【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は細胞表層に発現した目的タンパク質と他のタンパク質又は低分子化合物との相互作用を検出する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年様々な生物のゲノム解析が進展した結果、今後の生物学はゲノムがコードするタンパク質の機能、及びタンパク質間の相互作用の解析が中心になると考えられており、「プロテオーム解析」を呼ばれる領域が形成されている。
【０００３】
この「プロテオーム解析」においてタンパク質間相互作用は、機能発現や疾患のメカニズム解析等の観点から非常に重要であり、種々の解析法が提案されている。例えば「酵母２ハイブリッド法」はその代表であり、包括的なタンパク質間相互作用解析が可能である。しかし酵母２ハイブリッド法は、原理的に核内でのタンパク質間相互作用を検出する手法であり、核内に移行できないタンパク質には適用できない。またタンパク質間相互作用をＤＮＡの転写活性により間接的に検出する為、偽陽性や偽陰性の発生頻度が高いという問題点も有している。
【０００４】
またタンパク質間の相互作用をＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）により検出する手法も開発されている。しかし、目的タンパク質を単離、精製する必要がある上に、蛍光性色素での標識等が必要であるという問題点があり、包括的なタンパク質間相互作用には適していなかった。
【０００５】
この様な問題に対して、タンパク質間相互作用を無標識で検出可能な表面プラズモン共鳴法が近年注目されている。「表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：以下、ＳＰＲと略称することがある）」とは、金属薄膜が被着されたガラス中を光が進み界面で全反射するとき、界面で生じるエバネッセント波と金属薄膜において生じる表面プラズモン波の波数が一致して起こる共鳴であり、この共鳴が起こると反射光の強度が減少する。表面プラズモン波は金属薄膜表面上で生じるので、その極く近傍の媒質に濃度変化や質量変化があれば、表面プラズモン波が変化し、それに応じて反射光の強度を減少させる入射角が変化する。この原理に従い、反射光の強度を減少させる入射角の変化を共鳴シグナルとして求めることができる〔１０−４度の変化を１ＲＵ（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｕｎｉｔ）と呼ぶ〕。表面プラズモン共鳴を応用して蛋白質の相互作用などを測定するためのＳＰＲバイオセンサーについては、例えば、「蛋白質 核酸 酵素、Ｖｏｌ．３７、（１９９２）」の５３〜６０頁及び８１〜８７頁に詳述されている。
【０００６】
従ってＳＰＲバイオセンサーを用いることにより、目的タンパク質について蛍光色素等で標識することなく結合定数等を定量的に解析できる。もっとも、従来のタンパク質間相互作用検出法と同様に、ＳＰＲにより特定のタンパク質間相互作用を検出するためには被験物質である目的タンパク質をアフィニティークロマトグラフィー等の煩雑な手法により精製する必要があるという問題点があった。また、細胞膜又は細胞壁中に発現したタンパク質と他のタンパク質との相互作用を検出するための簡便な手法は従来提供されていないが、その理由は膜タンパク質の単離及び精製が容易ではないことにある。特開２００１−２０８７５５号公報には「細胞膜をリン脂質の存在下に金属薄膜表面に固定化し、該細胞膜と相互作用する物質を選択することを特徴とする表面プラズモン共鳴による生理活性物質のスクリーニング方法」が開示されているが、この方法においても、膜タンパク質を一旦単離して精製した後に金属薄膜表面へ固定化する必要があった。
【０００７】
この様な問題を解決するための手段として、表層に目的タンパク質を発現した細胞を直接用い、他のタンパク質との相互作用を検出することは非常に有効である。目的タンパク質が膜タンパク質である場合には、そのタンパク質を単離及び精製することなく、簡便な遠心分離により細胞表層に目的タンパク質を発現させた細胞を容易に分離した後、直接他のタンパク質との相互作用を検出できる。目的タンパク質が膜タンパク質でない場合でも、他の膜タンパク質との融合タンパク質として発現させることによりアフィニテイークロマトグラフィー等の煩雑な手法により精製することなく、同様に簡便な遠心分離により細胞表層に目的タンパク質を発現させた細胞を分離して、直接他のタンパク質との相互作用検出を検出できる。従って、細胞表層に発現された目的タンパク質と他のタンパク質との相互作用をＳＰＲにより直接検出する手法は、煩雑なタンパク質精製や色素標識等を必要としない簡便な方法として極めて有用である。
【０００８】
例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ社のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉａｃｏｒｅ．ｃｏ．ｊｐ）及びＪ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．，ｖｏｌ２８，７７−８４（１９９７）には、黄色ブトウ球菌表面に発現したプロテインＡと金属薄膜上に固定化されたＩｇＧとの相互作用検出法が開示されている。しかし、このプロテインＡは本来黄色ブトウ球菌表面に発現するタンパク質であり、他の目的タンパク質を同様に黄色ブトウ球菌表面に発現させることができないという問題がある。また、原核生物である黄色ブトウ球菌では糖修飾等の翻訳後修飾ができないという欠点もあった。さらに、ガラスにコートされた金属薄膜の表面にリガンドを固定化し、これに接するように被測定物質収容用フローセルが配備されたセンサーチップを使用する方法では被測定物質を変更するためにはフローセルを含む流路を全て一旦洗浄する必要がある。また黄色ブトウ球菌より大きな酵母や動物細胞や植物細胞を用いると、一旦固定化されたリガンドと相互作用しても流圧により細胞がリガンドから解離してしまう懸念があった。
【０００９】
この様な問題は、センサーカップを用いる非フロー方式により解決することができる。センサーカップとは、誘電体ブロックが光ビームの入射面、出射面及び金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化されているカップ状の表面プラズモン共鳴検出用の測定チップであり、このセンサーカップを用いる表面プラズモン共鳴に関する技術はＷＯ９５／２２７５４及び特開２００２−２９６１７２号公報に開示されている。被測定物質（細胞）毎にセンサーカップを用意することで煩雑な流路洗浄の必要がなくなり、また相互作用評価を静置させて行うことで流圧の問題も回避可能である。
【００１０】
もっとも、従来の測定チップを用いる場合は、誘電体ブロックとプリズム状誘電体ブロックとの間の空隙により屈折率が不連続になることを防止するため、両誘電体ブロックを屈折率マッチング液を介して一体化する必要があるが、その作業は非常に煩雑であり、従来の測定チップを用いた測定は操作性が悪いという問題がある。また、屈折率マッチング液を使用することから、環境に与える悪影響も懸念されている。
【００１１】
これらの問題に対し、特開２００２−２９６１７２号公報には、誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料に接触させられる薄膜層と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記薄膜層との界面で全反射条件となり、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなる、全反射減衰を利用した測定装置に用いられる測定チップであって、前記誘電体ブロックが、前記光ビームの入射面、出射面及び前記薄膜層が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記薄膜層が一体化されてなることを特徴とする技術が開示されている。
【００１２】
また、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料に接触させられる金属膜からなる薄膜層と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記金属膜との界面で全反射条件となり、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して、表面プラズモン共鳴による全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置に用いられる測定チップにおいて、前記誘電体ブロックが、前記光ビームの入射面、出射面及び前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化されてなることを特徴とする技術が開示されている。
