着している第２種類のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部に対して相補的な配列を有している。第１種類のナノ粒子に付着している第２種類のオリゴヌクレオチドは、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に対して相補的な配列を有している。
【０１５９】
別の実施態様において、キットは、ナノ粒子が付着している基板を含み得る。ナノ粒子には、核酸の第１部分の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。キットはさらに、凝集体プローブが入った第１容器を含んでいる。凝集したプローブは、オリゴヌクレオチドが付着している少なくとも２種類のナノ粒子を含んでいる。凝集体プローブのナノ粒子は、それぞれに付着しているオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合している。凝集体プローブの少なくとも１種類のナノ粒子には、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。
【０１６０】
さらに別の実施態様において、キットは、オリゴヌクレオチドが付着している基板を含み得る。オリゴヌクレオチドは、核酸の第１部分の配列に対して相補的な配列を有している。キットはさらに、凝集体プローブが入った第１容器を含んでいる。凝集体プローブは、オリゴヌクレオチドが付着している少なくとも２種類のナノ粒子を含んでいる。凝集体プローブのナノ粒子は、それぞれに付着しているオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合している。凝集体プローブの少なくとも１種類のナノ粒子には、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。
【０１６１】
追加実施態様において、キットは、オリゴヌクレオチドが付着している基板と、凝集体プローブが入った第１容器とを含んでいる。凝集体プローブは、オリゴヌクレオチドが付着している少なくとも２種類のナノ粒子を含んでいる。凝集体プローブのナノ粒子は、それぞれに付着しているオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合している。凝集体プローブの少なくとも１種類のナノ粒子には、核酸配列の第１部分に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。キットはさらに、ナノ粒子が入った第２容器を含んでいる。ナノ粒子には、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドが付着している。第１種類のオリゴヌクレオチドは、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有している。第２種類のオリゴヌクレオチドは、基板に付着しているオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部に対して相補的な配列を有している。
【０１６２】
別の実施態様において、キットは、オリゴヌクレオチドが付着している基板を含んでいる。オリゴヌクレオチドは、核酸の第１部分の配列に対して相補的な配列を有している。キットはさらに、オリゴヌクレオチドが付着しているリポソームが入った第１容器を含んでいる。オリゴヌクレオチドは、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有している。キットはさらに、オリゴヌクレオチドが付着している少なくとも２種類のナノ粒子を含む凝集体プローブが入った第２容器を含んでいる。凝集体プローブのナノ粒子は、それぞれに付着しているオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合している。凝集体プローブの少なくとも１種類のナノ粒子には、ナノ粒子に付着していない末端に疎水基が付いたオリゴヌクレオチドが付着している。
【０１６３】
さらなる実施態様において、キットは、オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子が入った第１容器を含み得る。キットはさらに、１つ以上の追加の容器を含んでおり、各容器は、結合オリゴヌクレオチドを保持している。各結合オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部に対して相補的な配列を有する第１部分と、検出すべき核酸の一部の配列に対して相補的な配列を有する第２部分とを有している。結合オリゴヌクレオチドの第２部分の配列は、各配列が検出すべき核酸の配列の一部と相補的である限り異なっていてもよい。別の実施態様において、キットは、オリゴヌクレオチドが付着している１つの種類のナノ粒子と、１つ以上の種類の結合オリゴヌクレオチドとが入った容器を含んでいる。各種類の結合オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの部分を含む配列を有している。第１部分は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列と相補的であり、それによって結合オリゴヌクレオチドは、容器中のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする。第２部分は、核酸の一部の配列と相補的である。
【０１６４】
別の実施態様において、キットは、２つの種類の粒子が入った１つ以上の容器を含み得る。第１種類の粒子には、核酸の第１部分の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。オリゴヌクレオチドの粒子に付着していない方の末端はエネルギー供与体で標識されている。第２種類の粒子には、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。オリゴヌクレオチドの粒子に付着していない方の末端はエネルギー受容体で標識されている。エネルギー供与体および受容体は蛍光分子であってよい。
【０１６５】
さらなる実施態様において、キットは、オリゴヌクレオチドが付着しているある種類のラテックスミクロスフェアが入った第１容器を含んでいる。オリゴヌクレオチドは、核酸の第１部分の配列に対して相補的な配列を有しており、蛍光分子で標識されている。キットはさらに、オリゴヌクレオチドが付着しているある種類の金ナノ粒子が入った第２容器を含んでいる。これらのオリゴヌクレオチドは、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有している。
【０１６６】
別の実施態様において、キットは、オリゴヌクレオチドが付着している第１種類の金属または半導体ナノ粒子が入った第１容器を含んでいる。オリゴヌクレオチドは、核酸の配列の第１部分に対して相補的な配列を有し、蛍光分子で標識されている。キットはさらに、オリゴヌクレオチドが付着している第２種類の金属または半導体ナノ粒子が入った第２容器を含んでいる。これらのオリゴヌクレオチドは、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有しており、蛍光分子で標識されている。
【０１６７】
さらなる実施態様において、キットは、サテライトプローブが入った容器を含んでいる。サテライトプローブは、オリゴヌクレオチドが付着している粒子を含んでいる。オリゴヌクレオチドは第１部分と第２部分を有しており、どちらの部分も核酸の配列の一部に対して相補的な配列を有している。サテライトプローブはさらに、ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたプローブオリゴヌクレオチドを含んでいる。プローブオリゴヌクレオチドは第１部分と第２部分を有している。第１部分は、ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドの第１部分の配列に対して相補的な配列を有しており、両部分とも、核酸の配列の一部に対して相補的な配列を有している。また、プローブオリゴヌクレオチドの一方の末端には、レポーター分子が付着している。
【０１６８】
別の実施態様において、キットは、凝集体プローブが入った容器を含んでいる。凝集体プローブは、オリゴヌクレオチドが付着している少なくとも２種類のナノ粒子を含んでいる。凝集体プローブのナノ粒子は、それぞれに付着しているオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合している。凝集体プローブの少なくとも１種類のナノ粒子には、核酸の配列の一部に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。
【０１６９】
追加実施態様において、キットは、凝集体プローブが入った容器を含み得る。凝集体プローブは、オリゴヌクレオチドが付着している少なくとも２種類のナノ粒子を含んでいる。凝集体プローブのナノ粒子は、それぞれに付着しているオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合している。凝集体プローブの少なくとも１種類のナノ粒子には、ナノ粒子に付着していない方の末端に疎水基が付いたオリゴヌクレオチドが付着している。
【０１７０】
さらに別の実施態様において、本発明は、基板の電極間にオリゴヌクレオチドが付着された、少なくとも１対の電極が配置されている基板を含む。好ましい実施態様において、基板には、単一核酸の複数の部分の検出、複数の異なる核酸の検出またはその両方を可能にするように、複数の電極対がアレイ状に付着されている。
【０１７１】
キットはさらに、核酸の検出に有用な他の試薬および品目を含み得る。試薬には、ＰＣＲ試薬、銀染色法用試薬、ハイブリダイゼーション試薬、緩衝剤などが含まれ得る。キットの一部として提供され得る他の品目には、ＴＬＣシリカプレートなどの（ハイブリダイゼーションを視覚化するための）固体表面、微孔質材料、シリンジ、ピペット、キュベット、容器、および（ハイブリダイゼーションおよびデハイブリダイゼーション温度を制御するための）サーモサイクラーが含まれる。キットには、ヌクレオチドまたはナノ粒子を官能化する試薬を含めてもよい。
【０１７２】
凝集したナノ粒子の沈殿は、選択された核酸を他の核酸から分離する手段を提供する。この分離は、核酸精製における１ステップとして用い得る。ハイブリダイゼーション条件は核酸検出に関して上述したとおりである。ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを核酸に結合させる温度がＴｍ（オリゴヌクレオチドの半分をその相補鎖に結合させる温度）より低い場合、凝集体を沈殿させるのに十分な時間が必要である。（例えば、Ｔｍにより測定した）ハイブリダイゼーション温度は、塩の種類（ＮａＣｌまたはＭｇＣｌ２）およびその濃度に応じて異なる。塩の組成および濃度は、核酸の不在下にコロイドの凝集を誘発させることなく都合の良い作業温度でナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸とのハイブリダイゼーションを促進するように選択される。
【０１７３】
本発明はさらに、ナノファブリケーション法を提供する。この方法は、選択された配列を有する少なくとも１種類の連結オリゴヌクレオチドを用意するステップを含む。ナノファブリケーションに用いられる連結オリゴヌクレオチドは、任意の所望配列を含んでいてよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。連結オリゴヌクレオチドはさらに、塩基、糖、または主鎖部分に化学修飾を含み得る。連結オリゴヌクレオチド用に選択される配列や、それらの長さおよび鎖の数は、得られるナノ材料もしくはナノ構造、またはナノ材料もしくはナノ構造の部分の剛性もしくは可撓性に寄与するであろう。単１種類の連結オリゴヌクレオチドに加えて、２つ以上の異なる種類の連結オリゴヌクレオチドを用いることも考えられる。異なる連結オリゴヌクレオチドの使用数およびそれらの長さは、得られるナノ材料およびナノ構造の形状、細孔サイズおよび他の構造的特徴に寄与するであろう。
【０１７４】
連結オリゴヌクレオチドの配列は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドに結合させるための第１部分と第２部分を有するであろう。連結オリゴヌクレオチドの第１、第２またはそれ以上の結合部分は、同一または異なる配列を有し得る。
【０１７５】
連結オリゴヌクレオチドの結合部分がすべて同じ配列を有している場合、ナノ材料またはナノ構造の形成には、相補的配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している単１種類のナノ粒子だけしか使わなくてよい。連結オリゴヌクレオチドの２つ以上の結合部分が異なる配列を有している場合、２つ以上のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を使わなければならない。例えば、図１７参照。各ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、連結オリゴヌクレオチドの配列の２つ以上の結合部分の１つに対して相補的な配列を有しているであろう。結合部分の数、配列および長さと、もしあれば、それらの間の間隔は、得られるナノ材料およびナノ構造の構造特性および物性に寄与するであろう。連結オリゴヌクレオチドが２つの以上の部分を含む場合、結合部分の配列は、結合ヌクレオチドの１つの部分を別の部分に結合するのを回避するために互いに対して相補的でないように選択する必要がある。
【０１７６】
連結オリゴヌクレオチドとナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を、ナノ粒子がオリゴヌクレオチドコネクタを介して纏まっている所望のナノ材料またはナノ構造が形成されるように、ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドと連結オリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせるのに有効な条件下に接触させる。これらのハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野では周知であり、特定のナノファブリケーション計画に合わせて最適化し得る（上記参照）。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が好ましい。
【０１７７】
さらに本発明は別のナノファブリケーション法を提供する。この方法は、少なくとも２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を与えるステップを含む。第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に対して相補的な配列を有している。第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に対して相補的な配列を有している。ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を、ナノ粒子がオリゴヌクレオチドコネクタを介して纏まっている所望のナノ材料またはナノ構造が形成されるように、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを互いにハイブリダイズさせるのに有効な条件下に接触させる。この場合も、これらのハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野では周知であり、特定のナノファブリケーション計画に合わせて最適化し得る。
【０１７８】
本発明のどちらのナノファブリケーション法においても、１つ以上の異なる種類のオリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子の使用が想定される。ナノ粒子に付着している異なるオリゴヌクレオチドの数や、１つ以上のオリゴヌクレオチドの長さおよび配列は、得られるナノ材料およびナノ構造の剛性および構造特徴に寄与するであろう。
【０１７９】
また、ナノ粒子のサイズ、形状および化学組成も、得られるナノ材料およびナノ構造の特性に寄与するであろう。これらの特性には、光学特性、光電子特性、電気化学特性、電子特性、種々の溶液中での安定性、細孔およびチャンネルサイズの変化、フィルターとしての役割を果たす間の生物活性分子の分離能などが含まれる。異なるサイズ、形状および／または化学組成を有するナノ粒子混合物の使用に加えて、均一なサイズ、形状および化学組成を有するナノ粒子の使用も想定される。
【０１８０】
いずれのファブリケーション法においても、得られるナノ材料またはナノ構造中のナノ粒子は、オリゴヌクレオチドコネクタを介して結合する。オリゴヌクレオチドコネクタの配列、長さおよび鎖の数や、存在する異なるオリゴヌクレオチドコネクタの数は、ナノ材料またはナノ構造の剛性および構造特性に寄与するであろう。オリゴヌクレオチドコネクタが部分的に二本鎖である場合、その剛性は、核酸検出法に関連して上述したフィラーオリゴヌクレオチドを用いることによって増強し得る。完全二本鎖オリゴヌクレオチドコネクタの剛性は、完全二本鎖オリゴヌクレオチドコネクタに結合して三本鎖オリゴにコネクタを形成するように相補的配列を有する１つ以上の強化オリゴヌクレオチドを用いて増強し得る。デオキシクアノシン（ｄｅｏｘｙｑｕａｎｏｓｉｎｅ）またはデオキシシチジン四重鎖をベースとする四本鎖オリゴヌクレオチドコネクタの使用も想定される。
【０１８１】
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションに基づいてナノ粒子を組織化するための様々な系のいくつかが図面に示されている。単純な系（図１）では、一方のナノ粒子セットは規定配列を有するオリゴヌクレオチドを有し、別のナノ粒子セットはそれに相補的配列を有するオリゴヌクレオチドを有している。２種のナノ粒子−オリゴヌクレオチドセットをハイブリダイゼーション条件下に混合すると、２つの種類のナノ粒子が、ナノ粒子を選択された間隔で配置するスペーサーとしての働きをする二本鎖オリゴヌクレオチドコネクタを介して結合する。
【０１８２】
ナノ粒子を間隔を置いて配置するための魅力的な系は、図２に示されているような１つの自由連結オリゴヌクレオチドの添加を伴う。この連結オリゴヌクレオチドの配列は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドに結合させるための少なくとも第１部分と第２部分を有するであろう。この系は、基本的には核酸検出法に利用されるものと同じであるが、但し、添加される連結オリゴヌクレオチドの長さは、ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドを合わせた長さに等しくなるように選択し得る。図３に示されている関連系は、用いられるナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体セットを変更する必要なく、ナノ粒子間の間隔を要求通りに調節する便利な手段を提供する。
【０１８３】
ナノ粒子間に規定間隔を創出するためのさらに精巧な計画が図４に示されている。この場合、オーバーハング末端を含むＤＮＡまたはＲＮＡの二本鎖セグメントが連結オリゴヌクレオチドとして用いられている。連結オリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングセグメントとナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより、ナノ粒子間に多重二本鎖オリゴヌクレオチド架橋が得られる。
【０１８４】
より剛性のナノ材料およびナノ構造またはその部分は、ナノ粒子間に三本鎖オリゴヌクレオチドコネクタを用いることによって調製し得る。三本鎖を生成させる際には、ピリミジン：プリン：ピリミジンモチーフ（Ｍｏｓｅｒ，Ｈ．Ｅ．およびＤｅｒｖａｎ，Ｐ．Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２３８巻，６４５−６５０ページ（１９８７））またはプリン：プリン：ピリミジンモチーフ（Ｐｉｌｃｈ，Ｄ．Ｓ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３０巻，６０８１−６０８７ページ（１９９１年））のいずれかを利用し得る。ピリミジン：プリン：ピリミジンモチーフを用いた三本鎖コネクタの調製によるナノ粒子組織化の１つの例が図１０に示されている。図１０に示されている系において、１つのナノ粒子セットをピリミジンヌクレオチドを含む規定鎖と結合させ、他のセットをプリンヌクレオチドを含む相補的オリゴヌクレオチドと結合させる。オリゴヌクレオチドの付着は、ナノ粒子がハイブリダイゼーション時に形成された二本鎖オリゴヌクレオチドによって分離されるように設計する。次いで、この系に、ナノ粒子を混合する前、混合と同時、または混合直後に、ナノ粒子に結合しているピリミジン鎖の配向と反対配向の自由ピリミジンオリゴヌクレオチドを加える。この系中の第３の鎖は、フーグスティーン型塩基対を介して保持されているので、三本鎖は比較的熱に不安定である。二本鎖の幅にわたる共有結合架橋は三本鎖複合体を安定化することが知られている（Ｓａｌｕｎｋｅ，Ｍ．，Ｗｕ，Ｔ．，Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１４巻，８７６８−８７７２ページ（１９９２年）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．およびＷｕ，ｔ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１７巻，７３２３−７３２８ページ（１９９５年）；Ｐｒａｋａｓｈ，Ｇ．およびＫｏｏｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１４巻，３５２３−３５２７ページ（１９９２年））。
【０１８５】
ナノ材料およびナノ構造を構築するためには、オリゴヌクレオチド成分のハイブリダイゼーションによるナノ材料またはナノ構造の形成後に、集合体を共有結合架橋により適切な場所で「ロック」するのが望ましい場合がある。これは、オリゴヌクレオチドに、不可逆反応を始動させる官能基を組み込むことによって達成し得る。このための官能基の１つの例は、スチルベンジカルボン酸基である。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド内で整列している２つのスチルベンジカルボキサミド基に紫外光（３４０ｎｍ）を照射すると容易に架橋が達成されることが証明された（Ｌｅｗｉｓ，Ｆ．Ｄ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１７巻，８７８５−８７９２ページ（１９９５年））。
【０１８６】
代わりに、メルカプトアルキル基を介してナノ粒子の３′位に保持されているオリゴヌクレオチドの５′−Ｏ−トシル基を、メルカプトアルキル基を介してナノ粒子に保持されているオリゴヌクレオチドの３′末端のチオホスホリル基で、置換する方法を用いてもよい。両オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、それによってチオホスホリル基をトシル基に近接させるオリゴヌクレオチドの存在下では、トシル基はチオホスホリル基で置換され、両末端が２つの異なるナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドが生成する。この種類の置換反応に関しては、Ｈｅｒｒｌｅｉｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１７７巻，１０１５１−１０１５２ページ（１９９５年）を参照されたい。チオホスホリルオリゴヌクレオチドが、メルカプトアルキル−オリゴヌクレオチドの金ナノ粒子への付着に用いられる条件下では金ナノ粒子と反応しないという事実から、メルカプト基を介してナノ粒子に結合し、カップリング反応に利用できる末端チオホスホリル基を含む金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体の調製が可能になる。
【０１８７】
集合したナノ粒子系を適切な場所でロックするための関連カップリング反応は、ＧｒｙａｚｎｏｖおよびＬｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１５巻，３８０８ページに記載のように、末端ブロモアセチルアミノヌクレオシドのブロミドの末端チオホスホリル−オリゴヌクレオチドによる置換を利用する。この反応は、上述のトシラートの置換と同じように進行するが、反応速度がもっと速い。チオホスホリル基を末端基とするオリゴヌクレオチドを担持するナノ粒子は上述のように調製する。ブロモアセチルアミノ基を末端基とするオリゴヌクレオチドを担持するナノ粒子を調製するためには、先ず、一方の末端がアミノヌクレオシド（例えば、５′−アミノ−５′−デオキシチミジンまたは３′−アミノ−３′−デオキシチミジン）を末端基とし、他方の末端がメルカプトアルキル基を末端基とするオリゴヌクレオチドを作製する。次いで、このオリゴヌクレオチド分子をメルカプト基を介してナノ粒子に固定し、次いで、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体をブロモアセチルアシル化剤と反応させてＮ−ブロモアセチルアミノ誘導体に転化させる。
【０１８８】
集合体を適切な場所でロックするための第４のカップリング計画は、チオホスホリル基を末端基とするオリゴヌクレオチドを担持するナノ粒子の酸化を利用する。三ヨウ化カリウム、フェリシアン化カリウム（ＧｒｙａｚｎｏｖおよびＬｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第２１巻，１４０３ページ）または酸素などの穏和な酸化剤が好ましい。
【０１８９】
さらに、ナノ材料およびナノ構造の特性は、連続オリゴヌクレオチド鎖に、オリゴヌクレオチド鎖に共有結合付加されて適切な場所に保持された有機および無機官能基を組み込むことにより変性させ得る。多様な主鎖、塩基および糖修飾が周知である（例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．およびＰｅｙｍａｎ，Ａ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ，第９０巻，５４４−５８４ページ（１９９０年）参照）。また、オリゴヌクレオチド鎖は、ヌクレオチド塩基がポリペプチド主鎖によって保持されている「ペプチド核酸」鎖（ＰＮＡ）で置換し得る（Ｗｉｔｔｕｎｇ，Ｐ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，第３６７巻，５６１−５６３ページ（１９９４年）参照）。
【０１９０】
上記から分るように、本発明のナノファブリケーション法は極めて用途が広い。連結オリゴヌクレオチドの長さ、配列および鎖の数や、ナノ粒子に付着させるオリゴヌクレオチドの長さ、配列および数、ナノ粒子のサイズ、形状および化学組成、用いられる異なる連結オリゴヌクレオチドおよびナノ粒子の数および種類、オリゴヌクレオチドコネクタの鎖の数を変えることにより、多岐にわたる構造および特性を有するナノ材料およびナノ構造を調製することができる。これらの構造および特性は、オリゴヌクレオチドコネクタを架橋したり、オリゴヌクレオチドを官能化したり、オリゴヌクレオチドの主鎖、塩基または糖を修飾したり、またはペプチド核酸を用いたりしてさらに変えることができる。
【０１９１】
本発明のナノファブリケーション法によって調製し得るナノ材料およびナノ構造には、ナノスケール機械装置、分離膜、バイオフィルターおよびバイオチップなどがある。本発明のナノ材料およびナノ構造は、化学センサーとして、コンピュータに、薬剤送出用に、タンパク質工学用に、また、生合成／ナノ構造ファブリケーション／他の構造の指定集合体の鋳型として、使用可能であると想定される。他の可能な用途に関しては、一般に、Ｓｅｅｍａｎら，Ｎｅｗ　Ｊ．Ｃｈｅｍ．，第１７巻，７３９ページ（１９９３年）を参照されたい。本発明のナノファブリケーション法によって調製し得るナノ材料およびナノ構造としてはさらに電子デバイスを挙げることができる。核酸が電子を移動させ得るかどうかについてはかなり議論されてきた。以下の実施例２１に示されているように、ＤＮＡを介して集合したナノ粒子は電気を伝導する（ＤＮＡコネクタは半導体として機能する）。
【０１９２】
最後に、本発明は、いくつかの独特なナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体調製法を提供する。最初のそのような方法において、オリゴヌクレオチドを荷電ナノ粒子に結合させて安定なナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成する。荷電ナノ粒子には、金ナノ粒子などの金属製ナノ粒子が含まれる。
【０１９３】
上記方法は、ナノ粒子に結合し得る官能基を含む部分が共有結合しているオリゴヌクレオチドを用意するステップを含む。そのような部分と官能基は、オリゴヌクレオチドとナノ粒子との結合（すなわち、化学吸着または共有結合）に関して上述したものである。例えば、５′または３′末端にアルカンチオール、アルカンジスルフィド、または環式ジスルフィドが共有結合しているオリゴヌクレオチドを、金ナノ粒子を含めた種々のナノ粒子に結合させることができる。
【０１９４】
水中でオリゴヌクレオチドとナノ粒子とを、少なくとも一部のオリゴヌクレオチドを官能基を介してナノ粒子に結合させるのに十分な時間接触させる。そのような時間は経験的に決定し得る。例えば、約１２〜２４時間で良好な結果が得られることが判明した。他の適当なオリゴヌクレオチド結合条件も経験的に決定し得る。例えば、約１２〜２０ｎＭのナノ粒子濃度および室温下のインキュベーションによって良好な結果が得られる。
【０１９５】
次いで、少なくとも１種の塩を水に添加して塩溶液をつくる。塩は任意の水溶性塩であってよい。例えば、塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、２種以上のこれらの塩の組合せ、またはリン酸緩衝液中のこれらの塩の１種であってよい。塩は、濃縮溶液として添加するのが好ましいが、固体として添加してもよい。塩は、水に一度に添加してもよいし、経時的に漸進的に添加してもよい。「経時的に漸進的に」とは、塩を少なくとも２つの部分に分けて一定の時間間隔を置いて添加することを意味する。適当な時間間隔は経験的に決定し得る。
【０１９６】
塩溶液のイオン強度は、オリゴヌクレオチドの互いからの静電斥力と、正に帯電したナノ粒子に対する負に帯電したオリゴヌクレオチドの静電引力、または負に帯電したナノ粒子からの負に帯電したオリゴヌクレオチドの静電斥力とを少なくとも部分的に克服するのに十分でなければならない。経時的に漸進的に塩を添加することにより静電引力および静電斥力を漸進的に減少させると、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの表面密度が最も高くなることが判明した。各塩または塩の組合せに適したイオン強度は経験的に決定し得る。塩化ナトリウムの濃度は経時的に漸進的に増大させるのが好ましく、リン酸緩衝液中約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの塩化ナトリウム最終濃度が良好な結果を生じることが判明した。
【０１９７】
塩を添加した後、塩溶液中で、オリゴヌクレオチドとナノ粒子を、追加のオリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させて安定なナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成するのに十分な追加時間インキュベートする。以下に詳細に説明するように、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの表面密度が増加すると、共役体が安定化することが判明した。このインキュベーションの時間は経験的に決定し得る。合計約２４〜４８（好ましくは４０時間）のインキュベーション時間で良好な結果が得られることが分った（これは、合計インキュベーション時間である。上述のように、塩濃度は、この合計時間にわたって漸進的に増大させ得る）。塩溶液中でのこの第２インキュベーション時間は、本明細書では「熟成」ステップと称する。この「熟成」ステップに適した他の条件は経験的に決定し得る。例えば、室温下のインキュベーションおよびｐＨ７．０で良好な結果が得られる。
【０１９８】
「熟成」ステップを用いて生成した共役体は、「熟成」ステップを用いずに生成したものよりかなり安定度が高いことが分った。上述のように、この安定性の向上は、「熟成」ステップによって達成されるナノ粒子表面上のオリゴヌクレオチド密度の増加によるものである。「熟成」ステップにより達成される表面密度は、ナノ粒子のサイズおよび種類、ならびにオリゴヌクレオチドの長さ、配列および濃度に依存するであろう。ナノ粒子を安定化するのに適した表面密度および所望のナノ粒子とオリゴヌクレオチドの組合せを得るのに必要な条件は、経験的に決定し得る。一般に、安定なナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を得るためには、少なくとも１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２の表面密度が適当であろう。表面密度は少なくとも１５ｐｍｏｌ／ｃｍ２が好ましい。共役体のオリゴヌクレオチドが核酸およびオリゴヌクレオチド標的とハイブリダイズする能力は表面密度が高すぎると低下するので、表面密度は約３５〜４０ｐｍｏｌ／ｃｍ２以下が好ましい。
【０１９９】
本明細書に使用する場合、「安定な」とは、共役体生成後少なくとも６ヶ月間に、大多数のオリゴヌクレオチドがナノ粒子に付着したままであり、オリゴヌクレオチドが、核酸検出法およびナノファブリケーション法において遭遇する標準条件下に核酸およびオリゴヌクレオチド標的とハイブリダイズし得ることを意味する。
【０２００】
この方法で調製されたナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体は、それらの安定性の他に、他の優れた特性を示す。例えば、本願の実施例５、７および１９を参照されたい。特に、共役体の表面密度が高いため、共役体は、標的核酸またはオリゴヌクレオチドの存在下では、大きな凝集体として集合するであろう。凝集体が生成し、解離する温度範囲は予想外に極めて狭いことが判明したが、この固有の特徴は、重要な実用的成果をもたらす。特に、これは、本発明の検出法の選択性および感度を高める。この共役体を用いて、１塩基誤対合および２０ｆｍｏｌ程度の小さい標的を検出することができる。これらの特徴はもともとは溶液中で実施したアッセイで発見されたものであるが、これらの共役体を用いることの利点は、１種類のみの共役体しか使用しないアッセイを含めた、基板上で実施するアッセイにも及ぶことが判明した。
【０２０１】
ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体のハイブリダイゼーション効率を、認識部分とスペーサー部分を含む認識オリゴヌクレオチドの使用によって劇的に増加させることができることがわかっている。「認識オリゴヌクレオチド」とは、核酸またはオリゴヌクレオチド標的の配列の少なくとも一部分に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドである。この実施形態では、認識オリゴヌクレオチドは認識部分およびスペーサー部分を含み、認識部分が核酸またはオリゴヌクレオチド標的にハイブリダイズする。認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分は、該スペーサー部分がナノ粒子に結合できるように設計される。例えば、スペーサー部分には、ナノ粒子に結合可能な官能基を含む部分が、共有結合によって結び付けられる。これらは上述したのと同じ部分および官能基である。ナノ粒子に対して認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分が結合した結果、認識部分はナノ粒子の表面から遠ざかり、その標的とのハイブリダイゼーションのためによりアクセス可能となる。認識部分のナノ粒子からのよい離間性を提供するスペーサー部分の長さと配列は、経験的に決定することが可能である。少なくとも約１０ヌクレオチド、好ましくは１０〜３０ヌクレオチドを含むスペーサー部分が、好結果を与えることがわかった。スペーサー部分は、認識オリゴヌクレオチドの、ナノ粒子への結合能もしくは核酸またはオリゴヌクレオチド標的への結合能に干渉しない、任意の配列を有してよい。例えば、スペーサー部分は、認識オリゴヌクレオチドの配列や認識オリゴヌクレオチドの核酸またはオリゴヌクレオチド標的の配列に対し、互い相補的な配列を有するべきではない。好ましくは、スペーサー部分のヌクレオチドの塩基は、すべてアデニン、すべてのチミン、すべてシチジン、またはすべてグアニンであり、そうでなければ上述のような問題が起こる可能性がある。より好ましくは、塩基はすべてアデニンまたはすべてのチミンである。好ましくは、塩基はすべてチミンである。
【０２０２】
所望のレベルのハイブリダイゼーションを与えるために、認識オリゴヌクレオチドに加えての希釈剤オリゴヌクレオチドの使用が、共役体を要求に合わせて作製する（あつらえる）手段を提供することがさらに知られている。希釈剤オリゴヌクレオチドと認識オリゴヌクレオチドは、共役体を調製するためにナノ粒子に接触させた時の溶液中の比とほぼ同じ比率でナノ粒子に付くことが分かった。したがって、共役体が所望の数のハイブリダイゼーション事象に参与するように、ナノ粒子に結び付けられた希釈剤オリゴヌクレオチド対認識オリゴヌクレオチドの比を制御することができる。希釈剤オリゴヌクレオチドは、認識オリゴヌクレオチドの、ナノ粒子への結合能もしくは核酸またはオリゴヌクレオチド標的への結合能に干渉しない、任意の配列を有してよい。例えば、希釈剤オリゴヌクレオチドは、認識オリゴヌクレオチドの配列や認識オリゴヌクレオチドの核酸またはオリゴヌクレオチド標的の配列に対し、互い相補的な配列を有するべきではない。希釈剤オリゴヌクレオチドは、認識オリゴヌクレオチドがその核酸またはオリゴヌクレオチド標的に結合できるように、認識オリゴヌクレオチドよりも短い長さを好ましくは有する。認識オリゴヌクレオチドがスペーサー部分を含む場合、希釈剤オリゴヌクレオチドは、最も好ましくはスペーサー部分とほぼ同じ長さである。このように、希釈剤オリゴヌクレオチドは、認識オリゴヌクレオチドの認識部分の核酸またはオリゴヌクレオチド標的とハイブリダイズする能力に干渉しない。さらにより好ましくは、希釈剤オリゴヌクレオチドは、認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分の配列と同じ配列を有する。
【０２０３】
容易に理解できるように、非常に望ましいナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を、上述のすべての方法を用いて調製することができる。そうすることによって、要求に合わせたハイブリダイゼーション能力を有する安定した共役体を作製することが可能である。
【０２０４】
上記の共役体の任意のものは、上述の核酸検出方法のいずれに使用してもよいし、好ましくは使用される。また、本発明は、上記共役体のうちの任意のものを入れた容器を含むキットも提供する。その上、該共役体は、本発明のナノファブリケーションの方法ならびに核酸分離方法のいずれに使用してもよいし、好ましくは使用される。
【０２０５】
用語「ある」存在とは、「１つ以上の」その存在を表す。例えば、「ある特徴」とは、１つ以上の特徴または少なくとも１つの特徴を表す。したがって、本明細書においては、用語「ある」「１つ以上」および「少なくとも１つ」は互換的に用いられる。用語「含んでなる」「含む」および「有する」は互換的に用いられていることに留意されたい。
【０２０６】
（実施例）
実施例１：　オリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子
Ａ：　金ナノ粒子の調製
Ｆｒｅｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ　Ｐｈｙｓ．Ｓｃｉ．，第２４１巻，２０ページ（１９７３年）およびＧｒａｂａｒ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，第６７巻，７３５ページ（１９９５年）に記載のように、ＨＡｕＣｌ４をクエン酸塩で還元して、金コロイド（直径１３ｎｍ）を調製した。簡単に説明すると、すべてのガラス器を王水（３部のＨＣｌ、１部のＨＮＯ３）で洗浄し、ＮａｎｏｐｕｒｅＨ２Ｏでリンス、次いで使用前にオーブンで乾燥させた。ＨＡｕＣｌ４およびクエン酸ナトリウムはオールドリッチケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）から購入した。水性ＨＡｕＣｌ４（１ｍＭ、５００ｍｌ）を攪拌還流させた。次いで、３８．８ｍＭのクエン酸ナトリウム（５０ｍｌ）を素早く添加した。溶液の色は薄黄色から暗紅色に変わったが、還流を１５分間継続した。室温に冷ました後、赤色溶液をミクロン・セパレーションズ社（Ｍｉｃｒｏｎ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　Ｉｎｃ．）の１ミクロンフィルターに通して濾過した。Ａｕコロイドを、Ｈｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　８４５２Ａダイオードアレイ分光光度計を用いたＵＶ−可視分光法および日立　８１００透過型電子顕微鏡を用いた透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）により特性決定した。直径１３ｎｍの金粒子は、標的および１０〜３５ヌクレオチド範囲のプローブオリゴヌクレオチドと共に凝集させると目に見える変色を生じる。
【０２０７】
Ｂ．オリゴヌクレオチドの合成
ホスホロアミダイト化学を用いる単カラムモードのＭｉｌｌｉｇｅｎｅ　Ｅｘｐｅｄｉｔｅ　ＤＮＡ合成機を用いて１μｍｏｌスケールでオリゴヌクレオチドを合成した。Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（編），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１年）。すべての溶液はミリジーン社（Ｍｉｌｌｉｇｅｎｅ）（ＤＮＡ合成グレード）から購入した。平均カップリング効率は９８〜９９．８％の範囲であり、最終ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基は精製を支援するためにオリゴヌクレオチドから切断しなかった。
【０２０８】
３′−チオール−オリゴヌクレオチドを得るために、チオール修飾剤Ｃ３　Ｓ−Ｓ　ＣＰＧ支持体をグレン・リサーチ社（Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から購入し、自動合成機に使用した。固相支持体からの通常の切断の間（５５℃で１６時間）に、ＮＨ４ＯＨ溶液に０．０５Ｍ　ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加えて、３′ジスルフィドをチオールに還元した。逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製する前に、過剰なＤＴＴを酢酸エチルで抽出して除去した。
【０２０９】
５′−チオールオリゴヌクレオチドを得るために、５′−チオール修飾剤Ｃ６−ホスホロアミダイト試薬をヴァージニア州　２０１６６、スターリング、ファルコン・プレイス　４４９０１所在のグレン・リサーチ社（Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４４９０１　Ｆａｌｃｏｎ　Ｐｌａｃｅ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖａ　２０１６６）から購入した。オリゴヌクレオチドを合成し、最終ＤＭＴ保護を除去した。次いで、１００μｍｏｌの５′チオール変性剤Ｃ６−ホスホロアミダイトに、１ｍｌの無水アセトニトリルを加えた。２００μｌのアミダイト溶液と２００μｌの（合成機から出来たばかりの）アクチベーターとを混合し、まだ固相支持体上の合成オリゴヌクレオチドを含有するカラム上にシリンジで導入し、カラム中で１０分間往復運動させた。次いで、支持体を無水アセトニトリルで３０秒間洗浄（２×１ｍｌ）した。カラムに７００μｌの０．０１６Ｍ　Ｉ２／Ｈ２Ｏ／ピリジン混合物（酸化剤溶液）を導入し、次いで、２つのシリンジを用いてカラム中で３０秒間往復運動させた。次いで、支持体をＣＨ３ＣＮ／ピリジンの１：１混合物（２×１ｍｌ）で１分間洗浄した後、無水アセトニトリル（２×１ｍｌ）で最終洗浄し、その後、カラムを窒素流で乾燥させた。精製を支援するために、トリチル保護基は除去しなかった。
【０２１０】
０．０３Ｍ　Ｅｔ３ＮＨ＋ＯＡｃ−緩衝液（ＴＥＡＡ）、ｐＨ７と共に、１％／分勾配の９５％ＣＨ３ＣＮ／５％ＴＥＡＡを用いて、Ｈｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　ＯＤＳ　ハイパーシル（ｈｙｐｅｒｓｉｌ）カラム（４．６×２００ｍｍ、５ｍｍ粒度）を具備したＤｉｏｎｅｘ　ＤＸ５００システムで、逆相ＨＰＬＣを実施した。流速は１ｍｌ／分、ＵＶ検出は２６０ｎｍであった。ＤＭＴ保護非修飾オリゴヌクレオチドの精製には、分取ＨＰＬＣ（溶離時間２７分）を用いた。緩衝液を回収して蒸発させた後、８０％酢酸で室温下に３０分間処理してオリゴヌクレオチドからＤＭＴを切断した。次いで、溶液を蒸発させてほぼ乾固し、水を加え、酢酸エチルを用いて切断ＤＭＴをオリゴヌクレオチド水溶液から抽出した。オリゴヌクレオチドの量は、２６０ｎｍでの吸光度により定量し、最終純度を逆相ＨＰＬＣ（溶離時間１４．５分）で評価した。
【０２１１】
３′−チオールオリゴヌクレオチドの精製には同じプロトコルを用いたが、但し、形成されるジスルフィドの量を減少させるためにＤＭＴを抽出した後でＤＴＴを加えた。４℃下に５時間後、酢酸エチルを用いてＤＴＴを抽出し、オリゴヌクレオチドをＨＰＬＣ（溶離時間１５分）で再精製した。
【０２１２】
５′−チオール修飾オリゴヌクレオチドを精製するために、非修飾オリゴヌクレオチドの場合と同じ条件下に分取ＨＰＬＣを実施した。精製後、無水オリゴヌクレオチド試料に、１５０μｌの５０ｍＭ　ＡｇＮＯ３溶液を加えて、トリチル保護基を除去した。試料は、切断が起こると同時に乳白色に変わった。２０分後、ＤＴＴの１０ｍｇ／ｍｌ溶液２００μｌを加えてＡｇを複合体化（反応時間５分）し、試料を遠心して黄色複合体を沈殿させた。次いで、オリゴヌクレオチド溶液（＜５０　ＯＤ）を、（１０塩基を超えるオリゴヌクレオチドの脱塩および緩衝液交換用のＤＮＡ　Ｇｒａｄｅ　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｄ−２５　Ｍｅｄｉｕｍを有する）精製用の脱塩ＮＡＰ−５カラム（スウェーデンのウプサラ所在ファルマシア・バイオテク社（Ｐｈａｒａｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ））上に移した。５′−チオール修飾オリゴヌクレオチドの量を、ＵＶ−可視分光法により２６０ｎｍでの吸光度を測定して定量した。１０ｍＭ　ＮａＯＨ溶液（ｐＨ１２）と共に、２％／分勾配の１０ｍＭ　ＮａＯＨ、１Ｍ　ＮａＣｌ溶液を用いて、Ｄｉｏｎｅｘ　Ｎｕｃｌｅｏｐａｃ　ＰＡ―１００（４×２５０）カラムでイオン交換ＨＰＬＣを実施して、最終純度を評価した。典型的には、約１９分および２５分の溶離時間で２つのピークを得た（溶離時間はオリゴヌクレオチド鎖長に依存する）。これらのピークはそれぞれチオールオリゴヌクレオチドおよびジスルフィドオリゴヌクレオチドに対応していた。
【０２１３】
Ｃ．オリゴヌクレオチドの金ナノ粒子への付着
上記パートＡに記載のように調製した１７ｎＭ（１５０μｌ）Ａｕコロイドの水溶液を、パートＢに記載のように調製した３．７５μＭ（４６μｌ）３′−チオール−ＴＴＴＧＣＴＧＡと混合し、キャップをした１ｍｌ容量Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆバイアル中室温下に２４時間放置した。第２コロイド溶液を３．７５μＭ（４６μｌ）３′−チオール−ＴＡＣＣＧＴＴＧと反応させた。これらのオリゴヌクレオチドは非相補的であることに留意されたい。使用直前に、等量の２種のナノ粒子溶液を合わせた。オリゴヌクレオチドは非相補的であるから、反応は起こらなかった。
【０２１４】
オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子は高温（８０℃）および高塩濃度（１Ｍ　ＮａＣｌ）下に何日も安定であり、粒子の成長は認められなかった。高塩濃度下に安定であることは、そのような条件が本発明の検出法およびナノファブリケーションの基礎を構成するハイブリダイゼーション反応に要求されるために重要である。
【０２１５】
実施例２：　ナノ粒子凝集体の形成
Ａ．連結オリゴヌクレオチドの作製
実施例１のパートＢに記載のように、２種（非チオール化）オリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドは以下の配列を有していた：
３′ＡＴＡＴＧＣＧＣＧＡ　ＴＣＴＣＡＧＣＡＡＡ（配列番号１）；および
３′ＧＡＴＣＧＣＧＣＡＴ　ＡＴＣＡＡＣＧＧＴＡ（配列番号２）。
これら２種のオリゴヌクレオチドを１Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　リン酸緩衝（ｐＨ７．０）溶液中で混合すると、ハイブリダイズして、１２塩基対オーバーラップおよび２つの８塩基対付着末端を有する二本鎖が形成された。付着末端はそれぞれ、実施例１のパートＣで調製したＡｕコロイドに付着しているオリゴヌクレオチドの１つの配列に対して相補的な配列を有していた。
【０２１６】
Ｂ．ナノ粒子凝集体の形成
この実施例のパートＡで作製した連結オリゴヌクレオチド（ＮａＣｌで希釈後の最終濃度０．１７μＭ）を、室温下に、実施例１のパートＣで調製したナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体（ＮａＣｌで希釈後の最終濃度５．１ｎＭ）に加えた。次いで、溶液をＮａＣｌ水溶液で（１Ｍの最終濃度に）希釈し、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに適した条件である１０ｍＭ　リン酸、ｐＨ７で緩衝した。その直後に赤から紫への変色が観察され、続いて沈殿反応が生じた。図６参照。数時間の間に、溶液は透明になり、反応容器の底にピンクがかった灰色の沈殿物が沈殿した。図６参照。
【０２１７】
このプロセスがオリゴヌクレオチドとコロイドを共に含むことを確認するために、沈殿物を回収し、ｐＨ７で緩衝する１Ｍ　ＮａＣｌ水溶液中で（振とうして）再懸濁させた。このようにして、ナノ粒子にハイブリダイズしなかったオリゴヌクレオチドを除去する。次いで、ハイブリダイズしたオリゴデオキシリボヌクレオチドに特徴的な吸光度（２６０ｎｍ）および金粒子間の間隔を表す凝集コロイドに特徴的な吸光度（７００ｎｍ）をモニターして、温度／時間解離実験を行った。図７参照。
【０２１８】
温度を０〜８０℃の間で１℃／分の速度で循環させながら、Ｐｅｌｔｉｅｒ　ＰＴＰ−１　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｃｅｌｌ　Ｈｏｌｄｅｒを用いるＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｌａｍｂｄａ２ＵＶ−可視分光光度計で２６０および７００ｎｍでの吸光度の変化を記録した。１０ｍＭ　リン酸緩衝液を用いてｐＨ７で緩衝し、１Ｍ　ＮａＣｌ濃度のＤＮＡ溶液は、約１吸光度単位（ＯＤ）であった。
【０２１９】
その結果は図８Ａに示されている。温度を０℃〜（二本鎖の解離温度（Ｔｍ）（Ｔｍ＝４２℃）より３８℃高い）８０℃の間で循環させると、コロイドとオリゴヌクレオチドの両方の光学的シグナチャーの間に良好な相関が存在した。何も結合していないＡｕコロイドのＵＶ−可視スペクトルははるかに温度依存度が低かった（図８Ｂ）。
【０２２０】
ポリマーオリゴヌクレオチド−コロイド沈殿物をその融解点より高い温度で加熱すると、肉眼で見える実質的な光学的変化があった。透明溶液は、ポリマー生体材料がデハイブリダイズして水溶液に可溶である非結合コロイドを生成すると、暗紅色に変わった。図８Ａの温度トレースにより証明されるように、このプロセスは可逆的であった。
【０２２１】
