JP2004500089A

JP2004500089A - Ｇタンパク共役受容体の酵素アッセイ法

Info

Publication number: JP2004500089A
Application number: JP2001558730A
Authority: JP
Inventors: ミシェル・エイ・ジェイ・パーマー; メリッサ・ジー; ボニー・ティロットソン; シャ−ジア・チャン
Original assignee: Tropix Inc
Current assignee: Tropix Inc
Priority date: 2000-02-07
Filing date: 2000-09-01
Publication date: 2004-01-08
Also published as: EP1257818A1; ATE494554T1; EP1257818A4; EP1257818B1; CA2399874A1; AU2000273414A1; WO2001059451A1; DE60045491D1

Abstract

Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）活性の検出法、ＧＰＣＲ活性のアッセイ法、さらにＧＰＣＲリガンド、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＲＫ）活性、およびＧＰＣＲ調節過程成分と相互作用する化合物のスクリーニング法について記載している。

Description

【０００１】
発明の背景
本出願は、２０００年２月７日に提出された仮出願番号６０／１８０，６６９の有益性を請求している。本仮出願の全文が参考としてここに収録されている。
【０００２】
発明の分野
本発明は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の活性を検出する方法に関するものであり、ＧＰＣＲ活性の定量法、およびＧＰＣＲリガンド、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＲＫ）活性、およびＧＰＣＲ調節過程のコンポーネントと相互作用する化合物のスクリーニング法を提供している。
【０００３】
多数の細胞外シグナルの活動は、Ｇタンパク質（ＧＰＣＲ）とグアニンヌクレオシド結合調節タンパク質（Ｇタンパク質）の相互作用により介される。Ｇタンパク質が介するシグナルシステムは、哺乳類や酵母のような多数の分岐生物中に見出されている。ＧＰＣＲは分岐アミノ酸配列を有する超大なタンパク質ファミリーを代表するものであるが、共通する構造的特徴として、特に７つの膜透過型ヘリックスドメインを有している。ＧＰＣＲは、他の細胞外シグナル間で、神経伝達物質、ホルモン、臭気および光に反応する。個々のＧＰＣＲタイプのタンパク質は、特にシグナル形質導入経路を活性化し、少なくとも１０種の異なるシグナル経路がＧＰＣＲにより活性化されることが知られている。例えば、β２−アドレナリン作動性受容体（β２ＡＲ）は哺乳類ＧＰＣＲのプロトタイプである。アゴニストとの結合による応答において、β２ＡＲ受容体は、アデニル酸シクラーゼの活性を刺激するＧタンパク質（Ｇｓ）を順次活性化し、その結果、細胞中のサイクリックアデノシンモノホスフェート（ｃＡＭＰ）の生成が増加する。
【０００４】
ＧＰＣＲの刺激の結果生ずるシグナル経路と最終的な細胞応答は、特定な受容体と共役するＧタンパク質の固有な種類に依存している（Ｈａｍｍ， ”ＴｈｅｍａｎｙｆａｃｅｓｏｆＧ−ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｇｎａｌｉｎｇ．” Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：６６９−６７２（１９９８））。例えば、Ｇタンパク質のＧｓクラスに共役するとｃＡＡ４Ｐの生成とプロテインキナーゼＡ、Ｃ経路の活性化が刺激され、一方Ｇタンパク質のＧｉクラスと共役するとｃＡＭＰを下方に調節する。カルシウム、ホスフォリパーゼＣ、およびホスファチジルイノシトール３として、他の２番目のメッセンジャー系が利用されることもある。最終的に、ＧＰＣＲシグナルイベントは、これら２番目のメッセンジャー系を定量することにより大部分が測定される。
【０００５】
ＧＰＣＲに一般的な生理的特徴は、受容体リン酸化、エンドサイトーシスのプロセスを通じた受容体の脱感作およびリサイクリングである（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，ｅｔａｌ．，Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｒｅｇｕｌａｔｏｒｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：ｒｏｌｅｏｆＧ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｋｉｎａｓｅｓａｎｄａｒｒｅｓｔｉｎｓ．” Ｃａｎ．ＩＰｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，７４：１０９５−１１１０（１９９６））。リガンドで占有されたＧＰＣＲは、セリン／スレオニンキナーゼの２つのファミリー、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＲＫｓ）、およびプロテインキナーゼＡ、Ｃのような２番目のメッセンジャー依存タンパク質キナーゼにより、リン酸化される可能性がある。どちらのクラスのキナーゼによるリン酸化でも、対応するＧタンパク質から脱共役させることで、受容体は下方に調節される。また、受容体の細胞質ドメインと結合し、嚢胞内膜小胞内への受容体のクラスタリングを促進させることで知られるタンパク質類が、ＧＲＫリン酸化により漸増し、受容体を下方調節する。一旦受容体がエンドサイトーシスされると、リソゾーム内で分解されるか、脱リン酸化およびリサイクルされ、完全な機能を持った受容体として細胞膜に戻される。
【０００６】