【００１３】
以上のように、従来、細胞表層に発現したタンパク質と他のタンパク質との相互作用のＳＰＲによる検出は、その細胞が本来有している膜タンパク質に限定されており、外来の目的タンパク質を遺伝子工学的手法により発現させ、他のタンパク質との相互作用を検出した例はこれまで報告なかった。また、従来報告されている系は黄色ブドウ球菌を用いた系に限定されており、酵母を利用した報告例はなかった。さらに、フロー系ではなく、センサーカップを用いてＳＰＲにより細胞表層に発現した目的タンパク質のタンパク質間相互作用を検出した報告例もない。
【特許文献１】特開２００１−２０８７５５号公報
【特許文献２】ＷＯ９５／２２７５４
【特許文献３】特開２００２−２９６１７２号公報
【００１４】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
本発明の課題は、ＳＰＲセンサーカップを用い、細胞表層に発現させた目的タンパク質と他のタンパク質又は低分子化合物との相互作用を簡便かつ正確に検出する方法を提供することにある。本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、表面プラズモン共鳴シグナルが検出可能な金属薄膜を底面に有するセンサーカップにタンパク質又は低分子化合物を固定化した後、目的タンパク質を細胞表層に発現させた酵母などの細胞の懸濁液を該センサーカップに加えることにより、目的タンパク質と固定化されたタンパク質又は低分子化合物との相互作用を簡便かつ正確に検出できることを見い出した。また、細胞表面に存在する可能性がある目的タンパク質以外のタンパク質との非特異的相互作用を血清アルブミンにより抑制可能であり、さらに精度の高い検出が可能になることを見い出した。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
【００１５】
すなわち、本発明により、目的タンパク質と他のタンパク質又は低分子化合物との相互作用を表面プラズモン共鳴により検出する方法であって、下記の工程：
（ａ）金属薄膜を底面に有し表面プラズモン共鳴シグナルを検出可能なセンサーカップの該金属薄膜表面にタンパク質又は低分子化合物を固定化する工程；及び
（ｂ）細胞表面に目的タンパク質を発現させた細胞の懸濁液を上記センサーカップに加え、固定化された上記タンパク質又は低分子化合物と上記目的タンパク質との相互作用を表面プラズモン共鳴により検出する工程
を含む方法が提供される。
【００１６】
上記発明の好ましい態様によれば、アルカンチオールで修飾した該金属薄膜上にタンパク質又は低分子化合物を固定化する上記の方法；該アルカンチオールに含まれる炭素数が８個以上である上記の方法；アルカンチオールで修飾した該金属薄膜上に上記タンパク質又は低分子化合物とともに血清アルブミンを固定化する上記の方法；血清アルブミンがウシ血清アルブミンである上記の方法；細胞が酵母である上記の方法；目的タンパク質がアグルチニン又はその一部との融合タンパク質として酵母の細胞表面に発現している上記の方法；上記融合タンパク質がα−アグルチニンのＣ末端３２０アミノ酸の配列を含む融合タンパク質である上記の方法が提供される。
【００１７】
また、別の観点からは、目的タンパク質と他のタンパク質又は低分子化合物との相互作用を表面プラズモン共鳴により検出するためのセンサーカップであって、上記の他のタンパク質又は低分子化合物をその表面に固定化した金属薄膜を底面に有しており、細胞表面に目的タンパク質を発現させた細胞の懸濁液をセンサーカップ内部に導入して検出を行うためのセンサーカップが本発明により提供される。
【００１８】
この発明の好ましい態様によれば、アルカンチオールで修飾した該金属薄膜上にタンパク質又は低分子化合物を固定化した上記のセンサーカップ；該アルカンチオールに含まれる炭素数が８個以上である上記のセンサーカップ；アルカンチオールで修飾した該金属薄膜上に上記タンパク質又は低分子化合物とともに血清アルブミンが固定化された上記のセンサーカップ；血清アルブミンがウシ血清アルブミンである上記のセンサーカップ；細胞が酵母である上記のセンサーカップ；目的タンパク質がアグルチニン又はその一部との融合タンパク質として酵母の細胞表面に発現したタンパク質である上記のセンサーカップ；上記融合タンパク質がα−アグルチニンのＣ末端３２０アミノ酸の配列を含む融合タンパク質である上記のセンサーカカップが提供される。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、細胞表層に発現したタンパク質と他のタンパク質又は低分子化合物との相互作用を表面プラズモン共鳴により検出する方法であって、下記の工程：（ａ）金属薄膜を底面に有し表面プラズモン共鳴シグナルを検出可能なセンサーカップにタンパク質又は低分子化合物を固定化する工程；及び（ｂ）細胞表面に目的タンパク質を発現させた細胞の懸濁液を上記センサーカップに加え、固定化された上記タンパク質又は低分子化合物と上記目的タンパク質との相互作用を表面プラズモン共鳴により検出する工程を含むことを特徴としている。
【００２０】
表面プラズモン共鳴シグナルを検出可能なセンサーカップの種類は底面に金属薄膜が備えられたものであれば特に限定されず、当業者は適宜のものを選択可能であるが、例えば、特開２００２−２９６１７２号公報に開示されているセンサーカップなどを本発明の方法に好適に利用できる。
【００２１】
センサーカップの一例は、誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料に接触させられる薄膜層と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記薄膜層との界面で全反射条件となり、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなる、全反射減衰を利用した測定装置に用いられる測定チップである。このセンサーカップは、誘電体ブロックが光ビームの入射面、出射面および前記薄膜層が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記薄膜層が一体化されてなることを特徴としている。
【００２２】
別のセンサーカップは、表面プラズモン共鳴測定装置を対象として構成されたものであり、誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料に接触させられる金属膜からなる薄膜層と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記金属膜との界面で全反射条件となり、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して、表面プラズモン共鳴による全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置に用いられる測定チップにおいて、前記誘電体ブロックが、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化されてなることを特徴とするものである。
【００２３】
図１には、上記の第１の実施形態による表面プラズモン共鳴測定チップ（以下、単に測定チップという）１０を用いる表面プラズモン共鳴測定装置の全体形状を示した。図２はこの装置の要部の側面形状を示し、図３は測定チップ１０の斜視形状を示している。図１に示す通り、この表面プラズモン共鳴測定装置は、複数の測定チップ１０を支持するターンテーブル２０と、測定用の光ビーム（レーザビーム）３０を発生させる半導体レーザ等のレーザ光源３１と、入射光学系を構成する集光レンズ３２と、光検出器４０と、上記ターンテーブル２０を間欠的に回動させる支持体駆動手段５０と、この支持体駆動手段５０の駆動を制御するとともに、上記光検出器４０の出力信号Ｓを受けて後述の処理を行なうコントローラ６０と、試料自動供給機構７０とを有している。
【００２４】
