JP2004500371A - 硫化オリゴヌクレオチドの改善された合成 - Google Patents
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Abstract
硫化オリゴヌクレオチドを形成する方法が提供される。この方法は、複雑な溶媒混合液の必要性及び洗浄又は溶媒変更の繰返しなしに、オリゴヌクレオチド又はその類縁体中でのホスホロチオエート連結の形成を可能にする。本発明の方法により、約８〜約５０のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが、従来報告されたよりも高い収率で硫化されることができる。
Description
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、硫化オリゴヌクレオチド及びその類縁体を合成する方法に関する。この方法は、単純化された溶媒系においてフェニルアセチルジスルフィド試薬を用いて、大きな効率と改善された収率でホスホロチオエート基を有するオリゴヌクレオチドを生成する。
【０００２】
【発明の背景】
修飾されたオリゴヌクレオチドは、分子生物学研究において及び抗ウイルス療法のような用途において大きな価値がある。ＲＮＡ翻訳を遮断することができ、かつヌクレアーゼ耐性である修飾オリゴヌクレオチドは、アンチセンス試薬として有用である。ホスホロチオエート連結（Ｐ−Ｓ）を含有する硫化オリゴヌクレオチドは、これら分野で興味の対象である。ホスホロチオエート含有オリゴヌクレオチドは、核酸を認識する一定の酵素の立体化学的経路を確認するのにも有用である。
リン含有化合物の硫化のための標準的技術が、硫化オリゴヌクレオチドの合成に適用されてきた。ホスホロチオエート結合を含有するオリゴヌクレオチドを合成するのに使用されてきた硫化試薬の例には、原子状硫黄、ジベンゾイルテトラスルフィド、３−Ｈ−１，２−ベンジジチオール−３−オン・１，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬としても知られる）、テトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）、及びビス（Ｏ，Ｏ−ジイソプロポキシホスフィノチオイル）ジスルフィド（Ｓｔｅｃ試薬として知られる）が含まれる。
【０００３】
原子状硫黄は、殆どの有機溶媒に溶解しないという問題があるので、自動化には適していない。更には、硫黄の好ましい供給源である二硫化炭素は、望ましくない揮発性と望ましくなく低い引火点とを有している。ジベンゾイルテトラスルフィドを使用すると、不要な副生成物が観察されることが多い。Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬は比較的効率的な硫化試薬であるが、合成するのが難しくまた安定であるという訳ではない。更には、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬を使用すると、強力な酸化剤である副反応生成物を形成する （Ｒ．Ｐ． Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１２， ｐｐ． １２５３−１２５４ （１９９０）； Ｒ．Ｐ． Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ５５， ４６９３−４６９９ （１９９０）） 。これは、更に、目的の反応生成物から分離し難い不要な副生成物をもたらし得る。テトラエチルチウラムジスルフィドは、比較的安価で安定であるが、望ましくなく低い硫化反応速度しか持たない。
【０００４】
亜リン酸エステルとアシルジスルフィドの反応によりホスホロチオエートエステルを製造する方法が、オランダ特許出願第８９０２５２１号に開示されている。その開示された方法は、精製されたホスホトリエステルダイマーに液相化学を利用して適用される。その方法は、第１段階の合成をアセトニトリル中で行なうこと（亜リン酸の形成）、そのアセトニトリルを除去すること、その中間体ホスホトリエステルを精製すること、及びジクロロエタン（ＤＣＥ）と２，４，６−コリジンの溶媒混合液中で硫化を進行させることを包含する複雑なスキームでのみ可能であることが示されたという点で時間及び労力集約的である。更には、この方法は、ジヌクレオチドで実証されたに過ぎない。このオランダ方法が、より大きな核酸構造体で用いられ得るという示唆も、全ての合成工程を通して共通の溶媒を使用できるという示唆も、向上した収率が得られるという示唆も、そして、自動化のスキームを大きく変更することなく慣用的な自動化合成に適合できるという示唆もなかった。幾つかの可能な溶媒の１つとしてアセトニトリルが挙げられたが、全ての合成工程を共通溶媒としてのアセトニトリル中で行なうための方法の有用性は示されなかった。他の刊行物 （Ｋａｍｅｒ ｅｌ ａｌ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３０（４８）， ｐｐ． ６７５７−６７６０ （１９８９）； Ｒｏｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃｈ． Ｔｒａｖ． Ｃｈｉｍ． Ｐａｙｓ−Ｂａｓ １１０， ｐｐ． ３２５−３３１ （１９９１）） が６までのヌクレオチドを有するオリゴマーの硫化を示しているが、これら刊行物に開示された方法によっては上述の欠点は克服されていない。
かくして、オリゴヌクレオチド及び他の有機化合物におけるホスホロチオエート連結のような硫黄含有リン基を製造するための改善された方法及び試薬の必要性が存在している。本発明は、これら、並びに他の重要な目標に向けられている。
【０００５】
【発明の要旨】
本発明は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの、従来法で得られるものに比較して向上した収率での合成方法を提供する。更には、本方法は、比較的大きな数のヌクレオチド及び／又はヌクレオシド単位をその中に有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドだけでなく、例えば、約６〜約５０以上、特に約８〜約３０のヌクレオチド及び／又はヌクレオシド単位を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成にとって有用である。本発明の方法は、自動化合成反応スキーム及び商業的合成装置に適合性である、大きく単純化された溶媒系を用いる。合成機会の向上は、核酸化学全体を通しての本方法の広い用途を可能にする。
【０００６】
本発明の一つの側面は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成方法であって、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオシドの５’−ヒドロキシル基を亜リン酸化する工程、及び得られたその亜リン酸中間体を、アセトニトリルを含む溶媒系の存在下でフェニルアセチルジスルフィドと、ホスホロチオエート官能基の形成をもたらすのに十分な時間接触させる工程を含んでなる方法を開示する。予め決められた長さ及び配列を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが、亜リン酸化工程と酸化工程を繰り返すことにより製造され得る。
本発明の更なる側面では、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド類縁体の合成方法であって、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオシドを、修飾されたヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオシドに置き換えることを含んでなる方法が開示される。ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオシドへの修飾は、当該技術分野で周知である。本明細書で使用される“ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド”という用語は、上で定義された類縁体を包含させようとするものである。
【０００７】
本明細書で使用される“亜リン酸部分”という用語は、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオシド内における亜リン酸部分を包含させようとするものである。好ましい態様では、亜リン酸部分は、ジメトキシトリチルホスホロアミダイトのような活性化された状態の亜リン酸部分である。本明細書で使用される“ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオシド”という用語は、当業者によって知られる、天然に存在する種及び天然に存在しないか若しくは修飾された種を包含させようとするものである。普通の修飾には、２’修飾のような糖修飾及び塩基修飾又は代替塩基の使用が含まれる。オリゴヌクレオチド又は修飾されたオリゴヌクレオチドが亜リン酸部分として使用されるとき、当該技術分野で普通に知られた修飾された連結も存在してよい。
【０００８】
本方法は、酸化工程の溶媒としてＤＣＥが使用されたときに比べて、不純物のレベルが低くかつ収率が低いことを証明した。本方法は、意外にも、アセトニトリル／ピコリン中では約９９％の収率が得られることを示した。アセトニトリル／ピコリンは、合成常識に大きな変更を加えることなしに自動化された合成法と全く適合性であるので、本方法は、自動化された合成装置において有利に使用れることができる。例えば、全ての自動化された合成工程で、単一溶媒又は共通の溶媒を有する混合液が使用されるので、広汎な洗浄を要しない。かくして、溶媒除去及び洗浄工程を排除することができる。驚いたことに、約８から約３０までのヌクレオチドを有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類縁体を合成するときに、高い収率が達成され得ることが発見された。
【０００９】
本発明の亜リン酸中間体の酸化における使用に適する溶媒系には、２又はそれを越える溶媒の混合液が含まれる。好ましくは、非プロトン性溶媒とプロトン性溶媒又は塩基性溶媒との混合液である。好ましい溶媒混合液には、アセトニトリル／ピコリン及びアセトニトリル／ルチジンが含まれる。適する非プロトン性溶媒には、ピリジン及び、ルチジン、コリジン及びピコリンのようなヒンダードピリジンが含まれる。溶媒混合液は、例えば、約１：１．５〜約１．５：１、好ましくは約１：１の容量割合のアセトニトリルとピコリン又はアセトニトリルとルチジンのような２溶媒系を含むことができる。
本発明の方法による硫化（硫化試薬を用いる酸化）は、オリゴヌクレオチド又はその類縁体をアセチルジスルフィドと、ホスホロチオエート官能基の形成をもたらすのに十分な時間接触させることによって行なわれる。好ましい試薬には、フェニルアセチルジスルフィド、アリールアセチルジスルフィド、及びアリール置換フェニルアセチルジスルフィドが含まれる。
【００１０】
亜リン酸部分をアセチルジスルフィドと接触させることは、当業者に知られた操作及び装置を使用して行なわれる。例えば、フラスコのようなガラス反応器を使用するのが適当である。好ましくは、固相合成法、及び制御有孔ガラスのような固体支持体が用いられる。より好ましくは、本発明の方法は、自動ＤＮＡ合成装置を使用して行なわれることができる。自動合成技術を包含する適する固相技術は、Ｆ． Ｅｃｋｓｔｅｉｎ （ｅｄ．）， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ， ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ． Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９１） に記載されている。
本発明の方法は、室温で行なわれることができる。“室温”は、約２０〜約３０℃の周囲温度を包含する。反応時間は、例えば、２、３、４又は５分間のような分のオーダーであるか、又は約１００秒という短さであったもよい。
【００１１】
一般に、本発明の方法は、核酸部分の５’−ヒドロキシル基を亜リン酸化して亜リン酸中間体を形成し、そしてその亜リン酸中間体をアセチルジスルフィドで、その亜リン酸中間体をホスホロチオエートへ転化するのに十分な時間酸化することを包含する。その亜リン酸中間体は、例えば、亜リン酸で連結したジヌクレオチドであるか、又はその中に少なくとも１つの亜リン酸連結を有するオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオシドであることができる。本法の亜リン酸化及び酸化は、両方ともアセトニトリルを包含する系で行なわれる。亜リン酸化及び酸化工程の繰り返しで、予め決められた長さを有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを与えるであろう。反応過程は、プロトン又は３１ＰＮＭＲのような周知の技術によって追跡されることができる。反応生成物は、例えば、約３０％の濃度の水酸化アンモニウム溶液のような塩基で処理されることができる。目的の生成物は、例えば、標準的濾過技術によって容易に単離されることができる。
