JP2004201673A - ラブコネクチン３結合蛋白質 - Google Patents

Abstract

【課題】Ｃａ^２＋依存性エキソサイトーシス、特にはＲａｂ３Ａの活性化および不活性化の制御機構の解明に有用な蛋白質、ならびに、この蛋白質を用いる、Ｃａ^２＋依存性エキソサイトーシス、特にはＲａｂ３Ａの活性化および不活性化の制御に有用な物質のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】抗Ｒａｂ３ ＧＥＰ抗体を用いる共免疫沈降により、Ｒａｂ３Ａの活性化および不活性化の制御に関与する蛋白質を特定した。この蛋白質は、ラブコネクチン３およびＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質に結合するので、この結合を増加または減少させる物質のスクリーニングに使用できる。
【選択図】 図１

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラブコネクチン３（ｒａｂｃｏｎｎｅｃｔｉｎ−３）およびＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質に結合する蛋白質およびそれをコードするポリヌクレオチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｒａｂ３Ａは、Ｒａｂ３Ａ，−３Ｂ，−３Ｃ，−３Ｄの４つからなるＲａｂ３ファミリーのひとつで、神経伝達物質のＣａ^２＋依存性エキソサイトーシスの制御に重要な役割を果たすことが知られている。神経伝達物質のＣａ^２＋依存性エキソサイトーシスのプロセスは、（１）プレシナプス貯溜プールから、Ｃａ^２＋チャンネルが存在する原形質膜の活性帯へのシナプス小胞の移動、（２）小胞の活性帯へのドッキング、（３）すでに放出可能な状態にあるプールでの、小胞のドッキングからプライミングへの推移、および、（４）Ｃａ^２＋流入により誘導された小胞と膜の融合のステップを含む。
【０００３】
Ｒａｂ３Ａ遺伝子ノックアウトマウス解析により、（１）シナプス小胞のプレシナプス原形質膜への移動とドッキングを促進し、（２）Ｃａ^２＋により誘導された、小胞と原形質膜との融合を阻害するというＲａｂ３Ａの二つの働きが明らかになっている。しかし、神経伝達物質のＣａ^２＋依存性エキソサイトーシスにおける、これらＲａｂ３Ａの働きの分子メカニズムは知られていない。
【０００４】
Ｒａｂ３ファミリーメンバーは、ＧＤＰ解離抑制蛋白質（Ｒａｂ ＧＤＩ）、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質（Ｒａｂ３ ＧＥＰ）およびＧＴＰａｓｅ活性促進蛋白質（Ｒａｂ３ ＧＡＰ）の三つの制御因子により制御されることが知られている。Ｒａｂ３ ＧＥＰとＲａｂ３ ＧＡＰはＲａｂ３ファミリーメンバーに特異であるが、Ｒａｂ ＧＤＩは全てのＲａｂファミリーメンバーに対して活性である。これらの制御因子の働きによるＲａｂ３Ａの循環的な活性化と不活性化が、神経伝達物質のＣａ^２＋依存性エキソサイトーシスにおけるＲａｂ３Ａの働きに必須である。これら制御因子の働きに関する、現在のモデルの一つは以下の通りである。ＧＤＰ−Ｒａｂ３ＡがＲａｂ ＧＤＩとの複合体として細胞質中に貯留される。Ｒａｂ５、−７、−９に対してはＧＤＩ置換因子（ＧＤＦ）、またはＹｐｔ１と−７に対してはＲａｂリサイクリング因子（ＲＲＦ）の様に、他の未同定分子の助けを受け、Ｒａｂ３ ＧＥＰの働きによりＧＤＰ−Ｒａｂ３ＡがＧＴＰ−Ｒａｂ３Ａに活性化される部位であるシナプス小胞に、この複合体が動員される。ＧＤＦとＲＲＦは同定されていない。ＧＴＰ−Ｒａｂ３Ａは、その下流の二つのエフェクター、すなわち、小胞と活性帯にそれぞれ存在するラブフィリン３（ｒａｂｐｈｉｌｉｎ−３）とＲｉｍ−３に結合する。融合段階の前または後に、エフェクターと複合体を形成するＧＴＰ−Ｒａｂ３Ａは、Ｒａｂ３ ＧＡＰの働きによりＧＤＰ−Ｒａｂ３Ａに非活性化される。ＧＤＰ−Ｒａｂ３ＡはＲａｂ ＧＤＩによりトラップされ、小胞から細胞質に移動する。それゆえ、Ｒａｂ３ ＧＥＰとＲａｂ３ ＧＡＰはおそらくそれらが機能するとき、小胞へ動員されると考えられるが、それらのメカニズムは依然不明である。
【０００５】
最近、ラット脳の粗シナプス小胞（ＣＳＶ）画分から、Ｒａｂ３ ＧＥＰまたはＲａｂ３ ＧＡＰを用いた共免疫沈降により新規蛋白質が単離され、ラブコネクチン３と命名されている（非特許文献１参照）。ヒトラブコネクチン３は３，０３６アミノ酸からなり、計算上の分子量は３３９，７５３である。ラブコネクチン３は１２個のＷＤドメインを持つ。ラブコネクチン３は、シナプス小胞と関連する脳に豊富に発現している。また、さらにふたつの蛋白質がラット脳のＣＳＶ画分からＲａｂ３ ＧＥＰを用いて共免疫沈降されることが見出されている（非特許文献１参照）。
【０００６】
【非特許文献１】
「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００２年、第２７７巻、第１２号、第９６２９−９６３２頁
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、Ｃａ^２＋依存性エキソサイトーシス、特にはＲａｂ３Ａの活性化および不活性化の制御機構の解明に有用な蛋白質を提供すること、ならびに、この蛋白質を用いる、Ｃａ^２＋依存性エキソサイトーシス、特にはＲａｂ３Ａの活性化および不活性化の制御に有用な物質のスクリーニング方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質に直接結合するラブコネクチン３結合蛋白質を得ることに成功し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下のものを提供する。
【０００９】
（１）下記（ａ）または（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質。
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつラブコネクチン３およびＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質に結合する活性を有する蛋白質。
【００１０】
（２）配列番号２に示すアミノ酸配列を有する（１）記載の蛋白質。
【００１１】
（３）（１）または（２）の蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【００１２】
（４）配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１〜４４７０の塩基配列を有する（３）のポリヌクレオチド。
【００１３】
（５）下記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１〜４４７０の塩基配列を有するポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１〜４４７０の塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつラブコネクチン３およびＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質に結合する活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【００１４】
（６）下記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１〜４４７０の塩基配列を有するポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１〜４４７０の塩基配列と相同性が８０％以上の塩基配列を有し、かつラブコネクチン３およびＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質に結合する活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【００１５】
（７）（３）〜（６）のいずれか１項のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【００１６】
（８）（３）〜（６）のいずれか１項のポリヌクレオチドにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
【００１７】
（９）（８）の形質転換体を培養し、該形質転換体が発現した、ラブコネクチン３およびＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質に結合する活性を有する蛋白質を培養物から採取することを含む、ラブコネクチン３およびＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質に結合する活性を有する蛋白質の製造法。
【００１８】
（１０）（３）〜（６）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを検出するための、３）〜（６）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドに相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドからなるプローブまたはプライマーの使用。
【００１９】
（１１）（３）〜（６）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドに相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドからなるプローブまたはプライマーを被検ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせることを特徴とする（３）〜（６）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの解析方法。
【００２０】
（１２）被検ポリヌクレオチドが被検組織または被検細胞中に存在することを特徴とする（１１）に記載の解析方法。
【００２１】
（１３）（３）〜（６）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドに相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドからなるプローブまたはプライマーを被検ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせることを特徴とする（１）または（２）に記載の蛋白質をコードする遺伝子の解析方法。
【００２２】
（１４）被検ポリヌクレオチドが被検組織または被検細胞中に存在することを特徴とする（１２）に記載の遺伝子解析方法。
【００２３】
（１５）（３）〜（６）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドに相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドからなるプライマーを用いて、被検組織または被検細胞中のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅させ、（３）〜（６）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを測定することを特徴とする遺伝子解析方法。
【００２４】
（１６）（１）または（２）に記載の蛋白質をコードするｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチド。
【００２５】
（１７）（１）または（２）に記載の蛋白質をコードするｍＲＮＡを切断するリボザイム。
【００２６】
（１８）（１）または（２）に記載の蛋白質をコードするｍＲＮＡをＲＮＡ干渉により切断する二本鎖ＲＮＡ。
【００２７】
（１９）（１）または（２）に記載の蛋白質に対する抗体。
【００２８】
（２０）（１９）に記載の抗体を用いることを特徴とする（１）または（２）記載の蛋白質の免疫組織学的な解析方法。
【００２９】
（２１）蛋白質の局在を解析する方法である（２０）に記載の解析方法。
【００３０】
（２２）蛋白質の発現量を解析する方法である（２０）に記載の解析方法。
【００３１】
（２３）（１）または（２）の蛋白質またはその異種相同蛋白質であるラブコネクチン３結合蛋白質と、ラブコネクチン３との結合を促進する物質または阻害する物質の候補物質のスクリーニング方法であって、ラブコネクチン３結合蛋白質と、ラブコネクチン３とを前記候補物質の存在下および非存在下で反応させ、前記結合を増加または減少させる前記候補物質を選択することを含む前記方法。
【００３２】
（２４）（１）または（２）の蛋白質またはその異種相同蛋白質であるＲａｂ３ ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質結合蛋白質と、Ｒａｂ３ ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質との結合を促進する物質または阻害する物質の候補物質のスクリーニング方法であって、Ｒａｂ３ ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質結合蛋白質とＲａｂ３ ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質とを前記候補物質の存在下および非存在下で反応させ、前記結合を増加または減少させる前記候補物質を選択することを含む前記方法。
【００３３】
【発明の実施の形態】
＜本発明の蛋白質等＞
本発明の蛋白質は、ラブコネクチン３およびＲａｂ３ ＧＥＰに直接結合する蛋白質である。本発明の蛋白質はラブコネクチン３と複合体を形成することから、以下、本発明蛋白質をラブコネクチン３βと、ラブコネクチン３をラブコネクチン３αとも呼ぶ。
【００３４】
本発明の蛋白質のうち、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質は、後述の実施例に記載したように、ヒトのラブコネクチン３βとして特定された蛋白質である。蛋白質には、同一の機能を有する変異体の存在が予測され、また、蛋白質のアミノ酸配列を、例えば保存的置換のように適宜改変することによって、同一の機能を有する変異体を得ることができる。従って、配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつラブコネクチン３およびＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質に結合する活性を有する蛋白質も本発明の蛋白質に包含される。
【００３５】
蛋白質のアミノ酸配列の改変は、部位特異的変異誘発法などの周知の手段により蛋白質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を改変し、塩基配列が改変されたポリヌクレオチドを発現させることによって行うことができる。また、ラブコネクチン３およびＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質に結合する活性は、生理的な条件でこれらに結合することを意味し、この活性は公知の蛋白質相互間の結合を測定する方法に従って測定できる（例えば、後記実施例、または、「タンパク実験プロトコール 機能解析編」、秀潤社（１９９７）、第９章 免疫沈降、親和性レジンを用いた相互作用解析、第１５１〜１６１頁参照）。従って、同一の機能を有するか否かを決定することは当業者であれば容易である。
【００３６】
本発明の蛋白質を構成するアミノ酸残基は天然に存在するものでも、また修飾されたものであっても良い。アミノ酸残基の修飾としては、アシル化、アセチル化、アミド化、アルギニル化、ＧＰＩアンカー形成、架橋、γ−カルボキシル化、環化、共有架橋の形成、グリコシル化、酸化、脂質または脂肪誘導体の共有結合化、ジスルフィド結合の形成、セレノイル化、脱メチル化、蛋白質の分解処理、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合化、ヒドロキシル化、ピログルタメーピログルタメートの形成、フラビンの共有結合化、プレニル化、ヘム部分の共有結合化、ホスファチジルイノシトールの共有結合化、ホルミル化、ミリストイル化、メチル化、ユビキチン化、ヨウ素化、ラセミ化、ＡＤＰ−リボシル化、硫酸化、リン酸化等が例示される。さらに、本発明の蛋白質にはシグナルペプチド部分がついた前駆体、シグナルペプチド部分を欠く成熟蛋白質、及びその他のペプチド配列により修飾された融合蛋白質を含む。本発明の蛋白質に付加するペプチド配列としては、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、サブスタンスＰ、多重ヒスチジンタグ（６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ等）、プロテインＣ断片、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）、免疫グロブリン定常領域、α−チューブリン断片、β−ガラクトシダーゼ、Ｂ−タグ、ｃ−ｍｙｃ断片、Ｅ−タグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｂｉｏ／Ｔｅｈｃｎｏｌ． ６： １２０４−１０）、ｌｃｋタグ、ｐ１８ ＨＩＶ断片、ＨＳＶ−タグ（ヒト単純ヘルペスウイルス糖蛋白質）、ＳＶ４０Ｔ抗原断片、Ｔ７−タグ（Ｔ７ ｇｅｎｅ１０蛋白質）、ＶＳＶ−ＧＰ断片（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓウイルス糖蛋白質）等の蛋白質の精製を容易にする配列（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のようなベクターを利用できる）、組換え技術により蛋白質を生産する際に安定性を付与する配列等を選択することができる。