アレスチンタンパク質の活性化受容体への結合は、ロドプシンからβ２ＡＲ、ニューロテンシンに至る範囲の様々なＧＰＣＲに共通する現象として、文献に発表されている（Ｂａｒａｋ，ｅｔａｌ．， ”Ａ β−ａｒｒｅｓｔｉｎ／ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｂｉｏｓｅｎｓｏｒｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇＧ−Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＣｏｕｐｌｅｄＲｅｃｅｐｔｏｒＡｃｔｉｖａｔｉｏｎ，” Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：２７４９７−５００（１９９７））．特異的ＧＰＣＲと相互作用するアレスチンをモニターすることが、ＧＰＣＲ活性を測定する一般的な方法として、最終的に利用できる可能性がある。同様に、１つのＧタンパク質とＧＲＫは様々な受容体と組み（Ｈａｍｍ，ｅｔａｌ．（１９９８）とＰｉｔｃｈｅｒｅｔａｌ．， ”Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＣｏｕｐｌｅｄＲｅｃｅｐｔｏｒＫｉｎａｓｅｓ，” Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７：６５３−９２（１９９８）），その結果、これらのタンパク質とタンパク質相互作用をモニターすることで、受容体活性を測定できることが考えられる。
【０００７】
本発明は、ＧＰＣＲシグナルからタンパク質／タンパク質相互作用をモニターするための特許取得済み技術（ＩＣＡＳＴ^ＴＭ：ＩｎｔｅｒｃｉｓｔｒｏｎｉｃＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓＳｃｒｅｅｎｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、シストロン内相補性分析スクリーニング法）の使用も含んでいる。この方法は２つの不活性なガラクトシダーゼ変異体の使用をみ、各変異体は、２対の相互作用タンパク質の１対、例えばＧＰＣＲとアレスチンのような対により融合される。活性なβ−ガラクトシダーゼ複合体の生成は、標的タンパク質の相互作用により誘導される。この系において、β−ガラクトシダーゼは、ＧＰＣＲ活性からの読み取り情報通り作用する。図２３は、本発明の方法を図解したものである。図２３は、２つの不活性変異体が相互作用する場合、活性になることを示している。さらに、本技法は、Ｇタンパク質、ＧＲＫｓまたはｃ−Ｓｒｃのような他のダウンストリームのシグナリングコンポーネントを通して、ＧＰＣＲで介されるシグナル経路をモニターすることに使用できる可能性もある。
【０００８】
今日使用されている多数の治療薬はＧＰＣＲを標的としている。ＧＰＣＲが血管拡張、心拍数、気管支拡張、内分泌および消化管ペリスターシスを始めとする、バイタルな生理反応を調節しているからである。例えば、Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚｅｔａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５２：１５９（１９８３）を参照。よく研究されたＧＰＣＲやβ２ＡＲを標的とする薬剤が、アナフィラキシー、高血圧、喘息、および他の病状の治療に用いられている。これらの薬剤の中には、この受容体に対するリガンドを模倣しているものがある。他の薬剤は、疾病がこの受容体自体の自然活性から発生した場合に、受容体に拮抗するように働く。
【０００９】
ヒトゲノムプロジェクトのような場所では、生理的役割やリガンドが未知な新たなＧＰＣＲ（「オーファン」受容体）を同定する努力を行っている。数千のＧＰＣＲがヒトゲノムには存在することが推定されている。今日までに同定された２５０個のＧＰＣＲ内、たった１５０個がリガンドを伴っている。
【００１０】
発明の要約
本発明の最初の観点は、受容体活性部位の近位においてＧＰＣＲ機能をモニターする方法にあり、競合メカニズムが少ないため、薬剤開発を目的としたより多くの情報を提供することにある。アレスチン、Ｇタンパク質ＧＲＫまたは他のキナーゼのような、受容体との結合が受容体のアゴニストの占有に依存している調節コンポーネントと、受容体の相互作用を読み取ることにより、ＧＰＣＲの活性化は測定される。タンパク質／タンパク質相互作用は、ＩＣＡＳＴ^ＴＭ技法で利用している、レポータータンパク質の相補作用によって検出される。
【００１１】
本発明の更なる観点は、試験状況下でＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）経路の活性を評価する方法にある。その評価は、ムスカリン作動、アドレナリン作動、ドーパミン、アンジオテンシンおよびエンドセリンなどのＧＰＣＲを、変異体レポータータンパク質への融合タンパク質として発現する試験細胞を提供することにより、さらに相補性レポータータンパク質との融合タンパク質として、Ｇタンパク質、アレスチン、またはＧＲＫを作用させることによって行われる。試験細胞が試験条件下で、標的ＧＰＣＲに知られたアゴニストに暴露される場合、ＧＰＣＲの活性化はレポーター酵素の相補作用によってモニターされることになる。レポーター酵素活性の増加は、ＧＰＣＲと反応タンパク質パートナーの相互作用を反映している。
【００１２】
本発明の更なる観点は、試験キナーゼの存在下でＧＰＣＲ経路活性を評価する方法にある。
【００１３】
本発明の更なる観点は、試験Ｇタンパク質の存在下でＧＰＣＲ経路活性を評価する方法にある。
【００１４】
本発明の更なる観点は、試験細胞を試験リガンドに暴露した状態でＧＰＣＲ経路活性を評価する方法にある。
【００１５】
本発明の更なる観点は、試験受容体の試験細胞中の同時発現に関するＧＰＣＲ経路活性を評価する方法にある。
【００１６】
本発明の更なる観点は、リガントまたはアゴニストからオーファンＧＰＣＲをスクリーニングする方法にある。リガンドやアゴニストは、天然または合成ライブラリーあるいはその混合物中に含まれている可能性があり、また生理的刺激物質である可能性がある。試験細胞は、オーファンＧＰＣＲを１つのβ−ガラクトシダーゼ変異体で融合したタンパク質として発現させる、例えば、アレスチンまたはその変異体型を別のβ−ガラクトシダーゼ変異体で融合したタンパク質として発現させるという条件下におかれている。受容体活性化に及ぼすアレスチンとオーファンＧＰＣＲの相互作用は、補充されたβガラクトシダーゼの酵素活性によって測定される。試験細胞は試験化合物に暴露されると、βガラクトシダーゼ活性が増加し、リガントまたはアゴニストの存在が示される。
【００１７】
