JP2004309276A

JP2004309276A - Substrate for immobilizing polynucleotide and method for producing the same, and microarray and method for fluorescent analysis thereof

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Publication number: JP2004309276A
Application number: JP2003102186A
Authority: JP
Inventors: Yasushi Yoshida; 吉田　　康; Yoshifumi Yamaguchi; 芳文山口; Hajime Tomokage; 肇友景
Original assignee: Yaskawa Electric Corp
Current assignee: Yaskawa Electric Corp
Priority date: 2003-04-04
Filing date: 2003-04-04
Publication date: 2004-11-04
Anticipated expiration: 2023-04-04
Also published as: JP4296479B2

Abstract

【課題】高精度の遺伝子解析ができるとともに、より高密度にポリヌクレオチドの微小スポットを配列でき、より多くの遺伝子解析を一度におこなうことができるポリヌクレオチドを固定化するための基体およびその製造方法とマイクロアレイを提供すること。
【解決手段】少なくとも表面が炭素系材料からなる固定支持体１００を有する、ポリヌクレオチドを固定化するための基体１０において、固定支持体上１００に離散的に２次元配列させた化学修飾部３０１を設けた。また、化学修飾部３０１の２次元配列位置を示す位置決め用マーク５０１，５０２，５０３を端部に設けた。
【選択図】図８A substrate for immobilizing a polynucleotide capable of performing high-accuracy gene analysis, arranging minute spots of polynucleotide at a higher density, and performing more gene analysis at once, and a method for producing the same. And providing a microarray.
Kind Code: A1 Abstract: In a substrate for immobilizing a polynucleotide, which has a fixed support at least on the surface of which is made of a carbon-based material, a chemically modified portion which is discretely and two-dimensionally arranged on the fixed support is provided. Provided. Further, positioning marks 501, 502, and 503 indicating the two-dimensional arrangement positions of the chemically modified portions 301 are provided at the ends.
[Selection diagram] FIG.