対照実験において、１４−Ｔ：１４−Ａ二本鎖は、可逆的Ａｕコロイド粒子の凝集を誘発するには有効でないことが明らかにされた。別の対照実験で、付着末端に４塩基対誤対合がある連結オリゴヌクレオチド二本鎖は、（実施例１のＣ部に記載のように調製し、上記のように反応させた）オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子の可逆的粒子凝集を誘発しないことが判明した。第３の対照実験において、連結オリゴヌクレオチドの付着末端に対して相補的な配列を有し、ナノ粒子と反応させた非チオール化オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子を連結オリゴヌクレオチドと合わせたときに可逆凝集を生成しなかった。
【０２２２】
重合／集合体プロセスについてのさらなる事実が沈殿物の透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）研究から明らかになった。ＴＥＭは、日立　８１００透過型電子顕微鏡で実施した。孔の多い炭素格子上に１００μｌのコロイド溶液をスポット
【０２２３】
して典型的な試料を調製した。次いで、格子を真空乾燥させ、画像を形成した。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを介して結合したＡｕコロイドのＴＥＭ画像は、集合した大きなＡｕコロイド網目構造を示した（図９Ａ）。何も結合していないＡｕコロイドは、同等な条件下には凝集せずに、分散するか、または粒子成長反応を起こす。Ｈａｙａｔ，Ｃｏｌｏｉｄａｌ　Ｇｏｌｄ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，１９９１年）。今日までに実施された実験ではコロイド粒子の成長の事実は全く存在しないことに留意されたい；ハイブリダイズしたコロイドは、平均直径が１３ｎｍの著しく一定したサイズを有するようである。
【０２２４】
ＴＥＭにより、三次元凝集体の秩序度の評価を困難にする層の重ね合わせが得られる。しかし、単層の二次元凝集体のもっと小規模の画像から、自己集合体プロセスに関するより多くの事実が得られた（図９Ｂ）。均一な粒子が約６０Å離れている密集凝集体集合体が見られる。この間隔は、用いられた配列を有する剛性オリゴヌクレオチドハイブリッドを介して結合したコロイドに関して予測された９５Å間隔よりいくらか短い。しかし、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと連結オリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせた後で得られた二本鎖中のニックのために、これらの凝集体は剛性ハイブリッドではなく、極めて可撓性であった。これは、系オーバーラップ鎖を４つから３つに減らす（それによってニックの数を減らす）か、または二本鎖の代わりに三本鎖を用いることにより制御し得る可変要素であることに留意されたい。
【０２２５】
実施例３：　オリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子の調製
実施例１に記載のように金コロイド（直径１３ｎｍ）を調製した。チオール−オリゴヌクレオチド［ＨＳ（ＣＨ２）６ＯＰ（Ｏ）（Ｏ−）−オリゴヌクレオチド］も実施例１に記載のように調製した。
【０２２６】
実施例１に記載のチオール−オリゴヌクレオチドを金ナノ粒子に付着させる方法は、満足すべき結果をもたらさない場合があることが判明した。特に、長いオリゴヌクレオチドを用いたとき、オリゴヌクレオチド−コロイド共役体は、診断系に通常存在するバックグラウンドＤＮＡ用のモデルとして用いられる大過剰の高分子量サケ精子ＤＮＡの存在下では安定でなかった。コロイドをチオール−オリゴヌクレオチドに長く暴露すると、サケ精子ＤＮＡに対して安定なオリゴヌクレオチド−コロイド共役体が生成したが、得られた共役体は、満足にハイブリダイズしていなかった。さらなる実験により、共役体が高分子ＤＮＡに対して安定でありかつ満足にハイブリダイズするように任意の長さのチオール−オリゴヌクレオチドを金コロイドに付着させる以下の手順を得た。
【０２２７】
水中の金コロイド（１７ｎＭ）の１ｍｌ溶液を水中の過剰な（３．６８μＭ）チオール−オリゴヌクレオチド（２８塩基長）と混合し、混合物を室温下に１２〜２４時間放置した。次いで、１００μｌの０．１Ｍ　リン酸水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０および１００μｌの１．０Ｍ　ＮａＣｌを予備混合して加えた。１０分後、１０μｌの１％水性ＮａＮ３を添加し、混合物をさらに４０時間放置した。この「熟成」ステップは、チオール−オリゴヌクレオチドにより表面被覆面積を増大させて、金表面からオリゴヌクレオチド塩基を置換させるように設計された。その後のアッセイで、４０時間のインキュベーション後に溶液をドライアイス浴中で凍結し、次いで室温下に解凍すると、いくらか透明度が増し、境界がよりはっきりした赤色スポットが得られた。どちらにしても、次ぎに、溶液をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ　５４１４にて１４，０００ｒｐｍで約１５分間遠心して、（２６０ｎｍでの吸光度によって示されている）ほとんどのオリゴヌクレオチドと共に、（５２０ｎｍでの吸光度により示されている）７〜１０％の金コロイドを含有する極めて薄いピンク色の上清と、管の底に密で暗色のゼラチン質残留物を得た。上清を除去し、残留物を約２００μｌの緩衝液（１０ｍＭ　リン酸、１．０Ｍ　ＮａＣｌ）中に再懸濁し、再遠心した。上清溶液を除去した後、残留物を１．０ｍｌの緩衝液（１０ｍＭ　リン酸、０．１Ｍ　ＮａＣｌ）および１０μｌの１％ＮａＮ３水溶液中に入れた。溶液をピペットで数回吸い込んだり、吐出したりして溶解を支援した。得られた赤色マスター溶液は、室温下に数ヶ月間放置し、シリカ薄相クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート（実施例４参照）上に置き、２Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、または高濃度のサケ精子ＤＮＡ含有溶液を添加しても、安定であった（すなわち、赤色を保ち、凝集しなかった）。
【０２２８】
実施例４：　ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体のハイブリダイゼーションの促進
実施例３に記載のように、図１１に示されているオリゴヌクレオチド−金コロイド共役体ＩおよびＩＩを調製した。これら２種の共役体のハイブリダイゼーションは極めて緩慢であった。特に、水性０．１Ｍ　ＮａＣｌまたは１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２＋０．１Ｍ　ＮａＣｌ中で共役体ＩおよびＩＩ試料を混合し、混合物を室温下に１日放置しても、変色はほとんどまたは全く生じなかった。
【０２２９】
２つの方法がハイブリダイゼーションを改善することが分った。最初の方法では、共役体ＩおよびＩＩの混合物（０．１Ｍ　ＮａＣｌ溶液中に各１５ｎＭを含有）をドライアイス−イソプロピルアルコール浴中で５分間凍結し、次いで混合物を室温下に解凍すると、より高速の結果が得られた。解凍した溶液は、青みを帯びた色を示した。標準Ｃ−１８ＴＬＣシリカプレート（オールテク・アソシエイツ社（Ａｌｌｔｅｃｈ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ））上に溶液１μｌをスポットすると、直ぐに濃青色が見られた。ハイブリダイゼーションおよびその結果として起こる凍結−解凍手順により起こった変色は可逆的であった。ハイブリダイズした溶液を８０℃に加熱すると、溶液は赤色に変わり、ＴＬＣプレート上にピンク色のスポットを生成した。次いで、凍結、解凍すると、系は（青色の）ハイブリダイズ状態に戻った（Ｃ−１８ＴＬＣプレート上の溶液とスポット両方共）。溶液を凍結しなかった同様な実験では、Ｃ−１８ＴＬＣプレート上で得られたスポットはピンク色であった。
【０２３０】
高速結果を得る第２の方法は、共役体と標的を温める方法である。例えば、別の実験では、０．１Ｍ　ＮａＣｌ溶液中でオリゴヌクレオチド−金コロイド共役体とオリゴヌクレオチド標的配列とを急速に６５℃に温め、２０分かけて室温に冷ました。Ｃ−１８シリカプレート上にスポットして、乾燥させると、ハイブリダイゼーションを示す青いスポットが得られた。それに対し、共役体と標的を室温下に１時間０．１Ｍ　ＮａＣｌ中でインキュベートしても、ハイブリダイゼーションを示す青色を生成しなかった。０．３Ｍ　ＮａＣｌ中でのハイブリダイゼーションはさらに高速である。
【０２３１】
実施例５：　ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を用いたアッセイ
図１２Ａ−Ｆに示されているオリゴヌクレオチド−金コロイド共役体１および２は実施例３に記載のように作製し、図１２Ａに示されているオリゴヌクレオチド標的３は、実施例２に記載のように作製した。誤対合標的および欠失標的４、５、６および７は、イリノイ州シカゴ所在のノースウエスタン大学バイオテクノロジー施設（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）から購入した。これらのオリゴヌクレオチドを４０ｎｍｏｌスケールで合成し、逆相Ｃ１８カートリッジ（ＯＰＣ）上で精製した。それらの純度は、イオン交換ＨＰＬＣを実施して定量した。
【０２３２】
ストリンジェントな温度に、急速加熱し、次いで急速に冷却して、選択的ハイブリダイゼーションを達成した。例えば、１５ｎＭの各オリゴヌクレオチド−コロイド共役体１および２と、３ｎｍｏｌの標的オリゴヌクレオチド３、４、５、６または７を含有する１００μｌの０．１Ｍ　ＮａＣｌ＋５ｍＭ　ＭｇＣｌ２を、７４℃に加熱し、以下の表に示されている温度に冷却し、混合物をこの温度で１０分間インキュベートしてハイブリダイゼーションを実施した。次いで、各反応混合物の３μｌ試料をＣ−１８ＴＬＣシリカプレート上にスポットした。（５分間）乾燥させると、ハイブリダイゼーションが起こった場合には濃青色が現われた。
【０２３３】
結果を以下の表１に示す。ピンク色のスポットは陰性テスト（すなわち、ナノ粒子がハイブリダイゼーションによって結合しなかったこと）を示し、青色のスポットは陽性テスト（すなわち、ナノ粒子が両オリゴヌクレオチド−コロイド共役体に関するハイブリダイゼーションにより近接させたこと）を示す。
【０２３４】
【表１】
Figure 2004501340
表１から分るように、６０℃のハイブリダイゼーションでは、完全対合標的３の場合のみ青色スポットが得られた。５０℃のハイブリダイゼーションでは、標的３と６の両方で青色スポットを生成した。４５℃のハイブリダイゼーションでは、標的３、５および６で青色スポットが得られた。
【０２３５】
関連シリーズにおいて、１誤対合Ｔヌクレオチドを含む標的は、５８℃で陽性テスト（青色）を生成し、共役体１および２は６４℃で陰性テスト（赤色）を生成した。同一条件下で、完全対合標的（３）は、どちらの温度下にも陽性テストを生成したが、これは、このテストが完全対合標的と、１誤対合塩基を含む標的とを識別し得ることを示している。
【０２３６】
異なるハイブリダイゼーション法を用いても同様な結果が得られた。特に、凍結、解凍し、次いで急速にストリンジェントな温度に温めることにより、選択的ハイブリダイゼーションが達成された。例えば、１５ｎＭの各オリゴヌクレオチド−コロイド共役体１および２と、１０ｐｍｏｌの標的オリゴヌクレオチド３、４、５、６または７を含有する１００μｌの０．１Ｍ　ＮａＣｌを、ドライアイス−イソプロピルアルコール浴中で５分間凍結し、室温下に解凍し、次いで、急速に以下の表２に示されている温度に冷却し、混合物をこの温度で１０分間インキュベートしてハイブリダイゼーションを実施した。次いで、各反応混合物の３μｌ試料をＣ−１８ＴＬＣシリカプレート上にスポットした。結果を表２に示す。
【０２３７】
【表２】
Figure 2004501340
これらの系の重要な特徴は、温度変化に関連する変色が極めて急激であり、かつ約１℃の温度範囲にわたって発生することである。これは、コロイド共役体が関与する融解および会合プロセスにおける高い協同性を示しており、完全対合配列と１塩基対誤対合を含むオリゴヌクレオチド標的を容易に識別し得ることを示している。
【０２３８】
高い識別度は２つの特徴によるものと考えられる。第１に、陽性シグナルを得るには、標的上の２つの比較的短いプローブオリゴヌクレオチドセグメント（１５ヌクレオチド）の整列が必要である。同等な２成分検出系において、どちらかのセグメント中に誤対合があると、もっと長いプローブ（例えば、３０塩基長のオリゴヌクレオチド）中の誤対合より不安定になる。第２に、溶液中の標的オリゴヌクレオチドとナノ粒子共役体とのハイブリダイゼーションで得られた２６０ｎｍでのシグナルは、ＤＮＡに基づくものではなく、ナノ粒子に基づいている。このシグナルは、多重オリゴヌクレオチド二本鎖によるポリマー網目構造として組織化されたナノ粒子集合体の解離に依存する。これによって、凝集体の解離に関して観察される温度範囲が、標準ＤＮＡ熱変性と比べて狭められる。簡単に説明すると、架橋凝集体中の一部の二本鎖は、ナノ粒子を溶液中に分散させることなく解離し得る。したがって、凝集体を融解させる温度範囲は、ナノ粒子を含まない同等な系の融解に関わる温度範囲（１２℃）に比べて極めて狭い（４℃）。この検出法のさらに顕著かつ有利な点は、Ｃ−１８シリカプレート上で観察される比色応答（＜１℃）の温度範囲である。原則的に、この３成分ナノ粒子をベースとする方法は、標的核酸とハイブリダイズしている一本鎖プローブをベースとする任意の２成分検出系よりも選択的であろう。
【０２３９】
１００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（０．３Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　リン酸、ｐＨ７）中で、１ｎｍｏｌの標的３を含有するマスター溶液を調製した。この溶液１μｌは、標的オリゴヌクレオチド１０ｐｍｏｌに相当する。マスター溶液からアリコートを取り、ハイブリダイゼーション緩衝液で所望の濃度に希釈して、連続希釈を実施した。表３は、プローブ１および２と異なる量の標的３との混合物３μｌを用いて得た感度を示している。凍結−解凍条件を用いてハイブリダイゼーションを実施した後、これらの溶液の３μｌアリコートをＣ−１８　ＴＬＣプレート上にスポットして、色を定量した。以下の表３において、ピンク色は陰性テストを示し、青色は陽性テストを示す。
【０２４０】
【表３】
Figure 2004501340
この実験は、１０ｆｍｏｌがこの特定の系の検出下限であることを示している。
【０２４１】
実施例６：　ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を用いたアッセイ
図１３Ｂに示されているように、ＤＮＡ修飾ナノ粒子を修飾透明基板上に吸着させた。この方法は、ＤＮＡハイブリダイゼーション相互作用を用いて、ＤＮＡ修飾ナノ粒子をガラス製基板に付着しているナノ粒子に結合させるステップから成る。
【０２４２】
ガラス製顕微鏡スライドはフィッシャー・サイエンティフック社（Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｆｉｔｉｃ）から購入した。先端にダイヤモンドが付いたけがきペンを用いて、スライドを約５×１５ｍｍの部片に切断した。スライドを、５０℃の４：１Ｈ２ＳＯ４：Ｈ２Ｏ溶液中に２０分間浸漬して清浄した。次いで、スライドを、多量の水、次いでエタノールでリンスし、乾燥窒素流下に乾燥させた。スライド表面をチオール末端シランで官能化するために、スライドを脱気エタノール１％（質量）メルカプトプロピル−トリメトキシシラン溶液に１２時間浸漬した。スライドをエタノール溶液から取り出し、エタノール、次いで水でリンスした。直径１３ｎｍの金ナノ粒子を含有する溶液（実施例１に記載の配合物）にナノ粒子を浸漬して、スライドのチオール末端表面上に吸着させた。コロイド溶液中で１２時間後、スライドを取り出し、水でリンスした。得られたスライドは、吸着されたナノ粒子に帰するピンク色を有し、水性金ナノ粒子コロイド溶液と同様なＵＶ−可視吸光度プロファイル（５２０ｎｍでの表面プラズモン吸光度ピーク）を示す。図１４Ａ参照。
【０２４３】
ガラス製スライドを、新たに精製された３′チオールオリゴヌクレオチド（３′チオール　ＡＴＧＣＴＣＡＡＣＴＣＴ［配列番号３３］（実施例１および３に記載のように合成）を含有する０．２ＯＤ（１．７μＭ）溶液中に浸漬して、ＤＮＡをナノ粒子修飾表面に付着させた。１２時間浸漬させた後、スライドを取り出し、水でリンスした。
【０２４４】
検体ＤＮＡ鎖がナノ粒子を修飾表面に結合させる能力を証明するために、連結オリゴヌクレオチドを調製した。（実施例２に記載のように調製した）連結オリゴヌクレオチドは、既に基板表面上に吸着されているＤＮＡ（配列番号３３）と相補的な１２ｂｐ末端を有する配列を含む２４ｂｐ長（５′ＴＡＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧＣＧ）［配列番号３４］であった。次いで、基板を、連結オリゴヌクレオチド（０．４ＯＤ、１．７μＭ）を含有するハイブリダイゼーション緩衝液（０．５Ｍ　ＮａＣｌ，１０ｍＭ　リン酸緩衝液ｐＨ７）溶液中に１２時間浸漬した。基板を取り出し、類似緩衝液でリンスした後、基板を、基板に付着している連結オリゴヌクレオチドのハイブリダイズしていない部分と相補的なオリゴヌクレオチド（ＴＡＧＧＡＣＴＴＡＣＧＣ５′チオール［配列番号３５］）（実施例３に記載のように調製）で修飾された直径１３ｎｍの金ナノ粒子を含有する溶液中に浸漬した。１２時間浸漬した後、基板を取り出し、ハイブリダイゼーション緩衝液でリンスした。基板の色は紫色に変わっており、５２０ｎｍでのＵＶ−可視吸光度はほぼ二倍になった（図１４Ａ）。
【０２４５】
オリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子が、連結オリゴヌクレオチドとのＤＮＡハイブリダイゼーション相互作用によりオリゴヌクレオチド／ナノ粒子修飾表面に付着したことを確認するために、融解曲線を作成した。融解実験のために、基板を１ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液を含有するキュベットに入れ、実施例２のパートＢで用いたものと同じ装置を用いた。基板の温度を０．５℃／分の速度で増大させながら、ナノ粒子に帰する吸光度シグナル（５２０ｎｍ）をモニターした。温度が６０℃を越えたときに、ナノ粒子のシグナルは劇的に低下した。図１４Ｂ参照。シグナルの一次導関数は６２℃の融解温度を示したが、これは、ナノ粒子を含まない溶液中でハイブリダイズした３つのＤＮＡ配列に関して見られた温度と一致する。図１４Ｂ参照。
【０２４６】
実施例７：　ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を用いたアッセイ
図１５Ａ−Ｇに示されている検出系は、２種のプローブ１および２が相補的標的４上に末端同士で整列するように設計した。これは、２つのプローブが標的鎖上に近接して整列している実施例５に記載の系とは異なる（図１２Ａ−Ｆ参照）。
【０２４７】
図１５Ａ−Ｇに示されているオリゴヌクレオチド−金ナノ粒子共役体は、実施例３に記載のように調製したが、但し、ナノ粒子は、ハイブリダイゼーション緩衝液（０．３Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　リン酸、ｐＨ７）に再分散させた。最終ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体濃度は、赤色のナノ粒子を生成する５２２ｎｍでの表面プラズモンバンド強度の低下を測定して、１３ｎＭであると予測した。図１５Ａ−Ｇに示されているオリゴヌクレオチド標的は、イリノイ州エバンストン所在のノースウエスタン大学バイオテクノロジー施設（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｅｖａｎｓｔｏｎ，ＩＬ）から購入した。
【０２４８】
１３ｎＭ　オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２を含有するハイブリダイゼーション緩衝液１５０μｌと、６０ｐｍｏｌ（６０μｌ）の標的４とを混合すると、溶液の色は直ぐに赤色から紫色に変化した。この変色は、金ナノ粒子の大きなオリゴヌクレオチド結合ポリマー網目構造の形成の結果として起こり、これは、ナノ粒子の表面プラズモン共鳴の赤色シフトをもたらす。溶液を２時間にわたって放置すると、大きな巨視的性質の凝集体の沈殿が観察された。懸濁凝集体を含む溶液の「融解分析」を実施した。「融解分析」を実施するために、溶液をハイブリダイゼーション緩衝液で１ｍｌに希釈し、温度を２５℃から７５℃まで上昇させながら、１分／１℃の保持時間で、２６０ｎｍでの凝集体の光学シグナチャーを１分間隔で記録した。５３．５℃の「融解温度」（Ｔｍ）で、オリゴヌクレオチド−ナノ粒子ポリマーとしての凝集体の特性決定と一致する、特徴的な急激な転移（半値全幅、一次導関数のＦＷ１／２＝３．５℃）が観察された。これは、ナノ粒子を含まないオリゴヌクレオチドに関して観察されたもっと広幅の転移（Ｔｍ＝５４℃、ＦＷ１／２＝〜１３．５℃）に関連するＴｍに十分匹敵する。ナノ粒子を含む分析と類似の条件下に、ナノ粒子を含まないオリゴヌクレオチド溶液の「融解分析」を実施したが、但し、温度は１０℃から８０℃まで増大させた。また、溶液の各オリゴヌクレオチド成分は１．０４μＭであった。
【０２４９】
系の選択性をテストするために、プローブ１と２の完全相補体４から形成された凝集体のＴｍを、１単塩基誤対合、欠失または挿入を含む標的から形成された凝集体のＴｍ′と比較した（図１５Ａ−Ｇ参照）。不完全標的を含むすべての金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド凝集体は、種々の凝集体のＴｍ値によって証明されているように、完全相補体から形成された凝集体と比べて、有意な測定可能不安定化を示した（図１５Ａ−Ｇ参照）。不完全標的を含有する溶液は、５２．５℃に保持された水浴に入れたときのそれらの色によって完全相補体を含有する溶液から容易に区別し得る。この温度は、誤対合ポリヌクレオチドのＴｍより高く、したがって、完全標的を含有する溶液のみがこの温度下に紫色を呈した。半相補的標的を含むプローブ溶液に関しても「融解分析」を実施した。２６０ｎｍでの吸光度は極くわずかに増大したことが観察された。
【０２５０】
次いで、ハイブリダイゼーション緩衝液中に５０μｌの各プローブ（１３ｎＭ）を含有する溶液に、２μｌ（２０ｐｍｏｌ）の各オリゴヌクレオチド標的（図１５Ａ−Ｇ参照）を加えた。室温下に１５分間放置した後、溶液を、温度制御水浴に移し、以下の表４に示されている温度下に５分間インキュベートした。次いで、各反応混合物の３μｌ試料をＣ−１８シリカプレート上にスポットした。凝集、したがって変色を誘発させるためには両プローブを標的上で整列させる必要があることを証明するために、２回の対照実験を行った。１回目の対照実験は、標的が存在しないプローブ１とプローブ２とから構成した。２回目の対照実験は、一方のプローブ配列のみと相補的な標的３を含むプローブ１とプローブ２とから構成した（図１５Ｂ参照）。結果は以下の表４に示されている。ピンク色のスポットは陰性テストを示し、青色のスポットは陽性テストを示している。
【０２５１】
注目すべきは、肉眼で検出し得る比色変化は、１℃未満にわたって発生し、それによって、完全標的４は、誤対合（５および６）、末端欠失（７）および２種のオリゴヌクレオチドプローブが出会う標的個所での１単塩基の挿入（８）を有する標的から容易に区別し得る（表４参照）ことである。比色変化Ｔｃは、Ｔｍと温度では近いが、同一ではない。どちらの対照の場合も、すべての温度下に観察されたピンクがかった赤色によって証明されるように、溶液中の粒子の凝集または不安定性の徴候はなく、すべての温度下のプレートテストで陰性スポット（ピンク色）を示した（表４）。
【０２５２】
１単塩基挿入標的８が完全相補性標的４から区別し得るという観察結果は、２種のプローブ配列を有する挿入鎖の完全相補性を考えれば、本当に注目すべきことである。８およびナノ粒子プローブから形成された凝集体の不安定化は、２つの短いプローブの使用と、完全相補性標的にハイブリダイズしたときにプローブの末端が出会う２つのチミジン塩基間の塩基の積み重ねの喪失とによるようである。同等条件（Ｔｍ＝５１℃）下に３塩基対挿入（ＣＣＣ）を含む標的をプローブとハイブリダイズさせると、類似の結果が観察された。実施例５で上述した系において、塩基挿入を有する標的は、完全相補性標的から区別できなかった。したがって、この実施例に記載されている系は選択性の点で極めて好ましい。また、この系は、増幅技術を用いずにおよそ１０ｆｍｏｌの実施例５に記載の系と同じ感度を示した。
【０２５３】
これらの結果は、標的鎖に沿った任意の１単塩基誤対合と共に、標的鎖への任意の挿入をも検出し得ることを示している。変色を検出し得る温度範囲は極めて急勾配であり、変化は極めて狭い温度範囲にわたって生じる。この急激な変化は、標的オリゴヌクレオチド鎖を介して結合された大きなコロイド網目構造が関与する融解プロセスに大きな協同度が存在することを示している。これは、データで示されているように顕著な選択性をもたらす。
【表４】
Figure 2004501340
【０２５４】
実施例８：　ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を用いたアッセイ
「充填」二本鎖オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを含む１式の実験を行った。図１６Ａに示されているナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体１および２を、図１６Ａ−Ｃに示されているような種々の長さの標的（２４、４８および７２塩基長）および相補的フィラーオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。条件は、その他の点では、実施例７に記載の通りであった。また、オリゴヌクレオチドとナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体は実施例７に記載のように調製した。
【０２５５】
予測したように、異なる反応溶液は、ハイブリダイゼーション後に、金ナノ粒子の間隔依存性光学特性による顕著に異なる光学特性を有していた。以下の表５参照。しかし、これらの溶液をＣ−１８　ＴＬＣプレート上にスポットして、室温または８０℃で乾燥させると、標的オリゴヌクレオチドの長さや金ナノ粒子間の間隔とは無関係に、青色を呈色した。表５参照。これは、固相支持体がハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体の凝集を促進するために起こると考えられる。これは、溶液をＴＬＣプレート上にスポットすることにより、金ナノ粒子間の間隔がかなり（少なくとも７２塩基）になるが、それでも比色検出が可能であることを証明している。
【０２５６】
【表５】
Figure 2004501340
この実施例や他の実施例で観察された変色は、金ナノ粒子間の間隔（粒子間間隔）がナノ粒子の直径とほぼ同じかそれより小さいときに起こる。したがって、ナノ粒子のサイズ、ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドのサイズ、およびナノ粒子を標的核酸にハイブリダイズさせるときのナノ粒子の間隔は、オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体が核酸標的とハイブリダイズして凝集体を形成するときに変色が観察可能であるかどうかに影響を与える。例えば、１３ｎｍの直径を有する金ナノ粒子は、長さが１０〜３５ヌクレオチドの標的配列とハイブリダイズするように設計されたナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドを用いて凝集させると、変色を生じるであろう。ナノ粒子を標的核酸にハイブリダイズさせたときに変色を生じさせるのに適したナノ粒子間間隔は、結果が証明しているように、凝集の度合いに応じて異なるであろう。これらの結果はさらに、固体表面が既に凝集している試料の凝集をさらに促進し、金ナノ粒子をさらに近接させることを示している。
【０２５７】
金ナノ粒子に関して観察された変色は、金の表面プラズモン共鳴のシフトや広がりによるものであり得る。この変色が直径が約４ｎｍ未満の金ナノ粒子に関して起こる可能性はありそうにない。というのは、核酸の特異的検出に必要なオリゴヌクレオチドの長さがナノ粒子の直径を超えるからである。
【０２５８】
実施例９：　ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を用いたアッセイ
それぞれプローブ１と２（図１２Ａ）から５μｌを緩衝液（１０ｍＭ　リン酸、ｐＨ７）と合わせて０．１Ｍ　ＮａＣｌの最終濃度とし、この溶液にヒト尿１μｌを添加した。この溶液を凍結、解凍し、次いでＣ−１８　ＴＬＣプレート上にスポットしたが、青色は発生しなかった。１２．５μｌの各プローブと、２．５μｌのヒト尿を含有する類似溶液に、０．２５μｌ（１０ｐｍｏｌ）の標的３（図１２Ａ）を加えた。溶液を凍結、解凍し、次いでＣ−１８　ＴＬＣプレート上にスポットすると、青色スポットが得られた。
【０２５９】
ヒト唾液の存在下で類似実験を行った。１２．５μｌの各プローブ１および２と、２および２．５μｌの標的３を含有する溶液を７０℃に加熱した。室温に冷ました後、２．５μｌの唾液溶液（水で１：１０希釈したヒト唾液）を加えた。得られた溶液を凍結、解凍し、次いで、Ｃ−１８　ＴＬＣプレート上にスポットした後、プローブと標的のハイブリダイゼーションを示す青色スポットが得られた。標的を加えなかった対照実験では、青色スポットは観察されなかった。
【０２６０】
実施例１０：　ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を用いたアッセイ
図１３Ａに示されているようにアッセイを実施した。先ず、フィッシャー・サイエンティフィック社から購入したガラス製顕微鏡スライドを先端にダイヤモンドが付いたけがきペンで約５×１５ｍｍの部片に切断した。スライドを５０℃の４：１のＨ２ＳＯ４：Ｈ２Ｏ２溶液中に２０分間浸漬して清浄した。次いで、スライドを多量の水、次いでエタノールでリンスし、乾燥窒素流下に乾燥させた。改変した文献記載手順（Ｃｈｒｉｓｅｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，第２４巻，３０３１−３０３９ページ（１９９６年））を用いてチオール修飾ＤＮＡをスライド上に吸着させた。先ず、スライドを、室温下に、Ｎａｎｏｐｕｒｅ水中の１ｍＭ酢酸中のトリメトキシシリルプロピルジエチルトリアミン１％溶液（ＤＥＴＡ、ペンシルベニア州ブリストル所在のユナイテッド・ケミカル・テクノロジー社（Ｕｎｉｔｅｄ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＰＡ）から購入）中に２０分間浸漬した。スライドを水、次いでエタノールでリンスした。乾燥窒素流で乾燥させた後、温度制御加熱ブロックを用いて１２０℃で５分間焼成した。スライドを冷まし、次いで、室温下に２時間、８０：２０メタノール：ジメトキシスルホキシド中１ｍＭのスクシンイミジル−４−（マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ、シグマ・ケミカルズ社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から購入）中に浸漬した。ＳＭＰＢ溶液から取り出して、エタノールでリンスした後、ＳＭＰＢ架橋剤と結合しなかったアミン部位に以下のようにキャップ形成した。先ず、スライドを、１０％　１−メチルイミダゾールを含有する８：１　ＴＨＦ：ピリジン溶液中に５分間浸漬した。次いで、スライドを、９：１　ＴＨＦ：無水酢酸溶液中に５分間浸漬した。これらのキャッピング溶液は、ヴァージニア州スターリング所在のグレン・リサーチ社から購入した。スライドをＴＨＦ、次いでエタノール、最後に水でリンスした。
【０２６１】
修飾ガラス製スライドを、新たに精製されたオリゴヌクレオチド（３′チオールＡＴＧＣＴＣＡＡＣＴＣＴ［配列番号３３］を含有する０．２ＯＤ（１．７μＭ）溶液中に浸漬して、ＤＮＡを表面に付着させた。１２時間浸漬した後、スライドを取り出し、水でリンスした。
【０２６２】
検体ＤＮＡ鎖がナノ粒子を修飾基板表面に結合させる能力を証明するために、連結オリゴヌクレオチドを調製した。連結オリゴヌクレオチドは、既に基板表面上に吸着されているＤＮＡと相補的な１２ｂｐ末端を含む配列を有する２４ｂｐ長（５′ＴＡＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧＣＧ）［配列番号３４］であった。次いで、基板を、連結オリゴヌクレオチド（０．４ＯＤ、１．７μＭ）を含有するハイブリダイゼーション緩衝液（０．５Ｍ　ＮａＣｌ，１０ｍＭ　リン酸緩衝液ｐＨ７）溶液中に１２時間浸漬した。基板を取り出し、類似緩衝液でリンスした後、基板を、基板に付着している連結オリゴヌクレオチドのハイブリダイズしていない部分と相補的なオリゴヌクレオチド（ＴＡＧＧＡＣＴＴＡＣＧＣ５′チオール［配列番号３５］）で修飾されている直径１３ｎｍの金ナノ粒子を含有する溶液中に浸漬した。１２時間浸漬した後、基板を取り出し、ハイブリダイゼーション緩衝液でリンスした。ガラス製基板の色は透明な無色から透明なピンク色に変わっていた。図１９Ａ参照。
【０２６３】
スライドを上記のような連結オリゴヌクレオチド溶液に浸漬し、次いで、オリゴヌクレオチド（３′チオールＡＴＧＣＴＣＡＡＣＴＣＴ［配列番号３３］）が付着している直径１３ｎｍの金ナノ粒子を含有する溶液に浸漬して、スライドに追加のナノ粒子層を加えた。１２時間浸漬した後、上記のように、スライドをナノ粒子溶液から取り出し、リンスして、ハイブリダイゼーション溶液中に浸漬した。スライドの色は、はっきり分るほど赤色が濃くなっていた。図１９Ａ参照。最終ナノ粒子層としてオリゴヌクレオチド（ＴＡＧＧＡＣＴＴＡＣＧＣ５′チオール［配列番号３５］）で修飾した１３ｎｍの金ナノ粒子を用いて連結オリゴヌクレオチドおよびナノ粒子浸漬手順を繰り返して最終ナノ粒子層を加えた。この場合も、色は濃くなり、５２０ｎｍのＵＶ−可視吸光度は増大した。図１９Ａ参照。
【０２６４】
オリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子が連結オリゴヌクレオチドとのＤＮＡハイブリダイゼーション相互作用によりオリゴヌクレオチド修飾表面に付着したことを確認するために、融解曲線を作成した。融解実験のために、スライドを、１．５ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液を含有するキュベットに入れ、実施例２のパートＢで用いたものと類似の装置を用いた。基板の温度を２０℃から８０℃まで増大させながら、１℃／１分の保持時間で、ナノ粒子に帰する吸光度シグナル（５２０ｎｍ）をモニターした。温度が５２℃を越えたとき、ナノ粒子のシグナルは劇的に低下した。図１９Ｂ参照。シグナルの一次導関数は、５５℃の融解温度を示したが、これは、溶液中でハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体と連結オリゴヌクレオチドに関して見られた温度と一致する。図１９Ｂ参照。
【０２６５】
実施例１１：　プローブとしてナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を用いたポリリボヌクレオチドアッセイ
これまでの実施例は、アッセイにおける標的としてオリゴ−デオキシリボヌクレオチドを利用した。本実施例は、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体をポリリボヌクレオチドアッセイにおけるプローブとして用い得ることを証明する。ポリ（ｒＡ）（０．００４２６０単位）の溶液１μｌを、５′末端のメルカプトアルキルリンカーを介してｄＴ２０（チミジレート残基を含有する２０ｍｅｒオリゴヌクレオチド）に結合している１００μＬの金ナノ粒子（粒子中〜１０ｎＭ）に加えて、実験を行った。結合手順は、実施例３に記載のものであった。実施例４に記載のように、ドライアイス／イソプロピルアルコール浴中で凍結し、室温下に解凍し、Ｃ１８　ＴＬＣプレート上にスポットした後、ハイブリダイゼーションによるナノ粒子の凝集の特徴を示す青色スポットが観察された。標的の不在下に実施した対照実験では、青色スポットではなく、ピンク色のスポットを得た。
【０２６６】
実施例１２：　ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を用いた炭疽菌保護抗原セグメントのアッセイ
多くの場合、ＰＣＲによる二本鎖ＤＮＡ標的の増幅にはアッセイに十分な材料を提供することが必要である。本実施例は、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体が、ＤＮＡ鎖をその相補体の存在下にアッセイする（すなわち、二本鎖標的の熱デハイブリダイゼーション後に一本鎖に関してアッセイする）ために使用し得、かつＰＣＲ反応から得られたアンプリコンを認識して、特異的に結合し得ることを証明する。
【０２６７】
炭疽菌の保護抗原セグメントの１４１塩基対二本鎖アンプリコンを含有するＰＣＲ溶液は海軍省（Ｎａｖｙ）から提供された（図１２に示されている配列）。このアンプリコンのアッセイは、Ｑｉａｑｕｉｃｋ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｒｅｍｏｖａｌ　Ｋｉｔ（カリフォルニア州サンタ・クラリタ所在のキアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ））およびこのキット用の標準プロトコルを用いて、１００μｌのＰＣＲ溶液からＤＮＡを単離して実施したが、但し、ＤＮＡの溶離は、キットで提供された緩衝液を用いるのではなく、ｐＨ８．５の１０ｍＭ　リン酸緩衝液を用いて実施した。次いで、Ｓｐｅｅｄ　Ｖａｃ（サバント社（Ｓａｖａｎｔ））上で溶離液を蒸発乾固した。この残留物に、２種の異なるオリゴヌクレオチド−ナノ粒子プローブ（図２３参照）からなる２種の各溶液を等量混合して調製した５μｌのマスター混合物を添加した。各オリゴヌクレオチド−ナノ粒子プローブは、実施例３に記載のように調製した。マスター混合物を形成するために合わせたプローブ溶液は、１０μｌの２Ｍ　ＮａＣｌおよび５μｌのオリゴヌクレオチドブロッカー溶液（０．３Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　リン酸、ｐＨ７．０溶液中５０ｐｍｏｌの各ブロッカーオリゴヌクレオチド（図２３および以下参照））を、５μｌの全強度（約１０ｎＭ）のナノ粒子−オリゴヌクレオチド溶液に加えて調製した。アンプリコン−プローブ混合物を３分間で１００℃に加熱し、次いで、ドライアイス／エタノール浴中で凍結し、室温に解凍した。小アリコート（２μｌ）をＣ１８　ＴＬＣプレート上にスポットし、乾燥させた。ハイブリダイゼーションを示す濃い青色のスポットを得た。
【０２６８】
アンプリコン標的の不在下、プローブ１の不在下、プローブ２の不在下、または塩化ナトリウムの不在下に、同様な方法で対照テストを実施したが、すべて陰性、すなわち、ピンク色のスポットを得た。同様に、保護抗原セグメントの代わりに炭疽菌の致死因子セグメント由来のＰＣＲアンプリコンを含むプローブ１および２を用いて実施したテストは陰性（ピンク色のスポット）。これらの対照により、どちらのプローブも必要不可欠であり、ハイブリダイゼーションに適した塩条件が必要であり、かつテストは特定の標的配列特異的であることが確認された。
【０２６９】
初期二本鎖標的の第２鎖（すなわち、標的鎖と相補的な鎖）がプローブに結合するセグメントの外側の標的核酸領域に結合するのを阻止するためにオリゴヌクレオチドブロッカーを付加した（配列に関しては図２３参照）。というのは、そのような結合はナノ粒子オリゴヌクレオチドプローブと標的鎖との結合に干渉するからである。この実施例では、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、プローブによって被覆されない領域の一本鎖標的と相補的であった。代替計画は、プローブオリゴヌクレオチドと競合する領域外のＰＣＲ相補鎖（標的鎖と相補的な鎖）と相補的なブロッカーオリゴヌクレオチドを用いるものである。
【０２７０】
実施例１３：　ＰＣＲ溶液からアンプリコンを単離しないＰＣＲアンプリコンの直接アッセイ
実施例１２に記載の手順は、ナノ粒子−オリゴヌクレオチドプローブを付加する前にＰＣＲ溶液からＰＣＲアンプリコンを分離するステップを含むものであった。多くの目的のためには、前以てポリヌクレオチド産物を単離することなく、ＰＣＲ溶液中で直接アッセイを実施し得ることが望ましいであろう。そのようなアッセイ用のプロトコルが開発されており、それを以下に説明する。このプロトコルは、Ａｍｐｌｉｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを含むＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔを用い、標準条件下に誘導されたいくつかのＰＣＲ産物を使って首尾良く実施されている。
【０２７１】
５０μｌのＰＣＲ試料溶液に、２種の金ナノ粒子−オリゴヌクレオチドプローブ（それぞれ０．００８Ａ５２０単位）の混合物５μｌを添加し、次いで、１μｌのブロッカーオリゴヌクレオチド（各１０ｐｍｏｌ）と、５μｌの５Ｍ　ＮａＣｌと、２μｌの１５０ｍＭ　ＭｇＣｌ２を加えた。この混合物を１００℃下に２分間加熱して二本鎖標的の鎖を分離し、管を直接冷浴（例えば、ドライアイス／エタノール）に２分間浸漬し、次いで、管を取り出して、溶液を室温下に解凍した（凍結−解凍サイクルにより、プローブと標的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが容易になる）。最後に、数μｌの溶液をプレート（例えば、Ｃ１８　ＲＰ　ＴＬＣプレート、シリカプレート、ナイロン膜など）上にスポットした。例の通り、青色はＰＣＲ溶液中の標的核酸の存在を示し、ピンク色はこの標的に関して陰性である。
【０２７２】
実施例１４：　ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体の集合体を用いた、デハイブリダイゼーションを行わない二本鎖オリゴヌクレオチドの直接認識
これ以前の実施例では、ナノ粒子に結合している一本鎖オリゴヌクレオチドプローブと相互作用させる一本鎖を生成するために、二本鎖標的を加熱してデハイブリダイズさせた。本実施例は、三本鎖複合体を形成し得る場合、前以て標的をデハイブリダイズさせなくても、二本鎖オリゴヌクレオチド配列がナノ粒子によって認識され得ることを証明する。
【０２７３】
２種の異なる系、ポリＡ：ポリＵおよびｄＡ４０：ｄＴ４０を用い、１００μｌの緩衝液（０．１Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　リン酸、ｐＨ７．０）中に０．８Ａ２６０単位の標的二本鎖を含有する溶液１μｌを、０．３Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中のＡｕ−ｓｄＴ２０ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体（粒子中〜１０ｎＭ；実施例１１参照）のコロイド溶液１００μｌに加えて、テストを実施した。その後、管をドライアイス／イソプロピルアルコール浴中に浸漬して急速凍結し、管を浴から取り出して解凍して、室温（２２℃）下に放置し、次いで、３μｌの溶液をＣ１８　ＴＬＣプレート上にスポットして、ナノ粒子のハイブリダイゼーションおよび凝集の特徴を示す青色のスポットを得た。
【０２７４】
このテストの原理は、（この実施例ではピリミジンオリゴヌクレオチドを担持する）ナノ粒子プローブが、配列特異的に、二本鎖標的に沿ったプリンオリゴヌクレオチド／ピリミジンオリゴヌクレオチド部位で結合することである。各二本鎖体上の多くの結合部位が利用可能なので、結合によって、ナノ粒子凝集体が形成される。これらの結果は、ナノ粒子プローブを含む三本鎖複合体をベースとするこのアッセイが、オリゴリボヌクレオチド二本鎖標的にも、オリゴデオキシリボヌクレオチド二本鎖標的にも機能することを示している。
【０２７５】
実施例１５：　蛍光検出と比色検出とを用いるアッセイ
すべてのハイブリダイゼーション実験は、０．３Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　リン酸、ｐＨ７．０、緩衝液中で実施した。ＡｃｅｔａｔｅＰｌｕｓＴＭ濾過メンブレン（０．４５μｍ）は、マサチューセッツ州ウエストボロ所在のミクロン・セパレ−ションズ社（Ｍｉｃｒｏｎ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｏｒｏ，ＭＡ）から購入した。アルキルアミン官能化ラテックスミクロスフェア（３．１μｍ）は、インディアナ州フィッシャーズ所在のバングス・ラボラトリーズ社（Ｂａｎｇｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｉｓｈｅｒｓ，ＩＮ）から購入した。Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ　Ｃ７　ＣＰＧ固相支持体（グレン・リサーチ社）およびＥｘｐｅｄｉｔｅ　８９０９合成機上の５′−フルオロセインホスホロアミダイト（６−ＦＡＭ，グレン・リサーチ社）を使う標準ホスホロアミダイト化学（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，第１版，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９１年）を用いて、３′末端をアルキルアミノ基で官能化した発蛍光団標識オリゴヌクレオチドを合成し、逆相ＨＰＬＣで精製した。これらのオリゴヌクレオチドを、Ｃｈａｒｒｅｙｒｅら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第１３巻，３１０３−３１１０ページ（１９９７年）に記載のようにジチオ尿素結合を生成するジイソチオシアネートカップリングを用いて、アミン官能化ラテックスミクロスフェアに付着させた。簡単に説明すると、１０００倍過剰の１，４−フェニレンジチオシアネートのＤＭＦ溶液を、アミノ修飾オリゴヌクレオチドの水性ホウ酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．３）に加えた。数時間後、過剰な１，４−フェニレンジイソチオシアネートをブタノールで抽出し、水溶液を凍結乾燥した。活性化オリゴヌクレオチドをホウ酸緩衝液に再溶解させて、炭酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．３、１Ｍ　ＮａＣｌ）中でアミノ官能化ラテックスミクロスフェアと反応させた。１２時間後、粒子を遠心分離し、緩衝塩類溶液（０．３Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　リン酸、ｐＨ７．０）で３回洗浄した。５′−オリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子を実施例３に記載のように調製した。
【０２７６】
標的オリゴヌクレオチド（１〜５μｌ、３ｎＭ）を、３μｌの発蛍光団で標識したオリゴヌクレオチド修飾ラテックスミクロスフェアプローブ溶液（３．１μｍ；１００ｆＭ）に添加した。５分後、３μｌの５′オリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子プローブ溶液（１３ｎｍ；８ｎＭ）を、標的およびラテックスミクロスフェアプローブを含有する溶液に加えた。さらに１０分間放置した後、プローブと標的とを含有する溶液をＡｃｅｔａｔｅＰｌｕｓメンブレンに通じて真空濾過した。メンブレンは、比較的大きいラテックス粒子を保持し、ハイブリダイズしなかった金ナノ粒子プローブはすべて通過させた。十分な濃度の標的と、標的にハイブリダイズしたラテックスミクロスフェアおよび金ナノ粒子との存在下、メンブレン上に赤色スポットが観察された（陽性結果）。標的オリゴヌクレオチドを含有する溶液のアリコートを等量の水に代えた対照実験を常に行った。この場合、メンブレン上には白色スポットが残された（陰性結果）。２４塩基対モデル系の場合、比色計で３ｆｍｏｌの標的オリゴヌクレオチドを肉眼検出できた。
【０２７７】
二本鎖標的オリゴヌクレオチド（１〜５μｌ、２０ｎＭ）、３μｌの発蛍光団標識オリゴヌクレオチド−ラテックスミクロスフェア（３．１μｍ；１００ｆＭ）および３μｌの５′−オリゴヌクレオチド−金ナノ粒子（１３ｎｍ；８ｎＭ）を合わせ、３分間で１００℃に加熱した。次いで、直ぐに溶液を含有する反応容器を液体Ｎ２浴に３分間に浸漬して凍結した。次いで、この溶液を室温下に解凍し、上記のように濾過した。２４塩基対のモデル系に関して、比色計で、２０ｆｍｏｌの二本鎖オリゴヌクレオチドが肉眼検出できた。
【０２７８】
蛍光によってモニターする場合、上記検出法はメンブレンからのバックグラウンド蛍光のために困難であることが証明された。この問題は、アリコートを逆相ＴＬＣプレート上にスポットする前に過剰な金ナノ粒子プローブを除去するためにラテックスミクロスフェアを遠心して「洗浄」することによって克服された。ハイブリダイゼーション実験を上述のように実施した。プローブと標的とのハイブリダイゼーションを実施した後、溶液に１０μｌの緩衝液を添加し、次いで、１０，０００×ｇで２分間遠心した。上清を除去し、沈殿物の再懸濁を支援するために５μｌの緩衝液を添加した。次いで、３μｌアリコートを逆相ＴＬＣプレート上にスポットした。一本鎖オリゴヌクレオチドと二本鎖標的オリゴヌクレオチドのどちらに関しても、比色計により２５ｆｍｏｌが肉眼検出できた。スポットの形成に用いた３μｌアリコート中の標的の量が５０ｆｍｏｌの低さになるまで、ハンドヘルドＵＶランプを用いて肉眼で蛍光スポットを視ることができた。この系を最適化することにより、もっと低量の標的核酸の検出も可能になるであろう。
【０２７９】
実施例１６：　銀染色法を用いたアッセイ
溶液中の特定のＤＮＡ配列の存在を検出するためには、一般に、オリゴヌクレオチド修飾基板上のＤＮＡハイブリダイゼーションテストが用いられる。遺伝子情報を精査するための組合せＤＮＡ配列の有望性が増してきていることは、未来の科学に対するこれらの異種配列アッセイの重要性を物語っている。ほとんどのアッセイにおいて、発蛍光団標識標的と表面結合プローブとのハイブリダイゼーションは、蛍光顕微鏡検査またはデンシトメーター検査によりモニターされている。蛍光検出は極めて感度が良いが、その使用は、実験装置費用とほとんどの慣用基板からのバックグラウンド放射とにより制限される。さらに、１単塩基誤対合を有するものに比べ完全相補性プローブに対する標識オリゴヌクレオチド標的への選択性の方が低いために、一ヌクレオチド多形を検出するための表面ハイブリダイゼーションテストが使用できない。蛍光法の簡易性、感度および選択性が改良された検出計画によって、組合せ配列の全ての可能性を具現化することができる。本発明はそのような改良型検出計画を提供する。
【０２８０】
例えば、３成分サンドイッチアッセイにおいて、オリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子と非修飾ＤＮＡ標的を、ガラス基板に付着しているオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせることができた（図２５Ａ−Ｂ参照）。ナノ粒子は、個別のもの（図２５Ａ参照）であっても、複数のナノ粒子の「ツリー」（ｔｒｅｅ）（図２５Ｂ参照）であってもよい。「ツリー」は、個別のナノ粒子に比べてシグナル感度を増大させ、ハイブリダイズした金ナノ粒子の「ツリー」は、ガラス基板上の暗色領域として肉眼で観察できることが多い。「ツリー」を用いない場合、または「ツリー」によって生成されたシグナルを増幅させるためには、ハイブリダイズした金ナノ粒子を銀染色溶液で処理し得る。「ツリー」は、染色プロセスを促進し、個別ナノ粒子に比べて標的核酸の検出をより高速にする。
【０２８１】