本発明の更なる観点は、興味あるタンパク質、例えばアレスチンタンパク質（またはアレスチンタンパク質の変異体型）の、リン酸化または活性化したＧＰＣＲへの結合能力をスクリーニングする方法にある。細胞は、ＧＰＣＲを発現し、β−アレスチンを含有しているという条件下にある。細胞は既知のＧＰＣＲアゴニストに暴露され、続いてレポーター酵素の活性が検出される。レポータ酵素の活性増加は、βアレクシン分子が、試験細胞中でリン酸化または活性化したＧＰＣＲに結合できることを示している。
【００１８】
本発明の更なる観点は、アゴニストから特定のＧＰＣＲをスクリーニングする方法にある。アゴニストは、天然または合成ライブラリ含まれている可能性があり、また生理的刺激物質である可能性がある。試験細胞は、ＧＰＣＲを１つのβ−ガラクトシダーゼ変異体で融合したタンパク質として発現させる、例えば、アレスチンを別のβ−ガラクトシダーゼ変異体で融合したタンパク質として発現させる条件下におかれている。受容体活性化に及ぼすアレスチンとＧＰＣＲの相互作用は、補充されたβガラクトシダーゼの酵素活性によって測定される。試験細胞は試験化合物に暴露されると、βガラクトシダーゼ活性が増加し、アゴニストの存在が示される。試験細胞は、１つの既知ＧＰＣＲまたは様々な既知ＧＰＣＲ類を発現するか、または１つの未知ＧＰＣＲまたは多様な未知ＧＰＣＲ類を発現する可能性がある。ＧＰＣＲとして、例えば、臭気剤ＧＰＣＲまたはβＡＲＧＰＣＲが挙げられる。
【００１９】
本発明の更なる観点は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）アンタゴニスト活性について試験化合物をスクリーニングする方法にある。試験細胞は、ＧＰＣＲを１つのβ−ガラクトシダーゼ変異体で融合したタンパク質として発現させる、例えば、アレスチンを別のβ−ガラクトシダーゼ変異体で融合したタンパク質として発現させる条件下におかれている。受容体活性化に及ぼすアレスチンとＧＰＣＲの相互作用は、補充されたβガラクトシダーゼの酵素活性によって測定される。試験細胞は試験化合物に暴露されると、βガラクトシダーゼ活性が増加し、アゴニストの存在が示される。細胞は試験化合物とＧＰＣＲアゴニストに暴露され、続いてレポーター酵素の活性が検出される。アゴニストへの暴露が、試験化合物への暴露と同時またはその後に起こる場合、試験化合物に暴露後のβ−ガラクトシダーゼ活性の減少は、試験化合物がＧＰＣＲに対するアンタゴニスト活性を有することを示している。
【００２０】
本発明の更なる観点は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）へのアゴニスト、アンタゴニスト、またはリガンドの存在をサンプル溶液からスクリーニングする方法にある。試験細胞は、ＧＰＣＲ融合を発現すること、例えば、β−アレスチンタンパク質融合を含むことが条件となっている。試験細胞はサンプル溶液に暴露され、さらにレポーター酵素活性が評価されている。サンプル溶液に暴露後、レポーター酵素活性が変化することは、細胞中で発現されたＧＰＣＲに対するアゴニスト、アンタゴニスト、またはリガンドが、サンプル溶液中に含まれていたことを示している。
【００２１】
本発明の更なる観点は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の存在について細胞を対象にスクリーニングする方法にある。
【００２２】
本発明の更なる観点は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を含有する細胞について、多数の細胞を対象にスクリーニングする方法にある。
【００２３】
本発明の更なる観点は、ＧＰＣＲが介するシグナル経路をマッピングする方法にある。例えば、この系は、ＧＰＣＲの活性化に関して、ｃ−ｓｒｃとβ−アレスチン−１の相互作用をモニターするために利用される可能性がある。さらに、この系は、ＧＰＣＲシグナル経路と、受容体チロシンキナーゼまたはＲａｓ／Ｒａｆのような他の経路との間のクロストークに関与した、タンパク質／タンパク質相互作用をモニターするために、使用できる可能性がある。
【００２４】
本発明のさらなる観点は、アゴニストまたはアンタゴニストの刺激に関してＧＰＣＲのホモまたはヘテロ二量化反応をモニターする方法にある。
【００２５】
本発明の更なる観点は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のアゴニストに応答するＧＰＣＲの存在を、細胞を対象にスクリーニングする方法にある。細胞は、ＧＰＣＲ経路中のダウンストリームに作用する、タンパク質対を含んでいるという条件下におかれている。タンパク質パートナーは、酵素を補充する変異体への融合タンパク質として発現され、ＧＰＣＲの活性化をモニターするために使用されている。細胞はＧＰＣＲアゴニストに暴露され、続いてレポーター酵素の酵素的活性が検出される。レポーター酵素活性が増加することは、細胞が、アゴニストに応答するＧＰＣＲを含んでいることを示している。
【００２６】
本発明では、タンパク質／タンパク質相互作用スクリーニング法であるＩＣＡＳＴ^ＴＭを使用して、シグナル経路のマッピングを行っている。この技術は多様な機能を持つ、既知および未知の様々なＧＰＣＲに適用可能である。以下に挙げるＧＰＣＲのサブファミリーに適用できるが、これだけに限らない。
【００２７】
（ａ）アミン様リガンドに結合する受容体 − アセチルコリンムスカリン受容体（Ｍ１からＭ５）、α、βアドレナリン受容体、ドーパミン受容体（Ｄ１，Ｄ２，Ｄ３，Ｄ４），ヒスタミン受容体（Ｈ１とＨ２）、オクトパミン受容体およびセロトニン受容体（５ＨＴ１，５ＨＴ２，５ＨＴ４，５ＨＴ５，５ＨＴ６，５ＨＴ７）。
【００２８】
（ｂ）ペプチドリガンドに結合する受容体 − アンジオテンシン受容体、ボンベシン受容体、ブラジキニン受容体、Ｃ−Ｃケモキン受容体（ＣＣＲ１からＣＣＲ８，およびＣＣＲＩＯ）、Ｃ−Ｘ−Ｃ型ケモキン受容体（ＣＸＣ−Ｒ５）、コレシストキン型Ａ受容体、ＣＣＫ型受容体、エンドセリン受容体、ニューロテシン受容体、ＦＭＥＬＰ関連受容体、ソマトスタチン受容体（タイプ１からタイプ５）およびオピオイド受容体（タイプＤ，Ｋ，Ｍ，Ｘ）。
【００２９】
（ｃ）ホルモンタンパク質と結合する受容体 − 葉酸刺激ホルモン受容体、甲状腺刺激ホルモン受容体、およびルトロピン−絨毛性ゴナドトロピンホルモン受容体。
【００３０】
（ｄ）神経伝達物質に結合する受容体 −　サブスタンスＰ受容体、サブスタンスＫ受容体、および神経ペプチドＹ受容体
【００３１】
（ｅ）臭覚受容体 − 臭覚タイプ１からタイプ１１、味覚および臭気物質受容体　（ｆ）プロスタノイド受容体 − プロスタグランジンＥ２（ＥＰ１からＥＰ４　サブタイプ）、プロスタサイクリンおよびトロンボキサン。
