JP2004313033A - New carbonyl reductase, gene encoding the same and use thereof - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a new carbonyl reductase useful for producing an alcohol such as 3,4-difluoro-2-((R)-2-hydroxypropyloxy)nitrobenzene as an optically active intermediate for producing an antimicrobial compound. <P>SOLUTION: The new carbonyl reductase is derived from a bacterium of the genus Leifsonia. A DNA encoding the same is also provided. An optically active alcohol such as 3,4-difluoro-2-((R)-2-hydroxypropyloxy)nitrobenzene is produced by asymmetrically reducing a carbonyl group-containing compound using the carbonyl reductase. The carbonyl reductase has excellent activity and stereoselectivity. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

（式中、Ｘａ 及びＸｂ は、同一でも異なっていてもよく、それぞれハロゲン原子である）で表されるフェノキシアセトン誘導体を、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の酵素、あるいは該酵素の産生能を有し且つ形質転換された微生物の菌体、その培養物、それらの処理物並びに抽出物から成る群から選ばれたものの存在下に処理することを特徴とする光学活性な一般式（ＩＩ）：
【化６】

（式中、Ｘａ 及びＸｂ は、上記と同様の意味を有する）で表されるフェノキシプロパン誘導体の製法、または、一般式（ＩＩＩ）：
【化７】

（式中、Ｒ_１ 及びＲ_２ は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子又はアルキル基であり、Ｒ_３ は置換又は非置換のアルキル基又はアリール基である）で表されるアセト酢酸エステル誘導体を、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の酵素、あるいは該酵素の産生能を有し且つ形質転換された微生物の菌体、その培養物、それらの処理物並びに抽出物から成る群から選ばれたものの存在下に処理することを特徴とする光学活性な一般式（ＩＶ）：
【化８】