以下は、（図２５Ａに例示されている）１つの特定の系の説明である。捕獲オリゴヌクレオチド（３′−ＨＳ（ＣＨ２）３−Ａ１０ＡＴＧＣＴＣＡＡＣＴＣＴ；配列番号４３）を、実施例１０に記載のように、ガラス基板上に固定した。標的オリゴヌクレオチド（５′−ＴＡＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧＣＧ−３′、配列番号４４、各実験用に以下の表６に示されている濃度）と捕獲オリゴヌクレオチドとを、実施例１０に記載のように、０．３Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　リン酸緩衝液中でハイブリダイズさせた。基板を同一緩衝液で２回リンスし、標的相補性ＤＮＡ（５′−ＨＳ（ＣＨ２）６Ａ１０ＣＧＣＡＴＴＣＡＧＧＡＴ、配列番号４５）（実施例３に記載の配合物）で官能化した金ナノ粒子プローブを含有する溶液中に１２時間浸漬した。次いで、基板を０．３Ｍ　ＮａＮＯ３で何回もリンスしてＣｌ−を除去した。次いで、基板を銀染色溶液（Ｓｉｌｖｅｒ　Ｅｎｈａｎｃｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ＡとＢの１：１混合物、シグマ・ケミカル社、＃Ｓ−５０２０および＃Ｓ−５１４５）で３分間現像した。グレースケール測定値を計算し得るソフトウエア（例えば、Ａｄｏｂｅ　Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ）をロードしたコンピュータに連結した（通常、文書をコンピュータにスキャンするのに用いられる）平台型スキャナで基板をスキャンしてグレースケール測定を行った。結果を以下の表６に示す。
【表６】
Figure 2004501340
【０２８２】
実施例１７：　量子ドットを含む集合体
この実施例は、半導体ナノ粒子量子ドット（ＱＤ）上の合成一本鎖ＤＮＡの固定化を説明する。天然ＣｄＳｅ／ＺｅＳコア／シェルＱＤ（〜４ｎｍ）は有機媒質にのみ可溶であるために、アルキルチオールを末端基とする一本鎖ＤＮＡと直接反応しにくい。この問題は、先ず、ＱＤに３−メルカプトプロピオン酸でキャップ形成することにより回避された。次いで、カルボン酸基を４−（ジメチルアミノ）ピリジンで脱保護して、粒子を水溶性とし、ＱＤと、３′−プロピルチオールまたは５′−ヘキシルチオール修飾オリゴヌクレオチド配列とを反応し易くした。ＤＮＡ修飾後、透析により、反応しなかったＤＮＡから粒子を分離した。次いで、「リンカー」ＤＮＡ鎖を表面結合配列とハイブリダイズさせて、長いナノ粒子集合体を生成した。ＴＥＭ、ＵＶ／可視分光法および蛍光顕微鏡検査により特性決定したＱＤ集合体は、溶液温度を制御することにより可逆的に集合させ得る。新規ＱＤ集合体およびＱＤと金ナノ粒子（〜１３ｎｍ）間に形成された複合凝集体の温度依存性ＵＶ−可視スペクトルを得た。
【０２８３】
Ａ．　一般法
ＮＡＮＯｐｕｒｅ超純水精製系を用いて調製したナノピュア水（１８．１ＭΩ）を一貫して用いた。Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　ＬＳ　５０Ｂ蛍光分光計を用いて蛍光スペクトル得た。Ｈｐ　９０９０ａ　Ｐｅｌｔｉｅｒ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを具備したＨＰ　８４５３ダイオードアレイ分光光度計を用いて融解分析を実施した。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　５４１５遠心機またはＢｅｃｋｍａｎ　Ａｖａｎｔｉ　３０遠心機を用いて遠心を行った。２００ｋＶで操作する日立　ＨＦ−２０００電界放出ＴＥＭを用いてＴＥＭ画像を得た。
【０２８４】
Ｂ．　オリゴヌクレオチド−ＱＤ共役体の調製
半導体量子ドット（ＱＤ）の合成法は最近の数年間に大きく改良されており、ある種の材料、最も注目すべきことにはＣｄＳｅに関して、今や予備決定サイズの単分散試料を比較的容易に調製し得る。Ｍｕｒｒａｙら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１５巻，８７０６ページ，１９９３年；Ｈｉｎｅｓら，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，第１００巻，４６８ページ，１９９６年。その結果、ＱＤを発光ダイオード（Ｓｃｈｌａｍｐら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．，第８２巻，５８３７ページ，１９９７年；Ｄａｂｂｏｕｓｉら，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，第６６巻，１３１６ページ、１９９５年）および非放射性生物学的標識（Ｂｒｕｃｈｅｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２８１巻，２０１３ページ，１９９８年；Ｃｈａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２８１巻，２０１６ページ，１９９８年）などの多様なテクノロジーに用いるための道を開く可能性があるこれらの粒子の固有の電子特性および蛍光特性が広範囲に研究されている（Ａｌｉｖｉｓａｔｏｓ，Ｊ．，Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，第１００巻，１３２２６ページ，１９９６年、およびその中の参考文献；Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，６９９，１９９７年；Ｋｕｎｏら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，第１０６巻，９８６９ページ，１９９７年；Ｎｉｒｍａｌら，Ｎａｔｕｒｅ，第３８３巻，８０２ページ，１９９６年参照）。しかし、多くの用途では、これらの粒子は表面上に空間的に配列されるか、または三次元物質中に組織化されることが要求されるであろう（Ｖｏｓｓｍｅｙｅｒら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．，第８４巻，３６６４ページ，１９９８年）。さらに、１種以上のナノ粒子を超格子構造（Ｍｕｒｒａｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２７０巻，１３３５ページ，１９９５年）中に組織化する能力があれば、新規かつ潜在的に興味深く有用な特性を有する完全に新しい種類のハイブリッド材料の構築が可能になるであろう。
【０２８５】
ＤＮＡは、ナノスケールの構築ブロック集合体を周期的な二次元および三次元拡張構造中にプログラムするための理想的なシントンである。合成し易さ、非常に高い結合特異性およびヌクレオチド配列による実質的に無制限のプログラム可能性を含むＤＮＡの多くの特性をＱＤ集合体の使用に利用し得る。
【０２８６】
ＤＮＡによるＱＤの修飾は、金ナノ粒子の場合よりも困難であることが証明された。高い蛍光ＣｄＳｅ　ＱＤを調製するための一般法によって、トリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）とトリオクチルホスフィン（ＴＯＰ）の混合物でコートされた材料が得られる。その結果、これらのＱＤは、非極性溶媒にのみ可溶になり、そのため、ＱＤを高荷電ＤＮＡ鎖で直接反応により官能化するのは難しい。この難点は、初めて半導体ナノ粒子を一本鎖ＤＮＡで修飾することに成功した以下に記載の方法により克服された。他の人々は、精密な研究において、ＱＤと二本鎖ＤＮＡとの相互作用を考えていたが、これらの研究は、拡張ＱＤ構造の集合体を誘導するＤＮＡの配列特異的結合特性を利用しなかったことに留意されたい。Ｃｏｆｆｅｒら，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，第６９巻，３８５１ページ，１９９６年；Ｍａｈｔａｂら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１４８巻，７０２８ページ，１９９６年。
【０２８７】
ＣｄＳｅ／ＺｎＳコア／シェルＱＤの表面は有機チオールと結合するので、これらの半導体粒子を、置換反応により、アルキルチオールを末端基とするＤＮＡ鎖で修飾することが望ましかった。しかし、これらのＱＤは水溶性ではないので、そのような方法は妨げられた。最近、ＱＤを水溶性にして、ＱＤ表面上にタンパク質構造を固定化させるための２種の異なる方法が報告された。一方は、シリカ層でコア／シェル構造を封入するステップを含み（Ｂｒｕｃｈｅｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２８１巻，２０１３ページ，１９９８年）、他方は、粒子を安定させ、かつ水溶性とするためにメルカプト酢酸を利用する（Ｃｈａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２８１巻，２０１６ページ，１９９８年）。ＤＮＡハイブリダイゼーション条件下に著しく安定したコロイドを生成する、この実施例に記載されている手順は、ＱＤ表面を不動態化するために３−メルカプトプロピオン酸を利用する。
【０２８８】
１．０ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；オールドリッチ社）中の（Ｈｉｎｅｓら，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，第１００巻，４６８ページ，１９９６年に記載のように調製した）〜２０ｍｇのＴＯＰ／ＴＯＰＯ安定化ＣｄＳｅ／ＺｎＳ　ＱＤの懸濁液に、シリンジを用いて、過剰な３−メルカプトプロピオン酸（０．１０ｍｌ、１．１５ｍｍｏｌ；オールドリッチ社）を添加して、３−メルカプトプロピオン酸官能化ＱＤを含有する透明な黒みがかったオレンジ色の溶液を生成した。反応は急速に起こった。後続反応のために、過剰な３−メルカプトプロピオン酸を除去せず、粒子を室温下にＤＭＦ中に保存した。
【０２８９】
しかし、ＱＤの特性決定のために、試料の一部から反応しなかった３−メルカプトプロピオン酸を以下のように除去して精製した。０．５０ｍｌ試料を（３０，０００ｒｐｍで４時間）遠心し、上清を除去した。残りの溶液を〜０．３ｍｌのＤＭＦで洗浄し、再遠心した。このステップをさらに２回繰り返してから、ＦＴＩＲスペクトルを記録した。ＦＴＩＲ（ポリエチレンカード、３Ｍ社）：１７１０ｃｍ−１（ｓ）、１４７２ｃｍ−１（ｍ）、１２７８ｃｍ−１（ｗ）、１１８９ｃｍ−１（ｍ）、１０４５ｃｍ−１（ｗ）、９９３ｃｍ−１（ｍ）、９４６ｃｍ−１（ｗ）、７７６ｃｍ−１（ｍ）、６７１ｃｍ−１（ｍ）。ＴＯＰ／ＴＯＰＯ安定化天然ＱＤとは異なり、３−メルカプトプロピオン酸修飾ＱＤは、表面結合プロピオン酸に特徴的な１７１０ｃｍ−１のｖｃｏバンドを示した。
【０２９０】
３−メルカプトプロピオン酸修飾ＱＤは水に実質的に不溶であるが、それらの溶解度は、以下のパラグラフに記載のように、表面結合メルカプトプロピオン酸部位を４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ；オールドリッチ社）で脱保護して有意に高めることができた。そうすると、ＱＤは水に容易に分散し、オレンジ色の溶液となり、この溶液は室温下に１週間まで安定であった。
【０２９１】
オリゴヌクレオチドをＱＤに付着させるために、ＤＭＦ中の３−メルカプトプロピオン酸官能化粒子溶液１５０μｌ（５３０ｎｍでの光学密度＝２１．４）を、０．４ｍｌのＤＭＦ中のＤＭＡＰ（８．０ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。オレンジ色の沈殿物が形成された。これを、遠心（３，０００ｒｐｍで〜３０秒）により分離し、次いで、３′プロピルチオール−または５′ヘキシルチオール−を末端基とするオリゴヌクレオチド（１．０〜２．０ＯＤ／ｍｌ；実施例１に記載のように調製；配列は以下に記載）の溶液１．０ｍｌに溶解させた。（水に溶解した）沈殿物をＩＲスペクトロスコピー（ポリエチレンカード、３Ｍ社）によって特性決定した。ＩＲ（ｃｍ−１）：　１６４７（ｍ）、１５５９（ｓ）、１４６２（ｍ）、１２１４（ｗ）、７１９（ｗ）、４７８（ｓ）。１２時間放置した後、オリゴヌクレオチド含有溶液を０．１５Ｍ　ＮａＣｌに加え、粒子をさらに１２時間熟成させた。次いで、ＮａＣｌの濃度を０．３Ｍに高め、混合物をさらに２４〜４０時間放置してから、１００ｋＤａメンブレン（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ　Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　Ｅｓｔｅｒ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ）を用いてＰＢＳ（０．３Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　リン酸緩衝液、ｐＨ７、０．０１％アジ化ナトリウム）で透析した。透析は４８時間にわたって実施し、その間に、透析浴を３回新しくした。
【０２９２】
このようにして調製したオリゴヌクレオチド−ＱＤ共役体は、不定な水安定性を示した。さらに、コロイドは、（〜３．２ｎｍ　ＣｄＳｅコアを示す；Ｍｕｒｒａｙら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１５巻，８７０６ページ，１９９３年）５４６ｎｍでの急激な［半値全幅（ＦＷＨＭ）＝３３ｎｍ］対称発光を有し、強力に蛍光性のままであった。
【０２９３】
このプロトコルにより、２種の異なるオリゴヌクレオチド−ＱＤ共役体を調製し、ＰＢＳ中に保存した。一方は、３′末端のプロピルチオール官能基と、１２ｍｅｒ捕獲配列と、介在１０塩基（すべてＡ）スペーサー：５′−ＴＣＴＣＡＡＣＴＣＧＴＡＡ１０−（ＣＨ２）３−ＳＨ［配列番号４６］とからなる２２ｍｅｒで修飾した。他方は、５′−ヘキシルチオールを末端基とする配列と、さらに１０塩基（すべてＡ）スペーサー、および３′−プロピルチオール配列とは非相補的な１２ｍｅｒ捕獲配列：５′−ＳＨ−（ＣＨ２）６−Ａ１０ＣＧＣＡＴＴＣＡＧＧＡＴ−３′［配列番号４７］を用いた。
【０２９４】
Ｃ．　ＱＤ集合体の調製
ほぼ等量のこれら２種のオリゴヌクレオチド（それぞれ、２００μｌ、ＯＤ５３０＝０．２２４および０．２０６）を混合し、次いで、相補的な連結２４ｍｅｒ配列（５′−ＴＡＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＡＴＣＣＴ−ＧＡＡＴＧＣＧ−３′、配列番号４８）の溶液６μｌ（６０ｐｍｏｌ）と合わせて、室温下に２０〜３０分以内でＱＤ集合体を形成した（図２６）。混合物を凍結（−７８℃）し、ゆっくり室温まで温めると、連結が速く起こった。
【０２９５】
生成したクラスターは、溶液から沈殿するほど大きくはなかった。しかし、クラスターは、連結しなかった粒子（３０，０００ｒｐｍで２〜３時間）と比べて、比較的低速で遠心（１０，０００ｒｐｍで１０分間）することにより分離することができた。
【０２９６】
ハイブリダイゼーション直後の蛍光の減少を、４対の試料の４７５ｎｍから６２５ｎｍまでの蛍光シグナル（励起波長３２０ｎｍ）の積分により定量した。各対は以下の方法で調製した。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心管中で、３′プロピルチオールを末端基とするＤＮＡで修飾した粒子（３０μｌ、５３０ｎｍでの光学密度＝０．２２４）の溶液を、５′ヘキシルチオールを末端基とするＤＮＡで修飾したＱＤ（３０μｌ、５３０ｎｍでの光学密度＝０．２０６）と合わせ、次いで１４０μｌのＰＢＳで希釈した。次いで、混合物を２つの等量部分に分け、一方には相補的「リンカー」ＤＮＡ（３μｌ、３０ｐｍｏｌ）を、他方には、非相補的「リンカー」ＤＮＡ（５′−ＣＴＡＣＴＴＡＧＡＴＣＣＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＡＴ−３′、配列番号４９）（３μｌ、３０ｐｍｏｌ）を加えた。次いで、全８種の試料をドライアイス／アセトン浴（−７８℃）中で凍結し、その後、試料を浴から取り出し、ゆっくり室温まで温めた。ハイブリダイゼーション時の蛍光効率の変化を予測するために、「標的」（相補的「リンカー」）試料の蛍光強度を、非相補的「リンカー」を含む対応する対照試料由来の３２０ｎｍでの吸光度における差を明らかにするように調整した。
【０２９７】
結果は、ＱＤ／ＱＤ集合体が、平均して２６．４±６．１％の積分蛍光強度の減少と、ＱＤ間の協同事象によると考えられる発光最大の〜２ｎｍのレッドシフトを伴うことを示した。興味深いことには、Ｂａｗｅｎｄｉらは、密集ＱＤと凍結マトリックス中で広く分離している隔離ドットの蛍光を比較したときに、類似ではあるが、わずかに大きなレッドシフトに気づいていた（Ｍｕｒｒａｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２７０巻，１３３５ページ，１９９５年）。蛍光スペクトルにおけるこれらの変化は、ＱＤ間にエキシマが形成されたことを示しているのかもしれないが、そのような複合体の正確な性質は、大部分まだ類推の域を出ないものである。予測したように、「リンカー」が無いか、もしくは相補的でない場合、または２種の粒子のどちらかが不在の場合に、凝集は観察されなかった。
【０２９８】
温度の関数として凝集体のＵＶ−可視スペクトルを観察して、ＤＮＡの「融解」挙動をモニターした。この「融解」分析のために、ＱＤ／ＱＤ集合体を含む沈殿物を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、７μｌのＰＢＳで洗浄、再遠心して、０．７ｍｌのＰＢＳに懸濁させた。温度を２５℃から７５℃まで上昇させながら、各測定の前に１分間の保持時間をとって、集合体のＵＶ／可視分光シグナチャーを２℃間隔で記録した。実験を通じて均一性を確実にするために、混合物を５００ｒｐｍの速度で攪拌した。次いで、６００ｎｍでの消光から温度対消光プロファイルを作製した。これらのプロファイルの一次導関数を用いて「融解」温度を決定した。
【０２９９】
結果、図２７Ｂ（Ｔｍ＝５７℃）は、ＤＮＡがＱＤ表面上に固定化され、ハイブリダイゼーションが集合体プロセスに関与することを明確に証明した。ＤＮＡだけと比較したときの偏移は極めて急激（それぞれの一次導関数のＦＷＨＭ：４℃対９℃）であり、これは、１粒子当たり多重ＤＮＡ結合を有する凝集体構造の形成と一致する。変性により消光の増大が観察されたが、これは、集合体内の粒子がその周囲のＱＤによる光の吸収から防止されるスクリーニング効果のためである可能性が高い。
【０３００】
Ｄ．　ＱＤ／金集合体の調製
ＤＮＡ官能化ＱＤが得られたので、多重種類のナノ粒子構築ブロックから作製したハイブリッド集合体の構成が実現可能になった。これらのハイブリッド集合体を作製するために、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心管中で、〜１７ｎＭの３′−ヘキシルチオールで修飾した１３ｎｍの金ナノ粒子（３０μｌ、〜５ｆｍｏｌ；実施例３に記載のように調製）の溶液を、５′−ヘキシルチオールを末端基とするＤＮＡ修飾ＱＤ（１５μｌ、５３０ｎｍでの光学密度は０．２０６）と混合した。「リンカー」ＤＮＡ（５μｌ、５０ｐｍｏｌ）を加え、混合物を−７８℃に冷却し、次いで、ゆっくり室温まで温めると、赤みを帯びた紫色の沈殿物が生成した。両種類の粒子と相補的標的の不在下には、凝集挙動は観察されなかった。遠心（３，０００ｒｐｍで１分間）し、上清を除去した後、沈殿物を１００μｌのＰＢＳで洗浄し、再遠心した。
【０３０１】
「融解」分析のために、洗浄した沈殿物を０．７ｍｌのＰＢＳに懸濁した。ＵＶ−可視分光法を用いて、金ナノ粒子の表面プラズモン共鳴の変化を追跡して、５２５ｎｍでの温度対消光プロファイルを作製した。金ナノ粒子の表面プラズモン共鳴を用いると、ハイブリダイゼーションをモニターするために、ＱＤだけのＵＶ−可視分光シグナチャーを用いるよりも、はるかに高感度のプローブが得られる。したがって、「融解」実験は、はるかに小さい試料（ＱＤ溶液の〜１０％が必要）に関して実施し得るが、プラズモンバンドの強さによって、ＱＤ由来のＵＶ／可視シグナルが不鮮明になる。上記の純粋ＱＤ系と同様に、急激な（一次導関数のＦＷＨＭ＝４．５℃）融解転移は、５８℃で起こった（図２７Ｄ参照）。
【０３０２】
これらの集合体の高解像度ＴＥＭ画像は、多重ＱＤにより相互連絡された金ナノ粒子網目構造を示した（図２７Ｃ）。ＴＥＭ画像では金ナノ粒子よりはるかにコントラストが弱いＱＤは、それらの格子干渉縞によって識別し得る。ＱＤは、高解像度ＴＥＭでかろうじて解像できるが、これらの複合体集合体の周期的構造やそれらの形成にＤＮＡが果たす役割を明瞭に示している。
【０３０３】
Ｅ．　要約
この実施例に記載されている結果は、ＱＤ表面へのＤＮＡの固定化が達成され、かつ今やこれらの粒子をハイブリダイゼーション条件下にＤＮＡと組合せて使用し得ることを最も確実に立証している。ＤＮＡ官能化ＱＤを用いて、最初のＤＮＡ誘導ＱＤ形成および混合金／ＱＤナノ粒子構造が実証された。半導体ＱＤをＤＮＡで首尾良く修飾することは、材料研究にとって重要な意味を有しており、これらの固有の構築ブロックは新規かつ機能的な多成分ナノ構造およびナノスケール材料に組み込まれるので、今や、これらのブロックの蛍光、電子、および化学特性の広範囲な研究への扉が開かれている。
【０３０４】
実施例１８：　オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体の合成法およびそれらの方法により生成された共役体
Ａ．　一般法
ＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏおよびクエン酸三ナトリウムは、ウィスコンシン州ミルウォーキー所在のオールドリッチ・ケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から購入した。純度９９．９９９％の金ワイヤ、およびチタンワイヤは、イリノイ州エバンストン所在のゴールドスミス社（Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ　Ｉｎｃ．，Ｅｖａｎｓｔｏｎ，ＩＬ）から購入した。厚さ１ミクロンの酸化物層を有するシリコンウェーハ（１００）は、カリフォルニア州サンタクララ所在のシリコン・クエスト・インターナショナル社（Ｓｉｌｉｃｏｎ　Ｑｕｅｓｔ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒａ，ＣＡ）から購入した。５′−チオール修飾剤Ｃ６−ホスホロアミダイト試薬、３′−プロピルチオール修飾剤ＣＰＧ、フルオレセインホスホロアミダイト、およびオリゴヌクレオチド合成に必要な他の試薬は、ヴァージニア州スターリング所在のグレン・リサーチ社から購入した。すべてのオリゴヌクレオチドは、標準ホスホロアミダイト化学（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ；第１版；Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９１年）を用いるＤＮＡ自動合成機（エキスペダイト社（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ））を使って調製した。５′ヘキシルチオール修飾体のみを含むオリゴヌクレオチドを実施例１に記載のように調製した。５−（および６−）−カルボキシフルオレセイン、スクシンイミジルエステルは、オレゴン州ユージーン所在のモレキュラー・プローブス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から購入した。ＮＡＰ−５カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５Ｍｅｄｉｕｍ、ＤＮＡグレード）は、ファルマシア・バイオテク社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）から購入した。すべての実験に、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ　ＮＡＮＯｐｕｒｅ超純水系を用いて精製したナノピュアＨ２Ｏ（＞１８．０ＭΩ）を用いた。Ａｕナノ粒子溶液の遠心には、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　５４１５ＣまたはＢｅｃｋｍａｎ　Ａｖａｎｔｉ　３０遠心機を用いた。高速液体クロマトグラフィーは、ＨＰシリーズ１１００ＨＰＬＣを用いて実施した。
【０３０５】
Ｂ．　物理測定
オリゴヌクレオチドおよびナノ粒子溶液の電子吸収スペクトルは、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ（ＨＰ）８４５２ａダイオードアレイ分光光度計を用いて記録した。蛍光分光法は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　ＬＳ５０蛍光光度計を用いて実施した。透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）は、２００ｋＶで操作する日立８１００透過型電子顕微鏡で実施した。ナノ粒子溶液中の金の原子濃度の定量には、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）源を備えたＡｔｏｍＳｃａｎ２５原子分光計を用いた（金の発光は２４２．７９５ｎｍでモニターした）。
【０３０６】
Ｃ．　蛍光標識したアルカンチオール修飾オリゴヌクレオチドの合成および精製　５′ヘキシルチオール部分および３′フルオレセイン部分を用いて、１２塩基を含むチオール修飾オリゴヌクレオチド鎖を調製した。１２ｍｅｒ（Ｓ１２Ｆ）の配列は、ＨＳ（ＣＨ２）６５−ＣＧＣ−ＡＴＴ−ＣＡＧ−ＧＡＴ−３′−（ＣＨ２）６−Ｆ［配列番号５０］であり、３２ｍｅｒ（ＳＡ２０１２Ｆ）は同じ１２ｍｅｒ配列とさらなる２０ｄＡスペーサー配列を５′端に有していた［配列番号５１］。チオール修飾オリゴヌクレオチドは、Ｓｔｏｒｈｏｆｆら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１２０巻：１９５９−１９６４ページ（１９９８年）に記載のように調製した。自動合成にはアミノ修飾剤Ｃ７　ＣＰＧ固相支持体を用い、５′末端は、先に記載のように、ヘキシルチオールホスホロアミダイトで手で修飾した。３′アミノ、５′トリチルで保護したチオール修飾オリゴヌクレオチドを、２５４ｎｍでＤＮＡのＵＶシグナルをモニターしながら、０．０３Ｍ　トリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡ）、ｐＨ７および１％／分勾配の９５％ＣＨ３ＣＮ／５％０．０３Ｍ　ＴＥＡＡを含むＨＰ　ＯＤＳ　Ｈｙｐｅｒｓｉｌカラム（５ｍｍ、２５０×４ｍｍ）を用いて、１ｍｌ／分の流速で逆相ＨＰＬＣにより精製した。５′−Ｓ−トリチル、３′アミノ修飾１２塩基および３２塩基オリゴヌクレオチドの保持時間はそれぞれ３６分、３２分であった。
【０３０７】
凍結乾燥産物を１ｍｌの０．１Ｍ　Ｎａ２ＣＯ３に再分散させ、調製業者の指示（モレキュラー・プローブ社の文献）に従って、暗所で攪拌しながら、無水ＤＭＦ中１０ｍｇ／ｍｌのフルオレセインスクシンイミジルエステル（５，６ＦＡＭ−ＳＥ、モレキュラー・プローブス社）１００μｌを１．５時間かけて加えた。溶液を室温下にさらに１５時間攪拌し、次いで、−２０℃下に１００％エタノールから沈殿させた。沈殿物を遠心して回収し、Ｈ２Ｏに溶解させ、イオン交換ＨＰＬＣにより、結合産物を反応しなかったアミノを末端基とするオリゴヌクレオチドから分離した。１０ｍＭ　ＮａＯＨ水性溶離液および１％／分勾配の１Ｍ　ＮａＣｌ／１０ｍＭ　ＮａＯＨを用いて、０．８ｍｌ／分の流速で、Ｄｉｏｎｅｘ　Ｎｕｃｌｅｏｐａｃ　ＰＡ−１００カラム（２５０×４ｍｍ）を操作した。５′−Ｓ−トリチル、３′フルオレセイン修飾１２ｍｅｒおよび３２ｍｅｒの保持時間はそれぞれ５０分、４９分であった。オリゴヌクレオチド産物を逆相ＨＰＬＣで脱塩した。フルオレセインを末端基とするトリチルオリゴヌクレオチドのトリチル保護基の除去は、先に記載のように、（Ｓｔｏｒｈｏｆｆら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１２０巻，１９５９−１９６４（１９９８年））、硝酸銀およびジチオトレイトール（ＤＴＴ）を用いて行った。オリゴヌクレオチドの収率および純度は、アルキルチオールオリゴヌクレオチドに関して先に記載した技術（Ｓｔｏｒｈｏｆｆら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１２０巻：１９５９−１９６４ページ（１９９８年））を用いて評価した。オリゴヌクレオチドは、チオール基のトリチル除去処理直後に使用した。
【０３０８】
３′がプロピルチオールで５′フルオレセイン部分（ＨＳ（ＣＨ２）３−３′−　（Ｗ）２０−ＴＡＧ−ＧＡＣ−ＴＴＡ−ＣＧＣ−５′−（ＣＨ２）６−Ｆ、Ｗ＝ＡまたはＴ）である３２塩基を含むチオール修飾オリゴヌクレオチド［配列番号５２］を、３′チオール修飾剤ＣＰＧを使用して自動合成装置で合成した。各オリゴヌクレオチドの５′末端を、手作業で、フルオレセインホスホロアミダイト（６−ＦＡＭ（６−ＦＡＭ、Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）につないた。修飾オリゴヌクレオチドを、イオン交換ＨＰＬＣで精製した（１Ｍ　ＮａＣｌの１％／分勾配、１０ｍＭ　ＮａＯＨ；保持時間（Ｒｔ）〜４８分（Ｗ＝Ｔ）、Ｒｔ〜２９分（Ｗ＝Ａ））。精製後、オリゴヌクレオチド溶液を逆相ＨＰＬＣで脱塩した。３′チオール部分を、以前に記述された方法（Ｓｔｏｒｈｏｆｆら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：１９５９−１９６４（１９９８））により、ジチオスレイトールで脱保護した。
【０３０９】
Ｄ．フルオレセイン標識オリゴヌクレオチドの合成および精製
発蛍光団標識相補体（１２′Ｆ）は、Ｓ１２ＦおよびＳＡ２０１２Ｆの１２ｍｅｒ配列と相補的な１２塩基３′−ＧＣＧ−ＴＡＡ−ＧＴＣ−ＣＴＡ−５′−（ＣＨ２）６−Ｆ［配列番号５３］から構成した。標準法を用いてオリゴヌクレオチドを合成し、５′アルキルチオール修飾に関して上述した手順に類似のシリンジベース手順を用いて、フルオレセインホスホロアミダイト（６−ＦＡＭ、グレン・リサーチ社）とＣＰＧ連結オリゴヌクレオチドの５′末端とをカップリングした。上記のような逆相ＨＰＬＣを用いて精製を実施した。フルオレセイン標識オリゴヌクレオチドの保持時間は１８分であった。自動合成機用のアミノ修飾剤Ｃ７　ＣＰＧ固相支持体を用いて発蛍光団標識相補体、３′１２Ｆ（５′−ＡＴＣ−ＣＴＧ−ＡＡＴ−ＧＣＧ−Ｆ；［配列番号５４］）を調製し、次いで、上記手順を用いて、５−（６）−カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルを３′アミンにカップリングした。
【０３１０】
Ｅ．金ナノ粒子の調製および特性決定
金ナノ粒子は、実施例１に記載のように、ＨＡｕＣｌ４をクエン酸塩で還元して調製した。得られたナノ粒子のサイズ分布の定量には、日立８１００ＴＥＭを用いて実施する透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）を用いた。グラフィックソフトウエア（ＩａｍｇｅＴｏｏｌ）を用いてＴＥＭネガから少なくとも２５０粒子を分粒した。典型的な粒子配合物の平均直径は１５．７±１．２ｎｍであった。球状ナノ粒子と密度がバルク金の密度（１９．３０ｇ／ｃｍ２）と等しいと仮定して、粒子当たりの平均分子量を計算した（２．４×１０７ｇ／ｍｏｌ）。金ナノ粒子溶液中の金原子の濃度を、ＩＣＰ−ＡＥＳ（誘導結合プラズモン原子発光分光法）によって決定した。較正には、金原子吸着標準溶液（オールドリッチ社）を用いた。粒子溶液中の金原子濃度とＴＥＭ分析によって得た平均粒子質量とを比較して、所与の配合物中の金粒子のモル濃度、典型的には〜１０ｎＭを得た。表面プラズモン周波数（５２０ｎｍ）でのナノ粒子溶液のＵＶ−可視吸光度を測定して、粒子のモル消光係数（５２０ｎｍでのε）を計算すると、典型的には、直径１５．７±１．２ｎｍの粒子では４．２×１０８Ｍ−１ｃｍ−１であった。
【０３１１】
Ｆ．金薄膜の調製
シリコンウェーハを〜１０ｍｍ×６ｍｍ部片に切断し、５０℃下にピラニア腐蝕溶液（４：１の濃Ｈ２ＳＯ４：３０％Ｈ２Ｏ２）で３０分清浄し、次いで、多量の水、次いでエタノールでリンスした。（警告：ピラニア腐蝕溶液は有機物質と激しく反応するので、取り扱いには厳重な注意が必要である。）Ｅｄｗａｒｄｓ　ＦＴＭ６石英結晶微量天秤を具備したＥｄｗａｒｄｓ　Ａｕｔｏ　３０６エバポレータ（３×１０−７ミリバールの基準圧力）を用いて０．２ｎｍ／秒の速度で金属を蒸着させた。シリコンの酸化された側面を、５ｎｍのＴｉ接着層、次いで２００ｎｍの金でコートした。
【０３１２】
Ｇ．５′アルキルチオールオリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子の調製
新たに脱保護したオリゴヌクレオチドをナノ粒子水溶液（粒子濃度〜１０ｎＭ）に３μＭの最終オリゴヌクレオチド濃度まで加えて、金ナノ粒子をフルオレセイン−アルキルチオールオリゴヌクレオチドで修飾した。２４時間後、溶液をｐＨ７（０．０１Ｍ　リン酸）で緩衝し、ＮａＣｌ溶液を（０．１Ｍの最終濃度まで）加えた。これらの条件下にさらに４０時間、溶液を「熟成」させた。次いで、１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心して、過剰な試薬を除去した。上清を除去した後、赤色の油性沈殿物を、０．３Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７（ＰＢＳ）で２回洗浄し、連続遠心して、再分散させ、最後に新鮮な緩衝液中に再分散させた。洗浄手順中、常に、少量（ＵＶ−可視分光法により測定して〜１０％）のナノ粒子が上清と共に廃棄される。したがって、最終ナノ粒子濃度を、ＴＥＭ、ＩＣＰ−ＡＥＳ、およびＵＶ−可視分光法（上記参照）で測定した。消光係数および粒度分布は、オリゴヌクレオチド修飾の結果として有意には変化しなかった。
【０３１３】
Ｈ．５′アルキルチオールオリゴヌクレオチド修飾金薄膜の調製
シリコン支持金薄膜を、金ナノ粒子の場合と同じ回数および同じ緩衝条件下に、脱保護したアルキルチオール修飾オリゴヌクレオチドの蒸着溶液中に浸漬した。オリゴヌクレオチド蒸着の後、膜を０．３Ｍ　ＰＢＳでよくリンスし、緩衝液中に保存した。不動態化されていないケイ素／酸化ケイ素面を残して、片面の金のみを蒸発させた。しかし、アルキルチオール修飾ＤＮＡは、ＰＢＳに浸漬した何も結合していない酸化ケイ素表面には有意に吸着しなかった。
【０３１４】
Ｉ．ナノ粒子上に充填したアルキルチオールオリゴヌクレオチドの定量
オリゴヌクレオチドを置換するために、０．３Ｍ　ＰＢＳ中の発蛍光団標識オリゴヌクレオチドで修飾したナノ粒子または薄膜に、メルカプトエタノール（ＭＥ）を（１２ｍＭの最終濃度まで）添加した。間欠的に振とうしながら、室温下に１８時間後、金ナノ粒子を遠心するか、または金薄膜を除去して、置換オリゴヌクレオチドを含有する溶液を金から分離した。０．３Ｍ　ＰＢＳ、ｐＨ７を添加して、上清のアリコートを２倍希釈した。試料および較正標準溶液のｐＨとイオン強度を、これらの条件に対するフルオレセインの光学的性質の感度によるすべての測定値に関して、同じに維持するように注意した（Ｚｈａｏら，Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ，４５Ａ：１１１３−１１１６ページ（１９８９年））。（５２０ｎｍで測定した）最大蛍光を、標準線形較正曲線からの補間によりフルオレセイン−アルキルチオール修飾オリゴヌクレオチドのモル濃度に変換した。標準曲線は、同一の緩衝液および塩濃度を用いて発蛍光団標識オリゴヌクレオチドの既知濃度を用いて作製した。最後に、測定したオリゴヌクレオチドのモル濃度を元の金ナノ粒子濃度で割って、粒子当たりの平均オリゴヌクレオチド数を得た。次いで、ナノ粒子溶液中の（球状粒子を想定して）予測した粒子表面積で割って、正規表面被覆面積値を計算した。真円度の仮定条件は、計算した０．９３の平均真円度に基づく。真円度因数は、Ｂａｘｅｓ，Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｄｉｇｉｔａｌ　Ｉｍａｇｅ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，１５７ページ（１９９４年）から引用した（４×ｐｉ×面積）（周長×２）として計算する。
【０３１５】
Ｊ．ハイブリダイズされた標的表面密度の定量
付着したオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション活性を測定するために、蛍光発色団で標識したオリゴヌクレオチド（表面結合オリゴヌクレオチド（１２′Ｆ）に相補的）を、ハイブリダイゼーション条件（３μＭ　相補的オリゴヌクレオチド、０．３Ｍ　ＰＢＳ、ｐＨ７、２４時間）下で、オリゴヌクレオチド修飾表面（金のナノ粒子または薄膜）と反応させた。ハイブリダイズしなかったオリゴヌクレオチドは、上述したように緩衝塩溶液で２度リンスすることにより金から取り外した。その後、蛍光発色団で標識したオリゴヌクレオチドを、ＮａＯＨの添加（最終濃度〜５０ｍＭ、ｐＨ１１〜１２、４時間）により、デハイブリダイズした。遠心によってナノ粒子溶液から１２′Ｆ含有溶液を分離した後、１Ｍ　ＨＣｌの追加によって溶液を中和し、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの濃度とそれに対応するハイブリダイズされた標的表面密度を、蛍光分光法により測定した。
【０３１６】
Ｋ．表面被覆面積の定量とハイブリダイゼーション
クエン酸塩安定化金ナノ粒子を１２ｍｅｒフルオレセイン修飾アルキルチオールＤＮＡ（ＨＳ−（ＣＨ２）６５′−ＣＧＣ−ＡＴＴ−ＣＡＧ−ＧＡＴ−（ＣＨ２）４−Ｆ［配列番号５０］）で官能化した。次いで、化学吸着していないオリゴヌクレオチドを完全に洗い流した後で、発蛍光団標識オリゴヌクレオチドを金表面から除去して表面被覆面積研究を実施し、（上記のような）蛍光分光法を用いてオリゴヌクレオチド濃度を定量した。
【０３１７】
金表面からすべてのオリゴヌクレオチドを除去し、次いで溶液から金ナノ粒子を除去することは、いくつかの理由で、蛍光による正確な被覆面積データを得るために重要である。第１に、標識した表面結合ＤＮＡの蛍光シグナルは、金ナノ粒子への蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の結果として効率的に消光される。実際、フルオレセイン修飾オリゴヌクレオチド（１２〜３２ヌクレオチド鎖、配列は上記に記載）が１５．７±１．２ｎｍの金ナノ粒子上に固定化され、溶液中の残留オリゴヌクレオチドが洗い流された後では、フルオレセイン修飾オリゴヌクレオチドに関して測定可能なシグナルはほとんど存在しない。第２に、金ナノ粒子は、２００〜５３０ｎｍの間に有意な量の光を吸収し、そのために、蛍光測定時の溶液中の金ナノ粒子の存在は、フィルターとしての役割を果たし、利用可能な励起エネルギーだけでなく放出される放射線の強度をも低下させる。フルオレセインの最大放出時には、５２０ｎｍでの金表面プラズモンバンドが減少する。
【０３１８】
メルカプトエタノール（ＭＥ）を用いて、交換反応により表面結合オリゴヌクレオチドを急速に置換させた。置換動力学を調べるために、遠心および蛍光測定の前に、オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子を、増加時間、ＭＥ（１２ｍＭ）に暴露した。ナノ粒子を含まない溶液に関連する蛍光の強さを用いて、ナノ粒子からどの位多くのオリゴヌクレオチドが放出されるかを測定することができる。ＭＥと交換に放出されたオリゴヌクレオチドの量は、約１０時間の暴露まで増大した（図２９）が、これは、完全なオリゴヌクレオチドの置換を示している。置換反応は高速であり、これは、オリゴヌクレオチド膜がＭＥの金表面へのアクセスをブロックし得ないためであると考えられる（Ｂｉｅｂｕｙｃｋら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第９巻，１７６６ページ（１９９３年））。
【０３１９】
金ナノ粒子上のアルキルチオール修飾１２ｍｅｒオリゴヌクレオチド（Ｓ１２Ｆ）の平均オリゴヌクレオチド表面被覆面積は、３４±１ｐｍｏｌ／ｃｍ２（試料の１０回の個別測定値の平均）であった。直径１５．７±１．２ｎｍの粒子の場合、これは、金粒子１個当たりおよそ１５９チオール結合１２ｍｅｒ鎖に相当する。バッチ毎に粒径はわずかに異なるものの、面積が正規化された表面被覆面積は、異なるナノ粒子配合物に関して類似していた。
【０３２０】
この方法が正確なオリゴヌクレオチド表面被覆面積を得るために有用であることを確認するために、金薄膜から発蛍光団標識オリゴヌクレオチドを置換する方法を用い、表面被覆面積データと類似の情報を得ることを目的とするが異なる技術を用いた実験と比較した。これらの実験では、金薄膜に対し、クエン酸塩安定化金ナノ粒子（上記参照）と類似のオリゴヌクレオチド修飾およびＭＥ置換手順を課した。金薄膜のオリゴヌクレオチド置換対時間曲線は、金ナノ粒子に関して測定したものと極めて類似している。これは、これらの薄膜に関して測定した典型的な表面被覆面積値が金ナノ粒子上のオリゴヌクレオチド被覆面積よりいくらか低かったにも拘わらず、薄膜の置換速度は類似していることを示唆している。本発明者らの技術によって測定した金薄膜上のオリゴヌクレオチド表面被覆面積（１８±３ｐｍｏｌ／ｃｍ２）が、既に報告されたオリゴヌクレオチド薄膜上の被覆面積の範囲内（電気化学または表面プラズモン共鳴分光法（ＳＰＲＳ）を用いて測定された金電極上の２５塩基オリゴヌクレオチドに関しては１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２（Ｓｔｅｅｌら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，第７０巻，４６７０−４６７７ページ（１９９８年））に含まれることは重要である。表面被覆面積の相違は、オリゴヌクレオチドの配列と長さの違いおよび薄膜の調整方法の違いによるものと考えられる。
【０３２１】
表面結合ｌ２ｍｅｒオリゴヌクレオチドを備えたナノ粒子への相補的な蛍光発色団標識されたオリゴヌクレオチド（１２′Ｆ））のハイブリダイゼーションの範囲を、上述のように測定した。簡潔に説明すると、Ｓ１２Ｆ修飾ナノ粒子を、１２Ｆ′に３μＭの濃度でハイブリダイゼーション条件（０．３Ｍ　ＰＢＳ、ｐＨ７）下で２４時間暴露し、次に、緩衝液で入念にリンスした。やはり、蛍光測定前に金からハイブリダイズした鎖を取り外すことが必要であった。これは、高ｐＨ溶液（ＮａＯＨ、ｐＨ１１）中で二重鎖ＤＮＡを変性させてから遠心にかけることにより遂行した。ハイブリダイズした１２′Ｆは、総計１．３±０．２ｐｍｏｌ／ｃｍ２（１５．７ｎｍ粒子当たり約６つの二本鎖；１粒子当たりの二本鎖の平均数は、正規化したハイブリダイズされた表面被覆範囲（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）に、ＴＥＭによって測定した粒度分布から求められる平均粒子表面積を掛けることにより算出した。）に達した。非特異性吸着の程度を測定するために、Ｓ１２Ｆ修飾金ナノ粒子を、０．３Ｍ　ＰＢＳ中で、蛍光発色団標識した非相補的な１２塩基オリゴヌクレオチド（１２Ｆ′）に暴露した。入念なリンス（連続する遠心／再分散ステップ）とそれに続く高ｐＨ処理後、ナノ粒子上の非特異的に吸着したオリゴヌクレオチドの被覆範囲は約０．１ｐｍｏｌ／ｃｍ２であるとわかった。金電極に関する報告値とハイブリダイゼーション結果を比較するために、類似の方法を使用して、Ｓ１２Ｆ修飾金薄膜へのハイブリダイゼーションを測定した。ハイブリダイゼーション６＋２ｐｍｏｌ／ｃｍ２の程度は、金電極上の混合塩基２５ｍｅｒに対して報告されているハイブリダイゼーション（２−６ｐｍｏｌ／ｃｍ２）（Ｓｔｅｅｌら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：４６７０−４６７７（１９９８）と一致していた。
【０３２２】
ナノ粒子用システムおよび薄膜の両方に対するＳ１２Ｆ／１２Ｆ′系の表面被覆範囲およびハイブリダイゼーション値を、表７に要約する。最も顕著な結果は、ハイブリダイゼーション効率の低さである（ナノ粒子上の表面結合鎖の４％未満、薄膜上の鎖の３３％がハイブリダイズ）。以前の研究では、十分に密に充填されたオリゴヌクレオチド単分子層に対して、同様に低いハイブリダイゼーションが示されていた。これは、塩基の立体的密集性の組合せ（特に金表面付近の）と静電気反発相互作用とにより、入って来るハイブリダイズ鎖への接近容易性が低いことを反映している可能性がある。
【０３２３】
Ｌ．表面被覆範囲とハイブリダイゼーションに対するオリゴヌクレオチドスペーサーの影響
Ｓ１２Ｆオリゴヌクレオチドの適用範囲が高いことは、ナノ粒子安定化の点から有利であるが、その低いハイブリダイゼーション効率により、本願発明者らは、ハイブリダイズする配列の周囲の立体的混雑を減少させる手段を考案するように促された。アルキルチオール基と最初の１２塩基認識配列との間に２０ｄＡスペーサー配列が挿入された、オリゴヌクレオチド（３２ｍｅｒ）を合成した。このストラテジーを、以下の２つの仮定に基づき選択した。すなわち、１）ナノ粒子表面付近の塩基は、含窒素塩基と金表面間の相互作用の弱さと、鎖間の立体密集との故に、立体的に接近不能であること、および、２）直径１５．７ｎｍの概ね球状の粒子では、概ねその表面に対して垂直な２０ｍｅｒスペーサーユニットの端部に付着された１２ｍｅｒ配列（Ｌｅｖｉｃｋｙら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：９７８７−９７９２（１９９８））は、表面に直接結び付けられた同じ１２ｍｅｒから形成されたフィルムに比べてより大きな自由体積を有するフィルムにつながるだろう。
【０３２４】
一本鎖ＳＡ２０１２Ｆ鎖の表面密度（１５±４ｐｍｏｌ／ｃｍ２）はＳｌ２Ｆ（３４の±１ｐｍｏｌ／ｃｍ２）よりも低いが、同一の表面修飾を使用して３２ｍｅｒで修飾した粒子は、１２ｍｅｒで修飾した粒子と比較して、かなりの安定性ｗｐ示した。予想されたように、ＳＡ２０１２Ｆ／１２Ｆ′系のハイブリダイゼーション効率」（６．６±０．２ｐｍｏｌ／ｃｍ２、４４％）は、元のＳ１２Ｆ／１２Ｆ′系のハイブリダイゼーション効率の約１０倍に増大した（表７）。
【０３２５】
Ｍ．オリゴヌクレオチド付着時の電解質濃度の効果
Ｓ１２Ｆ配列を用いた研究において、塩熟成ステップが、安定したオリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子を得るのに重要であることが判明した（実施例３参照）。純水中Ｓ１２Ｆで修飾した金ナノ粒子を不可逆的に融解し、遠心すると、黒色沈殿物が形成されたが、塩中で熟成させたものは、高イオン強度溶液中で遠心しても凝集しなかった。安定性の増大は、立体保護作用および静電保護作用をもたらす高いオリゴヌクレオチド表面被覆面積によるものと考えられる。ＳＡ２０１２Ｆ修飾粒子を用いて、オリゴヌクレオチド表面添加に及ぼす電解質条件の効果を調べた。図８に示すように、５′ヘキシルチオールおよび３′フルオレセイン部分を有するチオール修飾オリゴヌクレオチドを調製し、上記のように金ナノ粒子に付着させ、ナノ粒子上のこれらのオリゴヌクレオチドの表面被覆面積を上記のように定量した。結果は以下の表７に示されている。水中のオリゴヌクレオチドに４８時間暴露した金ナノ粒子の最終表面被覆面積は、塩で「熟成」させるか、または実験の最後の２４時間にわたって漸進的に塩濃度を増大させて（最終濃度は１．０Ｍ　ＮａＣｌ）調製したものと比べると、はるかに低かった（７．９±０．２ｐｍｏｌ／ｃｍ２）（上記参照）。
【０３２６】
合成された金ナノ粒子は、極めて低いイオン強度媒質中でさえ不可逆的に凝集することは注目に値する。確かに、金ナノ粒子は本来、塩、特にオリゴヌクレオチドなどのポリアニオンには不相溶である。安定したオリゴヌクレオチド粒子を調製するためには、この熟成処理が必須である。したがって、粒子は、イオン強度を徐々に増大させる前に、先ず、水中のアルキルチオールオリゴヌクレオチドで修飾しなければならない。オリゴヌクレオチドは、初期には、窒素含有塩基と金との弱い相互作用を介して結合した状態で平らに横たわっていると思われる。類似の相互作用モードが薄膜に付けたオリゴヌクレオチドに関して提案されている（Ｈｅｒｎｅら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１９巻，８９１６−８９２０ページ（１９９７年））。しかし、オリゴヌクレオチドと正に帯電したナノ粒子表面との相互作用は、さらに強力であると予想される（Ｗｅｉｔｚら，Ｓｕｒｆ．Ｓｃｉ．，第１５８巻，１４７−１６４ページ（１９８５年））。熟成ステップにおいて、高イオン強度媒質は、隣接するオリゴヌクレオチド間の電荷反発だけでなくポリアニオンオリゴヌクレオチドと正に帯電した金表面との間の引力をも効率的に遮蔽する。これにより、より多くのオリゴヌクレオチドがナノ粒子表面に結合し、それによってオリゴヌクレオチド表面被覆面積が増大する。
【０３２７】
Ｎ．表面被覆範囲に対するオリゴヌクレオチドスペーサー配列の影響
スペーサーの配列がどのようにＡｕナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの被覆範囲に影響するかを調べるために、３′プロピルチオールとフルオレセイン標識１２ｍｅｒ配列の間に２０ｄＡスペーサーおよび２０ｄＴスペーサーが挿入されたフルオレセイン修飾３２ｍｅｒ鎖を、調製した。Ｓ３′Ｔ２０１２ＦとＳ３′Ａ２０１２Ｆで修飾したナノ粒子に関する表面被覆範囲とハイブリダイゼーションの研究で最も顕著な結果は、２０ｄＡスペーサー（２４±１ｐｍｏｌ／ｃｍ２）と比較して、２０ｄＴスペーサー（３５±１ｐｍｏｌ／ｃｍ２）でより大きな表面被覆範囲が達成されたことである。ハイブリダイズした表面結合鎖のパーセンテージはＳＴ２０ｌ２ｍｅｒナノ粒子（７９％）ではＳＡ２０１２ナノ粒子（「〜９４％」より低かったが、ハイブリダイズした鎖の数は匹敵していた。これらの結果は、ｄＴ豊富なオリゴヌクレオチド鎖が、ｄＡ豊富なオリゴヌクレオチドよりも低い程度でナノ粒子表面と非特異的に相互作用することを示唆している。従って、２０ｄＡスペーサーセグメントが粒子表面上で平坦に横渡ることにより金の部位をブロックする一方、２０ｄＴスペーサーセグメントは、金の表面から垂直に延びることができ、これはより高い表面被覆範囲を促す。
【０３２８】
Ｏ．同時吸着された希釈剤オリゴヌクレオチドの影響
効率的なハイブリダイゼーションに加えて、オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子の別の重要な特性は、ハイブリダイゼーション事象の総数を調節する可能性である。これは、認識鎖の表面密度の調節により最も容易に遂行される。他の研究者は、ハイブリダイゼーションを制御するために、金電極上の修飾オリゴヌクレオチドと共に、メルカプトヘキサノールのよう同時吸着される希釈剤アルキルチオールを使用した（Ｓｔｅｅｌら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：４６７０−４６７７（１９９８）；Ｈｅｒｎｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：８９１６−８９２０（１９９７））。しかしながら、保護されていない金ナノ粒子の固有の低い安定性は、希釈剤分子の選択に重大な制約を提起した。チオール修飾２０ｄＡ配列（ＳＡ２０）［配列番号５５］は、ハイブリダイゼーションに必要な高いイオン強度の緩衝液中での粒子安定性を維持し、かつ非特異的吸着から表面を保護する点で、適切していることがわかった。
【０３２９】
ナノ粒子を、種々の認識鎖（ＳＡ２０１２Ｆ）対希釈剤（ＳＡ２０）鎖の分子比を有する溶液を用いて修飾した。得られた粒子を、ＳＡ２０１２Ｆ表面密度の測定のために上述の蛍光方法で分析し、次に、１２′Ｆとのハイブリダイゼーション効率に関してテストした。
【０３３０】
ＳＡ２０１２Ｆ表面密度は、堆積溶液中のＳＡ２０１２Ｆ対ＳＡ２０の比率に関して直線的に増加した（図３０）。これは、ナノ粒子に付けられたＳＡ２０１２ＦとＳＡ２０の比が溶液の比を反映することを示唆しているので、面白い結果である。この結果は、溶解度と鎖長が吸着動力学に重大な役割を果たす、短鎖アルキルまたはＴ官能化チオールの混合物に通常見られる結果と対照的である（Ｂａｉｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：７１５５−７１６４（１９８９）；Ｂａｉｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：７１６４−７１７５（１９８９）。
【０３３１】
個々の異なるサンプルにハイブリダイズした相補的な１２Ｆオリゴヌクレオチドの量も、ＳＡ２０１２Ｆ表面被覆範囲の増加につれて直線的に増加した（図３１）。この関係が良好に定義されるという事実は、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体のハイブリダイゼーションの程度を予測および制御できることを示す。これは１２Ｆ′のハイブリダイゼーションがより高いＳＡ２０１２Ｆ被覆範囲ではより困難になり、オリゴヌクレオチド間に立体的密集と静電気反発が起こる可能性が高いことを示唆している。
【０３３２】
Ｐ．要約
