JP2004501110A - 細胞選択用試薬および使用方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、遊離型のペプチドをこのペプチドに特異的な第２のリガンドを離脱させることができる、ペプチドを含むペプチド−リガンド接合体を提供する。本発明はまた、細胞を選択する方法を提供する。本方法は、細胞集団をペプチド−リガンド接合体に接触させ、該接合体がペプチドに特異的な第２のリガンドを離脱させることができるペプチドに接合した集団中の細胞に特異的な第１のリガンドを含み、これにより細胞−接合体複合体を形成し、該ペプチド−リガンド接合体に第２のリガンドを接触させ、細胞−接合体複合体を単離することを含む。本方法は、さらに、遊離型のペプチドを加えて複合体から細胞を放出させる工程を含むことができる。本発明はまた、２つまたはそれ以上の特異的に単離された細胞を含む細胞の亜集団および細胞亜集団を単離する方法を提供する。本発明は、さらに、ペプチド−リガンド接合体を使用した病態の診断法を提供する。本発明は、さらに、ペプチドおよび抗体に特異的な抗体を離脱させることができるペプチドを含む細胞を単離するためのキットを提供する。

Description

【０００１】
発明の背景
本発明は、一般に、細胞を陽性選択する方法、より詳細には、集団から細胞を陽性選択する方法に関する。
【０００２】
希少な細胞型の高純度の単離には、細胞生物学の研究に不可欠であり、分子医学における適用に重要である。細胞関連疾患の診断には、たとえ細胞が希少であっても各細胞の検出、単離、および分析するための方法を必要とする。
【０００３】
細胞に基づく治療は、血液および骨髄などの不均一な細胞集団からの１つまたはそれ以上の特異的細胞表現型の選択をも含み得る。例えば、特異的細胞型の単離は、治療遺伝子を細胞に導入し、その結果患者に導入して治療遺伝子または治療タンパク質を送達させる遺伝子治療への適用に有用である。単離幹細胞は、免疫無防備状態の患者への移植のための治療としても使用されている。幹細胞移植は、特に、治療中に損傷した免疫系組織を補償するための高用量化学療法を受けている癌患者に有用である。
【０００４】
細胞選択技術は、一般に、大きく２つのカテゴリー（陰性細胞選択および陽性細胞選択）に分類される。陰性細胞選択は、集団からの選択した細胞表現型の除去を含む。陽性細胞選択は、より大きい不均一集団からの特異的細胞表現型の選択または単離を含む。
【０００５】
特定の細胞型に特異的な抗体の使用が陽性細胞選択に適用されている。細胞特異的抗体を使用して細胞集団から特定の細胞を有効に単離することができる一方で、さらなる使用のための結合細胞の放出は、特に細胞の生存度の維持において問題となり得る。ビーズに結合させた抗体に結合した細胞を放出する手法には、例えば、ｐＨおよび温度の変更、還元剤および／またはキレート剤の使用、およびプロテアーゼの使用が含まれる。しかし、これらの各手法は、細胞生存度の維持または治療に適用するためのその有用性の維持に関して不利である。例えば、細胞表面に結合する抗体は、細胞の生理学の変化を誘導し得る（ベラルディー（Ｂｅｒａｒｄｉ．）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６７、１０４−１０８（１９９５））。
【０００６】
細胞の陽性選択に有用な１つの方法は、特定の細胞および離脱ペプチドに特異的な抗体を使用する（１９９９年１０月１９日刊行の米国特許第５，９６８，７５３号）。この方法は、抗体に特異的に結合している細胞をペプチドで離脱して遊離の結合抗体である細胞を放出させることができるという点で有利である。しかし、このような方法は、所与の細胞に特異的な各抗体を予め結合した抗体−細胞複合体を離脱させるように機能するペプチドをスクリーニングすることが必要である。したがって、この方法は、各細胞型に特異的な抗体の同定および抗体に結合した細胞を離脱させることができるペプチドのスクリーニングを必要とする。
【０００７】
したがって、細胞を陽性選択する一方で細胞の生存度および治療に有用である方法、さらに、種々の細胞型の陽性選択に普遍的に適用することができる方法の必要性がある。本発明は、この必要性を満たし、さらにそれに関連する利点も提供する。
【０００８】
発明の概要
本発明によれば、遊離型のペプチドがペプチドに特異的な第２のリガンドを離脱させることができる、ペプチドを含むペプチド−リガンド接合体が得られる。ペプチド−リガンド接合体を、特定の細胞の陽性選択を行うために種々の細胞型に有利に適用することができる。ペプチド−リガンド接合体は、ペプチドに特異的な第２のリガンドを離脱させる能力に基づいて、種々の異なる細胞型に特異性を有する種々のリガンドに接合することができるペプチドを使用し、このようにして予め結合させたリガンド−細胞複合体を離脱させるように機能することができるペプチドについて各々が細胞特異的リガンドをスクリーニングする必要性をなくす。ペプチドが接合するリガンドは、標的分子（例えば、細胞表面受容体などの細胞表面上で発現する標的分子）に特異的に結合する抗体などの分子であり得る。
【０００９】
本発明はまた、細胞を選択する方法を提供する。この方法は、細胞集団をペプチド−リガンド接合体に接触させ、該接合体がペプチドに特異的な第２のリガンドを離脱させることができるペプチドに接合した該集団中の細胞に特異的な第１のリガンドを含み、それにより細胞−接合体複合体を形成する工程と；該ペプチド−リガンド接合体に該第２のリガンドを接触させる工程と；該細胞−接合体複合体を単離する工程とを含む。本発明の方法は、該細胞−接合体複合体を遊離型の該ペプチドに接触させ、それにより該細胞−接合体複合体から該細胞を放出させる工程をさらに含むことができる。本発明は、さらに、ペプチド−リガンド接合体を使用して集団由来の細胞を濃縮する方法を提供する。
【００１０】
本発明は、さらに、細胞亜集団を選択する方法を提供する。この方法は、細胞集団に、ペプチド−リガンド接合体を接触させ、該接合体が該集団中の第１の細胞に特異的な第１のリガンドを含み、該第１のリガンドがペプチド特異的リガンドを離脱させることができるペプチドに接合されており、それにより第１の細胞−接合体複合体が形成され；該集団中の第２の細胞に特異的な第２のリガンドと接触させ、それにより第２の細胞−第２のリガンド複合体を形成する工程と；ペプチド−リガンド接合体に該ペプチド特異的リガンドを接触させる工程と；該第１の細胞−接合体複合体および該第２の細胞−第２のリガンド複合体を単離する工程とを含む。本発明はまた、細胞亜集団の組成物を提供する。
【００１１】
本発明は、さらに、病態を診断する方法を提供する。この方法は、細胞集団を含む試料をペプチド−リガンド接合体に接触させ、該接合体がペプチドに特異的な第２のリガンドを離脱させることができるペプチドに接合した該集団中の細胞に特異的な第１のリガンドを含み、それにより細胞−接合体複合体を形成する工程と；該ペプチド−リガンド接合体に該第２のリガンドを接触させる工程と；該細胞−接合体複合体を単離する工程と；該複合体中の該細胞を同定し、該細胞が病態に関連する工程とを含む。
【００１２】
本発明は、さらに、細胞を単離するためのキットを提供する。このキットは、ペプチドおよび抗体に特異的な抗体を離脱させることができるペプチドを含む。本発明のキットを使用して、細胞に結合する任意の所望のリガンドにペプチド特異的な抗体を離脱させることができるペプチドを結合させることができる。
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明によれば、遊離型のペプチドがペプチドに特異的な第２のリガンドを離脱させることができる、第１のリガンドに接合したペプチドを含むペプチド−リガンド接合体が提供される。
【００１４】
本明細書中で使用されるように、「ペプチド−リガンド接合体」という用語は、リガンドに共有架橋結合した少なくとも１つのペプチドを含む分子を意味する。ペプチド−リガンド接合体は、リガンドのその結合パートナーへの結合が検出可能であるように元のリガンドのリガンド結合活性を全部または一部保持している。ペプチド−リガンド接合体を、本明細書中で開示される種々の化学的架橋剤を使用してペプチドとリガンドとを結合することによって作製することができる。
【００１５】
本発明のペプチド−リガンド接合体は、リガンドに共有結合した複数コピーのペプチド（例えば、２コピーまたはそれ以上、３コピーまたはそれ以上、４コピーまたはそれ以上、５コピーまたはそれ以上、６コピーまたはそれ以上、７コピーまたはそれ以上、８コピーまたはそれ以上、９コピーまたはそれ以上、１０コピーまたはそれ以上、１１コピーまたはそれ以上、１２コピーまたはそれ以上、１３コピーまたはそれ以上、１４コピーまたはそれ以上、１５コピーまたはそれ以上、１６コピーまたはそれ以上、１７コピーまたはそれ以上、１８コピーまたはそれ以上、１９コピーまたはそれ以上、または２０コピーまたはそれ以上のペプチド）を含むことができる。本発明のペプチド−リガンド接合体はまた、２５コピーまたはそれ以上、３０コピーまたはそれ以上、３５コピーまたはそれ以上、４０コピーまたはそれ以上、４５コピーまたはそれ以上、５０コピーまたはそれ以上、７５コピーまたはそれ以上、さらに１００コピーまたはそれ以上のペプチドを含むことができる。リガンドがその結合パートナーの特異的結合活性を保持する限り、任意のコピー数のペプチドをリガンドに接合することができることが理解される。当業者は、リガンドへの種々の量のペプチドの結合および集団から細胞を単離する方法のために至適化したペプチドの数または範囲の決定によって本発明のペプチド−リガンド接合体を容易に至適化することができる。本明細書中で使用されるように、「ペプチド−リガンド接合体」という用語は、ペプチドがペプチド結合を介してリガンドに直線状に結合して１つの直鎖ポリペプチドを形成する融合ポリペプチドを特異的に排除する。
【００１６】
本明細書中で使用されるように、「ペプチド」または「ポリペプチド」という用語は、２つまたはそれ以上のアミノ酸のペプチドまたはポリペプチドを意味する。「ポリペプチド類似体」という用語には、１つまたはそれ以上の残基が機能的に類似の残基と保存的に置換され、親ペプチドからリガンドを離脱させる能力を示す、特に本明細書中記載の配列に実質的に同一のアミノ酸配列を含む任意のポリペプチドが含まれる。コードされたアミノ酸の保存的置換には、例えば、以下の群内に属するアミノ酸が含まれる：（１）非極性アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅ）；（２）極性中性アミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、およびＧｌｎ）；（３）極性酸性アミノ酸（ＡｓｐおよびＧｌｕ）；（４）極性塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓ）；および（５）芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＨｉｓ）。ペプチドがペプチドに特異的なリガンドを離脱させる部分的またはすべての能力を保持している限り、他のわずかな改変は本発明のペプチドの範囲内に含まれる。
【００１７】
本発明のペプチドのアミノ酸長は、約２個またはそれ以上、約３個またはそれ以上、約４個またはそれ以上、約５個またはそれ以上、約６個またはそれ以上、約７個またはそれ以上、約８個またはそれ以上、約９個またはそれ以上、または約１０個またはそれ以上のアミノ酸の範囲であり得る。ある種の態様では、アミノ酸長は、例えば、約１１個またはそれ以上、約１２個またはそれ以上、約１３個またはそれ以上、約１４個またはそれ以上、約１５個またはそれ以上、約１６個またはそれ以上、約１７個またはそれ以上、約１８個またはそれ以上、約１９個またはそれ以上、約２０個またはそれ以上、約２１個またはそれ以上、約２２個またはそれ以上、約２３個またはそれ以上、約２４個またはそれ以上、約２５個またはそれ以上、約２６個またはそれ以上、約２７個またはそれ以上、約２８個またはそれ以上、約２９個またはそれ以上、約３０個またはそれ以上のアミノ酸を含む。本発明のペプチドはまた、例えば、約３２個またはそれ以上、約３５個またはそれ以上、約３８個またはそれ以上、約４０個またはそれ以上、約４５個またはそれ以上、約５０個またはそれ以上、約５５個またはそれ以上、約６０個またはそれ以上、約６５個またはそれ以上、約７０個またはそれ以上、約７５個またはそれ以上、約８０個またはそれ以上、約９０個またはそれ以上、または、約１００個またはそれ以上のアミノ酸のアミノ酸長を含む。
【００１８】
ペプチドまたはポリペプチドの改変には、このようなペプチドがペプチドに特異的なリガンドを離脱させる能力を示す場合、その誘導体、類似体、および機能的模倣体も含み得る。例えば、誘導体には、アルキル化、アシル化、カルバミル化、ヨウ素化などのペプチドの化学修飾、またはペプチドを誘導化する任意の改変を含み得る。このような誘導化分子には、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されて塩酸アミン、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンズオキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、またはホルミル基を形成する分子が含まれる。遊離カルボキシル基を誘導体化して、塩、メチル、およびエチルエステルもしくはエステルの他の型またはヒドラジドを形成することができる。遊離水酸基を誘導体化して、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成することができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導体化してＮ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成することができる。１つまたはそれ以上の天然に存在する２０個の標準的なアミノ酸のアミノ酸誘導体（例えば、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジン、３−メチルヒスチジン、ホモセリン、オルニチン、またはカルボキシグルタミン酸）を含むペプチドもまた誘導体または類似体に含まれ、ペプチド結合によって結合されていないアミノ酸も含めることができる。このようなペプチド誘導体を、ペプチド合成の際に組み込むことができるか、ペプチドを周知の化学修飾法によって改変することができる（例えば、グレイザー（Ｇｌａｚｅｒ）ら、「タンパク質の化学修飾：方法および分析手順の選択（ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ）」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ
Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９７５）を参照のこと）。
【００１９】
合成直鎖ペプチドの類似体を、構造を環状形態への化学的に変換することによって作製することができる。直鎖ペプチドの環状化は、標的タンパク質への結合能力の増減によって生物活性を調整することができる（ペルトン・ジェイ・ティー（Ｐｅｌｔｏｎ，
Ｊ．Ｔ．）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． 、 Ｕ．Ｓ．Ａ．、８２：２３６−２３９）。直鎖ペプチドは非常に柔軟性があり、溶液中で多数の異なる高次構造をとる傾向がある。環状化は、使用可能な高次構造の数を制約するように作用するので、ペプチドのより活性または不活性な構造を好む。合成ペプチドの免疫原性は、実験で認められた溶液中の高次構造の優先度に相関していた（ダイソン・エイチ（Ｄｙｓｏｎ，
Ｈ．）ら、１９８８、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１７：
３０５−３２４）。免疫原性の相違は、環状ペプチドの特異的抗体の結合親和性の相違を示し得る。
【００２０】
遊離のＮ末端とＣ末端との間のペプチド結合の形成（ホモデティック（ｈｏｍｏｄｅｔｉｃ）シクロペプチド）またはアミノ酸骨格および／またはＮ末端またはＣ末端付近に位置する側鎖基の間の新規の共有結合の形成（ヘテロデティック（ｈｅｔｅｒｏｄｅｔｉｃ）シクロペプチド）によって直鎖ペプチドの環状化を行う（ボダンスズキー・エム（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，
Ｍ．）、「ペプチド合成の原理（ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ）」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ （１９８４））。後者の環状化は、別の化学ストラテジーを使用して、共有結合（例えば、ジスルフィド、ラクトン、エーテル、またはチオエーテル）を形成させる。一般に、５つを超える残基の直鎖ペプチドを比較的容易に環状化することができる。中心の４つの残基中のβ−ターン構造を形成するためのペプチドの性質は、ホモデティックシクロペプチドまたはヘテロデティックシクロペプチドの形成を容易にする。Ｎ末端またはＣ末端のプロリンまたはグリシン残基の存在はまた、特に６残基長よりも短い直鎖ペプチドからのシクロペプチドの形成を容易にする。
【００２１】
本発明のペプチドの改変体には、その機能的模倣体が含まれる。模倣体は、ペプチドに特異的なリガンドを離脱させるペプチド機能を模倣する化学的部分を含む化学物質を含む。例えば、ペプチドが機能的活性を有する２つの荷電化学的部分を含む場合、模倣体には空間的方向の２つの荷電化学的構造が配置され、荷電化学機能が三次元空間で維持されるような構造に制限されている。したがって、本発明のペプチドのペプチドに特異的なリガンドを離脱させる機能を提供する官能基に配向している模倣体は、本発明のペプチドの意味の範囲内に含まれる。ペプチドがペプチドに特異的なリガンドを離脱させる能力を保持している限り、これらの改変は「ペプチド」または「ポリペプチド」という用語の範囲内に含まれる。
【００２２】
本明細書中で使用されるように、「リガンド」という用語は、分子に選択的に結合することができる分子を意味する。この用語は、選択的に、リガンドとその結合パートナーとの間の結合相互作用が定量アッセイ法による非特異的相互作用に対して検出可能であることを意味する。リガンドは、本質的に、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、または任意の有機由来化合物などの任意の型の分子であり得る。さらに、誘導体、類似体、および模倣化合物もまた、この用語の定義の範囲内に含まれることが意図される。１つの態様では、本発明のリガンドは、抗体であり得る。
【００２３】
本明細書中で使用されるように、「離脱させることができる」という語句は、ペプチドを参照して使用する場合、ペプチドのリガンドとその結合パートナーとのあらかじめ形成された複合体を破壊する能力を意味する。あらかじめ形成された複合体の分解により、複合体からリガンドを離脱できる。あらかじめ形成された複合体の例は、ペプチド−リガンド接合体とペプチドに特異的な第２のリガンドとの複合体である。このような場合、ペプチドに特異的なリガンドを離脱させることができるペプチドは、第２のリガンドと予め結合したペプチド−リガンド接合体を離脱させることができ、それにより、ペプチド−リガンド接合体を第２のリガンドから放出することができる。リガンドを離脱させることができるペプチドに特異的なリガンドは、例えば、抗体であり得る。
【００２４】
本明細書中で使用されるように、「遊離型のペプチド」という用語は、リガンドに接合されていないペプチドを意味する。遊離型のペプチドは、リガンドに接合したペプチドと同一であり得る。または、遊離型のペプチドがペプチドに特異的な第２のリガンドを離脱させる能力を有する限り、遊離型のペプチドをリガンドに接合したペプチドの改変体であり得る。本発明の方法では、遊離型のペプチドは、ペプチド−リガンド接合体とペプチドに特異的な第２のリガンドとあらかじめ形成された複合体を離脱させることができる。
【００２５】
当業者は、ペプチド−リガンド接合体とペプチドに特異的な第２のリガンドとあらかじめ形成された複合体の離脱に十分な遊離型のペプチドの量を容易に決定することができる。遊離ペプチドは、本発明の方法での使用に十分な量のあらかじめ形成された複合体を離脱させ、遊離ペプチドは全てのあらかじめ形成された複合体を離脱させる必要はないことが理解される。複合体を離脱するために使用される遊離ペプチドの量を、あらかじめ形成された複合体の離脱を至適化するペプチドの量を決定するための複合体に対するペプチドの比の変化によって至適化することができる。例えば、細胞がペプチド−リガンド接合体に結合し、その結果ペプチドに特異的な第２のリガンドに結合し、その結果ビーズなどの固体支持体に結合するあらかじめ形成された複合体を、ビーズに結合した複合体と種々の量の遊離ペプチドとのインキュベーションおよびあらかじめ形成された複合体離脱を至適にする遊離ペプチドの量の決定によって遊離ペプチドの至適量について試験することができる。したがって、ペプチドとビーズの比率の変化を使用して、離脱のための遊離ペプチドの至適使用量を決定することができる。
【００２６】
リガンドを離脱させることができるペプチドに特異的なリガンドは、ペプチド特異的リガンドともいい、一般に、ペプチドに対して約１×１０^５Ｍ^−１〜約１×１０^１３Ｍ^−１の親和性を有する。ペプチド特異的リガンドを使用して、細胞が遊離型のペプチドによって放出される方法で標的細胞を捕獲することができる。あらかじめ形成された複合体離脱ペプチドにおける有効性は、複合体中のリガンドに対するペプチドの親和性の関数である。一般に、このようなリガンドを離脱させることができるペプチドのオン速度（ｋ_ｏｎ）は速く、予め結合した複合体が解離した場合ペプチドはより有効に結合する。本発明で特に有用なペプチドは、リガンドに対する親和性が高く、一般に比較的小さい。
【００２７】
ペプチドに特異的なリガンドを離脱させることができるペプチドの例には、本明細書中に開示されている以下：