上記測定チップ１０は、図２および図３に示す通り、例えば直方体状に形成された透明誘電体ブロック１１と、この誘電体ブロック１１の上面に形成された例えば金、銀、銅、アルミニウム等からなる金属膜１２と、この金属膜１２の上に側方が閉じられた空間を画成する筒状部材からなる試料保持枠１３とから構成されている。誘電体ブロック１１は、上記金属膜１２が形成される面（後述の界面１１ａを構成する面）と、光ビーム３０が入射する面１１ｂと、光ビーム３０が出射する面１１ｃとを全てを含む１つのブロックとして形成されている。試料保持枠１３の中には、後述のようにして例えば液体の試料１５が貯えられる。
【００２５】
光ビーム３０は、上述の通り収束光状態で誘電体ブロック１１に入射するので、上記界面１１ａに対して種々の入射角θで入射する成分を含むことになる。なおこの入射角θは、全反射角以上の角度とされる。そこで、光ビーム３０は界面１１ａで全反射し、この反射した光ビーム３０には、種々の反射角で反射する成分が含まれることになる。ここで、上記集光レンズ３２等の光学系は、光ビーム３０を界面１１ａにデフォーカス状態で入射させるように構成されてもよい。そのようにすれば、表面プラズモン共鳴の状態検出（例えば前記暗線の位置測定）の誤差が平均化されて、測定精度が高められる。
【００２６】
上述のように、光ビーム３０が全反射するとき、界面１１ａから金属膜１２側にエバネッセント波がしみ出す。そして、光ビーム３０が界面１１ａに対してある特定の入射角θＳＰで入射した場合は、このエバネッセント波が金属膜１２の表面に励起する表面プラズモンと共鳴するので、この光については反射光強度Ｉが鋭く低下する。なお図４には、この全反射減衰現象が生じた際の入射角θと反射光強度Ｉとの関係を概略的に示した。そこで、光検出器４０が出力する光量検出信号Ｓから各受光素子毎の検出光量を調べ、暗線を検出した受光素子の位置に基づいて上記入射角（全反射減衰角）θＳＰを求め、予め求めておいた反射光強度Ｉと入射角θとの関係曲線に基づけば、試料１５中の特定物質を定量分析することができる。コントローラ６０の信号処理部６１は、以上の原理に基づいて試料１５中の特定物質を定量分析し、その分析結果が表示部６２に表示される。
【００２７】
センサーカップの底面の金属薄膜の表面には、ＳＡＭ（Ｓｅｌｆ Ａｓｓｅｍｂｌｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ）と呼ばれる単分子膜を形成することができ、この単分子膜に相互作用を検出するためのタンパク質又は低分子化合物を固定化することができる。通常、ＳＡＭを形成するための化合物としては、非特異的相互作用を抑制する目的からデキストランやポリエチレングリコールの様な親水性化合物及びポリマーがしばしば利用される。例えば金属表面にリンカーを介し、親水性のハイドロゲルを固定化することで物理吸着を抑制する方法が知られている（特許第２８１５１２０号、米国特許第５４３６１６１号明細書、特開平８−１９３９４８号公報を参照）。この様な親水性のＳＡＭは、溶液中に存在するタンパク質間の相互作用を検出する場合には適しているが、本発明者らの検討の結果、細胞表層に発現した目的タンパク質との相互作用を検出する目的でタンパク質又は低分子化合物を金属薄膜上に固定化する場合のＳＡＭとしては、必ずしも適していないことが判明した。
【００２８】
本発明の方法において、金属薄膜上にタンパク質又は低分子化合物を固定化する場合に用いるＳＡＭとしては、例えばアルカンチオール類により形成されるＳＡＭが好適である。アルカンチオール類によりＳＡＭを製造する技術は公知であり、例えば、末端をチオール化したＤＮＡを金属膜に固定化してＳＰＲを用いるＤＮＡセンサーを作製する場合には、６−ヒドロキシ−１−ヘプタンチオールを添加することによって、非特異的吸着が起こらず、高感度で目的ＤＮＡを検出できることが報告されている（米国特許第５９４２３９７号、及びＪ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １９９７， １１９， ８９１６−８９２０を参照）。また、チオール化したビオチンと１１−ヒドロキシ−１−ウンデカンチオールとを同時混合し、ストレプトビジンとの反応を非特異結合を抑制して検出できることが報告されている（Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １９９９， １２１， ６４６９−６４７８）。しかしながら、披験物質として細胞を用いる場合、特にセンサーカップ式ＳＰＲにおいてアルカンチオール類が好ましいＳＡＭを与えることは従来知られていなかった。
【００２９】
アルカンチオールの種類は直鎖又は分岐のアルキル基を有するチオールであれば特に限定されないが、炭素数４以上のアルカンチオールが好ましく、炭素数６個以上、好ましくは８個以上のアルカンチオールが特に好ましい。例えばブタン−１−チオール、オクタン−１−チオール、ウンデカン−１−チオール、ドデカン−１−チオールなどを用いることができる。炭素数の上限は特に限定されないが、例えば３０個以下、好ましくは２０個以下、より好ましくは１５個以下である。また、これらのアルキル基は置換基を有していてもよく、このような例として、例えば１１−ヒドロキシ−１−ウンデカンチオールなどを用いることができる。
【００３０】
また、本発明の方法でアルカンチオールで形成させたＳＡＭを用いる場合、非特異的相互作用を抑制するために血清アルブミン、好ましくはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を測定系内に存在させることが好ましい。生理活性物質の物理吸着による非特異結合を軽減する方法として、プラスチックプレートを用いる免疫化学分析ではウシ血清アルブミンなどによりいわゆるブロッキングが行われているが、細胞を用いる場合、特にセンサーカップ式ＳＰＲで細胞を測定系に導入する場合に血清アルブミンが非特異的相互作用を顕著に抑制できることは従来知られていない。血清アルブミンは、アルカンチオールにより金属薄膜上にＳＡＭを形成し、タンパク質又は化合物を固定化した後に物理吸着により固定化してもよく、あるいはアルカンチオールにより金属薄膜上にＳＡＭを形成した後、タンパク質又は化合物を固定化する際に同時に吸着させてもよい。
【００３１】
金属薄膜上に固定化したタンパク質又は化合物に対して、細胞表層に目的タンパク質を発現させた細胞を相互作用させる場合、センサーカップ内に細胞浮遊液を導入して一定時間毎にピペッテイングにより撹拌してもよく、あるいは細胞を添加した後、静置させて相互作用を検出してもよい。細胞をセンサーカップ内に添加した後、静置させて相互作用を検出することが好ましい。
【００３２】
細胞表層に目的タンパク質を発現させた細胞の種類は特に限定されないが、例えば、糖タンパク質やリン酸化タンパク質を発現可能な酵母、動物細胞、又は植物細胞が好ましい。これらのうち、培養の容易さ及び安全性などの観点から酵母を用いることが最も好ましい。酵母の細胞表層に目的タンパク質を細胞壁又は細胞膜タンパク質との融合タンパク質として発現させる技術は既に報告されている。例えば、植田等はグルコアミラーゼをα−アグルチニンとの融合タンパク質として酵母表層に発現させ、デンプンを唯一の炭素源として生育させ、エタノールを生産することに成功している（Ｕｅｄａ ｅｔ ａｌ， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ６３， １３３２−１３３６ （１９９７））。細胞表層に目的タンパク質を発現させるためには、これらの公知技術を適宜採用することができる。
【００３３】
酵母を用いる場合、目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列、プロモーター配列、分泌シグナル配列、並びに細胞膜及び／又は細胞壁アンカータンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む組換えベクターを酵母に導入して発現させることにより、目的タンパク質と細胞膜及び／又は細胞壁アンカータンパク質又はその一部とを含む融合タンパク質を酵母表層に発現させることができる。
【００３４】
プロモーターの種類は、酵母での発現に通常利用されるプロモーターであれば特に限定されないが、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のグリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のプロモター（Ｓａｗａｉ−Ｈａｔａｎａｋａ， Ｈ．， Ｔ． ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ５９， １２２１−１２２８ （１９９５））、及びガラクトキナーゼ（Ｇａｌａｃｔｏｋｉｎａｓｅ）のプロモーター（ＧＡＬ１）（Ｄａｖｉｓ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ４， １４４０−１４４８ （１９８４））、キャンデイダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）のイソクエン酸リアーゼ（ＩＣＬ）のプロモーター（ＵＰＲ−ＩＣＬ）（Ｋａｎａｉ ｅｔ ａｌ， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ４４， ７５９−７６５ （１９９６））などが利用される。