以下の実施例は、単に本発明を例示するだけであって、本発明の範囲を限定するものと考えられるべきではない。これら実施例とその均等物が、本発明の開示及び添付の請求の範囲を参照することによって、当業者により明らかになるであろう。
【００１２】
【実施例】
実施例１
５’−ＴＴＴＴＴＴＴ’−３’ホスホロチオエートヘプタマーの合成
エステル連結を介してＣＰＧ（制御有孔ガラス）に結合した５０ｍｇ（２μモル）の５’−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジンが、ガラス反応器内に入れられ、そして２％ジクロロ酢酸（容量／容量）のジクロロメタン溶液が加えられて、その５’−ヒドロキシル基が脱保護される。その生成物がアセトニトリルで洗浄される。次いで、アセトニトリル中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の０．２Ｍ溶液及びアセトニトリル中の１Ｈ−テトラゾールの０．４Ｍ溶液が加えられ、室温で５分間反応させられる。その生成物は、アセトニトリルで洗浄されてから、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液が加えられ、室温で３分間反応させられる。この硫化工程がもう１回３分間繰り返される。その支持体がアセトニトリルで洗浄され、次いで、無水酢酸／ルチジン／ＴＨＦ（１：１：８）とＮ−メチルイミダゾール／ＴＨＦの溶液が加えられて、あらゆる未反応５’−ヒドロキシル基がキャップされる。その生成物はアセトニトリルで洗浄される。
この全部のサイクルが、あと５回繰り返されて、完全に保護されたチミジンヘプタマーが生成する。その化合物を含有するキャリヤは、３０％水酸化アンモニウム水溶液で室温で９０分間処理される。その水溶液が濾過され、減圧濃縮されて、ホスホロチオエートヘプタマー，ＴＴＴＴＴＴＴ が得られる。
【００１３】
実施例２
５’−ｄ（ＧＡＣＴ）−３’ ホスホロチオエートテトラマーの合成
エステル連結を介してＣＰＧ（制御有孔ガラス）に結合した５０ｍｇ（２×１０−６モル（２μモル））の５’−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジンが、ガラス反応器内に入れられ、そして２％ジクロロ酢酸（容量／容量）のジクロロメタン溶液が加えられて、その５’−ヒドロキシル基が脱保護される。その生成物がアセトニトリルで洗浄される。次いで、アセトニトリル中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の０．２Ｍ溶液及びアセトニトリル中の１Ｈ−テトラゾールの０．４Ｍ溶液が加えられ、室温で５分間反応させられる。その生成物は、アセトニトリルで洗浄されてから、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液が加えられ、室温で３分間反応させられる。この硫化工程がもう１回３分間繰り返される。その支持体がアセトニトリルで洗浄され、次いで、無水酢酸／ルチジン／ＴＨＦ（１：１：８）とＮ−メチルイミダゾール／ＴＨＦの溶液が加えられて、未反応５’−ヒドロキシル基がキャップされる。その生成物はアセトニトリルで洗浄される。
２％ジクロロ酢酸（容量／容量）の溶液が加えられて、その５’−ヒドロキシル基が脱保護される。その生成物がアセトニトリルで洗浄される。次いで、アセトニトリル中のＮ４ −ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の０．２Ｍ溶液及びアセトニトリル中の１Ｈ−テトラゾールの０．４Ｍ溶液が加えられ、室温で５分間反応させられる。その生成物は、アセトニトリルで洗浄されてから、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液が加えられ、室温で３分間反応させられる。この硫化工程がもう１回３分間繰り返される。その支持体がアセトニトリルで洗浄され、次いで、無水酢酸／ルチジン／ＴＨＦ（１：１：８）とＮ−メチルイミダゾール／ＴＨＦの溶液が加えられて、あらゆる未反応５’−ヒドロキシル基がキャップされる。その生成物はアセトニトリルで洗浄される。
２％ジクロロ酢酸（容量／容量）の溶液が加えられて、その５’−ヒドロキシル基が脱保護される。その生成物がアセトニトリルで洗浄される。次いで、無水アセトニトリル中のＮ６ −ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシアデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の０．２Ｍ溶液及びアセトニトリル中の１Ｈ−テトラゾールの０．４Ｍ溶液が加えられ、室温で５分間反応させられる。その生成物は、アセトニトリルで洗浄されてから、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液が加えられ、室温で３分間反応させられる。この硫化工程がもう１回３分間繰り返される。その支持体がアセトニトリルで洗浄され、次いで、無水酢酸／ルチジン／ＴＨＦ（１：１：８）とＮ−メチルイミダゾール／ＴＨＦの溶液が加えられて、未反応５’−ヒドロキシル基がキャップされる。その生成物はアセトニトリルで洗浄される。
２％ジクロロ酢酸（容量／容量）の溶液が加えられて、その５’−ヒドロキシル基が脱保護される。その生成物がアセトニトリルで洗浄される。次いで、アセトニトリル中のＮ２ −イソブチリル−５’−Ｏ−４，４’−ジメトキシトリチル−デオキシグアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の０．２Ｍ溶液及びアセトニトリル中の１Ｈ−テトラゾールの０．４Ｍ溶液が加えられ、室温で５分間反応させられる。その生成物は、アセトニトリルで洗浄されてから、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液が加えられ、室温で３分間反応させられる。この硫化工程がもう１回３分間繰り返される。その支持体がアセトニトリルで洗浄され、次いで、無水酢酸／ルチジン／ＴＨＦ（１：１：８）とＮ−メチルイミダゾール／ＴＨＦの溶液が加えられて、あらゆる未反応５’−ヒドロキシル基がキャップされる。その生成物はアセトニトリルで洗浄される。
その化合物を含有するキャリヤは、３０％水酸化アンモニウム水溶液で室温で９０分間処理されてから、５５℃で２４時間インキュベートされる。その水溶液が濾過され、減圧濃縮されて、ホスホロチオエートテトラマー，５’−ｄＧ−ｄＡ−ｄＣ−Ｔ−３’が得られる。
【００１４】
実施例３
完全に修飾された ５’−ｄ（ＴＣＣ−ＣＧＣ−ＣＴＧ−ＴＧＡ−ＣＡＴ−ＧＣＡ−ＴＴ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：１＞の合成
上記配列の合成が、上記のシアノエチルホスホロアミダイト及び Ｐｈａｒｍａｃｉａのプライマー支持体を使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で６２０μモルスケールで行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体がアセトニトリルで洗浄され、切り離され、脱保護され、そして先に示したようにして精製された。
【００１５】
実施例４
完全に修飾された ５’−ｄ（ＧＣＣ−ＣＡＡ−ＧＣＴ−ＧＧＣ−ＡＴＣ−ＣＧＴ−ＣＡ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：２＞の合成
上記配列の合成が、上記のシアノエチルホスホロアミダイト及び Ｐｈａｒｍａｃｉａのプライマー支持体を使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で６２０μモルスケールで行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体がアセトニトリルで洗浄され、切り離され、脱保護され、そして先に示したようにして精製された。
【００１６】
実施例５
完全に修飾された ５’−ｄ（ＧＣＧ−ＴＴＴ−ＧＣＴ−ＣＴＴ−ＣＴＴ−ＣＴＴ−ＧＣＧ）−３’ ホスホロチオエート２１マー＜配列番号：３＞の合成
上記配列の合成が、上記のシアノエチルホスホロアミダイト及び Ｐｈａｒｍａｃｉａのプライマー支持体を使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で６２０μモルスケールで行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体がアセトニトリルで洗浄され、切り離され、脱保護され、そして先に示したようにして精製された。
【００１７】
実施例６
完全に修飾された ５’−ｄ（ＧＴＴ−ＣＴＣ−ＧＣＴ−ＧＧＴ−ＧＡＧ−ＴＴＴ−ＣＡ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：４＞の合成
上記配列の合成が、上記のシアノエチルホスホロアミダイト及び Ｐｈａｒｍａｃｉａのプライマー支持体を使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で６２０μモルスケールで行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体がアセトニトリルで洗浄され、切り離され、脱保護され、そして先に示したようにして精製された。
【００１８】
実施例７
完全に修飾された ５’−ｄ（ＴＣＣ−ＣＧＣ−ＣＴＧ−ＴＧＡ）−２’−メトキシエチル−（ＣＡＵ−ＧＣＡ−ＵＵ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：５＞の合成
上記配列の合成が、上記のシアノエチルホスホロアミダイト及び Ｐｈａｒｍａｃｉａのプライマー支持体を使用して、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ ８８００ 合成装置で２８２μモルスケールで行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．４Ｍ溶液を使用して６分間行なわれた。合成の最後に、その支持体がアセトニトリルで洗浄され、切り離され、脱保護され、そして先に示したようにして精製された。
【００１９】
実施例８
完全に修飾された ５’−ｄ（ＴＣＣ−ＣＧＣ−ＣＴＧ−ＴＧＡ）−２’−メトキシエチル−（ＣＡＵ−ＧＣＡ−ＵＵ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：６＞の合成
上記配列の合成が、上記のシアノエチルホスホロアミダイト及び Ｐｈａｒｍａｃｉａのプライマー支持体を使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で２５０μモルスケールで行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．４Ｍ溶液を使用して１０分間行なわれた。合成の最後に、その支持体がアセトニトリルで洗浄され、切り離され、脱保護され、そして先に示したようにして精製された。
【００２０】
実施例９
完全に修飾された ５’−［２’−メトキシエチル（ＧＣＧＵＵＵＧ）−ｄ［ＣＴＣＴＴＣＴ］−［２’− メトキシエチル−（ＵＣＵＵＧＣ）−ｄＧ−３’ ホスホロチオエート２１マー＜配列番号：７＞の合成
上記配列の合成が、上記のシアノエチルホスホロアミダイト及び Ｐｈａｒｍａｃｉａのプライマー支持体を使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で２５０μモルスケールで行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．４Ｍ溶液を使用して６分間行なわれた。合成の最後に、その支持体がアセトニトリルで洗浄され、切り離され、脱保護され、そして先に示したようにして精製された。
【００２１】
実施例１０
完全に修飾された ５’−ｄ（ＧＣＣ−ＣＡＡ−ＧＣＴ−ＧＧＣ）−２’−メトキシエチル−（ＡＵＣ−ＣＧＵ−ＣＡ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：８＞の合成
上記配列の合成が、上記のシアノエチルホスホロアミダイト及び Ｐｈａｒｍａｃｉａのプライマー支持体を使用して、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ ８８００ 合成装置で５６５μモルスケールで行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．４Ｍ溶液を使用して６分間行なわれた。合成の最後に、その支持体がアセトニトリルで洗浄され、切り離され、脱保護され、そして先に示したようにして精製された。