（式中、Ｒ_１ 、Ｒ_２ 及びＲ_３ は、上記と同様の意味を有する）で表される３−ヒドロキシ酪酸エステル誘導体の製法。
【００１３】
さらに、本発明は、
〔１１〕さらに、付加的に、次の理化学的性質：
（３） 至適ｐＨ： ｐＨ ５．５〜６．０
（４） 至適温度： 約５０℃
（５） 分子量： ゲルろ過分析において約７０，０００、ＳＤＳ ポリアクリルアミド電気泳動分析において約２９，０００
（６） 補酵素： ＮＡＤＰＨ 及びＮＡＤＨの両方を補酵素として利用できる
（７）ｐＨ 安定性： ｐＨ ５．５〜９．０ （２５ ℃、２ ｈｒ）
から成る群から選ばれた性質を有することを特徴とする上記〔１〕記載のカルボニル還元酵素。
【００１４】
〔１２〕 レイフソニア属微生物に由来する酵素又はタンパク質であることを特徴とする上記〔１〕〜〔４〕及び〔１１〕のいずれかに記載の酵素又はタンパク質。
〔１３〕 レイフソニア・ナガノエンシスから得られた酵素又はタンパク質であることを特徴とする上記〔１〕〜〔４〕及び〔１１〕のいずれかに記載の酵素又はタンパク質。
〔１４〕 レイフソニア・ナガノエンシスＪＣＭ １０５９２ から得られた酵素又はタンパク質であることを特徴とする上記〔１〕〜〔４〕及び〔１１〕のいずれかに記載の酵素又はタンパク質。
〔１５〕 補酵素再生系酵素が、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ及び有機酸デヒドロゲナーゼから成る群から選ばれたものであることを特徴とする上記〔７〕記載の組換えプラスミド又はベクター。
〔１６〕 補酵素再生系酵素が、グルコースデヒドロゲナーゼであることを特徴とする上記〔７〕記載の組換えプラスミド又はベクター。
〔１７〕 グルコースデヒドロゲナーゼがバチルス・サブチルス由来のものであることを特徴とする上記〔１６〕記載の組換えプラスミド又はベクター。
【００１５】
〔１８〕 宿主細胞が大腸菌又はレイフソニア属微生物であることを特徴とする上記〔８〕記載の形質転換体。
〔１９〕 上記〔８〕又は〔１８〕記載の形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする上記〔９〕記載のカルボニル還元酵素又はタンパク質の製造法。
〔２０〕 カルボニル基含有化合物を上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の酵素、タンパク質、あるいは該酵素の産生能を有し且つ形質転換された微生物の菌体、その培養物、それらの処理物並びに抽出物から成る群から選ばれたものの存在下に還元して、アルコール化合物を生成せしめることを特徴とする製法。
〔２１〕 微生物が、上記〔８〕又は〔１８〕記載の形質転換体であることを特徴とする上記〔１０〕又は〔２０〕の製法。
〔２２〕 上記〔１０〕記載の製法により光学活性な一般式（ＩＩ）で表されるフェノキシプロパン誘導体（式中、Ｘａ 及びＸｂ は、上記〔１０〕と同様の意味を有する）を製造し、次に得られたフェノキシプロパン誘導体（ＩＩ）を、公知の方法に従って処理し、２，３−ジフルオロ−６−（２，２−ジエトキシカルボニルエテニル）アミノ−（（Ｒ）−２−（メタンスルホニルオキシ）プロピルオキシ）ベンゼンを製造することを特徴とする製造法；
【００１６】
〔２３〕 公知の方法が、特許第２６１２３２７号明細書（又は特開平２−７３２号公報）、特開平１−２５０３６９号公報及び特開平１−２８７０９６号公報から成る群から選ばれたものに開示の方法であることを特徴とする上記〔２２〕記載の製造法；
〔２４〕 上記〔１０〕記載の製法により光学活性な一般式（ＩＩ）で表されるフェノキシプロパン誘導体（式中、Ｘａ 及びＸｂ は、上記〔１０〕と同様の意味を有する）を製造し、得られたフェノキシプロパン誘導体（ＩＩ）を、以下（ａ） 〜（ｄ） の処理を組み合わせて行い：
（ａ） ニトロ基の還元、
（ｂ） メチレンマロネート化反応、
（ｃ） スルホニルオキシ化反応、及び
（ｄ） 保護基の除去
２，３−ジフルオロ−６−（２，２−ジエトキシカルボニルエテニル）アミノ−（（Ｒ）−２−（メタンスルホニルオキシ）プロピルオキシ）ベンゼンを得ることを特徴とする上記〔２２〕又は〔２３〕記載の製造法；
〔２５〕 上記〔１０〕記載の製法により光学活性な一般式（ＩＩ）で表されるフェノキシプロパン誘導体（式中、Ｘａ 及びＸｂ は、上記〔１０〕と同様の意味を有する）を製造し、次に得られたフェノキシプロパン誘導体（ＩＩ）を、公知の方法に従って処理し、Ｓ−（−）−９−フルオロ−３−メチル−１０−（４−メチル−１−ピペラジニル）−７−オキソ−２，３−ジヒドロ−７Ｈ−ピリド［１，２，３，−ｄｅ］［１，４］ベンゾオキサジン−６−カルボン酸（レボフロキサシン）を得ることを特徴とするレボフロキサシンの製造法；
【００１７】
〔２６〕 公知の方法が、特許第２６１２３２７号明細書（又は特開平２−７３２号公報）、特開平１−２５０３６９号公報、特開平１−２８７０９６号公報及び特開平２−２１８６４８号公報から成る群から選ばれたものに開示の方法であることを特徴とする上記〔２５〕記載の製造法；及び
〔２７〕 上記〔１０〕記載の製法により光学活性な一般式（ＩＩ）で表されるフェノキシプロパン誘導体（式中、Ｘａ 及びＸｂ は、上記〔１０〕と同様の意味を有する）を製造し、得られたフェノキシプロパン誘導体（ＩＩ）を、以下（ａ） 〜（ｇ） の処理を組み合わせて行い：
（ａ） ニトロ基の還元、
（ｂ） メチレンマロネート化反応、
（ｃ） スルホニルオキシ化反応、
（ｄ） オキサジン環形成反応、
（ｅ） ピリジン環形成反応
（ｆ） Ｎ−メチルピペリジン導入反応、及び
（ｇ） 保護基の除去及び／又はエステルの加水分解による遊離カルボキシル基形成反応
レボフロキサシンを得ることを特徴とする上記〔２５〕又は〔２６〕記載の製造法。
【００１８】
本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。本明細書に開示した本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び／又は改変（あるいは修飾）をなすことは、以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての特許文献及び参考文献は、説明の目的で引用されているもので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに含めて解釈されるべきものである。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明によるカルボニル還元酵素は、２−アセトニルオキシ−３，４−ジフルオロニトロベンゼンに作用し、３，４−ジフルオロ−２−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピルオキシ）ニトロベンゼンを生成する活性（高度な不斉選択的還元活性）を有することによって特徴付けられる。該酵素は、Ｒ−体の３，４−ジフルオロ−２−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピルオキシ）ニトロベンゼンを選択的に与えることによって特徴付けられる。該酵素は、補酵素として還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を利用しうることによって特徴付けられ、さらに補酵素として還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を利用しうることによっても特徴付けられる。
【００２０】
本発明において、２−アセトニルオキシ−３，４−ジフルオロニトロベンゼンに対する還元活性は、次のようにして確認することができる。
２−アセトニルオキシ−３，４−ジフルオロニトロベンゼン還元活性測定法：
リン酸緩衝液（ｐＨ６．０， １００ｍＭ）、ＮＡＤＰＨ（０．２ｍＭ）、２−アセトニルオキシ−３，４−ジフルオロニトロベンゼン（０．０２ 重量％）及び酵素を含む液（２０〜２００μＬ／ｍＬ） からなる反応混合液を、２５℃でインキュベーションして反応させ、ＮＡＤＰＨ の減少にともなう３４０ ｎｍの吸光度の減少を測定する。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰ^＋に変換するのを触媒する酵素活性を １ ｕｎｉｔ （１Ｕ）と定義する。タンパク質の定量は、市販のタンパク質アッセイキットを使用して行われ、例えば色素結合法により行うことができ、タンパク質自動分析装置を使用しても行うことができる。
また、本発明のカルボニル還元酵素は、ＮＡＤＰＨ よりもＮＡＤＨを与えるときに高い酵素活性を示す。すなわち、電子供与体としてＮＡＤＨに対してＮＡＤＰＨ よりも有意に高い活性を有する。補酵素としていずれの電子供与体が適しているのかについても、上記の条件下で電子供与体のみを代えて比較検討すれば明らかにすることができる。本明細書中、酵素が「安定」とは、ｐＨ６．０で、２５℃、２時間経過したときの残存活性が、処理前の９０％又はそれ以上の活性が残存していることをいう。
【００２１】
上記のような理化学的性状を持つカルボニル還元酵素は、たとえばレイフソニア（Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ）属菌の培養物より精製することができる。レイフソニア属菌としては、レイフソニア・ナガノエンシス（Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ ｎａｇａｎｏｅｎｓｉｓ） が特に本発明によるカルボニル還元酵素の産生能に優れる。本発明のカルボニル還元酵素を得るために利用することができるレイフソニア・ナガノエンシスは、たとえば、ＪＣＭ １０５９２として理化学研究所（ＪＣＭ）より入手することができる。
上記微生物は、ＧＰＹ 培地等の微生物の培養に用いられる一般的な培地で培養される。培養培地は、該菌が増殖し得るものである限り特に限定されないが、例えば、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素等を含有する液体栄養培地などが使用できる。十分に増殖させた後に菌体を回収し（例えば、遠心分離などして回収し）、緩衝液中で破砕等（例えば、ガラスビーズを使用した物理的破砕、超音波処理あるいは酵素などによる生化学的手法）して無細胞抽出液とする。無細胞抽出液から、蛋白質の溶解度による分画（有機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析など）、透析、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィーや、キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどを単独あるいは適宜組み合わせることにより精製する事ができる。例えば、ＤＥＡＥ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ） などを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、ブルー−セファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、Ｍｏｎｏ Ｑ ＨＲ ５／５（ＦＰＬＣシステム、アマシャム・ファルマシアバイオテク） などの高性能液体クロマトグラフィーシステム等を経て電気泳動的にほぼ単一バンドにまで精製することができる。
本発明のカルボニル還元酵素は、それを生産し得る微生物から得ることができ、該微生物は野生株又は変異株のいずれであってもよい。さらに、細胞融合又は遺伝子組換え技術等の遺伝子操作や遺伝学的な手法により誘導される微生物あるいはそれ以外の細胞（例えば、形質転換された細胞を含む）も用いられる。
【００２２】
本発明では、「遺伝子組換え技術」を利用して所定の核酸・ポリヌクレオチドなどを単離・配列決定したり、組換え体を作製したり、所定のタンパク質・ペプチドを得ることができる。本明細書中使用できる遺伝子組換え技術としては、当該分野で知られたものが挙げられ、例えば Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９８９ ＆ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１）； Ｄ． Ｍ． Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ． ｅｄ．， ”ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ”， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｖｏｌ． １ ｔｏ ３， （Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ）， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９５）； ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ” ｓｅｒｉｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、例えば Ｒ． Ｗｕ ｅｄ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． ６８ （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８０）； Ｒ． Ｗｕ ｅｔ ａｌ． ｅｄ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． １００ （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， Ｐａｒｔ Ｂ） ＆ １０１ （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， Ｐａｒｔ Ｃ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８３）； Ｒ． Ｗｕ ｅｔ ａｌ． ｅｄ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． １５３ （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， Ｐａｒｔ Ｄ）， １５４ （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， Ｐａｒｔ Ｅ） ＆ １５５ （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， Ｐａｒｔ Ｆ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８７）； Ｒ． Ｗｕ ｅｄ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． ２１６ （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， Ｐａｒｔ Ｇ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９２）； Ｒ． Ｗｕ ｅｄ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． ２１７ （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， Ｐａｒｔ Ｈ） ＆ ２１８ （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， Ｐａｒｔ Ｉ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９３）； Ｐ． Ｍ． Ｃｏｎｎ ｅｄ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． ３０２ （Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９９）； Ｓ． Ｗｅｉｓｓｍａｎ ｅｄ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． ３０３ （ｃＤＮＡ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９９） などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法あるいはそれらと実質的に同様な方法や改変法が挙げられる（それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる） 。
【００２３】
本明細書で用いる用語「ポリペプチド」としては、以下に記載するような如何なるポリペプチドを指すものであってもよい。ポリペプチドの基本的な構造は周知であり、当該技術分野において非常に数多くの参考書及びその他の刊行物に記載がある。こうしたことに鑑み、本明細書で用いる用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合又は修飾したペプチド結合により互いに結合しているような２個又はそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又は任意のタンパク質を意味する。本明細書で用いる用語「ポリペプチド」としては、当該分野において、例えばペプチド、オリゴペプチドあるいはペプチドオリゴマーとも称せられる短い鎖のもの、及びタンパク質と一般的に言われ、多くの形態のものが知られている長い鎖のものの両方を通常意味してよい。ポリペプチドは、しばしば、通常、天然型アミノ酸（天然に存在しているアミノ酸： あるいは遺伝子でコードされるアミノ酸）と称されるアミノ酸以外のアミノ酸を含有していてもよい。ポリペプチドは、また末端アミノ酸残基を含めて、その多くのアミノ酸残基が翻訳された後にプロセッシング及びその他の改変（あるいは修飾）されるといった天然の工程によるのみならず、当業者に周知の化学的改変技術によっても、上記のポリペプチドはそれが改変（修飾）できることは理解されよう。該ポリペプチドに加えられる改変（修飾）については、多くの形態のものが知られており、それらは当該分野の基礎的な参考書及びさらに詳細な論文並びに多数の研究文献にも詳しく記載されており、これらは当業者に周知である。幾つかのとりわけ常套的な改変・修飾としては、例えばアルキル化、アシル化、エステル化、アミド化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、リン酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、水酸化及びＡＤＰ−リボシル化等が挙げられ、例えばＴ． Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９９３）； Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ （Ｅｄ．）， Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９８３） （Ｗｏｌｄ， Ｆ．， ”Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ”， ｐｐ．１−１２）； Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， ”Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ”， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １８２： ６２６−６４６ （１９９０）； Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．， ”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ”， Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ６６３： ｐ．４８−６２ （１９９２）等の記載を参照できる。修飾の中には、固相化を可能にするための活性基の導入などが含まれてよい。
【００２４】
本明細書中、「相同性」とは、ペプチド配列（あるいはアミノ酸配列）又はヌクレオチド配列（あるいは塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖を構成している各アミノ酸残基同志又は各塩基同志の互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量（数）を意味し、二つのペプチド配列（ポリペプチド配列を含む）又は二つのヌクレオチド配列（ポリヌクレオチド配列を含む）の間の配列相関性の程度を意味するものである。相同性は容易に算出できる。二つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の相同性を測定する方法は数多く知られており、「相同性」（「ホモロジー」又は「同一性」とも言われる）なる用語は、当業者には周知である （例えば、Ｌｅｓｋ， Ａ． Ｍ． （Ｅｄ．）， Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９８８）； Ｓｍｉｔｈ， Ｄ． Ｗ． （Ｅｄ．）， Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９９３）； Ｇｒｉｆｉｎ， Ａ． Ｍ． ＆ Ｇｒｉｆｉｎ， Ｈ． Ｇ． （Ｅｄ．）， Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ： Ｐａｒｔ Ｉ， Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， （１９９４）； ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９８７）； Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． ＆ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ． （Ｅｄ．）， Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｍ−Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９９１） 等） 。二つの配列の相同性を測定するのに用いる一般的な方法には、Ｍａｒｔｉｎ， Ｊ． Ｂｉｓｈｏｐ （Ｅｄ．）， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， （１９９４）； Ｃａｒｉｌｌｏ， Ｈ． ＆ Ｌｉｐｍａｎ， Ｄ．， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．， ４８： １０７３ （１９８８） 等に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。相同性を測定するための好ましい方法としては、試験する二つの配列間の最も大きな適合関係部分を得るように設計したものが挙げられる。このような方法は、コンピュータープログラムとして組み立てられているものが挙げられる。二つの配列間の相同性を測定するための好ましいコンピュータープログラム法としては、ＧＣＧ プログラムパッケージ （Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １２（１）： ３８７ （１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ （Ａｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ．， ２１５： ４０３ （１９９０）） 等が挙げられるが、これらに限定されるものでなく、当該分野で公知の方法を使用することができるし、市販のものを使用できる。相同性検索にはデータベースを利用でき、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ^ＴＭ， ＤＮＡ ＤａｔａＢａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ （ＤＤＢＪ）， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （ＥＭＢＬ）などを対象にできる。本明細書で「高い相同性」といった場合当該対象配列の長さにもよるが、例えば ７０％以上、好ましくは８０％ 以上、より好ましくは９０％ 以上、そして特定の場合には９５％ 以上で、特に好ましくは９７％ 以上であってよい。
【００２５】
本明細書中、「オリゴヌクレオチド」とは、比較的短い一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドで、好ましくはポリデオキシヌクレオチドが挙げられ、Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．， Ｖｏｌ．２８， ｐ．７１６−７３４ （１９８９） に記載されているような既知の方法、例えば、フォスフォトリエステル法、フォスフォジエステル法、フォスファイト法、フォスフォアミダイト法、フォスフォネート法などの方法により化学合成されることができる。通常合成は、修飾された固体支持体上で合成を便利に行うことができることが知られており、例えば、市販されている自動化された合成装置、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３４００ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）， ＡＢＩ ３９００ Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） などを用いて行うことができる。該オリゴヌクレオチドは、一つ又はそれ以上の修飾された塩基を含有していてよく、例えば、イノシンなどの天然においては普通でない塩基あるいはトリチル化された塩基などを含有していてよいし、場合によっては、マーカーの付された塩基を含有していてよい。
【００２６】
本明細書中、「ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）」又は「ＰＣＲ」とは、一般的に、Ｈ． Ａ． Ｅｒｌｉｃｈ ｅｄ．， ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， １９８９などに記載されたような方法を指し、例えば、所望のヌクレオチド配列をインビトロで酵素的に増幅するための方法を指している。一般に、ＰＣＲ 法は、鋳型核酸と優先的にハイブリダイズすることのできる２個のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プライマー伸長合成を行うようなサイクルを繰り返し行うことを含むものである。典型的には、ＰＣＲ 法で用いられるプライマーは、鋳型内部の増幅されるべきヌクレオチド配列に対して相補的なプライマーを使用することができ、例えば、該増幅されるべきヌクレオチド配列とその両端において相補的であるか、あるいは該増幅されるべきヌクレオチド配列に隣接しているものを好ましく使用することができる。プライマーは、好ましくは ５個以上の塩基、さらに好ましくは１０個以上の塩基からなるオリゴヌクレオチド、より好ましくは１８〜２５個の塩基からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＰＣＲ 反応は、当該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことができるが、上記文献の他、例えば Ｒ． Ｓａｉｋｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３０： １３５０， １９８５； Ｒ． Ｓａｉｋｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９： ４８７， １９８８； Ｄ． Ｍ． Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ． ｅｄ．， ”ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ”， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｖｏｌ． １， （Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ）， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９５）； Ｍ． Ａ． Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ． ｅｄ．， ”ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９０））； Ｍ． Ｊ． ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｐ． Ｑｕｉｒｋｅ ａｎｄ Ｇ． Ｒ． Ｔａｙｌｏｒ （Ｅｄ．）， ＰＣＲ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ （１９９１）； Ｍ． Ａ． Ｆｒｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５， ８９９８−９００２ （１９８８） などに記載された方法あるいはそれを修飾したり、改変した方法に従って行うことができる。また、ＰＣＲ 法は、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコルに従って実施することもできる。
【００２７】
ＰＣＲ 反応は、代表的な場合には、例えば鋳型（代表的にはＤＮＡ）と対象核酸に基づいてデザインされたプライマーとを、１０×反応緩衝液 （Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼに添付されている） 、ｄＮＴＰｓ （ デオキシヌクレオシド三リン酸ｄＡＴＰ， ｄＧＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＴＴＰの混合物）、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ及び脱イオン蒸留水と混合する。混合物を、例えば、ＧｅｎｅＡｍｐ^ＴＭ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ２７００ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） などの自動サーマルサイクラーを用いて一般的なＰＣＲ サイクル条件下にそのサイクルを２５〜６０回繰り返すが、増幅のためのサイクル数は適宜目的に応じて適当な回数とすることができる。ＰＣＲ サイクル条件としては、例えば、変性９０〜９５℃ ５〜１００ 秒、アニーリング４０〜６０℃ ５〜１５０ 秒、伸長６５〜７５℃ ３０ 〜３００ 秒のサイクル、好ましくは変性 ９４ ℃ １５ 秒、アニーリング ５８ ℃ １５ 秒、伸長 ７２ ℃ ４５ 秒のサイクルが挙げられるが、アニーリングの反応温度及び時間は適宜実験によって適当な値を選択できるし、変性反応及び伸長反応の時間も、予想されるＰＣＲ 産物の鎖長に応じて適当な値を選択できる。アニーリングの反応温度は、通常プライマーと鋳型ＤＮＡとのハイブリッドのＴｍ値に応じて変えることが好ましい。伸長反応の時間は、通常１０００ｂｐの鎖長当たり１ 分程度がおおよその目安であるが、より短い時間を選択することも場合により可能である。
【００２８】
所定の核酸を同定したりするには、ハイブリダイゼーション技術を利用することができる。該ハイブリダイゼーションは、上記「遺伝子組換え技術」を開示する文献記載の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。例えば、ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡなどの核酸を含有しているサンプルを担体（ナイロンフィルターなどの膜を含めたもの）に転写せしめ、必要に応じ変成処理、固定化処理、洗浄処理などを施した後、その担体（例えば、膜など）に転写せしめられたものを、必要に応じ変成させた標識プローブＤＮＡ断片と、ハイブリダイゼーション用バッファ中で反応させて行われる。
ハイブリダイゼーション処理は、普通約３５℃〜約８０℃、より好適には約５０℃〜約６５℃で、約１５分〜約３６時間、より好適には約１ 時間〜約２４時間行われるが、適宜最適な条件を選択して行うことができる。例えば、ハイブリダイゼーション処理は、約５５℃で約１８時間行われる。ハイブリダイゼーション用バッファとしては、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで用いることができる。転写した担体（例えば、膜など）の変成処理としては、アルカリ変性液を使用する方法が挙げられ、その処理後中和液や緩衝液で処理するのが好ましい。また担体（例えば、膜など）の固定化処理としては、普通約４０℃〜約 １００℃、より好適には約７０℃〜約９０℃で、約１５分〜約２４時間、より好適には約１ 時間〜約４ 時間ベーキングすることにより行われるが、適宜好ましい条件を選択して行うことができる。例えば、フィルターなどの担体を約８０℃で約２ 時間ベーキングすることにより固定化が行われる。転写した担体（例えば、膜など）の洗浄処理としては、当該分野で普通に使用される洗浄液、例えば１Ｍ ＮａＣｌ 、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび ０．１％ Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ （ＳＤＳ） 含有 ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１緩衝液，ｐＨ８．０ などで洗うことにより行うことができる。膜を含めた担体としては、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで用いることができ、例えば、ナイロンフィルターなどを挙げることができる。
【００２９】
上記アルカリ変性液、中和液、緩衝液としては、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで用いることができ、アルカリ変性液としては、例えば、０．５Ｍ ＮａＯＨ および１．５Ｍ ＮａＣｌ を含有する液などを挙げることができ、中和液としては、例えば、１．５Ｍ ＮａＣｌ 含有 ０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ 緩衝液，ｐＨ８．０ などを挙げることができ、緩衝液としては、例えば、 ２×ＳＳＰＥ（０．３６Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４および２ｍＭ ＥＤＴＡ）などを挙げることができる。またハイブリダイゼーション処理に先立ち、非特異的なハイブリダイゼーション反応を防ぐために、必要に応じて転写した担体（例えば、膜など）はプレハイブリダイゼーション処理することが好ましい。このプレハイブリダイゼーション処理は、例えば、プレハイブリダイゼーション溶液［５０％ ｆｏｒｍａｍｉｄｅ， ５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液（０．２ ％ウシ血清アルブミン、０．２％ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）， ５×ＳＳＰＥ， ０．１％ ＳＤＳ， １００μｇ／ｍＬ熱変性サケ精子ＤＮＡ］などに浸し、約３５℃〜約５０℃、好ましくは約４２℃で、約 ４〜約２４時間、好ましくは約 ６〜約８ 時間反応させることにより行うことができるが、こうした条件は当業者であれば適宜実験を繰り返し、より好ましい条件を決めることができる。ハイブリダイゼーションに用いる標識プローブＤＮＡ断片の変成は、例えば、約７０℃〜約１００ ℃、好ましくは約１００ ℃で、約１ 分間〜約６０分間、好ましくは約 ５分間加熱するなどして行うことができる。なお、ハイブリダイゼーションは、それ自体公知の方法あるいはそれに準じた方法で行うことができるが、本明細書でストリンジェントな条件とは、例えばナトリウム濃度に関し、約１５〜約５０ｍＭ、好ましくは約１９〜約４０ｍＭ、より好ましくは約１９〜約２０ｍＭで、温度については約３５〜約８５℃、好ましくは約５０〜約７０℃、より好ましくは約６０〜約６５℃の条件を示す。
【００３０】
ハイブリダイゼーション完了後、フィルターなどの担体を十分に洗浄処理し、特異的なハイブリダイゼーション反応をした標識プローブＤＮＡ断片以外の標識プローブを取り除くなどしてから検出処理をすることができる。フィルターなどの担体の洗浄処理は、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで用いて行うことができ、例えば、０．１％ ＳＤＳ含有 ０．５×ＳＳＣ （Ｏ．１５Ｍ ＮａＣｌ， １５ｍＭ クエン酸）溶液などで洗うことにより実施できる。
ハイブリダイズした核酸は、代表的にはオートラジオグラフィーにより検出することができるが、当該分野では各種の技術手法が知られており、そうした方法の中から適宜選択して検出に用いることもできる。検出したシグナルに相当する核酸バンドを、適切な緩衝液、例えば、ＳＭ溶液（１００ｍＭ ＮａＣｌ および１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４含有５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ 緩衝液、ｐＨ７．５）などに懸濁し、ついでこの懸濁液を適度に希釈して、所定の核酸を単離・精製、そしてさらなる増幅処理にかけることができる。所定の核酸を保有するサンプル（例えば、ファージ粒子、組換えプラスミド又はベクターなど）は、当該分野で普通に使用される方法でそれを精製分離することができ、例えば、グリセロールグラジエント超遠心分離法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ｅｄ． Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ２ｎｄ ｅｄ． ７８， １９８９）などにより精製することができる。ファージ粒子などからは、当該分野で普通に使用される方法でＤＮＡを精製分離することができ、例えば、得られたファージなどをＴＭ溶液（１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４含有５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ 緩衝液、ｐＨ７．８ ）などに懸濁し、ＤＮａｓｅ Ｉ およびＲＮａｓｅ Ａ などで処理後、２０ｍＭ ＥＤＴＡ 、５０μｇ／ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ 及び０．５ ％ＳＤＳ 混合液などを加え、約６５℃、約１ 時間保温した後、これをフェノール抽出ジエチルエーテル抽出後、エタノール沈殿によりＤＮＡを沈殿させ、次に得られたＤＮＡを７０％エタノールで洗浄後乾燥し、ＴＥ溶液（１０ｍＭ ＥＤＴＡ 含有１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１ 緩衝液、ｐＨ８．０）に溶解するなどして得られる。また、目的としているＤＮＡは、サブクローニングなどにより大量に得ることも可能であり、例えばサブクローニングは、宿主として大腸菌を用いプラスミドベクターなどを用いて行うことができる。こうしたサブクローニングにより得られたＤＮＡも、上記と同様にして遠心分離、フェノール抽出、エタノール沈殿などの方法により精製分離できる。
【００３１】
本明細書において、核酸は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、合成ＤＮＡなどの核酸であり、またゲノムＤＮＡ、ゲノミックＤＮＡライブラリー、細胞由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡのいずれであってもよい。核酸の塩基配列は、修飾（例えば、付加、除去、置換など）されることもでき、そうした修飾されたものも包含されてよい。核酸は、本発明で記載するペプチドあるいはその一部をコードするものであってよく、好ましいものとしてはＤＮＡが挙げられる。また核酸は、対象ポリペプチド（タンパク質）、あるいはそれらの部分配列と実質的に同等な抗原性などのそれと実質的に同等な生物学的活性を有するペプチド（それと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するものを含むし、それと高い相同性を有するものも含まれてよい）をコードするといったそれと同効の塩基配列を含有するものであれば如何なるものであってもよい。該「同効の塩基配列」とは、例えばストリンジェントな条件で問題の配列を有するものにハイブリダイズするものであってよく、例えば当該塩基配列のうちの連続した５個以上の塩基配列、好ましくは１０個以上の塩基配列、より好ましくは１５個以上の塩基配列、さらに好ましくは２０個以上の塩基配列とハイブリダイズし、当該ポリペプチドと実質的に同等のアミノ酸配列をコードするものなどが挙げられる。核酸は、化学合成によって得ることも可能である。その場合断片を化学合成し、それらを酵素により結合することによってもよい。
【００３２】
本発明のカルボニル還元酵素をコードするＤＮＡは、例えば、以下のような方法によって単離することができる。
本発明の酵素を精製後、Ｎ末端アミノ酸配列を解析する。該酵素のアミノ酸配列解析では、精製酵素を必要に応じて、リジルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼなどの酵素により切断後、逆相液体クロマトグラフィーなどによりペプチド断片を精製後、プロテインシーケンサーによりアミノ酸配列を解析する。配列解析では、複数のペプチド断片を利用してそのアミノ酸配列を決めることができる。決定したアミノ酸配列を元にＰＣＲ用のプライマーを設計し、酵素生産株の染色体ＤＮＡもしくは、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、アミノ酸配列から設計したＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより本発明のＤＮＡの一部を得ることができる。さらに、得られたＤＮＡ断片をプローブとして、酵素生産株の染色体ＤＮＡの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを利用して、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどにより、本発明のＤＮＡを得ることができる。
【００３３】
また、ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、得られた配列から、既知のＤＮＡの外側に伸長させるためのＰＣＲプライマーを設計し、酵素生産株の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、自己環化反応によりＤＮＡを鋳型としてインバースＰＣＲを行うことにより（Ｏｃｈｍａｎ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １２０： ６２１−６２３ （１９８８）； Ｉｎｎｉｓ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （Ｅｄ．）， ＰＣＲ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＆ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９））、また、ＲＡＣＥ法（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ， Ｆｒｏｈｍａｎ， Ｍ．Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５： ８９９８ （１９８８）； Ｉｎｎｉｓ， Ｍ．Ａ． ｅｔ ａｌ． （Ｅｄ．）， ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐｐ２８−３８， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９０）， 駒野徹編、生物化学実験法４７ ＰＣＲ実験マニュアル、学会出版センター（ＪＳＳＰ）） などにより本発明のＤＮＡを得ることも可能である。なお、本発明のＤＮＡは、以上のような方法によってクローニングされたゲノムＤＮＡ、あるいはｃＤＮＡの他、合成によって得ることもできる。
このようにして単離された、本発明によるカルボニル還元酵素をコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに挿入することにより、カルボニル還元酵素発現ベクターが提供される。また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、本発明のカルボニル還元酵素を組み換え体から得ることができる。
【００３４】
本発明にしたがっての標的カルボニル還元酵素をコードするＤＮＡの単離について、以下説明する。本発明のカルボニル還元酵素をコードするＤＮＡは、標的カルボニル還元酵素を産生する微生物、例えばレイフソニア・ナガノエンシス ＪＣＭ １０５９２ 株菌の染色体ＤＮＡからライブラリーを構築し、このライブラリーをスクリーニングすることにより単離取得することができる。
ライブラリー構築に用いるドナーＤＮＡは、当該微生物細胞を培養して得られた培養物を遠心分離して細胞ペレットを得、次に緩衝液（例えばリン酸緩衝生理食塩水 （ＰＢＳ））に懸濁してから遠心分離するという処理を加えて洗浄し、次にこうして得られた細胞ペレットをＴＥ緩衝液〔１０ ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）， ｐＨ ７．５， １ ｍＭ エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）〕に懸濁し、必要に応じリゾチームなどで処理し、ＤＮＡ抽出緩衝液〔例えば、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．０）， ０．１ Ｍ ＥＤＴＡ， ０．５％ ＳＤＳ〕に添加した後、必要に応じＲＮａｓｅ などで処理し、プロティナーゼＫ で処理し、次に抽出分離精製処理して得られる〔例えば、ＤＮＡ含有処理液にフェノールを加えて、液を混合し、次いでクロロホルム／イソアミルアルコール（例えば、２４：１）を加えて混合し、遠心分離し、ＤＮＡを含有する水層（上層） を採取するなどし、次に抽出されたＤＮＡを含有する水層を、例えば酢酸アンモニウムやイソプロパノールを使用して処理し、含まれるＤＮＡを沈殿化せしめ、必要に応じ遠心分離機を用いて、ＤＮＡを沈殿として得る。沈殿として得られたＤＮＡは、例えば７０％ のエタノールで洗浄された後、ＴＥ緩衝液に溶解される。必要に応じて密度勾配超遠心法、ゲル電気泳動法などを用いて精製される〕。得られた染色体ＤＮＡは、適宜適当な制限酵素を用いて部分分解してライブラリー構築に適した断片（例えば、約２０ ｋｂｐ程度までの大きさ） にし、必要に応じて密度勾配超遠心法、ゲル電気泳動法などを用いて分離される。
【００３５】
ＤＮＡライブラリーは、ファージベクター、プラスミドベクターを使用するなどして構築できる。例えばλファージ由来ベクター、Ｐ１ファージベクター、コスミドファージベクターなどを好ましく使用できる。好ましくは市販された試薬、あるいは調製済のベクターＤＮＡ（例えば、酵素切断され、脱リン酸化されたものなど）、パッケージングエキストラクト、宿主菌株、さらには最初から最後までのステップをすべて行えるキットなどを用いて行うことができる。具体的には、ＤＮＡライブラリーは、例えば、ｐＬＡＦＲ３， λｇｔ１０， λＺＡＰ ＩＩ， λＦＩＸ ＩＩ， λＤＡＳＨ， ｐＵＣ１８ などのｐＵＣ系ベクター， ｐＢＲ３２２などのｐＢＲ系ベクターなどに構築することができ、それを大腸菌Ｃ６００ｈｆｌ， ＤＨ１０Ｂ， ＤＨ５α， ＳＴＢＬ４， ＤＨ１２Ｓ， ＨＢ１０１， ＭＣ１０６１， ＪＭ１０９， ＳＴＢＬ２， ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ， ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ（Ｐ２）， ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ などの宿主大腸菌に感染させ、プラークを形成させるなどして得ることができる。