【００３５】
分泌シグナルとしては、酵母の発現及び分泌に通常利用されるシグナル領域、例えば、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のグルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル領域や、酵母のα−ファクターのプレプロ配列（Ｗａｌｋｅｒ， Ｇ． Ｍ．， ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｐ２６５， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｙｄ．， Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ （１９９８） ）を利用できる。これらのプロモーター及び分泌シグナルは、既知の方法、例えば既知配列を基にして作成されたプライマーを用いて、前記微生物のゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲ法や、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ５１， ６５−７０ （１９９５）やＡｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ５７， ６９７−７０１ （２００１）に記載のプラスミドｐＧＡ１１及びｐＧＰＭ６を適当な制限酵素反応により切り出すことにより入手できる。
【００３６】
酵母の種類は特に限定されず、例えば、サッカロミセス類、ジゾサッカロミセス属、キャンデイダ属に属する酵母を用いることができるが、これらのうちサッカロミセス属に属する酵母が好ましく、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＴ８−１などが特に好ましい（Ｔａｊｉｍａ， Ｍ．， Ｙｅａｓｔ， １， ６７−７７ （１９８５））。アグルチニン遺伝子又はその断片は酵母から得られるが、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＴ８−１などから得ることが好ましい。アグルチニンはａ−アルグチニン及びα−アグルチニンのいずれであってもよく、その断片は表層に発現する酵素活性に悪影響を与えなければどの様な配列であってもよい。アグルチニン又はその一部をコードする配列としては、好ましくはサッカロミセス属由来のａ−アグルチニンのＡＧＡ２配列をコードする配列が用いられる。このＡＧＡ２は、ＧＰＩアンカーを介して細胞壁に固定化されているＡＧＡ１に２つのジスルフィド結合で結合することにより細胞表層に固定化される。また、好ましくはサッカロミセス属由来のα−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードする配列が用いられる。このアミノ酸配列中には４個所の糖鎖結合部位がある。グリコシルフォスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーがフォスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼ（ＰＩ−ＰＬＣ）で切断された後に、この糖鎖と細胞壁を構成する多糖類とが共有結合することにより、α−アグルチニンのＣ末端配列部分が細胞壁と結合して保持される。
【００３７】
上記ａ−アルグチニンを用いる場合は、ＡＧＡ１配列の３’末端側に目的タンパク質をコードする配列を融合させることが可能であり、その結果、目的タンパク質のＮ末端がａ−アルグチニンに融合することになる。一方、上記α−アグルチニンを用いる場合には、α−アグルチニンの５’末端側に目的タンパク質をコードする配列を融合させることが可能であり、目的タンパク質のＣ末端がα−アルグチニンに融合することになる。
【００３８】
上記の組換えベクターを導入した酵母では、上記組換えベクターはプラスミドの形態又は染色体に組み込まれた形態のどちらで存在していてもよい。また、上記の組換えベクターは、取得の簡易化の観点から大腸菌とのシャトルベクターであることが好ましい。例えば、上記ＤＮＡの調製材料は、例えば、酵母の２μｍプラスミドの複製開始点（２μｍ）とＣｏｌＥ１の複製開始点（ｏｒｉ）を有しており、また、酵母選択マーカー（例えばＴＲＰ、ＵＲＡ３等）及び大腸菌の選択マーカー（薬剤耐性遺伝子等）を有することがさらに好ましい。また、目的タンパク質を発現させるために、該目的タンパク質をコードする遺伝子の発現を調節するオペレーター、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー等のいわゆる調節配列をも含んでいることが望ましい。
【００３９】
上記の組換えベクターによる酵母の形質転換は、定法に従って行うことができ、例えば、酢酸リチウム法、電気パルス法又はプロトプラスト法等により形質転換体を得ることができる。形質転換体の培養方法も公知であり、例えば「Ｍ． Ｄ． Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ， ”Ｍｅｔｈｏｄ Ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”， Ｇｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂａｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９０）」等に記載された方法を当業者は適宜行うことができる。
【００４０】
【実施例】
以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されることはない。
実施例１： ＺＺドメインを表層発現した酵母の作成
Ａ：ＺＺドメインを表層発現可能なプラスミドの構築
プロテインＡの抗体（Ｆｃ部位）認識に関わるαへリックスの繰り返し部分をコードする塩基配列を、ｐＥＺＺ１８（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ， ＵＳＡ）を鋳型ＤＮＡとし、以下の２種類のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅し、増幅産物を制限酵素Ｓａｃ ＩＩとＸｈｏ Ｉ で切断した。これをにＡｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ５５， ４７１−４７５ （２００１）記載のプラスミドｐＣＡＳ１を制限酵素Ｓａｃ ＩＩとＸｈｏ Ｉ で切断したベクターに挿入することにより、ＺＺドメインを表層発現可能なプラスミドを構築し、ｐＣＺＺと命名した。
５’−ｇｃｔｇｃｇｃａａｃａｃｇａｔｇｃｃｇｃｇｇｇｇｇａｃａａｃａａ−３’
５’−ｃｃｇｇｇｔａｃｃｇａｇｃｔｃｇａａｇａｇｃｔｃｇｇｔａｃｔｔｔ−３’
【００４１】
Ｂ：ｐＣＺＺを含む酵母の調製
前記Ａにより得られたプラスミドＤＮＡ、ｐＣＺＺを酢酸リチウム法により酵母ＭＴ８−１に形質転換し、酵母ＭＴ８−１／ｐＣＺＺを調製した。得られた酵母ＭＴ８−１／ｐＣＺＺを０．６７％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ、２％グルコース、２％カザミノ酸を含むＳＤ培地で１８時間培養した後、得られた酵母を遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分間）により分離し、更にリン酸バッファー（ｐＨ ７．４）で２回洗浄した。
【００４２】
Ｃ：アルカンチオールでの金薄膜の修飾
以下の操作では、特開２００２−２９６１７２号公報に開示されている技術に基づいて作成したセンサーカップ（測定チップ）を用いた。ドデカンチオール２．４μＬをエタノール１０ｍＬに溶解し、金蒸着直後のセンサーカップに各７０μＬずつ添加した後、２４時間冷蔵庫で保管した。センサーカップ内からエタノール溶液をピペットで全量吸い取った後、水１００μＬでカップを１０回洗浄し、冷蔵庫に保管した。また、対照として、１１−ヒドロキシ−ウンデカンチオールを金薄膜に固定化し、エピクロルヒドリン水溶液を加え２５℃４時間反応させた後、デキストラン（Ｔ−１００）水溶液を加えて２５℃２０時間反応させることによりデキストランＴ５００による修飾を行った。