（ｇ）代謝物質に結合する受容体−グクタミン酸塩グループＩからＩＩＩの代謝生成物産性受容体。
（ｈ）光など物理的刺激、または味覚や臭覚など化学的刺激に応答する受容体。
（ｉ）オーファンＧＰＣＲ − 受容体への天然リガンドは確認されていない。
【００３２】
ＩＣＡＳＴ^ＴＭ技法は、スクリーニング過程に多数の利点を与えている。それらの利点には、非細胞コンパートメントと細胞膜、細胞ゾルおよび核などの間におけるタンパク質の作用をモニターする能力、タンパク質過剰発現を必要とせずに、より生理的に信頼性のあるモデルを実行する能力、さらに受容体結合の機能検定を実行し、高度な情報を得る能力などが含まれる。
【００３３】
発明の態様の詳細な説明
本公開に引用されている論文と特許すべてが、参考文献として本文書内に挿入されている。
【００３４】
本発明は、ＧＰＣＲの機能と経路を探す方法を提供している。ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノミックＤＮＡの自動配列決定により、新たな受容体が発見されているので、Ｇタンパク質共役スーパーファミリーは、迅速に広がり続けている。
【００３５】
数千のＧＰＣＲがヒトゲノムに存在し、２５０個のＧＰＣＲがクローン化されているが、そのうちリガンドが付随しているのは、僅かに１５０個と推定されている。これらの受容体または新たに発見されたオーファン受容体が、同族リガンドや生理的機能に関与する方法は、生物学および生物医学研究における主要なチャレンジとなっている。オーファン受容体の同定は一般的に、個別にアッセイし、その機能を推定する必要がある。受容体を置換させてＧＰＣＲのシグナル挙動を詮索する方法は、他のシグナルイベントに関する情報の有無に関わらず実施できるので、上記で必要とされた作業を行わなくすむ。これら受容体の多くが、共通のメカニズムで脱感作するので、この方法は、感度よく、迅速で簡易に実施でき、さらにほとんどすべてのＧＰＣＲに適用できる。
【００３６】
刺激物質に応答する細胞内活動をモニターするために、様々な方法が使用されてきている。例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光画像プレートリーダー測定法（ＦＬＩＰＲ^ＴＭ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓＣｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）、ＥＶＯｓｃｒｅｅｎ^ＴＭ法（ＥＶＯＴＥＣ^ＴＭ，ＥｖｏｔｅｃＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＧｍｂｈ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、およびＣＥＬＬＯＭＩＣＳ^ＴＭ法（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）から開発された方法などである。
【００３７】
Ｇｅｒｍｉｎｏ，Ｆ．Ｊ．，ｅｔａｌ．， ”Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｆｏｒｉｎｖｉｖｏｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０（３）：９３３−７（１９９３）の論文では、興味あるタンパク質と相互作用するタンパク質を単離するｉｎｖｉｖｏアプローチを発表している。
【００３８】
Ｐｈｉｚｉｃｋｙ，Ｅ．Ｍ．，ｅｔａｌ． ”Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓ．” Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５９，１）：９４−１２３（１９９５）の論文では、タンパク質−タンパク質相互作用を研究するために、生化学的、分子生物学的、および遺伝学的方法をレビューしている。
【００３９】
Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ．ｅｔａｌ．， ”Ｇα_５ａｎｄＧα_１６ＣｏｕｐｌｅａＷｉｄｅＶａｒｉｅｔｙｏｆＲｅｃｅｐｔｏｒｓｔｏＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅＣ．” Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０（２５）：１５１７５−８０（１９９５）の論文では、Ｇα_１５およびＧα_１６が、広範囲なＧタンパク質共役受容体によって活性化されることを発表している。活性化受容体のＧタンパク質判別パターンへの選択的カップリングは、正確なシグナルの形質導入を実行するための、必須事項として考えられている。
【００４０】
Ｂａｒａｋｅｔａｌ．， ”Ａ β−ａｒｒｅｓｔｉｎ／ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎＢｉｏｓｅｎｓｏｒｆｏｒＤｅｔｅｃｔｉｎｇＧＰｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄＲｅｃｅｐｔｏｒＡｃｔｉｖａｔｉｏｎ．” Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（４４）：２７４９７−５００（１９９７）の論文と米国特許Ｎｏ．５，８９１，６４６，では、β−アレスチン／緑色蛍光融合タンパク質（ＧＦＰ）を使用して、ＧＰＣＲの刺激によるタンパク質の転座をモニターすることを発表している。
【００４１】
本発明は、ＩＣＡＳＴ^ＴＭ法（ＩｎｔｅｒｃｉｓｔｒｏｎｉｃＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓＳｃｒｅｅｎｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：シストロン間補性検定スクリーニング技法、米国特許出願中、出願番号０５３，１６４、１９９８年４月１日提出）を使用する完全なアッセイ法として、ＧＰＣＲ経路におけるタンパク質−タンパク質相互作用をモニターする方法である。本発明は、ＧＰＣＲの結合アッセイを始めとする多数のアッセイを、高処理量スクリーニングに基づく高速で非放射性アッセイ様式を用い、細胞環境中で直接実施することができる。既存の方法によりこの種のアッセイを実施するには、現在、非細胞環境下でしかも放射線同位体を必要としている。本発明は、Ｔｒｏｐｉｘ社のＩＣＡＳＴ^ＴＭ法とＡｄｖａｎｃｅｄＤｉｓｃｏｖｅｒｙＳｃｉｅｎｃｅｓ^ＴＭ社の技術、例えば超高処理スクリーニング法などを組み合わせたものであり、高処理スクリーニング（ＨＴＳ）に従った、ＧＰＣＲ経路を検索する高感度で細胞をベースとした方法である。