またファージベクターを使用する以外で、大腸菌などの宿主細胞の形質転換をするには、例えばカルシウム法、ルビジウム／カルシウム法、カルシウム／マンガン法、ＴＦＢ 高効率法、ＦＳＢ 凍結コンピテント細胞法、迅速コロニー法、エレクトロポレーションなど当該分野で知られた方法あるいはそれと実質的に同様な方法で行うことができる（Ｄ． Ｈａｎａｈａｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １６６： ５５７ （１９８３）など）。
【００３６】
単離精製された酵素のアミノ酸配列解析に基づいて合成された核酸断片をプローブとして、構築されたゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、前記菌株由来のカルボニル還元酵素遺伝子をコードするクローンを取得する。
また、本発明の酵素遺伝子であるＤＮＡは、それが一旦単離取得されたならば、慣用方法に従ってそのＤＮＡ中の塩基配列の大部分あるいは一部分を利用して、それをプローブとして用いて、他の生物を検索して、その生物の保有する遺伝子のうちに、高度な不斉選択的還元活性に関与する遺伝情報を担うものを見つけ出し、次にそのようにして同定された遺伝子を遺伝子組換え技術の手法を応用して切り出して、それを大量に得、それを本微生物に由来するものと同様に用いることは、当業者であれば容易に理解し得るところのものである。なお、プローブなどを放射性同位体などによって標識するには、市販の標識キット、例えばランダムプライムドＤＮＡラベリングキット （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）などを使用してプローブ用ＤＮＡを ［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰ （Ａｍｅｒｓｈａｍ）などを用いて標識し、放射活性を持つプローブを得ることにより行うことが出来る。また、該標識は、当該分野で知られた方法で行うことができ、例えばジゴキシゲニン、蛍光色素、ビオチン− アビジン系などによって行うこともできる。
本発明のカルボニル還元酵素の同族体の遺伝情報を担うＤＮＡ源としては、上記したような手法の適用できるグラム陰性あるいはグラム陽性細菌であって、高度な不斉選択的還元活性を持つカルボニル還元酵素をコードする遺伝子を有するものがあげられる。この他にも、独特の酵素遺伝子を有するものであれば、下等生物、高等生物の区別なく利用することが可能である。
【００３７】
該取得されたＤＮＡの塩基配列の決定は、代表的には次のように行うことができる。単離取得された所定の遺伝子をコードするＤＮＡ領域を含む部分は、これを当業者によく知られたベクターに結合し、大腸菌などの宿主細胞を用い、得られた組換え体コロニーをハイブリダイゼーションの手法など、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、ハイブリダイゼーション・トランスレーションアッセイ法、プラス・マイナス法などによって同定して、当該染色体由来のカルボニル還元酵素遺伝子をコードするＤＮＡを大量に調製できる。ハイブリダイゼーションは、上記したようにして実施できる。
目的の遺伝子を保持するクローンの選択には、当該カルボニル還元酵素遺伝子の産物である酵素活性をアッセイすることを利用してもよい。
こうして得られたＤＮＡは、ＤＮＡの塩基配列を決定するのに適した程度まで断片化され、次に当該分野でよく知られた方法により処理されて、その塩基配列を決定することができる。ＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列の決定法としては、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ 法、ジデオキシ法、例えばジデオキシ・チェイン・ターミネーション法 （Ｓａｎｇｅｒ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２１４， １２０５ （１９８１））、Ｍ１３ ジデオキシ法等が挙げられる。ジデオキシ法に用いられるポリメラーゼとしては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ Ｉのクレノー・フラグメント、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、修飾 Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。また、市販のシークエンシングキットや、自動塩基配列決定装置を利用できる。所定のＤＮＡの塩基配列、例えば１本鎖ＤＮＡの塩基配列は、シークエンシングすることができ、例えば、ＢｉｇＤｙｅ^ＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖ３．０ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などを含めたＴａｑダイプライマーサイクルシークエンシングキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などを使用し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） などを含めた蛍光ＤＮＡシーケンサーなどにより、その配列を決定することができる。
【００３８】
このような方法の内には、適当な制限酵素を作用させ、制限酵素地図を作製した上で、必要な断片をサブクローン化する方法や、ショットガン・クローニング法、ＰＣＲ により遺伝子を増幅する方法、核酸分解酵素によりディリーションする方法などの様々な手法が含まれていることはもちろんである。次に、こうしてＤＮＡ塩基配列の決定されたＤＮＡのうちから所定のポリペプチドをコードしているＤＮＡ領域を決定する。決定したＤＮＡ塩基配列の中でオープン・リーディング・フレームを検索する。その中で標的酵素をコードすると思われるＤＮＡ領域を制限酵素で切り出し、再度これを用いて発現ベクターを構築し、それを適当な宿主中で発現させ、こうして得られた発現物中の活性を所定の活性測定系にかけて検討し、最終的に確認されることもできる。
次にこうして得られた所定のポリペプチドをコードするＤＮＡ部分を再度当業者によく知られたベクターに結合し大腸菌などの宿主細胞に導入し、得られた組換え体を所定の酵素活性測定系にかけ、得られたクローンを検定して、標的酵素活性を有する形質転換体をうる。次にこの形質転換体から標的酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を含む部分を制限酵素を用いて切りだすことが可能である。また該解析された新規な酵素遺伝子の有しているＤＮＡ配列を基にセンスプライマーとアンチセンスプライマーを合成することができる。オリゴヌクレオチドプライマーの作製は、上記したように当該分野で知られた方法で行うことができる。
【００３９】
該形質転換体からの組換え体ＤＮＡおよび目的の酵素遺伝子を持つＤＮＡ断片の調製は通常の方法を用いて行うことができる。例えば、培地中で増殖させた該形質転換体を収穫し、細胞壁をリゾチーム処理等の細胞破壊法として知られた方法により壊し、次に核酸画分を分離した後、密度勾配遠心などの方法により所望の画分に分ける。こうして得られたプラスミドを含有する画分は、次に適当な制限酵素で処理することにより、適度な断片にすることができると共にまた選択的に所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片とすることができる。得られた断片は、例えばゲル電気泳動などにより、所望のものに分離でき、適当なサイズのＤＮＡ断片を含むゲルは、例えばフェノール抽出−エタノール沈殿などによりＤＮＡ抽出処理される。抽出されたＤＮＡは必要に応じ適当な制限酵素で切断し、さらに必要に応じ精製処理したり、また必要に応じ５’末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼなどによりリン酸化した後、ｐＵＣ１８などのｐＵＣ系ベクターといった適当なプラスミドベクターにライゲーションし、適当なコンピテント細胞を形質転換する。クローニングされたＤＮＡ断片はその塩基配列を解析される。
上記のようにして構造解析されたＤＮＡから、所定の遺伝子をコードするＤＮＡ以外の領域を除くには、様々な方法で不必要な領域を欠失させることによってなすことができる。このような方法としては、ＢＡＬ３１ ヌクレアーゼやエキソヌクレアーゼＩＩＩ による欠失法、制限酵素切断サイトを利用した組換え法などがあげられる。この際、本発明に従えば遺伝子の固有のプロモーターを他のものに変更したり、部位特異的変異を導入してプロモーターの強度を変化させることが、現在の遺伝子操作技術を用いることにより、容易に行いうる。従って、そのように一部を変更したＤＮＡ断片であっても、所定の酵素活性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片であれば、全て本発明に含まれることは明白である。また、本発明の酵素活性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片としては、構造遺伝子をコードするＤＮＡに加えて、その遺伝子を生体内で発現させるのに重要な役割を担う制御領域、例えば、遺伝子の転写プロモーター、リボソーム結合部位、転写のターミネーターなどをコードするＤＮＡをも含んだものがあげられる。
【００４０】
本発明に従えば、一旦標的酵素活性に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列が明らかにされることにより、その塩基の置換、付加あるいは欠失を当該分野においてよく知られた方法を適用して容易に行なうことができる。
例えば、相当するアミノ酸をコードする遺伝暗号の縮重を利用したもの、生物の遺伝暗号の利用率を考慮した変換あるいは立体選択的還元反応の機能に悪影響を及ぼさないようなアミノ酸配列の変換のための塩基の置換、付加または欠失処理などがあげられる。更にまた、このような改変のうちには、立体選択的還元反応に関与する酵素の活性中心のみを保存し、その他の部分を大幅に変化させるようにそのＤＮＡの配列及び長さを変えることも含まれる。従って、本発明の遺伝子をコードするＤＮＡとしては、以上のような改変を施したものすべてが含まれることは当業者であれば容易に理解し得るところのものである。
以上のような事情に鑑み、本発明のカルボニル還元酵素タンパク質をコードする遺伝子は、本発明の思想を実質的に利用して得られ、本発明の該遺伝子と実質的に同一の機能（あるいは活性）を有するものすべてを含有するものである。
【００４１】
本発明は、カルボニル還元酵素をコードするＤＮＡおよびその同族体に関する。本発明のカルボニル還元酵素をコードするＤＮＡは、たとえば配列番号：２に示す塩基配列を含む。配列番号：２に示す塩基配列は、配列番号：３に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしており、このアミノ酸配列を含むタンパク質は、本発明によるカルボニル還元酵素の好ましい態様を構成する。本発明のカルボニル還元酵素をコードするＤＮＡ同族体とは、配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、前記性質（１）及び／又は（２）を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む。当業者であれば、配列番号：２記載のＤＮＡに、下記するＰＣＲ や部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， １０： ｐｐ．６４８７ （１９８２）； Ｒ． Ｗｕ， Ｌ． Ｇｒｏｓｓｍａｎ， ｅｄ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． １００， ｐｐ．４４８， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８３）； Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９）； Ｍ． Ｊ． ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｐ． Ｑｕｉｒｋｅ ａｎｄ Ｇ． Ｒ． Ｔａｙｌｏｒ （Ｅｄ．）， ＰＣＲ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ， ｐｐ．２００， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ （１９９１） などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することによりＤＮＡ同族体を得ることが可能である。
また、本発明のＤＮＡ同族体は、配列番号：２に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズできるＤＮＡであって、かつ、前記性質（１）及び／又は（２）を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含む。ハイブリダイズできるＤＮＡとは、配列番号：２に記載中の任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０、６０または１００ 個の連続した配列を一つまたは複数選択し、その選択したＤＮＡをプローブＤＮＡとし、たとえばＥＣＬ ｄｉｒｅｃｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｉｃａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、マニュアルに記載の条件（ｗａｓｈ：４２℃、０．５ｘ ＳＳＣを含むｐｒｉｍａｒｙ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ）において、ハイブリダイズするＤＮＡを指してよい。さらに、本発明のＤＮＡ同族体は、配列番号：３に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％または９０％、より好ましくは９５％以上の相同性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む。
【００４２】
本明細書中、「カルボニル還元酵素遺伝子」とは、２−アセトニルオキシ−３，４−ジフルオロニトロベンゼンに作用し、３，４−ジフルオロ−２−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピルオキシ）ニトロベンゼンを生成するといった高い不斉選択性の還元活性を有するレイフソニア属微生物（例えば、レイフソニア・ナガノエンシス、特にはレイフソニア・ナガノエンシス ＪＣＭ １０５９２株）が保有するカルボニル還元酵素活性に関与する遺伝子を意味してよい。本明細書中、「カルボニル還元酵素」とは、代表的には２−アセトニルオキシ−３，４−ジフルオロニトロベンゼンのカルボニル基を特異的な立体選択性でもって還元して、３，４−ジフルオロ−２−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピルオキシ）ニトロベンゼンを与える微生物が保有するカルボニル基還元活性を担う酵素タンパク質の全てあるいはその一部を意味してよい。該遺伝子は、核酸からなるもので、通常ゲノム上では、ＤＮＡであるが、本明細書中で説明するいかなる形態のものであってよい。
該カルボニル還元酵素遺伝子は、代表的には配列表の配列番号：２のＤＮＡのＯＲＦ に対応する塩基配列、配列番号：３のアミノ酸配列をコードする塩基配列、又はその一部のフラグメントを包含する。
本発明は、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を有し、かつ、前記性質（１）及び／又は（２）を有するカルボニル還元酵素、及びその同族体を含む。配列番号：３に示すアミノ酸配列を含むタンパク質は、本発明によるカルボニル還元酵素の好ましい態様を構成する。本発明のタンパク質は、代表的には配列番号： ３ のアミノ酸配列あるいはそれと実質的に同等なアミノ酸配列により表されるタンパク質、配列番号： ３ のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列により表されるタンパク質、好ましくは２−アセトニルオキシ−３，４−ジフルオロニトロベンゼンのカルボニル基を特異的な立体選択性でもって還元して、３，４−ジフルオロ−２−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピルオキシ）ニトロベンゼンを生成する活性を担う酵素活性に関与するタンパク質、さらにはその一部のフラグメントが挙げられる。本発明のカルボニル還元酵素の同族体とは、配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含む。また、該カルボニル還元酵素の同族体とは、配列番号：３に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％または９０％、より好ましくは９５％以上のホモロジーを有するタンパク質であってよい。
【００４３】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子（それに関連する核酸又はオリゴヌクレオチドを含む）としては、代表的には配列番号：３のアミノ酸配列により表されるタンパク質をコードする核酸、配列番号：３のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列により表されるタンパク質をコードする核酸、さらにはその一部のフラグメント、配列番号：２の塩基配列から選択された且つ連続した塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、例えば、５ 個以上の連続した塩基、さらには１０個以上の連続した塩基からなるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、さらには好ましくは１５個以上の塩基からなるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、より好ましくは１８〜１００ 個の塩基からなるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、代表的には２０〜３０個の塩基からなるオリゴヌクレオチドあるいは３０〜５５個の塩基からなるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドなどが挙げられる。該塩基配列と相同性を有するが、上記カルボニル還元活性能に関し実質的に同等なタンパク質をコードしているといったそれと同効の塩基配列を含有するＤＮＡ配列でコードされるものであることができるし、さらにそれらと相補的なヌクレオチドなどであってよい。
本発明では、２−アセトニルオキシ−３，４−ジフルオロニトロベンゼンのカルボニル基を特異的な立体選択性でもって還元して、３，４−ジフルオロ−２−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピルオキシ）ニトロベンゼンを生成する活性を持つ酵素タンパク質、あるいはそれと実質的に同等な機能（あるいは活性）を有するタンパク質またはその塩、そのタンパク質の特徴的な部分ペプチドまたはその塩、それらをコードする遺伝子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡなど、その遺伝子を遺伝子組換え技術で操作することが可能なように含有しているベクターあるいはプラスミド、こうしたベクターなどで形質転換された宿主細胞、さらにはその宿主細胞を培養して該タンパク質またはその塩を製造する方法、こうして得られた該タンパク質またはその塩やそのタンパク質の特徴的な部分ペプチドまたはその塩を用いて得られた抗体、特にはモノクローナル抗体、その抗体を産生するハイブリドーマ細胞、該単離された遺伝子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡなどをプローブとして用いたり、該配列情報に基づいてデザインされたオリゴヌクレオチドを使用する核酸増幅技術などあるいは該抗体やオリゴヌクレオチドを用いた測定手段並びに試薬、そして組換え酵素などの組換えタンパク質や、形質転換された宿主細胞、固定化酵素あるいは固定化菌体を使用した不斉還元法などが提供される。
【００４４】
本発明に係わる遺伝子の塩基配列を基に遺伝子工学的に常用される方法を用いることにより、所定のポリペプチドのアミノ酸配列中に適宜、１個ないし複数個以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入、転移あるいは付加したごとき変異を導入した相当するポリペプチドを製造することができる。こうした変異・変換・修飾法としては、例えば日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法 ＩＩ 」、ｐ１０５（広瀬進）、東京化学同人（１９８６）； 日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 ＩＩＩ（組換えＤＮＡ技術）」、ｐ２３３（広瀬進）、東京化学同人（１９９２）； Ｒ． Ｗｕ， Ｌ． Ｇｒｏｓｓｍａｎ， ｅｄ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． １５４， ｐ． ３５０ ＆ ｐ． ３６７， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８７）； Ｒ． Ｗｕ， Ｌ． Ｇｒｏｓｓｍａｎ， ｅｄ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． １００， ｐ． ４５７ ＆ ｐ． ４６８， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８３）； Ｊ． Ａ． Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ３４： ３１５， １９８５； Ｔ． Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｅｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３： ３３０５， １９８５； Ｊ． Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３： ８７６５， １９８５； Ｒ． Ｗｕ ｅｄ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． １５５， ｐ． ５６８， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８７）； Ａ． Ｒ． Ｏｌｉｐｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ４４： １７７， １９８６などに記載の方法が挙げられる。例えば、ＰＣＲ 、合成オリゴヌクレオチドなどを利用する位置指定変異導入法（部位特異的変異導入法） （Ｚｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １０： ６４８７， １９８７； Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３： ４３３１， １９８６）， カセット変異導入法 （ｃａｓｓｅｔｔｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ： Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ３４： ３１５， １９８５）， 制限部位選択変異導入法 （ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ： Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈｉｌｏｓ． Ｔｒａｎｓ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄｏｎ Ｓｅｒ Ａ， ３１７： ４１５， １９８６），アラニン・スキャンニング法 （Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＆ Ｗｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４： １０８１−１０８５， １９８９）， ＰＣＲ変異導入法， Ｋｕｎｋｅｌ法， ｄＮＴＰ［αＳ］法（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ），亜硫酸や亜硝酸などを用いる領域指定変異導入法等の方法が挙げられる。
【００４５】
また、遺伝子組換え法で製造する時に融合ポリペプチド（融合タンパク質）として発現させ、生体内あるいは生体外で、所望のポリペプチドと実質的に同等の生物学的活性を有しているものに変換・加工してもよい。遺伝子工学的に常用される融合産生法を用いることができるが、こうした融合ポリペプチドはその融合部を利用してアフィニティクロマトグラフィーなどで精製することも可能である。こうした融合ポリペプチドとしては、ヒスチジンタグに融合せしめられたもの、あるいは、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ） 、マルトース結合タンパク （ＭＢＰ），グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ （ＧＳＴ）、チオレドキシン （ＴＲＸ）又は Ｃｒｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅのアミノ酸配列に融合せしめられたものなどが挙げられる。同様に、ポリペプチドは、ヘテロジーニアスなエピトープのタグを付加され、該エピトープに特異的に結合する抗体を用いてのイムノアフィニティ・クロマトグラフィーによる精製をなし得るようにすることもできる。より適した実施態様においては、ポリヒスチジン（ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ）又はポリヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ）タグ、また該エピトープタグとしては、例えば ＡＵ５， ｃ−Ｍｙｃ， ＣｒｕｚＴａｇ ０９， ＣｒｕｚＴａｇ ２２， ＣｒｕｚＴａｇ ４１， Ｇｌｕ−Ｇｌｕ， ＨＡ， Ｈａ．１１， ＫＴ３， ＦＬＡＧ （ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ ｔｒａｄｅｍａｒｋ， Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）， Ｏｍｎｉ−ｐｒｏｂｅ， Ｓ−ｐｒｏｂｅ， Ｔ７， Ｌｅｘ Ａ， Ｖ５， ＶＰ１６， ＧＡＬ４， ＶＳＶ−Ｇ などが挙げられる （Ｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ８： ｐｐ．２１５９−２１６５ （１９８８）； Ｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５： ｐｐ．３６１０−３６１６ （１９８５）； Ｐａｂｏｒｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ３（６）： ｐｐ．５４７−５５３ （１９９０）； Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６： ｐｐ．１２０４−１２１０ （１９８８）； Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５５： ｐｐ．１９２−１９４ （１９９２）； Ｓｋｉｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６６： ｐｐ．１５１６３−１５１６６ （１９９１）； Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７： ｐｐ．６３９３−６３９７ （１９９０） など） 。
【００４６】
さらに融合ポリペプチドとしては、検出可能なタンパク質となるようなマーカーを付されたものであることもできる。より好適な実施態様においては、該検出可能なマーカーは、ビオチン／ストレプトアビジン系のＢｉｏｔｉｎ Ａｖｉ Ｔａｇ、螢光を発する物質などであってよい。該螢光を発する物質としては、オワンクラゲ （Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｅａ）などの発光クラゲ由来の緑色螢光タンパク質（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ： ＧＦＰ）、それを改変した変異体（ＧＦＰバリアント） 、例えば、ＥＧＦＰ （Ｅｎｈａｎｃｅｄ−ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＧＦＰ）， ｒｓＧＦＰ （ｒｅｄ−ｓｈｉｆｔ ＧＦＰ）， 黄色螢光タンパク質 （ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ： ＹＦＰ）， 緑色螢光タンパク質 （ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ： ＧＦＰ），藍色螢光タンパク質 （ｃｙａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ： ＣＦＰ）， 青色螢光タンパク質 （ｂｌｕｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ： ＢＦＰ）， ウミシイタケ （Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ） 由来のＧＦＰ などが挙げられる（宮脇敦史編、実験医学別冊ポストゲノム時代の実験講座３−ＧＦＰ とバイオイメージング、羊土社 （２０００年））。また、上記融合タグを特異的に認識する抗体（モノクローナル抗体及びそのフラグメントを含む）を使用して検出を行うこともできる。こうした融合ポリペプチドの発現及び精製は、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコルに従って実施することもできる。本発明の所定のペプチドは、天然に存在する形態に加えて、そのペプチドの機能と同等、又はより強力な、又はよりプラスの機能を有するペプチド類縁体のような他のポリペプチドも含む。
【００４７】
本発明のカルボニル還元酵素同族体のタンパク質は、１個以上のアミノ酸残基が同一性の点で天然のものと異なるもの、１個以上のアミノ酸残基の位置が天然のものと異なるものであってもよい。本発明のレイフソニア・ナガノエンシス ＪＣＭ １０５９２株菌由来のタンパク質は、当該タンパク質に特有なアミノ酸残基が１個以上（例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、特には１〜１０個など）欠けている欠失類縁体、特有のアミノ酸残基の１個以上（例えば、１〜４０個、好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特には１〜２個など）が他の残基で置換されている置換類縁体、１個以上（例えば、１〜４０個、好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特には１〜２個など）のアミノ酸残基が付加されている付加類縁体も包含する。該カルボニル還元酵素タンパク質の内に見出される共通の特徴であるドメイン構造が維持されていれば、上記のごとき変異体は、全て本発明に包含される。また本発明のタンパク質は天然の当該酵素と実質的に同等の一次構造コンフォメーションあるいはその一部を有しているものも含まれてよいと考えられ、さらに天然のレイフソニア・ナガノエンシス ＪＣＭ １０５９２株菌由来の所定のタンパク質と実質的に同等の生物学的活性を有しているものも含まれてよいと考えられる。さらに天然に生ずる変異体の一つであることもできる。本発明の菌由来のタンパク質は、例えば、配列表の配列番号：３で示されるアミノ酸配列に対し、７０％ より高い相同性を有しているものが挙げられ、より好ましくは８０％ 以上、特に好ましくは９０％ 以上の相同アミノ酸配列を有するものが挙げられる。
【００４８】
アミノ酸の置換、欠失、あるいは挿入は、しばしばポリペプチドの生理的な特性や化学的な特性に大きな変化を生ぜしめないし、こうした場合、その置換、欠失、あるいは挿入を施されたポリペプチドは、そうした置換、欠失、あるいは挿入のされていないものと実質的に同一であるとされるであろう。該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一な置換体としては、そのアミノ酸が属するところのクラスのうちの他のアミノ酸類から選ぶことができうる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、トリプトファン、メチオニンなどが挙げられ、極性（中性）としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなどが挙げられ、陽電荷をもつアミノ酸（塩基性アミノ酸）としては、アルギニン、リジン、ヒスチジンなどが挙げられ、陰電荷をもつアミノ酸（酸性アミノ酸）としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００４９】
本発明の標的酵素関与遺伝子を持つ組換え体ＤＮＡの作製について以下説明する。形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができ、例えば、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （１９８９） ＆ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （２００１））， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ などに記載の上記「遺伝子組換え技術」を利用して行うことができる。
本発明の標的カルボニル還元酵素をコードするＤＮＡを含む断片から、適当な手段を施して不必要な領域を欠失させたＤＮＡは、それを適当なベクターＤＮＡに再び組み込むことにより、宿主細胞に再び導入することが出来る。本発明のカルボニル還元酵素遺伝子を宿主中などにおいて、発現させるためには、まず該宿主生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中にこのＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の５’側上流に、より好ましくはターミネーターを３’側下流に、それぞれ組み込めばよい。
本発明の上記酵素などをコードするＤＮＡを宿主細胞に導入し、そしてそれをその導入された宿主細胞内で発現させるために用いられるベクターＤＮＡとしては、適当な宿主細胞内で、所定の酵素遺伝子などを発現できるものであれば特に制限なく使用し得る。
このようなベクターＤＮＡとしては、上記酵素などをコードするＤＮＡを組み込むことの出来るものであり、組換えたベクターＤＮＡで宿主細胞を形質転換できるものであり、そして得られた形質転換体の細胞内で導入された遺伝子産物をコードするＤＮＡの発現ができるものであれば特に限定されず、如何なるものも使用することが出来る。
【００５０】
このようなベクターＤＮＡとしては、宿主細胞中で自律複製可能であり、さらに組換え宿主細胞のみを選別できるような適当な選択マーカーなどが付与されたものがあげられる。さらにまた、このようなベクターＤＮＡは公知のベクターＤＮＡ等から当業者が容易に製造し得るようなものであってもよい。
このようなベクターＤＮＡとしては、例えばプラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターから選ばれたものがあげられる。また、このようなベクターＤＮＡは他の宿主株との間で遺伝子交換が可能なシャトルベクターであってもよいし、ランナウェイベクターやスリーパーベクターなど遺伝子産物の発現効率を向上せしめるために特別に工夫されたものであってもよい。
さらに、このようなベクターＤＮＡは、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、Ｐ_Ｌプロモーター、Ｐ_Ｒプロモーター、Ｔ７プロモーター等のプロモーター、ｔｒｐＡ由来ターミネーター、ファージ由来ターミネーター、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ 由来ターミネーター等のターミネーター、エンハンサーなどの制御因子を作動可能なように適宜付与されたものであってもよい。このような形質発現などに係わる因子等を導入するためには、遺伝子組換え技術の分野でよく知られた方法を適宜選択して適用することにより行うことができる。代表的な発現ベクターとしては、例えば、ｐＬＡＦＲ３， ｐＲ０１６１４ などを挙げることができる。
【００５１】
エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属微生物、特に大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）を宿主とするプラスミド（又はベクター）としては、例えばｐＢＲ３２２などのｐＢＲ系ベクター， ｐＵＣ１８， ｐＵＣ１９， ｐＵＣ１１８， ｐＵＣ１１９などのｐＵＣ系ベクター， ｐＬＡＣ１１， ｐＬＡＣ２１， ｐＳＰ６４， ｐＳＰ６５， ｐＴＺ−１８Ｒ／−１８Ｕ， ｐＴＺ−１９Ｒ／−１９Ｕ， ｐＧＥＭ−３， Ｍ−４， ｐＧＥＭ−３Ｚ， ｐＧＥＭ−４Ｚ， ｐＧＥＭ−５Ｚｆ（−）などのｐＧＥＸ系ベクター， ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ^ＴＭ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ベクターが挙げられる。大腸菌での発現に適したプラスミドベクターとしては、例えばｐＡＳ， ｐＫＫ２２３ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）， ｐＭＣ１４０３， ｐＭＣ９３１， ｐＫＣ３０， ｐＲＳＥＴ−Ｂ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） なども挙げられる。
シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物においては、トルエン化合物の分解に関与するプラスミドＴＯＬプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（ＲＳＦ１０１０などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）ｐＫＴ２４０などが利用可能であり、プロモーター、ターミネーターとして、リパーゼ（特開平５−２８４９７３）遺伝子などが利用できる。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物においては、ベクターとしてｐＵＢ１１０系プラスミド、ｐＣ１９４系プラスミドなどが利用可能であり、染色体にインテグレートすることもできる。また、プロモーター、ターミネーターとしてａｐｒ（アルカリプロテアーゼ）、ｎｐｒ（中性プロテアーゼ）、ａｍｙ（α−アミラーゼ）などが利用できる。ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属微生物においては、ｐＡＪ４３（Ｇｅｎｅ， ３９： ２８１ （１９８５））などのプラスミドベクターが利用可能である。プロモーター、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属微生物においては、ｐＣＳ１１（特開昭５７−１８３７９９）、ｐＣＢ１０１（Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， １９６： １７５ （１９８４）などのプラスミドベクターが利用可能である。ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属微生物においては、ｐＨＶ１３０１（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．， ２６： ２３９ （１９８５）、ｐＧＫ１（Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ５０： ９４ （１９８５））などがプラスミドベクターとして利用可能である。ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物においては、ストレプトコッカス属用に開発されたｐＡＭβ１（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １３７： ６１４ （１９７９））などが利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。
【００５２】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属においては、ロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）から単離されたプラスミドベクターが使用可能である （Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １３８： １００３ （１９９２））。ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属微生物においては、Ｈｏｐｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （１９８５）に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができ、例えばｐＩＪ４８６ （Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， ２０３： ４６８−４７８， １９８６）、ｐＫＣ１０６４（Ｇｅｎｅ， １０３： ９７−９９ （１９９１））、ｐＵＷＬ−ＫＳ （Ｇｅｎｅ， １６５： １４９−１５０ （１９９５））などが使用できる。
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ） 属微生物においては、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系プラスミドが利用可能である。また、染色体内に多コピー存在するリボソームＤＮＡとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（ＥＰ ５３７４５６など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＰＨＯ（酸性フォスファターゼ）、ＧＡＬ（β−ガラクトシダーゼ）、ＰＧＫ（ホスホグリセレートキナーゼ）、ＥＮＯ（エノラーゼ）などのプロモーター、ターミネーターが利用可能である。カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属微生物においては、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ） 由来ＡＲＳがクローニングされ（Ａｇｒｉ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ５１： １５８７ （１９８７）） 、これを利用したベクターが開発されている。また、染色体インテグレートタイプのベクターでは強力なプロモーターが開発されている（特開平 ０８−１７３１７０）。
ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属微生物においては、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ） 由来自律複製に関与する遺伝子 （ＰＡＲＳ１、ＰＡＲＳ２）などを利用した宿主ベクター系が開発されており（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ５： ３３７６ （１９８５））、高濃度培養とメタノールで誘導可能な ＡＯＸ など強いプロモーターが利用できる（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １５： ３８５９ （１９８７））。ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属微生物においては、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ） 由来自律複製に関与する遺伝子（ＨＡＲＳ１、ＨＡＲＳ２）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である（Ｙｅａｓｔ， ７： ４３１−４４３ （１９９１）） 。また、メタノールなどで誘導される ＡＯＸ（アルコールオキシダーゼ）、ＦＤＨ（ギ酸デヒドロゲナーゼ）のプロモーターなどが利用可能である。
【００５３】
クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物においては、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来２μｍ系プラスミド、ｐＫＤ１系プラスミド（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １４５： ３８２−３９０ （１９８１））、キラー活性に関与するｐＧＫｌ１由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子ＫＡＲＳ系プラスミド、リボソームＤＮＡなどとの相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（ＥＰ ５３７４５６など）などが利用可能である。また、ＡＤＨ、ＰＧＫなどに由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）由来のＡＲＳ（自律複製に関与する遺伝子）及びサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ６： ８０ （１９８６））。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のＡＤＨプロモーターなどが利用できる（ＥＭＢＯ Ｊ．， ６： ７２９ （１９８７））。特に、ｐＡＵＲ２２４は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物においては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ） 、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）などに関連して、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ７： ２８３−２８７ （１９８９）） 。
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属微生物においては、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーターなどが利用できる（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７， ５９６−６０３ （１９８９））。また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Ｎａｔｕｒｅ、 ３１５， ５９２−５９４ （１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。
【００５４】
上記ベクターＤＮＡに、上記所定タンパク質をコードするＤＮＡを組み込むには、まず、上記ベクターＤＮＡに適当な制限酵素を作用させ、得られたベクターＤＮＡ断片を、目的タンパク質をコードするＤＮＡ断片とを混合し、これにＤＮＡリガーゼを作用させることによりなしうる。この際、必要に応じ当該分野で知られたリンカー付与、ブラントエンド化等の処理を加えることもできる。このようにして得られた組換え体ＤＮＡは次に適当な宿主細胞の中に導入される。
同一のプラスミド上に複数の所定遺伝子を組み込めば、より良好な結果が得られる。複数の酵素遺伝子などを組み込む際のその様式は、固有のプロモーターを持つ当該遺伝子が複数個導入されていてもよいし、複数の酵素遺伝子がポリシストロニックに転写されるオペロンとして導入されていてもよいし、またこれらの組み合わせであってもよい。導入する遺伝子の数に特に制限はなく、組換え体ＤＮＡ及びそれを含む形質転換体の安定性を損なわない範囲であればよい。