【００４３】
Ｄ：ウサギＩｇＧの金薄膜上への固定化
前記Ｃにより得られたドデカンチオールで修飾した金薄膜を底面に持つセンサーカップ内を１００ＭμＬのＰＢＳで満たした後、センサーカップ内より７０μＬを除去しアセテートバッファー（Ｂｉａｃｏｒｅ社）７０μＬを添加する操作を３回繰り返した。このセンサーカップ内より５０μＬを除去しウサギＩｇＧ（２５μｇ／ｍＬ）を含むアセテートバッファー ５０μＬを加え、室温で３０分反応（固定化）させた。次にカップ内より７０μＬを除去しＰＢＳ（７０μＬ）を添加する操作を５回繰り返した後、ベースラインを安定化させ、固定化開始時のシグナル値との差を固定化量とした。
【００４４】
またデキストランＴ５００の修飾した金薄膜上へのウサギＩｇＧの固定化は、以下のとおり行った。センサーカップを１００μＬのＰＢＳで満たしベースラインを安定化させた後、カップ内より７０μＬを除去し蒸留水７０μＬを加える操作を３回繰り返した。カップ内より７０μＬを除去後、０．４ｍＭ ＥＤＣ及び０．２ｍＭ ＮＨＳの混合水溶液を添加し、室温で１０分間反応させカルボキシル基の活性エステル化を行った。カップ内より７０μＬを除去しアセテートバッファー（７０μＬ）を添加する操作を３回繰り返した後、カップ内より５０μＬを除去しウサギＩｇＧ（２５μｇ／ｍＬ）を含むアセテートバッファー ５０μＬを加え、室温で３０分反応（固定化）させた。さらにカップ内より７０μＬを除去しＰＢＳ ７０μＬを加える操作を３回繰り返した後、１Ｍ エタノールアミン ７０μＬを加え、室温で１０分間ブロッキングした。最後にカップ内より７０μＬを除去しＰＢＳ（７０μＬ）を添加する操作を５回繰り返した後ベースラインを安定化させ、固定化開始時のシグナル値との差を固定化量とした。
【００４５】
Ｅ：ウサギＩｇＧと酵母表層ＺＺドメインとの相互作用におけるＳＡＭの影響
前記Ｄにより得られたウサギＩｇＧを固定化したセンサーカップを完全にＰＢＳ（１００μＬ）で置換しベースラインを安定化させた後、カップ内より５０μＬを除去し、ＺＺドメインを表層発現した酵母（ＭＴ８−１／ｐＣＺＺ、６００ｎｍの吸光度＝１．０）のＰＢＳ溶液を添加し、室温で１０分間反応させた（添加後のカップ内の酵母濃度 ６００ｎｍの吸光度＝０．５）。カップ内より７０μＬを除去しＰＢＳ（７０μＬ）を添加する操作を５回繰り返した後ベースラインを安定化させ、開始時のシグナル値との差を相互作用量とした。また対照としてＺＺドメインを表層発現していない酵母（ＭＴ８−１／ｐＣＡＳ）についても同様の操作を行った。その結果、デキストランＴ５００で修飾したセンサーカップを用いた場合は、相互作用シグナルは検出されなかった。一方、アルカンチオールで修飾したセンサーカップを用いた場合、ＭＴ８−１／ｐＣＺＺでは５０ＲＵ（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｕｎｉｔ）が、ＭＴ８−１／ｐＣＡＳでは２０ＲＵのシグナルが検出された。
【００４６】
Ｆ：ウサギＩｇＧと酵母表層ＺＺドメインとの相互作用の酵母濃度依存性
前記Ｅにより、ＳＡＭとしてアルカンチオールを用いた場合にウサギＩｇＧと酵母表層ＺＺドメインとの相互作用が検出されたが、これが両者の相互作用によるものが確認するために酵母濃度依存性を検討した。実験は前記Ｅと同様に行い、添加後のカップ内の６００ｎｍの吸光度が０．０５，、０．５、５となる酵母を用い連続的に行った。 その結果を表１に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
ＺＺでは６００ｎｍの吸光度＝０．０５， ０．５、５に対して各々５、５０、２４０ ＲＵのシグナルが検出され、ＭＴ８−１／ｐＣＡＳでは同じく０、２０、１９０ ＲＵのシグナルが検出された。同じ６００ｎｍの吸光度におけるシグナルの差は５、３０、５０と酵母濃度依存的に増加していることから、これらの差がＩｇＧと酵母表層ＺＺドメインとの相互作用によるものと推定された。
【００４９】
Ｇ：ウサギＩｇＧと酵母表層ＺＺドメインとの相互作用におけるＢＳＡの効果
ＳＡＭとしてアルカンチオールを用いた場合においてウサギＩｇＧと酵母表層ＺＺドメインとの相互作用が酵母濃度依存的に検出されたが、対照酵母（ＭＴ８−１／ｐＣＡＳ）でもウサギＩｇＧとの相互作用が検出されたことから、ＢＳＡによる非特異的相互作用の抑制について検討した。実験は前記Ｅと同様の方法で行ない、ウサギＩｇＧ固定化時にＢＳＡを共存させた場合と一旦ウサギＩｇＧを固定化後ＢＳＡを改めて固定化した場合の両方について検討した。
【００５０】
ウサギＩｇＧの固定化量について結果を表２に示した。ＢＳＡを共存させた場合には、ウサギＩｇＧとＢＳＡとを合わせた固定化量には大きな影響はみられなかった。一方、固定化後ＢＳＡを改めて固定化した場合、ウサギＩｇＧ固定化量の４割のＢＳＡが固定化されることがわかった。
【００５１】
【表２】
【００５２】
次に、ＢＳＡを共存させ固定化したウサギＩｇＧと酵母（添加後のカップ内の酵母濃度 ６００ｎｍの吸光度＝０．５）との相互作用を検討した。その結果を表３に示した。２５μｇ／ｍＬのＢＳＡをＩｇＧ固定化の際に共存させた場合、対照酵母（ＭＴ８−１／ｐＣＡＳ）との相互作用は検出されなかったが、ＺＺドメインを表層発現した酵母（ＭＴ８−１／ｐＣＺＺ）との相互作用は検出可能であることがわかった。また、一旦ウサギＩｇＧを固定化後にＢＳＡを改めて固定化した場合も同様の結果が得られた。この様にＢＳＡを用いることで非特異的相互作用を抑制可能であることがわかった。
【００５３】
【表３】
【００５４】
さらに２５μｇ／ｍＬのＢＳＡを共存させ固定化したウサギＩｇＧと酵母との相互作用の濃度依存性について検討した結果を表４に示す。カップ内の６００ｎｍの吸光度０．２５〜２．５の範囲でＺＺドメインを表層発現した酵母（ＭＴ８−１／ｐＣＺＺ）との相互作用シグナルは、濃度依存的に増加することがわかった。一方、対照酵母（ＭＴ８−１／ｐＣＡＳ）との相互作用シグナルは吸光度０．５までは検出されないが、吸光度２．５では若干検出された。この結果から、非特異的相互作用を排除するためには、少なくとも吸光度０．５以下で測定する必要があることがわかった。
【００５５】
【表４】
【００５６】
Ｈ：ウサギＩｇＧと酵母表層ＺＺドメインとの相互作用における攪拌の影響
前記Ｇにより、アルブミンでブロッキングした場合に非特的相互作用が抑制されることがわかったが、次に攪拌の影響について検討した。実験は前記Ｆと同様の方法で行った。相互作用検討時間を３分と１０分、１０分については攪拌の有無について比較検討した。その結果、相互作用検討時間は３分より１０分の方が相互作用シグナルが顕著に検出された。また同じ１０分でも１分おきに攪拌した場合は、殆ど相互作用が検出されないことがわかった。これは、タンパク質に対し酵母が非常に大きい為、流圧により一旦相互作用しても解離してしまうためと推定された。従ってフロー方式では、酵母の様に大きな細胞を用いる場合、この様な細胞の解離が懸念される。
【００５７】
【表５】
【００５８】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、目的タンパク質の煩雑な単離及び精製工程や、目的タンパク質の色素標識などの工程を必要とせず、目的タンパク質を細胞表層に発現させた細胞を直接用いてタンパク質間相互作用を正確に検出可能である。
【００５９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法を行うための表面プラズモン共鳴測定チップを用いる表面プラズモン共鳴測定装置の一例について全体図を示した図である。
【図２】図１の表面プラズモン共鳴測定装置の要部を示す一部破断側面図である。
【図３】表面プラズモン共鳴測定チップの一例を示した斜視図である。
【図４】表面プラズモン共鳴測定装置における光ビーム入射角と、光検出器による検出光強度との概略関係を示したグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for detecting an interaction between a target protein expressed on a cell surface and another protein or a low molecular weight compound.