【００３７】
本発明の蛋白質は公知の遺伝子組換え技術により、また化学的な合成法により製造することができる。遺伝子組換え技術により本発明の蛋白質を製造する場合、製造される蛋白質は、選択する宿主の種類によってグリコシル化を受ける場合と受けない場合、さらに分子量、等電点等が異なる場合がある。通常、大腸菌等の原核細胞を宿主として蛋白質を発現させた場合、得られる蛋白質は本来蛋白質が有していたＮ−末端にメチオニン残基が付加された形で産生される。このような宿主の違いにより、構造の異なる蛋白質も本発明の蛋白質に含まれる。
【００３８】
＜蛋白質の製造＞
Ｉｎ ｖｉｔｒｏで蛋白質を製造する場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスレーション（Ｄａｓｓｏ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ （１９８９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７： ３１２９−４４）等の方法に従って、細胞を含まない試験管内の系で蛋白質を製造することができる。それに対して、細胞を用いて蛋白質を製造する場合、まず、適当な宿主細胞を選択し、目的とするＤＮＡによる形質転換を行う。続いて形質転換された細胞を培養することにより所望の蛋白質を得ることができる。培養は、選択した細胞に適した公知の方法により行う。例えば、動物細胞を選択した場合には、ＤＭＥＭ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８： ３９６ （１９５９）、ＭＥＭ（Ｓｃｉｅｎｃｅ １２２： ５０１ （１９５２））、ＲＰＭＩ１６４０（Ｊ． Ａｍ． Ｍｅｄ． Ａｓｓｏｃ． １９９： ５１９ （１９６７））、１９９（Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． ７３： １ （１９５０））、ＩＭＤＭ等の培地を用い、必要に応じウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清を添加し、ｐＨ約６〜８、３０〜４０℃において１５〜２００時間前後の培養を行うことができる。その他、必要に応じ途中で培地の交換を行ったり、通気及び攪拌を行ったりすることができる。
【００３９】
一方、ｉｎ ｖｉｖｏにおける蛋白質の生産系を確立するためには、動物または植物へ目的とするＤＮＡを導入し、生体内において蛋白質を産生させる。ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシ等の哺乳動物、カイコ等の昆虫（Ｓｕｓｕｍｕ （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１５： ５９２−４）等の動物系が公知である（Ｌｕｂｏｎ （１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． ４： １−５４）。また、哺乳動物系においてトランスジェニック動物を用いることもできる。
【００４０】
例えば、所望の蛋白質をヤギの乳汁中に分泌させることを目的とする場合、該蛋白質をコードするＤＮＡをβカゼイン等の乳汁中に特異的分泌される蛋白質をコードするＤＮＡと結合し、目的蛋白質を融合蛋白質として発現させるようにする。次に、融合蛋白質をコードするＤＮＡをヤギの胚へ導入する。ＤＮＡを導入した胚を雌ヤギの子宮へ移植する。このヤギから生まれるトランスジェニックヤギ、またはその子孫は乳汁中に所望の蛋白質を分泌する。必要に応じ、乳汁量を増やすため、ホルモンを投与することもできる（Ｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２： ６９９−７０２）。
【００４１】
タバコ等の植物を用いたトランスジェニック植物の蛋白質産生系が公知である。まず、所望の蛋白質コードＤＮＡをｐＭＯＮ５３０等の植物発現に適したベクターに組み込み、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ等の細菌に導入する。ＤＮＡの導入された細菌をＮｉｃｏｔｉｎａ ｔａｂａｃｕｍ等の植物に感染させ、植物を再生させることにより、所望の蛋白質を得られたトランスジェニック植物の葉より単離することができる（Ｊｕｌｉａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４： １３１−８）。その他の方法としては、ＰＥＧを用いプロトプラストへＤＮＡを導入して植物体を再生する方法（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ， Ｐｏｔｒｙｋｕｓ ａｎｄ Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ ｅｄ． （１９９５） ｐｐ． ６６−７４；インド型イネ品種に適する）、電気パルスによりプロトプラストへＤＮＡを導入して植物体を再生する方法（Ｔｏｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １００： １５０３−７；日本型イネに適する）、パーティクルガン法で植物細胞に直接ＤＮＡを導入し植物体を再生する方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９： ９５７−６２）、アグロバクテリウムを介し細胞にＤＮＡを導入し植物体を再生する方法（Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ６：２７１−８２）等が確立されている。植物を再生する方法については、Ｔｏｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １００： １５０３−７を参照することができる。
【００４２】
トランスジェニック植物が一度得られた後は、さらに該植物の種子、果実、塊茎、塊根、株、切穂、カルス、プロトプラスト等を材料として同じように本発明の蛋白質を産生する植物宿主を繁殖させ得ることができる。
【００４３】
通常、遺伝子組換え技術により製造された本発明の蛋白質は、まず、蛋白質が細胞外に分泌される場合には培地を、特にトランスジェニック生物の場合には体液等を、細胞内に産生される場合には細胞を溶解して溶解物を回収する。そして、蛋白質の精製方法として公知の塩析、蒸留、各種クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、ゲル濾過、限外濾過、再結晶、酸抽出、透析、免疫沈降、溶媒沈澱、溶媒抽出、硫安またはエタノール沈澱等を適宜組合せることにより所望の蛋白質を精製する。クロマトグラフィーとしては、アニオンまたはカチオン交換等のイオン交換、アフィニティー、逆相、吸着、ゲル濾過、疎水性、ヒドロキシアパタイト、ホスホセルロース、レクチンクロマトグラフィー等が公知である（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ， Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ． ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９６））。ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
【００４４】
また、天然由来の蛋白質を精製して取得してもよい。例えば、後述の本発明の蛋白質に対する抗体を利用して、アフィニティークロマトグラフィーにより精製することもできる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９８７） Ｓｅｃｔｉｏｎ １６．１−１６．１９）。また、ＧＳＴとの融合蛋白質とした場合にはグルタチオンカラムを、ヒスチジンタグを付加した融合蛋白質とした場合にはニッケルカラムを用いた精製法も利用できる。本発明の蛋白質を融合蛋白質として製造した場合には、必要に応じて精製後にトロンビンまたはファクターＸａ等を使用して不要な部分を切断することもできる。さらに、必要に応じキモトリプシン、グルコシダーゼ、トリプシン、プロテインキナーゼ、リシルエンドペプチダーゼ等の酵素を用い得られたポリペプチドを修飾することも可能である。
【００４５】
＜ポリヌクレオチド＞
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドである。このポリヌクレオチドは、本発明の蛋白質を遺伝子工学的に発現させる際に使用することができる。また、本発明のポリヌクレオチドは、ラブコネクチン３結合蛋白質遺伝子の検出試薬として用いることができる。つまり、本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチド、またはその一部の特異的断片を使用して、分子生物学的解析方法を行うことができ、ポリヌクレオチドを検出する方法、ポリヌクレオチドの発現量を解析する方法を提供する。例えば、サザンブロット法、ノーザンブロット法、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法等があげられる。
【００４６】
本発明において、ラブコネクチン３結合蛋白質がシナプスに局在することが確認されたことから、ラブコネクチン３結合蛋白質をシナプスのマーカーとして使用することができる。すなわち、本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチド、またはその一部の特異的断片を使用して、ラブコネクチン３結合蛋白質遺伝子の発現を検出することによりシナプスを検出することができる。従って、本発明のポリヌクレオチドは、シナプス検出試薬として用いることができる。また、本発明の蛋白質は、ラブコネクチン３およびＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質に結合することが確認されたことから、本発明のポリヌクレオチドは、これらの検出にも用いることができる。
【００４７】
ここで、「ポリヌクレオチド」とは、複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）等の塩基または塩基対からなる重合体を指し、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。また、天然以外の塩基、例えば、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’−Ｏ−メチルプソイドウリジン、β−Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルプソイドウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、β−Ｄ−マンノシルキュェオシン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシル−２−メチルリオプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）Ｎ−メチルカルバモイル）トレオニン、ウリジン−５−オキシ酢酸−メチルエステル、ウリジン−５オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、キュェオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、ワイブトシン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン等を必要に応じて含むポリヌクレオチドも包含する。
【００４８】
本発明のポリヌクレオチドとしては、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１〜４４７０の塩基配列を有するポリヌクレオチドが挙げられる。このポリヌクレオチドは、後述の実施例において、塩基配列が決定されたポリヌクレオチドである。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、ラブコネクチン３β蛋白質をコードする、配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列、または該核酸配列に相補的な配列を含む。このようなアミノ酸配列をコードする核酸配列は、配列番号１に記載された核酸配列に加えて、遺伝子暗号の縮重により配列番号１記載の配列とは異なる核酸配列を含むものである。本発明のポリヌクレオチドを遺伝子工学的な手法によりポリペプチドを発現させるのに用いる場合、使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、発現効率の高いヌクレオチド配列を選択し、設計することができる（Ｇｒａｎｔｈａｍ ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ９： ｒ４３−７４）。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドは、ラブコネクチン３β蛋白質、またはその抗原性断片をコードする、配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列をコードする核酸配列、または該核酸配列に相補的な配列を含む。１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなる変異ポリペプチドで、元のポリペプチドと同じ生物学的活性が維持されることは公知である（Ｍａｒｋ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１： ５６６２−６； Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ （１９８２） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １０： ６４８７−５００； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４： １４３１−３； Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ． （１９８２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９： ６４０９−１３）。複数個とは、通常には２〜３０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜５個である。
【００５０】
ここで、アミノ酸の置換とは、配列中のアミノ酸残基の一つ以上が、異なる種類のアミノ酸残基に変えられた変異を意味する。このような置換により本発明のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を改変する場合、蛋白質の機能を保持することが必要な場合には、保存的な置換を行うことが好ましい。保存的な置換とは、置換前のアミノ酸と似た性質のアミノ酸をコードするように配列を変化させることである。アミノ酸の性質は、例えば、非極性アミノ酸（Ａｌａ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｔｒｐ， Ｖａｌ）、非荷電性アミノ酸（Ａｓｎ， Ｃｙｓ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｙｒ）、酸性アミノ酸（Ａｓｐ， Ｇｌｕ）、塩基性アミノ酸（Ａｒｇ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ）、中性アミノ酸（Ａｌａ， Ａｓｎ， Ｃｙｓ， Ｇｌｎ， Ｇｌｙ， Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｍｅｔ， Ｐｈｅ， Ｐｒｏ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｔｒｐ， Ｔｙｒ， Ｖａｌ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ， Ｇｌｙ）、分枝アミノ酸（Ｉｌｅ， Ｌｅｕ， Ｖａｌ）、ヒドロキシアミノ酸（Ｓｅｒ， Ｔｈｒ）、アミド型アミノ酸（Ｇｌｎ， Ａｓｎ）、含硫アミノ酸（Ｃｙｓ， Ｍｅｔ）、芳香族アミノ酸（Ｈｉｓ， Ｐｈｅ， Ｔｒｐ， Ｔｙｒ）、複素環式アミノ酸（Ｈｉｓ， Ｔｒｐ）、イミノ酸（Ｐｒｏ， ４Ｈｙｐ）等に分類することができる。中でも、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅの間、Ｓｅｒ及びＴｈｒの間、Ａｓｐ及びＧｌｕの間、Ａｓｎ及びＧｌｎの間、Ｌｙｓ及びＡｒｇの間、Ｐｈｅ及びＴｙｒの間の置換は、蛋白質の性質を保持する置換として好ましい。変異されるアミノ酸の数及び部位は特に制限されず、該ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸がラブコネクチン３β蛋白質の抗原性を有していれば良い。
【００５１】
このような配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２^ｎｄ ｅｄ．』（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （１９８９））、『Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ』（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ （１９８７−１９９７）；特にＳｅｃｔｉｏｎ８．１−８．５）、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｇｅｎｅ１５２： ２７１−５、Ｋｕｎｋｅｌ （１９８５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２： ４８８−９２、Ｋｒａｍｅｒａｎｄ Ｆｒｉｔｚ （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４： ３５０−６７、Ｋｕｎｋｅｌ （１９８８） Ｍｅｔｈｏｄ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ８５： ２７６３−６等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。