組換え体ＤＮＡを作製する場合、このための技術としては制限酵素による切断、リガーゼによる連結、化学合成ＤＮＡの利用、ヌクレアーゼによる欠失、部位特異的変異による塩基置換など、通常の遺伝子操作で用いられる技術を適宜選択して適用することにより行なうことができるが、この際に、プロモーターの変更やその他の所定酵素遺伝子を発現させるための塩基配列の改変を行ってもよい。このようにして得られた組換え体ＤＮＡは次に適当な宿主細胞の中に導入される。
【００５５】
本発明に従った、標的酵素遺伝子及び当該酵素が利用する補酵素の再生能を付与する遺伝子を保有する組換え体ＤＮＡの作製につき、以下説明する。補酵素（例えばＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ など）を再生する活性を付与したり、増強すると、補酵素を添加したり、補酵素再生のための付加的な成分の使用を低減あるいは不要とすることを可能にし、効率的な標的酵素利用を可能とする。
典型的な手法では、補酵素を再生する能力を付与する遺伝子を導入するように、宿主を形質転換させることが挙げられる。例えば、補酵素再生に利用可能な酵素などの遺伝子を本発明のカルボニル還元酵素をコードするＤＮＡと同時に宿主に導入することによって、より効率的な還元反応を達成できる。
補酵素再生に利用可能な酵素としては、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、有機酸デヒドロゲナーゼ（リンゴ酸デヒドロゲナーゼなど）などが挙げられる。これらは一つ若しくは二つ又はそれ以上の遺伝子を導入することができる。好適には、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を利用でき、例えば、バチルス属細菌由来のＧＤＨ が挙げられる。具体的には、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＧＤＨ遺伝子を利用できる。補酵素を再生する能力を付与又は高めるのは、解糖系、メチロトローフのＣ１化合物資化経路などに関与する遺伝子を利用するものであってもよい。
二つもしくはそれ以上の遺伝子の宿主への導入には、不和合性をさけるために複製起源のことなる複数のベクターに別々に遺伝子を導入した組み換えベクターを利用して宿主を形質転換する方法や、単一のベクターに両遺伝子を導入する方法を適用できる。また、両方の遺伝子を染色体中に導入する方法などを利用することもできる。単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター、ターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【００５６】
本発明に従った、組換え体ＤＮＡの宿主細胞への導入について以下説明する。
上記のようにして作製した組換え体ＤＮＡを導入するための宿主細胞としては、上記で得られた組換えプラスミド（又はベクター）でもって形質転換されて、当該遺伝子を発現させることができるようなものであれば、特に制限なく使用することができる。宿主細胞としては、宿主ベクター系の開発されている細菌、放線菌、酵母、糸状菌、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられ、例えば大腸菌を含めたエシェリヒア属微生物の他、レイフソニア属、シュードモナス属、バチルス属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｏｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ストレプトコッカス属、ラクトバチルス属、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、ロドコッカス属、ストレプトマイセス属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、サッカロマイセス属、カンジダ属、ピキア属、ハンゼヌラ属、クライベロマイセス属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、シゾサッカロマイセス属、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ属などの微生物が挙げられる。このような宿主細胞としては、本発明の目的に沿って標的酵素遺伝子の発現を達成し得る限り、グラム陰性菌あるいはグラム陽性菌の区別なく、さらには、下等細胞あるいは高等細胞の区別なく使用できる。
【００５７】
宿主細胞が、例えばエシェリヒア属、特に大腸菌の場合、例えば大腸菌Ｋ１２ 株に由来するものが挙げられ、例えばＭ１５， Ｃ６００， ＤＨ１， ＤＨ５， ＤＨ１１Ｓ， ＤＨ１２Ｓ， ＤＨ５α， ＤＨ１０Ｂ， ＨＢ１０１， ＭＣ１０６１， ＪＭ１０９， ＳＴＢＬ２， ＳＴＢＬ４， ＸＬ１−Ｂｌｕｅ 系株， ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳなどが挙げられる。レイフソニア属微生物においては、例えばレイフソニア・ナガノエンシスなどが挙げられる。シュードモナス属微生物においては、例えばシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）などで宿主ベクター系が開発されているもの。ブレビバクテリウム属微生物においては、例えばブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）などが挙げられる。コリネバクテリウム属微生物においては、例えばコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などが利用可能である。ロドコッカス属微生物においては、例えばロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）などが利用可能である。
ストレプトマイセス属微生物においては、例えばストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・バージニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｅ）などが利用可能である。
サッカロマイセス属微生物においては、例えばサッカロマイセス・セレビシアエなどが利用可能である。ピキア属微生物においては、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが利用可能である。カンジダ属微生物においては、例えばカンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・ウチルス （Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ） などが利用可能である。アスペルギルス属微生物においては、アスペルギルス・ニガー （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）などが利用可能である。
【００５８】
組換え体ＤＮＡを導入するのは、当業者によく知られた方法から適宜選択して行うことができ、例えば、組換え体ＤＮＡをコンピテント細胞に接触せしめる、エレクトロポレーション、インビトロパッケージング法などを用いて適当な増殖期にある宿主に、組換えファージベクターを感染させる方法等などが適用される。
本発明に従い、ポリペプチドをコードする核酸を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体は、必要に応じて適当な選択マーカーを用い、繰り返しクローニングを行うことにより、高い発現能を安定して有する細胞株を得ることができる。形質転換体を用いる場合、使用する菌株に応じてアンピシリン、クロラムフェニコール等の抗生物質を培養液に添加してもよい。本発明の形質転換体は、適当な栄養培地中で本発明のポリペプチドをコードする核酸が発現可能な条件下で培養し、それを大量に得ることができるし、さらに目的物を生成、蓄積せしめることもできる。該形質転換体は、当該分野で汎用されている培地中で培養することができる。例えば、大腸菌等の原核細胞宿主などを宿主としている形質転換体は、液体培地を好適に使用することができる。培地中には、該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、麦芽エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては，例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム、炭酸カルシウムなどが挙げられる。また、酵母、ビタミン類、カザミノ酸、生長促進因子などを添加してもよい。また、必要に応じて、培地には、微生物の活性を誘導する物質、培地のｐＨ保持に有効な緩衝物質、消泡剤、さらにはシリコン、アデカノール、プルロニックなどを添加してもよい。必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリル
アクリル酸のような薬剤を加えることができる。
【００５９】
微生物の培養は、生育に適した条件下で行うことができる。具体的には、培地のｐＨ３〜１０、好ましくは４〜９、温度０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で行うことができる。微生物の培養は、好気的または嫌気的条件下で行うことができる。培養時間は、１〜３００ 時間、より好ましくは２〜３００ 時間であるが、それぞれの微生物により適宜決められるべきである。
培養は、例えば大腸菌では通常約１５〜約４５℃で約３〜約７５時間行い、必要により、通気や攪拌を加えることもできる。培養は通常約３０℃〜約４０℃で約１５〜約７２時間行い、必要に応じて通気や攪拌を加える。所定の遺伝子産物を発現している形質転換体はそのまま利用可能であるが、その細胞ホモジュネートとしても利用でき、さらに所定の遺伝子産物を単離して用いることもできる。上記培養細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により粗抽出液を得る方法などを適宜用いることができる。緩衝液の中には尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤や、トリトン Ｘ−１００（商品名）、ツウィーン−２０ （商品名）などの界面活性剤を加えてあってもよい。培養液中に目的生成物が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる目的生成物は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせてその精製を行なうことができ、例えば硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、例えばジエチルアミノエチル基あるいはカルボキシメチル基などを持つ担体などを用いたイオン交換クロマトグラフィー法、例えばブチル基、オクチル基、フェニル基など疎水性基を持つ担体などを用いた疎水性クロマトグラフィー法、色素ゲルクロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラフィー法、逆相クロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法などにより精製して得ることができる。好ましくは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、リガンドなどを固定化したアフィニティー・クロマトグラフィーなどで処理し精製分離処理できる。例えば、ゼラチン−アガロース・アフィニティー・クロマトグラフィー、ヘパリン−アガロース・クロマトグラフィーなどが挙げられる。それらの方法は、単独あるいは適宜組み合わせて用いて適用することにより行うことが出来る。
【００６０】
得られたタンパク質（ペプチドあるいはポリペプチドを包含していてよい）は、それを酵素免疫測定法など知られた手法で、適当な担体あるいは固相に結合せしめて固相化することができる。固相化タンパク質、固相化ペプチドは、便利に結合アッセイや物質のスクリーニングに使用できる。精製されたリコンビナントタンパク質は、モノクローナル抗体作製のための免疫抗原として好適に使用できる。
該ポリペプチドは、化学的な手法でその含有されるアミノ酸残基を修飾することもできるし、ペプチダーゼ、例えばペプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼなどの酵素を用いて修飾したり、部分分解したりしてその誘導体などにすることができる。
タンパク質・ポリペプチドの構造の修飾・改変などは、例えば日本生化学会編、「新生化学実験講座１、タンパク質 ＶＩＩ、タンパク質工学」、東京化学同人（１９９３）を参考にし、そこに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法、さらにはそれらと実質的に同様な方法で行うことができる。またその生物学的活性のうちには、免疫的に活性、例えば抗原性を有するということも含まれてよい。該修飾・改変のうちには、アミノ基、ＳＨ基及び／又はカルボキシル基の導入、シリル化、脱アミノ化、ヒドロキシル化、リン酸化、メチル化、アセチル化などのアシル化、酸化、還元、開環、閉環、Ｄ−体アミノ酸残基への置換などであってもよい。それらの方法は、当該分野で知られている。
本明細書において、「実質的に同等」とはポリペプチドの活性、例えば、２−アセトニルオキシ−３，４−ジフルオロニトロベンゼンに作用し、３，４−ジフルオロ−２−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピルオキシ）ニトロベンゼンを生成するといった高い不斉選択性の還元活性、それに対応する生理的な活性、生物学的な活性が実質的に同じであることを意味する。さらにまた、その用語の意味の中には、実質的に同質の活性を有する場合を包含していてよく、該実質的に同質の活性としては、例えば、２−アセトニルオキシ−３，４−ジフルオロニトロベンゼンに作用し、３，４−ジフルオロ−２−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピルオキシ）ニトロベンゼンを生成する酵素活性などを挙げることができる。該実質的に同質の活性とは、それらの活性が性質的に同質であることを示し、例えば、生理的に、不斉合成的に、あるいは生物学的に同質であることを示す。例えば、該カルボニル還元酵素活性などの活性が、同等 （例えば、約 ０．０００１ 〜１００００ 倍、好ましくは約０．００１ 〜１０００倍、より好ましくは約 ０．０１ 〜２００ 倍、さらに好ましくは約 ０．５〜１０倍） であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的な要素は異なっていてもよい。
【００６１】
本発明に従えば、不斉還元性能において特異な活性を有するカルボニル還元酵素遺伝子が明らかにされたので、当該ＤＮＡ配列は、例えば各種の微生物における同様な活性を有するカルボニル還元酵素及び関連タンパク質をコードする、微生物などの、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡのスクリーニング及び特有の不斉還元能などの検知のためのプローブの設計などに使用できる。プローブは、必要に応じて、当該分野で広く利用されている標識を付与しておくことができる。遺伝子の単離にあたっては、ＰＣＲ 法、さらには逆転写酵素 （ＲＴ） を用いたＰＣＲ 法 （ＲＴ−ＰＣＲ） を利用することが出来る。例えば、所定のｃＤＮＡをプローブとして用いれば、例えばノーザン・ブロティング、サザン・ブロティング、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションなどにより細胞中での特有の不斉還元能を持つカルボニル還元酵素遺伝子などを検出・測定できる。
本明細書中で開示した関連したタンパク質あるいはポリペプタイド、そのフラグメント、さらにはＤＮＡを含めた核酸（ｍＲＮＡ やオリゴヌクレオチドを含む） は、それらを単独あるいは有機的に使用し、更にはアンチセンス技術、モノクローナル抗体を含めた抗体、組換え微生物などとも適宜組合わせて、ゲノミックス及びプロテオミックス技術に応用できる。核酸アレイ、タンパク質アレイを使用した遺伝子発現解析、遺伝子機能解析、タンパク質間相互作用解析、関連遺伝子解析をすることが可能となる。例えば、核酸アレイ技術では、ｃＤＮＡライブラリーを使用したり、ＰＣＲ技術で得たＤＮＡを基板上にスポッティング装置で高密度に配置して、ハイブリダイゼーションを利用して試料の解析が行われる。
【００６２】
該アレイ化は、針あるいはピンを使用して、あるいはインクジェトプリンティング技術などでもって、スライドガラス、シリコン板、プラスチックプレートなどの基板のそれぞれ固有の位置にＤＮＡが付着せしめられることによりそれを実施することができる。該核酸アレイ上でのハイブリダイゼーションの結果得られるシグナルを観察してデータを取得する。該シグナルは、螢光色素などの標識（例えば、Ｃｙ３， Ｃｙ５， ＢＯＤＩＰＹ， ＦＩＴＣ， Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ｄｙｅｓ（商品名）， Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ（商品名） など） より得られるものであってよい。検知にはレーザースキャナーなどを利用することもでき、得られたデータは適当なアルゴリズムに従ったプログラムを備えたコンピューターシステムで処理されてよい。また、タンパク質アレイ技術では、タグを付された組換え発現タンパク質産物を利用してよく、二次元電気泳動（２−ＤＥ）、酵素消化フラグメントを含めての質量分析 （ＭＳ）（これにはエレクトロスプレーイオン化法（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ： ＥＳＩ）， マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ： ＭＡＬＤＩ）などの技術が含まれ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 分析計、ＥＳＩ−３ 連四重極分析計、ＥＳＩ−イオントラップ分析計などを使用してよい） 、染色技術、同位体標識及び解析、画像処理技術などが利用されることができる。したがって、本発明には上記で得られるあるいは利用できる酵素遺伝子系など及びそれに対する抗体に関連したソフトウエア、データベースなども含まれてよい。
【００６３】
本発明は、前記カルボニル還元酵素のカルボニル基含有化合物の還元によるアルコール化合物の製造用途を提供している。例えば、前記カルボニル還元酵素存在下ケトンなどのカルボニル基含有化合物を還元することによるアルコール化合物の製造法が提供される。本発明のカルボニル還元酵素は、不斉還元を行うことから、特定の光学活性アルコール化合物を製造するといった工業的な利用において有利である。酵素分子、その処理物、酵素分子を含む培養物、固定化酵素、あるいは酵素を生成する形質転換体微生物等（該形質転換体が生きた状態であっても固定化されていてもよい）を反応溶液と接触させることにより、目的とする酵素反応を行わせることができるが、酵素と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定されるものではない。反応溶液は、基質や酵素反応に必要な補酵素を酵素活性の発現に望ましい環境を与える適当な溶媒に溶解したものである。本発明におけるカルボニル還元酵素を含む微生物の処理物には、具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどが含まれる。該微生物の処理物には、例えば粗抽出液、培養菌体、凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、それらの菌体の磨砕物などが含まれてよい。
【００６４】
本発明の一つの態様では、一般式（Ｉ） で表わされる化合物（式中、ＸａおよびＸｂは、同一でも異なっていてもよく、それぞれハロゲン原子を意味する）を、本発明で特定されたカルボニル還元酵素、あるいは該酵素の産生能を有し且つ形質転換された微生物の菌体、その培養物、それらの処理物並びに抽出物から成る群から選ばれたもので処理して一般式（ＩＩ）で表わされる光学活性な化合物（式中、ＸａおよびＸｂは、上記と同様の意味を有する）を製造する方法に関する。前述の式（Ｉ） および（ＩＩ）においては、ＸａおよびＸｂが共にフッ素原子が好ましく、３，４−ジフルオロ−２−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピルオキシ） ニトロベンゼンが好適に得られる。本発明の別の態様では、一般式（ＩＩＩ） で表わされる化合物（式中、Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子又はアルキル基であり、Ｒ_３は置換又は非置換のアルキル基又はアリール基である）を、本発明で特定されたカルボニル還元酵素、あるいは該酵素の産生能を有し且つ形質転換された微生物の菌体、その培養物、それらの処理物並びに抽出物から成る群から選ばれたもので処理して一般式（ＩＶ）で表わされる光学活性な化合物（式中、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、上記と同様の意味を有する）を製造する方法に関する。前述の式（ＩＩＩ） および（ＩＶ）においては、ハロゲン原子としては、好適には塩素原子、臭素原子又はヨード原子であり、アルキル基としては、炭素数１〜４のアルキル基で、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、イソプロピル基などが挙げられ、Ｒ_３が置換されたアルキル基の場合、Ｒ_３は例えばベンジル基などが挙げられる。Ｒ_３のアリール基としては、例えばフェニル基、トリル基などで、Ｒ_３が置換されたアリール基の場合、Ｒ_３は、例えばフルオロフェニル基、クロロフェニル基などである。代表的な化合物（ＩＩＩ） としては、４−クロロアセト酢酸メチル、４−クロロアセト酢酸エチル、４−ブロモアセト酢酸メチル、４−ブロモアセト酢酸エチル、４−ヨードアセト酢酸エチル、２−クロロ−３−オキソ酪酸エチル、２−メチル−３−オキソ酪酸エチルなどが挙げられる。
【００６５】
本発明では、微生物の菌体又はその微生物培養物を使用する場合、エネルギー源の存在下に処理を行うことができる。菌体としては、上記微生物を培養液より収穫したものあるいは培養液より集菌洗浄したもの、乾燥又はアセトンパウダー処理したもの等を挙げることができる。酵素や菌体は、そのままか、或いは固定化した形で使用することができる。固定化は、当業者に周知の方法（例えば、架橋法、物理的吸着法、包括法等）で行い得る。固定化担体としては、一般に用いられているものであれば何れでもよく、例えば、セルロース、アガロース、デキストラン、κ−カラギナン、アルギン酸、ゼラチン、酢酸セルロース等の多糖類；例えばグルテン等の天然高分子；例えば活性炭、ガラス、白土、カオリナイト、アルミナ、シリカゲル、ベントナイト、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム等の無機物；ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリプロピレングリコール、ウレタン等の合成高分子などが挙げられる。また、菌体は、マイクロカプセルに封入した形で使用することもでき、当該分野で知られた方法から適宜選択して使用できる。
【００６６】
培養物としては、上記微生物を適当な培地で培養したものを挙げることができる。前記微生物の処理物及び抽出物としては、菌体又は培養物を、必要に応じて、緩衝液に懸濁させ、得られた懸濁液を自己消化して得たもの、あるいはフレンチプレス、超音波、ホモジナイザー等の物理的方法、更にはリゾチーム等の酵素的方法を組み合わせて破砕するなどして得られた菌体破砕物を指してもよいし、そうして得られた生成物から、水もしくは適当な緩衝液で抽出したもの、該抽出液に硫安もしくはアルコールを加えることにより得られる沈殿物及び該抽出液を限外濾過、ゲル濾過、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等を用いて分画したものを挙げることができる。また、該微生物の処理物及び抽出物としては、菌体又は培養物を、必要に応じて、熱処理したものあるいは該熱処理物に上記の処理を施したものなどであってもよい。該熱処理は、当該分野で知られた方法で行うことができ、具体的な条件については目的にあわせて実験などにより適宜それを決定することができる。熱処理の温度としては、約３７℃以上の温度が挙げられるが、例えば約４０〜７０℃、好ましくは約４５〜６０℃である。熱処理の時間としては、処理温度にもよるが、例えば、約５分間〜約２４時間、好ましくは約３０分間〜１０時間、より好ましくは約１〜５ 時間である、代表的な熱処理は、例えば約４５℃、約５０℃あるいは約５５℃で約２〜４時間処理するものであるが、好ましくは約４５〜５５℃で約３時間程度処理するものである。熱処理されたものを使用することにより、選択性、転換率などを含めて良好な結果を得ることもできる。
【００６７】
本発明に係るフェノキシプロパン誘導体（ＩＩ）の製造における反応方法としては、前記一般式（Ｉ） に示されるフェノキシアセトン誘導体に前記カルボニル還元酵素、あるいは該酵素の産生能を有し且つ形質転換された微生物の菌体、その培養物、それらの処理物並びに抽出物から成る群から選ばれたものが作用して、対応する一般式（ＩＩ）で表される光学活性フェノキシプロパン誘導体を生成する方法であれば特に限定されず、原料化合物の水溶液に、単離された酵素、該酵素産生能を有する形質転換体の緩衝液または水などで洗浄した菌体、あるいは該形質転換体培養物、それらの処理物並びに抽出物から成る群から選ばれたものを混合することで反応を開始する。反応は、通常、水中、或いは水に実質的に不溶性ないし難溶解性の有機溶媒と水との液体二相系で行うことができるが、一般的には水性系で行うことが好ましい。また、前記一般式（Ｉ） に示されるフェノキシアセトン誘導体は、必要に応じて、適当な有機溶媒、例えばエタノール、メタノール、ジオキサン、ジメチルスルホキシド等に溶解した後に、該溶解液を水性溶液にして用いることもできる。
【００６８】
また、反応条件は、一般式（ＩＩ）で示される光学活性フェノキシプロパン誘導体の生成を損なわない範囲で選択できる。基質である式（Ｉ） の化合物の濃度は、好ましくは０．００１ 〜２０％ 、より好ましくは０．０１〜１０％ である。さらに、反応液のｐＨは、好ましくは５〜９、より好ましくは６〜８であり、反応温度は好ましくは１０〜５０℃、より好ましくは２０〜４０℃である。ｐＨを安定させるために緩衝液を使用することもできる。さらに、ｐＨを調節するために、酸、塩基を使用して調節することもできる。また、反応時間は、１〜２００ 時間、好ましくは５〜１５０ 時間であるが、それぞれの酵素濃度や使用形質転換体により適宜決められるべきである。化合物（ＩＩＩ） から化合物（ＩＶ）を製造する場合も上記と同様にして行うことが可能である。
【００６９】
本発明の還元反応においては、補酵素等を添加することもできる。補酵素としては、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ などが挙げられ、それらは各々単独で用いてもよく、それらの混合物の形態で用いてもよく、その添加量は、基質化合物に対して、好ましくは１０００分の１〜３分の１倍量である。本発明の還元反応に付随して還元型補酵素から生成される酸化型補酵素を再生するのを助ける手段を講じることができる。該補酵素の再生は、微生物の持つＮＡＤ^＋還元能といった酸化型補酵素還元能（解糖系、メチロトローフのＣ１化合物資化経路など）を用いて行うことができる。例えば、ＮＡＤ^＋還元能は、反応系にグルコースやエタノール、ギ酸などを添加することにより増強することが可能である。また、還元型補酵素を生成する能力を有する微生物やその処理物、補酵素再生酵素などを反応系に添加することによっても行うことができる。例えば、上記したグルコースデヒドロゲナーゼなどの補酵素再生に利用可能な酵素などを含む微生物、その処理物、ならびに部分精製もしくは精製補酵素再生酵素を用いて補酵素の再生を行うことができる。これらの補酵素再生に必要な反応を構成する成分は、本発明によるアルコール化合物の製造のための反応系に添加したり、固定化したものを添加したり、あるいはＮＡＤＨなどの補酵素の交換が可能な膜を介して接触させることができる。
また、前記したように、補酵素再生に利用可能な酵素などの発現を制御された形質転換体など（補酵素再生活性の高い微生物を含む）を用いて、補酵素再生のための付加的な反応系を使用することなく、あるいは補酵素再生用の酵素を添加することなく、効率的な反応を行うことを可能にすることもできる。
【００７０】
形質転換体を使用する場合、反応をより効率的に進行させるために、グルコースなどの糖類、酢酸などの有機酸、エタノール、グリセロールなどのエネルギー物質を添加することができる。これらは、各々単独で用いてもよく、それらの混合物の形態で用いてもよい。添加量は、基質に対して好ましくは１００ 分の１〜１０倍量である。さらに、グルコースなどの糖類、酢酸などの有機酸、グリセロールなどのエネルギー物質、補酵素、補酵素再生酵素および補酵素再生酵素の基質をそれぞれ組み合わせて用いてもよい。これらは、本来、菌体中に蓄積されているが、必要に応じてこれら物質を添加することにより、反応速度、収率等を上昇させることができる場合があり、適宜選択され得る。
必要に応じて反応系内には、基質、当該酵素、微生物の菌体、その培養物、それらの処理物並びに抽出物から成る群から選ばれたもの、さらにはその他のものを、逐次添加したり、連続的に添加することも可能である。生成物を連続的に取り出しながら反応を行うことにより、反応速度を高めることなどもできる。反応はバッチ式又は連続方式で行いうるし、膜リアクターなども使用できる。
反応によって生成したアルコール化合物（例えば、光学活性フェノキシプロパン誘導体（ＩＩ）など）は、慣用の分離精製手段によって単離精製できる。例えば、反応液から直接または菌体を分離した後、膜分離、有機溶媒（例えば、トルエン、クロロホルムなど）による抽出、カラムクロマトグラフィー、減圧濃縮、蒸溜、晶析、再結晶などの通常の精製方法に供することができる。例えば、反応終了後、酢酸ブチル、酢酸エチル、トルエン、クロロホルム等の有機溶媒で反応液から生成物を抽出し、溶媒を留去することにより粗生成物を得ることができる。該粗生成物は、それをそのまま次の工程に使用してもよいが、必要によりシリカゲルカラムクロマトグラフィー等の手段により精製した後、さらにセルロース誘導体等の光学活性担体を使用した高速液体クロマトグラフィー等の手段により精製してもよい。
【００７１】
本発明で使用される前記一般式（Ｉ） のフェノキシアセトン誘導体は、公知の方法で得ることができ、例えば、２−アセトニルオキシ−３，４− ジフルオロニトロベンゼンは、Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．， ３２（１２）： ４９０７−４９１３， １９８４ などに記載があり、２，３−ジフルオロ−６− ニトロフェノールを、強塩基存在下、クロロアセトンと反応させることにより、容易に合成できることも知られている（特開昭６１−２４６１５１ 号など）。
本発明で得られる光学活性フェノキシプロパン誘導体（ＩＩ）は、当業者に自明の反応工程により、例えば、特許第２６１２３２７号明細書、特開平１−２５０３６９号公報、特開平１−２８７０９６号公報、特開平２−２１８６４８号公報などに開示の方法により、レボフロキサシンに変換することができる。
本発明で得られる光学活性フェノキシプロパン誘導体（ＩＩ）は、当業者に自明の反応工程により、例えば、３，４−ジフルオロ−２−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピルオキシ） ニトロベンゼンの場合、（Ｓ）−（−）−７，８−ジフルオロ−３− メチル− ３，４−ジヒドロ−２Ｈ−［１，４］ ベンゾオキサジン誘導体に変換することができる。
【００７２】
例えば、光学活性フェノキシプロパン誘導体から製造中間体２，３−ジフルオロ−（２，２−ジエトキシカルボニルエテニル）アミノ−（（Ｒ）−２−（メタンスルホニルオキシ）プロピルオキシ）ベンゼン誘導体への製法としては、特開平１−２５０３６９号公報、特開平２−２１８６４８号公報などに記載の方法により、例えば、ジエチルエトキシメチレンマロネート（ＥＭＭＥ）などのジアルキルアルコキシエチレンマロネートによるアミノ窒素をメチレンマロネート化し得ることができる。メチレンマロネート化体は炭酸カリウムによりオキサジン閉環させ、（Ｓ）−（−）−７，８−ジフルオロ−３−メチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−［１，４］ベンゾオキサジン誘導体に変換することができる。また、光学活性フェノキシプロパン誘導体から製造中間体（Ｓ）−（−）−７，８−ジフルオロ−３−メチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−［１，４］ベンゾオキサジン誘導体への製法としては、特開平２−７３２号公報（実施例２２、２３、２４、３３、３９、４０、４１および４２など）、特開平１−２５０３６９号公報（実施例１７、１８、１９、２２、２３、２４、２５、２６、２７および２９など）に記載の方法が挙げられ、スルホニル化反応、ニトロ基の還元、および閉環反応を組み合わせて製造され、具体的には、例えば、特開平１−２５０３６９号公報の実施例２２、２３、２６、２７、２９に記載の通りの方法で得られ、光学活性フェノキシプロパン誘導体をピリジン中トシルクロライドを用いてトシル化し、トシル体をエタノール中、パラジウム−炭素を加えて常温常圧で接触還元しニトロ基を還元し、次に生成物を閉環反応に付すが、該閉環反応は、例えば、無水ＤＭＦ に溶解し、炭酸カリウムおよび触媒量の１８−クラウン−６−エーテルを加え加熱攪拌し行われる。場合により、所定の化合物に、ジエチルエトキシメチレンマロネート（ＥＭＭＥ）などのジアルキルアルコキシメチレンマロネートを加え、加熱しながら攪拌し、アミノ窒素をメチレンマロネート化し、次の工程で閉環反応に付してピリドンカルボン酸エステル構造を形成できるようにしておくこともできる。
【００７３】
代表的な態様では、上記の様にして得られた３，４−ジフルオロ−２−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロポキシ） ニトロベンゼンは、特開平２−７３２号公報に記載された方法、例えば、水酸基をパラトルエンスルホン酸クロリドをはじめとする置換スルホニルクロリド等を用いてスルホニル化した後、ニトロ基を還元することにより、（Ｓ）−（−）−７，８−ジフルオロ−３− メチル−３，４− ジヒドロ−２Ｈ−［１，４］ ベンゾオキサジン誘導体に変換することができる。得られた（Ｓ）−（−）−７，８−ジフルオロ−３− メチル−３，４− ジヒドロ−２Ｈ−［１，４］ ベンゾオキサジン誘導体を合成抗菌剤レボフロキサシンに変換するには、特開昭６２−２５２７９０号公報に記載された方法によればよい。
例えば、（Ｓ）−（−）−７，８−ジフルオロ−３− メチル−３，４− ジヒドロ−２Ｈ−［１，４］ ベンゾオキサジン誘導体から、レボフロキサシンへの製法としては、特開昭６２−２５２７９０号公報及び特開平１−２８７０８６号公報（実施例４、５、６）に記載の方法が挙げられ、具体的には、例えば、特開平１−２８７０８６号公報の実施例４、５、６に記載の通り、標記のベンゾオキサジン誘導体を、必要に応じて、ＥＭＭＥと加熱還流して、メチレンマロネート化し、当該メチレンマロネート化体を酢酸に溶解し、濃塩酸を加えて対応するカルボン酸とし、それをジエチルエーテル中、三フッ化ホウ素ジエテルエーテルコンプレックスを加え攪拌する。さらにジメチルスルホキシド中、トリエチルアミンおよびＮ−メチルピペラジンを加え攪拌し製することができる。
【００７４】
かくして、本発明は、ここで特定した酵素、該酵素遺伝子で形質転換した微生物の菌体、その培養物、それらの処理物並びに抽出物から成る群から選ばれたものの存在下に処理して、一般式（Ｉ） のフェノキシアセトン誘導体を光学活性な一般式（ＩＩ）のフェノキシプロパン誘導体とし、次に得られたフェノキシプロパン誘導体（ＩＩ）を、公知の方法に従って処理し、レボフロキサシンを得ることを特徴とするレボフロキサシンの製造法にも関する。該フェノキシプロパン誘導体（ＩＩ）からレボフロキサシンを製造するには、例えば、以下（ａ） 〜（ｇ） の処理を組み合わせて行うことでよい：（ａ） ニトロ基のアミノ基への還元、（ｂ） アミノ基のメチレンマロネート化反応、（ｃ） ２−ヒドロキシプロピルオキシ基上のヒドロキシ基のスルホニル化反応、（ｄ） ベンゼン核上の２−スルホニロキシプロピルオキシ基とアミノ窒素原子間の閉環反応によるオキサジン環形成反応、（ｅ） メチレンマロネート化アミノ基とベンゼン核上の炭素原子間の閉環反応によるピリジン環形成反応、（ｆ） Ｎ−メチルピペリジン導入反応、及び（ｇ） 保護基の除去及び／又はエステルの加水分解による遊離カルボキシル基形成反応。
上記（ａ） 〜（ｇ） の処理に使用する試薬並びに反応条件、具体的な処理操作は、特許第２６１２３２７号明細書、特開平１−２５０３６９号公報、特開平１−２８７０９６号公報、特開平２−２１８６４８号公報などに開示されており、該文献を参照することによりそれらは本明細書の一部としてその内容はここに含めて解釈されるべきものである。
【００７５】
明細書及び図面において、用語は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによるか、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。代表的な用語の意味を以下に示す。
アミノ酸配列に関しては：
Ａ：アラニン （Ａｌａ） Ｍ：メチオニン （Ｍｅｔ）
Ｃ：システイン （Ｃｙｓ） Ｎ：アスパラギン （Ａｓｎ）
Ｄ：アスパラギン酸 （Ａｓｐ） Ｐ：プロリン （Ｐｒｏ）
Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ） Ｑ：グルタミン （Ｇｌｎ）
Ｆ：フェニルアラニン（Ｐｈｅ） Ｒ：アルギニン （Ａｒｇ）
Ｇ：グリシン（Ｇｌｙ） Ｓ：セリン （Ｓｅｒ）
Ｈ：ヒスチジン（Ｈｉｓ） Ｔ：スレオニン （Ｔｈｒ）
Ｉ：イソロイシン（Ｉｌｅ） Ｖ：バリン （Ｖａｌ）
Ｋ：リジン（Ｌｙｓ） Ｗ：トリプトファン （Ｔｒｐ）
Ｌ：ロイシン（Ｌｅｕ） Ｙ：チロシン （Ｔｙｒ）
Ｘ：上記のいずれかのアミノ酸あるいは特定の任意のアミノ酸（特別に指定した場合はその指定したアミノ酸である）（Ｘａａ）
ヌクレオチド配列に関しては：
Ａ，ａ：アデニン Ｇ，ｇ： グアニン
Ｃ，ｃ：シトシン Ｔ，ｔ： チミン
Ｒ，ｒ：アデニン又はグアニン Ｙ，ｙ： シトシン又はチミン／ウラシル
Ｍ，ｍ：アデニン又はシトシン Ｋ，ｋ： グアニン又はチミン／ウラシル
Ｓ，ｓ：シトシン又はグアニン Ｗ，ｗ： アデニン又はチミン／ウラシル
Ｂ，ｂ：シトシン又はグアニン又はチミン／ウラシル
Ｄ，ｄ：アデニン又はグアニン又はチミン／ウラシル
Ｈ，ｈ：アデニン又はシトシン又はチミン／ウラシル
Ｖ，ｖ：アデニン又はシトシン又はグアニン
Ｎ，ｎ：アデニン又はグアニン又はシトシン又はチミン／ウラシル，不明，
又は他の如何なる塩基でもよい（特別に指定した場合はその指定した塩基である）
また、配列表の配列番号：１２ には Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ＧＤＨ のアミノ酸配列が示され、配列番号：１３ には Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ ｎａｇａｎｏｅｎｓｉｓ ＪＣＭ１０５９２ 由来カルボニル還元酵素のアミノ酸配列が示されている。
後述の実施例５に記載の形質転換された組換え大腸菌 Ｍ１５ （ｐＲＥＰ４， ｐＡＦＮ１１）は、平成１５年３月２８日から茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６ （郵便番号 ３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｒｇａｎｉｓｍ Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ： ＩＰＯＤ）に寄託されて保管されている（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１９２７６）。また、後述の実施例８に記載の形質転換された組換え大腸菌 Ｍ１５ （ｐＲＥＰ４， ｐＡＦＮ−ＧＤＨ）は、平成１５年３月２８日からＩＰＯＤに寄託されて保管されている（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１９２７７）。
【００７６】
【実施例】
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。以下の実施例における通常慣用されるＤＮＡクローニングを含めた技術としては、標準的な実験マニュアル、例えば Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９） ＆ Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１）に記載されるように実施できる。また特にＰＣＲ 法では、Ｒ． Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３０： １３５０， １９８５； Ｒ． Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９： ４８７， １９８８； Ｈ． Ａ． Ｅｒｌｉｃｈ （ｅｄ．）， ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， １９８９ ； Ｄ． Ｍ． Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ． （ｅｄ．）， ”ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ”， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｖｏｌ． １， （Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ）， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９５）； Ｍ． Ａ． Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ． （ｅｄ．）， ”ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９０））； Ｍ． Ｊ． ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｐ． Ｑｕｉｒｋｅ ａｎｄ Ｇ． Ｒ． Ｔａｙｌｏｒ （ｅｄ．）， ＰＣＲ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ （１９９１） などに記載の方法に準じて行っているし、また市販の試薬あるいはキットを用いている場合はそれらに添付の指示書（ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ） や添付の薬品等を使用している。
【００７７】
〔実施例１：カルボニル還元酵素の精製〕
ＧＰＹ 液体培地（１％グルコース、０．５％ポリペプトン、０．３％酵母抽出物、水道水 （ｐＨ ７）） ３０００ ｍＬを調製し、２０００ ｍＬ 三角フラスコに５００ ｍＬずつ分注して １２０℃、２０分の蒸気滅菌を行った。同じＧＰＹ 培地で少量培養しておいたレイフソニア・ナガノエンシス菌株 （Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ ｎａｇａｎｏｅｎｓｉｓ ＪＣＭ １０５９２）を１／１００ 量入れ、３０℃で１〜２日間培養した（ＯＤ_６１０ ＞３まで）。この培養液から遠心分離により菌体を集め、８０ｇ の湿菌体を得た。この菌体を菌体１ｇ当たり１ ｍＬの１０ ｍＭ リン酸緩衝液 （ｐＨ ６） に懸濁し、超音波破砕機（日本精機製作所社製、ＵＳ−３００）によって破砕した。この菌体破砕液から遠心分離によって菌体残渣を取り除き、無細胞抽出液７０ ｍＬ を得た。
この無細胞抽出液に３０％ 飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して硫酸アンモニウムを溶解させ、次に遠心分離によって沈殿を分離し、この上清にさらに５０％ 飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し溶解させ、遠心分離によって沈殿を分離した。この沈殿部分を１０ ｍＭ リン酸緩衝液 （ｐＨ ６） で１ｇ／１０ｍＬ になるように溶解し、分画分子量１２，０００の透析膜を用いて、１ Ｌ の１０ ｍＭ リン酸緩衝液 （ｐＨ ６） の透析液で１６時間、４℃で透析した。上記透析終了液を１０ ｍＭ リン酸緩衝液 （ｐＨ ６） で平衡化してあるＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ担体（ファルマシア・バイオテク社製、容量 １０ ｍＬ）に供し ０〜１ Ｍ ＮａＣｌのグラジエントでタンパク質を溶出、活性画分を分画分子量１２，０００の透析膜を用いて、１Ｌの１０ ｍＭ リン酸緩衝液 （ｐＨ ６） の透析液で１６時間、４℃で透析した。
活性測定方法には下記のような測定方法を使用した。１００ ｍＭリン酸緩衝液 （ｐＨ ６．０） に、基質として ０．０２％（重量％）２−アセトニルオキシ−３，４−ジフルオロニトロベンゼン、補酵素として０．２ ｍＭ ＮＡＤＰＨおよび酵素溶液（２０〜２００ μＬ／ｍＬ反応溶液）を添加し２５℃で波長３４０ｎｍ の吸光度の増減を測定することにより行った。この反応条件において、１分間に １μｍｏｌ のＮＡＤＰＨ をＮＡＤＰ^＋ に酸化する酵素活性を１ ｕｎｉｔと定義した。
上記ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ処理−透析終了液を１０ ｍＭ リン酸緩衝液 （ｐＨ ６） で平衡化してあるＢｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア・バイオテク社製、容量 ５ｍＬ）に供し、３倍容量の１０ ｍＭ リン酸緩衝液 （ｐＨ ６） で洗浄、１Ｍ のＮａＣｌで活性画分を溶出。溶出液を分画分子量１２，０００の透析膜を用いて、１Ｌ の１０ ｍＭ リン酸緩衝液 （ｐＨ ６） の透析液で１６時間、４℃で透析した。
上記Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−透析終了溶液をＭｏｎｏ Ｑ ＨＲ ５／５ （アマシャム・ファルマシアバイオテク製ＦＰＬＣシステム）カラムに供し、１０ ｍＭ リン酸緩衝液 （ｐＨ ７） 、 ０〜１ Ｍ ＮａＣｌのグラジエントで活性画分を溶出し精製酵素標品を得た。
【００７８】
〔実施例２：酵素の性質〕
実施例１において得られた酵素の性質について検討した。酵素活性の測定方法は実施例１に記した測定方法と同様である。
（１）作用：２−アセトニルオキシ−３，４−ジフルオロニトロベンゼンに作用し、光学純度９９％ ｅ．ｅ．以上の３，４−ジフルオロ−２−（（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピルオキシ）ニトロベンゼンを生成した。
（２）基質特異性：２−アセトニルオキシ−３，４−ジフルオロニトロベンゼンおよび４−クロロアセト酢酸エチルを基質として、実施例１と同様の方法で酵素活性を測定したところ、共に高い活性を示した。なお、２−アセトニルオキシ−３，４−ジフルオロニトロベンゼンを基質としたときの活性：０．０５４３ Ｕを１００％としたときの４−クロロアセト酢酸エチルを基質としたときの活性は０．０９９９ Ｕ、１８４％であった。
（３）補酵素：ＮＡＤＰＨ およびＮＡＤＨの両方を補酵素として利用できる。
上記活性測定方法でそれぞれの補酵素を用いて測定したとき、ＮＡＤＰＨ を補酵素として測定したときの活性を１００％とするとＮＡＤＨを補酵素として測定したときの活性は２１６％であった。
（４）至適ｐＨ：本酵素を実施例１に記載の活性測定法において緩衝液のｐＨを ５〜７ の範囲で測定したとき、ｐＨ ６での活性を１００％とした場合の各ｐＨでの活性は下記の通りであった。ｐＨ ５ ： ２７．６％、 ｐＨ ５．５ ： ８７．０％、ｐＨ ６ ： １００％ 、ｐＨ ６．５ ： ５２．２％、ｐＨ ７ ： ２４．９％。その結果、至適ｐＨは ５．５〜６．０ であった。
（５）ｐＨ安定性：本酵素溶液のｐＨを ３〜９ まで変化させ、２５℃で２時間経過したときの残存活性を検討したところ、表１のようにｐＨ ５．５〜９ の間で酵素活性が安定であった。
【００７９】
【表１】