[0002]
[Prior art]
As a result of progress in genome analysis of various organisms in recent years, it is considered that future biology will be centered on analysis of the functions of proteins encoded by the genome and the interaction between proteins, and there is an area called “proteome analysis”. Is formed.
[0003]
In this “proteome analysis”, protein-protein interactions are very important from the viewpoints of function expression and disease mechanism analysis, and various analysis methods have been proposed. For example, the “yeast two-hybrid method” is a representative example, and comprehensive protein-protein interaction analysis is possible. However, the yeast two-hybrid method is a technique for detecting protein-protein interactions in the nucleus in principle, and cannot be applied to proteins that cannot move into the nucleus. In addition, since the protein-protein interaction is indirectly detected by the transcription activity of DNA, there is also a problem that the frequency of false positives and false negatives is high.
[0004]
A technique for detecting an interaction between proteins by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) has also been developed. However, there is a problem that it is necessary to isolate and purify the target protein, and labeling with a fluorescent dye is necessary, which is not suitable for comprehensive protein-protein interaction.
[0005]
In recent years, attention has been paid to the surface plasmon resonance method capable of detecting protein-protein interactions without labeling. “Surface plasmon resonance (hereinafter sometimes abbreviated as SPR)” refers to evanescent waves and metal generated at the interface when light travels through the glass on which the metal thin film is deposited and is totally reflected at the interface. The resonance occurs when the wave numbers of surface plasmon waves generated in the thin film coincide with each other. When this resonance occurs, the intensity of reflected light decreases. Since the surface plasmon wave is generated on the surface of the metal thin film, if there is a concentration change or mass change in the medium in the vicinity, the surface plasmon wave changes, and the incident angle that decreases the reflected light intensity changes accordingly. . According to this principle, a change in incident angle that reduces the intensity of reflected light can be obtained as a resonance signal [10. -4 The change in the degree is called 1RU (resonance unit). The SPR biosensor for measuring protein interaction and the like by applying surface plasmon resonance is described in detail in, for example, pages 53-60 and 81-87 of “Protein Nucleic Acid Enzyme, Vol. 37, (1992)”. It is stated.
[0006]
Therefore, by using the SPR biosensor, the binding constant and the like can be quantitatively analyzed without labeling the target protein with a fluorescent dye or the like. However, like the conventional protein-protein interaction detection method, in order to detect a specific protein-protein interaction by SPR, it is necessary to purify the target protein as a test substance by a complicated technique such as affinity chromatography. There was a problem. In addition, a simple method for detecting an interaction between a protein expressed in a cell membrane or a cell wall and another protein has not been provided so far, because the isolation and purification of the membrane protein is not easy. is there. Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-208755 discloses a method for screening a physiologically active substance by surface plasmon resonance, which comprises immobilizing a cell membrane on the surface of a metal thin film in the presence of phospholipid and selecting a substance that interacts with the cell membrane. In this method, it was necessary to isolate and purify the membrane protein and then immobilize it on the surface of the metal thin film.
[0007]
As a means for solving such a problem, it is very effective to directly detect a cell expressing a target protein on the surface layer and detect an interaction with another protein. When the target protein is a membrane protein, the cells expressing the target protein on the cell surface layer are easily separated by simple centrifugation without isolating and purifying the protein, and then directly with other proteins. Can detect interactions. Even if the target protein is not a membrane protein, it can be expressed as a fusion protein with other membrane proteins without purification by a complicated technique such as affinity chromatography, and the target protein is similarly applied to the cell surface layer by simple centrifugation. Can be detected, and detection of interaction directly with other proteins can be detected. Therefore, the technique of directly detecting the interaction between the target protein expressed on the cell surface and other proteins by SPR is extremely useful as a simple method that does not require complicated protein purification or dye labeling.
[0008]
For example, Biacore's website (http://biacore.co.jp) and J.A. Microbiol. Methods. , Vol 28, 77-84 (1997) discloses a method for detecting an interaction between protein A expressed on the surface of S. aureus and IgG immobilized on a metal thin film. However, protein A is originally a protein that is expressed on the surface of S. aureus, and there is a problem that other target proteins cannot be expressed on the surface of S. aureus as well. In addition, S. aureus, a prokaryote, has a drawback that post-translational modifications such as sugar modification cannot be performed. Furthermore, in the method of using a sensor chip in which a ligand is immobilized on the surface of a metal thin film coated with glass and a flow cell for containing a substance to be measured is in contact with the surface, a flow cell is used to change the substance to be measured. It is necessary to once clean all the flow paths including it. In addition, when yeast, animal cells, or plant cells larger than S. aureus were used, there was a concern that the cells might dissociate from the ligand due to fluid pressure even if they interacted with the immobilized ligand.
[0009]
Such a problem can be solved by a non-flow method using a sensor cup. In the sensor cup, the dielectric block is formed as one block including all of the light beam incident surface, the light exit surface, and one surface on which the metal film is formed, and the metal film is integrated with the dielectric block. A cup-shaped measurement chip for detecting surface plasmon resonance, and a technique relating to surface plasmon resonance using this sensor cup is disclosed in WO95 / 22754 and JP-A-2002-296172. By preparing a sensor cup for each substance to be measured (cells), it is not necessary to perform complicated flow path cleaning, and it is possible to avoid the problem of fluid pressure by leaving the interaction evaluation stationary.
[0010]
However, when using a conventional measuring chip, both dielectric blocks are inserted through a refractive index matching liquid in order to prevent the refractive index from becoming discontinuous due to the gap between the dielectric block and the prismatic dielectric block. However, the work is very complicated, and the measurement using the conventional measuring chip has a problem that the operability is poor. Moreover, since the refractive index matching liquid is used, there is a concern about an adverse effect on the environment.
[0011]
In order to solve these problems, Japanese Patent Laid-Open No. 2002-296172 discloses a dielectric block, a thin film layer formed on one surface of the dielectric block and brought into contact with a sample, a light source that generates a light beam, and the light An optical system that causes a beam to be incident on the dielectric block at the interface between the dielectric block and the thin film layer so as to have a total reflection condition and include various incident angle components, and light that has been totally reflected at the interface A measuring chip used for a measuring device using total reflection attenuation, comprising: a light detecting means for measuring a beam intensity to detect a state of total reflection attenuation, wherein the dielectric block includes the light beam; The thin film layer is formed as a single block including all of the incident surface, the exit surface, and the one surface on which the thin film layer is formed, and the thin film layer is integrated with the dielectric block. Techniques have been disclosed.
