JP2004208654A

JP2004208654A - Nucleic acid isolation cartridge and nucleic acid isolation device

Info

Publication number: JP2004208654A
Application number: JP2003002369A
Authority: JP
Inventors: Masaharu Aritomi; 正治有富; Masahiro Tsukamoto; 雅弘塚本; Mikio Takada; 幹生高田
Original assignee: Asahi Kasei Corp
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 2003-01-08
Filing date: 2003-01-08
Publication date: 2004-07-29

Abstract

【課題】ＰＯＣ検査に適した簡便な核酸単離装置、すなわち、核酸を含有する材料から、効率よく、短時間に自動機械化可能な手段により核酸を単離するカートリッジ、およびカートリッジ内で核酸を単離する自動装置を提供する。
【解決手段】核酸を含む試料から、核酸吸着物質に核酸を吸着させ、核酸吸着物質を洗浄し、吸着された核酸を溶出する一連の工程を、処理槽、廃液槽、集積槽を含む基底部材と、洗浄液、溶出液が、試薬ウェルピストンで封入された試薬ウェルを包含する頂上部材から構成され、頂上部材は基底部材に対して回転または並進が可能であるカートリッジ内の反応により、検体中の核酸を単離できる核酸単離用カートリッジと、そのカートリッジ内で核酸単離を行う核酸単離装置。
【選択図】図９Kind Code: A1 A simple nucleic acid isolation apparatus suitable for POC inspection, that is, a cartridge for isolating nucleic acid from a nucleic acid-containing material by means that can be automatically and efficiently automated in a short time, and a method for isolating nucleic acid in a cartridge. An automatic release device is provided.
A base member including a treatment tank, a waste liquid tank, and an accumulation tank is provided with a series of steps for adsorbing a nucleic acid to a nucleic acid-adsorbing substance from a sample containing the nucleic acid, washing the nucleic acid-adsorbing substance, and eluting the adsorbed nucleic acid. And a washing solution and an eluate are constituted by a top member including a reagent well enclosed by a reagent well piston, and the top member is capable of rotating or translating with respect to the base member, and a reaction in a cartridge is performed. A nucleic acid isolation cartridge capable of isolating a nucleic acid, and a nucleic acid isolation device for performing nucleic acid isolation in the cartridge.
[Selection] Fig. 9