【００８０】
（６）至適反応温度：本酵素を実施例１に記載の活性測定法において反応液の温度を２０〜６０℃の範囲で測定したとき、２０℃での活性を１００％ （０．０６８７ Ｕ） とした場合の各温度での活性は下記の通りであった。２０℃：１００％、３０℃：１１６．６％、４０℃：１０９．３％、５０℃：１５０．８％、６０℃：１２６．９％。その結果、至適反応温度は約５０℃であった。
（７）阻害剤：本酵素の活性測定法において阻害剤を以下の表の濃度で添加したときの残存活性は以下の表２の通りであった。硫酸銅、クエルセチンでは阻害されなかった。
【００８１】
【表２】

【００８２】
（８）分子量：本酵素の分子量測定はＨｉ Ｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＰＧ （アマシャム・ファルマシアバイオテク製ＦＰＬＣシステム）を使用して０．１ Ｍ ＮａＣｌを含む１０ ｍＭ リン酸緩衝液 （ｐＨ ７） を用いて測定した場合、分子量約７０，０００であった。酵素のサブユニットの分子量は２％ （Ｖ／Ｖ） ２−メルカプトエタノール存在下の１０％−ＳＤＳ ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、標準タンパク質の移動度から算出した結果、約２９，０００であった。
【００８３】
〔実施例３：カルボニル還元酵素遺伝子のクローニング〕
（ＤＮＡライブラリーの作製）
レイフソニア・ナガノエンシス （Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ ｎａｇａｎｏｅｎｓｉｓ） ＪＣＭ １０５９２の培養菌体（培養方法は実施例１と同様）からキアゲン・ゲノミックチップ（キアゲン社製）を利用してゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３Ａ１で限定分解し１５〜２３ ｋｂ のＤＮＡ断片をλＦＩＸ^ＴＭＩＩファージベクタ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ 社製）のＢａｍＨＩ 部位に挿入した。得られた組換えファージベクターをＧｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いてインビトロパッケージングした後、これを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡに感染させ約５千個からなるゲノミックＤＮＡライブラリーを作製した。
【００８４】
（合成オリゴヌクレオチドプローブの作製）
実施例１のようにして得られたカルボニル還元酵素を Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ（１０％ アクリルアミド、３７５ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ ８．９）） １０〜２０ ｍＡ で電気泳動し、そのゲルを以下の組成の発色液でザイモグラフィーアッセイを行った（室温、３０分）。
発色液：
４０ｍＭトリス−塩酸 （ｐＨ ６．８） 、０．１ ｍＭ ＮＡＤ^＋ 、５ ｍＭ Ｒ−ＨＰＮＢ 、０．２ ｍｇ／ｍＬ フェナジン・メトサルファート、０．３ ｍｇ／ｍＬ ヨードニトロ・テトラゴリウム・バイオレット
この発色反応で赤くなったバンドと同じ位置のゲルを切り出し、モデル４２２ 電気溶出装置（バイオラッド社）を用いて溶出溶液（０．３％トリス、１．４４％ グリシン）中で目的活性バンドを電気溶出した。上記抽出液を ２％ （Ｖ／Ｖ） ２−メルカプトエタノール存在下の １０％−ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動しニトロセルロースメンブレンに転写した。上記ニトロセルロースメンブレンより目的酵素のバンドを切り出し、タンパク質一次配列解析装置（ＰＰＳＱ−２１） （島津製作所社）を用いて目的酵素のＮ末端アミノ酸配列を解析し、配列番号：１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １） のハイブリダイゼーション用ＤＮＡプローブを設計した。なお、解析の結果、実施例１で得られた精製カルボニル還元酵素のＮ末端アミノ酸配列は、Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ 〔配列番号：１１〕であった。
【００８５】
ハイブリダイゼーション用ＤＮＡプローブ配列〔配列番号：１〕
ＧＣＮ ＣＡＲ ＴＡＹ ＧＡＹ ＧＴＮ ＷＳＮ ＡＡＹ ＭＧＮ ＷＳＮ ＧＣＮ ＡＴＨ ＧＴＮ ＡＣＮ ＧＧＮ ＧＣＮ ＣＡＹ ＷＳＮ ＧＧＮ ＡＴＨ ＧＧＮ ＧＣＮ ＣＡＹ ＧＡＲ ＧＡＲ ＧＣＮ ＧＡＹ ＧＡＹ ＧＡＲ ＧＣＮ
（ただし、Ｒ＝Ａ／Ｇ， Ｙ＝Ｃ／Ｔ， Ｍ＝Ａ／Ｃ， Ｋ＝Ｇ／Ｔ， Ｓ＝Ｃ／Ｇ， Ｗ＝Ａ／Ｔ， Ｂ＝Ｃ／Ｇ／Ｔ， Ｄ＝Ａ／Ｇ／Ｔ， Ｈ＝Ａ／Ｃ／Ｔ， Ｖ＝Ａ／Ｃ／Ｇ 及び Ｎ＝Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ）
【００８６】
（ゲノムＤＮＡライブラリーからのカルボニル還元酵素遺伝子のクローニング）
作製したゲノミックＤＮＡライブラリーと、ジゴキシゲニン標識・検出キット（ロッシュダイアグノシティック社製）を用いて標識したハイブリダイゼーション用ＤＮＡプローブで、プラークハイブリダイゼーションを行った （Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４１， ８８３ （１９９５））。その結果得られたポジティブプラークから、ファージＤＮＡをキアゲンラムダキット（キアゲン社製）を用いて精製した。
上記方法で精製したファージＤＮＡを制限酵素Ｓａｌ Ｉ で切断し、ジゴキシゲニン標識・検出キット（ロッシュダイアグノシティック社製）を用いて標識したハイブリダイゼーション用ＤＮＡプローブとのサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、約２．５ ｋｂのＤＮＡ 断片がハイブリダイゼーション用ＤＮＡ プローブで検出できた。この２．５ ｋｂのＤＮＡ 断片をプラスミドｐＵＣ１８ （ＴＯＹＯＢＯ 社製） のＳａｌ Ｉ 切断部位にＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ （ＴＯＹＯＢＯ 社製） を使用してライゲーションし、形質転換用大腸菌ＪＭ１０９ （ＴＡＫＡＲＡ 社製） に４２℃、９０秒の温度刺激を加えて形質転換した。この大腸菌をＬＢプレート培地 （１％トリプシン、０．５％酵母抽出物、１％ ＮａＣｌ 、水道水（ｐＨ ７）、 １％ 寒天パウダー、オートクレープ １２１℃、２０分、選択マーカー：アンピシリン １００μｇ／ｍＬ） において３７℃で培養し、出現したコロニーをＬＢ培地（１％ トリプシン、０．５％酵母抽出物、１％ ＮａＣｌ 、水道水（ｐＨ ７）、オートクレープ １２１℃、２０分、選択マーカー：アンピシリン １００μｇ／ｍＬ） を用いて３７℃で培養し、ＧＦＸ マイクロ・プラスミドプレップキット（アマシャム・ファルマシア社製）を用いて大腸菌からプラスミドを精製した。このプラスミドを ”ｐＡＦＮ３”と命名した。
【００８７】
（塩基配列の決定）
上記、プラスミドｐＡＦＮ３ の挿入遺伝子部分（２．５ ｋｂ）をＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ． ３（アプライドバイオシステムズ社製）とＡＢＩ プリズム３１０ ジェネティックアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて解析した。その結果、配列番号：２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２） に示した目的酵素の遺伝子配列を確認した。配列番号：２の遺伝子配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号：３ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３） に示す。
【００８８】
〔実施例４：カルボニル還元酵素遺伝子を導入した組換えプラスミドの作製〕
大腸菌において上記カルボニル還元酵素遺伝子を発現させるための組換えプラスミドの作製を行った。配列番号： ４ 及び ５ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ４ ＆ ５）に示すプライマーを使用してプラスミドｐＡＦＮ３ を鋳型にＰＣＲ によってＡＦＮ 遺伝子を増幅し、その開始コドンにＳｐｈ Ｉ 終始コドンにＨｉｎｄ ＩＩＩ制限酵素配列を付加した。ＰＣＲ 条件は以下の通りである。ＰＣＲ 反応液（０．２ ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１ ｍＭ ＭｇＳＯ_４ ０．３ μＭ プライマー、１０〜２００ｎｇ 鋳型ＤＮＡ 、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （ＴＯＹＯＢＯ 社製） １ ｕｎｉｔ／５０μＬ−反応溶液、１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ １／１０− 反応溶液、滅菌水）をＰＣＲ 装置：マスターサイクラーグラディエント（エッペンドルフ社製）を使用して９４℃・１５秒→［ ５５℃・３０秒→６８℃・１分］ ×３０サイクルでＰＣＲ 反応を行った。
【００８９】
５’−ＧＴＣＣＧＴＧＧＧＣＧＣＡＴＧＣＧＣＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＧＣＧ−３’ 〔配列番号：４〕
５’−ＧＡＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＣＧＡＴＣＡＧＧＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＧ−３’ 〔配列番号：５〕
【００９０】
上記方法で増幅したカルボニル還元酵素遺伝子を制限酵素Ｓｐ ｈＩ 、ＨｉｎｄＩＩＩ で切断し、プラスミドｐＱＥ７０ （キアゲン社製）のＳｐｈ Ｉ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位（Ｔ５プロモータ下流）にＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ （ＴＯＹＯＢＯ 社製） を使用してライゲーションし、形質転換用大腸菌ＪＭ１０９ （ＴＡＫＡＲＡ 社製） に４２℃、９０秒の温度刺激を加えて形質転換した。この大腸菌をＬＢプレート培地（選択マーカー：アンピシリン １００μｇ／ｍＬ）を使用して３７℃で培養し、出現したコロニーをＬＢ培地（選択マーカー：アンピシリン １００μｇ／ｍＬ）を用いて３７℃で培養し、ＧＦＸ マイクロ・プラスミドプレップキット（アマシャム・ファルマシア社製）を用いて大腸菌からプラスミドを精製した。このプラスミドを ”ｐＡＦＮ１１” と命名した。
【００９１】
実施例５：カルボニル還元酵素遺伝子を形質転換した組換え大腸菌の作製
実施例４で作製した組換えプラスミドを大腸菌Ｍ１５（ｐＲＥＰ４）（キアゲン社製）に形質転換し大腸菌Ｍ１５（ｐＲＥＰ４， ｐＡＦＮ１１）を作製した。この形質転換体Ｍ１５（ｐＲＥＰ４， ｐＡＦＮ１１）は受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１９２７６ として平成１５年３月２８日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に寄託されている。
【００９２】
〔実施例６：カルボニル還元酵素遺伝子を形質転換した組換え大腸菌によるカルボニル還元酵素活性の測定〕
実施例５で作製した組換え大腸菌をＬＢ培地（１％トリプトン、 ０．５％ 酵母抽出物、１％ ＮａＣｌ 、水道水（ｐＨ ７）、オートクレーブ １２１℃、２０分、選択マーカー：アンピシリン １００μｇ／ｍＬ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ）で培養し、ＯＤ_６１０ が ０．４〜０．６ の間で １ ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、ＯＤ_６１０＞１ に達したら遠心分離で菌体を沈殿させた。さらに、１０ ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ６）で菌体を懸濁し超音波破砕機（日本精機製作所社製、ＵＳ−３００）で破砕し、遠心分離で細胞残渣を取り除いた無細胞抽出液を得た。この抽出液の活性を実施例１に記した活性測定方法を使用して測定した。この方法で測定したときの値は、カルボニル還元酵素遺伝子を形質転換していない大腸菌Ｍ１５（ｐＲＥＰ４）の活性を１００％とすると、大腸菌Ｍ１５（ｐＲＥＰ４， ｐＡＦＮ１１）の活性は ２４０〜４９０％であった。
【００９３】
〔実施例７：カルボニル還元酵素遺伝子および補酵素再生系酵素（グルコースデヒドロゲナーゼ、ＧＤＨ）遺伝子を挿入したプラスミドの作製〕
（補酵素再生遺伝子（グルコースデヒドロゲナーゼ、ＧＤＨ）のクローニング）
すでに発表されているＧＤＨ 遺伝子 （ＤＤＢＪ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｍ１２２７６）の遺伝子配列をもとに配列番号： ６ 及び ７ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ６ ＆ ７）に示したプライマーを用いて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＦＯ ３０２６株からキアゲン・ゲノミックチップ（キアゲン社製）を使用して抽出したゲノムＤＮＡ を鋳型としてＧＤＨ 遺伝子をＰＣＲ で増幅した。ＰＣＲ 条件は以下の通りである。ＰＣＲ 反応液（０．２ ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１ ｍＭ ＭｇＳＯ_４ 、０．３ μＭ プライマー、１０〜２００ｎｇ 鋳型ＤＮＡ 、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （ＴＯＹＯＢＯ 社製） １ｕｎｉｔ／５０μＬ−反応溶液、１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ １／１０− 反応溶液、滅菌水）をＰＣＲ 装置：マスターサイクラーグラディエント（エッペンドルフ社製）を使用して９４℃・１５秒→［ ５５℃・３０秒→６８℃・１分］ ×３０サイクルでＰＣＲ 反応を行った。
【００９４】
５’−ＧＡＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＣＡＴＧＴＡＴＣＣＡＧＡＴＴＴＡ−３’〔配列番号：６〕
５’−ＧＧＴＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＡＡＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧＣＣ−３’ 〔配列番号：７〕
【００９５】
増幅したＧＤＨ 遺伝子には、開始コドンにＥｃｏＲＩ、終始コドンにＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素切断配列が付加されている。増幅したＧＤＨ 遺伝子をＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、プラスミドｐＵＣ１８ のＥｃｏＲ Ｉ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 部位にＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ （ＴＯＹＯＢＯ 社製） を使用してライゲーションし、形質転換用大腸菌ＪＭ１０９ （ＴＡＫＡＲＡ 社製） に４２℃、９０秒の温度刺激を加えて形質転換した。この大腸菌をＬＢプレート培地（選択マーカー：アンピシリン １００μｇ／ｍＬ）を使用して３７℃で培養し、出現したコロニーをＬＢ培地（選択マーカー：アンピシリン １００μｇ／ｍＬ）を用いて３７℃で培養し、ＧＦＸ マイクロ・プラスミドプレップキット（アマシャム・ファルマシア社製）を用いて大腸菌からプラスミドを精製した。このプラスミドを ”ｐＵＣ−ＧＤＨ１” と命名した。上記方法でクローニングしたＧＤＨ 遺伝子の遺伝子配列をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ． ３ （アプライドバイオシステムズ社製）と ＡＢＩプリズム３１０ ジェネティックアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて解析した。その結果、図１及び配列番号： ８ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８）に示したＧＤＨ 酵素の遺伝子配列を確認した。
【００９６】
（ＧＤＨ 遺伝子組換え大腸菌の作製）
上記ＧＤＨ 遺伝子を導入したプラスミドｐＵＣ−ＧＤＨ１を形質転換用大腸菌Ｍ１５ （ｐＲＥＰ４） （キアゲン社製）に４２℃、９０秒の温度刺激を加えて形質転換しＬＢプレート培地（選択マーカー：アンピシリン １００μｇ／ｍＬ、カナマイシン ２５ μｇ／ｍＬ）を使用して３７℃で培養し、出現したコロニーをＬＢ培地（選択マーカー：アンピシリン １００μｇ／ｍＬ、カナマイシン ２５ μｇ／ｍＬ）を用いて３７℃で培養し大腸菌Ｍ１５ （ｐＲＥＰ４、ｐＵＣ−ＧＤＨ１） を作製した。この大腸菌をＬＢ培地（選択マーカー：アンピシリン １００μｇ／ｍＬ、カナマイシン ２５ μｇ／ｍＬ）で培養し（３７℃）、ＯＤ_６１０ が ０．４〜０．６ の間に １ ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド）を添加しＯＤ_６１０＞１になるまで培養した。
この大腸菌を超音波破砕機（日本精機製作所社製、ＵＳ−３００）を使用して破砕し遠心分離で細胞残渣を取り除いた無細胞抽出液を用いて活性を測定した。
【００９７】
（ＧＤＨ 活性測定方法）
ＧＤＨ 活性の測定は１００ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ６．０）に、基質としてグルコース ０．１ Ｍ， 補酵素として２．５ ｍＭ ＮＡＤ^＋ および無細胞抽出液（２０μＬ／ｍＬ反応溶液）を添加し２５℃で波長３４０ｎｍ の吸光度の増加を測定することにより行った。この反応条件において、１分間に １μｍｏｌ の ＮＡＤ^＋ をＮＡＤＨに還元する酵素活性を１ ｕｎｉｔと定義した。測定の結果、大腸菌Ｍ１５（ｐＲＥＰ４， ｐＵＣ−ＧＤＨ１）のＧＤＨ 活性はコントロールとなるＧＤＨ 遺伝子導入プラスミドが形質転換されていないＭ１５（ｐＲＥＰ４）に比べて５倍以上になった。
【００９８】
（カルボニル還元酵素遺伝子、ＧＤＨ 遺伝子共発現組換えプラスミドの作製）
上記方法でクローニングしたＧＤＨ 遺伝子をカルボニル還元酵素遺伝子と共発現させるためのプラスミドを作製した。ＧＤＨ 遺伝子をクローニングしたプラスミドｐＵＣ−ＧＤＨ１を鋳型にして配列番号： ９ 及び １０ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ９ ＆ １０）で示したプライマーを作製しＰＣＲ によって、ＧＤＨ の開始コドンと終始コドンにそれぞれＨｉｎｄ ＩＩＩ制限酵素切断配列を付加した。ＰＣＲ の条件は以下の通りである。ＰＣＲ 反応液（０．２ ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１ ｍＭ ＭｇＳＯ_４ 、 ０．３μＭ プライマー、１０〜２００ｎｇ 鋳型ＤＮＡ 、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （ＴＯＹＯＢＯ 社製） １ｕｎｉｔ／５０μＬ−反応溶液、１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ １／１０− 反応溶液、滅菌水）をＰＣＲ 装置：マスターサイクラーグラディエント（エッペンドルフ社製）を使用して９４℃・１５秒→［ ６２℃・３０秒→６８℃・１分］ ×３０サイクルでＰＣＲ 反応を行った。
【００９９】
５’−ＡＡＡＡＡＧＣＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＧＧＡＴＴＴＡ−３’ 〔配列番号：９〕
５’−ＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧＣＣＴＧ−３’〔配列番号：１０〕
【０１００】
増幅したＧＤＨ 遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩ で切断したＤＮＡ断片を、カルボニル還元酵素遺伝子を導入した組換えプラスミドｐＡＦＮ１１のＨｉｎｄ ＩＩＩ部位にＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ （ＴＯＹＯＢＯ 社製） を使用してライゲーションし、形質転換用大腸菌ＪＭ１０９ （ＴＡＫＡＲＡ 社製） に４２℃、９０秒の温度刺激を加えて形質転換した。この大腸菌をＬＢプレート培地（選択マーカー：アンピシリン １００μｇ／ｍＬ）を使用して３７℃で培養し、出現したコロニーをＬＢ培地（選択マーカー：アンピシリン １００μｇ／ｍＬ）を用いて３７℃で培養し、ＧＦＸ マイクロ・プラスミドプレップキット（アマシャム・ファルマシア社製）を用いて大腸菌からプラスミドを精製した。このプラスミドのＧＤＨ 遺伝子の挿入向きを配列番号：９及び１４で示したプライマーを用いてＰＣＲ によって確認した。ＰＣＲ の条件は以下の通り。ＰＣＲ 反応液（０．２ ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１ ｍＭ ＭｇＳＯ_４ 、０．３ μＭプライマー、１０〜２００ｎｇ 鋳型ＤＮＡ 、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （ＴＯＹＯＢＯ 社製） １ｕｎｉｔ／５０μＬ−反応溶液、１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ １／１０− 反応溶液、滅菌水）をＰＣＲ 装置：マスターサイクラーグラディエント（エッペンドルフ社製）を使用して９４℃・１５秒→［ ６２℃・３０秒→６８℃・１分］ ×３０サイクルでＰＣＲ 反応を行った。このＰＣＲ によって約０．８ ｋｂのＤＮＡ 断片が増幅されるプラスミドを、カルボニル還元酵素遺伝子、補酵素再生遺伝子（ＧＤＨ 遺伝子）共発現組換えプラスミド ”ｐＡＦＮ−ＧＤＨ” と命名した。
５’−ＧＴＴＣＴＧＡＧＧＴＣＡＴＴＡＣＴＧＧ−３’ 〔配列番号：１４〕
【０１０１】
〔実施例８：カルボニル還元酵素およびＧＤＨ 酵素遺伝子を有する形質転換体の作製〕
上記方法で作製した組換えプラスミドｐＡＦＮ−ＧＤＨを形質転換用大腸菌Ｍ１５ （ｐＲＥＰ４） （キアゲン社製）に４２℃、９０秒の温度刺激を加えて形質転換しＬＢプレート培地（選択マーカー：アンピシリン １００μｇ／ｍＬ、カナマイシン ２５ μｇ／ｍＬ）を使用して３７℃で培養し、出現したコロニーをＬＢ培地（選択マーカー：アンピシリン １００μｇ／ｍＬ）を用いて３７℃で培養し大腸菌Ｍ１５ （ｐＲＥＰ４、ｐＡＦＮ−ＤＨ）を作製した。この形質転換体Ｍ１５（ｐＲＥＰ４、ｐＡＦＮ−ＧＤＨ） は受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１９２７７ として平成１５年３月２８日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に寄託されている。
【０１０２】
〔実施例９：本酵素遺伝子を挿入したプラスミドを導入した形質転換体による不斉還元反応〕
実施例５および８で作製した組換え大腸菌Ｍ１５（ｐＲＥＰ４， ｐＡＦＮ１１）およびＭ１５（ｐＲＥＰ４ 、ｐＡＦＮ−ＧＤＨ） をＬＢ培地（選択マーカー：アンピシリン １００μｇ／ｍＬ、カナマイシン ２５ μｇ／ｍＬ）で培養、ＯＤ６１０ が ０．４〜０．６ の間で １ ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、ＯＤ_６１０ ＞１に達した後、遠心分離で菌体を沈殿させ、１０ ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ６）で菌体を懸濁し超音波破砕機（日本精機製作所社製、ＵＳ−３００） で破砕した。遠心分離で細胞残渣を取り除いた無細胞抽出液、または細胞を破砕する前の菌体懸濁液を用いて以下の組成で反応を実施させた。
組成；０．１％ ２−アセトニルオキシ−３，４−ジフルオロニトロベンゼン、２ ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１００ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ６）、無細胞抽出液、または菌体懸濁液酵素溶液（３０℃、３時間〜一晩）
生成物を酢酸ブチルで抽出しヘキサン／ＩＰＡ／ＴＦＡ＝１００／２／０．１ の移動相を用いてダイセル：キラルセルＯＪカラム、０．８ ｍＬ／ｍｉｎの流速でＨＰＬＣによる反応生成物の評価を行った。上記方法で２−アセトニルオキシ−３，４−ジフルオロニトロベンゼンを基質としたときの３，４−ジフルオロ−２−（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピルオキシ）ニトロベンゼンの生成をＨＰＬＣで確かめたところ、標準品の３，４−ジフルオロ−２−（Ｒ）−２−ヒドロキシプロピルオキシ）ニトロベンゼンとほぼ同じ溶出時間に生成産物のピークが認められた。
【０１０３】
【発明の効果】
本発明は、特徴的な性状を示すカルボニル還元酵素を同定し、さらに該酵素をコードする遺伝子をクローニングし、工業的に該酵素を利用するための技術を提供している。本発明で、組換え酵素あるいは該酵素遺伝子で形質転換された宿主細胞を利用することで、カルボニル基含有化合物を還元してアルコール化合物を製造するための工業的に有利な方法が提供される。本発明の酵素を利用して、光学純度の高い光学活性アルコール化合物を効率的に生産できる。
本発明は、前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、実行できることは明らかである。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。
＜配列表フリーテキスト＞
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ＤＮＡ ｐｒｏｂｅ， ｗｈｅｒｅｉｎ ｎ ｓｔａｎｄｓ ｆｏｒ Ａ ｏｒ Ｇ ｏｒ Ｃ ｏｒ Ｔ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】クローニングしたグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子並びにそれによりコードされるアミノ酸配列を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an enzyme having a carbonyl reducing activity for asymmetrically reducing a carbonyl compound to generate an optically active alcohol, a gene encoding the enzyme, a plasmid (or vector) having the enzyme gene, the plasmid (or vector) ) And a method for producing an optically active alcohol by using the enzyme or the transformant. The present invention relates to a technique for using the enzyme and a gene encoding the enzyme. The present invention provides a technique for asymmetrically providing an optically active alcohol, such as an optically active 4-halo-3-hydroxybutyrate, an optically active hydroxy-phenoxypropane derivative, which is a compound useful as an intermediate of a pharmaceutical or the like. About.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, many carbonyl reductases are known, but as a microorganism which acts on 4-haloacetoacetate to produce (S) -4-halo-3-hydroxybutyrate, an enzyme derived from Geotricum candy dam is used. Method (Enzyme Microb. Technol., Vol. 14, 731, 1992 [Non-Patent Document 1]), and a method using an enzyme derived from Candida parapsilosis (Enzyme Microb. 2]), a method using an enzyme derived from Candida magnoliae (WO 98/35025 pamphlet [Patent Document 1]), a method using an enzyme derived from Kleiberomyces estuary (Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2000-236883 [ Patent Document 2]) etc. Have been reported, it has been required more industrially available efficient manner.
[0003]
In addition, an important intermediate (S)-(−)-7,8-difluoro-3-methyl-3,4-dihydro-2H- [1,4] benzoxazine derivative in the production of levofloxacin, an excellent synthetic antibacterial agent, is efficiently used. For good production, there is a demand for the development of a production method for easily and efficiently producing an optically active hydroxy-phenoxypropane derivative which is a useful production intermediate in the production. In addition, it is possible to use a starting material which can be obtained at a low cost, is easy to process and operate, generates little by-products, and has high chemical, high optical purity and optical yield, and has an optically active hydroxy-phenoxypropane derivative. There is a need for a method of manufacturing.
Phenoxyacetone derivatives have attracted attention as inexpensive starting materials, and some methods for producing optically active hydroxy-phenoxypropane derivatives from the phenoxyacetone derivatives have already been reported. Compared to the chemical synthesis method, it is expected that it can be performed without complicated optical resolution, complicated asymmetric synthesis using expensive catalysts, etc. Are also expected to be advantageous.
[0004]
However, when baker's yeast or the like is used as a microorganism, only the S form is preferentially produced, which is a problem in obtaining an R form useful as an intermediate for the production of levofloxacin (Acta. Chem. Scand., 48 (6): 506 (1994) [Non-Patent Document 3]). Thus, very few microorganisms have the ability to act on the phenoxyacetone derivative to produce the optically active hydroxy-phenoxypropane derivative in the R form, and there are still very few microorganisms having the ability to strictly R-selectively reduce. It has also been pointed out that it has not been found (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-175693 [Patent Document 3]).
For example, a method for R-selective reduction of 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene using a filamentous fungus (JP-A-3-183489 [Patent Document 4]), which belongs to the genus Corynebacterium Method for R-selective reduction of 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene using a microorganism (Japanese Unexamined Patent Publication No. 5-68577 [Patent Document 5]), a microorganism belonging to the genus Thermoanerobacter There is known a method for R-selective reduction of phenoxyacetone using a compound (JP-A-8-266292 [Patent Document 6]). However, since the optical purity of the product is low, the efficiency is further improved. A good way is needed.
[0005]
In addition, a method for reducing 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene using a microorganism belonging to the genus Candida is also known, but the microorganism used here is Candida magnolia IFO. Recombinant Escherichia coli transformed with a plasmid having DNA encoding carbonyl reductase from No. 0705, and not necessarily from a native (native or non-recombinant) microorganism, and not necessarily to a satisfactory R-selective reduced production A product cannot be obtained (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-175693 [Patent Document 3]).
When microbial cells are used, the optical purity of the product may be reduced due to the coexistence of S-selective carbonyl reductase in the cells. Therefore, there is also known a method aimed at R-selective reduction of phenoxyacetone or the like using a purified R-selective alcohol dehydrogenase, a coenzyme, and an enzyme necessary for regenerating the coenzyme. However, the optical purity is not sufficiently high and an expensive purified enzyme is used, so that it is hard to say that this is a realistic production method (US Pat. No. 5,385,833 [Patent Document 7]).
Many of these disclosed microorganisms do not necessarily have enzyme activity that can be immediately industrially used.In order to increase the enzyme activity of the microorganism to an industrially practicable level, Complicated and difficult studies involving a long time are required for culture conditions, activity induction conditions, and the like.
[0006]
[Patent Document 1]
WO 98/35025 pamphlet (WO, A, 98/35025)
[Patent Document 2]
JP 2000-236883A (JP, A, 2000-236883)
[Patent Document 3]
JP-A-2000-175693
[Patent Document 4]
JP-A-3-183489
[Patent Document 5]
JP-A-5-68577
[Patent Document 6]
JP-A-8-266292
[Patent Document 7]
U.S. Pat. No. 5,385,833
[Non-patent document 1]
Enzyme Microb. Technol. , Vol. 14, 731, 1992
[Non-patent document 2]
Enzyme Microb. Technol. , Vol. 15, 950, 1993
[Non-Patent Document 3]
Acta. Chem. Scand. , 48 (6): 506 (1994).
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, the method for producing an optically active alcohol compound selectively by asymmetric reduction of a carbonyl group-containing compound is a method that is noted for obtaining useful organic synthesis starting materials and production intermediates. There is a strong demand for the development of a technique for producing an optically active alcohol compound by simply and efficiently performing an asymmetric reduction reaction.
A method using a microorganism or an enzyme produced by the microorganism has the potential of being easy to process and operate, producing little by-products, and being efficient, and its development is expected. However, the conventional methods using microorganisms or the like cannot 1) easily obtain a product having high optical purity required as a raw material for pharmaceuticals, 2) have low substrate concentration, and thus have low productivity 3). It is not satisfactory in terms of stable supply of microorganisms and enzymes used and stability of activity. 4) Use expensive purified enzymes. 5) In terms of conversion to desired products and optical purity of desired products. Both methods have points to be improved as industrial methods, such as not being satisfactory.
Further, a method for producing an optically active alcohol compound with a high optical purity and an optical yield, which can use a starting material which can be obtained at a low cost, is simple in processing and operation, generates few by-products, and is required. ing.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the conventional problems, it is possible to overcome the improvements such as the conversion rate to the desired product and the optical purity of the desired product, and to obtain an excellent optically active phenoxypropane derivative using a microorganism. A production method was found (Japanese Patent Application No. 2002-298544).
The present inventors have focused on enzymes having particularly excellent properties among enzymes involved in this reaction, and have conducted intensive research, and have succeeded in purifying and further specifying the enzymes.
The present inventors have found a novel carbonyl reductase derived from the genus Leifsonia, cloned and identified a gene encoding the enzyme, and further used the enzyme to obtain optically active hydroxy-phenoxypropane derivatives and the like. It has been found that an optically active alcohol compound can be efficiently produced.
That is, the present invention provides a novel carbonyl reductase, a gene encoding the enzyme, a plasmid (or vector) having the enzyme gene, a transformant transformed with the plasmid (or vector), and the enzyme and / or A method for producing an optically active phenoxypropane derivative using the transformant is provided. The present invention purifies and specifies the carbonyl reductase derived from Leifsonia. The enzyme of the present invention is an enzyme characterized by having the ability to asymmetrically reduce a carbonyl group to convert to an optically active alcohol compound. The enzymes of the present invention also have the ability to act on 4-haloacetoacetates to produce (S) -4-halo-3-hydroxybutyrate.
[0009]
The carbonyl reductase of the present invention has at least the following physicochemical properties:
(1) Action:
Acts on 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene to produce 3,4-difluoro-2-((R) -2-hydroxypropyloxy) nitrobenzene.
Shows high selectivity for asymmetric reduction.
(2) Substrate specificity:
It has high reducing activity against 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene and ethyl 4-chloroacetoacetate.
(3) Optimal pH:
pH 5.5-6.0
(4) Optimal temperature:
About 50 ° C
(5) Molecular weight:
About 70,000 in gel filtration analysis and about 29,000 in SDS polyacrylamide electrophoresis analysis.
Possess the characteristics and properties selected from the group consisting of
The carbonyl reductase of the present invention has, in addition to the features and properties described above, at least the following:
(6) Coenzyme:
Both NADPH and NADH can be used as coenzymes.
(7) pH stability:
pH 5.5-9.0 (25 ° C, 2 hr)
Possess the characteristics and properties selected from the group consisting of
[0010]
The present invention provides the following.
[1] It is derived from a microorganism of the genus Leifsonia, exhibits asymmetric reduction activity, and acts on at least 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene to produce 3,4-difluoro-2-((R) -2-hydroxy A carbonyl reductase having an activity of specifically producing propyloxy) nitrobenzene.
[2] Physical and chemical properties shown below:
(1) Action:
Acts on 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene to produce 3,4-difluoro-2-((R) -2-hydroxypropyloxy) nitrobenzene and has high selectivity for asymmetric reduction. Show
(2) Substrate specificity:
High reduction activity for 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene and ethyl 4-chloroacetoacetate
(3) Molecular weight:
About 70,000 in gel filtration analysis and about 29,000 in SDS polyacrylamide electrophoresis analysis.
A carbonyl reductase comprising:
[3] (A) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and acting on 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene, 3,4-difluoro-2-((R) -2- A protein having an enzymatic activity for producing hydroxypropyloxy) nitrobenzene, and
(B) has an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted, and / or added to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and is 2-acetonyloxy-3,4- A protein having an enzymatic activity exhibiting asymmetric reduction selectivity equivalent to the activity of acting on difluoronitrobenzene to generate 3,4-difluoro-2-((R) -2-hydroxypropyloxy) nitrobenzene
A protein having carbonyl reductase activity, which is selected from the group consisting of:
[0011]
[4] (A) a protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2,
(B) encoded by a DNA capable of hybridizing under stringent conditions to a DNA consisting of at least 20 consecutive sequences in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and 2-acetonyloxy A protein having an enzymatic activity that acts on -3,4-difluoronitrobenzene to produce 3,4-difluoro-2-((R) -2-hydroxypropyloxy) nitrobenzene;
(C) having an amino acid sequence having 70% or more homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and acting on 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene, A protein having an enzymatic activity for producing-((R) -2-hydroxypropyloxy) nitrobenzene, and
(D) encoded by a DNA consisting of a nucleotide sequence having 70% or more homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and acting on 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene, Protein having enzymatic activity to produce difluoro-2-((R) -2-hydroxypropyloxy) nitrobenzene
A protein having carbonyl reductase activity, which is selected from the group consisting of:
[5] A nucleic acid such as a DNA, which encodes the enzyme or protein according to any one of the above [1] to [4].
[6] A recombinant plasmid or vector into which the nucleic acid such as the DNA according to [5] has been incorporated.
[7] The recombinant plasmid or vector according to the above [6], further comprising a coenzyme regenerating enzyme gene inserted therein.
[8] A transformant characterized by being transformed with a nucleic acid such as the DNA according to [5] or the recombinant plasmid or vector according to [6] or [7].
[0012]
[9] The method for producing the carbonyl reductase according to [1] or [2] or the protein according to [3] or [4], comprising culturing the transformant according to [8].
[10] General formula (I):
Embedded image

