JP2004201679A

JP2004201679A - Ｐｃｒ法によるフゾバクテリウム・ニュークレタム菌の検出用プライマー及びその検出方法

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Publication number: JP2004201679A
Application number: JP2003403715A
Authority: JP
Inventors: Tadayuki Iwase; 忠行岩瀬; Morihide Itano; 守秀板野; Yoshitaka Yano; 義高矢納
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2002-12-10
Filing date: 2003-12-02
Publication date: 2004-07-22
Also published as: EP1443118A1; US20040197849A1

Abstract

【課題】生体試料中から化膿性疾患関連細菌及び口臭原因菌であるフゾバクテリウム・ニュークレタム菌を特異的に検出する方法を提供する。
【解決手段】下記（１）及び（２）のプライマーを含む、ＰＣＲ法による細菌の検定及び/又は定量用の方法。（１）特定の塩基配列の一部からなる少なくとも１０塩基以上の塩基配列を有するフォワードプライマー（２）他の特定の塩基配列の相補的塩基配列の一部からなる少なくとも１０塩基以上の塩基配列を有するリバースプライマー。
【選択図】なし

Description

本発明は、歯肉縁上歯垢や歯肉縁下歯垢、舌苔、唾液、歯肉溝滲出液、血液、髄液、化膿部位やその他組織等の生体試料中から化膿性疾患関連細菌及び口臭原因菌であるフゾバクテリウム・ニュークレタム菌を特異的に検出する方法に関する。

従来、細菌の同定は培養法を用いて行うことが一般的であり、増殖培養、分離培養等を行ってシングルコロニーを生育させる必要があるため、数日から数週間を要していた。さらにその後、単離した菌を増殖させ、形態観察、グラム染色等による細胞染色、およびプロピオン酸産生試験、糖資化性等多くの生化学的性状を調べる必要があり、培養法による細菌の同定には、設備、時間、費用を要した。

前記培養法の欠点を克服する方法として、近年、ＰＣＲ法による細菌同定が行われるようになった。ＰＣＲ法を用いることにより細菌同定は迅速かつ鋭敏に行えるようになったが、ＰＣＲ法はプライマーが不可欠であり、目的とする細菌を検出・同定できるかはプライマー設計にかかっていた。

一方、ヒト口腔から分離されるフゾバクテリウム属として、フゾバクテリウム・ナヴィフォールム（F. naviforme）、フゾバクテリウム・ペリオドンティカム（F. periodonticum）、フゾバクテリウム・ネクロフォーラム（F. necrophorum）、フゾバクテリウム・ヴァリウム（F. varium）、フゾバクテリウム・ニュークレタム菌（Fusobacterium nucleatum、以下、Ｆｎ菌という。)、フゾバクテリム・ルージー（F. russii）等が知られている。

口臭原因菌とも言われているＦｎ菌は、食物残渣や剥離粘膜等に含まれる含硫アミノ酸や含硫アミノ酸を含むペプチド等を分解し揮発性硫化化合物（以下ＶＳＣという）を産生するのに対し、Ｆｎ菌以外の前記フゾバクテリウム属の菌のＶＳＣ産生能はＦｎ菌ほど高くない。また、Ｆｎ菌は、歯周病原菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）やプレボテラ・インターメディア（Prevotella intermedia）等の歯周病原菌と共凝集する特有の性質を有するため、歯周疾患との関連も示唆されている。

このように、フゾバクテリウム属の中でＦｎ菌は特に重要な菌種である。しかし、Ｆｎ菌は、フゾバクテリウム属の他種と極めて近い類縁関係にあるため、それを分離培養することが困難であり、これまでにＦｎ菌だけを検出することのできる選択培地は開発されていない。

また、Ｆｎ菌種を検出同定するための試みとして、検体となる微生物の１６ＳリボゾーマルＤＮＡ（以下１６ＳｒＤＮＡという）を抽出し、このＤＮＡと相補関係にある数十の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法による細菌の検出方法が報告されている（非特許文献１）。しかし、前記ＰＣＲ法ではＦｎ菌のみを検出することはできなかった。

Conrads, G. et al, J. Endodontics. 25:433-438. 1997

本発明は、フゾバクテリウム属細菌の中でＦｎ菌を特異的に区別し、かつ、生体試料に混入されるヒト由来ＤＮＡと明確に区別しうる簡便かつ迅速な検出方法を提供することを目的とする。