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸を含有する材料から、簡便、かつ、短時間に核酸を精製、単離する核酸単離カートリッジ、および該核酸単離カートリッジを制御する核酸単離装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子工学分野の進歩によって、遺伝子を用いた医療診断や微生物検査が行われるようになった。例えば、核酸ハイブリダイゼーション法を用いて、微生物の菌種同定を行う試験方法が実用化されている。また、ポリメラーゼ・チェイン反応法（ＰＣＲ法）（非特許文献１、特許文献１〜３）をはじめとした、様々な核酸増幅方法の開発により、遺伝子を用いた医療診断や微生物検査技術が大きく伸展した。これらの手法によると、配列特異的に核酸増幅を行わせることが可能である。そのため、検体中に存在する可能性のある特定の配列の核酸を、増幅して高感度に検出することができる。
【０００３】
医療診断や微生物検査に用いる検体中には、タンパク質、脂質、糖質等の夾雑物質が大量に含まれている。遺伝子を利用したポリメラーゼ・チェイン反応等の増幅反応やハイブリダイゼーション反応等を行う場合等においては、これらの夾雑物が悪影響を及ぼす。例えば、増幅反応が阻害される因子を含むような場合には、実際には、目的の菌が含まれているにもかかわらず、核酸の増幅反応が起きないため、検体中に菌が含まれていないという誤った結果を与える。したがって、核酸増幅反応や、ハイブリダイゼーション等の検出反応に影響を及ぼさないように、検体中の核酸を、これらの夾雑物が無いようにあらかじめ単離する操作が必要となる。
【０００４】
核酸を単離する方法として、特許文献４に記載の方法がある。この方法は、核酸を含有する材料に、グアニジンチオシアン酸塩水溶液等のカオトロピック性の高い水溶液を加えて核酸を遊離させた後、シリカ粒子に核酸を吸着させ、該シリカ粒子を洗浄して夾雑物質を分離し、最後にシリカ粒子に結合した核酸を溶出させることにより実施される。この方法は広く一般的に行われており、本手法に基づいた核酸の単離を行う試薬や用具は、いわゆる「キット」として市販されている。さらに、この手法を用いて、核酸を自動的に単離する自動装置も開発されている。
【０００５】
一方、医療における臨床検査の現場では、患者から採取した検体を、臨床の現場において、迅速、かつ、簡便に検査し、その結果を判断してすぐに診療に生かす、いわゆる「ポイント・オブ・ケアー・テスト」と呼ばれる診断法が求められている（以下、これらの検査を、「ＰＯＣ検査」、という）。これらの検査においては、できるだけ短時間に、かつ、手動で行う操作を減らして簡便に行うことが要求される。更に、このカートリッジは、「使い捨て」ができるように安価に製造することができるように設計されていることが望ましい。したがって、医療現場等で求められているＰＯＣ検査においては、簡易、かつ、低価格のカートリッジおよび装置を用いて、短時間に自動的に核酸を単離することが要求される。
【０００６】
しかし、従来から開発されている核酸の自動単離装置は、数多くの試料を大量に処理することが求められる場合には有用であるが、ＰＯＣ検査においては、十分にこの要求に応え得るとは言えず、解決すべき課題は非常に多い。特に、核酸を精製することが要求される試料の数が１種類、またはせいぜい数種類に限られている場合に、これらを迅速に処理する場合に、現時点で実用化されている装置はＰＯＣ検査の要求を満たしていない。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０：１３５０−１３５４、１９８５
【特許文献１】
特許第２５４６５７６号明細書
【特許文献２】
特許第２５０２０４１号明細書
【特許文献３】
特許第２６１３８７７号明細書
【特許文献４】
特許第２６８０４６２号明細書
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＰＯＣ検査に適した簡便な核酸単離装置を提供するものである。すなわち、核酸を含有する材料から、効率よく、短時間に自動機械化可能な手段により核酸を単離するカートリッジを提供することを課題とする。また、カートリッジ内で核酸を単離する自動装置を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題を解決するため、簡便、かつ、迅速に検体から核酸を単離するための核酸単離カートリッジ、および同カートリッジ用の核酸単離装置について、本出願人に係る国際特許公開第０１／１１３７４号パンフレットに開示された機器について、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＪＰ０２／０６９３９号に記載の手法を適用する検討を重ね、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）核酸を含む試料から核酸を単離するための核酸単離用カートリッジであって、該カートリッジは、
（イ）核酸吸着材料が固定されている処理槽、
（ロ）処理槽に連通し、廃液を溜める廃液槽、および
（ハ）処理槽に連通し、単離された核酸を含む溶液を集める集積槽、
を包含する基底部材と、
（ニ）核酸吸着材料を洗浄する洗浄液および／または核酸吸着材料から核酸を溶出する溶出液が封入された少なくとも１つの試薬ウェルを包含する頂上部材と、から構成され、試薬ウェルの少なくとも１つは、試薬を核酸吸着材料に搬送するための試薬ウェルピストンを有しており、頂上部材は基底部材に対して回転または並進が可能であることを特徴とする核酸単離用カートリッジ。
【００１１】
（２）基底部材は、処理槽と廃液槽を連通する廃液用配管、および／または処理槽と集積槽を連通する溶出液用配管を、さらに含むことを特徴とする（１）に記載の核酸単離用カートリッジ。
（３）頂上部材は、核酸を含む試料をカートリッジに導入する為の開口部、および／または単離された核酸を含む溶液を基底部材の集積槽から取り出す為の開口部を、さらに含むことを特徴とする（１）または（２）に記載の核酸単離用カートリッジ。
（４）試薬ウェルの底部は、破損可能なフィルムによって密封され、試薬ウェルの上部は、ピストンによって密封されていることを特徴とする（１）〜（３）のいずれか１つに記載の核酸単離用カートリッジ。
【００１２】
（５）基底部材に設置された集積槽の開口部は、破損可能なフィルムで密封されていることを特徴とする（１）〜（４）のいずれか１つに記載の核酸単離用カートリッジ。
（６）核酸吸着材料が核酸吸着フィルターであることを特徴とする（１）〜（５）のいずれか１つに記載の核酸単離用カートリッジ。
（７）核酸吸着フィルターが、ろ紙、織布、不織布、マトリックスまたは膜であることを特徴とする（６）に記載の核酸単離用カートリッジ。
（８）処理槽を加熱する機構が設置されていることを特徴とする（６）または（７）に記載の核酸単離用カートリッジ。
【００１３】
（９）処理槽が金属材料で形成されていることを特徴とする（８）に記載の核酸単離用カートリッジ。
（１０）核酸吸着フィルターを貫通する金属部材を有することを特徴とする（８）または（９）に記載の核酸単離用カートリッジ。
（１１）処理槽を、バルブまたは蓋により密閉する機構を有することを特徴とする（８）〜（１０）のいずれか１つに記載の核酸単離用カートリッジ。
（１２）処理槽内の液体が、廃液槽および／または集積槽に流出することを防止するバルブを有することを特徴とする（１）〜（１１）のいずれか１つに記載の核酸単離用カートリッジ。
【００１４】
（１３）試料中の核酸を単離するための核酸単離装置であって、
（ホ）（１）〜（１２）のいずれか１つに記載の核酸単離用カートリッジを設置する受容機構、
（ヘ）該カートリッジの頂上部材を基底部材に対して回転または並進させ、かつ、頂上部材を所定位置に位置決めすることができる回転または並進要素、
（ト）該カートリッジに設置された試薬ウェル内の試薬を送液する試薬ウェルピストンに押力を適用する垂直駆動装置と押し出し棒とから形成されるプランジャ要素、および
（チ）試料および／または試薬を、廃液槽および／または集積槽に送液するための減圧要素、
を包含すると共に、
核酸を含む検体を、核酸吸着材料近傍を通過させる過程で、核酸吸着材料に核酸を吸着させ、核酸吸着材料に吸着している不要な物質を洗浄液によって除去し、核酸が結合した核酸吸着材料に溶出試薬を加えて、溶出試薬中に核酸を溶出させる一連の工程に従って、（ヘ）〜（チ）の各要素を制御する制御装置を含むことを特徴とする核酸単離装置。
【００１５】
（１４）受容機構に、制御装置によって制御可能であり、受容された核酸単離用カートリッジを移動させ、かつ、カートリッジを所定位置に位置決めすることができる直線移動機構を、さらに含むことを特徴とする（１３）に記載の核酸単離装置。
（１５）制御装置によって制御可能な処理槽を加熱するための発熱体を、さらに包含することを特徴とする（１３）または（１４）に記載の核酸単離装置。
（１６）発熱体が、正の温度係数を有する物質への通電加熱を利用するものであることを特徴とする（１５）に記載の核酸単離装置。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、核酸とは、ＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）またはＲＮＡ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）を意味し、対象となる材料に含まれるＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。
【００１６】
本発明において、検体としては、例えば、喀痰、血液、尿、便等が挙げられるが、何らこれらに限定されるものではない。検体が固形成分等を含む場合は、溶解等の前処理により、核酸吸着材料である不織布等のフィルターや、核酸結合性樹脂等によく浸透し、通過できる性状とすることが望ましい。本目的の為には、例えば、検体が喀痰の場合、界面活性剤添加、加熱、機械的振動等の手段が有効である。この過程で検体に含まれる細胞が破壊され、検体中に核酸が遊離される。核酸単離カートリッジに注入する、検体または前処理済みの検体を、本発明では、試料、と称する。
【００１７】
本発明のカートリッジの材質としては、金属、ガラス、セラミックス等を用いることができ、加工の容易さの点からプラスチックが好ましい。ただし、核酸の単離工程において、核酸が吸着しない材質が好ましい。
このような材質としては、例えば、塩化ビニール樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリ塩化ビニリデン樹脂、ポリウレタン樹脂、テフロン（登録商標）樹脂、ナイロン樹脂、ポリスチレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂等が上げられる。
【００１８】
カートリッジ上に、バルブ、流路内の液体、気体の気密性を保つために、パッキング等にゴム等の弾性体を用いてもよい。このような弾性体としては、天然ゴム、ブタジエンゴム、スチレンゴム、ブチルゴム、エチレン・プロピレンゴム、ニトリルゴム、アクリルゴム、ウレタンゴム、シリコーンゴム、フッ素ゴム等のゴム類、軟質塩化ビニール樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリ塩化ビニリデン樹脂、ポリウレタン樹脂、テフロン（登録商標）樹脂、ナイロン樹脂等が上げられる。更に、カートリッジとしての形状を完成させるための部品、バルブに用いる部品、熱を効率良く伝える為の部品等は、プラスチックの他、アルミニウム、真鍮、鉄、銅、ステンレス、チタン合金、マグネシウム合金、ジュラルミン等の金属であってもよい。カートリッジに熱を加える場合には、その加熱部分が設定した温度において、機械的強度を維持できる材質を用いる。
【００１９】
本発明による核酸単離は、（ａ）核酸単離に必要な試薬類が封入されている試薬ウェルが、基底部材の必要な位置の上方に位置するように、頂上部材を、基底部材に対して回転または並進移動させる、（ｂ）頂上部材の試薬ウェルへ、プランジャ等で、外部から力を与えて試薬が基底部材の必要な位置に送液させる、ことにより遂行される。ここで、プランジャとは、流体を圧縮送液するための往復運動をなす機械部分の総称を意味している。
核酸単離の工程は、（ｃ）核酸を含む検体を、核酸吸着材料近傍を通過させる過程で、核酸吸着材料に核酸を吸着させる、（ｄ）核酸吸着材料に吸着している不要な物質を、洗浄液によって除去する、（ｅ）核酸が結合した核酸吸着材料に、溶出試薬を加えて溶出試薬中に核酸を溶出させる、（ｆ）加熱して、溶出試薬中に核酸を遊離させる、（ｇ）単離された核酸を含む溶出液を集積槽に送液する、ことからなる。
【００２０】
なお、核酸吸着材料および溶出試薬の種類によっては、（ｆ）の工程を省略することができる。また、最後の（ｇ）の工程も、処理槽が集積槽を兼ねることが可能であるため省略することができる。この場合は、単離された核酸溶液は処理槽の中に集積される。また、処理の工程で発生する廃液類は、廃液槽の中に送液され、貯留される。廃液槽の中に廃液を吸収するパッド類を設置しておけば、廃液がさらに他の部分に流れるのを防ぐことができる。
【００２１】
基底部材に、処理槽と廃液槽を連通する廃液用配管、および／または処理槽と集積槽を連通する溶出液用配管を設置することによって、配管を利用した送液が可能になり、カートリッジ内での送液が容易になるので好ましい。これらの配管の接続口は、処理槽の核酸吸着物質の位置よりも更に下部にある方が、液体が滞りなく廃液槽または集積槽へ送液されやすいので好ましい。処理槽と集積槽を連通する溶出液用配管を設ける場合には、配管の一部を試料液面より高い位置に配置することにより、試料が自重で処理槽の核酸吸着材料の部分から処理槽に流れる時に、集積槽側に流れ込むのを防ぐことができるので有用である。
【００２２】
頂上部材に、核酸を含む試料をカートリッジに導入する為の開口部および／または単離された核酸を含む溶液を基底部材の集積槽から取り出す為の開口部を設置することによって、処理槽への試料の導入、および／または集積槽から溶出液を取り出す操作が容易になる。これらの開口部は、それぞれ、異なる開口部でもよいが、同一の開口部を共用することも可能である。開口部を設ける場合は、初期状態では、処理槽上部に開口部が位置するように固定される。この開口部より、試料を、ピペット等を用いて処理槽に注入する。
【００２３】
処理槽に注入された試料は、自重、または外部に設置された吸引ポンプによる陰圧等によって、処理槽の部分から廃液槽に流れ込む。この過程は、試料および核酸吸着物質の性状に依存する。試料の粘性が高い場合や、吸着物質が細かい等の場合は、自重による試料の送液が行われにくいので、吸引ポンプに等によって処理槽から廃液槽に送液する。
頂上部材の試薬ウェルの底部は、破損可能なフィルムによって密封され、試薬ウェルの上部はピストンによって密封されることにより、試薬ウェル内部の試薬を、外気との接触が無い状態で保存することが可能になる。さらに、送液が必要な場合に、プランジャ等の外部からの力でフィルムの一部を破損せて送液させることが可能になる。
【００２４】
試薬保存の為には、フィルムは、保存する間に各ウェルに保存する内部の試薬によって腐食等を受けない性能、および内部の試薬を外部に漏出しない性能が要求される。また、フィルムは、ある十分な力を適用することによって破損する必要がある。例えば、試薬ウェル内の圧力増加により、試薬ウェル底面を密封していたフィルムを剥離させて送液すること、フィルムの破損を容易にするために、鋭利な突起物等をカートリッジに設置しておくこと等により達成される。試薬ウェルピストンに突起部を設けてもよい。ピストンによる密封が不完全である場合、ピストンの上部に、さらに破損可能なフィルムを組み合わせて密封しておくことも有効である。
【００２５】
基底部材に設置された集積槽の開口部を破損可能なフィルムで密封することにより、集積槽に集められた単離された核酸溶液を、外気との接触が無い状態で保存することが可能になり、保存期間の間、外からの不純物の混入をさけることができる。単離された核酸が必要な場合には、フィルムの一部を破損せて取り出す。フィルムは、単離された核酸を保存する間に、単離された核酸を含む溶液によって、実質的に変化しない性能、および内部の試薬を外部に漏出しない性能が要求される。
【００２６】
核酸吸着物質として、核酸吸着フィルターを用いることにより、核酸吸着物質を処理槽に容易に設置することが可能になり、検体からの核酸を効率よく、核酸吸着物質上に吸着させることができる。
フィルターとしては、核酸吸着性物質であり、適当な溶出液が選択できるものであればよく、ろ紙、織布、不織布、マトリックスおよび膜が好ましい。フィルターの形状、厚さ、材質、形状、寸法等は、カートリッジに設置できるものであれば制限されない。フィルターは、シート、膜、板塊状、繊維状、粒状等の任意の形態であることができるが、処理槽への設置の容易さから、シート状のものが好ましい。材質は、親水性および疎水性のいずれでもよいが、疎水性が好ましい。
【００２７】
フィルターは、有機材料および無機材料のいずれからなっていてもよく、天然材料、合成材料または半合成材料からなっていてもよい。フィルターの例としては、天然、合成、半合成または再生の、有機または無機繊維からなる多孔質体；有機または無機発泡体（例えばスポンジ、フォーム等）；孔成分の溶出、焼結、延伸、穿孔等により孔形成された有機、無機多孔質体；有機または無機の微粒子や細片を充填または結合した多孔質体；ろ紙等を挙げることができる。
【００２８】
例えば、繊維からなるフィルターの場合は、繊維としては、有機または無機の短繊維、スライバーおよび長繊維のいずれでもよい。フィルターの形態は任意であり、例えば、単なる繊維の塊でもよく、１層または複数層のシート状でもよい。
核酸吸着フィルターとして、ろ紙は安価であり、実験用として市販されているものを用いることができるので好ましい。ろ紙としては、セルロースを主成分とすものが好ましい。
織布または不織布も安価である上に、ろ紙よりも機械的強度が強いので好ましい。織布とは、縦糸と横糸とが交錯してできた布地である。不織布とは、短繊維またはフィラメントを機械的、熱的、化学的な手段を用いて接着または交絡させて作るシート状またはウェブ構造のものである（第２版繊維便覧繊維学会編丸善）。
【００２９】
不織布は、さまざまな方法で生産されるが、基本的な工程はウェブ（繊維の方向がある程度揃った繊維塊のシート状のもの）の形成工程、ウェブの接着工程および仕上げ工程である。ウェブを形成する方式は、湿式、乾式および直接式に大別される。直説法は紡糸直結式ともいわれる方法で、溶融高分子溶液から紡糸された繊維を集めて直接ウェブとする工程である。これに含まれる方法は、スパンレース法、スパンボンド法、メルトブロー法、ニードルパンチ法、ステッチボンド法等であるが、本発明においては、メルトブロー法でつくられた超極細繊維不織布が最も好ましい。
【００３０】
不織布には、天然繊維から化学繊維まで種々の繊維が用いられているが、一般的に用いられるのは、綿、レーヨン、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維、ナイロン繊維であり、その他にもアクリル繊維、ビニロ繊維ン、ガラス繊維、パルプ、炭素繊維等が使用される。
織布の素材としては、木綿、絹、人絹、アクリル繊維、ポリエチレンテレフタレート繊維等のポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維、ナイロン繊維等、布地に織ることができるものであればよい。
【００３１】
本発明においては、ポリエチレンテレフタレート繊維等のポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維、ナイロン繊維からなる織布および不織布が好ましい。
不織布を用いた核酸単離用カートリッジは、本出願人に係る別の発明（国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ０２／０６９３９号）の方法を、本発明の核酸単離用カートリッジに適用したものが挙げられる。国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ０２／０６９３９号には、不織布を用いて核酸を単離する方法が開示されている。不織布の平均孔径は２〜１５０μｍのものが適しているが、２〜２０μｍのものがより好ましい。ここで、不織布の平均孔径とは、水銀ポロシメーターによって測定した測定値（メディアン値）をいう。平均孔径は、フィルター要素を構成する繊維の絡み具合や空隙の大きさに関連する指標である。
【００３２】
織布および不織布は、１層、または複数層を積層したものが用いられる。
核酸吸着フィルターとして、シリカまたはシリカ誘導体から形成される膜を用いることも可能である。この場合、カートリッジに導入する核酸を含む試料に、カオトロピック性の高い物質を添加しておき、洗浄液としてアルコール等の有機溶媒を含む溶液を用い、溶出液として、イオン強度が低い中性付近の水溶液を用いることが好ましい。さらに、カオトロピック性物質や有機溶媒が、単離される核酸の溶液中に残存しないように、洗浄工程の後、溶出工程までの間に充分に除去することが好ましい。
【００３３】
処理槽に、加熱する機構を設置することにより、核酸吸着フィルターに吸着している核酸を溶出させる為に、加熱を行うことが可能になる。本出願人に係る別の発明（国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ０２／０６９３９号）には、核酸吸着フィルターに吸着した核酸を溶出させる方法として、主に、過酸化水素水、塩基性溶液等を用いる方法、および加熱による方法が開示されている。過酸化水素水や、塩基性溶液を用いる方法は、これらの試薬によって単離される核酸が化学変化を受ける可能性があるので、加熱による溶出方法が好ましい。この点から、本発明においては、加熱により、核酸吸着フィルターから核酸を溶出させることが好ましい。
【００３４】
核酸吸着フィルターとして不織布を利用した場合、核酸を溶出する場合の好適な条件は、ＴＥ緩衝液（１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝８）を用いた場合、９０〜９５℃で、２０〜３０分である。
核酸吸着フィルターとして、シリカまたはシリカ誘導体を用いた場合、洗浄液としてアルコール等の有機溶媒を含む溶液が用いられることが多い。これらの有機溶媒は、単離される核酸の溶液中に残存しないようにする必要があるが、本発明により、洗浄工程の後、処理槽を加熱しながら吸引ポンプで減圧することにより、有機溶媒を乾燥させて除去することができる。
【００３５】
処理槽の材質として、熱伝導性に優れた金属を利用することにより、処理槽を加熱して核酸吸着フィルターから核酸を溶出する場合に、熱を効率よく伝達することが可能になる。加熱によって核酸吸着フィルターに吸着している核酸を溶出させる場合、溶出液が送液された後に処理槽を加熱する必要がある。この場合、発熱体の熱は、処理槽に設置された伝熱面を経由して溶出試薬に伝わる。処理槽の底部のみに伝熱面が配置された場合、加熱温度が高いため、伝熱面近くの溶液が気化して、フィルターと伝熱面の間に気層が形成される。気層は液体に比べて熱伝導率が大幅に小さいので、フィルターおよびフィルター上部の溶出試薬に充分な熱が伝わらず、核酸溶出の効率が低下する。
【００３６】
本発明により、伝熱面からの熱を効率よく核酸吸着フィルターおよび溶出液の全体に伝達することが可能になるので、核酸の回収率が高くなる。処理槽に用いる金属は、各種試薬に侵されず、金属が溶出液に微量溶け出したとしても、後の核酸増幅や核酸検出を阻害しないことが要求される。例えば、銅は、この条件を満たし、しかも、各種金属の中でも熱伝導率が大きいことから、処理槽の素材として好ましい。
【００３７】
処理槽の構造として、核酸吸着フィルターを貫通する熱伝導性に優れた金属部材を有する構造にすることにより、熱を効率よく伝達し、かつ、安い価格でカートリッジを作成することが可能になる。本発明の処理槽の構造の一例として、実施例４に示した構造の処理槽を挙げることができる。もともと処理槽には、廃液配管、溶出液配管、処理槽を密閉構造にする蓋、バルブ等を取り付ける必要があり、処理槽全体を金属材料を用いて製作する場合には、金属切削加工が要求される。これは、量産性や、コストの観点では不利である。熱伝導性に優れた金属部材が核酸吸着フィルターに貫通している構造にすれば、処理槽内部へ発熱体からの熱が効率よく伝達されるため、処理槽全体を金属で作る必要がなくなる。したがって、処理槽の主要部分を、射出成型が可能で、かつ、十分な耐熱性を有するプラスチックで作成することが可能である。
【００３８】
配管接続部等は、プラスチックの射出成型時に作り込むようにしておく。そして、発熱体から核酸吸着フィルターおよび核酸吸着フィルターの近傍に存在する溶出試薬への伝熱ルートを確保するため、処理槽底面から核酸吸着フィルターの上へ貫通する金属部品を配置する。これにより、プラスチック類の熱伝導の低さによる加熱効率の低下を克服できる。すなわち、本発明によると、金属部品を単純な形状にすることができ、プレス加工等により製造すれば、量産コストを抑えられる。したがって、この方法により、量産性とコストにすぐれ、更に、熱伝導のルートを確保した構造の処理槽を作成することが可能となる。
【００３９】
処理槽を、バルブまたは蓋により密閉すること、処理槽内の液体が廃液槽および／または集積槽に流出することを防止するバルブを設けることにより、溶出時に加熱する場合に、溶出液の蒸散を防ぐことが可能になる。
核酸吸着フィルターに不織布を用いた場合、核酸溶出のための好適条件は、９０〜９５℃、２０〜３０分である。この条件を維持する場合、例えば、処理槽が非密封状態であり、溶出試薬が数１００μＬ程度であれば、大半が蒸散する。しかし、本発明によって、加熱時に処理槽を密閉状態にすることが可能になり、この蒸散を防ぐことができる。ここで、バルブおよび蓋に対する要求仕様のひとつは、加熱時に処理槽内部に発生する内圧に対応して密閉を保つことである。例えば、処理槽を沸騰状態にした場合には、内圧として約１気圧となるので、蓋やバルブに対して、少なくともこの内圧でも密閉状態が達成できる力をかけなければならない。
【００４０】
蓋の素材としては、適度に柔軟で、かつ、耐熱性のある熱可塑性ゴムを用い、射出成型により、処理槽開口部に適合する形状に成型する。バルブの構造としては、例えば、柔軟性のある材質で廃液用配管および溶出液用配管を作成し、密閉が要求される際に、配管部分を２本のピンによる圧力によって変形させて閉じる。蓋およびバルブを閉じる２本のピンを一体とし、核酸単離カートリッジ頂上部材に上下移動可能なガイドを設けて設置して、外部からのプランジャ機構により、同時に閉止状態にして、溶出試薬の蒸散ならびに流出を防止するのが好ましい。
【００４１】
カートリッジは、核酸単離装置に設置され、核酸単離装置の制御によって、自動的に核酸を単離することが可能となる。まず、核酸単離装置に設置されたカートリッジを受容する機構により、カートリッジが設置される。この際、カートリッジ側に突起部を設け、受容機構にその突起部と咬み合う部分を設置、あるいはこの逆に受容機構側に突起部を設け、カートリッジにその突起部と咬み合う部分を設置しておいて、カートリッジの設置が安定化されることが好ましい。そして、本発明の装置に設置された回転または並進機構により、カートリッジの頂上部材が基底部材に対して移動可能となる。このとき、カートリッジを受容する機構の並進要素または回転要素には、機械的な原点を検出するためのセンサが備えられていることが好ましい。このセンサとしては、例えば、フォトインタラプタ等が挙げられる。また、並進要素または回転要素はステップモータを利用することが好ましい。これらの機器により、制御装置から所定の駆動パルスを与えることにより、機械的原点からの位置決めが可能である。さらに、カートリッジの並進部分または回転軸と、カートリッジを受容する機構の並進要素または回転要素は機械的にかみ合う、カップリング構造となっていることが好ましい。これによって、カートリッジの頂上部材を、並進要素または回転要素により、所定の位置に位置決めすることが可能である。
【００４２】
位置決めがされると、頂上部材に封入された試薬の位置が、装置の制御装置に認識される。そして、核酸吸着材料に核酸を吸着させ、核酸吸着材料に吸着している不要な物質を洗浄液によって除去し、核酸が結合した核酸吸着材料に溶出試薬を加えて溶出試薬中に核酸を溶出させる一連の工程に従って、装置に設置されたプランジャ機構により試薬ウェルピストンに押力を適用することにより、試薬が適当な場所へ送液される。処理槽に、バルブまたは蓋による密閉構造を達成させる機構を有している場合、本発明の装置に設置されたプランジャ機構により、これらのバルブまたは蓋を押して密閉させることができる。さらに、処理槽内の液体が廃液槽、および／または集積槽に流出することを防止するバルブを有する場合も、本発明の装置に設置されたプランジャ機構で押すことにより、バルブが閉止状態になる。蓋およびバルブを閉じる機構を一体とし、核酸単離カートリッジ頂上部材に上下移動可能なガイドを設けて設置した場合は、同時に閉止状態にすることが可能になるので好ましい。
【００４３】
プランジャの形状として、垂直駆動の要素に対して、中心部の棒と、外側に円筒状の棒を配した２重構造の押し出し棒を使用すれば、外側の筒部分でカートリッジを押さえ、内側の棒で試薬ウェルピストンを押すという２段階の工程が可能になるので好ましい。また、処理槽、廃液槽、集積槽への送液において、装置から供給される負圧が、制御装置の制御に従って、本発明の装置に設置されたカートリッジを受容する機構を通してカートリッジに供給され、送液が可能になる。核酸単離用カートリッジにおいて、測定する試料を区別するためにラベルを貼付したり、コンピューター等に読みとらせることが可能なバーコードやＩＣチップ等を取り付けておくことは有用であり、本発明の核酸単離装置の制御装置に、これらのバーコードやＩＣチップを読みとりできる要素を、さらに付加しておくことが好ましい。
【００４４】
核酸単離装置に発熱体を設置することにより、カートリッジの処理槽を加熱することが可能になる。すなわち、処理槽を加熱して核酸を溶出させたり、フィルター上の有機溶媒を乾燥させることが可能になる。発熱体は、核酸単離装置のカートリッジの受容機構の部分に設置され、処理槽底面部分に発熱体表面が押し付けられるように配置されることが好ましい。発熱体表面には、処理槽への伝熱効果を高めるため、電子部品冷却等に用いられる、熱伝導が良好で、柔軟なシリコーンゴム素材等を貼り付けておくことが好ましい。発熱体は、処理槽内部が前記温度条件になるよう、伝熱のロスを勘案し、前記温度条件より、例えば、数℃高めに温度制御することが好ましい。例えば、発熱体に電気抵抗体を用い、その近傍に設置した温度センサと、電気抵抗体への電力供給の強弱を用いて所定温度に制御する。
【００４５】
より簡素な構成とするためには、電気抵抗体に正の温度係数を持つ素子（ＰＴＣ素子（ＰｏｓｉｔｉｖｅＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ））で、かつ、そのキュリー点が、前記所定温度付近のものを用いる。このような特性をもつ電気抵抗体に一定電圧を印加すると、はじめは室温で抵抗が低いため大電流が流れ、さかんに発熱し、急速に温度が上昇する。温度がキュリー点近くに上昇すると、電気抵抗が急増するので、電流が抑制され、したがって、発熱量が低下するので、結局、電気抵抗値が急増するキュリー点近傍で、電気抵抗体の温度が自己制御される。つまり、価格上昇要因である温度センサと温度制御装置が不要で、通電の制御のみにより、一定温度での加熱が実現される。
【００４６】
処理槽を加熱するための発熱体が、核酸単離用カートリッジ内部に設置された構造にすることも可能である。この場合、カートリッジ内に、加熱するためのエネルギー源を必要とするが、核酸単離装置の簡素化が期待できる。例えば、エネルギー源として乾電池を用いて、カートリッジ内の発熱源を加熱および／または冷却して温度制御を行うことができる。発熱源をカートリッジ内部に、エネルギー源をカートリッジ外部にすることも可能である。また、中和反応や水和反応等の化学的な発熱および／または吸熱反応を用いてもよい。例えば、生石灰と水、水酸化リチウムアルミニウムと水の加水分解反応等が挙げられる。
【００４７】
【発明の実施の形態】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は、何らこれに限定されるものではない。
実施例に記載された長さ、深さ、直径等の数値は単なる例示であって、本発明は、これらの数値に限定されるものではない。
【００４８】
【実施例１】
＜核酸単離カートリッジ＞
図１は、本実施例で作成した基底部材（１ｂ）と頂上部材（１ｃ）とからなる核酸単離カートリッジ（１ａ）（以下、カートリッジ、と記す）の組立図、図２は、基底部材（１ｂ）と頂上部材（１ｃ）に分解した図である。
頂上部材（１ｃ）は、４つの試薬ウェル（２ａ）、蒸散防止機構の蓋（２ｂ）、ガイド機構に保持された２本のピン（２ｃ）、および基底部材（１ｂ）の処理槽（２ｄ）に試料を導入したり、集積槽（２ｅ）から単離された核酸を取り出す開口部（２ｆ）を有し、高密度ポリエチレンを用いて射出成形により作成されている。
