【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、基礎研究レベル、臨床診断レベルの全てにおける血清の電気泳動的解析分野に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血清のアルブミンを除去する方法、免疫グロブリンを除去する方法はそれぞれ個別の方法として知られている。しかし、これらの方法は血清中の微量なタンパク質成分の電気泳動的解析には不十分である。また、２次元電気泳動を行う際に効率よく血清タンパク質成分を可溶化するための組成を有するリシスバッファーは知られていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、血清中に多量に存在する血清アルブミン及び免疫グロブリンを効率的に除去する方法、及び血清タンパク質成分を可溶化するバッファーを提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討した結果、前処理すべき血清試料を５５〜６５％飽和硫安によって硫安分画し、得られた沈殿画分を、後述する血清アルブミン用担体及び後述する免疫グロブリン用担体を用いて精製することによって、上記目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち本発明は、前処理すべき血清試料を５５〜６５％飽和硫安によって硫安分画し、得られた沈殿画分を、血清アルブミンに対する親和性吸着体が支持体に結合した担体及び免疫グロブリンに対する親和性吸着体が支持体に結合した担体を用いて精製する、血清の前処理法である。
【０００６】
本発明は、前記硫安分画を６０％飽和硫安によって行う、前記の血清の前処理法である。
【０００７】
本発明は、前記血清アルブミンに対する親和性吸着体が、クロロトリアジン色素である、前記の血清の前処理法である。
本発明は、前記血清アルブミンに対する親和性吸着体が、チバクロンブルーＦ３ＧＡ及びプロシオンレッドＨＥ３Ｂから選ばれる、前記の血清の前処理法である。
【０００８】
本発明は、前記免疫グロブリンに対する親和性吸着体が抗原物質である、前記の血清の前処理法である。
本発明は、前記免疫グロブリンに対する親和性吸着体が、プロテインＡ及びプロテインＧから選ばれる、前記の血清の前処理法である。
【０００９】
本発明は、前記精製の後、リシスバッファーに溶解する、前記の血清の前処理法である。
本発明は、前記リシスバッファーが、リシスバッファー全体を基準として５〜８Ｍの尿素、１．５〜２．５Ｍのチオ尿素、２〜４重量％の３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、０．５〜２重量％のトリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、０．２〜０．６重量％の両性担体（ｃａｒｒｉｅｒ ａｍｐｈｏｌｙｔｅ）、及び２０〜７０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む、前記の血清の前処理法である。
【００１０】
本発明は、電気泳動のための、前記の血清の前処理法である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明においては、血清タンパク質から、血清アルブミン、免疫グロブリンを高効率で除去する。本明細書では、血清タンパク質から血清アルブミン及び免疫グロブリンを除外したものをその他の血清タンパク質と表記する。
【００１２】
本発明においては、まず前処理すべき血清試料を硫安分画することによって、通常血清タンパク質全体に対して５０〜６０重量％程度含まれている血清アルブミンの大部分を除去する。用いられる硫安（硫酸アンモニウム）の濃度は、５５〜６５％飽和、例えば６０％飽和である。ここで、％飽和で表される濃度は、２５℃における硫酸アンモニウムの溶解度に対する１００分率を表す。上記特定の範囲の濃度によって、血清タンパク質のうち、主にその他の血清タンパク質及び免疫グロブリンを沈殿させ、血清アルブミンの大部分を上澄みへ分画することができる。この範囲において沈殿する画分は、主として前記その他の血清タンパク質及び免疫グロブリンであり、少量の血清アルブミンも含まれている。この沈殿画分に含まれている血清アルブミンの量は、沈殿画分全体の量を基準として１５〜２５重量％程度である。
【００１３】
上記硫安分画による沈殿画分は、限外濾過によって脱塩・濃縮することができる。限外濾過は、常法により行うことができる。
【００１４】
本発明においては、前記硫安分画に加えて、さらにアフィニティークロマトグラフィーによる精製を行う。アフィニティークロマトグラフィーは、血清アルブミンに対する親和性吸着体が支持体に結合した担体（血清アルブミン用担体）、及び免疫グロブリンに対する親和性吸着体が支持体に結合した担体（免疫グロブリン用担体）を用いて行う。
【００１５】
血清アルブミンに対する親和性吸着体としては、イオン相互作用、疎水相互作用、立体構造的相互作用等による結合部位が存在し、これらの作用が重なり合うことによって血清アルブミンを特異的に結合させるものを用いる。このような親和性吸着体としては、クロロトリアジン色素が挙げられる。クロロトリアジン色素の例としては、チバクロンブルーＦ３ＧＡ、プロシオンレッドＨＥ３Ｂなどが挙げられる。これら親和性吸着体は、単独で、又は組み合わせて用いることができる。本発明においては、チバクロンブルーＦ３ＧＡを用いることが好ましい。