発明者らは、Ｆｎ菌のｒＤＮＡを検討した結果、１６ＳｒＤＮＡはフゾバクテリウム属の近縁種間で極めて酷似しており、１６ＳｒＤＮＡの中でプライマーを作成しＰＣＲ法を行ってもＦｎ菌の検出・同定は困難であることがわかった。一方、２３ＳリボゾーマルＤＮＡ（以下２３ＳｒＤＮＡという）はヒトの遺伝子ＤＮＡと類似しているため、歯肉縁上歯垢や歯肉縁下歯垢、唾液等の生体試料を分析する点で望ましくない。
そこで、「１６ＳｒＤＮＡ及び/又はスペーサー部位(配列番号１)の一部を有するフォワードプライマー」と「２３ＳｒＤＮＡ（配列番号２の相補鎖）の一部を有するリバースプライマー」を組み合わせてＰＣＲすることにより初めて、生体試料に混入されるヒト由来ＤＮＡと明確に区別し、さらにＦｎ菌を特異的に区別しうる簡便かつ迅速な検出が可能となった。

本発明において、配列番号１に記載の塩基配列の一部からなる少なくとも１０塩基以上の塩基配列を有するフォワードプライマーとは、当該フォワードプライマー自体の全配列又は部分的配列として、配列番号１で表される塩基配列の少なくとも一部に相当する塩基配列であり且つ少なくとも１０塩基分の長さを有するプライマーである。
より具体的には、当該フォワードプライマーは、３’末端に配列番号１記載の塩基配列の一部を含むプライマーであり、その５’末端に配列番号１で表される塩基配列とは全く関係ない付加的な塩基配列により延長されていても良い。
当該フォワードプライマーは、配列番号１の相補的塩基配列と後述するＰＣＲ法条件下でハイブリダイズし、ヒト由来正常歯肉繊維芽細胞由来のＤＮＡとハイブリダイズしないものであれば特に限定はないが、プライマーのデザインは以下の条件に適合するものが望ましい。プライマーの鎖長としては、１０塩基以上４０塩基以下のものが好ましく、より好ましくは１２塩基以上３０塩基以下であり、特に好ましくは１５塩基以上２５塩基以下である。
Tm値は４０℃以上、６５℃以下になるよう設計するが、より好ましくは５０℃以上６０℃以下である。GC含量は２５％以上、７０％以下になるよう設計することが好ましく、より好ましくは４０％以上６０％以下である。
上記フォワードプライマーとして好ましい配列としては、例えば、ＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ（配列番号１１）、ＣＴＴＡＡＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣ（配列番号１２）、ＡＡＴＧＣＴＴＡＡＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣ（配列番号１３）、ＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ（配列番号１４）、ＧＴＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣ（配列番号１５）等を挙げることができる。

配列番号２に記載の塩基配列の相補的塩基配列の一部からなる少なくとも１０塩基以上の塩基配列を有するリバースプライマーとは、当該リバースプライマー自体の全配列又は部分的配列として、配列番号２で表される塩基配列の少なくとも一部に相当する塩基配列の相補的塩基配列であり且つ少なくとも１０塩基分の長さを有するプライマーである。
より具体的には、当該リバースプライマーは、３’末端に配列番号２記載の塩基配列の相補的塩基配列の一部を含むプライマーであり、その５’末端に配列番号２で表される塩基配列の相補的塩基配列とは全く関係ない付加的な塩基配列により延長されていても良い。
当該リバースプライマーは、配列番号２のＤＮＡと後述するＰＣＲ法の条件下でハイブリダイズし、フゾバクテリウム・ペリオドンティカム（F. periodonticum ＡＴＣＣ３３６９３）、フゾバクテリウム・ネクロフォーラム（F. necrophorum ＡＴＣＣ２５２８６）及びフゾバクテリウム・ヴァリウム（F. varium ＡＴＣＣ８５０１）の２３ＳｒＤＮＡとハイブリダイズしないものであれば特に限定はないが、プライマーのデザインは以下の条件に適合するものが望ましい。
プライマ−の鎖長としては、１０塩基以上４０塩基以下のものが好ましく、より好ましくは１２塩基以上３０塩基以下であり、特に好ましくは１５塩基以上２５塩基以下である。Tm値は４０℃以上、６５℃以下になるよう設計するが、より好ましくは５０℃以上６０℃以下である。GC含量は２５％以上、７０％以下になるよう設計することが好ましく、より好ましくは４０％以上６０％以下である。
上記リバースプライマーとして好ましい配列としては、例えばＧＣＣＡＴＣＡＣＣＣＡＡＡＴＧＧ（配列番号１６）、ＡＡＧＡＡＧＧＧＴＡＡＣＣＧＡＣＴＴ（配列番号１７）等を挙げることができる。

特に、生体試料からＦｎ菌を特異的に検出する点で下記プライマー（Ａ）と（Ｂ）、もしくは（Ｂ）と（Ｃ）を組み合わせたプライマーセットを用いることが好ましい。
（Ａ）配列番号３に記載の塩基番号第１番目乃至第３９番目の塩基配列又はその一部からなる少なくとも１０塩基以上の塩基配列を有するプライマー
（Ｂ）配列番号３に記載の塩基番号第８６３番目乃至８８３番目の塩基配列の相補的塩基配列又はその相補的塩基配列の一部からなる少なくとも１０塩基以上の塩基配列を有するプライマー
（Ｃ）配列番号３に記載の塩基番号第１番目乃至第１８番目の塩基配列