[0012]
Further, a thin film layer made of a metal film formed on one surface of the dielectric block and brought into contact with the sample, a light source for generating a light beam, and the dielectric block with respect to the dielectric block; Total reflection attenuation by surface plasmon resonance by measuring the intensity of the light beam totally reflected at the interface, and an optical system that is made to be incident so as to include various incident angle components at the interface with the metal film. In the measuring chip used in the surface plasmon resonance measuring apparatus comprising the light detecting means for detecting the state of the above, the dielectric block is formed on one surface on which the light beam incident surface, the light emitting surface, and the metal film are formed. A technique is disclosed that is formed as one block including all, and the metal film is integrated with the dielectric block.
[0013]
As described above, conventionally, the detection by SPR of the interaction between the protein expressed on the cell surface and other proteins is limited to the membrane protein originally possessed by the cell. There has been no report of an example in which an interaction with other proteins is detected by a genetic method. Moreover, the system reported conventionally is limited to the system using Staphylococcus aureus, and there was no report example using yeast. Furthermore, there is no report that detects the protein-protein interaction of the target protein expressed on the cell surface by SPR using a sensor cup instead of the flow system.
[Patent Document 1] Japanese Patent Laid-Open No. 2001-208755
[Patent Document 2] WO95 / 22754
[Patent Document 3] Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-296172
[0014]
SUMMARY OF THE INVENTION Problems to be Solved by the Invention and Means for Solving the Problems
An object of the present invention is to provide a method for easily and accurately detecting an interaction between a target protein expressed on a cell surface layer and another protein or a low molecular weight compound using an SPR sensor cup. As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have immobilized a protein or low molecular weight compound in a sensor cup having a metal thin film on the bottom surface capable of detecting a surface plasmon resonance signal, It was found that the interaction between the target protein and the immobilized protein or low molecular weight compound can be easily and accurately detected by adding a suspension of cells such as yeast expressed on the cell surface to the sensor cup. In addition, it has been found that non-specific interaction with a protein other than the target protein that may be present on the cell surface can be suppressed by serum albumin, and detection with higher accuracy becomes possible. The present invention has been completed based on these findings.
[0015]
That is, according to the present invention, a method for detecting an interaction between a target protein and another protein or a low molecular compound by surface plasmon resonance, comprising the following steps:
(A) immobilizing a protein or low molecular weight compound on the surface of the metal thin film of a sensor cup having a metal thin film on the bottom surface and capable of detecting a surface plasmon resonance signal; and
(B) adding a cell suspension in which the target protein is expressed on the cell surface to the sensor cup, and detecting the interaction between the immobilized protein or low molecular weight compound and the target protein by surface plasmon resonance
Is provided.
[0016]
According to a preferred aspect of the invention, the method for immobilizing a protein or a low molecular weight compound on the metal thin film modified with alkanethiol; the method wherein the alkanethiol contains 8 or more carbon atoms; The above method for immobilizing serum albumin together with the above protein or low molecular weight compound on the metal thin film modified with alkanethiol; the above method wherein serum albumin is bovine serum albumin; the above method wherein the cell is yeast; the target protein Is expressed on the yeast cell surface as a fusion protein with agglutinin or a part thereof; and the above method is a fusion protein comprising the C-terminal 320 amino acid sequence of α-agglutinin. The
[0017]
From another point of view, a sensor cup for detecting an interaction between a target protein and another protein or low molecular weight compound by surface plasmon resonance, wherein the other protein or low molecular weight compound is placed on the surface. The present invention provides a sensor cup for detecting by introducing a suspension of cells having a fixed metal thin film on the bottom surface and expressing a target protein on the cell surface into the sensor cup.
[0018]
According to a preferred embodiment of the present invention, the sensor cup in which a protein or a low molecular weight compound is immobilized on the metal thin film modified with alkanethiol; the sensor having 8 or more carbon atoms contained in the alkanethiol The above-mentioned sensor cup in which serum albumin is immobilized together with the protein or low molecular weight compound on the metal thin film modified with alkanethiol; the sensor cup in which serum albumin is bovine serum albumin; and the cell is yeast A sensor protein of the above; wherein the target protein is a protein expressed on the cell surface of yeast as a fusion protein with agglutinin or a part thereof; the fusion protein comprising a sequence of 320 amino acids of C-terminal of α-agglutinin Is the above sensor kaka Flops are provided.
[0019]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The method of the present invention is a method for detecting an interaction between a protein expressed on a cell surface layer and another protein or a low molecular weight compound by surface plasmon resonance, and comprises the following steps: (a) a metal thin film on the bottom surface. Immobilizing a protein or low molecular weight compound in a sensor cup capable of detecting a surface plasmon resonance signal; and (b) adding a cell suspension expressing the target protein on the cell surface to the sensor cup to immobilize the protein or low molecular compound. And a step of detecting the interaction between the protein or low molecular weight compound and the target protein by surface plasmon resonance.
[0020]
The type of sensor cup capable of detecting the surface plasmon resonance signal is not particularly limited as long as the bottom surface is provided with a metal thin film, and those skilled in the art can select an appropriate one. For example, JP-A-2002-296172 The sensor cup etc. which are indicated by gazette can be used suitably for the method of the present invention.
[0021]
An example of a sensor cup includes a dielectric block, a thin film layer formed on one surface of the dielectric block and brought into contact with a sample, a light source that generates a light beam, and the light beam to the dielectric block. An optical system that is made to be totally reflective at the interface between the dielectric block and the thin film layer and includes various incident angle components, and the total reflection attenuation by measuring the intensity of the light beam totally reflected at the interface. It is a measuring chip used for the measuring apparatus using the total reflection attenuation, comprising a light detecting means for detecting the state of the above. In this sensor cup, the dielectric block is formed as one block including all of the light beam incident surface, the light exit surface, and the one surface on which the thin film layer is formed, and the thin film layer is integrated with the dielectric block. It is characterized by becoming.
[0022]
Another sensor cup is configured for a surface plasmon resonance measurement device, and includes a dielectric block, a thin film layer made of a metal film formed on one surface of the dielectric block and brought into contact with the sample, and a light A light source that generates a beam, and an optical system that causes the light beam to be incident on the dielectric block so as to satisfy a total reflection condition at an interface between the dielectric block and the metal film and to include various incident angle components And a measuring chip used in a surface plasmon resonance measuring device comprising: a light detecting means for measuring the intensity of a light beam totally reflected at the interface and detecting a state of attenuated total reflection due to surface plasmon resonance; The dielectric block is formed as one block including all of the incident surface, the exit surface of the light beam, and one surface on which the metal film is formed, The metal film on the dielectric block of is characterized in that are integral.
[0023]
FIG. 1 shows the overall shape of a surface plasmon resonance measuring apparatus using a surface plasmon resonance measuring chip (hereinafter simply referred to as a measuring chip) 10 according to the first embodiment. FIG. 2 shows the side shape of the main part of this apparatus, and FIG. 3 shows the perspective shape of the measuring chip 10. As shown in FIG. 1, the surface plasmon resonance measuring apparatus includes a turntable 20 that supports a plurality of measurement chips 10, a laser light source 31 such as a semiconductor laser that generates a measurement light beam (laser beam) 30, and an incident light. The condensing lens 32 constituting the optical system, the photodetector 40, the support driving means 50 for intermittently rotating the turntable 20, and the driving of the support driving means 50 are controlled, and the light It has a controller 60 that receives the output signal S of the detector 40 and performs processing described later, and an automatic sample supply mechanism 70.