【００２２】
実施例１１
完全に修飾された ５’−ｄ（ＧＣＣ−ＣＡＡ−ＧＣＴ−ＧＧＣ）−２’−メトキシエチル−（ＡＵＣ−ＣＧＵ−ＣＡ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：９＞の合成
上記配列の合成が、上記のシアノエチルホスホロアミダイト及び Ｐｈａｒｍａｃｉａのプライマー支持体を使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で６８０μモルスケールで行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．４Ｍ溶液を使用して６分間行なわれた。合成の最後に、その支持体がアセトニトリルで洗浄され、切り離され、脱保護され、そして先に示したようにして精製された。
【００２３】
実施例１２
完全に修飾された ５’−［２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：１０＞の合成
上記ホモピリミジン配列の合成が、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジンのシアノエチルホスホロアミダイトを使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で１８０μモルスケールで行なわれた。２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジンが付けられた ＰｈａｒｍａｃｉａのＨＬ３０プライマー支持体が使用された。脱トリチル化がトルエン中の３％ジクロロ酢酸（容量／容量）を使用して行なわれた。ホスホロアミダイトの活性化は、アセトニトリル中の１Ｈ−テトラゾールの０．４５Ｍ溶液で行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体はトリエチルアミン：アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ）の溶液で１２時間処理され、アセトニトリルで洗浄され、オリゴヌクレオチドが切り離され、そして３３％水溶液アンモニウム水溶液で５５℃で１２時間かけて脱保護され、冷却され、濃縮され、そして逆相ＨＰＬＣにより精製された。全てのＤＭＴ画分が一つにされ、キャピラリーゲル電気泳動により分析され、脱トリチル化され、析出され、そして粉末へと凍結乾燥された。この段階的硫化の効率は、３１ＰＮＭＲ（Ｄ２ Ｏ）に基づき９９．６％と分かった。
【００２４】
実施例１３
完全に修飾された ５’−［２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：１０＞の合成
上記ホモピリミジン配列の合成が、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジンのシアノエチルホスホロアミダイトを使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で１８０μモルスケールで行なわれた。２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジンが付けられた ＰｈａｒｍａｃｉａのＨＬ３０プライマー支持体が使用された。脱トリチル化がトルエン中の３％ジクロロ酢酸（容量／容量）を使用して行なわれた。ホスホロアミダイトの活性化は、トリフルオロ酢酸ピリジニウムの０．２２Ｍ溶液及び１−メチルイミダゾールの０．１１Ｍ溶液で行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体はトリエチルアミン：アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ）の溶液で１２時間処理され、アセトニトリルで洗浄され、オリゴヌクレオチドが切り離され、そして３３％水溶液アンモニウム水溶液で５５℃で１２時間かけて脱保護され、冷却され、濃縮され、そして逆相ＨＰＬＣにより精製された。全てのＤＭＴ画分が一つにされ、キャピラリーゲル電気泳動により分析され、脱トリチル化され、析出され、そして粉末へと凍結乾燥された。この段階的硫化の効率は、３１ＰＮＭＲ（Ｄ２ Ｏ）に基づき９９．７％と分かった。
【００２５】
実施例１４
完全に修飾された ５’−［２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＧＣＴＧＡ］−ｄ（ＴＴＡ−ＧＡＧ−ＡＧＡ−Ｇ）−［２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＧＴＣＣＣ）−３’ ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：１１＞の合成
上記配列の合成が、２’−デオキシリボヌクレオシド及び２’−Ｏ−メトキシエチル置換リボヌクレオシドのシアノエチルホスホロアミダイトを使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で１８０μモルスケールで行なわれた。２’−Ｏ−メトキシエチル−Ｎ４ −ベンゾイル−５−メチルシチジンが付けられた ＰｈａｒｍａｃｉａのＨＬ３０プライマー支持体が使用された。脱トリチル化がトルエン中の３％ジクロロ酢酸（容量／容量）を使用して行なわれた。ホスホロアミダイトの活性化は、アセトニトリル中の１Ｈ−テトラゾールの０．４５Ｍ溶液で行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体はトリエチルアミン：アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ）の溶液で１２時間処理され、アセトニトリルで洗浄され、オリゴヌクレオチドが切り離され、そして３３％水溶液アンモニウム水溶液で５５℃で１２時間かけて脱保護され、冷却され、濃縮され、そして逆相ＨＰＬＣにより精製された。全てのＤＭＴ画分が一つにされ、キャピラリーゲル電気泳動により分析され、脱トリチル化され、析出され、そして粉末へと凍結乾燥された。この段階的硫化の効率は、３１ＰＮＭＲ（Ｄ２ Ｏ）に基づき９９．７％と分かった。
【００２６】
実施例１５
完全に修飾された ５’−［２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＣＴＧ］−ｄ（ＡＧＴ−ＣＴＧ−ＴＴＴ）−［２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＴＣＣ−ＡＴＴ−ＣＴ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：１２＞の合成
上記配列の合成が、２’−デオキシリボヌクレオシド及び２’−Ｏ−メトキシエチル置換リボヌクレオシドのシアノエチルホスホロアミダイトを使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で１７２μモルスケールで行なわれた。２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジンが付けられた ＰｈａｒｍａｃｉａのＨＬ３０プライマー支持体が使用された。脱トリチル化がトルエン中の３％ジクロロ酢酸（容量／容量）を使用して行なわれた。ホスホロアミダイトの活性化は、アセトニトリル中の１Ｈ−テトラゾールの０．４５Ｍ溶液で行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体はトリエチルアミン：アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ）の溶液で１２時間処理され、アセトニトリルで洗浄され、オリゴヌクレオチドが切り離され、そして３３％水溶液アンモニウム水溶液で５５℃で１２時間かけて脱保護され、冷却され、濃縮され、そして逆相ＨＰＬＣにより精製された。全てのＤＭＴ画分が一つにされ、キャピラリーゲル電気泳動により分析され、脱トリチル化され、析出され、そして粉末へと凍結乾燥された。この段階的硫化の効率は、３１ＰＮＭＲ（Ｄ２ Ｏ）に基づき９９．７％と分かった。
【００２７】
実施例１６
完全に修飾された ５’−［２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＧＣＴＧＡ］−ｄ（ＴＴＡ−ＧＡＧ−ＡＧＡ−Ｇ）−［２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＧＴＣＣＣ）−３’ ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：１１＞の合成
上記配列の合成が、２’−デオキシリボヌクレオシド及び２’−Ｏ−メトキシエチル置換リボヌクレオシドのシアノエチルホスホロアミダイトを使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で１５０ミリモルスケールで行なわれた。２’−Ｏ−メトキシエチル−Ｎ４ −ベンゾイル−５−メチルシチジンが付けられた ＰｈａｒｍａｃｉａのＨＬ３０プライマー支持体が使用された。脱トリチル化がトルエン中の３％ジクロロ酢酸（容量／容量）を使用して行なわれた。ホスホロアミダイトの活性化は、アセトニトリル中の１Ｈ−テトラゾールの０．４５Ｍ溶液で行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２．２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体はトリエチルアミン：アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ）の溶液で１２時間処理され、アセトニトリルで洗浄され、オリゴヌクレオチドが切り離され、そして３３％水溶液アンモニウム水溶液で５５℃で１２時間かけて脱保護され、冷却され、濃縮され、そして逆相ＨＰＬＣにより精製された。ＤＭＴピークが分画され、キャピラリーゲル電気泳動により分析され、画分が一つにされ、脱トリチル化され、析出され、そして粉末へと凍結乾燥された。この段階的硫化の効率は、３１ＰＮＭＲ（Ｄ２ Ｏ）に基づき９９．７５％と分かった。
【００２８】
実施例１７
完全に修飾された ５’−［２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＣＴＧ］−ｄ（ＡＧＴ−ＣＴＧ−ＴＴＴ）−［２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＴＣＣ−ＡＴＴ−ＣＴ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：１２＞の合成
上記配列の合成が、２’−デオキシリボヌクレオシド及び２’−Ｏ−メトキシエチル置換リボヌクレオシドのシアノエチルホスホロアミダイトを使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で４０ミリモルスケールで行なわれた。２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジンが付けられた ＰｈａｒｍａｃｉａのＨＬ３０プライマー支持体が使用された。脱トリチル化がトルエン中の１５％ジクロロ酢酸（容量／容量）を使用して行なわれた。ホスホロアミダイトの活性化は、アセトニトリル中の１Ｈ−テトラゾールの０．４５Ｍ溶液で行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２．２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体はトリエチルアミン：アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ）の溶液で１２時間処理され、アセトニトリルで洗浄され、オリゴヌクレオチドが切り離され、そして３３％水溶液アンモニウム水溶液で５５℃で１２時間かけて脱保護され、冷却され、濃縮され、そして逆相ＨＰＬＣにより精製された。ＤＭＴピークが分画され、キャピラリーゲル電気泳動により分析され、画分が一つにされ、脱トリチル化され、析出され、そして粉末へと凍結乾燥された。この段階的硫化の効率は、３１ＰＮＭＲ（Ｄ２ Ｏ）に基づき９９．７％と分かった。
【００２９】
実施例１８
完全に修飾された ５’−ｄ（ＴＣＣ−ＣＧＣ−ＣＴＧ−ＴＧＡ）−２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＣＡＴ−ＧＣＡ−ＴＴ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：１３＞の合成