Ｆｎ菌由来ＤＮＡだけでなく、ヒト由来ＤＮＡが含まれている生体試料のＰＣＲを行うため、一般細菌とヒト由来ＤＮＡを区別する領域として特に好ましい配列として塩基配列（Ａ）の１つである配列番号３に記載の塩基番号第１番目乃至３９番目の塩基配列を見出した。この塩基配列は、１６ＳｒＤＮＡの３’末端の５塩基および、前記５塩基に隣接する１６ＳｒＤＮＡと２３ＳｒＤＮＡとの間に構成されるスペーサー領域の５’末端の塩基配列からなる部位に存在していた。

次にＰＣＲ法で増幅するための前記のオリゴヌクレオチドプライマーを設計し合成した。これらのプライマーを用いて、Ｆｎ菌が存在する生体試料についてＰＣＲを行うとき、Ｆｎ菌に特異的な増幅産物のみが得られる。

Ｆｎ菌検出可能な検体としては、歯肉縁上歯垢や歯肉縁下歯垢、舌苔、唾液、歯肉溝滲出液等の口腔関連の生体試料を用いることができる。さらには血液、髄液、化膿部位やその他組織等の生体試料でもよい。また、プライマーに用いるオリゴヌクレオチドは化学合成されたものでも天然物由来のものでも使用可能である。

好ましいプライマー（Ａ）〜（Ｃ）について説明する。プライマー（Ａ）に該当する、配列番号３に記載の塩基番号第１番目乃至第３９番目の塩基配列又はその一部からなる少なくとも１０塩基以上の塩基配列を有するプライマーをフォワードプライマーとして用い、プライマー（Ｂ）に該当する配列番号３に記載の塩基番号第８６３番目乃至８８３番目の塩基配列の相補的塩基配列又はその相補的塩基配列の一部からなる少なくとも１０塩基以上の塩基配列を有するプライマーをリバースプライマーとしてＰＣＲを行うことができる。プライマ−の鎖長としては、１０塩基以上４０塩基以下のものが使用され、好ましくは１２塩基以上３０塩基以下であり、より好ましくは１５塩基以上２５塩基以下である。塩基配列（Ａ）としては、例えば１８塩基からなる塩基配列（Ｃ）ＡＡＣＧＴＧＣＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＣや、塩基配列（Ａ）における塩基番号第１番目乃至２２番目の塩基配列ＡＡＣＧＴＧＣＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣや、塩基番号第７番目乃至２６番目の塩基配列ＣＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＣ、塩基番号第１２番目乃至３１番目の塩基配列ＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＡＡＧＧ、塩基番号第１６番目乃至３３番目の塩基配列ＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＡＡＧＧＡＧ等を用いることができる。塩基配列（Ｂ）の１種（配列番号３に記載の塩基番号第８６３番目乃至８８３番目の塩基配列の相補的塩基配列）および（Ｃ）のプライマーを用いてＰＣＲを行った場合、配列番号３の塩基配列の増幅産物を特異的に得ることができる。主要な増幅産物の鎖長は、計算上８８３ｂｐであり、塩基泳動像で増幅産物を示す約９００ｂｐのバンドが確認できる（図２参照）。

また、試料中のＦｎ菌数が極めて少ない場合や、より明瞭な電気泳動像を得たい場合には、前記プライマー（Ａ）、（Ｂ）とプライマー（Ｄ）に該当する、配列番号３に記載の塩基番号第１２４番目乃至１５６番目の塩基配列の相補的塩基配列又はその相補的塩基配列の一部からなる１０塩基以上の塩基配列を含むプライマーの３つのプライマーを用いてセミネスティットＰＣＲ法を行うことができる。塩基配列（Ｄ）は１６ＳｒＤＮＡと２３ＳｒＤＮＡとの間のスペーサー領域と呼ばれる部位に存在する。塩基配列（Ｄ）としては２９塩基からなるものであってもよく、プライマーとしてより好適な１５〜２５塩基、例えば２０塩基からなる塩基配列を有するプライマー（Ｅ）等を用いることが好ましい。ここで、プライマー（Ｅ）とは、配列番号３に記載の塩基番号第１２４番目乃至１４３番目の相補的塩基配列を有するプライマーである。
セミネスティットＰＣＲ法は２段階の増幅ステップからなる。先ず第１の増幅ステップで標的領域を含んだ増幅産物を得る。そして得られた増幅産物を鋳型に第２の増幅ステップを行うが、この時最初に使用したプライマー（アウタープライマー）位置より、どちらか一方のプライマーだけ内側のプライマー（インナープライマー）を使用し、標的領域以外のＤＮＡ由来の増幅産物を除外することができる。第１の増幅ステップとして、前記（Ａ）および（Ｂ）の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをアウタープライマーとしてＰＣＲを行う。増幅処理を行ったサンプルの一部を用いて第２の増幅ステップに入る。第２の増幅ステップでは、前記（Ａ）および（Ｄ）の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをインナープライマーとして用いＰＣＲを行う。この場合の主要な増幅産物は、第２の増幅ステップで用いたプライマーに依存するため、配列番号３に記載の塩基配列の一部に相当する。