(Wherein Xa and Xb may be the same or different and are each a halogen atom), and the phenoxyacetone derivative represented by the above-mentioned [1] to [4], An optically active substance characterized in that it is treated in the presence of cells selected from the group consisting of cells of a transformed microorganism having an enzyme-producing ability, a culture thereof, a processed product thereof, and an extract. Formula (II):
Embedded image

(Wherein, Xa and Xb have the same meanings as described above), or a method for producing a phenoxypropane derivative represented by the general formula (III):
Embedded image

(Where R ₁ And R ₂ Is each independently a hydrogen atom, a halogen atom or an alkyl group; ₃ Is a substituted or unsubstituted alkyl group or aryl group) with the enzyme according to any one of the above [1] to [4], or an enzyme capable of producing the enzyme; An optically active general formula (IV) characterized in that it is treated in the presence of a cell selected from the group consisting of cells of a transformed microorganism, cultures thereof, processed products thereof and extracts.
Embedded image

(Where R ₁ , R ₂ And R ₃ Has the same meaning as described above).
[0013]
Further, the present invention provides
[11] In addition, additionally, the following physicochemical properties:
(3) Optimum pH: pH 5.5 to 6.0
(4) Optimum temperature: about 50 ° C
(5) Molecular weight: about 70,000 in gel filtration analysis, about 29,000 in SDS polyacrylamide electrophoresis analysis
(6) Coenzyme: Both NADPH and NADH can be used as coenzymes
(7) pH stability: pH 5.5 to 9.0 (25 ° C, 2 hr)
The carbonyl reductase according to the above [1], which has a property selected from the group consisting of:
[0014]
[12] The enzyme or protein according to any one of [1] to [4] and [11], which is an enzyme or protein derived from a microorganism of the genus Leifsonia.
[13] The enzyme or protein according to any one of [1] to [4] and [11], which is an enzyme or protein obtained from Leifsonia Naganoensis.
[14] The enzyme or protein according to any one of [1] to [4] and [11] above, which is an enzyme or protein obtained from Leifsonia Naganoensis JCM 10592.
[15] The coenzyme regeneration system enzyme is characterized in that it is selected from the group consisting of glucose dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, formate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase, amino acid dehydrogenase and organic acid dehydrogenase. The recombinant plasmid or vector according to [7] above.
[16] The recombinant plasmid or vector according to [7], wherein the coenzyme regenerating enzyme is glucose dehydrogenase.
[17] The recombinant plasmid or vector according to [16], wherein the glucose dehydrogenase is derived from Bacillus subtilis.
[0015]
[18] the transformant of the above-mentioned [8], wherein the host cell is Escherichia coli or a microorganism of the genus Leifsonia;
[19] The method for producing a carbonyl reductase or a protein according to the above [9], which comprises a step of culturing the transformant according to the above [8] or [18].
[20] The enzyme or protein according to any one of the above [1] to [4], a cell of a transformed microorganism capable of producing the enzyme, a culture thereof, and a carbonyl group-containing compound. A reduction method in the presence of a substance selected from the group consisting of a treated product and an extract to produce an alcohol compound.
[21] The method of the above-mentioned [10] or [20], wherein the microorganism is the transformant of the above-mentioned [8] or [18].
[22] An optically active phenoxypropane derivative represented by the general formula (II) (wherein Xa and Xb have the same meaning as in the above [10]) is produced by the production method described in the above [10], Next, the obtained phenoxypropane derivative (II) is treated according to a known method to give 2,3-difluoro-6- (2,2-diethoxycarbonylethenyl) amino-((R) -2- (methane A process for producing sulfonyloxy) propyloxy) benzene;
[0016]
[23] A known method is disclosed in a method selected from the group consisting of Japanese Patent No. 261327 (or JP-A-2-732), JP-A-1-250369 and JP-A-1-2877096. The production method according to the above [22], which is a method of the above [22];
[24] An optically active phenoxypropane derivative represented by the general formula (II) (wherein Xa and Xb have the same meaning as in the above [10]) is produced by the production method described in the above [10], The obtained phenoxypropane derivative (II) is subjected to the following processes (a) to (d) in combination:
(A) reduction of a nitro group,
(B) methylene malonation reaction,
(C) a sulfonyloxylation reaction, and
(D) Removal of protecting group
The above-mentioned [22] or [22], wherein 2,3-difluoro-6- (2,2-diethoxycarbonylethenyl) amino-((R) -2- (methanesulfonyloxy) propyloxy) benzene is obtained. 23] The production method described above;
[25] An optically active phenoxypropane derivative represented by the general formula (II) (wherein Xa and Xb have the same meaning as in the above [10]) is produced by the production method described in the above [10], Next, the obtained phenoxypropane derivative (II) is treated according to a known method to give S-(-)-9-fluoro-3-methyl-10- (4-methyl-1-piperazinyl) -7-oxo- A process for producing levofloxacin, which comprises obtaining 2,3-dihydro-7H-pyrido [1,2,3, -de] [1,4] benzoxazine-6-carboxylic acid (levofloxacin);
[0017]
[26] The known method comprises Japanese Patent No. 261327 (or JP-A-2-732), JP-A-1-250369, JP-A-1-2877096 and JP-A-2-218648. The method according to the above [25], which is a method disclosed in a member selected from the group; and
[27] An optically active phenoxypropane derivative represented by the general formula (II) (wherein Xa and Xb have the same meaning as in the above [10]) is produced by the production method described in the above [10], The obtained phenoxypropane derivative (II) is performed by combining the following treatments (a) to (g):
(A) reduction of a nitro group,
(B) methylene malonation reaction,
(C) sulfonyloxylation reaction,
(D) an oxazine ring forming reaction,
(E) Pyridine ring formation reaction
(F) N-methylpiperidine introduction reaction, and
(G) Free carboxyl group formation reaction by removal of protecting group and / or hydrolysis of ester
The method according to the above [25] or [26], wherein levofloxacin is obtained.
[0018]
Other objects, features, advantages and aspects of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the following description. However, it should be understood that the description of the present specification, including the following description and the description of the specific examples and the like, shows preferred embodiments of the present invention and is given only for explanation. I want to. Various changes and / or alterations (or modifications) within the spirit and scope of the present invention disclosed herein will be apparent to those skilled in the art, based on the following description and knowledge from other portions of the present specification. Will be readily apparent. All patents and references cited herein are cited for explanatory purposes, which are to be construed as being incorporated herein by reference. is there.
[0019]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The carbonyl reductase according to the present invention acts on 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene to produce 3,4-difluoro-2-((R) -2-hydroxypropyloxy) nitrobenzene (highly active). Asymmetric selective reduction activity). The enzyme is characterized by selectively providing the R-form of 3,4-difluoro-2-((R) -2-hydroxypropyloxy) nitrobenzene. The enzyme is characterized by being able to utilize reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) as a coenzyme, and also by being able to utilize reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) as a coenzyme. Characterized.
[0020]
In the present invention, the reduction activity for 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene can be confirmed as follows.
2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene reduction activity measuring method:
Solution containing phosphate buffer (pH 6.0, 100 mM), NADPH (0.2 mM), 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene (0.02% by weight) and enzyme (20 to 200 μL / mL) Is reacted at 25 ° C. by incubation, and the decrease in absorbance at 340 nm accompanying the decrease in NADPH is measured. Under these reaction conditions, 1 μmol of NADPH is converted into NADP per minute. ⁺ The enzymatic activity that catalyzes the conversion to is defined as 1 unit (1U). Protein quantification is performed using a commercially available protein assay kit, for example, by a dye binding method, and can also be performed using an automatic protein analyzer.
Further, the carbonyl reductase of the present invention shows higher enzyme activity when giving NADH than NADPH. That is, it has a significantly higher activity than NADPH against NADH as an electron donor. Which electron donor is suitable as a coenzyme can be clarified by comparing and examining only the electron donor under the above conditions. In the present specification, the term "stable" means that the enzyme has 90% or more of the remaining activity at pH 6.0 at 25 ° C for 2 hours before treatment, or more.
[0021]
The carbonyl reductase having the above-mentioned physicochemical properties can be purified, for example, from a culture of a genus Leifsonia. As the Leifsonia genus, Leifsonia naganoensis is particularly excellent in the ability to produce the carbonyl reductase according to the present invention. Leifsonia Naganoensis that can be used to obtain the carbonyl reductase of the present invention can be obtained, for example, from RIKEN (JCM) as JCM 10592.
The microorganism is cultured in a general medium used for culturing microorganisms such as a GPY medium. The culture medium is not particularly limited as long as the bacterium can grow. For example, a liquid nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, organic nutrients, and the like can be used. After sufficient growth, the cells are collected (for example, collected by centrifugation) and disrupted in a buffer solution (for example, physical disruption using glass beads, ultrasonic treatment, or biochemistry by enzyme, etc.). Method) to obtain a cell-free extract. Fractionation based on protein solubility (precipitation with organic solvent or salting out with ammonium sulfate, etc.) from cell-free extract, dialysis, cation exchange chromatography, anion exchange chromatography, gel filtration, hydrophobic chromatography, chelate And affinity chromatography using dyes, antibodies, or the like, alone or in appropriate combination. For example, high performance liquid chromatography such as anion exchange chromatography using DEAE-Sepharose, affinity chromatography using Blue-Sepharose, Mono Q HR 5/5 (FPLC system, Amersham Pharmacia Biotech) and the like. It can be purified electrophoretically to almost a single band via a system or the like.
The carbonyl reductase of the present invention can be obtained from a microorganism capable of producing the carbonyl reductase, and the microorganism may be either a wild-type strain or a mutant strain. Further, microorganisms or other cells (including, for example, transformed cells) induced by genetic manipulation or genetic techniques such as cell fusion or gene recombination techniques are also used.
[0022]
In the present invention, a predetermined nucleic acid / polynucleotide or the like can be isolated and sequenced, a recombinant can be prepared, or a predetermined protein / peptide can be obtained by utilizing “gene recombination technology”. Genetic recombination techniques that can be used herein include those known in the art. Sambrook et al. , "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2nd Edition, 1989 & 3rd Ed., 3rd Ed. M. Glover et al. ed. , "DNA Cloning", 2nd ed. , Vol. 1 to 3, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); "Methods in Enzymology" series, Academic Press. Wu ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); Wu et al. ed. , "Methods in Enzymology", Vol. R. 100 (Recombinant DNA, Part B) & 101 (Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); Wu et al. ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987); Wu ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 216 (Recombinant DNA, Part G), Academic Press, New York (1992); Wu ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 217 (Recombinant DNA, Part H) & 218 (Recombinant DNA, Part I), Academic Press, New York (1993); M. Conn ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 302 (Green Fluorescent Protein), Academic Press, New York (1999); Weissman ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 303 (cDNA Preparation and Characterization), Academic Press, New York (1999), the methods described in the literature cited therein, or methods and modifications substantially similar thereto. Certain statements are included in the disclosure herein by reference thereto).
[0023]
As used herein, the term “polypeptide” may refer to any of the polypeptides described below. The basic structure of a polypeptide is well known and is described in numerous references in the art and other publications. In view of these, the term "polypeptide" as used herein refers to any peptide or any protein containing two or more amino acids joined together by peptide bonds or modified peptide bonds. I do. As used herein, the term "polypeptide" is generally known in the art as, for example, a peptide, an oligopeptide or a peptide oligomer, and is also known as a protein and in many forms. Both of the longer chains may usually mean. Polypeptides may often contain amino acids other than the amino acids usually referred to as naturally occurring amino acids (naturally occurring amino acids: or amino acids encoded by a gene). Polypeptides may also be produced by natural processes, such as processing and other alterations (or modifications) after translation of many of the amino acid residues, including the terminal amino acid residues, as well as by chemical processes well known to those skilled in the art. It will be appreciated that the above polypeptides can also be altered (modified) by targeted modification techniques. Many forms of alterations (modifications) to be added to the polypeptide are known, and they are described in detail in basic reference books and more detailed articles in the art, as well as in many research literatures. And these are well known to those skilled in the art. Some particularly conventional alterations and modifications include, for example, alkylation, acylation, esterification, amidation, glycosylation, lipid binding, sulfation, phosphorylation, γ-carboxylation of glutamic acid residues, hydroxylation and ADP-ribosylation and the like. E. FIG. Creighton, Proteins-Structure and Molecular Properties, Second Edition, W.C. H. Freeman and Company, New York, (1993); C. Johnson (Ed.), Post-translational Covalent Modification of Proteins, Academic Press, New York, (1983) (Wold, F., 1st ed., Lt. , "Analysis for Protein Modifications and nonprotein cofactors", Methods in Enzymology, 182: 626-646 (1990); Rattan et al. , "Protein Synthesis: Posttranslational Modification and Aging", Ann. N. Y. Acad. Sci. , 663: p. 48-62 (1992). Modifications may include the introduction of an active group to enable immobilization.
[0024]
As used herein, the term “homology” refers to each amino acid residue or each base constituting each chain between two chains in a peptide sequence (or amino acid sequence) or nucleotide sequence (or base sequence). The amount (number) of items that can be determined to be the same in the mutual relationship of each other, and means the amount between two peptide sequences (including a polypeptide sequence) or two nucleotide sequences (including a polynucleotide sequence). It means the degree of sequence correlation. Homology can be easily calculated. Many methods are known for measuring the homology between two polynucleotide or polypeptide sequences, and the term "homology" (also called "homology" or "identity") is well known to those skilled in the art. (E.g., Lesk, AM (Ed.), Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, D.W., ed. Ic., Lt. Press, New York, (1993); Griffin, A. M. & Griffin, HG (Ed.), Computer Analysis of Sequence Da. ta: Part I, Human Press, New Jersey, (1994); von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, New York, Ek., ev. , Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New York, (1991), etc.). General methods used to determine the homology of two sequences are described in Martin, J. et al. Bishop (Ed.), Guide to Huge Computers, Academic Press, San Diego, (1994); & Lipman, D.A. , SIAM J. et al. Applied Math. , 48: 1073 (1988) and the like, but are not limited thereto. Preferred methods for determining homology include those designed to give the largest match between the two sequences tested. Such methods include those that are assembled as computer programs. Preferred computer programming methods for determining homology between two sequences include the GCG program package (Deverex, J. et al., Nucleic Acids Research, 12 (1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, SF et al., J. Molec. Biol., 215: 403 (1990)) and the like, but are not limited thereto, and a method known in the art is used. And commercially available ones can be used. A database can be used for homology search, for example, GenBank. ^TM , DNA DataBank of Japan (DDBJ), European Molecular Biology Laboratory (EMBL), and the like. In the present specification, the term “high homology” depends on the length of the subject sequence, for example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and in certain cases, 95% or more. And particularly preferably 97% or more.
[0025]
As used herein, the term "oligonucleotide" refers to a relatively short single-stranded or double-stranded polynucleotide, preferably a polydeoxynucleotide, as described in Angew. Chem. Int. Ed. Engl. , Vol. 28, p. 716-734 (1989), for example, chemically synthesized by a method such as a phosphphotoester method, a phosphodiester method, a phosphite method, a phosphoramidite method, and a phosphonate method. be able to. It is known that conventional synthesis can conveniently be carried out on a modified solid support; for example, commercially available automated synthesizers, such as the Applied Biosystems 3400 DNA synthesizer (Applied Biosystems), This can be performed using ABI 3900 High-Throughput DNA synthesizer (Applied Biosystems) or the like. The oligonucleotide may contain one or more modified bases, for example, it may contain unnatural bases such as inosine or tritylated bases, etc. May contain a base with a marker.
[0026]
As used herein, the term "polymerase chain reaction" or "PCR" generally refers to H. A. Erlich ed. , PCR Technology, Stockton Press, 1989 and the like, for example, a method for enzymatically amplifying a desired nucleotide sequence in vitro. In general, the PCR method involves repeating a cycle of performing primer extension synthesis using two oligonucleotide primers capable of hybridizing preferentially to a template nucleic acid. Typically, as the primer used in the PCR method, a primer complementary to the nucleotide sequence to be amplified inside the template can be used, for example, complementary to the nucleotide sequence to be amplified at both ends. Or those adjacent to the nucleotide sequence to be amplified can be preferably used. The primer is preferably an oligonucleotide consisting of 5 or more bases, more preferably an oligonucleotide consisting of 10 or more bases, and more preferably an oligonucleotide consisting of 18 to 25 bases.
The PCR reaction can be performed by a method known in the art or a method substantially similar to or a modification thereof. Saiki, et al. R., Science, 230: 1350, 1985; Saiki, et al. , Science, 239: 487, 1988; M. Glover et al. ed. , "DNA Cloning", 2nd ed. , Vol. M.1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); A. Innis et al. ed. M., "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Academic Press, New York (1990)); J. McPherson, P .; Quirke and G.A. R. Taylor (Ed.), PCR: a practical approach, IRL Press, Oxford (1991); A. Frohman et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002 (1988), or by modifying or modifying the method. The PCR method can be performed using a commercially available kit suitable for the PCR method, and can also be performed according to a protocol specified by a kit manufacturer or a kit distributor.
[0027]
In a typical PCR reaction, for example, a template (typically, DNA) and a primer designed based on a target nucleic acid are combined with a 10 × reaction buffer (attached to Taq DNA polymerase), dNTPs (Mixture of deoxynucleoside triphosphates dATP, dGTP, dCTP, dTTP), Taq DNA polymerase and deionized distilled water. The mixture is, for example, GeneAmp ^TM The cycle is repeated 25 to 60 times under a general PCR cycle condition using an automatic thermal cycler such as PCR system 2700 (Applied Biosystems), and the number of cycles for amplification is appropriately set according to the purpose. be able to. The PCR cycle conditions include, for example, denaturation at 90 to 95 ° C for 5 to 100 seconds, annealing at 40 to 60 ° C for 5 to 150 seconds, elongation at 65 to 75 ° C for 30 to 300 seconds, preferably denaturation at 94 ° C for 15 seconds and annealing 58. A cycle of 15 ° C. for 15 seconds and an extension of 72 ° C. for 45 seconds can be cited. The annealing reaction temperature and time can be appropriately selected by appropriate experiments, and the denaturation reaction and the extension reaction time can also be estimated based on the expected chain length of the PCR product. An appropriate value can be selected according to the length. The annealing reaction temperature is usually preferably changed according to the Tm value of the hybrid of the primer and the template DNA. The time for the extension reaction is generally about 1 minute per 1000 bp chain length, but a shorter time can be selected in some cases.
[0028]
Hybridization technology can be used to identify a predetermined nucleic acid. The hybridization can be carried out by the method described in the literature that discloses the above-mentioned “gene recombination technique”, or a method substantially similar to or a modification thereof. For example, in hybridization, a sample containing a nucleic acid such as DNA is transferred to a carrier (including a membrane such as a nylon filter), and then subjected to denaturation treatment, immobilization treatment, washing treatment, and the like, if necessary. The reaction is carried out by reacting the DNA transcribed on the carrier (for example, a membrane) with the denatured labeled probe DNA fragment in a hybridization buffer, if necessary.
The hybridization process is usually performed at about 35 ° C. to about 80 ° C., more preferably about 50 ° C. to about 65 ° C., for about 15 minutes to about 36 hours, more preferably about 1 hour to about 24 hours. It can be carried out by selecting optimal conditions as appropriate. For example, the hybridization treatment is performed at about 55 ° C. for about 18 hours. The hybridization buffer can be selected from those commonly used in the art. Examples of denaturation treatment of the transferred carrier (for example, membrane) include a method using an alkali denaturing solution, and after the treatment, treatment with a neutralizing solution or a buffer is preferable. In addition, the immobilization treatment of the carrier (eg, a membrane) is usually performed at about 40 ° C. to about 100 ° C., more preferably at about 70 ° C. to about 90 ° C., for about 15 minutes to about 24 hours, and more preferably at about 40 minutes. Baking is carried out for 1 hour to about 4 hours, but can be carried out by appropriately selecting preferable conditions. For example, the immobilization is performed by baking a carrier such as a filter at about 80 ° C. for about 2 hours. Washing of the transferred carrier (eg, membrane) includes washing solutions commonly used in the art, for example, 50 mM Tris-HC1 buffer containing 1 M NaCl, 1 mM EDTA and 0.1% Sodium Dodecyl sulfate (SDS), It can be carried out by washing at pH 8.0 or the like. The carrier including the membrane can be selected from those commonly used in the art, and examples thereof include a nylon filter.
[0029]
As the alkali denaturing solution, the neutralizing solution, and the buffer solution, those commonly used in the art can be selected and used. Examples of the alkali denaturing solution include 0.5 M NaOH and 1.5 M NaCl. The neutralizing solution includes, for example, a 0.5 M Tris-HCl buffer containing 1.5 M NaCl, pH 8.0, and the like. × SSPE (0.36 M NaCl, 20 mM NaH ₂ PO ₄ And 2 mM EDTA). Prior to the hybridization treatment, it is preferable to perform a pre-hybridization treatment on the transferred carrier (for example, a membrane) as necessary in order to prevent a non-specific hybridization reaction. This pre-hybridization treatment is performed, for example, using a pre-hybridization solution [50% formamide, 5 × Denhardt's solution (0.2% bovine serum albumin, 0.2% polyvinylpyrrolidone), 5 × SSPE, 0.1% SDS] , 100 μg / mL heat-denatured salmon sperm DNA], and react at about 35 ° C. to about 50 ° C., preferably about 42 ° C. for about 4 to about 24 hours, preferably about 6 to about 8 hours. These conditions can be determined by those skilled in the art by repeating experiments as appropriate and determining more preferable conditions. Denaturation of the labeled probe DNA fragment used for hybridization can be performed, for example, by heating at about 70 ° C. to about 100 ° C., preferably about 100 ° C., for about 1 minute to about 60 minutes, preferably for about 5 minutes. it can. The hybridization can be carried out by a method known per se or a method analogous thereto. In the present specification, the stringent condition refers to, for example, about 15 to about 50 mM, preferably about 19 to about sodium concentration. The condition is about 40 mM, more preferably about 19 to about 20 mM, and the temperature is about 35 to about 85 ° C, preferably about 50 to about 70 ° C, more preferably about 60 to about 65 ° C.
[0030]
After the hybridization is completed, the carrier such as a filter is sufficiently washed to remove the labeled probe other than the labeled probe DNA fragment that has undergone the specific hybridization reaction, and then the detection can be performed. The washing treatment of the carrier such as a filter can be carried out by selecting from those commonly used in the art. For example, 0.5 × SSC containing 0.1% SDS (0.15 M NaCl, 15 mM quencher) (Acid) solution.
The hybridized nucleic acid can be typically detected by autoradiography, but various technical methods are known in the art, and the method can be appropriately selected from such methods and used for detection. The nucleic acid band corresponding to the detected signal is transferred to an appropriate buffer such as SM solution (100 mM NaCl and 10 mM MgSO 4). ₄ Containing 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5) and the like, and then appropriately diluting the suspension to isolate / purify a predetermined nucleic acid and to subject it to further amplification treatment. A sample (eg, a phage particle, a recombinant plasmid or a vector) carrying a predetermined nucleic acid can be purified and separated by a method commonly used in the art, for example, glycerol gradient ultracentrifugation ( Molecular cloning, a laboratory manual, ed. T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd ed. 78, 1989) and the like. From phage particles and the like, DNA can be purified and separated by a method commonly used in the art. For example, the obtained phages and the like can be purified using a TM solution (10 mM MgSO 4 ₄ Suspended in 50 mM Tris-HCl buffer solution (pH 7.8) and treated with DNase I and RNase A, and then mixed with 20 mM EDTA, 50 μg / ml Proteinase K, 0.5% SDS, and the like. The mixture was incubated for about 1 hour, extracted with phenol, extracted with diethyl ether, and precipitated with ethanol. The resulting DNA was washed with 70% ethanol, dried, and then TE solution (10 mM Tris-containing 10 mM EDTA containing 10 mM EDTA). HC1 buffer, pH 8.0). The target DNA can also be obtained in large quantities by subcloning or the like. For example, subcloning can be performed using Escherichia coli as a host and a plasmid vector. DNA obtained by such subcloning can be purified and separated by methods such as centrifugation, phenol extraction, and ethanol precipitation in the same manner as described above.
[0031]
As used herein, a nucleic acid is a nucleic acid such as a single-stranded DNA, a double-stranded DNA, an RNA, a DNA: RNA hybrid, or a synthetic DNA, and a genomic DNA, a genomic DNA library, a cell-derived cDNA, or a synthetic DNA. Any of them may be used. The base sequence of the nucleic acid can be modified (for example, added, removed, substituted, etc.), and such modified ones are included. The nucleic acid may encode the peptide described in the present invention or a part thereof, and preferred is DNA. In addition, the nucleic acid is a peptide having substantially the same biological activity as that of the target polypeptide (protein) or a partial sequence thereof, such as antigenicity (including a substantially identical amino acid sequence). And any having a homology with it). The “equivalent nucleotide sequence” may be, for example, a sequence that hybridizes to a sequence having a problematic sequence under stringent conditions. For example, five or more consecutive nucleotide sequences of the nucleotide sequence, preferably Are those that hybridize with 10 or more base sequences, more preferably 15 or more base sequences, and still more preferably 20 or more base sequences, and encode an amino acid sequence substantially equivalent to the polypeptide. Can be Nucleic acids can also be obtained by chemical synthesis. In that case, the fragments may be chemically synthesized and ligated with an enzyme.
[0032]
The DNA encoding the carbonyl reductase of the present invention can be isolated, for example, by the following method.
After purifying the enzyme of the present invention, the N-terminal amino acid sequence is analyzed. In the amino acid sequence analysis of the enzyme, if necessary, the purified enzyme is cleaved with an enzyme such as lysyl endopeptidase or V8 protease, the peptide fragment is purified by reverse phase liquid chromatography or the like, and the amino acid sequence is analyzed by a protein sequencer. . In sequence analysis, the amino acid sequence can be determined using a plurality of peptide fragments. A primer for PCR is designed based on the determined amino acid sequence, and chromosomal DNA of the enzyme-producing strain or a cDNA library is used as a template, and PCR is performed using PCR primers designed from the amino acid sequence to thereby obtain the DNA of the present invention. You can get some. Furthermore, using the obtained DNA fragment as a probe, a restriction enzyme digest of the chromosomal DNA of the enzyme-producing strain is introduced into a phage, a plasmid, etc., and a library or cDNA library obtained by transforming Escherichia coli is used. The DNA of the present invention can be obtained by colony hybridization, plaque hybridization, or the like.
[0033]
In addition, the base sequence of the DNA fragment obtained by PCR is analyzed, and from the obtained sequence, PCR primers for extending to outside the known DNA are designed, and the chromosomal DNA of the enzyme-producing strain is digested with an appropriate restriction enzyme. After the digestion, an inverse PCR is performed using DNA as a template by a self-cyclization reaction (Ochman, H. et al., Genetics, 120: 621-623 (1988); Innis, M. et al. (Ed.), PCR: Application & Protocols, Academic Press, New York (1989), and the RACE method (Rapid Amplification of cDNA Ends, Froman, MA, et al., Proc. Nat. 85: 8998 (1988); Innis, MA et al. (Ed.), PCR Protocols: A guide to methods and applications, pp. 28-38, Academic Press, New York, Tokio, No. 90 Experimental method 47 The DNA of the present invention can also be obtained by using a PCR experiment manual, JSSP, etc. The DNA of the present invention can be obtained by synthesis in addition to genomic DNA or cDNA cloned by the above method.
By inserting the DNA encoding the carbonyl reductase according to the present invention thus isolated into a known expression vector, a carbonyl reductase expression vector is provided. Further, by culturing a transformant transformed with this expression vector, the carbonyl reductase of the present invention can be obtained from the recombinant.
[0034]
The isolation of the DNA encoding the target carbonyl reductase according to the present invention is described below. The DNA encoding the carbonyl reductase of the present invention is isolated by constructing a library from chromosomal DNA of a microorganism producing the target carbonyl reductase, for example, Leifsonia naganoensis JCM 10592 strain, and screening this library. Can be obtained.
The donor DNA used for library construction is obtained by centrifuging a culture obtained by culturing the microorganism cells to obtain a cell pellet, and then suspending the cell pellet in a buffer (for example, phosphate buffered saline (PBS)). And then centrifuged to wash. The cell pellet thus obtained is then washed with TE buffer [10 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane-hydrochloride (Tris-HCl), pH 7.5, 1 mM Suspended in disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA), treated with lysozyme or the like, if necessary, and extracted with a DNA extraction buffer [eg, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 M EDTA, 0.5 % SDS], treated with RNase, etc., if necessary, treated with proteinase K, and then extracted, separated and purified. For example, phenol is added to the DNA-containing treatment solution, the solution is mixed, and then chloroform / isoamyl alcohol (for example, 24: 1) is added and mixed, centrifuged, and the DNA-containing aqueous layer (upper layer) is collected. Then, the aqueous layer containing the extracted DNA is treated with, for example, ammonium acetate or isopropanol to precipitate the contained DNA, and if necessary, the DNA is precipitated using a centrifuge. Get as. The DNA obtained as a precipitate is washed with, for example, 70% ethanol and then dissolved in a TE buffer. Purified by density gradient ultracentrifugation, gel electrophoresis, etc., if necessary]. The obtained chromosomal DNA is partially decomposed with an appropriate restriction enzyme to obtain a fragment (for example, a size of about 20 kbp) suitable for library construction, and if necessary, density gradient ultracentrifugation. It is separated using gel electrophoresis or the like.
[0035]
A DNA library can be constructed using a phage vector, a plasmid vector, or the like. For example, λ phage-derived vectors, P1 phage vectors, cosmid phage vectors and the like can be preferably used. Preferably, a commercially available reagent, or a prepared vector DNA (eg, enzyme-digested and dephosphorylated), a packaging extract, a host strain, and a kit capable of performing all steps from the beginning to the end Can be performed. Specifically, the DNA library can be constructed, for example, into a pUC-based vector such as pLAFR3, λgt10, λZAP II, λFIX II, λDASH, pUC18, or a pBR-based vector such as pBR322, and the like. Infecting host Escherichia coli such as DH10B, DH5α, STBL4, DH12S, HB101, MC1061, JM109, STBL2, XL1-Blue MRA, XL1-Blue MRA (P2), XL1-Blue MRF, etc. to form plaque. Can be.
In addition to using a phage vector, transformation of host cells such as Escherichia coli includes, for example, the calcium method, the rubidium / calcium method, the calcium / manganese method, the TFB high efficiency method, the FSB freezing competent cell method, and the rapid colony method. The method can be carried out by a method known in the art, such as a method and electroporation, or a method substantially similar thereto (D. Hanahan, J. Mol. Biol., 166: 557 (1983), etc.).
[0036]
Using the nucleic acid fragment synthesized based on the amino acid sequence analysis of the isolated and purified enzyme as a probe, the constructed genomic DNA library is screened to obtain a clone encoding the carbonyl reductase gene derived from the strain.
Once isolated and obtained, the DNA which is the enzyme gene of the present invention can be used as a probe by utilizing most or a part of the base sequence in the DNA according to a conventional method and using it as a probe. Search for organisms and find those that carry the genetic information involved in advanced asymmetric selective reduction activity among the genes possessed by the organism, and then genetically modify the genes identified in this way It can be easily understood by those skilled in the art to cut out by applying the technique of the technology, obtain it in a large amount, and use it in the same manner as that derived from the present microorganism. In order to label a probe or the like with a radioisotope or the like, the DNA for the probe is labeled with [α-α] using a commercially available labeling kit such as a random primed DNA labeling kit (Boehringer Mannheim). ³² [P] dCTP (Amersham) or the like, and a radioactive probe can be obtained. The labeling can be performed by a method known in the art, for example, digoxigenin, a fluorescent dye, a biotin-avidin system, or the like.
The DNA source carrying the genetic information of the homologue of the carbonyl reductase of the present invention is a gram-negative or gram-positive bacterium to which the above-described method can be applied, and a carbonyl reductase having a high asymmetric selective reducing activity And those having a gene encoding In addition, any organism having a unique enzyme gene can be used without distinction between lower organisms and higher organisms.
[0037]
The determination of the nucleotide sequence of the obtained DNA can be typically performed as follows. The isolated and obtained portion containing the DNA region encoding the predetermined gene is ligated to a vector well known to those skilled in the art, and the obtained recombinant colony is hybridized using host cells such as E. coli. , Such as colony hybridization, plaque hybridization, hybridization translation assay, plus / minus method, etc. to prepare a large amount of DNA encoding the chromosome-derived carbonyl reductase gene. it can. Hybridization can be performed as described above.
The selection of a clone carrying the gene of interest may be performed by assaying the activity of the product of the carbonyl reductase gene.
The DNA thus obtained can be fragmented to an extent suitable for determining the nucleotide sequence of the DNA, and then processed by methods well known in the art to determine the nucleotide sequence. Examples of the method for determining the DNA base sequence of the DNA fragment include the Maxam-Gilbert method, the dideoxy method, such as the dideoxy chain termination method (Sanger, Science, 214, 1205 (1981)), and the M13 dideoxy method. Examples of the polymerase used for the dideoxy method include Klenow fragment of DNA polymerase I, AMV reverse transcriptase, Taq DNA polymerase, T7 DNA polymerase, and modified T7 DNA polymerase. In addition, a commercially available sequencing kit or an automatic base sequencer can be used. A base sequence of a predetermined DNA, for example, a base sequence of a single-stranded DNA can be sequenced, for example, BigDye. ^TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit V3.0 (Applied Biosystems) and other Taq Dye Primer Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems) and Applied Biosystems (Applied Biosystems) are used. Can determine the sequence.
[0038]
Among these methods, there are a method in which an appropriate restriction enzyme is acted, a restriction enzyme map is prepared, and then a necessary fragment is subcloned, a method in which a gene is amplified by a shotgun cloning method, or PCR. Needless to say, various methods such as a method of performing releasing with a nuclease are included. Next, a DNA region encoding a predetermined polypeptide is determined from the DNA whose DNA base sequence has been determined in this manner. An open reading frame is searched for in the determined DNA base sequence. A DNA region that is supposed to encode the target enzyme is excised with a restriction enzyme, and an expression vector is constructed using this again, expressed in an appropriate host, and the activity in the obtained expression product is determined. The activity can be finally confirmed by examining the activity using a measurement system.
Next, the DNA portion encoding the predetermined polypeptide thus obtained is again ligated to a vector well-known to those skilled in the art, introduced into a host cell such as Escherichia coli, and the obtained recombinant is subjected to a predetermined enzyme activity measurement system. And the resulting clones are assayed to obtain a transformant having the target enzyme activity. Next, a portion containing a DNA region encoding a polypeptide having a target enzyme activity can be cut out from this transformant using a restriction enzyme. Further, a sense primer and an antisense primer can be synthesized based on the analyzed DNA sequence of the novel enzyme gene. The preparation of the oligonucleotide primer can be performed by a method known in the art as described above.
[0039]
Preparation of a recombinant DNA and a DNA fragment having the desired enzyme gene from the transformant can be performed by a conventional method. For example, the transformant grown in a medium is harvested, the cell wall is broken by a method known as cell disruption such as lysozyme treatment, and then the nucleic acid fraction is separated, followed by a method such as density gradient centrifugation. Divide into desired fractions. The fraction containing the plasmid thus obtained can be subsequently treated with an appropriate restriction enzyme to obtain an appropriate fragment, and also selectively as a DNA fragment encoding a desired polypeptide. it can. The obtained fragments can be separated into desired fragments by, for example, gel electrophoresis, and the gel containing DNA fragments of an appropriate size is subjected to DNA extraction, for example, by phenol extraction-ethanol precipitation. The extracted DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme if necessary, and further purified if necessary, or if necessary, phosphorylated at the 5 'end with T4 polynucleotide kinase or the like, and then pUC-based vector such as pUC18. Ligated to a suitable plasmid vector, and transformed into a suitable competent cell. The nucleotide sequence of the cloned DNA fragment is analyzed.
Regions other than the DNA encoding the predetermined gene can be removed from the DNA subjected to the structural analysis as described above by deleting unnecessary regions by various methods. Examples of such a method include a deletion method using BAL31 nuclease and exonuclease III, and a recombination method using a restriction enzyme cleavage site. At this time, according to the present invention, it is easy to change the promoter specific to the gene to another one or to introduce a site-specific mutation to change the strength of the promoter by using current gene manipulation techniques. Can be performed. Therefore, it is apparent that all the DNA fragments including the DNA encoding the polypeptide exhibiting a predetermined enzyme activity are included in the present invention, even if the DNA fragments are partially modified as described above. The DNA fragment containing the DNA encoding the polypeptide exhibiting the enzyme activity of the present invention includes, in addition to the DNA encoding the structural gene, a control region that plays an important role in expressing the gene in vivo, For example, those containing DNA encoding a gene transcription promoter, ribosome binding site, transcription terminator and the like are also included.
[0040]
According to the present invention, once the nucleotide sequence of the DNA encoding the polypeptide involved in the target enzyme activity is determined, the substitution, addition or deletion of the base can be performed by a method well known in the art. And can be easily performed.
For example, a method using the degeneracy of the genetic code encoding the corresponding amino acid, a conversion considering the utilization rate of the genetic code of an organism, or a conversion of an amino acid sequence that does not adversely affect the function of a stereoselective reduction reaction. Substitution, addition or deletion of the base. Furthermore, among such modifications, it is also possible to conserve only the active center of the enzyme involved in the stereoselective reduction reaction, and to change the sequence and length of the DNA so as to greatly change the other portions. included. Therefore, it can be easily understood by those skilled in the art that the DNA encoding the gene of the present invention includes all DNAs modified as described above.
In view of the above circumstances, the gene encoding the carbonyl reductase protein of the present invention can be obtained by substantially utilizing the concept of the present invention, and has substantially the same function (or activity) as the gene of the present invention. ) Are included.
[0041]
The present invention relates to DNA encoding carbonyl reductase and homologs thereof. The DNA encoding the carbonyl reductase of the present invention contains, for example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2. The base sequence shown in SEQ ID NO: 2 encodes a protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the protein containing this amino acid sequence constitutes a preferred embodiment of the carbonyl reductase according to the present invention. The DNA homologue encoding the carbonyl reductase of the present invention includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and DNAs encoding proteins having the properties (1) and / or (2) are included. A person skilled in the art can use the following PCR and site-directed mutagenesis (Nucleic Acid Res., 10: pp. 6487 (1982); R. Wu, L. Grossman, ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 100, pp. 448, Academic Press, New York (1983); J. Sambrook et al., London, Canada, Colonial: Canada, Canada. Cold Spring Harbor, New York (1989); MJ McPherson, P. Quirke and GR. Taylor (Ed.), PCR: DNA homologues by introducing appropriate substitutions, deletions, insertions, and / or addition mutations using, for example, a practical approach, pp. 200, IRL Press, Oxford (1991) and the like. It is possible to get.
Further, the DNA homolog of the present invention is a DNA that can hybridize under stringent conditions with a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, and has the properties (1) and / or (2). DNAs encoding proteins having the same are also included. The DNA that can be hybridized is selected from one or more of any at least 20, preferably at least 30, for example, 40, 60 or 100 continuous sequences described in SEQ ID NO: 2, and the selected DNA Is used as a probe DNA, and using, for example, ECL direct nucleic acid labeling and detection system (manufactured by Amersham Pharmaica Biotech) under the conditions described in the manual (wash: 42 ° C., 0.5 x SSC, fast flash, fast flash including fast diving with 0.5 × SSC) DNA to be treated. Further, the DNA homolog of the present invention is a DNA homologue of a protein having at least 70%, preferably at least 80% or 90%, more preferably 95% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. Including.
[0042]
As used herein, the term "carbonyl reductase gene" refers to a compound that acts on 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene and reacts with 3,4-difluoro-2-((R) -2-hydroxypropyloxy) nitrobenzene. Means a gene involved in the carbonyl reductase activity possessed by a microorganism of the genus Leifsonia having a high asymmetric selectivity and reducing activity (for example, Leifsonia naganoensis, especially JCM 10592 strain of Leifsonia naganoensis JCM). Good. As used herein, the term "carbonyl reductase" refers to the reduction of the carbonyl group of 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene with specific stereoselectivity to give 3,4-difluoro It may mean all or a part of the enzyme protein responsible for carbonyl group reduction activity possessed by a microorganism that gives -2-((R) -2-hydroxypropyloxy) nitrobenzene. The gene is composed of a nucleic acid and is usually a DNA on the genome, but may be in any form described in the present specification.
The carbonyl reductase gene typically includes a nucleotide sequence corresponding to the ORF of the DNA of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, or a partial fragment thereof. .
The present invention includes a carbonyl reductase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and having the properties (1) and / or (2), and homologs thereof. The protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 constitutes a preferred embodiment of the carbonyl reductase according to the present invention. The protein of the present invention is typically a protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence substantially equivalent thereto, one or more amino acids deleted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, Reduction of the carbonyl group of the protein represented by the substituted, inserted and / or added amino acid sequence, preferably 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene, with specific stereoselectivity to give 3,4 -Difluoro-2-((R) -2-hydroxypropyloxy) nitrobenzene, a protein involved in an enzymatic activity responsible for the activity of producing nitrobenzene, and a partial fragment thereof. The homologue of the carbonyl reductase of the present invention includes an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. The homologue of the carbonyl reductase may be a protein having at least 70%, preferably at least 80% or 90%, more preferably 95% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. .
[0043]
As the gene encoding the protein of the present invention (including the nucleic acid or oligonucleotide related thereto), typically, the nucleic acid encoding the protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 A nucleic acid encoding a protein represented by an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted and / or added, and a partial fragment thereof, selected from the base sequence of SEQ ID NO: 2. And oligonucleotides or polynucleotides containing a continuous base sequence, for example, oligonucleotides or polynucleotides consisting of 5 or more continuous bases, more preferably 10 or more continuous bases, and more preferably 15 or more Oligonucleotides or polynucleotides consisting of bases, more preferred Specifically, an oligonucleotide or polynucleotide consisting of 18 to 100 bases, typically an oligonucleotide consisting of 20 to 30 bases or an oligonucleotide or polynucleotide consisting of 30 to 55 bases, and the like. It may be encoded by a DNA sequence containing a nucleotide sequence having homology to the nucleotide sequence, but having the same effective nucleotide sequence as that encoding a protein having substantially the same carbonyl reduction activity. And nucleotides complementary thereto.
In the present invention, the carbonyl group of 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene is reduced with specific stereoselectivity to give 3,4-difluoro-2-((R) -2-hydroxypropyloxy). ) Enzyme protein having an activity of producing nitrobenzene, or a protein or a salt thereof having a function (or activity) substantially equivalent thereto, a characteristic partial peptide of the protein or a salt thereof, a gene encoding them, for example, DNA , RNA, etc., vectors or plasmids containing the gene so that it can be manipulated by genetic recombination techniques, host cells transformed with such vectors, etc., and further culturing the host cells to produce the protein. Or a method for producing a salt thereof, the protein or a salt thereof thus obtained. An antibody obtained using a characteristic partial peptide of the protein or a salt thereof, in particular, a monoclonal antibody, a hybridoma cell producing the antibody, the isolated gene, such as DNA, RNA, or the like as a probe, A nucleic acid amplification technique using an oligonucleotide designed based on the sequence information or a measuring means and a reagent using the antibody or the oligonucleotide, and a recombinant protein such as a recombinant enzyme, a transformed host cell, An asymmetric reduction method using an immobilized enzyme or immobilized cells is provided.
[0044]
By using a method commonly used in genetic engineering based on the nucleotide sequence of the gene according to the present invention, substitution, deletion, insertion of one or more amino acids in the amino acid sequence of a predetermined polypeptide as appropriate. The corresponding polypeptide into which a mutation such as transposition or addition has been introduced can be produced. Examples of such mutation / transformation / modification methods include, for example, “The Biochemical Chemistry Laboratory Course 1, Gene Research Method II”, edited by The Biochemical Society of Japan, p105 (Susumu Hirose), Tokyo Kagaku Dojin (1986); Chemistry Experiment Course 2, Nucleic Acid III (Recombinant DNA Technology) ", p233 (Susumu Hirose), Tokyo Kagaku Dojin (1992); Wu, L .; Grossman, ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 154, p. 350 & p. 367, Academic Press, New York (1987); Wu, L .; Grossman, ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 100, p. 457 & p. 468, Academic Press, New York (1983); A. Wells et al. , Gene, 34: 315, 1985; Grundstroem et al. , Nucleic Acids Res. , 13: 3305, 1985; Taylor et al. , Nucleic Acids Res. , 13: 8765, 1985; Wu ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 155, p. 568, Academic Press, New York (1987); R. Olifant et al. , Gene, 44: 177, 1986. For example, position-directed mutagenesis (site-directed mutagenesis) using PCR, synthetic oligonucleotides and the like (Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10: 6487, 1987; Carter et al., Nucl. Acids). Res., 13: 4331, 1986), cassette mutagenesis (Cassette mutagenesis: Wells et al., Gene, 34: 315, 1985), restriction site selection mutagenesis (restriction selection. Mutagenesis. Trans.R.Soc.London Ser A, 317: 415, 1986), alanine scanning method (Cunningham & Wells). , Science, 244: 1081-1085, 1989), a PCR mutagenesis method, a Kunkel method, a dNTP [αS] method (Eckstein), and a region-directed mutagenesis method using sulfurous acid or nitrous acid.
[0045]
In addition, it is expressed as a fusion polypeptide (fusion protein) at the time of production by a gene recombination method, and converted into a substance having substantially the same biological activity as the desired polypeptide in vivo or in vitro.・ It may be processed. Although a fusion production method commonly used in genetic engineering can be used, such a fusion polypeptide can be purified by affinity chromatography or the like using the fusion portion. Such fusion polypeptides include those fused to a histidine tag, or β-galactosidase (β-gal), maltose-binding protein (MBP), glutathione-S-transferase (GST), thioredoxin (TRX) or Cre Recombinase. And those fused to the amino acid sequence of Similarly, a polypeptide can be tagged with a heterogeneous epitope so that it can be purified by immunoaffinity chromatography using an antibody that specifically binds to the epitope. In a more suitable embodiment, a polyhistidine (poly-His) or polyhistidine-glycine (poly-His-Gly) tag, and the epitope tag is, for example, AU5, c-Myc, CruzTag 09, CruzTag 22, CruzTag. 41, Glu-Glu, HA, Ha. 11, KT3, FLAG (registered trademark, Sigma-Aldrich), Omni-probe, S-probe, T7, Lex A, V5, VP16, GAL4, VSV-GV, and the like. , 8: pp. 2159-2165 (1988); Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: pp. 3610-3616 (1985); Paborsky et al., Protein Engineering: 3; 553 (1990); Hopp et al., BioTechnology, 6: pp. 1204-1210 (19). Martin et al., Science, 255: pp. 192-194 (1992); Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: pp. 15163-15166 (1991); Lutz-Freyermuth et al. Natl. Acad. Sci. USA, 87: pp. 6393-6397 (1990)).
[0046]
Furthermore, the fusion polypeptide may be a marker with a marker that becomes a detectable protein. In a more preferred embodiment, the detectable marker may be a biotin / streptavidin-based Biotin Avi Tag, a fluorescent substance, or the like. Examples of the fluorescent substance include a green fluorescent protein (GFP) derived from a luminescent jellyfish such as Aequorea victoria, a mutant thereof (GFP variant), for example, EGFP (Enhanced-humanized). GFP), rsGFP (red-shift GFP), yellow fluorescent protein (YFP), green fluorescent protein (GFP), blue fluorescent protein (FP), blue fluorescent protein (FP) and blue fluorescent protein (FP). Photoprotein (blue fluorescein protein: BFP), sea pansy Renilla reniformis) derived from GFP, and the like (Atsushi Miyawaki, ed., Experimental Medicine separate volume post-genome era of the experimental course 3-GFP and bioimaging, YODOSHA (2000)). Detection can also be performed using an antibody (including a monoclonal antibody and a fragment thereof) that specifically recognizes the fusion tag. Expression and purification of such a fusion polypeptide can be performed using a commercially available kit suitable for the fusion polypeptide, or can be performed according to a protocol specified by a kit manufacturer or a kit distributor. Certain peptides of the present invention include, in addition to the naturally-occurring form, other polypeptides, such as peptide analogs, that have equivalent, more potent, or more positive functions than the function of the peptide.