【００５２】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、ラブコネクチン３β蛋白質、またはその抗原性断片をコードする、配列番号１の核酸配列または該核酸配列に相補的な配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列、を含むポリヌクレオチドである。このようなポリヌクレオチドとしては、アイソフォーム、アルタナティブアイソフォーム、及びアレリック変異体が考えられ、本発明のポリヌクレオチドに含まれる。このようなポリヌクレオチドは、配列番号１を含む核酸配列からなるポリヌクレオチド、またはその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の動物のｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。ｃＤＮＡライブラリーの作成方法については、『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２^ｎｄ ｅｄ．』（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （１９８９））を参照することができる。また、市販のｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。
【００５３】
より具体的に、ｃＤＮＡライブラリーの作製においては、まず、本発明のポリヌクレオチドを発現する細胞、臓器、組織等からグアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｗｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９７９） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８： ５２９４−９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ （１９８７） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２： １５６−９）等の公知の手法により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等を用いてｍＲＮＡを精製する。ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のような、直接ｍＲＮＡを調製するためのキットを利用してもよい。次に得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（生化学工業）のようなｃＤＮＡ合成のためのキットも市販されている。その他の方法として、ｃＤＮＡはＰＣＲを利用した５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ８９９８−９００２； Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７： ２９１９−３２）により合成、及び増幅させてもよい。また、全長率の高いｃＤＮＡライブラリーを作製するために、オリゴキャップ法（Ｍａｒｕｙａｍａ ａｎｄ Ｓｕｇａｎｏ （１９９４） Ｇｅｎｅ １３８： １７１−４； Ｓｕｚｕｋｉ （１９９７） Ｇｅｎｅ ２００： １４９−５６）等の公知の手法を採用することもできる。上述のようにして得られたｃＤＮＡは、適当なベクター中に組み込む。
【００５４】
本発明におけるハイブリダイゼーション条件としては、例えば「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃」、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた方法として、６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して１時間以上６８℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を３回、最後に、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で２０分の洗浄を２回行うことも考えられる。その他、例えばＥｘｐｒｅｓｓｈｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ （ＣＬＯＮＴＥＣＨ）中、５５℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行い、標識プローブを添加し、３７〜５５℃で１時間以上インキュベートし、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を１回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションや２度目の洗浄の際の温度を上げることにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。例えば、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの温度を６０℃、さらにストリンジェントな条件としては６８℃とすることができる。あるいは、０．１％ ＳＤＳを含む４×ＳＳＣ中４２℃でのハイブリダイゼーション、次いで０．１％ ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中２５℃（好ましくは、０．１％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中５０℃）での１時間の洗浄が挙げられる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を適宜設定することができる。
【００５５】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２^ｎｄ ｅｄ．』（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）；特にＳｅｃｔｉｏｎ９．４７−９．５８） 、『Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ』（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９８７−１９９７）；特にＳｅｃｔｉｏｎ６．３−６．４）、『ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １： Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ２^ｎｄ ｅｄ．』（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ （１９９５）；条件については特にＳｅｃｔｉｏｎ２．１０）等を参照することができる。ハイブリダイズするポリヌクレオチドとしては、配列番号１を含む核酸配列に対して少なくとも５０％以上、好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、より一層好ましくは９０％（例えば、９５％以上、さらには９９％）の同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。このような同一性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７： ２２６４−８； Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ５８７３−７）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいたプログラムとして、アミノ酸配列についての同一性を決定するプログラムとしてはＢＬＡＳＴＸ、ヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３−１０）等が開発されており、本発明の配列に対して使用することができる。具体的な解析方法については、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．等を参照することができる。
【００５６】
その他、遺伝子増幅技術（ＰＣＲ）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９８７） Ｓｅｃｔｉｏｎ ６．１−６．４）により、ラブコネクチン３βのアイソフォームやアレリック変異体等、ラブコネクチン３βと類似した構造及び機能を有する遺伝子を、配列番号１に記載の核酸配列を基にプライマーを設計し、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の動物のｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。
【００５７】
本発明のポリヌクレオチドの塩基配列の確認は、慣用の方法により配列決定することにより行うことができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９７７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７４： ５４６３）等により行うことができる。また、適当なＤＮＡシークエンサーを利用して配列を解析することも可能である。
【００５８】
＜ベクター＞
本発明により、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。本発明のベクターは、本発明のポリヌクレオチドを宿主細胞内に保持したり、該ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドを発現させたりするのに有用である。本ベクターには、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、クローニング用ベクター、発現ベクター等の種々のベクターが含まれる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２^ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９８７））。好ましい態様においては、ベクターを導入した宿主細胞内で本発明のポリヌクレオチドが発現されるように制御配列下に結合する。ここで「制御配列」とは、宿主細胞が原核生物であればプロモーター、リボソーム結合部位、及びターミネーターを含み、真核生物の場合は、プロモーター及びターミネーターであり、場合によってトランスアクチベーター、転写因子、転写物を安定化するポリＡシグナル、スプライシング及びポリアデニル化シグナル等が含まれる。このような制御配列は、それに連結されたポリヌクレオチドの発現に必要とされるすべての構成成分を含むものである。また、本発明のベクターは、好ましくは選択可能なマーカーを含む。さらに、細胞内で発現されたポリペプチドを小胞体内腔、グラム陰性菌を宿主とする場合ペリプラズム内、または細胞外へと移行させるために必要とされるシグナルペプチドを目的のポリペプチドに付加するようにして発現ベクターへ組み込むこともできる。さらに、必要に応じリンカーの付加、開始コドン（ＡＴＧ）、終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）の挿入を行ってもよい。
【００５９】
本発明のベクターは、好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは、目的とする宿主細胞内で発現ベクター中にコードされるポリペプチドを発現することができる構築物を指す。クローニングベクター、バイナリーベクター、インテグレイティングベクター等が本発明の発現ベクターに含まれる。発現の過程には、発現ベクター中のコード配列の翻訳可能なｍＲＮＡへの転写、及びｍＲＮＡから本発明のポリペプチドへの翻訳、さらに場合によっては発現されたポリペプチドの小胞体内腔、ペリプラズムまたは細胞外への分泌が含まれる。
【００６０】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるポリペプチドの発現を可能にするベクターとしては、ｐＢＥＳＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を例示することができる。また、Ｅ．ｃｏｌｉ等の原核細胞宿主における発現を可能にするプロモーターとしてはＰ_Ｌ、ａｒａＢ（Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０： １０４１−３）、ｌａｃＺ（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４１： ５４４−６； Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９９２） ＦＡＳＥＢ Ｊ． ６： ２４２２−７）、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃ（ｌａｃとｔｒｐの融合）等のプロモーターが挙げられる。また、ｔｒｐＡ由来、ファージ由来、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来ターミネーターが、利用可能である。さらに、大腸菌用のベクターは、好ましくはベクターを宿主内で増幅するための「ｏｒｉ」、及び形質転換された宿主を選抜するためのマーカー遺伝子を持つ。アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、及びクロラムフェニコール等の薬剤により宿主の判別を行うことを可能にする薬剤耐性遺伝子の使用が好ましい。特に、ポリペプチドをペリプラズムへ分泌させることを目的とする場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ ｅｔａｌ． （１９８７） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６９：４３７９）を使用することができる。例えば、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＧＦＰ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＥＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；この場合の宿主はＴ７ポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）等のベクターを挙げることができる。また、特にサブクローニングまたは切出し用のベクターとしては、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７等を例示できる。
【００６１】
大腸菌以外の細菌宿主用としては、バチルス属のものが挙げられ、ｐＵＢ１１０系、ｐｃ１９４系のベクターが例示される。より具体的に、枯草菌由来のｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０等を挙げることができる。その他、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ等のシュードモナス属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ等のブレビバクテリウム属（ｐＡＪ４３（Ｇｅｎｅ ３９： ２８１ （１９８５））等）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ等のコリネバクテリウム属（ｐＣＳ１１（特開昭５７−１８３７９９号公報； ｐＣＢ１０１（Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １９６：１７５ （１９８４））等）、ストレプトコッカス属（ｐＨＶ１３０１（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． ２６： ２３９ （１９８５））、ｐＧＫ１（Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５０： ９４ （１９８５））等）、ラクトバチルス属（ｐＡＭβ１（Ｊ． Ｂａｃｔｅｉｏｌ． １３７： ６１４ （１９７９））等）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ等のロドコッカス属（Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １３８： １００３ （１９９２））、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｅ等の ストレプトマイセス属（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｈｏｐｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （１９８５）参照；ｐＩＪ４８６（Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２０３： ４６８−７８ （１９８６））、ｐＫＣ１０６４（Ｇｅｎｅ １０３： ９７−９ （１９９１））、ｐＵＷＬ−ＫＳ（Ｇｅｎｅ １６５： １４９−５０ （１９９５）））の細菌を宿主とするベクター系が開発されている。微生物を宿主として利用できるベクターについては、『微生物学基礎講座８ 遺伝子工学』（共立出版）等の文献を参照することができる。ベクターを細菌宿主へ導入するための手法としては、塩化カルシウム法（Ｍａｎｄｅｌ ａｎｄ Ｈｉｇａ （１９７０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５３： １５８−６２； Ｈａｎａｈａｎ （１９８３） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １６６： ５５７−８０）、エレクトポレーション法等を採用することができる。