第１の増幅ステップに用いることのできるアウタープライマーとして、前記（Ａ）の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの他に、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を基に設計した例えばＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＣＧＡＧＡＧＴＴＧＧ（配列番号１に記載の塩基番号第１３８４番目乃至第１４０３番目の塩基配列）等を用いることもできる。あるいは（Ｂ）の塩基配列を含むプライマーの他に２３ＳｒＤＮＡの塩基配列を基に設計した例えばＣＣＡＴＴＴＧＧＧＴＧＡＴＧＧＣ（配列番号２に記載の塩基番号第５９７番目乃至第６１２番目の塩基配列）の相補的塩基配列をアウタープライマーとして用いることができる。

また、セミネスティットＰＣＲ法に代えてネスティットＰＣＲ法も適用が可能である。ネスティットＰＣＲ法は、セミネスティットＰＣＲ法と比較して、両側とも内側のインナープライマーセットを使用する点が異なる。

ネスティットＰＣＲ法に使用可能なアウタープライマーとして、前記の（Ｃ）や（Ｂ）の塩基配列の他に、下記のものを挙げることができる。
フォワードプライマー：配列番号４に記載の塩基配列の一部からなる少なくとも１０塩基以上の塩基配列、又は、配列番号３に記載の塩基番号第１番目乃至第１２３番目の塩基配列の一部からなる少なくとも１０塩基以上の塩基配列を有するプライマー
リバースプライマー：２３ＳｒＤＮＡ（配列番号２の相補鎖）の一部からなる少なくとも１０塩基以上の塩基配列を有するプライマー
例えば、アウタープライマーとして、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を基に設計したＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＣＧＡＧＡＧＴＴＧＧ（配列番号４に記載の塩基番号第１３８４番目乃至第１４０３番目の塩基配列）と、２３ＳｒＤＮＡの塩基配列のうち、ＡＡＧＡＡＧＧＧＴＡＡＣＣＧＡＣＴＴ（配列番号２に記載の塩基番号第１２５６番目乃至第１２７３番目の塩基配列）の相補的塩基配列とを用いて第１ステップの増幅を行うことができる。この場合、Ｆｎ菌を特異的に検出するためには、本発明のプライマー（Ａ）と（Ｂ）のプライマーセット又はプライマー（Ｂ）と（Ｄ）のプライマーセットをインナープライマーとして用いることが好ましい。

本発明においてＰＣＲ法とは、当業者が通常実施する遺伝子増幅方法であるが、以下にその概略を説明する。
鋳型となる２本鎖のＤＮＡを加熱によって、それぞれ、１本鎖ＤＮＡに分離（熱変性）させる。その後、アニールによって、標的領域を挟むように、プライマーと呼ばれるオリゴヌクレオチドを前記熱変性によって分離された相補関係にあるそれぞれの１本鎖の５’末端にハイブリッド結合させる（アニーリング）。基質である４種類のｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３燐酸）の存在下、TaqＤＮＡポリメラーゼを作用させると、このプライマーの３’末端に鋳型の塩基配列に従ってヌクレオチドが添加されＤＮＡ鎖が伸長する（伸長反応）。この反応を繰り返すことで、標的領域を含むＤＮＡ断片を大量に得ることができる。なお、プライマーの合成反応及び鎖長反応の基質としてｄＮＴＰ中のｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを用いても良い。

本発明におけるＰＣＲ法の温度条件は、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９０〜９８℃、プライマー鋳型ＤＮＡにハイブリッド結合させるアニーリング反応を３７〜６５℃、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を５０〜７５℃で行い、これを１サイクルとし、このようなサイクルを数十サイクル行わせることにより、標的配列を増幅させることが好ましい。ＰＣＲ後、増幅産物を電気泳動等により分離し、エチジウムブロマイド等で核酸染色を行い、増幅されたポリヌクレオチド配列の鎖長が、上述の標的配列の鎖長と等しければ検体中に検出対象の菌が存在すると判定できる。増幅されたポリヌクレオチド配列の検出には、高速液体クロマトグラフィーも有効である。