[0047]
The carbonyl reductase homologue protein of the present invention is one in which one or more amino acid residues are different from the natural one in terms of identity, and one or more amino acid residues are different in position from the natural one. You may. The protein of the present invention derived from the strain of Leifsonia Naganoensis JCM 10592 has one or more amino acid residues unique to the protein (for example, 1 to 80, preferably 1 to 60, and more preferably 1 to 40). Deletion analogs, more preferably 1-20, especially 1-10, etc., one or more of unique amino acid residues (eg 1-40, preferably 1-20, more A substituted analog in which preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, particularly 1 to 2, and the like are substituted with another residue, 1 or more (for example, 1 to 40, preferably 1 to 40) Addition analogs to which 1 to 20, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and especially 1 to 2 amino acid residues are added are also included. As long as the domain structure which is a common feature found in the carbonyl reductase protein is maintained, all the variants as described above are included in the present invention. It is also considered that the protein of the present invention may include a protein having a primary structural conformation substantially equivalent to that of the natural enzyme or a part thereof, and further includes a natural Leifsonia naganoensis JCM 10592 strain. It is contemplated that those having a biological activity substantially equivalent to the given protein of origin may also be included. It can also be one of the naturally occurring variants. Examples of the fungi-derived protein of the present invention include those having a homology higher than 70% to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, more preferably 80% or higher, particularly Preferably, those having a homologous amino acid sequence of 90% or more are mentioned.
[0048]
Amino acid substitutions, deletions, or insertions often do not result in significant changes in the physiological or chemical properties of the polypeptide, in which case the substituted, deleted, or inserted polypeptide Would be substantially identical to those without such substitutions, deletions, or insertions. Substantially identical substitutions of amino acids in the amino acid sequence may be selected from other amino acids of the class to which the amino acid belongs. For example, non-polar (hydrophobic) amino acids include alanine, phenylalanine, leucine, isoleucine, valine, proline, tryptophan, methionine and the like, and polar (neutral) glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, and the like. Amino acids (basic amino acids) having a positive charge include arginine, lysine, histidine and the like, and amino acids having a negative charge (acidic amino acids) include aspartic acid and glutamic acid. Can be
[0049]
The production of the recombinant DNA having the target enzyme-related gene of the present invention will be described below. Procedures for producing a transformant and construction of a recombinant vector suitable for a host can be performed according to techniques commonly used in the fields of molecular biology, biotechnology, and genetic engineering. Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition (1989) & 3rd Edition (2001)), Cold Spring Harbor Laboratory Use of genes described in "Recombinations, etc." Can be.
DNA obtained by removing an unnecessary region from a fragment containing the DNA encoding the target carbonyl reductase of the present invention by appropriate means is re-incorporated into an appropriate vector DNA, and then re-introduced into host cells. Can be introduced. In order to express the carbonyl reductase gene of the present invention in a host or the like, first, the DNA is introduced into a plasmid vector or a phage vector stably present in the host organism, and the genetic information is transcribed and translated. There is a need. For this purpose, a promoter, which is a unit for controlling transcription / translation, may be incorporated at the 5 ′ upstream of the DNA strand of the present invention, and more preferably, a terminator may be incorporated at the 3 ′ downstream of the DNA strand.
The vector DNA used to introduce the DNA encoding the above enzyme or the like of the present invention into a host cell, and to express it in the host cell into which the enzyme has been introduced, includes, in an appropriate host cell, a predetermined enzyme gene. Any substance can be used without particular limitation as long as it can express the above.
Such a vector DNA is one into which a DNA encoding the above enzyme or the like can be incorporated, one which can transform a host cell with the recombinant vector DNA, and one in the cell of the obtained transformant. There is no particular limitation so long as it is capable of expressing the DNA encoding the gene product introduced in step 1. Any one can be used.
[0050]
Examples of such vector DNAs include those that are capable of autonomous replication in a host cell and are provided with an appropriate selection marker or the like so that only recombinant host cells can be selected. Furthermore, such a vector DNA may be one that can be easily produced by those skilled in the art from a known vector DNA or the like.
Examples of such a vector DNA include those selected from a plasmid vector, a phage vector, and a cosmid vector. Such a vector DNA may be a shuttle vector capable of gene exchange with another host strain, or specially devised to improve the expression efficiency of a gene product such as a runaway vector or a sleeper vector. May be done.
Further, such a vector DNA contains lacUV5 promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lpp promoter, tufB promoter, recA promoter, _L Promoter, P _R A promoter, a promoter such as a T7 promoter, a terminator such as a terminator derived from trpA, a terminator derived from a phage, a terminator derived from rrnB ribosomal RNA, and a control factor such as an enhancer may be appropriately provided so as to be operable. In order to introduce such factors involved in the expression of a trait or the like, a method well known in the field of gene recombination technology can be appropriately selected and applied. Representative expression vectors include, for example, pLAFR3, pR01614 and the like.
[0051]
Examples of plasmids (or vectors) using a microorganism belonging to the genus Escherichia, particularly Escherichia coli (E. coli) as a host include, for example, pBR-based vectors such as pBR322, pUC-based vectors such as pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pLAC11 and pLAC21. PGEX-based vectors, such as pGEX-3, pGEM-3Z, pGEM-5Zf (-), pGEX-3 vectors, pBluescript KS, pSP64, pSP65, pTZ-18R / -18U, pTZ-19R / -19U, pGEM-3, M-4, pGEM-3Z, pGEM-4Z, pGEM-5Zf (-). ^TM (Stratagene) and the like. Examples of plasmid vectors suitable for expression in Escherichia coli include, for example, pAS, pKK223 (Pharmacia), pMC1403, pMC931, pKC30, pRSET-B (Invitrogen) and the like.
In Pseudomonas microorganisms, a broad host range vector (including a gene necessary for autonomous replication derived from RSF1010 or the like) based on a plasmid TOL plasmid involved in the degradation of toluene compounds, such as pKT240, can be used. As the promoter, terminator, lipase (JP-A-5-284973) gene and the like can be used. For Bacillus microorganisms, pUB110-based plasmids, pC194-based plasmids and the like can be used as vectors, and they can also be integrated into chromosomes. Further, apr (alkali protease), npr (neutral protease), amy (α-amylase) and the like can be used as the promoter and terminator. For microorganisms of the genus Brevibacterium, plasmid vectors such as pAJ43 (Gene, 39: 281 (1985)) can be used. As the promoter and terminator, the promoter and terminator used in Escherichia coli can be used as they are. For microorganisms of the genus Corynebacterium, plasmid vectors such as pCS11 (JP-A-57-183799) and pCB101 (Mol. Gen. Genet., 196: 175 (1984)) can be used. Among the microorganisms of the genus, pHV1301 (FEMS Microbiol. Lett., 26: 239 (1985)), pGK1 (Appl. Environ. Microbiol., 50:94 (1985)) and the like can be used as plasmid vectors. Among the microorganisms belonging to the genus, pAMβ1 (J. Bacteriol., 137: 614 (p. 147) developed for Streptococcus sp. 979)) and the like are available, which are used in E. coli as a promoter is available.
[0052]
In the genus Rhodococcus, a plasmid vector isolated from Rhodococcus rhodochrous can be used (J. Gen. Microbiol., 138: 1003 (1992)). For Streptomyces microorganisms, see Hopwood et al. , Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories (1985). Plasmids can be constructed according to the method described in, for example, pIJ486 (Mol. pKC1064 (Gene, 103: 97-99 (1991)), pUWL-KS (Gene, 165: 149-150 (1995)) and the like can be used.
In Saccharomyces microorganisms, YRp, YEp, YCp, and YIp plasmids can be used. In addition, an integration vector (such as EP 537456) utilizing homologous recombination with ribosomal DNA present in multiple copies in a chromosome is extremely useful because a gene can be introduced in multiple copies and the gene can be stably retained. Promoters such as ADH (alcohol dehydrogenase), GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), PHO (acid phosphatase), GAL (β-galactosidase), PGK (phosphoglycerate kinase), and ENO (enolase); Terminator is available. Among Candida microorganisms, an ARS derived from Candida maltosa has been cloned (Agri. Biol. Chem., 51: 1587 (1987)), and vectors utilizing this have been developed. A strong promoter has been developed for a chromosome integration type vector (JP-A-08-173170).
For Pichia microorganisms, host vector systems utilizing genes (PARS1, PARS2) involved in autonomous replication derived from Pichia pastoris have been developed (Mol. Cell. Biol., 5: 3376 (1985)), and strong promoters such as AOX which can be induced by high-concentration culture and methanol can be used (Nucleic Acids Res., 15: 3859 (1987)). In Hansenula microorganisms, genes involved in autonomous replication derived from Hansenula polymorpha (HARS1, HARS2) can also be used, but since they are relatively unstable, multicopy integration into chromosomes is effective. (Yeast, 7: 431-443 (1991)). Also, AOX (alcohol oxidase), FDH (formate dehydrogenase) promoters and the like, which are induced by methanol or the like, can be used.
[0053]
In the microorganisms of the genus Kluyveromyces, 2 μm-family plasmids derived from Saccharomyces cerevisiae, pKD1-family plasmids (J. Bacteriol., 145: 382-390 (1981)), and p derived from killer K1 are involved. Plasmids, KARS-based plasmids for autonomous growth genes in the genus Kleiberomyces, and vector plasmids that can be integrated into chromosomes by homologous recombination with ribosomal DNA (such as EP 573456) can be used. Further, promoters and terminators derived from ADH, PGK and the like can be used.
In the microorganism of the genus Schizosaccharomyces, a vector containing an ARS (a gene involved in autonomous replication) derived from Schizosaccharomyces pombe and a selection marker complementary to an auxotrophy derived from Saccharomyces cerevisiae complementing the auxotrophy from Saccharomyces cerevisiae. Available (Mol. Cell. Biol., 6:80 (1986)). In addition, an ADH promoter derived from Schizosaccharomyces pombe and the like can be used (EMBO J., 6: 729 (1987)). In particular, pAUR224 is commercially available from Takara Shuzo and can be easily used.
In the microorganism of the genus Aspergillus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, and the like, integration into plasmids and chromosomes can be used, and extracellular proteases and amylase-derived enzymes can be used in connection with Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, and the like. Promoters are available (Trends in Biotechnology, 7: 283-287 (1989)).
As for microorganisms of the genus Trichoderma, a host vector system using Trichoderma reesei has been developed, and a promoter derived from an extracellular cellulase gene and the like can be used (Biotechnology 7, 596-603 (1989)). In addition to microorganisms, various host / vector systems have been developed for plants and animals, particularly insects using silkworms (Nature, 315, 592-594 (1985)) and plants such as rapeseed, corn and potato. A system for expressing a heterologous protein in large quantities has been developed and can be suitably used.
[0054]
To incorporate the DNA encoding the predetermined protein into the vector DNA, first, an appropriate restriction enzyme is allowed to act on the vector DNA, and the obtained vector DNA fragment is mixed with a DNA fragment encoding the target protein. , And DNA ligase. At this time, if necessary, treatments such as linker addition and blunt end known in the art may be added. The recombinant DNA thus obtained is then introduced into a suitable host cell.
Better results can be obtained by incorporating multiple predetermined genes on the same plasmid. The manner of incorporating a plurality of enzyme genes and the like may be such that a plurality of such genes having a unique promoter may be introduced, or a plurality of enzyme genes may be introduced as an operon that is transcribed into polycistronic. Or a combination of these. The number of genes to be introduced is not particularly limited, as long as it does not impair the stability of the recombinant DNA and a transformant containing the same.
In the case of producing recombinant DNA, techniques used for this purpose include conventional gene manipulation such as restriction enzyme digestion, ligase ligation, use of chemically synthesized DNA, nuclease deletion, and site-specific mutation-based base substitution. The technique can be carried out by appropriately selecting and applying the technique to be performed. At this time, the promoter may be changed or the base sequence for expressing other predetermined enzyme genes may be modified. The recombinant DNA thus obtained is then introduced into a suitable host cell.
[0055]
The production of a recombinant DNA having a target enzyme gene and a gene conferring the ability to regenerate a coenzyme used by the enzyme according to the present invention will be described below. Giving or enhancing the activity of regenerating coenzymes (eg, NADH, NADPH, etc.) makes it possible to add coenzymes and reduce or eliminate the use of additional components for coenzyme regeneration. And enables efficient use of the target enzyme.
A typical approach involves transforming a host to introduce a gene that confers the ability to regenerate a coenzyme. For example, a more efficient reduction reaction can be achieved by introducing a gene such as an enzyme that can be used for coenzyme regeneration into a host simultaneously with the DNA encoding the carbonyl reductase of the present invention.
Enzymes that can be used for coenzyme regeneration include, for example, glucose dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, formate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase, amino acid dehydrogenase, and organic acid dehydrogenase (such as malate dehydrogenase). These can introduce one or two or more genes. Preferably, glucose dehydrogenase (GDH) can be used, for example, GDH derived from Bacillus bacteria. Specifically, the GDH gene of Bacillus subtilis can be used. To impart or enhance the ability to regenerate a coenzyme, a gene utilizing a glycolytic pathway, a gene involved in the methylotroph C1 compound utilization pathway, or the like may be used.
To introduce two or more genes into a host, a method of transforming a host using a recombinant vector in which genes are separately introduced into a plurality of vectors having different origins of replication to avoid incompatibility, Alternatively, a method of introducing both genes into a single vector can be applied. In addition, a method of introducing both genes into a chromosome can also be used. When multiple genes are introduced into a single vector, promoters, terminators and other regions involved in expression control may be linked to each gene, or expressed as an operon containing multiple cistrons such as the lactose operon. It is possible.
[0056]
The introduction of a recombinant DNA into a host cell according to the present invention will be described below.
The host cell for introducing the recombinant DNA prepared as described above is a host cell that can be transformed with the recombinant plasmid (or vector) obtained above to express the gene. Anything can be used without particular limitation. Examples of host cells include bacteria whose host vector system is being developed, actinomycetes, yeast, filamentous fungi, plant cells, insect cells, animal cells, and the like.For example, other Escherichia microorganisms including Escherichia coli, Leifsonia, Pseudomonas sp., Bacillus sp., Alcaligenes sp., Acinetobacter sp., Serratia sp., Brevibacterium sp., Corynebacterium sp., Streptococcus sp., Lactobacillus sp., Nocardia sp., Rhodocos sp. Streptomyces, Fusarium, Saccharomyces, Candida, Pichia, Hansenula, Kleiberomyces, Trichosporon, Rhodosporidium (Rhodosporidium) genus Schizosaccharomyces the genus Neurospora (Neurospora), Aspergillus, Cephalosporium (Cephalosporium) genus include microorganisms such as Trichoderma. As such a host cell, as long as the expression of the target enzyme gene can be achieved for the purpose of the present invention, gram-negative bacteria or gram-positive bacteria are used without distinction, and further, lower cells or higher cells are used without distinction. it can.
[0057]
When the host cell is, for example, the genus Escherichia, particularly Escherichia coli, for example, those derived from the Escherichia coli K12 strain can be mentioned. STBL4, XL1-Blue strain, BL21 (DE3) pLysS and the like. Examples of Leifsonia microorganisms include Leifsonia naganoensis. Among the microorganisms of the genus Pseudomonas, for example, those in which host vector systems have been developed, such as Pseudomonas putida and Pseudomonas cepacia. Examples of the microorganism of the genus Brevibacterium include Brevibacterium lactofermentum. As the microorganisms of the genus Corynebacterium, for example, Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum) and the like can be used. As the microorganism of the genus Rhodococcus, for example, Rhodococcus rhodochrous and the like can be used.
As the microorganism of the genus Streptomyces, for example, Streptomyces lividans, Streptomyces virginia, and the like can be used.
As the microorganism of the genus Saccharomyces, for example, Saccharomyces cerevisiae can be used. As Pichia microorganisms, for example, Pichia pastoris can be used. Among the microorganisms of the genus Candida, for example, Candida maltosa, Candida albicans, Candida tropicalis, and Candida utilis (Candida utilis) are available. Aspergillus niger (Aspergillus niger), Aspergillus oryzae (Aspergillus oryzae) and the like can be used.
[0058]
The introduction of the recombinant DNA can be carried out by appropriately selecting from methods well known to those skilled in the art. For example, electroporation, in vitro packaging method for bringing the recombinant DNA into contact with competent cells For example, a method of infecting a host in an appropriate growth phase with a recombinant phage vector using the method described above is applied.
According to the present invention, a transformant transformed with an expression vector containing a nucleic acid encoding a polypeptide can stably maintain a high expression ability by repeatedly cloning using an appropriate selection marker as necessary. Cell lines can be obtained. When a transformant is used, an antibiotic such as ampicillin or chloramphenicol may be added to the culture solution depending on the strain used. The transformant of the present invention can be cultured in a suitable nutrient medium under conditions under which the nucleic acid encoding the polypeptide of the present invention can be expressed, and can be obtained in a large amount. You can do it. The transformant can be cultured in a medium commonly used in the art. For example, for a transformant using a prokaryotic host such as Escherichia coli as a host, a liquid medium can be suitably used. The medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic substances and the like necessary for the growth of the transformant. As a carbon source, for example, glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc. As a nitrogen source, for example, ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, malt extract, soybean meal, potato extract Examples of the inorganic or organic substance and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride, and calcium carbonate. In addition, yeast, vitamins, casamino acids, growth promoting factors and the like may be added. If necessary, the medium may be supplemented with a substance that induces the activity of the microorganism, a buffer substance that is effective for maintaining the pH of the medium, an antifoaming agent, silicon, decanol, pluronic, and the like. In order to make the promoter work efficiently if necessary, for example, 3β-indolyl
An agent such as acrylic acid can be added.
[0059]
Cultivation of the microorganism can be performed under conditions suitable for growth. Specifically, it can be carried out at a pH of the culture medium of 3 to 10, preferably 4 to 9, and a temperature of 0 to 50C, preferably 20 to 40C. Cultivation of the microorganism can be performed under aerobic or anaerobic conditions. The cultivation time is 1 to 300 hours, more preferably 2 to 300 hours, but should be determined appropriately for each microorganism.
For example, cultivation is usually performed at about 15 to about 45 ° C. for about 3 to about 75 hours for Escherichia coli, and if necessary, aeration and stirring can be applied. The cultivation is usually performed at about 30 ° C. to about 40 ° C. for about 15 to about 72 hours, and if necessary, aeration or stirring is added. The transformant expressing the predetermined gene product can be used as it is, but it can also be used as a cell homogenate, and the predetermined gene product can be isolated and used. When extracting from the above cultured cells, the cells or cells are collected by a known method after culture, suspended in an appropriate buffer, and disrupted by ultrasonication, lysozyme and / or freeze-thawing. After that, a method of obtaining a crude extract by centrifugation or filtration can be appropriately used. The buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 (trade name) or Tween-20 (trade name). When the target product is secreted into the culture solution, after completion of the culture, the supernatant is separated from the cells or cells by a method known per se, and the supernatant is collected. The target product contained in the culture supernatant or the extract thus obtained can be purified by appropriately combining known separation and purification methods, for example, by a salt such as ammonium sulfate precipitation method. Precipitation, gel filtration by Sephadex, etc., for example, ion-exchange chromatography using a carrier having a diethylaminoethyl group or a carboxymethyl group, etc., for example, a carrier having a hydrophobic group such as a butyl group, an octyl group, a phenyl group, etc. Purified by hydrophobic chromatography, dye gel chromatography, electrophoresis, dialysis, ultrafiltration, affinity chromatography, reverse phase chromatography, high performance liquid chromatography, etc. it can. Preferably, it can be purified and separated by polyacrylamide gel electrophoresis, affinity chromatography in which a ligand or the like is immobilized, or the like. Examples include gelatin-agarose affinity chromatography, heparin-agarose chromatography, and the like. These methods can be carried out by applying them alone or in an appropriate combination.
[0060]
The obtained protein (which may include a peptide or polypeptide) can be immobilized by binding it to a suitable carrier or solid phase by a known technique such as enzyme immunoassay. The immobilized protein and the immobilized peptide can be conveniently used for a binding assay and a substance screening. The purified recombinant protein can be suitably used as an immunizing antigen for producing a monoclonal antibody.
The polypeptide may be modified by modifying the amino acid residues contained in the polypeptide by a chemical method, or by modifying the polypeptide with an enzyme such as pepsin, chymotrypsin, papain, bromelain, endopeptidase, exopeptidase, and the like. Can be partially decomposed into derivatives thereof.
Modification and alteration of the structure of proteins and polypeptides can be performed by referring to, for example, “Chemical Chemistry Experiment Course 1, Protein VII, Protein Engineering,” edited by The Biochemical Society of Japan, Tokyo Kagaku Dojin (1993), or the method described there or It can be carried out by the methods described in the cited documents, or by methods substantially similar thereto. The biological activity may also include having an immunological activity, for example, having antigenicity. Examples of the modifications include the introduction of amino groups, SH groups and / or carboxyl groups, acylation such as silylation, deamination, hydroxylation, phosphorylation, methylation, and acetylation, oxidation, reduction, and cleavage. It may be a ring, ring closure, substitution to a D-form amino acid residue, or the like. Those methods are known in the art.
As used herein, “substantially equivalent” refers to the activity of a polypeptide, for example, acts on 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene, and acts on 3,4-difluoro-2-((R) -2). It means that the reducing activity with high asymmetric selectivity such as forming (hydroxypropyloxy) nitrobenzene, the corresponding physiological activity, and the biological activity are substantially the same. Furthermore, the meaning of the term may include a case having substantially the same activity, and the substantially same activity includes, for example, 2-acetonyloxy-3,4- An enzyme activity that acts on difluoronitrobenzene to generate 3,4-difluoro-2-((R) -2-hydroxypropyloxy) nitrobenzene can be mentioned. The term “substantially the same activity” means that those activities are the same in nature, for example, that they are physiologically, asymmetrically synthesized, or biologically the same. For example, the activities such as the carbonyl reductase activity are equivalent (for example, about 0.0001 to 10000-fold, preferably about 0.001 to 1000-fold, more preferably about 0.01 to 200-fold, and still more preferably about 0-fold. (0.5 to 10 times), but the quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different.
[0061]
According to the present invention, a carbonyl reductase gene having a specific activity in asymmetric reduction performance has been identified, and thus the DNA sequence encodes a carbonyl reductase and a related protein having similar activities in various microorganisms, for example. For screening genomic DNAs and cDNAs of microorganisms, and designing probes for detecting specific asymmetric reduction ability. The probe can be provided with a label widely used in the art, if necessary. For gene isolation, a PCR method and a PCR method using reverse transcriptase (RT) (RT-PCR) can be used. For example, if a predetermined cDNA is used as a probe, a carbonyl reductase gene having a unique asymmetric reducing ability in cells can be detected and measured by, for example, Northern blotting, Southern blotting, in situ hybridization, or the like. .
Related proteins or polypeptides disclosed herein, fragments thereof, and nucleic acids (including mRNAs and oligonucleotides) including DNAs can be used alone or organically, and further, antisense technology, It can be applied to genomics and proteomics technology by appropriately combining antibodies, including monoclonal antibodies, recombinant microorganisms, and the like. It becomes possible to perform gene expression analysis, gene function analysis, protein-protein interaction analysis, and related gene analysis using nucleic acid arrays and protein arrays. For example, in the nucleic acid array technology, a cDNA library is used, or DNA obtained by the PCR technology is arranged on a substrate at high density by a spotting device, and a sample is analyzed using hybridization.
[0062]
The arraying is performed by using a needle or a pin, or by using an ink-jet printing technique or the like, by attaching DNA to a unique position on a substrate such as a slide glass, a silicon plate, or a plastic plate. Can be. Observing a signal obtained as a result of the hybridization on the nucleic acid array, obtains data. The signal may be obtained from a label such as a fluorescent dye (eg, Cy3, Cy5, BODIPY, FITC, Alexa Fluor dyes (trade name), Texas red (trade name), etc.). A laser scanner or the like may be used for detection, and the obtained data may be processed by a computer system equipped with a program according to an appropriate algorithm. In protein array technology, tagged recombinant expressed protein products may be used, including two-dimensional electrophoresis (2-DE), mass spectrometry (MS) including enzymatic digestion fragments (including electrophoresis). Includes techniques such as spray ionization (ESI), matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI), and MALDI-TOF analyzer, ESI-3 quadrupole analyzer. , An ESI-ion trap analyzer, etc.), staining techniques, isotope labeling and analysis, image processing techniques, and the like. Accordingly, the present invention may also include software, databases, and the like relating to the enzyme gene systems and the like obtained or usable above and antibodies thereto.
[0063]
The present invention provides an application for producing an alcohol compound by reducing the carbonyl group-containing compound of the carbonyl reductase. For example, there is provided a method for producing an alcohol compound by reducing a carbonyl group-containing compound such as a ketone in the presence of the carbonyl reductase. Since the carbonyl reductase of the present invention performs asymmetric reduction, it is advantageous in industrial use such as producing a specific optically active alcohol compound. Enzyme molecules, processed products thereof, cultures containing the enzyme molecules, immobilized enzymes, transformant microorganisms producing the enzymes, etc. (the transformants may be alive or immobilized). By bringing the enzyme into contact with the reaction solution, the desired enzyme reaction can be carried out, but the form of contact between the enzyme and the reaction solution is not limited to these specific examples. The reaction solution is obtained by dissolving a substrate and a coenzyme necessary for the enzyme reaction in a suitable solvent that provides an environment for expressing the enzyme activity. The treated product of a microorganism containing a carbonyl reductase in the present invention is, specifically, a microorganism whose permeability of a cell membrane has been changed by treatment with a surfactant or an organic solvent such as toluene, or a cell obtained by treatment with glass beads or an enzyme. It includes a crushed cell-free extract and a partially purified extract thereof. The processed product of the microorganism may include, for example, a crude extract, cultured cells, freeze-dried organisms, acetone-dried organisms, and ground products of these cells.
[0064]
In one embodiment of the present invention, a compound represented by the general formula (I) (wherein Xa and Xb may be the same or different and each represents a halogen atom) is converted to a carbonyl specified in the present invention. Treating with a reductase or a cell of a transformed microorganism capable of producing the enzyme and selected from the group consisting of a culture thereof, a processed product thereof, and an extract; (Wherein Xa and Xb have the same meaning as described above). In the above formulas (I) and (II), both Xa and Xb are preferably fluorine atoms, and 3,4-difluoro-2-((R) -2-hydroxypropyloxy) nitrobenzene is suitably obtained. In another embodiment of the present invention, a compound represented by general formula (III): ₁ And R ₂ Is each independently a hydrogen atom, a halogen atom or an alkyl group; ₃ Is a substituted or unsubstituted alkyl or aryl group), the carbonyl reductase specified in the present invention, or a cell of a transformed microorganism capable of producing the enzyme and transformed, a culture thereof, An optically active compound represented by the general formula (IV) (wherein R is treated with a substance selected from the group consisting of ₁ , R ₂ And R ₃ Has the same meaning as described above). In the above formulas (III) and (IV), the halogen atom is preferably a chlorine atom, a bromine atom or an iodine atom, and the alkyl group is an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, for example, a methyl group , An ethyl group, a propyl group, a butyl group, an isopropyl group, and the like. ₃ Is a substituted alkyl group, ₃ Is, for example, a benzyl group. R ₃ Examples of the aryl group include a phenyl group and a tolyl group. ₃ Is a substituted aryl group, ₃ Is, for example, a fluorophenyl group, a chlorophenyl group or the like. Representative compounds (III) include methyl 4-chloroacetoacetate, ethyl 4-chloroacetoacetate, methyl 4-bromoacetoacetate, ethyl 4-bromoacetoacetate, ethyl 4-iodoacetoacetate, ethyl 2-chloro-3-oxobutyrate, Ethyl 2-methyl-3-oxobutyrate and the like.
[0065]
In the present invention, when using microbial cells or a microorganism culture thereof, the treatment can be performed in the presence of an energy source. Examples of the cells include those obtained by harvesting the above-mentioned microorganisms from a culture solution, those collected and washed from the culture solution, and those dried or treated with acetone powder. Enzymes and cells can be used as they are or in an immobilized form. The immobilization can be performed by a method well known to those skilled in the art (for example, a crosslinking method, a physical adsorption method, an entrapment method, and the like). The immobilization carrier may be any commonly used one, for example, polysaccharides such as cellulose, agarose, dextran, κ-carrageenan, alginic acid, gelatin, cellulose acetate; natural polymers such as gluten; Examples thereof include inorganic substances such as activated carbon, glass, clay, kaolinite, alumina, silica gel, bentonite, hydroxyapatite, and calcium phosphate; and synthetic polymers such as polyacrylamide, polyvinyl alcohol, polypropylene glycol, and urethane. The cells can also be used in a form encapsulated in microcapsules, and can be appropriately selected and used from methods known in the art.
[0066]
Examples of the culture include those obtained by culturing the above microorganism in an appropriate medium. As the processed product and extract of the microorganism, the cells or the culture are suspended in a buffer, if necessary, and the resulting suspension is obtained by autolysis, or a French press, an ultra-fine press, or the like. Sonic waves, physical methods such as a homogenizer, and may further refer to a crushed bacterial cell obtained by crushing in combination with an enzymatic method such as lysozyme, or water obtained from the product obtained in this manner. Alternatively, the extract obtained with an appropriate buffer, the precipitate obtained by adding ammonium sulfate or alcohol to the extract, and the extract are separated using ultrafiltration, gel filtration, hydrophobic chromatography, ion exchange chromatography, or the like. Painted ones can be mentioned. The processed product and extract of the microorganism may be those obtained by heat-treating the cells or culture, if necessary, or those obtained by subjecting the heat-treated product to the above-described treatment. The heat treatment can be performed by a method known in the art, and specific conditions can be appropriately determined by experiments or the like according to the purpose. The temperature of the heat treatment is, for example, about 37 ° C. or higher, and is, for example, about 40 to 70 ° C., preferably about 45 to 60 ° C. The time of the heat treatment depends on the treatment temperature, but is, for example, about 5 minutes to about 24 hours, preferably about 30 minutes to 10 hours, and more preferably about 1 to 5 hours. The treatment is carried out at about 45 ° C., about 50 ° C. or about 55 ° C. for about 2 to 4 hours, preferably at about 45 ° C. to 55 ° C. for about 3 hours. By using a heat-treated one, good results including selectivity and conversion can be obtained.
[0067]
As a reaction method in the production of the phenoxypropane derivative (II) according to the present invention, the phenoxyacetone derivative represented by the general formula (I) is transformed with the carbonyl reductase or the enzyme capable of producing the enzyme. A method for producing a corresponding optically active phenoxypropane derivative represented by the general formula (II) by the action of a microorganism selected from the group consisting of microbial cells, cultures thereof, processed products thereof and extracts. It is not particularly limited as long as it is an aqueous solution of the starting compound, the isolated enzyme, the cells washed with a buffer or water of a transformant capable of producing the enzyme, or a culture of the transformant, The reaction is initiated by mixing one selected from the group consisting of the processed product and the extract. The reaction can usually be carried out in water or in a liquid two-phase system of an organic solvent substantially insoluble or hardly soluble in water and water, but is generally preferably carried out in an aqueous system. The phenoxyacetone derivative represented by the general formula (I) may be dissolved in an appropriate organic solvent such as ethanol, methanol, dioxane, or dimethyl sulfoxide, if necessary, and then used as an aqueous solution. You can also.
[0068]
The reaction conditions can be selected within a range that does not impair the production of the optically active phenoxypropane derivative represented by the general formula (II). The concentration of the compound of formula (I) as a substrate is preferably 0.001 to 20%, more preferably 0.01 to 10%. Further, the pH of the reaction solution is preferably 5 to 9, more preferably 6 to 8, and the reaction temperature is preferably 10 to 50 ° C, more preferably 20 to 40 ° C. Buffers can also be used to stabilize the pH. Further, the pH can be adjusted using an acid or a base. The reaction time is from 1 to 200 hours, preferably from 5 to 150 hours, and should be determined appropriately depending on the respective enzyme concentrations and the transformants used. The production of compound (IV) from compound (III) can be carried out in the same manner as described above.
[0069]
In the reduction reaction of the present invention, a coenzyme or the like may be added. Examples of the coenzyme include NADH, NADPH, etc., each of which may be used alone, or may be used in the form of a mixture thereof. 1 to 3 times the amount. Means can be taken to assist in regenerating the oxidized coenzyme produced from the reduced coenzyme accompanying the reduction reaction of the present invention. The regeneration of the coenzyme is carried out by the NAD ⁺ Oxidized coenzyme reduction ability such as reduction ability (glycolysis system, methylotroph C1 compound utilization pathway, etc.) can be used. For example, NAD ⁺ The reducing ability can be enhanced by adding glucose, ethanol, formic acid or the like to the reaction system. Alternatively, the reaction can be carried out by adding a microorganism capable of producing reduced coenzyme, a processed product thereof, a coenzyme regenerating enzyme, and the like to the reaction system. For example, the coenzyme can be regenerated using a microorganism containing an enzyme available for coenzyme regeneration such as glucose dehydrogenase described above, a processed product thereof, and a partially purified or purified coenzyme regenerating enzyme. These components constituting the reaction necessary for coenzyme regeneration may be added to a reaction system for producing an alcohol compound according to the present invention, or may be added as an immobilized component, or exchange of a coenzyme such as NADH may be performed. Contact can be made through a possible membrane.
Further, as described above, an additional enzyme for coenzyme regeneration can be obtained by using a transformant or the like (including a microorganism having a high coenzyme regeneration activity) in which the expression of an enzyme or the like usable for coenzyme regeneration is controlled. It is also possible to perform an efficient reaction without using a reaction system or adding an enzyme for coenzyme regeneration.
[0070]
When a transformant is used, a sugar such as glucose, an organic acid such as acetic acid, or an energy substance such as ethanol or glycerol can be added in order to allow the reaction to proceed more efficiently. These may be used alone or in the form of a mixture thereof. The addition amount is preferably 1/100 to 10 times the amount of the substrate. Further, a saccharide such as glucose, an organic acid such as acetic acid, an energy substance such as glycerol, a coenzyme, a coenzyme regenerating enzyme, and a substrate of a coenzyme regenerating enzyme may be used in combination. These are originally accumulated in the cells, but the reaction rate, yield and the like can be increased by adding these substances as needed, and they can be selected as appropriate.
If necessary, sequentially add a substance selected from the group consisting of the substrate, the enzyme, the microbial cells of the microorganism, the culture thereof, the processed product thereof and the extract to the reaction system, and further, other components. Alternatively, it can be added continuously. The reaction rate can be increased by performing the reaction while continuously taking out the product. The reaction can be performed in a batch system or a continuous system, and a membrane reactor can be used.
The alcohol compound (eg, optically active phenoxypropane derivative (II)) produced by the reaction can be isolated and purified by a conventional separation and purification means. For example, ordinary purification methods such as membrane separation, extraction with an organic solvent (eg, toluene, chloroform, etc.), column chromatography, concentration under reduced pressure, distillation, crystallization, recrystallization, etc., directly or after separating cells from the reaction solution. Can be provided to For example, after the reaction is completed, a crude product can be obtained by extracting the product from the reaction solution with an organic solvent such as butyl acetate, ethyl acetate, toluene, chloroform and the like, and distilling off the solvent. The crude product may be used as it is in the next step, but if necessary, it may be purified by means such as silica gel column chromatography and then further purified by high performance liquid chromatography using an optically active carrier such as a cellulose derivative. May be used for purification.
[0071]
The phenoxyacetone derivative of the general formula (I) used in the present invention can be obtained by a known method. For example, 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene can be obtained from Chem. Pharm. Bull. , 32 (12): 4907-4913, 1984, and it is also known that the compound can be easily synthesized by reacting 2,3-difluoro-6-nitrophenol with chloroacetone in the presence of a strong base. (JP-A-61-246151).
The optically active phenoxypropane derivative (II) obtained according to the present invention can be prepared by a reaction process obvious to those skilled in the art, for example, as described in Japanese Patent No. 261327, Japanese Patent Application Laid-Open No. 1-250369, Japanese Patent Application Laid-Open No. 1-287096, It can be converted to levofloxacin by the method disclosed in, for example, JP-A-2-218648.
The optically active phenoxypropane derivative (II) obtained in the present invention can be prepared by a reaction process obvious to those skilled in the art, for example, in the case of 3,4-difluoro-2-((R) -2-hydroxypropyloxy) nitrobenzene, S)-(-)-7,8-Difluoro-3-methyl-3,4-dihydro-2H- [1,4] benzoxazine derivative.
[0072]
For example, a method for producing an intermediate 2,3-difluoro- (2,2-diethoxycarbonylethenyl) amino-((R) -2- (methanesulfonyloxy) propyloxy) benzene derivative from an optically active phenoxypropane derivative For example, according to the method described in JP-A-1-250369, JP-A-2-218648, etc., for example, the amino nitrogen is converted to methylenemalonate by a dialkylalkoxyethylenemalonate such as diethylethoxymethylenemalonate (EMME). Obtainable. The methylene malonate is subjected to oxazine ring closure with potassium carbonate and converted to (S)-(-)-7,8-difluoro-3-methyl-3,4-dihydro-2H- [1,4] benzoxazine derivative. be able to. Further, as a method for producing an intermediate (S)-(−)-7,8-difluoro-3-methyl-3,4-dihydro-2H- [1,4] benzoxazine derivative from an optically active phenoxypropane derivative, JP-A-2-732 (Examples 22, 23, 24, 33, 39, 40, 41 and 42, etc.) and JP-A-1-250369 (Examples 17, 18, 19, 22, 23, 24) , 25, 26, 27 and 29), which are produced by a combination of a sulfonylation reaction, a reduction of a nitro group, and a ring closing reaction. Specifically, for example, JP-A-1-250369 The optically active phenoxypropane derivative was tosylated using tosyl chloride in pyridine, and the tosyl form was obtained by the method described in Examples 22, 23, 26, 27 and 29 of In methanol, palladium-carbon is added and catalytic reduction is carried out at room temperature and pressure to reduce the nitro group, and then the product is subjected to a ring closure reaction, for example, by dissolving in anhydrous DMF, potassium carbonate and a catalyst. An amount of 18-crown-6-ether is added and stirred with heating. In some cases, a dialkylalkoxymethylene malonate such as diethylethoxymethylene malonate (EMME) is added to a predetermined compound, and the mixture is stirred with heating to convert the amino nitrogen into methylene malonate and subjected to a ring closure reaction in the next step. It may be possible to form a pyridonecarboxylic acid ester structure.
[0073]
In a typical embodiment, 3,4-difluoro-2-((R) -2-hydroxypropoxy) nitrobenzene obtained as described above is obtained by the method described in JP-A-2-732, for example, After the hydroxyl group is sulfonylated with a substituted sulfonyl chloride such as paratoluenesulfonic acid chloride, the nitro group is reduced to give (S)-(-)-7,8-difluoro-3-methyl-3. , 4-Dihydro-2H- [1,4] benzoxazine derivative. To convert the obtained (S)-(−)-7,8-difluoro-3-methyl-3,4-dihydro-2H- [1,4] benzoxazine derivative into the synthetic antibacterial agent levofloxacin, refer to The method described in JP-A-62-252790 may be used.
For example, as a method for producing levofloxacin from (S)-(-)-7,8-difluoro-3-methyl-3,4-dihydro-2H- [1,4] benzoxazine derivative, Japanese Patent Application Laid-Open No. The methods described in JP-A-252790 and JP-A-1-287086 (Examples 4, 5, and 6) can be mentioned. Specifically, for example, Examples 4, 5, and 6 of JP-A-1-287086 can be used. As described in the above, the title benzoxazine derivative is heated to reflux with EMME, if necessary, to form methylene malonate, the methylene malonate is dissolved in acetic acid, and concentrated hydrochloric acid is added to form the corresponding carboxylic acid. Then, in diethyl ether, boron trifluoride diether ether complex is added and stirred. Further, in dimethyl sulfoxide, triethylamine and N-methylpiperazine are added, and the mixture can be stirred and produced.
[0074]
Thus, the present invention provides a method for treating a microorganism selected from the group consisting of an enzyme specified herein, a cell of a microorganism transformed with the enzyme gene, a culture thereof, a processed product thereof, and an extract, The phenoxyacetone derivative of the general formula (I) is used as an optically active phenoxypropane derivative of the general formula (II), and the obtained phenoxypropane derivative (II) is treated according to a known method to obtain levofloxacin. The present invention also relates to a method for producing levofloxacin. In order to produce levofloxacin from the phenoxypropane derivative (II), for example, the following treatments (a) to (g) may be performed in combination: (a) reduction of a nitro group to an amino group, (b) Methylene malonation reaction of amino group, (c) sulfonylation reaction of hydroxy group on 2-hydroxypropyloxy group, (d) ring closing reaction between 2-sulfonyloxypropyloxy group on benzene nucleus and amino nitrogen atom (E) N-methylpiperidine-introducing reaction, (g) N-methylpiperidine-introducing reaction, and (g) Removal of protecting group And / or free carboxyl group formation reaction by hydrolysis of ester.
The reagents and reaction conditions used in the above processes (a) to (g) and the specific processing procedures are described in JP-B-2612327, JP-A-1-250369, JP-A-1-2877096, It is disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-218648, and the contents thereof are to be interpreted as a part of the present specification by referring to the documents.
[0075]
In the specification and drawings, terms are based on the meaning of the terms according to IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or as commonly used in the art. The meanings of typical terms are shown below.
For amino acid sequence:
A: Alanine (Ala) M: Methionine (Met)
C: Cysteine (Cys) N: Asparagine (Asn)
D: Aspartic acid (Asp) P: Proline (Pro)
E: Glutamic acid (Glu) Q: Glutamine (Gln)
F: Phenylalanine (Phe) R: Arginine (Arg)
G: Glycine (Gly) S: Serine (Ser)
H: Histidine (His) T: Threonine (Thr)
I: Isoleucine (Ile) V: Valine (Val)
K: Lysine (Lys) W: Tryptophan (Trp)
L: Leucine (Leu) Y: Tyrosine (Tyr)
X: any of the above amino acids or a specific arbitrary amino acid (if specified, it is the specified amino acid) (Xaa)
For nucleotide sequences:
A, a: adenine G, g: guanine
C, c: cytosine T, t: thymine
R, r: adenine or guanine Y, y: cytosine or thymine / uracil
M, m: adenine or cytosine K, k: guanine or thymine / uracil
S, s: cytosine or guanine W, w: adenine or thymine / uracil
B, b: cytosine or guanine or thymine / uracil
D, d: adenine or guanine or thymine / uracil
H, h: adenine or cytosine or thymine / uracil
V, v: adenine or cytosine or guanine
N, n: adenine or guanine or cytosine or thymine / uracil, unknown,
Or any other base (if specified, it is the specified base)
In the sequence listing, SEQ ID NO: 12 shows the amino acid sequence of GDH derived from Bacillus subtilis, and SEQ ID NO: 13 shows the amino acid sequence of carbonyl reductase derived from Leifsonia naganensis JCM10592.
The transformed recombinant Escherichia coli M15 (pREP4, pAFN11) described in Example 5 described below has been used since March 28, 2003, 1-1 1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Chuo No. 6 (Zip code 305-8566). Deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depository (IPOD), which is deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Institute Organism Depository (IPOD), No. 76 ER, and is deposited and kept at No. 76 ER. Further, the transformed recombinant Escherichia coli M15 (pREP4, pAFN-GDH) described in Example 8 described below has been deposited and stored in the IPOD since March 28, 2003 (Accession No. FERM P- 19277).
[0076]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the examples are merely provided for describing the present invention and for referencing specific embodiments thereof. These exemplifications are intended to illustrate certain specific embodiments of the present invention, but are not intended to limit or limit the scope of the invention disclosed herein. It is to be understood that the invention is capable of various embodiments based on the teachings herein.
All examples, unless otherwise described in detail, are performed or can be performed using standard techniques, which are well known and routine to those skilled in the art. . Techniques that include commonly used DNA cloning in the following examples include standard laboratory manuals such as Sambrook, E .; F. Fritsch & T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) & J. Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001). Particularly in the PCR method, R. Saiki et al. R., Science, 230: 1350, 1985; Saiki et al. H., Science, 239: 487, 1988; A. Erlich (ed.), PCR Technology, Stockton Press, 1989; M. Glover et al. (Ed.), "DNA Cloning", 2nd ed. , Vol. M.1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); A. Innis et al. (Ed.), "PCR Protocols: a Guide to Methods and Applications", Academic Press, New York (1990)); J. McPherson, P .; Quirke and G.A. R. Taylor (ed.), PCR: Performed according to the method described in a practical approach, IRL Press, Oxford (1991), and, if a commercially available reagent or kit is used, instructions attached thereto. (Protocols) and attached chemicals.
[0077]
[Example 1: Purification of carbonyl reductase]
GPY liquid medium (1% glucose, 0.5% polypeptone, 0.3% yeast extract, tap water (pH 7)) 3000 mL was prepared, and 500 mL was dispensed into a 2000 mL Erlenmeyer flask at 120 ° C. Steam sterilization was performed for 20 minutes. A 1/100 amount of Leifsonia naganensis JCM 10592, which had been cultured in a small amount in the same GPY medium, was added and cultured at 30 ° C. for 1 to 2 days (OD ₆₁₀ > 3). The cells were collected from the culture by centrifugation to obtain 80 g of wet cells. The cells were suspended in 1 mL of 10 mM phosphate buffer (pH 6) per gram of cells, and crushed by an ultrasonic crusher (US-300, manufactured by Nippon Seiki Seisaku-sho, Ltd.). Cell debris was removed from the cell lysate by centrifugation to obtain 70 mL of a cell-free extract.
Ammonium sulfate was added to the cell-free extract to dissolve ammonium sulfate so as to be 30% saturated, and then the precipitate was separated by centrifugation. Ammonium sulfate was further added to the supernatant so as to be 50% saturated and dissolved. And the precipitate was separated by centrifugation. The precipitated portion was dissolved in 10 mM phosphate buffer (pH 6) to 1 g / 10 mL, and 1 L of 10 mM phosphate buffer (pH 6) was used using a dialysis membrane having a molecular weight cut off of 12,000. ) Was dialyzed for 16 hours at 4 ° C. The above dialyzed solution was applied to a DEAE Sepharose carrier (manufactured by Pharmacia Biotech, volume 10 mL) equilibrated with a 10 mM phosphate buffer (pH 6) to elute proteins with a gradient of 0 to 1 M NaCl to elute the active fraction. The fraction was dialyzed for 16 hours at 4 ° C. with 1 L of a 10 mM phosphate buffer (pH 6) using a dialysis membrane having a molecular weight cutoff of 12,000.
The following measuring method was used for the activity measuring method. In 100 mM phosphate buffer (pH 6.0), 0.02% (wt%) 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene as a substrate, 0.2 mM NADPH as a coenzyme, and an enzyme solution (20%) were used. ２００200 μL / mL reaction solution) and measuring the increase or decrease in absorbance at a wavelength of 340 nm at 25 ° C. Under these reaction conditions, 1 μmol of NADPH was converted to NADP per minute. ⁺ The enzymatic activity to oxidize to 1 unit was defined as 1 unit.
The above-mentioned DEAE Sepharose-treated dialysis solution was applied to Blue Sepharose (Pharmacia Biotech, 5 mL in volume) equilibrated with 10 mM phosphate buffer (pH 6), and 3 times the volume of 10 mM phosphate buffer ( Wash with pH 6) and elute the active fraction with 1M NaCl. The eluate was dialyzed against 1 L of a dialysate of 10 mM phosphate buffer (pH 6) at 4 ° C. for 16 hours using a dialysis membrane having a molecular weight cutoff of 12,000.
The above Blue Sepharose-dialysis end solution was applied to a Mono Q HR 5/5 (FPLC system manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) column, and the active fraction was eluted with a gradient of 10 mM phosphate buffer (pH 7) and 0 to 1 M NaCl. The product was eluted to obtain a purified enzyme preparation.
[0078]
[Example 2: Properties of enzyme]
The properties of the enzyme obtained in Example 1 were examined. The measuring method of the enzyme activity is the same as the measuring method described in Example 1.
(1) action: acts on 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene and has an optical purity of 99% e. e. The above 3,4-difluoro-2-((R) -2-hydroxypropyloxy) nitrobenzene was produced.
(2) Substrate specificity: Using 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene and ethyl 4-chloroacetoacetate as substrates, enzyme activity was measured in the same manner as in Example 1, and both showed high activity. . The activity when 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene was used as a substrate: 0.0999 U when ethyl 4-chloroacetoacetate was used as a substrate when 0.0543 U was 100%. , 184%.
(3) Coenzyme: Both NADPH and NADH can be used as coenzymes.
When the activity was measured using the respective coenzymes by the above-mentioned activity measuring method, the activity when NADPH was measured as a coenzyme was 100%, and the activity when NADH was measured as a coenzyme was 216%.
(4) Optimum pH: When the activity of this enzyme was measured in the range of 5 to 7 in the buffer in the activity measurement method described in Example 1, the activity at pH 6 was assumed to be 100%. Was as follows. pH 5: 27.6%, pH 5.5: 87.0%, pH 6: 100%, pH 6.5: 52.2%, pH 7: 24.9%. As a result, the optimum pH was 5.5 to 6.0.
(5) pH stability: When the pH of the enzyme solution was changed from 3 to 9 and the residual activity after 2 hours at 25 ° C. was examined, as shown in Table 1, the pH between 5.5 and 9 was determined. Enzyme activity was stable.
[0079]
[Table 1]