【００４９】
基底部材（１ｂ）は、ポリスチレンを用いて射出成形により作成され、処理槽（２ｄ）、集積槽（２ｅ）、廃液槽（２ｇ）、処理槽（２ｄ）と集積槽（２ｅ）を連通する溶出液用配管（２ｈ）、および処理槽（２ｄ）と廃液槽（２ｇ）を連通する廃液用配管（２ｉ）が設置されている。
基底部材（１ｂ）の底部には、後述する受容機構（以下、キャリッジ、と記す）に設けられたガイド機構にはめ込むことが可能な４つの突起（２ｊ）が対称位置に設けられている。カートリッジ（１ａ）の頂上部材（１ｃ）の回転軸（２ｋ）の先端には、核酸単離装置の回転駆動機構の回転力を伝達するための突起（２ｌ）が設けられていて、基底部材（１ｂ）の回転軸受（２ｍ）にはめ込まれた時に、回転駆動機構からの駆動力を頂上部材（１ｃ）に伝達するようになっている。
【００５０】
図３は、試薬ウェル（２ａ）の断面図である。試薬ウェル（２ａ）には、試薬液（３ａ）が満たされている。試薬ウェル（２ａ）の上部にポリカーボネートで作成した突起部をもつ試薬ウェルピストン（３ｂ）が挿入され、更にその上部は、ポリエチレンコートアルミフォイルで作成した試薬ウェルピストンフィルム（３ｃ）が貼り付けられており、下部はポリエチレンコートアルミフォイルで作成した試薬ウェル用フィルム（３ｄ）が貼り付けられ、試薬液（３ａ）が試薬ウェル（２ａ）内に封入されている。
【００５１】
図４は、試薬ウェル（２ａ）から、外部の核酸単離装置のプランジャにより試薬液（３ａ）が送液される状態を示した断面の模式図である。プランジャは、垂直駆動装置の先に、二重構造になった押し出し棒（内側：４ａ、外側：４ｂ）が設置されている。垂直駆動装置によって、押し出し棒が、矢印で示す方向に駆動されると、まず、外側の押し出し棒（４ｂ）によって、頂上部材（１ｃ）が押さえられ、次いで、内側の押し出し棒（４ａ）によって、試薬ウェル（２ａ）の試薬ウェルピストンフィルム（３ｃ）と試薬ウェルピストン（３ｂ）が押され、底部の試薬ウェル用フィルム（３ｄ）が破損して、試薬（３ａ）が、処理槽（２ｄ）に送液されるようになっている。
【００５２】
４カ所の試薬ウェル（２ａ）には、下記の試薬液が、それぞれ０．５ｍｌづつ封入されている。
第一洗浄液：０．５％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１ＭのＮａＣｌを含むｐＨ＝８の１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液
第二洗浄液：１ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ＝７．４の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
第三洗浄液：ＴＥ緩衝液（１ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ＝８の１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液）
溶出液：ＴＥ緩衝液
【００５３】
図５は、処理槽（２ｄ）の模式図である。処理槽（２ｄ）は銅製で、図５に示すように、廃液用配管設置口（５ａ）および溶出液用配管設置口（５ｂ）を有し、基底部材（１ｂ）に取り付けられている。処理槽内部には、直径１３ｍｍに切断したポリエレンテレフタレート製の不織布（５ｃ）（旭化成社製）が内壁に沿って水平に設置されている。
図６は、基底部材（１ｂ）に収容された処理槽（２ｄ）、集積槽（２ｅ）、廃液槽（２ｇ）およびその他の補助部材の配置図である。処理槽（２ｄ）の廃液用配管設置口（５ａ）および溶出液用配管設置口（５ｂ）に、内径１ｍｍ、外径３ｍｍの柔軟なシリコーンゴム製チューブで作成した廃液用配管（２ｉ）および溶出液用配管（２ｈ）が取り付けられている。これらの配管は、それぞれ、基底部材内部に加工された廃液槽（２ｇ）および集積槽（２ｅ）に連通している。溶出液用配管（２ｈ）は、一部が処理槽（２ｄ）の上部より高くなるようにしてある。
【００５４】
処理槽（２ｄ）の上部の頂上部材（１ｃ）には、処理槽（２ｄ）を密閉するシリコーンゴムの円盤状の蓋（２ｂ）および廃液用配管（２ｉ）と溶出液用配管（２ｈ）を圧迫・解除する開閉バルブとして、先端を半球に加工した直径１ｍｍの２本のステンレスピン（２ｃ）が設置されている。これらの蓋（２ｂ）とピン（２ｃ）は、頂上部材（１ｃ）により支持されている。そして、核酸単離装置のプランジャの押し出し棒（４ａ、４ｂ）によって同時に押され、処理槽（２ｄ）の上部、廃液用配管（２ｉ）および溶出液用配管（２ｈ）を閉じる構造となっている。
【００５５】
図７は、廃液用配管（２ｉ）および溶出液用配管（２ｈ）に設置される弁の模式図である。押し出し棒（４ｂ）によって押されたピン（２ｃ）が、廃液用／溶出液用配管（２ｉ、２ｈ）を押すことでバルブ（７ａ）が開閉される仕組みを示している。
集積槽（２ｅ）および廃液槽（２ｇ）の底には、図６に示すように、核酸単離装置に設置される吸引ポンプ等の減圧がカートリッジ内に導かれる吸引ポート（６ｃ）が設けられている。廃液槽（２ｇ）には、廃液が吸収される濾紙で作成した吸水パッド（６ｄ）が設置されている。集積槽（２ｅ）の上部の取り出し口には、ポリエチレンテレフタレート製のフィルムが貼り付けてある。
【００５６】
【実施例２】
＜単離装置＞
本発明の核酸単離装置の一例の機能ブロック図を図８に、その機構部の模式図を図９に示す。
図８に示すように、制御機構（８ａ）は、ＣＰＵ（８ｂ）、メモリ（８ｃ）および制御回路（８ｄ）からなり、これらは１枚の電子回路基板にまとめられている。制御回路（８ｄ）は、各種センサおよびスイッチパネル（８ｈ）の入力回路と、表示パネル（８ｇ）、回転駆動機構、プランジャ、吸引ポンプ、発熱体、バルブなどの制御用の出力回路からなる。メモリ（８ｃ）は、読み書き可能な部分と、読み出し専用部分に分けられるが、読み出し専用部分には、後述の核酸単離工程を実行するためのプログラムが予め書き込まれており、同プログラムは、ＣＰＵ（８ｂ）により実行される。これらの機構への電源（８ｅ）として、適正な電圧に整流された直流電源が組み込まれている。
【００５７】
マンマシンＩ／Ｆ（８ｆ）は、表示パネル（８ｇ）とスイッチパネル（８ｈ）から構成され、核酸単離装置の正面パネルに設置されている。表示パネル（８ｇ）には、蛍光表示管を用いており、ＣＰＵ（８ｂ）から制御回路（８ｄ）を経由して制御され、核酸単離装置の各種状態や核酸単離操作の進行状況を、簡潔に表示し、操作者に伝える。スイッチパネル（８ｈ）は、低価格でコンパクトなメンブレンキースイッチを用いており、コマンドキー、テンキーなど１０数個のキースイッチが配置されている。一部のコマンドキーの直上には、前記の蛍光表示管が配置され、核酸単離装置の状態に応じたコマンドキーの役割を簡潔に表示するようになっている。これらのキースイッチは、主に核酸単離装置の初期設定や調整等で利用される。通常の核酸単離操作においては、カートリッジ（１ａ）をキャリッジに設置後、スタート用コマンドキーを押すだけでよく、以降の一連の処理は自動的に実行される。
【００５８】
機構部（８ｓ）は、カートリッジ（１ａ）が設置可能であるキャリッジ（８ｉ）、キャリッジを直線移動させる直線移動機構（８ｊ）、カートリッジ（１ａ）の頂上部材（１ｃ）を回転させる回転駆動機構（８ｋ）、実施例１で示したカートリッジ（１ａ）の試薬ウェル（２ａ）の試薬を送液するプランジャ（８ｌ）、実施例１で示したカートリッジ（１ａ）の処理槽（２ｄ）を加熱する発熱体（８ｍ）、減圧要素を供給するための吸引ポンプ（８ｎ）、吸引ポンプからの減圧要素について、カートリッジへの供給を制御する廃液槽送液用バルブ（８ｐ）、集積槽送液用バルブ（８ｏ）、リークバルブ（８ｑ）、これらのポンプとバルブおよびキャリッジ間を結合する塩化ビニールの配管（８ｒ）からなっている。
【００５９】
図９は、これらの機構部（８ｓ）の配置の概略図である。キャリッジ（８ｉ）には、実施例１で示したカートリッジ（１ａ）の突起（２ｊ）がはめ込まれるガイド機構（９ｂ）があり、カートリッジ（１ａ）がキャリッジ上面にきっちりと押し付けられるように設置される。直線移動機構（８ｊ）は、キャリッジ（８ｉ）を直進移動させるので、それに従ってカートリッジ（１ａ）も並進する。この直線駆動機構は、ステップモータの回転軸に螺旋ネジを接続し、そのネジにかみ合うナットを回転自由度を拘束、ネジの回転軸方向の直進移動の自由度だけを可動とし、回転を直進移動に変換することで駆動する。また、キャリッジ（８ｉ）に設置されたカートリッジ（１ａ）を認識し、制御機構（８ａ）からの指示により、カートリッジ（１ａ）の位置決めが可能である。回転駆動機構（８ｋ）は、ステップモータにより駆動される。
【００６０】
カートリッジ（１ａ）との接合部において、回転力をカートリッジの回転軸（２ｋ）の先端の突起（２ｌ）に伝達する対の突起（９ａ）が設置されていて、カートリッジ（１ａ）の頂上部材（１ｃ）を、回転駆動機構（８ｋ）により、位置決めした後、所定の位置に回転させることが可能である。
プランジャ（８ｌ）は、ステップモータの回転軸に螺旋ネジを接続し、そのネジにかみ合うナットを回転自由度を拘束、ネジの回転軸方向の直進移動の自由度だけを可動とし、回転を直進移動に変換することにより駆動する。直進駆動部の先に押し出し棒（４ａ、４ｂ）を設置してある。押し出し棒は、中心部の内側の棒（４ａ）と、外側に円筒状の棒（４ｂ）を配した２重構造の押し出し棒になっており、外側の筒部分でカートリッジを押さえ、内側の棒で試薬ウェルピストン（３ｂ）を押して試薬ウェル（２ａ）の試薬を送液する構造になっている。
【００６１】
発熱体（８ｍ）は、チタン酸バリウムを主成分とするＰＴＣセラミック（キュリー点１０１℃、直径１０ｍｍ、厚さ１．５ｍｍ、宇部エレクトロニクス社製）を、キャリッジ上面で、カートリッジ（１ａ）を設置した場合に、処理槽（２ｄ）の下面に接触するように設置され、核酸単離装置内の制御回路（８ｄ）を介して通電可能になっている。
吸引ポンプ（８ｎ）は、制御回路（８ｄ）からの通電により、空気を吸引することが可能になる。集積槽送液用バルブ（８ｏ）、リークバルブ（８ｑ）および廃液槽送液用バルブ（８ｐ）は、電磁バルブを用いて作成されており、制御回路（８ｄ）からの通電の有無により開閉が制御される。これらのバルブは、吸引ポンプ（８ｎ）およびキャリッジ（８ｉ）と配管（８ｒ）によって結合されている。
【００６２】
図１０は、核酸単離装置のキャリッジ（８ｉ）と、基底部材（１ｂ）の接合の構成要素の模式図である。配管（８ｒ）とキャリッジ（８ｉ）が接合する部分の先は、図１０に示すように、キャリッジ（８ｉ）に設けられた吸引ポート（１０ａ）により、カートリッジ（１ａ）の吸引ポート（６ｃ）と接合されるようになっている。すなわち、カートリッジ底面がキャリッジ上面に押し付けられた時に、カートリッジ底面に設けた吸引ポート（６ｃ）とキャリッジ上面に設けた吸引ポート（１０ａ）が接続され、減圧要素による送液が可能な状態になる。
これらの機構部（８ｓ）に設置された駆動装置、プランジャ、発熱体、ポンプ、バルブ、類は、制御回路（８ｄ）に接続されており、核酸単離工程に従って送液や加温が制御されるようになっている。
【００６３】
すなわち、核酸単離工程に従って、
（Ａ）制御機構（８ａ）により、回転駆動機構（８ｋ）と同期して頂上部材（１ｃ）の回転軸（２ｋ）を介して頂上部材（１ｃ）を回転させ、
（Ｂ）カートリッジの試薬ウェル（２ａ）が、プランジャ（８ｌ）の直下に来た時に、押し出し棒（４ａ、４ｂ）が押し下げられ、先ず、押し出し棒の外側円筒部分（４ｂ）が試薬ウェル（２ａ）上部の外周部分の頂上部材（１ｃ）を押さえつけ、次いで、内側の押し出し棒（４ａ）により、試薬ウェルピストン（３ｂ）が押され、その突起部が、シール材を貫通し開口部をあけ、洗浄液が処理槽（２ｄ）に送液され、
（Ｃ）処理槽（２ｄ）の加熱時は、このプランジャ（８ｌ）によって、蓋（２ｂ）および２本のピン（２ｃ）が押し下げられて、溶出試薬の蒸散および流出を防止し、
（Ｄ）処理槽（２ｄ）の液体を廃液槽（２ｇ）に送液する時には、吸引ポンプ（８ｎ）が稼働し、集積槽送液用バルブ（８ｏ）およびリークバルブ（８ｑ）が閉じられ、廃液槽送液用バルブ（８ｐ）が開けられて送液され、
（Ｅ）処理槽（２ｄ）の液体を集積槽（２ｅ）に送液する時には、吸引ポンプ（８ｎ）が稼働し、廃液槽送液用バルブ（８ｐ）およびリークバルブ（８ｑ）が閉じられ、集積槽送液用バルブ（８ｏ）が開けられて送液される、
ようになっている。
【００６４】
【実施例３】
＜大腸菌核酸の単離＞
実施例１のカートリッジ（１ａ）を実施例２の核酸単離装置のキャリッジ（８ｉ）に設置した。核酸単離装置の扉を閉じる前に、大腸菌（１．５×１０^９個のペレット）を、１ｍｌの０．５％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）および０．１ＭのＮａＣｌを含むｐＨ＝８の１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液で溶解し、この試料をマイクロピペットを用いてカートリッジ（１ａ）の開口部（２ｆ）から処理槽（２ｄ）に注入した。処理槽（２ｄ）に注入された試料は、不織布（５ｃ）に浸透した後、試料の自重で、処理槽（２ｄ）の不織布下の部分に流れ、さらに廃液槽（２ｇ）に流れ込んだ。このとき、集積槽（２ｅ）に繋がる溶出液用配管（２ｈ）は、この一部が試料液面より高い位置に配置されているので、試料が自重により廃液槽（２ｇ）に流れ込む間、集積槽（２ｅ）には流れ込まなかった。およそ２分で、試料のほとんどが不織布（５ｃ）を通過し、試料中の核酸が不織布（５ｃ）に吸着された。
【００６５】
核酸単離装置の扉を閉じ、タッチパネル（８ｇ）のスタートボタンを押した。以降、カートリッジ（１ａ）を核酸単離装置の扉を開けて取り出すまでの操作は、核酸単離装置の制御機構（８ａ）によって自動的に達成された。まず、カートリッジ（１ａ）が設置されたキャリッジ（８ｉ）を所定の位置に移動させた。これにより、基底部材（１ｂ）の処理槽（２ｄ）は、頂上部材（１ｃ）の開口部（２ｆ）の下に位置するようになった。
【００６６】
吸引ポンプ（８ｎ）を作動させ、集積槽送液用バルブ（８ｏ）およびリークバルブ（８ｑ）を閉じ、廃液槽送液用バルブ（８ｐ）を開け、処理槽内にわずかに残っていた試料を廃液槽（２ｇ）に導いた。１分後、吸引ポンプ（８ｎ）を止め、リークバルブ（８ｑ）を開けた後、回転駆動機構（８ｋ）を働かせて、第一洗浄液が封入された試薬ウェル（２ａ）が処理槽（２ｄ）の上部に来るように、頂上部材（１ｃ）を回転させた。次いで、押し出し棒（４ａ、４ｂ）を下降させ、洗浄液１を処理槽（２ｄ）に導いた。１分後、吸引ポンプ（８ｎ）を作動させ、集積槽送液用バルブ（８ｏ）およびリークバルブ（８ｑ）を閉じ、廃液槽送液用バルブ（８ｐ）を開け、処理槽内に残っていた第一洗浄液の廃液を廃液槽（２ｇ）に導いた。
【００６７】
以下、第二洗浄液、第三洗浄液について同様の操作を行った。最後に、溶出液を処理槽（２ｄ）に導き、その後、頂上部材（１ｃ）を回転させ、カートリッジの蓋（２ｂ）および２本のピン（２ｃ）を押し出し棒（４ａ、４ｂ）で押し下げた。
核酸単離装置の加熱装置に通電を開始して、処理槽（２ｄ）を３０分間、およそ９５℃で加熱した。通電を止め、５分間放熱した後、集積槽送液用バルブ（８ｏ）を開け、リークバルブ（８ｑ）および廃液槽送液用バルブ（８ｐ）を閉じて、吸引ポンプ（８ｎ）を作動させ、処理槽（２ｄ）の中の核酸が単離された溶出液を集積槽（２ｅ）に送液した。次いで、頂上部材（１ｃ）の開口部（２ｆ）が集積槽（２ｅ）の直上にくるよう回転した後、キャリッジ（８ｉ）を初期位置に戻した。この段階で、核酸単離装置の制御機構によって自動的に達成さる工程が終了した。
【００６８】
最後に、核酸単離装置の扉をあけ、カートリッジ（１ａ）を取り出し、マイクロピペットの先端を用いて、集積槽（２ｅ）の上部のフィルムを破り、そのマイクロピペットで集積槽内部の核酸単離溶液を回収した。回収した核酸を紫外吸収スペクトルにより定量した。その結果、図１１の１１ａに示すように、およそ２．７μｇの核酸が単離された。
【００６９】
【実施例４】
＜他の構造の処理槽＞
図１２は、実施例１で示した処理槽（２ｄ）とは異なる構造の処理槽（１２）の断面図である。内径が１４ｍｍポリプロピレンのプラスチック円筒容器（１２ａ）の底に、直径３ｍｍの穴が設けられており、そこにアルミニウムで作成した伝熱ピン（１２ｂ）が挿入されている。底の部分には、直径１４ｍｍで、その中心に直径３ｍｍの穴を開けた円盤状の不織布（１２ｃ）が、プラスチック製のワッシャーで押さえて設置されている。不織布（１２ｃ）の有効内径は１２ｍｍである。
【００７０】
シリコーンゴムチューブで２本の配管（１２ｄ）が設けられている。この処理槽（１２）と、図５に示す実施例１の処理槽（２ｄ）に、それぞれ、０．５ｍｌの水を入れ、それぞれ、上部と配管を閉じて密閉した後、内部の水の温度を熱電対を用いた温度計で測定しながら、実施例２の発熱体（８ｍ）を用いて加熱を行った。
その結果、図５の処理槽（２ｄ）と図１２処理槽（１２）の温度上昇速度を比較すると、図１３に示すように、図１２処理槽（１２）の結果（１３ｂ）の方が、図５の処理槽（２ｄ）の結果（１３ａ）よりも早く９５℃程度の目的の温度に達しており、より熱伝達の効率が優れていることがわかる。
【００７１】
【比較例１】
＜手動操作による核酸単離実験＞
実施例１と同様に、直径１３ｍｍの円盤状に切断したポリエレンテレフタレート製の不織布（旭化成社製）を、フィルターホルダー（有孔径φ１０ｍｍ、ミリポア社製）に固定し、その上部にプラスチック製注射筒（５ｍｌ、テルモ社製）、および下部に廃液槽を介して吸引ポンプを接合した。
大腸菌（１．５×１０^９個のペレット）を１ｍｌの０．５％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、および０．１ＭのＮａＣｌを含むｐＨ＝８の１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液で溶解し、プラスチック注射筒の部分からホルダーに導入した。吸引ポンプでフォルダ内の試料を廃液槽に廃液した後、順次、各０．５ｍｌの第一、第二、第三洗浄液をプラスチック注射筒から導入し、吸引ポンプで排出した。
【００７２】
次いで、フォルダーから不織布を取り出し、０．５ｍｌのＴＥ緩衝液を入れたポリプロピレン製マイクロテストチューブ（容量１．５ｍｌ、エッペンドルフ社製）に投入した。密栓後、アルミブロックヒーターにて、９５℃で３０分加熱した。最後に、不織布を取りだし、チューブ内の核酸単離溶液を回収した。回収した核酸を紫外吸収スペクトルにより定量した。その結果、図１１の１１ｂに示すように、およそ２．９μｇの核酸が単離された。本比較実験の結果は、実施例３の核酸単離の結果と同等である。
したがって、比較例の手動操作で行った核酸単離と同様の核酸単離が、本発明の核酸単離カートリッジと核酸単離装置を用いることで簡便に達成されることが示された。
【００７３】
【発明の効果】
本発明により、核酸を含有する材料から簡便に核酸を単離することが可能になる。そのため、検体中の特定微生物の存在を検出する場合や、人の遺伝子の検出を行ったりする場合において、核酸単離に要する手間や時間が節約され有用である。特に、医療分野における遺伝子診断等を、簡便、迅速、かつ、安全に行うことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の核酸単離カートリッジの組立図。
【図２】本発明の核酸単離カートリッジの分解図。
【図３】本発明の試薬ウェルの断面図。
【図４】本発明のプランジャによる試薬ウェルからの処理槽への送液の模式図。
【図５】本発明の処理槽の模式図。
【図６】本発明の基底部材、頂上部材、プランジャの構成の模式図。
【図７】本発明の基底部材に設置されるバルブの模式図。
【図８】本発明の核酸単離装置の構成図。
【図９】本発明の核酸単離装置の機構部とカートリッジの模式図。
【図１０】本発明の核酸単離装置のキャリッジと、基底部材の接合の構成要素の模式図。
【図１１】本発明の核酸単離と、比較例の核酸単離の測定結果を示すグラフ。
【図１２】本発明の処理槽の他の例の模式図。
【図１３】本発明の処理槽への加熱実験の測定結果を示すグラフ。
【符号の説明】
１ａ：核酸単離カートリッジ
１ｂ：基底部材
１ｃ：頂上部材
２ａ：試薬ウェル
２ｂ：蓋
２ｃ：ピン
２ｄ：処理槽
２ｅ：集積槽
２ｆ：開口部
２ｇ：廃液槽
２ｈ：溶出液用配管
２ｉ：廃液用配管
２ｊ：突起
２ｋ：回転軸
２ｌ：突起
２ｍ：回転軸受
３ａ：試薬液
３ｂ：試薬ウェルピストン
３ｃ：試薬ウェルピストンフィルム
３ｄ：試薬ウェル用フィルム
４ａ：押し出し棒（内側）
４ｂ：押し出し棒（外側）
５ａ：廃液用配管設置口
５ｂ：溶出液用配管設置口
５ｃ：不織布
６ｃ：吸引ポート
６ｄ：吸水パッド
７ａ：バルブ
８ａ：制御機構
８ｂ：ＣＰＵ
８ｃ：メモリ
８ｄ：制御回路
８ｅ：電源
８ｆ：マンマシンＩ／Ｆ
８ｇ：表示パネル
８ｈ：スイッチパネル
８ｉ：キャリッジ
８ｊ：直線移動機構
８ｋ：回転駆動機構
８ｌ：プランジャ
８ｍ：発熱体
８ｎ：吸引ポンプ
８ｏ：集積槽送液用バルブ
８ｐ：廃液槽送液用バルブ
８ｑ：リークバルブ
８ｒ：配管
９ａ：突起
９ｂ：ガイド機構
１０ａ：吸引ポート
１１ａ：実施例３の核酸単離用カートリッジと核酸単離装置による核酸単離量
１１ｂ：比較例の手動操作による核酸単離量
１２：処理槽
１２ａ：円筒容器、１２ｂ：伝熱ピン、１２ｃ：不織布、１２ｄ：配管
１３ａ：処理槽（２ｄ）の加熱の結果
１３ｂ：処理槽（１２）の加熱の結果[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a nucleic acid isolation cartridge for purifying and isolating a nucleic acid from a material containing a nucleic acid simply and in a short time, and a nucleic acid isolation device for controlling the nucleic acid isolation cartridge.
[0002]
[Prior art]
Advances in the field of genetic engineering have led to medical diagnostics and microbiological tests using genes. For example, a test method for identifying a microorganism species using a nucleic acid hybridization method has been put to practical use. In addition, the development of various nucleic acid amplification methods including the polymerase chain reaction method (PCR method) (Non-Patent Document 1, Patent Documents 1 to 3) has greatly expanded the use of genes for medical diagnosis and microbiological testing. did. According to these techniques, nucleic acid amplification can be performed in a sequence-specific manner. Therefore, a nucleic acid having a specific sequence that may be present in a sample can be amplified and detected with high sensitivity.
[0003]
Specimens used for medical diagnosis and microbial tests contain large amounts of contaminants such as proteins, lipids, and carbohydrates. These contaminants have an adverse effect when performing an amplification reaction such as a polymerase chain reaction using a gene or a hybridization reaction. For example, when a factor that inhibits the amplification reaction is contained, the nucleic acid amplification reaction does not actually occur despite the fact that the target bacterium is contained, and therefore, the bacterium is contained in the sample. Not give the wrong result. Therefore, it is necessary to perform an operation of isolating the nucleic acid in the sample in advance without these contaminants so as not to affect the nucleic acid amplification reaction or the detection reaction such as hybridization.
[0004]
As a method for isolating a nucleic acid, there is a method described in Patent Document 4. In this method, a nucleic acid-containing material is added with an aqueous solution having a high chaotropic property, such as an aqueous solution of guanidine thiocyanate, to release the nucleic acid. Then, the nucleic acid is adsorbed on silica particles, and the silica particles are washed to remove contaminants. And finally eluting the nucleic acids bound to the silica particles. This method is widely and generally performed, and reagents and tools for isolating nucleic acids based on this method are commercially available as so-called "kits". Further, an automatic device for automatically isolating a nucleic acid using this technique has been developed.
[0005]
On the other hand, in the field of clinical tests in medical care, the so-called “point-of-care” method is used to quickly and easily examine samples collected from patients at clinical sites, judge the results, and immediately apply them to medical treatment. A diagnostic method called “test” is required (hereinafter, these tests are referred to as “POC tests”). In these inspections, it is required to perform the inspection in a short time as possible and with a reduced number of manual operations. Further, the cartridge is desirably designed to be inexpensive to manufacture so that it can be "disposable." Therefore, in a POC test required at a medical site or the like, it is required to automatically isolate a nucleic acid in a short time by using a simple and low-cost cartridge and device.
[0006]
However, the conventionally developed automatic nucleic acid isolation apparatus is useful when a large number of samples need to be processed in large quantities, but it is not enough in POC inspection to meet this demand. I can't say that there are so many issues to solve. In particular, when the number of samples required to purify nucleic acids is limited to one type or at most several types, and these are to be processed quickly, an apparatus currently in practical use is not suitable for POC inspection. Not meeting requirements.
[0007]
[Non-patent document 1]
Science, 230: 1350-1354, 1985
[Patent Document 1]
Patent No. 2546576
[Patent Document 2]
Patent No. 2502041
[Patent Document 3]
Japanese Patent No. 2613877
[Patent Document 4]
Patent No. 2680462
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention provides a simple nucleic acid isolation device suitable for POC inspection. That is, an object of the present invention is to provide a cartridge for isolating a nucleic acid from a nucleic acid-containing material by means that can be automatically and efficiently automated in a short time. Another object is to provide an automatic device for isolating a nucleic acid in a cartridge.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventor has proposed a nucleic acid isolation cartridge for easily and rapidly isolating a nucleic acid from a sample, and a nucleic acid isolation device for the cartridge, according to the international patent application of the present applicant. The apparatus disclosed in the pamphlet of Japanese Patent Publication No. 01/11374 has been studied by applying the method described in International Patent Application No. PCT / JP02 / 06939, and the present invention has been completed.