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子の発現、変異、多型等の同時解析に非常に有用な、ポリヌクレオチドを固定化するための基体およびその製造方法、ならびにマイクロアレイおよびその蛍光分析方法に関する
【０００２】
【従来の技術】
基体上にＤＮＡ等のポリヌクレオチドの微小スポットが固定されたものをマイクロアレイと呼ぶが、図１０に示すように、従来のマイクロアレイ１は、あらかじめ調製しておいたＰＣＲ増幅したＤＮＡの微小スポット２００を基体１０の固定支持体１００表面に２次元配列し、固定化している（例えば、特許文献１参照）。また、固定支持体１００は、スライドガラスまたはシリコンなどの平面基板からなり、図１１に示すようにその表面にはＤＮＡが固定化できるようにＰｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ等の高分子層３００が塗布形成されている。
【０００３】
しかし、スライドガラスまたはシリコンなどの平面基板表面にＰｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ等の高分子層３００を塗布形成してＤＮＡを固定化する方法では、ＤＮＡの固定化状態が不安定であり、ハイブリッド形成過程や洗浄工程において、ＤＮＡが剥離するといった問題がある。そこで、ＤＮＡを安定に固定するために、図１２のようにダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、グラファイト等の炭素系材料からなる固定支持体１０１の表面を官能基で化学修飾しているものがある。（例えば、特許文献２参照）。図１２において、１０１は固定支持体、３０１は化学修飾部、２００はＤＮＡの微小スポットである。
【０００４】
以上のような高分子層を形成した基体や化学修飾された基体に、スポッティング装置を用いて、ＤＮＡの微小スポットを高密度で配列させる。スポッティング装置は、ペン先のような形状をしたスポットピンを持ち、吸引したＤＮＡを基体に接触してスポッティングする方式や、インクジェット式のスポットピンを持ち、基体に非接触でＤＮＡをスポッティングする方式がある。
【０００５】
一般的なマイクロアレイの大きさは２５ｍｍ×７６ｍｍであり、これにスポット径１００〜３００μｍ、スポットピッチ２００μｍ程度でスポッティング装置によりＤＮＡを配列している。
【０００６】
これら従来のマイクロアレイを用いて遺伝子解析する方法は以下のとおりである（例えば、特許文献３参照）。まず、既知の異なる多数のポリヌクレオチド、例えば標本ＤＮＡを２次元配列したマイクロアレイを作成する。つぎに、第１の蛍光色素で標識された健常者の細胞から取り出した検体ＤＮＡを前記マイクロアレイ上の標本ＤＮＡとハイブリタイズさせる。その後、所定の溶液で前記マイクロアレイを洗浄すると、マイクロアレイ上の標本ＤＮＡとハイブリタイズされなかった検体ＤＮＡは除去され、ハイブリタイズされた検体ＤＮＡだけが標本ＤＮＡの各微小スポット部に残る。蛍光分析装置を用いて、第１の蛍光色素を励起する波長の第１の励起レーザを走査しながらこのマイクロアレイ上の各微小スポットに照射する。すると検体ＤＮＡの残った部分のみ、第１の蛍光色素から蛍光を発する。この蛍光強度を検出し、標識信号を得る。
【０００７】
上記と同様の処理を、第２の蛍光色素で標識された遺伝子疾患を有する患者の細胞から取り出した検体ＤＮＡに関しても行い、第２の励起レーザの照射により発生した蛍光の検出結果を表す標識信号を得る。健常者の検体ＤＮＡから得られた標識信号と患者の検体ＤＮＡから得られた標識信号との比から、特異的な微小スポットを求めることにより、患者に特異なＤＮＡが何であるかを解析することができる。
【０００８】
図１３に従来の蛍光分析装置を示す。４０１は第１の励起レーザを出力する第１のレーザ光源、４０２は第２の励起レーザを出力する第２のレーザ光源である。この第１のレーザ光源４０１および第２のレーザ光源４０２から発せられた励起光は反射ミラー４０３、第１のダイクロイックミラー４０４、プリズム４０５を通過後、第１のスキャナミラ−４０６、および第２のスキャナミラー４０７で走査され、レンズ４０８を通過してマイクロアレイ１上のポリヌクレオチドの微小スポットを照射する。前記第１または第２の励起レーザの照射によりポリヌクレオチドの微小スポットから発生した蛍光を、レンズ４０８、第２のスキャナミラー４０７、第１のスキャナミラー４０６、プリズム４０５、フィルタ４０９、ピンホール４１０を通過させて、第２のダイクロイックミラー４１１で波長分離後、第１のフォトマルチメータ４１２または第２のフォトマルチメータ４１３に入射させ検出する構成になっている。
【０００９】
【特許文献１】
特表平１０−５０３８４１号公報
【００１０】
【特許文献２】
特開２００１−１３９５３２号公報
【００１１】
【特許文献３】
特開平２００１−０７４６５８号公報
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のマイクロアレイおよびポリヌクレオチドを固定化するための基体では、各微小スポットの形状ばらつきや各微小スポット間距離のばらつきがあり、遺伝子解析プロセスの中で後工程となる測定・解析工程での不具合や測定精度が低くなるという問題があった。また、各微小スポットの形状ばらつきや各微小スポット間距離のばらつきによって、各微小スポットの大きさや、微小スポット間距離が制限され、マイクロアレイの高密度化が図れないといった問題点があった。
【００１３】
また、従来のマイクロアレイおよびポリヌクレオチドを固定化するための基体では、その固定支持体の外形公差が０．３ｍｍほどある。したがって、固定支持体に対する化学修飾部の２次元配列位置が、基体毎に図１４（ｂ）のようにオフセットしたり、図１４（ｃ）のように傾いたりする。さらに、この化学修飾部に固定化したポリヌクレオチドの微小スポットの２次元配列も、マイクロアレイ毎にオフセットしたり、傾いたりする。そのため、マイクロアレイを蛍光分析装置で測定する際、励起レーザが微小スポットの配列位置からずれて走査することがあり、マイクロアレイごとに測定結果のばらつきが生じるという問題があった。
【００１４】
そこで、本発明の目的は、ポリヌクレオチドの微小スポット形状を均一にするとともに微小スポットを均一配列させることにより、高精度の遺伝子解析ができるとともに、より高密度にポリヌクレオチドの微小スポットを配列でき、より多くの遺伝子解析を一度におこなうことができるポリヌクレオチドを固定化するための基体およびその製造方法とマイクロアレイを提供することにある。
【００１５】
また、本発明の別の目的は、マイクロアレイの蛍光分析において励起光をポリヌクレオチドの微小スポットに正確に走査・照射でき、蛍光分析による測定精度が低下しないようにすることができるポリヌクレオチドを固定化するための基体およびその製造方法、ならびにマイクロアレイおよびその蛍光分析方法を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
上記問題を解決するため、請求項１記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体は、少なくとも表面が炭素系材料からなる固定支持体を有する、ポリヌクレオチドを固定化するための基体において、前記固定支持体上に離散的に２次元配列させた化学修飾部を設けたことを特徴とするものである。
【００１７】
このような構成にすることで、化学修飾部以外の場所にポリヌクレオチドは固定されないので、ポリヌクレオチドは２次元配列された化学修飾部上にのみ固定化され、ポリヌクレオチドの微小スポットの大きさや配置を均等にすることができる。
【００１８】
また、請求項２記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体は、前記固定支持体が、炭素系材料からなる固定層と、前記固定層を支持する支持体とからなることを特徴とするものである。
【００１９】
このような構成にすることで、ポリヌクレオチドを固定化しない部分の固定層を除去し、残った固定層上に化学修飾することにより、離散的に２次元配列させた化学修飾部を設けることができる。
【００２０】
また、請求項３記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体は、前記支持体がシリコンからなることを特徴とするものである。
【００２１】
また、請求項４記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体は、前記炭素系材料が、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、グラファイトの少なくともいずれか１つからなることを特徴とするものである。
【００２２】
請求項３及び４のような構成とすることで、シリコンは疎水性を有し、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、グラファイトは親水性を有するので、前記基体上にスポッティングされたＤＮＡは、シリコンを避けて、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボンまたはグラファイト上の化学修飾部に効率よく集中することができる。
【００２３】
また、請求項５記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体は、前記化学修飾部の２次元配列位置を示す位置決めマークを端部に設けたことを特徴とするものである。
【００２４】
このような構成にすることで、位置決めマークを蛍光分析装置であらかじめ検出することにより、化学修飾部およびポリヌクレオチドの微小スポットの２次元配列位置を特定でき、蛍光分析装置の励起光をポリヌクレオチドの微小スポットに正確に走査・照射できる。また、固定支持体の表面はダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、グラファイト等の炭素系材料からなっているため、位置決めマークはレーザによって容易に設けることができる。
【００２５】
また、請求項６記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法は、請求項１記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体を製造する方法において、前記固定支持体の表面を化学修飾し、前記固定支持体表面の化学修飾部を選択的に除去することを特徴とするものである。
【００２６】
このように化学修飾部を広範囲に形成した後、不要部を選択除去することにより、容易かつ微細に２次元配列された化学修飾部を形成することができ、ポリヌクレオチドの微小スポットの大きさや配置を均等にできる。
【００２７】
また、請求項７記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法は、前記固定支持体表面の化学修飾部を選択的に除去するにあたって、化学修飾された前記固定支持体の表面をレーザ光により除去することを特徴とするものである。
【００２８】
このようにレーザ光を用いるため、容易に前記固定支持体表面の化学修飾部を選択的に除去することができ、ポリヌクレオチドの微小スポットの大きさや配列数が異なる他種のマイクロアレイを作製することができる。また、固定支持体はダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、グラファイト等の炭素系材料からなっているため、レーザによって容易に選択除去できる。
【００２９】
また、請求項８記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法は、請求項２記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体を製造する方法において、前記固定層を離散的に２次元配列し、前記固定層の表面を化学修飾することを特徴とするものである。
【００３０】
このようにするため、ポリヌクレオチドを固定化しない部分の固定層を除去し、残った固定層上を化学修飾することにより、離散的に２次元配列させた化学修飾部を持つポリヌクレオチドを固定化するための基体を製造できる。
【００３１】
また、請求項９記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法は、前記固定層を離散的に２次元配列するにあたって、前記支持体上に作成した前記固定層をエッチングにより選択的に除去することを特徴とするものである。
【００３２】
このようにエッチングを用いることで、エッチングの際に用いるマスクにしたがって固定層を微細に２次元配列することができる。
【００３３】
また、請求項１０記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法は、前記固定層を離散的に２次元配列するにあたって、前記支持体上に作成した前記固定層をレーザ加工により選択的に除去することを特徴とするものである。
【００３４】
このようにレーザ加工を用いることで、マスクを用いずに固定層を微細に２次元配列することができるので、ポリヌクレオチドの微小スポットの大きさや配列数が異なる他種のマイクロアレイを容易に作成することができる。また、固定層はダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、グラファイト等の炭素系材料からなっているため、レーザによって容易に選択除去できる。
【００３５】
また、請求項１１記載のマイクロアレイは、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体と、前記基体の化学修飾部上に２次元配列固定されたポリヌクレオチドとからなることを特徴とするものである。
【００３６】
このような構成にすることで、ポリヌクレオチドは２次元配列された化学修飾部上にのみ固定化され、化学修飾部以外の場所にポリヌクレオチドは固定されないので、基体上のポリヌクレオチド微小スポットは微細かつ配置が均一になる。また、化学修飾部すなわちポリヌクレオチドの微小スポットの２次元配列位置を示す位置決めマークを設けた基体からなるマイクロアレイでは、その位置決めマークを蛍光分析装置であらかじめ検出することにより、蛍光分析装置の励起光をポリヌクレオチドの微小スポットに正確に走査・照射できる。
【００３７】
請求項１２記載のマイクロアレイの蛍光分析方法は、請求項５記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体と、前記基体の化学修飾部上に２次元配列固定されたポリヌクレオチドとからなるマイクロアレイの前記ポリヌクレオチドを解析するためのマイクロアレイの蛍光分析方法において、固定支持体の端部に設けた前記位置決めマークを検出し、前記ポリヌクレオチドの２次元配列位置情報を演算し、前記ポリヌクレオチドの２次元配列位置情報に基づき、検出用レーザ光の走査方向を補正して前記マイクロアレイに照射することを特徴とするものである。
【００３８】
これにより、蛍光分析装置の励起光をポリヌクレオチドの微小スポットに正確に走査・照射でき、蛍光分析によるマイクロアレイごとの測定結果のばらつきを抑えることができる。
【００３９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の具体的実施例を図に基づいて説明する。
【００４０】
（第１実施例）
図１は本発明のＤＮＡ等のポリヌクレオチドを固定化するための基体の断面図である。図２はポリヌクレオチドを固定化するための基体の上面図である。図において、１０はＤＮＡ等のポリヌクレオチドを固定するための基体、１０１はダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、またはグラファイトからなる固定支持体、３０１は化学修飾部である。化学修飾部３０１は図２のように微小エリアに分かれ、各微小エリアは離散的に２次元配列されている。本実施例では固定支持体１０１として、３ｍｍ角、厚さ０．３ｍｍのＣＶＤダイヤモンドを用いた。
【００４１】
本実施例の基体１０の製造方法としては、図３に示すように、まず固定支持体１０１の表面全体に化学修飾を施した（ステップ１）。ついで、化学修飾部３０１が図２のように離散的に配列するように、化学修飾部３０１を選択的に除去した（ステップ２）。ステップ１の化学修飾は、特許文献１を参考に、塩素ガス中でＣＶＤダイヤモンドの固定支持体１０１に紫外線照射して表面を塩素化し、ついでアンモニアガス中で紫外線照射してアミノ化した後、酸クロリドを用いてクロロフォルム中で乾留してカルゴキシル化した。この表面が化学修飾された固定支持体１０１を、カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した１，４−ジオキサン溶液中に浸漬させ、末端カルボキシル基を脱水縮合した。反応終了後、さらに、１，４−ジオキサン溶液で洗浄後乾燥し、固定支持体１０１表面を化学修飾した。つぎに、ステップ２の化学修飾部３０１の選択除去では、レーザを用いた。用いたレーザは波長２６６ｎｍのＹＡＧ４倍波レーザであり、固定支持体１０１表面でφ２００μｍになるようにレンズ系で集光した。このレーザ光を２つのガルバノスキャナーを用いて３５０μｍの等間隔でＸ−Ｙ方向に走査した。波長２６６ｎｍのレーザ光に対して、固定支持体１０１として用いたダイヤモンドの炭素原子間の共有結合が切れ、固定支持体１０１表面のレーザ照射部はケミカル加工される。したがって、レーザ照射により、照射部の固体支持体１０１表面が数μｍ消失してしまうと共に、化学修飾部３０１も除去することができた。
【００４２】
作製した基体１０の各化学修飾部３０１の大きさは１５０μｍ角、各化学修飾部間の距離は２００μｍであった。あらかじめ調製しておいたＰＣＲ増幅したＤＮＡをスポッティング装置によって、作製した基体１０の各化学修飾部３０１上にスポッティング固定し、マイクロアレイを作製した。その後、相補的な配列をもつ蛍光標識プローブとハイブリタイゼーションさせ、蛍光分析装置で分析をおこなった。従来のマイクロアレイに比べ、ＤＮＡの各微小スポットが、規則正しく所定の位置に配列しているために、サンプル毎の解析結果のばらつきが大幅に減少した。
【００４３】