【００１６】
前記血清アルブミンに対する親和性吸着体を結合させる支持体としては特に限定されないが、架橋アガロースゲルを用いることが好ましい。支持体の形状としては特に限定されないが、ゲル等をビーズ状にしたものが好ましい。
本発明における血清アルブミン用担体としては、架橋アガロースビーズにチバクロンブルーＦ３ＧＡを結合させた担体であるＡｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｂｌｕｅ（バイオラッド社製）を用いることが特に好ましい。
このような血清アルブミン用担体を用いることによって、前記沈殿画分に残留する血清アルブミンをさらに除去することができる。
【００１７】
免疫グロブリンに対する親和性吸着体としては、免疫グロブリンを特異的に吸着させる抗原物質を用いることが好ましい。このような親和性吸着体としては、プロテインＡ、プロテインＧなどが挙げられる。これら親和性吸着体は、単独で、又は組み合わせて用いることができる。本発明においては、プロテインＡを用いることが好ましい。
【００１８】
前記免疫グロブリンに対する親和性吸着体を結合させる支持体としては特に限定されないが、架橋アガロースゲルを用いることができる。支持体の形状としては特に限定されないが、ゲル等をビーズ状にしたものを用いることができる。
本発明における免疫グロブリン用担体としては、架橋アガロースビーズにプロテインＡを結合させた担体であるＡｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ（バイオラッド社製）を用いることが特に好ましい。
このような免疫グロブリン用担体を用いることによって、前記沈殿画分に含まれる免疫グロブリンを除去することができる。
【００１９】
上述したように、本発明においては、硫安分画と、上記血清アルブミン用担体及び上記免疫グロブリン担体を用いた精製とを組み合わせて行う。これによって得られる精製試料は、主としてその他の血清タンパク質を含み、血清アルブミン及び免疫グロブリンは少量含むのみである。特にこの精製試料に含まれる血清アルブミンはほとんど除去されており、その量は、精製試料全体の量を基準として０．３〜０．８重量％程度である。一方、この精製試料に含まれる免疫グロブリンの量は、精製試料全体の量を基準として５〜１５重量％程度である。
【００２０】
本発明においては、上記血清アルブミン用担体及び上記免疫グロブリン用担体を組み合わせて用いることによって、血清タンパク質から血清アルブミン及び免疫グロブリンを効率よく取り除くことができる。このようにして得られた精製試料は、様々な血清プロテオーム解析に用いることができる。
【００２１】
２次元電気泳動によってプロテオーム解析を行う場合は、上述の硫安分画及び精製によって得られた精製試料を、リシスバッファーに溶解させる。前記リシスバッファーは、リシスバッファー全体を基準として５〜８Ｍの尿素、１．５〜２．５Ｍのチオ尿素、２〜４重量％の３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、０．５〜２重量％のトリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、０．２〜０．６重量％の両性担体（ｃａｒｒｉｅｒ ａｍｐｈｏｌｙｔｅ）、及び２０〜７０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含むことが好ましい。本発明においては、例えば、リシスバッファー全体を基準として５Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、３重量％のＣＨＡＰＳ、１重量％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．４重量％のｃａｒｒｉｅｒ ａｍｐｈｏｌｙｔｅ、及び５０ｍＭのＤＴＴの組成を有するリシスバッファーを用いることができる。
【００２２】
上記特定の範囲の組成を有するリシスバッファーを用いることによって、効率よく血清タンパク質成分を可溶化することができる。また、２次元電気泳動パターンにおいて多くのタンパク質スポットの数を検出することができ、各タンパク質スポットのフォーカスのされ方も優れている。
【００２３】
本発明の方法においては、検出できるタンパク質のスポットの数が従来の方法に比べて多く、各タンパク質のフォーカスのされ方も従来の方法に比べて優れている。
【００２４】
【実施例】
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。また、「％」は特に断りのない限り、すべて重量基準である。
【００２５】
［実施例］