[0010]
That is, the present invention is as follows.
(1) A cartridge for isolating a nucleic acid from a sample containing the nucleic acid, the cartridge comprising:
(A) a treatment tank in which the nucleic acid-adsorbing material is fixed,
(B) a waste liquid tank that communicates with the treatment tank and stores the waste liquid, and
(C) an accumulation tank communicating with the treatment tank and collecting a solution containing the isolated nucleic acid;
A base member including:
(D) a top member including at least one reagent well in which a washing solution for washing the nucleic acid-adsorbing material and / or an eluate for eluting the nucleic acid from the nucleic acid-adsorbing material is enclosed, and at least one of the reagent wells is And a reagent well piston for transferring the reagent to the nucleic acid-adsorbing material, wherein the top member can rotate or translate with respect to the base member.
[0011]
(2) The nucleic acid according to (1), wherein the base member further includes a waste liquid pipe connecting the processing tank and the waste liquid tank and / or an eluate pipe connecting the processing tank and the accumulation tank. Isolation cartridge.
(3) The top member may further include an opening for introducing a sample containing nucleic acids into the cartridge and / or an opening for removing a solution containing isolated nucleic acids from the collecting tank of the base member. The nucleic acid isolation cartridge according to (1) or (2), which is characterized in that:
(4) The nucleic acid according to any one of (1) to (3), wherein the bottom of the reagent well is sealed with a breakable film, and the top of the reagent well is sealed with a piston. Isolation cartridge.
[0012]
(5) The cartridge for nucleic acid isolation according to any one of (1) to (4), wherein an opening of the collecting tank provided on the base member is sealed with a breakable film. .
(6) The nucleic acid isolation cartridge according to any one of (1) to (5), wherein the nucleic acid adsorption material is a nucleic acid adsorption filter.
(7) The nucleic acid isolation cartridge according to (6), wherein the nucleic acid adsorption filter is a filter paper, a woven fabric, a nonwoven fabric, a matrix, or a membrane.
(8) The nucleic acid isolation cartridge according to (6) or (7), further comprising a mechanism for heating the treatment tank.
[0013]
(9) The cartridge for nucleic acid isolation according to (8), wherein the treatment tank is formed of a metal material.
(10) The nucleic acid isolation cartridge according to (8) or (9), further comprising a metal member penetrating the nucleic acid adsorption filter.
(11) The nucleic acid isolation cartridge according to any one of (8) to (10), further including a mechanism for sealing the treatment tank with a valve or a lid.
(12) The nucleic acid isolation according to any one of (1) to (11), further comprising a valve for preventing a liquid in the treatment tank from flowing out to a waste liquid tank and / or an accumulation tank. For cartridges.
[0014]
(13) A nucleic acid isolation device for isolating a nucleic acid in a sample,
(E) a receiving mechanism for installing the nucleic acid isolation cartridge according to any one of (1) to (12),
(F) a rotating or translating element capable of rotating or translating the top member of the cartridge with respect to the base member and positioning the top member in a predetermined position;
(G) a plunger element formed by a vertical driving device for applying a pressing force to a reagent well piston for feeding a reagent in a reagent well installed in the cartridge and a push rod, and
(H) a decompression element for sending a sample and / or a reagent to a waste liquid tank and / or an accumulation tank;
And
In the process of passing a nucleic acid-containing sample through the vicinity of the nucleic acid-adsorbing material, the nucleic acid is adsorbed on the nucleic acid-adsorbing material, unnecessary substances adsorbed on the nucleic acid-adsorbing material are removed by a washing liquid, and the nucleic acid-adsorbed material to which the nucleic acid is bound is removed. A nucleic acid isolation device, comprising: a controller that controls each of the elements (f) to (h) in accordance with a series of steps of adding an elution reagent to elute a nucleic acid in the elution reagent.
[0015]
(14) The receiving mechanism further includes a linear moving mechanism that can be controlled by the control device, moves the received nucleic acid isolation cartridge, and positions the cartridge at a predetermined position. The nucleic acid isolation device according to (13).
(15) The nucleic acid isolation device according to (13) or (14), further including a heating element for heating the treatment tank that can be controlled by the control device.
(16) The nucleic acid isolation apparatus according to (15), wherein the heating element utilizes electric heating to a substance having a positive temperature coefficient.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
In the present invention, the nucleic acid means DNA (deoxyribonucleic acid) or RNA (ribonucleic acid), and means DNA or RNA contained in a target material.
[0016]
In the present invention, examples of the specimen include sputum, blood, urine, stool, and the like, but are not limited thereto. When the sample contains a solid component or the like, it is desirable that the sample be preformed by dissolution or the like so that the sample can well penetrate and pass through a filter such as a nonwoven fabric as a nucleic acid adsorbing material or a nucleic acid binding resin. For this purpose, for example, when the specimen is sputum, means such as addition of a surfactant, heating, and mechanical vibration are effective. In this process, cells contained in the specimen are destroyed, and nucleic acids are released in the specimen. In the present invention, a specimen or a pretreated specimen injected into the nucleic acid isolation cartridge is referred to as a sample.
[0017]
As the material of the cartridge of the present invention, metal, glass, ceramics and the like can be used, and plastic is preferable from the viewpoint of easy processing. However, in the nucleic acid isolation step, a material that does not adsorb the nucleic acid is preferable.
Examples of such a material include vinyl chloride resin, polyethylene resin, polypropylene resin, polyvinylidene chloride resin, polyurethane resin, Teflon (registered trademark) resin, nylon resin, polystyrene resin, ABS resin, acrylic resin, fluorine resin, and polycarbonate. Resin, methylpentene resin, phenol resin, melamine resin, epoxy resin, and the like.
[0018]
On the cartridge, an elastic body such as rubber may be used for packing or the like in order to keep the airtightness of the valve and the liquid and gas in the flow path. Examples of such elastic bodies include rubbers such as natural rubber, butadiene rubber, styrene rubber, butyl rubber, ethylene / propylene rubber, nitrile rubber, acrylic rubber, urethane rubber, silicone rubber, fluorine rubber, soft vinyl chloride resin, and polyethylene resin. , Polypropylene resin, polyvinylidene chloride resin, polyurethane resin, Teflon (registered trademark) resin, nylon resin and the like. Furthermore, parts for completing the shape as a cartridge, parts used for valves, parts for efficiently transmitting heat, etc. are made of plastic, aluminum, brass, iron, copper, stainless steel, titanium alloy, magnesium alloy, duralumin And the like. When applying heat to the cartridge, a material that can maintain mechanical strength at a temperature set by the heated portion is used.
[0019]
In the nucleic acid isolation according to the present invention, (a) the top member is moved with respect to the base member so that the reagent well in which the reagents necessary for nucleic acid isolation are enclosed is located above the required position of the base member. (B) Applying an external force to the reagent well of the top member with a plunger or the like to send the reagent to a required position of the base member. Here, the plunger is a general term for a mechanical portion that performs a reciprocating motion for compressing and sending a fluid.
In the nucleic acid isolation step, (c) the nucleic acid-adsorbing material adsorbs the nucleic acid in the process of passing the sample containing the nucleic acid near the nucleic acid-adsorbing material, and (d) unnecessary substances adsorbed on the nucleic acid-adsorbing material. (E) adding an elution reagent to the nucleic acid-adsorbed material to which the nucleic acid is bound to elute the nucleic acid in the elution reagent; (f) heating to release the nucleic acid in the elution reagent; (g) E) sending the eluate containing the isolated nucleic acid to the collection tank.
[0020]
The step (f) can be omitted depending on the types of the nucleic acid-adsorbing material and the elution reagent. Also, the last step (g) can be omitted because the processing tank can also serve as the accumulation tank. In this case, the isolated nucleic acid solution is accumulated in the treatment tank. Further, waste liquids generated in the processing step are sent to and stored in a waste liquid tank. If a pad for absorbing the waste liquid is provided in the waste liquid tank, it is possible to prevent the waste liquid from flowing to another portion.
[0021]
By installing a waste liquid pipe connecting the processing tank and the waste liquid tank and / or an eluate pipe connecting the processing tank and the collecting tank to the base member, the liquid can be sent using the pipe and the cartridge can be supplied. This is preferable because the liquid supply at the step becomes easy. It is preferable that the connection ports of these pipes are located further below the position of the nucleic acid adsorbing substance in the treatment tank because the liquid is easily sent to the waste liquid tank or the accumulation tank without interruption. When providing a pipe for eluate that communicates between the processing tank and the accumulation tank, by placing a part of the pipe at a position higher than the sample liquid level, the sample weighs under its own weight from the nucleic acid-adsorbing material part of the processing tank. This is useful because it can be prevented from flowing into the collecting tank when flowing into the collecting tank.
[0022]
The top member is provided with an opening for introducing a sample containing nucleic acids into the cartridge and / or an opening for taking out a solution containing isolated nucleic acids from the collecting tank of the base member. The operation of introducing the sample and / or removing the eluate from the collecting tank is facilitated. These openings may be different openings, but may share the same opening. When an opening is provided, it is fixed so that the opening is located above the processing tank in an initial state. From this opening, the sample is injected into the processing tank using a pipette or the like.
[0023]
The sample injected into the processing tank flows from the processing tank into the waste liquid tank by its own weight or by a negative pressure by a suction pump provided outside. This process depends on the properties of the sample and the nucleic acid-adsorbing substance. When the viscosity of the sample is high or the adsorbed substance is fine, it is difficult to send the sample by its own weight. Therefore, the sample is sent from the treatment tank to the waste tank by a suction pump or the like.
The bottom of the reagent well on the top member is sealed by a breakable film, and the top of the reagent well is sealed by a piston, so that the reagent inside the reagent well can be stored without contact with outside air. become. Further, when liquid feeding is required, it becomes possible to break a part of the film by an external force such as a plunger and feed the liquid.
[0024]
In order to store reagents, the film is required to have a performance of preventing corrosion or the like by the internal reagent stored in each well during storage and a performance of not leaking the internal reagent to the outside. Also, the film needs to be broken by applying some sufficient force. For example, a sharp projection or the like is installed on the cartridge to facilitate the breakage of the film by peeling off the film that has sealed the bottom of the reagent well due to an increase in the pressure in the reagent well and sending the liquid easily. It is achieved by things. A projection may be provided on the reagent well piston. If the seal by the piston is incomplete, it is also effective to seal the upper part of the piston with a further breakable film.
[0025]
By sealing the opening of the collecting tank installed on the base member with a breakable film, it is possible to store the isolated nucleic acid solution collected in the collecting tank without contact with outside air. That is, during the storage period, contamination of impurities from outside can be avoided. When isolated nucleic acids are required, a portion of the film is broken and removed. The film is required to have a performance that does not substantially change due to the solution containing the isolated nucleic acid during storage of the isolated nucleic acid, and a performance that does not leak the internal reagent to the outside.
[0026]
By using a nucleic acid adsorption filter as the nucleic acid adsorbing substance, the nucleic acid adsorbing substance can be easily installed in the treatment tank, and the nucleic acid from the sample can be efficiently adsorbed on the nucleic acid adsorbing substance.
The filter may be any substance that is a nucleic acid-adsorbing substance from which an appropriate eluate can be selected, and is preferably a filter paper, a woven fabric, a nonwoven fabric, a matrix, or a membrane. The shape, thickness, material, shape, size, etc. of the filter are not limited as long as they can be installed in the cartridge. The filter can be in any form such as a sheet, a membrane, a plate-like mass, a fiber shape, a granular shape, etc., but a sheet-like filter is preferable because of easy installation in a treatment tank. The material may be either hydrophilic or hydrophobic, but is preferably hydrophobic.
[0027]
