JP2004283078A - 植物における病原菌及びウイルスの感染の防御方法 - Google Patents
植物における病原菌及びウイルスの感染の防御方法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】植物に対する病原菌及び／又はウイルス感染の防御手段を提供する。
【解決手段】植物内において、液胞プロセシング酵素を過剰発現させることを特徴とする、植物に対する病原菌及び／又はウイルスの感染の防御方法；そのための液胞プロセシング酵素又はそれをコードする核酸の使用；液胞プロセシング酵素をコードする核酸を保持した細胞と、被検物質とを接触させるステップ及び得られた細胞内における液胞プロセシング酵素の発現又は活性を評価するステップを含む、植物における病原菌及び／又はウイルスの感染の防御剤の候補物質のスクリーニング方法；被検物質の存在下、液胞プロセシング酵素の整理活性を測定するステップを含む、該防御剤の候補物質のスクリーニング方法；特定アミノ酸配列からなり、かつ液胞プロセシング酵素の生理活性を有するポリペプチド、並びに該ポリペプチドをコードする核酸。
【選択図】 なし
【解決手段】植物内において、液胞プロセシング酵素を過剰発現させることを特徴とする、植物に対する病原菌及び／又はウイルスの感染の防御方法；そのための液胞プロセシング酵素又はそれをコードする核酸の使用；液胞プロセシング酵素をコードする核酸を保持した細胞と、被検物質とを接触させるステップ及び得られた細胞内における液胞プロセシング酵素の発現又は活性を評価するステップを含む、植物における病原菌及び／又はウイルスの感染の防御剤の候補物質のスクリーニング方法；被検物質の存在下、液胞プロセシング酵素の整理活性を測定するステップを含む、該防御剤の候補物質のスクリーニング方法；特定アミノ酸配列からなり、かつ液胞プロセシング酵素の生理活性を有するポリペプチド、並びに該ポリペプチドをコードする核酸。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物に対する病原菌及び／又はウイルスの感染の防御手段に関する。より詳しくは、植物に対する病原菌及び／又はウイルス感染を防御しうる、病原菌及び／又はウイルスの感染の防御方法及び植物に対する病原菌及び／又はウイルスの感染の防御に関与する酵素又はそれをコードする核酸の植物に対する病原菌及び／又はウイルス感染の防御のための使用、並びに病原菌及び／又はウイルス感染の防御に有用な候補物質を大量、かつ容易にスクリーニングすることができる、植物における病原菌及び／又はウイルス感染の防御剤の候補物質のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プログラムされた細胞死は、種々のストレス下や動物及び植物の発生の際に起こる基本的な生理学的プロセスである。動物における前記細胞死は、生体個体の形態形成等に代表される生体制御的な役割、腫瘍細胞等の異常細胞の除去等に代表される生体防御的な役割があると考えられている。
【０００３】
一方、植物においては、病原体の侵入に対して感染の拡大を抑制する過敏感反応を引き起し、感染細胞を細胞死に至らしめ、それにより、病原体の増殖を抑制することが知られている。
【０００４】
前記過敏感細胞死は、高等植物における細胞死の型である。植物と病原体との間の相互作用は、宿主組織の感染部位での迅速で局在した細胞死に関連して、過敏感反応をしばしば導く（非特許文献１）。
【０００５】
例えば、タバコにおいては、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）は、Ｎ抵抗性遺伝子を保持する品種（ＮＮタバコ）において、過敏感反応を引き起こす（非特許文献２）。Ｎ遺伝子が機能的でない２８℃を超える温度では、目に見えるいかなる壊死病斑もなく、感染ＮＮタバコ葉で、ＴＭＶは、増殖及び全体に拡大する。かかるＴＭＶ感染植物を２６℃未満に冷却すると、ＴＭＶ感染領域において、同時病斑を引き起こす（前出非特許文献２、非特許文献３）。
【０００６】
しかしながら、過敏感細胞死の活性化を制御するシグナル伝達経路は、よく知られていないのが現状である。
【０００７】
【非特許文献１】
グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）ら、「病原に対する植物の過敏感応答反応：抵抗現象」 “Ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ ｔｏ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ：Ａ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ” Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｐｒｅｓｓ、 １９９４
【非特許文献２】
ホルメス（Ｈｏｌｍｅｓ）、Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２８、５５３−５６１、１９３８
【非特許文献３】
ウエストスタイン（Ｗｅｓｔｓｔｅｉｊｎ）、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ．、１８、３５７−３６８、１９８１
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、植物における病原菌及び／又はウイルス感染を防除又は抑制すること、病原菌及び／又はウイルスに感染した植物における感染部位の拡大を抑制すること等を可能にする、植物に対する病原菌及び／又はウイルス感染の防御方法を提供することを目的とする。また、本発明は、植物における病原菌及び／又はウイルス感染を防除又は抑制すること、病原菌及び／又はウイルスに感染した植物における感染部位の拡大を抑制すること、病原菌及び／又はウイルス感染に対する植物の耐性能を増強すること、植物における病原菌及び／又はウイルス感染部位の拡大に対する抑制能を増強すること等を可能にする、植物に対する病原菌及び／又はウイルス感染を防御するための液胞プロセシング酵素又はそれをコードする核酸の使用を提供することを目的とする。さらに、本発明は、植物に対する病原菌及び／又はウイルス防除剤等の開発を可能にする物質を容易に、大量にスクリーニングすることができる、植物における病原菌及び／又はウイルス感染の防御剤の候補物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨は、
〔１〕 植物内において、液胞プロセシング酵素を過剰発現させることを特徴とする、植物に対する病原菌及び／又はウイルスの感染の防御方法、
〔２〕 植物に対する病原菌及び／又はウイルスの感染を防御するための液胞プロセシング酵素又はそれをコードする核酸の使用、
〔３〕 （ａ）液胞プロセシング酵素をコードする核酸を保持した細胞と、被検物質とを接触させるステップ、及び
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた細胞内における液胞プロセシング酵素の発現又は活性を評価するステップ、
を含む、植物における病原菌及び／又はウイルスの感染の防御剤の候補物質のスクリーニング方法、
〔４〕 被検物質の存在下、液胞プロセシング酵素の生理活性を測定するステップを含む、植物における病原菌及び／又はウイルス感染の防御剤の候補物質のスクリーニング方法、
〔５〕 下記（ｉ’）〜（ｉｉｉ’） ：
（ｉ’）配列番号：１、２、３及び４からなる群より選ばれたアミノ酸配列を含有したポリペプチド、
（ｉｉ’）配列番号：１、２、３及び４からなる群より選ばれたアミノ酸配列において、少なくとも１つの残基の置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列からなり、かつ液胞プロセシング酵素の生理活性を有するポリペプチド、及び
（ｉｉｉ’） 配列番号：１、２、３及び４からなる群より選ばれたアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し、かつ液胞プロセシング酵素の生理活性を有するポリペプチド、
からなる群より選ばれたポリペプチドからなる液胞プロセシング酵素、並びに
〔６〕 （Ｉ’）前記〔５〕に記載されたポリペプチドをコードする核酸、又は（ＩＩ’）配列番号：１、２、３及び４からなる群より選ばれたアミノ酸配列をコードする核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、液胞プロセシング酵素の生理活性を有するポリペプチドである核酸
を含有してなる、液胞プロセシング酵素をコードする核酸、
に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、植物、例えば、タバコ植物において、液胞プロセシング酵素が、驚くべく、動物におけるカスパーゼと類似したカスパーゼ様活性を呈するという本発明者らの知見、カスパーゼインヒビター及び液胞プロセシング酵素特異的インヒビターのそれぞれにより、阻害されることで、タバコモザイクウイルスにより誘導された過敏感細胞死が妨げられる、すなわち、液胞プロセシング酵素が、該過敏感細胞死を制御するという本発明者らの驚くべき知見に基づく。
【００１１】
なお、本明細書において、「感染の防御」とは、例えば、外部からの病原菌及び／又はウイルスの感染、例えば、侵入の防御、感染部位の拡大の抑制等を意図するものとする。
【００１２】
本発明の植物に対する病原菌及び／又はウイルスの感染の防御方法は、植物内において、液胞プロセシング酵素を過剰発現させることに１つの大きな特徴がある。本発明においては、液胞プロセシング酵素を植物体内で過剰発現させるため、病原菌及び／又はウイルスの感染を防御することができ、病原菌及び／又はウイルス感染部位の感染細胞に対して、実質的に特異的に作用して、過敏感細胞死を引き起こすという優れた効果を発揮する。また、前記過敏感細胞死を引き起こされることにより、感染細胞から、その周辺に存在する非感染細胞（正常細胞）への病原菌及び／又はウイルスの伝播（拡大）を抑制することができるという優れた効果を発揮する。
【００１３】
本発明の防御方法において、液胞プロセシング酵素を過剰発現させるには、例えば、該液胞プロセシング酵素の生理活性を増強する物質又は液胞プロセシング酵素をコードする遺伝子の発現を誘導しうる物質を感染部位又は感染植物に供給（例えば、該物質を含有した溶液を浸潤させること等）すること
等が挙げられる。
【００１４】
なお、前記液胞プロセシング酵素又はそれをコードする核酸は、植物に対する病原菌及び／又はウイルス感染を防御、具体的には、感染拡大を抑制するために使用することができる。前記液胞プロセシング酵素又は核酸の使用も本発明に含まれる。
【００１５】
前記「対象となる植物」としては、例えば、アブラナ科植物、ウリ科植物、ナス科植物、マメ科植物、ゴマ科植物、イネ科植物、ミカン科植物、ヒルガオ科植物等が挙げられ、具体的には、タバコ、シロイヌナズナ、アブラナ、ナズナ、ダイコン、キャベツ、カボチャ、キュウリ、メロン、スイカ、タバコ、トマト、ジャガイモ、ピーマン、ナス， ダイズ、エンドウ、アズキ、ラッカセイ、インゲンマメ、ソラマメ、ゴマ、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、ミカン、ユズ、サツマイモ等が挙げられる。
【００１６】
前記液胞プロセシング酵素としては、（ｉ）配列番号：１、２、３、４、２３〜４６からなる群より選ばれたアミノ酸配列を含有したポリペプチドが挙げられる。前記アミノ酸配列について、配列番号：１は、タバコ植物の液胞プロセシング酵素ＮｔＶＰＥ−１ａ、配列番号：２は、タバコ植物の液胞プロセシング酵素ＮｔＶＰＥ−１ｂ、配列番号：３は、タバコ植物の液胞プロセシング酵素ＮｔＶＰＥ−２、配列番号：４は、タバコ植物の液胞プロセシング酵素ＮｔＶＰＥ−３であり、本発明者らにより見出された液胞プロセシング酵素である。なお、配列番号：２３〜４６は、本発明者らにより見出されたタバコ植物の液胞プロセシング酵素と同様の機能を有することが、下記の「液胞プロセシング酵素の生理活性」の測定方法により確認されうるホモログであり、その由来となる生物及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、下記表１の通りである。
【００１７】
【表１】
【００１８】
なお、本発明においては、液胞プロセシング酵素は、液胞プロセシング酵素の生理活性を有するものであれば、前記アミノ酸配列を有する液胞プロセシング酵素の他、
（ｉｉ）配列番号：１、２、３、４、２３〜４６からなる群より選ばれたアミノ酸配列において、少なくとも１つの残基の置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列からなり、かつ液胞プロセシング酵素の生理活性を有するポリペプチド、又は
（ｉｉｉ） 配列番号：１、２、３、４、２３〜４６からなる群より選ばれたアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し、かつ液胞プロセシング酵素の生理活性を有するポリペプチド、
であってもよい。
【００１９】
前記（ｉｉ）のポリペプチドにおいて、配列番号：１、２、３、４、２３〜４６からなる群より選ばれたアミノ酸配列における置換、欠失、付加、挿入等の変異の数は、液胞プロセシング酵素の生理活性を呈する範囲であればよく、例えば、少なくとも１つ、具体的には、１個若しくは数個、又はそれ以上であればよい。
【００２０】
特に、前記配列番号：１、２、３、４、２３〜４６からなる群より選ばれたアミノ酸配列について、配列番号：１を参照配列として、適切にアライメントした場合、
− 配列番号：１のアミノ酸番号：７７のＣｙｓ（例えば、配列番号：２のアミノ酸番号：７６、配列番号：３のアミノ酸番号：７０、配列番号：４のアミノ酸番号：６７）；
− 配列番号：１のアミノ酸番号：１７４のＨｉｓ（例えば、配列番号：２のアミノ酸番号：１７３、配列番号：３のアミノ酸番号：１６７、配列番号：４のアミノ酸番号：１６４）；
− 配列番号：１のアミノ酸番号：２６３のＣｙｓ（例えば、配列番号：２のアミノ酸番号：２６２、配列番号：３のアミノ酸番号：２５６、配列番号：４のアミノ酸番号：２５３）
のそれぞれに対応する残基は、グリシン残基等と置換されうる残基である。なお、
− 配列番号：１のアミノ酸番号：２１６のＣｙｓ（例えば、配列番号：２のアミノ酸番号：２１５、配列番号：３のアミノ酸番号：２０９、配列番号：４のアミノ酸番号：２０６）；
− 配列番号：１のアミノ酸番号：２４９のＣｙｓ（例えば、配列番号：２のアミノ酸番号：２４８、配列番号：３のアミノ酸番号：２３２、配列番号：４のアミノ酸番号：２３９）
のそれぞれに対応する残基は、保存されていることが望ましい。
【００２１】
前記「液胞プロセシング酵素の生理活性」は、例えば、０．５ｍＭ ＥＤＴＡと０．５Ｍジチオトレイトールとを含有した１００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中、測定対象のタンパク質等に、蛍光性基質であるＡｃ−ＥＳＥＮ−α−（４−メチル−クマリル−７−アミド）（ＭＣＡ）、Ａｃ−ＥＳＥＤ−ＭＣＡ、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＭＣＡ及びＡｃ−ＡＡＮ−ＭＣＡ（ペプチド・インスティテュート社製）のいずれかを、終濃度２００〜５００μＭとなるように添加することにより、３０℃で反応を開始し、反応混合物の蛍光の増加を、蛍光分光測光器を用いて、４６０ｎｍで測定することにより評価されうる。
【００２２】
また、液胞プロセシング酵素の生理活性は、下記のように測定することもできる。カボチャ種子貯蔵タンパク質１１Ｓグロブリンのプロセシング部位を含む１０アミノ酸残基〔ＳＥＳＥＮＧＬＥＥＴ（配列番号：４７）〕からなる合成ペプチド（ＮＧ１０）を基質として用いる。４．５ｎｍｏｌ 基質ＮＧ１０を、被検ポリペプチドと反応溶液（２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、０．１Ｍ ＤＴＴ及び０．１Ｍ ＥＤＴＡ）中で３７℃で０．５−３．０時間インキュベートして、反応させる。ここで、液胞プロセシング酵素は、前記基質ＮＧ１０を２つのペプチド、すなわち、Ｐ１ペプチド〔ＳＥＳＥＮ （配列番号：４８）〕とＰ２ペプチド〔ＧＬＥＥＴ （配列番号：４９））とに切断する。基質と、Ｐ１ペプチドとＰ２ペプチドは、キャピラリー電気泳動装置（３Ｄ−ＣＥ、アジレントテクノロジー社製）で、緩衝液（１０ｍＭ ホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．２）中で３０℃、２０ｋＶの条件下で分離し、波長２００ｎｍの吸収を測定することにより検出することができる。なお、活性は、１分間に１ｍｍｏｌのＰ２ペプチドを生成する酵素量を１ユニットとして定義される。
【００２３】
また、前記「液胞プロセシング酵素の生理活性」は、植物体内における過敏感細胞死の発生を指標としても評価されうる。かかる過敏感細胞死は、例えば、病班、細胞収縮、クロマチン凝集、核ＤＮＡ断片化、デオキシリボヌクレアーゼの活性増加等を指標として評価されうる。過敏感細胞死の発生を指標とする評価は、特に、後述の植物に対する病原菌及び／又はウイルス感染の防御効果の評価にも用いられうる。
【００２４】
前記「置換」としては、本来のアミノ酸残基と生理的に同等な物理化学的性質を与えるアミノ酸との保存的置換が挙げられる。前記「生理的に同等な物理化学的性質を与えるアミノ酸」とは、ポリペプチドの有する生理活性を維持し、かつ生体において、立体構造における形状の特徴、疎水性、電荷、ｐＫ等に関して同等の物理化学的性質を示しうるアミノ酸をいう。前記「保存的置換」としては、下記グループＩ〜ＶＩ：
Ｉ グリシン、アラニン；
ＩＩ バリン、イソロイシン、ロイシン；
ＩＩＩ アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；
ＩＶ セリン、スレオニン；
Ｖ リジン、アルギニン；
ＶＩ フェニルアラニン、チロシン；
のいずれかのグループ内における他のアミノ酸との置換が挙げられる。
【００２５】
前記（ｉｉｉ） のポリペプチドにおいて、配列同一性は、液胞プロセシング酵素の生理活性を呈する範囲であればよく、配列番号：１、２、３、４、２３〜４６からなる群より選ばれたアミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは、６０％以上、より好ましくは、７０％以上であればよい。
【００２６】