ラット血清１０μｌ（１０００μｇ）に１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を９０μｌ加え、１００μｌとした。これに終濃度６０％硫安になるように１００％硫安溶液を加えた。攪拌後、氷上に３０分放置した。（このとき、１０分毎に攪拌した。）その後、２０，０００×ｇ、１時間、４℃で遠心操作を行った。得られた沈殿物に１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を４００μｌ加え、溶解した。溶解されたサンプルをマイクロコンＹＭ−３（ミリポア社製）に移し、１４，０００×ｇ、４℃、１００分で遠心操作を行った。マイクロコンＹＭ−３のリザーバーに１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を４００μｌ加え、１４，０００×ｇ、４℃、１００分で遠心操作を行った。濃縮された液をＡｕｒｕｍ Ｓｅｒｕｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（バイオラッド製、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｂｌｕｅ及びＡｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎのキット）により精製した。精製試料をリシスバッファー（５Ｍ 尿素、２Ｍ チオ尿素、３重量％ ＣＨＡＰＳ、１重量％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．４重量％ ｃａｒｒｉｅｒ ａｍｐｈｏｌｙｔｅ、５０ｍＭ ＤＴＴ）に溶解し、電気泳動用サンプルを調製した。
【００２６】
［比較例１］
ラット血清１００μｌ（１００μｇ）を６種類用意し、終濃度がそれぞれ３０、４０、５０、６０、７０、８０％飽和硫安になるように、それぞれに１００％硫安溶液を加えた。攪拌後、氷上に３０分放置した。（このとき、１０分毎に攪拌した。）その後、２０，０００×ｇ、１時間、４℃で遠心操作を行った。上清（ｓｕｐ）は、マイクロコンＹＭ−３（ミリポア社製）に移し、１４，０００×ｇ、４℃、１００分で遠心操作を行った。一方、沈殿物（ｐｐｔ）は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）４００μｌに溶解し、マイクロコンＹＭ−３に移し、１４，０００×ｇ、４℃、１００分で遠心操作を行った。遠心操作を行った上清試料及び沈殿物試料それぞれに、等量の２×ＳＤＳサンプルバッファー（０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）／４％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）／３０％グリセロール／０．０２５％ＢＰＢ（ブロモフェノールブルー））を加え、１００℃で３分間加熱し、電気泳動用サンプルを調製した。それぞれの電気泳動用サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％ゲル）に供し、ＣＢＢ（クーマシーブリリアントブルー）染色を行った。
その結果を図１に示す。図１が示すように、６０％飽和硫安による沈殿画分におけるアルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ）の量が少なく、且つ他のタンパク質のロスも少ないという結果になった。
【００２７】
［比較例２］
ラット血清５０μｌ（５００μｇ）を、Ａｕｒｕｍ Ｓｅｒｕｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔによって精製した。精製試料をリシスバッファー（５Ｍ 尿素、２Ｍ チオ尿素、３重量％ ＣＨＡＰＳ、１重量％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．４重量％ ｃａｒｒｉｅｒ ａｍｐｈｏｌｙｔｅ、５０ｍＭ ＤＴＴ）に溶解し、電気泳動用サンプルを調製した。
【００２８】
［血清アルブミンの精製度の比較評価］
比較例２で精製に用いられた後のカラムゲル、及び実施例で精製に用いられた後のカラムゲルそれぞれに、等量の２×ＳＤＳサンプルバッファー（０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）／４％ＳＤＳ／３０％グリセロール／０．０２５％ＢＰＢ）を加え、１００℃で３分間加熱し、電気泳動用サンプルを調製した。
【００２９】
試料に用いたラット血清、実施例の精製試料、比較例１の６０％飽和硫安による硫安分画後の沈殿物試料、比較例２の精製試料、比較例２の精製後のカラムゲルからの試料、及び実施例の精製後のカラムゲルからの試料のそれぞれの電気泳動用サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％ゲル）にかけ、ＣＢＢ染色を行った。その結果を図２に示す。図２中、Ｍはマーカー、Ｃはラット血清、１は比較例１の硫安分画後の沈殿物試料、２は比較例２の精製試料、３は実施例の精製試料、４は比較例２の精製後のカラムゲルからの試料、５は実施例の精製後のカラムゲルからの試料である。Ｃ、１、２、及び３のレーンのゲルから血清アルブミンに相当するバンド部分を切り出し、その染色強度から血清アルブミンの量を概算した。
その結果、各レーンの全バンドに対する血清アルブミンの割合は以下のようになった。
Ｃ：４１．２％ １：１８．４％ ２：３．６％ ３：０．５％
【００３０】