が含まれる。本発明で有用なリガンドを離脱させることができる任意のペプチドを、アミノ末端でアセチル化され、カルボキシル末端でアミド化されるように改変することができる。
【００２８】
さらなるペプチドの例には、例えば、ＡＴＣＣ ＨＢ １１６４６によって産生された９０６９抗体を離脱させるペプチドが含まれる（例えば、米国特許第５，９６８，７５３号を参照のこと）。このようなペプチドには、ＱＱＧＦＦＰ（配列番号４）、ＴＱＧＴＦＳ（配列番号５）、ＮＱＧＹＦＰ（配列番号６）が含まれる。他には、ＱＧＸ_１Ｆ（配列番号５２）およびＸ_２ＱＧＸ_１ＦＸ_３（配列番号５３）（式中、Ｘ_１＝Ｗ、Ｙ、Ｓ、Ｆ、またはＴ；Ｘ_２＝Ｑ、Ｎ、Ｔ、またはＳ；およびＸ_３＝Ｐ、Ｗ、またはＳ）が含まれる。
【００２９】
９０６９抗体を離脱させるさらなるペプチドには、以下が含まれる：

式中、Ｊ_１およびＪ_２は、０〜６個のアミノ酸残基からなる群より選択され、Ｘは任意のアミノ酸である。Ｊ_１およびＪ_２は、水溶液中のペプチドの溶解性を助けるために親水性、極性、または電荷アミノ酸残基を含む。親水性、極性、または電荷アミノ酸の例は、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＲである。
【００３０】
ＡＴＣＣ ＨＢ−１１８８５と命名されたＡＴＣＣに寄託されているハイブリドーマによって産生された９０７９と呼ばれる抗ＣＤ３４抗体によって結合した細胞を放出することができるペプチドの例には、以下が含まれる。

【００３１】
細胞への抗ＣＤ２抗体Ｂ−Ｅ２の結合を競合するペプチドの例には、以下が含まれる。

（実施例ＶＩを参照のこと）
【００３２】
本発明はまた、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを提供する。