上記配列の合成が、シアノエチルホスホロアミダイト及び ＰｈａｒｍａｃｉａのＨＬ３０プライマー支持体を使用して、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ ８８００ 合成装置で２８２μモルスケールで行なわれた。脱トリチル化がトルエン中の３％ジクロロ酢酸（容量／容量）を使用して行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．４Ｍ溶液を使用して４分間行なわれた。合成の最後に、その支持体はトリエチルアミン：アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ）の溶液で１２時間処理され、アセトニトリルで洗浄され、オリゴヌクレオチドが切り離され、そして３３％水溶液アンモニウム水溶液で５５℃で１２時間かけて脱保護され、冷却され、濃縮され、そして逆相ＨＰＬＣにより精製された。ＤＭＴピークが分画され、キャピラリーゲル電気泳動により分析され、画分が一つにされ、脱トリチル化され、析出され、そして粉末へと凍結乾燥された。
【００３０】
実施例１９
完全に修飾された ５’−［２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＧＣＴＧＡ］−ｄ（ＴＴＡ−ＧＡＧ−ＡＧＡ−Ｇ）−［２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＧＴＣＣＣ）−３’ ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：１１＞の合成
上記配列の合成が、２’−デオキシリボヌクレオシド及び２’−Ｏ−メトキシエチル置換リボヌクレオシドのシアノエチルホスホロアミダイトを使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で１８０μモルスケールで行なわれた。２’−Ｏ−メトキシエチル−Ｎ４ −ベンゾイル−５−メチルシチジンが付けられた ＰｈａｒｍａｃｉａのＨＬ３０プライマー支持体が使用された。脱トリチル化がトルエン中の３％ジクロロ酢酸（容量／容量）を使用して行なわれた。ホスホロアミダイトの活性化は、トリフルオロ酢酸ピリジニウムの０．２２Ｍ溶液及び１−メチルイミダゾールの０．１１Ｍ溶液で行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体はトリエチルアミン：アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ）の溶液で１２時間処理され、アセトニトリルで洗浄され、オリゴヌクレオチドが切り離され、そして３３％水溶液アンモニウム水溶液で５５℃で１２時間かけて脱保護され、冷却され、濃縮され、そして逆相ＨＰＬＣにより精製された。全てのＤＭＴ画分が一つにされ、キャピラリーゲル電気泳動により分析され、脱トリチル化され、析出され、そして粉末へと凍結乾燥された。
【００３１】
実施例２０
完全に修飾された ５’−［２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＣＴＧ］−ｄ（ＡＧＴ−ＣＴＧ−ＴＴＴ）−［２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＴＣＣ−ＡＴＴ−ＣＴ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：１２＞の合成
上記配列の合成が、２’−デオキシリボヌクレオシド及び２’−Ｏ−メトキシエチル置換リボヌクレオシドのシアノエチルホスホロアミダイトを使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で１７２μモルスケールで行なわれた。２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジンが付けられた ＰｈａｒｍａｃｉａのＨＬ３０プライマー支持体が使用された。脱トリチル化がトルエン中の３％ジクロロ酢酸（容量／容量）を使用して行なわれた。ホスホロアミダイトの活性化は、トリフルオロ酢酸ピリジニウムの０．２２Ｍ溶液及び１−メチルイミダゾールの０．１１Ｍ溶液で行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体はトリエチルアミン：アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ）の溶液で１２時間処理され、アセトニトリルで洗浄され、オリゴヌクレオチドが切り離され、そして３３％水溶液アンモニウム水溶液で５５℃で１２時間かけて脱保護され、冷却され、濃縮され、そして逆相ＨＰＬＣにより精製された。全てのＤＭＴ画分が一つにされ、キャピラリーゲル電気泳動により分析され、脱トリチル化され、析出され、そして粉末へと凍結乾燥された。
【００３２】
実施例２１
完全に修飾された ５’−ｄ（ＧＣＣ−ＣＡＡ−ＧＣＴ−ＧＧＣ）−２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＡＴＣ−ＣＧＴ−ＣＡ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：１４＞の合成
上記配列の合成が、シアノエチルホスホロアミダイト及び ＰｈａｒｍａｃｉａのＨＬ３０プライマー支持体を使用して、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ ８８００ 合成装置で２８２μモルスケールで行なわれた。脱トリチル化がトルエン中の３％ジクロロ酢酸（容量／容量）を使用して行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．４Ｍ溶液を使用して４分間行なわれた。合成の最後に、その支持体はトリエチルアミン：アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ）の溶液で１２時間処理され、アセトニトリルで洗浄され、オリゴヌクレオチドが切り離され、そして３３％水溶液アンモニウム水溶液で５５℃で１２時間かけて脱保護され、冷却され、濃縮され、そして逆相ＨＰＬＣにより精製された。ＤＭＴピークが分画され、キャピラリーゲル電気泳動により分析され、画分が一つにされ、脱トリチル化され、析出され、そして粉末へと凍結乾燥された。
【００３３】
実施例２２
完全に修飾された ５’−［２’−Ｏ−メチル−（ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：１５＞の合成
上記ホモピリミジン配列の合成が、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジンのシアノエチルホスホロアミダイトを使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で１８０μモルスケールで行なわれた。２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジンが付けられた ＰｈａｒｍａｃｉａのＨＬ３０プライマー支持体が使用された。脱トリチル化がトルエン中の３％ジクロロ酢酸（容量／容量）を使用して行なわれた。ホスホロアミダイトの活性化は、アセトニトリル中の１Ｈ−テトラゾールの０．４５Ｍ溶液で行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体はトリエチルアミン：アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ）の溶液で１２時間処理され、アセトニトリルで洗浄され、オリゴヌクレオチドが切り離され、そして３３％水溶液アンモニウム水溶液で５５℃で１２時間かけて脱保護され、冷却され、濃縮され、そして逆相ＨＰＬＣにより精製された。全てのＤＭＴ画分が一つにされ、キャピラリーゲル電気泳動により分析され、脱トリチル化され、析出され、そして粉末へと凍結乾燥された。
【００３４】
実施例２３
完全に修飾された ５’−［２’−Ｏ−メチル−（ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：１５＞の合成
上記ホモピリミジン配列の合成が、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジンのシアノエチルホスホロアミダイトを使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で１８０μモルスケールで行なわれた。２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジンが付けられた ＰｈａｒｍａｃｉａのＨＬ３０プライマー支持体が使用された。脱トリチル化がトルエン中の３％ジクロロ酢酸（容量／容量）を使用して行なわれた。ホスホロアミダイトの活性化は、トリフルオロ酢酸ピリジニウムの０．２２Ｍ溶液及び１−メチルイミダゾールの０．１１Ｍ溶液で行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体はトリエチルアミン：アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ）の溶液で１２時間処理され、アセトニトリルで洗浄され、オリゴヌクレオチドが切り離され、そして３３％水溶液アンモニウム水溶液で５５℃で１２時間かけて脱保護され、冷却され、濃縮され、そして逆相ＨＰＬＣにより精製された。全てのＤＭＴ画分が一つにされ、キャピラリーゲル電気泳動により分析され、脱トリチル化され、析出され、そして粉末へと凍結乾燥された。
【００３５】
実施例２４
完全に修飾された ５’−［２’−Ｏ−メチル−（ＧＣＴＧＡ］−ｄ（ＴＴＡ−ＧＡＧ−ＡＧＡ−Ｇ）−［２’−Ｏ−メチル−（ＧＴＣＣＣ）−３’ ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：１６＞の合成
上記配列の合成が、２’−デオキシリボヌクレオシド及び２’−Ｏ−メチル置換リボヌクレオシドのシアノエチルホスホロアミダイトを使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で１８０μモルスケールで行なわれた。２’−Ｏ−メチル−Ｎ４ −ベンゾイル−５−メチルシチジンが付けられた ＰｈａｒｍａｃｉａのＨＬ３０プライマー支持体が使用された。脱トリチル化がトルエン中の３％ジクロロ酢酸（容量／容量）を使用して行なわれた。ホスホロアミダイトの活性化は、アセトニトリル中の１Ｈ−テトラゾールの０．４５Ｍ溶液で行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体はトリエチルアミン：アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ）の溶液で１２時間処理され、アセトニトリルで洗浄され、オリゴヌクレオチドが切り離され、そして３３％水溶液アンモニウム水溶液で５５℃で１２時間かけて脱保護され、冷却され、濃縮され、そして逆相ＨＰＬＣにより精製された。全てのＤＭＴ画分が一つにされ、キャピラリーゲル電気泳動により分析され、脱トリチル化され、析出され、そして粉末へと凍結乾燥された。この段階的硫化の効率は、３１ＰＮＭＲ（Ｄ２ Ｏ）に基づき９９．５％と分かった。
当業者は、本発明のこれら好ましい態様に多くの変更及び修飾が行なわれることができ、そしてそのような変更や修飾が本発明の精神から逸脱することなく行なわれることが分かるであろう。従って、添付の請求の範囲がそのような全ての均等的変法を本発明の真の精神及び範囲内に属するものとしてカバーすることが意図されている。
本明細書に記載された事柄に加えて、本発明の種々の修飾が、前述の記載から当業者に明らかであろう。そのような修飾は、添付の請求の範囲の範囲内に属することが意図される。
【発明の分野】
本発明は、硫化オリゴヌクレオチド及びその類縁体を合成する方法に関する。この方法は、単純化された溶媒系においてフェニルアセチルジスルフィド試薬を用いて、大きな効率と改善された収率でホスホロチオエート基を有するオリゴヌクレオチドを生成する。
【０００２】
【発明の背景】
修飾されたオリゴヌクレオチドは、分子生物学研究において及び抗ウイルス療法のような用途において大きな価値がある。ＲＮＡ翻訳を遮断することができ、かつヌクレアーゼ耐性である修飾オリゴヌクレオチドは、アンチセンス試薬として有用である。ホスホロチオエート連結（Ｐ−Ｓ）を含有する硫化オリゴヌクレオチドは、これら分野で興味の対象である。ホスホロチオエート含有オリゴヌクレオチドは、核酸を認識する一定の酵素の立体化学的経路を確認するのにも有用である。