以上の結果から、６０％飽和硫安による硫安分画と、Ａｕｒｕｍ Ｓｅｒｕｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔとを組み合わせると、血清アルブミンをほとんど取り除くことができた。また、Ａｕｒｕｍ Ｓｅｒｕｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔによる処理のみと比較しても、他のタンパク質の損失に大きな差はなかった。
【００３１】
【発明の効果】
本発明によれば、血清中に多量に存在する血清アルブミン及び免疫グロブリンを効率的に除去する方法、及び血清タンパク質成分を可溶化するバッファーが提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】比較例１のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。
【図２】実施例及び比較例による血清アルブミンの精製度を比較したＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to the field of electrophoretic analysis of serum at all basic research levels and clinical diagnostic levels.
[0002]
[Prior art]
Methods for removing serum albumin and immunoglobulin are known as individual methods. However, these methods are insufficient for electrophoretic analysis of trace protein components in serum. Further, a lysis buffer having a composition for efficiently solubilizing serum protein components when performing two-dimensional electrophoresis is not known.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for efficiently removing serum albumin and immunoglobulin present in a large amount in serum, and a buffer for solubilizing serum protein components.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies and, as a result, fractionated a serum sample to be pre-treated with ammonium sulfate using 55 to 65% saturated ammonium sulfate, and separated the obtained precipitate fraction into a serum albumin carrier described below and an immunoglobulin described later. It has been found that the above object can be achieved by purification using a carrier, and the present invention has been completed.
[0005]
That is, the present invention provides a serum sample to be pretreated, which is subjected to ammonium sulfate fractionation with 55 to 65% saturated ammonium sulfate, and the resulting precipitate fraction is separated into a carrier having an affinity adsorbent for serum albumin bound to a support and an immunoglobulin. This is a serum pretreatment method in which an affinity adsorbent is purified using a carrier bound to a support.
[0006]
The present invention is the above-mentioned serum pretreatment method, wherein the ammonium sulfate fractionation is performed with 60% saturated ammonium sulfate.
[0007]
The present invention is the above-mentioned serum pretreatment method, wherein the affinity adsorbent for serum albumin is a chlorotriazine dye.