【００６２】
また、真核細胞宿主での発現を可能にする調節要素は、酵母を宿主とする場合には、ＡＯＸ１及びＧＡＬ１プロモーターが例示される。酵母由来の発現ベクターとしては、Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１等が例示できる。酵母で利用可能なベクターに関しては、Ａｄｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｅｎｇ． ４３： ７５−１０２ （１９９０）、Ｙｅａｓｔ ８： ４２３−８８ （１９９２）等に詳述されている。より具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等のサッカロマイセス属では、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系、ＹＣｐ系、及びＹＩｐ系ベクターが利用可能である。特に、多コピーの遺伝子導入が可能であり、安定に遺伝子を保持できるインテグレーションベクター（ＥＰ５３７４５６等）が有用である。その他、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ等のクルイベロマイセス属では、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来２μｍ系ベクター、ｐＫＤ１系ベクター（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １４５： ３８２−９０ （１９８１））、ｐＧＫ１１由来ベクター、クライベロマイセス自律増殖遺伝子ＫＡＲＳ系ベクター等、シゾサッカロマイセス属では、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ６： ８０ （１９８６）に記載のベクター、ｐＡＵＲ２２４（宝酒造）、チゴサッカロマイセスではｐＳＢ３（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３： ４２６７ （１９８５））由来ベクター、Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ等のピキア属ではＹｅａｓｔ ７： ４３１−４３ （１９９１）、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５： ３３７６ （１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５： ３８５９ （１９８７）等の文献記載のベクター、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ等のキャンディダ属では、特開平８−１７３１７０号公報記載のベクター、またＣ．ｍａｌｔｏｓａ由来のＡＲＳ（Ａｇｒｉ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ５１： １５８７ （１９８７））を利用したベクター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ等のアスペルギルス属では、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７： ２８３−７ （１９８９）記載のベクター、トリコデルマ属では菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーター（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７： ５９６−６０３ （１９８９））を利用したベクターが利用できる。
【００６３】
哺乳動物及びその他の動物細胞を宿主とする場合には、アデノウイルス後期プロモーター（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ９： ９４６）、ＣＡＧプロモーター（Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｇｅｎｅ １０８： １９３−２００）、ＣＭＶ 前初期プロモーター（Ｓｅｅｄ ａｎｄ Ａｒｕｆｆｏ （１９８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４： ３３６５−９）、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８： ５３２２； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｇｅｎｅ ９１： ２１７−２３）、ＨＳＶ ＴＫプロモーター、ＳＲαプロモーター（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８： ４６６）、ＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ． （１９７９） Ｎａｔｕｒｅ ２７７： １０８）、ＳＶ４０ ｅａｒｌｙプロモーター（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌ．３， Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９８２） ｐｐ．８３−１４１）、ＳＶ４０ ｌａｔｅプロモーター（Ｇｈｅｙｓｅｎ ａｎｄ Ｆｉｅｒｓ （１９８２） Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． １： ３８５−９４）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）−ＬＴＲプロモーター（Ｃｕｌｌｅｎ （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２： ６８４−７０４）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー、及びグロビンイントロン等を使用することができる。さらに、ネオマイシン、Ｇ４１８等の薬剤による判別を可能とする薬剤耐性遺伝子がベクターに含まれていることが好ましい。そして、細胞内で遺伝子のコピー数の増加を計る場合には、例えば核酸合成経路を欠損したＣＨＯを宿主とし、その欠損を補うＤＨＦＲ遺伝子を有するｐＣＨＯＩ等のベクターを採用し、メトトレキセート（ＭＴＸ）によりコピー数を増幅させることができる。一方、遺伝子の一過性発現のためには、ＳＶ４０のＴ抗原遺伝子を染色体上に有するＣＯＳ細胞を宿主とし、ｐｃＤ等のＳＶ４０の複製起点、またはアデノウイルス、ウシパピーローマウイルス（ＢＰＶ）、ポリオーマウイルス等の複製開始点を持つベクターを使用することができる。さらに、遺伝子コピー数の増幅のための選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）等をコードする遺伝子を含んでもよい。適当なベクターとして、例えば、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇの発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８（Ｎａｔｕｒｅ ３２９： ８４０−２ （１９８７））、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １： ８５４−６４ （１９８１））、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８： ５３２２ （１９９０））、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３、ｐＭＥ１８Ｓ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ８： ４６６−７２ （１９８８））等が公知である。
【００６４】
特に動物の生体内において本発明のポリヌクレオチドを発現させるためには、ｐＡｄｅｘｌｃｗ等のアデノウイルスベクター、ｐＺＩＰｎｅｏ等のレトロウイルスベクターが挙げられる。ベクターはアデノウイルス法、エレクトポレーション（電気穿孔）法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３： １３３ （１９９０））、カチオニックリポソーム法（カチオニックリポソームＤＯＴＡＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）等）、正電荷ポリマーによる導入法、静電気型リポソーム（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｔｙｐｅ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）法、内包型リポソーム（ｉｎｔｅｒｎａｌｔｙｐｅ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）法、パーティクルガンを用いる方法、リポソーム法、リポフェクション（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４： ７４１３ （１９８７））、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、レセプター介在遺伝子導入法、レトロウイルス法、ＤＥＡＥデキストラン法、ウイルス−リポソーム法（別冊実験医学『遺伝子治療の基礎技術』羊土社（１９９７）；別冊実験医学『遺伝子導入＆発現解析実験法』羊土社（１９９７）； Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９３： １４５８−６４ （１９９４）； Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７１： Ｒ１２１２−２０ （１９９６）； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３０： １４４０−８ （１９９３）； 実験医学 １２： １８２２−６ （１９９４）； 蛋白質核酸酵素 ４２： １８０６−１３ （１９９７）； Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９２（Ｓｕｐｐｌ．ＩＩ）： ４７９−８２ （１９９５））、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法等により宿主に導入することができる。アデノウイルス及びレトロウイルス以外由来のウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、トガウイルス、パラミクソウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス等を元に作製されたベクターを利用することもできる。生体内への投与は、ｅｘ ｖｉｖｏ法でもｉｎ ｖｉｖｏ法で行ってもよい。
【００６５】
その他、昆虫発現システムも異種ポリペプチドを発現させる系として知られており、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ核ポリへドロシスウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとし、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞、またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｌａｒｖａｅ細胞中で外来遺伝子を発現させることができる。この際、目的とする外来遺伝子は、ウイルスの非必須領域にクローニングする。例えば、ポリヘドリンプロモーター制御下に連結してもよい。この場合、ポリへドリン遺伝子は不活化され、コート蛋白質を欠く組換えウイルスが産生され、該ウイルスに感染したＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａまたはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｌａｒｖａｅ等の細胞中で目的とするポリペプチドが発現される（Ｓｍｉｔｈ （１９８３） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ４６： ５８４； Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１： ３２２４−７）。その他、昆虫細胞由来の発現ベクターとして、Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｇｃｏ ＢＲＬ）、ｐＢａｃＰＡＫ８等も公知である。
【００６６】
植物細胞を宿主とする場合には、例えばカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター等を利用したベクターが使用可能である。植物細胞へのベクターの導入法としては、ＰＥＧ法、エレクトポーレション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法等が公知である。
【００６７】
ベクターへのＤＮＡの挿入は、制限酵素サイトを利用したリガーゼ反応により行うことができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７） Ｓｅｃｔｉｏｎ １１．４−１１．１１； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２^ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （１９８９） Ｓｅｃｔｉｏｎ ５．６１−５．６３）。
【００６８】
＜形質転換体＞
本発明の形質転換体は、本発明のポリヌクレオチドにより宿主を形質転換して得られる形質転換体であり、本発明の蛋白質を発現する。
【００６９】
＜宿主＞
本発明により、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主が提供される。本発明のポリペプチドの製造には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの産生系が考えられる。本発明の宿主には、古細菌、細菌、真菌類、植物、昆虫、魚類、両生類、ハ虫類、鳥類、哺乳類由来の原核及び真核細胞が含まれる。本発明の宿主は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞内に含むものである。該ポリヌクレオチドは、宿主細胞のゲノム上の天然に存在する位置になければよく、該ポリヌクレオチド自身のプロモーター支配下にあっても、ゲノム中に組み込まれていても、染色体外の構造として保持されていても良い。
【００７０】
細菌宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＪＭ１０９， ＤＨ５α， ＨＢ１０１， ＸＬ１Ｂｌｕｅ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ等、エシェリシア属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、セラチア属、バシルス属等に属するのグラム陽性及びグラム陰性細菌を例示することができる。
【００７１】
真核宿主には、酵母等の真菌類、高等植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ由来細胞）、昆虫（ドロソフィラＳ２、スポロドプテラＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５）、魚類、両生類（アフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｎａｔｕｒｅ ２９１： ３５８−４０））、ハ虫類、鳥類、哺乳類（ＣＨＯ（Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １０８： ９４５ （１９９５）； 中でもＤＨＦＲ遺伝子欠損ｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７： ４２１６−２０ （１９８０）及びＣＨＯ Ｋ−１（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ６０： １２７５ （１９６８））が好適である）、ＣＯＳ、Ｈｅｌａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞）、ミエローマ、Ｖｅｒｏ、Ｎａｍａｌｗａ、Ｎａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９号公報）、植物（ジャガイモ、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、ダイズ、トマト、コムギ、オオムギ、ライ麦、アルファルファ、亜麻等）等の細胞が含まれる。真菌類としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ属等の酵母に加えて、糸状菌のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ等の細胞を宿主とした発現系も公知である。