（第２実施例）
図４は第２実施例のポリヌクレオチドを固定化するための基体の断面図である。図５は第２実施例のポリヌクレオチドを固定化するための基体の上面図である。図において、１０２は固定層、１０３は支持体、３０１は化学修飾部である。本実施例において、固定支持体は、固定層１０２とこれを支持する支持体１０３とから構成されている。固定層１０２は図５のように微小エリアに分かれ、各微小エリアは離散的に２次元配列されている。化学修飾部３０１は、この２次元配列された固定層１０２の上に設けられている。
【００４４】
本実施例の基体１０の製造方法としては、図６に示すように、まず支持体１０３の表面全体に固定層１０２を形成した（ステップ１）。ついで、固定層１０２が図５のように離散的に配列するように、固定層１０２を選択的に除去した（ステップ２）。さらに、固定層１０２上に化学修飾を施した（ステップ３）。ステップ１では、２５ｍｍ×７６ｍｍ、厚さ１ｍｍのガラスまたはシリコン製の支持体１０３上に、メタンガス（ＣＨ_４）を原料にプラズマＣＶＤを用いて厚さ０．２μｍのダイヤモンドライクカーボンを形成した。ステップ２では、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）法を用いて加工をおこなった。使用したマスク形状に応じて、１２５μｍピッチで２次元配列されたφ５０μｍの固定層１０２の微小エリアが１０万個形成できた。ステップ３では、第１実施例のステップ１と同等の化学修飾処理をおこなった。
【００４５】
図７は、本実施例で作製した基体１０にＤＮＡをスポッティングして固定して得られたマイクロアレイ１の断面図である。図において、２００はＤＮＡの微小スポットである。このマイクロアレイ１に対して相補的な配列をもつ蛍光標識プローブとハイブリタイゼーションさせ、蛍光分析装置で分析をおこなった。その結果、高密度で実装した１０万個のＤＮＡについて、解析することができた。数千個程度の解析しかできなかった従来のマイクロアレイに比べて、大幅に高密度化が達成できた。
【００４６】
（第３実施例）
第３実施例のポリヌクレオチドを固定化するための基体は、第２実施例の図６のステップ２において、レーザを用いて加工をおこなって作製したものである。用いたレーザは波長２６６ｎｍのＹＡＧ４倍波レーザであり、固定層１０２表面でφ７５μｍになるようにレンズ系で集光した。このレーザ光を２つのガルバノスキャナーを用いて１２５μｍの等間隔でＸ−Ｙ方向に走査した。その結果、１２５μｍピッチで２次元配列されたφ５０μｍの固定層１０２の微小エリアが１０万個形成できた。ステップ３では、第２実施例のステップ３と同等の化学修飾処理をおこなった。
【００４７】
第２実施例と同様に、本実施例の基体にＤＮＡをスポッティングし、相補的な配列をもつ蛍光標識プローブとハイブリタイゼーションさせ、蛍光分析装置で分析をおこなった。その結果、第２実施例と同様に、高密度で実装した１０万個のＤＮＡについて、解析することができた。数千個程度の解析しかできなかった従来のマイクロアレイに比べて、第２実施例と同様に大幅に高密度化が達成できた。
【００４８】
（第４実施例）
図８は第４実施例のポリヌクレオチドを固定化するための基体の断面図である。同図に示すように、本実施例の基体には、その端部に化学修飾部３０１の２次元配列位置を示す位置決めマーク５０１〜５０３を設けている。位置決めマーク５０１は化学修飾部３０１の２次元配列のＸ軸方向の開始点、位置決めマーク５０２はＸ軸方向の終了点、位置決めマーク５０３はＹ軸方向の開始点を示している。そのほかの構成は、第２，第３実施例の基体と同様であり、本実施例の基体も、ガラスまたはシリコン製の支持体１０３と、支持体１０３上に離散的に２次元配列されたダイヤモンドライクカーボンからなる固定層２０２と、固定層２０２上に設けられた化学修飾部３０１とを備えている。
【００４９】
この基体の製造装置は、２次元方向に走査可能な加工用レーザを備えている。加工用レーザとしては、ＹＡＧレーザやＹＡＧレーザの高調波（ＳＨＧ，ＴＨＧ，ＦＨＧ）レーザなどが利用できる。また、半導体レーザを用いることも可能である。２次元方向に走査する手段として、２軸ステージや、２つのスキャナミラーや、ステージとスキャナミラーの組み合わせなどを用いることができる。
【００５０】
基体の製造方法としては、まず支持体１０３表面全体に固定層１０２を形成した（ステップ１）。ついで、固定層１０２が図５のように離散的に配列するように、加工用レーザによって固定層１０２を選択的に除去した（ステップ２）。つづいて、固定層１０２の２次元配列のＸ軸方向の開始点を示す位置決めマーク５０１、Ｘ軸方向の終了点を示す位置決めマーク５０２、およびＹ軸方向の開始点示す位置決めマーク５０３を加工用レーザによってマークした（ステップ３）。さらに、固定層１０２上に化学修飾を施した（ステップ４）。
【００５１】
ステップ１では、２５ｍｍ×７６ｍｍ、厚さ１ｍｍのガラスまたはシリコン製の支持体１０３上に、メタンガス（ＣＨ_４）を原料にプラズマＣＶＤを用いて厚さ０．２μｍのダイヤモンドライクカーボンを形成した。
【００５２】
ステップ２で用いたレーザは波長２６６ｎｍのＹＡＧ４倍波レーザであり、固定層１０２表面でφ７５μｍになるようにレンズ系で集光した。このレーザ光を２つのガルバノスキャナーを用いて１２５μｍの等間隔でＸ−Ｙ方向に走査した。その結果、１２５μｍピッチで２次元配列された５０μｍ角の固定層１０２の微小エリアが１０万個形成できた。
【００５３】
ステップ３では、ステップ２の状態から支持体１０３の位置を動かさず、加工用レーザの走査位置指令だけをコントロールしてマークした。その際、位置決めマークの線幅が細くなるように、レーザの集光径が固定層１０２表面でφ１０μｍになるように集光後、マークした。ステップ２とステップ３の順序は逆であってもかまわない。
【００５４】
ステップ４では、ステップ３の支持体を取り出し、特許文献１を参考に、化学修飾をおこなった。
【００５５】
作製した基体に、あらかじめ調製しておいた標本ＤＮＡをスポッティング装置によって固定し、１０万個のＤＮＡ微小スポットを持つマイクロアレイを作製した。その後、蛍光標識した検体ＤＮＡとハイブリタイゼーションさせ、蛍光分析装置で分析をおこなった。
【００５６】
蛍光分析の方法としては、図９に示すように、まず励起用レーザを基体の端部に走査・照射して、その反射光の変化をフォトマルチメータで検出することにより、位置決めマークの位置を特定した（ステップ１）。ついで、位置決めマークの位置をもとに、ポリヌクレオチドの微小スポットの２次元配列位置座標を演算した（ステップ２）。その後、微小スポットの２次元配列位置座標をもとに、励起用レーザ光の走査方向を補正してマイクロアレイに照射した（ステップ３）。
【００５７】
従来の位置決めマークを設けていないマイクロアレイと、本発明の位置決めマークを設けたマイクロアレイとを比較するため、それぞれ同一検体ＤＮＡについて２０枚のマイクロアレイを用いて蛍光分析をおこなった。その結果、本発明の位置決めマークを設けたマイクロアレイでは、測定のばらつきが１／５に抑えられた。
【００５８】
なお、上記各実施例では、サンプルとしてＤＮＡを使用したが、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡの他のポリヌクレオチドを使用しても同様の効果が得られた。
【００５９】
また、本実施例においては、レーザにより位置決めマークを施したが、同時にバーコードや２次元コードのような識別コードを基体端部に形成することも可能である。
【００６０】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明の請求項１記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体によれば、ポリヌクレオチドを固定化したい部分のみ化学修飾することによって、ポリヌクレオチドの微小スポットの大きさや配置を均等にすることができる。そのため、精度よく遺伝子解析できる。
【００６１】
また、請求項２記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体によれば、ポリヌクレオチドを固定化しない部分の固定層を除去することにより、離散的に２次元配列させた化学修飾部を設けることができる。したがって、ポリヌクレオチドの微小スポットの大きさや配置を均等にすることができ、精度よく遺伝子解析できる。また、基体上に高密度にポリヌクレオチドを固定化することができる。
【００６２】
また、請求項３及び４ポリヌクレオチドを固定化するための基体によれば、シリコンは疎水性を有し、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、グラファイトは親水性を有するので、前記基体上にスポッティングされたＤＮＡを、シリコンを避けて、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボンまたはグラファイト上の化学修飾部に効率よく集中させることができる。
【００６３】
また、請求項５記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体によれば、蛍光分析装置の励起レーザを微小スポットの配列位置に正確に走査・照射することができるので、マイクロアレイごとの外形寸にばらつきがあっても、測定のばらつきを抑えることができる。
【００６４】
また、請求項６記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法によれば、ポリヌクレオチドを固定化したい部分のみ化学修飾部とすることができ、ポリヌクレオチドの微小スポットの大きさや配置を均等にできる。
【００６５】
また、請求項７記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法によれば、レーザを用いるため、ポリヌクレオチドの微小スポットの大きさや配列数が異なるマイクロアレイを作製する際に、容易に固定支持体表面の化学修飾部を選択的に除去することができる。
【００６６】
また、請求項８記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法によれば、固定層のある部分のみ化学修飾されるので、離散的に２次元配列された化学修飾部を設けることができる。
【００６７】
また、請求項９記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法によれば、エッチングを用いるため、エッチングの際に用いるマスクの寸法精度にしたがって固定層を微細に２次元配列することができる。
【００６８】
また、請求項１０記載のポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法によれば、レーザ加工を用いるため、固定層を微細に２次元配列することができる。
【００６９】
また、請求項１１記載のマイクロアレイによれば、ポリヌクレオチドの微小スポットの大きさや配置を均等にすることができ、またポリヌクレオチドの微小スポットも小さくすることができるので、多くの遺伝子についての解析を一度に行える高密度のマイクロアレイにすることができる。さらに、化学修飾部すなわちポリヌクレオチドの微小スポットの２次元配列位置を示す位置決めマークを設けた基体からなるマイクロアレイでは、その位置決めマークを蛍光分析装置であらかじめ検出することにより、蛍光分析装置の励起光をポリヌクレオチドの微小スポットに正確に走査・照射できる。
【００７０】
また、請求項１２記載のマイクロアレイの蛍光分析方法によれば、蛍光分析装置の励起レーザが微小スポットの配列位置上を正確に走査・照射するので、マイクロアレイごとの外形寸にばらつきがあっても、測定のばらつきを抑えることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１実施例を示すポリヌクレオチドを固定化するための基体の断面図である。
【図２】本発明の第１実施例を示すポリヌクレオチドを固定化するための基体の上面図である。
【図３】本発明の第１実施例を示すポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法を示す模式図である。
【図４】本発明の第２実施例を示すポリヌクレオチドを固定化するための基体の断面図である。
【図５】本発明の第２実施例を示すポリヌクレオチドを固定化するための基体の上面図である。
【図６】本発明の第２実施例を示すポリヌクレオチドを固定化するための基体の製造方法を示す模式図である。
【図７】本発明の第２実施例を示すマイクロアレイの断面図である。
【図８】本発明の第４実施例を示すポリヌクレオチドを固定化するための基体の上面図である。
【図９】本発明のマイクロアレイの蛍光分析方法を示す模式図である。
【図１０】従来のポリヌクレオチドを固定化するための基体の上面図である。
【図１１】従来のポリヌクレオチドを固定化するための基体の断面図である。
【図１２】従来のポリヌクレオチドを固定化するための基体の断面図である。
【図１３】従来の蛍光分析装置の模式図である
【図１４】従来のマイクロアレイの問題点を示す模式図である。
【符号の説明】
１マイクロアレイ
１０ポリヌクレオチドを固定化するための基体
１００スライドガラスまたはシリコンからなる固定支持体
１０１ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、またはグラファイトからなる固定支持体
１０２ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、またはグラファイトからなる固定層
１０３ガラスまたはシリコン製の支持体
２００ＤＮＡの微小スポット
３００Ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ等の高分子層
３０１化学修飾部
４０１第１の励起レーザを出力する第１のレーザ光源
４０２第２の励起レーザを出力する第２のレーザ光源
４０３反射ミラー
４０４第１のダイクロイックミラー
４０５プリズム
４０６第１のスキャナミラ−
４０７第２のスキャナミラー
４０８レンズ
４０９フィルタ
４１０ピンホール
４１１第２のダイクロイックミラー
４１２第１のフォトマルチメータ
４１３第２のフォトマルチメータ
５０１〜５０３位置決めマーク[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a substrate for immobilizing a polynucleotide, a method for producing the same, and a microarray and a method for analyzing its fluorescence, which are very useful for simultaneous analysis of gene expression, mutation, polymorphism, etc.
[0002]
[Prior art]
A microarray having a small spot of a polynucleotide such as DNA fixed on a substrate is referred to as a microarray. As shown in FIG. 10, the conventional microarray 1 uses a small spot 200 of PCR-amplified DNA prepared in advance. It is two-dimensionally arranged and fixed on the surface of the fixed support 100 of the base 10 (for example, see Patent Document 1). Further, the fixed support 100 is made of a flat substrate such as a slide glass or silicon, and a polymer layer 300 such as Poly-L-lysine is applied on the surface of the fixed support 100 so as to immobilize DNA as shown in FIG. Have been.
[0003]
However, in the method of immobilizing DNA by coating and forming a polymer layer 300 such as Poly-L-lysine on the surface of a flat substrate such as glass slide or silicon, the immobilized state of DNA is unstable, and the hybridization process There is a problem that the DNA is peeled off during the cleaning process. Therefore, in order to stably fix DNA, there is one in which the surface of the fixed support 101 made of a carbon-based material such as diamond, diamond-like carbon, and graphite is chemically modified with a functional group as shown in FIG. (For example, see Patent Document 2). In FIG. 12, 101 is a fixed support, 301 is a chemically modified part, and 200 is a minute spot of DNA.
[0004]