【００４２】
これらの方法は、緑色蛍光タンパク質で融合するＧＰＣＲ成分の顕微鏡画像を特長とした、米国特許５，８９１，６４６で公開されている発明を進展させたものである。低処理量、完璧な定量性の欠落、およびシグナル／ノイズ比の低さなどの理由から、画像技術には限界がある。高処理量アッセイにおいてタンパク質／タンパク質相互作用をモニターするために利用されている、酵母による２ハイブリッドアッセイ法と異なり、本発明は、哺乳類の細胞、植物細胞、大腸菌のような原生動物細胞、および酵母、どろどろしたカビ（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）や昆虫のような無脊椎を起源とする細胞など、様々な細胞に適用できる。また、本発明は、受容体ターゲット部位における相互作用や、核よりむしろ下方の標的タンパク質における相互作用を検出する。さらに転写活性化のように、直接的な読み取り情報に依存していない。本発明は、生理的により大きい信頼性のある、マエナスの誤差が少ないアッセイ法を提供している。
【００４３】
ＡｄｖａｎｃｅｄＤｉｓｃｏｖｅｒｙＳｃｉｅｎｃｅｓ^ＴＭ社は、個々のアッセイの必要事項に最適化した、自動化が約束された、様々なニーズに適応するように開発された、スクリーニングアッセイ法を提供するビジネスを行っている。これらのアッセイ法はＨＴＳのエキスパートによりデザインされ、優れたアッセイ結果を届けている。ＡｄｖａｎｃｅｄＤｉｓｃｏｖｅｒｙＳｃｉｅｎｃｅｓ^ＴＭ社のニーズに応じたアッセイ法の開発サービスは、高性能のスクリーニングアッセイのデザイン、開発、最適化および変更を実施している。ＡｄｖａｎｃｅｄＤｉｓｃｏｖｅｒｙＳｃｉｅｎｃｅｓ^ＴＭ社は、新たなアッセイ法のデザイン、または既存方法を過酷なＨＴＳ測定に耐える超高感度発光アッセイ法に変換することを行っている。ＡｄｖａｎｃｅｄＤｉｓｃｏｖｅｒｙＳｃｉｅｎｃｅｓ^ＴＭ社により開発された技術の中に、ｃＡＭＰ−Ｓｃｒｅｅｎ^ＴＭ免疫測定システムがある。このシステムにより、細胞溶解物中からｃＡＭＰの超高感度定量が行える。ｃＡＭＰ−Ｓｃｒｅｅｎ^ＴＭアッセイ法は、Ｓａｐｐｈｉｒｅ−Ｉｌ^ＴＭ発光エンハンサーとともに、高感度な化学発光アルカリホスファターゼ（ＡＰ）の基質、ＣＳＰＤ（登録商標）を利用している。
【００４４】
実施例：
ＧＰＣＲの活性化は、リガンド活性化ＧＰＣＲのアレスチンとの結合をモニターすることにより測定できる。このアッセイ系で、ＧＰＣＲ、例えばβアドレナリン作動性受容体（β２ＡＲ）とアレスチンは、βｇａｌ変異体の融合タンパク質と同じ細胞内に同時に発現される。図１に図解されているように、β２ＡＲはβｇａｌ変異体のΔα型との融合タンパク質（β２ＡＤＲΔα）として、βアレスチンは、βｇａｌのΔω型との融合タンパク質（β−ＡｒｒΔω）として発現される。この２つの融合タンパク質は、別々のコンパートメント、すなわちＧＰＣＲでは膜内、アレスチンでは細胞質ゾル内の休息（または非刺激）細胞の内部に存在しており、活性なβガラクトシダーゼ酵素を生成することはできない。このような細胞がアゴニストまたはリガンドで処理されると、リガンド占有活性化受容体は、アレスチンに対して高い親和性をもつ結合部位となる。活性化されたβ２ＡＤＲΔαおよびβ−ＡｒｒΔω間の相互作用により、βｇａｌとｇａｌ変異体の相補性が誘導される。酵素活性は、酵素基質により測定することができ、その基質は開裂時に、比色法、蛍光法、化学発光法（例えば、Ｔｒｏｐｉｘ社製品、ＧａＩＳｃｒｅｅｎ^ＴＭ）により測定可能な生成物を放出する。
【００４５】
実験プロトコル
１．第１段階において、β２ＡＤＲΔα とβＡｒｒ２Δωの発現ベクターを、図１８と図１５でそれぞれ説明している、選択的レトロウイルスベクターのｐＩＣＡＳＴＡＬＣおよびｐＩＣＡＳＴＯＭＣ中で構築した。
【００４６】
２．第２段階において、その２つの発現構築領域を、筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２または、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、Ａ４３１、ＨＥＫ２９３、およびＣＨＷのような他の哺乳類の細胞株内に形質導入した。抗生物質で選択した後、適切なレベルで両方の融合タンパク質を発現する安定なクローンを選択した。
【００４７】
３．最終段階において、β２ＡＤＲΔα とβＡｒｒ２Δωの両方を発現する細胞を、アゴニスト／リガンド刺激によるβガラクトシダーゼ活性に対する応答について試験した。３倍に増やした細胞サンプルを、９６−ウェル培養プレートの１つのウェル内に、１００μＬにつき１０，０００個の細胞となるように平板培養した。細胞を２４時間培養し、アッセイを行った。アゴニストのアッセイ法（図３と図４）用に、細胞を、（−）イソプロテレノール、プロカテロール、ドブタミン、テルブチリン、Ｌ−Ｌ−フェニレフリンなど、アゴニストの濃度を変化させて３７℃で６０分間処理を行った。ＴｒｏｐｉｘＧａＩＳｃｒｅｅｎ^ＴＭ基質（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を添加し、誘発されたβガラクトシダーゼ活性を、発光量からＴｒｏｐｉｘＴＲ７１７^ＴＭルミノメーター（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した。アンタゴニストのアッセイ（図５）において、細胞を、ＩＣＩ− １１８，５５１またはプロプラノロールの共存下、血清なしの新鮮な培地で１０分間予備インキュベートし、続いて１０μＭの（−）イソプロテレノールを添加した。
【００４８】
本発明のアッセイ法、およびその適用と調製について、これまで、全般的にさらに実施例を示して具体的に記述してきた。ただし、実施例に示されているものだけに限られない。同定物質、特徴およびアッセイ法など他に代替となるものが、発明者が実施していなくとも、本方法の通常の技法として考慮される場合がある。このような変更は、以下に提出した請求範囲内で詳細な表現によって除外されていない場合は、本発明の範囲内に入るものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｃ２クローン中のβ２アドレナリン作動性受容体（β２ＡＲ）と β−アレスチン−２（βＡｒｒ２）の細胞発現レベル。 β−ｇａｌ融合タンパク質の定量は、標準のＥＬＩＳＡ法による検量線から、β−ｇａｌと精製β−ｇａｌタンパク質に対する抗体量を求めて行った。Ｆｉｇｕｒｅ１Ａは、β２ＡＲ−βｇａｌΔα クローンの発現レベルを示す（発現ベクターｐＩＣＡＳＴＡＬＣ中）。図１Ｂは、クローン９−３， −７， −９， −１０， −１９および−２４に対するｐＩＣＡＳＴＯＭＣ４ベクター、またはクローン１２−４， −９， −１６， −１８， −２２および−２４に対するベクターｐＩＣＡＳＴＯＭＮ４中のβＡｒｒ２−βｇａｌΔωの発現レベルを示す。