本研究は、オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子を安定化させる程度に高いが、高い割合の鎖が溶液中のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのために接近できる程度に低く、オリゴヌクレオチド被覆範囲間のバランスを達成することが重要であることを示している。それは、オリゴヌクレオチドを、高いオリゴヌクレオチド表面被覆範囲を得るためにナノ粒子に付着させたり、静電相互作用を減らすためにオリゴヌクレオチドスペーサーセグメントに付着させたり、各ナノ粒子に対するハイブリダイゼーション事象の平均数を再現可能に制御するために同時吸着鎖を付着したりしている間に、塩条件を調節させることにより達成される。鎖（スペーサー）の配列の性質が、金ナノ粒子に装填されたオリゴヌクレオチド鎖の数に影響を及ぼすことも示された。この研究は、オリゴヌクレオチドとナノ粒子の間の相互作用の理解ならびにナノ粒子−オリゴヌクレオチド検出方法の感度の最良化に関して重要な意味合いを持つ。
【０３３３】
【表７】
Figure 2004501340
【化１】
Figure 2004501340
【化２】
Figure 2004501340
【表８】
Figure 2004501340
【表９】
Figure 2004501340
実施例１９：　遺伝子チップアッセイ
この実施例では、オリゴヌクレオチド官能化金ナノ粒子を用いたコンビナトリアルＤＮＡアレイの選択的が非常に高くかつ非常に高感度な分析法を説明する。非常に狭いナノ粒子−標的複合体熱解離温度範囲により、ヌクレオチド誤対合を１つ有する標的から所与のオリゴヌクレオチド配列を、非常に高い選択性で識別することができる。さらに、銀（Ｉ）のナノ粒子触媒還元に基づくシグナル増幅法と組合せると、このナノ粒子配列検出系の感度は、慣用の類似発蛍光団系の感度よりも２桁の大きさだけ優れている。
【０３３４】
科学者が病気の遺伝的根拠を明らかにし、この新規な情報を医学診断や治療の改良に用いるにつれ、配列選択的ＤＮＡ検出はますますその重要度を増している。サザンブロットやコンビナトリアルＤＮＡチップなどの一般に用いられている異種ＤＮＡ配列検出系は、標的ＤＮＡと相補的な表面結合一本鎖オリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションに基づいている。これらのアッセイの特異性も感度も、全対合配列および誤対合配列にハイブリダイズした捕獲鎖の解離特性に依存する。以下に説明するように、驚くべきことには、基板にハイブリダイズした単１種類のナノ粒子が類似の発蛍光団ベース系や非標識ＤＮＡよりも実質的に急激な融解プロファイルを示すことが発見された。さらに、ナノ粒子二本鎖の融解温度は、同一配列を有する類似の発蛍光団系の場合より１１℃も高い。これら２つの観察結果を、銀（Ｉ）のナノ粒子触媒還元に基づく定量的シグナル増幅法の開発と合わせると、１単塩基誤対合選択性および類似の慣用発蛍光団ベースアッセイよりも２桁も高い感度を有する新規なチップベースＤＮＡ検出系の開発が可能になる。
【０３３５】
３成分サンドイッチアッセイ形式（図３２参照）において、透明な基板にハイブリダイズした特定のＤＮＡ配列の存在を示すために、実施例３に記載のように調製したオリゴヌクレオチドが付着している金ナノ粒子（直径１３ｎｍ）を用いた。典型的な実験では、基板は、実施例１０に記載のようなアミン修飾プローブオリゴヌクレオチドを用いて、フロートガラス製顕微鏡スライド（フィッシャー・サイエンティフック社）を官能化して作製した。この方法を用いて、スライドの表面全体に１種類のオリゴヌクレオチドかまたは市販のマイクロアレイヤーを用いてスポットした複数種類のオリゴヌクレオチドアレイで官能化したスライドを作製した。次いで、指示オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子および（炭疽菌保護抗原配列をベースとする）合成３０ｍｅｒオリゴヌクレオチド標的をこれらの基板に同時ハイブリダイズさせた（図３２参照）。したがって、表面のナノ粒子の存在によって、特定の３０塩基配列の検出が示された。標的濃度が高い（≧１ｎＭ）と、表面上のハイブリダイズした高密度のナノ粒子が、表面を明るいピンク色にした（図３３参照）。標的濃度が低い場合、付着しているナノ粒子は、（電界放出走査電子顕微鏡検査では画像が見られたが）肉眼で見ることはできなかった。基板表面にハイブリダイズしたナノ粒子の視覚化を容易にするために、銀イオンをヒドロキノンによって触媒的に還元してスライド表面上に銀金属を形成するシグナル増幅法を用いた。この方法は、組織化学顕微鏡検査研究において、タンパク質−および抗体−結合金ナノ粒子を拡大するために用いられている（Ｈａｃｋｅｒ，Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ　Ｇｏｌｄ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍ．Ａ．Ｈａｙａｔ編（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，１９８９年），第１巻，第１０章；Ｚｅｈｂｅら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，第１５０巻，１５５３ページ（１９９７年））が、その定量的ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイにおける使用は新規である（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第１７１巻，２１７ページ（１９８８年））。この方法は、ナノ粒子プローブの極めて低い表面被覆面積を簡単な平台型スキャナや肉眼で視覚化し得た（図３３）だけでなく、染色面積の光学密度に基づく標的ハイブリダイゼーションの定量も可能になった（図３４）。重要なことには、標的の不在下、または非相補的標的の存在下には、表面の染色は観察されず、これは、ナノ粒子の表面への非特異的結合も、非特異的銀染色も起こらないことを証明している。この結果は、核酸の非常に高い感度かつ非常に選択的な検出を可能にするこれらのナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体の優れた特徴である。
【０３３６】
さらに、本発明のオリゴヌクレオチド官能化ナノ粒子の固有のハイブリダイゼーション特性を、さらにコンビナトリアルオリゴヌクレオチドアレイ（または「遺伝子チップ」）の選択性を改良するために用い得ることが確認された（Ｆｏｄｏｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２７巻，３９３ページ（１９９７年））。オリゴヌクレオチドアレイの異なる素子にハイブリダイズした標的の相対比は、標的配列決定時のアレイの正確性を決定するであろう。この比率は、異なる捕獲鎖とＤＮＡ標的との間で形成された二本鎖のハイブリダイゼーション特性に依存する。驚くべきことには、これらのハイブリダイゼーション特性は、発蛍光団標識の代わりにナノ粒子標的を用いることにより劇的に改良される。図３５に示されているように、ナノ粒子標識標的の表面結合捕獲鎖からのデハイブリダイゼーションは、同一配列を有する発蛍光団標識標的のものよりはるかに温度感受性である。発蛍光団標識標的は、極めて広範な温度範囲（一次導関数ＦＷＨＭ＝１６℃）にわたって表面捕獲鎖からデハイブリダイズしたが、同一ナノ粒子標識標的ははるかに急激に融解した（一次導関数ＦＷＨＭ＝３℃）。これらの急勾配の解離プロファイルは、通常、ハイブリダイゼーションストリンジェンシー洗浄によって影響を受ける、チップベースの配列分析のストリンジェンシーを改善すると予想された。確かに、相補的表面プローブにハイブリダイズした標的と、（図３５の水平線によって表される）特定温度下のストリンジェンシー洗浄後に、誤対合プローブにハイブリダイズした標的との比率は、発蛍光団標識よりナノ粒子標識の方がはるかに高い。これは、チップ検出形式における高選択性を意味する筈である。さらに、ナノ粒子標識は、それによって、それより低いと、二本鎖が室温下に自発融解する臨界濃度を低下させる表面二本鎖の融解温度（Ｔｍ）を上昇させることによりアレイ感度を向上させるであろう。
【０３３７】
オリゴヌクレオチドアレイの比色指示剤としてのナノ粒子の有効性を評価するために、テストチップを合成標的でプローブし、発蛍光団指示剤とナノ粒子指示剤とで標識した。テストアレイとオリゴヌクレオチド標的は、公開されているプロトコル（Ｇｕｏら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，第２２巻，５４５６ページ（１９９４年）；Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ　４１７　Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒを用いて、３７５μｍで分離された直径１７５μｍのスポットアレイをパターン化した）に従って作製した。アレイは、標的の８位の４つの可能なヌクレオチド（Ｎ）それぞれに対応する４つの素子を含んでいた（図３２参照）。ハイブリダイゼーション緩衝液中で、合成標的と、蛍光標識またはナノ粒子標識プローブとを段階的にアレイにハイブリダイズさせたが、各ステップの後で、３５℃のストリンジェンシー緩衝液洗浄を行った。先ず、２×ＰＢＳ（０．３Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　Ｎａ２Ｈ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液、ｐＨ７）中の１ｎＭ　合成標的溶液２０μｌとアレイとを、室温下に４時間、ハイブリダイゼーションチャンバ（Ｇｒａｃｅ　Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ　Ｃｏｖｅｒ　Ｗｅｌｌ　ＰＣ２０）中でハイブリダイズさせ、次いで、３５℃下に清浄な２×ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。次いで、２×ＰＢＳ中１００ｐＭ　オリゴヌクレオチド官能化金ナノ粒子溶液２０μｌとアレイとを、室温下に４時間、新鮮なハイブリダイゼーションチャンバ中でハイブリダイズさせた。アレイを３５℃下に清浄な２×ＰＢＳで洗浄し、次いで、２×ＰＢＳ（０．３Ｍ　ＮａＮＯ３、１０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液、ｐＨ７）で２回洗浄した。次いで、ナノ粒子アレイを銀増幅溶液（シグマ・ケミカル社、Ｓｉｌｖｅｒ　Ｅｎｈａｎｃｅｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中に５分間浸漬し、水で洗浄した。銀増幅により、アレイ素子はかなり暗色化し、直径２００μｍの素子は平台型スキャナまたは肉眼でさえ容易に見ることができた。
【０３３８】
モデル標的およびナノ粒子標識プローブで攻撃し、銀溶液で染色したアレイは、相補的アレイ素子への選択性の高いハイブリダイゼーションを明瞭に示した（図３６Ａ）。同じ捕獲配列の重複スポットは、再現性があってばらつきのないハイブリダイゼーションシグナルを示した。ナノ粒子または銀染料によるバックグラウンド吸着は全く観察されなかった。平台型スキャナによって記録された画像グレースケール値は、清浄な顕微鏡スライドに関して観察されたものと同じであった。８位のアデニン（Ｎ＝Ａ）に対応する暗いスポットは、オリゴヌクレオチド標的が、３：１を超える比率で、誤対合鎖よりも完全相補性捕獲鎖に選択的にハイブリダイズしたことを示している。さらに、各スポットセットの総合グレースケール値は、ワトソン・クリック型塩基対、Ａ：Ｔ＞Ｇ：Ｔ＞Ｃ：Ｔ＞Ｔ：Ｔ（Ａｌｌａｗｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３６巻，１０５８１ページ（１９８８年））の予測安定性に従う。通常、Ｇ：Ｔ誤対合をＡ：Ｔ相補体から識別するのは特に難しく（Ｓａｉｋｉら，Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｃｏｔｔｏｎら編（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９８年），第７章；Ｓ．Ｉｋｕｔａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，第１５巻，７９７ページ（１９８７年））、これら２種のアレイ素子の識別は、１つのヌクレオチド誤対合の検出におけるナノ粒子標識の驚異的な分解能を証明している。ナノ粒子ベースアレイの選択性は、発蛍光団指示アレイの選択性より高く（図３６Ｂ）、発蛍光団標識は８位のアデニンに対して２：１の選択性を提供したに過ぎない。
【０３３９】
ナノ粒子標識プローブを利用するアッセイは、発蛍光団標識プローブを利用するものより感度が有意に高かった。ハイブリダイゼーションシグナルを、５０ｆＭ程度の低さ（または、２０μｌの溶液を含有するハイブリダイゼーションチャンバの場合は、１×１０６総コピー数）の標的濃度のＮ＝Ａ要素で分解することができた。これは、通常、１ｐＭ以上の標的濃度が要求される慣用のＣｙ３／Ｃ７５発蛍光団標識アレイに比べて劇的な感度の向上を示している。表面上に固定化されたナノ粒子−標的複合体に関して観察された高融解温度がアレイの感度に寄与していることは疑いもない。ナノ粒子系の場合に発蛍光団系に比べてプローブ／標的／表面−オリゴヌクレオチド複合体の安定性が増大すると、洗浄ステップ中に失われる標的およびプローブが少なくなると考えられる。
【０３４０】
コンビナトリアルオリゴヌクレオチドアレイの比色性ナノ粒子標識は、誤対合１つの解像、感度、コスト、使用し易さが重要な要素である一ヌクレオチド多型分析などの用途に有用であろう。さらに、全体的に最適化する必要があるこの系の感度は、ポリメラーゼ連鎖反応などの標的増幅計画を必要とせずに、オリゴヌクレオチド標的を検出するための潜在的な方法を示している。
【０３４１】
実施例２０：　ナノ粒子構造
ハイブリダイズしたＤＮＡリンカーを媒介としたガラス支持体上への超分子重層金ナノ粒子構造の可逆的集合体を説明する。オリゴヌクレオチド官能化ナノ粒子を、相補的ＤＮＡリンカーの存在下、オリゴヌクレオチド官能化ガラス支持体に連続付着させる。ＤＮＡの独特な認識特性により、相補的リンカーの存在下にナノ粒子構造が選択的に集合する。さらに、これらの構造は、溶液の温度、ｐＨ、およびイオン強度を含めた連結二本鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーションを媒介する外部刺激に応答して集合したり、離散したりし得る。この系は、固相支持体上にナノ粒子ベース構造を構築する極めて選択的かつ制御された方法を提供することに加えて、ＤＮＡによって連結されたナノ粒子網目構造の光学特性と融解特性とに影響を与える要素の研究を可能にする。
【０３４２】
別の者は、いかにして、二官能価有機分子（Ｇｉｔｔｉｎｓら，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，第１１巻，７３７ページ（１９９９年）；Ｂｒｕｓｔら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第１４巻：５４２５ページ（１９９８年）；Ｂｒｉｇｈｔら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第１４巻：５６９６ページ（１９９８年）；Ｇｒａｂａｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１８巻：１１４８ページ（１９９６年）；Ｆｒｅｅｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２６７巻：１６２９ページ（１９９５年）；Ｓｃｈｍｉｄら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｅｌ．，第３９巻：１８１ページ（２０００年）；Ｍａｒｉｎａｋｏｓら，Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．，第１０巻：１２１４ページ（１９９８年））または高分子電解質（Ｓｔｏｒｈｏｆｆら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１２０巻，１９５９ページ（１９９８年）；Ｓｔｏｒｈｏｆｆら，Ｊ．Ｃｌｕｓｔｅｒ　Ｓｃｉ．，第８巻：１７９ページ（１９９７年）；Ｅｌｇｈａｎｉａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２７７巻：１０７８ページ（１９９７年）；Ｍｉｒｋｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ　第３８２巻，６０７ページ（１９９６年））を使用して平面構造から単層および多層ナノ粒子材料を制御可能に構築し得るかを証明した。ナノ粒子の相互連結体としてＤＮＡを用いることの魅力的な特徴は、ＤＮＡ配列を選択することにより、粒子間間隔、粒子周期性および粒子組成を合成的にプログラムし得ることである。さらに、オリゴヌクレオチドの可逆結合特性を利用して、動構造ではなく熱力学的構造を確実に形成し得る。この方法は、固相支持体からのナノ粒子ベース構造の成長を制御する新規かつ強力な方法を提供するだけでなく、ナノ粒子凝集体サイズと、凝集体ＤＮＡ相互連結構造の融解特性および光学特性との関係を評価することもできる。これら２つの物理的パラメータとそれらの材料構築物との関係は、特にバイオ検出分野におけるナノ粒子網目構造材料の利用に必須である。
【０３４３】
多層集合体の構築に用いられる直径１３ｎｍのオリゴヌクレオチド官能化金ナノ粒子を実施例１および３に記載のように調製した。これらのナノ粒子には、それぞれナノ粒子ａおよびｂを生成する、５′−ヘキシルチオール−キャップオリゴヌクレオチド１（５′−ＨＳ（ＣＨ２）６Ｏ（ＰＯ２ −）Ｏ−ＣＧＣＡＴＴＣＡＧＧＡＴ−３′［配列番号５０］と、３′−プロパンチオール−キャップオリゴヌクレオチド２（３′−ＨＳ（ＣＨ２）３Ｏ（ＰＯ２ −）Ｏ−ＡＴＧＣＴＣＡＡＣＴＣＴ−５′［配列番号５９］が付着していた（図３７参照）。実施例１０に記載のように、ガラス製スライドを１２ｍｅｒオリゴヌクレオチド２で官能化した。ナノ粒子層を構築するために、先ず、基板を２４ｍｅｒリンカー３（５′−ＴＡＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧＣＧ−３′［配列番号６０］）の１０ｎＭ溶液に浸漬し、室温下に４時間ハイブリダイズさせた（図３７参照）。支持体を清浄な緩衝液で洗浄し、次いで、第１ナノ粒子層を付着させるために室温下に４時間、粒子ａの２ｎＭ溶液とハイブリダイズさせた。同様に基板表面をリンカー３とナノ粒子ｂの溶液に暴露するだけで第２ナノ粒子層を第１ナノ粒子層に付着させることができた。これらのハイブリダイゼーションステップを繰り返して、各層がリンカー３を介して前の層に連結したナノ粒子ａとｂの多重交互層を付着させることができた。リンカーの不在下、または非相補的オリゴヌクレオチドの存在下では、表面へのナノ粒子のハイブリダイゼーションは観察されなかった。さらに、ＤＮＡリンカーのハイブリダイゼーションを促進させる条件：中性ｐＨ、穏和な塩濃度（＞０．０５Ｍ　ＮａＣｌ）および二本鎖融解温度（Ｔｍ）を下回る温度下にのみ多層集合体が観察された。
【０３４４】
ハイブリダイズした各ナノ粒子層は、基板をより暗紅色とし、１０層がハイブリダイズした後の支持ガラス製スライドには、反射による金色が出現した。表面へのナノ粒子の連続ハイブリダイゼーションのモニターには、基板の透過ＵＶ−可視分光法を用いた（図３８Ａ）。初期ナノ粒子層の吸光度の低さは、この層がさらなる層の形成を促進するもととなったことを示唆しており、層を追加するに従って、プラズモンバンドの強度がほぼ線形に増大することが示された（各連続ナノ粒子層の形成に関して、リンカー３またはナノ粒子溶液の暴露時間を長くしたり、濃度を増大させたりしても、さらなる吸光度の増大は観察されなかった）。初期ナノ粒子層生成後に吸光度が線形に増大したことは、連続的に層を加えるに従って、表面がハイブリダイズしたナノ粒子で飽和されたことを示している（図３８Ｂ）。これは、１層の場合には低いナノ粒子被覆を示すが、２層の場合にはほぼ完全な被覆を示す表面上の１つ（図３９Ａ）および２つ（図３９Ｂ）のナノ粒子層の電界放出走査型電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ）画像によって支持される。多層集合体のプラズモンバンドλｍａｘは、５層になった後でさえ、１０ｎｍ以下しかシフトしない。このシフトの検出は、金ナノ粒子凝集体の他の実験的処理（Ｇｒａｂａｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１８巻，１１４８ページ（１９９６年））および理論的処理（Ｑｕｉｎｔｅｎら，Ｓｕｒｆ．Ｓｃｉ．，第１７２巻，５５７ページ（１９９６年）；Ｙａｎｇら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，第１０３巻：８６９ページ（１９９５年））と一致する。しかし、シフトの大きさは、λｍａｘ＞５７０ｎｍを示す、オリゴヌクレオチドに連結した金ナノ粒子網目構造の懸濁液に関して先に観察されたものと比較すると小さい（先の実施例参照）。これは、金ナノ粒子ベースのオリゴヌクレオチドプローブに関して観察された赤色から青色への劇的な変色を生成するには、恐らく何百または何千ものもっと多くのナノ粒子が連結する必要があることを示唆している。（Ｓｔｏｒｈｏｆｆら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１２０巻，１９５９ページ（１９９８年）；Ｓｔｏｒｈｏｆｆら，Ｊ．Ｃｌｕｓｔｅｒ　Ｓｃｉ．，第８巻，１７９ページ（１９９７年）；Ｅｌｇｈａｎｉａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２７７巻，１０７８ページ（１９９７年）；Ｍｉｒｋｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，第３８２巻，６０７ページ（１９９６年））。凝集した金ナノ粒子の表面プラズモンシフトは、粒子間間隔に大きく依存することが明らかにされた（Ｑｕｉｎｔｅｎら，Ｓｕｒｆ．Ｓｃｉ．，第１７２巻：５５７ページ（１９８６年）；Ｓｔｏｒｈｏｆｆら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，前掲）。オリゴヌクレオチドリンカーにより提供される大きな間隔（この系の場合８．２ｎｍ）によって、金表面プラズモンバンドに及ぼすナノ粒子凝集の累積的効果が有意に低下する。
【０３４５】
集合したナノ粒子多層の解離特性は、層の数に大きく依存していた。多層でコートされた基板を緩衝液に懸濁し、温度を連結オリゴヌクレオチドのＴｍより高い温度（５３℃）に上げると、ナノ粒子は、無色のガラス表面を残して、溶液中に解離した。緩衝懸濁液のｐＨを上下させたり（＞１１または＜３）、塩濃度を低下させたり（０．０１Ｍ　ＮａＣｌ未満）しても、連結したＤＮＡをデハイブリダイズすることによりナノ粒子は解離した。多層集合体は完全に可逆性であり、ナノ粒子は、ガラス基板にハイブリダイズしたり、ガラス基板からデハイブリダイズしたりし得る（例えば、３つのサイクルは、検出可能な不可逆性ナノ粒子結合がないことが示された）。
【０３４６】
重要なことには、表面結合ナノ粒子集合体はすべて連結オリゴヌクレオチドのＴｍを超える温度で解離したが、これらの転移の急激さは、支持されている凝集体のサイズに依存していた（図３９Ｄ−Ｆ）。驚くべきことには、支持体からの第１ナノ粒子層の解離は、溶液中にナノ粒子を含まない同じオリゴヌクレオチド（図３９Ｃ）のものより急激な転移（図３９Ｄ、一次導関数のＦＷＨＭ＝５℃）を示した。基板にさらにナノ粒子層がハイブリダイズするにつれ、オリゴヌクレオチド連結ナノ粒子の融解転移は、溶液中に見出された大きなナノ粒子網目構造集合体の融解転移と同等になるまで連続的に急激さを増した（図３９Ｅ−Ｆ、一次導関数のＦＷＨＭ＝３℃）。（Ｇｉｔｔｉｎｓら，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，第１１巻：７３７ページ（１９９９年）；Ｂｒｕｓｔら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第１４巻：５４２５ページ（１９９８年）。）これらの実験は、最適な急激融解曲線を得るためには、３つ以上のナノ粒子と多重ＤＮＡの相互連結体が必要であることを立証している。これらの実験はさらに、この系における光学的変化が融解特性から完全に切り離されている（すなわち、凝集が小さいと、急激な転移は生じ得るが、それでも変色は生じない）ことを示している。
【０３４７】
実施例２１：　金ナノ粒子集合体の電気的性質
ＤＮＡを介した電子的移動は、過去数年にわたり化学の分野で最も広範囲に討議されている問題の１つである。（Ｋｅｌｌｅｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２８３巻：３７５−３８１ページ（１９９９年）；Ｔｕｒｒｏら，ＪＢＩＣ、第３巻：２０１−２０９ページ（１９９８年）；Ｌｅｗｉｓら，ＪＢＩＣ，第３巻：２１５−２２１ページ（１９９８年）；Ｒａｔｎｅｒ，Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ，第３９７巻，４８０−４８１ページ（１９９９年）；Ｏｋａｈａｔａら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１２０巻，６１６５−６１６６ページ（１９９８年））。ＤＮＡは効率的に電子を移動させ得ると主張するものもいるが、ＤＮＡは絶縁体であると考えるものもいる。
【０３４８】
表面上類似点の無い研究分野において、ナノ粒子をベースとした材料の電気的性質の研究に多大な努力が傾けられてきた（Ｔｅｒｒｉｌｌら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１７巻，１２５３７−１２５４８ページ（１９９５年）；Ｂｒｕｓｔら，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，第７巻，７９５−７９７ページ（１９９５年）；Ｂｅｔｈｅｌｌら，Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，第４０９巻：１３７−１４３ページ（１９９６年）；Ｍｕｓｉｃｋら，Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．，第９巻：１４９９−１５０１ページ（１９９７年）；Ｂｒｕｓｔら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第１４巻，５４２５−５４２９ページ（１９９８年）；Ｃｏｌｌｉｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２７７巻：１９７８−１９８１ページ（１９９７年））。確かに、多くのグループがナノ粒子を二次元および三次元網目構造に集合させる方法を探究し、そのような構造の電子特性を調査してきた。しかし、ＤＮＡと連結させたナノ粒子ベース材料の電気的性質については実質的に何も分っていない。
【０３４９】
この研究において初めて、異なる長さのＤＮＡ相互連結体によって形成された金ナノ粒子集合体の電気的性質が調査された。以下に示されているように、これらのハイブリッド無機集合体は、２４〜７２ヌクレオチド範囲にわたるオリゴヌクレオチド粒子相互連結体長にも拘わらず、半導体として挙動する。本明細書に記載されている結果は、ＤＮＡ相互共役体が、金属ナノ粒子間の絶縁バリヤを形成不要で、このため粒子の電気的性質を破壊することのない、金属ナノ粒子用の化学的に特異的な足場材料として用い得ることを示している。これらの結果は、そのようなハイブリッド集合体を電子材料として利用し得る新規な方法を示している。
【０３５０】
この主題の中心には以下の問題がある：ＤＮＡを介して集合したナノ粒子は、それでも電気を伝導し得るか、または各粒子上に重度に添加されたＤＮＡ相互共役体は絶縁シェルとして作用し得るか、ということである（Ｍｕｃｉｃ，Ｒ．Ｃ．，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｌｌｙ　Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ　Ｕｉｓｎｇ　ＤＮＡ，Ｔｈｅｓｉｓ　Ｐｈ．Ｄ．，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９９年））。これらの材料の導電率を、温度、オリゴヌクレオチド長および相対湿度の関数として調べた。ＤＮＡによって連結されたナノ粒子構造を、電界放出走査型電子顕微鏡検査（ＦＥ−ＳＥＭ）、シンクロトロン小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ、ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ　ｓｍａｌｌ　ａｎｇｌｅ　ｘ−ｒａｙ　ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）実験、熱変性プロファイル、およびＵＶ−可視分光法によって特性決定した。
【０３５１】
典型的な実験（図４０参照）では、クエン酸塩で安定化した１３ｎｍ金ナノ粒子を、実施例１および３に記載のように、３′および５′アルカンチオールでキャップした１２ｍｅｒオリゴヌクレオチド１（３′ＳＨ（ＣＨ２）２Ｏ（ＰＯ２ −）Ｏ−ＡＴＧＣＴＣＡＡＣＴＣＴ５′［配列番号５９］）および２（５′ＳＨ（ＣＨ２）６Ｏ（ＰＯ２ −）Ｏ−ＣＧＣＡＴＴＣＡＧＧＡＴ３′［配列番号５０］）で修飾した。２４、４８または７２塩基長のＤＮＡ鎖３（５′ＴＡＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧＣＧ３′［配列番号６０］）、４（５′ＴＡＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＣＣＧＴＴＡＡＧＡＣＧＡＧＧＣＡＡＴＣ−ＡＴＧＣＡＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧＣＧ３′［配列番号６１］）、および５（５′ＴＡＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＣＣＧＴＴＡＡＧＡＣＧＡＧＧＣＡＡＴＣＡＴＧＣＡＴＡＴＡＴＴＧＧＡＣＧＣＴＴＴＡＣＧＧＡＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧＣＧ３′［配列番号６２］）をリンカーとして用いた。充填剤６（３′ＧＧＣＡＡＴＴＣＴＧＣＴＣＣＧＴＴＡＧＴＡＣＧＴ５′［配列番号６３］）および７（３′ＧＧＣＡＡＴＴＣＴＧＣＴＣＣＧＴＴＡＧＴＡＣＧＴＡＴＡＴＡＡＣＣＴＧＣＧＡＡＡＴＧＣＣＴＧＴＴＧ５′［配列番号６４］）を４８塩基リンカーおよび７２塩基リンカーと共に用いた。ＤＮＡ修飾ナノ粒子とＤＮＡリンカーおよび充填剤は、使用前に、０．３Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　リン酸（ｐＨ７）緩衝液（０．３Ｍ　ＰＢＳと称される）中に貯蔵した。ナノ粒子集合体を構築するために、１で修飾した金ナノ粒子（６５２μｌ、９．７ｎＭ）と２で修飾した金ナノ粒子（６５２μｌ、９．７μＭ）をリンカーＤＮＡ３、４、または５（３０μｌ、１０ｎＭ）に加えた。完全に沈殿させた後、凝集体を０．３Ｍ　ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４溶液で洗浄して過剰なＤＮＡおよびＮａＣｌを除去した。
【０３５２】
凝集体を凍結乾燥（１０−３〜１０−２トル）乾固してペレットを得、揮発性塩ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４を除去した。Ｆｒｅｎｓ法（Ｆｒｅｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ　Ｐｈｙｓ．Ｓｃｉ．，第２４１巻：２０−２２ページ（１９７３年））により調製した官能化されていないクエン酸塩安定化粒子を膜として乾燥させ、比較用に用いた。得られた乾燥凝集体は曇った黄銅に似た色を有しており、非常に脆かった。ＦＥ−ＳＥＭ画像は、オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子は乾燥しても無傷のままであるが、クエン酸塩安定化ナノ粒子は互いに融合したことを示した。乾燥したＤＮＡを介して連結された凝集体が０．３Ｍ　ＰＢＳ緩衝液（１ｍｌ）に再分散し得、かつ優れた融解特性を示したことは重要である。そのような分散液を６０℃に加熱すると、ＤＮＡ相互共役体のハイブリダイゼーションが起こり、分散したナノ粒子の赤色溶液が得られた。これをＦＥ−ＳＥＭデータと合わせると、ＤＮＡ修飾金ナノ粒子は、乾燥させると、不可逆的には凝集しないことが最終的に証明された。
【０３５３】
コンピュータ制御４プローブ技術を用いて、３種の試料（それぞれ３、４および５を介して連結された乾燥凝集体）の導電率を測定した。電気接点は、金ペーストでペレットに付着させた細い金ワイヤ（直径２５および６０μｍ）から構成した。試料を中程度の真空（１０−３〜１０−２トル）下に冷却し、低圧のドライヘリウムガス下に温度を増大させながら導電率を測定した。起こり得る光電子事象を排除するために、試料チャンバを光から隔離した。励起電流を１００ｎＡ以下に維持し、試料全体にわたる圧力を最大２０Ｖに制限した。驚くべきことには、３種すべてのリンカーから形成された凝集体の導電率は、室温下に１０−５〜１０−４Ｓ／ｃｍの範囲であり、これらの凝集体は、類似した温度依存性挙動を示した。ＤＮＡ連結凝集体の導電率は、半導体材料の特徴を示す、約１９０°Ｋまでのアレニウス挙動を示した。これは、不連続金属島状膜に認められる活性化電子ホッピング挙動に似ている（Ｂａｒｗｉｎｓｋｉ，Ｔｈｉｎ　Ｓｏｌｉｄ　Ｆｉｌｍｓ，第１２８巻：１−９ページ（１９８５年））。アルカンジチオールを介して連結された金ナノ粒子の網目構造は類似の温度依存性を示した（Ｂｒｕｓｔら，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，第７巻：７９５−７９７ページ（１９９５年）；Ｂｅｔｈｅｌｌら．Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，第４０９巻：１３７−１４３ページ（１９９６年））。電荷移動の活性化エネルギーは、方程式（１）
【０３５４】
σ＝σｏｅｘｐ［−Ｅα／ｋＴ］］　（１）
を用いる１ｎσ対１／Ｔのプロットから得ることができる。３つの測定値から計算した平均活性化エネルギーは、それぞれ２４、４８および７２ｍｅｒリンカーに関して、７．４±０．２ｍｅＶ、７．５±０．３ｍｅＶ、７．６±０．４ｍｅＶであった。これらの計算には、５０°Ｋから１５０°Ｋまでの導電率を用いた。
【０３５５】
これらの種類の材料の電気的性質は粒子間間隔に依存する筈なので、シンクロトロンＳＡＸＳ実験を用いて、分散した乾燥凝集体の粒子間間隔を測定した。ＳＡＸＳ実験は、Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｐｒｏｔｏｎ　Ｓｏｕｒｃｅ、Ａｒｇｏｎｎｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＤｕｐｏｎｔ−Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ−Ｄｏｗ　Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ａｃｃｅｓｓ　Ｔｅａｍ（ＤＮＤ−ＣＡＴ）Ｓｅｃｔｏｒ５で実施した。ＤＮＡ連結凝集体およびＤＮＡ修飾コロイドの希釈物試料を０．３ミクロンビームの１．５４Å放射線で照射し、散乱放射線をＣＣＤ検出器で回収した。２Ｄデータを循環的に平均し、散乱ベクトル量、ｓ＝２ｓｉｎ（θ）／λ（ここで、２θは散乱角、λは入射放射線の波長）の関数、Ｉ（ｓ）に変換した。すべてのデータをバックグラウンド散乱および試料吸収に対して補正した。３種すべての凝集体構造を乾燥させると、粒子間間隔感受性の第１ピーク位置は、それぞれ、２４ｍｅｒ、４８ｍｅｒおよび７２ｍｅｒ連結凝集体の０．０６３ｎｍ−１、０．０４８ｎｍ−１、および０．０３７ｎｍ−１のｓ値から０．０８７ｎｍ−１のｓ値へ大きく変化した。これは、乾燥させると、粒子が殆ど接触するポイントまで粒子間間隔が有意に減少したこと、およびそのような間隔は実質的にはリンカー長とは無関係であるが、溶液中での粒子間隔はリンカー長に大きく依存していたことを示している。これによって、乾燥ペレットの導電率実験における３種の異なる系に関して何故類似の活性化エネルギーが観察されたかが分る。さらに、これによって、何故、ＤＮＡの電子特性の見方とは無関係に比較的高い導電率が観察されたかも明らかになる。ＤＮＡ連結材料とは異なり、乾燥させたクエン酸塩安定化金ナノ粒子膜は、金属様挙動を示した。これは、そのような粒子が互いに融合することを示したＳＥＭデータと一致する。
【０３５６】
１９０°Ｋを超えると、測定したＤＮＡ連結試料の導電率は非常に急な低下挙動を示した。すべての試料について、導電率は約１９０°Ｋで急激に低下し始め、およそ２５０°Ｋまで低下し続け、そこから再度増大した。この挙動を詳細に調査するために、試料を繰返し冷却、加熱しながら導電率を測定した。興味深いことには、導電率の低下は、温度が増大方向にあるときにのみ起こった。ＤＮＡは親水性であり、かつ水は潜在的にハイブリッド構造の電気的性質に影響を与え得るので、金凝集体の導電率に及ぼす相対湿度の影響を調べた。湿度を１％から１０％に増大させると、抵抗が１０因数増大した。導電率測定前に、試料を真空（１０−６トル）下に４８時間維持したときには、特有な急低下が非常に弱かったことに留意されたい。これらの観察結果から、１９０°Ｋを超えたときの導電率の非常に急な低下およびその後の増大は、粒子間間隔を（蒸発が起こるまで）一時的に増大させた水の融解およびＤＮＡの吸湿性に関連すると推断した。この仮説と一致して、０．３Ｍ　ＰＢＳ緩衝液で湿らせた乾燥凝集体に関するＳＡＸＳ測定値は、粒子間間隔の２００％の増大（〜２ｎｍ）を示した。
【０３５７】
これらの研究は以下の理由から重要である。先ず、これらの研究は、ＤＮＡの分子認識特性を用いれば、ナノ粒子ベース材料を、不動態化したり、それらの離散構造または電気的性質を破壊せずに集合させ得ることを証明している。これらのＤＮＡ官能化粒子を用いて三次元巨視的集合体または、さらにリトグラフィーパターン化構造（Ｐｉｎｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２８３巻：６６１−６６３（１９９９年））における電気的移動を研究しようとする場合、それらの電気的移動特性を正確に叙述することが絶対に必要である。第２に、これらの研究は、かなり長いリンカー間隔（８〜２４ｎｍ）にわたって、乾燥集合体の導電率がＤＮＡリンカー長には実質的に無関係であることを示している。これは、これらの実験において、水を除去したり、揮発性塩を用いたりした結果であると考えられる。確かに、溶媒および塩の除去によって創出された自由体積によって、ＤＮＡが表面に圧縮され、凝集体内の粒子が近接する。第３に、ＤＮＡ保護ナノ粒子を有する凝集体は半導体として挙動するが、クエン酸塩安定化粒子から形成された膜は、不可逆的粒子融合および金属様挙動を示す。最後に、これらの結果は、オリゴヌクレオチドで官能化されたナノ粒子と標的ＤＮＡとの間の配列特異的結合事象が回路の閉鎖および導電率の急激な増大（すなわち、絶縁体から半導体へ）を起こすＤＮＡ診断用途におけるこれらの材料の使用を示している（次ぎの実施例参照）。
【０３５８】
実施例２２：　金電極を用いた核酸の検出
金電極を用いた核酸検出法が図３９に略図で示されている。Ｇｕｏら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，第２２巻，５４５６−５４６５ページ（１９９４年）の方法に従って、２つの金電極の間のガラス表面を、標的ＤＮＡ３（５′ＴＡＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧＣＧ［配列番号６０］）と相補的な１２ｍｅｒオリゴヌクレオチド１（３′ＮＨ２（ＣＨ２）７Ｏ（ＰＯ２ −）Ｏ−ＡＴＧ−ＣＴＣ−ＡＡＣ−ＴＣＴ［配列番号５９］）で修飾した。オリゴヌクレオチド２（５′ＳＨ（ＣＨ２）６Ｏ（ＰＯ２ −）Ｏ−ＣＧＣ−ＡＴＴ−ＣＡＧ−ＧＡＴ［配列番号５０］）を作製し、実施例１および１８に記載のように１３ｎｍ金ナノ粒子に付着させて、ナノ粒子ａを生成した。標的ＤＮＡ３とナノ粒子ａをデバイスに付加した。ガラス表面の色はピンク色に変わったが、これは、標的ＤＮＡ−金ナノ粒子集合体がガラス基板上に形成されたことを示している。次いで、デバイスを０．３Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　リン酸緩衝液中に浸漬し、４０℃で１時間加熱して、非特異的に結合したＤＮＡを除去し、次いで、実施例１９に記載のような銀染色溶液で５分間処理した。電極の抵抗は６７ｋΩであった。
【０３５９】
比較のために、電極間に、オリゴヌクレオチド１の代わりにオリゴヌクレオチド４を付着させて対照デバイスを修飾した。オリゴヌクレオチド４は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチド２と同じ配列（５′ＮＨ２（ＣＨ２）６Ｏ（ＰＯ２ −）Ｏ−ＣＧＣ−ＡＴＴ−ＣＡＧ−ＧＡＴ［配列番号５０］）を有しており、ナノ粒子の結合を阻止するように標的ＤＮＡ３に結合するであろう。その他の点では上記のようにテストを実施した。抵抗は、使用したマルチメーターの検出限度である４０ＭΩより高かった。
【０３６０】
この実験は、相補的標的ＤＮＡ鎖のみがデバイスの２つの電極間にナノ粒子集合体を形成し、回路は、ナノ粒子のハイブリダイゼーションおよびその後の銀染色によって完成し得ることを示している。したがって、相補的ＤＮＡおよび非相補的ＤＮＡは、導電率を測定することにより識別し得る。この形式は、何千もの異なる核酸を同時にテストし得る何千対もの電極を用いた基板アレイ（チップ）にも適用範囲を広げ得る。
【０３６１】
実施例２３：環式ジスルフィドリンカーを用いたオリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子の調製
この実施例では、調製が簡単で、広く有用で、メルカプトヘキシルリンカーを使用して調製した金−オリゴヌクレオチド共役体よりもＤＴＴに対して大きな安定性を示す金−オリゴヌクレオチド共役体を与える、ステロイドジスルフィド１ａ（図４２）に基づく金表面にオリゴヌクレオチドを結合させる新しい環式ジスルフィドリンカーについて説明する。１，２−ジチアン−４，５−ジオールのエステル誘導体は金表面上で単分子層を形成することが知られているため（Ｎｕｚｚｏら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５，４４８１−４４８３）、環式ジスルフィドを、アンカーユニットの反応部位として選択した。環式ジスルフィドは、両方の硫黄原子を介して立とうに表面に結合し（Ｕｌｍａｎ，Ａ．、ＭＲＳ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、６月４６−５１）、向上した安定性を示し得るキレート構造を与えるだろう。リンク要素としては、入手が容易で、容易に誘導退化されるケトアルコールであり、大きな疎水性表面を備えた置換体として、金の表面への水溶性分子の接近を選別するのに役立つよう期待されるため、エピアンドロステロンを選択した（Ｒｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５、７５３５−７５３６―Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．９、８２６−８３０）。
【０３６２】
先の研究に使用していたオリゴヌクレオチド−金プローブを、水性緩衝液中で末端メルカプトヘキシル基を有するオリゴヌクレオチドを金ナノ粒子と反応させることによって調製した。該プローブは、驚くほど丈夫で、１００℃まで加熱した後や５℃で３年間保存した後でさえ良好に機能することが分かった。しかしながら、本願発明者らは、この共役体が、金の表面から誘導体化したオリゴヌクレオチドを取り外すことで作用するチオールを含む溶液に浸漬させた時に、ハイブリダイゼーションプローブとしての活性を失うことを見出した。この特徴は、ナノ粒子プローブが、チオールを含む溶液（例えばポリメラーゼ酵素の安定化剤としてジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含むＰＣＲ溶液）中で使用される場合に、問題を提起する。
【０３６３】
（ａ）一般法
ＮＭＲスペクトルを、溶媒としてＣＤＣｌ３、内部（Ｈ）標準としてＴＭＳ、外部（３１Ｐ）標準としてＨ３ＰＯ４を使用して、５００ＭＨｚ（１Ｈ）および４００ＭＨｚ（３１Ｐ；１６１．９ＭＨｚの獲得）Ｖａｒｉａｎ分光計により記録した。化学シフトはδユニットで表される。ＭＳデータをＱｕａｔｔｒｏ　ＩＩ三重四極子質量分析計により得た。自動オリゴヌクレオチド合成を、ミリジーンＥｘｐｅｄｉｔｅ　ＤＮＡＤＮＡ合成装置で行った。Ｓの分析は、Ｏｎｅｉｄａ研究サービスによって行われた。
【０３６４】
（ｂ）ステロイド−ジスルフィドケタール（１ａ）の調製
合成スキームは図４３に示される。エピアンドロステロン（０．５ｇ）、１，２−ジチアン−４，５ジオール（０．２８ｇ）およびｐ−トルエンスルホン酸（１５ｍｇ）をトルエン（３０ｍＬ）に溶かした溶液を、脱水条件下で７時間環流した（Ｄｅａｎ　Ｓｔａｒｋ装置）。その後、トルエンを、減圧下で除去し、残留物を酢酸エチルに溶解した。この溶液を水で洗い、硫酸ナトリウムで乾燥し、シロップ条の残留物に濃縮した。これをペンタン／エーテル中に一晩静置すると、白色固体（４００ｍｇ）として化合物ｌａが得られた。Ｒｆ値（ＴＬＣ、シリカプレート、溶離液としてエーテル）は０．５であった。比較として、同じ条件下でのエピアンドロステロンおよびの１，２−ジチアン−４、５−ジオールのＲｆ値は、それぞれ０．４および０．３である。ペンタン／エーテルからの再結晶により、白い粉末（融点１１０〜１１２℃）を生じた。１Ｈ　ＮＭＲ、δ３．６、（１Ｈ，Ｃ３ＯＨ）３．５４−３．３９（２Ｈ，ｍ　ジチアン環の２ＯＣＨ）、３．２−３．０（４Ｈ，ｍ　２ＣＨ２Ｓ）、２．１−０．７（２９Ｈ，ｍ　ステロイドのＨ）；質量スペクトル（ＥＳ＋）　Ｃ２３Ｈ３６Ｏ３Ｓ２（Ｍ＋Ｈ）に対する計算値４２５．２１７９、実測値４２５．２１５１　（Ｃ２３Ｈ３７Ｏ３Ｓ２）分析　計算値１５．１２、実測値１５．２６。
【０３６５】
（ｃ）ステロイド−ジスルフィドケタールホスホロアミダイト誘導体（１ｂ）の調製
化合物１ａ（１００ｍｇ）をＴＨＦ（３ｍＬ）に溶解し、ドライアイスアルコール浴で冷却した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８０μＬ）およびβ−シアノエチルクロロジイソプロピルホスホルアミダイト（８０μＬ）を連続して加えた。その後、混合物を室温まで温め、２時間撹拌し、酢酸エチル（１００ｍＬ）と混ぜ、５％ＮａＨＣＯ３水溶液で洗い、硫酸ナトリウムで乾燥させ、干し上がるまで濃縮した。残留物を最小量のジクロロメタンに溶かし、ヘキサンを加えて−７０℃で沈降させ、真空下で乾燥させ、１００ｍｇを生成した。；３１Ｐ　ＮＭＲ　１４６．０２。
【０３６６】
（ｄ）５′修飾オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体の調製
最後の亜リン酸化工程で化合物１ｂ（図４２）を使用した以外には、従来のホスホロアミダイト化学機構を使用して５′修飾オリゴヌクレオチドＩｃ１および１ｃ２をＣＰＧ支持体上に構築した。生成物を、濃縮ＮＨ４ＯＨで１６時間、５５℃で処理することにより支持体から外した。オリゴヌクレオチドを、Ｈｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　ＯＤＳ　Ｈｙｐｅｒｓｉｌカラム（４．６×２００ｎｍ、５μｍ粒径）を備えたＤｉｏｎｅｘ　ＤＸ５００システムで、ＴＥＡＡ緩衝液（ｐＨ７．０）と１％／分勾配の９５％ＣＨ３ＣＮ／５％０．０３ＴＥＡＡを１ｍＬ／分の流量で使用して、逆相ＨＰＬＣにより精製した。疎水性ステロイド基の優れた特徴は、キャップされた誘導体が、キャップが外されたオリゴマーから楽に分離されることである。硫黄で誘導体化したオリゴヌクレオチドＩＩａ、ＩＩｃ１，およびＩＩｃ２（図４３）を、市販の「５′−チオール−修飾試薬」（Ｃ６Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と、以前に説明されたような（Ｓｔｏｒｈｏｆｆ、Ｊ．Ｊ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０、１９５９−１９６４）硝酸銀によるトリチル保護基の解離とを使用して調製した。ジスルフィドＩＩｃ１の調製に関しては、「チオール−修飾Ｃ６　Ｓ−Ｓ」（Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を最後の亜リン酸化に使用し、末端のジメトキシトリチル基を８０％酢酸水溶液中で解離させた。
【０３６７】
各修飾オリゴヌクレオチドを、固定されたメルカプトヘキシル基を介したオリゴヌクレオチドの固定に使用された方法（Ｓｔｏｒｈｏｆｆら（１９９８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０、１９５９−１９６４）により、〜１３ｎｍの金ナノ粒子に固定化した。これは、クエン酸塩で安定化ナノ粒子（直径〜１３ｎｍ）を５６時間末端硫黄置換基（ＨＳ−または非環式または環式ジスルフィド）を有するオリゴヌクレオチドを含む緩衝塩溶液に浸漬してから、０．１ＭまでのＮａＣＬを添加し、２４時間静置することを含んでいた。ナノ粒子を遠心によってペレットにし、上澄溶液を除去した。ナノ粒子を洗浄し、緩衝液に再懸濁し、再び遠心し、０．１Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩に懸濁した。この方法により、装填プロセスに使用される過剰な硫化オリゴヌクレオチドのない、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体が得られた。
【０３６８】
（ｅ）ハイブリダイゼーション
ジスルフィド−ステロイドアンカーを含むナノ粒子−オリゴヌクレオチドプローブの一体性を評価するために、金ナノ粒子上の修飾オリゴヌクレオチドの固定により、プローブＩｃ１、Ｉｃ２、ＩＩｃ１、ＩＩｃ２、およびＩＩＩｃ１を作製した。与えたシリーズ中のオリゴマーは同じヌクレオチド配列を有するが、５′先端基Ｙの構造が異なっている。Ｉｃ１とＩｃ２はステロイド−ジスルフィド先端基を有し；ＩＩｃ１、ＩＩｃ２はメルカプトヘキシル先端基を有し、ＩＩＩｃ１は非環式ジスルフィド先端基を有する。（ｄＡ）２０鎖はハイブリダイゼーションを促進するための、金とオリゴヌクレオチド認識部分との間のスペーサーとして機能する。硫黄で誘導体化されたオリゴマーの多くは各ナノ粒子に結合する。標的オリゴヌクレオチドとのナノ粒子プローブ対のハイブリダイゼーションは３次元のネットワークの生成と、および赤から青灰色への色の変化につながる（Ｍｕｃｉｃ，Ｒ．Ｃ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０、１２６７４−１２６７５）。
【０３６９】
プローブのハイブリダイゼーションを、プローブに相補的な配列を含む７９ｍｅｒオリゴヌクレオチド標的を用いて調べた。（図４３）。その反応は、０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．０）で、プローブ対Ｉｃ１、Ｉｃ２、およびＩＩｃ１、ＩＩｃ２、およびＩＩＩｃ１、ＩＩＩｃ２のコロイド溶液（各ナノ粒子プローブに関して５０μＬおよび１．０Ａ５２０ユニット）に１μＬの標的溶液（１０ｐｍｏｌのＩＶ）を加えることにより、室温で行った。１０秒、５分、および１０分目に、アリコート（３μＬ）を取り、Ｃ−１８逆相ＴＬＣプレート上にスポットした。様々なプローブ対はすべて同じに作用した。すなわち、１０秒間の反応のスポットは赤くなり（ナノ粒子が自由であること示す）；１０分間の反応のスポットは紺青灰色となり（ナノ粒子の凝集物の特徴）；５分間の反応は、赤茶けた青色のスポットを与えた（非結合ナノ粒子と結合ナノ粒子の混合物を示す）。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって達成されるナノ粒子の凝集に関する以前の観察と一致して（Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０、１９５９−１９６４；Ｅｌｇｈａｎｉａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７、１０７８−１０８１；Ｍｕｃｉｃ　Ｒ．Ｃ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０、１２６７４−１２６７５；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｇ．Ｐ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１、８１２２−８１２３）、反応は可逆的だった。凝集物を９０℃（ナノ粒子を一緒にリンクするオリゴマーの解離温度を超える温度）に温め、熱いうちにスポットすると、赤いスポットが得られた。オリゴヌクレオチド標的を省略したかオリゴヌクレオチド標的がプローブに相補的でない対照実験では、すべての条件下で色が赤かった。