Using a spotting device, minute spots of DNA are arranged at high density on the substrate on which the polymer layer is formed or on the chemically modified substrate as described above. A spotting device has a spot pin shaped like a pen tip and spots DNA by contacting the aspirated DNA with the substrate.A spotting device has an inkjet spot pin and spots DNA without contacting the substrate. is there.
[0005]
The size of a general microarray is 25 mm × 76 mm, and DNAs are arranged on the microarray with a spot diameter of 100 to 300 μm and a spot pitch of about 200 μm by a spotting device.
[0006]
The method of performing gene analysis using these conventional microarrays is as follows (for example, see Patent Document 3). First, a microarray in which a large number of different known polynucleotides, for example, sample DNAs are two-dimensionally arranged is prepared. Next, the sample DNA extracted from the cells of the healthy subject labeled with the first fluorescent dye is hybridized with the sample DNA on the microarray. Thereafter, when the microarray is washed with a predetermined solution, the specimen DNA not hybridized with the specimen DNA on the microarray is removed, and only the hybridized specimen DNA remains on each minute spot of the specimen DNA. Using a fluorescence analyzer, each minute spot on the microarray is irradiated while scanning a first excitation laser having a wavelength for exciting the first fluorescent dye. Then, only the remaining portion of the sample DNA emits fluorescence from the first fluorescent dye. This fluorescence intensity is detected to obtain a label signal.
[0007]
The same processing as described above is also performed on sample DNA extracted from cells of a patient having a genetic disease labeled with a second fluorescent dye, and a label signal representing the detection result of fluorescence generated by irradiation with the second excitation laser Get. Analyzing what the specific DNA of a patient is by finding specific small spots from the ratio of the labeled signal obtained from the sample DNA of a healthy person to the labeled signal obtained from the sample DNA of a patient Can be.
[0008]
FIG. 13 shows a conventional fluorescence analyzer. Reference numeral 401 denotes a first laser light source that outputs a first excitation laser, and 402 denotes a second laser light source that outputs a second excitation laser. The excitation light emitted from the first laser light source 401 and the second laser light source 402 passes through the reflection mirror 403, the first dichroic mirror 404, and the prism 405, and then passes through the first scanner mirror 406 and the second The light is scanned by the scanner mirror 407, passes through the lens 408, and irradiates a minute spot of the polynucleotide on the microarray 1. The fluorescence generated from the minute spot of the polynucleotide by the irradiation of the first or second excitation laser is transmitted through a lens 408, a second scanner mirror 407, a first scanner mirror 406, a prism 405, a filter 409, and a pinhole 410. The light passes through, is separated in wavelength by the second dichroic mirror 411, and then enters the first photomultimeter 412 or the second photomultimeter 413 to be detected.
[0009]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Publication No. Hei 10-503841
[0010]
[Patent Document 2]
JP 2001-139532 A
[0011]
[Patent Document 3]
JP 2001-074658 A
[0012]
[Problems to be solved by the invention]
However, conventional substrates for immobilizing microarrays and polynucleotides have variations in the shape of each minute spot and variations in the distance between each minute spot. There were problems such as inconvenience and a decrease in measurement accuracy. Further, there is a problem that the size of each minute spot and the distance between the minute spots are restricted by the variation in the shape of each minute spot and the variation in the distance between the minute spots, so that the density of the microarray cannot be increased.
[0013]
In the case of a conventional substrate for immobilizing a microarray and a polynucleotide, the outer shape tolerance of the immobilized support is about 0.3 mm. Therefore, the two-dimensional arrangement position of the chemically modified portion with respect to the fixed support is offset for each base as shown in FIG. 14B or tilted as shown in FIG. 14C. Further, the two-dimensional arrangement of the minute spots of the polynucleotide immobilized on the chemically modified portion is also offset or inclined for each microarray. Therefore, when the microarray is measured by the fluorescence analyzer, the excitation laser may scan while being displaced from the arrangement position of the minute spots, and there is a problem that the measurement results vary from microarray to microarray.
[0014]
Therefore, an object of the present invention is to make the shape of the minute spots of the polynucleotide uniform and uniformly arrange the minute spots, thereby enabling high-precision gene analysis and arraying the minute spots of the polynucleotide at a higher density, An object of the present invention is to provide a substrate for immobilizing a polynucleotide capable of performing more gene analyzes at a time, a method for producing the same, and a microarray.
[0015]
Another object of the present invention is to immobilize a polynucleotide capable of accurately scanning and irradiating a micro spot of a polynucleotide with excitation light in a microarray fluorescence analysis, so that measurement accuracy by the fluorescence analysis is not reduced. And a method of manufacturing the same, and a microarray and a method of analyzing fluorescence thereof.
[0016]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above-mentioned problem, the substrate for immobilizing the polynucleotide according to claim 1 is a substrate for immobilizing a polynucleotide, wherein the substrate has an immobilization support made of at least a surface made of a carbon-based material. The present invention is characterized in that a chemically modified portion which is two-dimensionally arranged discretely on a support is provided.
[0017]
By adopting such a configuration, the polynucleotide is not immobilized in a place other than the chemically modified portion, so that the polynucleotide is immobilized only on the two-dimensionally arranged chemically modified portion, and the size and arrangement of the minute spots of the polynucleotide Can be equalized.
[0018]
Further, the substrate for immobilizing the polynucleotide according to claim 2 is characterized in that the fixed support comprises a fixed layer made of a carbon-based material and a support for supporting the fixed layer. It is.
[0019]
With such a configuration, it is possible to provide a chemically modified portion that is discretely two-dimensionally arranged by removing a portion of the fixed layer where the polynucleotide is not immobilized and chemically modifying the remaining fixed layer. it can.
[0020]
Further, the substrate for immobilizing the polynucleotide according to claim 3 is characterized in that the support is made of silicon.
[0021]
Further, the substrate for immobilizing the polynucleotide according to claim 4 is characterized in that the carbon-based material is made of at least one of diamond, diamond-like carbon, and graphite.
[0022]
By adopting the constitution as in claims 3 and 4, since silicon has hydrophobicity and diamond, diamond-like carbon, and graphite have hydrophilicity, DNA spotted on the substrate avoids silicon. , Diamond, diamond-like carbon or graphite can be efficiently concentrated on the chemically modified portion.
[0023]
Further, the base for immobilizing the polynucleotide according to claim 5 is characterized in that a positioning mark indicating a two-dimensional arrangement position of the chemically modified portion is provided at an end.
[0024]