【００７２】
宿主細胞へのベクターの導入は、エレクトポレーション法（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ． （１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５： １３１１−２６）、カチオニックリポソーム法、電気パルス穿孔法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９８７） Ｓｅｃｔｉｏｎ ９．１−９．９）、微小ガラス管を使用した直接注入法、マイクロインジェクション法、リポフェクション（Ｄｅｒｉｊａｒｄ （１９９４） Ｃｅｌｌ ７： １０２５−３７； Ｌａｍｂ （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５： ２２−３０； Ｒａｂｉｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９： ２３０−４）、リポフェクタミン法（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）、リン酸カルシウム法（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ （１９８７） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７： ２７４５−５２）、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｌｏｐａｔａ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２： ５７０７−１７； Ｓｕｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｍｉｌｍａｎ （１９８５） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４： １６４２−３）、ＦｕＧｅｎｅ６試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）等により行い得る。
【００７３】
本発明の製造法は、本発明の蛋白質すなわちラブコネクチン３結合蛋白質の製造法であり、本発明の形質転換体を培養し、該形質転換体が発現したラブコネクチン３結合蛋白質を培養物から採取することを含む。より具体的には前述の＜蛋白質の製造＞に記載した方法を用いることができる。
【００７４】
ラブコネクチン３βとラブコネクチン３αは、抗ラブコネクチン３α抗体および抗ラブコネクチン３β抗体のいずれを用いても共免疫沈降される。両タンパクは、０．５ Ｍ ＮａＣｌまたは１％ ＣＨＡＰＳ存在下では互いから分離しないが、１ Ｍ ＮａＣｌ存在下で一部が、１％デオキシコレート存在下では完全に分離する。さらに、これらの二つのタンパクは、シナプス小胞に共存する。これらの結果は、ラブコネクチン３αと３βとがサブユニット構造を構成することを示している。
【００７５】
ラブコネクチン３αは膜貫通部分を持たないが、シナプス小胞と結合することが示されている（上記非特許文献１）。ラブコネクチン３αは、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００やＮＰ−４０の様な界面活性剤の存在下で小胞から分離することから、この蛋白質はシナプス小胞の表在性膜蛋白質の一つであることが示唆される。同様に、ラブコネクチン３βは膜貫通部分を持たず、同じ状況下で小胞から分離することから、この蛋白質もまた、シナプス小胞の表在性膜蛋白質の一つであることが示唆される。
【００７６】
ラブコネクチン３βは直接Ｒａｂ３ ＧＥＰに化学量論的に結合するが、ラブコネクチン３αは結合しない。ラブコネクチン３αと３βの複合体は直接Ｒａｂ３ ＧＥＰに結合するが、化学量論的にはこの結合はラブコネクチン３βのものよりもずっと小さいことから、３αと３βとの相互作用が、Ｒａｂ３ ＧＥＰが複合体に結合しない様にその結合部位を隠すことが示唆される。対照的に、ラブコネクチン３α、３β、およびそれらの複合体のいずれもＲａｂ３ ＧＡＰに結合しないことから、ラブコネクチン３βは間接的に、おそらくは未同定の分子を介して、Ｒａｂ３ ＧＡＰに結合すると示唆される。
【００７７】
なお、ラブコネクチン３およびＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質は、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２， ３８７５−３８７８（１９９７）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７３， ２４７８１−２４７８５、特開平１０−２１０９７１号公報等に記載されているようにして得ることができる。
【００７８】
＜プローブ＞
本発明により、本発明のポリヌクレオチドに対するプローブが提供される。本発明のプローブは、本発明のポリヌクレオチドに相補的な、少なくとも１５ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドからなる。ここで「相補的な配列」とは、ヌクレオチド配列中の少なくとも１５個の連続した塩基が鋳型に対して完全に対になっている場合のみならず、そのうちの少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９７％または９９％）が対になっているものも含む。対になっているとは、鋳型となるポリヌクレオチドの塩基配列中のＡに対しＴ（ＲＮＡの場合はＵ）、ＴまたはＵに対しＡ、Ｃに対しＧ、そしてＧに対しＣが対応して鎖が形成されていることを意味する。そして相同性は、上述のハイブリダイズするポリヌクレオチドの場合と同様の方法で決定することができる。本発明のプローブは、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドの一部の、連続してなる少なくとも１５ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドからなる。本発明のプローブを用いることにより、本発明のポリヌクレオチドを検出または単離することができる。また、本発明の蛋白質をコードする遺伝子発現を解析することができる。さらには、発現の局在を解析することができる。測定するサンプルは、臓器、組織、細胞等である。
【００７９】
プローブを用いる本発明のポリヌクレオチドの解析または本発明の蛋白質をコードする遺伝子の解析は、プローブを被検ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせることにより行うことができ、通常には、プローブを被検ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせ、生じたハイブリッドを検出し、その検出結果を解析することにより行われる。検出結果の解析には、ポリヌクレオチドまたは遺伝子の測定（検出、定量を含む）、ポリヌクレオチドまたは遺伝子の局在の検出が含まれる。被検ポリヌクレオチドは、被検組織または被検細胞中に存在するものであってもよい。
【００８０】
＜プライマー＞
本発明により、本発明のポリヌクレオチドに対するプライマーが提供される。このような本発明のプライマーは、本発明のポリヌクレオチドに相補的な、少なくとも１５ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドからなり、本発明のポリヌクレオチドを検出または増幅するために利用することができる。通常、プライマーとして使用する場合には１５〜１００、好ましくは１５〜３５個の塩基より構成されていることが望ましく、プライマーとして使用する場合には、少なくとも１５、好ましくは３０個の塩基より構成されていることが望ましい。プライマーの場合には、３’末端側の領域を標的とする配列に対して相補的な配列に、５’末端側には制限酵素認識配列、タグ等を付加した形態に設計することができる。本発明のプライマーは、本発明のポリヌクレオチドに対してハイブリダイズすることができる。本発明のプライマーは、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドの一部の、連続してなる少なくとも１５ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドからなる。本発明のプライマーを用いることにより、本発明のポリヌクレオチドを検出または単離することができる。また、本発明の蛋白質をコードする遺伝子発現を解析することができる。さらには、発現の局在を解析することができる。測定するサンプルは、臓器、組織、細胞等である。これらのプライマーを用いて、ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅できることは言うまでもない。また、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、サンプル中のｍＲＮＡを定量することもできる。
【００８１】
プライマーを用いる本発明のポリヌクレオチドの解析または本発明の蛋白質をコードする遺伝子の解析は、プライマーを被検ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせることにより行うことができ、通常には、プライマーを被検ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせることによりポリヌクレオチドの増幅を行い（すなわち被検ポリヌクレオチド（必要により逆転写を行う）をテンプレートとし、プライマーを用いてＰＣＲを行い）、増幅産物を検出し、その検出結果を解析することにより行われる。検出結果の解析には、ポリヌクレオチドまたは遺伝子の測定（検出、定量を含む）、ポリヌクレオチドまたは遺伝子の局在の検出が含まれる。被検ポリヌクレオチドは、被検組織または被検細胞中に存在するものであってもよい。
【００８２】
＜アンチセンス＞
本発明により、本発明のポリヌクレオチドに対するアンチセンスポリヌクレオチドが提供される。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの細胞内における発現をｍＲＮＡまたはＤＮＡに対して結合することにより抑制するものである。
【００８３】
アンチセンスが標的遺伝子の発現抑制作用の機構としては、（１）３重鎖形成による転写開始阻害、（２）ＲＮＡポリメラーゼにより形成される局所的開状ループ構造部位とのハイブリッド形成による転写抑制、（３）合成中のＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、（４）イントロン−エキソン接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング抑制、（５）スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、（６）ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による、ｍＲＮＡの細胞質への移行抑制、（７）キャッピング部位またはポリＡ付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、（８）翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、（９）リボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、（１０）ｍＲＮＡ翻訳領域またはポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長抑制、並びに（１１）核酸と蛋白質の相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制が挙げられる（平島及び井上『新生化学実験講座２ 核酸ＩＶ 遺伝子の複製と発現』日本生化学会編、東京化学同人、ｐｐ．３１９−３４７ （１９９３））。
【００８４】
本発明のヌクレオチド鎖に含まれるアンチセンスポリヌクレオチドは、上述の（１）〜（１１）のどの機構により遺伝子発現を抑制するポリヌクレオチドであってもよく、即ち、発現を阻害する目的の遺伝子の翻訳領域のみならず、非翻訳領域の配列に対するアンチセンス配列を含むものであってもよい。アンチセンスポリヌクレオチドをコードするＤＮＡは、その発現を可能とする適当な制御配列下に連結して使用され得る。アンチセンスポリヌクレオチドは、標的とする遺伝子の翻訳領域または非翻訳領域に対して完全に相補的である必要はなく、効果的に該遺伝子の発現を阻害するものであればよい。このようなアンチセンスポリヌクレオチドとしは、少なくとも１５ｂｐ以上、好ましくは１００ｂｐ以上、さらに好ましくは５００ｂｐ以上であり通常３０００ｂｐ以内、好ましくは２０００ｂｐ以内、より好ましくは１０００ｂｐ以内の鎖長を有し、標的遺伝子の転写産物の相補鎖に対して好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上同一である。このようなアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドを基に、ホスホロチオネート法（Ｓｔｅｉｎ （１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６： ３２０９−２１）等により調製することができる。
【００８５】
＜リボザイム＞
本発明により、本発明のポリヌクレオチドに対するリボザイムが提供される。本発明のリボザイムは、本発明のポリヌクレオチドの細胞内における発現をｍＲＮＡまたはＤＮＡに対して結合することにより抑制するものである。
【００８６】
リボザイムとは、ＲＮＡを構成成分とする触媒の総称であり、大きくラージリボザイム（ｌａｒｇｅ ｒｉｂｏｚｙｍｅ）及びスモールリボザイム（ｓｍａｌｌ ｌｉｂｏｙｍｅ）に分類される。ラージリボザイムは、核酸のリン酸エステル結合を切断し、反応後に５’−リン酸と３’−ヒドロキシル基を反応部位に残す酵素である。ラージリボザイムは、さらに（１）グアノシンによる５’−スプライス部位でのトランスエステル化反応を行うグループＩイントロンＲＮＡ、（２）自己スプライシングをラリアット構造を経る二段階反応で行うグループＩＩイントロンＲＮＡ、及び（３）加水分解反応によるｔＲＮＡ前駆体を５’側で切断するリボヌクレアーゼＰのＲＮＡ成分に分類される。それに対して、スモールリボザイムは、比較的小さな構造単位（４０ｂｐ程度）であり、ＲＮＡを切断して、５’−ヒドロキシル基と２’−３’環状リン酸を生じさせる。スモールリボザイムには、ハンマーヘッド型（Ｋｏｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ． （１９８８） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２２８： ２２５）、ヘアピン型（Ｂｕｚａｙａｎ （１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２３： ３４９； Ｋｉｋｕｃｈｉ ａｎｄ Ｓａｓａｋｉ （１９９２） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９： ６７５１； 菊地洋（１９９２）化学と生物 ３０： １１２）等のリボザイムが含まれる。リボザイムは、改変及び合成が容易になため多様な改良方法が公知であり、例えば、リボザイムの基質結合部を標的部位の近くのＲＮＡ配列と相補的となるように設計することにより、標的ＲＮＡ中の塩基配列ＵＣ、ＵＵまたはＵＡを認識して切断するハンマーヘッド型リボザイムを作ることができる（Ｋｏｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ． （１９８８） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２２８： ２２５； 小泉誠及び大塚栄子（１９９０）蛋白質核酸酵素３５： ２１９１； Ｋｏｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７： ７０５９）。ヘアピン型のリボザイムについても、公知の方法に従って設計、製造が可能である（Ｋｉｋｕｃｈｉ ａｎｄ Ｓａｓａｋｉ （１９９２） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９： ６７５１； 菊地洋（１９９２）化学と生物 ３０： １１２）。
【００８７】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド及びリボザイムは、細胞内における遺伝子の発現を制御するために、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等のウイルス由来のベクター、リポソーム等を利用した非ウイルスベクター、またはｎａｋｅｄ ＤＮＡとしてｅｘ ｖｉｖｏ法またはｉｎ ｖｉｖｏ法により遺伝子治療に用いることもできる。
【００８８】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド及びリボザイムの塩基配列の確認は、上述のポリヌクレオチドと同様の方法により行うことができる。
【００８９】
＜ＲＮＡ干渉＞
本発明により、本発明のポリヌクレオチドに対してＲＮＡ干渉により切断する二本鎖ＲＮＡが提供される。本発明の二本鎖ＲＮＡは、本発明のポリヌクレオチドの細胞内における発現をｍＲＮＡに対して結合し、酵素的に切断されることにより抑制するものである （Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９１： ８０６−８１１； 森田 隆ら． （２００２） 蛋白質 核酸 酵素 ４７： １９３９−１９４５）。
【００９０】