【００３３】
あらかじめ形成された複合体からリガンドを離脱させることができるペプチドを同定する方法は、例えば、１９９９年１０月１９日刊行の米国特許第５，９６８，７５３号およびＰＣＴ国際公開公報第９５／３４８１７号で開示されているように当業者に周知である。ペプチドに特異的なリガンドを離脱させることができるペプチドを同定するために、抗体に結合するペプチドを最初に決定することができる。例えば、競合結合アッセイ法を行って、ペプチドが抗体の抗原への結合を防止することができるかを決定することができる（実施例ＶＩを参照のこと）。抗原結合を競合するペプチドをさらに試験して、抗体と抗原とあらかじめ形成された複合体、単離抗原または細胞に結合した抗原のいずれかを離脱させることができるペプチドを同定することができる。あらかじめ形成された複合体を離脱させるこれらのペプチドをさらに試験して、最適な離脱活性を有する任意のペプチド（ビーズからの細胞の離脱に適切なペプチド）を同定することができる。したがって、任意の所望の適用（細胞とあらかじめ形成された複合体の離脱またはビーズなどの固体支持体に結合した細胞の離脱を含む）のために至適な離脱活性を有するペプチドを同定することができる。
【００３４】
あらかじめ形成された複合体からリガンドを離脱させることができるペプチドを、必要に応じて、ペプチドのリガンドへの接合を促進するように改変することができる。例えば、本明細書中に開示されているように、Ｃｙｓ残基を加えてペプチドＱＱＧＷＦＰＫＤ（配列番号２）の架橋を促進する。Ｃｙｓ残基を介してペプチドを結合する方法は当業者に公知であり、例えば、ＥＭＣＳまたはＭＢＳの使用が含まれる（実施例Ｉを参照のこと；Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ
ＩＬ）。ペプチドがペプチド特異的リガンドへの結合能力を保持する限り、ペプチドをいずれかの周知の方法によって改変してリガンドへの接合を容易にすることができることが理解される。
【００３５】
ペプチドをペプチドのリガンドへの接合を容易にするように改変することができるにもかかわらず、ペプチドを使用してペプチドに特異的な第２のリガンドを離脱させる場合、遊離型のペプチドに同一の改変を行う必要はない。さらに、遊離型のペプチドがペプチド−リガンド接合体に結合した第２のリガンドを離脱させることができる限り、遊離型のペプチドはリガンドに結合したペプチドと同一のアミノ酸配列を有する必要はない。さらに、遊離型のペプチドがペプチド−リガンド接合体に結合した第２のリガンドを離脱させることができる限り、遊離型のペプチドはまた接合ペプチドの改変体（ペプチド模倣体または任意のポリペプチド改変体を含む）であり得る。
【００３６】
ペプチドへの接合に有用なリガンドは、一般に、細胞表面受容体などの細胞表面上の標的分子に結合する。このようなリガンド（標的特異的リガンドともいう）はペプチドへの接合に有用であり、例えば、細胞表面分子または受容体に結合する細胞表面分子またはリガンドに特異的な抗体であり得る。リガンドは、天然に存在するリガンドであっても天然に存在するリガンドの改変体であってもよい。リガンドはまた、細胞表面上の標的分子に対する結合活性についてスクリーニングされた化学物質であり得る。本明細書中に開示されるように、細胞表面分子に対するリガンドを同定する方法は当業者に周知である。
【００３７】
リガンドの例として、本発明は、標的に特異的に結合して標的特異的リガンドとして機能するか、リガンドを離脱させることができるペプチドに特異的であり且つペプチド特異的リガンドとして機能する抗体を提供する。本明細書中で使用されるように、「抗体」という用語は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体ならびにこのような抗体の抗原結合断片を含むように最も広義で使用される。ポリクローナル抗体を使用する場合、ポリクローナル血清を抗原を使用して親和性精製して、バックグラウンドが減少し、抗原特異的抗体の濃度が高い単一特異的抗体が得られる。
【００３８】
本発明の抗体またはこのような抗体の抗原結合断片は、標的分子またはその断片の特異的結合活性が少なくとも約１×１０^５Ｍ^−１であると特徴付けられる。したがって、標的分子についての特異的結合活性を保持する本発明の抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、ＦｄおよびＦｖ断片は、抗体の定義内に含まれる。当業者は、標的分子への抗体の特異的結合活性を標的分子への抗体の結合活性と標的分子ではない対照分子との比較により容易に決定することができる。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を調製する方法は、当業者に周知である（例えば、ハーローおよびレーン（Ｈａｒｌｏｗ
ａｎｄ Ｌａｎｅ）、「抗体：実験マニュアル（ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８８）を参照のこと）。
【００３９】
さらに、本明細書中で使用される、「抗体」という用語には、天然に存在する抗体、天然に存在しない抗体（例えば、一本鎖抗体、キメラ抗体、二官能性抗体、およびヒト化抗体が含まれる）、およびその抗原結合断片が含まれる。このような天然に存在しない抗体を、固相ペプチド合成を使用して構築することができるか、組換えによって産生することができるか、例えば、ヒューズ（Ｈｕｓｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４６：１２７５−１２８１ （１９８９）記載のように、可変重鎖および可変軽鎖からなるコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって得ることができる。これらおよび他の例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植抗体、一本鎖抗体、および二官能性抗体を作製するこれらの方法および他の方法は、当業者に周知である（ウィンターおよびハリス（Ｗｉｎｔｅｒ
ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ）、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １４：２４３−２４６ （１９９３）；ウォード（Ｗａｒｄ）ら、Ｎａｔｕｒｅ
３４１：５４４−５４６ （１９８９）；ハーローおよびレーン（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ）、前記、１９８８）；ヒルヤード（Ｈｉｌｙａｒｄ）ら、「タンパク質工学：実践アプローチ（ ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ）」（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９９２）；ボラベック（Ｂｏｒｒａｂｅｃｋ）、「抗体工学（ Ａｎｔｉｂｏｄｙ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ）」、第２版、（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５））。
【００４０】
天然供給源から組換えまたは化学合成で作製することができる単離標的分子、その断片、またはペプチドなどの免疫原を使用して抗体を生成することができる。非免疫原または免疫原性の弱い標的分子もしくはその一部を、担体分子（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはスカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）など）へのハプテンの結合によって作製することができる。種々の他の担体分子および担体分子へハプテンを結合する方法は、当技術分野で周知である（例えば、ハーローおよびレーン（Ｈａｒｌｏｗ
ａｎｄ Ｌａｎｅ）、前記、１９８８を参照のこと）。免疫原性断片を、融合タンパク質としてのポリペプチド（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリＨｉｓなど）である標的分子の一部を発現することによっても作製することができる。ペプチド融合体を発現する方法は、当業者に周知である（アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、「現代の分子生物学プロトコール（ Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ）」、増補４７、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９９））。
【００４１】
標的特異的リガンドおよびペプチド特異的リガンドが共に抗体である場合、２つの抗体は、２つの異なる種由来であり得る。２つの異なる種の使用は、ペプチド相互作用によって複合体を特異的に単離するために二次抗体を使用する場合に特に有用である（以下を参照のこと）。例えば、標的特異的抗体はヒト抗体であり、ペプチド特異的抗体はマウス抗体であり得る。抗体を作製するのに有用な種の例には、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、ヒツジ、およびヤギなどの哺乳動物種ならびにニワトリなどの非哺乳動物種が含まれる。標的特異的抗体およびペプチド特異的抗体が異なる種由来である限り、標的特異的抗体およびペプチド特異的抗体は任意の種であり得る。
【００４２】
抗体の例には、細胞表面抗原に特異的な抗体が含まれうる。例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３４、ＣＤ５６、およびＣＤ６９などの細胞表面マーカーに特異的な抗体は、本発明のリガンドとして使用することができる抗体の例である。細胞表面マーカーは、特定の細胞型または細胞群に特異的であり得る。例えば、ＣＤ２は全てのＴ細胞のｐａｎ
Ｔ細胞マーカーであり、ＣＤ８はＴ細胞サブセットのマーカーである。したがって、これらの細胞表面マーカーに特異的な抗体リガンドを使用して、それぞれＣＤ８陽性であるＴ細胞またはＴ細胞のサブセットを単離することができる。
【００４３】
本発明のリガンドとして有用な他の抗体の例には、腫瘍細胞マーカー（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ１３８、ｐ５３、前立腺特異的抗原、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４、ＭＡＧＥ６、またはＭＡＧＥ１２、ｇｐ１００、癌胚抗原（ＣＥＡ）、Ｐａｎ−Ｏ−５マーカーなどが含まれる）および白血病またはリンパ腫などの腫瘍型のマーカー（ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、およびＣＤ３０が含まれる）が含まれる。Ｐａｎ−Ｏ−５抗体は、上皮腫瘍に結合することができる。
【００４４】
本発明のリガンドとして有用な他の抗体の例には、幹細胞に特異的な抗体が含まれる。このような幹細胞には、例えば、造血幹細胞などの血液産生幹細胞、間葉幹細胞、ニューロン幹細胞、または筋肉幹細胞が含まれる。本質的に、全ての表面分子の任意の型も、本発明で有用なリガンドの標的として使用することができる。このような細胞表面分子には、細胞表面受容体（例えば、成長因子受容体またはサイトカイン受容体）が含まれる。
【００４５】
ペプチドに特異的なリガンドを離脱することができる本発明のペプチドを、所望の標的に特異的な任意のリガンドにも接合することができる。本発明のペプチドを、所望の標的（特定の細胞型など）に特異的な任意の標的特異的リガンドに接合することができる（図１）。例えば、標的特異的リガンドは、特定の細胞型上の細胞表面受容体に特異的な公知のリガンドであり得る。標的特異的リガンドを、当業者に周知の方法によって作製することもできる。例えば、細胞表面上の標的に特異的な抗体リガンドを、所望の細胞型または細胞型特異的標的分子での免疫化および所望の細胞型に特異的に結合する抗体のスクリーニングによる本明細書中に開示される抗体産生法を使用して作製することができる。当業者は、特定の細胞型への特異的結合を、例えば所望の細胞へのリガンドの結合と細胞型特異的標的分子を発現しない対照細胞への結合と比較することによって決定することができる。
【００４６】
抗体を使用することに加えて、細胞表面上で発現する標的分子に特異的なリガンドは、細胞表面上の受容体に結合する天然に存在するリガンドであり得る。このような天然に存在するリガンドおよび受容体の例には、成長因子およびサイトカインならびにこれらの同族体受容体が含まれる。公知のリガンド−受容体結合パートナーに加えて、オーファン受容体に結合する天然に存在するリガンドを、当業者に周知の方法によって決定することができる。例えば、発現ライブラリーをオーファン受容体でスクリーニングして、受容体に結合する天然に存在するリガンドを決定することができる。さらに、天然に存在するリガンドを、酵母２ハイブリッドアッセイ法などのスクリーニングアッセイ法を使用して同定することができる（例えば、米国特許第５，２８３，１７３号、同第５，４６８，６１４号、および同第５，６６７，９７３号；アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、前記、１９９９；ルバン（Ｌｕｂａｎ）ら、Ｃｕｒｒ．
Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６：５９−６４ （１９９５）を参照のこと）。このような天然に存在するリガンドを、ペプチドに特異的なリガンドを離脱することができるペプチドに接合することができる。
【００４７】
細胞表面で抗体を発現する抗体発現Ｔ細胞の場合、標的特異的リガンドはＴ細胞中で発現される抗体に特異的な抗原であり得る。したがって、本発明の方法を使用して、抗原に特異的な抗体を発現するＴ細胞またはＴ細胞集団を単離または濃縮することができる。
【００４８】
天然に存在するリガンドに加えて、標的分子に特異的な天然に存在しないリガンドを、本発明のペプチドに接合することもできる。天然に存在しないリガンドは、例えば、ポリペプチドについて上記のような天然に存在するリガンドの誘導体であり得る。さらに、天然に存在しないリガンドは、標的分子に対する結合活性についてスクリーニングされた化合物であり得る。標的分子のリガンドとして機能することができる化合物（単一または複合体の有機分子、金属含有化合物、炭水化物、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣体、糖タンパク質、リポタンパク質、核酸、抗体などの化学的または生物学的分子が含まれる）についてのスクリーニングに使用するための多数の化合物を生成する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、ヒューズ（Ｈｕｓｅ）、米国特許第５，２６４，５６３号；フランシス（Ｆｒａｎｃｉｓ）ら、Ｃｕｒｒ．
Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２：４２２−４２８（１９９８）；チエツェ（Ｔｉｅｔｚｅ）ら、Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ２：３６３−３７１
（１９９８）；ソフィア（ｓｏｆｉａ）、Ｍｏｌ． Ｄｉｖｅｒｓ． ３：７５−９４ （１９９８）；エイクラー（Ｅｉｃｈｌｅｒ）ら、Ｍｅｄ．
Ｒｅｓ． Ｒｅｖ． １５：４８１−４９６ （１９９５）などに記載されている。多数の天然および合成化合物を含むライブラリーも市販の供給源から得ることができる。分子のコンビナトリアルライブラリーを、周知のコンビナトリアル化学法を使用して調製することができる（ゴードン（Ｇｏｒｄｏｎ）ら、Ｊ．
Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７： １２３３−１２５１）（１９９４）；ゴードン（Ｇｏｒｄｏｎ）ら、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：
１３８５−１４０１ （１９９４）；ゴードン（Ｇｏｒｄｏｎ）ら、Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． ２９：１４４−１５４ （１９９６）；ウィルソンおよびクザルニック（Ｗｉｌｓｏｎ
ａｎｄ Ｃｚａｒｎｉｋ）編、「コンビナトリアル化学：合成と応用（ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ： Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ）」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９７）。
【００４９】
ペプチドがペプチドに特異的なリガンドを離脱することができる任意のペプチド−リガンド結合対を、細胞を単離するための本発明の方法と組み合わせて使用することができる。ペプチドを任意の標的特異的リガンドに接合させて、ペプチド−リガンド接合体によって標的細胞を単離することができる。次いで、細胞を遊離型のペプチドとあらかじめ形成された複合体から離脱させることができる。
【００５０】
１つの態様では、リガンドを離脱させることができるペプチドに特異的なリガンドは、ＣＤ３４に特異的に結合する。ＣＤ３４に特異的に結合するこのようなリガンドの１つは、モノクローナル抗体９Ｃ５である。抗体９０６９としても知られている抗ＣＤ３４抗体９Ｃ５は、１９９４年６月７日アメリカンタイプカルチャーコレクション、１０８０１ユニバーシティー・ブールヴァード、Ｍａｎａｓｓａｓ
ＶＡ ９０１１０に寄託され、ＨＢ１１６４６と命名された。９Ｃ５リガンドを離脱させることができるペプチドの例は、ＱＱＧＷＦＰ（配列番号１）；ＱＱＧＷＦＰＫＤ（配列番号２）；およびＱＱＧＷＦＰＫＤＣ（配列番号３）である（実施例Ｉ〜ＩＩＩを参照のこと）。
【００５１】
ペプチド−リガンド接合体を、例えば、標的分子に特異的なリガンドへの少なくとも１コピーのペプチドの化学的架橋によって作製することができる。適切な架橋剤には、例えば、ヘテロ二官能性架橋剤であるＮ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）（実施例Ｉを参照のこと）が含まれる。他の適切な架橋剤には、例えば、グルタルアルデヒド；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）；カルボジイミド；ビス−ジアゾベンジジン（ＢＤＢ）；アジドベンゾイルヒドラジド（ＡＢＨ）；Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（ＡＮＢ−ＮＯＳ）；Ｎ−（４−（ｐ−アジドサリチルアジド）ブチル）−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）；ｐ−アジドフェニルグリオキサルモノヒドレート（ＡＰＧ）；４−（ｐ−アジドサリチルアミド）ブチルアミン（ＡＳＢＡ）；１−（ｐ−アジドサリチルアミド）−４−（ヨードアセトアミド）ブタン（ＡＳＩＢ）；ビス−（β−（４−アジドサリチルアミド）エチル）ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）；ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）；ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ^３）ビス（２−スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル）スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）；ビス（２−スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル）スルホン（スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ）；１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）；ジメチルアジピミデート・２ＨＣｌ（ＤＭＡ）；ジメチルピメルイミデート・２ＨＣｌ（ＤＭＰ）；ジメチルスベルイミデート・２ＨＣｌ（ＤＭＳ）；１，４−ジ−（３’−（２’−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド））ブタン（ＤＰＤＰＢ）；ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）；ジチオビス（スクシンイミジルプロピネート）（ＤＳＰ）；ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）；ジスクシニミジルタータレート（ＤＳＴ）；ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート・２ＨＣｌ（ＤＴＢＰ）；３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）；１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）；エチレングリコールビス−（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）；エチレングリコールビス−（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−ＥＧＳ）；Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシ−スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）；Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシ−スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢＳ）；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート（ＨＳＡＢ）；−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート（スルホ−ＨＳＡＢ）；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）；４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジド・ＨＣｌ（Ｍ_２Ｃ_２Ｈ）；４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）−酪酸ヒドラジド・ＨＣｌ（ＭＰＢＨ）；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸（ＮＨＳ−ＡＳＡ）；Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸（スルホ−ＮＨＳ−ＡＳＡ）；スルホスクシンイミジル（４−アジドサリチルアミド）ヘキサノエート（スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＡＳＡ）；３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）；ｐ−ニトロフェニル−２−ジアゾ−３，３，３−トリフルオロプロピオネート（ＰＮＰ−ＤＴＰ）；２−ジアゾ−３，３，３−トリフルオロプロピオニルクロリド（ＤＴＰ）；Ｎ−スクシンイミジル（４−アジドフェニル）１，３’−ジチオプロピオネート（ＳＡＤＰ）；スルホスクシンイミジル（４−アジドフェニルジチオ）プロピオネート（スルホ−ＳＡＤＰ）；スルホスクシンイミジル２−（７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ＳＡＥＤ）；スルホスクシンイミジル２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド）−エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ＳＡＮＤ）；Ｎ−スクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ＳＡＮＰＡＨ）；スルホスクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（スルホ−ＳＡＮＰＡＨ）；スルホスクシンイミジル−２−（ｐ−アジドサリチルアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ＳＡＳＤ）；−ヒドロキシスクシンイミジル−２，３−ジブロモプロピオネート（ＳＤＢＰ）；Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）；スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）；スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）；スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）；スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）；スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ−ＳＭＰＢ）；スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）；スルホスクシンイミジル６−（α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド）ヘキサノエート（スルホ−ＳＭＰＴ）；Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）；スクシンイミジル６−（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）；スルホスクシンイミジル６−（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）；スルホスクシンイミジル７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセテート（スルホ−ＳＡＭＣＡ）；スルホスクシンイミジル４（ｐ−アジドフェニル）ブチレート（スルホ−ＳＡＰＢ）；Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）；１，８−ビス−マレイミドトリエチレングリコール（ＢＭ（ＰＥＯ）_３）；１，１１−ビス−マレイミドテトラエチレングリコール（ＢＭ（ＰＥＯ）_４）；１，４−ビス−マレイミドブタン（ＢＭＤ）；１，４−ビス−マレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）；Ｎ−（β−マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド・トリフルオロ酢酸（ＢＭＰＨ）；Ｎ−（β−マレイミドプロピルオキシ）−スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）；Ｎ−ε−マレイミドカプロン酸（ＥＭＣＡ）；Ｎ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド（ＥＭＣＨ）；Ｎ−κ−マレイミドウンデカン酸（ＫＭＵＡ）；Ｎ−（κ−マレイミドウンデカン酸）−ヒドラジド（ＫＭＵＨ）；スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ（６−アミドカプロエート）（ＬＣ−ＳＭＣＣ）；スクシンイミジル−６−（（β−マレイミド−プロピオンアミド）ヘキサノエート）（ＳＭＰＨ）；Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（Ｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ）；Ｎ−（κ−マレイミドウンデカノイルオキシ）−スルホスクシンイミドエステル（Ｓｕｌｆｏ−ＫＭＵＳ）；Ｎ−スクシンイミジル−（４−ビニルスルホニル）ベンゾエート（ＳＶＳＢ）（ハーローおよびレーン（Ｈａｒｌｏｗ
ａｎｄ Ｌａｎｅ）、「抗体：実験マニュアル（ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８８）； Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．； Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬを参照のこと）が含まれる。
【００５２】
本発明のペプチド−リガンド接合体およびペプチドに特異的なリガンドは、陽性細胞選択技術に特に有用である。ペプチドに特異的なリガンドを離脱させることができるペプチドを、細胞表面標的分子に特異的に結合する任意のリガンドに結合させることができ、これを使用して細胞表面標的分子を発現する細胞を単離することができる。ペプチド−リガンド接合体の例には、抗ＣＤ８抗体に接合したＰＲ３４^＋（商標）ペプチド（ＱＱＧＷＦＰＫＤＣ；配列番号３）および抗ＣＤ２抗体に接合したＰＲ３４^＋（商標）ペプチドが含まれる（実施例ＩおよびＩＶを参照のこと）。
【００５３】
本発明はまた、細胞を選択する方法を提供する。本方法は、細胞集団をペプチド−リガンド接合体に接触させ、該接合体がペプチドに特異的な第２のリガンドを離脱させることができる該ペプチドに接合した該集団中の細胞に特異的な第１のリガンドを含み、それにより細胞−接合体複合体を形成する工程と、該ペプチド−リガンド接合体に該第２のリガンドを接触させる工程と、該細胞−接合体複合体を単離する工程とを含む。本発明の方法は、さらに、細胞−接合体複合体に遊離型のペプチドを接触させ、それにより該細胞−接合体複合体から該第１の細胞を放出させる工程をさらに含むことができる。
【００５４】
本発明の方法は、種々の細胞型を含む細胞集団からの細胞の単離に有用である。本発明の方法は、リガンドを集団中の標的細胞に特異的に結合させることにより、集団から標的細胞を選択することができる、ペプチド−リガンド接合体を使用する。
【００５５】
本発明の方法は、幹細胞の単離に特に有用である。単離した幹細胞を、種々の治療法（例えば、治療薬の発現法または移植）で使用することができる。治療遺伝子産物を発現することができる遺伝因子を幹細胞に形質導入して、遺伝子治療のために患者に導入することができる。幹細胞は、幹細胞移植が必要な患者（例えば、高用量の化学療法薬で治療した癌患者）への移植に特に有用である。特に移植のための骨髄細胞および幹細胞の処理法は、当業者に周知である（例えば、アレマン（Ａｒｅｍａｎ）ら、「骨髄細胞および幹細胞処理：最新技術マニュアル（ Ｂｏｎｅ
Ｍａｒｒｏｗ ａｎｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ）」，Ｆ．Ａ．Ｄａｖｉｓ
Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ （１９９２）を参照のこと）。幹細胞は、例えば、ＣＤ３４＋細胞であり得る。
【００５６】
本発明の方法を使用して、種々の組織型の幹細胞を単離することができる。本発明の方法を使用して、例えば、血液産生幹細胞、間葉幹細胞、ニューロン幹細胞、または筋肉幹細胞を単離することができる。本明細書中で使用されるように、「血液産生細胞」とは、血液細胞由来の細胞を意味する。血液細胞は、一般に、骨髄由来である。血液細胞には、例えば、赤血球、単核球、白血球、樹状細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナイーブＴ細胞および記憶Ｔ細胞、抗原特異的Ｔ細胞などが含まれる。血液産生細胞は血液産生細胞由来であるにもかかわらず、血液細胞は血液中に存在する必要がないことが理解される。したがって、血液を介して輸送されるが、血液から種々の組織に移動する細胞は、血液産生細胞の意味の範囲内に含まれる。血液産生細胞には、血液系を介して存在または移動する細胞、骨髄由来の細胞、リンパ系由来の細胞、または臍帯血由来の細胞が含まれる。このような細胞には、免疫系の多数の細胞が含まれる。血液産生幹細胞には、造血幹細胞が含まれうる。
【００５７】
種々の幹細胞は、その各系に特異的な種々の細胞に分化することができる。したがって、ニューロン幹細胞は、神経系の種々の細胞に分化することができ、間葉幹細胞は間葉起源の種々の細胞または組織（骨格筋、血管、および尿生殖系、および結合組織を含む）に発生することができる。造血幹細胞などの血液産生幹細胞は、白血球およびその種々の分化形態（Ｂ細胞およびＴ細胞を含む）のような種々の細胞型に分化することができる。
【００５８】
本発明の方法はまた、Ｔ細胞およびＴ細胞サブセット、Ｂ細胞およびＢ細胞サブセット、樹状細胞、ＮＫ細胞、ナイーブＴ細胞または記憶Ｔ細胞、間葉幹細胞、ニューロン幹細胞、抗原特異的Ｔ細胞、単球などの細胞を単離するのに有用である。Ｔ細胞サブセットには、Ｔ細胞発現特異的マーカー（ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３４、ＣＤ２５、およびＣＤ６９など）が含まれる。Ｂ細胞サブセットには、ＣＤ１９およびＣＤ２０などのＢ細胞発現マーカーが含まれる。
【００５９】
本発明の方法を使用して、腫瘍細胞（例えば、乳房、前立腺、結腸、肺、卵巣、膵臓、副腎を含む種々の組織の腫瘍由来の腫瘍細胞、ならびに白血病、骨髄腫、黒色腫、リンパ腫、腎細胞癌、副腎細胞癌、膵臓細胞癌、または他の腫瘍細胞型などの癌由来の腫瘍細胞）を単離することもできる。腫瘍細胞の単離は、下記の診断法に特に有用である。本発明の方法を使用して、抗イディオタイプ（例えば、イディオタイプが細胞表面上で発現する骨髄腫またはＢ細胞リンパ腫細胞）を単離することができる。この場合、ペプチド特異的リガンドによって認識されるペプチドに接合した抗イディオタイプ抗体を使用して、標的細胞を捕獲することができる。その後、ペプチド特異的抗体が結合する遊離型のペプチドの添加によって細胞の放出を達成することができる。
【００６０】
腫瘍細胞の単離を、腫瘍ワクチンのような治療法のための抗原供給源として使用することもできる。例えば、本発明の方法によって単離された腫瘍細胞を、エキソビボで樹状細胞に曝露して樹状細胞を抗原感作することができる。次いで、感作した樹状細胞を個体に投与して、樹状細胞中で発現する腫瘍抗原に対するＴ細胞応答を刺激することができる。または、単離した腫瘍細胞を照射するか他の方法で成長を不可能にし、個体に再導入し、腫瘍細胞中で発現する腫瘍細胞抗原に対する免疫応答を刺激することができる。必要に応じて、単離腫瘍細胞をインビトロで培養して、樹状細胞に曝露するか照射することができる。
【００６１】
本明細書中で使用されるように、「特異的に結合する」または「〜に特異的な」という用語は、結合相互作用に関して使用する場合、非特異的相互作用と測定可能なほど異なる結合を意味する。特異的結合を、例えば、一般に結合活性を示さない類似の構造の分子である対照分子への結合と比較した標的分子への結合の決定によって測定することができる。この場合、この分子が対照分子よりも標的分子に対する親和性が測定可能に高いかどうかが示される。同様に、標的細胞への特異的結合を、一般に標的細胞に特異的な標的分子を発現しない細胞である対照細胞への結合の比較によって決定することができる。
【００６２】
本明細書中で使用されるように、「選択的結合」は、分子間、例えば、１つの分子または密接に関連する分子に結合する抗体などのリガンドで特異的且つ差別的な結合相互作用を意味する。例えば、抗体は、抗原性エピトープが分子に固有である場合、抗原に特異的且つ選択的であり得る抗原に特異性を示す。したがって、選択的結合性を有する分子は、１つの細胞または密接に関連する細胞に対して固有のエピトープに特異性を示す抗体で例示されるように、分子間で区別することができる。または、抗体は、多数の分子に共通のエピトープに対する特異性を持ち得る。このような抗体は特異的結合を有するが、１つの分子または密接に関連する分子に選択性を示さない。
【００６３】
結合特異性を、例えば、標的に結合することが公知の対照分子との競合によって決定することができる。例えば、標的へのリガンドの特異的結合を、同一のリガンドとの結合の競合によって実証することができる。この場合、特異的結合により分子の結合が同一のリガンドによって競合的に阻害されるかどうかが示される。
【００６４】
本明細書中で使用されるように、「特異的結合」という用語には、低親和異性および高親和性特異的結合の両方が含まれる。特異的結合を、例えば、少なくとも約１０^−４ＭのＫｄを有する低親和性相互作用によって示すことができる。特異的結合を、高親和性結合分子（例えば、少なくとも約１０^−７Ｍ、少なくとも約１０^−８Ｍ、少なくとも約１０^−９Ｍ、少なくとも約１０^−１０Ｍまたは少なくとも約１０^−１１Ｍ、または１０^−１２Ｍまたはそれ以上のＫｄを持つ結合分子）によって示すこともできる。低親和異性および高親和性結合分子はいずれも本発明の方法において有用である。
【００６５】
選択的結合は、標的分子への比較的特異的な特定のリガンドの結合を意味する。一般に、選択的結合は、部分的に、対照分子または細胞と比較して標的分子または標的細胞が少なくとも２倍（２×）高い特異的結合の検出によって特徴付けられる。したがって、標的分子または細胞への選択的結合を示す分子は、少なくとも１つの他の分子または細胞と比較して検出可能に異なる結合活性を有する。
【００６６】
集団からの細胞の単離に本発明の方法を使用する場合、一般に、固体支持体上の細胞の単離に有利である。本明細書中で使用されるように、「固体支持体」という用語は、集団からの細胞の単離に有用な分子の固定を可能にするのに十分に安定な固体媒体を意味する。固体支持体には、例えば、ニトロセルロースなどの膜、ナイロン、ポリビニリデンジフルオリド、プラスチック、ガラス、ポリアクリルアミド、アガロース、またはポリスチレンが含まれうる。固体支持体を、集団からの細胞の単離に有用な分子の固定を支持する限り本質的に任意のサイズまたは形状で作製することもできる。例えば、固体支持体は、天然または合成の膜フィルターまたはガラススライドなどの平面であり得る。または、固体支持体は、種々の球形（例えば、ガラス、ポリアクリルアミド、またはアガロース製のビーズを含む）であり得る。固体支持体はまた、粒子または鉄溶液であり得る。同様に、固体支持体として多孔質媒体を使用することができ、これは本明細書中で使用する用語の定義の範囲内である。さらに、任意の固体支持体を、例えば、結合分子またはリンカーの結合に直接的または間接的に使用することができる化学官能基を含むように改変することができる。
【００６７】
固体支持体は、標的細胞の単離に有用な性質をさらに示すことができる。例えば、固体支持体は、集団からの細胞の単離に有用な磁気ミクロスフェアであり得る（ハードウィック（Ｈａｒｄｗｉｃｋ）ら、Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ、１：３７９−３８６
（１９９２）；エーゲランド（Ｅｇｅｌａｎｄ）ら、Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７：４３９−４４４ （１９８８）； Ｄｙｎａｌ、Ｌａｋｅ
Ｓｕｃｃｅｓｓ ＮＹを参照のこと）。
【００６８】
集団からの細胞の単離のために、ペプチド−リガンド接合体中のペプチドに特異的なリガンドを、固体支持体に結合することができる。ペプチド特異的リガンドを固体支持体に共有結合するか、非共有相互作用を介して固体支持体に結合することができる。例えば、ペプチド特異的リガンドを、ビーズに直接結合することができる（図１および実施例Ｖを参照のこと）。固体支持体へのリガンドの直接結合のために、本明細書中に開示されているような架橋剤を使用して、固体支持体にリガンドを共有結合させることができる。非共有相互作用を介した支持体へのリガンドの結合のために、リガンドを固体支持体に直接結合させるか、非共有相互作用によって（例えば、ビーズへのリガンドの直接結合）結合させることができる（図１および実施例Ｖを参照のこと）。ビーズまたは他の固体支持体への直接結合を、ビーズの生化学的および／または生物物理学的性質（親水性、疎水性、イオンの特徴など）によって媒介する。または、リガンドを、媒体間の相互作用（例えば、抗体リガンドの場合、二次抗体）を介して支持体に結合させることができる。二次抗体または試薬などのリガンドに対して結合活性を示す分子を、例えば、一般に固体支持体への共有結合を介して固体支持体に結合させることができる。次いで、リガンドを、固体支持体に共有結合したリガンド特異的分子との非共有相互作用を介して固体支持体に結合させる。
【００６９】
リガンドが抗体である場合、固体支持体に結合したリガンド特異的分子は、抗体に特異的な二次抗体であり得る。例えば、抗体がマウスモノクローナル抗体である場合、固体支持体に結合した二次抗体は、抗マウス重鎖および／または軽鎖抗体または抗イソ型抗体であり得る。二次抗体を選択する場合、抗体は、好ましくはペプチド特異的リガンドには特異的であり、標的特異的リガンドには特異的ではない。したがって、リガンドとして抗体を使用する場合、ペプチド特異的抗体は、標的特異的抗体と異なる種由来であり得る。異なる種の使用により、ペプチド特異的抗体に特異的であるが標的特異的抗体に結合しない二次抗体を都合よく使用が可能である。二次抗体として有用な種の例には、ヒト、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、およびヤギなどの哺乳動物種ならびにニワトリなどが含まれる。異なる種の抗体リガンドの使用により、ペプチド特異的抗体に特異的な二次抗体が使用可能である。したがって、ペプチドおよびペプチド特異的リガンドの相互作用を介して結合する細胞のみをビーズによって単離して、遊離ペプチドとの複合体の離脱が可能である。
【００７０】
さらに、リガンドを、固体支持体に結合することができる分子によって認識される部分を組み込むように改変することができる。例えば、本明細書中に開示されるように、リガンドをビオチンに接合することができる（実施例Ｉ〜ＩＩＩを参照のこと）。次いで、ビオチン化リガンドを、固体支持体に結合させたアビジンまたはストレプトアビジンに結合させることができる（図１を参照のこと）。ビオチンおよびアビジンの使用は、これが高親和性相互作用であるので細胞の免疫選択に特に有用である（例えば、１９９３年７月６日刊行の米国特許第５，２２５，３５３号および１９９３年６月１日刊行の同第５，２１５，９２７号を参照のこと）。本明細書中に開示のように、ＣＤ３４＋およびＣＤ２＋標的細胞に特異的なペプチド−リガンド接合体を使用したＣＤ３４＋細胞およびＣＤ２＋細胞の単離は、ストレプトアビジンビーズで単離した場合、非常に有効であった（実施例ＩＩＩおよびＩＶを参照のこと）。
【００７１】
ビオチンに加えて、適切な結合パートナーを有する任意の分子を使用してリガンドに結合することができる。適切な架橋剤（本明細書中に開示のもの）を使用して共有結合させることができる。または、リガンドが組換えで発現する場合、固体支持体に結合させた分子に特異性を示す適切なタグを、リガンドとの融合ポリペプチドとして発現させることができる。融合ポリペプチドの発現は、当業者に周知である（アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、前記、１９９９を参照のこと）。
【００７２】
集団から細胞を単離する場合、細胞の結合効率は、ビーズもしくは他の固体支持体への細胞の比率または固体支持体の表面積に依存して変化し得る。したがって、当業者は、細胞−ビーズ比の変更、並びに最適な細胞結合および単離効率が得られるビーズ比の決定によって最も効率よく細胞を単離するための細胞−ビーズまたは他の固体支持体の最適な比を同定することができる。
【００７３】
標的細胞の単離のための結合複合体を形成する場合、形成された結合複合体により標的細胞が単離可能である限り、標的細胞、ペプチド−リガンド接合体、ペプチド特異的リガンド、およびビーズなどの固体支持体をいずれの順番において組み合わせることができる。いずれの成分も予めインキュベーションを行って複合体を形成した後全ての成分を組み合わせることができる。例えば、本明細書中に開示されるように、標的細胞、ペプチド−リガンド接合体、ペプチド特異的リガンド、および捕獲ビーズの連続的インキュベーションにより、ペプチド特異的リガンドを捕獲ビーズとあらかじめ形成された複合体中に存在する場合よりも有効に細胞が結合する（実施例ＩＩを参照のこと）。当業者は、特定のペプチド−リガンド接合体およびペプチド特異的リガンドを使用して特定の細胞の最適な単離条件を決定するための成分の最適なインキュベーション条件、インキュベーション時間およびビーズ対細胞比を容易に決定することができる。細胞の結合条件の最適化に加えて、種々の量の上記遊離ペプチドを使用した遊離ペプチドによる細胞の離脱のために細胞−ビーズ比を最適化することができる。
【００７４】
さらに、本発明は、細胞集団からの細胞を濃縮する方法を提供する。本方法は、細胞集団をペプチド−リガンド接合体に接触させ、該接合体がペプチドに特異的な第２のリガンドを離脱させることができるペプチドに接合した該集団中の細胞に特異的な第１のリガンドを含み、それにより細胞−接合体複合体を形成する工程と；該ペプチド−リガンド接合体に該第２のリガンドを接触させる工程と；該細胞−接合体複合体を単離する工程とを含む。本発明の方法は、該細胞−接合体複合体を該ペプチドに接触させ、それにより該細胞−接合体複合体から該細胞を放出させる工程をさらに含むことができる。さらに、以下により詳細に記載するように、本発明は、細胞亜集団を濃縮する方法を提供する。本明細書中で使用されるように、「細胞集団由来の細胞または亜集団の濃縮」は、標的細胞が元の細胞集団よりも他の集団と比較して濃度が高いことを意味する。当業者は、本明細書中に開示される周知の免疫学的方法または組織化学的方法を使用して濃縮細胞または細胞集団の相対純度を容易に決定することができる。
【００７５】
さらに、病態を診断する方法が提供される。この方法には、細胞集団を含む試料をペプチド−リガンド接合体に接触させ、該接合体がペプチドに特異的な第２のリガンドを離脱させることができるペプチドに接合した該集団中の細胞に特異的な第１のリガンドを含み、それにより細胞−接合体複合体が形成する工程と；該ペプチド−リガンド接合体に該第２のリガンドを接触させる工程と；該細胞−接合体複合体を単離する工程と；該複合体中の該病態に関連する細胞を同定する工程とを含む。本発明の方法は、該細胞−接合体複合体を該ペプチドに接触させ、それにより該細胞−接合体複合体から該細胞を放出させる工程をさらに含むことができる。
【００７６】
本発明の病態を診断する方法は、病態に関連する限定数の細胞が存在する病態の診断に特に有用である。細胞集団を含む試料を、リガンドが病態に関連する標的細胞に特異的なペプチド−リガンド接合体と接触させる。試料は、例えば、血液試料または生検であり得る。組織生検の場合、初代培養物を得るための周知のタンパク質分解消化法を使用して細胞を分散させることができる（例えば、ジャフィー（Ｊａｆｆｅｅ）ら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｊ． Ｓｃｉ． Ａｍ．、４：１９４−２０３ （１９９８）を参照のこと）。組織生検の場合、分散細胞集団中の特定の細胞の存在を決定する。腫瘍生検などの腫瘍試料由来の細胞の分散は、本明細書中に開示されるように腫瘍ワクチン法に有用であり得る。
【００７７】
癌などの疾患の初期検出法における１つの制限は、初期段階では癌細胞数が限られているので検出が困難であるという点である。本発明の方法を有利に使用して初期段階の癌における限られた癌細胞数を濃縮し、それにより細胞をより容易に検出可能である。例えば、本発明の方法を、初期段階の乳癌または前立腺癌のような初期段階の癌を検出するためのスクリーニング法として使用することができる。本発明の方法を、血液試料中の濃度が低く標準的な方法を使用した検出には不十分な濃度である転移性癌細胞を検出するために試料に適用することもできる。本発明の方法により、検出法への適用前に細胞を濃縮可能である。したがって、本発明の方法は、診断用の腫瘍細胞の濃縮、例えば、血液または骨髄由来の腫瘍細胞の濃縮に有用である。
【００７８】
細胞集団由来の細胞から単離または濃縮した特定の細胞型を同定する方法は、当業者に周知であり、例えば、免疫学的手順、組織化学的方法、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用した組織特異的遺伝子発現の解析を含む。特定の細胞型の検出に有用な免疫学的手順には、検出可能な抗体を使用する免疫アッセイ法が含まれる。このような免疫アッセイ法には、例えば、当技術分野で周知の免疫組織化学、免疫蛍光、ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ法、蛍光表示式細胞分取（ＦＡＣＳ）分析、免疫沈降、免疫ブロット分析、パンデックス（Ｐａｎｄｅｘ）マイクロ蛍光測定アッセイ法、凝集アッセイ法、フローサイトメトリー、および血清診断アッセイ法が含まれる（ハーローおよびレーン（Ｈａｒｌｏｗ
ａｎｄ Ｌａｎｅ）、前記、１９９８；ハーローおよびレーン「抗体の使用：実験マニュアル（ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （１９９９））。組織化学的または免疫組織化学的方法による細胞の同定法は、当業者に周知である（例えば、サムナー（Ｓｕｍｎｅｒ）、「基礎組織化学（ Ｂａｓｉｃ
Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）」、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）； グ（Ｇｕ）編、「分析形態学：理論、応用、およびプロトコール（ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ： Ｔｈｅｏｒｙ， Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ）」、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｂｏｓｔｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ
ＭＡ （１９９７）を参照のこと）。
【００７９】
さらに、ＰＣＲによる細胞の同定法は、当技術分野で周知である（例えば、ディーフェンバッハおよびドベクスラー（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ）、「ＰＣＲ プライマー：実験マニュアル（ ＰＣＲ
Ｐｒｉｍｅｒ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （１９９５）；アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、前記、１９９９を参照のこと）。逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）および対応するＰＣＲ産物の検出において、１つの細胞または少数の細胞中で細胞特異的メッセンジャーＲＮＡ発現を検出することができる。細胞特異的ｍＲＮＡ発現を検出するためにハイブリッド形成し増幅反応を開始させるようにＰＣＲプライマーを選択することができる。細胞特異的ｍＲＮＡの検出に特に有用なプライマーは、２つの異なるエクソンによってコードされる領域中で開始するプライマーである。このようなプライマーを、適切なサイズのＰＣＲ産物の有効な産生によってｍＲＮＡが検出されるように選択することができる。それに対して、２つの異なるエクソンによってコードされる領域中でハイブリッド形成するプライマーはイントロン配列の介在によりゲノムＤＮＡから検出可能な産物を生成せず、あまりに遠く離れているためいかなる検出可能なＰＣＲ産物も生成されないプライマーを置く。２つの異なるエクソンから開始するように選択したこのようなプライマーは、細胞特異的ｍＲＮＡ発現の検出に有用である。
【００８０】
いくつかの適用では、結合したペプチド−リガンド接合体から細胞が放出されることが望ましい。例えば、細胞表面抗原に結合した抗体は、細胞生理学の変化を誘導することができる（ベラルディー（Ｂｅｒａｒｄｉ）ら、前記、１９９５）。したがって、細胞の生理学的状態が潜在的に重要な本発明の方法によって単離された細胞を用いた適用（例えば、治療への適用）では、単離細胞からペプチド−リガンド接合体を離脱させることが望ましい。さらに、ある細胞診断技術（例えば、組織化学法および免疫組織化学法）において固体支持体に結合したペプチドから細胞を放出させることが望ましい。
【００８１】
細胞からのペプチド−リガンド接合体の１つの解離法は、それ自体を公知の分子によって置換することができる細胞特異的リガンドを使用することである。例えば、接合体中の標的特異的リガンドを、公知のペプチドに置換することができるか、当業者はこのようなペプチドを本明細書中に開示のリガンドを離脱させることができるかを容易に決定することができる（米国特許第５，９６８，７５３号を参照のこと）。このような場合、ペプチド−リガンド接合体中の標的特異的リガンドおよびペプチド特異的リガンドの両方を、対応するペプチドによって離脱させることができる。
【００８２】
細胞からペプチド−リガンド接合体を離脱させるためのペプチドの使用に加えて、他の分子をペプチドと併せて使用して、ペプチドによる離脱を増強することができる。当業者は、種々の化合物の存在下で本明細書中に開示の方法によるペプチド離脱活性のスクリーニングによってペプチドの離脱活性を容易にする他の試薬または成分を容易に決定することができる。例えば、緩衝液のｐＨ、塩濃度、または温度を変化させてペプチドでの離脱を増強することができる。他の薬剤を加えることができ、例えば、ジチオトレイトールなどの還元剤および／またはエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）またはエチレングリコールビス（β−アミノエチルエステル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’．Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）などのキレート剤を加えてペプチドでの離脱を増強することができる。
【００８３】
細胞からペプチド−リガンド接合体を離脱させるように機能することができる分子を、当業者は容易に決定することができる。例えば、リガンドに特異的であり且つ細胞からペプチド−リガンド接合体を離脱させることができるペプチドを、周知の方法を使用してスクリーニングおよび同定することができる（米国特許第５，９６８，７５３号を参照のこと）。さらに、細胞からペプチド−リガンド接合体を離脱させる化合物を、周知のスクリーニング法を使用して同定し、標的分子について非天然リガンドを同定するために上記の離脱活性を示す化合物を同定することができる。
【００８４】
化合物をスクリーニングして、例えば、標的分子からの標的特異的リガンドの離脱を検出することができる。このようなスクリーニング法では、標的分子を細胞表面上で発現させるか組換えにより発現させることができる。当業者は、リガンドと標的分子とあらかじめ形成された複合体からのリガンドの離脱の検出法を知っているか、またはこれを容易に決定することができる。スクリーニング法について、リガンドは放射性標識、蛍光色素、強磁気物質、発光タグ、またはビオチンなどの検出可能な結合剤で検出可能に標識することができる。標識リガンドにより、リガンドに離脱活性を示す化合物をより容易に同定可能である。
【００８５】
さらに、タンパク質分解消化、例えば、キモパパイン、ペプシン、パパイン、キモトリプシンなどを使用して固体支持体に結合している複合体から細胞を離脱させることができる。プロテアーゼを使用した親和性基質からの細胞の放出方法は、当業者に周知である（１９９２年１月１４日刊行の米国特許第５，０８１，０３０号）。
【００８６】
本発明は、さらに、細胞亜集団を選択する方法を提供する。本方法は、細胞集団にペプチド−リガンド接合体を接触させ、第１のリガンドがペプチド特異的リガンドを離脱させることができるペプチドに接合している場合、該接合体が該集団中の第１の細胞に特異的な第１のリガンドを含み、それにより細胞−接合体複合体を形成し、該集団中第２の細胞に特異的な第２のリガンドに該細胞集団を同時または連続的に接触させ、それにより細胞−第２のリガンド複合体を形成する工程と；該ペプチド−リガンド接合体に該ペプチド特異的リガンドを接触させる工程と；該第１の細胞−接合体複合体および第２の細胞−第２のリガンド複合体を単離する工程とを含む。
【００８７】
したがって、本発明の方法を有利に使用して、細胞集団または２つまたはそれ以上の異なる細胞型の亜集団から１つの細胞型を単離することができる。本方法は、異なる細胞に特異的な２つまたはそれ以上の標的特異的リガンドの１つまたは任意の組み合わせを使用する。例えば、本明細書中に開示される方法を使用して固体支持体への標的特異的リガンドの結合によって細胞を単離することができる。さらに、例えば、下記のペプチドを使用して、固体支持体から細胞を放出させることができる。
【００８８】
１つの態様では、細胞亜集団を単離する場合、細胞亜集団を、標的特異的リガンドを離脱させることができる同一のペプチドを使用して都合よく放出させることができる（図６を参照のこと）。例えば、ペプチド特異的リガンド（例えば、９０６９抗体など）はまた、細胞上の標的分子（例えば、ＣＤ３４抗原など）に特異的である場合、ペプチド特異的リガンドを同時に使用して、対応するペプチド−リガンド接合体（図６Ｂ、細胞型２）に結合する細胞およびペプチド特異的リガンドが結合する標的細胞（図６Ｂ、細胞型４）（本明細書中では標的分子（例えば、ＣＤ３４細胞））を単離することができる。したがって、細胞亜集団を単離する本発明の方法は、ペプチド特異的リガンドおよび標的特異的リガンドである第２のリガンドを使用することができる（図６Ｂ）。このようなペプチド特異的リガンドの例は、ＣＤ３４細胞に特異的であり且つＰＲ３４（商標）ペプチドによって離脱される本明細書中に開示の９０６９抗体である。したがって、リガンドがＰＲ３４（商標）ペプチドに接合する場合、９０６９抗体などの抗体を使用してＣＤ３４細胞を単離して、第２の細胞に特異的なリガンドを使用して第２の細胞を同時に単離することができる。
【００８９】
例えば、ＣＤ３４細胞を含む細胞集団（骨髄など）を使用して、骨髄集団中にＣＤ３４細胞およびいくつかの他の細胞を含む細胞亜集団（例えば、間葉幹細胞）を単離することができる（図７を参照のこと）。このような骨髄の亜集団は、移植への適用に特に有用であり得る。血液細胞集団を使用して、例えばＣＤ３４細胞または別の血液細胞型と共にＴ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞集団を含む亜集団を単離することもできる。例えば、抗白血病活性を示すＴ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞または任意の数の特異的細胞型を、ＣＤ３４細胞と共に単離することができる。このようなＴ細胞またはＢ細胞亜集団は、免疫応答、例えば、抗白血病免疫応答の刺激への適用に特に有用であり得る一方で、ＣＤ３４細胞は造血系の再構築を担う。
【００９０】
標的特異的リガンドが各細胞型に使用可能である限り、本発明の方法を使用して、集団から任意の数の特異的細胞型を単離することができる。このような細胞型の亜集団は、集団由来の、例えば、２個またはそれ以上、３個またはそれ以上、４個またはそれ以上、５個またはそれ以上、６個またはそれ以上、７個またはそれ以上、８個またはそれ以上、９個またはそれ以上、１０個またはそれ以上、１２個またはそれ以上、１５個またはそれ以上、２０個またはそれ以上の細胞型であり得る。
【００９１】
１つを超える細胞型の亜集団を単離する場合、任意の数の標的特異的リガンドを、ペプチド特異的リガンドを放出させることができる同一のペプチドに接合することができる（図６Ａ、リガンド６および８に接合したペプチドが同一である場合）。同一のペプチドへの異なる細胞型に特異的な２つまたはそれ以上のリガンドの接合または標的特異的リガンドでもあるペプチド特異的リガンドの使用により、単離した亜集団中の種々の細胞型を同一のペプチドを使用して都合よく放出させることができる。または、複数の標的特異的リガンドをペプチド特異的リガンドを離脱させることができる２つまたはそれ以上の異なるペプチドに接合することができ、これを使用して異なるペプチドを使用して放出させることができる複数の細胞型を単離することができる（図６Ａ、２つの異なるペプチドがリガンド６および８に接合する場合））。
【００９２】
集団から複数の細胞型を単離するための複数の標的特異的リガンドの使用に加えて、同一の細胞に対して２つまたはそれ以上の標的特異的リガンドを使用することができる。１つの細胞型を単離するための１つより多い標的特異的リガンドの使用は、例えば、特定の細胞型の単離効率の増大に有用であり得る。
【００９３】
さらに、必要に応じて、細胞の集団または亜集団を、複数の標的特異的リガンドを使用して連続的に接触させることができる。例えば、細胞の亜集団を、集団中のいくつかの異なる細胞を認識するリガンドを使用して単離することができる。このような標的特異的リガンドを使用した初期単離工程を使用して、特定の細胞を含む亜集団を濃縮させることができる。このような亜集団を放出させて、引き続いて亜集団中の特定の細胞に特異性を示す異なる標的特異的リガンドと接触させることができる。このような連続単離工程は、１つの細胞型に特異的な標的特異的リガンドを使用不可能である場合に特に有用であり得る。連続的方法を使用して、特定の細胞型が同一のリガンドにも結合する他の細胞から分離されるように亜集団を単離し、その後標的特異的リガンドに結合し、いくつかの細胞型に特異性を示す標的特異的リガンドを使用して１つの細胞型を単離することができる。
【００９４】
細胞亜集団の単離法には、第１の細胞−接合体複合体および第２の細胞−接合体複合体に遊離型の離脱ペプチドを接触させ、それにより第１の細胞−接合体複合体から第１の細胞および第２の細胞−接合体複合体から第２の細胞が放出される工程をさらに含むことができる。したがって、本発明の方法を使用して、集団から細胞亜集団を選択および放出させることができる。
【００９５】
本発明の方法を使用して、細胞亜集団を単離することができる。細胞の同時単離または連続的インキュベーションに加えて、細胞を本明細書中に開示される方法によってそれぞれ単離およびプールして細胞亜集団を得ることもできる。
【００９６】
本発明はまた、所望の細胞と同時精製することができる細胞の陰性選択を行うための第２のリガンドの使用法を提供する（図６Ｃ）。本方法は、細胞集団にペプチド−リガンド接合体を接触させ、該接合体がペプチド特異的リガンドを離脱させることができるペプチドに接合されている該集団中の第１の細胞に特異的な第１のリガンドを含み、該ペプチド特異的リガンドが集団中の第２の細胞に結合しており、それにより細胞−接合体複合体が形成され；ペプチドリガンド接合体をペプチド特異的リガンドに接触させる工程と；第２の細胞に特異的な第２のリガンドに細胞集団を接触させ、第２のリガンドがペプチドによって離脱されずにペプチド特異的リガンドと異なる部位に結合する工程と；該細胞−接合体複合体を単離する工程とを含む。本方法は、細胞−接合体複合体に遊離型のペプチドを接触させ、それにより、細胞−接合体複合体から第１の細胞を放出させる工程をさらに含むことができる。
【００９７】
所望の細胞と同時精製することができる細胞について陰性選択を行うための第２のリガンドの使用法は、細胞選択法の特異性の増強に有用であり得る（図６Ｃを参照のこと）。例えば、ＣＤ３４特異的抗体９０６９は、上記のＣＤ３４＋細胞型に対するＣＤ３４の標的特異的リガンドとしても機能することができるペプチド特異的リガンドである。細胞集団がＣＤ３４細胞を含む場合、例えば、ＰＲ３４（商標）ペプチドに接合した標的特異的リガンドに結合する標的細胞（例えば、図６Ｃ中の細胞型２）と共に骨髄のＣＤ３４細胞（例えば、図６Ｃ中の細胞型４）が同時単離される。細胞の単離亜集団からＣＤ３４細胞型を排除することが望ましい場合、ＣＤ３４に結合するが非離脱抗体である別の抗体（すなわち、ＰＲ３４（商標）ペプチドまたは反応に使用される任意の他のペプチド）を含むことができる（例えば、図６Ｃのリガンド１６）。非離脱リガンドが固体支持体に結合する場合、細胞型２を放出することができる一方で、細胞型４が細胞型４の非離脱標的特異的リガンド（すなわち、リガンド１６）への結合を介して捕獲されたままである（図６Ｃ）。
【００９８】
細胞を非離脱リガンドに同時に接触させるかペプチドでの離脱後に連続的に接触させることができる。非離脱抗体は、離脱ペプチドへの結合に関して非競合的である。離脱ペプチドとのインキュベーションの前に非離脱リガンドを接触させる場合、非離脱リガンドは標的特異的リガンドでもあるペプチド特異的リガンドに関して非競合的である。例えば、９０６９抗体の場合、非離脱リガンドはＣＤ３４標的細胞に非競合的に結合する。陰性選択を行う細胞が細胞亜集団から十分に除去されている限り、非離脱リガンドは、標的特異的リガンドでもあるペプチド特異的リガンドと同一の分子または同一の標的細胞上の異なる分子に結合することができる。
【００９９】
一般に、細胞の陰性選択を行うために使用した第２のリガンドを、陰性選択を行う細胞への結合に十分な量で使用し、この量はリガンドの相対的親和性に依存する。したがって、相対親和性に基づいて、相対量を補償することができる。例えば、親和性が１０倍異なる場合、約等量の結合活性が存在するように約１０倍異なるように相対量を調整することができる（すなわち、低親和性リガンドが高親和性リガンドの１／１０の濃度である）。一般に、細胞の陰性選択に使用した第２のリガンドを、少なくとも等量の結合活性で使用し、特に、陰性選択を行った細胞が有効に保持されるように過剰に使用する。細胞の陰性選択に使用した第２のリガンドは、少なくとも約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、または約１０倍過剰の結合活性で存在し、必要に応じて、約５０倍、約１００倍、約１０００倍、約１０，０００倍、またはさらに約２０，０００倍過剰の結合活性またはそれ以上で存在し得る。
【０１００】
少なくとも２つの標的特異的リガンドを使用した細胞亜集団を単離する場合、一般に、細胞を固体支持体（例えば、本明細書中で開示される磁気ビーズなどのビーズまたは粒子）上で単離する。必要に応じて、標的特異的リガンドを同一のビーズに結合させることができる。または、異なる標的特異的リガンドを結合させて、連続的または同時にインキュベートすることができるビーズを分離することができる。
【０１０１】
本発明は、さらに、ＣＤ３４細胞および少なくとも１つの他の特異的単離細胞型を含む実質的に純粋な細胞亜集団を提供する。上記のように、ＣＤ３４抗原を発現するＣＤ３４細胞を、本発明の方法または他の方法によって単離するか、必要に応じて第２の細胞型との同時に単離することができる。本明細書中で使用されるように、「実質的に純粋」は、細胞または細胞集団に関して使用する場合、元の細胞集団と比較した特異的単離細胞の濃縮を意味する。第２の細胞型は、間葉細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、もしくは増強細胞、または標的特異的リガンドが本明細書中に開示の方法によって細胞型の単離に使用可能である任意の型の細胞であり得る。「増強細胞」は、ＨＬＡ抗原耐性を誘導し、例えば移植片対宿主疾患または移植片拒絶に有用であり得る耐性誘導細胞である（例えば、シュシェルト（Ｓｃｈｕｃｈｅｒｔ）ら、Ｎａｔｕｒｅ
Ｍｅｄ． ６：９０４−９０９ （２０００）を参照のこと）。ＣＤ３４細胞を含む亜集団に加えて、標的特異的リガンドが亜集団中で単離される細胞標的に使用可能である限り、種々の病態の治療のための有用な細胞の組み合わせとして任意の細胞組み合わせを単離することができることが理解される（以下を参照のこと）。
【０１０２】
実質的に純粋な亜集団を、本明細書中に開示の方法を使用した細胞の特異的単離によって特定の細胞型を濃縮することができる。実質的に純粋な細胞集団は、一般に、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の実質的に純粋な亜集団を含み、本質的に１００％の実質的に純粋な集団であり得る。亜集団中の特異的に単離された細胞型は等量である必要はないが、それぞれの特異的に単離された細胞型が最初の細胞集団と比較して濃縮される限り任意の比であり得ることが理解される。例えば、上記のように、本発明の方法を使用して、ＣＤ３４細胞および間葉細胞を単離することができ、実質的に純粋なＣＤ３４細胞および間葉細胞の亜集団は、１０％から本質的に１００％の実質的に純粋な亜集団であり得る。
【０１０３】
実質的に純粋な亜集団中の細胞の組み合わせは、種々の治療への適用に有用であり得る。例えば、ＣＤ３４細胞と間葉細胞との組み合わせは、幹細胞でのこれを必要とする患者の移植の増大または造血系細胞を有する患者を得るために有用であり得る。間葉幹細胞により、間質細胞、コラーゲン、または骨細胞などが得られ、ＣＤ３４細胞により、造血細胞機能を得ることができる。ＣＤ３４細胞とナチュラルキラー（ＮＫ）細胞との組み合わせは、例えば、抗腫瘍活性または抗ウイルス活性が亢進したこの組み合わせを必要とする患者を得るために有用であり得る。ＣＤ３４細胞とＴ細胞またはＴ細胞サブセットの組み合わせは、例えば、抗腫瘍活性、抗ウイルス活性、免疫機能の亢進、または移植設定での応答の亢進に有用であり得る。
【０１０４】
したがって、本発明は、本発明の方法によって単離した実質的に純粋な細胞亜集団を使用した個体の病態に対する応答を亢進する方法を提供する。実質的に純粋な細胞亜集団を使用した本発明の方法は、免疫無防備個体の治療に特に有用である。このような個体には、造血系または間葉細胞系の先天性欠損症個体、癌患者（白血病などの免疫系を抑制する癌または癌治療に起因する免疫抑制）、または免疫が抑制されるか免疫抑制治療が必要な自己免疫疾患の個体が含まれる。本明細書中で使用されるように、免疫抑制患者は、物理的刺激（例えば、Ｘ線照射）、化学的刺激（例えば、免疫抑制薬）、または生物学的刺激（例えば、抗リンパ球血清または免疫系の先天性欠損）に起因し得る免疫応答が減少している。
【０１０５】
実質的に純粋な細胞亜集団を使用して、例えば、器官移植または幹細胞移植であり得る移植を受けたか受ける予定の個体を治療することができる。本発明の実質的に純粋な細胞亜集団を使用して、免疫抑制個体を治療することもできる。したがって、本発明は、個体の治療法または病態を治療するための治療に対する個体の応答を亢進させる方法を提供する。本明細書中で使用される、「治療応答の亢進」は、病態に関連する兆候または症状の任意の測定可能な改善を意味する。当業者は、個体が病態に関連する兆候または症状の測定可能な改善を示し、個体で直接測定可能な兆候または症状を媒介することができるか、寿命の長期化またはより良好な生活の質を反映するかどうかを容易に決定することができる。
【０１０６】
したがって、本発明の方法は、免疫無防備個体に関連する種々の病態の治療に有用である。例えば、ＣＤ３４細胞および間葉細胞は、器官移植を受けたか受ける予定の個体の耐性を誘導することができる。ＣＤ３４細胞および間葉細胞を使用して、同種異系移植の安全性を増大させる（骨髄または幹細胞移植に起因する移植片対宿主疾患の緩和）こともできる。ＣＤ３４細胞と間葉細胞との組み合わせは、同種異系移植の耐性の誘導および自家細胞移植におけるより迅速且つ有効な移植に有用である。ＣＤ３４と間葉細胞との組み合わせは耐性を誘導および供与器官または組織の受け入れの増大に有用なだけでなく、これらの細胞の組み合わせにより、器官拒絶または移植片対宿主疾患の緩和のための免疫抑制治療の必要性を減少させることができる。
【０１０７】
本発明の方法または任意の他の方法によって単離した実質的に純粋な細胞亜集団を使用して、所望の特徴を有する細胞（例えば、機能的細胞および支持細胞の単離物）を得ることもできる。本発明の方法により単離できる機能的細胞により、特定の細胞機能が得られる一方で支持細胞により機能的細胞を刺激する。機能的細胞および支持細胞の１つのこのような組み合わせは、ＩＬ−２を産生するＣＤ４細胞およびＩＬ−２によって活性化されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。したがって、本発明は、それぞれ支持細胞および機能的細胞として機能することができ、ＮＫ細胞免疫応答の刺激に使用することができるＣＤ４細胞とＮＫ細胞との組み合わせを提供する。
【０１０８】
支持細胞と機能的細胞との組み合わせの別の例は、間葉細胞と組み合わせたＣＤ３４細胞である。間葉細胞は、ＣＤ３４細胞の成長を刺激するサイトカインを生成する。したがって、間葉細胞およびＣＤ３４細胞を含む実質的に純粋な細胞亜集団において、間葉細胞は、造血系の細胞を得る際に機能することができる、ＣＤ３４細胞の支持細胞として機能することができる。同様に、間質細胞はまた、ＣＤ３４細胞の成長刺激のための支持細胞として機能することができる。本発明の方法を使用し、本明細書中に開示される細胞選択法を使用して支持細胞と機能的細胞との任意の有用な組み合わせを単離することができることが理解される。
【０１０９】
実質的に純粋な細胞亜集団はまた、細胞治療への適用に有用であり得る。例えば、一般に、レトロウイルスベクターを使用して、インビボ細胞治療法のために遺伝子を形質導入する。しかし、レトロウイルスは、細胞への有効な感染のために細胞を複製する必要がある。したがって、レトロウイルスベクターを使用する必要のある治療法は、増殖細胞を使用する。支持細胞が機能的細胞の成長を刺激することができる場合、増殖細胞を得るための１つの方法は、機能的細胞と支持細胞との組み合わせを含む本発明の方法によって単離された実質的に純粋な細胞亜集団を使用することである。例えば、間葉細胞とＣＤ３４細胞との組み合わせをこのような治療で使用して、間葉細胞がＣＤ３４細胞を増殖させるための成長刺激として機能するサイトカインを得ることができる。したがって、このような亜集団での増殖ＣＤ３４細胞に治療遺伝子を導入し、インビボ治療法で形質導入細胞を使用することができる。したがって、本発明は、インビボ治療に適用するために細胞の形質導入効率を増大させる方法を提供する。
【０１１０】
本発明の別の態様によれば、ペプチドに特異的な抗体を離脱することができる少なくとも１つの本発明のペプチドおよび適切なパッケージング材料中の抗体を含む、好ましくはキット形態の診断系が得られる。例えば、キットは、ＱＱＧＷＦＰ（配列番号１）；ＱＱＧＷＦＰＫＤ（配列番号２）；およびＱＱＧＷＦＰＫＤＣ（配列番号３）、またはその組み合わせ、および９Ｃ５抗体を含むことができる。本発明の診断系は、試料中の細胞型の有無についてのアッセイ法に有用である。
【０１１１】
適切な診断系には、少なくとも１つのアッセイ法に十分な量で個別にパッケージングされた化学試薬として少なくとも１つの本発明のペプチドまたは抗体が含まれる。本発明のキットは、さらに、ペプチドを任意の所望のリガンドに結合可能な本明細書中に開示の架橋剤を含むことができる。本発明のキットはまた、接合体中のリガンドが細胞表面標的分子に特異的であり、標的分子を発現する特定の細胞を単離可能なペプチド−リガンド接合体を含むことができる。本発明のキットは、細胞を単離するためのビーズなどの個体支持体をさらに含むことができ、例えば、キットは磁気ビーズを含むことができる。
【０１１２】
本発明のキットの内容物は、滅菌された、汚染物を含まない環境を得るためにパッケージング材料中に含まれる。さらに、パッケージング材料は、キット内の材料をどのように使用すれば封入されたペプチドとの予め結合したペプチド−リガンド複合体を離脱することができるか、または適切ならば特定の細胞を単離することができるのかを示した説明書を含む。使用説明書には、通常試薬濃度を記載した具体的な表現または少なくとも１つのアッセイ法パラメーター（試薬および混合すべき試料の相対量、試薬／試料混合物の品質保持期限、温度、緩衝液条件など）が含まれる。
【０１１３】
本発明は、さらに、細胞を選択する方法を提供する。本方法は、細胞集団をペプチド特異的リガンドに接触させ、該細胞集団がペプチドに融合した細胞表面融合ポリペプチドを発現する細胞を含み、遊離型のペプチドが該融合ポリペプチドに結合した該ペプチド特異的リガンドを離脱させることができ、それにより細胞−ペプチドリガンド複合体を形成する工程と、該細胞−ペプチドリガンド複合体を単離する工程とを含む。本方法は、該細胞−ペプチドリガンド複合体を遊離型の該ペプチドに接触させ、それにより該細胞−ペプチドリガンド複合体から該細胞を放出させる工程をさらに含むことができる。
【０１１４】
標的細胞に結合させるためのペプチド−リガンド接合体の使用に加えて、本発明はまた、リガンドを離脱させることができるペプチドを有利に使用し、該リガンドが細胞表面上で発現する分子との融合体として発現するペプチドと複合体を形成する、細胞の単離法を提供する。この場合、ペプチドは細胞表面ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして発現するので、リガンドが標的細胞に特異的なペプチド−リガンド接合体の結合が迂回される。本明細書中で使用されるように、「融合ポリペプチド」は、共に天然に発現されない少なくとも２つの異種分子が１つの翻訳産物として発現するものである。細胞表面ポリペプチドに融合したペプチドの場合、少なくとも１コピーのペプチドが、細胞表面ポリペプチド内で融合体として発現される。必要に応じて、複数コピーのポリペプチドを融合ポリペプチドの一部として発現することができる。ペプチドが細胞表面上で発現し、細胞に投与したペプチド特異的リガンドに接触可能であるように、ペプチドを細胞表面ポリペプチドに融合する。
【０１１５】
周知の方法を使用して、ペプチドを細胞表面ポリペプチドとの融合体として発現することができる（アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、前記、１９９９）。組換えペプチド−細胞表面ポリペプチド融合体を発現する細胞の単離法は、遺伝子操作した細胞の単離または濃縮に有用であり、この方法を使用して、遺伝子治療などの治療の適用に有用な細胞を単離または濃縮することができる。
【０１１６】
上記のように、ビーズなどの固体支持体での細胞の捕獲によって細胞を単離することができる。または、ＦＡＣＳによって細胞を単離することができる。細胞を単離するためのＦＡＣＳの使用は、ペプチド−表面ポリペプチド融合体を発現する細胞を単離する場合に特に有用である。
【０１１７】
本発明の種々の態様の活性に実質的に影響を与えない改変もまた本明細書で提供され、本発明の定義内であることが理解される。したがって、以下の実施例は、本発明の例示を意図し、本発明の限定を意図しない。
【０１１８】
実施例Ｉ
ＣＤ８抗体とのＰＲ３４＋（商標）ペプチド接合体の合成およびＳＵＰ−Ｔ１細胞への結合
本実施例は、ＰＲ３４＋（商標）ペプチドの合成、ＣＤ８抗体への接合、およびＴ細胞へのペプチド−抗体接合体の結合を記載する。
【０１１９】
ペプチドＡｃ−ＱＱＧＷＦＰＫＤ（ＰＲ３４＋（商標）；配列番号２）を、本質的に以前記載のペプチドに特異的なリガンドを離脱させることができるペプチドとして同定した（米国特許第５，９６８，７５３号）。
【０１２０】
ＰＲ３４＋（商標）ペプチドを、Ｃ末端Ｃｙｓ残基を使用して合成し、ＭＴ−４１５（ヒトＣＤ８に対する抗体）に共有結合して、ＣＤ８−ＰＲ３４＋接合体を得た。ペプチドを、ヘテロ二官能性リンカーＮ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）を使用してＣＤ８抗体に接合させた。製造者が推奨する標準的プロトコールを使用した（Ｐｉｅｒｃｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．； Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ）。
【０１２１】
抗ヒトＣＤ３４モノクローナル抗体である９Ｃ５抗体を、ビオチンヒドラジン（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してビオチン化した。最初に冷蔵よりもむしろ室温でメタ過ヨウ素酸酸化を行うこと以外は、製造者（Ｐｉｅｒｃｅ）が推奨する標準的プロトコールの後にビオチン化反応を行った。
【０１２２】
フローサイトメトリー実験のために、ＳＵＰ−Ｔ１細胞を使用した。ＳＵＰ−Ｔ１は、典型的なＴ細胞表面マーカーを発現することが公知のＴリンパ球由来の腫瘍細胞系統である。フローサイトメトリー用にＳＵＰ−Ｔ１細胞を調製し、ＣＤ８抗体−ＰＲ３４＋ペプチド（ＣＤ８−ＰＲ３４＋）接合体、ビオチン化９Ｃ５、およびフィコエリトリン標識（ＰＥ標識）ストレプトアビジンで連続的に感作した。ＳＵＰ−Ｔ１細胞をストレプトアビジン−ＰＥ、連続的にＣＤ８−ＰＲ３４＋接合体、ビオチン化９Ｃ５のいずれかとインキュベートし、その後ストレプトアビジン−ＰＥ；または連続的にＣＤ８−ＰＲ３４＋接合体、ビオチン化９Ｃ５、ストレプトアビジン−ＰＥ、次いでＰＲ３４＋（商標）を含まないペプチドと１５分間インキュベートした。次いで、ＳＵＰ−Ｔ１細胞を、フローサイトメトリーによって分析した。ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、０．０５％アジ化物、１．０％ヒト血清アルブミン（ＰＡＨ）の混合液中で全てのインキュベーションを行った。全てのインキュベーションを室温で１５分間行い、その後それぞれを１．０ｍｌ
ＰＡＨで洗浄した。フローサイトメトリーのために、染色細胞を０．２５ｍｌのＰＡＨ中に再懸濁した。ＳＵＰ−Ｔ１細胞（１×１０^６）を、１μｇのＣＤ８−９０６９ＮまたはＣＤ３４−ビオチンのいずれかで染色した。５．０ｍｇ／ｍｌのペプチドを使用した。
【０１２３】
図２は、フローサイトメトリー分析の結果を示す。ストレプトアビジン−ＰＥとのＳＵＰ−Ｔ１細胞のインキュベーションを示し、「イソ型」を示す。イソ型と比較して認められた平均チャネル蛍光のシフトは、抗体−ペプチド接合体が、標的細胞への良好な親和性を示す結合であることを示した（「抗体＋ＳＡ−ＰＥ」で示される）。遊離のＰＲ３４＋（商標）ペプチド（ＱＱＧＷＦＰＫＤ；配列番号２）を加えて、ピークの左側へのシフトで示されるように、蛍光シグナルが消滅した（「抗体＋ペプチド＋ＳＡ−ＰＥ」）。
【０１２４】
これらの結果は、ＣＤ８−ＰＲ３４＋接合体が、Ｔ細胞結合活性を保持することを示す。これらの結果はまた、ＣＤ８−ＰＲ３４＋接合体がビオチン化９Ｃ５に結合することができ、ＣＤ８−ＰＲ３４＋接合体とビオチン化９Ｃ５との複合体が免疫原性親和性を保持してＴ細胞を結合可能にすることを示す。これらの結果は、遊離のＰＲ３４＋（商標）ペプチドがＣＤ８−ＰＲ３４＋接合体からビオチン化９Ｃ５を放出し、それによりＴ細胞を放出することができることをさらに示す。
【０１２５】
実施例ＩＩ
ペプチド−抗体接合体およびストレプトアビジンビーズを使用したＳＵＰ−Ｔ１細胞の陽性細胞選択
本実施例は、ＣＤ８−ＰＲ３４＋接合体、ビオチン化９Ｃ５、およびストレプトアビジンビーズを使用したＳＵＰ−Ｔ１細胞の陽性選択を示す。
【０１２６】
陽性選択のために、ＳＵＰ−Ｔ１細胞を種々の条件下でインキュベートし、ストレプトアビジンビーズを使用してロゼット形成させた。感作のために、１×１０^６個のＳＵＰ−Ｔ１細胞のアイソレックス（Ｉｓｏｌｅｘ）（商標）緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水、１５ｍＭクエン酸、１％ヒトアルブミン）を１μｇのＣＤ８−９０６９Ｎで感作し、１ｍｌのアイソレックス（商標）緩衝液で洗浄し、１μｇのＣＤ３４−ビオチンで感作し、１ｍｌのアイソレックス（商標）緩衝液で洗浄した。両インキュベーションを、体積５００μｌ、室温で１５分間行った。ロゼット形成のために、１５μｌのストレプトアビジン（ＳＡ）被覆ビーズ（Ｄｙｎａｌ）を各チューブに加えた。チューブを、穏やかに撹拌しながら室温で３０分間インキュベートした。溶出のために、ロゼット形成した細胞を、磁石を使用してビーズを保持しながらアイソレックス（商標）緩衝液で洗浄した。次いで、ビーズを５００μｌの体積で５ｍｇ／ｍｌのＰＲ３４＋（商標）ペプチドと１５分間インキュベートした。混合物を磁石に２分間曝露し、上清をピペットで捨てた。ビーズをアイソレックス（商標）緩衝液で洗浄し、この洗浄物を先の上清と合わせた。全放出細胞を計数した。
【０１２７】
対照反応では（チューブ１）、ＳＵＰ−Ｔ１細胞をストレプトアビジンビーズと直接インキュベートした。陽性選択のために、ＳＵＰ−Ｔ１細胞を２つの条件下でインキュベートした。第１の条件下では（チューブ２）、ＳＵＰ−Ｔ１細胞をＣＤ８−ＰＲ３４＋接合体、ビオチン化９Ｃ５、およびその後ストレプトアビジンビーズと連続的にインキュベートした。第２の条件下では（チューブ３）、ＳＵＰ−Ｔ１細胞をＣＤ８−ＰＲ３４＋接合体とインキュベートし、ストレプトアビジンビーズをビオチン化９Ｃ５と別にインキュベートした。両方を洗浄し、その後３０分間共にインキュベートした。
【０１２８】
ストレプトアビジンビーズでのロゼット形成反応後、残存する遊離の細胞を除去し、３つ全ての反応物を放出薬剤としてＰＲ３４＋（商標）ペプチドと３０分間インキュベートした。遊離細胞を、回収し、定量した。
【０１２９】
表１に示すように、ストレプトアビジンビーズのみとインキュベートしたＳＵＰ−Ｔ１細胞（チューブ１）は、１％のＳＵＰ−Ｔ１細胞のみを捕獲した。それに対して、ＣＤ８−ＰＲ３４＋接合体、続いてビオチン化９Ｃ５、およびストレプトアビジンビーズと連続的にインキュベートしたＳＵＰ−Ｔ１細胞（チューブ２）約８０％が捕獲された。ＣＤ８−ＰＲ３４＋接合体および次いでストレプトアビジンと予め結合したビオチン化９Ｃ５とインキュベートした場合（チューブ３）、ＳＵＰ−Ｔ１細胞の約４４％が捕獲された。
【００】
【表１】ＳＵＰ−Ｔ１細胞の陽性選択