With such a configuration, the two-dimensional arrangement position of the chemically modified portion and the minute spot of the polynucleotide can be specified by detecting the positioning mark in advance by the fluorescence analyzer, and the excitation light of the fluorescence analyzer is used for the polynucleotide. Scans and irradiates minute spots accurately. Further, since the surface of the fixed support is made of a carbon-based material such as diamond, diamond-like carbon, and graphite, the positioning mark can be easily provided by laser.
[0025]
The method for producing a substrate for immobilizing a polynucleotide according to claim 6 is the method for producing a substrate for immobilizing a polynucleotide according to claim 1, wherein the surface of the immobilized support is chemically modified. And a step of selectively removing a chemically modified portion on the surface of the fixed support.
[0026]
After forming the chemically modified portion in a wide range in this manner, by selectively removing unnecessary portions, it is possible to easily and finely form the chemically modified portion which is two-dimensionally arranged, and to determine the size and arrangement of the minute spots of the polynucleotide. Can be equalized.
[0027]
The method for producing a substrate for immobilizing a polynucleotide according to claim 7, wherein the chemically modified surface of the fixed support is subjected to laser irradiation when the chemically modified portion on the surface of the fixed support is selectively removed. It is characterized by being removed by light.
[0028]
Since the laser light is used as described above, the chemically modified portion on the surface of the fixed support can be easily selectively removed, and another type of microarray in which the size and the number of minute spots of the polynucleotide are different is produced. Can be. In addition, since the fixed support is made of a carbon-based material such as diamond, diamond-like carbon, and graphite, it can be easily selected and removed by laser.
[0029]
The method for producing a substrate for immobilizing a polynucleotide according to claim 8 is a method for producing a substrate for immobilizing a polynucleotide according to claim 2, wherein the immobilization layer is discretely two-dimensionally formed. It is characterized by being arranged and chemically modifying the surface of the fixed layer.
[0030]
In order to do so, by removing the immobilization layer where the polynucleotide is not immobilized, and chemically modifying the remaining immobilization layer, the polynucleotide having the chemically modified portions arranged in a two-dimensional array discretely is immobilized. A substrate can be manufactured.
[0031]
Further, in the method for producing a substrate for immobilizing a polynucleotide according to claim 9, when the fixing layer is two-dimensionally arranged discretely, the fixing layer formed on the support is selectively etched. It is characterized by being removed.
[0032]
By using the etching in this manner, the fixed layers can be finely two-dimensionally arranged according to the mask used in the etching.
[0033]
Further, in the method for producing a substrate for immobilizing a polynucleotide according to claim 10, when the fixing layer is arranged two-dimensionally discretely, the fixing layer formed on the support is selectively processed by laser processing. It is characterized by being removed.
[0034]
By using laser processing in this way, the fixed layer can be finely two-dimensionally arranged without using a mask, so that other types of microarrays in which the size and number of minute spots of polynucleotides are different can be easily formed. be able to. In addition, since the fixed layer is made of a carbon-based material such as diamond, diamond-like carbon, and graphite, the fixed layer can be easily removed by laser.
[0035]
Further, the microarray according to claim 11, a substrate for immobilizing the polynucleotide according to any one of claims 1 to 5, and a polynucleotide having a two-dimensional array immobilized on a chemically modified portion of the substrate. And characterized by the following.
[0036]
With such a configuration, the polynucleotide is immobilized only on the two-dimensionally arranged chemically modified portion, and the polynucleotide is not immobilized in a place other than the chemically modified portion. And the arrangement becomes uniform. In addition, in a microarray comprising a substrate provided with a positioning mark indicating a two-dimensional arrangement position of a chemically modified portion, that is, a minute spot of polynucleotide, the excitation light of the fluorescence analyzer is detected by detecting the positioning mark in advance by the fluorescence analyzer. It can scan and irradiate minute spots of polynucleotide accurately.
[0037]
The fluorescence analysis method for a microarray according to claim 12, wherein the substrate for immobilizing the polynucleotide according to claim 5 and a polynucleotide two-dimensionally immobilized on a chemically modified portion of the substrate. In a fluorescence analysis method of a microarray for analyzing a polynucleotide, the positioning mark provided at an end of a fixed support is detected, two-dimensional sequence position information of the polynucleotide is calculated, and the two-dimensional sequence of the polynucleotide is calculated. The scanning direction of the detection laser beam is corrected based on the position information, and the corrected laser beam is irradiated onto the microarray.
[0038]
This makes it possible to accurately scan and irradiate the minute spot of the polynucleotide with the excitation light of the fluorescence analyzer, thereby suppressing variation in the measurement results of each microarray by the fluorescence analysis.
[0039]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, specific embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
[0040]
(First embodiment)
FIG. 1 is a cross-sectional view of a substrate for immobilizing a polynucleotide such as DNA of the present invention. FIG. 2 is a top view of a substrate for immobilizing a polynucleotide. In the figure, reference numeral 10 denotes a substrate for fixing a polynucleotide such as DNA, 101 denotes a fixed support made of diamond, diamond-like carbon or graphite, and 301 denotes a chemically modified portion. The chemical modification unit 301 is divided into minute areas as shown in FIG. 2, and each minute area is discretely two-dimensionally arranged. In this embodiment, a 3 mm square and 0.3 mm thick CVD diamond is used as the fixed support 101.
[0041]
As shown in FIG. 3, in the method of manufacturing the base 10 of the present embodiment, first, the entire surface of the fixed support 101 was chemically modified (step 1). Next, the chemical modification units 301 were selectively removed so that the chemical modification units 301 were discretely arranged as shown in FIG. 2 (step 2). In the chemical modification in Step 1, referring to Patent Document 1, the surface of the fixed support 101 of CVD diamond is chlorinated by irradiating it with ultraviolet light in chlorine gas, and then aminated by irradiating it with ultraviolet light in ammonia gas. Cargoxylation was carried out by carbonization in chloroform using chloride. The fixed support 101 whose surface was chemically modified was immersed in a 1,4-dioxane solution in which carbodiimide and N-hydroxysuccinimide were dissolved, and terminal carboxyl groups were dehydrated and condensed. After the completion of the reaction, the resultant was further washed with a 1,4-dioxane solution and then dried to chemically modify the surface of the fixed support 101. Next, in the selective removal of the chemical modification unit 301 in step 2, a laser was used. The laser used was a YAG fourth-harmonic laser having a wavelength of 266 nm, and was condensed by a lens system so as to have a diameter of 200 μm on the surface of the fixed support 101. This laser beam was scanned in the XY direction at equal intervals of 350 μm using two galvanometer scanners. With respect to the laser beam having a wavelength of 266 nm, the covalent bond between the carbon atoms of the diamond used as the fixed support 101 is broken, and the laser irradiation portion on the surface of the fixed support 101 is subjected to chemical processing. Therefore, the surface of the solid support 101 in the irradiated portion was lost by several μm by the laser irradiation, and the chemically modified portion 301 could be removed.