【図２】受容体β２ＡＲの活性化は、アゴニストの刺激によるｃＡＭＰ生成から測定された。ｐＩＣＡＳＴＡＬＣ β２ＡＲ（クローン５）を発現するＣ２細胞または親細胞は、（−）イソプロテレノールと０．１ｍＭＩＢＭＸの濃度を増加させて処理した。ｃＡＭＰレベルの定量はｐｍｏｌ／ウェル単位で表されている。
【図３】活性化受容体β２ＡＲとアレスチンの反応は、β−ガラクトシダーゼの相補性により測定可能である。図３Ａは、β２ＡＲ−βｇａｌΔαを発現する（β２ＡＲのみ、発現ベクターｐＩＣＡＳＴＡＬＣ中）Ｃ２、またはＣ２クローン、およびβ−２ＡＲ−βｇａｌΔα と βＡｒｒ２−βｇａｌΔωαを同時発現する（発現ベクターｐＩＣＡＳＴＡＬＣとｐＩＣＡＳＴＯＭＣ中）Ｃ２プールにおいて、アゴニストである（−）イソプロテレノールの刺激に応答するβ−ガラクトシダーゼ活性の経時変化を表している。図３Ｂは、β２ＡＲのみを発現するＣ２細胞（発現ベクターｐＩＣＡＳＴＡＬＣ中）、およびβ２ＡＲと βＡｒｒ１を同時発現する（発現ベクターＩＣＡＳＴＡＬＣとｐＩＣＡＳＴＯＭＣ中）Ｃ２クローンにおいて、アゴニストである（−）イソプロテレノールの刺激に応答する、β−ガラクトシダーゼ活性の経時変化を表している。
【図４】β２ＡＲとアレスチンの反応に対するアゴニストの用量反応曲線は、β−ガラクトシダーゼの相補性から測定できる。図４Ａは、ｐＩＣＡＳＴＡＬＣ β２ＡＲとｐＩＣＡＳＴＯＭＣ βＡｒｒ２の融合構築領域を同時発現するＣ２細胞における、アゴニストである（−）イソプロテレノールとプロカテロールに対する用量反応曲線を表している。図４Ｂは、ｐＩＣＡＳＴＡＬＣ β２ＡＲとｐＩＣＡＳＴＯＭＣ βＡｒｒ１の融合構築領域を同時発現するＣ２細胞における、アゴニストである（−）イソプロテレノールとプロカテロールに対する用量反応曲線を表している。
【図５】アゴニストが介する受容体活性の抑制は、β２ＡＲ−βｇａｌΔα と βＡｒｒ−βｇａｌΔωを同時発現する細胞中で、β−ガラクトシダーゼの相補性から測定できる。図５Ａは、アゴニストの（−）イソプロテレノールでインキュベーション後に、融合構築領域となるｐＩＣＡＳＴＡＬＣ β２ＡＲとｐＩＣＡＳＴＯＭＣ βＡｒｒ２を同時発現するＣ２クローン中で、アドレナリン作動性アンタゴニストであるＩＣＩ−Ｉ１８，５５１とプロプラノロールが、βガラクトシダーゼ活性を特異的に抑制する作用を示している。図５Ｂは、アゴニストの（−）イソプロテレノール共存下で、融合構築領域となるｐＩＣＡＳＴＡＬＣ β２ＡＲとｐＩＣＡＳＴＯＭＣ βＡｒｒ１を同時発現するＣ２クローン中における、アドレナリン作動性アンタゴニストであるＩＣＩ−Ｉ１８，５５１とプロプラノロールが、βガラクトシダーゼ活性を特異的に抑制する作用を示している。
【図６】アデノシン受容体であるＡ２ａを発現するＣ２細胞は、アゴニスト（ＣＧＣ−２１６８０）の処理に対応して、ｃＡＭＰの誘発を示す。プールとして、あるいは選択されたクローンとしてｐＩＣＡＳＴＡＬＣＡ２ａＲとｐＩＣＡＳＴＯＭＣ βＡｒｒ１を同時発現するＣ２親細胞およびＣ２細胞は、アゴニストに誘導されたｃＡＭＰの応答（ｐｍｏｌ／ウェル）から測定された。
【図７】ドーパミン受容体Ｄ１（Ｄｌ−βｇａｌΔα）と β−アレスチン−２（βＡｒｒ２−βｇａｌΔω）を同時発現するＣ２細胞における、アンタゴニストに刺激されたｃＡＭＰの応答。βＡｒｒ２−βｇａｌΔω（Ａｒｒ２のみ）を発現するクローンが、この検定において陰性コントロールとして使用された。βＡｒｒ２−βｇａｌΔωに加えてＤ１−βｇａｌΔαを発現する細胞は、アゴニストの処理（３μＭの３−ヒドロキシチアミン塩酸塩）に反応した。Ｄｌ（ＰＩＣ２）またはＤｌ（ＰＩＣ３）は、それぞれ発現ベクターｐＩＣＡＳＴＡＬＣ２またはｐＩＣＡＳＴＡＬＣ４中でＤ１を指定した。
【図８】哺乳類の様々な細胞株を使用して、安定な細胞を生成し、ＧＰＣＲとアレスチンの相互作用をモニターすることができる。図８Ａ、図８Ｂおよび図８Ｃは、アドレナリン作動性受容体β２ＡＲおよび β−ガラクトシダーゼ変異体のアレスチン融合タンパク質を同時発現する、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯおよびＣＨＷの細胞株例を示している。アゴニストに誘発された、β２ＡＲとアレスチンタンパク質の相互作用をモニターするのに、β−ガラクトシダーゼ活性が使用された。
【図９】β−ｇａｌの相補性を利用して、β２アドレナリン作動性受容体のホモ二量化反応がモニターされた。図９Ａは、ｐＩＣＡＳＴＡＬＣ β２ＡＲとｐＩＣＡＳＴＯＭＣ β２ＡＲを同時発現するＨＥＫ２９３クローン中の、β−ガラクトシダーゼを表している。図９Ｂは、ｐＩＣＡＳＴＡＬＣ β２ＡＲおよびｐＩＣＡＳＴＯＭＣ β２ＡＲを同時発現するＨＥＫ２９３クローン中における、アンタゴニストである（−）イソプロテレノールに対するｃＡＭＰの応答を示している。ＨＥ１２９３親細胞は陰性コントロールとして検定中に含まれている。
【図１０Ａ】ｐＩＣＡＳＴＡＬＣ：標的タンパク質のＣ−末端融合物質としてβ−ｇａｌΔαを発現するベクター。このベクターの構造は、以下の特徴領域を含んでいる。すなわち、β−ｇａｌΔαのフレーム中で標的タンパク質をクローニングするための複数クローニング用部位（ＭＣＳ）、ＧＳリンカー（（ＧＧＧＧＳ）ｎ）、ネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）、内部リボソーム入口部位（ＩＲＥＳ）、大腸菌増殖における複製起点（ＣｏｌＥ１ｏｒｉ）、白血病ウイルスによるウイルス性プロモーターシグナルとポリアデニル化シグナル（５’ ＭｏＭｕＬＶＬＴＲと３’ＭｏＭｕＬＶＬＴＲ）などである。
【図１０Ｂ】ｐＩＣＡＳＴＡＬＣのヌクレオシド配列