本明細書においては、配列同一性とは、比較対象の配列の領域にわたって、例えば、ＨｉｇｇｉｎｓらによるＣｌｕｓｔａｌＷ法によるマルチプルアライメントにより、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較し、算出された値をいう。ここで、比較対象のポリペプチド又は核酸は、２つの配列の最適なアラインメントのための参考配列（例えば、コンセンサス配列等）と比べて、付加又は欠失（例えば、ギャップ等）を有していてもよい。かかる配列同一性は、例えば、日立製作所社製のＤＮＡＳＩＳプログラム（Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ ５、Ｆｉｘｅｄ Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ １０、ｗｉｎｄｏｗｓｓｉｚｅ ５、Ｆｌｏａｔｉｎｇ Ｇａｐ １０） 等により求められうる。
【００２７】
前記「液胞プロセシング酵素をコードする核酸」としては、（Ｉ）前記（ｉ）〜（ｉｉｉ） のポリペプチドをコードする核酸、（ＩＩ）配列番号：１、２、３、４、２３〜４６からなる群より選ばれたアミノ酸配列をコードする核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、液胞プロセシング酵素の生理活性を有するポリペプチドである核酸が挙げられる。
【００２８】
本明細書において、前記「ストリンジェントな条件」とは、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版〔ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス刊、１９８９〕等に記載の条件が挙げられる。具体的には、例えば、
▲１▼ ６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍＬ 変性断片化サケ精子ＤＮＡと５０％ ホルムアミドを含む溶液中、プローブとともに４２℃で一晩保温するステップ、
▲２▼ 非特異的にハイブリダイズしたプローブを洗浄により除去するステップ、ここで、より精度を高める観点から、より低イオン強度、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、０．１×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、例えば、用いられる核酸のＴｍ値の４０℃下、よりストリンジェントには、３０℃下、さらにストリンジェントには、２５℃下、よりさらにストリンジェントには、１０℃下、具体的には、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、２５℃以上、よりストリンジェントには、３７℃以上、さらにストリンジェントには、４２℃以上、よりさらにストリンジェントには、５０℃以上、より一層ストリンジェントには、６０℃以上等の条件下での洗浄を行なうことにより、例えば、配列番号：１、２、３、４、２３〜４６からなる群より選ばれたアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列と少なくとも約５０％、よりストリンジェントには、６０％以上、さらにストリンジェントには、７０％以上の配列同一性を有する核酸を得ることができる。なお、Ｔｍは、例えば、下記式：
Ｔｍ＝＝８１．５−１６．６ （ｌｏｇ１０［Ｎａ＋ ］）＋０．４１ （％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）
（式中、Ｎはオリゴヌクレオチドの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチド中のグアニン及びシトシン残基の含有量である）
により求められる。
【００２９】
本発明の防御方法及び液胞プロセシング酵素又はその核酸の使用では、液胞プロセシング酵素は、例えば、配列番号：１、２、３及び４からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有する液胞プロセシング酵素と同レベル又はそれ以上の比活性を有する液胞プロセシング酵素であることが望ましい。
【００３０】
液胞プロセシング酵素をコードする核酸の使用においては、該液胞プロセシング酵素をコードする遺伝子を、対象となる植物に適した転写制御エレメントの制御下に配置して得られた核酸（例えば、発現ベクターなどに組み込み得られた組換えベクター等の細胞導入用担体等）を対象となる植物の細胞に導入することにより、該液胞プロセシング酵素を過剰発現させることができる、例えば、植物体よりカルスを得、得られたカルス又は該カルスから得られるプロトプラストに、前記液胞プロセシング酵素をコードする核酸を対象となる植物に適した転写制御エレメントの制御下に配置して得られた核酸を導入することにより行なわれる。
【００３１】
転写制御エレメントとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ等のプロモーター、ターミネーター等が挙げられる。本発明の防御方法においては、前記転写制御エレメントを保持する発現ベクター、例えば、ｐＢＩ１２１等を用いてもよい。
【００３２】
植物への核酸の導入は、プロトプラストへのエレクトロポレーション、アグロバクテリウム法、ウイルスベクターの感染、金粒子を用いた遺伝子銃による導入等により行なわれうる。
【００３３】
なお、本発明には、液胞プロセシング酵素をコードする核酸を含有した細胞導入用担体も含まれる。
【００３４】
本発明の防御方法及び液胞プロセシング酵素の使用においては、液胞プロセシング酵素の生理活性を増強する物質又は液胞プロセシング酵素をコードする遺伝子の発現を誘導しうる物質の感染部位又は感染植物への供給は、例えば、該物質を含有した溶液を感染部位に浸潤させること、該物質を含有した溶液を感染部位に塗布すること、該物質を含有した溶液を感染部位に噴霧すること等により行なわれる。
【００３５】
本発明の防御方法及び液胞プロセシング酵素の使用における「液胞プロセシング酵素の生理活性を増強する物質」及び「液胞プロセシング酵素をコードする遺伝子の発現を誘導しうる物質」としては、例えば、サリチル酸又はその誘導体、エチレン又はその誘導体、具体的には、アセチルサリチル酸、サリチル酸メチル、サリチル酸エチル等が挙げられる。前記「液胞プロセシング酵素の生理活性を増強する物質」及び「液胞プロセシング酵素をコードする遺伝子の発現を誘導しうる物質」は、植物体全体に供給してもよく、局所に投与してもよい。
【００３６】
また、液胞プロセシング酵素の生理活性は、人為的に植物体の一部に物理的な傷を付けることによって、植物体全体において、増強されうる。
【００３７】
また、前記「液胞プロセシング酵素の生理活性を増強する物質」及び「液胞プロセシング酵素をコードする遺伝子の発現を誘導しうる物質」は、
（ａ）液胞プロセシング酵素をコードする核酸を保持した細胞と、被検物質とを接触させるステップ、及び
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた細胞内における液胞プロセシング酵素の発現若しくは活性を評価するステップ、
を含む、植物における病原菌及び／又はウイルス感染の防御剤の候補物質のスクリーニング方法（スクリーニング方法１）、又は
被検物質の存在下、液胞プロセシング酵素の生理活性を測定するステップを含む、植物における病原菌及び／又はウイルス感染の防御剤の候補物質のスクリーニング方法（スクリーニング方法２）を行なうことにより得ることができる。本発明には、前記スクリーニング方法も含まれる。
【００３８】
被検物質としては、核酸、ポリペプチド、オリゴペプチド、その他の高分子有機化合物、低分子化合物等が挙げられる。
【００３９】
前記スクリーニング方法１のステップ（ａ）において、液胞プロセシング酵素をコードする核酸を保持した細胞は、液胞プロセシング酵素をコードする核酸を含有した組換えベクター等を宿主細胞に導入することにより得られうる。
【００４０】
前記宿主細胞としては、植物細胞、酵母細胞、大腸菌、昆虫細胞、動物細胞等が挙げられる。なかでも、好ましくは、植物細胞が望ましい。
【００４１】
また、組換えベクターに用いられるベクターは、前記宿主細胞に応じて適宜選択されうる。具体的には、植物細胞の場合、例えば、ｐＢＩ１２１等、大腸菌の場合、例えば、ＰＥＴ系のベクター等、昆虫細胞の場合、バキュロウイルス等が挙げられる。
【００４２】
液胞プロセシング酵素をコードする核酸を保持した細胞と、被検物質との接触は、例えば、細胞に適した培地に、種々の希釈率となるように被検物質を添加し、得られた培地で、該細胞を生育させること等により行なわれうる。
【００４３】
前記ステップ（ｂ）において、細胞内における液胞プロセシング酵素の発現は、例えば、細胞から無細胞抽出液を調製し、該無細胞抽出液を、該液胞プロセシング酵素に対する抗体を用いたイムノブロット解析に供すること；細胞からｍＲＮＡを得、該液胞プロセシング酵素をコードする核酸を用いて、ノーザンブロット解析に供すること等により評価される。ここで、液胞プロセシング酵素の発現が、被検物質非存在下に比べ、増加した場合、被検物質が、植物における病原菌及び／又はウイルス感染の防御剤の候補物質であることの指標となる。
【００４４】
前記ステップ（ｂ）において、細胞内における液胞プロセシング酵素の生理活性は、例えば、細胞から無細胞抽出液を調製し、該無細胞抽出液について、前記液胞プロセシング酵素の生理活性の評価法により生理活性を測定すること等により評価されうる。ここで、液胞プロセシング酵素の生理活性が、被検物質非存在下に比べ、増加した場合、被検物質が、植物における病原菌及び／又はウイルス感染の防御剤の候補物質であることの指標となる。
【００４５】
なお、前記スクリーニング方法１においては、前記工程（ａ）において、被検物質を用いずに同様の操作を行なって得られた細胞における液胞プロセシング酵素の発現若しくは活性を対照として用いればよい。
【００４６】
スクリーニング方法２において、被検物質の存在下における液胞プロセシング酵素の生理活性の測定は、前記液胞プロセシング酵素の生理活性の評価法に用いられる反応液に、種々の希釈率となるように被検物質を添加し、得られた反応液を用いて、前記液胞プロセシング酵素の生理活性の評価法と同様に生理活性を測定すること等により評価されうる。
【００４７】
なお、前記スクリーニング方法２において、被検物質の非存在下における液胞プロセシング酵素の生理活性を対照として用いればよい。
【００４８】
さらに、液胞プロセシング酵素のプロモーター領域の下流に発現可能に植物体内で発現可能なレポーター遺伝子を導入し、得られた構築物を導入した形質転換植物細胞又は植物と、被検物質とを接触させ、被検物質存在下におけるレポーター遺伝子の発現又はその増大を指標として、植物における病原菌及び／又はウイルス感染の防御剤の候補物質をスクリーニングすることもできる。かかるスクリーニング方法も本発明に含まれる。
【００４９】
ここで、前記レポーター遺伝子としては、β−グルクロニダーゼ等に代表される慣用のレポーター遺伝子が用いられうる。
【００５０】
また、本発明のスクリーニング方法により得られた候補物質は、さらに、病原菌及び／又はウイルス感染植物又は植物における病原菌及び／又はウイルス感染部位に供給し、過敏感細胞死の誘導、増強等を評価してもよい。ここで、候補物質存在下における病原菌及び／又はウイルス感染部位の過敏感細胞死が、該候補物質非存在下における過敏感細胞死に比べて、より早期に起こった場合及び肉眼観察下により明確に観察された場合、候補物質が、植物における病原菌及び／又はウイルス感染の防御能を発揮することを示唆する指標となる。
【００５１】
なお、前記したように、配列番号：１、２、３及び４は、それぞれ、本発明者らにより見出されたタバコ植物の液胞プロセシング酵素である。かかる液胞プロセシング酵素及びそれをコードする核酸も本発明に含まれる。
【００５２】
本発明のタバコ植物の液胞プロセシング酵素は、具体的には、下記（ｉ’）〜（ｉｉｉ’） ：
（ｉ’）配列番号：１、２、３及び４からなる群より選ばれたアミノ酸配列を含有したポリペプチド、
（ｉｉ’）配列番号：１、２、３及び４からなる群より選ばれたアミノ酸配列において、少なくとも１つの残基の置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列からなり、かつ液胞プロセシング酵素の生理活性を有するポリペプチド、及び
（ｉｉｉ’） 配列番号：１、２、３及び４からなる群より選ばれたアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し、かつ液胞プロセシング酵素の生理活性を有するポリペプチド、
からなる群より選ばれたポリペプチドからなる液胞プロセシング酵素である。
【００５３】
また、本発明の液胞プロセシング酵素をコードする核酸は、（Ｉ’）前記（ｉ’）〜（ｉｉｉ’） からなる群より選ばれたポリペプチドをコードする核酸、又は
（ＩＩ’）配列番号：１、２、３及び４からなる群より選ばれたアミノ酸配列をコードする核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、液胞プロセシング酵素の生理活性を有するポリペプチドである核酸
を含有した核酸である。
【００５４】
ここで、「置換、欠失、付加又は挿入」、「配列同一性」及び「ストリンジェントな条件」については、前記と同様である。
【００５５】
【実施例】
以下、実施例により、本発明を詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例により限定されるものではない。
【００５６】
実施例１
Ｎ抵抗性遺伝子を保持するタバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍＬ．ｃｖ．Ｓａｍｓｕｎ）（ＮＮタバコ）及びＮ抵抗性遺伝子欠損タバコ植物（ｎｎタバコ）を、２６℃で６〜８週間、１６時間照光サイクル下で生育させた。充分に生育し、広がった葉に、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に加えたタバコモザイク病ウイルス（ＴＭＶ−ＯＭ、２５μｇ／ｍＬ）を、カーボランダム（６００メッシュ）で葉の表面を擦ることにより接種した。ＴＭＶ感染の後、該植物を３０℃で４０時間維持し、ついで、２３℃で同調壊死病班形成を誘導した。様々な時点で回収した感染葉由来の円盤状組織を液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保存した。
【００５７】
得られた感染タバコ葉について、種々の物質に対する応答を調べた。以下に、その例を示す。
【００５８】
ＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉を３０℃で４０時間インキュベートし、その後、分離した。各種プロテイナーゼインヒビター、具体的には、１ｍＭ ペプスタチンＡの１％（ｖ／ｖ） ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液、１ｍＭ Ｅ−６４の１％（ｖ／ｖ） ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液、１ｍＭ Ａｃ−ＥＳＥＮ−ＣＨＯの１％（ｖ／ｖ） ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液、１ｍＭ Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯの１％（ｖ／ｖ） ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液、１ｍＭ Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯの１％（ｖ／ｖ） ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液、１ｍＭ ＰＭＳＦの１％（ｖ／ｖ） メタノール溶液及び５ｍＭ ＰＭＳＦの５％（ｖ／ｖ）メタノール溶液のそれぞれを、葉に浸潤させた。ついで、１時間後、温度を２３℃にシフトした。
【００５９】
その結果、図１に示されるように、過敏感細胞死を示す特徴的な壊死病斑が、対照では、温度シフト２４時間後での葉で見られるのに対し、ＮＮタバコ葉中のＴＭＶ誘導過敏感細胞死は、カスパーゼ−１インヒビターとして知られているＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯにより、強く阻害されることがわかった。この結果は、植物における細胞死の機構において、動物と同様に、カスパーゼ−１様活性を有する成分が存在することを示唆する。
【００６０】
また、図１に示されるように、液胞プロセシング酵素特異的インヒビターであるＡｃ−ＥＳＥＮ−ＣＨＯにより、壊死病斑形成が阻害されることがわかる。なお、前記Ａｃ−ＥＳＥＮ−ＣＨＯは、不安定であり、ＣＨＯ基が、分子のアスパラギン残基のアミド基と容易に反応するため、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯよりも、より低い阻害作用を示した。一方、カスパーゼ−３インヒビターであるＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯは、壊死病斑形成を阻害しなかった。他のプロテイナーゼのインヒビターであるペプスタチンＡ（アスパラギン酸プロテイナーゼインヒビター） 及びＰＭＳＦ （セリンプロテイナーゼインヒビター） は、壊死病斑形成に対する影響を示さず、Ｅ−６４（パパイン型プロテイナーゼインヒビター） は、わずかな阻害作用を示した。
【００６１】
これらの結果により、植物においては、カスパーゼ−１様プロテイナーゼ及び液胞プロセシング酵素の両方が、タバコ葉におけるＴＭＶ誘導敏感細胞死に寄与することが示唆される。
【００６２】
実施例２
カスパーゼ−１様活性を有するタンパク質を同定するため、非可逆的カスパーゼインヒビターであるビオチン−ｘＶＡＤ−ｆｍｋｔを用いたビオチン化インヒビターブロット解析方法を開発した。なお、図２Ａの左パネルにおける「Ｂｉｏｔｉｎ−ｘＶＡＤ−ｆｍｋ」に示されるように、インヒビター非存在下においても、ビオチン−ｘＶＡＤ−ｆｍｋは、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯと同様に、温度シフト２４時間後に、ＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉において過敏感細胞死を示す壊死病斑の形成を強く阻害する。
【００６３】
前記ビオチン化インヒビターブロット解析方法は、以下のように行なった。
【００６４】
液体窒素中で凍結したタバコ葉を乳鉢と乳棒を用いて磨砕し、５０ｍＭ ＮａＣｌと１ｍＭ ＥＤＴＡとを含有した５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）でホモジナイズした。得られたホモジネートを１５，０００×ｇで４℃にて２０分間遠心分離し、得られた上清をプロテイナーゼインヒビター存在下又は該プロテイナーゼインヒビター非存在下で、０．５ｍＭ ＥＤＴＡと０．５Ｍ ジチオトレイトールとを含有した１００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中、３０℃で１時間プレインキュベートした。
【００６５】