プライマー鎖長が、本発明において必須の配列部分（例えば、プライマーＡにおいては配列番号３の塩基番号第１番目から第３９番目の塩基配列又はその一部からなる少なくとも１０塩基以上の配列に相当する部分、また、プライマーＢにおいては配列番号３に記載の塩基番号第８６３番目から８８３番目の塩基配列の相補的塩基配列又はその相補的塩基配列の一部からなる少なくとも１０塩基以上の配列に相当する部分）の５’末端が付加的な配列により延長されている場合には、鎖長追加分が増幅産物に賦与される。逆に、５’末端が短いものを用いたときには、その欠失分だけ増幅産物が短くなる。プライマーは、ビオチン、ジゴキシゲニン、ＦＩＴＣ(Fluorecein Isothiocyanate)、アクリジン、ジニトロフェニル、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、[³²P]ｄＮＴＰから選ばれる一つ以上を用いて標識されてもよい。

本発明に供するサンプルとして、様々な生体試料が考えられるが、例えば唾液、舌苔、歯肉縁上歯垢、歯肉縁下歯垢、口腔内粘膜、歯肉溝滲出液、血液、髄液、化膿性疾患部位の検体、糞便、尿、あるいはそれら生体試料の培養物等を挙げることができる。

採取した生体試料は、直接あるいはＤＮＡ抽出後ＰＣＲに供することができる。ＤＮＡ抽出は、常法に従って行うことができる。例えば、アルカリ抽出もしくは界面活性剤抽出、酵素処理、ボイリング法等のうちいずれか一つ以上の方法、もしくは市販のキットを用いてＤＮＡ抽出を行う。

生体から抽出されたＤＮＡを含む試料は、常法に従って更に精製処理をしてもよい。例えば高速液体クロマトグラフィーもしくはアルコール沈殿、塩析、シリカゲルカラム、シリカゲルメンブレン等のうちいずれか一つ以上の方法、もしくは市販のキットを用いて、ＤＮＡ精製する。

前記のプライマーや増幅産物は、Ｆｎ菌検出のためのプローブとしても有用である。増幅産物は制限酵素等を用いて、適当な長さのＤＮＡ断片にしてもよい。制限酵素としてEcoR I 、Mse I、Ban II、Alu I、Mbo I、Fok I、Taq I、Mbo II、Hinf I、Ava IIから一つ以上を用いることができる。制限酵素処理して得られたＤＮＡ断片は、電気泳動や高速液体クロマトグラフィー、シリカゲルカラム、シリカゲルメンブレン、ナイロンメンブレン等を用いて精製することが望ましい。

これらのプローブは標識物質で標識することも可能である。標識物質としてビオチン、ジゴキシゲニン、ＦＩＴＣ(Fluorecein Isothiocyanate)、アクリジン、ジニトロフェニル、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、[³²P]dNTPから選ばれる一つ以上を用いてプローブを標識することが可能である。

これらプローブは支持担体に結合させ、ＤＮＡチップとして用いることができる。ＤＮＡチップの作製等については、常法に従って実施することができる。例えば、プローブをチップ基板上に配置させるプローブ配置型や、ガラスやシリコンなどの基板上で直接ＤＮＡの伸長反応を用いてプローブＤＮＡを生成させたプローブ合成型などを用いてもよい。また、市販のＤＮＡチップ作製装置及びその読み取りには、ＤＮＡチップ読み取り装置等を用いてもよい。

菌検出又は同定用キットは、本発明のプローブおよび／またはプライマーを含む。さらに他の成分としてＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、その他の酵素、ｄＮＴＰ等の基質、緩衝液等を含む。

以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。
＜実施例１＞Ｆｎ菌の検出１
下記プライマーを用いて、フゾバクテリウム・ニュークレタム標準菌の検出を行った。
フォワードプライマー：５’―ＡＡＣＧＴＧＣＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＣ―３’
リバースプライマー：５’―ＣＴＡＣＧＣＣＡＡＡＣＧＡＣＴＡＡＴＴＣＧ―３’
３種類のフゾバクテリウム・ニュークレタム菌標準株（Fusobacterium nucleatum ＡＴＣＣ２５５８６、ＡＴＣＣ１０９５３、ＡＴＣＣ２３７２６）を、変法ＦＭ培地（日水製薬株式会社製）上にて３〜５日間３７℃で嫌気培養を行い、出現したコロニーを１白金耳分採取し市販キット（キアゲン社製ＤＮＡミニキット）を用いてＤＮＡ抽出液を得た。ＤＮＡ抽出液１μｌに５０ｍＭのＭｇＣｌ_２溶液を１．５μｌ、各２ｍＭのｄＮＴＰ溶液（アプライドバイオシステム社製）２μｌ、１２．５ｐｍｏｌ／μｌのフォワードプライマー溶液１μｌ、１２．５ｐｍｏｌ／μｌのリバースプライマー溶液１μｌ、５Ｕ／μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ溶液（アプライドバイオシステム社製）０．５μｌ、Ampli Taq Gold緩衝液（アプライドバイオシステム社製）５μｌをそれぞれ加え、更に滅菌した超純水を全量５０μｌになるよう加えて反応液とした。