【０３７０】
本願発明者が結論づけるのは、ステロイド−ジスルフィドアンカーによって生成されたナノ粒子共役体が、ハイブリダイゼーションプローブとして有効に機能することである。さらに、スポット試験によって判断されるように、様々なアンカーユニットを備えた共役体が、かなりの割合で標的オリゴヌクレオチドと反応する。この特徴は、プローブが、ナノ粒子の表面にかなりの密度のオリゴヌクレオチドを有し、５′先端基から比較的遠くに離れているヌクレオチド認識部分を有するという予想と一致している。
【０３７１】
（ｆ）ナノ粒子プローブとジチオスレイトールの反応
金ナノ粒子かメルカプトヘキシル−オリゴヌクレオチドを装填した金ナノ粒子のコロイド溶液へのチオールの追加は、ナノ粒子の凝集につながる。色は赤から紺青まで変化し、静置すると、暗色沈澱物が沈着する。蛍光標識したオリゴヌクレオチドを有するナノ粒子の実験で実証されるように、チオールは、金表面に結び付けられたメルカプトアルキル−オリゴヌクレオチドを置換する（Ｍｕｃｉｃ、Ｒ．Ｃ．（１９９９）　Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ　Ｕｓｉｎｇ　ＤＮＡ　ＰｈＤ論文、ノースウェスタン大学）。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体のハイブリダイゼーションによって起こった凝集とは対照的に、そのような反応は不可逆であり、加熱しても、ＮａＯＨを加えても、凝集物を分解することはできない。
【０３７２】
本願発明者らは、この色を、ステロイド環式ジスルフィド先端基、メルカプトヘキシル先端基、および非環式ジスルフィド先端基を用いて作製したプローブとＤＴＴとの反応をモニタするために使用した。実験は、１μＬの１Ｍ　ＤＴＴ溶液を、０．５Ｍ　ＮａＣｌおよび１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．０）の１００μＬのナノ粒子−オリゴヌクレオチドプローブ溶液（ナノ粒子の２Ａ５２０ユニット）に加え、次に、様々な時間に３μＬのアリコートをＴＬＣプレート上にスポットし、色を観察するにより行った。表１に示されるように、メルカプトヘキシル（ＩＩｃ１とＩＩｃ２）と非環式オリゴヌクレオチド先端基（ＩＩＩｃ１）を備えたオリゴヌクレオチドに由来するコロイドプローブは、急速に反応した。赤青色のスポットが２０秒で得られ、強い青色のスポットが５分以内に得られた。１００分までに、ほとんどの金は沈殿した。対照的に、ステロイド環式ジスルフィド先端基（Ｉｃ１、Ｉｃ２）を用いて作製したプローブの反応では、４０分以内に、色の変化が観察されなかった。ＩＩｃ１、ＩＩｃ２を用いて作製したプローブで得られたのと同じ色に達するには１００分かかった。ＩＩＩｃ１では２０秒かかった。これに基づいて、本願発明者らは、ステロイドジスルフィドプローブのＤＴＴとの反応速度は、他のプローブの反応速度の約３００分の１であると推測する、非環式ジスルフィドアンカー３ｃから作製したプローブは、メルカプトヘキシルアンカーから作製したプローブとほぼ同じ速度で反応する。この後者の結果は、非環式ジスルフィドの金との反応がＳ−Ｓ結合の開裂に関与しているという証拠を考慮すれば、驚くことではない（Ｚｈｏｎｇ、Ｃ．Ｊ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１５、５１８−５２５）。従って、非環式先端基を備えたオリゴヌクレオチドは、メルカプトヘキシル−オリゴヌクレオチド誘導体の場合のように、１つの硫黄原子によって恐らく金にリンクされるだろう。
【０３７３】
ＤＴＴの存在下で静置した後に、ＩｃｌおよびＩｃ２から作製したプローブが実際にハイブリダイゼーションプローブとして依然として機能するかどうか確かめるために、本願発明者らは、表１の反応に使用した条件下でプローブ混合物の２つのサンプルをＤＴＴで処理した。３０分後に、１μＬの７９ｍｅｒ標的オリゴヌクレオチド溶液（１０ｐｍｏｌ）を加えた。サンプルを急速凍結し、解凍し、スポット試験によって測定した。標的を含むサンプルのスポットは青く、標的を欠く対照のスポットは赤かった。これは、ナノ粒子共役体が安定しているだけでなく、メルカプトヘキシルか線形ジスルフィドアンカー基に由来するプローブの凝集を生じさせる条件下でＤＴＴに暴露した後でプローブとして有効であることを実証した。
【０３７４】
【表１０】
Figure 2004501340
（ｇ）結論
この環式ジスルフィドリンカーを用いて作られた金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体は、特定のオリゴヌクレオチド配列を検出するのに有効なプローブとして機能し、従来のメルカプトヘキシル基または非環式ジスルフィドユニットを用いて作製された対応する共役体よりも、ジチオスレイトールへのはるかに大きな安定性を示す。チオール不活性化に対する高い安定性は、少なくとも一部では、２つの硫黄原子によって各オリゴヌクレオチドを金に固定することに因ると考えられる。
【０３７５】
実施例２４：単純な環式ジスルフィドリンカーを使用したオリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子の調製
この実施例では、本願発明者らは非ステロイド環式ジスルフィドリンカーと、このリンカーからオリゴヌクレオチド−ナノ粒子プローブとを調製し、ステロイド環式ジスルフィドとアルキルチオールリンカーにより調製されたプローブに対する、チオール含有溶液の存在下でのプローブ安定性を評価した。アルキルチオールアンカー基Ｉ（図４４）［Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３８２、６０７（１９９６）；Ｓｔｏｒｈｏｆｆら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０、１９５９年（１９９８）］またはステロイド環式ジスルフィドアンカー基ＩＩ（図４４）［Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１１、２８９（２０００）］を使用して金ナノ粒子にオリゴヌクレオチドを結合することにより、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列を検出するためのプローブの調製方法が記載されている。プローブとしてステロイド環式ジスルフィドリンカーを使用して調製した共役体は、メルカプトエタノールやジチオスレイトール（ＤＴＴ）のようなチオール化合物の存在下ではるかにより安定している点でアルキルチオールアンカーを使用して調製した共役体よりも遊離であることがわかった。検出するＤＮＡサンプルを増幅するのに使用されるＰＣＲ溶液は、酵素を保護するために少量のＤＴＴを含んでいるため、この特徴は重要である。ＰＣＲ産物の単純かつ迅速な検出の場合、最初に増幅されたＤＮＡを分離せずにＰＣＲ溶液中で直接試験を行えるように、ＤＴＴへの高い安定性を有するプローブを使用することが望ましい。
【０３７６】
２つの特徴がステロイド環式アンカー（化合物１、図４２）を際だたせている。すなわち、（１）環式ジスルフィド（金表面で所与オリゴヌクレオチドを保持するのに共同的に作用する２つの結合部位を原則的に与えることができる）と、（２）疎水的相互作用により金上の隣接鎖を安定させることが可能なステロイドユニット（例えばＲ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５，７５３５（１９９３）参照）である。それらの寄与の重要性を評価するために、本願発明者らは、ステロイド基を欠く環式ジスルフィド化合物ＩＩＩｃ（図４４）によって固定された金共役体を調製し、調べた。
【０３７７】
トランス−１，２−ジチアン−４，５−ジチオールを、トルエン中でアセトールと加熱することにより調製した化合物２ａを、シアノエチルＮ，Ｎ−ジ−ｉ−プロピルホスホロアミダイト試薬２ｂに変換した。該試薬２ｂは、修飾オリゴヌクレオチド２ｃ１および２ｃ２の合成の最終結合ステップに使用した。１つの金共役体プローブを、２ｃ１および等モル量の２ｄで金コロイド溶液を処理することにより調製した。２ｄは金表面上の希釈剤として機能する。コンパニオンプローブを、２ｃ２および２ｄから同様に作製した。これらのナノ粒子共役体は、静置と、凍結・融解との両方に関して、塩化ナトリウム溶液の０．１、０．３、０．５、０．７Ｍの範囲で安定していた。
【０３７８】
（ａ）化合物２ａ、２ｂ、２ｃ１、２ｃ２の調製
実施例２３に記述したように化合物２ａを調製した。２ａの亜リン酸化とオリゴヌクレオチド２ｃ１および２ｃ２の合成を、実施例２３や他の箇所でステロイド環式ジスルフィド誘導体に関して先に述べたように行った［Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１１、２８９（２０００）、この文献の開示は引用によりその全体が組み込まれる］。ＣＰＧ支持体上のオリゴマーにＩＩＩｂを縮合することに関与するステップの反応時間は、１０分であった。
【０３７９】
（ｂ）金−オリゴヌクレオチド共役体の調製
１．７μモル／ｍＬの各オリゴヌクレオチドを含む溶液を提供するために、等モル量のオリゴヌクレオチド２ｃ１および２ｄまたは２ｃ２および２ｄを１３ｎｍの金コロイド（〜１０ｎＭ）に加えた。該溶液を暗所で２４時間保存し、その後、塩類を加えて、該溶液を０．３Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　リン酸塩（ｐＨ７．０）、０．０１％アジ化ナトリウムとなるようにした。２４時間後に、ＮａＣｌ濃度を０．８Ｍに増大し、溶液をさらに２４時間静置した。その後、凝集物を除去するためにコロイドをろ過し、溶液を遠心してナノ粒子を集める。ペレットを、ナノピュア水で洗浄し、再び遠心し、０．１Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．０１％アジ化ナトリウムに再分散した。
【０３８０】
（ｃ）ナノ粒子プローブとジチオスレイトールの反応
置換の研究は、２０μＬの２ｃ１と２ｃ２から得たコロイド共役体の等量混合物に、２μＬの０．１Ｍ　ＤＴＴを加えることにより、室温（２２℃）で行った。アリコート（３μＬ）を定期的に取り、白いナイロン膜上にスポットした。最初、スポットは赤かった。ＤＴＴによる金からのオリゴヌクレオチド硫黄誘導体の置換により、スポット試験で青灰色のスポットを与える混合物が生じた。ＤＴＴによる置換の時間を、混合物がスポット試験で強い青灰色を与える時間として採用した。２ｃ１および２ｃ２に由来する共役体の混合物の場合、この時は１０時間だった。
【０３８１】
比較のために、オリゴヌクレオチド共役体を、同様にメルカプトヘキシルアンカー（化合物２、図４２）およびステロイド環式ジスルフィドアンカー（化合物１、図４２）を使用して、オリゴヌクレオチド配列ｃ１およびｃ２（図４４）から調製した。青灰色のスポットを与える時間によって測定される、単チオール誘導体（２および図４２）およびステロイド環式ジスルフィドから調製した共役体の反応時間は、それぞれ５分と５３時間であった。これらの値は、メルカプトアルキル誘導体、非ステロイド環式ジスルフィドおよびステロイド環式ジスルフィドに由来するナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体に対する相対安定性の１、〜６０、〜３００に対応する。結果は、環式ジスルフィドアンカーユニット自体が、これらの系でメルカプトアルキル基に対して高い安定性を与えるのに十分であることを示す。化合物１に由来するナノ粒子共役体中の大きな疎水基も、オリゴヌクレオチドのチオール置換に対して安定性を増強するのに役割を果たしているように思われる。
【０３８２】
実施例２５：オリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子の調製
この実施例では、本願発明者らは、チオール含有溶液の存在下での、アルキルチオールおよびステロイド環式ジスルフィドリンカーと比較した、新しい非環式ジスルフィドリンカーであるトリチオールの安定性を評価した。比較のために、メルカプトヘキシルアンカー（化合物５、図４５）およびステロイド環式ジスルフィドアンカー（化合物６、図４５）を備えたオリゴヌクレオチドを調製した。
【０３８３】
（ａ）５′−トリメルカプトアルキルオリゴヌクレオチドの合成および特徴付け
図４７に示したように、５′−トリメルカプトアルキルチオールオリゴヌクレオチドを合成した。Ｔｒｅｍｂｌｅｒホスホロアミダイト７（Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、バージニア州スターリング）（図４５）およびチオール修飾剤Ｃ６　Ｓ−Ｓホスホロアミダイトを、ＣＰＧ支持体に結合された保護オリゴマーの５′端に逐次結合した。生成物をＣＰＧから解離し、上述のように精製した。３つのＤＭＴ基を備えたトリチオールオリゴヌクレオチドに対する保持時間は、約６４分である。続いて、５′−ＤＭＴ基を、８０％酢酸に３０分間オリゴヌクレオチドを溶解し、その後蒸発により取り外した。オリゴヌクレオチドを５００μＬのナノピュア水に再溶解した、溶液を酢酸エチル（３×３００μＬ）で抽出した。溶媒の蒸発後、オリゴヌクレオチドを白色固体として得られた。ＤＭＴ基がないこの５′−トリ−ジスルフィドオリゴヌクレオチドの保持時間は、逆相カラムで約３５分であり、イオン交換カラムでは２４分であった。これらのピークはいずれもスペクトル面積の９７％以上であり、オリゴヌクレオチドが高純度であることを示している。オリゴヌクレオチド８（図４５）の式量を、エレクトロスプレーＭＳ（計算値１２２４２．８５、実測値１２２４４．１）により得た。ＤＮＡ鎖上の３つのジスルフィド基を５′モノチオールＤＮＡに対して上述したようにトリチオール基に還元し、その後、ＮＡＰ−５カラムでオリゴヌクレオチドを精製した。
【０３８４】
（ｂ）５′−チオールまたはジスルフィドＤＮＡ修飾金ナノ粒子の調製
ベクター研究所（カリフォルニア州Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）より購入した金のナノ粒子を使用した。１０ｍＬの３０ｎｍ金コロイドに、５ＯＤのチオール修飾ＤＮＡを添加した。溶液を、徐々に０．３Ｍ　ＮａＣｌ／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）（ＰＢＳ）にした。その後、ナノ粒子を遠心によって沈降させた。無色の上清を除去した後、赤色の油状沈殿物を１０ｍＬの新しいＰＢＳ緩衝液に再分散した。このプロセスを繰り返すことにより、コロイドを１０ｍＬの新しいＰＢＳ緩衝液を用いて２回洗浄した。
【０３８５】
（ｃ）チオール−ＤＮＡ修飾金ナノ粒子の安定性試験
固体のＤＴＴを、ＤＴＴ濃度が０．０１７Ｍとなるまで、様々な種類のチオールまたはジスルフィドＤＮＡで修飾した３０ｎｍ金ナノ粒子コロイドの６００μＬ溶液に加えた。ＤＴＴがオリゴヌクレオチドを置換するにつれて、コロイドの色は赤から青に代わる。ＵＶ／ＶＩＳスペクトルを時間の関数として取った。分散した３０ｎｍ金粒子に関連する〜５２８ｎｍの吸光度は減少し始め、７００ｎｍの広幅のバンドが伸び始めた。７００ｎｍのバンドはコロイドの凝集に関連している。図４８に示されるように、１つのチオールオリゴヌクレオチド（１）で修飾した３０ｎｍ金の粒子は、０．０１７Ｍ　ＤＴＴで迅速に凝集物を形成し、１．５時間後にはコロイドが完全に青くなる。ジスルフィドオリゴヌクレオチド（４）で修飾したナノ粒子を含む溶液は、同一条件下では２０時間後に青くなる。トリチオール−オリゴヌクレオチド（開裂した６）で修飾したナノ粒子では、溶液が青くなるのに４０時間かかった。
【０３８６】
本明細書に引用した特許、特許出願および参考文献はすべて、引用によりその全体が組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】相補的オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を結合させることによるナノ粒子凝集体の形成を示す略図。ナノ粒子は、相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの結果として凝集体をなして結合している。Ｘは、（−Ｓ（ＣＨ２）３ＯＰ（Ｏ）（Ｏ−）−（ここで、Ｓは金ナノ粒子に接合している）などの）任意の共有結合アンカーを表す。図１および後続のいくつかの図面では、分かり易くするために、各ナノ粒子には単一のオリゴヌクレオチドしか付着していないように示されているが、実際には、各ナノ粒子には、いくつかのオリゴヌクレオチドが付着している。また、図１および後続図面において、金ナノ粒子とオリゴヌクレオチドとの相対サイズは正確な縮尺率では描かれていない点に留意することが重要である。
【図２】オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いて核酸を検出する系を示す略図。２つのナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、示されている一本鎖ＤＮＡの２つの異なる部分に対して相補的な配列を有している。その結果、これらのオリゴヌクレオチドがＤＮＡとハイブリダイズすると、（凝集体を形成し、変色を起こす）検出可能な変化が生じる。
【図３】図２に示されている系の変型の略図。２つのナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、示されているナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとは相補的でない第３部分によって分離された一本鎖ＤＮＡの２つの異なる部分に対して相補的な配列を有している。一本鎖ＤＮＡの非相補的部分とのハイブリダイズに用い得る任意のフィラーオリゴヌクレオチドも示されている。ＤＮＡ、ナノ粒子およびフィラーオリゴヌクレオチドを合わせると、ナノ粒子は、切れ目が入った（ｎｉｃｋｅｄ）二本鎖オリゴヌクレオチドコネクタを形成して凝集する。
【図４】連結オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションおよびデハイブリダイゼーションの結果としての、オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子の可逆的凝集を示す略図。例示されている連結オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドと相補的なオーバーハング末端（付着末端）を有する二本鎖ＤＮＡである。
【図５】オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子とナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を有する連結オリゴヌクレオチドとを合わせることによるナノ粒子凝集体の形成を示す略図。
【図６Ａ】それぞれ異なるオリゴヌクレオチドが付着している２つの種類の金コロイドと、ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドと相補的な付着末端を有する連結二本鎖オリゴヌクレオチドとが入ったキュベット（図４参照）。キュベットＡ−連結ＤＮＡのＴｍを超える８０℃；デハイブリダイズ（熱変性）した。色は暗赤色。
【図６Ｂ】それぞれ異なるオリゴヌクレオチドが付着している２つの種類の金コロイドと、ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドと相補的な付着末端を有する連結二本鎖オリゴヌクレオチドとが入ったキュベット（図４参照）。キュベットＢ−リンカーＤＮＡのＴｍより低い室温に冷却後。ハイブリダイゼーションが起って、ナノ粒子は凝集したが、凝集体は沈殿しなかった。色は紫色。
【図６Ｃ】それぞれ異なるオリゴヌクレオチドが付着している２つの種類の金コロイドと、ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドと相補的な付着末端を有する連結二本鎖オリゴヌクレオチドとが入ったキュベット（図４参照）。キュベットＣ−室温下に数時間後、凝集したナノ粒子はキュベットの底に沈殿した。溶液は清澄で、沈殿物はピンクがかった灰色。ＢまたはＣを加熱するとＡが生じる。
【図７】図４に示されているように、オリゴヌクレオチドが付着している金ナノ粒子が温度を下げると連結オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたために凝集するときの吸光度の変化を示す吸光度対波長（ｎｍ）のグラフ。
【図８Ａ】図４に示されている系に関する吸光度対温度／時間の変化のグラフである。低温下、オリゴヌクレオチドが付着している金ナノ粒子は、連結オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより凝集する（図４参照）。高温（８０℃）下で、ナノ粒子はデハイブリダイズする。経時的な温度の変化は、これが可逆的プロセスであることを示している。
【図８Ｂ】修飾していない金ナノ粒子の水溶液を用いて図８Ａと同じ方法で実施した吸光度対温度／時間における変化のグラフである。図８Ａに見られた可逆的変化は観測されない。
【図９Ａ】透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像。金ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと連結オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより結合した凝集金ナノ粒子のＴＥＭ画像である。
【図９Ｂ】透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像。結合したナノ粒子の順序づけ（ｏｒｄｅｒｉｎｇ）を示す二次元凝集体のＴＥＭ画像である。
【図１０】ピリミジン：プリン：ピリミジンモチーフを有するナノ粒子間の熱安定性三本鎖オリゴヌクレオチドコネクタの形成を示す略図。このような三本鎖コネクタは、二本鎖コネクタより剛性が大きい。図１０において、一方のナノ粒子には、全てがプリンからなるオリゴヌクレオチドが付着しており、他方のナノ粒子には、全てがピリミジンからなるオリゴヌクレオチドが付着している。（ナノ粒子には付着していない）三本鎖コネクタを形成するための第３オリゴヌクレオチドはピリミジンからなる。
【図１１】相補的オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を合わせることによるナノ粒子凝集体の形成を示す略図であり、ナノ粒子は、相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの結果として凝集体をなして結合している。図１１において、丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、ｓはチオ−アルキルリンカーである。２種類のナノ粒子上の多数のオリゴヌクレオチドは、互いにハイブリダイズして凝集体構造を形成し得る。
【図１２Ａ】オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を示す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２と、一本鎖オリゴヌクレオチド標的３が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、点線および破線は、ヌクレオチドを連結するつなぎ目を表す。
【図１２Ｂ】オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を示す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、点線および破線は、ヌクレオチドを連結するつなぎ目を表す。
【図１２Ｃ】オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を示す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２と、一本鎖オリゴヌクレオチド標的４が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、点線および破線は、ヌクレオチドを連結するつなぎ目を表す。
【図１２Ｄ】オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を示す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２と、一本鎖オリゴヌクレオチド標的５が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、点線および破線は、ヌクレオチドを連結するつなぎ目を表す。
【図１２Ｅ】オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を示す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２と、一本鎖オリゴヌクレオチド標的６が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、点線および破線は、ヌクレオチドを連結するつなぎ目を表す。
【図１２Ｆ】オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を示す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２と、一本鎖オリゴヌクレオチド標的７が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、点線および破線は、ヌクレオチドを連結するつなぎ目を表す。
【図１３Ａ】ナノ粒子および透明基板を用いたＤＮＡ（検体ＤＮＡ）検出系を示す略図である。
【図１３Ｂ】ナノ粒子および透明基板を用いたＤＮＡ（検体ＤＮＡ）検出系を示す略図である。
【図１４Ａ】オリゴヌクレオチドが付着している金ナノ粒子（その１つの集団は溶液中にあり、１つの集団は図１３Ｂに示されているような透明基板に付着している）が連結オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより凝集したときの吸光度の変化を示す吸光度対波長（ｎｍ）のグラフである。
【図１４Ｂ】温度の増大（融解する）に従った、図１４Ａに示されているハイブリダイズした系に関する吸光度の変化のグラフである。
【図１５Ａ】オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を示す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、Ｓはチオ−アルキルリンカーを表す。
【図１５Ｂ】オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を示す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２と、一本鎖オリゴヌクレオチド標的３が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、Ｓはチオ−アルキルリンカーを表す。
【図１５Ｃ】オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を示す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２と、一本鎖オリゴヌクレオチド標的４が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、Ｓはチオ−アルキルリンカーを表す。
【図１５Ｄ】オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を示す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２と、一本鎖オリゴヌクレオチド標的５が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、Ｓはチオ−アルキルリンカーを表す。
【図１５Ｅ】オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を示す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２と、一本鎖オリゴヌクレオチド標的６が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、Ｓはチオ−アルキルリンカーを表す。
【図１５Ｆ】オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を示す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２と、一本鎖オリゴヌクレオチド標的７が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、Ｓはチオ−アルキルリンカーを表す。
【図１５Ｇ】オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を示す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２と、一本鎖オリゴヌクレオチド標的８が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、Ｓはチオ−アルキルリンカーを表す。
【図１６Ａ】オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を表す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２と、長さが異なる複数の一本鎖オリゴヌクレオチド標的が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、Ｓはチオ−アルキルリンカーを表す。
【図１６Ｂ】オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を表す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２と、長さが異なる複数の一本鎖オリゴヌクレオチド標的が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、Ｓはチオ−アルキルリンカーを表す。
【図１６Ｃ】オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を表す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２と、長さが異なる複数の一本鎖オリゴヌクレオチド標的が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、Ｓはチオ−アルキルリンカーを表す。
【図１７Ａ】ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と、オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系とを示す略図。丸はナノ粒子を表し、直線はオリゴヌクレオチド鎖（塩基は示さず）を表し、間隔の狭い２本の平行線は二本鎖分子セグメントを表し、小文字は特異的ヌクレオチド配列（ａはａ′と相補的、ｂはｂ′の相補的である、など）を示す。
【図１７Ｂ】ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と、オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系とを示す略図。丸はナノ粒子を表し、直線はオリゴヌクレオチド鎖（塩基は示さず）を表し、間隔の狭い２本の平行線は二本鎖分子セグメントを表し、小文字は特異的ヌクレオチド配列（ａはａ′と相補的、ｂはｂ′の相補的である、など）を示す。
【図１７Ｃ】ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と、オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系とを示す略図。丸はナノ粒子を表し、直線はオリゴヌクレオチド鎖（塩基は示さず）を表し、間隔の狭い２本の平行線は二本鎖分子セグメントを表し、小文字は特異的ヌクレオチド配列（ａはａ′と相補的、ｂはｂ′の相補的である、など）を示す。
【図１７Ｄ】ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と、オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系とを示す略図。丸はナノ粒子を表し、直線はオリゴヌクレオチド鎖（塩基は示さず）を表し、間隔の狭い２本の平行線は二本鎖分子セグメントを表し、小文字は特異的ヌクレオチド配列（ａはａ′と相補的、ｂはｂ′の相補的である、など）を示す。
【図１７Ｅ】ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と、オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系とを示す略図。丸はナノ粒子を表し、直線はオリゴヌクレオチド鎖（塩基は示さず）を表し、間隔の狭い２本の平行線は二本鎖分子セグメントを表し、小文字は特異的ヌクレオチド配列（ａはａ′と相補的、ｂはｂ′の相補的である、など）を示す。
【図１８】リポソーム（大きい二重丸）、ナノ粒子（小さい白丸）および透明基板を用いた核酸検出系を示す略図。黒い四角はコレステリル基を表し、ねじれ線はオリゴヌクレオチドを表し、梯子は二本鎖（ハイブリダイズした）オリゴヌクレオチドを表す。
【図１９Ａ】金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体が図１３Ａに示されているような透明基板上の多重層として集合したときの吸光度の変化を示す吸光度対波長（ｎｍ）のグラフである。
【図１９Ｂ】温度の増大（融解）に従った図１９Ａに示されているハイブリダイズした系に関する吸光度の変化のグラフである。
【図２０Ａ】金属もしくは半導体消光ナノ粒子（図２０Ａ）に付着している蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いた計画の略図。
【図２０Ｂ】非金属、非半導体粒子（図２０Ｂ）に付着している蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いた計画の略図。
【図２１】オリゴヌクレオチドが付着している金ナノ粒子および蛍光標識オリゴヌクレオチドが付着しているラテックスミクロスフェアを用いた標的核酸検出系を示す略図。小さい黒丸はナノ粒子を表し、大きい白丸はラテックスミクロスフェアを表し、大きい楕円は微孔質膜を表す。
【図２２】２つの種類の蛍光標識オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体を用いた標的核酸検出系を示す略図。黒丸はナノ粒子を表し、大きな楕円は微孔質膜を表す。
【図２３】炭疽菌保護抗原（実施例１２参照）用アッセイに利用される材料の配列。
【図２４】オリゴヌクレオチド（直線）が付着している磁気ナノ粒子（黒球）、ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたプローブオリゴヌクレオチド（直線）を含む「サテライトプローブ」を用いた標的核酸検出系を示す略図であり、プローブオリゴヌクレオチドはレポーター基（白四角）で標識されている。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ａ′、Ｂ′、およびＣ′は、特異的ヌクレオチド配列を表し、Ａ、ＢおよびＣはそれぞれ、Ａ′、Ｂ′およびＣ′と相補的である。
【図２５Ａ】ナノ粒子と透明基板を用いたＤＮＡ検出系を示す略図。これらの図面において、ａ、ｂおよびｃは、異なるオリゴヌクレオチド配列を表し、ａ′、ｂ′およびｃ′は、それぞれａ、ｂおよびｃと相補的なオリゴヌクレオチド配列を表す。
【図２５Ｂ】ナノ粒子と透明基板を用いたＤＮＡ検出系を示す略図。これらの図面において、ａ、ｂおよびｃは、異なるオリゴヌクレオチド配列を表し、ａ′、ｂ′およびｃ′は、それぞれａ、ｂおよびｃと相補的なオリゴヌクレオチド配列を表す。
【図２６】ＣｄＳｅ／ＺｎＳコア／シェル量子ドット（ＱＤ）の集合体を形成する系を示す略図。
【図２７】（Ａ）は、４００ｎｍでの励起で、分散ＱＤと凝集ＱＤを比較する蛍光スペクトルを示している。試料は同じように調製したが、但し、一方には相補的「リンカー」ＤＮＡを付加し、他方には等量、等濃度の非相補的ＤＮＡを付加した。（Ｂ）は、「融解」の前、間および後の異なる温度下のＱＤ／ＱＤ集合体のＵＶ−可視スペクトルを示している。図中の挿入図は、集合体の熱変性に関する温度対消光プロファイルを示している。変性実験は、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７）、０．０１％アジ化ナトリウム中、１３ｎｍの金ナノ粒子および／または〜４ｎｍのＣｄＳｅ／ＺｎＳコア／シェルＱＤを用いて実施した。（Ｃ）は、ハイブリッド金／ＱＤ集合体の一部の高解像度ＴＥＭ画像を示している。指紋に似たＱＤの格子干渉縞が各金ナノ粒子の近くに見える。（Ｄ）は、「融解」の前、間および後の異なる温度下のハイブリッド金／ＱＤ集合体のＵＶ−可視スペクトルを示している。図中の挿入図は、集合体の熱変性に関する温度対消光プロファイルを示している。変性実験は、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７）、０．０１％アジ化ナトリウム中、１３ｎｍの金ナノ粒子および／または〜４ｎｍのＣｄＳｅ／ＺｎＳコア／シェルＱＤを用いて実施した。
【図２８Ａ】コアプローブ、凝集体プローブの作製およびこれらのプローブを用いたＤＮＡ検出系を示す略図。これらの図面において、ａ、ｂ、ｃおよびｄは、異なるオリゴヌクレオチド配列を表し、ａ′、ｂ′、ｃ′およびｄ′はそれぞれ、ａ、ｂ、ｃおよびｄと相補的なオリゴヌクレオチド配列を表す。
【図２８Ｂ】コアプローブ、凝集体プローブの作製およびこれらのプローブを用いたＤＮＡ検出系を示す略図。これらの図面において、ａ、ｂ、ｃおよびｄは、異なるオリゴヌクレオチド配列を表し、ａ′、ｂ′、ｃ′およびｄ′はそれぞれ、ａ、ｂ、ｃおよびｄと相補的なオリゴヌクレオチド配列を表す。
【図２８Ｃ】コアプローブ、凝集体プローブの作製およびこれらのプローブを用いたＤＮＡ検出系を示す略図。これらの図面において、ａ、ｂ、ｃおよびｄは、異なるオリゴヌクレオチド配列を表し、ａ′、ｂ′、ｃ′およびｄ′はそれぞれ、ａ、ｂ、ｃおよびｄと相補的なオリゴヌクレオチド配列を表す。
【図２８Ｄ】コアプローブ、凝集体プローブの作製およびこれらのプローブを用いたＤＮＡ検出系を示す略図。これらの図面において、ａ、ｂ、ｃおよびｄは、異なるオリゴヌクレオチド配列を表し、ａ′、ｂ′、ｃ′およびｄ′はそれぞれ、ａ、ｂ、ｃおよびｄと相補的なオリゴヌクレオチド配列を表す。
【図２８Ｅ】コアプローブ、凝集体プローブの作製およびこれらのプローブを用いたＤＮＡ検出系を示す略図。これらの図面において、ａ、ｂ、ｃおよびｄは、異なるオリゴヌクレオチド配列を表し、ａ′、ｂ′、ｃ′およびｄ′はそれぞれ、ａ、ｂ、ｃおよびｄと相補的なオリゴヌクレオチド配列を表す。
【図２９】メルカプトエタノールによる、オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子（黒丸）または金薄膜（白四角）からのオリゴヌクレオチドの置換分率のグラフ。
【図３０】ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体の調製に使用される、様々な認識オリゴヌクレオチド：希釈剤オリゴヌクレオチド比に対して得られた、ナノ粒子上の認識オリゴヌクレオチドの表面被覆範囲のグラフ。
【図３１】ナノ粒子上の認識オリゴヌクレオチドの様々な表面被覆範囲に対する、ハイブリダイズした相補的なオリゴヌクレオチドの表面被覆範囲のグラフ。
【図３２】ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体および銀染色法による増幅を用いた基板上の４素子アレイ中の標的ＤＮＡを検出する系を示す略図。
【図３３】平台型スキャナを用いて得た、７ｍｍ×１３ｍｍのオリゴヌクレオチド官能化フロートガラススライドの画像。（Ａ）ＤＮＡ標的と金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド指示共役体とがハイブリダイズする前のスライド。（Ｂ）１０ｎＭの標的ＤＮＡと５ｎＭのナノ粒子−オリゴヌクレオチド指示共役体とがハイブリダイズした後のスライドＡ。ピンク色は赤い直径１３ｎｍ金ナノ粒子が付着したためである。（Ｃ）銀増幅溶液に５分間暴露した後のスライドＢ。（Ｄ）（Ａ）と同じ。（Ｅ）１００ｐＭの標的と５ｎＭのナノ粒子−オリゴヌクレオチド指示共役体とがハイブリダイズした後のスライドＤ。ナノ粒子層の吸光度は低過ぎて肉眼または平台型スキャナで観測できなかった。（Ｆ）銀増幅溶液に５分間暴露した後のスライドＥ。スライドＦはスライドＣよりはるかに明るく、これは、標的濃度が低いことを示している。（Ｇ）５ｎＭのナノ粒子−オリゴヌクレオチド指示共役体に暴露し、かつ銀増幅溶液に５分間暴露した対照スライド。スライドの黒ずみは観測されなかった。
【図３４】種々の濃度の標的ＤＮＡに暴露した後、５ｎＭの金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド指示共役体に暴露し、銀増幅溶液に５分間暴露した、オリゴヌクレオチド官能化ガラス表面のグレースケール（光学密度）のグラフ。
【図３５】（Ａ）は、発蛍光団で標識した標的のオリゴヌクレオチド官能化ガラス表面からの解離を示すハイブリダイズ標的％対温度のグラフ。（Ｂ）は、ナノ粒子で標識した標的（図３５Ｂ）のオリゴヌクレオチド官能化ガラス表面からの解離を示すハイブリダイズ標的％対温度のグラフ。図３５ＡおよびＢにおいて、測定は、ガラス表面上の溶液中の解離した標識の蛍光（図３５Ａ）および吸光度（図３５Ｂ）を測定して実施した。「ｂ」と標示された線は、ガラス上の完全対合オリゴヌクレオチドの解離曲線を示し、「ｒ」と標示されている線は、ガラス上の誤対合オリゴヌクレオチド（１塩基誤対合）の曲線を示している。グラフ中の垂線は、各測定に関して所与の温度（各曲線の融解温度Ｔｍの中間）で解離した標的分画および発蛍光団およびナノ粒子ベース遺伝子チップに関する予測された配列同定選択率を示している。蛍光（図３５Ａ）：相補体（６９％）／誤対合（３８％）＝１．８：１。吸光度（図３５Ｂ）：相補体（８５％）／誤対合（１４％）＝６：１。発蛍光団標識曲線（図３５Ａ）の幅は、発蛍光団標識標的の遺伝子チップからの解離に特徴的なものである（Ｆｏｒｍａｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｏｄｅｌｉｎｇ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，Ｌｅｏｎｔｉｓら編（ＡＣＳ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｓｅｒｉｅｓ　６８２，Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９８年），２０６−２２８ページ）。
【図３６Ａ】合成標的および蛍光標識ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体プローブで攻撃したモデルオリゴヌクレオチド配列の画像。
【図３６Ｂ】ナノ粒子標識ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体プローブで攻撃したモデルオリゴヌクレオチド配列の画像。図３６ＡおよびＢにおいて、Ｃ、Ａ、ＴおよびＧは、基板に付着しているオリゴヌクレオチドに１単塩基変化が起こって標的との完全対合（塩基Ａ）または１塩基誤対合（塩基Ａとの完全対合の代わりに塩基Ｃ、ＴまたはＧ）をもたらした配列上のスポット（要素）を表している。要素Ｃ：Ａ：Ｔ：Ｇのグレースケール比は、図３６Ａに関しては９：３７：９：１１、図３６Ｂに関しては３：６２：７：３４である。
【図３７】連結核酸（３）を介して結合したナノ粒子（ａおよびｂ）の凝集体（Ａ）または層（Ｂ）を形成する系を示す略図。
【図３８Ａ】相補的リンカー３を介してオリゴヌクレオチド官能化ガラス製顕微鏡スライドにハイブリダイズした金ナノ粒子のａとｂの交互層（図３７参照）のＵＶ−可視スペクトル。これらのスペクトルは、１（ａ、λｍａｘ＝５２４ｎｍ）、２（ｂ、λｍａｘ＝５２９ｎｍ）、３（ｃ、λｍａｘ＝５３２ｎｍ）、４（ｄ、λｍａｘ＝５３４ｎｍ）または５（ｅ、λｍａｘ＝５３４ｎｍ）層を有する集合体に関する。これらのスペクトルは、スライドを介して直接測定した。
【図３８Ｂ】層の数の増大に伴うナノ粒子集合体（図３８Ａ参照）のλｍａｘでの吸光度のグラフ。
【図３９Ａ】ＤＮＡリンカーと共にオリゴヌクレオチド官能化導電性インジウム−スズ−オキシド（ＩＴＯ）スライド（オリゴヌクレオチド官能化ガラススライドと同じ方法で作製）に同時ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド官能化金ナノ粒子の１つの層のＦＥ−ＳＥＭ。このスライドの可視吸光度スペクトルは、図３８Ａと同一であったが、これは、ＩＴＯ上の官能化およびナノ粒子被覆面積がガラス上のものと類似であることを示している。１０枚のそのような画像から計数したナノ粒子の平均密度は約８００ナノ粒子／μｍ２であった。
【図３９Ｂ】ＩＴＯスライド上の２つのナノ粒子層のＦＥ−ＳＥＭ画像。１０枚のそのような画像から計数したナノ粒子の平均密度は約２８００ナノ粒子／μｍ２であった。
【図３９Ｃ】０．３Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７）中の一本鎖とのオリゴヌクレオチド二本鎖分子（１＋２＋３；図３５Ａ参照）の０．５μＭ溶液の解離を示す２６０ｎｍ（Ａ２６０）の吸光度。
【図３９Ｄ】０．３Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　燐酸緩衝液に浸漬したガラススライドからの１層のオリゴヌクレオチド官能化金ナノ粒子の解離を示す２６０ｎｍ（Ａ２６０）の吸光度。
【図３９Ｅ】０．３Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　燐酸緩衝液に浸漬したガラススライドからの４層のオリゴヌクレオチド官能化金ナノ粒子の解離を示す２６０ｎｍ（Ａ２６０）の吸光度。
【図３９Ｆ】０．３Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　燐酸緩衝液に浸漬したガラススライドからの１０層のオリゴヌクレオチド官能化金ナノ粒子の解離を示す２６０ｎｍ（Ａ２６０）の吸光度。図Ｄ〜Ｆに関して、温度の増大に従って減少するスライドを介した５２０ｎｍ（Ａ５２０）での吸光度を測定して融解プロファイルを得た。図３９Ｄ−Ｆそれぞれの挿入図は、測定した解離曲線の一次導関数を示している。これらの曲線のＦＷＨＭは、（図３９Ｃの挿入図）１３．２℃、（図３９Ｄの挿入図）５．６℃、（図３９Ｅの挿入図）３．２℃、（図３９Ｆの挿入図）２．９℃であった。
【図４０】ＤＮＡを介して結合している金ナノ粒子集合体の電気的性質の測定に用いられる系を示す略図。分かり易くするために、単一のハイブリダイゼーション事象のみが描かれている。
【図４１】金電極および金ナノ粒子を用いた核酸検出法を示す略図。
【図４２】オリゴヌクレオチドをナノ粒子に連結する際に使用されるステロイド部分を有する好ましい化合物１を含む、環式ジスルフィド１の構造を例証する略図。ステロイドジスルフィド分子は、４，５−ジヒドロキシ−１，２−ジチアンをエピアンドロステロンと縮合することにより得られる。金のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体は、ステロイドジスルフィドにより修飾したオリゴヌクレオチドを使用して調製され、その調製用にオリゴヌクレオチド−メルカプトヘキシルリンカーを使用したナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と比べて、ＤＴＴに対するより大きな安定性を示す。
【図４３】ステロイド環式スルフィドアンカー基に対する合成と化学式を示す略図。
【図４４】実施例２４に説明したオリゴヌクレオチド環式ジスルフィドリンカーの調製に使用される化学式２の環式ジスルフィドと、アンカー基として使用される同様な関連環式ジスルフィドを示す略図。
【図４５】実施例２５に記述した構造を示す略図。図４５（ａ）は、５′−モノチオール−修飾オリゴヌクレオチド５、３５塩基５′−ステロイドジスルフィドオリゴマー６、Ｔｒｅｍｂｌｅｒホスホルアミド７、および５−トリ−メルカプトアルキルオリゴヌクレオチド８を示す。
【図４６】新規トリチオールオリゴヌクレオチドを作製する化学的機構を示す略図。

Claims (485)

  1. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    オリゴヌクレオチドを付着したある種類のナノ粒子を提供するステップであって、各ナノ粒子上の該オリゴヌクレオチドが核酸の少なくとも２つの部分の配列に相補的な配列を有するステップと、
    ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを核酸の２つ以上の部分と有効にハイブリダイズさせる条件下で、核酸とナノ粒子を接触させるステップと、
    ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸とのハイブリダイゼーションによって起こる検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  2. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    核酸を、オリゴヌクレオチドを付着した少なくとも２種類のナノ粒子と接触させるステップであって、第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは該核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有し、前記接触が、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸とのハイブリダイゼーションによって起こる検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  3. 前記接触条件には凍結と融解が含まれる、請求項２に記載の方法。
  4. 前記接触条件には加熱が含まれる、請求項２に記載の方法。
  5. 検出可能な変化は固体表面上で観察される、請求項２に記載の方法。
  6. 検出可能な変化は肉眼で観察可能な色の変化である、請求項２に記載の方法。
  7. 色の変化が固体表面上で観察される、請求項６に記載の方法。
  8. ナノ粒子が金から形成されている、請求項２に記載の方法。
  9. ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの、ナノ粒子に付着していない端部が、核酸とのナノ粒子上のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに基づいて検出可能な変化を生成する分子によって標識される、請求項２に記載の方法。
  10. ナノ粒子が金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子であり、ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドは蛍光分子で標識される、請求項９に記載の方法。
  11. 核酸は第１部分と第２部分の間に位置する第３部分を有し、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列は、核酸の該第３部分に相補的な配列を有さず、
    核酸を、核酸の該第３部分に相補的な配列を有するフィラーオリゴヌクレオチドとさらに接触させ、前記接触が、フィラーオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる、請求項２に記載の方法。
  12. 核酸がウイルスＲＮＡまたはウイルスＤＮＡである、請求項２に記載の方法。
  13. 核酸が疾患関連遺伝子である、請求項２に記載の方法。
  14. 核酸が細菌ＤＮＡである、請求項２に記載の方法。
  15. 核酸が真菌ＤＮＡである、請求項２に記載の方法。