ついで、１００ｍＭ ジチオトレイトールを含有した１００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中、終濃度２０μＭのビオチンｘＶＡＤ−フルオロメチルケトン（ビオチン−ｘＶＡＤ−ｆｍｋ；カルビオケム社製）とともに３０分間インキュベートした。
【００６６】
生成した酵素とビオチンｘＶＡＤ−ｆｍｋとの複合体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜（０．２２μｍ；日本ミリポア社製）に転写した。転写後の膜を、ブロック溶液（組成：５％ スキムミルク）で処理し、次いで、ストレプトアビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼ（３，０００倍希釈；アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）で３０分間処理した。その後、エンハンスドケミルミネセンスキット〔ＥＣＬシステム、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製〕を用いて検出を行なった。
【００６７】
その結果、図２Ａの右パネルのレーン１に示されるように、分子量４０ｋＤａ、３８ｋＤａ及び２３ｋＤａの３つのバンドが、処理葉のブロット上で特異的に検出された）が、図２Ａの右パネルのレーン２に示されるように、未処理葉のブロット上では、検出されなかった。
【００６８】
どの成分がビオチンｘＶＡＤ−ｆｍｋとの標準的なパートナーであるかを明らかにするため、酵素−インヒビター複合体の形成における種々のプロテイナーゼインヒビターの競合作用を同様に調べた。結果を図２Ｂに示す。
【００６９】
その結果、図２Ｂのレーン１に示されるように、プロテイナーゼインヒビター非存在下の場合、４０ｋＤａバンド、３８ｋＤａバンド及び２３ｋＤａバンドが、ブロット上で検出された。また、図２Ｂのレーン５、８及び１１に示されるように、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ（１．０〜５．０ｍＭ）を、ビオチンｘＶＡＤ−ｆｍｋとのコンペティターとした場合、４０ｋＤａバンド及び３８ｋＤａバンドのみが、完全に消失した。また、２つのバンドは、より低い濃度のＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ（０．５ｍＭ）により消失した。前記２３ｋＤａバンドは、図２Ｂのレーン５、８及び１１に示されるように、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯにより消失しなかったが、図２Ｂのレーン４に示されるように、Ｅ−６４により消失した。したがって、前記２３ｋＤａ成分は、ビオチンｘＶＡＤ−ｆｍｋのフルオロメチルケトン基とは反応するが、ＶＡＤ配列とは反応しないことが示唆される。
【００７０】
これらの結果により、４０ｋＤａ及び３８ｋＤａ成分が、ＶＡＤ配列を認識し、ビオチンｘＶＡＤ−ｆｍｋに結合する能力を持つことがわかる。
【００７１】
また、図２Ｂのレーン７ 、１０及び１３に示されるように、４０ｋＤａバンド及び３８ｋＤａバンドのシグナル強度は、ビオチンｘＶＡＤ−ｆｍｋとのコンペティターとしてＡｃ−ＥＳＥＮ−ＣＨＯである液胞プロセシング酵素特異的インヒビターを添加した場合、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯよりも複合体形成を排除する低い能力を示すが、Ａｃ−ＥＳＥＮ−ＣＨＯの場合、該シグナル強度は、濃度依存的な様式で低減することがわかる。これは、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯが、Ａｃ−ＥＳＥＮ−ＣＨＯよりも強く壊死病斑形成を阻害するという前記実施例１における結果と一致した。
【００７２】
また、ペプタスタチンＡ、ＰＭＳＦ、Ｅ−６４又はＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯのいずれもが、ブロット上での４０ｋＤａ及び３８ｋＤａタンパク質複合体形成を阻害しなかった。この結果より、４０ｋＤａタンパク質及び３８ｋＤａタンパク質は、液胞プロセシング酵素に対応することを示唆される。
【００７３】
そこで、４０ｋＤａ及び３８ｋＤａタンパク質が、液胞プロセシング酵素自体であるかどうかを決定するため、抗液胞プロセシング酵素抗体を用いて、ＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉のイムノブロット解析を行なった。イムノブロット解析は、以下のように行なった。
【００７４】
ＳＤＳ試料用緩衝液（組成：０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％ ＳＤＳ、１２％ メルカプトエタノール）を用い、タバコ葉をホモジナイズし、得られたホモジネートを１５，０００×ｇで４℃にて２０分間遠心分離した。得られた上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ミツハシら〔Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ１３、２３６１−２３７２、２００１〕の手法を参照し、イムノブロット解析を行なった。
【００７５】
なお、イムノブロット解析に用いた抗体は、タバコ液胞プロセシング酵素の検出に用いるための黒ヒヨコマメの液胞プロセシング酵素ホモログに対する抗体（１，０００倍希釈）（トヨオカら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１４８、４５３−４６３、２０００）、ＰＲ−１タンパク質に対する抗体、ＰＲ−２タンパク質に対する抗体及びＰＲ−３タンパク質に対する抗体（５，０００倍希釈）（ヤマカワら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１１８、１２１３−１２２２、
１９９８）に対する抗体である。
【００７６】
図２Ｃの左パネルに示されるように、抗液胞プロセシング酵素抗体を用いた場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のゲル上に、４０ｋＤａバンド及び３８ｋＤａバンドが検出された。
【００７７】
また、タバコ葉抽出物を、抗液胞プロセシング酵素抗体との免疫沈降に供し、ついで、上清を、前記と同様の手法により、ビオチニル化−インヒビターブロット解析に供した。
【００７８】
免疫沈降においては、図２Ｃの右パネルに示されるように、４０ｋＤａバンド及び３８ｋＤａバンド両方のシグナル強度が低減した。
【００７９】
これらの結果により、ＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉において、カスパーゼ−１様活性を有するプロテイナーゼは、４０ｋＤａの液胞プロセシング酵素及び３８ｋＤａの液胞プロセシング酵素であることが示唆される。また、これらの結果により、液胞プロセシング酵素が、主に、過敏感細胞死により引き起こされる壊死病斑形成に関与することが示唆される。
【００８０】
実施例３
タバコ葉における両方のプロテイナーゼ活性：Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＭＣＡに対するカスパーゼ−１様活性及びＡｃ−ＥＳＥＮ−ＭＣＡに対する液胞プロセシング酵素活性を測定した。
【００８１】
液体窒素中で凍結したタバコ葉を乳鉢と乳棒を用いて磨砕し、５０ｍＭ ＮａＣｌと１ｍＭ ＥＤＴＡとを含有した５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を用いてホモジナイズした。得られたホモジネートを、１５，０００×ｇで４℃にて２０分間遠心分離し、得られた上清を、０．５ｍＭ ＥＤＴＡと０．５Ｍ ジチオトレイトールとを含有した１００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中、３０℃で１時間プレインキュベートした。
【００８２】
プレインキュベート後に得られた産物に、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＭＣＡ（５００μＭ）又はＡｃ−ＥＳＥＮ−ＭＣＡ（５００μＭ）を添加することにより、反応を開始し、蛍光分光測光器（マイクロプレートリーダー、ＧＥＮｉｏｓ；ＴＥＣＡＮ社製）を用いて、反応混合物の蛍光の増加を４６５ｎｍにて測定した。
【００８３】
その結果、図３のパネルＡに示されるように、カスパーゼ−１様活性は、ＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉において、温度シフト３時間後、最大レベルまで急速に増加し、ついで、徐々に対照レベルまで下降した。一方、図３のパネルＢに示されるように、液胞プロセシング酵素活性の変動は、カスパーゼ−１様活性の変動と平行していた。また、カスパーゼ−１様活性及び液胞プロセシング酵素活性の両方の活性は、ｍｏｃｋ感染ＮＮタバコ葉においては、非常にゆっくりと増えたが、ＴＭＶ感染ｎｎタバコ葉では、全く増えなかった。
【００８４】
この結果により、カスパーゼ−１様活性を有するプロテイナーゼが、液胞プロセシング酵素自体であるという仮説が裏付けられた。また、カスパーゼ−１様活性を有する液胞プロセシング酵素は、タバコ葉の過敏感反応の初期で速やかに誘導されることが示唆された。
【００８５】
実施例４
温度シフト３時間後でのＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉におけるカスパーゼ−１基質及び液胞プロセシング酵素特異的基質に対する活性における種々のインヒビターの作用を調べた。
【００８６】
インヒビターとして、０．５ｍＭ ペプスタチンＡ、１ｍＭ及び５ｍＭ ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）、０．５ｍＭ Ｅ−６４［（Ｌ−３−トランス−カルボキシオキシラン−２−カルボニル）−Ｌ−ロイシルアグマチニン］、１ｍＭ Ａｃ−ＥＳＥＮ−ＣＨＯ、１ｍＭ Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ並びに１ｍＭ Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ（ペプチド・インスティテュート社製）を用いた。
【００８７】
液体窒素中で凍結したタバコ葉を乳鉢と乳棒を用いて磨砕し、５０ｍＭ ＮａＣｌと１ｍＭ ＥＤＴＡとを含有した５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を用いてホモジナイズした。得られたホモジネートを、１５，０００×ｇで４℃にて２０分間遠心分離し、得られた上清を、前記インヒビター存在下又はインヒビター非存在下に、０．５ｍＭ ＥＤＴＡと０．５Ｍ ジチオトレイトールとを含有した１００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中、３０℃で１時間プレインキュベートした。
【００８８】
プレインキュベート後に得られた産物に、各蛍光性基質（終濃度２００μＭ）を添加することにより、反応を開始し、蛍光分光測光器（マイクロプレートリーダー、ＧＥＮｉｏｓ；ＴＥＣＡＮ社製）を用いて、反応混合物の蛍光の増加を４６５ｎｍにて測定した。
【００８９】
その結果、図３のパネルＣに示されるように、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＭＣＡに対するカスパーゼ−１様活性は、カスパーゼ−１インヒビターであるＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯにより、インヒビター非存在下の活性の７９％まで競合的に阻害され、カスパーゼ−３インヒビターであるＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯにより、インヒビター非存在下の活性の４７％まで阻害された。
【００９０】
一方、図３のパネルＤに示されるように、液胞プロセシング酵素活性は、液胞プロセシング酵素特異的インヒビターであるＡｃ−ＥＳＥＮ−ＣＨＯにより、インヒビター非存在下の活性の６５％まで競合的に阻害された。
【００９１】
また、図３のパネルＣに示されるように、カスパーゼ−１様活性が、液胞プロセシング酵素特異的インヒビターにより６３％まで阻害されたこと及び図３のパネルＤに示されるように、液胞プロセシング酵素活性が、カスパーゼ−１インヒビターにより７２％まで阻害された。
【００９２】
ペプタスタチンＡ、ＰＭＳＦ及びＥ−６４のいずれも、いかなる活性におけるいかなる作用も示さなかった。各活性における交差阻害様式は、液胞プロセシング酵素が、ＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉で誘導されたカスパーゼ−１様活性に応答しうることを示唆した。
【００９３】
実施例５
昆虫細胞においてアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の液胞プロセシング酵素γＶＰＥを発現させ、液胞プロセシング酵素及びカスパーゼの基質を用いて、精製液胞プロセシング酵素の活性を測定した。
【００９４】
アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ） γＶＰＥは、バキュロウイルス発現系（インビトロゲン社製）を用い、既報（クロヤナギら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、４３、１４３−１５１、２００２）に記載の方法に準じ、作製した。
【００９５】
組換えアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ） γＶＰＥ（１．６〜４．０μｇ相当量）を０．５ｍＭ ＥＤＴＡと０．５Ｍ ジチオトレイトールとを含有した１００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中、３０℃で１時間プレインキュベートした。
【００９６】
プレインキュベート後に得られた産物に、蛍光基質であるＡｃ−ＹＶＡＤ−ＭＣＡ又はＡｃ−ＥＳＥＮ−ＭＣＡを添加することにより、反応を開始し、蛍光分光測光器（マイクロプレートリーダー、ＧＥＮｉｏｓ；ＴＥＣＡＮ社製）を用いて、反応混合物の蛍光の増加を４６５ｎｍにて測定した。なお、活性測定時において、８０〜４００μＭの各蛍光基質を用いることによりＫｍ 値を求めた。
【００９７】
その結果、図３Ｅに示されるように、液胞プロセシング酵素は、カスパーゼ−１基質（Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＭＣＡ）に対する活性を示し、Ｋｍ 値は、４４．２μＭであり、標準カスパーゼ−１のＫｍ 値（１１−２３μＭ）よりもわずかに高く、液胞プロセシング酵素特異的基質（Ａｃ−ＥＳＥＮ−ＭＣＡ）に対するＫｍ 値（３０．３μＭ）に匹敵した。対照的に、前記液胞プロセシング酵素は、カスパーゼ−３基質（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＭＣＡ）又は液胞プロセシング酵素特異的基質の誘導体（Ａｃ−ＥＳＥＤ−ＭＣＡ）のいずれに対しても活性を示さなかった。また、液胞プロセシング酵素は、Ａｃ−ＥＳＥＮ−ＭＣＡにおけるアスパラギン残基だけでなく、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＭＣＡにおけるアスパラギン酸をも認識した。これらの結果により、液胞プロセシング酵素は、カスパーゼ−１様活性を有することがわかる。
【００９８】
実施例６
ＲＴ−ＰＣＲにより、タバコ葉から、液胞プロセシング酵素をコードするｃＤＮＡのクローニングを行なった。
【００９９】
クローニングには、温度を３０℃から２３℃にシフトした後の異なる時点におけるＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉を使用した。タバコ葉（１００ｍｇ）を液体窒素中で凍結し、乳鉢と乳棒で磨砕した。
【０１００】
ついで、商品名：ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉキット（キアゲン社製製）を用いて全ＲＮＡを単離し、得られた全ＲＮＡを、５Ｕ ＲＮアーゼ無含有ＤＮアーゼ Ｉにより３７℃で３０分間処理した。ついで、処理後の産物について、フェノール／クロロホルム抽出を行ない、精製ＲＮＡを得た。
【０１０１】
前記精製ＲＮＡ（１μｇ相当量）を７０℃で１０分間加熱し、５０ｐｍｏｌのオリゴｄ（Ｔ）１８プライマーを含有した反応液 ５０μＬ中において、商品名：Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ＲＴ−ＰＣＲビーズ（タカラバイオ社製）を用い、４２℃で３０分間の逆転写反応を行なった。ついで、得られた反応産物（１μＬ）と、１ＵのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）と１００ｐｍｏｌの各プライマーとを含むＰＣＲ反応液（Ｅｘ Ｔａｑ緩衝液、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ） ５０μＬを用い、ＰＣＲを行なった。
【０１０２】
前記プライマーは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の液胞プロセシング酵素の保存配列［ＷＡＶＬＶＡＧ （配列番号：５）、ＨＱＡＤ（Ｖ／Ｉ）ＣＨＡ（配列番号：６）、ＰＬＶＤＤＷ（配列番号：７）及びＮＱＲＤ（Ａ／Ｖ）（Ｄ／Ｈ）Ｌ （配列番号：８）］に基づいて設計した。具体的には、プライマーは、
Ｆｗｄ１：５’−ｔｇｇｇｃｉｒｔｉｙｔｉｂｔｉｇｃｉｇｇ−３’ （配列番号：９）、
Ｆｗｄ２：５’−ｃａｙｃａｒｇｃｉｇａｙｒｔｉｔｇｙｃａｙｇｃ−３’ （配列番号：１０）、
Ｒｅｖ３：５’−ｃｃａｒｔｃｒｔｃｉａｃｉａｒｉｇｇ−３’ （配列番号：１１）、
Ｒｅｖ４：５’−ａｒｒｔｓｉｒｃｒｔｃｉｃｋｙｔｇｒｔｔ−３’ （配列番号：１２）、
（前記配列中、ｉ：イノシン、ｂ：シトシン、グアニン及びチミンの混合物、ｋ：グアニン及びチミンの混合物、ｒ：アデニン及びグアニンの混合物、ｓ：シトシン及びグアニンの混合物、ｙ：シトシン及びチミン）である。前記Ｆｗｄ１プライマーとＲｅｖ４プライマーとの組み合わせを、１次ＰＣＲで用い、Ｆｗｄ２プライマーとＲｅｖ３プライマーとの組み合わせをｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲで用いた。反応条件は、９５℃で５分間インキュベートした後、９５℃で４０秒と５０℃で６０秒と７２℃で９０秒とを１サイクルとする反応を３５サイクル行い、最後に７２℃で７分間インキュベートする条件である。
【０１０３】