ＰＣＲの反応条件は、以下の通りである。
熱変性：９４℃、３０秒
アニ−リング：５５℃、３０秒
伸長反応：７２℃、３０秒
反応サイクル：４０回

これらの操作は、アプライド・バイオシステム社製のGeneAmp ９７００システムを用いて行った。増幅産物の有無は、常法のアガロース電気泳動法に従った。電気泳動のためのアガロースゲルを用意し予めTAE（Tris-acetate , Ethylenediamine-Tetraacetic Acid）バッファーを満たした泳動装置にセットし、PCR反応物を試料溝にセットした。１００Ｖ、１５分間泳動した後、アガロースゲルをエチジウムブロマイド溶液に３０分浸漬し、核酸を染色した。染色後、ＵＶトランスイルミネーターを用いて、増幅産物のバンドを確認した。電気泳動の結果は図２の通りである。図中のレーン１はマーカー、レーン２はＡＴＣＣ２５５８６株、レーン３はＡＴＣＣ１０９５３株、レーン４はＡＴＣＣ２３７２６株の電気泳動像を示す。３菌種のフゾバクテリウム・ニュークレタム菌全てに約９００ｂｐの増幅産物を示すバンドが認められた。

＜実施例２＞Ｆｎ菌の検出
下記プライマーを用いて、実施例１同様の試験を行った。
フォワードプライマー：５’―ＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣ―３’
リバースプライマー：５’―ＧＣＣＡＴＣＡＣＣＣＡＡＡＴＧＧ―３’
フゾバクテリウム・ニュークレタム菌（ＡＴＣＣ２５５８６株）において約１５００ｂｐの増幅産物を示すバンドが認められた。

＜比較例１＞Ｆｎ菌以外のフゾバクテリウム属細菌およびヒト由来細胞のＰＣＲ
供試菌体および供試細胞はとして、Ｆｎ菌以外の５菌種、すなわちフゾバクテリウム・ナヴィフォールム（ F. naviforme ＡＴＣＣ２５８３２）、フゾバクテリウム・ペリオドンティカム（ F. periodonticum ＡＴＣＣ３３６９３）、フゾバクテリウム・ネクロフォーラム（ F. necrophorum ＡＴＣＣ２５２８６）、フゾバクテリウム・ヴァリウム（ F. varium ＡＴＣＣ８５０１）及び、フゾバクテリム・ルージー（ F. russii ＡＣＴＴ２５５３３）と、ヒト由来正常歯肉繊維芽細胞（Normal Gingiva Fibroblast ＡＴＣＣＣＲＬ１２９２）を供試した。

ヒト由来正常歯肉繊維芽細胞は、改良イーグルス培地（Dulbecco社製）に１０％のウシ胎児血清を加えた培地中で、５％ＣＯ_２の気相条件で、３７℃、７２時間培養後回収し、生理食塩水で洗浄後ＤＮＡ抽出を行った。それ以外の菌株については、実施例１同様の操作を行った。電気泳動の結果は図３の通りである。レーン１はマーカー、レーン２はフゾバクテリウム・ナヴィフォールム、レーン３はフゾバクテリウム・ペリオドンティカム、レーン４はフゾバクテリウム・ネクロフォーラム、レーン５はフゾバクテリウム・ヴァリウム、レーン６はフゾバクテリム・ルージー、レーン７はヒト由来正常歯肉繊維芽細胞の電気泳動像を示す。いずれのレーンにも増幅産物を示すバンドは認められなかった。

＜実施例３＞生体試料のＰＣＲの実施
１．試料の調製
被験者５名から生体試料として、唾液、舌苔、歯肉縁下歯垢および口腔粘膜を採取した。それぞれの採取方法は下記の通りである。
（１）唾液の場合
１ｍｌの唾液を採取し、5000ｇで５分間遠心分離した。上清を捨て、ＰＢＳ（phosphate buffered saline :燐酸緩衝生理食塩水）１ｍｌを加え、再懸濁した。この操作を３回繰り返し、洗浄したものをＤＮＡ抽出に供試した。
（２）舌苔の場合
舌ブラシで舌を擦過し、舌苔を採取した。得られた舌苔中10ｍｇを分取し、これに１ｍｌのＰＢＳを加えて懸濁後5000ｇで５分間遠心分離した。上清を捨て更に１ｍｌのＰＢＳを加え再懸濁後5000ｇで５分間遠心分離した。この操作を３回繰り返し、洗浄したものをＤＮＡ抽出に供試した。