The filter may be made of any of an organic material and an inorganic material, and may be made of a natural material, a synthetic material, or a semi-synthetic material. Examples of filters include natural, synthetic, semi-synthetic or regenerated porous bodies made of organic or inorganic fibers; organic or inorganic foams (eg, sponges, foams, etc.); elution, sintering, stretching, perforation of pore components And the like; a porous body filled or bonded with organic or inorganic fine particles or fine particles; a filter paper, and the like.
[0028]
For example, in the case of a filter composed of fibers, the fibers may be any of organic or inorganic short fibers, slivers, and long fibers. The form of the filter is arbitrary, and may be, for example, a mere fiber mass or a sheet of one or more layers.
As the nucleic acid adsorption filter, filter paper is inexpensive, and a commercially available filter for experiment can be used. As the filter paper, those containing cellulose as a main component are preferable.
Woven or nonwoven fabrics are also preferred because they are inexpensive and have higher mechanical strength than filter paper. A woven fabric is a fabric formed by interlacing warp yarns and weft yarns. The nonwoven fabric has a sheet or web structure made by bonding or entanglement of short fibers or filaments by mechanical, thermal or chemical means (second edition, Textile Handbook, edited by Textile Society, Maruzen).
[0029]
Nonwoven fabrics are produced by various methods, and the basic steps are a web forming step (a sheet of fibrous mass with a certain degree of fiber orientation), a web bonding step, and a finishing step. The method of forming the web is roughly classified into a wet method, a dry method and a direct method. The direct method is a method also called a direct spinning type, which is a process of collecting fibers spun from a molten polymer solution and directly forming a web. The methods included therein include a spunlace method, a spun bond method, a melt blow method, a needle punch method, a stitch bond method and the like. In the present invention, a nonwoven fabric made of a microfiber formed by a melt blow method is most preferable.
[0030]
Various fibers are used for non-woven fabrics, from natural fibers to chemical fibers.Generally used are cotton, rayon, polyester fibers, polypropylene fibers, and nylon fibers. Fiber, glass fiber, pulp, carbon fiber and the like are used.
As the material of the woven fabric, any material such as cotton, silk, human silk, acrylic fiber, polyester fiber such as polyethylene terephthalate fiber, polypropylene fiber, nylon fiber and the like can be used as long as it can be woven on the fabric.
[0031]
In the present invention, a woven fabric and a nonwoven fabric made of polyester fiber such as polyethylene terephthalate fiber, polypropylene fiber, and nylon fiber are preferable.
Examples of the cartridge for nucleic acid isolation using a nonwoven fabric include one in which the method of another invention (International Patent Application No. PCT / JP02 / 06939) according to the present applicant is applied to the cartridge for nucleic acid isolation of the present invention. International Patent Application No. PCT / JP02 / 06939 discloses a method for isolating nucleic acids using a non-woven fabric. The average pore size of the nonwoven fabric is suitably from 2 to 150 μm, and more preferably from 2 to 20 μm. Here, the average pore diameter of the nonwoven fabric means a measured value (median value) measured by a mercury porosimeter. The average pore diameter is an index related to the degree of entanglement of fibers constituting the filter element and the size of the void.
[0032]
As the woven fabric and the nonwoven fabric, one obtained by laminating one layer or a plurality of layers is used.
It is also possible to use a membrane formed from silica or a silica derivative as the nucleic acid adsorption filter. In this case, a substance containing a high chaotropic property is added to the sample containing the nucleic acid to be introduced into the cartridge, and a solution containing an organic solvent such as alcohol is used as a washing solution. It is preferable to use Further, it is preferable to sufficiently remove the chaotropic substance and the organic solvent between the washing step and the elution step so that the chaotropic substance and the organic solvent do not remain in the solution of the isolated nucleic acid.
[0033]
By providing a heating mechanism in the treatment tank, heating can be performed to elute the nucleic acid adsorbed on the nucleic acid adsorption filter. Another invention (International Patent Application No. PCT / JP02 / 06939) according to the present applicant discloses a method for eluting a nucleic acid adsorbed on a nucleic acid adsorption filter, mainly using a hydrogen peroxide solution, a basic solution or the like. And a method by heating is disclosed. The method using a hydrogen peroxide solution or a basic solution is preferably an elution method by heating because nucleic acids isolated by these reagents may undergo a chemical change. From this point, in the present invention, it is preferable to elute the nucleic acid from the nucleic acid adsorption filter by heating.
[0034]
When a non-woven fabric is used as a nucleic acid adsorption filter, suitable conditions for eluting a nucleic acid are 90 to 95 when a TE buffer (10 mM Tris / HCl buffer containing 1 mM EDTA, pH = 8) is used. C. for 20-30 minutes.
When silica or a silica derivative is used as the nucleic acid adsorption filter, a solution containing an organic solvent such as alcohol is often used as a washing solution. Although it is necessary that these organic solvents do not remain in the solution of the nucleic acid to be isolated, according to the present invention, after the washing step, the pressure of the organic solvent is reduced by reducing the pressure with a suction pump while heating the treatment tank. It can be removed by drying.
[0035]
By using a metal having excellent thermal conductivity as a material of the treatment tank, heat can be efficiently transmitted when the treatment tank is heated to elute nucleic acids from the nucleic acid adsorption filter. When the nucleic acid adsorbed on the nucleic acid adsorption filter is eluted by heating, it is necessary to heat the treatment tank after the eluate is sent. In this case, the heat of the heating element is transmitted to the elution reagent via the heat transfer surface provided in the processing tank. When the heat transfer surface is arranged only at the bottom of the processing tank, the solution near the heat transfer surface is vaporized due to the high heating temperature, and an air layer is formed between the filter and the heat transfer surface. Since the gas phase has a significantly lower thermal conductivity than the liquid, sufficient heat is not transferred to the filter and the elution reagent on the upper portion of the filter, and the efficiency of nucleic acid elution is reduced.
[0036]
According to the present invention, since the heat from the heat transfer surface can be efficiently transmitted to the entire nucleic acid adsorption filter and the eluate, the nucleic acid recovery rate is increased. The metal used in the treatment tank is required not to be affected by various reagents and not to interfere with subsequent nucleic acid amplification or nucleic acid detection even if a small amount of the metal is dissolved in the eluate. For example, copper satisfies this condition and has a high thermal conductivity among various metals, so that copper is preferable as a material for the treatment tank.
[0037]
By adopting a structure having a metal member having excellent thermal conductivity penetrating the nucleic acid adsorption filter as the structure of the treatment tank, it becomes possible to efficiently transfer heat and to manufacture a cartridge at a low price. As an example of the structure of the processing tank of the present invention, a processing tank having the structure shown in Embodiment 4 can be mentioned. Originally, it is necessary to attach waste liquid piping, eluent piping, lids and valves that make the processing tank hermetically sealed to the processing tank, and metal cutting is required if the entire processing tank is manufactured using metal materials. Is done. This is disadvantageous in terms of mass productivity and cost. With a structure in which a metal member having excellent thermal conductivity penetrates the nucleic acid adsorption filter, heat from the heating element is efficiently transmitted to the inside of the processing tank, and thus the entire processing tank does not need to be made of metal. Therefore, the main part of the processing tank can be made of plastic that can be injection-molded and has sufficient heat resistance.
[0038]
The pipe connection part and the like are made during injection molding of plastic. Then, in order to secure a heat transfer route from the heating element to the nucleic acid adsorption filter and the elution reagent present in the vicinity of the nucleic acid adsorption filter, a metal component penetrating from the bottom of the processing tank to above the nucleic acid adsorption filter is arranged. Thereby, it is possible to overcome a decrease in heating efficiency due to low heat conduction of plastics. That is, according to the present invention, a metal part can be formed into a simple shape, and mass production cost can be reduced if it is manufactured by press working or the like. Therefore, according to this method, it is possible to produce a processing tank having excellent mass productivity and cost, and having a structure in which a route for heat conduction is secured.
[0039]
The treatment tank is sealed with a valve or a lid, and a valve for preventing the liquid in the treatment tank from flowing out to the waste liquid tank and / or the collecting tank is provided. Can be prevented.
When a nonwoven fabric is used for the nucleic acid adsorption filter, preferable conditions for elution of the nucleic acid are 90 to 95 ° C and 20 to 30 minutes. When these conditions are maintained, for example, if the treatment tank is in an unsealed state and the elution reagent is about several hundred μL, most of it evaporates. However, according to the present invention, it becomes possible to keep the treatment tank closed during heating, and this transpiration can be prevented. Here, one of the required specifications for the valve and the lid is to maintain a hermetic seal corresponding to the internal pressure generated inside the processing tank during heating. For example, when the processing tank is brought into a boiling state, the internal pressure is about 1 atm. Therefore, it is necessary to apply a force to the lid or the valve so that a sealed state can be achieved at least with this internal pressure.
[0040]
As a material for the lid, a thermoplastic rubber having an appropriate flexibility and heat resistance is used, and is molded into a shape suitable for the opening of the processing tank by injection molding. As the structure of the valve, for example, a waste liquid pipe and an eluate pipe are made of a flexible material, and when sealing is required, the pipe portion is deformed and closed by the pressure of two pins. Two pins for closing the lid and the valve are integrated, and a vertically movable guide is provided and installed on the top member of the nucleic acid isolation cartridge, and simultaneously closed by an external plunger mechanism to evaporate the eluted reagent and It is preferred to prevent outflow.
[0041]
The cartridge is installed in the nucleic acid isolation device, and the nucleic acid can be automatically isolated by controlling the nucleic acid isolation device. First, the cartridge is installed by a mechanism for receiving the cartridge installed in the nucleic acid isolation device. At this time, a projection is provided on the cartridge side, and a portion that engages with the projection is installed on the receiving mechanism, or a conversely, a projection is provided on the reception mechanism side, and a portion that engages with the projection is installed on the cartridge. It is preferable that the installation of the cartridge is stabilized. The rotation or translation mechanism installed in the apparatus of the present invention allows the top member of the cartridge to move relative to the base member. At this time, it is preferable that the translation element or the rotation element of the mechanism for receiving the cartridge is provided with a sensor for detecting a mechanical origin. As this sensor, for example, a photo interrupter or the like can be mentioned. Preferably, the translation element or the rotation element utilizes a step motor. With these devices, positioning from a mechanical origin can be performed by giving a predetermined drive pulse from the control device. Further, it is preferable that the translation part or the rotation axis of the cartridge and the translation element or the rotation element of the mechanism for receiving the cartridge have a mechanically meshing coupling structure. This makes it possible to position the top member of the cartridge in place by means of a translation element or a rotation element.
[0042]
When the positioning is performed, the position of the reagent sealed in the top member is recognized by the control device of the apparatus. Then, the nucleic acid is adsorbed on the nucleic acid-adsorbing material, unnecessary substances adsorbed on the nucleic acid-adsorbing material are removed by a washing solution, and an elution reagent is added to the nucleic acid-adsorbing material to which the nucleic acid is bound, and the nucleic acid is eluted in the elution reagent. According to the step, the reagent is sent to an appropriate place by applying a pressing force to the reagent well piston by a plunger mechanism installed in the apparatus. When the treatment tank has a mechanism for achieving a closed structure with a valve or a lid, these valves or lids can be pressed and sealed by a plunger mechanism installed in the apparatus of the present invention. Further, when a valve for preventing the liquid in the processing tank from flowing out to the waste liquid tank and / or the collecting tank is provided, the valve is closed by being pushed by the plunger mechanism installed in the apparatus of the present invention. . It is preferable that the lid and the valve closing mechanism are integrated, and a guide that can move up and down is provided on the top member of the nucleic acid isolation cartridge because it can be simultaneously closed.
[0043]