[0042]
The size of each chemically modified portion 301 of the produced base 10 was 150 μm square, and the distance between each chemically modified portion was 200 μm. The PCR-amplified DNA prepared in advance was spotted and fixed on each of the chemically modified portions 301 of the prepared substrate 10 by a spotting device to prepare a microarray. Thereafter, hybridization was performed with a fluorescent-labeled probe having a complementary sequence, and analysis was performed using a fluorescence analyzer. Compared with the conventional microarray, since the minute spots of DNA are regularly arranged at predetermined positions, the dispersion of the analysis results for each sample is greatly reduced.
[0043]
(Second embodiment)
FIG. 4 is a sectional view of a substrate for immobilizing the polynucleotide of the second embodiment. FIG. 5 is a top view of a substrate for immobilizing the polynucleotide of the second embodiment. In the figure, 102 is a fixed layer, 103 is a support, and 301 is a chemically modified part. In this embodiment, the fixed support includes a fixed layer 102 and a support 103 that supports the fixed layer 102. The fixed layer 102 is divided into minute areas as shown in FIG. 5, and each minute area is discretely two-dimensionally arranged. The chemical modification section 301 is provided on the fixed layers 102 arranged two-dimensionally.
[0044]
As a method of manufacturing the base 10 of the present embodiment, as shown in FIG. 6, first, the fixed layer 102 was formed on the entire surface of the support 103 (Step 1). Next, the fixed layer 102 was selectively removed so that the fixed layer 102 was discretely arranged as shown in FIG. 5 (step 2). Further, chemical modification was performed on the fixed layer 102 (Step 3). In step 1, methane gas (CH 2) was placed on a glass or silicon support 103 having a size of 25 mm × 76 mm and a thickness of 1 mm. ₄ ) Was used as a raw material to form diamond-like carbon having a thickness of 0.2 μm using plasma CVD. In step 2, processing was performed using a reactive ion etching (RIE) method. According to the used mask shape, 100,000 small areas of the fixed layer 102 of φ50 μm two-dimensionally arranged at a pitch of 125 μm could be formed. In step 3, the same chemical modification treatment as in step 1 of the first embodiment was performed.
[0045]
FIG. 7 is a cross-sectional view of the microarray 1 obtained by spotting and fixing DNA on the substrate 10 manufactured in this example. In the figure, 200 is a minute spot of DNA. The microarray 1 was hybridized with a fluorescent-labeled probe having a complementary sequence, and analyzed by a fluorescence analyzer. As a result, 100,000 DNAs mounted at high density could be analyzed. Compared to a conventional microarray that was able to analyze only several thousands, it was possible to achieve a much higher density.
[0046]
(Third embodiment)
The substrate for immobilizing the polynucleotide of the third embodiment was prepared by processing using a laser in step 2 of FIG. 6 of the second embodiment. The laser used was a fourth harmonic of a YAG laser having a wavelength of 266 nm, and was condensed by a lens system so as to have a diameter of 75 μm on the surface of the fixed layer 102. The laser beam was scanned in the X-Y direction at equal intervals of 125 μm using two galvanometer scanners. As a result, 100,000 small areas of the fixed layer 102 having a diameter of 50 μm and two-dimensionally arranged at a pitch of 125 μm were formed. In step 3, the same chemical modification treatment as in step 3 of the second embodiment was performed.
[0047]
As in the second example, DNA was spotted on the substrate of the present example, hybridized with a fluorescent-labeled probe having a complementary sequence, and analyzed with a fluorescence analyzer. As a result, as in the second embodiment, 100,000 DNAs mounted at high density could be analyzed. As compared with the conventional microarray which was able to analyze only about several thousand pieces, the density was significantly increased as in the second embodiment.
[0048]
(Fourth embodiment)
FIG. 8 is a sectional view of a substrate for immobilizing the polynucleotide of the fourth embodiment. As shown in the figure, the base of the present embodiment is provided with positioning marks 501 to 503 at the end thereof, which indicate the two-dimensional arrangement positions of the chemically modified portions 301. The positioning mark 501 indicates the start point in the X-axis direction of the two-dimensional array of the chemical modification unit 301, the positioning mark 502 indicates the end point in the X-axis direction, and the positioning mark 503 indicates the start point in the Y-axis direction. Other configurations are the same as those of the bases of the second and third embodiments. The base of the present embodiment also includes a support 103 made of glass or silicon, and a diamond two-dimensionally arranged on the support 103 in a discrete manner. A fixed layer 202 made of like carbon and a chemically modified portion 301 provided on the fixed layer 202 are provided.
[0049]
This apparatus for manufacturing a substrate includes a processing laser that can scan in two-dimensional directions. As the processing laser, a YAG laser or a harmonic (SHG, THG, FHG) laser of the YAG laser can be used. It is also possible to use a semiconductor laser. As means for scanning in the two-dimensional direction, a two-axis stage, two scanner mirrors, a combination of a stage and a scanner mirror, or the like can be used.
[0050]
As a method of manufacturing the substrate, first, the fixing layer 102 was formed on the entire surface of the support 103 (Step 1). Next, the fixed layer 102 was selectively removed by the processing laser so that the fixed layer 102 was discretely arranged as shown in FIG. 5 (step 2). Next, a positioning mark 501 indicating a start point in the X-axis direction of the two-dimensional array of the fixed layer 102, a positioning mark 502 indicating an end point in the X-axis direction, and a positioning mark 503 indicating a start point in the Y-axis direction are processed by the processing laser. (Step 3). Further, chemical modification was performed on the fixed layer 102 (Step 4).
[0051]
In step 1, methane gas (CH 2) was placed on a glass or silicon support 103 having a size of 25 mm × 76 mm and a thickness of 1 mm. ₄ ) Was used as a raw material to form diamond-like carbon having a thickness of 0.2 μm using plasma CVD.
[0052]
The laser used in Step 2 was a YAG fourth-harmonic laser having a wavelength of 266 nm, which was focused on the surface of the fixed layer 102 by a lens system so as to have a diameter of 75 μm. The laser beam was scanned in the X-Y direction at equal intervals of 125 μm using two galvanometer scanners. As a result, 100,000 small areas of the fixed layer 102 having a square of 50 μm and two-dimensionally arranged at a pitch of 125 μm were formed.
[0053]
In step 3, the position of the support 103 was not moved from the state in step 2, and only the scanning position command of the processing laser was controlled to mark. At that time, the laser beam was condensed so that the condensing diameter of the laser became φ10 μm on the surface of the fixed layer 102 so that the line width of the positioning mark became thin, and then the mark was formed. The order of Step 2 and Step 3 may be reversed.
[0054]
In step 4, the support in step 3 was taken out and chemically modified with reference to Patent Document 1.
[0055]
A sample DNA prepared in advance was fixed to the prepared substrate by a spotting device, and a microarray having 100,000 DNA micro spots was prepared. Then, it was hybridized with a fluorescently labeled sample DNA and analyzed by a fluorescence analyzer.