【０１３０】
遊離のＰ３４＋ペプチドとのインキュベーションにより、ストレプトアビジンビーズによって捕獲された結合ＳＵＰ−Ｔ１細胞が放出された。ＳＵＰ−Ｔ１細胞の収量は、ＣＤ８−ＰＲ３４＋接合体、その後のビオチン化９Ｃ５およびストレプトアビジンビーズとの連続的インキュベーションで細胞の約４３％が捕獲された。放出細胞の収量は、ＣＤ８−ＰＲ３４＋接合体、その後のストレプトアビジンビーズに予め結合した９Ｃ５で処理した細胞の約３１％であった。
【０１３１】
これらの結果は、ＣＤ８−ＰＲ３４＋接合体を使用して、ＣＤ８抗体受容体を発現するＳＵＰ−Ｔ１細胞を高い比率で捕獲することができることを示す。これらの結果は、遊離のＰＲ３４＋（商標）ペプチドを使用して、ＣＤ８−ＰＲ３４＋接合体によって捕獲されたＳＵＰ−Ｔ１細胞を離脱させることができることをさらに示す。
【０１３２】
実施例ＩＩＩ
単核細胞調製物からのＣＤ８＋細胞の陽性選択
本実施例は、単核細胞集団からＣＤ８を発現する細胞の陽性選択を記載する。
【０１３３】
ＣＤ８−ＰＲ３４＋接合体の集団からＣＤ８＋細胞を単離する能力を試験するために、ＣＤ８＋細胞を含む単核細胞（ＭＮＣ）を調製した。単核細胞をヒト供与者から採取した。単核細胞を、製造者のプロトコールに従ってＣＳ−３０００（商標）（Ｂａｘｔｅｒ）を使用してＧ−ＣＳＦ可動ヒト供与者から採取した。ＭＮＣの出発集団は、１９．４２％ＣＤ３＋／８＋細胞であった。各ロゼット形成反応のために、２×１０^６個のＣＤ８＋細胞を含むＭＮＣの量を使用した。ビオチン化ＣＤ８抗体（ＭＴ−４１５）を、本質的に実施例Ｉ記載のようにビオチン化した。
【０１３４】
ＭＮＣを、３つの条件下でインキュベートした。条件１では、ＭＮＣをストレプトアビジンビーズのみとインキュベートした。条件２では、ＭＮＣをビオチン化ＣＤ８抗体とインキュベートし、その後ストレプトアビジンビーズとインキュベートした。条件３では、ＭＮＣをＣＤ８−ＰＲ３４＋接合体とインキュベートし、その後ビオチン化９Ｃ５およびストレプトアビジンビーズとインキュベートした。ストレプトアビジンビーズとのインキュベーション後、遊離の細胞を除去し、ストレプトアビジンビーズに結合した細胞を遊離のＰＲ３４＋（商標）ペプチドとインキュベートした。放出細胞を計数し、ＣＤ８＋細胞数をフローサイトメトリーを使用して評価した。ＣＤ８＋細胞を、ＣＤ３とＣＤ４との組み合わせを使用して定量した。ＣＤ３は、ｐａｎ
Ｔ細胞マーカーであり、ＣＤ３＋集団を、互いに排他的なＣＤ４＋およびＣＤ８陽性集団にさらに分けることができる。したがって、ＣＤ８＋細胞はまた、ＣＤ３＋／４−である主要な細胞と定義することができる。インキュベーション条件は、実施例ＩＩ記載のものと本質的に同一であった。
【０１３５】
表２に示すように、ＣＤ８＋細胞の約１９％が、ストレプトアビジンビーズのみで捕獲された（条件１）。それに対して、９０％を超えるＣＤ８＋細胞がビオチン化ＣＤ８抗体で捕獲され（条件２）、これは、抗ＣＤ８抗体でのＣＤ８＋細胞の有効な結合を示す。同様に、８３％を超えるＣＤ８＋細胞がＣＤ８−ＰＲ３４＋接合体で捕獲され（条件３）、これは、接合ＣＤ８抗体が単核細胞集団中のＣＤ８細胞を有効な結合が可能な抗原結合活性を保持していることを示していた。
【００】
【表２】単核細胞調製物からのＣＤ８細胞の選択