The present invention is the above-mentioned serum pretreatment method, wherein the affinity adsorbent for serum albumin is selected from Cibacron Blue F3GA and Procion Red HE3B.
[0008]
The present invention is the above-mentioned serum pretreatment method, wherein the affinity adsorbent for the immunoglobulin is an antigenic substance.
The present invention is the above-mentioned serum pretreatment method, wherein the affinity adsorbent for the immunoglobulin is selected from protein A and protein G.
[0009]
The present invention is the above-described serum pretreatment method, wherein the serum is dissolved in a lysis buffer after the purification.
In the present invention, the lysis buffer is preferably 5 to 8 M urea, 1.5 to 2.5 M thiourea, and 2 to 4% by weight of 3-[(3-cholamidopropyl) -dimethyl based on the whole lysis buffer. Ammonio] -1-propanesulfonic acid (CHAPS), 0.5 to 2% by weight of Triton X-100, 0.2 to 0.6% by weight of an amphoteric carrier (carrier ampholyte), and This is a pretreatment method of the serum containing 20 to 70 mM dithiothreitol (DTT).
[0010]
The present invention is a method for pretreating the above-mentioned serum for electrophoresis.
[0011]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In the present invention, serum albumin and immunoglobulin are removed from serum proteins with high efficiency. In the present specification, a serum protein excluding serum albumin and immunoglobulin is referred to as other serum proteins.
[0012]
In the present invention, the serum sample to be pretreated is first fractionated with ammonium sulfate to remove most of the serum albumin normally contained in the serum protein at about 50 to 60% by weight. The concentration of ammonium sulphate (ammonium sulphate) used is 55-65% saturation, for example 60% saturation. Here, the concentration represented by% saturation represents a percentage of the solubility of ammonium sulfate at 25 ° C. With the concentration in the above specific range, among serum proteins, mainly other serum proteins and immunoglobulins can be precipitated, and most of the serum albumin can be fractionated into the supernatant. The fraction precipitated in this range is mainly the other serum proteins and immunoglobulins, and also contains a small amount of serum albumin. The amount of serum albumin contained in the precipitate fraction is about 15 to 25% by weight based on the total amount of the precipitate fraction.
[0013]
The precipitate fraction obtained by the above ammonium sulfate fractionation can be desalted and concentrated by ultrafiltration. Ultrafiltration can be performed by a conventional method.
[0014]
In the present invention, purification by affinity chromatography is further performed in addition to the ammonium sulfate fraction. Affinity chromatography uses a carrier having an affinity adsorbent for serum albumin bound to a support (carrier for serum albumin) and a carrier having an affinity adsorbent for immunoglobulin bound to the support (carrier for immunoglobulin). Do.
[0015]
As the affinity adsorbent for serum albumin, a substance that has binding sites due to ionic interaction, hydrophobic interaction, steric interaction, and the like, and specifically binds serum albumin by overlapping these actions is used. Such affinity adsorbents include chlorotriazine dyes. Examples of chlorotriazine dyes include Cibacron Blue F3GA, Procion Red HE3B, and the like. These affinity adsorbents can be used alone or in combination. In the present invention, it is preferable to use Cibacron Blue F3GA.
[0016]
The support to which the affinity adsorbent for serum albumin is bound is not particularly limited, but a cross-linked agarose gel is preferably used. The shape of the support is not particularly limited, but preferably a gel or the like in the form of beads.
As the carrier for serum albumin in the present invention, it is particularly preferable to use Affi-Gel Blue (manufactured by Bio-Rad), which is a carrier obtained by binding Cibacron Blue F3GA to cross-linked agarose beads.
By using such a serum albumin carrier, serum albumin remaining in the precipitate fraction can be further removed.
[0017]
As the affinity adsorbent for immunoglobulin, it is preferable to use an antigen substance that specifically adsorbs immunoglobulin. Such affinity adsorbents include protein A, protein G, and the like. These affinity adsorbents can be used alone or in combination. In the present invention, it is preferable to use protein A.