[0080]
(6) Optimum reaction temperature: When the temperature of the reaction solution of this enzyme was measured in the range of 20 to 60 ° C in the activity measurement method described in Example 1, the activity at 20 ° C was 100% (0.0687 U The activity at each temperature in the case of) was as follows. 20 ° C: 100%, 30 ° C: 116.6%, 40 ° C: 109.3%, 50 ° C: 150.8%, 60 ° C: 126.9%. As a result, the optimum reaction temperature was about 50 ° C.
(7) Inhibitor: In the method for measuring the activity of the present enzyme, the residual activity when the inhibitor was added at the concentration shown in the following table was as shown in Table 2 below. It was not inhibited by copper sulfate or quercetin.
[0081]
[Table 2]

[0082]
(8) Molecular weight: The molecular weight of this enzyme was measured using Hi Load 16/60 Superdex 200 PG (FPLC system manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) using 10 mM phosphate buffer (pH 7) containing 0.1 M NaCl. The molecular weight was about 70,000 as measured by using. The molecular weight of the enzyme subunit was about 29,000 as a result of electrophoresis on a 10% -SDS polyacrylamide gel in the presence of 2% (V / V) 2-mercaptoethanol and calculation from the mobility of the standard protein. .
[0083]
[Example 3: Cloning of carbonyl reductase gene]
(Preparation of DNA library)
Genomic DNA was extracted from cultured cells of Leifsonia naganoensis JCM 10592 (the culture method was the same as in Example 1) using a Qiagen genomic chip (Qiagen). The extracted genomic DNA is limitedly digested with a restriction enzyme Sau3A1, and a 15 to 23 kb DNA fragment is ^TM It was inserted into the BamHI site of a II phage vector (Stratagene). After in vitro packaging of the obtained recombinant phage vector using Gigapack III Gold (manufactured by Stratagene), this was infected with Escherichia coli XL1-Blue MRA to prepare a genomic DNA library consisting of about 5,000 pieces.
[0084]
(Preparation of synthetic oligonucleotide probe)
The carbonyl reductase obtained as in Example 1 was electrophoresed at Native-PAGE (10% acrylamide, 375 mM Tris-HCl (pH 8.9)) at 10 to 20 mA, and the gel was colored with the following composition. A zymography assay was performed on the solution (room temperature, 30 minutes).
Coloring solution:
40 mM Tris-HCl (pH 6.8), 0.1 mM NAD ⁺ , 5 mM R-HPNB, 0.2 mg / mL phenazine methosulfate, 0.3 mg / mL iodonitro tetragolium violet
The gel at the same position as the band that became red in this color reaction was cut out, and the target active band was dissolved in an elution solution (0.3% Tris, 1.44% glycine) using a model 422 electroelution device (Bio-Rad). Electroeluted. The extract was electrophoresed on a 10% -SDS polyacrylamide gel in the presence of 2% (V / V) 2-mercaptoethanol and transferred to a nitrocellulose membrane. The band of the target enzyme was cut out from the nitrocellulose membrane, and the N-terminal amino acid sequence of the target enzyme was analyzed using a primary protein sequence analyzer (PPSQ-21) (Shimadzu Corporation). SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 1) A DNA probe for hybridization was designed. As a result of the analysis, the N-terminal amino acid sequence of the purified carbonyl reductase obtained in Example 1 was Met-Gly-Glu-His-Gln-Gly-Asp-Gly-Leu-Arg-Lys-Phe-Ala- Val-Glu-Gln-Arg [SEQ ID NO: 11].
[0085]
DNA probe sequence for hybridization [SEQ ID NO: 1]
GCN CAR TAY GAY GTN WSN AAY MGN WSN GCN ATH GTN ACN GGN GCN CAY WSN GGN ATH GGN GCN CAY GAR GAR GCN GAY GAY GAR GCN
(However, R = A / G, Y = C / T, M = A / C, K = G / T, S = C / G, W = A / T, B = C / G / T, D = A / G / T, H = A / C / T, V = A / C / G and N = A / G / C / T)
[0086]
(Cloning of carbonyl reductase gene from genomic DNA library)
Plaque hybridization was performed with the prepared genomic DNA library and a hybridization DNA probe labeled using a digoxigenin labeling / detection kit (manufactured by Roche Diagnostics) (Cell. Mol. Biol. 41, 883 ( 1995)). Phage DNA was purified from the resulting positive plaques using a Qiagen lambda kit (Qiagen).
The phage DNA purified by the above method was cleaved with the restriction enzyme Sal I, and subjected to Southern hybridization with a hybridization DNA probe labeled using a digoxigenin labeling / detection kit (manufactured by Roche Diagnostics). As a result, a DNA fragment of about 2.5 kb could be detected with the DNA probe for hybridization. This 2.5 kb DNA fragment was ligated to the SalI cleavage site of plasmid pUC18 (TOYOBO) using Ligation High (TOYOBO) at 42 ° C. for transformation E. coli JM109 (TAKARA). Transformation was performed by applying a temperature stimulus of 90 seconds. This Escherichia coli was cultured in an LB plate medium (1% trypsin, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, tap water (pH 7), 1% agar powder, autoclave at 121 ° C. for 20 minutes, selection marker: ampicillin 100 μg / mL) ) At 37 ° C., and the emerged colonies were cultured in LB medium (1% trypsin, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, tap water (pH 7), autoclave at 121 ° C. for 20 minutes, selection marker: ampicillin) (100 μg / mL) at 37 ° C., and the plasmid was purified from Escherichia coli using the GFX Micro Plasmid Prep Kit (Amersham Pharmacia). This plasmid was designated as "pAFN3".
[0087]
(Determination of base sequence)
The above inserted gene portion (2.5 kb) of the plasmid pAFN3 was obtained using the BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit Ver. 3 (manufactured by Applied Biosystems) and ABI Prism 310 Genetic Analyzer (manufactured by Applied Biosystems). As a result, the gene sequence of the target enzyme shown in SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 2) was confirmed. The amino acid sequence deduced from the gene sequence of SEQ ID NO: 2 is shown in SEQ ID NO: 3 (SEQ ID NO: 3).
[0088]
[Example 4: Preparation of recombinant plasmid into which carbonyl reductase gene has been introduced]
A recombinant plasmid for expressing the carbonyl reductase gene in Escherichia coli was prepared. Using the primers shown in SEQ ID NOs: 4 and 5 (SEQ ID NOs: 4 & 5), the AFN gene was amplified by PCR using plasmid pAFN3 as a template, and the start codon was replaced with the SphI termination codon and the HindIII restriction enzyme sequence. Added. The PCR conditions are as follows. PCR reaction solution (0.2 mM dNTPs, 1 mM MgSO ₄ 0.3 μM primer, 10 to 200 ng template DNA, KOD-Plus-DNA Polymerase (manufactured by TOYOBO) 1 unit / 50 μL-reaction solution, 10 × PCR buffer for KOD-Plus 1 / 10-reaction solution, sterilized water) PCR device: Using a master cycler gradient (manufactured by Eppendorf), a PCR reaction was performed at 94 ° C for 15 seconds → [55 ° C for 30 seconds → 68 ° C for 1 minute] × 30 cycles.
[0089]
5′-GTCCGTGGGGCGCATGCGCGAGCACCAGGGCG-3 ′ [SEQ ID NO: 4]
5'-GACCGCAAGCTTCGATCAGGCGCCGACCACG-3 '[SEQ ID NO: 5]
[0090]
The carbonyl reductase gene amplified by the above method is digested with restriction enzymes SphI and HindIII, and Ligation High (manufactured by TOYOBO) is used at the SphI-HindIII site (downstream of the T5 promoter) of plasmid pQE70 (manufactured by Qiagen). Ligation was performed, and Escherichia coli JM109 (manufactured by TAKARA) for transformation was transformed by applying a temperature stimulus of 42 ° C. and 90 seconds. This Escherichia coli was cultured at 37 ° C. using an LB plate medium (selection marker: ampicillin 100 μg / mL), and the resulting colonies were cultured at 37 ° C. using an LB medium (selection marker: ampicillin 100 μg / mL). Plasmids were purified from Escherichia coli using a microplasmid prep kit (Amersham Pharmacia). This plasmid was designated as "pAFN11".
[0091]
Example 5: Preparation of recombinant Escherichia coli transformed with carbonyl reductase gene
The recombinant plasmid prepared in Example 4 was transformed into Escherichia coli M15 (pREP4) (manufactured by Qiagen) to prepare Escherichia coli M15 (pREP4, pAFN11). The transformant M15 (pREP4, pAFN11) has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (IPOD) on March 28, 2003 under the accession number FERM P-19276.
[0092]
[Example 6: Measurement of carbonyl reductase activity by recombinant Escherichia coli transformed with carbonyl reductase gene]
The recombinant Escherichia coli prepared in Example 5 was used in an LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, tap water (pH 7), autoclave 121 ° C, 20 minutes, selection marker: ampicillin 100 µg / mL) , Kanamycin 25 μg / mL) and OD ₆₁₀ Add 1 mM IPTG between 0.4-0.6 and add OD ₆₁₀ Upon reaching> 1, the cells were precipitated by centrifugation. Further, the cells were suspended in a 10 mM phosphate buffer (pH 6), disrupted by an ultrasonic disrupter (US-300, manufactured by Nippon Seiki Seisaku-sho, Ltd.), and the cell-free extract from which cell residues were removed by centrifugation was removed. Obtained. The activity of this extract was measured using the activity measurement method described in Example 1. When the activity of Escherichia coli M15 (pREP4) not transformed with the carbonyl reductase gene was defined as 100%, the activity of Escherichia coli M15 (pREP4, pAFN11) was 240 to 490%. .
[0093]
[Example 7: Preparation of plasmid into which carbonyl reductase gene and coenzyme regenerating enzyme (glucose dehydrogenase, GDH) gene are inserted]
(Cloning of coenzyme regeneration gene (glucose dehydrogenase, GDH))
Based on the previously published gene sequence of the GDH gene (DDBJ accession No. M12276), the primers shown in SEQ ID NOs: 6 and 7 (SEQ ID NOs: 6 & 7) were used to obtain primers from Bacillus subtilis IFO 3026. The GDH gene was amplified by PCR using genomic DNA extracted using a Qiagen genomic chip (Qiagen) as a template. The PCR conditions are as follows. PCR reaction solution (0.2 mM dNTPs, 1 mM MgSO ₄ , 0.3 μM primer, 10-200 ng template DNA, KOD-Plus-DNA Polymerase (manufactured by TOYOBO) 1 unit / 50 μL-reaction solution, 10 × PCR buffer for KOD-Plus 1 / 10-reaction solution, sterilized water) PCR device: Using a master cycler gradient (manufactured by Eppendorf), a PCR reaction was performed at 94 ° C for 15 seconds → [55 ° C for 30 seconds → 68 ° C for 1 minute] × 30 cycles.
[0094]
5'-GAGGGAATTCATACATGTATCCAGATTTA-3 '[SEQ ID NO: 6]
5'-GGTAAGCTTTCATTAACCGCGGCCTGCC-3 '[SEQ ID NO: 7]
[0095]
The amplified GDH gene has EcoRI as a start codon and a HindIII restriction enzyme cleavage sequence as a stop codon. The amplified GDH gene was digested with EcoRI and HindIII, ligated to the EcoRI-HindIII site of plasmid pUC18 using Ligation High (manufactured by TOYOBO), and transformed into E. coli JM109 (manufactured by TAKARA) for transformation at 42 ° C. Transformation was performed by applying a temperature stimulus of 90 seconds. This Escherichia coli was cultured at 37 ° C. using an LB plate medium (selection marker: ampicillin 100 μg / mL), and the resulting colonies were cultured at 37 ° C. using an LB medium (selection marker: ampicillin 100 μg / mL). Plasmids were purified from Escherichia coli using a microplasmid prep kit (Amersham Pharmacia). This plasmid was designated as "pUC-GDH1". The gene sequence of the GDH gene cloned by the above method was used to prepare the ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit Ver. 3 (manufactured by Applied Biosystems) and ABI Prism 310 Genetic Analyzer (manufactured by Applied Biosystems). As a result, the gene sequence of the GDH enzyme shown in FIG. 1 and SEQ ID NO: 8 (SEQ ID NO: 8) was confirmed.
[0096]
(Preparation of GDH transgenic E. coli)
The plasmid pUC-GDH1 into which the GDH gene was introduced was transformed into E. coli M15 (pREP4) for transformation (Qiagen) by applying a temperature stimulus of 42 ° C. for 90 seconds to the LB plate medium (selective marker: ampicillin 100 μg / mL). And kanamycin 25 μg / mL) at 37 ° C., and the resulting colonies were cultured at 37 ° C. using an LB medium (selective marker: ampicillin 100 μg / mL, kanamycin 25 μg / mL), and Escherichia coli M15 (pREP4 , PUC-GDH1). The Escherichia coli was cultured in an LB medium (selective marker: ampicillin 100 μg / mL, kanamycin 25 μg / mL) (37 ° C.) and OD ₆₁₀ When 1 mM IPTG (isopropyl-β-D (−)-thiogalactopyranoside) was added between 0.4 and 0.6, ₆₁₀ Cultured until> 1.
This Escherichia coli was disrupted using an ultrasonic disrupter (US-300, manufactured by Nippon Seiki Seisaku-sho, Ltd.), and the activity was measured using a cell-free extract from which cell residues were removed by centrifugation.
[0097]
(Method for measuring GDH activity)
The GDH activity was measured in a 100 mM phosphate buffer (pH 6.0) using 0.1 M glucose as a substrate and 2.5 mM NAD as a coenzyme. ⁺ And a cell-free extract (20 μL / mL reaction solution) was added, and the increase in absorbance at a wavelength of 340 nm was measured at 25 ° C. Under these reaction conditions, 1 μmol of NAD ⁺ Is defined as 1 unit. As a result of the measurement, the GDH activity of Escherichia coli M15 (pREP4, pUC-GDH1) was at least 5 times higher than that of M15 (pREP4) in which the GDH gene-introduced plasmid as a control was not transformed.
[0098]
(Preparation of carbonyl reductase gene and GDH gene co-expressed recombinant plasmid)
A plasmid for coexpressing the GDH gene cloned by the above method with the carbonyl reductase gene was prepared. Using the plasmid pUC-GDH1 in which the GDH gene was cloned as a template, primers represented by SEQ ID NOS: 9 and 10 (SEQ ID NOs: 9 & 10) were prepared, and the start codon and the stop codon of GDH were restricted to Hind III by PCR. An enzyme cleavage sequence was added. The conditions for PCR are as follows. PCR reaction solution (0.2 mM dNTPs, 1 mM MgSO ₄ , 0.3 μM primer, 10-200 ng template DNA, KOD-Plus-DNA Polymerase (manufactured by TOYOBO) 1 unit / 50 μL-reaction solution, 10 × PCR buffer for KOD-Plus 1 / 10-reaction solution, sterilized water) Apparatus: Using a master cycler gradient (manufactured by Eppendorf), a PCR reaction was carried out at 94 ° C for 15 seconds → [62 ° C for 30 seconds → 68 ° C for 1 minute] × 30 cycles.
[0099]
5'-AAAAAAGCTTATGTATCCGGATTTA-3 '[SEQ ID NO: 9]
5'-GCCCAAGCTTTTAACCGCCGGCCTGCCTG-3 '[SEQ ID NO: 10]
[0100]
The amplified DNA fragment obtained by digesting the GDH gene with HindIII was ligated to the HindIII site of the recombinant plasmid pAFN11 into which the carbonyl reductase gene had been introduced using Ligation High (manufactured by TOYOBO) and transformed into Escherichia coli JM109 (TAKARA). Was transformed by applying a temperature stimulus of 42 ° C. and 90 seconds. This Escherichia coli was cultured at 37 ° C. using an LB plate medium (selection marker: ampicillin 100 μg / mL), and the resulting colonies were cultured at 37 ° C. using an LB medium (selection marker: ampicillin 100 μg / mL). Plasmids were purified from Escherichia coli using a microplasmid prep kit (Amersham Pharmacia). The insertion direction of the GDH gene in this plasmid was confirmed by PCR using the primers shown in SEQ ID NOs: 9 and 14. PCR conditions are as follows. PCR reaction solution (0.2 mM dNTPs, 1 mM MgSO ₄ , 0.3 μM primer, 10-200 ng template DNA, KOD-Plus-DNA Polymerase (manufactured by TOYOBO) 1 unit / 50 μL-reaction solution, 10 × PCR buffer for KOD-Plus 1 / 10-reaction solution, sterilized water) PCR device: Using a master cycler gradient (manufactured by Eppendorf), a PCR reaction was performed at 94 ° C for 15 seconds → [62 ° C for 30 seconds → 68 ° C for 1 minute] × 30 cycles. A plasmid in which a DNA fragment of about 0.8 kb was amplified by this PCR was named "pAFN-GDH", a recombinant plasmid for co-expression of a carbonyl reductase gene and a coenzyme regenerating gene (GDH gene).
5'-GTTCTGAGGTCATTACTGG-3 '[SEQ ID NO: 14]
[0101]
[Example 8: Preparation of transformant having carbonyl reductase and GDH enzyme genes]
The recombinant plasmid pAFN-GDH prepared by the above method was transformed into E. coli M15 (pREP4) for transformation (Qiagen) by applying a temperature stimulus of 42 ° C. and 90 seconds for LB plate medium (selective marker: ampicillin 100 μg / and Kanamycin (25 μg / mL) at 37 ° C., and the resulting colonies were cultured at 37 ° C. using LB medium (selective marker: ampicillin 100 μg / mL), and E. coli M15 (pREP4, pAFN-DH) Was prepared. The transformant M15 (pREP4, pAFN-GDH) has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (IPOD) on March 28, 2003 as Accession No. FERM P-19277.
[0102]
[Example 9: Asymmetric reduction reaction using a transformant into which a plasmid into which the present enzyme gene has been inserted]
The recombinant Escherichia coli M15 (pREP4, pAFN11) and M15 (pREP4, pAFN-GDH) prepared in Examples 5 and 8 were cultured in an LB medium (selective marker: ampicillin 100 μg / mL, kanamycin 25 μg / mL), and OD610 was 0. Add 1 mM IPTG between 0.4-0.6 and add OD ₆₁₀ After reaching> 1, the cells were precipitated by centrifugation, and the cells were suspended in 10 mM phosphate buffer (pH 6) and disrupted with an ultrasonic disrupter (US-300, manufactured by Nippon Seiki Seisaku-sho, Ltd.). . Using a cell-free extract from which cell residues were removed by centrifugation or a cell suspension before crushing the cells, a reaction was carried out with the following composition.
Composition: 0.1% 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene, 2 mM NADPH, 100 mM phosphate buffer (pH 6), cell-free extract, or cell suspension enzyme solution (30 ° C.) 3 hours to overnight)
The product was extracted with butyl acetate, and the reaction product was evaluated by HPLC using a mobile phase of hexane / IPA / TFA = 100/2 / 0.1 at a flow rate of 0.8 mL / min using a Daicel: Chiralcel OJ column. went. The production of 3,4-difluoro-2- (R) -2-hydroxypropyloxy) nitrobenzene using 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene as a substrate by the above method was confirmed by HPLC. A peak of the product was observed at almost the same elution time as the product 3,4-difluoro-2- (R) -2-hydroxypropyloxy) nitrobenzene.
[0103]
【The invention's effect】
The present invention provides a technique for identifying a carbonyl reductase having characteristic properties, cloning a gene encoding the enzyme, and industrially utilizing the enzyme. The present invention provides an industrially advantageous method for producing an alcohol compound by reducing a carbonyl group-containing compound by using a recombinant enzyme or a host cell transformed with the enzyme gene. By using the enzyme of the present invention, an optically active alcohol compound having high optical purity can be efficiently produced.
Obviously, the present invention can be practiced other than as specifically described in the foregoing description and examples. Many modifications and variations of the present invention are possible in light of the above teachings, and so are within the scope of the appended claims.
<Sequence list free text>
SEQ ID NO: 1, Oligonucleotide to act as a DNA probe, where n standards for A or Gor T
SEQ ID NO: 4, Oligonucleotide to act as a primer for PCR
SEQ ID NO: 5, Oligonucleotide to act as a primer for PCR
SEQ ID NO: 6, Oligonucleotide to act as a primer for PCR
SEQ ID NO: 7, Oligonucleotide to act as a primer for PCR
SEQ ID NO: 9, Oligonucleotide to act as a primer for PCR
SEQ ID NO: 10, Oligonucleotide to act as a primer for PCR
SEQ ID NO: 14, Oligonucleotide to act as a primer for PCR
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the cloned glucose dehydrogenase gene and the amino acid sequence encoded thereby.

Claims (10)

It is derived from a microorganism of the genus Leifsonia and exhibits asymmetric reduction activity and acts on at least 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene to give 3,4-difluoro-2-((R) -2-hydroxypropyloxy). A carbonyl reductase having an activity of specifically producing nitrobenzene. The following physicochemical properties:
(1) Action:
Acts on 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene to produce 3,4-difluoro-2-((R) -2-hydroxypropyloxy) nitrobenzene and has high selectivity for asymmetric reduction. Shown (2) substrate specificity:
It has high reduction activity on 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene and ethyl 4-chloroacetoacetate. (3) Molecular weight:
About 70,000 in gel filtration analysis and about 29,000 in SDS polyacrylamide electrophoresis analysis.
A carbonyl reductase comprising: (A) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and acting on 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene to cause 3,4-difluoro-2-((R) -2-hydroxypropyloxy ) A protein having an enzymatic activity for producing nitrobenzene, and (B) an amino acid sequence having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 in which one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted, and / or added. And asymmetric reduction selectivity equivalent to the activity of acting on 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene to form 3,4-difluoro-2-((R) -2-hydroxypropyloxy) nitrobenzene A protein having a carbonyl reductase activity, wherein the protein is selected from the group consisting of proteins having an enzymatic activity. (A) a protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2,
(B) encoded by a DNA capable of hybridizing under stringent conditions to a DNA consisting of at least 20 consecutive sequences in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and 2-acetonyloxy A protein having an enzymatic activity that acts on -3,4-difluoronitrobenzene to produce 3,4-difluoro-2-((R) -2-hydroxypropyloxy) nitrobenzene;
(C) having an amino acid sequence having 70% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and acting on 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene, 3,4-difluoro-2 A protein having an enzymatic activity for producing ((R) -2-hydroxypropyloxy) nitrobenzene, and (D) a DNA comprising a nucleotide sequence having 70% or more homology with the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 2. A group consisting of proteins which are coded and have an enzymatic activity which act on 2-acetonyloxy-3,4-difluoronitrobenzene to produce 3,4-difluoro-2-((R) -2-hydroxypropyloxy) nitrobenzene A protein having carbonyl reductase activity, which is selected from the group consisting of: A nucleic acid, such as DNA, encoding the enzyme or protein according to any one of claims 1 to 4. A recombinant plasmid or vector into which a nucleic acid such as the DNA according to claim 5 has been incorporated. The recombinant plasmid or vector according to claim 6, further comprising a coenzyme regeneration enzyme gene inserted therein. A transformant characterized by being transformed with a nucleic acid such as the DNA according to claim 5 or the recombinant plasmid or vector according to claim 6 or 7. The method for producing the carbonyl reductase according to claim 1 or 2, or the protein according to claim 3 or 4, comprising a step of culturing the transformant according to claim 8. General formula (I):

(Wherein Xa and Xb may be the same or different and are each a halogen atom), and the phenoxyacetone derivative represented by the formula (I) or the production thereof. An optically active compound of the general formula (II) characterized in that it is treated in the presence of a cell selected from the group consisting of cells of transformed microorganisms, their cultures, their processed products and extracts. ):

(Wherein, Xa and Xb have the same meanings as described above), or a method for producing a phenoxypropane derivative represented by the general formula (III):

(Wherein R ₁ and R ₂ are each independently a hydrogen atom, a halogen atom or an alkyl group, and R ₃ is a substituted or unsubstituted alkyl group or an aryl group) The derivative is selected from the group consisting of the enzyme according to any one of claims 1 to 4, or a cell of a transformed microorganism capable of producing the enzyme, a culture thereof, a processed product thereof, and an extract. Optically active general formula (IV), characterized in that it is treated in the presence of a selected one:

(Wherein R ₁ , R ₂ and R ₃ have the same meaning as described above).

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