  16. 核酸が合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、構造的に修飾された天然または合成ＲＮＡ、もしくは構造的に修飾された天然または合成ＤＮＡである、請求項２に記載の方法。
  17. 核酸が生物源のものである、請求項２に記載の方法。
  18. 核酸がポリメラーゼ連鎖反応増幅法の産物である、請求項２に記載の方法。
  19. 核酸を第１および第２種類のナノ粒子と同時に接触させる、請求項２に記載の方法。
  20. 核酸を、第２種類のナノ粒子と接触させる前に、第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと接触およびハイブリダイズさせる、請求項２に記載の方法。
  21. 第１種類のナノ粒子が基板に付着される、請求項２０に記載の方法。
  22. 核酸が二本鎖であり、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって三本鎖複合体が生じる、請求項２に記載の方法。
  23. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    第１種類のナノ粒子を付着させた基板を提供するステップであって、該ナノ粒子にはオリゴヌクレオチドが付着しており、該オリゴヌクレオチドは検出すべき核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有するステップと、
    前記核酸を、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で、基板に付着されたナノ粒子と接触させるステップと、
    オリゴヌクレオチドを付着した第２種類のナノ粒子を提供するステップであって、該オリゴヌクレオチドが、前記核酸の配列の１または複数の他の部分に相補的な配列を有するステップと、
    基板に結び付けられた前記核酸分子を、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で、第２種類のナノ粒子と接触させるステップと、
    検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  24. 基板には、１つの核酸中の複数の部分の検出、複数の異なる核酸の検出、またはそれらの両方の検出を可能にするようアレイ状に複数の種類のナノ粒子が付着されている、請求項２３に記載の方法。
  25. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    第１種類のナノ粒子を付着させた基板を提供するステップであって、該ナノ粒子にはオリゴヌクレオチドが付着し、該オリゴヌクレオチドは検出すべき核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有するステップと、
    前記核酸を、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で、基板に付着されたナノ粒子と接触させるステップと、
    オリゴヌクレオチドを付着した第２種類のナノ粒子を提供するステップであって、該オリゴヌクレオチドが、前記核酸の配列の１または複数の他の部分に相補的な配列を有するステップと、
    前記基板に結び付けられた核酸を、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で、第２種類のナノ粒子と接触させるステップと、
    少なくとも２つの部分を有する選択配列を有する結合オリゴヌクレオチドを提供するステップであって、その第１部分は、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的であるステップと、
    結合オリゴヌクレオチドを、結合オリゴヌクレオチドをナノ粒子上のオリゴヌクレオチドに対して有効にハイブリダイズさせる条件下で、基板に結び付けられた第２種類のナノ粒子と接触させるステップと、
    オリゴヌクレオチドを付着した第３種類のナノ粒子を提供するステップであって、該オリゴヌクレオチドは結合オリゴヌクレオチドの第２部分の配列に相補的な配列を有するステップと、
    第３種類のナノ粒子を、結合オリゴヌクレオチドをナノ粒子上のオリゴヌクレオチドに対して有効にハイブリダイズさせる条件下で、基板に結び付けられた結合オリゴヌクレオチドと接触させるステップと、
    検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  26. 基板には、１つの核酸中の複数の部分の検出、複数の異なる核酸の検出、またはそれらの両方の検出を可能にするようアレイ状に複数の種類のナノ粒子が付着されている、請求項２５に記載の方法。
  27. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    検出すべき核酸を、オリゴヌクレオチドを付着させた基板と接触させるステップであって、該オリゴヌクレオチドは前記核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、前記接触が、基板上のオリゴヌクレオチドを前記核酸に有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    基板に結び付けられた前記核酸を、１または複数の種類のオリゴヌクレオチドを付着した第１種類のナノ粒子と接触させるステップであって、該１または複数の種類のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種類は前記核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有し、前記接触が、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    基板に結び付けられた第１種類のナノ粒子を、オリゴヌクレオチドを付着した第２種類のナノ粒子と接触させるステップであって、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、第１種類のナノ粒子上の該１または複数の種類のオリゴヌクレオチドのうちの１種類の配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有し、前記接触が、第１および第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  28. 第１種類のナノ粒子には、１種類のみのオリゴヌクレオチドが付着しており、該オリゴヌクレオチドは、前記核酸の配列の第２部分および第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有する、請求項２７に記載の方法。
  29. 基板に結び付けられた第２種類のナノ粒子を第１種類のナノ粒子と接触させるステップであって、前記接触が、第１および第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップからさらに成る、請求項２８に記載の方法。
  30. 第１種類のナノ粒子には、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドが付着しており、第１種類のオリゴヌクレオチドは前記核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有し、第２種類のオリゴヌクレオチドは第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分の配列に相補的な配列を有する、請求項２７に記載の方法。
  31. 基板に結び付けられた第２種類のナノ粒子を、第１種類のナノ粒子と接触させるステップであって、前記接触第１および第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させるステップからさらに成る、請求項３０に記載の方法。
  32. 基板には、１つの核酸中の複数の部分の検出、複数の異なる核酸の検出、またはそれらの両方の検出を可能にするようアレイ状に複数の種類のオリゴヌクレオチドが付着されている、請求項２７に記載の方法。
  33. 基板が透明な基板または不透明な白色基板である、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 検出可能な変化は基板上における暗色領域の形成である、請求項３３に記載の方法。
  35. ナノ粒子が金から形成されている、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  36. 基板を銀染料と接触させて検出可能な変化を生成する、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  37. 検出可能な変化は光学式スキャナで観察される、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  38. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    検出すべき核酸を、オリゴヌクレオチドを付着させた基板と接触させるステップであって、該オリゴヌクレオチドは前記核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、前記接触が、基板上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    基板に結び付けられた前記核酸を、オリゴヌクレオチドを付着したある種類のナノ粒子と接触させるステップであって、該オリゴヌクレオチドは前記核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有し、前記接触が、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    基板を銀染料と接触させて、検出可能な変化を生成するステップと、
    検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  39. ナノ粒子が貴金属から形成されている、請求項３８に記載の方法。
  40. ナノ粒子が金または銀から形成されている、請求項３９に記載の方法。
  41. 基板には、１つの核酸中の複数の部分の検出、複数の異なる核酸の検出、またはそれらの両方の検出を可能にするようアレイ状に複数の種類のオリゴヌクレオチドが付着されている、請求項３８に記載の方法。
  42. 検出可能な変化は光学式スキャナで観察される、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    検出すべき核酸を、オリゴヌクレオチドを付着した基板と接触させるステップであって、該オリゴヌクレオチドは前記核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、前記接触が、基板上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    前記基板に結び付けられた核酸を、オリゴヌクレオチドを付着したリポソームと接触させるステップであって、該オリゴヌクレオチドは前記核酸の配列の一部分に相補的な配列を有し、前記接触が、リポソーム上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    基板に結び付けられたリポソームを、少なくとも第１種類のオリゴヌクレオチドを付着した第１種類のナノ粒子と接触させるステップであって、該第１種類のオリゴヌクレオチドの、ナノ粒子に付着していない端部には、疎水基が付けられ、前記接触が、疎水的相互作用の結果としてナノ粒子上のオリゴヌクレオチドがリポソームへ付着するのを可能にするのに有効な条件下で起こるステップと、
    検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  44. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    検出すべき核酸を、オリゴヌクレオチドを付着させた基板と接触させるステップであって、該オリゴヌクレオチドは前記核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、前記接触は、基板上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    前記基板に結び付けられた核酸を、オリゴヌクレオチドを付着したリポソームと接触させるステップであって、オリゴヌクレオチドは、前記核酸の配列の一部分に相補的な配列を有し、前記接触は、リポソーム上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    前記基板に結び付けられたリポソームを、少なくとも１つの第１種類のオリゴヌクレオチドを付着した第１種類のナノ粒子と接触させるステップであって、該第１種類のオリゴヌクレオチドの、ナノ粒子に付着していない端部には、疎水基が付けられ、前記接触が、疎水的相互作用の結果としてナノ粒子上のオリゴヌクレオチドがリポソームに付着するのを可能にするのに有効な条件下で起こるステップと、
    リポソームに結び付けられた第１種類のナノ粒子を、オリゴヌクレオチドを付着した第２種類のナノ粒子と接触させるステップであって、
    第１種類のナノ粒子には、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有する第２種類のオリゴヌクレオチドが付着し、
    第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、第１種類のナノ粒子上の第２種類のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有し、
    前記接触は、第１および第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  45. 基板には、１つの核酸中の複数の部分の検出、複数の異なる核酸の検出、またはそれらの両方の検出を可能にするようアレイ状に複数の種類のオリゴヌクレオチドが付着されている、請求項４３または４４に記載の方法。
  46. ナノ粒子が金から形成されている、請求項４３または４４に記載の方法。
  47. 基板を銀染料と接触させて検出可能な変化を生成する、請求項４３または４４に記載の方法。
  48. 検出可能な変化は光学式スキャナで観察される、請求項４３または４４のいずれか一項に記載の方法。
  49. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    第１種類のナノ粒子を付着させた基板を提供するステップであって、該ナノ粒子にはオリゴヌクレオチドが付着しており、該オリゴヌクレオチドは検出すべき核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有するステップと、
    前記核酸を、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で、基板に付着されたナノ粒子と接触させるステップと、
    オリゴヌクレオチドを付着した少なくとも２種類のナノ粒子を含む凝集体プローブを提供するステップであって、該凝集体プローブのナノ粒子は、それに付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果互いに結び付けられ、凝集体プローブの該少なくとも２種類ナノ粒子の少なくとも１種類には、前記核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着しているステップと、
    基板に結び付けられた前記核酸分子を、凝集体プローブ上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で、凝集体プローブと接触させるステップと、
    検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  50. 基板には、１つの核酸中の複数の部分の検出、複数の異なる核酸の検出、またはそれらの両方の検出を可能にするようアレイ状に複数の種類のナノ粒子が付着されている、請求項４９に記載の方法。
  51. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    オリゴヌクレオチドを付着させた基板を提供するステップであって、該オリゴヌクレオチドは検出すべき核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有するステップと、
    オリゴヌクレオチドを付着した少なくとも２種類のナノ粒子を含む凝集体プローブを提供するステップと、該凝集体プローブのナノ粒子は、それに付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果互いに結び付けられ、凝集体プローブの該少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類には、前記核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着しているステップと、
    前記核酸、基板、および凝集体プローブを、前記核酸を凝集体プローブ上のオリゴヌクレオチドおよび基板上のオリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させるステップと、
    検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  52. 前記核酸が基板上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように前記核酸を基板と接触させ、その後、前記核酸が凝集体プローブ上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように基板に結び付けられた前記核酸を前記凝集体プローブと接触させる、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記核酸が凝集体プローブ上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように前記核酸を凝集体プローブと接触させ、その後、前記核酸が基板上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように前記核酸を基板と接触させる、請求項５１に記載の方法。
  54. 前記核酸を凝集体プローブおよび基板と同時に接触させる、請求項５１に記載の方法。
  55. 基板には、１つの核酸中の複数の部分の検出、複数の異なる核酸の検出、またはそれらの両方の検出を可能にするようアレイ状に複数の種類のオリゴヌクレオチドが付着されている、請求項５１に記載の方法。
  56. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    オリゴヌクレオチドを付着させた基板を提供するステップと、
    オリゴヌクレオチドを付着した少なくとも２種類のナノ粒子を含む凝集体プローブを提供するステップであって、該凝集体プローブのナノ粒子は、それに付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果互いに結び付けられ、凝集体プローブの該少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類には、検出すべき核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着しているステップと、
    少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドを付着したある種類のナノ粒子を提供するステップであって、第１種類のオリゴヌクレオチドは前記核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有し、第２種類のオリゴヌクレオチドは基板に付着されたオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有するステップと、
    前記核酸、凝集体プローブ、ナノ粒子、および基板を接触させるステップであって、前記接触が、凝集体プローブ上およびナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせ、かつナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを基板上のオリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  57. 前記核酸が凝集体プローブ上のオリゴヌクレオチドおよびナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように前記核酸を凝集体プローブおよびナノ粒子と接触させ、その後、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが基板上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように凝集体プローブおよびナノ粒子に結び付けられた前記核酸を基板と接触させる、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記核酸が凝集体プローブ上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように前記核酸を凝集体プローブと接触させ、その後、前記核酸がナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように、凝集体プローブに結び付けられた前記核酸をナノ粒子上と接触させ、その後、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが基板上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように、凝集体プローブおよびナノ粒子に結び付けられた前記核酸を基板と接触させる、請求項５６に記載の方法。
  59. 前記核酸が凝集体プローブ上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように前記核酸を凝集体プローブと接触させ、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが基板上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするようにナノ粒子を基板と接触させ、その後、前記核酸がナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように凝集体プローブに結び付けられた前記核酸をナノ粒子と接触させる、請求項５６に記載の方法。
  60. 基板には、１つの核酸中の複数の部分の検出、複数の異なる核酸の検出、またはそれらの両方の検出を可能にするようアレイ状に複数の種類のオリゴヌクレオチドが付着されている、請求項５６に記載の方法。
  61. 基板が透明な基板または不透明な白色基板である、請求項４９〜６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 検出可能な変化は基板上における暗色領域の形成である、請求項６１に記載の方法。
  63. 凝集体プローブのナノ粒子が金から形成されている、請求項４９〜６０のいずれか一項に記載の方法。
  64. 基板を銀染料と接触させて検出可能な変化を生成する、請求項４９〜６０のいずれか一項に記載の方法。
  65. 検出可能な変化は光学式スキャナで観察される、請求項４９〜６０のいずれか一項に記載の方法。
  66. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    検出すべき核酸を、オリゴヌクレオチドを付着させた基板と接触させるステップであって、該オリゴヌクレオチドは前記核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、前記接触が、基板上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    基板に結び付けた前記核酸を、オリゴヌクレオチドを付着したリポソームと接触させるステップであって、該オリゴヌクレオチドは前記核酸の配列の部分に相補的な配列を有し、前記接触は、リポソーム上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    オリゴヌクレオチドを付着した少なくとも２種類のナノ粒子を含む凝集体プローブを提供するステップであって、該凝集体プローブのナノ粒子はそれに付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果互いに結び付けられ、凝集体プローブの該少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類には、ナノ粒子に付着していない端部に疎水基を有するオリゴヌクレオチドが付けられ、
    疎水的相互作用の結果として、凝集体プローブ上のオリゴヌクレオチドをリポソームへ付着するのを可能にするのに有効な条件下で、基板に結び付けられたリポソームを凝集体プローブと接触させるステップと、
    検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  67. 凝集体プローブのナノ粒子が金から形成されている、請求項６６に記載の方法。
  68. 基板を銀染料と接触させて検出可能な変化を生成する、請求項６６に記載の方法。
  69. 基板には、１つの核酸中の複数の部分の検出、複数の異なる核酸の検出、またはそれらの両方の検出を可能にするようアレイ状に複数の種類のオリゴヌクレオチドが付着されている、請求項６６に記載の方法。
  70. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    オリゴヌクレオチドを有する基板を提供するステップであって、該オリゴヌクレオチドは検出すべき核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有するステップと、
    少なくとも２種類のナノ粒子を有するコアプローブを提供するステップであって、各種類のナノ粒子には、他の種類のナノ粒子の少なくとも１種の上のオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドが付着しており、凝集体プローブのナノ粒子は、それらに付着したオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした結果互いに結び付けられるステップと、
    ２種類のオリゴヌクレオチドを付着したある種類のナノ粒子を提供するステップであって、第１種類のオリゴヌクレオチドは前記核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有し、第２種類のオリゴヌクレオチドは、前記コアプローブの該少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類に付着したオリゴヌクレオチドの配列の一部分に相補的な配列を有するステップと、
    前記核酸、ナノ粒子、基板、およびコアプローブを、前記核酸をナノ粒子上のオリゴヌクレオチドおよび基板上のオリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせ、かつナノ粒子上のオリゴヌクレオチドをコアプローブ上のオリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させるステップと、
    検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  71. 核酸が基板上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように前記核酸を基板と接触させ、前記核酸がナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように基板に結び付けられた前記核酸をナノ粒子と接触させ、コアプローブ上のオリゴヌクレオチドがナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように前記核酸に結び付けられたナノ粒子をコアプローブと接触させる、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記核酸がナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように前記核酸をナノ粒子と接触させ、その後、前記核酸が基板上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするようにナノ粒子に結び付けられた前記核酸を基板と接触させ、コアプローブ上のオリゴヌクレオチドがナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように、前記核酸に結び付けられたナノ粒子をコアプローブと接触させる、請求項７０に記載の方法。
  73. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    オリゴヌクレオチドを付着させた基板を提供するステップであって、該オリゴヌクレオチドは検出すべき核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有するステップと、
    少なくとも２種類のナノ粒子を有するコアプローブを提供するステップであって、各種類のナノ粒子には、少なくとも１つの他の種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドが付着しており、凝集体プローブのナノ粒子が、それらに付着したオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした結果互いに結び付けられるステップと、
    前記核酸の配列の第２部分に相補的な配列と、コアプローブの該少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類に付着したオリゴヌクレオチドの配列の一部分に相補的な配列とを含む、ある種類の連結オリゴヌクレオチドを提供するステップと、
    前記核酸、連結オリゴヌクレオチド、基板、およびコアプローブを、前記核酸を連結オリゴヌクレオチドおよび基板上のオリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせ、かつ連結オリゴヌクレオチド上のオリゴヌクレオチドをコアプローブ上のオリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させるステップと、
    検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  74. 基板には、１つの核酸中の複数の部分の検出、複数の異なる核酸の検出、またはそれらの両方の検出を可能にするようアレイ状に複数の種類のオリゴヌクレオチドが付着されている、請求項７０〜７３のいずれか一項に記載の方法。
  75. 基板が透明な基板または不透明な白色基板である、請求項７０〜７３のいずれか一項に記載の方法。
  76. 検出可能な変化は基板上における暗色領域の形成である、請求項７６に記載の方法。
  77. コアプローブのナノ粒子が金から形成されている、請求項７０〜７３のいずれか一項に記載の方法。
  78. 基板を銀染料と接触させて検出可能な変化を生成する、請求項７０〜７３のいずれか一項に記載の方法。
  79. 検出可能な変化は光学式スキャナで観察される、請求項７０〜７３のいずれか一項に記載の方法。
  80. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子を提供するステップと、
    １または複数の種類の結合オリゴヌクレオチドを提供するステップであって、各結合オリゴヌクレオチドは２つの部分を有し、その一方の部分の配列は、核酸の複数の部分のうちの１つの配列に相補的であり、他方の部分の配列は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的であるステップと、
    ナノ粒子および結合オリゴヌクレオチドを、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを結合オリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させるステップと、
    核酸および結合オリゴヌクレオチドを、結合オリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させるステップと、
    検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  81. 核酸と接触させるに先立って、ナノ粒子を結合オリゴヌクレオチドと接触させる、請求項８０に記載の方法。
  82. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子を提供するステップと、
    １または複数の結合オリゴヌクレオチドを提供するステップであって、各結合オリゴヌクレオチドは２つの部分を有し、その一方の部分の配列は、核酸の少なくとも２つの部分の配列に相補的であり、他方の部分の配列は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的であるステップと、
    ナノ粒子および結合オリゴヌクレオチドを、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを結合オリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させるステップと、
    核酸および結合オリゴヌクレオチドを、結合オリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させるステップと、
    検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  83. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    核酸を、オリゴヌクレオチドを付着した少なくとも２種類の粒子と接触させるステップであって、
    第１種類の粒子上のオリゴヌクレオチドは、核酸の配列の第１部分に相補的な配列が有し、エネルギー供与体で標識されており、
    第２種類の粒子上のオリゴヌクレオチドは、核酸の配列の第２部分に相補的な配列が有し、エネルギー受容体で標識されており、
    前記接触が、粒子上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    粒子上のオリゴヌクレオチドの核酸とのハイブリダイゼーションによって起こる検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  84. エネルギー供与体および受容体が蛍光分子である、請求項８３に記載の方法。
  85. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    オリゴヌクレオチドを付着したある種類のマイクロスフェアを提供するステップであって、該オリゴヌクレオチドは核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、かつ蛍光分子で標識されているステップと、
    オリゴヌクレオチドを付着したある種類のナノ粒子を提供するステップであって、該オリゴヌクレオチドは核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有し、該ナノ粒子は検出可能な変化を生成可能であるステップと、
    核酸を、マイクロスフェア上およびナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを該核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で、マイクロスフェアおよびナノ粒子と接触させるステップと、
    蛍光の変化、ナノ粒子によって生成される別の検出可能な変化、またはその両方を観察するステップと、から成る方法。
  86. ナノ粒子によって生成される検出可能な変化が色の変化である、請求項８５に記載の方法。
  87. マイクロスフェアがラテックスマイクロスフェアであり、ナノ粒子が金ナノ粒子であり、蛍光、色または両方の変化を観察する、請求項８５に記載の方法。
  88. ラテックスマイクロスフェア、ナノ粒子および核酸の混合物の一部分を、微孔質材料に位置する観察領域に配置し、観察領域から非結合の金ナノ粒子を取り除くために微孔質材料を処理し、その後、蛍光、色、または両方の変化を観察するステップからさらに成る、請求項８７に記載の方法。
  89. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    オリゴヌクレオチドを付着した第１種類の金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子を提供するステップであって、該オリゴヌクレオチドは核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、蛍光分子で標識されているステップと、
    オリゴヌクレオチドを付着した第２種類の金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子を提供するステップであって、該オリゴヌクレオチドは核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有し、蛍光分子で標識されているステップと、
    ２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で核酸を前記２種類のナノ粒子と接触させるステップと、
    蛍光の変化を観察するステップと、から成る方法。
  90. ナノ粒子および核酸の混合物の一部分を、微孔質材料に位置する観察領域に配置し、観察領域から非結合のナノ粒子を取り除くために微孔質材料を処理し、その後、蛍光の変化を観察するステップからさらに成る、請求項８９に記載の方法。
  91. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    オリゴヌクレオチドを付着したある種類の粒子を提供するステップであって、該オリゴヌクレオチドが第１部分と第２部分を有し、両方の部分が核酸の配列の一部分に相補的であるステップと、
    第１部分と第２部分を有するある種類のプローブオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、該第１部分は、粒子に付着したオリゴヌクレオチドの前記第１部分に相補的な配列を有し、両部分は核酸の配列の一部分に相補的であり、プローブオリゴヌクレオチドがさらにその一端でリポーター分子で標識されているステップと、
    粒子上のオリゴヌクレオチドをプローブオリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせる条件下で、粒子およびプローブオリゴヌクレオチドを接触させて、サテライトプローブを生成するステップと、
    その後、核酸をプローブオリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせる条件下で、サテライトプローブを核酸と接触させるステップと、
    粒子を取り除くステップと、
    リポーター分子を検出するステップと、から成る方法。
  92. 粒子が磁気粒子で、リポーター分子が蛍光分子である、請求項９１に記載の方法。
  93. 粒子が磁気粒子で、リポーター分子が染料分子である、請求項９１に記載の方法。
  94. 粒子が磁気粒子で、リポーター分子がレドックス活性分子である、請求項９１に記載の方法。
  95. 少なくとも１つの容器を備えたキットであって、前記容器には前記オリゴヌクレオチドを付着した少なくとも２種類のナノ粒子を含む組成物が入っており、第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有し、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有する、キット。
  96. 容器中の組成物が、第１および第２部分間に位置する核酸の第３部分に相補的な配列を有するフィラーオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項９５に記載のキット。
  97. ナノ粒子が金から形成されている、請求項９５に記載のキット。
  98. 固体表面をさらに備えた、請求項９５に記載のキット。
  99. 少なくとも２つの容器を備えたキットであって、
    第１容器には、核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子が入っており、
    第２容器には、核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子が入っている、キット。
  100. 第１および第２部分間に位置する核酸の第３部分に相補的な配列を有するフィラーオリゴヌクレオチドを保持する第３容器を備えた請求項９９に記載のキット。
  101. ナノ粒子が金から形成されている、請求項９９に記載のキット。
  102. 固体表面をさらに備えた、請求項９９に記載のキット。
  103. 少なくとも２つの容器を備えたキットであって、
    第１容器には、結合オリゴヌクレオチドの第１部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子が入っており、
    第２容器には、第１部分がナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的であり第２部分が核酸の一部分の配列に相補的である、少なくとも２つの部分を含む配列を有する、１または複数の種類の結合オリゴヌクレオチドが入っている、キット。
  104. 追加の容器を備え、該追加の容器の各々には追加的結合オリゴヌクレオチドが入っており、個々の追加的結合オリゴヌクレオチドは、第１部分がナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列と相補的であり第２部分が核酸の別の部分の配列に相補的である、少なくとも２つの部分を含む配列を有する、請求項１０３に記載のキット。
  105. ナノ粒子が金から形成されている、請求項１０３に記載のキット。
  106. 固体表面をさらに備えた、請求項１０３に記載のキット。
  107. キットであって、
    オリゴヌクレオチドを付着した１種類のナノ粒子と、第１部分がナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的であり、そのため結合オリゴヌクレオチドがナノ粒子上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされるようになっており、第２部分が核酸の１または複数の部分の配列に相補的である少なくとも２つの部分を含む配列を各種類が有する１または複数の種類の結合オリゴヌクレオチドとが入った容器、を備えたキット。
  108. 少なくとも１つの容器を備え得たキットであって、該容器にはオリゴヌクレオチドを付着した金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子が入っており、該オリゴヌクレオチドは核酸の一部分に相補的な配列を有し、該オリゴヌクレオチドの、ナノ粒子に付着していない端部には蛍光分子が付けられている、キット。
  109. キットであって、
    核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子を付着させた基板と、
    核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子が入った第１容器と、を備えたキット。
  110. 第１部分が第１容器内のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的である、少なくとも２つの部分を有する選択配列を有する結合オリゴヌクレオチドが入った第２容器と、
    結合オリゴヌクレオチドの第２部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子が入った第３容器と、をさらに備えた請求項１０９に記載のキット。
  111. 少なくとも３つの容器を備えたキットであって、
    ナノ粒子が入った第１容器と、
    核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有する第１オリゴヌクレオチドが入った第２容器と、
    核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有する第２オリゴヌクレオチドが入った第３容器と、を備えたキット。
  112. 第１および第２部分間に位置する核酸の第３部分の配列に相補的な配列を有する第３オリゴヌクレオチドが入った第４容器をさらに備えた、請求項１１１に記載のキット。
  113. 基板をさらに備えた、請求項１１１に記載のキット。
  114. 第１部分が第２オリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的である、少なくとも２つの部分を有する選択配列を有する結合オリゴヌクレオチドが入った第４容器と、
    結合オリゴヌクレオチドの第２部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが入った第５容器と、をさらに備えた請求項１１３に記載のキット。
  115. オリゴヌクレオチド、ナノ粒子、またはその両方が、オリゴヌクレオチドをナノ粒子へ付着するための官能基を担持している、請求項１１１に記載のキット。
  116. 基板、ナノ粒子、またはその両方が、基板へナノ粒子を付着するための官能基を担持している、請求項１１３に記載のキット。
  117. 基板にナノ粒子が付着されている、請求項１１３に記載のキット。
  118. ナノ粒子が金から形成されている、請求項１１１に記載のキット。
  119. キットであって、
    核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させた基板と、
    核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを一部に付着させたナノ粒子が入った第１容器と、
    第１容器内のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子が入った第２容器と、を備えたキット。
  120. キットであって、
    基板と、
    ナノ粒子が入った第１容器と、
    核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有する第１オリゴヌクレオチドが入った第２容器と、
    核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有する第２オリゴヌクレオチドが入った第３容器と、
    第２オリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有する第３オリゴヌクレオチドが入った第４容器と、を備えたキット。
  121. オリゴヌクレオチド、ナノ粒子、基板、またはそれらすべてが、ナノ粒子へオリゴヌクレオチドを付着させるか、または基板へオリゴヌクレオチドを付着するための、官能基を担持している、請求項１２０に記載のキット。
  122. ナノ粒子が金から形成されている、請求項１２０に記載のキット。
  123. キットであって、
    核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させた基板と、
    核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着したリポソームが入った第１容器と、
    少なくとも第１種類のオリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子が入った第２容器であって前記第１種類のオリゴヌクレオチドの、ナノ粒子に付着していない端部には疎水基が付いている、第２容器と、を備えたキット。
  124. 第２容器のナノ粒子には、第２の種類のオリゴヌクレオチドが付着しており、該第２種類のオリゴヌクレオチドは第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有し、
    キットはさらに、
    第１種類のナノ粒子上の第２種類のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させた第２種類のナノ粒子が入った第３容器をさらに備える、請求項１２３に記載のキット。
  125. キットであって、
    核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子を付着させた基板と、
    オリゴヌクレオチドを付着した少なくとも２種類のナノ粒子を含む凝集体プローブが入った第１容器であって、該凝集体プローブのナノ粒子は、それに付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果互いに結び付けられ、凝集体プローブの該少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類には、前記核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している、第１容器と、を備えたキット。
  126. キットであって、
    核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させた基板と、
    オリゴヌクレオチドを付着した少なくとも２種類のナノ粒子を含む凝集体プローブが入った第１容器であって、該凝集体プローブのナノ粒子は、それに付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果互いに結び付けられ、凝集体プローブの該少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類には、前記核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している、第１容器と、を備えたキット。
  127. 基板には、１つの核酸中の複数の部分の検出、複数の異なる核酸の検出、またはそれらの両方の検出を可能にするようアレイ状に複数の種類のオリゴヌクレオチドが付着されている、請求項１２６に記載のキット。
  128. キットであって、
    オリゴヌクレオチドを付着させた基板と、
    オリゴヌクレオチドを付着した少なくとも２種類のナノ粒子を含む凝集体プローブが入った第１容器であって、凝集体プローブのナノ粒子は、それに付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果互いに結び付けられ、凝集体プローブの該少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類には、核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している、第１容器と、
    少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子が入った第２容器であって、第１種類のオリゴヌクレオチドは核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有し、第２種類のオリゴヌクレオチドは基板に付着させたオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有する、第２容器と、を備えたキット。
  129. キットであって、
    核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させた基板と、