【図１１Ａ】ｐＩＣＡＳＴＡＬＮ：標的タンパク質のＮ−末端融合物質としてβ−ｇａｌΔαを発現するベクター。このベクターの構造は、以下の特徴領域を含んでいる。すなわち、β−ｇａｌΔαのフレーム中で標的タンパク質をクローニングするための複数クローニング用部位（ＭＣＳ）、ＧＳリンカー（（ＧＧＧＧＳ）ｎ）、ネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）、内部リボソーム入口部位（ＩＲＥＳ）、大腸菌増殖における複製起点（ＣｏｌＥ１ｏｒｉ）、白血病ウイルスによるウイルス性プロモーターシグナルとポリアデニル化シグナル（５’ ＭｏＭｕＬＶＬＴＲと３’ＭｏＭｕＬＶＬＴＲ）などである。
【図１１Ｂ】ｐＩＣＡＳＴＡＬＮのヌクレオシド配列。
【図１２Ａ】ｐＩＣＡＳＴＯＭＣ：標的タンパク質のＣ−末端融合物質としてβ−ｇａｌΔωを発現するベクター。このベクターの構造は、以下の特徴領域を含んでいる。すなわち、β−ｇａｌΔωのフレーム中で標的タンパク質をクローニングするための複数クローニング用部位（ＭＣＳ）、ＧＳリンカー（（ＧＧＧＧＳ）ｎ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇｒｏ）、内部リボソーム入口部位（ＩＲＥＳ）、大腸菌増殖における複製起点（ＣｏｌＥ１ｏｒｉ）、白血病ウイルスによるウイルス性プロモーターシグナルとポリアデニル化シグナル（５’ ＭｏＭｕＬＶＬＴＲと３’ＭｏＭｕＬＶＬＴＲ）などである。
【図１２Ｂ】ｐＩＣＡＳＴＯＭＣのヌクレオシド配列。
【図１３Ａ】ｐＩＣＡＳＴＯＭＣ：標的タンパク質のＮ−末端融合物質としてβ−ｇａｌΔωを発現するベクター。このベクターの構造は、以下の特徴領域を含んでいる。すなわち、β−ｇａｌΔωのフレーム中で標的タンパク質をクローニングするための複数クローニング用部位（ＭＣＳ）、ＧＳリンカー（（ＧＧＧＧＳ）ｎ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇｒｏ）、内部リボソーム入口部位（ＩＲＥＳ）、大腸菌増殖における複製起点（ＣｏｌＥ１ｏｒｉ）、白血病ウイルスによるウイルス性プロモーターシグナルとポリアデニル化シグナル（５’ ＭｏＭｕＬＶＬＴＲと３’ＭｏＭｕＬＶＬＴＲ）などである。
【図１３Ｂ】ｐＩＣＡＳＴＯＭＮのヌクレオシド配列
【図１４】ｐＩＣＡＳＴＡＬＣ βＡｒｒ２：β−アレスチン−２へのＣ−末端融合物質としてβ−ｇａｌΔαを発現するベクター。　ヒトβ−アレスチン−２のコード配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセス番号：ＮＭ００４３１３）は、ｐＩＣＡＳＴＡＬＣベクター中のβ−ｇａｌΔα へのフレーム内でクローン化された。
【図１５】ｐＩＣＡＳＴＯＭＣ βＡｒｒ２：β−アレスチン−２へのＣ−末端融合物質としてβ−ｇａｌΔωを発現するベクター。ヒトβ−アレスチン−２のコード配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセス番号：ＮＭ００４３１３）は、ｐＩＣＡＳＴＯＭＣベクター中のβ−ｇａｌΔω のフレーム内でクローン化された。
【図１６】ｐＩＣＡＳＴＡＬＣ βＡｒｒ１： β−アレスチン−１へのＣ−末端融合物質としてβ−ｇａｌΔαを発現するベクター。ヒトβ−アレスチン−１のコード配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセス番号：ＮＭ００４０４１）は、ｐＩＣＡＳＴＡＬＣベクター中のβ−ｇａｌΔα のフレーム内でクローン化された。
【図１７】ｐＩＣＡＳＴＯＭＣ βＡｒｒ１：β−アレスチン−１へのＣ−末端融合物質としてβ−ｇａｌΔωを発現するベクター。ヒトβ−アレスチン−１のコード配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセス番号：ＮＭ００４０４１）は、ｐＩＣＡＳＴＯＭＣベクター中のβ−ｇａｌΔω のフレーム内でクローン化された。
【図１８】ｐＩＣＡＳＴＡＬＣ β２ＡＲ：β２アドレナリン作動性受容体へのＣ−末端融合物質としてβ−ｇａｌΔαを発現するベクター。ヒトβ２アドレナリン作動性受容体のコード配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセス番号：ＮＭ００００２４）は、ｐＩＣＡＳＴＡＬＣベクター中のβ−ｇａｌΔα のフレーム内でクローン化された。
【図１９】ｐＩＣＡＳＴＯＭＣ β２ＡＲ：β２アドレナリン作動性受容体のＣ−末端融合物質としてβ−ｇａｌΔωを発現するベクターヒトβ２アドレナリン作動性受容体のコード配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセス番号：ＮＭ００００２４）は、ｐＩＣＡＳＴＯＭＣベクター中のβ−ｇａｌΔω へのフレーム内でクローン化された。
【図２０】ｐＩＣＡＳＴＡＬＣＡ２ａＲ：アデノシン２ａ受容体のＣ−末端融合物質としてβ−ｇａｌΔαを発現するベクター。ヒトアデノシン２ａ受容体受容体のコード配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセス番号：ＮＭ０００６７５）は、ｐＩＣＡＳＴＡＬＣベクター中のβ−ｇａｌΔα のフレーム内でクローン化された。
【図２１】ｐＩＣＡＳＴＯＭＣＡ２ａＲ：アデノシン２ａ受容体のＣ−末端融合物質としてβ−ｇａｌΔαを発現するベクター。ヒトアデノシン２ａ受容体のコード配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセス番号：ＮＭ０００６７５）は、ｐＩＣＡＳＴＯＭＣベクター中のβ−ｇａｌΔω のフレーム内でクローン化された。
【図２２】ｐＩＣＡＳＴＡＬＣＤ１：ドーパミンＤ１受容体のＣ−末端融合物質としてβ−ｇａｌΔαを発現するベクター。ヒトドーパミンＤ１受容体のコード配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセス番号：Ｘ５８９８７）は、ｐＩＣＡＳＴＡＬＣベクター中のβ−ｇａｌΔα のフレーム内でクローン化された。
【図２３】本発明方法の概略図。２つの不活性変異体が、相互作用する時に活性になることを示している。

Claims

Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）経路活性に対する、試験条件の影響を評価するための方法であって、
ａ）レポーター酵素の変異体型への融合タンパク質として、また別の酵素変異体型に融合するために相互作用するタンパク質パートナーとして、ＧＰＣＲを発現する細胞を提供し、
ｂ）上記試験条件の下で、上記ＧＰＣＲのリガンドにその細胞を暴露し、および