リン含有化合物の硫化のための標準的技術が、硫化オリゴヌクレオチドの合成に適用されてきた。ホスホロチオエート結合を含有するオリゴヌクレオチドを合成するのに使用されてきた硫化試薬の例には、原子状硫黄、ジベンゾイルテトラスルフィド、３−Ｈ−１，２−ベンジジチオール−３−オン・１，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬としても知られる）、テトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）、及びビス（Ｏ，Ｏ−ジイソプロポキシホスフィノチオイル）ジスルフィド（Ｓｔｅｃ試薬として知られる）が含まれる。
【０００３】
原子状硫黄は、殆どの有機溶媒に溶解しないという問題があるので、自動化には適していない。更には、硫黄の好ましい供給源である二硫化炭素は、望ましくない揮発性と望ましくなく低い引火点とを有している。ジベンゾイルテトラスルフィドを使用すると、不要な副生成物が観察されることが多い。Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬は比較的効率的な硫化試薬であるが、合成するのが難しくまた安定であるという訳ではない。更には、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬を使用すると、強力な酸化剤である副反応生成物を形成する （Ｒ．Ｐ． Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１２， ｐｐ． １２５３−１２５４ （１９９０）； Ｒ．Ｐ． Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ５５， ４６９３−４６９９ （１９９０）） 。これは、更に、目的の反応生成物から分離し難い不要な副生成物をもたらし得る。テトラエチルチウラムジスルフィドは、比較的安価で安定であるが、望ましくなく低い硫化反応速度しか持たない。
【０００４】
亜リン酸エステルとアシルジスルフィドの反応によりホスホロチオエートエステルを製造する方法が、オランダ特許出願第８９０２５２１号に開示されている。その開示された方法は、精製されたホスホトリエステルダイマーに液相化学を利用して適用される。その方法は、第１段階の合成をアセトニトリル中で行なうこと（亜リン酸の形成）、そのアセトニトリルを除去すること、その中間体ホスホトリエステルを精製すること、及びジクロロエタン（ＤＣＥ）と２，４，６−コリジンの溶媒混合液中で硫化を進行させることを包含する複雑なスキームでのみ可能であることが示されたという点で時間及び労力集約的である。更には、この方法は、ジヌクレオチドで実証されたに過ぎない。このオランダ方法が、より大きな核酸構造体で用いられ得るという示唆も、全ての合成工程を通して共通の溶媒を使用できるという示唆も、向上した収率が得られるという示唆も、そして、自動化のスキームを大きく変更することなく慣用的な自動化合成に適合できるという示唆もなかった。幾つかの可能な溶媒の１つとしてアセトニトリルが挙げられたが、全ての合成工程を共通溶媒としてのアセトニトリル中で行なうための方法の有用性は示されなかった。他の刊行物 （Ｋａｍｅｒ ｅｌ ａｌ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３０（４８）， ｐｐ． ６７５７−６７６０ （１９８９）； Ｒｏｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃｈ． Ｔｒａｖ． Ｃｈｉｍ． Ｐａｙｓ−Ｂａｓ １１０， ｐｐ． ３２５−３３１ （１９９１）） が６までのヌクレオチドを有するオリゴマーの硫化を示しているが、これら刊行物に開示された方法によっては上述の欠点は克服されていない。
かくして、オリゴヌクレオチド及び他の有機化合物におけるホスホロチオエート連結のような硫黄含有リン基を製造するための改善された方法及び試薬の必要性が存在している。本発明は、これら、並びに他の重要な目標に向けられている。
【０００５】
【発明の要旨】
本発明は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの、従来法で得られるものに比較して向上した収率での合成方法を提供する。更には、本方法は、比較的大きな数のヌクレオチド及び／又はヌクレオシド単位をその中に有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドだけでなく、例えば、約６〜約５０以上、特に約８〜約３０のヌクレオチド及び／又はヌクレオシド単位を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成にとって有用である。本発明の方法は、自動化合成反応スキーム及び商業的合成装置に適合性である、大きく単純化された溶媒系を用いる。合成機会の向上は、核酸化学全体を通しての本方法の広い用途を可能にする。
【０００６】
本発明の一つの側面は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成方法であって、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオシドの５’−ヒドロキシル基を亜リン酸化する工程、及び得られたその亜リン酸中間体を、アセトニトリルを含む溶媒系の存在下でフェニルアセチルジスルフィドと、ホスホロチオエート官能基の形成をもたらすのに十分な時間接触させる工程を含んでなる方法を開示する。予め決められた長さ及び配列を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが、亜リン酸化工程と酸化工程を繰り返すことにより製造され得る。
本発明の更なる側面では、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド類縁体の合成方法であって、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオシドを、修飾されたヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオシドに置き換えることを含んでなる方法が開示される。ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオシドへの修飾は、当該技術分野で周知である。本明細書で使用される“ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド”という用語は、上で定義された類縁体を包含させようとするものである。
【０００７】
本明細書で使用される“亜リン酸部分”という用語は、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオシド内における亜リン酸部分を包含させようとするものである。好ましい態様では、亜リン酸部分は、ジメトキシトリチルホスホロアミダイトのような活性化された状態の亜リン酸部分である。本明細書で使用される“ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオシド”という用語は、当業者によって知られる、天然に存在する種及び天然に存在しないか若しくは修飾された種を包含させようとするものである。普通の修飾には、２’修飾のような糖修飾及び塩基修飾又は代替塩基の使用が含まれる。オリゴヌクレオチド又は修飾されたオリゴヌクレオチドが亜リン酸部分として使用されるとき、当該技術分野で普通に知られた修飾された連結も存在してよい。
【０００８】
本方法は、酸化工程の溶媒としてＤＣＥが使用されたときに比べて、不純物のレベルが低くかつ収率が低いことを証明した。本方法は、意外にも、アセトニトリル／ピコリン中では約９９％の収率が得られることを示した。アセトニトリル／ピコリンは、合成常識に大きな変更を加えることなしに自動化された合成法と全く適合性であるので、本方法は、自動化された合成装置において有利に使用れることができる。例えば、全ての自動化された合成工程で、単一溶媒又は共通の溶媒を有する混合液が使用されるので、広汎な洗浄を要しない。かくして、溶媒除去及び洗浄工程を排除することができる。驚いたことに、約８から約３０までのヌクレオチドを有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類縁体を合成するときに、高い収率が達成され得ることが発見された。
【０００９】
本発明の亜リン酸中間体の酸化における使用に適する溶媒系には、２又はそれを越える溶媒の混合液が含まれる。好ましくは、非プロトン性溶媒とプロトン性溶媒又は塩基性溶媒との混合液である。好ましい溶媒混合液には、アセトニトリル／ピコリン及びアセトニトリル／ルチジンが含まれる。適する非プロトン性溶媒には、ピリジン及び、ルチジン、コリジン及びピコリンのようなヒンダードピリジンが含まれる。溶媒混合液は、例えば、約１：１．５〜約１．５：１、好ましくは約１：１の容量割合のアセトニトリルとピコリン又はアセトニトリルとルチジンのような２溶媒系を含むことができる。
本発明の方法による硫化（硫化試薬を用いる酸化）は、オリゴヌクレオチド又はその類縁体をアセチルジスルフィドと、ホスホロチオエート官能基の形成をもたらすのに十分な時間接触させることによって行なわれる。好ましい試薬には、フェニルアセチルジスルフィド、アリールアセチルジスルフィド、及びアリール置換フェニルアセチルジスルフィドが含まれる。
【００１０】
亜リン酸部分をアセチルジスルフィドと接触させることは、当業者に知られた操作及び装置を使用して行なわれる。例えば、フラスコのようなガラス反応器を使用するのが適当である。好ましくは、固相合成法、及び制御有孔ガラスのような固体支持体が用いられる。より好ましくは、本発明の方法は、自動ＤＮＡ合成装置を使用して行なわれることができる。自動合成技術を包含する適する固相技術は、Ｆ． Ｅｃｋｓｔｅｉｎ （ｅｄ．）， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ， ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ． Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９１） に記載されている。
本発明の方法は、室温で行なわれることができる。“室温”は、約２０〜約３０℃の周囲温度を包含する。反応時間は、例えば、２、３、４又は５分間のような分のオーダーであるか、又は約１００秒という短さであったもよい。
【００１１】
一般に、本発明の方法は、核酸部分の５’−ヒドロキシル基を亜リン酸化して亜リン酸中間体を形成し、そしてその亜リン酸中間体をアセチルジスルフィドで、その亜リン酸中間体をホスホロチオエートへ転化するのに十分な時間酸化することを包含する。その亜リン酸中間体は、例えば、亜リン酸で連結したジヌクレオチドであるか、又はその中に少なくとも１つの亜リン酸連結を有するオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオシドであることができる。本法の亜リン酸化及び酸化は、両方ともアセトニトリルを包含する系で行なわれる。亜リン酸化及び酸化工程の繰り返しで、予め決められた長さを有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを与えるであろう。反応過程は、プロトン又は３１ＰＮＭＲのような周知の技術によって追跡されることができる。反応生成物は、例えば、約３０％の濃度の水酸化アンモニウム溶液のような塩基で処理されることができる。目的の生成物は、例えば、標準的濾過技術によって容易に単離されることができる。
以下の実施例は、単に本発明を例示するだけであって、本発明の範囲を限定するものと考えられるべきではない。これら実施例とその均等物が、本発明の開示及び添付の請求の範囲を参照することによって、当業者により明らかになるであろう。
【００１２】
【実施例】
実施例１
５’−ＴＴＴＴＴＴＴ’−３’ホスホロチオエートヘプタマーの合成
エステル連結を介してＣＰＧ（制御有孔ガラス）に結合した５０ｍｇ（２μモル）の５’−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジンが、ガラス反応器内に入れられ、そして２％ジクロロ酢酸（容量／容量）のジクロロメタン溶液が加えられて、その５’−ヒドロキシル基が脱保護される。その生成物がアセトニトリルで洗浄される。次いで、アセトニトリル中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の０．２Ｍ溶液及びアセトニトリル中の１Ｈ−テトラゾールの０．４Ｍ溶液が加えられ、室温で５分間反応させられる。その生成物は、アセトニトリルで洗浄されてから、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液が加えられ、室温で３分間反応させられる。この硫化工程がもう１回３分間繰り返される。その支持体がアセトニトリルで洗浄され、次いで、無水酢酸／ルチジン／ＴＨＦ（１：１：８）とＮ−メチルイミダゾール／ＴＨＦの溶液が加えられて、あらゆる未反応５’−ヒドロキシル基がキャップされる。その生成物はアセトニトリルで洗浄される。