得られた増幅産物を、ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−ベクター（ノバジェン社製）に連結し、該増幅産物の配列を決定した。タバコＶＰＥの上流配列及び下流配列を決定するため、５’ −Ｆｕｌｌ ＲＡＣＥ Ｃｏｒｅ Ｓｅｔ及び３’ −ＦｕｌｌＲＡＣＥ Ｃｏｒｅ Ｓｅｔ（タカラバイオ社製）を使用した。
【０１０４】
その結果、４つの液胞プロセシング酵素をコードするｃＤＮＡが単離された。得られた４つの液胞プロセシング酵素を、それぞれ、ＮｔＶＰＥ−１ａ、ＮｔＶＰＥ−１ｂ、ＮｔＶＰＥ−２及びＮｔＶＰＥ−３と称する。
【０１０５】
４つのＮｔＶＰＥの予想アミノ酸配列とアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ） γＶＰＥのアミノ酸配列とを比較した結果を、図４Ａに示す。その結果、ＮｔＶＰＥアミノ酸配列とγＶＰＥアミノ酸配列間の同一性は、約６４．３％以上であった。
【０１０６】
また、液胞プロセシング酵素には、ヒトカスパーゼ−１における触媒２分子のＨｉｓ−２３７及びＣｙｓ−２８５に相当する触媒２分子の２残基（Ｈｉｓ及びＣｙｓ）がよく保存されていることがわかった。液胞プロセシング酵素の活性部位のペンタペプチドＥ（Ａ／Ｇ）ＣＥＳ（配列番号：１３）は、カスパーゼ−１の活性部位のペンタペプチドＱＡＣＲＧ（配列番号：１４）に類似することがわかった。
【０１０７】
また、カスパーゼ−１のＡｓｐポケットを形成する３つの必須アミノ酸Ａｒｇ−１７９、Ａｒｇ−３４１及びＳｅｒ−３４７のそれぞれは、液胞プロセシング酵素に保存されていた。
【０１０８】
この結果により、液胞プロセシング酵素の基質ポケットが、カスパーゼ−１のＡｓｐポケットと類似することを示唆する。また、これは、タバコ液胞プロセシング酵素が、カスパーゼインヒビターＡｃ−ｘＶＡＤ−ｆｍｋ及びＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯと結合したという結果と一致した。
【０１０９】
アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の液胞プロセシング酵素及びトウゴマの液胞プロセシング酵素は、プレプロタンパク質前駆体として、合成され、翻訳に伴って、Ｎ末端プロペプチド及びＣ末端プロペプチドを有するプロタンパク質前駆体に変換されることを示している（図４Ｂ）。不活性プロタンパク質前駆体は、Ｃ末端プロペプチド及びＮ末端プロペプチドの逐次除去により自己触媒的に活性化される。同様に、カスパーゼ−１は、不活性前駆体として合成され、ついで、液胞プロセシング酵素で起こるように、自己触媒的に活性成熟酵素に変換される。カスパーゼ前駆体は、Ｃ末端プロペプチドをもたないが、除去されるリンカーペプチドを有する（図４Ｂ）。
【０１１０】
実施例７
タバコ植物におけるＮｔＶＰＥ−１ａ、ＮｔＶＰＥ−１ｂ、ＮｔＶＰＥ−２及びＮｔＶＰＥ−３それぞれのｍＲＮＡ発現レベルを調べるため、前記実施例６と同様に、ＲＴ−ＰＣＲを行なった。
【０１１１】
前記実施例６と同様にして得られたＤＮアーゼＩ処理ＲＮＡ（２μｇ）を用い、４２℃で３０分間の逆転写反応を行なった。
【０１１２】
ついで、得られた反応液（２μＬ）と、ＮｔＶＰＥ−１特異的プライマー対として
５’−ｇｇｇｔｇｇｔｃｔｃａａａｇａｔｇａｇａａｃａｔｔｇ−３’ （配列番号：１５）及び
５’−ｇｔａｔａｇａｇｃａｔｃｃｔｔｇｃｔｇ−３’ （配列番号：１６）、
ＮｔＶＰＥ−２特異的プライマー対として、
５’−ａｇｇｇｃａｔｃａｔｇｔｔａｃａｇｃｃ−３’ （配列番号：１７）及び
５’−ｇｇｇａａａｇａｇｇａｔｃａｔｃｃａｔｔａｇｃｔｔｃ−３’ （配列番号：１８）、
ＮｔＶＰＥ−３特異的プライマー対として、
５’−ａａｇｇａｇｔｔａｔｃａｔｃａａｔａｇｔｃｃｔｇｃ−３’ （配列番号：１９）
５’−ｇｔａｃａｔｇａａｃａｇａｇａａｔｃｃａｔａｃｃｃ−３ （配列番号：２０）
のそれぞれの特異的プライマー対 ５０ｐｍｏｌを含むＰＣＲ反応液（Ｅｘ Ｔａｑ緩衝液、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ） ２０μＬを用い、ＰＣＲを行なった。なお、アクチンに対するプライマー対〔５’−ａｔｇｇｃａｇａｃｇｇｔｇａｇｇａｔａｔｔｃａ−３’ （配列番号：２１）及び５’−ｇｃｃｔｔｔｇｃａａｔｃｃａｃａｔｃｔｇｔｔｇ−３’ （配列番号：２２）〕を対照実験として使用した。
【０１１３】
ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間インキュベートした後、９５℃で４０秒と５２−６０℃で６０秒と７２℃で６０秒とを１サイクルとする反応を２５−２８サイクル行い、最後に７２℃で７分間インキュベートする条件である。
【０１１４】
その結果、図５Ａに示されるように、ＮｔＶＰＥ ｍＲＮＡは、ＮＮタバコ葉におけるＴＭＶ誘導過敏感反応のごく初期段階で、１時間で最大レベルに達し、ＮｔＶＰＥ ｍＲＮＡのレベルの速やかでかつ一過的に増加することがわかった。
【０１１５】
図５Ａに示されるように、ＮｔＶＰＥ ｍＲＮＡの一過性発現は、酸性及び塩基性病原関連タンパク質（ＰＲ−１）両方のｍＲＮＡの発現に先立っていた。
【０１１６】
また、図５Ａ及び図５Ｃに示されるように、発現は、はるかに壊死病斑形成に先んじ、ＮｔＶＰＥ ｍＲＮＡは、約８時間の時点で消失し、葉で、壊死病斑を形成しはじめた。
【０１１７】
ＮｔＶＰＥ ｍＲＮＡのレベルは、ｍｏｃｋ感染ＮＮタバコ葉での温度シフト後、わずかに、ゆるやかに誘導された。葉の左半分における誘導は、葉の右半分におけるＴＭＶ感染による全体的な作用によると思われる。一方、ＮｔＶＰＥ ｍＲＮＡは、ＴＭＶ感染ｎｎタバコ葉において、ほんのわずかに増加した。
【０１１８】
また、図５Ｂに示されるように、ＮＮタバコ葉でのＴＭＶ誘導過敏感反応の際の液胞プロセシング酵素レベルは、３時間で速やかに最大レベルに増加し、６時間まで高いままであり、その後、基底レベルに減少した。
【０１１９】
図５Ａ及び図５Ｂに示されるように、生育中における液胞プロセシング酵素のレベルの変動は、対応のｍＲＮＡレベルの変動に類似していた。一方、ｍｏｃｋ感染ＮＮタバコ葉において、液胞プロセシング酵素の量は、温度シフト後、わずかに、増加した。液胞プロセシング酵素は、ＴＭＶ感染ｎｎタバコ葉で誘導されなかった。
【０１２０】
ついで、ビオチンｘＶＡＤ−ｆｍｋを用い、前記実施例２と同様のビオチニル化インヒビターブロットにより、カスパーゼ−１インヒビターに結合する活性型の液胞プロセシング酵素のレベルの変動を決定した。
【０１２１】
図６に示されるように、温度シフト後０時間から１２時間後のＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉のビオチニル化インヒビターブロットの結果、ビオチンｘＶＡＤ−ｆｍｋに結合する４０ｋＤａ液胞プロセシング酵素及び３８ｋＤａ液胞プロセシング酵素のレベルは、３時間で最大に達し、ついで、対照レベルに徐々に下降した。また、４０ｋＤａ液胞プロセシング酵素及び３８ｋＤａ液胞プロセシング酵素のレベルは、ＴＭＶ誘導過敏感反応が起こらないＴＭＶ感染ｎｎタバコ葉で増加せず、ｍｏｃｋ感染ＮＮタバコ葉でわずかに増加した。４０ｋＤａ及び３８ｋＤａ活性ＶＰＥのレベルは、ＴＭＶ誘導過敏感反応増加した。
【０１２２】
このらの結果により、ＮｔＶＰＥ ｍＲＮＡの発現、液胞プロセシング酵素の発現及び液胞プロセシング酵素活性の全てが、ＴＭＶ誘導過敏感反応の初期段階で、迅速、かつ一過的に誘導されることが示唆される。
【０１２３】
実施例８
Ｎ抵抗性遺伝子を保持するタバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍＬ．ｃｖ．Ｓａｍｓｕｎ）（ＮＮタバコ）を、２６℃で６〜８週間、１２時間照光サイクル下で生育させた。充分に生育し、広がった葉に、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に加えたタバコモザイク病ウイルス（ＴＭＶ−ＯＭ、２５μｇ／ｍＬ）を、カーボランダム（６００メッシュ）で葉の表面を擦ることにより接種した。ＴＭＶ感染の後、前記植物を３０℃で４０時間維持し、分離した。ついで、前記植物を、２３℃での温度シフト１時間前、温度シフト１時間後、３時間後、６時間後、９時間後及び１２時間後、インヒビターを浸潤させ、ＮＮタバコ葉における壊死病斑形成におけるインヒビターの作用を調べた。
【０１２４】
その結果、図７に示されるように、過敏感細胞死を示す壊死病斑の形成は、温度シフト１時間後まで浸潤させた場合、インヒビターにより強く阻害された。また、温度シフト３時間後、浸潤させた場合、壊死病斑形成は、わずかに阻害された。さらに、温度シフト６時間後、浸潤させた場合、壊死病斑形成は阻害されなかった。
【０１２５】
これらの結果により、液胞プロセシング酵素が、ＮＮタバコ葉におけるＴＭＶ誘導過敏感細胞死のシグナル伝達経路の初期プロセスに機能することが示唆される。
【０１２６】
実施例９
シロイヌナズナの液胞プロセシング酵素（γＶＰＥ；アクセッションナンバーＤ６１３９５）のプロモータを含む領域（開始コドンを起点として−２０３６から＋１１の上流部分）にβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を繋いだキメラ遺伝子を導入した形質転換シロイヌナズナを作製した。この植物体に種々の化合物を与えた後にＧＵＳ染色を行なったところ、サリチル酸（２．５ｍＭ）とエチレン（１００μＬ／Ｌ）処理によって植物体が明らかに青く染まり、顕著なＧＵＳ遺伝子の発現を示した。したがって、サリチル酸が、病原菌及び／又はウイルス感染の防御剤の候補物質として選別された。
【０１２７】
【発明の効果】
本発明の植物に対する病原菌及び／又はウイルス感染の防御方法によれば、植物における病原菌及び／又はウイルス感染を防除又は抑制し、病原菌及び／又はウイルスに感染した植物における感染部位の拡大を抑制することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の植物に対する病原菌及び／又はウイルス感染を防御するための液胞プロセシング酵素又はそれをコードする核酸の使用によれば、植物における病原菌及び／又はウイルス感染を防除又は抑制し、病原菌及び／又はウイルスに感染した植物における感染部位の拡大を抑制し、病原菌及び／又はウイルス感染に対する植物の耐性能を増強し、植物における病原菌及び／又はウイルス感染部位の拡大に対する抑制能を増強することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の植物における病原菌及び／又はウイルス感染の防御剤の候補物質のスクリーニング方法によれば、植物に対する病原菌及び／又はウイルス防除剤等の開発を可能にする物質を容易に、大量にスクリーニングすることができるという優れた効果を奏する。
【０１２８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＮＮタバコ葉のＴＭＶ感染部位に、温度シフト前に各種物質を浸潤させた２４時間後の葉を観察した結果を示す。
【図２】図２は、植物におけるカスパーゼ−１様活性を有するタンパク質を同定を行なった結果を示す。パネルＡにおいて、左パネルは、温度シフト前に１ｍＭ ビオチン−ｘＶＡＤ−ｆｍｋの浸潤の有無によるＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉の温度シフト２４時間後における結果であり、右パネルは、ビオチン化インヒビターブロット解析の結果を示す。前記右パネルにおいて、レーン１は、温度シフト２４時間後のビオチン−ｘＶＡＤ−ｆｍｋ処理葉、レーン２は、温度シフト６時間後の未処理葉を示す。また、パネルＢは、プロテアーゼインヒビターの存在下又は非存在下の場合のビオチン化インヒビターブロット解析の結果を示す。パネルＣにおいて、左パネルは、葉抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、抗ＶＰＥ抗体を用いてイムノブロットに供した結果を示し、右パネルは、葉抽出物を、抗ＶＰＥ抗体を用いて免疫沈降させ、上清をビオチン化インヒビターブロットに供した結果を示す。分子量をｋＤａで示す。
【図３】図３は、カスパーゼ−１様活性と液胞プロセシング酵素活性との比較の結果を示す。パネルＡは、タバコ葉における、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＭＣＡに対するカスパーゼ−１様活性レベルの成長過程での変化を示し、パネルＢは、タバコ葉におけるＡｃ−ＥＳＥＮ−ＭＣＡに対するＶＰＥ活性の成長過程での変化を示す。パネルＣは、タバコ葉における、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＭＣＡに対するカスパーゼ−１様活性に対する種々のインヒビターの作用を示し、パネルＤは、タバコ葉における、Ａｃ−ＥＳＥＮ−ＭＣＡに対するＶＰＥ活性に対する種々のインヒビターの作用を示す。パネルＥは、ＶＰＥ基質（Ａｃ−ＥＳＥＮ−ＭＣＡ）、ＶＰＥ基質（Ａｃ−ＥＳＥＤ−ＭＣＡ）の誘導体、カスパーゼ−１基質（Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＭＣＡ）及びカスパーゼ−３基質（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＭＣＡ）に対するアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）液胞プロセシング酵素γＶＰＥのＫｍ 値を示す。パネルＥにおいて、ｎ．ｄ．は未検出を示す。
【図４】図４は、タバコ植物の４種類の液胞プロセシング酵素（ＮｔＶＰＥ−１ａ、ＮｔＶＰＥ−１ｂ、ＮｔＶＰＥ−２及びＮｔＶＰＥ−３）の構造解析の結果を示す。パネルＡは、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）液胞プロセシング酵素γＶＰＥと、タバコ植物の４種類の液胞プロセシング酵素との間のアミノ酸配列の配列同一性を示す。数値は、プログラムＤＮＡＳＩＳ（日立製作所社製）にて算出したアミノ酸配列同一性（％）を示す。パネルＢは、ヒトカスパーゼ−１及び植物ＶＰＥの構造の模式図を示す。ヒトカスパーゼ−１及び植物ＶＰＥは、プロタンパク質前駆体として合成され、次いで、プロペプチド（白四角）及びリンカーペプチド（灰色四角）の除去後に、それぞれの成熟形態（黒四角）に変換される。ｈカスパーゼ−１の必須アミノ酸及びタバコＶＰＥの対応するアミノ酸（ＮｔＶＰＥ−１ａ）を黒四角で示す。
【図５】図５は、ＮＮタバコ葉におけるＴＭＶ誘導性過敏感反応中の、ＮｔＶＰＥのｍＲＮＡ及びタンパク質の両方の初期発現及び一過性発現を調べた結果を示す。パネルＡは、ＮｔＶＰＥ ｍＲＮＡレベルの成長過程での変化を示し、左パネルは、ＲＴ−ＰＣＲの結果であり、右パネルは、ＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉におけるＮｔＶＰＥ−１及び塩基性ＰＲ−１のｍＲＮＡレベルを光学濃度的に検出し、相対量を、ＮｔＶＰＥ−１では温度シフトの１時間後、塩基性ＰＲ−１では温度シフトの１２時間後での最大値に対する割合で示した結果である。パネルＢは、ＮｔＶＰＥタンパク質レベルの成長過程での変化を示し、左パネルは、イムノブロットの結果であり、右パネルは、ＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉におけるＮｔＶＰＥタンパク質、ＰＲ−１、ＰＲ−２及びＰＲ−３のレベルを光学濃度的に測定し、ＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉における相対量を、ＮｔＶＰＥでは温度シフトの３時間後、ＰＲ−１では温度シフトの１２時間後での最大値に対する割合で示した結果である。パネルＣは、温度シフト後、表示された時間におけるＮＮタバコ葉の形態学的変化を示す。
【図６】図６は、ＮＮタバコ葉のＴＭＶ誘導性過敏感反応の際のＮｔＶＰＥのに関するビオチン化インヒビターブロットの結果を示す。パネルＡは、ビオチン化インヒビターブロットであり、パネルＢは、パネルＡにおけるビオチン化インヒビターに結合したＮｔＶＰＥの量を光学濃度的に測定した結果である。パネルＢにおいて、相対量を、ＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉において温度シフトの３時間後の最大値に対する割合で示す。
【図７】図７は、１ｍＭ Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ（ＶＰＥ／カスパーゼ−１インヒビター）をＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉に浸潤させ、温度シフト２４時間後に観察した結果を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物に対する病原菌及び／又はウイルスの感染の防御手段に関する。より詳しくは、植物に対する病原菌及び／又はウイルス感染を防御しうる、病原菌及び／又はウイルスの感染の防御方法及び植物に対する病原菌及び／又はウイルスの感染の防御に関与する酵素又はそれをコードする核酸の植物に対する病原菌及び／又はウイルス感染の防御のための使用、並びに病原菌及び／又はウイルス感染の防御に有用な候補物質を大量、かつ容易にスクリーニングすることができる、植物における病原菌及び／又はウイルス感染の防御剤の候補物質のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プログラムされた細胞死は、種々のストレス下や動物及び植物の発生の際に起こる基本的な生理学的プロセスである。動物における前記細胞死は、生体個体の形態形成等に代表される生体制御的な役割、腫瘍細胞等の異常細胞の除去等に代表される生体防御的な役割があると考えられている。
【０００３】
一方、植物においては、病原体の侵入に対して感染の拡大を抑制する過敏感反応を引き起し、感染細胞を細胞死に至らしめ、それにより、病原体の増殖を抑制することが知られている。
【０００４】
前記過敏感細胞死は、高等植物における細胞死の型である。植物と病原体との間の相互作用は、宿主組織の感染部位での迅速で局在した細胞死に関連して、過敏感反応をしばしば導く（非特許文献１）。
【０００５】
例えば、タバコにおいては、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）は、Ｎ抵抗性遺伝子を保持する品種（ＮＮタバコ）において、過敏感反応を引き起こす（非特許文献２）。Ｎ遺伝子が機能的でない２８℃を超える温度では、目に見えるいかなる壊死病斑もなく、感染ＮＮタバコ葉で、ＴＭＶは、増殖及び全体に拡大する。かかるＴＭＶ感染植物を２６℃未満に冷却すると、ＴＭＶ感染領域において、同時病斑を引き起こす（前出非特許文献２、非特許文献３）。
【０００６】
しかしながら、過敏感細胞死の活性化を制御するシグナル伝達経路は、よく知られていないのが現状である。