As a plunger, if a vertically driven element is provided with a double-structured push rod having a rod at the center and a cylindrical rod on the outside, the cartridge can be held down by the outer tubular part, This is preferable because a two-step process of pushing the reagent well piston with a rod becomes possible. Further, in the processing tank, the waste liquid tank, the negative pressure supplied from the apparatus in the liquid supply to the accumulation tank, under the control of the control device, is supplied to the cartridge through a mechanism for receiving the cartridge installed in the apparatus of the present invention, The liquid can be sent. In the nucleic acid isolation cartridge, it is useful to attach a label for distinguishing the sample to be measured or to attach a barcode or an IC chip that can be read by a computer or the like. It is preferable that an element capable of reading these barcodes and IC chips is further added to the control device of the nucleic acid isolation device.
[0044]
By installing a heating element in the nucleic acid isolation device, it becomes possible to heat the processing tank of the cartridge. That is, it becomes possible to elute the nucleic acid by heating the treatment tank and to dry the organic solvent on the filter. It is preferable that the heating element is provided at a portion of the receiving mechanism of the cartridge of the nucleic acid isolation device, and is arranged such that the surface of the heating element is pressed against the bottom portion of the processing tank. In order to enhance the heat transfer effect to the processing tank, it is preferable to attach a flexible silicone rubber material having good heat conduction and used for cooling electronic components, on the surface of the heating element. It is preferable that the temperature of the heating element is controlled to be, for example, several degrees higher than the above-mentioned temperature condition in consideration of the loss of heat transfer so that the inside of the processing tank is at the above-mentioned temperature condition. For example, an electric resistor is used as a heating element, and the temperature is controlled to a predetermined temperature by using a temperature sensor installed in the vicinity thereof and the strength of power supply to the electric resistor.
[0045]
In order to achieve a simpler configuration, an element having a positive temperature coefficient (PTC element (Positive Temperature coefficient)) and having a Curie point near the predetermined temperature is used. When a constant voltage is applied to an electric resistor having such characteristics, a large current flows at first because the resistance is low at room temperature, heat is generated rapidly, and the temperature rises rapidly. When the temperature rises near the Curie point, the electric resistance sharply increases, so that the current is suppressed, and thus the calorific value decreases. As a result, the temperature of the electric resistor is self-equalized near the Curie point where the electric resistance value suddenly increases. Controlled. In other words, a temperature sensor and a temperature control device, which are factors that cause an increase in price, are unnecessary, and heating at a constant temperature is realized only by controlling the energization.
[0046]
It is also possible to adopt a structure in which a heating element for heating the treatment tank is provided inside the nucleic acid isolation cartridge. In this case, an energy source for heating is required in the cartridge, but simplification of the nucleic acid isolation device can be expected. For example, temperature control can be performed by using a dry battery as an energy source and heating and / or cooling the heat source in the cartridge. It is also possible to set the heat source inside the cartridge and the energy source outside the cartridge. Further, a chemical exothermic and / or endothermic reaction such as a neutralization reaction and a hydration reaction may be used. For example, there is a hydrolysis reaction of quicklime and water, lithium aluminum hydroxide and water, and the like.
[0047]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
The numerical values such as length, depth, diameter and the like described in the examples are merely examples, and the present invention is not limited to these numerical values.
[0048]
Embodiment 1
<Nucleic acid isolation cartridge>
FIG. 1 is an assembly diagram of a nucleic acid isolation cartridge (1a) (hereinafter, referred to as a cartridge) composed of a base member (1b) and a top member (1c) prepared in the present embodiment, and FIG. 1b) and an exploded view into a top member (1c).
The top member (1c) includes four reagent wells (2a), a lid (2b) for a transpiration prevention mechanism, two pins (2c) held by a guide mechanism, and a processing tank (2d) for a base member (1b). It has an opening (2f) for introducing a sample into the container or extracting nucleic acid isolated from the accumulation tank (2e), and is made by injection molding using high-density polyethylene.
[0049]
The base member (1b) is made by injection molding using polystyrene, and elutes to communicate the treatment tank (2d), the accumulation tank (2e), the waste liquid tank (2g), and the treatment tank (2d) with the accumulation tank (2e). A liquid pipe (2h) and a waste liquid pipe (2i) communicating the treatment tank (2d) and the waste liquid tank (2g) are provided.
At the bottom of the base member (1b), there are provided four projections (2j) at symmetrical positions that can be fitted into a guide mechanism provided in a receiving mechanism (hereinafter, referred to as a carriage) described later. At the tip of the rotation shaft (2k) of the top member (1c) of the cartridge (1a), a projection (2l) for transmitting the rotation force of the rotation drive mechanism of the nucleic acid isolation device is provided. When fitted into the rotary bearing (2m) of 1b), the driving force from the rotary drive mechanism is transmitted to the top member (1c).
[0050]
FIG. 3 is a sectional view of the reagent well (2a). The reagent well (2a) is filled with a reagent solution (3a). A reagent well piston (3b) having a protrusion made of polycarbonate is inserted into the upper part of the reagent well (2a), and a reagent well piston film (3c) made of polyethylene coated aluminum foil is further adhered to the upper part thereof. A reagent well film (3d) made of polyethylene coated aluminum foil is attached to the lower part, and a reagent solution (3a) is sealed in the reagent well (2a).
[0051]
FIG. 4 is a schematic sectional view showing a state in which a reagent solution (3a) is sent from a reagent well (2a) by a plunger of an external nucleic acid isolation device. In the plunger, a push rod (inside: 4a, outside: 4b) having a double structure is installed at the tip of the vertical drive device. When the push rod is driven by the vertical drive in the direction indicated by the arrow, first the top member (1c) is pressed by the outer push rod (4b) and then by the inner push rod (4a). The reagent well piston film (3c) and the reagent well piston (3b) of the reagent well (2a) are pushed, the bottom reagent well film (3d) is broken, and the reagent (3a) is transferred to the treatment tank (2d). The liquid is sent.
[0052]
Each of the four reagent wells (2a) contains 0.5 ml of the following reagent solution.
First washing solution: 10 mM Tris / HCl buffer (pH = 8) containing 0.5% SDS (sodium dodecyl sulfate) and 0.1 M NaCl
Second wash: 10 mM sodium phosphate buffer, pH = 7.4, containing 1 M NaCl, 1 mM EDTA
Third washing solution: TE buffer (10 mM Tris / HCl buffer at pH = 8 containing 1 mM EDTA)
Eluate: TE buffer
[0053]
FIG. 5 is a schematic view of the processing tank (2d). The treatment tank (2d) is made of copper and has a waste liquid piping installation port (5a) and an eluate piping installation port (5b) as shown in FIG. 5, and is attached to the base member (1b). Inside the processing tank, a nonwoven fabric (5c) made of polyethylene terephthalate (made by Asahi Kasei Corporation) cut to a diameter of 13 mm is horizontally installed along the inner wall.
FIG. 6 is a layout diagram of the processing tank (2d), the collecting tank (2e), the waste liquid tank (2g), and other auxiliary members housed in the base member (1b). A waste liquid pipe (2i) made of a flexible silicone rubber tube having an inner diameter of 1 mm and an outer diameter of 3 mm is inserted into a waste liquid pipe installation port (5a) and an eluate pipe installation port (5b) of the treatment tank (2d) and elution. A liquid pipe (2h) is attached. These pipes respectively communicate with a waste liquid tank (2g) and an accumulation tank (2e) processed inside the base member. A part of the eluate pipe (2h) is higher than the upper part of the processing tank (2d).
[0054]
The top member (1c) at the top of the processing tank (2d) is provided with a silicone rubber disc-shaped lid (2b) for sealing the processing tank (2d), a waste liquid pipe (2i) and an eluate pipe (2h). Two stainless steel pins (2c) having a diameter of 1 mm and having a hemispherical tip are installed as open / close valves for pressing / releasing. These lid (2b) and pin (2c) are supported by a top member (1c). Then, they are simultaneously pushed by the push rods (4a, 4b) of the plunger of the nucleic acid isolation device, and the upper part of the treatment tank (2d), the waste liquid pipe (2i) and the eluate liquid pipe (2h) are closed. .
[0055]
FIG. 7 is a schematic view of valves installed in the waste liquid pipe (2i) and the eluate pipe (2h). The pin (2c) pushed by the push rod (4b) pushes the waste liquid / eluate pipe (2i, 2h) to open and close the valve (7a).
At the bottom of the collecting tank (2e) and the waste liquid tank (2g), as shown in FIG. 6, a suction port (6c) for introducing a reduced pressure of a suction pump or the like installed in the nucleic acid isolation device into the cartridge is provided. ing. The waste liquid tank (2 g) is provided with a water absorbing pad (6d) made of filter paper that absorbs the waste liquid. A film made of polyethylene terephthalate is attached to an outlet at the upper part of the collecting tank (2e).
[0056]
Embodiment 2
<Isolation device>
FIG. 8 shows a functional block diagram of an example of the nucleic acid isolation device of the present invention, and FIG. 9 shows a schematic diagram of its mechanism.
As shown in FIG. 8, the control mechanism (8a) includes a CPU (8b), a memory (8c) and a control circuit (8d), which are integrated on one electronic circuit board. The control circuit (8d) includes an input circuit for various sensors and a switch panel (8h), and an output circuit for controlling a display panel (8g), a rotary drive mechanism, a plunger, a suction pump, a heating element, a valve, and the like. The memory (8c) is divided into a readable / writable part and a read-only part. In the read-only part, a program for executing a nucleic acid isolation step described later is previously written. This is executed by (8b). A DC power supply rectified to an appropriate voltage is incorporated as a power supply (8e) to these mechanisms.
[0057]
The man-machine I / F (8f) includes a display panel (8g) and a switch panel (8h), and is installed on a front panel of the nucleic acid isolation device. The display panel (8g) uses a fluorescent display tube, and is controlled by the CPU (8b) via the control circuit (8d) to display various states of the nucleic acid isolation device and the progress of the nucleic acid isolation operation. Display briefly and inform the operator. The switch panel (8h) uses inexpensive and compact membrane key switches, and has ten or more key switches such as command keys and numeric keys. The fluorescent display tube described above is arranged immediately above some of the command keys, so that the function of the command key according to the state of the nucleic acid isolation device is simply displayed. These key switches are used mainly for initial setting and adjustment of the nucleic acid isolation device. In a normal nucleic acid isolation operation, it is only necessary to press the start command key after setting the cartridge (1a) on the carriage, and a series of subsequent processes are automatically executed.
[0058]
The mechanism section (8s) includes a carriage (8i) on which the cartridge (1a) can be installed, a linear movement mechanism (8j) for linearly moving the carriage, and a rotary drive mechanism (1c) for rotating the top member (1c) of the cartridge (1a). 8k), a plunger (8l) for feeding the reagent in the reagent well (2a) of the cartridge (1a) shown in Example 1, and a heat generation for heating the processing tank (2d) of the cartridge (1a) shown in Example 1 The body (8 m), the suction pump (8n) for supplying the pressure reducing element, and the pressure reducing element from the suction pump, the waste liquid tank liquid supply valve (8p) for controlling the supply to the cartridge, the accumulation tank liquid supply valve ( 8o), a leak valve (8q), and a PVC pipe (8r) for connecting these pumps to the valve and the carriage.
[0059]
FIG. 9 is a schematic view of the arrangement of these mechanical units (8s). The carriage (8i) has a guide mechanism (9b) into which the projection (2j) of the cartridge (1a) shown in the first embodiment is fitted, and is installed so that the cartridge (1a) is pressed firmly against the upper surface of the carriage. . Since the linear movement mechanism (8j) moves the carriage (8i) straight, the cartridge (1a) also translates accordingly. This linear drive mechanism connects a helical screw to the rotation shaft of the step motor, restricts the rotational freedom of the nut that engages with the screw, makes only the degree of freedom of the linear movement of the screw in the rotation axis direction movable, and rotates the rotation straight. Drive by converting to Further, the cartridge (1a) mounted on the carriage (8i) is recognized, and the cartridge (1a) can be positioned according to an instruction from the control mechanism (8a). The rotation drive mechanism (8k) is driven by a step motor.
[0060]
At the joint with the cartridge (1a), a pair of projections (9a) for transmitting the rotational force to the projection (2l) at the tip of the rotating shaft (2k) of the cartridge is provided, and the top member (9) of the cartridge (1a) is provided. 1c) can be rotated to a predetermined position after being positioned by the rotation drive mechanism (8k).