[0018]
The support to which the affinity adsorbent for the immunoglobulin is bound is not particularly limited, but a cross-linked agarose gel can be used. The shape of the support is not particularly limited, but a gel or the like in the form of beads can be used.
As the carrier for immunoglobulins in the present invention, it is particularly preferable to use Affi-Gel Protein (manufactured by Bio-Rad), which is a carrier obtained by binding protein A to cross-linked agarose beads.
By using such an immunoglobulin carrier, the immunoglobulin contained in the precipitate fraction can be removed.
[0019]
As described above, in the present invention, the ammonium sulfate fraction is combined with the purification using the serum albumin carrier and the immunoglobulin carrier. The resulting purified sample contains mainly other serum proteins and only small amounts of serum albumin and immunoglobulin. In particular, serum albumin contained in this purified sample is almost completely removed, and its amount is about 0.3 to 0.8% by weight based on the total amount of the purified sample. On the other hand, the amount of immunoglobulin contained in the purified sample is about 5 to 15% by weight based on the total amount of the purified sample.
[0020]
In the present invention, serum albumin and immunoglobulin can be efficiently removed from serum proteins by using the carrier for serum albumin and the carrier for immunoglobulin in combination. The purified sample thus obtained can be used for various serum proteome analyses.
[0021]
When performing proteome analysis by two-dimensional electrophoresis, a purified sample obtained by the above-described ammonium sulfate fractionation and purification is dissolved in a lysis buffer. The lysis buffer is 5-8M urea, 1.5-2.5M thiourea, 2-4% by weight of 3-[(3-cholamidopropyl) -dimethylammonio]-based on the whole lysis buffer. 1-propanesulfonic acid (CHAPS), 0.5-2% by weight of Triton X-100, 0.2-0.6% by weight of amphoteric carrier, and 20-70 mM of amphoteric carrier. It preferably contains dithiothreitol (DTT). In the present invention, for example, 5M urea, 2M thiourea, 3% by weight of CHAPS, 1% by weight of Triton X-100, 0.4% by weight of carrier ampholyte, and 50 mM of DTT based on the whole lysis buffer A lysis buffer having the following composition can be used.
[0022]
By using a lysis buffer having a composition in the above specific range, serum protein components can be efficiently solubilized. In addition, the number of protein spots can be detected in a two-dimensional electrophoresis pattern, and the focus of each protein spot is excellent.
[0023]
In the method of the present invention, the number of protein spots that can be detected is larger than in the conventional method, and the focusing of each protein is also superior to the conventional method.
[0024]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto. All “%” are based on weight unless otherwise specified.
[0025]
[Example]
90 μl of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) was added to 10 μl (1000 μg) of rat serum to make 100 μl. To this was added a 100% ammonium sulfate solution so that the final concentration was 60% ammonium sulfate. After stirring, the mixture was left on ice for 30 minutes. (At this time, the mixture was stirred every 10 minutes.) Thereafter, centrifugation was performed at 20,000 × g for 1 hour at 4 ° C. 400 μl of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) was added to the obtained precipitate to dissolve it. The dissolved sample was transferred to Microcon YM-3 (manufactured by Millipore) and centrifuged at 14,000 × g at 4 ° C. for 100 minutes. 400 μl of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) was added to the reservoir of Microcon YM-3, and centrifugation was performed at 14,000 × g at 4 ° C. for 100 minutes. The concentrated solution was purified by Aurum Serum Protein Mini Kit (manufactured by Bio-Rad, kits of Affi-Gel Blue and Affi-Gel Protein). The purified sample was dissolved in lysis buffer (5M urea, 2M thiourea, 3% by weight CHAPS, 1% by weight Triton X-100, 0.4% by weight carrier ampholyte, 50 mM DTT) to prepare a sample for electrophoresis.