    核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着したリポソームが入った第１容器と、
    オリゴヌクレオチドを付着した少なくとも２種類のナノ粒子を含む凝集体プローブが入った第２容器であって、凝集体プローブのナノ粒子は、それに付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果互いに結び付けられ、凝集体プローブの該少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類にはオリゴヌクレオチドが付着し、該オリゴヌクレオチドのナノ粒子に付着していない端部には、疎水基が付いている、第２容器と、を備えたキット。
  130. 基板が透明な基板または不透明な白色基板である、請求項１２５〜１２９いずれか一項に記載のキット。
  131. 凝集体プローブのナノ粒子が金から形成されている、請求項１２５〜１２９いずれか一項に記載のキット。
  132. 少なくとも３つの容器を備えたキットであって、
    ナノ粒子が入った第１容器と、
    核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有する第１オリゴヌクレオチドが入った第２容器と、
    核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有する第２オリゴヌクレオチドが入った第３容器と、を備えたキット。
  133. 第１部分と第２部分の間に位置する核酸の第３部分の配列に相補的な配列を有する第３オリゴヌクレオチドが入った第４容器をさらに備えた、請求項１３２に記載のキット。
  134. 基板をさらに備えた。請求項１３２に記載のキット。
  135. 第１部分が第２オリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的である、少なくとも２つの部分を有する選択配列を有する結合オリゴヌクレオチドが入った第４容器と、
    結合オリゴヌクレオチドの第２部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが入った第５容器と、をさらに備えた請求項１３４に記載のキット。
  136. オリゴヌクレオチド、ナノ粒子、またはその両方が、オリゴヌクレオチドをナノ粒子へ付着するための官能基を担持している、請求項１３２に記載のキット。
  137. 基板、ナノ粒子、またはその両方が、基板へナノ粒子を付着するための官能基を担持している、請求項１３４に記載のキット。
  138. 基板にナノ粒子が付着されている、請求項１３４に記載のキット。
  139. ナノ粒子が金から形成されている、請求項１３２に記載のキット。
  140. キットであって、
    核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させた基板と、
    核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを一部付着させたナノ粒子が入った第１容器と、
    第１容器内のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子が入った第２容器と、を備えたキット。
  141. キットであって、
    基板と、
    ナノ粒子が入った第１容器と、
    核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有する第１オリゴヌクレオチドが入った第２容器と、
    核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有する第２オリゴヌクレオチドが入った第３容器と、
    第２オリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有する第３オリゴヌクレオチドが入った第４容器と、を備えたキット。
  142. オリゴヌクレオチド、ナノ粒子、基板、またはそれらすべてが、ナノ粒子へオリゴヌクレオチドを付着させるか、または基板へオリゴヌクレオチドを付着するための、官能基を担持している、請求項１４１に記載のキット。
  143. ナノ粒子が金から形成されている、請求項１４１に記載のキット。
  144. キットであって、
    核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させた基板と、
    核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させたリポソームが入った第１容器と、
    少なくとも第１種類のオリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子が入った第２容器であって、該第１種類のオリゴヌクレオチドの、ナノ粒子に付着していない端部には疎水基が付いている、第２容器と、を備えたキット。
  145. 第２容器内のナノ粒子には、第２の種類のオリゴヌクレオチドが付着され、該第２種類のオリゴヌクレオチドは第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有し、
    キットはさらに、
    第１種類のナノ粒子上の第２種類のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させた第２種類のナノ粒子が入った第３容器をさらに備える、請求項１４４に記載のキット。
  146. 少なくとも２つの容器を備えたキットであって、
    第１容器には、核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有し、かつ粒子に付着していない端部がエネルギー供与体で標識されているオリゴヌクレオチドを付着させた粒子が入っており、
    第２容器には、核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有し、かつ粒子に付着していない端部がエネルギー受容体で標識されているオリゴヌクレオチドを付着させた粒子が入っている、キット。
  147. エネルギー供与体および受容体が蛍光分子である、請求項１４６に記載のキット。
  148. 少なくとも１つの容器を備えたキットであって、前記容器には、核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有し、かつ該粒子に付着していない端部がエネルギー供与体で標識されているオリゴヌクレオチドを付着させた第１種類の粒子と、それに付けられた、核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有し、かつ該粒子に付着していない端部がエネルギー受容体で標識されているオリゴヌクレオチドを付着させた第２種類の粒子とが入っている、キット。
  149. エネルギー供与体および受容体が蛍光分子である、請求項１４８に記載のキット。
  150. キットであって、
    核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、かつ蛍光分子で標識されたオリゴヌクレオチドを付着させたマイクロスフェアが入った第１容器と、
    核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させたある種類のナノ粒子が入った第２容器と、を備えたキット。
  151. マイクロスフェアがラテックスマイクロスフェアであり、ナノ粒子が金ナノ粒子である、請求項１５０に記載のキット。
  152. 微孔質材料をさらに備えた、請求項１５０に記載のキット。
  153. キットであって、
    核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、かつ蛍光分子で標識されたオリゴヌクレオチドを付着させた第１種類の金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子が入った第１容器と、
    核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有し、かつ蛍光分子で標識されたオリゴヌクレオチドを付着させた第２種類の金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子が入った第２容器と、を備えたキット。
  154. 微孔質材料をさらに備えた、請求項１５３に記載のキット。
  155. サテライトプローブが入った容器を備えたキットであって、該サテライトプローブが、
    両部分が核酸の配列の一部分に相補的な配列を有する、第１部分および第２部分を有するオリゴヌクレオチドを付着させた粒子と、
    第１部分および第２部分を有し、ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、さらにリポーター分子が一端に付いた、プローブオリゴヌクレオチドであって、該第１部分は粒子に付着した該オリゴヌクレオチドの第１部分の配列に相補的な配列を有し、両部分は核酸の配列の部分に相補的な配列を有するプローブオリゴヌクレオチドと、を含むキット。
  156. 凝集体プローブが入った容器を備えたキットであって、凝集体プローブはオリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を含み、該凝集体プローブのナノ粒子は、それに付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果互いに結び付けられ、凝集体プローブの該少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類には、核酸の配列の一部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している、キット。
  157. 凝集体プローブが入った容器を備えたキットであって、凝集体プローブはオリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を含み、該凝集体プローブのナノ粒子は、それに付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果互いに結び付けられ、凝集体プローブの該少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類には、ナノ粒子に付着していない端部に疎水基が付いたオリゴヌクレオチドが付着している、キット。
  158. 凝集体プローブであって、該凝集体プローブはオリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を含み、凝集体プローブの該ナノ粒子は、それに付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果互いに結び付けられ、凝集体プローブの該少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類には、核酸の配列の部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している、凝集体プローブ。
  159. 各々２種類のオリゴヌクレオチドを付着させた２種類のナノ粒子を含み、各種類のナノ粒子に付着した第１種類のオリゴヌクレオチドは、核酸の配列の一部分に相補的な配列を有し、第１種類のナノ粒子に付着した第２種類のオリゴヌクレオチドは、第２種類のナノ粒子に付着した第２種類のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有する、請求項１５８に記載の凝集体プローブ。
  160. オリゴヌクレオチドを付着させた３種類のナノ粒子を含み、第１種類のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドは、第２種類のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有し、第２種類のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドは、第１種類のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有し、第３種類のナノ粒子には２種類のオリゴヌクレオチドが付着しており、第１種類のオリゴヌクレオチドは核酸の配列の部分に相補的な配列を有し、第２種類のオリゴヌクレオチドは１番目または第２種類のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有する、請求項１５８に記載の凝集体プローブ。
  161. 凝集体プローブであって、該凝集体プローブはオリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を含み、凝集体プローブのナノ粒子は、それに付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果互いに結び付けられ、凝集体プローブの該少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類にはオリゴヌクレオチドが付着し、該オリゴヌクレオチドのナノ粒子に付着していない端部には、疎水基が付いている、凝集体プローブ。
  162. コアプローブが入った容器を備えたキットであって、該コアプローブは、オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を含み、コアプローブのナノ粒子は、それに付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果互いに結び付けられている、キット。
  163. 検出すべき核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させた基板をさらに備えた、請求項１６２に記載のキット。
  164. ２種類のオリゴヌクレオチドを付着させたある種類のナノ粒子が入った容器をさらに備え、第１種類のオリゴヌクレオチドは核酸の第２部分に相補的な配列を有し、第２種類のオリゴヌクレオチドは、コアプローブの前記少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類に付着したオリゴヌクレオチドの配列の一部分に相補的な配列を有する、請求項１６２または１６３に記載のキット。
  165. 核酸の配列の第２部分に相補的な配列と、コアプローブの前記少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類に付着したオリゴヌクレオチドの配列の一部分に相補的な配列とを有するある種類の連結オリゴヌクレオチドが入った容器をさらに備えた、請求項１６２または１６３に記載のキット。
  166. オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を含むコアプローブであって、コアプローブのナノ粒子が、それに付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果互いに結び付けられている、コアプローブ。
  167. ナノ粒子を付着させた基板。
  168. 前記ナノ粒子には、核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着している、請求項１６７に記載の基板。
  169. オリゴヌクレオチドを付着した金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子であって、オリゴヌクレオチドのナノ粒子に付着していない端部が蛍光分子で標識されている、金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子。
  170. サテライトプローブであって、
    第１部分および第２部分を有し、かつ両部分が核酸の配列の部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させた粒子と、
    ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたプローブオリゴヌクレオチドであって、第１部分および第２部分を有し、第１部分は前記粒子に付着したオリゴヌクレオチドの第１部分の配列に相補的な配列を有し、両部分が核酸の配列の一部分に相補的な配列を有し、さらにリポーター分子が一端に付いた、プローブオリゴヌクレオチドと、を含むサテライトプローブ。
  171. ナノファブリケーションの方法であって、
    選択配列を有する少なくとも１種類の連結オリゴヌクレオチドを提供するステップであって、連結オリゴヌクレオチドの各種類の配列が少なくとも２つの部分を有するステップと、
    オリゴヌクレオチドを付着させた１または複数の種類のナノ粒子を提供するステップであって、各種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが連結オリゴヌクレオチドの部分の配列に相補的な配列を有するステップと、
    連結オリゴヌクレオチドおよびナノ粒子を、ナノ粒子がオリゴヌクレオチドコネクタによって一緒に纏められた所望のナノ材料またはナノ構造が形成されるように、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを連結オリゴヌクレオチドへ有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させるステップと、から成る方法。
  172. オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子が提供され、第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、連結オリゴヌクレオチドの配列の第１部分に相補的な配列を有し、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、連結オリゴヌクレオチドの配列の第２部分に相補的な配列を有する、請求項１７１に記載の方法。
  173. ナノ粒子は金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子、またはそれらの組合せである、請求項１７１または１７２に記載の方法。
  174. 金属ナノ粒子は金から形成されており、半導体ナノ粒子はＣｄＳｅ／ＺｎＳ（コア／シェル）から形成されている、請求項１７３に記載の方法。
  175. ナノファブリケーションの方法であって、
    オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を提供するステップであって、
    第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有し、
    第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有するステップと、
    所望のナノ材料またはナノ構造が形成されるように、第１と第２種類のナノ粒子を、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを互いに有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させるステップと、から成る方法。
  176. ナノ粒子は金属のナノ粒子、半導体ナノ粒子、またはそれらの組合せである、請求項１７５に記載の方法。
  177. 金属ナノ粒子は金から形成されており、半導体ナノ粒子はＣｄＳｅ／ＺｎＳ（コア／シェル）から形成されている、請求項１７６に記載の方法。
  178. オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子から構成されたナノ材料またはナノ構造であって、ナノ粒子がオリゴヌクレオチドコネクタにより一緒に纏められている、ナノ材料またはナノ構造。
  179. 少なくともオリゴヌクレオチドコネクタの一部が三本鎖である、請求項１７８に記載のナノ材料またはナノ構造。
  180. ナノ粒子は金属のナノ粒子、半導体ナノ粒子、またはそれらの組合せである、請求項１７８のナノ材料またはナノ構造。
  181. 金属ナノ粒子は金から形成されており、半導体ナノ粒子はＣｄＳｅ／ＺｎＳ（コア／シェル）から形成されている、請求項１８０に記載のナノ材料またはナノ構造。
  182. オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を含む組成物であって、第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、核酸の第１部分または連結オリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有し、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、核酸の第２部分または連結オリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有する、組成物。
  183. ナノ粒子は金属のナノ粒子、半導体ナノ粒子、またはそれらの組合せである、請求項１８２に記載の組成物。
  184. 金属ナノ粒子は金から形成されており、半導体ナノ粒子はＣｄＳｅ／ＺｎＳ（コア／シェル）から形成されている、請求項１８３に記載の組成物。
  185. 容器のアセンブリであって、
    オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子が入った第１容器と、
    オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子が入った第２容器とを備え、
    第１容器内のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドは、第２容器内のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有し、
    第２容器内のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドは、第２容器内のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有する、アセンブリ。
  186. ナノ粒子は金属のナノ粒子、半導体ナノ粒子、またはそれらの組合せである、請求項１８５のアセンブリ
  187. 金属ナノ粒子は金から形成されており、半導体ナノ粒子はＣｄＳｅ／ＺｎＳ（コア／シェル）から形成されている、請求項１８６に記載のアセンブリ。
  188. 複数の異なるオリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子。
  189. 少なくとも２つの部分を有する選択核酸を、他の核酸から分離する方法であって、
    オリゴヌクレオチドを付着させた２種類以上のナノ粒子を提供するステップであって、各種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、選択核酸の複数の部分のうちの１つの配列に相補的な配列を有するステップと、
    核酸およびナノ粒子を、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを選択核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させ、その結果、選択核酸にハイブリダイズしたナノ粒子が凝集して沈降するようにするステップと、
  190. 安定したナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成するためにオリゴヌクレオチドを荷電ナノ粒子へ結合させる方法であって、
    ナノ粒子に結合可能な官能基を含む部分を共有結合で結合させた、オリゴヌクレオチドを提供するステップと、
    少なくともオリゴヌクレオチドの一部がナノ粒子に結合するのに十分な期間、水中でオリゴヌクレオチドとナノ粒子を接触させるステップと、
    該水へ少なくとも１つの塩を加えて塩溶液を作製するステップであって、該塩溶液のイオン強度は、ナノ粒子に対するオリゴヌクレオチドの静電引力または静電斥力、ならびに互いに対するオリゴヌクレオチドの静電斥力を少なくとも部分的に克服するのに十分な強度であるステップと、
    追加オリゴヌクレオチドがナノ粒子に結合して、安定したナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成するのに十分な追加期間、塩溶液中でオリゴヌクレオチドとナノ粒子を接触させるステップと、から成る方法。
  191. ナノ粒子が金属ナノ粒子か半導体ナノ粒子である、請求項１９０に記載の方法。
  192. ナノ粒子が金ナノ粒子である、請求項１９１に記載の方法。
  193. ナノ粒子に結合可能な官能基を含む部分がアルカンチオールである、請求項１９２に記載の方法。
  194. すべての塩が１回の追加で水に加えられる、請求項１９０に記載の方法。
  195. 塩が時間の経過と共に徐々に加えられる、請求項１９０に記載の方法。
  196. 前記塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、アンモニア、塩化物、ナトリウム、酢酸塩、酢酸アンモニウム、これらの塩の２以上の組合せ、リン酸緩衝液中のこれらの塩の１つ、および、リン酸緩衝液中のこれらの塩の２以上の組合せから成る群から選択される、請求項１９０に記載の方法。
  197. 前記塩がリン酸緩衝液中の塩化ナトリウムである、請求項１９６に記載の方法。
  198. 少なくとも１０ピコモル／ｃｍ２の表面密度でナノ粒子表面に存在するオリゴヌクレオチドを有するナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体が生成される、請求項１９０に記載の方法。
  199. オリゴヌクレオチドが少なくとも１５ピコモル／ｃｍ２の表面密度でナノ粒子表面に存在する、請求項１９８に記載の方法。
  200. オリゴヌクレオチドが約１５ピコモル／ｃｍ２〜約４０ピコモル／ｃｍ２の表面密度でナノ粒子表面に存在する、請求項１９９に記載の方法。
  201. ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成するためにオリゴヌクレオチドをナノ粒子へ結合させる方法であって、
    少なくとも１種類の認識オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、各認識オリゴヌクレオチドがスペーサー部分と認識部分を有し、該スペーサー部分はナノ粒子に結合可能であるように設計されているステップと、
    認識オリゴヌクレオチドの少なくとも一部がナノ粒子に結合して、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成するのに有効な条件下で、オリゴヌクレオチドおよびナノ粒子を接触させるステップと、から成る方法。
  202. 認識オリゴヌクレオチドの各スペーサー部分には、ナノ粒子に結合可能な官能基を有する部分が共有結合によって結び付けられている、請求項２０１に記載の方法。
  203. ナノ粒子が金属ナノ粒子か半導体ナノ粒子である、請求項２０１に記載の方法。
  204. ナノ粒子が金ナノ粒子である、請求項２０３に記載の方法。
  205. スペーサー部分が少なくとも約１０ヌクレオチドを含む、請求項２０４に記載の方法。
  206. スペーサー部分が約１０〜約３０のヌクレオチドを含む、請求項２０５に記載の方法。
  207. スペーサーのヌクレオチドの塩基が、すべてアデニン、すべてチミン、すべてシトシン、すべてウラシル、またはすべてグアニンである、請求項２０６に記載の方法。
  208. ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成するためにオリゴヌクレオチドをナノ粒子へ結合させる方法であって、
    ある種類の認識オリゴヌクレオチドと、ある種類の希釈剤オリゴヌクレオチドとを含む、オリゴヌクレオチドを提供するステップと、
    前記オリゴヌクレオチドを前記ナノ粒子と、前記ある種類のオリゴヌクレオチドの各々の少なくとも一部がナノ粒子に結合して、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成するために有効な条件下で、接触させるステップと、から成る方法。
  209. ナノ粒子が金属ナノ粒子か半導体ナノ粒子である、請求項２０８に記載の方法。
  210. ナノ粒子が金ナノ粒子である、請求項２０９に記載の方法。
  211. 各認識オリゴヌクレオチドがスペーサー部分と認識部分を有し、該スペーサー部分はナノ粒子に結合可能であるように設計されている、請求項２０８に記載の方法。
  212. 認識オリゴヌクレオチドの各スペーサー部分には、ナノ粒子に結合可能な官能基を有する部分が共有結合によって結び付けられている、請求項２１１に記載の方法。
  213. 認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分が少なくとも約１０ヌクレオチドを含む、請求項２１１に記載の方法。
  214. 認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分が約１０ヌクレオチド〜約３０ヌクレオチドを含む、請求項２１３に記載の方法。
  215. スペーサーのヌクレオチドの塩基が、すべてアデニン、すべてチミン、すべてシトシン、すべてウラシル、またはすべてグアニンである、請求項２１１に記載の方法。
  216. 希釈剤オリゴヌクレオチドが、認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分に含まれるのとほぼ同じ数のヌクレオチドを含む、請求項２１１に記載の方法。
  217. 希釈剤オリゴヌクレオチドの配列が、認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分の配列と同じである、請求項２１６に記載の方法。
  218. オリゴヌクレオチドが少なくとも２種類の認識オリゴヌクレオチドを含む、請求項２０８に記載の方法。
  219. ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成するためにオリゴヌクレオチドを荷電ナノ粒子へ結合させる方法であって、
    ナノ粒子に結合可能な官能基を有する部分が共有結合によって結び付けられ、かつある種類の認識オリゴヌクレオチドと、ある種類の希釈剤オリゴヌクレオチドとを含む、オリゴヌクレオチドを提供するステップと、
    前記ある種類のオリゴヌクレオチドの各々の少なくとも一部がナノ粒子に結合するのに十分な期間、水中で該オリゴヌクレオチドをナノ粒子と接触させるステップと、
    該水へ少なくとも１つの塩を加えて塩溶液を作製するステップであって、該塩溶液のイオン強度は、ナノ粒子に対するオリゴヌクレオチドの静電引力または静電斥力、ならびに互いに対するオリゴヌクレオチドの静電斥力を少なくとも部分的に克服するのに十分な強度であるステップと、
    前記ある種類のオリゴヌクレオチドの各々の追加オリゴヌクレオチドがナノ粒子に結合して、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成するのに十分な追加期間、塩溶液中でオリゴヌクレオチドとナノ粒子を接触させるステップと、から成る方法。
  220. ナノ粒子が金属ナノ粒子か半導体ナノ粒子である、請求項２１９に記載の方法。
  221. ナノ粒子が金ナノ粒子である、請求項２２０に記載の方法。
  222. ナノ粒子に結合可能な官能基を含む部分がアルカンチオールである、請求項２２１に記載の方法。
  223. すべての塩が１回の追加で水に加えられる、請求項２１９に記載の方法。
  224. 塩が時間の経過と共に徐々に加えられる、請求項２１９に記載の方法。
  225. 前記塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、アンモニア、塩化物、ナトリウム、酢酸塩、酢酸アンモニウム、これらの塩の２以上の組合せ、リン酸緩衝液中のこれらの塩の１つ、および、リン酸緩衝液中のこれらの塩の２以上の組合せから成る群から選択される、請求項２１９に記載の方法。
  226. 前記塩がリン酸緩衝液中の塩化ナトリウムである、請求項２２５に記載の方法。
  227. 少なくとも１０ピコモル／ｃｍ２の表面密度でナノ粒子表面に存在するオリゴヌクレオチドを有するナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体が生成される、請求項２１９に記載の方法。
  228. オリゴヌクレオチドが少なくとも１５ピコモル／ｃｍ２の表面密度でナノ粒子表面に存在する、請求項２２７に記載の方法。
  229. オリゴヌクレオチドが約１５ピコモル／ｃｍ２〜約４０ピコモル／ｃｍ２の表面密度でナノ粒子表面に存在する、請求項２２８に記載の方法。
  230. 各認識オリゴヌクレオチドがスペーサー部分と認識部分を有し、各スペーサー部分には、ナノ粒子に結合可能な官能基を有する部分が共有結合によって結び付けられている、請求項２１９に記載の方法。
  231. スペーサー部分が少なくとも約１０ヌクレオチドを含む、請求項２３０に記載の方法。
  232. スペーサー部分が約１０〜約３０のヌクレオチドを含む、請求項２３１に記載の方法。
  233. スペーサーのヌクレオチドの塩基が、すべてアデニン、すべてチミン、すべてシトシン、すべてウラシル、またはすべてグアニンである、請求項２３０に記載の方法。
  234. 希釈剤オリゴヌクレオチドが、認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分に含まれるのとほぼ同じ数のヌクレオチドを含む、請求項２３０に記載の方法。
  235. 希釈剤オリゴヌクレオチドの配列が、認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分の配列と同じである、請求項２３４に記載の方法。
  236. オリゴヌクレオチドが少なくとも２種類の認識オリゴヌクレオチドを含む、請求項２１９に記載の方法。
  237. オリゴヌクレオチドを付着したナノ粒子であるナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体であって、該オリゴヌクレオチドは共役体が安定であるように十分な表面密度でナノ粒子表面に存在し、該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、核酸または別のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有する、共役体。
  238. オリゴヌクレオチドが少なくとも１０ピコモル／ｃｍ２の表面密度でナノ粒子表面に存在する、請求項２３７に記載の共役体
  239. オリゴヌクレオチドが少なくとも１５ピコモル／ｃｍ２の表面密度でナノ粒子表面に存在する、請求項２３８に記載のナノ粒子。
  240. オリゴヌクレオチドが約１５ピコモル／ｃｍ２〜約４０ピコモル／ｃｍ２の表面密度でナノ粒子表面に存在する、請求項２３９に記載のナノ粒子。
  241. ナノ粒子が金属ナノ粒子か半導体ナノ粒子である、請求項２３７に記載のナノ粒子。
  242. ナノ粒子が金ナノ粒子である、請求項２４１に記載のナノ粒子。
  243. オリゴヌクレオチドを有するナノ粒子であって、該オリゴヌクレオチドは少なくとも１種類の認識オリゴヌクレオチドを含み、該認識オリゴヌクレオチドの各々はスペーサー部分と認識部分を有し、該スペーサー部分はナノ粒子に結び付けられるように設計され、該認識部分は核酸または別のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有する、ナノ粒子。
  244. 前記スペーサー部分が、ナノ粒子に共有結合で結び付けられる部分を有し、該部分は、スペーサー部分をナノ粒子に結び付ける官能基を含む、請求項２４３に記載のナノ粒子。
  245. スペーサー部分が少なくとも約１０ヌクレオチドを含む、請求項２４３に記載のナノ粒子。
  246. スペーサー部分が約１０〜約３０のヌクレオチドを含む、請求項２４５に記載のナノ粒子。
  247. スペーサー部分のヌクレオチドの塩基が、すべてアデニン、すべてチミン、すべてシトシン、すべてウラシル、またはすべてグアニンである、請求項２４３に記載のナノ粒子。
  248. オリゴヌクレオチドが少なくとも１０ピコモル／ｃｍ２の表面密度でナノ粒子表面に存在する、請求項２４３に記載のナノ粒子。
  249. オリゴヌクレオチドが少なくとも１５ピコモル／ｃｍ２の表面密度でナノ粒子表面に存在する、請求項２４８に記載のナノ粒子。
  250. オリゴヌクレオチドが約１５ピコモル／ｃｍ２〜約４０ピコモル／ｃｍ２の表面密度でナノ粒子表面に存在する、請求項２４９のナノ粒子。
  251. ナノ粒子が金属ナノ粒子か半導体ナノ粒子である、請求項２４３に記載のナノ粒子。
  252. ナノ粒子が金ナノ粒子である、請求項２５１に記載の方法。
  253. オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子であって、該オリゴヌクレオチドが、
    核酸またはまたは別のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を各々が有する少なくとも１種類の認識オリゴヌクレオチドと、
    ある種類の希釈剤オリゴヌクレオチドと、
    を含む、ナノ粒子。
  254. 認識オリゴヌクレオチドの各々がスペーサー部分と認識部分を有し、該スペーサー部分はナノ粒子に結び付けられるように設計され、該認識部分は核酸または別のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有する、請求項２５３に記載のナノ粒子。
  255. 前記スペーサー部分が、ナノ粒子に共有結合で結び付けられる部分を有し、該部分は、スペーサー部分をナノ粒子に結び付ける官能基を含む、請求項２５４に記載のナノ粒子。
  256. スペーサー部分が少なくとも約１０ヌクレオチドを含む、請求項２５４に記載のナノ粒子。
  257. スペーサー部分が約１０〜約３０のヌクレオチドを含む、請求項２５６に記載のナノ粒子。
  258. スペーサー部分のヌクレオチドの塩基が、すべてアデニン、すべてチミン、すべてシトシン、すべてウラシル、またはすべてグアニンである、請求項２５４に記載のナノ粒子。
  259. オリゴヌクレオチドが少なくとも１０ピコモル／ｃｍ２の表面密度でナノ粒子表面に存在する、請求項２５３に記載のナノ粒子。
  260. オリゴヌクレオチドが少なくとも１５ピコモル／ｃｍ２の表面密度でナノ粒子表面に存在する、請求項２５９に記載のナノ粒子。
  261. オリゴヌクレオチドが約１５ピコモル／ｃｍ２〜約４０ピコモル／ｃｍ２の表面密度でナノ粒子表面に存在する、請求項２６０に記載のナノ粒子。
  262. 前記希釈剤オリゴヌクレオチドが、認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分に含まれるヌクレオチドとほぼ同じ数のヌクレオチドを含む、請求項２５４に記載のナノ粒子。
  263. 希釈剤オリゴヌクレオチドの配列が認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分の配列と同じである、請求項２６２に記載のナノ粒子。
  264. ナノ粒子が金属ナノ粒子か半導体ナノ粒子である、請求項２５３に記載のナノ粒子。
  265. ナノ粒子が金ナノ粒子である、請求項２６４に記載のナノ粒子。
  266. 核酸を検出する方法であって、
    請求項２３７〜２４２のいずれか一項に記載の少なくとも１種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と核酸を、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させるステップと、
    ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸のハイブリダイゼーションによって起こる検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  267. 核酸を検出する方法であって、
    請求項２４３〜２６５のいずれか一項に記載の少なくとも１種類のナノ粒子と核酸を、ナノ粒子上の少なくとも１種類の認識オリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させるステップと、
    認識オリゴヌクレオチドと核酸のハイブリダイゼーションによって起こる検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  268. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    請求項２３７〜２４２のいずれか一項に記載のある種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を提供するステップであって、各ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、核酸の少なくとも２つの部分の配列に相補的な配列を有するステップと、
    ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸の２つ以上の部分とを有効にハイブリダイズさせる条件下で、核酸と共役体を接触させるステップと、
    ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸のハイブリダイゼーションによって起こる検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  269. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    請求項２３７〜２４０のいずれか一項に記載の少なくとも２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を核酸と接触させるステップであって、第１種類の共役体のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは該核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、第２種類の共役体のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは該核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有し、前記接触は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを該核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸のハイブリダイゼーションによって起こる検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  270. 前記接触条件には凍結と融解が含まれる、請求項２６９に記載の方法。
  271. 前記接触条件には加熱が含まれる、請求項２６９に記載の方法。
  272. 検出可能な変化は固体表面上で観察される、請求項２６９に記載の方法。
  273. 検出可能な変化は肉眼で観察可能な色の変化である、請求項２６９に記載の方法。
  274. 色の変化が固体表面上で観察される、請求項２７３に記載の方法。
  275. ナノ粒子が金属ナノ粒子か半導体ナノ粒子である、請求項２６９に記載の方法。
  276. ナノ粒子が金ナノ粒子である、請求項２６９に記載の方法。
  277. ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの、ナノ粒子に付着していない端部が、核酸とのナノ粒子上のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに基づいて検出可能な変化を生成する分子によって標識される、請求項２６９に記載の方法。
  278. ナノ粒子が金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子であり、ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドは蛍光分子で標識される、請求項２７７に記載の方法。
  279. 核酸は第１部分と第２部分の間に位置する第３部分を有し、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列は、核酸の該第３部分に相補的な配列を有さず、
    核酸を、核酸の該第３部分に相補的な配列を有するフィラーオリゴヌクレオチドとさらに接触させ、前記接触が、フィラーオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる、請求項２６９に記載の方法。
  280. 核酸がウイルスＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項２６９に記載の方法。
  281. 核酸が疾患関連遺伝子である、請求項２６９に記載の方法。
  282. 核酸が細菌ＤＮＡである、請求項２６９に記載の方法。
  283. 核酸が真菌ＤＮＡである、請求項２６９に記載の方法。
  284. 核酸が合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、構造的に修飾された天然または合成ＲＮＡ、もしくは構造的に修飾された天然または合成ＤＮＡである、請求項２６９に記載の方法。
  285. 核酸が生物源のものである、請求項２６９に記載の方法。
  286. 核酸がポリメラーゼ連鎖反応増幅の産物である、請求項２６９に記載の方法。
  287. 核酸を第１と第２種類の共役体と同時に接触させる、請求項２６９に記載の方法。
  288. 核酸を、第２種類の共役体と接触させる前に、第１種類の共役体のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと接触およびハイブリダイズさせる、請求項２６９に記載の方法。
  289. 第１種類の共役体が基板に付着される、請求項２８８に記載の方法。
  290. 核酸が二本鎖であり、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって三本鎖複合体が生じる、請求項２６９に記載の方法。
  291. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    認識オリゴヌクレオチドを付着させた請求項２４３〜２５２のいずれか一項に記載の少なくともある種類のナノ粒子を提供するステップであって、各ナノ粒子上の認識オリゴヌクレオチドは核酸の少なくとも２つの部分の配列に相補的な配列を有するステップと、
    核酸とナノ粒子を、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを核酸の２つ以上の部分と有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させるステップと
    核酸とナノ粒子上のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって起こる検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  292. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    認識オリゴヌクレオチドを付着させた請求項２４３〜２５０に記載のいずれか一項に記載の少なくとも２種類のナノ粒子と核酸を接触させるステップであって、第１種類のナノ粒子上の認識オリゴヌクレオチドは核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、第２種類のナノ粒子上の認識オリゴヌクレオチドは核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有し、前記接触が、ナノ粒子上の認識オリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    ナノ粒子上の認識オリゴヌクレオチドと核酸のハイブリダイゼーションによって起こる検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  293. 前記接触条件には凍結と融解が含まれる、請求項２９２に記載の方法。
  294. 前記接触条件には加熱が含まれる、請求項２９２に記載の方法。
  295. 検出可能な変化は固体表面上で観察される、請求項２９２に記載の方法。
  296. 検出可能な変化は肉眼で観察可能な色の変化である、請求項２９２に記載の方法。
  297. 色の変化が固体表面上で観察される、請求項２９６に記載の方法。
  298. ナノ粒子が金属ナノ粒子か半導体ナノ粒子である、請求項２９２に記載の方法。
  299. ナノ粒子が金から形成されている、請求項２９８に記載の方法。
  300. ナノ粒子に付着した認識オリゴヌクレオチドの、ナノ粒子に付着していない端部が、核酸とのナノ粒子上のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに基づいて検出可能な変化を生成する分子によって標識される、請求項２９２に記載の方法。
  301. ナノ粒子が金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子であり、ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドは蛍光分子で標識される、請求項３００に記載の方法。
  302. 核酸は第１部分と第２部分の間に位置する第３部分を有し、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列は、核酸の該第３部分に相補的な配列を有さず、
    核酸を、核酸の該第３部分に相補的な配列を有するフィラーオリゴヌクレオチドとさらに接触させ、前記接触が、フィラーオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる、請求項２９２に記載の方法。
  303. 核酸がウイルスＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項２９２に記載の方法。
  304. 核酸が疾患関連遺伝子である、請求項２９２に記載の方法。
  305. 核酸が細菌ＤＮＡである、請求項２９２に記載の方法。
  306. 核酸が真菌ＤＮＡである、請求項２９２に記載の方法。
  307. 核酸が合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、構造的に修飾された天然または合成ＲＮＡ、もしくは構造的に修飾された天然または合成ＤＮＡである、請求項２９２に記載の方法。
  308. 核酸が生物源のものである、請求項２９２に記載の方法。
  309. 核酸がポリメラーゼ連鎖反応増幅法の産物である、請求項２９２に記載の方法。
  310. 核酸を、第１および第２種類のナノ粒子と同時に接触させる、請求項２９２に記載の方法。
  311. 核酸を、第２種類のナノ粒子と接触させる前に、第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと接触およびハイブリダイズさせる、請求項２９２に記載の方法。
  312. 第１種類のナノ粒子が基板に付けられる、請求項３１１に記載の方法。
  313. 核酸が二本鎖であり、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって三本鎖複合体が生じる、請求項２９２に記載の方法。
  314. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    認識オリゴヌクレオチドを付着させた請求項２５３〜２６５のいずれか一項に記載のある種類のナノ粒子を提供するステップであって、各ナノ粒子上の認識オリゴヌクレオチドは核酸の少なくとも２つの部分の配列に相補的な配列を有するステップと、
    核酸とナノ粒子を、ナノ粒子上の認識オリゴヌクレオチドを核酸の２つ以上の部分と有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させるステップと、