The plunger (8l) connects a helical screw to the rotation shaft of the step motor, restricts the rotational freedom of the nut that engages with the screw, and makes only the degree of freedom of the linear movement of the screw in the direction of the rotation axis movable. Drive by converting to Push rods (4a, 4b) are installed at the end of the linear drive unit. The extruding rod is a double-structured extruding rod having an inner rod (4a) at the center and a cylindrical rod (4b) on the outer side. And presses the reagent well piston (3b) to feed the reagent in the reagent well (2a).
[0061]
The heating element (8 m) was a PTC ceramic (curie point: 101 ° C., diameter: 10 mm, thickness: 1.5 mm, manufactured by Ube Electronics Co., Ltd.) containing barium titanate as a main component. In this case, it is installed so as to be in contact with the lower surface of the processing tank (2d), and can be energized via a control circuit (8d) in the nucleic acid isolation device.
The suction pump (8n) can suck air by supplying power from the control circuit (8d). The accumulation tank liquid supply valve (8o), the leak valve (8q), and the waste liquid tank liquid supply valve (8p) are made using an electromagnetic valve, and are opened and closed depending on whether or not power is supplied from the control circuit (8d). Controlled. These valves are connected to the suction pump (8n) and the carriage (8i) by piping (8r).
[0062]
FIG. 10 is a schematic diagram of components for joining the carriage (8i) and the base member (1b) of the nucleic acid isolation device. As shown in FIG. 10, the tip of the part where the pipe (8r) and the carriage (8i) are joined is connected to the suction port (6c) of the cartridge (1a) by the suction port (10a) provided in the carriage (8i). It is to be joined. That is, when the bottom surface of the cartridge is pressed against the top surface of the carriage, the suction port (6c) provided on the bottom surface of the cartridge and the suction port (10a) provided on the top surface of the carriage are connected, and the liquid can be sent by the pressure reducing element.
The driving device, plunger, heating element, pump, valve, and the like installed in these mechanisms (8s) are connected to the control circuit (8d), and the liquid sending and heating are controlled according to the nucleic acid isolation step. It has become so.
[0063]
That is, according to the nucleic acid isolation step,
(A) The control member (8a) rotates the top member (1c) via the rotation shaft (2k) of the top member (1c) in synchronization with the rotation drive mechanism (8k),
(B) When the reagent well (2a) of the cartridge comes directly below the plunger (8l), the push rods (4a, 4b) are pushed down, and first, the outer cylindrical portion (4b) of the push rod is placed in the reagent well (2a). ) The top member (1c) of the upper outer peripheral part is pressed down, and then the reagent well piston (3b) is pushed by the inner push rod (4a), and the protrusion penetrates the sealant to make an opening, The cleaning liquid is sent to the processing tank (2d),
(C) When the treatment tank (2d) is heated, the plunger (8l) pushes down the lid (2b) and the two pins (2c) to prevent evaporation and outflow of the elution reagent,
(D) When the liquid in the treatment tank (2d) is sent to the waste liquid tank (2g), the suction pump (8n) is operated, and the accumulation tank liquid supply valve (8o) and the leak valve (8q) are closed. The waste liquid tank liquid supply valve (8p) is opened and liquid is supplied,
(E) When the liquid in the processing tank (2d) is sent to the collecting tank (2e), the suction pump (8n) operates, the waste tank feeding valve (8p) and the leak valve (8q) are closed, The liquid feeding valve (8o) is opened and the liquid is fed.
It has become.
[0064]
Embodiment 3
<Isolation of E. coli nucleic acid>
The cartridge (1a) of Example 1 was set on the carriage (8i) of the nucleic acid isolation device of Example 2. Before closing the door of the nucleic acid isolation device, E. coli (1.5 × 10 ⁹ Pellets) are dissolved in 1 ml of 0.5% SDS (sodium dodecyl sulfate) and 10 mM Tris / HCl buffer, pH = 8, containing 0.1 M NaCl, and the sample is removed using a micropipette. The cartridge (1a) was injected into the processing tank (2d) through the opening (2f). The sample injected into the treatment tank (2d) penetrated into the nonwoven fabric (5c), and then flowed under the weight of the sample into the portion of the treatment tank (2d) below the nonwoven fabric, and further into the waste liquid tank (2g). At this time, since a part of the eluate pipe (2h) connected to the collecting tank (2e) is arranged at a position higher than the sample liquid level, the eluate is collected while the sample flows into the waste liquid tank (2g) by its own weight. It did not flow into the tank (2e). In approximately 2 minutes, most of the sample passed through the nonwoven fabric (5c), and the nucleic acids in the sample were adsorbed on the nonwoven fabric (5c).
[0065]
The door of the nucleic acid isolation device was closed, and the start button on the touch panel (8 g) was pressed. Thereafter, the operation until the cartridge (1a) is removed by opening the door of the nucleic acid isolation device was automatically achieved by the control mechanism (8a) of the nucleic acid isolation device. First, the carriage (8i) on which the cartridge (1a) was installed was moved to a predetermined position. As a result, the processing tank (2d) of the base member (1b) is located below the opening (2f) of the top member (1c).
[0066]
Activate the suction pump (8n), close the collecting tank feeding valve (8o) and the leak valve (8q), open the waste tank feeding valve (8p), and remove the sample remaining in the processing tank. It was led to a waste liquid tank (2 g). One minute later, the suction pump (8n) is stopped, the leak valve (8q) is opened, and the rotation drive mechanism (8k) is operated to move the reagent well (2a) filled with the first cleaning liquid into the treatment tank (2d). The top member (1c) was rotated so as to come to the upper part of. Next, the push rods (4a, 4b) were lowered, and the cleaning liquid 1 was led to the treatment tank (2d). One minute later, the suction pump (8n) was operated, the liquid supply valve (8o) and the leak valve (8q) for the accumulation tank were closed, and the liquid supply valve (8p) for the waste liquid tank was opened to remain in the treatment tank. The waste liquid of the first washing liquid was led to a waste liquid tank (2 g).
[0067]
Hereinafter, the same operation was performed for the second cleaning liquid and the third cleaning liquid. Finally, the eluate was introduced into the treatment tank (2d), after which the top member (1c) was rotated, and the cartridge lid (2b) and the two pins (2c) were pushed down by the push rods (4a, 4b). .
Electricity was started to the heating device of the nucleic acid isolation device, and the treatment tank (2d) was heated at approximately 95 ° C. for 30 minutes. After stopping the current supply and releasing the heat for 5 minutes, the valve (8o) for feeding the collecting tank was opened, the leak valve (8q) and the valve (8p) for feeding the waste tank were closed, and the suction pump (8n) was operated. The eluate from which the nucleic acid was isolated in the treatment tank (2d) was sent to the accumulation tank (2e). Next, the carriage (8i) was returned to the initial position after the opening (2f) of the top member (1c) was rotated so that the opening (2f) was directly above the collecting tank (2e). At this stage, the steps automatically accomplished by the control mechanism of the nucleic acid isolation device have been completed.
[0068]
Finally, open the door of the nucleic acid isolation device, take out the cartridge (1a), use the tip of a micropipette to break the film on the top of the accumulation tank (2e), and use the micropipette to isolate the nucleic acid inside the accumulation tank. The solution was collected. The recovered nucleic acid was quantified by an ultraviolet absorption spectrum. As a result, as shown in FIG. 11A, about 2.7 μg of the nucleic acid was isolated.
[0069]
Embodiment 4
<Treatment tank of other structure>
FIG. 12 is a sectional view of a processing tank (12) having a structure different from that of the processing tank (2d) shown in the first embodiment. A hole having a diameter of 3 mm is provided in the bottom of a plastic cylindrical container (12a) having an inner diameter of 14 mm polypropylene, into which a heat transfer pin (12b) made of aluminum is inserted. At the bottom, a disc-shaped nonwoven fabric (12c) having a diameter of 14 mm and a hole of 3 mm in the center thereof is placed while being held down by a plastic washer. The effective inner diameter of the nonwoven fabric (12c) is 12 mm.
[0070]
Two pipes (12d) are provided with silicone rubber tubes. 0.5 ml of water was put into each of the treatment tank (12) and the treatment tank (2d) of Example 1 shown in FIG. 5, and the upper part and the piping were closed and sealed, respectively. Was heated using the heating element of Example 2 (8 m) while measuring with a thermometer using a thermocouple.
As a result, comparing the temperature rise rates of the processing tank (2d) of FIG. 5 and the processing tank (12) of FIG. 12, as shown in FIG. 13, the result (13b) of the processing tank (12) of FIG. The target temperature of about 95 ° C. is reached earlier than the result (13a) of the processing tank (2d) in FIG. 5, which indicates that the heat transfer efficiency is more excellent.
[0071]
[Comparative Example 1]
<Manual nucleic acid isolation experiment>
In the same manner as in Example 1, a non-woven fabric made of polyethylene terephthalate (made by Asahi Kasei Co., Ltd.) cut into a disc having a diameter of 13 mm was fixed to a filter holder (pore diameter: 10 mm, made by Millipore), and a plastic syringe was placed on top of it. (5 ml, manufactured by Terumo Corporation), and a suction pump was connected to the lower part via a waste liquid tank.
E. coli (1.5 × 10 ⁹ Pellet) was dissolved in 1 ml of 0.5% SDS (sodium dodecyl sulfate) and 10 mM Tris / HCl buffer pH = 8 containing 0.1 M NaCl, and the plastic syringe was transferred from the syringe to the holder. Introduced. After draining the sample in the folder into the waste liquid tank with a suction pump, 0.5 ml of each of the first, second, and third washing liquids was sequentially introduced from the plastic syringe and discharged with the suction pump.
[0072]
Next, the nonwoven fabric was taken out of the folder and placed in a polypropylene microtest tube (capacity: 1.5 ml, manufactured by Eppendorf) containing 0.5 ml of TE buffer. After sealing, the mixture was heated at 95 ° C. for 30 minutes using an aluminum block heater. Finally, the nonwoven fabric was taken out, and the nucleic acid isolation solution in the tube was recovered. The recovered nucleic acid was quantified by an ultraviolet absorption spectrum. As a result, as shown in 11b of FIG. 11, approximately 2.9 μg of the nucleic acid was isolated. The results of this comparative experiment are equivalent to the results of the nucleic acid isolation of Example 3.
Therefore, it was shown that the same nucleic acid isolation as that performed by the manual operation of the comparative example can be easily achieved by using the nucleic acid isolation cartridge and the nucleic acid isolation device of the present invention.
[0073]
【The invention's effect】
According to the present invention, it is possible to easily isolate a nucleic acid from a material containing the nucleic acid. Therefore, when detecting the presence of a specific microorganism in a specimen or when detecting a human gene, the labor and time required for nucleic acid isolation can be saved, which is useful. In particular, genetic diagnosis in the medical field can be performed simply, quickly, and safely.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an assembly view of the nucleic acid isolation cartridge of the present invention.
FIG. 2 is an exploded view of the nucleic acid isolation cartridge of the present invention.
FIG. 3 is a cross-sectional view of the reagent well of the present invention.
FIG. 4 is a schematic diagram of a liquid supply from a reagent well to a processing tank by the plunger of the present invention.
FIG. 5 is a schematic view of a processing tank of the present invention.
FIG. 6 is a schematic diagram of a configuration of a base member, a top member, and a plunger of the present invention.
FIG. 7 is a schematic view of a valve installed on a base member of the present invention.
FIG. 8 is a configuration diagram of the nucleic acid isolation device of the present invention.
FIG. 9 is a schematic view of a mechanism and a cartridge of the nucleic acid isolation device of the present invention.
FIG. 10 is a schematic diagram of components for joining a carriage and a base member of the nucleic acid isolation device of the present invention.
FIG. 11 is a graph showing measurement results of nucleic acid isolation of the present invention and nucleic acid isolation of a comparative example.
FIG. 12 is a schematic view of another example of the processing tank of the present invention.
FIG. 13 is a graph showing measurement results of an experiment of heating a treatment tank according to the present invention.
[Explanation of symbols]
1a: Nucleic acid isolation cartridge
1b: Base member
1c: Top member
2a: reagent well
2b: lid
2c: Pin
2d: treatment tank
2e: accumulation tank
2f: Opening
2g: waste liquid tank
2h: Eluate piping
2i: Waste liquid piping
2j: protrusion
2k: rotating shaft
2l: protrusion
2m: rotating bearing
3a: Reagent solution
3b: reagent well piston
3c: Reagent well piston film
3d: Reagent well film
4a: Extruded rod (inside)
4b: Extruded rod (outside)
5a: Piping port for waste liquid
5b: Piping installation port for eluate
5c: non-woven fabric
6c: suction port
6d: water absorption pad
7a: Valve
8a: control mechanism
8b: CPU
8c: Memory
8d: control circuit
8e: Power supply
8f: Man-machine I / F
8g: Display panel
8h: Switch panel
8i: Carriage
8j: linear movement mechanism
8k: Rotary drive mechanism
8l: plunger
8m: Heating element
8n: suction pump
8o: Valve for feeding the collecting tank
8p: Valve for feeding waste liquid tank
8q: Leak valve
8r: Piping
9a: protrusion
9b: Guide mechanism
10a: suction port
11a: Nucleic acid isolation amount by the nucleic acid isolation cartridge and nucleic acid isolation device of Example 3
11b: Nucleic acid isolation amount by manual operation of Comparative Example
12: Processing tank
12a: cylindrical container, 12b: heat transfer pin, 12c: non-woven fabric, 12d: piping
13a: Result of heating of processing tank (2d)
13b: Result of heating of treatment tank (12)