【０００７】
【非特許文献１】
グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）ら、「病原に対する植物の過敏感応答反応：抵抗現象」 “Ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ ｔｏ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ：Ａ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ” Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｐｒｅｓｓ、 １９９４
【非特許文献２】
ホルメス（Ｈｏｌｍｅｓ）、Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２８、５５３−５６１、１９３８
【非特許文献３】
ウエストスタイン（Ｗｅｓｔｓｔｅｉｊｎ）、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ．、１８、３５７−３６８、１９８１
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、植物における病原菌及び／又はウイルス感染を防除又は抑制すること、病原菌及び／又はウイルスに感染した植物における感染部位の拡大を抑制すること等を可能にする、植物に対する病原菌及び／又はウイルス感染の防御方法を提供することを目的とする。また、本発明は、植物における病原菌及び／又はウイルス感染を防除又は抑制すること、病原菌及び／又はウイルスに感染した植物における感染部位の拡大を抑制すること、病原菌及び／又はウイルス感染に対する植物の耐性能を増強すること、植物における病原菌及び／又はウイルス感染部位の拡大に対する抑制能を増強すること等を可能にする、植物に対する病原菌及び／又はウイルス感染を防御するための液胞プロセシング酵素又はそれをコードする核酸の使用を提供することを目的とする。さらに、本発明は、植物に対する病原菌及び／又はウイルス防除剤等の開発を可能にする物質を容易に、大量にスクリーニングすることができる、植物における病原菌及び／又はウイルス感染の防御剤の候補物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨は、
〔１〕 植物内において、液胞プロセシング酵素を過剰発現させることを特徴とする、植物に対する病原菌及び／又はウイルスの感染の防御方法、
〔２〕 植物に対する病原菌及び／又はウイルスの感染を防御するための液胞プロセシング酵素又はそれをコードする核酸の使用、
〔３〕 （ａ）液胞プロセシング酵素をコードする核酸を保持した細胞と、被検物質とを接触させるステップ、及び
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた細胞内における液胞プロセシング酵素の発現又は活性を評価するステップ、
を含む、植物における病原菌及び／又はウイルスの感染の防御剤の候補物質のスクリーニング方法、
〔４〕 被検物質の存在下、液胞プロセシング酵素の生理活性を測定するステップを含む、植物における病原菌及び／又はウイルス感染の防御剤の候補物質のスクリーニング方法、
〔５〕 下記（ｉ’）〜（ｉｉｉ’） ：
（ｉ’）配列番号：１、２、３及び４からなる群より選ばれたアミノ酸配列を含有したポリペプチド、
（ｉｉ’）配列番号：１、２、３及び４からなる群より選ばれたアミノ酸配列において、少なくとも１つの残基の置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列からなり、かつ液胞プロセシング酵素の生理活性を有するポリペプチド、及び
（ｉｉｉ’） 配列番号：１、２、３及び４からなる群より選ばれたアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し、かつ液胞プロセシング酵素の生理活性を有するポリペプチド、
からなる群より選ばれたポリペプチドからなる液胞プロセシング酵素、並びに
〔６〕 （Ｉ’）前記〔５〕に記載されたポリペプチドをコードする核酸、又は（ＩＩ’）配列番号：１、２、３及び４からなる群より選ばれたアミノ酸配列をコードする核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、液胞プロセシング酵素の生理活性を有するポリペプチドである核酸
を含有してなる、液胞プロセシング酵素をコードする核酸、
に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、植物、例えば、タバコ植物において、液胞プロセシング酵素が、驚くべく、動物におけるカスパーゼと類似したカスパーゼ様活性を呈するという本発明者らの知見、カスパーゼインヒビター及び液胞プロセシング酵素特異的インヒビターのそれぞれにより、阻害されることで、タバコモザイクウイルスにより誘導された過敏感細胞死が妨げられる、すなわち、液胞プロセシング酵素が、該過敏感細胞死を制御するという本発明者らの驚くべき知見に基づく。
【００１１】
なお、本明細書において、「感染の防御」とは、例えば、外部からの病原菌及び／又はウイルスの感染、例えば、侵入の防御、感染部位の拡大の抑制等を意図するものとする。
【００１２】
本発明の植物に対する病原菌及び／又はウイルスの感染の防御方法は、植物内において、液胞プロセシング酵素を過剰発現させることに１つの大きな特徴がある。本発明においては、液胞プロセシング酵素を植物体内で過剰発現させるため、病原菌及び／又はウイルスの感染を防御することができ、病原菌及び／又はウイルス感染部位の感染細胞に対して、実質的に特異的に作用して、過敏感細胞死を引き起こすという優れた効果を発揮する。また、前記過敏感細胞死を引き起こされることにより、感染細胞から、その周辺に存在する非感染細胞（正常細胞）への病原菌及び／又はウイルスの伝播（拡大）を抑制することができるという優れた効果を発揮する。
【００１３】
本発明の防御方法において、液胞プロセシング酵素を過剰発現させるには、例えば、該液胞プロセシング酵素の生理活性を増強する物質又は液胞プロセシング酵素をコードする遺伝子の発現を誘導しうる物質を感染部位又は感染植物に供給（例えば、該物質を含有した溶液を浸潤させること等）すること
等が挙げられる。
【００１４】
なお、前記液胞プロセシング酵素又はそれをコードする核酸は、植物に対する病原菌及び／又はウイルス感染を防御、具体的には、感染拡大を抑制するために使用することができる。前記液胞プロセシング酵素又は核酸の使用も本発明に含まれる。
【００１５】
前記「対象となる植物」としては、例えば、アブラナ科植物、ウリ科植物、ナス科植物、マメ科植物、ゴマ科植物、イネ科植物、ミカン科植物、ヒルガオ科植物等が挙げられ、具体的には、タバコ、シロイヌナズナ、アブラナ、ナズナ、ダイコン、キャベツ、カボチャ、キュウリ、メロン、スイカ、タバコ、トマト、ジャガイモ、ピーマン、ナス， ダイズ、エンドウ、アズキ、ラッカセイ、インゲンマメ、ソラマメ、ゴマ、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、ミカン、ユズ、サツマイモ等が挙げられる。
【００１６】
前記液胞プロセシング酵素としては、（ｉ）配列番号：１、２、３、４、２３〜４６からなる群より選ばれたアミノ酸配列を含有したポリペプチドが挙げられる。前記アミノ酸配列について、配列番号：１は、タバコ植物の液胞プロセシング酵素ＮｔＶＰＥ−１ａ、配列番号：２は、タバコ植物の液胞プロセシング酵素ＮｔＶＰＥ−１ｂ、配列番号：３は、タバコ植物の液胞プロセシング酵素ＮｔＶＰＥ−２、配列番号：４は、タバコ植物の液胞プロセシング酵素ＮｔＶＰＥ−３であり、本発明者らにより見出された液胞プロセシング酵素である。なお、配列番号：２３〜４６は、本発明者らにより見出されたタバコ植物の液胞プロセシング酵素と同様の機能を有することが、下記の「液胞プロセシング酵素の生理活性」の測定方法により確認されうるホモログであり、その由来となる生物及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、下記表１の通りである。
【００１７】
【表１】
なお、本発明においては、液胞プロセシング酵素は、液胞プロセシング酵素の生理活性を有するものであれば、前記アミノ酸配列を有する液胞プロセシング酵素の他、
（ｉｉ）配列番号：１、２、３、４、２３〜４６からなる群より選ばれたアミノ酸配列において、少なくとも１つの残基の置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列からなり、かつ液胞プロセシング酵素の生理活性を有するポリペプチド、又は
（ｉｉｉ） 配列番号：１、２、３、４、２３〜４６からなる群より選ばれたアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し、かつ液胞プロセシング酵素の生理活性を有するポリペプチド、
であってもよい。
【００１９】
前記（ｉｉ）のポリペプチドにおいて、配列番号：１、２、３、４、２３〜４６からなる群より選ばれたアミノ酸配列における置換、欠失、付加、挿入等の変異の数は、液胞プロセシング酵素の生理活性を呈する範囲であればよく、例えば、少なくとも１つ、具体的には、１個若しくは数個、又はそれ以上であればよい。
【００２０】
特に、前記配列番号：１、２、３、４、２３〜４６からなる群より選ばれたアミノ酸配列について、配列番号：１を参照配列として、適切にアライメントした場合、
− 配列番号：１のアミノ酸番号：７７のＣｙｓ（例えば、配列番号：２のアミノ酸番号：７６、配列番号：３のアミノ酸番号：７０、配列番号：４のアミノ酸番号：６７）；
− 配列番号：１のアミノ酸番号：１７４のＨｉｓ（例えば、配列番号：２のアミノ酸番号：１７３、配列番号：３のアミノ酸番号：１６７、配列番号：４のアミノ酸番号：１６４）；
− 配列番号：１のアミノ酸番号：２６３のＣｙｓ（例えば、配列番号：２のアミノ酸番号：２６２、配列番号：３のアミノ酸番号：２５６、配列番号：４のアミノ酸番号：２５３）
のそれぞれに対応する残基は、グリシン残基等と置換されうる残基である。なお、
− 配列番号：１のアミノ酸番号：２１６のＣｙｓ（例えば、配列番号：２のアミノ酸番号：２１５、配列番号：３のアミノ酸番号：２０９、配列番号：４のアミノ酸番号：２０６）；
− 配列番号：１のアミノ酸番号：２４９のＣｙｓ（例えば、配列番号：２のアミノ酸番号：２４８、配列番号：３のアミノ酸番号：２３２、配列番号：４のアミノ酸番号：２３９）
のそれぞれに対応する残基は、保存されていることが望ましい。
【００２１】
前記「液胞プロセシング酵素の生理活性」は、例えば、０．５ｍＭ ＥＤＴＡと０．５Ｍジチオトレイトールとを含有した１００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中、測定対象のタンパク質等に、蛍光性基質であるＡｃ−ＥＳＥＮ−α−（４−メチル−クマリル−７−アミド）（ＭＣＡ）、Ａｃ−ＥＳＥＤ−ＭＣＡ、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＭＣＡ及びＡｃ−ＡＡＮ−ＭＣＡ（ペプチド・インスティテュート社製）のいずれかを、終濃度２００〜５００μＭとなるように添加することにより、３０℃で反応を開始し、反応混合物の蛍光の増加を、蛍光分光測光器を用いて、４６０ｎｍで測定することにより評価されうる。
【００２２】
また、液胞プロセシング酵素の生理活性は、下記のように測定することもできる。カボチャ種子貯蔵タンパク質１１Ｓグロブリンのプロセシング部位を含む１０アミノ酸残基〔ＳＥＳＥＮＧＬＥＥＴ（配列番号：４７）〕からなる合成ペプチド（ＮＧ１０）を基質として用いる。４．５ｎｍｏｌ 基質ＮＧ１０を、被検ポリペプチドと反応溶液（２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、０．１Ｍ ＤＴＴ及び０．１Ｍ ＥＤＴＡ）中で３７℃で０．５−３．０時間インキュベートして、反応させる。ここで、液胞プロセシング酵素は、前記基質ＮＧ１０を２つのペプチド、すなわち、Ｐ１ペプチド〔ＳＥＳＥＮ （配列番号：４８）〕とＰ２ペプチド〔ＧＬＥＥＴ （配列番号：４９））とに切断する。基質と、Ｐ１ペプチドとＰ２ペプチドは、キャピラリー電気泳動装置（３Ｄ−ＣＥ、アジレントテクノロジー社製）で、緩衝液（１０ｍＭ ホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．２）中で３０℃、２０ｋＶの条件下で分離し、波長２００ｎｍの吸収を測定することにより検出することができる。なお、活性は、１分間に１ｍｍｏｌのＰ２ペプチドを生成する酵素量を１ユニットとして定義される。
【００２３】
また、前記「液胞プロセシング酵素の生理活性」は、植物体内における過敏感細胞死の発生を指標としても評価されうる。かかる過敏感細胞死は、例えば、病班、細胞収縮、クロマチン凝集、核ＤＮＡ断片化、デオキシリボヌクレアーゼの活性増加等を指標として評価されうる。過敏感細胞死の発生を指標とする評価は、特に、後述の植物に対する病原菌及び／又はウイルス感染の防御効果の評価にも用いられうる。
【００２４】
前記「置換」としては、本来のアミノ酸残基と生理的に同等な物理化学的性質を与えるアミノ酸との保存的置換が挙げられる。前記「生理的に同等な物理化学的性質を与えるアミノ酸」とは、ポリペプチドの有する生理活性を維持し、かつ生体において、立体構造における形状の特徴、疎水性、電荷、ｐＫ等に関して同等の物理化学的性質を示しうるアミノ酸をいう。前記「保存的置換」としては、下記グループＩ〜ＶＩ：
Ｉ グリシン、アラニン；
ＩＩ バリン、イソロイシン、ロイシン；
ＩＩＩ アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；
ＩＶ セリン、スレオニン；
Ｖ リジン、アルギニン；
ＶＩ フェニルアラニン、チロシン；
のいずれかのグループ内における他のアミノ酸との置換が挙げられる。
【００２５】
前記（ｉｉｉ） のポリペプチドにおいて、配列同一性は、液胞プロセシング酵素の生理活性を呈する範囲であればよく、配列番号：１、２、３、４、２３〜４６からなる群より選ばれたアミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは、６０％以上、より好ましくは、７０％以上であればよい。
【００２６】
本明細書においては、配列同一性とは、比較対象の配列の領域にわたって、例えば、ＨｉｇｇｉｎｓらによるＣｌｕｓｔａｌＷ法によるマルチプルアライメントにより、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較し、算出された値をいう。ここで、比較対象のポリペプチド又は核酸は、２つの配列の最適なアラインメントのための参考配列（例えば、コンセンサス配列等）と比べて、付加又は欠失（例えば、ギャップ等）を有していてもよい。かかる配列同一性は、例えば、日立製作所社製のＤＮＡＳＩＳプログラム（Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ ５、Ｆｉｘｅｄ Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ １０、ｗｉｎｄｏｗｓｓｉｚｅ ５、Ｆｌｏａｔｉｎｇ Ｇａｐ １０） 等により求められうる。
【００２７】
前記「液胞プロセシング酵素をコードする核酸」としては、（Ｉ）前記（ｉ）〜（ｉｉｉ） のポリペプチドをコードする核酸、（ＩＩ）配列番号：１、２、３、４、２３〜４６からなる群より選ばれたアミノ酸配列をコードする核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、液胞プロセシング酵素の生理活性を有するポリペプチドである核酸が挙げられる。
【００２８】
本明細書において、前記「ストリンジェントな条件」とは、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版〔ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス刊、１９８９〕等に記載の条件が挙げられる。具体的には、例えば、
▲１▼ ６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍＬ 変性断片化サケ精子ＤＮＡと５０％ ホルムアミドを含む溶液中、プローブとともに４２℃で一晩保温するステップ、
▲２▼ 非特異的にハイブリダイズしたプローブを洗浄により除去するステップ、ここで、より精度を高める観点から、より低イオン強度、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、０．１×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、例えば、用いられる核酸のＴｍ値の４０℃下、よりストリンジェントには、３０℃下、さらにストリンジェントには、２５℃下、よりさらにストリンジェントには、１０℃下、具体的には、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、２５℃以上、よりストリンジェントには、３７℃以上、さらにストリンジェントには、４２℃以上、よりさらにストリンジェントには、５０℃以上、より一層ストリンジェントには、６０℃以上等の条件下での洗浄を行なうことにより、例えば、配列番号：１、２、３、４、２３〜４６からなる群より選ばれたアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列と少なくとも約５０％、よりストリンジェントには、６０％以上、さらにストリンジェントには、７０％以上の配列同一性を有する核酸を得ることができる。なお、Ｔｍは、例えば、下記式：
Ｔｍ＝＝８１．５−１６．６ （ｌｏｇ１０［Ｎａ＋ ］）＋０．４１ （％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）
（式中、Ｎはオリゴヌクレオチドの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチド中のグアニン及びシトシン残基の含有量である）
により求められる。
【００２９】
本発明の防御方法及び液胞プロセシング酵素又はその核酸の使用では、液胞プロセシング酵素は、例えば、配列番号：１、２、３及び４からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有する液胞プロセシング酵素と同レベル又はそれ以上の比活性を有する液胞プロセシング酵素であることが望ましい。
【００３０】