（３）歯肉縁下歯垢の場合
歯周ポケット一部位に対しペーパーポイント（United Dental Manufacturers Inc．製）２本を差込み、歯肉縁下歯垢を採取した。このペーパーポイントを１ｍｌのＰＢＳ中で強く１分間攪拌ボルテックスし、付着物を回収した。ペーパーポイントを取り除いた後、懸濁液を5000ｇで５分間遠心分離した。上清を捨て更に１ｍｌのＰＢＳを加え再懸濁後5000ｇで５分間遠心分離した。この操作を３回繰り返し、洗浄したものをＤＮＡ抽出に供試した。
（４）口腔粘膜の場合
シードスワブを用いて、頬粘膜を採取した。採取物を１ｍｌのＰＢＳにて懸濁した。懸濁液を5000ｇで５分間遠心分離した。上清を捨て更に１ｍｌのＰＢＳを加え再懸濁後5000ｇで５分間遠心分離した。この操作を３回繰り返し、洗浄したものをＤＮＡ抽出に供試した。

それ以外は、実施例１同様の操作を行った。電気泳動の結果は図４（１）〜（４）の通りである。図４（１）は唾液からの検出結果、図４（２）は舌苔からの検出結果、図４（３）は歯肉縁下歯垢からの検出結果、図４（４）は口腔粘膜からの検出結果を示す。各図のレーン１はマーカー、レーン２は被験者Ａ、レーン３は被験者Ｂ、レーン４は被験者Ｃ、レーン５は被験者Ｄ、レーン６は被験者Ｅからの採取試料の電気泳動像を示す。唾液に関しては、５名中３名に、舌苔に関しては、５名中４名に、歯肉縁下歯垢に関しては５名全員に、口腔粘膜に関しては５名中１名に約９００ｂｐのバンドが認められた。

＜実施例４＞生体試料の定量ＰＣＲの実施
実施例３の歯肉縁下歯垢試料を用いて、定量ＰＣＲを行った。核酸定量試薬としてSYBR Green（Molecular Probe社製）を３０００倍希釈したものを５μｌ供試した。下記のプライマーを１２．５ｐＭの濃度になるように滅菌した超純水で希釈したものを１μｌ用いた。それ以外の試薬は実施例１の反応液組成の通りである。これらを混ぜ合わせて反応液を調製し、アプライドバイオシステム社製ＡＢＩプリズム７０００システムを用いて定量ＰＣＲを行った。結果を表１に示した。
フォワードプライマー：５’―ＡＡＣＧＴＧＣＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＣ―３’
リバースプライマー：５’―ＴＣＴＡＡＡＧＡＡＡＴＴＧＴＴＴＡＧＡＧ―３’

＜実施例５＞生体試料のセミネスティットＰＣＲの実施
下記のプライマーを用いて、２段階のＰＣＲから成るセミネスティットＰＣＲを行った。
第１ステップのＰＣＲに供試したプライマー：
フォワードプライマー：５’―ＡＡＣＧＴＧＣＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＣ―３’
リバースプライマー：５’―ＣＴＡＣＧＣＣＡＡＡＣＧＡＣＴＡＡＴＴＣＧ―３’
第２ステップのＰＣＲに供試したプライマー：
フォワードプライマー：５’―ＡＡＣＧＴＧＣＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＣ―３’
リバースプライマー：５’―ＴＣＴＡＡＡＧＡＡＡＴＴＧＴＴＴＡＧＡＧ―３’

生体試料として実施例３の唾液を用いた。第１ステップおよび第２ステップのＰＣＲとも４０サイクルの増幅を行った。それ以外は実施例１と同様の操作を行った。電気泳動の結果を図５に示した。図中のレーン１はマーカー、レーン２は被験者Ａ、レーン３は被験者Ｂ、レーン４は被験者Ｃ、レーン５は被験者Ｄ、レーン６は被験者Ｅからの採取試料の電気泳動像を示す。５名中３名に増幅産物を示すバンドが検出された。

＜実施例６＞生体試料のネスティットＰＣＲの実施
下記のプライマーを用いて、２段階のＰＣＲから成るセミネスティットＰＣＲを行った。
第１ステップのＰＣＲに供試したプライマー：
フォワードプライマー：５’―ＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＣＧＡＧＡＧＴＴＧＧ―３’
リバースプライマー：５’―ＣＴＡＣＧＣＣＡＡＡＣＧＡＣＴＡＡＴＴＣＧ―３’
第２ステップのＰＣＲに供試したプライマー：
フォワードプライマー：５’―ＡＡＣＧＴＧＣＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＣ―３’
リバースプライマー：５’―ＴＣＴＡＡＡＧＡＡＡＴＴＧＴＴＴＡＧＡＧ―３’
結果は実施例５と同様であった。