【０１３６】
ＣＤ８−ＰＲ３４＋接合体で捕獲したＣＤ８＋細胞と遊離ＰＲ３４＋（商標）放出ペプチドとのインキュベーションにより、収量１６％で純度６１％のＣＤ８＋細胞が得られた。ＣＤ３＋／４−細胞濃度（すなわち、ＣＤ８＋細胞）は、放出細胞では出発細胞集団よりも３．５倍高かった。しかし、遊離ＰＲ３４＋（商標）放出ペプチドを用いて脱離したＣＤ８＋細胞の収量は３％未満であった。条件２での低収量のＣＤ８＋細胞は、機械的放出が細胞放出に有意に寄与しないことを示す。
【０１３７】
これらの結果は、ＣＤ８−ＰＲ３４＋接合体を使用して単核細胞集団から対応する受容体（特に、ＣＤ８＋細胞）を有する細胞を単離することができ、これを使用して単核細胞集団中に存在するＣＤ８＋細胞を高い比率で単離することができることを示す。これらの結果はまた、捕獲細胞を、遊離のＰＲ３４＋（商標）ペプチドで放出させて、純度の高いＣＤ８＋細胞を得ることができることを示す。
【０１３８】
実施例ＩＶ
ＣＤ２＋Ｔ細胞の陽性選択
本実施例は、ペプチド−リガンド接合体を使用したＣＤ２＋ Ｔ細胞の陽性選択を記載する。
【０１３９】
本質的に実施例Ｉ記載のように、ＰＲ３４＋ペプチド−接合体の異なる細胞型を単離する能力を試験するために、ＰＲ３４＋（商標）ペプチドをＣＤ２抗体（Ｂ−Ｅ２；
ＩｇＧ２ｂイソ型；Ｄｉａｃｌｏｎｅ； Ｂｅｓａｎｃｏｎ； Ｆｒａｎｃｅ）に結合させた。ＣＤ２抗体に接合したＰＲ３４＋（商標）ペプチド（９０６９Ｎとも呼ばれる）を、ＣＤ２−９０６９Ｎと呼んだ。９０６９抗体としても知られるビオチン化９Ｃ５抗体を、ｂ−９０６９と呼んだ。
【０１４０】
可動または非可動ＭＮＣ調製物のいずれか（実施例ＩＩＩを参照のこと）を使用し、類似の結果が得られた。細胞を１μｇまたは５μｇのＣＤ２−９０６９Ｎ接合体と室温で１５分間インキュベートした（表３を参照のこと）。次いで、細胞を１μｇまたは１０μｇのビオチン化９Ｃ５抗体（ｂ−９０６９）およびストレプトアビジンビーズとインキュベートした。その後、結合した細胞を、緩衝液または２．５ｍｇの遊離ＰＲ３４＋（商標）ペプチド（９０６９Ｎ）のいずれかとインキュベートした。インキュベーション条件は、本質的に実施例ＩＩに記載されたものであった。次いで、放出細胞を定量し、純度を決定した。純度および細胞数を、抗ＣＤ３抗体およびトゥルーカウント（Ｔｒｕｅ
Ｃｏｕｎｔ）フローサイトメトリー定量法（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ； Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）を使用して評価した。
【０１４１】
表３に示すように、ＣＤ２−９０６９Ｎ接合体とのインキュベーションにより、高い割合（少なくとも７５％）のＣＤ２＋細胞が捕獲された。５μｇの接合体とインキュベートした場合、１μｇよりもわずかに捕獲効率が高いように思われた。これらの結果は、ＣＤ２−９０６９Ｎ接合体を使用して、高い割合のＣＤ２＋Ｔ細胞を単離することができることを示す。遊離ペプチドとのインキュベーションにより、高い割合（５０〜８７％）で捕獲ＣＤ２＋細胞が放出された。それに対して、緩衝液とのインキュベーションにより、少ない割合の捕獲細胞しか放出されなかった。これらの結果は、遊離のペプチドが、ＣＤ２−９０６９ペプチド接合体で捕獲された細胞を特異的に放出することができることを示す。遊離ペプチドによって放出された細胞の純度は高く、７０〜８９％の範囲であった。
【００】
【表３】ＣＤ２−９０６９Ｎを使用したＣＤ２＋ Ｔ細胞の陽性選択