    ナノ粒子上の認識オリゴヌクレオチドと核酸のハイブリダイゼーションによって起こる検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  315. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    認識オリゴヌクレオチドを付着させた請求項２５３〜２６３のいずれか一項に記載の少なくとも２種類のナノ粒子を核酸と接触させるステップであって、第１種類のナノ粒子上の認識オリゴヌクレオチドは核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、第２種類のナノ粒子上の認識オリゴヌクレオチドは核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有し、前記接触が、ナノ粒子上の認識オリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    ナノ粒子上の認識オリゴヌクレオチドと核酸のハイブリダイゼーションによって起こる検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  316. 前記接触条件には凍結と融解が含まれる、請求項３１５に記載の方法。
  317. 前記接触条件には加熱が含まれる、請求項３１５に記載の方法。
  318. 検出可能な変化は固体表面上で観察される、請求項３１５に記載の方法。
  319. 検出可能な変化は肉眼で観察可能な色の変化である、請求項３１５に記載の方法。
  320. 色の変化が固体表面上で観察される、請求項３１９に記載の方法。
  321. ナノ粒子が金属ナノ粒子か半導体ナノ粒子である、請求項３１５に記載の方法。
  322. ナノ粒子が金から形成されている、請求項３２１に記載の方法。
  323. ナノ粒子に付着した認識オリゴヌクレオチドの、ナノ粒子に付着していない端部が、核酸とのナノ粒子上の認識オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに基づいて検出可能な変化を生成する分子によって標識される、請求項３１５に記載の方法。
  324. ナノ粒子が金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子であり、ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドは蛍光分子で標識される、請求項３２３に記載の方法。
  325. 核酸は第１部分と第２部分の間に位置する第３部分を有し、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列は、核酸の該第３部分に相補的な配列を有さず、
    核酸を、核酸の該第３部分に相補的な配列を有するフィラーオリゴヌクレオチドとさらに接触させ、前記接触が、フィラーオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる、請求項３１５に記載の方法。
  326. 核酸がウイルスＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項３１５に記載の方法。
  327. 核酸が疾患関連遺伝子である、請求項３１５に記載の方法。
  328. 核酸が細菌ＤＮＡである、請求項３１５に記載の方法。
  329. 核酸が真菌ＤＮＡである、請求項３１５に記載の方法。
  330. 核酸が合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、構造的に修飾された天然または合成ＲＮＡ、もしくは構造的に修飾された天然または合成ＤＮＡである、請求項３１５に記載の方法。
  331. 核酸が生物源のものである、請求項３１５に記載の方法。
  332. 核酸がポリメラーゼ連鎖反応増幅の産物である、請求項３１５に記載の方法。
  333. 核酸を第１と第２種類の共役体と同時に接触させる、請求項３１５に記載の方法。
  334. 核酸を、第２種類のナノ粒子と接触させる前に、第１種類のナノ粒子上の認識オリゴヌクレオチドと接触およびハイブリダイズさせる、請求項３１５に記載の方法。
  335. 第１種類のナノ粒子が基板に付けられる、請求項３３４に記載の方法。
  336. 核酸が二本鎖であり、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって三本鎖複合体が生じる、請求項３１５に記載の方法。
  337. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    （ａ）オリゴヌクレオチドを付着させた基板を核酸と接触させるステップであって、該オリゴヌクレオチドは前記核酸配列の第１部分に相補的な配列を有し、前記接触が、基板上のオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｂ）請求項２３７〜２４０のいずれか一項に記載の第１種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を、基板に結び付けた前記核酸と接触させるステップであって、共役体のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの少なくとも１種類は、前記核酸配列の第２部分に相補的な配列を有し、前記接触が、共役体のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｃ）検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  338. （ｄ）基板に結び付けた第１種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を、請求項２３７〜２４０のいずれか一項に記載の第２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と接触させるステップであって、第２種類の共役体のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの少なくとも１種類は、第１種類の共役体のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの少なくとも１種類の配列に相補的な配列を有するステップと、
    （ｅ）検出可能な変化を観察するステップと、をさらに含む請求項３３７に記載の方法。
  339. 第１種類の共役体のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種類が、第２種類の共役体のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種類の配列に相補的な配列を有し、
    （ｆ）基板に結び付けた第２種類の共役体を、第１種類の共役体と接触させるステップであって、前記接触が、第１および第２種類の共役体のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｇ）検出可能な変化を観察するステップと、をさらに含む請求項３３８に記載の方法。
  340. ステップ（ｄ）か、ステップ（ｄ）および（ｆ）かを、１または複数回繰り返し、検出可能な変化を観察する、請求項３３９に記載の方法。
  341. （ｄ）少なくとも２つの部分を含む配列を有するある種類の結合オリゴヌクレオチドを提供するステップであって、該第１部分は、第１種類の共役体のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの少なくとも１種類に相補的であるステップと、
    （ｅ）　結合オリゴヌクレオチドを基板に結び付けた第１種類の共役体と接触させるステップであって、前記接触が、結合オリゴヌクレオチドを第１種類の共役体のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｆ）請求項２３７〜２４０のいずれか一項に記載の第２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を提供するステップであって、第２種類の共役体のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの少なくとも１種類が、結合オリゴヌクレオチドの配列の第２部分に相補的な配列を有するステップと、
    （ｇ）基板に結び付けた結合オリゴヌクレオチドを第２種類の共役体と接触させるステップであって、前記接触が、第２種類の共役体のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドを結合オリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｈ）検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  342. （ｉ）基板に結び付けた第２種類の共役体を結合オリゴヌクレオチドと接触させるステップであって、前記接触が、結合オリゴヌクレオチドと第２種類の共役体のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    ｊ）基板に結び付けた結合オリゴヌクレオチドを、第１種類の共役体と接触させるステップであって、前記接触が、第１種類の共役体のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと結合オリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｋ）検出可能な変化を観察するステップと、をさらに含む請求項３４１に記載の方法。
  343. ステップ（ｅ）および（ｇ）か、ステップ（ｅ），（ｇ），（ｉ）ならびに（ｊ）かを１または複数回繰り返し、検出可能な変化を観察する、請求項３４２に記載の方法。
  344. 基板が透明な基板または不透明な白色基板である、請求項３３７に記載の方法。
  345. 検出可能な変化は基板上における暗色領域の形成である、請求項３４４に記載の方法。
  346. 共役体のナノ粒子が金属ナノ粒子か半導体ナノ粒子である、請求項３３７に記載の方法。
  347. 共役体のナノ粒子が金または銀から形成されている、請求項３４６に記載の方法。
  348. 基板には、１つの核酸中の複数の部分の検出、複数の異なる核酸の検出、またはそれらの両方の検出を可能にするようアレイ状に複数の種類のオリゴヌクレオチドが付着されている、請求項３３７に記載の方法。
  349. 基板を銀染料と接触させて検出可能な変化を生成する、請求項３３７に記載の方法。
  350. 基板を銀染料と接触させて検出可能な変化を生成する、請求項３４８に記載の方法。
  351. 検出可能な変化は光学式スキャナで観察される、請求項３３７に記載の方法。
  352. 前記光学式スキャナが平台型スキャナである、請求項３５１に記載の方法。
  353. 前記スキャナをグレースケール測定値を計算可能なソフトウエアを搭載したコンピュータに連結し、グレースケール測定値を計算して、検出した核酸の定量的測定を提供する、請求項３５１に記載の方法。
  354. 基板に付着したオリゴヌクレオチドが２つの電極間に配置され、共役体のナノ粒子は導電体の材料から形成され、検出可能な変化は導電率の変化である、請求項３３７に記載の方法。
  355. 電極は金から形成され、ナノ粒子は金から形成される、請求項３５４に記載の方法。
  356. 基板を銀染料と接触させて導電率の変化を生じさせる、請求項３５４に記載の方法。
  357. 基板にアレイ状に付着している複数のオリゴヌクレオチドの各々が２つの電極間に配置され、ナノ粒子は導電体の材料から形成され、検出可能な変化は導電率の変化である、請求項３４８に記載の方法。
  358. 電極は金から形成され、ナノ粒子は金から形成される、請求項３５７に記載の方法。
  359. 基板を銀染料と接触させて導電率の変化を生じさせる、請求項３５７に記載の方法。
  360. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    （ａ）オリゴヌクレオチドを付着させた基板と核酸を接触させるステップであって、該オリゴヌクレオチドは前記核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、前記接触は、基板上のオリゴヌクレオチドと核酸を有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｂ）１または複数の種類の認識オリゴヌクレオチドを付着させた請求項２４３〜２５０のいずれか一項に記載の第１種類のナノ粒子を、基板に結び付けた前記核酸と接触させるステップであって、該１または複数の種類の認識オリゴヌクレオチドの少なくとも１種類は前記核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有し、前記接触が、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｃ）検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  361. （ｄ）認識オリゴヌクレオチドを付着させた請求項２４３〜２５０のいずれか一項に記載の第２種類のナノ粒子を、基板に結び付けた第１種類のナノ粒子と接触させるステップであって、第２種類のナノ粒子上の認識オリゴヌクレオチドの少なくとも１種類が、第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種類の配列に相補的な配列を有し、前記接触が、第１および第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｅ）検出可能な変化を観察するステップと、をさらに含む請求項３６０に記載の方法。
  362. 第１種類のナノ粒子上の認識オリゴヌクレオチドの少なくとも１種類が、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種類の配列に相補的な配列を有し、
    （ｆ）基板に結び付けた第２種類のナノ粒子を第１種類のナノ粒子と接触させるステップであって、前記接触が、第１および第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｇ）検出可能な変化を観察するステップと、をさらに含む請求項３６０に記載の方法。
  363. ステップ（ｄ）か、ステップ（ｄ）および（ｆ）かを１または複数回繰り返し、検出可能な変化を観察する、請求項３６２に記載の方法。
  364. （ｄ）少なくとも２つの部分を含む配列を有するある種類の結合オリゴヌクレオチドを提供するステップであって、該第１部分は第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種類に相補的であるステップと、
    （ｅ）基板に結び付けた第１種類のナノ粒子と結合オリゴヌクレオチドを接触させるステップであって、前記接触が、結合オリゴヌクレオチドを第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｆ）認識オリゴヌクレオチドを付着させた請求項２４３〜２５０のいずれか一項に記載の第２種類のナノ粒子を提供するステップであって、第２種類のナノ粒子上の認識オリゴヌクレオチドの少なくとも１種類は、結合オリゴヌクレオチドの配列の第２部分に相補的な配列を有するステップと、
    （ｇ）基板に結び付けた結合オリゴヌクレオチドを第２種類のナノ粒子と接触させるステップであって、前記接触が、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを結合オリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｈ）検出可能な変化を観察するステップと、をさらに含む請求項３６０に記載の方法。
  365. （ｉ）基板に結び付けた第２種類のナノ粒子を結合オリゴヌクレオチドと接触させるステップであって、前記接触が、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを結合オリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｊ）基板に結び付けた結合オリゴヌクレオチドを第１種類のナノ粒子と接触させるステップであって、前記接触が、結合オリゴヌクレオチドを第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｋ）検出可能な変化を観察するステップと、をさらに含む請求項３６４に記載の方法。
  366. ステップ（ｅ）および（ｇ）か、ステップ（ｅ），（ｇ），（ｉ），ならびに（ｊ）かを１または複数回繰り返し、検出可能な変化を観察する、請求項３６５に記載の方法。
  367. 基板が透明な基板または不透明な白色基板である、請求項３６０に記載の方法。
  368. 検出可能な変化は基板上における暗色領域の形成である、請求項３６７に記載の方法。
  369. ナノ粒子が金属ナノ粒子か半導体ナノ粒子である、請求項３６０に記載の方法。
  370. ナノ粒子が金または銀から形成されている、請求項３６９に記載の方法。
  371. 基板には、１つの核酸中の複数の部分の検出、複数の異なる核酸の検出、またはそれらの両方の検出を可能にするようアレイ状に複数の種類のオリゴヌクレオチドが付着されている、請求項３６０に記載の方法。
  372. 基板を銀染料と接触させて検出可能な変化を生成する、請求項３６０に記載の方法。
  373. 基板を銀染料と接触させて検出可能な変化を生成する、請求項３７１に記載の方法。
  374. 検出可能な変化は光学式スキャナで観察される、請求項３６０に記載の方法。
  375. 前記光学式スキャナが平台型スキャナである、請求項３７５に記載の方法。
  376. 前記スキャナをグレースケール測定値を計算可能なソフトウエアを搭載したコンピュータに連結し、グレースケール測定値を計算して、検出した核酸の定量的測定を提供する、請求項３７５に記載の方法。
  377. 基板に付着したオリゴヌクレオチドが２つの電極間に配置され、共役体のナノ粒子は導電体の材料から形成され、検出可能な変化は導電率の変化である、請求項３６０に記載の方法。
  378. 電極は金から形成され、ナノ粒子は金から形成される、請求項３７８に記載の方法。
  379. 基板を銀染料と接触させて導電率の変化を生じさせる、請求項３７８に記載の方法。
  380. 基板にアレイ状に付着している複数のオリゴヌクレオチドの各々が２つの電極間に配置され、ナノ粒子は導電体の材料から形成され、検出可能な変化は導電率の変化である、請求項３７１に記載の方法。
  381. 電極は金から形成され、ナノ粒子は金から形成される、請求項３８１に記載の方法。
  382. 基板を銀染料と接触させて導電率の変化を生じさせる、請求項３８１に記載の方法。
  383. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    （ａ）オリゴヌクレオチドを付着させた基板と核酸を接触させるステップであって、該オリゴヌクレオチドは前記核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、前記接触が、基板上のオリゴヌクレオチドと核酸を有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｂ）１または複数の種類の認識オリゴヌクレオチドを付着させた請求項２５３〜２６３のいずれか一項に記載の第１種類のナノ粒子を、基板に結び付けた前記核酸と接触させるステップであって、該１または複数の種類の認識オリゴヌクレオチドの少なくとも１種類は前記核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有し、前記接触が、ナノ粒子上の認識オリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｃ）検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法。
  384. （ｄ）基板に結び付けた第１種類のナノ粒子を、認識オリゴヌクレオチドが付着した請求項２５３〜２６３のいずれか一項に記載の第２種類のナノ粒子と接触させるステップであって、第２種類のナノ粒子上の認識オリゴヌクレオチドの少なくとも１種類が、第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種類の配列に相補的な配列を有し、前記接触が、第１および第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｅ）検出可能な変化を観察するステップと、をさらに含む請求項３８４に記載の方法。
  385. 第１種類のナノ粒子上の認識オリゴヌクレオチドの少なくとも１種類が、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種類の配列に相補的な配列を有し、
    （ｆ）基板に結び付けた第２種類のナノ粒子を、第１種類のナノ粒子と接触させるステップであって、前記接触が、第１および第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｇ）検出可能な変化を観察するステップと、をさらに含む請求項３８５に記載の方法。
  386. ステップ（ｄ）か、ステップ（ｄ）および（ｆ）かを１または複数回繰り返し、検出可能な変化を観察する、請求項３８６に記載の方法。
  387. （ｄ）少なくとも２つの部分を含む配列を有するある種類の結合オリゴヌクレオチドを提供するステップであって、該第１部分は第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種類に相補的であるステップと、
    （ｅ）結合オリゴヌクレオチドを、基板に結び付けた第１種類のナノ粒子と接触させるステップであって、前記接触が、結合オリゴヌクレオチドを第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｆ）認識オリゴヌクレオチドが付着した請求項２５３〜２６３のいずれか一項に記載の第２種類のナノ粒子を提供するステップであって、第２種類のナノ粒子上の認識オリゴヌクレオチドの少なくとも１種類が結合オリゴヌクレオチドの配列の第２部分に相補的な配列を有するステップと、
    （ｇ）基板に結び付けた結合オリゴヌクレオチドを第２種類のナノ粒子と接触させるステップであって、前記ステップが、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを結合オリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｈ）検出可能な変化を観察するステップと、をさらに含む請求項３８６に記載の方法。
  388. （ｉ）基板に結び付けた第２種類のナノ粒子を結合オリゴヌクレオチドと接触させるステップであって、前記接触が、結合オリゴヌクレオチドを第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｊ）　基板に結び付けた結合オリゴヌクレオチドを第１種類のナノ粒子と接触させるステップであって、前記接触が、第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを結合オリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｋ）検出可能な変化を観察するステップと、をさらに含む請求項３８４に記載の方法。
  389. ステップ（ｅ）および（ｇ）か、ステップ（ｅ），（ｇ），（ｉ），ならびに（ｊ）かを１または複数回繰り返し、検出可能な変化を観察する、請求項３８９に記載の方法。
  390. 基板が透明な基板または不透明な白色基板である、請求項３８４に記載の方法。
  391. 検出可能な変化は基板上における暗色領域の形成である、請求項３９１に記載の方法。
  392. ナノ粒子が金属ナノ粒子か半導体ナノ粒子である、請求項３８４に記載の方法。
  393. ナノ粒子が金または銀から形成されている、請求項３９３に記載の方法。
  394. 基板には、１つの核酸中の複数の部分の検出、複数の異なる核酸の検出、またはそれらの両方の検出を可能にするようアレイ状に複数の種類のオリゴヌクレオチドが付着されている、請求項３８４に記載の方法。
  395. 基板を銀染料と接触させて検出可能な変化を生成する、請求項３８４に記載の方法。
  396. 基板を銀染料と接触させて検出可能な変化を生成する、請求項３９５に記載の方法。
  397. 検出可能な変化は光学式スキャナで観察される、請求項３８４の方法
  398. 前記光学式スキャナが平台型スキャナである、請求項３９８に記載の方法。
  399. 前記スキャナをグレースケール測定値を計算可能なソフトウエアを搭載したコンピュータに連結し、グレースケール測定値を計算して、検出した核酸の定量的測定を提供する、請求項３９８に記載の方法。
  400. 基板に付着したオリゴヌクレオチドが２つの電極間に配置され、共役体のナノ粒子は導電体の材料から形成され、検出可能な変化は導電率の変化である、請求項３８４に記載の方法は。
  401. 電極は金から形成され、ナノ粒子は金から形成される、請求項４０１に記載の方法。
  402. 基板を銀染料と接触させて導電率の変化を生じさせる、請求項４０１に記載の方法。
  403. 基板にアレイ状に付着している複数のオリゴヌクレオチドの各々が２つの電極間に配置され、ナノ粒子は導電体の材料から形成され、検出可能な変化は導電率の変化である、請求項３９７に記載の方法。
  404. 電極は金から形成され、ナノ粒子は金から形成される、請求項４０４に記載の方法。
  405. 基板を銀染料と接触させて導電率の変化を生じさせる、請求項４０４に記載の方法。
  406. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    （ａ）オリゴヌクレオチドを付着させた基板と核酸を接触させるステップであって、該オリゴヌクレオチドは一対の電極の間に配置されると共に、該オリゴヌクレオチドは前記核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、前記接触が、基板上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｂ）　基板に結び付けた前記核酸を第１種類のナノ粒子と接触させるステップであって、前記ナノ粒子は電気を伝導可能な材料から形成されていると共に、前記ナノ粒子には１または複数の種類のオリゴヌクレオチドが付着しており、オリゴヌクレオチドの少なくとも１種類は、前記核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有し、前記接触が、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｃ）導電率の変化を検出するステップと、から成る方法。
  407. 基板には、１つの核酸中の複数の部分の検出、複数の異なる核酸の検出、またはそれらの両方の検出を可能にするようアレイ状に複数対の電極が配置されており、前記電極対の各々は、対の間に基板に付着させたある種類のオリゴヌクレオチドを有する、請求項４０７に記載の方法。
  408. ナノ粒子が金属から形成されている、請求項４０７に記載の方法。
  409. ナノ粒子が金または銀から形成されている、請求項４０７に記載の方法。
  410. 基板を銀染料と接触させて導電率の変化を生じさせる、請求項４０７に記載の方法。
  411. （ｄ）基板に結び付けた第１種類のナノ粒子を、第２種類のナノ粒子と接触させるステップであって、前記ナノ粒子は電気を伝導可能な材料から形成されていると共に、前記ナノ粒子には１または複数の種類のオリゴヌクレオチドが付着しており、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種類は、第１種類のナノ粒子上の１または複数の種類のオリゴヌクレオチドのうちの１種類の配列に相補的な配列を有し、前記接触が、第１および第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｅ）導電率の変化を検出するステップと、をさらに含む請求項４０７に記載の方法。
  412. 第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種類が、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種類の配列に相補的な配列を有し、
    （ｆ）基板に結び付けた第２種類のナノ粒子を第１種類のナノ粒子と接触させるステップであって、前記接触が、第１および第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｇ）伝導率の変化を検出するステップと、をさらに含む請求項４１２に記載の方法。
  413. ステップ（ｄ）か、ステップ（ｄ）および（ｆ）かを１または複数回繰り返し、導電率の変化を検出する、請求項４１３に記載の方法。
  414. （ｄ）基板に結び付けた第１種類のナノ粒子を、オリゴヌクレオチドが付着した凝集体プローブと接触させるステップであって、凝集体プローブのナノ粒子が電気を伝導可能な材料から形成されており、凝集体上のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種類は、第１種類のナノ粒子上の１または複数の種類のオリゴヌクレオチドのうちの１種類の配列に相補的な配列を有し、前記接触が、凝集体プローブ上のオリゴヌクレオチドと第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｅ）導電率の変化を検出するステップと、をさらに含む請求項４０７に記載の方法。
  415. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    （ａ）オリゴヌクレオチドを付着させた基板を核酸と接触させるステップであって、該オリゴヌクレオチドは一対の電極の間に配置されると共に、該オリゴヌクレオチドは前記核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、前記接触が、基板上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｂ）基板に結び付けた前記核酸を、オリゴヌクレオチドを付着させた凝集体プローブと接触させるステップであって、凝集体プローブ上のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種類が、前記核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有し、凝集体プローブのナノ粒子は電気を伝導可能な材料から形成されており、前記接触が、凝集体プローブ上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、
    （ｃ）導電率の変化を検出するステップと、から成る方法。
  416. 核酸の検出方法であって、基板上で行われ、かつ核酸の存在、量、またはその両方を光学式スキャナで検出するステップから成る方法。
  417. 前記光学式スキャナが平台型スキャナである、請求項４１７に記載の方法。
  418. 前記スキャナをグレースケール測定値を計算可能なソフトウエアを搭載したコンピュータに連結し、グレースケール測定値を計算して、検出した核酸の定量的測定を提供する、請求項４１７に記載の方法。
  419. 前記スキャナをグレースケール測定値を計算可能なソフトウエアを搭載したコンピュータに連結し、核酸の存在、核酸の量、またはその両方を定性的に決定する、請求項４１７に記載の方法。
  420. 請求項２３７〜２４２のいずれか一項に記載のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体が入った容器を含むキット。
  421. 請求項２４３〜２６５のいずれか一項に記載のナノ粒子が入った容器を含むキット。
  422. 少なくとも１対の電極が付着された基板を備え、該電極の間に基板に付着させたオリゴヌクレオチドが存在する、キット。
  423. 基板には、１つの核酸中の複数の部分の検出、複数の異なる核酸の検出、またはそれらの両方の検出を可能にするようアレイ状に複数対の電極が付着されている、請求項４２３に記載のキット。
  424. ナノファブリケーションの方法であって、
    選択配列を有する少なくとも１種類の連結オリゴヌクレオチドを提供するステップであって、各種類の連結オリゴヌクレオチドの配列は少なくとも２つの部分を有するステップと、
    請求項２３７〜２４２のいずれか一項に記載の１または複数の種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を提供するステップであって、該１または複数の種類の共役体の各ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドが連結オリゴヌクレオチドの一部分の配列に相補的な配列を有するステップと、
    共役体のナノ粒子に付着させたオリゴヌクレオチドを連結オリゴヌクレオチドに有効にハイブリダイズさせ、その結果、共役体のナノ粒子がオリゴヌクレオチドコネクタによって一緒に纏められた所望のナノ材料またはナノ構造が形成される条件下で、連結オリゴヌクレオチドと共役体を接触させるステップと、から成る方法。
  425. ナノファブリケーションの方法であって、
    選択配列を有する少なくとも１種類の連結オリゴヌクレオチドを提供するステップであって、各種類の連結オリゴヌクレオチドの配列は少なくとも２つの部分を有するステップと、
    請求項２４３〜２６５のいずれか一項に記載の１または複数の種類のナノ粒子を提供するステップであって、該１または複数の種類の各々のナノ粒子上の認識オリゴヌクレオチドは連結オリゴヌクレオチドの部分の配列に相補的な配列を有するステップと、
    ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを連結オリゴヌクレオチドに有効にハイブリダイズさせ、その結果、ナノ粒子がオリゴヌクレオチドコネクタによって一緒に纏められた所望のナノ材料またはナノ構造が形成される条件下で、連結オリゴヌクレオチドとナノ粒子と接触させるステップと、から成る方法。
  426. ナノファブリケーションの方法であって、
    請求項２３７〜２４２のいずれか一項に記載の少なくとも２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を提供するステップであって、
    第１種類の共役体のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドは、第２種類の共役体のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有し、
    第２種類の共役体のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドは、第１種類の共役体のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有するステップと、
    共役体のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが互いに有効にハイブリダイズして、その結果、所望のナノ材料またはナノ構造が形成される条件下で、第１および第２種類の共役体を接触させるステップと、から成る方法。
  427. ナノファブリケーションの方法であって、
    請求項２４３〜２６５のいずれか一項に記載の少なくとも２種類のナノ粒子を提供するステップであって、
    第１種類のナノ粒子上の認識オリゴヌクレオチドは、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有し、
    第２種類のナノ粒子上の認識オリゴヌクレオチドは、第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有し、
    ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが互いに有効にハイブリダイズして、その結果、所望のナノ材料またはナノ構造が形成される条件下で、第１および第２種類のナノ粒子を接触させるステップと、から成る方法。
  428. 請求項２３７〜２４２のいずれか一項に記載のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体から構成されたナノ材料またはナノ構造であって、ナノ粒子がオリゴヌクレオチドコネクタによって一緒に纏められているナノ材料またはナノ構造。
  429. 請求項２４３〜２６５のいずれか一項に記載のナノ粒子から構成されたナノ材料またはナノ構造であって、ナノ粒子がオリゴヌクレオチドコネクタによって一緒に纏められているナノ材料またはナノ構造。
  430. 少なくとも２つの部分を有する選択核酸を他の核酸から分離する方法であって、
    請求項２３７〜２４２のいずれか一項に記載の２つ種類以上のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を提供するステップであって、該２種類以上の共役体の各々のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドは選択核酸の該少なくとも２つの部分のうちの１つの配列に相補的な配列を有するステップと、
    共役体のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを選択核酸と有効な条件下でハイブリダイズさせ、その結果、選択核酸にハイブリダイズした共役体が凝集して沈降するように、核酸および共役体を接触させるステップと、から成る方法。
  431. 少なくとも２つの部分を有する選択核酸を他の核酸から分離する方法であって、
    請求項２４３〜２６５のいずれか一項に記載の２種類以上のナノ粒子を提供するステップであって、前記２種類以上のナノ粒子の各々の上のオリゴヌクレオチドは、選択核酸の該少なくとも２つの部分のうちの１つの配列に相補的な配列を有するステップと、
    ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを選択核酸と有効な条件下でハイブリダイズさせ、その結果、選択核酸にハイブリダイズしたナノ粒子が凝集して沈降するように、核酸とナノ粒子を接触させるステップと、から成る方法。
  432. オリゴヌクレオチドが付着したナノ粒子である、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体であって、該オリゴヌクレオチドが、ナノ粒子に結合可能な共有結合する環式ジスルフィド官能基を有する、共役体。
  433. オリゴヌクレオチドが付着したナノ粒子である、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体であって、該オリゴヌクレオチドが、ナノ粒子に結合可能な共有結合するポリチオール官能基を有する、共役体。
  434. オリゴヌクレオチドが付着したナノ粒子である、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体であって、該オリゴヌクレオチドが、ナノ粒子に結合可能な共有結合するジスルフィド官能基を有し、該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、核酸または別のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有する、共役体。
  435. オリゴヌクレオチドが付着したナノ粒子である、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体であって、該オリゴヌクレオチドが、ナノ粒子に結合可能な共有結合するポリチオール官能基を有し、該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、核酸または別のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有する、共役体。
  436. 共役体が安定するのに十分な表面密度で前記オリゴヌクレオチドが存在する、請求項４３５または４３６に記載の共役体。
  437. オリゴヌクレオチドが少なくとも１０ピコモル／ｃｍの表面密度でナノ粒子表面に存在する、請求項４３７に記載の共役体。
  438. オリゴヌクレオチドが少なくとも１５ピコモル／ｃｍ２の表面密度でナノ粒子表面に存在する、請求項４３８に記載の共役体。
  439. オリゴヌクレオチドが約１５ピコモル／ｃｍ２〜約４０ピコモル／ｃｍ２の表面密度でナノ粒子表面に存在する、請求項４３９に記載の共役体。
  440. ナノ粒子が金属ナノ粒子か半導体ナノ粒子である、請求項４３５または４３６に記載の共役体。
  441. ナノ粒子が金ナノ粒子である、請求項４４１に記載の共役体。
  442. オリゴヌクレオチドが少なくとも１種類の認識オリゴヌクレオチドを含み、該認識部分が、核酸または別のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有する、請求項４３５または４３６に記載の共役体。
  443. 各認識オリゴヌクレオチドがスペーサー部分と認識部分を有し、該スペーサー部分はナノ粒子に結合可能であるように設計されている、請求項４４３に記載の共役体。
  444. スペーサー部分には、スペーサー部分をナノ粒子に結び付ける環式ジスルフィド官能基を有する部分が、共有結合によって結び付けられる、請求項４４４に記載の共役体。
  445. スペーサー部分には、スペーサー部分をナノ粒子に結び付けるポリチオール官能基を有する部分が、共有結合によって結び付けられる、請求項４４４に記載の共役体。
  446. スペーサー部分が少なくとも約１０ヌクレオチドを含む、請求項４４２に記載の共役体。
  447. スペーサー部分が約１０〜約３０のヌクレオチドまで含む、請求項４４７に記載の共役体。
  448. スペーサーのヌクレオチドの塩基が、すべてアデニン、すべてチミン、すべてシトシン、すべてウラシル、またはすべてグアニンである、請求項４４８に記載の共役体。
  449. ある種類の希釈剤オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項４３５または４３６に記載の共役体。
  450. 希釈剤オリゴヌクレオチドが、認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分に含まれるのとほぼ同じ数のヌクレオチドを含んでいる、請求項４５０に記載のナノ粒子。
  451. 希釈剤オリゴヌクレオチドの配列が認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分の配列と同じである、請求項４５１に記載のナノ粒子。
  452. ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成するための、ナノ粒子へのオリゴヌクレオチドの結合方法であって、
    ナノ粒子に結合可能な環式スルフィド官能基が共有結合されたオリゴヌクレオチドを提供するステップと、
    少なくともオリゴヌクレオチドのうちの一部をナノ粒子と結合させてナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成するのに有効な条件下で、オリゴヌクレオチドとナノ粒子を接触させるステップと、から成る方法。
  453. ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成するための、ナノ粒子へのオリゴヌクレオチドの結合方法であって、
    ナノ粒子に結合可能なポリチオール官能基が共有結合されたオリゴヌクレオチドを提供するステップと、
    少なくともオリゴヌクレオチドのうちの一部をナノ粒子と結合させてナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成するのに有効な条件下で、オリゴヌクレオチドとナノ粒子を接触させるステップと、から成る方法。
  454. ナノ粒子が金属ナノ粒子か半導体ナノ粒子である、請求項４５４または４５５項に記載の方法。
  455. ナノ粒子が金ナノ粒子である、請求項４５５に記載の方法。
  456. オリゴヌクレオチドが少なくとも１種類の認識オリゴヌクレオチドを含み、各認識オリゴヌクレオチドがスペーサー部分と認識部分を有し、該スペーサー部分には、ナノ粒子に結合可能な官能基を有する部分が共有結合によって結び付けられている、請求項４５３または４５４に記載の方法。
  457. スペーサー部分が少なくとも約１０ヌクレオチドを含む、請求項４５７に記載の方法。
  458. スペーサー部分が約１０〜約３０のヌクレオチドを含む、請求項４５８に記載の方法。
  459. スペーサーのヌクレオチドの塩基が、すべてアデニン、すべてチミン、すべてシトシン、すべてウラシル、またはすべてグアニンである、請求項４５９に記載の方法。
  460. オリゴヌクレオチドがある種類の希釈剤オリゴヌクレオチドをさらに含み、前記オリゴヌクレオチドと前記ナノ粒子を、前記オリゴヌクレオチドのうちの各種類のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部がナノ粒子と結合して、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成するのに有効な条件下で接触させる、請求項４５７に記載の方法。
  461. 希釈剤オリゴヌクレオチドが、認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分に含まれるのとほぼ同じ数のヌクレオチドを含む、請求項４６１に記載の方法。
  462. 希釈剤オリゴヌクレオチドの配列が認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分の配列と同じである、請求項４６２に記載の方法。
  463. オリゴヌクレオチドが少なくとも２種類の認識オリゴヌクレオチドを含む、請求項４５７に記載の方法。
  464. ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成するための、荷電ナノ粒子へのオリゴヌクレオチドの結合方法であって、
    ナノ粒子に結合可能な環式ジスルフィド官能基が共有結合で結び付けられたオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、該オリゴヌクレオチドが、
    ある種類の認識オリゴヌクレオチドと、
    ある種類の希釈剤オリゴヌクレオチドとを含むステップと、
    前記オリゴヌクレオチドのうちの各種類のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部がナノ粒子と結合するのに十分な期間、水中でオリゴヌクレオチドとナノ粒子を接触させるステップと、
    前記水に少なくとも１つの塩を加えて塩溶液を作製するステップであって、該塩溶液のイオン強度は、ナノ粒子に対するオリゴヌクレオチドの静電引力または静電斥力、ならびに互いに対するオリゴヌクレオチドの静電斥力を少なくとも部分的に克服するのに十分な強度であるステップと、
    前記オリゴヌクレオチドのうちの各種類のオリゴヌクレオチドのさらなるオリゴヌクレオチドがナノ粒子に結合して、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成するのに十分な追加期間、塩溶液中でオリゴヌクレオチドとナノ粒子を接触させるステップと、から成る方法。
  465. ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成するための、荷電ナノ粒子への結合オリゴヌクレオチドの結合方法であって、
    ナノ粒子に結合可能なポリチオール官能基が共有結合で結び付けられたオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、該オリゴヌクレオチドが、
    ある種類の認識オリゴヌクレオチド、
    ある種類の希釈剤オリゴヌクレオチドとを含むステップと、
    前記オリゴヌクレオチドのうちの各種類のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部がナノ粒子と結合するのに十分な期間、水中でオリゴヌクレオチドとナノ粒子を接触させるステップと、
    前記水に少なくとも１つの塩を加えて塩溶液を作製するステップであって、該塩溶液のイオン強度は、ナノ粒子に対するオリゴヌクレオチドの静電引力または静電斥力、ならびに互いに対するオリゴヌクレオチドの静電斥力を少なくとも部分的に克服するのに十分な強度であるステップと、
    前記オリゴヌクレオチドのうちの各種類のオリゴヌクレオチドのさらなるオリゴヌクレオチドがナノ粒子に結合して、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成するのに十分な追加期間、塩溶液中でオリゴヌクレオチドとナノ粒子を接触させるステップと、から成る方法。
  466. ナノ粒子が金属ナノ粒子か半導体ナノ粒子である、請求項４６５または４６６に記載の方法。
  467. ナノ粒子が金ナノ粒子である請求項４６７に記載の方法。
  468. すべての塩が１回の追加で水に加えられる、請求項４６５または４６６に記載の方法。
  469. 塩が時間の経過と共に徐々に加えられる、請求項４６５または４６６に記載の方法。
  470. 前記塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、アンモニア、塩化物、ナトリウム、酢酸塩、酢酸アンモニウム、これらの塩の２以上の組合せ、リン酸緩衝液中のこれらの塩の１つ、および、リン酸緩衝液中のこれらの塩の２以上の組合せから成る群から選択される、請求項４６５または４６６に記載の方法。
  471. 前記塩がリン酸緩衝液中の塩化ナトリウムである、請求項４７１に記載の方法。
  472. 少なくとも１０ピコモル／ｃｍ２の表面密度でナノ粒子表面に存在するオリゴヌクレオチドを有するナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体が生成される、請求項４６５または４６６に記載の方法。
  473. オリゴヌクレオチドが少なくとも１５ピコモル／ｃｍ２の表面密度でナノ粒子表面に存在する、請求項４７３に記載の方法。
  474. オリゴヌクレオチドが約１５ピコモル／ｃｍ２〜約４０ピコモル／ｃｍ２の表面密度でナノ粒子表面に存在する、オリゴヌクレオチドが上に存在する請求項４７４に記載の方法。
  475. 各認識オリゴヌクレオチドがスペーサー部分と認識部分を有し、スペーサー部分にはナノ粒子に結合可能な環式ジスルフィド官能基を有する部分が付着されている、請求項４６５に記載の方法。
  476. 各認識オリゴヌクレオチドがスペーサー部分と認識部分を有し、スペーサー部分にはナノ粒子に結合可能なポリチオール官能基を有する部分が付着されている、請求項４６６に記載の方法。
  477. スペーサー部分が少なくとも約１０ヌクレオチドを含む、請求項４７６または４７７に記載の方法。
  478. スペーサー部分約１０〜約３０のヌクレオチドを含む、請求項４７８に記載の方法。
  479. スペーサーのヌクレオチドの塩基が、すべてアデニン、すべてチミン、すべてシトシン、すべてウラシル、またはすべてグアニンである、請求項４７６または４７７に記載の方法。
  480. 希釈剤オリゴヌクレオチドが、認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分に含まれるのとほぼ同じ数のヌクレオチドを含む、請求項４７６または４７７に記載の方法。
  481. 希釈剤オリゴヌクレオチドの配列が認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分の配列と同じである、請求項４８１に記載の方法。
  482. オリゴヌクレオチドが少なくとも２種類の認識オリゴヌクレオチドを含む、請求項４７６または４７７に記載の方法。
  483. ナノ粒子に結合可能な、共有結合した環式ジスルフィド官能基を有するオリゴヌクレオチド。
  484. ナノ粒子に結合可能な、共有結合したポリチオール官能基を有するオリゴヌクレオチド。
  485. オリゴヌクレオチドと環式ジスルフィド官能基の間に大きな疎水基が位置する、請求項４３３、４３５、４４５、４４６、４５３、４６５および４８４に記載の組成物。
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