本発明の二本鎖ＲＮＡは、細胞内における遺伝子の発現を制御するために、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等のウイルス由来のベクター、リポソーム等を利用した非ウイルスベクター、またはｎａｋｅｄ ＤＮＡとしてｅｘ ｖｉｖｏ法またはｉｎ ｖｉｖｏ法により遺伝子治療に用いることもできる。
【００９１】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイムおよび本発明のポリヌクレオチドに対してＲＮＡ干渉により切断する二本鎖ＲＮＡは、本発明の蛋白質をコードするｍＲＮＡを減少させることができる。従って、本発明の蛋白質を減少させることができる。また、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイムおよび本発明のポリヌクレオチドに対してＲＮＡ干渉により切断する二本鎖ＲＮＡは、ラブコネクチン３結合蛋白質の阻害試薬として機能するため、本発明の蛋白質の機能解析試薬として有用である。
【００９２】
本発明において、ラブコネクチン３結合蛋白質がシナプスに局在することが確認されたこと、ラブコネクチン３およびＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質に結合することが確認されたことから、シナプス小胞の輸送の制御に関与していると考えられるので、ラブコネクチン３結合蛋白質を阻害する物質は、シナプス小胞の輸送の異常が原因と考えられる疾患、例えば、知的障害（精神遅滞）、注意欠陥多動障害、自閉性障害、学習障害などに関与している可能性が考えられる。従って、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイムおよび本発明のポリヌクレオチドに対してＲＮＡ干渉により特異的に切断する二本鎖ＲＮＡは、本発明の蛋白質に阻害作用を有するこれら疾患の治療剤の有効成分として使用できると考えられる。
【００９３】
＜抗体＞
本発明により、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド断片に対する抗体が提供される。本発明の抗体にはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ｌａ． （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８５： ５８７９−８３； Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ， ｖｏｌ．１１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ （１９９４） ｐｐ．２６９−３１５）、ヒト化抗体、多特異性抗体（ＬｅＤｏｕｓｓａｌ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ． ７： ５８−６２； Ｐａｕｌｕｓ （１９８５） Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ． Ｍｉｔｔ． ７８： １１８−３２； Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ （１９８３） Ｎａｔｕｒｅ ３０５： ５３７−９； Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ （１９８６） Ｒｅｖ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １０５： １７６−２６０； Ｖａｎ Ｄｉｊｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ４３： ９４４−９）、並びに、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｖ等の抗体断片が含まれる。さらに、本発明の抗体は必要に応じ、ＰＥＧ等により修飾されていてもよい。その他、本発明の抗体は、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合蛋白質、ＧＳＴ、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）等との融合蛋白質として製造され得、二次抗体を用いずに検出できるようにしてもよい。また、ビオチン等により抗体を標識することによりアビジン、ストレプトアビジン等を用いて抗体の回収を行い得るように改変されていてもよい。
【００９４】
本発明の抗体は、本発明のポリペプチド若しくはその断片、またはそれらを発現する細胞を感作抗原として製造することができる。また、本発明のポリペプチド若しくはその断片のうち短いものは、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、卵白アルブミン等のキャリアに結合して免疫原として用いてもよい。また、本発明のポリペプチドまたはその断片と共に、アルミニウムアジュバント、完全（または不完全）フロイントアジュバント、百日咳菌アジュバント等の公知のアジュバントを抗原に対する免疫応答を強化するために用いてもよい。
【００９５】
ポリクローナル抗体は、例えば、本発明のポリペプチドまたはその断片を所望によりアジュバントと共に哺乳動物に免疫し、免疫した動物より血清を得る。ここで用いる哺乳動物は、特に限定されないが、ゲッ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が一般的である。マウス、ラット、ハムスター等のゲッ歯目、ウサギ等のウサギ目、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等のサル等の霊長目の動物が挙げられる。動物の免疫化は、感作抗原をＰｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）または生理食塩水等で適宜希釈、懸濁し、必要に応じアジュバントを混合して乳化した後、動物の腹腔内または皮下に注射して行われる。その後、好ましくは、フロイント不完全アジュバントに混合した感作抗原を４〜２１日毎に数回投与する。抗体の産生は、血清中の所望の抗体レベルを慣用の方法により測定することにより確認することができる。最終的に、血清そのものをポリクローナル抗体として用いても良いし、さらに精製して用いてもよい。具体的な方法として、例えば、『Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ』（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９８７） Ｓｅｃｔｉｏｎ １１．１２−１１．１３）を参照することができる。
【００９６】
モノクローナル抗体を産生するためには、まず、上述のようにして免疫化した動物より脾臓を摘出し、該脾臓より免疫細胞を分離し、適当なミエローマ細胞とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等を用いて融合してハイブリドーマを作成する。細胞の融合は、Ｍｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｇａｌｆｒｅ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （１９８１） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３： ３−４６）に準じて行うことができる。ここで、適当なミエローマ細胞として特に、融合細胞を薬剤により選択することを可能にする細胞を挙げられる。このようなミエローマを用いた場合、融合されたハイブリドーマは、融合された細胞以外は死滅するヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養液（ＨＡＴ培養液）で培養して選択する。次に、作成されたハイブリドーマの中から、本発明のポリペプチドまたはその断片に対して結合する抗体を産生するクローンを選択する。その後、選択したクローンをマウス等の腹腔内に移植し、腹水を回収してモノクローナル抗体を得る。また、具体的な方法として、『Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ』（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９８７） Ｓｅｃｔｉｏｎ １１．４−１１．１１）を参照することもできる。
【００９７】
ハイブリドーマは、その他、最初にＥＢウイルスに感染させたヒトリンパ球をｉｎｖｉｔｒｏで免疫原を用いて感作し、感作リンパ球をヒト由来のミエローマ細胞（Ｕ２６６等）と融合し、ヒト抗体を産生するハイブリドーマを得る方法（特開昭６３−１７６８８号公報）によっても得ることができる。また、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物を感作して製造した抗体産生細胞を用いても、ヒト抗体を得ることができる（ＷＯ９２／０３９１８； ＷＯ９３／０２２２７； ＷＯ９４／０２６０２； ＷＯ９４／２５５８５；ＷＯ９６／３３７３５； ＷＯ９６／３４０９６； Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５： １４６−５６等）。ハイブリドーマを用いない例としては、抗体を産生するリンパ球等の免疫細胞に癌遺伝子を導入して不死化する方法が挙げられる。
【００９８】
また、遺伝子組換え技術により抗体を製造することもできる（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ ａｎｄ Ｌａｒｒｉｃｋ （１９９０） Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ ＬＴＤ．， ＵＫ参照）。そのためには、まず、抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマまたは抗体産生細胞（感作リンパ球等）からクローニングする。得られた遺伝子を適当なベクターに組み込み、宿主に該ベクターを導入し、宿主を培養することにより抗体を産さ生させる。このような組換え型の抗体も本発明の抗体に含まれる。代表的な組換え型の抗体として、非ヒト抗体由来可変領域及びヒト抗体由来定常領域とからなるキメラ抗体、並びに非ヒト抗体由来相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び、ヒト抗体由来フレームワーク領域（ＦＲ）及び定常領域とからなるヒト化抗体が挙げられる（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２１： ５２２−５； Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３２： ３２３−９； Ｐｒｅｓｔａ （１９９２） Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２： ５９３−６； Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０３： ９９−１２１ （１９９１））。
【００９９】
本発明の抗体断片は、上述のポリクローナルまたはモノクローナル抗体をパパイン、ペプシン等の酵素で処理することにより製造し得る。または、抗体断片をコードする遺伝子を用いて遺伝子工学的に製造することも可能である（Ｃｏ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２： ２９６８−７６； Ｂｅｔｔｅｒ ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ （１９８９） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １７８： ４７６−９６； Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ （１９８９） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １７８： ４９７−５１５； Ｌａｍｏｙｉ （１９８６） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １２１： ６５２−６３； Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ ｅｔ ａｌ． （１９８６） １２１： ６６３−９； Ｂｉｒｄ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ （１９９１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９： １３２−７参照）。
【０１００】
本発明の多特異性抗体には、二特異性抗体（ＢｓＡｂ）、ダイアボディ（Ｄｂ）等が含まれる。多特異性抗体は、（１）異なる特異性の抗体を異種二機能性リンカーにより化学的にカップリングする方法（Ｐａｕｌｕｓ （１９８５） Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ． Ｍｉｌｌ． ７８： １１８−３２）、（２）異なるモノクローナル交代を分泌するハイブリドーマを融合する方法（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ （１９８３） Ｎａｔｕｒｅ ３０５： ５３７−９）、（３）異なるモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖遺伝子（４種のＤＮＡ）によりマウス骨髄腫細胞等の真核細胞発現系をトランスフェクションした後、二特異性の一価部分を単離する方法（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ （１９８６） Ｒｅｖ． Ｐｈｙｓｉｏ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １０５： １７６−２６０； Ｖａｎ Ｄｉｊｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ４３： ９４４−９）等により作製することができる。一方、Ｄｂは遺伝子融合により構築され得る二価の２本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーの抗体断片であり、公知の手法により作製することができる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ６４４４−８； ＥＰ４０４０９７； ＷＯ９３／１１１６１参照）。
【０１０１】
抗体及び抗体断片の回収及び精製は、プロテインＡ及びＧを用いて行う他、＜ポリペプチドの製造＞の項で詳細に記載した蛋白質精製技術によっても行い得る（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８８））。例えば、本発明の抗体の精製にプロテインＡを利用する場合、Ｈｙｐｅｒ Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等のプロテインＡカラムが公知であり、使用可能である。得られた抗体の濃度は、その吸光度を測定することにより、または酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）等により決定することができる。
【０１０２】
抗体の抗原結合活性は、吸光度測定、蛍光抗体法、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ等により測定することができる。ＥＬＩＳＡ法により測定の場合、本発明の抗体をプレート等の担体に固相化し、次いで本発明のポリペプチドを添加した後、目的とする抗体を含む試料を添加する。ここで、抗体を含む試料としては、抗体産性細胞の培養上清、精製抗体等が考えられる。続いて、本発明の抗体を認識する二次抗体を添加し、プレートのインキュベーションを行う。その後、プレートを洗浄し、二次抗体に付加された標識を検出する。即ち、二次抗体がアルカリフォスファターゼで標識されている場合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸等の酵素基質を添加して吸光度を測定することで、抗原結合活性を測定することができる。また、抗体の活性評価に、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の市販の系を使用することもできる。
【０１０３】
本発明の抗体は、ラブコネクチン３結合蛋白質の検出試薬として用いることができる。つまり、本発明の抗体を用いて、免疫組織学的な解析方法を行うことができ、したがって、本発明は、免疫組織学的な解析方法、例えば、蛋白質の発現量を解析する方法、蛋白質の局在を解析する方法を提供する。免疫組織学的な解析方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ法、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法、フローサイトメトリー、免疫組織化学染色等があげられる。また、本発明のポリペプチド及びその断片の精製に使用することができる。
【０１０４】
本発明においてラブコネクチン３結合蛋白質がシナプスに局在することが確認されたことから、ラブコネクチン３結合蛋白質をシナプスのマーカーとして、本発明の抗体を用いた検出を行うこともできる。従って、本発明の抗体は、必要に応じシナプス検出試薬として用いることができる。また、本発明の蛋白質は、ラブコネクチン３およびＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質に結合することが確認されたことから、本発明の抗体は、これらの検出にも用いることができる。
【０１０５】
＜本発明のスクリーニング法＞