【０１４２】
これらの結果は、ＣＤ２−ＰＲ３４＋ペプチド接合体を使用してＣＤ２＋細胞を単離することができ、遊離ＰＲ３４＋（商標）ペプチドを使用して純度の高い細胞を高い割合で放出させることができることを示す。これらの結果は、ペプチドを細胞特異的リガンドに結合させる場合、ペプチドに特異的なリガンドを離脱させることができるペプチド（ペプチド／リガンド対ＰＲ３４＋／９Ｃ５）を使用して、種々の細胞型を単離することができることも示す。
【０１４３】
実施例Ｖ
ビーズへの直接結合によるＣＤ２＋ Ｔ細胞の陽性選択
本実施例は、ビーズへのペプチド特異的抗体の直接結合によるＣＤ２ Ｔ細胞の陽性選択を記載する。
【０１４４】
本質的に実施例ＩＶ記載のように、ＣＤ２抗体Ｂ−Ｅ２をＰＲ３４（商標）ペプチドに接合した。ＭＮＣをＣＤ２−ＰＲ３４接合体を使用して本質的に実施例ＩＶ記載のようにインキュベートした。次いで、細胞をＭ−４５０
ダイナビーズ（Ｄｙｎａｌ）上に被覆したＣＤ３４抗体９０６９とインキュベートした。ＣＤ３４抗体被覆ビーズを、ビーズ表面への種々の量の抗ＣＤ３４抗体を吸収することによって調製した。ビーズを０μｇ、１μｇ、５μｇ、２０μｇ、または５０μｇの抗体／１０^８ビーズで予め結合させた。対照として、細胞のアリコートをストレプトアビジン被覆ダイナビーズとインキュベートした。
【０１４５】
表４に示すように、ＣＤ２細胞はダイナビーズ上に直接被覆したＣＤ３４抗体によって有効に捕獲された。示される割合は、ＣＤ２のようにＣＤ２細胞を定量するために使用したｐａｎ
Ｔ細胞マーカーである全ＣＤ３陽性細胞である。捕獲した細胞の割合は、試験した各量の抗体に類似していた。捕獲細胞の割合は、約６０〜７０％であり、ストレプトアビジンビーズで認められた８０％捕獲よりも幾らか低いだけであった。ストレプトアビジン被覆ダイナビーズ対照では、ビオチン化９０６９抗体（９Ｃ５）を使用した。
【００】
【表４】ＣＤ２−ＰＲ３４接合体を使用したＴ細胞選択およびダイナビーズへの抗体の直接結合による捕獲