この全部のサイクルが、あと５回繰り返されて、完全に保護されたチミジンヘプタマーが生成する。その化合物を含有するキャリヤは、３０％水酸化アンモニウム水溶液で室温で９０分間処理される。その水溶液が濾過され、減圧濃縮されて、ホスホロチオエートヘプタマー，ＴＴＴＴＴＴＴ が得られる。
【００１３】
実施例２
５’−ｄ（ＧＡＣＴ）−３’ ホスホロチオエートテトラマーの合成
エステル連結を介してＣＰＧ（制御有孔ガラス）に結合した５０ｍｇ（２×１０−６モル（２μモル））の５’−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジンが、ガラス反応器内に入れられ、そして２％ジクロロ酢酸（容量／容量）のジクロロメタン溶液が加えられて、その５’−ヒドロキシル基が脱保護される。その生成物がアセトニトリルで洗浄される。次いで、アセトニトリル中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の０．２Ｍ溶液及びアセトニトリル中の１Ｈ−テトラゾールの０．４Ｍ溶液が加えられ、室温で５分間反応させられる。その生成物は、アセトニトリルで洗浄されてから、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液が加えられ、室温で３分間反応させられる。この硫化工程がもう１回３分間繰り返される。その支持体がアセトニトリルで洗浄され、次いで、無水酢酸／ルチジン／ＴＨＦ（１：１：８）とＮ−メチルイミダゾール／ＴＨＦの溶液が加えられて、未反応５’−ヒドロキシル基がキャップされる。その生成物はアセトニトリルで洗浄される。
２％ジクロロ酢酸（容量／容量）の溶液が加えられて、その５’−ヒドロキシル基が脱保護される。その生成物がアセトニトリルで洗浄される。次いで、アセトニトリル中のＮ４ −ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシシチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の０．２Ｍ溶液及びアセトニトリル中の１Ｈ−テトラゾールの０．４Ｍ溶液が加えられ、室温で５分間反応させられる。その生成物は、アセトニトリルで洗浄されてから、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液が加えられ、室温で３分間反応させられる。この硫化工程がもう１回３分間繰り返される。その支持体がアセトニトリルで洗浄され、次いで、無水酢酸／ルチジン／ＴＨＦ（１：１：８）とＮ−メチルイミダゾール／ＴＨＦの溶液が加えられて、あらゆる未反応５’−ヒドロキシル基がキャップされる。その生成物はアセトニトリルで洗浄される。
２％ジクロロ酢酸（容量／容量）の溶液が加えられて、その５’−ヒドロキシル基が脱保護される。その生成物がアセトニトリルで洗浄される。次いで、無水アセトニトリル中のＮ６ −ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシアデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の０．２Ｍ溶液及びアセトニトリル中の１Ｈ−テトラゾールの０．４Ｍ溶液が加えられ、室温で５分間反応させられる。その生成物は、アセトニトリルで洗浄されてから、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液が加えられ、室温で３分間反応させられる。この硫化工程がもう１回３分間繰り返される。その支持体がアセトニトリルで洗浄され、次いで、無水酢酸／ルチジン／ＴＨＦ（１：１：８）とＮ−メチルイミダゾール／ＴＨＦの溶液が加えられて、未反応５’−ヒドロキシル基がキャップされる。その生成物はアセトニトリルで洗浄される。
２％ジクロロ酢酸（容量／容量）の溶液が加えられて、その５’−ヒドロキシル基が脱保護される。その生成物がアセトニトリルで洗浄される。次いで、アセトニトリル中のＮ２ −イソブチリル−５’−Ｏ−４，４’−ジメトキシトリチル−デオキシグアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の０．２Ｍ溶液及びアセトニトリル中の１Ｈ−テトラゾールの０．４Ｍ溶液が加えられ、室温で５分間反応させられる。その生成物は、アセトニトリルで洗浄されてから、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液が加えられ、室温で３分間反応させられる。この硫化工程がもう１回３分間繰り返される。その支持体がアセトニトリルで洗浄され、次いで、無水酢酸／ルチジン／ＴＨＦ（１：１：８）とＮ−メチルイミダゾール／ＴＨＦの溶液が加えられて、あらゆる未反応５’−ヒドロキシル基がキャップされる。その生成物はアセトニトリルで洗浄される。
その化合物を含有するキャリヤは、３０％水酸化アンモニウム水溶液で室温で９０分間処理されてから、５５℃で２４時間インキュベートされる。その水溶液が濾過され、減圧濃縮されて、ホスホロチオエートテトラマー，５’−ｄＧ−ｄＡ−ｄＣ−Ｔ−３’が得られる。
【００１４】
実施例３
完全に修飾された ５’−ｄ（ＴＣＣ−ＣＧＣ−ＣＴＧ−ＴＧＡ−ＣＡＴ−ＧＣＡ−ＴＴ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：１＞の合成
上記配列の合成が、上記のシアノエチルホスホロアミダイト及び Ｐｈａｒｍａｃｉａのプライマー支持体を使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で６２０μモルスケールで行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体がアセトニトリルで洗浄され、切り離され、脱保護され、そして先に示したようにして精製された。
【００１５】
実施例４
完全に修飾された ５’−ｄ（ＧＣＣ−ＣＡＡ−ＧＣＴ−ＧＧＣ−ＡＴＣ−ＣＧＴ−ＣＡ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：２＞の合成
上記配列の合成が、上記のシアノエチルホスホロアミダイト及び Ｐｈａｒｍａｃｉａのプライマー支持体を使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で６２０μモルスケールで行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体がアセトニトリルで洗浄され、切り離され、脱保護され、そして先に示したようにして精製された。
【００１６】
実施例５
完全に修飾された ５’−ｄ（ＧＣＧ−ＴＴＴ−ＧＣＴ−ＣＴＴ−ＣＴＴ−ＣＴＴ−ＧＣＧ）−３’ ホスホロチオエート２１マー＜配列番号：３＞の合成
上記配列の合成が、上記のシアノエチルホスホロアミダイト及び Ｐｈａｒｍａｃｉａのプライマー支持体を使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で６２０μモルスケールで行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体がアセトニトリルで洗浄され、切り離され、脱保護され、そして先に示したようにして精製された。
【００１７】
実施例６
完全に修飾された ５’−ｄ（ＧＴＴ−ＣＴＣ−ＧＣＴ−ＧＧＴ−ＧＡＧ−ＴＴＴ−ＣＡ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：４＞の合成
上記配列の合成が、上記のシアノエチルホスホロアミダイト及び Ｐｈａｒｍａｃｉａのプライマー支持体を使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で６２０μモルスケールで行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体がアセトニトリルで洗浄され、切り離され、脱保護され、そして先に示したようにして精製された。
【００１８】
実施例７
完全に修飾された ５’−ｄ（ＴＣＣ−ＣＧＣ−ＣＴＧ−ＴＧＡ）−２’−メトキシエチル−（ＣＡＵ−ＧＣＡ−ＵＵ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：５＞の合成
上記配列の合成が、上記のシアノエチルホスホロアミダイト及び Ｐｈａｒｍａｃｉａのプライマー支持体を使用して、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ ８８００ 合成装置で２８２μモルスケールで行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．４Ｍ溶液を使用して６分間行なわれた。合成の最後に、その支持体がアセトニトリルで洗浄され、切り離され、脱保護され、そして先に示したようにして精製された。
【００１９】
実施例８
完全に修飾された ５’−ｄ（ＴＣＣ−ＣＧＣ−ＣＴＧ−ＴＧＡ）−２’−メトキシエチル−（ＣＡＵ−ＧＣＡ−ＵＵ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：６＞の合成
上記配列の合成が、上記のシアノエチルホスホロアミダイト及び Ｐｈａｒｍａｃｉａのプライマー支持体を使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で２５０μモルスケールで行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．４Ｍ溶液を使用して１０分間行なわれた。合成の最後に、その支持体がアセトニトリルで洗浄され、切り離され、脱保護され、そして先に示したようにして精製された。
【００２０】
実施例９
完全に修飾された ５’−［２’−メトキシエチル（ＧＣＧＵＵＵＧ）−ｄ［ＣＴＣＴＴＣＴ］−［２’− メトキシエチル−（ＵＣＵＵＧＣ）−ｄＧ−３’ ホスホロチオエート２１マー＜配列番号：７＞の合成
上記配列の合成が、上記のシアノエチルホスホロアミダイト及び Ｐｈａｒｍａｃｉａのプライマー支持体を使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で２５０μモルスケールで行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．４Ｍ溶液を使用して６分間行なわれた。合成の最後に、その支持体がアセトニトリルで洗浄され、切り離され、脱保護され、そして先に示したようにして精製された。
【００２１】
実施例１０
完全に修飾された ５’−ｄ（ＧＣＣ−ＣＡＡ−ＧＣＴ−ＧＧＣ）−２’−メトキシエチル−（ＡＵＣ−ＣＧＵ−ＣＡ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：８＞の合成
上記配列の合成が、上記のシアノエチルホスホロアミダイト及び Ｐｈａｒｍａｃｉａのプライマー支持体を使用して、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ ８８００ 合成装置で５６５μモルスケールで行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．４Ｍ溶液を使用して６分間行なわれた。合成の最後に、その支持体がアセトニトリルで洗浄され、切り離され、脱保護され、そして先に示したようにして精製された。
【００２２】
実施例１１
完全に修飾された ５’−ｄ（ＧＣＣ−ＣＡＡ−ＧＣＴ−ＧＧＣ）−２’−メトキシエチル−（ＡＵＣ−ＣＧＵ−ＣＡ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：９＞の合成
上記配列の合成が、上記のシアノエチルホスホロアミダイト及び Ｐｈａｒｍａｃｉａのプライマー支持体を使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で６８０μモルスケールで行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．４Ｍ溶液を使用して６分間行なわれた。合成の最後に、その支持体がアセトニトリルで洗浄され、切り離され、脱保護され、そして先に示したようにして精製された。
【００２３】
実施例１２
完全に修飾された ５’−［２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：１０＞の合成