液胞プロセシング酵素をコードする核酸の使用においては、該液胞プロセシング酵素をコードする遺伝子を、対象となる植物に適した転写制御エレメントの制御下に配置して得られた核酸（例えば、発現ベクターなどに組み込み得られた組換えベクター等の細胞導入用担体等）を対象となる植物の細胞に導入することにより、該液胞プロセシング酵素を過剰発現させることができる、例えば、植物体よりカルスを得、得られたカルス又は該カルスから得られるプロトプラストに、前記液胞プロセシング酵素をコードする核酸を対象となる植物に適した転写制御エレメントの制御下に配置して得られた核酸を導入することにより行なわれる。
【００３１】
転写制御エレメントとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ等のプロモーター、ターミネーター等が挙げられる。本発明の防御方法においては、前記転写制御エレメントを保持する発現ベクター、例えば、ｐＢＩ１２１等を用いてもよい。
【００３２】
植物への核酸の導入は、プロトプラストへのエレクトロポレーション、アグロバクテリウム法、ウイルスベクターの感染、金粒子を用いた遺伝子銃による導入等により行なわれうる。
【００３３】
なお、本発明には、液胞プロセシング酵素をコードする核酸を含有した細胞導入用担体も含まれる。
【００３４】
本発明の防御方法及び液胞プロセシング酵素の使用においては、液胞プロセシング酵素の生理活性を増強する物質又は液胞プロセシング酵素をコードする遺伝子の発現を誘導しうる物質の感染部位又は感染植物への供給は、例えば、該物質を含有した溶液を感染部位に浸潤させること、該物質を含有した溶液を感染部位に塗布すること、該物質を含有した溶液を感染部位に噴霧すること等により行なわれる。
【００３５】
本発明の防御方法及び液胞プロセシング酵素の使用における「液胞プロセシング酵素の生理活性を増強する物質」及び「液胞プロセシング酵素をコードする遺伝子の発現を誘導しうる物質」としては、例えば、サリチル酸又はその誘導体、エチレン又はその誘導体、具体的には、アセチルサリチル酸、サリチル酸メチル、サリチル酸エチル等が挙げられる。前記「液胞プロセシング酵素の生理活性を増強する物質」及び「液胞プロセシング酵素をコードする遺伝子の発現を誘導しうる物質」は、植物体全体に供給してもよく、局所に投与してもよい。
【００３６】
また、液胞プロセシング酵素の生理活性は、人為的に植物体の一部に物理的な傷を付けることによって、植物体全体において、増強されうる。
【００３７】
また、前記「液胞プロセシング酵素の生理活性を増強する物質」及び「液胞プロセシング酵素をコードする遺伝子の発現を誘導しうる物質」は、
（ａ）液胞プロセシング酵素をコードする核酸を保持した細胞と、被検物質とを接触させるステップ、及び
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた細胞内における液胞プロセシング酵素の発現若しくは活性を評価するステップ、
を含む、植物における病原菌及び／又はウイルス感染の防御剤の候補物質のスクリーニング方法（スクリーニング方法１）、又は
被検物質の存在下、液胞プロセシング酵素の生理活性を測定するステップを含む、植物における病原菌及び／又はウイルス感染の防御剤の候補物質のスクリーニング方法（スクリーニング方法２）を行なうことにより得ることができる。本発明には、前記スクリーニング方法も含まれる。
【００３８】
被検物質としては、核酸、ポリペプチド、オリゴペプチド、その他の高分子有機化合物、低分子化合物等が挙げられる。
【００３９】
前記スクリーニング方法１のステップ（ａ）において、液胞プロセシング酵素をコードする核酸を保持した細胞は、液胞プロセシング酵素をコードする核酸を含有した組換えベクター等を宿主細胞に導入することにより得られうる。
【００４０】
前記宿主細胞としては、植物細胞、酵母細胞、大腸菌、昆虫細胞、動物細胞等が挙げられる。なかでも、好ましくは、植物細胞が望ましい。
【００４１】
また、組換えベクターに用いられるベクターは、前記宿主細胞に応じて適宜選択されうる。具体的には、植物細胞の場合、例えば、ｐＢＩ１２１等、大腸菌の場合、例えば、ＰＥＴ系のベクター等、昆虫細胞の場合、バキュロウイルス等が挙げられる。
【００４２】
液胞プロセシング酵素をコードする核酸を保持した細胞と、被検物質との接触は、例えば、細胞に適した培地に、種々の希釈率となるように被検物質を添加し、得られた培地で、該細胞を生育させること等により行なわれうる。
【００４３】
前記ステップ（ｂ）において、細胞内における液胞プロセシング酵素の発現は、例えば、細胞から無細胞抽出液を調製し、該無細胞抽出液を、該液胞プロセシング酵素に対する抗体を用いたイムノブロット解析に供すること；細胞からｍＲＮＡを得、該液胞プロセシング酵素をコードする核酸を用いて、ノーザンブロット解析に供すること等により評価される。ここで、液胞プロセシング酵素の発現が、被検物質非存在下に比べ、増加した場合、被検物質が、植物における病原菌及び／又はウイルス感染の防御剤の候補物質であることの指標となる。
【００４４】
前記ステップ（ｂ）において、細胞内における液胞プロセシング酵素の生理活性は、例えば、細胞から無細胞抽出液を調製し、該無細胞抽出液について、前記液胞プロセシング酵素の生理活性の評価法により生理活性を測定すること等により評価されうる。ここで、液胞プロセシング酵素の生理活性が、被検物質非存在下に比べ、増加した場合、被検物質が、植物における病原菌及び／又はウイルス感染の防御剤の候補物質であることの指標となる。
【００４５】
なお、前記スクリーニング方法１においては、前記工程（ａ）において、被検物質を用いずに同様の操作を行なって得られた細胞における液胞プロセシング酵素の発現若しくは活性を対照として用いればよい。
【００４６】
スクリーニング方法２において、被検物質の存在下における液胞プロセシング酵素の生理活性の測定は、前記液胞プロセシング酵素の生理活性の評価法に用いられる反応液に、種々の希釈率となるように被検物質を添加し、得られた反応液を用いて、前記液胞プロセシング酵素の生理活性の評価法と同様に生理活性を測定すること等により評価されうる。
【００４７】
なお、前記スクリーニング方法２において、被検物質の非存在下における液胞プロセシング酵素の生理活性を対照として用いればよい。
【００４８】
さらに、液胞プロセシング酵素のプロモーター領域の下流に発現可能に植物体内で発現可能なレポーター遺伝子を導入し、得られた構築物を導入した形質転換植物細胞又は植物と、被検物質とを接触させ、被検物質存在下におけるレポーター遺伝子の発現又はその増大を指標として、植物における病原菌及び／又はウイルス感染の防御剤の候補物質をスクリーニングすることもできる。かかるスクリーニング方法も本発明に含まれる。
【００４９】
ここで、前記レポーター遺伝子としては、β−グルクロニダーゼ等に代表される慣用のレポーター遺伝子が用いられうる。
【００５０】
また、本発明のスクリーニング方法により得られた候補物質は、さらに、病原菌及び／又はウイルス感染植物又は植物における病原菌及び／又はウイルス感染部位に供給し、過敏感細胞死の誘導、増強等を評価してもよい。ここで、候補物質存在下における病原菌及び／又はウイルス感染部位の過敏感細胞死が、該候補物質非存在下における過敏感細胞死に比べて、より早期に起こった場合及び肉眼観察下により明確に観察された場合、候補物質が、植物における病原菌及び／又はウイルス感染の防御能を発揮することを示唆する指標となる。
【００５１】
なお、前記したように、配列番号：１、２、３及び４は、それぞれ、本発明者らにより見出されたタバコ植物の液胞プロセシング酵素である。かかる液胞プロセシング酵素及びそれをコードする核酸も本発明に含まれる。
【００５２】
本発明のタバコ植物の液胞プロセシング酵素は、具体的には、下記（ｉ’）〜（ｉｉｉ’） ：
（ｉ’）配列番号：１、２、３及び４からなる群より選ばれたアミノ酸配列を含有したポリペプチド、
（ｉｉ’）配列番号：１、２、３及び４からなる群より選ばれたアミノ酸配列において、少なくとも１つの残基の置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列からなり、かつ液胞プロセシング酵素の生理活性を有するポリペプチド、及び
（ｉｉｉ’） 配列番号：１、２、３及び４からなる群より選ばれたアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し、かつ液胞プロセシング酵素の生理活性を有するポリペプチド、
からなる群より選ばれたポリペプチドからなる液胞プロセシング酵素である。
【００５３】
また、本発明の液胞プロセシング酵素をコードする核酸は、（Ｉ’）前記（ｉ’）〜（ｉｉｉ’） からなる群より選ばれたポリペプチドをコードする核酸、又は
（ＩＩ’）配列番号：１、２、３及び４からなる群より選ばれたアミノ酸配列をコードする核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、液胞プロセシング酵素の生理活性を有するポリペプチドである核酸
を含有した核酸である。
【００５４】
ここで、「置換、欠失、付加又は挿入」、「配列同一性」及び「ストリンジェントな条件」については、前記と同様である。
【００５５】
【実施例】
以下、実施例により、本発明を詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例により限定されるものではない。
【００５６】
実施例１
Ｎ抵抗性遺伝子を保持するタバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍＬ．ｃｖ．Ｓａｍｓｕｎ）（ＮＮタバコ）及びＮ抵抗性遺伝子欠損タバコ植物（ｎｎタバコ）を、２６℃で６〜８週間、１６時間照光サイクル下で生育させた。充分に生育し、広がった葉に、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に加えたタバコモザイク病ウイルス（ＴＭＶ−ＯＭ、２５μｇ／ｍＬ）を、カーボランダム（６００メッシュ）で葉の表面を擦ることにより接種した。ＴＭＶ感染の後、該植物を３０℃で４０時間維持し、ついで、２３℃で同調壊死病班形成を誘導した。様々な時点で回収した感染葉由来の円盤状組織を液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保存した。
【００５７】
得られた感染タバコ葉について、種々の物質に対する応答を調べた。以下に、その例を示す。
【００５８】
ＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉を３０℃で４０時間インキュベートし、その後、分離した。各種プロテイナーゼインヒビター、具体的には、１ｍＭ ペプスタチンＡの１％（ｖ／ｖ） ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液、１ｍＭ Ｅ−６４の１％（ｖ／ｖ） ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液、１ｍＭ Ａｃ−ＥＳＥＮ−ＣＨＯの１％（ｖ／ｖ） ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液、１ｍＭ Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯの１％（ｖ／ｖ） ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液、１ｍＭ Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯの１％（ｖ／ｖ） ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液、１ｍＭ ＰＭＳＦの１％（ｖ／ｖ） メタノール溶液及び５ｍＭ ＰＭＳＦの５％（ｖ／ｖ）メタノール溶液のそれぞれを、葉に浸潤させた。ついで、１時間後、温度を２３℃にシフトした。
【００５９】
その結果、図１に示されるように、過敏感細胞死を示す特徴的な壊死病斑が、対照では、温度シフト２４時間後での葉で見られるのに対し、ＮＮタバコ葉中のＴＭＶ誘導過敏感細胞死は、カスパーゼ−１インヒビターとして知られているＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯにより、強く阻害されることがわかった。この結果は、植物における細胞死の機構において、動物と同様に、カスパーゼ−１様活性を有する成分が存在することを示唆する。
【００６０】
また、図１に示されるように、液胞プロセシング酵素特異的インヒビターであるＡｃ−ＥＳＥＮ−ＣＨＯにより、壊死病斑形成が阻害されることがわかる。なお、前記Ａｃ−ＥＳＥＮ−ＣＨＯは、不安定であり、ＣＨＯ基が、分子のアスパラギン残基のアミド基と容易に反応するため、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯよりも、より低い阻害作用を示した。一方、カスパーゼ−３インヒビターであるＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯは、壊死病斑形成を阻害しなかった。他のプロテイナーゼのインヒビターであるペプスタチンＡ（アスパラギン酸プロテイナーゼインヒビター） 及びＰＭＳＦ （セリンプロテイナーゼインヒビター） は、壊死病斑形成に対する影響を示さず、Ｅ−６４（パパイン型プロテイナーゼインヒビター） は、わずかな阻害作用を示した。
【００６１】
これらの結果により、植物においては、カスパーゼ−１様プロテイナーゼ及び液胞プロセシング酵素の両方が、タバコ葉におけるＴＭＶ誘導敏感細胞死に寄与することが示唆される。
【００６２】
実施例２
カスパーゼ−１様活性を有するタンパク質を同定するため、非可逆的カスパーゼインヒビターであるビオチン−ｘＶＡＤ−ｆｍｋｔを用いたビオチン化インヒビターブロット解析方法を開発した。なお、図２Ａの左パネルにおける「Ｂｉｏｔｉｎ−ｘＶＡＤ−ｆｍｋ」に示されるように、インヒビター非存在下においても、ビオチン−ｘＶＡＤ−ｆｍｋは、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯと同様に、温度シフト２４時間後に、ＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉において過敏感細胞死を示す壊死病斑の形成を強く阻害する。
【００６３】
前記ビオチン化インヒビターブロット解析方法は、以下のように行なった。
【００６４】
液体窒素中で凍結したタバコ葉を乳鉢と乳棒を用いて磨砕し、５０ｍＭ ＮａＣｌと１ｍＭ ＥＤＴＡとを含有した５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）でホモジナイズした。得られたホモジネートを１５，０００×ｇで４℃にて２０分間遠心分離し、得られた上清をプロテイナーゼインヒビター存在下又は該プロテイナーゼインヒビター非存在下で、０．５ｍＭ ＥＤＴＡと０．５Ｍ ジチオトレイトールとを含有した１００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中、３０℃で１時間プレインキュベートした。
【００６５】
ついで、１００ｍＭ ジチオトレイトールを含有した１００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中、終濃度２０μＭのビオチンｘＶＡＤ−フルオロメチルケトン（ビオチン−ｘＶＡＤ−ｆｍｋ；カルビオケム社製）とともに３０分間インキュベートした。
【００６６】
生成した酵素とビオチンｘＶＡＤ−ｆｍｋとの複合体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜（０．２２μｍ；日本ミリポア社製）に転写した。転写後の膜を、ブロック溶液（組成：５％ スキムミルク）で処理し、次いで、ストレプトアビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼ（３，０００倍希釈；アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）で３０分間処理した。その後、エンハンスドケミルミネセンスキット〔ＥＣＬシステム、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製〕を用いて検出を行なった。
【００６７】
その結果、図２Ａの右パネルのレーン１に示されるように、分子量４０ｋＤａ、３８ｋＤａ及び２３ｋＤａの３つのバンドが、処理葉のブロット上で特異的に検出された）が、図２Ａの右パネルのレーン２に示されるように、未処理葉のブロット上では、検出されなかった。
【００６８】
どの成分がビオチンｘＶＡＤ−ｆｍｋとの標準的なパートナーであるかを明らかにするため、酵素−インヒビター複合体の形成における種々のプロテイナーゼインヒビターの競合作用を同様に調べた。結果を図２Ｂに示す。
【００６９】
その結果、図２Ｂのレーン１に示されるように、プロテイナーゼインヒビター非存在下の場合、４０ｋＤａバンド、３８ｋＤａバンド及び２３ｋＤａバンドが、ブロット上で検出された。また、図２Ｂのレーン５、８及び１１に示されるように、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ（１．０〜５．０ｍＭ）を、ビオチンｘＶＡＤ−ｆｍｋとのコンペティターとした場合、４０ｋＤａバンド及び３８ｋＤａバンドのみが、完全に消失した。また、２つのバンドは、より低い濃度のＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ（０．５ｍＭ）により消失した。前記２３ｋＤａバンドは、図２Ｂのレーン５、８及び１１に示されるように、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯにより消失しなかったが、図２Ｂのレーン４に示されるように、Ｅ−６４により消失した。したがって、前記２３ｋＤａ成分は、ビオチンｘＶＡＤ−ｆｍｋのフルオロメチルケトン基とは反応するが、ＶＡＤ配列とは反応しないことが示唆される。
【００７０】
これらの結果により、４０ｋＤａ及び３８ｋＤａ成分が、ＶＡＤ配列を認識し、ビオチンｘＶＡＤ−ｆｍｋに結合する能力を持つことがわかる。
【００７１】
また、図２Ｂのレーン７ 、１０及び１３に示されるように、４０ｋＤａバンド及び３８ｋＤａバンドのシグナル強度は、ビオチンｘＶＡＤ−ｆｍｋとのコンペティターとしてＡｃ−ＥＳＥＮ−ＣＨＯである液胞プロセシング酵素特異的インヒビターを添加した場合、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯよりも複合体形成を排除する低い能力を示すが、Ａｃ−ＥＳＥＮ−ＣＨＯの場合、該シグナル強度は、濃度依存的な様式で低減することがわかる。これは、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯが、Ａｃ−ＥＳＥＮ−ＣＨＯよりも強く壊死病斑形成を阻害するという前記実施例１における結果と一致した。
【００７２】
また、ペプタスタチンＡ、ＰＭＳＦ、Ｅ−６４又はＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯのいずれもが、ブロット上での４０ｋＤａ及び３８ｋＤａタンパク質複合体形成を阻害しなかった。この結果より、４０ｋＤａタンパク質及び３８ｋＤａタンパク質は、液胞プロセシング酵素に対応することを示唆される。