（脚注）％は全ＣＤ３陽性細胞に対するものである。
^＊ダイナル（Ｄｙｎａｌ）Ｍ−４５０ダイナビーズを、ビーズ表面への種々の量の抗ＣＤ３４抗体の吸収によって調製した。数値は、μｇ抗体／１０^８ビーズである。
^＊＊ストレプトアビジン被覆ダイナビーズ対照
^＊＊＊ＣＤ３４抗体からのＣＤ２−ＰＲ３４接合体の離脱に、ＰＲ３４（商標）ＣＤ３４放出剤を使用した。
【０１４６】
ビーズと遊離ＰＲ３４（商標）ペプチドとのインキュベーションにより、約５０％またはそれ以上の収量のＣＤ２細胞が得られた。遊離ペプチドによって放出された細胞の純度は、９０％を超え、これはストレプトアビジンビーズから捕獲および放出された細胞の純度に匹敵した（表４を参照のこと）。
【０１４７】
これらの結果は、ペプチド−リガンド接合体によって結合した細胞を、ビーズへのペプチド特異的抗体の直接結合によって有効に捕獲することができることを示す。捕獲細胞を、ビーズから高純度で有効に放出することもできる。
【０１４８】
実施例ＶＩ
種々のペプチドを使用したＣＤ２抗体で捕獲した細胞の放出
本実施例は、種々のペプチドによる抗ＣＤ２抗体に結合した細胞の離脱を記載する。
【０１４９】
ＣＤ２モノクローナル抗体Ｂ−Ｅ２に親和性を示すペプチドを、ファージディスプレイバイオパニングによって単離した。抗ＣＤ２抗体Ｂ−Ｅ２へのＴ細胞の結合についての競合物として種々のペプチドを試験した。１ｍＭの各ペプチドを使用して競合アッセイ法を行った。ペプチドは、競合物ＣＤ２抗原と比較して２×１０^７倍モル過剰であり、抗ＣＤ２抗体と比較して６×１０^６倍モル過剰であった。ＦＡＣＳ競合アッセイ法を使用して競合を測定した（図３を参照のこと）。
【０１５０】
競合アッセイ法のために、０．５ｍｌの１ｍＭの種々のペプチド溶液を、１×１０^６末梢血単核細胞（ＭＮＣ）に添加し、その後１００μｌの０．０２μｇ／ｍｌのＣＤ２抗体（Ｂ−Ｅ２）を加え、室温で１５分間インキュベートした。細胞を溶解試薬（１５５ｍＭ塩化アンモニウム、１０ｍＭ重炭酸カリウム、および０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ）で１回洗浄し、２ｍｌのＰＡＨ（ＤＰＢＳ、１％ヒト血清アルブミン、０．０２％ＮａＮ_３）で２回洗浄した。１μｌのヤギＦ（ａｂ’）２断片である抗マウスＩｇＧ（重鎖＋軽鎖）−フィコエリトリン接合体（ＧＡＭ−ＰＥ；
Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ； Ｍｉａｍｉ ＦＬ）を各試料に加え、室温で１０分間インキュベートした。細胞を２ｍｌのＰＡＨ中で２回洗浄した。最終細胞ペレットを０．２５ｍｌの０．５％パラホルムアルデヒド中に再懸濁した。試料を、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１５１】
競合アッセイ法の結果を図３に示す。種々のペプチドは競合結合活性を示した。「^＊」で示したペプチドで処理した細胞はアポトーシスが認められた。
【０１５２】
いくつかのペプチドを、放出活性についてさらに試験した。簡単に述べれば、１００μｌの０．０２μｇ／ｍｌのＣＤ２抗体との１×１０^６個のＭＮＣの室温で１５分間のインキュベーションによってＦＡＣＳ放出アッセイ法を行った。細胞を２ｍｌの溶解試薬で１回洗浄し、２ｍｌのＰＡＨ溶液で２回洗浄した。０．５ｍｌの１ｍＭまたは５ｍＭペプチド保存液を細胞ペレットに加え、室温で３０分間インキュベートした。細胞を、２ｍｌのＰＡＨで２回洗浄した。１μｌのＧＡＭ−ＰＥを各試料に添加し、室温で１０分間インキュベートした。細胞を２ｍｌのＰＡＨ中で２回洗浄した。最終細胞ペレットを０．２５ｍｌの０．５％パラホルムアミド中に再懸濁した。試料を、フローサイトメトリーで分析した。
【０１５３】
放出アッセイ法では、１ｍＭまたは５ｍＭペプチド（図４で５ｍＭをインキュベートする以外は、１ｍＭのペプチド）のいずれかであった。ある場合、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）の存在下で、放出アッセイ法を行った。２つの異なる供与細胞のバッチを使用してアッセイ法を行った（図４に、供与細胞の第２のバッチを「^＊」で示した）。放出アッセイ法の結果を、図４に示す。環状ペプチドＲＣＲＲＰＡＴＴＰＡＣＲは、最も高い放出活性を示すように思われた。
【０１５４】
これらの結果は、種々のペプチドがＣＤ２抗体を離脱するように機能することができることを示す。
【０１５５】
実施例ＶＩＩ
Ｐａｎ−Ｏ−５モノクローナル抗体を使用したカンマ（Ｃａｍｍａ）細胞の陽性選択
本実施例は、乳房細胞系統を選択することができるＰａｎ−Ｏ−５モノクローナル抗体を使用したカンマ細胞（乳房細胞系統）の陽性選択を記載する。
【０１５６】
抗体被覆ビーズを調製するために、ダイナビーズ（Ｄｙｎａｌ）を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）で洗浄した。洗浄したビーズを５０μｇの抗ＣＤ３４モノクローナル抗体／１０^８ビーズで４℃で２４時間被覆した。ビーズをアイソレックス緩衝液で２回洗浄し、１％アルブミンのアイソレックス緩衝液と４℃で２４時間インキュベートした。
【０１５７】
Ｐａｎ−Ｏ−５−ＰＲ３４接合体を合成するために、Ｐａｎ−Ｏ−５モノクローナル抗体を、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドエステルと室温で３０分間インキュベートして抗体−リンカー複合体を作製した。抗体−リンカー複合体を、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）スピンカラム（３０ＫＤ；
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．； Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ）使用してＤ−ＰＢＳで２回洗浄した。Ｐａｎ−Ｏ−５−抗体−リンカー複合体を、ＰＲ３４（商標）ペプチドと室温で３０分間インキュベートした。Ｐａｎ−Ｏ−５−リンカー−ＰＲ３４抗体複合体をアミコンスピンカラム使用してＤ−ＰＢＳで２回洗浄した。接合体の濃度を、２８０ｎｍの吸光度によって測定した。
【０１５８】
細胞（１８×１０^６）を、Ｐａｎ−Ｏ−５−リンカー−ＰＲ３４抗体（５μｇ／ｍｌ）と１５分間インキュベートした。細胞抗体複合体をアイソレックス緩衝液で２回洗浄し、抗ＣＤ３４被覆ダイナビーズ（５ビーズ／細胞）と室温で３０分間インキュベートした。ダイナビーズを磁石で単離し、非結合細胞を除去した。ビーズ−細胞画分をＰＲ３４（商標）ペプチド（５ｍｇ／ｍｌ）と室温で３０分間インキュベートした。磁石を使用して、放出細胞を非放出細胞から分離した。結果を、図５に示す（Ｎ＝１）。
【０１５９】
図５に示すように、Ｐａｎ−Ｏ−５−リンカー−ＰＲ３４抗体は、９０％を超えるカンマ細胞を有効に捕獲した。ＰＲ３４（商標）ペプチドを使用して、７５％を超える細胞が放出された。カンマ細胞の収量は、７０％を超えていた。
【０１６０】
これらの結果は、細胞の陽性選択のためのペプチド−リガンド接合体の方法を、乳癌細胞を選択することができるＰａｎ−Ｏ−５抗体を含む種々の細胞型に特異的な種々の抗体と使用することができることを示す。
【０１６１】
本出願を通して、種々の刊行物が参照されている。これらの刊行物の開示の全体が、本発明が属する当技術分野の状態をより詳細に記載するために、本出願の本明細書に参照として組み入れられる。
【０１６２】
本発明を上記の実施例を参照して記載したが、本発明の精神を逸脱することなく種々の変更を行うことができると理解すべきである。したがって、本発明は、特許請求の範囲のみによって限定される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ペプチドに接合した標的特異的抗体およびペプチドに特異的な抗体を使用して標的細胞の捕獲および放出の略図を示す。上のパネルは、ストレプトアビジンビーズを使用したペプチド−抗体複合体の捕獲を示し、下のパネルはビーズへのペプチド特異的抗体の直接結合による捕獲を示す。
【図２】抗体−ペプチド接合体（抗体＋ＳＡ−ＰＥ）および抗体−ペプチド接合体および遊離のペプチド（抗体＋ペプチド＋ＳＡ−ＰＥ）の存在下でのＳＵＰ−Ｔ１細胞のみ（イソ型）のフローサイトメトリーを示す。
【図３】抗ＣＤ２抗体についての種々のペプチドの競争％を示す。
【図４】種々のペプチドを使用して抗ＣＤ２抗体に結合したＴ細胞の放出％を示す。星印は異なる供与細胞を使用した第２のアッセイ法からのデータを示す。
【図５】Ｐｎａ−Ｏ−５モノクローナル抗体を使用したカンマ細胞の陽性選択および遊離ペプチドでの放出を示す。
【図６】細胞亜集団の単離の概略図を示す。図６Ａは、２つの標的特異的抗体リガンド（それぞれ、抗体６および８）を使用した２つの細胞型２および４の単離を示す。両標的特異的リガンド６および８をペプチド１０に接合して、ペプチド特異的抗体リガンド１４によって認識されるペプチド−リガンド接合体１２を形成する。２つの標的特異的リガンド６および８に結合したペプチド１０は、対応するペプチド１０の遊離型を離脱させることができる同一のペプチドまたは異なるペプチドであり得る。遊離ペプチド１０の添加により、ペプチド特異的リガンド１４から細胞型２および４が放出される。図６Ｂは、２つの細胞型２および４の単離を示す。細胞型２の標的特異的リガンド６を使用して、細胞型２を単離する。標的特異的リガンド６をペプチド１０に接合して、ペプチド−リガンド接合体１２を形成する。ペプチド特異的リガンド１４はペプチド−リガンド接合体１２に結合する。ペプチド特異的リガンド１４はまた、細胞型４の標的特異的リガンドである。遊離ペプチド１０の添加により、ペプチド特異的リガンド１４から細胞型２および４が放出される。図６Ｃは、細胞型２のみが放出されるような第２の細胞型４の陰性選択による、例えば図６Ｂで単離した２つの細胞型２および４からの１つの細胞型２の単離を示す図である。細胞型２を、ペプチド１０に接合した標的特異的リガンド６に結合させて、ペプチド−リガンド接合体１２を形成する。図６Ｂに類似の細胞型４を、細胞型４の標的特異的リガンドでもあるペプチド特異的リガンド１４に結合する。細胞型４はペプチド１０で離脱されない第２の標的特異的リガンド１６とも結合する。遊離ペプチド１０を添加することで、細胞型２が放出されるが、細胞型４は標的特異的リガンド１６に捕獲されたままである。
【図７】本質的に図６Ｂで示した方法による２つの細胞型の単離を示す。ペプチドにより離脱されるＣＤ３４抗体は、ＣＤ３４細胞に直接結合する。ＣＤ３４抗体はまた、ペプチドに接合する間葉細胞（ＭＳＣ）特異的リガンドに結合する。ＣＤ３４細胞および間葉細胞の両方を、他の細胞から単離する。その後、ＣＤ３４細胞および間葉細胞は共に遊離型のペプチドにより固体支持体から放出される。