本発明の蛋白質は、ラブコネクチン３およびＲａｂ３ ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質に結合する。従って、本発明の蛋白質は、これらの結合を増加または減少させる物質のスクリーニングに用いることができる。本発明の蛋白質はヒト由来のものであるが、この用途には、ラットなどの他種に存在する同活性を有する異種相同蛋白質も本発明の蛋白質と同様に使用できる。従って、本発明の蛋白質またはその異種相同蛋白質であるラブコネクチン３結合蛋白質と、ラブコネクチン３との結合を促進する物質または阻害する物質の候補物質のスクリーニング方法であって、ラブコネクチン３結合蛋白質と、ラブコネクチン３とを前記候補物質の存在下および非存在下で反応させ、前記結合を増加または減少させる前記候補物質を選択することを含む前記方法、ならびに、本発明の蛋白質またはその異種相同蛋白質であるＲａｂ３ ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質結合蛋白質と、Ｒａｂ３ ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質との結合を促進する物質または阻害する物質の候補物質のスクリーニング方法であって、Ｒａｂ３ ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質結合蛋白質とＲａｂ３ ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質とを前記候補物質の存在下および非存在下で反応させ、前記結合を増加または減少させる前記候補物質を選択することを含む前記方法が提供される。
【０１０６】
ラブコネクチン３結合蛋白質とラブコネクチン３との結合、および、Ｒａｂ３ ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質結合蛋白質とＲａｂ３ ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質との結合の測定は、蛋白質相互間の結合を測定する公知の方法に従って行うことができる。
【０１０７】
本発明の蛋白質およびその異種相同蛋白質は、ｐ１６０は神経伝達物質放出等のシナプス小胞の輸送の制御に関与していると考えられるので、このように選択されたこれらの結合を促進または阻害する物質は、シナプス小胞の輸送の異常が原因となる疾患（例えば、知的障害（精神遅滞）、注意欠陥多動障害、自閉性障害、学習障害）の治療剤の有効成分として使用できると考えられる。
【０１０８】
このような治療剤（医薬）は、スクリーニングにより選択された物質（有効成分）を、製剤化することにより製造できる。製剤化は、選択された物質の種類、製剤の形態等により適宜、通常の方法に従って行うことができる。医薬は、有効成分と医薬的に許容な可能な担体との医薬組成物としてもよい。
【０１０９】
【実施例】
本発明を下記実施例により更に詳しく説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
【０１１０】
【実施例１】
（１）Ｒａｂ３ ＧＥＰと共免疫沈降されたラット蛋白質の取得
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７７， ９６２９−９６３２ （２００２）に記載された方法に従って、ラット脳のＣＳＶ画分抽出物に対して抗Ｒａｂ３ ＧＥＰ抗体を用いて共免疫沈降を行い、沈降物に対して電気泳動を行った。具体的には以下のように行った。この文献に記載のようにラット脳からＣＳＶ画分を調製した。画分を、バッファーＡ（２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）， １ ｍＭ ＥＤＴＡ， １ ｍＭ ＤＴＴ， ０．８％ ｎ−オクチルグルコピラノシド）を用いて抽出し、抽出物（各２ ｍｇのタンパク）を、抗Ｒａｂ３ ＧＥＰ抗体を固定したプロテインＡセファロースビーズ（２０μｌ湿重量）と共に４℃で一晩静置した。バッファーＡでビーズを完全に洗浄した後、結合した蛋白質を、ビーズをＳＤＳサンプルバッファー（６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ （ｐＨ ６．７）， ３％ ＳＤＳ， ２％ （ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール，５％グリセロール）中で煮沸して抽出した。抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、蛋白質染色を行った。この結果、ラブコネクチン３（バンドＮｏ．１）、ｐ１６０（バンドＮｏ．３）そしてｐ６０（バンドＮｏ．４）の他に、Ｒａｂ３ ＧＥＰと共免疫沈降されたふたつのタンパク（バンドＮｏ．２）が検出された（図１のＡ）。
【０１１１】
Ｎｏ．３バンドをゲルから切り出してトリプシンで消化し、そしてそのペプチドを質量分析にかけた。コンピューターデーターベース検索により、ｐ１６０がヒトｃＤＮＡ断片（ＫＩＡＡ０５４１， ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０１１１１３）から推定されるアミノ酸配列を含むことが明らかになった。
【０１１２】
なお、下記（５）に示すように、ｐ１６０はラブコネクチン３と複合体を形成することが判明したので、以下、ｐ１６０をラブコネクチン３β、ラブコネクチン３をラブコネクチン３αと呼ぶ。
【０１１３】
（２）分子クローニングと一次構造決定
ＫＩＡＡ０５４１ ｃＤＮＡは、約３．５ｋｂのコーディング領域とインフレーム停止コドンを含むが、予想される開始コドンを欠いていた。また、ＫＩＡＡ０５４１ ｃＤＮＡの配列はヒトゲノムのＢＡＣクローンに含まれていた（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣ００７０５２およびＡＣ００８００６）。この情報を基礎として、ヒトラブコネクチン３β ｃＤＮＡの５’末端を得るためにＰＣＲを行った。具体的には以下のように行った。ＡＴＧ ＧＣＡ ＧＧＡ ＡＡＣ ＡＧＣ ＣＴＴ ＧＴＴ ＣＴＡ ＣＣＣ ＡＴＴ ＧＴＴ Ｃ（配列番号３）／ＧＴＴ ＧＴＣ ＡＴＴ ＧＣＣ ＡＧＣ ＣＣＴ ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＴＴ ＣＣＣ（配列番号４）の配列を有するプライマーセットを設計した。ｃＤＮＡ断片を、ヒト心臓ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）からこれらのプライマーを用いて増幅した。ＰＣＲ産物はｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローンした。ＤＮＡシークエンシングを、ジデオキシ核酸ターミネーション法により、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩＰＲＩＳＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ， ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。この結果、約１．０ｋｂのコーディング領域と予想される開始コドンを含むｃＤＮＡ断片を得た。
【０１１４】
ヒトラブコネクチン３βｃＤＮＡの全長が、このｃＤＮＡ断片をＫＩＡＡ０５４１ ｃＤＮＡにライゲーションすることで得られた（配列番号１）。コードされる蛋白質は１，４９０アミノ酸からなり、計算上の分子量は１６３，８０８であった（配列番号２）。ヒトラブコネクチン３βは７つのＷＤドメインを含んでいた（図１のＢ）。ライゲートしたｃＤＮＡがヒトラブコネクチン３βの全長をコードするかどうかを確認するため、このｃＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、続いて抗ラブコネクチン３β抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った。具体的には以下のように行った。ｐＣＭＶＦａラブコネクチン３β（下記（３）参照）をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、その細胞の溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ポリアクリルアミドゲル）にかけ、続いて抗ラブコネクチン３β−１抗体（下記（３）参照）を用いたウエスタンブロッティングが行われた。対照としてＨＥＫ２９３細胞溶解液とラット脳ホモジェネートを、同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、続いてウエスタンブロッティングを行った。この結果、分子量約１６０ｋＤａのタンパクが検出された（図１のＣ）。図１のＣ中、各レーンは以下の通りである。レーン１，対照ＨＥＫ２９３細胞（１μｇ蛋白質）、レーン２，ｐＣＭＶＦａラブコネクチン３βをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞（１μｇ蛋白質）、レーン３，ラット脳のホモジェネート（２０μｇ蛋白質）。
【０１１５】
この分子量は、ラット脳由来の天然のラブコネクチン３βと同様であった。それゆえ、このｃＤＮＡがヒトラブコネクチン３βの全長をコードすると結論された。ヒトラブコネクチン３βは、ラットＴＲＡＧ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３０５８１３）とヒトＷＤＲ７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ０２８５８８）に似た領域構造を示した。ＴＲＡＧ はこれまで、ＴＧＦ−β耐性細胞株で発現する蛋白質として同定されていたが、その機能は知られていない（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ． Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ． ８８， ３２４−３２５， ２０００）。
【０１１６】
（３）ラブコネクチン３βに対する抗体の調製
ラブコネクチン３βの発現ベクターを、ｐＧｅｘ４Ｔ−１ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ）を用いて構築した。構築物はラブコネクチン３βの以下のアミノ酸配列を含んでいた。ｐＧｅｘ４Ｔ−１ラブコネクチン３β−１、アミノ酸番号４８７−６２５； ｐＧｅｘ４Ｔ−１ラブコネクチン３β−２、アミノ酸番号６１５−９２０。
【０１１７】
ＧＳＴ融合タンパクはＥ． ｃｏｌｉで発現させ、グルタチオンセファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて精製した。抗原としてＧＳＴ−ラブコネクチン３β−１および−２をそれぞれ用いてウサギポリクローナル抗ラブコネクチン３β−１および−２抗体を作成し、ＮＨＳ−活性化セファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）に各抗原を共有結合したものを用いてアフィニティー精製した。
【０１１８】
（４）ラブコネクチン３βの組織および細胞下（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）の分布の検討
ラブコネクチン３βの組織および細胞下分布を検討した。組織分布については、種々のラット組織のホモジェネート（各２０μｇ蛋白質）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、続いて抗ラブコネクチン３β−２抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。細胞下分布については、ラット大脳のホモジェネートを、細胞下分画し（Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２６５， １１８７２−１１８７９ （１９９０））、各画分（各１０μｇ蛋白質）をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、抗ラブコネクチン３β−１抗体、抗ラブコネクチン３α抗体、または抗Ｒａｂ３ ＧＥＰ抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。
【０１１９】
この結果、組織分布解析により、ラブコネクチン３βが脳に特異的に発現していることが明らかになった（図２のＡ）。脳での細胞レベル下分布解析により、ラブコネクチン３βがＣＳＶ画分中に高濃度であることを示した（図２のＢ）。図２のＢにおける記号は以下の画分等を示す。Ｒｃ−３β， ラブコネクチン３β、Ｒｃ−３α， ラブコネクチン３α、ＧＥＰ， Ｒａｂ３ ＧＥＰ、Ｈｏ， ホモジェネート画分、Ｐ１， 核ペレット画分、Ｐ２， 粗シナプトソーム画分、Ｐ３， ミクロソーム画分、Ｓ， 可溶性細胞質画分、Ｐ２Ａ， ミエリン画分、Ｐ２Ｂ， 小胞体およびゴルジ複合体画分、Ｐ２Ｃ， シナプトソーム画分、Ｐ２Ｄ， ミトコンドリア画分、ＳＳ， シナプス可溶性画分、ＣＳＶ， 粗シナプス小胞画分、ＣＳＭ， 粗シナプス膜画分。なお、図に示した結果は３つの独立した実験の典型的なものである。
【０１２０】
さらに、マウス海馬とラット海馬ニューロンの初代培養（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７７， ９６２９−９６３２ （２００２））について免疫電子顕微鏡観察（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ２０２， １２３５−１２４３ （１９９４））を行った。
【０１２１】
試料は、抗ラブコネクチン３α抗体と抗ラブコネクチン３β−２抗体を用いて二重染色を行い、続いて免疫蛍光顕微鏡法で観察した。
【０１２２】
この結果、ラブコネクチン３βはラブコネクチン３αと共に、マウス海馬のシナプス領域と初代培養を行ったラット海馬ニューロンに共存していることが明らかになった（図３のＡａとＡｂ）。図３のＡａは、マウス海馬ＣＡ３領域 、Ａｂは、ラット海馬ニューロン初代培養（培養２０日目）である。記号は以下の通りである。ＳＲ， 放線状層、 ＳＬ， 淡明層、 ＳＰ， 錐体層、バー， ３０ μｍ。
【０１２３】
また、培養２２日目のニューロンを、抗ラブコネクチン３β−１抗体で染色した（図３のＢ）。図３のＢにおいてバーは２００ ｎｍを示す。この結果は、ラブコネクチン３βがシナプス小胞と関連することを示した（図３のＢ）。
【０１２４】
これらの結果は、ラブコネクチン３βとラブコネクチン３αがシナプス小胞に共存することを示す。なお、図３に示した結果は、３つの独立した実験の典型例である。
【０１２５】
（５）ラブコネクチン３βに対する、ラブコネクチン３α、Ｒａｂ３ ＧＥＰおよびＲａｂ３ＧＡＰの結合の検討
ラブコネクチン３βとラブコネクチン３αの結合を検討した。ＣＳＶ画分の抽出物を、抗ラブコネクチン３αまたは３β−２抗体による免疫沈降にかけた。各免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％ポリアクリルアミドゲル）にかけ、続いて抗ラブコネクチン３αまたは３β−１抗体によるウエスタンブロッティングを行った。さらに、抗ラブコネクチン３β−２抗体を用いた免疫沈降物は、まず０．５ Ｍ ＮａＣｌまたは１％ ＣＨＡＰＳで洗浄し、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％ポリアクリルアミドゲル）にかけ、さらにクーマシーブリリアントブルーによるタンパク染色を行った。結果を図４のＡａ〜Ａｃに示す。Ａａは、抗ラブコネクチン３α抗体による免疫沈降物、Ａｂは、抗ラブコネクチン３β−２抗体による免疫沈降物、Ａｃは、ＮａＣｌまたはＣＨＡＰＳ処理を行った、抗ラブコネクチン３β−２抗体による免疫沈降物の結果である。
【０１２６】
ラブコネクチン３αがその抗体を用いてＰ２Ｃ画分抽出物から免疫沈降されたとき、ラブコネクチン３βはウエスタンブロッティングから予想されたように共免疫沈降された（図４のＡａ）。逆に、ラブコネクチン３βがその抗体を用いてＰ２Ｃ画分抽出物から免疫沈降されたとき、ラブコネクチン３αが共免疫沈降された（図４のＡｂ）。抗ラブコネクチン３β−２抗体により共免疫沈降されたラブコネクチン３αおよびラブコネクチン３βを、０．５ Ｍ ＮａＣｌまたは１％ ＣＨＡＰＳのどちらかで洗浄し、続いてクーマシーブリリアントブルーでタンパク染色した。両タンパクは互いに分離せず、明らかに同じ分子比率で染色された（図４のＡｃ）。ラブコネクチン３αとラブコネクチン３βは、１ Ｍ ＮａＣｌで一部が、１％デオキシコレートで完全に互いに分離した（データ省略）。これらの結果は、ラブコネクチン３αとラブコネクチン３βが 複合体を形成することを示している。
【０１２７】
次に、ラブコネクチン３αおよび３βのいずれがＲａｂ３ ＧＥＰおよびＲａｂ３ ＧＡＰに結合しているかを調べた。この目的のため、昆虫細胞から得たラブコネクチン３βとＲａｂ３ ＧＥＰ、そしてＥ．ｃｏｌｉ．から得たＲａｂ３ ＧＡＰの非触媒サブユニット（ｐ１５０）の純粋なサンプルを調製した（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２， ３８７５−３８７８（１９９７）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７３， ２４７８１−２４７８５参照）。ラブコネクチン３αは巨大な蛋白質なので、その全長蛋白質を、ＣＯＳ７細胞のような哺乳類細胞株で発現させることや、その純粋なリコンビナントサンプルをＥ．ｃｏｌｉや昆虫細胞から用意することにまだ成功していない。それゆえ、天然のラブコネクチン３α、および、３αと３βの複合体をラット脳Ｐ２Ｃ画分から調製した。ラブコネクチン３αと３βの複合体は、プロテインＡセファロースビーズに結合した抗ラブコネクチン３β−２抗体を用いて、Ｐ２Ｃ画分から免疫沈降され、続いて０．５ Ｍ ＮａＣｌでビーズが洗浄された。このサンプルはラブコネクチン３αと３βの複合体として使われた。鎖の調製をするための別の実験で、プロテインＡセファロースビーズに結合した抗ラブコネクチン３β−２抗体を用いてＰ２Ｃ画分から免疫沈降されたラブコネクチン３αと３βの複合体は、３αを３βから分離するために、１Ｍ ＮａＣｌで洗浄された。ビーズより分離された３αは、続いてプロテインＡセファロースビーズに固定した３αに対する抗体を用いて免疫沈降された。