[0056]
As shown in FIG. 9, the fluorescence analysis method first scans and irradiates the end of the substrate with an excitation laser and detects the change in the reflected light with a photomultimeter, thereby determining the position of the positioning mark. Identified (step 1). Next, based on the position of the positioning mark, the two-dimensional array position coordinates of the minute spots of the polynucleotide were calculated (step 2). After that, the scanning direction of the excitation laser beam was corrected based on the two-dimensional arrangement position coordinates of the minute spots, and the microarray was irradiated (step 3).
[0057]
In order to compare a conventional microarray provided with no positioning mark with a microarray provided with the positioning mark of the present invention, fluorescence analysis was performed on the same sample DNA using 20 microarrays. As a result, in the microarray provided with the positioning marks of the present invention, the variation in measurement was suppressed to 1/5.
[0058]
In each of the above examples, DNA was used as a sample. However, similar effects were obtained by using other polynucleotides such as mRNA and cDNA.
[0059]
Further, in this embodiment, the positioning mark is formed by laser, but it is also possible to form an identification code such as a bar code or a two-dimensional code at the end of the base at the same time.
[0060]
【The invention's effect】
As described above, according to the substrate for immobilizing the polynucleotide according to claim 1 of the present invention, the size and arrangement of the minute spots of the polynucleotide are obtained by chemically modifying only the portion where the polynucleotide is to be immobilized. Can be equalized. Therefore, gene analysis can be performed with high accuracy.
[0061]
Further, according to the substrate for immobilizing the polynucleotide according to the second aspect, by providing a chemically modified portion which is discretely and two-dimensionally arranged by removing a portion of the immobilization layer where the polynucleotide is not immobilized. Can be. Therefore, the size and arrangement of the minute spots of the polynucleotide can be equalized, and the gene can be analyzed with high accuracy. Further, the polynucleotide can be immobilized on the substrate at a high density.
[0062]
According to the substrate for immobilizing the polynucleotide according to claims 3 and 4, since silicon has hydrophobicity and diamond, diamond-like carbon, and graphite have hydrophilicity, DNA spotted on the substrate is used. Can be efficiently concentrated on the chemically modified portion on diamond, diamond-like carbon or graphite, avoiding silicon.
[0063]
Further, according to the substrate for immobilizing the polynucleotide according to the fifth aspect, the excitation laser of the fluorescence analyzer can be accurately scanned and irradiated on the arrangement position of the minute spots. Even if there is variation, variation in measurement can be suppressed.
[0064]
Further, according to the method for manufacturing a substrate for immobilizing a polynucleotide according to claim 6, only a portion where the polynucleotide is to be immobilized can be a chemically modified portion, and the size and arrangement of the minute spots of the polynucleotide can be reduced. Can be even.
[0065]
According to the method for producing a substrate for immobilizing a polynucleotide according to claim 7, since a laser is used, it is easily immobilized when producing microarrays having different sizes and arrangement numbers of minute spots of the polynucleotide. Chemically modified portions on the surface of the support can be selectively removed.
[0066]
According to the method for producing a substrate for immobilizing a polynucleotide according to claim 8, since only a certain portion of the immobilization layer is chemically modified, it is possible to provide discretely two-dimensionally arranged chemically modified portions. it can.
[0067]
According to the method for manufacturing a substrate for immobilizing a polynucleotide according to claim 9, since etching is used, the fixing layer can be finely two-dimensionally arranged according to the dimensional accuracy of a mask used for etching. it can.
[0068]
Further, according to the method of manufacturing a substrate for immobilizing a polynucleotide according to claim 10, since the laser processing is used, the fixing layer can be finely two-dimensionally arranged.
[0069]
According to the microarray according to the eleventh aspect, the size and arrangement of the minute spots of the polynucleotide can be equalized, and the minute spots of the polynucleotide can be reduced, so that analysis of many genes can be performed. A high-density microarray that can be performed at one time can be obtained. Further, in a microarray comprising a substrate provided with a positioning mark indicating a two-dimensional arrangement position of a chemically modified portion, that is, a minute spot of a polynucleotide, the excitation light of the fluorescence analyzer is detected by detecting the positioning mark in advance by the fluorescence analyzer. It can scan and irradiate minute spots of polynucleotide accurately.
[0070]
Further, according to the microarray fluorescence analysis method of claim 12, since the excitation laser of the fluorescence analyzer accurately scans and irradiates the arrangement position of the minute spots, even if the external dimensions of each microarray vary, Variation in measurement can be suppressed.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a cross-sectional view of a substrate for immobilizing a polynucleotide according to a first embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a top view of a substrate for immobilizing a polynucleotide according to the first embodiment of the present invention.
FIG. 3 is a schematic diagram illustrating a method for producing a substrate for immobilizing a polynucleotide according to the first embodiment of the present invention.
FIG. 4 is a cross-sectional view of a substrate for immobilizing a polynucleotide according to a second embodiment of the present invention.
FIG. 5 is a top view of a substrate for immobilizing a polynucleotide according to a second embodiment of the present invention.
FIG. 6 is a schematic view illustrating a method for producing a substrate for immobilizing a polynucleotide according to a second embodiment of the present invention.
FIG. 7 is a sectional view of a microarray showing a second embodiment of the present invention.
FIG. 8 is a top view of a substrate for immobilizing a polynucleotide according to a fourth embodiment of the present invention.
FIG. 9 is a schematic diagram showing a method for analyzing fluorescence of a microarray of the present invention.
FIG. 10 is a top view of a conventional substrate for immobilizing a polynucleotide.
FIG. 11 is a cross-sectional view of a conventional substrate for immobilizing a polynucleotide.
FIG. 12 is a cross-sectional view of a conventional substrate for immobilizing a polynucleotide.
FIG. 13 is a schematic view of a conventional fluorescence analyzer.
FIG. 14 is a schematic view showing a problem of a conventional microarray.
[Explanation of symbols]
1 Microarray
10. Substrate for immobilizing polynucleotide
100 Fixed support made of glass slide or silicon
101 Fixed support made of diamond, diamond-like carbon, or graphite
102 Fixed layer made of diamond, diamond-like carbon, or graphite
103 Support made of glass or silicon
200 DNA micro spots
Polymer layer such as 300 Poly-L-lysine
301 Chemical Modification Department
401 First laser light source for outputting first pump laser
402 Second laser light source for outputting a second excitation laser
403 Reflecting mirror
404 First dichroic mirror
405 prism
406 First Scanner Mirror
407 Second scanner mirror
408 lens
409 Filter
410 Pinhole
411 Second dichroic mirror
412 First Photomultimeter
413 Second photomultimeter
501-503 Positioning mark