[0026]
[Comparative Example 1]
Six 100 μl (100 μg) rat sera were prepared, and 100% ammonium sulfate solution was added to each such that the final concentrations were 30, 40, 50, 60, 70, and 80% saturated ammonium sulfate. After stirring, the mixture was left on ice for 30 minutes. (At this time, the mixture was stirred every 10 minutes.) Thereafter, centrifugation was performed at 20,000 × g for 1 hour at 4 ° C. The supernatant (sup) was transferred to Microcon YM-3 (manufactured by Millipore) and centrifuged at 14,000 × g at 4 ° C. for 100 minutes. On the other hand, the precipitate (ppt) was dissolved in 400 μl of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), transferred to Microcon YM-3, and centrifuged at 14,000 × g at 4 ° C. for 100 minutes. An equal volume of 2 × SDS sample buffer (0.125 M Tris-HCl (pH 6.8) / 4% SDS (sodium dodecyl sulfate) / 30% glycerol / 0) was added to each of the centrifuged supernatant sample and precipitate sample. .025% BPB (bromophenol blue)) and heated at 100 ° C. for 3 minutes to prepare a sample for electrophoresis. Each electrophoresis sample was subjected to SDS-PAGE (12.5% gel) and stained with CBB (Coomassie Brilliant Blue).
The result is shown in FIG. As shown in FIG. 1, the amount of albumin (Albumin) in the precipitate fraction with 60% saturated ammonium sulfate was small, and the loss of other proteins was small.
[0027]
[Comparative Example 2]
50 μl (500 μg) of rat serum was purified by the Aurum Serum Protein Mini Kit. The purified sample was dissolved in lysis buffer (5M urea, 2M thiourea, 3% by weight CHAPS, 1% by weight Triton X-100, 0.4% by weight carrier ampholyte, 50 mM DTT) to prepare a sample for electrophoresis.
[0028]
[Comparative Evaluation of Purity of Serum Albumin]
An equal amount of 2 × SDS sample buffer (0.125 M Tris-HCl (pH 6.8) / 4) was added to each of the column gel used for purification in Comparative Example 2 and the column gel used for purification in Examples. % SDS / 30% glycerol / 0.025% BPB) and heated at 100 ° C. for 3 minutes to prepare a sample for electrophoresis.
[0029]
Rat serum used for the sample, the purified sample of the example, the precipitate sample after ammonium sulfate fractionation with 60% saturated ammonium sulfate of Comparative Example 1, the purified sample of Comparative Example 2, the sample from the purified column gel of Comparative Example 2, Each sample for electrophoresis of the sample from the column gel after the purification was subjected to SDS-PAGE (12.5% gel), and CBB staining was performed. The result is shown in FIG. In FIG. 2, M is a marker, C is rat serum, 1 is a precipitate sample after ammonium sulfate fractionation of Comparative Example 1, 2 is a purified sample of Comparative Example 2, 3 is a purified sample of Example, and 4 is Comparative Example 2. 5 is a sample from the purified column gel of Example, and 5 is a sample from the purified column gel of Example. Bands corresponding to serum albumin were cut out from the gels in lanes C, 1, 2, and 3, and the amount of serum albumin was estimated from the staining intensity.
As a result, the ratio of serum albumin to all bands in each lane was as follows.
C: 41.2% 1: 18.4% 2: 3.6% 3: 0.5%
[0030]
From the above results, serum albumin could be almost completely removed by combining ammonium sulfate fractionation with 60% saturated ammonium sulfate and Aurum Serum Protein Mini Kit. Also, there was no significant difference in the loss of other proteins when compared to the treatment with the Aurum Serum Protein Mini Kit alone.
[0031]
【The invention's effect】
According to the present invention, there are provided a method for efficiently removing serum albumin and immunoglobulin present in a large amount in serum, and a buffer for solubilizing serum protein components.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the result of SDS-PAGE of Comparative Example 1.
FIG. 2 shows the results of SDS-PAGE comparing the purity of serum albumin according to Examples and Comparative Examples.