【００７３】
そこで、４０ｋＤａ及び３８ｋＤａタンパク質が、液胞プロセシング酵素自体であるかどうかを決定するため、抗液胞プロセシング酵素抗体を用いて、ＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉のイムノブロット解析を行なった。イムノブロット解析は、以下のように行なった。
【００７４】
ＳＤＳ試料用緩衝液（組成：０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％ ＳＤＳ、１２％ メルカプトエタノール）を用い、タバコ葉をホモジナイズし、得られたホモジネートを１５，０００×ｇで４℃にて２０分間遠心分離した。得られた上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ミツハシら〔Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ１３、２３６１−２３７２、２００１〕の手法を参照し、イムノブロット解析を行なった。
【００７５】
なお、イムノブロット解析に用いた抗体は、タバコ液胞プロセシング酵素の検出に用いるための黒ヒヨコマメの液胞プロセシング酵素ホモログに対する抗体（１，０００倍希釈）（トヨオカら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１４８、４５３−４６３、２０００）、ＰＲ−１タンパク質に対する抗体、ＰＲ−２タンパク質に対する抗体及びＰＲ−３タンパク質に対する抗体（５，０００倍希釈）（ヤマカワら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１１８、１２１３−１２２２、
１９９８）に対する抗体である。
【００７６】
図２Ｃの左パネルに示されるように、抗液胞プロセシング酵素抗体を用いた場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のゲル上に、４０ｋＤａバンド及び３８ｋＤａバンドが検出された。
【００７７】
また、タバコ葉抽出物を、抗液胞プロセシング酵素抗体との免疫沈降に供し、ついで、上清を、前記と同様の手法により、ビオチニル化−インヒビターブロット解析に供した。
【００７８】
免疫沈降においては、図２Ｃの右パネルに示されるように、４０ｋＤａバンド及び３８ｋＤａバンド両方のシグナル強度が低減した。
【００７９】
これらの結果により、ＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉において、カスパーゼ−１様活性を有するプロテイナーゼは、４０ｋＤａの液胞プロセシング酵素及び３８ｋＤａの液胞プロセシング酵素であることが示唆される。また、これらの結果により、液胞プロセシング酵素が、主に、過敏感細胞死により引き起こされる壊死病斑形成に関与することが示唆される。
【００８０】
実施例３
タバコ葉における両方のプロテイナーゼ活性：Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＭＣＡに対するカスパーゼ−１様活性及びＡｃ−ＥＳＥＮ−ＭＣＡに対する液胞プロセシング酵素活性を測定した。
【００８１】
液体窒素中で凍結したタバコ葉を乳鉢と乳棒を用いて磨砕し、５０ｍＭ ＮａＣｌと１ｍＭ ＥＤＴＡとを含有した５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を用いてホモジナイズした。得られたホモジネートを、１５，０００×ｇで４℃にて２０分間遠心分離し、得られた上清を、０．５ｍＭ ＥＤＴＡと０．５Ｍ ジチオトレイトールとを含有した１００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中、３０℃で１時間プレインキュベートした。
【００８２】
プレインキュベート後に得られた産物に、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＭＣＡ（５００μＭ）又はＡｃ−ＥＳＥＮ−ＭＣＡ（５００μＭ）を添加することにより、反応を開始し、蛍光分光測光器（マイクロプレートリーダー、ＧＥＮｉｏｓ；ＴＥＣＡＮ社製）を用いて、反応混合物の蛍光の増加を４６５ｎｍにて測定した。
【００８３】
その結果、図３のパネルＡに示されるように、カスパーゼ−１様活性は、ＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉において、温度シフト３時間後、最大レベルまで急速に増加し、ついで、徐々に対照レベルまで下降した。一方、図３のパネルＢに示されるように、液胞プロセシング酵素活性の変動は、カスパーゼ−１様活性の変動と平行していた。また、カスパーゼ−１様活性及び液胞プロセシング酵素活性の両方の活性は、ｍｏｃｋ感染ＮＮタバコ葉においては、非常にゆっくりと増えたが、ＴＭＶ感染ｎｎタバコ葉では、全く増えなかった。
【００８４】
この結果により、カスパーゼ−１様活性を有するプロテイナーゼが、液胞プロセシング酵素自体であるという仮説が裏付けられた。また、カスパーゼ−１様活性を有する液胞プロセシング酵素は、タバコ葉の過敏感反応の初期で速やかに誘導されることが示唆された。
【００８５】
実施例４
温度シフト３時間後でのＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉におけるカスパーゼ−１基質及び液胞プロセシング酵素特異的基質に対する活性における種々のインヒビターの作用を調べた。
【００８６】
インヒビターとして、０．５ｍＭ ペプスタチンＡ、１ｍＭ及び５ｍＭ ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）、０．５ｍＭ Ｅ−６４［（Ｌ−３−トランス−カルボキシオキシラン−２−カルボニル）−Ｌ−ロイシルアグマチニン］、１ｍＭ Ａｃ−ＥＳＥＮ−ＣＨＯ、１ｍＭ Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ並びに１ｍＭ Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ（ペプチド・インスティテュート社製）を用いた。
【００８７】
液体窒素中で凍結したタバコ葉を乳鉢と乳棒を用いて磨砕し、５０ｍＭ ＮａＣｌと１ｍＭ ＥＤＴＡとを含有した５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を用いてホモジナイズした。得られたホモジネートを、１５，０００×ｇで４℃にて２０分間遠心分離し、得られた上清を、前記インヒビター存在下又はインヒビター非存在下に、０．５ｍＭ ＥＤＴＡと０．５Ｍ ジチオトレイトールとを含有した１００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中、３０℃で１時間プレインキュベートした。
【００８８】
プレインキュベート後に得られた産物に、各蛍光性基質（終濃度２００μＭ）を添加することにより、反応を開始し、蛍光分光測光器（マイクロプレートリーダー、ＧＥＮｉｏｓ；ＴＥＣＡＮ社製）を用いて、反応混合物の蛍光の増加を４６５ｎｍにて測定した。
【００８９】
その結果、図３のパネルＣに示されるように、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＭＣＡに対するカスパーゼ−１様活性は、カスパーゼ−１インヒビターであるＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯにより、インヒビター非存在下の活性の７９％まで競合的に阻害され、カスパーゼ−３インヒビターであるＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯにより、インヒビター非存在下の活性の４７％まで阻害された。
【００９０】
一方、図３のパネルＤに示されるように、液胞プロセシング酵素活性は、液胞プロセシング酵素特異的インヒビターであるＡｃ−ＥＳＥＮ−ＣＨＯにより、インヒビター非存在下の活性の６５％まで競合的に阻害された。
【００９１】
また、図３のパネルＣに示されるように、カスパーゼ−１様活性が、液胞プロセシング酵素特異的インヒビターにより６３％まで阻害されたこと及び図３のパネルＤに示されるように、液胞プロセシング酵素活性が、カスパーゼ−１インヒビターにより７２％まで阻害された。
【００９２】
ペプタスタチンＡ、ＰＭＳＦ及びＥ−６４のいずれも、いかなる活性におけるいかなる作用も示さなかった。各活性における交差阻害様式は、液胞プロセシング酵素が、ＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉で誘導されたカスパーゼ−１様活性に応答しうることを示唆した。
【００９３】
実施例５
昆虫細胞においてアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の液胞プロセシング酵素γＶＰＥを発現させ、液胞プロセシング酵素及びカスパーゼの基質を用いて、精製液胞プロセシング酵素の活性を測定した。
【００９４】
アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ） γＶＰＥは、バキュロウイルス発現系（インビトロゲン社製）を用い、既報（クロヤナギら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、４３、１４３−１５１、２００２）に記載の方法に準じ、作製した。
【００９５】
組換えアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ） γＶＰＥ（１．６〜４．０μｇ相当量）を０．５ｍＭ ＥＤＴＡと０．５Ｍ ジチオトレイトールとを含有した１００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中、３０℃で１時間プレインキュベートした。
【００９６】
プレインキュベート後に得られた産物に、蛍光基質であるＡｃ−ＹＶＡＤ−ＭＣＡ又はＡｃ−ＥＳＥＮ−ＭＣＡを添加することにより、反応を開始し、蛍光分光測光器（マイクロプレートリーダー、ＧＥＮｉｏｓ；ＴＥＣＡＮ社製）を用いて、反応混合物の蛍光の増加を４６５ｎｍにて測定した。なお、活性測定時において、８０〜４００μＭの各蛍光基質を用いることによりＫｍ 値を求めた。
【００９７】
その結果、図３Ｅに示されるように、液胞プロセシング酵素は、カスパーゼ−１基質（Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＭＣＡ）に対する活性を示し、Ｋｍ 値は、４４．２μＭであり、標準カスパーゼ−１のＫｍ 値（１１−２３μＭ）よりもわずかに高く、液胞プロセシング酵素特異的基質（Ａｃ−ＥＳＥＮ−ＭＣＡ）に対するＫｍ 値（３０．３μＭ）に匹敵した。対照的に、前記液胞プロセシング酵素は、カスパーゼ−３基質（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＭＣＡ）又は液胞プロセシング酵素特異的基質の誘導体（Ａｃ−ＥＳＥＤ−ＭＣＡ）のいずれに対しても活性を示さなかった。また、液胞プロセシング酵素は、Ａｃ−ＥＳＥＮ−ＭＣＡにおけるアスパラギン残基だけでなく、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＭＣＡにおけるアスパラギン酸をも認識した。これらの結果により、液胞プロセシング酵素は、カスパーゼ−１様活性を有することがわかる。
【００９８】
実施例６
ＲＴ−ＰＣＲにより、タバコ葉から、液胞プロセシング酵素をコードするｃＤＮＡのクローニングを行なった。
【００９９】
クローニングには、温度を３０℃から２３℃にシフトした後の異なる時点におけるＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉を使用した。タバコ葉（１００ｍｇ）を液体窒素中で凍結し、乳鉢と乳棒で磨砕した。
【０１００】
ついで、商品名：ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉキット（キアゲン社製製）を用いて全ＲＮＡを単離し、得られた全ＲＮＡを、５Ｕ ＲＮアーゼ無含有ＤＮアーゼ Ｉにより３７℃で３０分間処理した。ついで、処理後の産物について、フェノール／クロロホルム抽出を行ない、精製ＲＮＡを得た。
【０１０１】
前記精製ＲＮＡ（１μｇ相当量）を７０℃で１０分間加熱し、５０ｐｍｏｌのオリゴｄ（Ｔ）１８プライマーを含有した反応液 ５０μＬ中において、商品名：Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ＲＴ−ＰＣＲビーズ（タカラバイオ社製）を用い、４２℃で３０分間の逆転写反応を行なった。ついで、得られた反応産物（１μＬ）と、１ＵのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）と１００ｐｍｏｌの各プライマーとを含むＰＣＲ反応液（Ｅｘ Ｔａｑ緩衝液、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ） ５０μＬを用い、ＰＣＲを行なった。
【０１０２】
前記プライマーは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の液胞プロセシング酵素の保存配列［ＷＡＶＬＶＡＧ （配列番号：５）、ＨＱＡＤ（Ｖ／Ｉ）ＣＨＡ（配列番号：６）、ＰＬＶＤＤＷ（配列番号：７）及びＮＱＲＤ（Ａ／Ｖ）（Ｄ／Ｈ）Ｌ （配列番号：８）］に基づいて設計した。具体的には、プライマーは、
Ｆｗｄ１：５’−ｔｇｇｇｃｉｒｔｉｙｔｉｂｔｉｇｃｉｇｇ−３’ （配列番号：９）、
Ｆｗｄ２：５’−ｃａｙｃａｒｇｃｉｇａｙｒｔｉｔｇｙｃａｙｇｃ−３’ （配列番号：１０）、
Ｒｅｖ３：５’−ｃｃａｒｔｃｒｔｃｉａｃｉａｒｉｇｇ−３’ （配列番号：１１）、
Ｒｅｖ４：５’−ａｒｒｔｓｉｒｃｒｔｃｉｃｋｙｔｇｒｔｔ−３’ （配列番号：１２）、
（前記配列中、ｉ：イノシン、ｂ：シトシン、グアニン及びチミンの混合物、ｋ：グアニン及びチミンの混合物、ｒ：アデニン及びグアニンの混合物、ｓ：シトシン及びグアニンの混合物、ｙ：シトシン及びチミン）である。前記Ｆｗｄ１プライマーとＲｅｖ４プライマーとの組み合わせを、１次ＰＣＲで用い、Ｆｗｄ２プライマーとＲｅｖ３プライマーとの組み合わせをｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲで用いた。反応条件は、９５℃で５分間インキュベートした後、９５℃で４０秒と５０℃で６０秒と７２℃で９０秒とを１サイクルとする反応を３５サイクル行い、最後に７２℃で７分間インキュベートする条件である。
【０１０３】
得られた増幅産物を、ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−ベクター（ノバジェン社製）に連結し、該増幅産物の配列を決定した。タバコＶＰＥの上流配列及び下流配列を決定するため、５’ −Ｆｕｌｌ ＲＡＣＥ Ｃｏｒｅ Ｓｅｔ及び３’ −ＦｕｌｌＲＡＣＥ Ｃｏｒｅ Ｓｅｔ（タカラバイオ社製）を使用した。
【０１０４】
その結果、４つの液胞プロセシング酵素をコードするｃＤＮＡが単離された。得られた４つの液胞プロセシング酵素を、それぞれ、ＮｔＶＰＥ−１ａ、ＮｔＶＰＥ−１ｂ、ＮｔＶＰＥ−２及びＮｔＶＰＥ−３と称する。
【０１０５】
４つのＮｔＶＰＥの予想アミノ酸配列とアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ） γＶＰＥのアミノ酸配列とを比較した結果を、図４Ａに示す。その結果、ＮｔＶＰＥアミノ酸配列とγＶＰＥアミノ酸配列間の同一性は、約６４．３％以上であった。
【０１０６】
また、液胞プロセシング酵素には、ヒトカスパーゼ−１における触媒２分子のＨｉｓ−２３７及びＣｙｓ−２８５に相当する触媒２分子の２残基（Ｈｉｓ及びＣｙｓ）がよく保存されていることがわかった。液胞プロセシング酵素の活性部位のペンタペプチドＥ（Ａ／Ｇ）ＣＥＳ（配列番号：１３）は、カスパーゼ−１の活性部位のペンタペプチドＱＡＣＲＧ（配列番号：１４）に類似することがわかった。
【０１０７】
また、カスパーゼ−１のＡｓｐポケットを形成する３つの必須アミノ酸Ａｒｇ−１７９、Ａｒｇ−３４１及びＳｅｒ−３４７のそれぞれは、液胞プロセシング酵素に保存されていた。
【０１０８】
この結果により、液胞プロセシング酵素の基質ポケットが、カスパーゼ−１のＡｓｐポケットと類似することを示唆する。また、これは、タバコ液胞プロセシング酵素が、カスパーゼインヒビターＡｃ−ｘＶＡＤ−ｆｍｋ及びＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯと結合したという結果と一致した。
【０１０９】
アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の液胞プロセシング酵素及びトウゴマの液胞プロセシング酵素は、プレプロタンパク質前駆体として、合成され、翻訳に伴って、Ｎ末端プロペプチド及びＣ末端プロペプチドを有するプロタンパク質前駆体に変換されることを示している（図４Ｂ）。不活性プロタンパク質前駆体は、Ｃ末端プロペプチド及びＮ末端プロペプチドの逐次除去により自己触媒的に活性化される。同様に、カスパーゼ−１は、不活性前駆体として合成され、ついで、液胞プロセシング酵素で起こるように、自己触媒的に活性成熟酵素に変換される。カスパーゼ前駆体は、Ｃ末端プロペプチドをもたないが、除去されるリンカーペプチドを有する（図４Ｂ）。
【０１１０】
実施例７
タバコ植物におけるＮｔＶＰＥ−１ａ、ＮｔＶＰＥ−１ｂ、ＮｔＶＰＥ−２及びＮｔＶＰＥ−３それぞれのｍＲＮＡ発現レベルを調べるため、前記実施例６と同様に、ＲＴ−ＰＣＲを行なった。
【０１１１】
前記実施例６と同様にして得られたＤＮアーゼＩ処理ＲＮＡ（２μｇ）を用い、４２℃で３０分間の逆転写反応を行なった。
【０１１２】
ついで、得られた反応液（２μＬ）と、ＮｔＶＰＥ−１特異的プライマー対として
５’−ｇｇｇｔｇｇｔｃｔｃａａａｇａｔｇａｇａａｃａｔｔｇ−３’ （配列番号：１５）及び
５’−ｇｔａｔａｇａｇｃａｔｃｃｔｔｇｃｔｇ−３’ （配列番号：１６）、
ＮｔＶＰＥ−２特異的プライマー対として、
５’−ａｇｇｇｃａｔｃａｔｇｔｔａｃａｇｃｃ−３’ （配列番号：１７）及び
５’−ｇｇｇａａａｇａｇｇａｔｃａｔｃｃａｔｔａｇｃｔｔｃ−３’ （配列番号：１８）、
ＮｔＶＰＥ−３特異的プライマー対として、
５’−ａａｇｇａｇｔｔａｔｃａｔｃａａｔａｇｔｃｃｔｇｃ−３’ （配列番号：１９）
５’−ｇｔａｃａｔｇａａｃａｇａｇａａｔｃｃａｔａｃｃｃ−３ （配列番号：２０）