上記ホモピリミジン配列の合成が、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジンのシアノエチルホスホロアミダイトを使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で１８０μモルスケールで行なわれた。２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジンが付けられた ＰｈａｒｍａｃｉａのＨＬ３０プライマー支持体が使用された。脱トリチル化がトルエン中の３％ジクロロ酢酸（容量／容量）を使用して行なわれた。ホスホロアミダイトの活性化は、アセトニトリル中の１Ｈ−テトラゾールの０．４５Ｍ溶液で行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体はトリエチルアミン：アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ）の溶液で１２時間処理され、アセトニトリルで洗浄され、オリゴヌクレオチドが切り離され、そして３３％水溶液アンモニウム水溶液で５５℃で１２時間かけて脱保護され、冷却され、濃縮され、そして逆相ＨＰＬＣにより精製された。全てのＤＭＴ画分が一つにされ、キャピラリーゲル電気泳動により分析され、脱トリチル化され、析出され、そして粉末へと凍結乾燥された。この段階的硫化の効率は、３１ＰＮＭＲ（Ｄ２ Ｏ）に基づき９９．６％と分かった。
【００２４】
実施例１３
完全に修飾された ５’−［２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：１０＞の合成
上記ホモピリミジン配列の合成が、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジンのシアノエチルホスホロアミダイトを使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で１８０μモルスケールで行なわれた。２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジンが付けられた ＰｈａｒｍａｃｉａのＨＬ３０プライマー支持体が使用された。脱トリチル化がトルエン中の３％ジクロロ酢酸（容量／容量）を使用して行なわれた。ホスホロアミダイトの活性化は、トリフルオロ酢酸ピリジニウムの０．２２Ｍ溶液及び１−メチルイミダゾールの０．１１Ｍ溶液で行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体はトリエチルアミン：アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ）の溶液で１２時間処理され、アセトニトリルで洗浄され、オリゴヌクレオチドが切り離され、そして３３％水溶液アンモニウム水溶液で５５℃で１２時間かけて脱保護され、冷却され、濃縮され、そして逆相ＨＰＬＣにより精製された。全てのＤＭＴ画分が一つにされ、キャピラリーゲル電気泳動により分析され、脱トリチル化され、析出され、そして粉末へと凍結乾燥された。この段階的硫化の効率は、３１ＰＮＭＲ（Ｄ２ Ｏ）に基づき９９．７％と分かった。
【００２５】
実施例１４
完全に修飾された ５’−［２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＧＣＴＧＡ］−ｄ（ＴＴＡ−ＧＡＧ−ＡＧＡ−Ｇ）−［２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＧＴＣＣＣ）−３’ ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：１１＞の合成
上記配列の合成が、２’−デオキシリボヌクレオシド及び２’−Ｏ−メトキシエチル置換リボヌクレオシドのシアノエチルホスホロアミダイトを使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で１８０μモルスケールで行なわれた。２’−Ｏ−メトキシエチル−Ｎ４ −ベンゾイル−５−メチルシチジンが付けられた ＰｈａｒｍａｃｉａのＨＬ３０プライマー支持体が使用された。脱トリチル化がトルエン中の３％ジクロロ酢酸（容量／容量）を使用して行なわれた。ホスホロアミダイトの活性化は、アセトニトリル中の１Ｈ−テトラゾールの０．４５Ｍ溶液で行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体はトリエチルアミン：アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ）の溶液で１２時間処理され、アセトニトリルで洗浄され、オリゴヌクレオチドが切り離され、そして３３％水溶液アンモニウム水溶液で５５℃で１２時間かけて脱保護され、冷却され、濃縮され、そして逆相ＨＰＬＣにより精製された。全てのＤＭＴ画分が一つにされ、キャピラリーゲル電気泳動により分析され、脱トリチル化され、析出され、そして粉末へと凍結乾燥された。この段階的硫化の効率は、３１ＰＮＭＲ（Ｄ２ Ｏ）に基づき９９．７％と分かった。
【００２６】
実施例１５
完全に修飾された ５’−［２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＣＴＧ］−ｄ（ＡＧＴ−ＣＴＧ−ＴＴＴ）−［２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＴＣＣ−ＡＴＴ−ＣＴ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：１２＞の合成
上記配列の合成が、２’−デオキシリボヌクレオシド及び２’−Ｏ−メトキシエチル置換リボヌクレオシドのシアノエチルホスホロアミダイトを使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で１７２μモルスケールで行なわれた。２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジンが付けられた ＰｈａｒｍａｃｉａのＨＬ３０プライマー支持体が使用された。脱トリチル化がトルエン中の３％ジクロロ酢酸（容量／容量）を使用して行なわれた。ホスホロアミダイトの活性化は、アセトニトリル中の１Ｈ−テトラゾールの０．４５Ｍ溶液で行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体はトリエチルアミン：アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ）の溶液で１２時間処理され、アセトニトリルで洗浄され、オリゴヌクレオチドが切り離され、そして３３％水溶液アンモニウム水溶液で５５℃で１２時間かけて脱保護され、冷却され、濃縮され、そして逆相ＨＰＬＣにより精製された。全てのＤＭＴ画分が一つにされ、キャピラリーゲル電気泳動により分析され、脱トリチル化され、析出され、そして粉末へと凍結乾燥された。この段階的硫化の効率は、３１ＰＮＭＲ（Ｄ２ Ｏ）に基づき９９．７％と分かった。
【００２７】
実施例１６
完全に修飾された ５’−［２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＧＣＴＧＡ］−ｄ（ＴＴＡ−ＧＡＧ−ＡＧＡ−Ｇ）−［２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＧＴＣＣＣ）−３’ ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：１１＞の合成
上記配列の合成が、２’−デオキシリボヌクレオシド及び２’−Ｏ−メトキシエチル置換リボヌクレオシドのシアノエチルホスホロアミダイトを使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で１５０ミリモルスケールで行なわれた。２’−Ｏ−メトキシエチル−Ｎ４ −ベンゾイル−５−メチルシチジンが付けられた ＰｈａｒｍａｃｉａのＨＬ３０プライマー支持体が使用された。脱トリチル化がトルエン中の３％ジクロロ酢酸（容量／容量）を使用して行なわれた。ホスホロアミダイトの活性化は、アセトニトリル中の１Ｈ−テトラゾールの０．４５Ｍ溶液で行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２．２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体はトリエチルアミン：アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ）の溶液で１２時間処理され、アセトニトリルで洗浄され、オリゴヌクレオチドが切り離され、そして３３％水溶液アンモニウム水溶液で５５℃で１２時間かけて脱保護され、冷却され、濃縮され、そして逆相ＨＰＬＣにより精製された。ＤＭＴピークが分画され、キャピラリーゲル電気泳動により分析され、画分が一つにされ、脱トリチル化され、析出され、そして粉末へと凍結乾燥された。この段階的硫化の効率は、３１ＰＮＭＲ（Ｄ２ Ｏ）に基づき９９．７５％と分かった。
【００２８】
実施例１７
完全に修飾された ５’−［２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＣＴＧ］−ｄ（ＡＧＴ−ＣＴＧ−ＴＴＴ）−［２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＴＣＣ−ＡＴＴ−ＣＴ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：１２＞の合成
上記配列の合成が、２’−デオキシリボヌクレオシド及び２’−Ｏ−メトキシエチル置換リボヌクレオシドのシアノエチルホスホロアミダイトを使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で４０ミリモルスケールで行なわれた。２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジンが付けられた ＰｈａｒｍａｃｉａのＨＬ３０プライマー支持体が使用された。脱トリチル化がトルエン中の１５％ジクロロ酢酸（容量／容量）を使用して行なわれた。ホスホロアミダイトの活性化は、アセトニトリル中の１Ｈ−テトラゾールの０．４５Ｍ溶液で行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２．２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体はトリエチルアミン：アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ）の溶液で１２時間処理され、アセトニトリルで洗浄され、オリゴヌクレオチドが切り離され、そして３３％水溶液アンモニウム水溶液で５５℃で１２時間かけて脱保護され、冷却され、濃縮され、そして逆相ＨＰＬＣにより精製された。ＤＭＴピークが分画され、キャピラリーゲル電気泳動により分析され、画分が一つにされ、脱トリチル化され、析出され、そして粉末へと凍結乾燥された。この段階的硫化の効率は、３１ＰＮＭＲ（Ｄ２ Ｏ）に基づき９９．７％と分かった。
【００２９】
実施例１８
完全に修飾された ５’−ｄ（ＴＣＣ−ＣＧＣ−ＣＴＧ−ＴＧＡ）−２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＣＡＴ−ＧＣＡ−ＴＴ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：１３＞の合成
上記配列の合成が、シアノエチルホスホロアミダイト及び ＰｈａｒｍａｃｉａのＨＬ３０プライマー支持体を使用して、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ ８８００ 合成装置で２８２μモルスケールで行なわれた。脱トリチル化がトルエン中の３％ジクロロ酢酸（容量／容量）を使用して行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．４Ｍ溶液を使用して４分間行なわれた。合成の最後に、その支持体はトリエチルアミン：アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ）の溶液で１２時間処理され、アセトニトリルで洗浄され、オリゴヌクレオチドが切り離され、そして３３％水溶液アンモニウム水溶液で５５℃で１２時間かけて脱保護され、冷却され、濃縮され、そして逆相ＨＰＬＣにより精製された。ＤＭＴピークが分画され、キャピラリーゲル電気泳動により分析され、画分が一つにされ、脱トリチル化され、析出され、そして粉末へと凍結乾燥された。
【００３０】
実施例１９
完全に修飾された ５’−［２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＧＣＴＧＡ］−ｄ（ＴＴＡ−ＧＡＧ−ＡＧＡ−Ｇ）−［２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＧＴＣＣＣ）−３’ ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：１１＞の合成