Claims

A nucleic acid isolation cartridge for isolating a nucleic acid from a sample containing the nucleic acid, the cartridge comprising:
(A) a treatment tank in which the nucleic acid-adsorbing material is fixed,
(B) a waste liquid tank that communicates with the treatment tank and stores waste liquid; and (c) an accumulation tank that communicates with the treatment tank and collects a solution containing the isolated nucleic acid.
A base member including:
(D) a top member including at least one reagent well in which a washing solution for washing the nucleic acid-adsorbing material and / or an eluate for eluting the nucleic acid from the nucleic acid-adsorbing material is enclosed, and at least one of the reagent wells is And a reagent well piston for transferring the reagent to the nucleic acid-adsorbing material, wherein the top member can rotate or translate with respect to the base member.

The nucleic acid isolation cartridge according to claim 1, wherein the base member further includes a waste liquid pipe connecting the processing tank and the waste liquid tank, and / or an eluate pipe connecting the processing tank and the accumulation tank. .

The top member may further include an opening for introducing a sample containing the nucleic acid into the cartridge and / or an opening for removing the solution containing the isolated nucleic acid from the collecting tank of the base member. The nucleic acid isolation cartridge according to claim 1 or 2.

The cartridge for nucleic acid isolation according to any one of claims 1 to 3, wherein the bottom of the reagent well is sealed with a breakable film, and the top of the reagent well is sealed with a piston.

The cartridge for nucleic acid isolation according to any one of claims 1 to 4, wherein an opening of the collecting tank provided on the base member is sealed with a breakable film.

The nucleic acid adsorption cartridge according to any one of claims 1 to 5, wherein the nucleic acid adsorption material is a nucleic acid adsorption filter.

7. The cartridge for nucleic acid isolation according to claim 6, wherein the nucleic acid adsorption filter is a filter paper, a woven fabric, a nonwoven fabric, a matrix or a membrane.

The nucleic acid isolation cartridge according to claim 6 or 7, further comprising a mechanism for heating the treatment tank.

9. The nucleic acid isolation cartridge according to claim 8, wherein the treatment tank is formed of a metal material.

The nucleic acid isolation cartridge according to claim 8, further comprising a metal member penetrating the nucleic acid adsorption filter.

The cartridge for nucleic acid isolation according to any one of claims 8 to 10, further comprising a mechanism for sealing the treatment tank with a valve or a lid.

The nucleic acid isolation cartridge according to any one of claims 1 to 11, further comprising a valve for preventing a liquid in the treatment tank from flowing out to a waste liquid tank and / or an accumulation tank.

A nucleic acid isolation device for isolating a nucleic acid in a sample,
(E) a receiving mechanism for installing the nucleic acid isolation cartridge according to any one of claims 1 to 12,
(F) a rotating or translating element capable of rotating or translating the top member of the cartridge with respect to the base member and positioning the top member in a predetermined position;
(G) a plunger element formed by a vertical driving device for applying a pressing force to a reagent well piston for feeding a reagent in a reagent well provided in the cartridge and a push rod, and (h) a sample and / or a reagent. A decompression element for sending the liquid to a waste liquid tank and / or a collecting tank.
And
In the process of passing a nucleic acid-containing sample through the vicinity of the nucleic acid-adsorbing material, the nucleic acid is adsorbed on the nucleic acid-adsorbing material, unnecessary substances adsorbed on the nucleic acid-adsorbing material are removed by a washing liquid, and the nucleic acid-adsorbed material to which the nucleic acid is bound is removed. A nucleic acid isolation device, comprising: a controller that controls each of the elements (f) to (h) in accordance with a series of steps of adding an elution reagent to elute a nucleic acid in the elution reagent.

The receiving mechanism further includes a linear moving mechanism that can be controlled by a control device, moves the received nucleic acid isolation cartridge, and positions the cartridge at a predetermined position. 14. The nucleic acid isolation device according to claim 13.

15. The nucleic acid isolation device according to claim 13, further comprising a heating element for heating a treatment tank that can be controlled by a control device.

16. The nucleic acid isolation device according to claim 15, wherein the heating element utilizes electric heating to a substance having a positive temperature coefficient.