のそれぞれの特異的プライマー対 ５０ｐｍｏｌを含むＰＣＲ反応液（Ｅｘ Ｔａｑ緩衝液、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ） ２０μＬを用い、ＰＣＲを行なった。なお、アクチンに対するプライマー対〔５’−ａｔｇｇｃａｇａｃｇｇｔｇａｇｇａｔａｔｔｃａ−３’ （配列番号：２１）及び５’−ｇｃｃｔｔｔｇｃａａｔｃｃａｃａｔｃｔｇｔｔｇ−３’ （配列番号：２２）〕を対照実験として使用した。
【０１１３】
ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間インキュベートした後、９５℃で４０秒と５２−６０℃で６０秒と７２℃で６０秒とを１サイクルとする反応を２５−２８サイクル行い、最後に７２℃で７分間インキュベートする条件である。
【０１１４】
その結果、図５Ａに示されるように、ＮｔＶＰＥ ｍＲＮＡは、ＮＮタバコ葉におけるＴＭＶ誘導過敏感反応のごく初期段階で、１時間で最大レベルに達し、ＮｔＶＰＥ ｍＲＮＡのレベルの速やかでかつ一過的に増加することがわかった。
【０１１５】
図５Ａに示されるように、ＮｔＶＰＥ ｍＲＮＡの一過性発現は、酸性及び塩基性病原関連タンパク質（ＰＲ−１）両方のｍＲＮＡの発現に先立っていた。
【０１１６】
また、図５Ａ及び図５Ｃに示されるように、発現は、はるかに壊死病斑形成に先んじ、ＮｔＶＰＥ ｍＲＮＡは、約８時間の時点で消失し、葉で、壊死病斑を形成しはじめた。
【０１１７】
ＮｔＶＰＥ ｍＲＮＡのレベルは、ｍｏｃｋ感染ＮＮタバコ葉での温度シフト後、わずかに、ゆるやかに誘導された。葉の左半分における誘導は、葉の右半分におけるＴＭＶ感染による全体的な作用によると思われる。一方、ＮｔＶＰＥ ｍＲＮＡは、ＴＭＶ感染ｎｎタバコ葉において、ほんのわずかに増加した。
【０１１８】
また、図５Ｂに示されるように、ＮＮタバコ葉でのＴＭＶ誘導過敏感反応の際の液胞プロセシング酵素レベルは、３時間で速やかに最大レベルに増加し、６時間まで高いままであり、その後、基底レベルに減少した。
【０１１９】
図５Ａ及び図５Ｂに示されるように、生育中における液胞プロセシング酵素のレベルの変動は、対応のｍＲＮＡレベルの変動に類似していた。一方、ｍｏｃｋ感染ＮＮタバコ葉において、液胞プロセシング酵素の量は、温度シフト後、わずかに、増加した。液胞プロセシング酵素は、ＴＭＶ感染ｎｎタバコ葉で誘導されなかった。
【０１２０】
ついで、ビオチンｘＶＡＤ−ｆｍｋを用い、前記実施例２と同様のビオチニル化インヒビターブロットにより、カスパーゼ−１インヒビターに結合する活性型の液胞プロセシング酵素のレベルの変動を決定した。
【０１２１】
図６に示されるように、温度シフト後０時間から１２時間後のＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉のビオチニル化インヒビターブロットの結果、ビオチンｘＶＡＤ−ｆｍｋに結合する４０ｋＤａ液胞プロセシング酵素及び３８ｋＤａ液胞プロセシング酵素のレベルは、３時間で最大に達し、ついで、対照レベルに徐々に下降した。また、４０ｋＤａ液胞プロセシング酵素及び３８ｋＤａ液胞プロセシング酵素のレベルは、ＴＭＶ誘導過敏感反応が起こらないＴＭＶ感染ｎｎタバコ葉で増加せず、ｍｏｃｋ感染ＮＮタバコ葉でわずかに増加した。４０ｋＤａ及び３８ｋＤａ活性ＶＰＥのレベルは、ＴＭＶ誘導過敏感反応増加した。
【０１２２】
このらの結果により、ＮｔＶＰＥ ｍＲＮＡの発現、液胞プロセシング酵素の発現及び液胞プロセシング酵素活性の全てが、ＴＭＶ誘導過敏感反応の初期段階で、迅速、かつ一過的に誘導されることが示唆される。
【０１２３】
実施例８
Ｎ抵抗性遺伝子を保持するタバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍＬ．ｃｖ．Ｓａｍｓｕｎ）（ＮＮタバコ）を、２６℃で６〜８週間、１２時間照光サイクル下で生育させた。充分に生育し、広がった葉に、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に加えたタバコモザイク病ウイルス（ＴＭＶ−ＯＭ、２５μｇ／ｍＬ）を、カーボランダム（６００メッシュ）で葉の表面を擦ることにより接種した。ＴＭＶ感染の後、前記植物を３０℃で４０時間維持し、分離した。ついで、前記植物を、２３℃での温度シフト１時間前、温度シフト１時間後、３時間後、６時間後、９時間後及び１２時間後、インヒビターを浸潤させ、ＮＮタバコ葉における壊死病斑形成におけるインヒビターの作用を調べた。
【０１２４】
その結果、図７に示されるように、過敏感細胞死を示す壊死病斑の形成は、温度シフト１時間後まで浸潤させた場合、インヒビターにより強く阻害された。また、温度シフト３時間後、浸潤させた場合、壊死病斑形成は、わずかに阻害された。さらに、温度シフト６時間後、浸潤させた場合、壊死病斑形成は阻害されなかった。
【０１２５】
これらの結果により、液胞プロセシング酵素が、ＮＮタバコ葉におけるＴＭＶ誘導過敏感細胞死のシグナル伝達経路の初期プロセスに機能することが示唆される。
【０１２６】
実施例９
シロイヌナズナの液胞プロセシング酵素（γＶＰＥ；アクセッションナンバーＤ６１３９５）のプロモータを含む領域（開始コドンを起点として−２０３６から＋１１の上流部分）にβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を繋いだキメラ遺伝子を導入した形質転換シロイヌナズナを作製した。この植物体に種々の化合物を与えた後にＧＵＳ染色を行なったところ、サリチル酸（２．５ｍＭ）とエチレン（１００μＬ／Ｌ）処理によって植物体が明らかに青く染まり、顕著なＧＵＳ遺伝子の発現を示した。したがって、サリチル酸が、病原菌及び／又はウイルス感染の防御剤の候補物質として選別された。
【０１２７】
【発明の効果】
本発明の植物に対する病原菌及び／又はウイルス感染の防御方法によれば、植物における病原菌及び／又はウイルス感染を防除又は抑制し、病原菌及び／又はウイルスに感染した植物における感染部位の拡大を抑制することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の植物に対する病原菌及び／又はウイルス感染を防御するための液胞プロセシング酵素又はそれをコードする核酸の使用によれば、植物における病原菌及び／又はウイルス感染を防除又は抑制し、病原菌及び／又はウイルスに感染した植物における感染部位の拡大を抑制し、病原菌及び／又はウイルス感染に対する植物の耐性能を増強し、植物における病原菌及び／又はウイルス感染部位の拡大に対する抑制能を増強することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の植物における病原菌及び／又はウイルス感染の防御剤の候補物質のスクリーニング方法によれば、植物に対する病原菌及び／又はウイルス防除剤等の開発を可能にする物質を容易に、大量にスクリーニングすることができるという優れた効果を奏する。
【０１２８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＮＮタバコ葉のＴＭＶ感染部位に、温度シフト前に各種物質を浸潤させた２４時間後の葉を観察した結果を示す。
【図２】図２は、植物におけるカスパーゼ−１様活性を有するタンパク質を同定を行なった結果を示す。パネルＡにおいて、左パネルは、温度シフト前に１ｍＭ ビオチン−ｘＶＡＤ−ｆｍｋの浸潤の有無によるＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉の温度シフト２４時間後における結果であり、右パネルは、ビオチン化インヒビターブロット解析の結果を示す。前記右パネルにおいて、レーン１は、温度シフト２４時間後のビオチン−ｘＶＡＤ−ｆｍｋ処理葉、レーン２は、温度シフト６時間後の未処理葉を示す。また、パネルＢは、プロテアーゼインヒビターの存在下又は非存在下の場合のビオチン化インヒビターブロット解析の結果を示す。パネルＣにおいて、左パネルは、葉抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、抗ＶＰＥ抗体を用いてイムノブロットに供した結果を示し、右パネルは、葉抽出物を、抗ＶＰＥ抗体を用いて免疫沈降させ、上清をビオチン化インヒビターブロットに供した結果を示す。分子量をｋＤａで示す。
【図３】図３は、カスパーゼ−１様活性と液胞プロセシング酵素活性との比較の結果を示す。パネルＡは、タバコ葉における、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＭＣＡに対するカスパーゼ−１様活性レベルの成長過程での変化を示し、パネルＢは、タバコ葉におけるＡｃ−ＥＳＥＮ−ＭＣＡに対するＶＰＥ活性の成長過程での変化を示す。パネルＣは、タバコ葉における、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＭＣＡに対するカスパーゼ−１様活性に対する種々のインヒビターの作用を示し、パネルＤは、タバコ葉における、Ａｃ−ＥＳＥＮ−ＭＣＡに対するＶＰＥ活性に対する種々のインヒビターの作用を示す。パネルＥは、ＶＰＥ基質（Ａｃ−ＥＳＥＮ−ＭＣＡ）、ＶＰＥ基質（Ａｃ−ＥＳＥＤ−ＭＣＡ）の誘導体、カスパーゼ−１基質（Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＭＣＡ）及びカスパーゼ−３基質（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＭＣＡ）に対するアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）液胞プロセシング酵素γＶＰＥのＫｍ 値を示す。パネルＥにおいて、ｎ．ｄ．は未検出を示す。
【図４】図４は、タバコ植物の４種類の液胞プロセシング酵素（ＮｔＶＰＥ−１ａ、ＮｔＶＰＥ−１ｂ、ＮｔＶＰＥ−２及びＮｔＶＰＥ−３）の構造解析の結果を示す。パネルＡは、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）液胞プロセシング酵素γＶＰＥと、タバコ植物の４種類の液胞プロセシング酵素との間のアミノ酸配列の配列同一性を示す。数値は、プログラムＤＮＡＳＩＳ（日立製作所社製）にて算出したアミノ酸配列同一性（％）を示す。パネルＢは、ヒトカスパーゼ−１及び植物ＶＰＥの構造の模式図を示す。ヒトカスパーゼ−１及び植物ＶＰＥは、プロタンパク質前駆体として合成され、次いで、プロペプチド（白四角）及びリンカーペプチド（灰色四角）の除去後に、それぞれの成熟形態（黒四角）に変換される。ｈカスパーゼ−１の必須アミノ酸及びタバコＶＰＥの対応するアミノ酸（ＮｔＶＰＥ−１ａ）を黒四角で示す。
【図５】図５は、ＮＮタバコ葉におけるＴＭＶ誘導性過敏感反応中の、ＮｔＶＰＥのｍＲＮＡ及びタンパク質の両方の初期発現及び一過性発現を調べた結果を示す。パネルＡは、ＮｔＶＰＥ ｍＲＮＡレベルの成長過程での変化を示し、左パネルは、ＲＴ−ＰＣＲの結果であり、右パネルは、ＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉におけるＮｔＶＰＥ−１及び塩基性ＰＲ−１のｍＲＮＡレベルを光学濃度的に検出し、相対量を、ＮｔＶＰＥ−１では温度シフトの１時間後、塩基性ＰＲ−１では温度シフトの１２時間後での最大値に対する割合で示した結果である。パネルＢは、ＮｔＶＰＥタンパク質レベルの成長過程での変化を示し、左パネルは、イムノブロットの結果であり、右パネルは、ＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉におけるＮｔＶＰＥタンパク質、ＰＲ−１、ＰＲ−２及びＰＲ−３のレベルを光学濃度的に測定し、ＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉における相対量を、ＮｔＶＰＥでは温度シフトの３時間後、ＰＲ−１では温度シフトの１２時間後での最大値に対する割合で示した結果である。パネルＣは、温度シフト後、表示された時間におけるＮＮタバコ葉の形態学的変化を示す。
【図６】図６は、ＮＮタバコ葉のＴＭＶ誘導性過敏感反応の際のＮｔＶＰＥのに関するビオチン化インヒビターブロットの結果を示す。パネルＡは、ビオチン化インヒビターブロットであり、パネルＢは、パネルＡにおけるビオチン化インヒビターに結合したＮｔＶＰＥの量を光学濃度的に測定した結果である。パネルＢにおいて、相対量を、ＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉において温度シフトの３時間後の最大値に対する割合で示す。
【図７】図７は、１ｍＭ Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ（ＶＰＥ／カスパーゼ−１インヒビター）をＴＭＶ感染ＮＮタバコ葉に浸潤させ、温度シフト２４時間後に観察した結果を示す。
Claims (11)
- 植物内において、液胞プロセシング酵素を過剰発現させることを特徴とする、植物に対する病原菌及び／又はウイルスの感染の防御方法。
- 植物が、アブラナ科植物、ウリ科植物、ナス科植物、マメ科植物、ゴマ科植物、イネ科植物、ミカン科植物及びヒルガオ科植物からなる群より選ばれた植物に由来するものである、請求項１記載の防御方法。
- 植物に対する病原菌及び／又はウイルス感染拡大を抑制する、請求項１又は２記載の防御方法。
- 液胞プロセシング酵素が、タバコ、シロイヌナズナ、アブラナ、ナズナ、ダイコン、キャベツ、カボチャ、キュウリ、メロン、スイカ、タバコ、トマト、ジャガイモ、ピーマン、ナス， ダイズ、エンドウ、アズキ、ラッカセイ、インゲンマメ、ソラマメ、ゴマ、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、ミカン、ユズ及びサツマイモからなる群より選ばれた植物に由来するものである、請求項１〜３いずれか１項に記載の防御方法。
- 植物に対する病原菌及び／又はウイルスの感染を防御するための液胞プロセシング酵素又はそれをコードする核酸の使用。
- 液胞プロセシング酵素が、
（ｉ）配列番号：１、２、３、４、２３〜４６からなる群より選ばれたアミノ酸配列を含有したポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号：１、２、３、４、２３〜４６からなる群より選ばれたアミノ酸配列において、少なくとも１つの残基の置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列からなり、かつ液胞プロセシング酵素の生理活性を有するポリペプチド、及び
（ｉｉｉ） 配列番号：１、２、３、４、２３〜４６からなる群より選ばれたアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し、かつ液胞プロセシング酵素の生理活性を有するポリペプチド、
からなる群より選ばれたポリペプチドである、請求項５記載の使用。 - 液胞プロセシング酵素をコードする核酸が、
（Ｉ）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ） ：
（ｉ）配列番号：１、２、３、４、２３〜４６からなる群より選ばれたアミノ酸配列を含有したポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号：１、２、３、４、２３〜４６からなる群より選ばれたアミノ酸配列において、少なくとも１つの残基の置換、欠失、付加若しくは挿入を有するアミノ酸配列からなり、かつ液胞プロセシング酵素の生理活性を有するポリペプチド、及び
（ｉｉｉ） 配列番号：１、２、３、４、２３〜４６からなる群より選ばれたアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し、かつ液胞プロセシング酵素の生理活性を有するポリペプチド、
のいずれかのポリペプチドをコードする核酸、又は
（ＩＩ）配列番号：１、２、３、４、２３〜４６からなる群より選ばれたアミノ酸配列をコードする核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、液胞プロセシング酵素の生理活性を有するポリペプチドである核酸、
である、請求項５記載の使用。 - （ａ）液胞プロセシング酵素をコードする核酸を保持した細胞と、被検物質とを接触させるステップ、及び
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた細胞内における液胞プロセシング酵素の発現又は活性を評価するステップ、
を含む、植物における病原菌及び／又はウイルスの感染の防御剤の候補物質のスクリーニング方法。 - 被検物質の存在下、液胞プロセシング酵素の生理活性を測定するステップを含む、植物における病原菌及び／又はウイルス感染の防御剤の候補物質のスクリーニング方法。
- 下記（ｉ’）〜（ｉｉｉ’） ：
（ｉ’）配列番号：１、２、３及び４からなる群より選ばれたアミノ酸配列を含有したポリペプチド、
（ｉｉ’）配列番号：１、２、３及び４からなる群より選ばれたアミノ酸配列において、少なくとも１つの残基の置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列からなり、かつ液胞プロセシング酵素の生理活性を有するポリペプチド、及び
（ｉｉｉ’） 配列番号：１、２、３及び４からなる群より選ばれたアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し、かつ液胞プロセシング酵素の生理活性を有するポリペプチド、
からなる群より選ばれたポリペプチドからなる液胞プロセシング酵素。 - （Ｉ’）請求項１０に記載されたポリペプチドをコードする核酸、又は
（ＩＩ’）配列番号：１、２、３及び４からなる群より選ばれたアミノ酸配列をコードする核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、液胞プロセシング酵素の生理活性を有するポリペプチドである核酸
を含有してなる、液胞プロセシング酵素をコードする核酸。
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| JP2003079185A JP2004283078A (ja) | 2003-03-20 | 2003-03-20 | 植物における病原菌及びウイルスの感染の防御方法 |
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|---|---|---|---|---|
| WO2006070815A1 (ja) * | 2004-12-28 | 2006-07-06 | Kyoto University | フザリウム毒抵抗性形質転換植物 |
| WO2008074891A3 (en) * | 2006-12-21 | 2008-09-04 | Basf Plant Science Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and a method for method for making the same |
-
2003
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