上記配列の合成が、２’−デオキシリボヌクレオシド及び２’−Ｏ−メトキシエチル置換リボヌクレオシドのシアノエチルホスホロアミダイトを使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で１８０μモルスケールで行なわれた。２’−Ｏ−メトキシエチル−Ｎ４ −ベンゾイル−５−メチルシチジンが付けられた ＰｈａｒｍａｃｉａのＨＬ３０プライマー支持体が使用された。脱トリチル化がトルエン中の３％ジクロロ酢酸（容量／容量）を使用して行なわれた。ホスホロアミダイトの活性化は、トリフルオロ酢酸ピリジニウムの０．２２Ｍ溶液及び１−メチルイミダゾールの０．１１Ｍ溶液で行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体はトリエチルアミン：アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ）の溶液で１２時間処理され、アセトニトリルで洗浄され、オリゴヌクレオチドが切り離され、そして３３％水溶液アンモニウム水溶液で５５℃で１２時間かけて脱保護され、冷却され、濃縮され、そして逆相ＨＰＬＣにより精製された。全てのＤＭＴ画分が一つにされ、キャピラリーゲル電気泳動により分析され、脱トリチル化され、析出され、そして粉末へと凍結乾燥された。
【００３１】
実施例２０
完全に修飾された ５’−［２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＣＴＧ］−ｄ（ＡＧＴ−ＣＴＧ−ＴＴＴ）−［２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＴＣＣ−ＡＴＴ−ＣＴ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：１２＞の合成
上記配列の合成が、２’−デオキシリボヌクレオシド及び２’−Ｏ−メトキシエチル置換リボヌクレオシドのシアノエチルホスホロアミダイトを使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で１７２μモルスケールで行なわれた。２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジンが付けられた ＰｈａｒｍａｃｉａのＨＬ３０プライマー支持体が使用された。脱トリチル化がトルエン中の３％ジクロロ酢酸（容量／容量）を使用して行なわれた。ホスホロアミダイトの活性化は、トリフルオロ酢酸ピリジニウムの０．２２Ｍ溶液及び１−メチルイミダゾールの０．１１Ｍ溶液で行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体はトリエチルアミン：アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ）の溶液で１２時間処理され、アセトニトリルで洗浄され、オリゴヌクレオチドが切り離され、そして３３％水溶液アンモニウム水溶液で５５℃で１２時間かけて脱保護され、冷却され、濃縮され、そして逆相ＨＰＬＣにより精製された。全てのＤＭＴ画分が一つにされ、キャピラリーゲル電気泳動により分析され、脱トリチル化され、析出され、そして粉末へと凍結乾燥された。
【００３２】
実施例２１
完全に修飾された ５’−ｄ（ＧＣＣ−ＣＡＡ−ＧＣＴ−ＧＧＣ）−２’−Ｏ−メトキシエチル−（ＡＴＣ−ＣＧＴ−ＣＡ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：１４＞の合成
上記配列の合成が、シアノエチルホスホロアミダイト及び ＰｈａｒｍａｃｉａのＨＬ３０プライマー支持体を使用して、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ ８８００ 合成装置で２８２μモルスケールで行なわれた。脱トリチル化がトルエン中の３％ジクロロ酢酸（容量／容量）を使用して行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．４Ｍ溶液を使用して４分間行なわれた。合成の最後に、その支持体はトリエチルアミン：アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ）の溶液で１２時間処理され、アセトニトリルで洗浄され、オリゴヌクレオチドが切り離され、そして３３％水溶液アンモニウム水溶液で５５℃で１２時間かけて脱保護され、冷却され、濃縮され、そして逆相ＨＰＬＣにより精製された。ＤＭＴピークが分画され、キャピラリーゲル電気泳動により分析され、画分が一つにされ、脱トリチル化され、析出され、そして粉末へと凍結乾燥された。
【００３３】
実施例２２
完全に修飾された ５’−［２’−Ｏ−メチル−（ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：１５＞の合成
上記ホモピリミジン配列の合成が、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジンのシアノエチルホスホロアミダイトを使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で１８０μモルスケールで行なわれた。２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジンが付けられた ＰｈａｒｍａｃｉａのＨＬ３０プライマー支持体が使用された。脱トリチル化がトルエン中の３％ジクロロ酢酸（容量／容量）を使用して行なわれた。ホスホロアミダイトの活性化は、アセトニトリル中の１Ｈ−テトラゾールの０．４５Ｍ溶液で行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体はトリエチルアミン：アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ）の溶液で１２時間処理され、アセトニトリルで洗浄され、オリゴヌクレオチドが切り離され、そして３３％水溶液アンモニウム水溶液で５５℃で１２時間かけて脱保護され、冷却され、濃縮され、そして逆相ＨＰＬＣにより精製された。全てのＤＭＴ画分が一つにされ、キャピラリーゲル電気泳動により分析され、脱トリチル化され、析出され、そして粉末へと凍結乾燥された。
【００３４】
実施例２３
完全に修飾された ５’−［２’−Ｏ−メチル−（ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴ）−３’ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：１５＞の合成
上記ホモピリミジン配列の合成が、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジンのシアノエチルホスホロアミダイトを使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で１８０μモルスケールで行なわれた。２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジンが付けられた ＰｈａｒｍａｃｉａのＨＬ３０プライマー支持体が使用された。脱トリチル化がトルエン中の３％ジクロロ酢酸（容量／容量）を使用して行なわれた。ホスホロアミダイトの活性化は、トリフルオロ酢酸ピリジニウムの０．２２Ｍ溶液及び１−メチルイミダゾールの０．１１Ｍ溶液で行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体はトリエチルアミン：アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ）の溶液で１２時間処理され、アセトニトリルで洗浄され、オリゴヌクレオチドが切り離され、そして３３％水溶液アンモニウム水溶液で５５℃で１２時間かけて脱保護され、冷却され、濃縮され、そして逆相ＨＰＬＣにより精製された。全てのＤＭＴ画分が一つにされ、キャピラリーゲル電気泳動により分析され、脱トリチル化され、析出され、そして粉末へと凍結乾燥された。
【００３５】
実施例２４
完全に修飾された ５’−［２’−Ｏ−メチル−（ＧＣＴＧＡ］−ｄ（ＴＴＡ−ＧＡＧ−ＡＧＡ−Ｇ）−［２’−Ｏ−メチル−（ＧＴＣＣＣ）−３’ ホスホロチオエート２０マー＜配列番号：１６＞の合成
上記配列の合成が、２’−デオキシリボヌクレオシド及び２’−Ｏ−メチル置換リボヌクレオシドのシアノエチルホスホロアミダイトを使用して、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔ ＩＩ合成装置で１８０μモルスケールで行なわれた。２’−Ｏ−メチル−Ｎ４ −ベンゾイル−５−メチルシチジンが付けられた ＰｈａｒｍａｃｉａのＨＬ３０プライマー支持体が使用された。脱トリチル化がトルエン中の３％ジクロロ酢酸（容量／容量）を使用して行なわれた。ホスホロアミダイトの活性化は、アセトニトリル中の１Ｈ−テトラゾールの０．４５Ｍ溶液で行なわれた。硫化は、アセトニトリル：３−ピコリン（１：１ｖ／ｖ）中のフェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を使用して２分間行なわれた。合成の最後に、その支持体はトリエチルアミン：アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ）の溶液で１２時間処理され、アセトニトリルで洗浄され、オリゴヌクレオチドが切り離され、そして３３％水溶液アンモニウム水溶液で５５℃で１２時間かけて脱保護され、冷却され、濃縮され、そして逆相ＨＰＬＣにより精製された。全てのＤＭＴ画分が一つにされ、キャピラリーゲル電気泳動により分析され、脱トリチル化され、析出され、そして粉末へと凍結乾燥された。この段階的硫化の効率は、３１ＰＮＭＲ（Ｄ２ Ｏ）に基づき９９．５％と分かった。
当業者は、本発明のこれら好ましい態様に多くの変更及び修飾が行なわれることができ、そしてそのような変更や修飾が本発明の精神から逸脱することなく行なわれることが分かるであろう。従って、添付の請求の範囲がそのような全ての均等的変法を本発明の真の精神及び範囲内に属するものとしてカバーすることが意図されている。
本明細書に記載された事柄に加えて、本発明の種々の修飾が、前述の記載から当業者に明らかであろう。そのような修飾は、添付の請求の範囲の範囲内に属することが意図される。
Claims (19)
- ２’修飾を伴う少なくとも１つのヌクレオシドを有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの製造方法であって、
２’修飾を伴う少なくとも１つのヌクレオシドを有する核酸部分の５’−ヒドロキシルを、アセトニトリル含有溶媒混合液中で亜リン酸化して亜リン酸中間体を形成し；そして
前記亜リン酸中間体をアセトニトリル含有溶媒混合液中でアセチルジスルフィドで、前記亜リン酸中間体を前記ホスホロチオエートへ転化するのに十分な時間酸化すること
を含んでなる方法。 - 前記酸化が容量基準で１：１の割合のアセトニトリル：ルチジンの存在下のものである、請求項１記載の方法。
- 前記アセチルジスルフィドがアリールアセチルジスルフィドである、請求項１記載の方法。
- 前記アセチルジスルフィドがフェニルアセチルジスルフィドである、請求項１記載の方法。
- 前記酸化溶媒が、ピリジン、ヒンダードピリジン又はそれらのブレンドである、請求項１記載の方法。
- 前記ヒンダードピリジンが、コリジン、ルチジン又はピコリンである、請求項５記載の方法。
- 前記亜リン酸化及び前記酸化を繰り返して、予め決められた長さを有する前記ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを与えることを含んでなる、請求項１記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが約６〜約５０ヌクレオチドを含んでなる、請求項７記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが約８〜約３０ヌクレオチドを含んでなる、請求項８記載の方法。
- 前記亜リン酸中間体がジヌクレオチドである、請求項１記載の方法。
- 前記亜リン酸中間体がオリゴヌクレオチドである、請求項１記載の方法。
- 全ての合成工程が自動化された合成装置で行なわれる、請求項１記載の方法。
- 前記亜リン酸化及び酸化工程の両方で共通の溶媒を使用することを含む、請求項１２記載の方法。
- 前記酸化工程において、前記アセトニトリル含有溶媒混合液が少なくとも１種の更なる溶媒と一緒に使用される、請求項１２記載の方法。
- 前記亜リン酸化工程が亜リン酸部分を用いて行なわれる、請求項１記載の方法。
- 前記亜リン酸部分がホスホロアミダイトである、請求項１５記載の方法。
- 前記亜リン酸化工程及び前記酸化工程がアセトニトリル中で行なわれる、請求項１記載の方法。
- 前記酸化工程が立体障害のあるヒンダードピリジンの存在下で行なわれる、請求項１７記載の方法。
- 前記ピリジンがピコリンである、請求項１８記載の方法。
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