ｃ）上記レポーター酵素の相補性により上記ＧＰＣＲの活性化をモニターすること含み、ここで細胞中のレポーター酵素活性が、試験条件不在下に比べ増加することは、ＧＰＣＲのタンパク質パートナーとの相互作用が試験条件不在下に比べ増加したことを示し、細胞中のレポーター酵素活性が、試験条件不在下に比べ減少することは、ＧＰＣＲのタンパク質パートナーとの相互作用が試験条件不在下に比べ減少したことを示すものである方法。
試験条件としてキナーゼの細胞が共存する、請求項１項に記載の方法。
試験条件がＧタンパク質細胞の共存下である、請求項１項に記載の方法。
試験条件として、ＧＰＣＲのアゴニストおよびアンタゴニストから選択された化合物に細胞が暴露されている、請求項１項に記載の方法。
試験条件として、第２の受容体細胞で同時発現が起きる、請求項１項に記載の方法。
第２の受容体がＧＰＣＲ受容体である、請求項５項に記載の方法。
ＧＰＣＲのホモ二量化反応が確認される、請求項５項に記載の方法。
ＧＰＣＲのヘテロ二量化反応が確認される、請求項５項に記載の方法。
ａ）ｉ）レポーター酵素の融合タンパク質として少なくとも１つのＧＰＣＲを発現し、そして
ｉｉ）別のレポーター酵素との融合タンパク質として、試験βアレスチンタンパク質から構成される共役体を含む細胞を提供し、
ｂ）少なくとも１つの上記ＧＰＣＲに対するリガンドに、その細胞を暴露し、および
ｃ）補体レポーター酵素の酵素活性を検出すること
を含み、ここで細胞中の酵素活性が増加することは、βアレスチンタンパク質が活性化ＧＰＣＲと結合していることを示すものである、活性化ＧＰＣＲへの結合能力に関する、βアレスチンタンパク質、未同定のアレスチン、アレスチン様タンパク質またはフラグメントおよびそれらの変異体型のスクリーニング方法。
ａ）レポーター酵素の変異体型への融合タンパク質として、また別の酵素変異体型に融合するためのアレスチンタンパク質として、ＧＰＣＲを発現する細胞を提供し、
ｂ）細胞を試験化合物へ暴露し、および
ｃ）上記レポーター酵素の相補性の検出する、
ことを含み、ここで細胞を試験化合物に暴露した後、レポーター酵素活性が増加することは、試験化合物がＧＰＣＲアゴニスト活性を持つことを示すものである、
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のアゴニスト活性に関する、試験化合物のスクリーニング方法。
細胞がその機能が既知であるＧＰＣＲを発現する、請求項１０に記載の方法。
細胞がその機能が未知であるＧＰＣＲを発現する、請求項１０に記載の方法。
細胞が臭気物質または味覚物質としてのＧＰＣＲを発現する、請求項１０に記載の方法。
細胞がβアドレナリン作動性ＧＰＣＲである、ＧＰＣＲを発現する、請求項１０に記載の方法。
細胞が、哺乳類の細胞、無脊椎動物を起源とする細胞、植物細胞および原生動物細胞からなるグループから選択された、請求項１０に記載の方法。
細胞が内因性のＧＰＣＲを発現する、請求項１０に記載の方法。
細胞が形質転換され、そのため、その細胞によって非内因性に発現されたＧＰＣＲを発現する、請求項１０に記載の方法。
ａ）レポーター酵素の変異体型への融合タンパク質として、また別の酵素変異体型に融合するためのアレスチンタンパク質として、ＧＰＣＲを発現する細胞を提供し、
ｂ）細胞を試験化合物に暴露し、
ｃ）上記ＧＰＣＲのアゴニストに細胞を暴露し、および
ｄ）上記レポーター酵素の相補性を検出する、
ことを含み、ここでアゴニストへの暴露は、試験化合物への暴露と同時またはそれ以後に行うが、その際に細胞の試験化合物への暴露後のレポーター酵素の活性が減少する場合、その試験化合物が、上記ＧＰＣＲのアンタゴニストであることを示すものとなる、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のアンタゴニスト活性に関する、試験化合物のスクリーニング方法。。
ａ）細胞、すなわち、レポーター酵素の融合タンパク質として、βアレスチンタンパク質を含有した共役体を含む上記細胞を提供し、
ｂ）その細胞をＧＰＣＲアゴニストへ暴露し、および
ｃ）補体レポーター酵素の酵素活性を検出する、
ことを含み、ここで細胞をＧＰＣＲアゴニストに暴露した後、酵素活性が増加する場合は、上記アゴニストに応答するＧＰＣＲが細胞に含まれていることを示すものである、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）アゴニストに応答するＧＰＣＲの存在について細胞をスクリーニングする方法。
ａ）レポーター酵素の融合タンパク質として、βアレスチンタンパク質から構成される共役体を含有する複数の細胞を提供し、
ｂ）それらの細胞をＧＰＣＲアゴニストに暴露し、および
ｃ）補体レポーター酵素の酵素活性を検出する、
ことを含み、ここでＧＰＣＲに暴露後に酵素活性が増加する場合はβアレスチンタンパク質がＧＰＣＲと結合していること、すなわち、細胞が上記ＧＰＣＲアゴニストに応答するＧＰＣＲを含んでいることを示すものである、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）アゴニストに応答するＧＰＣＲを含む細胞を、複数の細胞からスクリーニングする方法。
複数の細胞が組織中に含まれるものである、請求項２０項に記載の方法。
複数の細胞が器官中に含まれるものである、請求項２０項に記載の方法。
段階（ｂ）に、複数のＧＰＣＲアゴニストまたはリガンドライブラリーへの細胞の暴露が含まれる、請求項２０項に記載の方法。
レポーター酵素のある変異体型への融合タンパク質として、また別の酵素変異体型に融合するためのアレスチンタンパク質として、少なくとも１つのＧＰＣＲを発現する複数細胞がその上に沈着している基質。
レポーター酵素によって開裂する際、比色法、蛍光法、または化学発光法によって測定可能な生成物を放出する酵素的化学基を基質が含んでいる、請求項２４項に記載の基質。
ガラス、プラスチック、セラミック、半導体、シリカ、光ファイバー、ダイヤモンド、生体適合性モノマーおよびポリマー材料から選択された材質から、基質が作られている、請求項２４項に記載の基質。
少なくとも１つのＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を発現し、レポーター酵素の融合タンパク質としてβ−アレスチンタンパク質を含む細胞中において、ＧＰＣＲ経路の活性を検出する方法であって、上記酵素活性は、ＧＰＣＲ経路の活性化を示す方法。
上記酵素活性を検出する前に、基質上へ細胞を置く、請求項２７項に記載の方法。
上記細胞が組織中に含まれている、請求項２７項に記載の方法。
上記細胞が器官中に含まれている、請求項２７項に記載の方法。