Claims (111)

1. 第１のリガンドに接合したペプチドを含み、遊離型の前記ペプチドが該ペプチドに特異的な第２のリガンドを離脱させることができる、ペプチド−リガンド接合体。
2. 第１のリガンドが細胞の表面上の標的分子に特異的に結合する、請求項１記載のペプチド−リガンド接合体。
3. 標的分子が細胞表面受容体である、請求項２記載のペプチド−リガンド接合体。
4. 第１のリガンドが抗体である、請求項１記載のペプチド−リガンド接合体。
5. 抗体が抗ＣＤ８抗体または抗ＣＤ２抗体である、請求項４記載のペプチド−リガンド接合体。
6. 第２のリガンドが抗体である、請求項１記載のペプチド−リガンド接合体。
7. 第２のリガンドがＣＤ３４に特異的に結合する、請求項１記載のペプチド−リガンド接合体。
8. 第２のリガンドがモノクローナル抗体９Ｃ５である、請求項７記載のペプチド−リガンド接合体。
9. ペプチドがＱＱＧＷＦＰ（配列番号１）；ＱＱＧＷＦＰＫＤ（配列番号２）；およびＱＱＧＷＦＰＫＤＣ（配列番号３）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１記載のペプチド接合体。
10. ペプチドがアシル化されている、請求項９記載のペプチド−リガンド接合体。
11. （ａ）細胞集団をペプチド−リガンド接合体に接触させ、接合体がペプチドに特異的な第２のリガンドを離脱させることができるペプチドに接合した前記集団中の細胞に特異的な第１のリガンドを含み、それにより細胞−接合体複合体を形成する工程と、
    （ｂ）ペプチド−リガンド接合体に第２のリガンドを接触させる工程と、
    （ｃ）細胞−接合体複合体を単離する工程とを含む、細胞を選択する方法。
12. （ｄ）細胞−接合体複合体を遊離型のペプチドに接触させ、それにより該細胞−接合体複合体から細胞を放出させる工程をさらに含む、請求項１１記載の方法。
13. 第１のリガンドが細胞表面上の標的分子に特異的に結合する、請求項１１記載の方法。
14. 標的分子が細胞表面受容体である、請求項１３記載の方法。
15. 第１のリガンドが抗体である、請求項１１記載の方法。
16. 抗体が抗ＣＤ８抗体または抗ＣＤ２抗体である、請求項１５記載の方法。
17. 第２のリガンドが抗体である、請求項１１記載の方法。
18. ペプチドがＱＱＧＷＦＰ（配列番号１）；ＱＱＧＷＦＰＫＤ（配列番号２）；およびＱＱＧＷＦＰＫＤＣ（配列番号３）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１１記載の方法。
19. 遊離型のペプチドがアミノ酸配列ＱＱＧＷＦＰ（配列番号１）またはＱＱＧＷＦＰＫＤ（配列番号２）を含む、請求項１２記載の方法。
20. ペプチドがアシル化されている、請求項１２記載の方法。
21. 第２のリガンドがＣＤ３４特異的抗体である、請求項１１記載の方法。
22. 抗体が９Ｃ５である、請求項２１記載の方法。
23. 細胞が幹細胞である、請求項１１記載の方法。
24. 幹細胞が血液産生幹細胞である、請求項２３記載の方法。
25. 血液産生幹細胞が造血幹細胞である、請求項２４記載の方法。
26. 幹細胞が間葉幹細胞、ニューロン幹細胞、または筋肉幹細胞である、請求項２３記載の方法。
27. 細胞が樹状細胞である、請求項１１記載の方法。
28. 細胞がＴ細胞である、請求項１１記載の方法。
29. 細胞が造血細胞である、請求項１１記載の方法。
30. 細胞がＣＤ３４＋細胞である、請求項２８記載の方法。
31. 細胞が腫瘍細胞である、請求項１１記載の方法。
32. 腫瘍細胞が、乳房、前立腺、結腸、肺、リンパ腫、骨髄腫、黒色腫、白血病、卵巣、膵臓、副腎、腎細胞癌、子宮頸部、肝臓、胃、および神経芽腫からなる群より選択される細胞である、請求項３１記載の方法。
33. （ａ）細胞集団をペプチド−リガンド接合体に接触させ、接合体がペプチドに特異的な第２のリガンドを離脱させることができるペプチドに接合した前記集団中の細胞に特異的な第１のリガンドを含み、それにより細胞−接合体複合体を形成する工程と、
    （ｂ）ペプチド−リガンド接合体に第２のリガンドを接触させる工程と、
    （ｃ）細胞−接合体複合体を単離する工程とを含む、細胞集団からの細胞を濃縮する方法。
34. （ｄ）細胞−接合体複合体をペプチドに接触させ、それにより、細胞−接合体複合体から細胞を放出させる工程をさらに含む、請求項３３記載の方法。
35. 第１のリガンドが細胞の表面上の標的分子に特異的に結合する、請求項３３記載の方法。
36. 標的分子が細胞表面受容体である、請求項３５記載の方法。
37. 第１のリガンドが抗体である、請求項３３記載の方法。
38. 抗体が抗ＣＤ８抗体または抗ＣＤ２抗体である、請求項３７記載の方法。
39. 第２のリガンドが抗体である、請求項３３記載の方法。
40. ペプチドがＱＱＧＷＦＰ（配列番号１）；ＱＱＧＷＦＰＫＤ（配列番号２）；およびＱＱＧＷＦＰＫＤＣ（配列番号３）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３３記載の方法。
41. 遊離型のペプチドがアミノ酸配列ＱＱＧＷＦＰ（配列番号１）またはＱＱＧＷＦＰＫＤ（配列番号２）を含む、請求項３４記載の方法。
42. ペプチドがアシル化されている、請求項３３記載の方法。
43. 第２のリガンドがＣＤ３４特異的抗体である、請求項３３記載の方法。
44. 抗体が９Ｃ５である、請求項４３記載の方法。
45. 細胞が幹細胞である、請求項３３記載の方法。
46. 幹細胞が血液産生幹細胞である、請求項４５記載の方法。
47. 血液産生幹細胞が造血幹細胞である、請求項４６記載の方法。
48. 幹細胞が間葉幹細胞、ニューロン幹細胞、または筋肉幹細胞である、請求項４５記載の方法。
49. 細胞が樹状細胞である、請求項３３記載の方法。
50. 細胞がＴ細胞、ナイーブＴ細胞、記憶Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞である、請求項３３記載の方法。
51. 細胞が造血細胞である、請求項３３記載の方法。
52. 細胞がＣＤ３４＋細胞である、請求項５０記載の方法。
53. 細胞が腫瘍細胞である、請求項３３記載の方法。
54. 腫瘍細胞が、乳房、前立腺、結腸、肺、リンパ腫、骨髄腫、黒色腫、白血病、卵巣、膵臓、副腎、腎細胞癌、子宮頸部、肝臓、胃、および神経芽腫からなる群より選択される細胞である、請求項５３記載の方法。
55. （ａ）細胞集団を含む試料をペプチド−リガンド接合体に接触させ、接合体がペプチドに特異的な第２のリガンドを離脱させることができるペプチドに接合した前記集団中の細胞に特異的な第１のリガンドを含み、それにより細胞−接合体複合体を形成する工程と、
    （ｂ）ペプチド−リガンド接合体に第２のリガンドを接触させる工程と、
    （ｃ）細胞−接合体複合体を単離する工程と、
    （ｄ）複合体中の細胞を同定する工程とを含み、該細胞が病態に関連する、病態を診断する方法。
56. （ｅ）細胞−接合体複合体をペプチドに接触させ、それにより細胞−接合体複合体から細胞を放出させる工程をさらに含む、請求項５５記載の方法。
57. 病態が癌である、請求項５５記載の方法。
58. 癌が、乳癌、前立腺癌、結腸、肺、リンパ腫、骨髄腫、黒色腫、白血病、卵巣、膵臓、副腎、腎細胞癌、子宮頸部、肝臓、胃、および神経芽腫からなる群より選択される、請求項５７記載の方法。
59. 第１のリガンドが細胞の表面上の標的分子に特異的に結合する、請求項５５記載の方法。
60. 第１のリガンドが抗体である、請求項５５記載の方法。
61. 第２のリガンドが抗体である、請求項５５記載の方法。
62. ペプチドがＱＱＧＦＰ（配列番号１）；ＱＱＧＷＦＰＫＤ（配列番号２）；およびＱＱＧＷＦＰＫＤＣ（配列番号３）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５５記載の方法。
63. 遊離型のペプチドがアミノ酸配列ＱＱＧＷＦＰ（配列番号１）またはＱＱＧＷＦＰＫＤ（配列番号２）を含む、請求項５６記載の方法。
64. 抗体が９Ｃ５である、請求項５５記載の方法。
65. ペプチドおよび抗体に特異的な抗体を離脱させることができるペプチドを含む、細胞単離用キット。
66. ペプチドが標的分子に指向するリガンドに接合される、請求項６５記載のキット。
67. ペプチドがＱＱＧＷＦＰ（配列番号１）；ＱＱＧＷＦＰＫＤ（配列番号２）；およびＱＱＧＷＦＰＫＤＣ（配列番号３）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６５記載のキット。
68. ペプチドがアミノ酸配列ＱＱＧＷＦＰＫＤＣ（配列番号１）を含む、請求項６５記載のキット。
69. ペプチドがアシル化される、請求項６７記載のキット。
70. 抗体がＣＤ３４に特異的に結合する、請求項６５記載のキット。
71. 抗体が９Ｃ５である、請求項７０記載のキット。
72. 細胞表面受容体に結合するリガンドに接合したペプチドを含むペプチド−リガンド接合体をさらに含む、請求項６５記載のキット。
73. （ａ）細胞集団をペプチド特異的リガンドに接触させ、細胞集団がペプチドに融合した細胞表面融合ポリペプチドを発現する細胞を含み、遊離型のペプチドが融合ポリペプチドに結合したペプチド特異的リガンドを離脱させることができ、それにより細胞−ペプチドリガンド複合体を形成する工程と、
    （ｂ）細胞−ペプチドリガンド複合体を単離する工程とを含む、細胞を選択する方法。
74. （ｃ）細胞−ペプチドリガンド複合体を遊離型のペプチドに接触させ、それにより該細胞−ペプチドリガンド複合体から細胞を放出させる工程をさらに含む、請求項７３記載の方法。
75. 

    からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド。
76. （ａ）細胞集団に、ペプチド−リガンド接合体を接触させ、接合体が集団中の第１の細胞に特異的な第１のリガンドを含み、第１のリガンドがペプチド特異的リガンドを離脱させることができるペプチドに接合されており、それにより第１の細胞−接合体複合体を形成し、
    細胞集団に、該集団中の第２の細胞に特異的な第２のリガンドと接触させ、それにより第２の細胞−第２のリガンド複合体が形成される工程と、
    （ｂ）ペプチド−リガンド接合体にペプチド特異的リガンドを接触させる工程と、
    （ｃ）第１の細胞−接合体複合体および第２の細胞−第２のリガンド複合体を単離する工程とを含む、細胞亜集団を選択する方法。
77. 第２のリガンドがペプチド特異的リガンドである、請求項７６記載の方法。
78. （ｄ）第１の細胞−接合体複合体および第２の細胞−第２のリガンド複合体に遊離型のペプチドを接触させ、それにより該第１の細胞−接合体複合体から第１の細胞を放出させ、該第２の細胞−第２のリガンド接合体から第２の細胞を放出させる工程をさらに含む、請求項７７記載の方法。
79. 第２のリガンドがペプチドに接合されている、請求項７６記載の方法。
80. （ｄ）第１の細胞−接合体複合体および第２の細胞−第２のリガンド複合体に遊離型のペプチドを接触させ、それにより該第１の細胞−接合体複合体から第１の細胞を放出させ、該第２の細胞−第２のリガンド接合体から第２の細胞を放出させる工程をさらに含む、請求項７９記載の方法。
81. 第２のリガンドが第２のペプチド特異的リガンドを離脱させることができる第２のペプチドに接合している、請求項７６記載の方法。
82. （ｄ）第１の細胞−接合体複合体に遊離型のペプチドを接触させ、第２の細胞−第２のリガンド複合体に遊離型の第２のペプチドを接触させ、それにより該第１の細胞−接合体複合体から第１の細胞を放出させ、該第２の細胞−第２のリガンド接合体から第２の細胞を放出させる工程をさらに含む、請求項８１記載の方法。
83. 第１のリガンドが第１の細胞の表面上の標的分子に特異的に結合する、請求項７６記載の方法。
84. 標的分子が細胞表面受容体である、請求項８３記載の方法。
85. 第２のリガンドが第２の細胞の表面上の標的分子に特異的に結合する、請求項７６記載の方法。
86. 標的分子が細胞表面受容体である、請求項８５記載の方法。
87. 第１および第２のリガンドが抗体である、請求項７６記載の方法。
88. 抗体が抗ＣＤ８抗体または抗ＣＤ２抗体である、請求項８７記載の方法。
89. ペプチド特異的リガンドが抗体である、請求項７６記載の方法。
90. ペプチドがＱＱＧＷＦＰ（配列番号１）；ＱＱＧＷＦＰＫＤ（配列番号２）；およびＱＱＧＷＦＰＫＤＣ（配列番号３）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７６記載の方法。
91. 遊離型のペプチドがアミノ酸配列ＱＱＧＷＦＰ（配列番号１）またはＱＱＧＷＦＰＫＤ（配列番号２）を含む、請求項８０記載の方法。
92. ペプチドがアシル化される、請求項９１記載の方法。
93. ペプチド特異的リガンドがＣＤ３４特異的抗体である、請求項７６記載の方法。
94. 抗体が９Ｃ５である、請求項９３記載の方法。
95. 第１および第２の細胞が幹細胞である、請求項７６記載の方法。
96. 幹細胞が血液産生幹細胞である、請求項９５記載の方法。
97. 血液産生幹細胞が造血幹細胞である、請求項９６記載の方法。
98. 幹細胞が間葉幹細胞、ニューロン幹細胞、または筋肉幹細胞である、請求項９５記載の方法。
99. 第１および第２の細胞が樹状細胞である、請求項７６記載の方法。
100. 細胞がＴ細胞である、請求項７６記載の方法。
101. 細胞が造血細胞である、請求項７６記載の方法。
102. 細胞がＣＤ３４＋細胞である、請求項１００記載の方法。
103. 細胞が腫瘍細胞である、請求項７６記載の方法。
104. 腫瘍細胞が、乳房、前立腺、結腸、肺、リンパ腫、骨髄腫、黒色腫、白血病、卵巣、膵臓、副腎、腎細胞癌、子宮頸部、肝臓、胃、および神経芽腫からなる群より選択される細胞である、請求項１０３記載の方法。
105. （ａ）細胞集団にペプチド−リガンド接合体を接触させ、接合体がペプチド特異的リガンドを離脱させることができるペプチドに接合した集団中の第１の細胞に特異的な第１のリガンドを含み、ペプチド特異的リガンドが該集団中の第２の細胞に結合し、それにより細胞−接合体複合体を形成する工程と、
     （ｂ）ペプチド−リガンド接合体にペプチド特異的リガンドを接触させる工程と、
     （ｃ）細胞集団に第２の細胞に特異的な第２のリガンドを接触させ、第２のリガンドがペプチドによって離脱されず、該ペプチド特異的リガンドと別の部位に結合する工程と、
     （ｄ）細胞−接合体複合体を単離する工程とを含む、細胞を選択する方法。
106. （ｄ）細胞−接合体複合体に遊離型のペプチドを接触させ、それにより該細胞−接合体複合体から第１の細胞を放出させる工程をさらに含む、請求項１０５記載の方法。
107. ＣＤ３４細胞および少なくとも１つの他の特異的に単離された細胞型を含む、実質的に純粋な細胞亜集団。
108. 他の特異的に単離された細胞型が、間葉細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、および増強細胞からなる群より選択される、請求項１０７記載の実質的に純粋な細胞亜集団。
109. 請求項１０７記載の実質的に純粋な細胞亜集団を投与することを含む、個体の病態を治療する方法。
110. 病態が移植である、請求項１０９記載の方法。
111. 病態が癌または免疫抑制である、請求項１０９記載の方法。

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