＜実施例７＞Ｆｎ菌に特異的なプローブを用いたＤＮＡチップ
実施例１において得られたプローブを常法により蛍光標識し、ガラス板に吸着させた。これを実施例３の唾液試料から得られたＤＮＡと反応させた。結果を表２に示した。

＜実施例８＞Ｆｎ菌に特異的なプローブを用いた検出キット
実施例１において得られたプローブを常法により蛍光標識し、ガラスビーズに吸着させた。これを実施例３の唾液試料から得られたＤＮＡと反応後、常法に従って発色させた。結果を表３に示した。

ｒＲＮＡをコードするＤＮＡの構成を示す図である。実施例１におけるフゾバクテリウム・ニュークレタム菌のＰＣＲ増幅産物の電気泳動像である。フゾバクテリウム・ニュークレタム菌以外のフゾバクテリウム属細菌とヒト由来細胞における増幅産物の電気泳動像である。生体試料におけるＰＣＲの結果である。（１）唾液、（２）舌苔、（３）歯肉縁下歯垢、（４）口腔粘膜生体試料におけるセミネスティットＰＣＲの結果である。

Claims

下記（１）及び（２）のプライマーを含む、ＰＣＲ法によるフゾバクテリウム・ニュークレタム菌の検出及び/又は定量用の方法。
（１）配列番号１に記載の塩基配列の一部からなる少なくとも１０塩基以上の塩基配列を有するフォワードプライマー
（２）配列番号２に記載の塩基配列の相補的塩基配列の一部からなる少なくとも１０塩基以上の塩基配列を有するリバースプライマー
下記プライマー（Ａ）とプライマー（Ｂ）とを含むＰＣＲ法によるフゾバクテリウム・ニュークレタム菌の検出用プライマーセット。
（Ａ）配列番号３に記載の塩基番号第１番目乃至第３９番目の塩基配列又はその一部からなる少なくとも１０塩基以上の塩基配列を有するプライマー
（Ｂ）配列番号３に記載の塩基番号第８６３番目乃至８８３番目の塩基配列の相補的塩基配列又はその相補的塩基配列の一部からなる少なくとも１０塩基以上の塩基配列を有するプライマー
下記プライマー（Ｃ）と請求項２記載のプライマー（Ｂ）とを含むＰＣＲ法によるフゾバクテリウム・ニュークレタム菌の検出用プライマーセット。
（Ｃ）配列番号３に記載の塩基番号第１番目乃至第１８番目の塩基配列
請求項２又は３に記載のプライマーセットを用い、フゾバクテリウム・ニュークレタムのリボゾーマルＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法により得られた、フゾバクテリウム・ニュークレタム菌に特異的な遺伝子増幅産物。
標識物質によって標識されたプローブである、請求項４に記載の遺伝子増幅産物。
前記標識物質が、ビオチン、ジゴキシゲニン、ＦＩＴＣ、アクリジン、ジニトロフェニル、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ及び[^３２Ｐ]ｄＮＴＰから選ばれる少なくとも１種である請求項５に記載の遺伝子増幅産物。
請求項２に記載のプライマー（Ａ）と（Ｂ）とを含むプライマーセットを用いてＰＣＲを行う第１ステップと、
前記第１ステップによって増幅された産物を鋳型として用い、請求項２に記載のプライマー（Ａ）、及び、下記プライマー（Ｄ）又は（Ｅ）、を含むプライマーセットを用いてＰＣＲを行う第２ステップと、
を含むフゾバクテリウム・ニュークレタム菌の検出方法。
（Ｄ）配列番号３に記載の塩基番号第１２４番目乃至１５６番目の塩基配列の相補的塩基配列又はその相補的塩基配列の一部からなる少なくとも１０塩基以上の塩基配列を有するプライマー
（Ｅ）配列番号３に記載の塩基番号第１２４番目乃至１４３番目の塩基配列の相補的塩基配列
配列番号４に記載の塩基配列の一部からなる少なくとも１０塩基以上のプライマーと請求項２に記載のプライマー（Ｂ）とを含むプライマーセットを用いてＰＣＲを行う第１ステップと、
前記第１ステップによって増幅された産物を鋳型として用い、請求項２に記載のプライマー（Ａ）および請求項７に記載のプライマー（Ｄ）を含むプライマーセットを用いてＰＣＲを行う第２ステップと、
を含むフゾバクテリウム・ニュークレタム菌の検出方法。
請求項２に記載のプライマー（Ａ）と請求項７に記載のプライマー（Ｄ）又は（Ｅ）を用い、配列番号５の塩基配列を含むＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法により得られた、フゾバクテリウム・ニュークレタム菌に特異的な遺伝子増幅産物。
配列番号５の塩基配列からなるプローブ。