Claims

At least a surface having a fixed support made of a carbon-based material, a substrate for immobilizing a polynucleotide,
A substrate for immobilizing a polynucleotide, characterized in that a chemical modification portion which is two-dimensionally arranged discretely is provided on the fixed support.

2. The substrate for immobilizing a polynucleotide according to claim 1, wherein the fixed support comprises a fixed layer made of a carbon-based material and a support for supporting the fixed layer.

3. The substrate for immobilizing a polynucleotide according to claim 2, wherein the support is made of silicon.

The substrate for immobilizing a polynucleotide according to any one of claims 1 to 3, wherein the carbon-based material is made of at least one of diamond, diamond-like carbon, and graphite.

The substrate for immobilizing a polynucleotide according to any one of claims 1 to 4, wherein a positioning mark indicating a two-dimensional arrangement position of the chemical modification portion is provided at an end.

A method for producing a substrate for immobilizing the polynucleotide according to claim 1,
A method for producing a substrate for immobilizing a polynucleotide, wherein the surface of the fixed support is chemically modified, and a chemically modified portion on the surface of the fixed support is selectively removed.

7. The method according to claim 6, wherein the chemically modified surface of the fixed support is selectively removed by a laser beam when the chemically modified portion on the surface of the fixed support is selectively removed. A method for manufacturing a substrate.

A method for producing a substrate for immobilizing the polynucleotide according to claim 2,
A method for producing a substrate for immobilizing a polynucleotide, wherein the fixing layer is two-dimensionally arranged discretely and the surface of the fixing layer is chemically modified.

9. The substrate according to claim 8, wherein the fixed layer formed on the support is selectively removed by etching when the fixed layer is two-dimensionally arranged discretely. Manufacturing method.

9. The method according to claim 8, wherein the fixed layer formed on the support is selectively removed by laser processing when the fixed layer is discretely two-dimensionally arranged. A method for manufacturing a substrate.

A microarray comprising a substrate for immobilizing the polynucleotide according to any one of claims 1 to 5, and a polynucleotide two-dimensionally immobilized on a chemically modified portion of the substrate.

A microarray fluorescence analysis method for analyzing a polynucleotide of a microarray comprising a substrate for immobilizing the polynucleotide according to claim 5 and a polynucleotide two-dimensionally fixed on a chemically modified portion of the substrate. At
Detecting the positioning mark, calculate the two-dimensional sequence position information of the polynucleotide based on the position information of the detected positioning mark,
A microarray fluorescence analysis method, comprising: correcting a scanning direction of a detection laser beam based on the two-dimensional array position information of the polynucleotide and irradiating the corrected microarray with the microarray.