【０１２８】
ラブコネクチン３β、３αまたは複合体と結合されたアフィニティービーズを準備した。ラブコネクチン３β結合ビーズに関しては、製造者のプロトコールに基づき（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）ｐＦａｓｔＢａｃ Ｈｔａ ラブコネクチン３βを用いて、ラブコネクチン３βｃＤＮＡを持つバキュロウイルスを準備し、バキュロウイルスをＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクトした。細胞の抽出物（５ｍｇ蛋白質）をバッファーＡを用いて調製し、プロテインＡセファロースビーズ（２０μｌ湿容量）に固定された抗ラブコネクチン３β−２抗体と共に４℃で一晩静置した。ラブコネクチン３α結合ビーズに関しては、初めに、プロテインＡセファロースビーズに結合された抗ラブコネクチン３β−２抗体を用いて、ラブコネクチン３αと３βの複合体を上記のＰ２Ｃ画分から免疫沈降させた。次いでラブコネクチン３αを１Ｍ ＮａＣｌを含むバッファーＡにより４℃で１時間洗浄することでビーズから分離した。分離したラブコネクチン３α（０．４μｇ蛋白質）を回収し、プロテインＡセファロースビーズ（２０μｌ湿容量）に固定された抗ラブコネクチン３α抗体と共に４℃で一晩静置した。複合体結合ビーズに関しては、ラブコネクチン３αと３βの複合体をＰ２Ｃ画分から同様に免疫沈降させ、次いで０．５ Ｍ ＮａＣｌを含むバッファーＡでビーズを洗浄した。ラブコネクチン３α、３β、または複合体と結合したアフィニティービーズは、次いで、バッファーＡで完全に洗浄した。
【０１２９】
リコンビナントＲａｂ３ ＧＥＰまたはＧＡＰ ｐ１５０を、リコンビナントラブコネクチン３βまたは天然のラブコネクチン３αと結合したプロテインＡセファロースビーズと静置した。また一方、ビーズ上に固定された抗ラブコネクチン３β−２抗体により、Ｐ２Ｃ画分からラブコネクチン３αおよび３βが免疫沈降された後、ビーズを０．５ Ｍ ＮａＣｌで洗浄し、Ｒａｂ３ ＧＥＰまたはＧＡＰ ｐ１５０をビーズと共に静置した。静置の後、これらをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％ポリアクリルアミドゲル）にかけ、続いてクーマシーブリリアントブルーによるタンパク染色または抗Ｒａｂ３ ＧＥＰもしくはＧＡＰ ｐ１５０抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った。結果を図４のＢａ１〜Ｂｂ２に示す。Ｂａは、ラブコネクチン３αが結合したビーズ、Ｂｂは、ラブコネクチン３βが結合したビーズを示し、数字は、１がＲａｂ３ ＧＥＰ、２がＲａｂ３ ＧＡＰ ｐ１５０を示す。
【０１３０】
この結果、ラブコネクチン３βはリコンビナントＲａｂ３ ＧＥＰに化学量論的に結合したが、ラブコネクチン３αは結合しなかった（図４のＢａ１およびＢｂ１）。複合体はＲａｂ３ ＧＥＰに直接結合したが、化学量論的にはこの結合は、ラブコネクチン３βのものに比べ相当低かった（データ省略）。一方、ラブコネクチン３α、３βそして複合体のいずれも、Ｒａｂ３ ＧＡＰには結合しなかった（図４のＢａ２， Ｂｂ２（複合体についてはデータ省略））。
【０１３１】
ＣＳＶ画分の抽出物を、抗Ｒａｂ３ ＧＥＰまたはＧＡＰ ｐ１５０抗体による免疫沈降にかけた。各免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％ポリアクリルアミドゲル）にかけ、続いて抗Ｒａｂ３ＧＥＰまたはＧＡＰ ｐ１５０抗体そして抗ラブコネクチン３α抗体および抗ラブコネクチン３β−１抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った。結果を図４のＣａおよびＣｂに示す。Ｃａは、抗Ｒａｂ３ ＧＥＰ抗体を用いた免疫沈降物、Ｃｂは、抗Ｒａｂ３ ＧＡＰ ｐ１５０抗体を用いた免疫沈降部の結果である。
【０１３２】
ラブコネクチン３βは、ラブコネクチン３αと同様に、Ｐ２Ｃ画分の抽出物から、抗Ｒａｂ３ ＧＥＰまたは抗Ｒａｂ３ ＧＡＰ ｐ１５０抗体を用いてそれぞれ、Ｒａｂ３ ＧＥＰまたはＲａｂ３ ＧＡＰ ｐ１５０により一貫して共免疫沈降された（図４のＣａおよびＣｂならびに図１のＡ参照）。
【０１３３】
総合すると、これらの結果は、制御された様式で、ラブコネクチン３βが、直接的にＲａｂ３ ＧＥＰに結合し、また、未同定の分子を介して間接的にＲａｂ３ ＧＡＰに結合することを示す。なお、図４の結果は、３つの独立した実験の典型例である。
【０１３４】
なお、実施例１で用いられた抗Ｒａｂ３ ＧＡＰ ｐ１５０抗体、抗Ｒａｂ３ ＧＥＰ抗体および抗ラブコネクチン３α抗体は、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７７， ９６２９−９６３２ （２００２）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７３， ２４７８１−２４７８５ （１９９８）およびＪ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７３， ３４５８０−３４５８５ （１９９８）に記載された方法により調製されたマウスモノクローナル抗Ｒａｂ３ ＧＡＰ ｐ１５０抗体、ウサギポリクローナル抗Ｒａｂ３ ＧＥＰ抗体、および、ラットポリクローナル抗ラブコネクチン３α抗体である。Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７７， ９６２９−９６３２ （２００２）には、抗Ｒａｂ３ ＧＥＰ抗体またはＲａｂ３ ＧＡＰ ｐ１５０抗体を用い、ラブコネクチン３αがＲａｂ３ ＧＥＰまたはＧＡＰによりＣＳＶ画分からそれぞれ共免疫沈降されることが示されている。
【０１３５】
【実施例２】
ポリＬ−リジンをコートしたウェルで１×１０^６の神経芽腫細胞ＰＣ−１２を培養し、培養開始日の翌日にリポフェクチン法によりｍｙｃを発現するｐＣＭＶ ｍｙｃ及びＰ１６０（ラブコネクチン３β）をｍｙｃとの融合タンパク質として発現するｐＣＭＶ ｍｙｃ：ｐ１６０をトランスフェクトした。ｐＣＭＶ ｍｙｃは、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ， ２７２， １１９４３−１１９５１（１９９７）に記載されている。ｐＣＭＶ ｍｙｃ：ｐ１６０は、ラブコネクチン３βのアミノ酸配列１〜１４９０（全長）をコードするＤＮＡを、ラブコネクチン３βとｍｙｃとの融合蛋白質が発現されるように組み込んだものである。
【０１３６】
トランスフェクションの２日後に、低カリウム（カリウム濃度：４．７ ｍＭ）バッファーを加え、３７℃で１０分間インキュベートした後、バッファーを取り除いて、低カリウム濃度または高カリウム（カリウム濃度：６０ ｍＭ）のバッファーを加えた。３７℃で１０分間インキュベートした後、上清中に分泌された成長ホルモン（ＧＨ）及び細胞に残されたＧＨの量を、ｈＧＨ ＥＬＩＳＡキット（ロッシュ社製）にて測定した。結果は、上清中及び細胞中のＧＨをあわせた量を１００％として、分泌されたＧＨの割合（％）として表現した。
【０１３７】
その結果、低カリウムバッファーでは全体の２．３％しか放出されなかった成長ホルモンが、高カリウムバッファーでは、８．９％が放出され、カリウムの刺激により増加した成長ホルモンの放出は、ｐ１６０を発現させることにより７．０％まで抑制された。この結果より、ｐ１６０は成長ホルモン放出等のシナプス小胞の輸送の制御に関与していると考えられる。
【０１３８】
【発明の効果】
本発明により、Ｃａ^２＋依存性エキソサイトーシス、特にはＲａｂ３Ａの活性化および不活性化の制御機構の解明に有用な蛋白質、ならびに、この蛋白質を用いる、Ｃａ^２＋依存性エキソサイトーシス、特にはＲａｂ３Ａの活性化および不活性化の制御に有用な物質のスクリーニング方法が提供される。
【０１３９】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ｐ１６０（ラブコネクチン３β）の単離と一次構造の概要。（Ａ） 抗Ｒａｂ３ ＧＥＰ抗体によるｐ１６０（ラブコネクチン３β）の共免疫沈降の結果（電気泳動写真）。１； ｐ３４０、２； ｐ２００、３； ｐ１６０、４； ｐ６０。（Ｂ）構造概要。グレーはＷＤドメインを示す。（Ｃ）リコンビナントラブコネクチン３βのウェスタンブロッティングの結果（電気泳動写真）。レーン１，対照群ＨＥＫ２９３細胞（１μｇ蛋白質）、レーン２，ｐＣＭＶＦａ ラブコネクチン３βをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞（１μｇ蛋白質）、レーン３，ラット脳のホモジェネート（２０μｇ蛋白質）。
【図２】ラブコネクチン３βの組織および細胞レベル下の分布。（Ａ）組織分布（電気泳動写真）。（Ｂ）細胞レベル下分布（電気泳動写真）。Ｒｃ−３β， ラブコネクチン３β、Ｒｃ−３α， ラブコネクチン３α、ＧＥＰ， Ｒａｂ３ ＧＥＰ、Ｈｏ， ホモジェネート画分、Ｐ１， 核ペレット画分、Ｐ２， 粗シナプトソーム画分、Ｐ３， ミクロソーム画分、Ｓ， 可溶性細胞質画分、Ｐ２Ａ， ミエリン画分、Ｐ２Ｂ， 小胞体およびゴルジ複合体画分、Ｐ２Ｃ， シナプトソーム画分、Ｐ２Ｄ， ミトコンドリア画分、ＳＳ， シナプス可溶性画分、ＣＳＶ， 粗シナプス小胞画分、ＣＳＭ， 粗シナプス膜画分。
【図３】シナプスにおけるラブコネクチン３αと３βの共存を示す免疫蛍光顕微鏡像（顕微鏡写真）。
【図４】ラブコネクチン３に対する、Ｒａｂ３ ＧＥＰの直接的な結合とＲａｂ３ ＧＡＰの間接的な結合を示すウェスタンブロッティングの結果（電気泳動写真）。

Claims (24)

1. 下記（ａ）または（ｂ）の蛋白質。
   （ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質。
   （ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつラブコネクチン３およびＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質に結合する活性を有する蛋白質。
2. 配列番号２に示すアミノ酸配列を有する請求項１記載の蛋白質。
3. 請求項１または２記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
4. 配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１〜４４７０の塩基配列を有する請求項３記載のポリヌクレオチド。
5. 下記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド。
   （ａ）配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１〜４４７０の塩基配列を有するポリヌクレオチド。
   （ｂ）配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１〜４４７０の塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつラブコネクチン３およびＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質に結合する活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
6. 下記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド。
   （ａ）配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１〜４４７０の塩基配列を有するポリヌクレオチド。
   （ｂ）配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１〜４４７０の塩基配列と相同性が８０％以上の塩基配列を有し、かつラブコネクチン３およびＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質に結合する活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
7. 請求項３〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
8. 請求項３〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
9. 請求項８記載の形質転換体を培養し、該形質転換体が発現した、ラブコネクチン３およびＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質に結合する活性を有する蛋白質を培養物から採取することを含む、ラブコネクチン３およびＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質に結合する活性を有する蛋白質の製造法。
10. 請求項３〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを検出するための、請求項３〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドに相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドからなるプローブまたはプライマーの使用。
11. 請求項３〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドに相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドからなるプローブまたはプライマーを被検ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせることを特徴とする請求項３〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの解析方法。
12. 被検ポリヌクレオチドが被検組織または被検細胞中に存在することを特徴とする請求項１１に記載の解析方法。
13. 請求項３〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドに相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドからなるプローブまたはプライマーを被検ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせることを特徴とする請求項１または２に記載の蛋白質をコードする遺伝子の解析方法。
14. 被検ポリヌクレオチドが被検組織または被検細胞中に存在することを特徴とする請求項１２に記載の遺伝子解析方法。
15. 請求項３〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドに相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドからなるプライマーを用いて、被検組織または被検細胞中のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅させ、請求項３〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを測定することを特徴とする遺伝子解析方法。
16. 請求項１または２に記載の蛋白質をコードするｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチド。
17. 請求項１または２に記載の蛋白質をコードするｍＲＮＡを切断するリボザイム。
18. 請求項１または２に記載の蛋白質をコードするｍＲＮＡをＲＮＡ干渉により切断する二本鎖ＲＮＡ。
19. 請求項１または２に記載の蛋白質に対する抗体。
20. 請求項１９に記載の抗体を用いることを特徴とする請求項１または２に記載の蛋白質の免疫組織学的な解析方法。
21. 蛋白質の局在を解析する方法である請求項２０記載の解析方法。
22. 蛋白質の発現量を解析する方法である請求項２０記載の解析方法。
23. 請求項１または２に記載の蛋白質またはその異種相同蛋白質であるラブコネクチン３結合蛋白質と、ラブコネクチン３との結合を促進する物質または阻害する物質の候補物質のスクリーニング方法であって、ラブコネクチン３結合蛋白質と、ラブコネクチン３とを前記候補物質の存在下および非存在下で反応させ、前記結合を増加または減少させる前記候補物質を選択することを含む前記方法。
24. 請求項１または２に記載の蛋白質またはその異種相同蛋白質であるＲａｂ３ ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質結合蛋白質と、Ｒａｂ３ ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質との結合を促進する物質または阻害する物質の候補物質のスクリーニング方法であって、Ｒａｂ３ ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質結合蛋白質とＲａｂ３ ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応促進蛋白質とを前記候補物質の存在下および非存在下で反応させ、前記結合を増加または減少させる前記候補物質を選択することを含む前記方法。

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