[0024]
As shown in FIGS. 2 and 3, the measurement chip 10 is made of, for example, a transparent dielectric block 11 formed in a rectangular parallelepiped shape, and gold, silver, copper, aluminum, or the like formed on the top surface of the dielectric block 11. And a sample holding frame 13 made of a cylindrical member that defines a space closed on the side on the metal film 12. The dielectric block 11 includes all of a surface on which the metal film 12 is formed (a surface constituting an interface 11a described later), a surface 11b on which the light beam 30 is incident, and a surface 11c on which the light beam 30 is emitted. It is formed as one block. For example, a liquid sample 15 is stored in the sample holding frame 13 as described later.
[0025]
Since the light beam 30 is incident on the dielectric block 11 in the convergent light state as described above, the light beam 30 includes components incident on the interface 11a at various incident angles θ. In addition, this incident angle (theta) shall be an angle more than a total reflection angle. Therefore, the light beam 30 is totally reflected at the interface 11a, and the reflected light beam 30 includes components reflected at various reflection angles. Here, the optical system such as the condenser lens 32 may be configured to allow the light beam 30 to enter the interface 11a in a defocused state. By doing so, errors in surface plasmon resonance state detection (for example, measurement of the position of the dark line) are averaged, and measurement accuracy is improved.
[0026]
As described above, when the light beam 30 is totally reflected, an evanescent wave oozes out from the interface 11a to the metal film 12 side. When the light beam 30 is incident on the interface 11a at a certain incident angle θSP, the evanescent wave resonates with the surface plasmon excited on the surface of the metal film 12, so that the reflected light intensity I Decreases sharply. FIG. 4 schematically shows the relationship between the incident angle θ and the reflected light intensity I when the total reflection attenuation phenomenon occurs. Therefore, the detected light quantity for each light receiving element is examined from the light quantity detection signal S output from the photodetector 40, and the incident angle (total reflection attenuation angle) θSP is obtained based on the position of the light receiving element where the dark line is detected, and obtained in advance. Based on the relationship curve between the reflected light intensity I and the incident angle θ, the specific substance in the sample 15 can be quantitatively analyzed. The signal processing unit 61 of the controller 60 quantitatively analyzes a specific substance in the sample 15 based on the above principle, and the analysis result is displayed on the display unit 62.
[0027]
A monomolecular film called SAM (Self Assembled Membrane) can be formed on the surface of the metal thin film on the bottom of the sensor cup, and proteins or low molecular compounds for detecting the interaction are immobilized on this monomolecular film. can do. Usually, as a compound for forming SAM, hydrophilic compounds and polymers such as dextran and polyethylene glycol are often used for the purpose of suppressing non-specific interaction. For example, a method for suppressing physical adsorption by immobilizing a hydrophilic hydrogel on a metal surface via a linker is known (Patent No. 2815120, US Pat. No. 5,436,161, JP-A-8-193948). See the publication). Such a hydrophilic SAM is suitable for detecting an interaction between proteins present in a solution, but as a result of the present inventors' study, the interaction with a target protein expressed on the cell surface layer is possible. It has been found that the SAM is not necessarily suitable for immobilizing a protein or a low molecular weight compound on a metal thin film for the purpose of detecting.
[0028]
In the method of the present invention, the SAM used when immobilizing a protein or low molecular weight compound on a metal thin film is preferably, for example, a SAM formed of alkanethiols. The technology for producing SAMs with alkanethiols is known. For example, when a DNA sensor using SPR is prepared by immobilizing DNA having thiolated ends on a metal film, 6-hydroxy-1-heptanethiol is used. It has been reported that nonspecific adsorption does not occur and the target DNA can be detected with high sensitivity when added (US Pat. No. 5,942,397 and J. Am. Chem. Soc., 1997, 119, 8916-8920). See). It has also been reported that thiolated biotin and 11-hydroxy-1-undecanethiol can be mixed simultaneously to detect the reaction with streptavidin while suppressing non-specific binding (J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 6469-6478). However, when cells are used as test substances, it has not been conventionally known that alkanethiols give preferable SAM particularly in sensor cup type SPR.
[0029]
The type of alkanethiol is not particularly limited as long as it is a thiol having a linear or branched alkyl group, but is preferably an alkanethiol having 4 or more carbon atoms, particularly preferably an alkanethiol having 6 or more carbon atoms, preferably 8 or more carbon atoms. . For example, butane-1-thiol, octane-1-thiol, undecane-1-thiol, dodecane-1-thiol and the like can be used. The upper limit of the carbon number is not particularly limited, but is, for example, 30 or less, preferably 20 or less, more preferably 15 or less. In addition, these alkyl groups may have a substituent, and as such an example, for example, 11-hydroxy-1-undecanethiol and the like can be used.
[0030]
Moreover, when using SAM formed with alkanethiol by the method of the present invention, it is preferable that serum albumin, preferably bovine serum albumin (BSA) is present in the measurement system in order to suppress non-specific interaction. As a method for reducing non-specific binding due to physical adsorption of physiologically active substances, so-called blocking is performed by bovine serum albumin or the like in immunochemical analysis using a plastic plate. It has not been known so far that serum albumin can significantly suppress non-specific interactions in the case where is introduced into a measurement system. Serum albumin may form SAM on a metal thin film with alkanethiol, and may be immobilized by physical adsorption after immobilizing protein or compound, or protein or compound after forming SAM on metal thin film with alkanethiol It may be adsorbed at the same time when the is immobilized.
[0031]
When interacting with a protein or compound immobilized on a metal thin film with cells expressing the target protein on the cell surface, introduce a cell suspension into the sensor cup and stir by pipetting at regular intervals. Alternatively, after adding cells, the interaction may be detected by allowing the cells to stand still. After adding the cells into the sensor cup, it is preferable that the interaction is detected by allowing the cells to stand still.
[0032]
The type of cell in which the target protein is expressed on the cell surface is not particularly limited, but for example, yeast, animal cells, or plant cells capable of expressing glycoproteins and phosphorylated proteins are preferred. Among these, it is most preferable to use yeast from the viewpoint of ease of culture and safety. A technique for expressing a target protein as a fusion protein with a cell wall or cell membrane protein on the cell surface layer of yeast has already been reported. For example, Ueda et al. Succeeded in producing glucoamylase on the yeast surface as a fusion protein with α-agglutinin, growing starch as the sole carbon source, and producing ethanol (Ueda et al, Appl. Environ). Microbiol., 63, 1332-1336 (1997)). In order to express the target protein on the cell surface layer, these known techniques can be appropriately employed.
[0033]
When yeast is used, a recombinant vector containing a DNA sequence encoding a target protein, a promoter sequence, a secretory signal sequence, and a DNA sequence encoding a cell membrane and / or cell wall anchor protein is introduced into yeast and expressed. A fusion protein comprising a protein and a cell membrane and / or cell wall anchor protein or a part thereof can be expressed on the yeast surface layer.
[0034]
The type of the promoter is not particularly limited as long as it is a promoter that is usually used for expression in yeast. T. et al, Biosci. Biotechnol. ), Candida tropicalis isocitrate lyase (ICL) promoter (UP -ICL) (Kanai et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 44, 759-765 (1996)), such as are utilized.
[0035]
As a secretion signal, a signal region usually used for yeast expression and secretion, for example, a secretion signal region of a glucoamylase gene derived from Rhizopus oryzae, or a prepro sequence (Walker, G) of a yeast α-factor. M., in Yeast Physiology and Biotechnology, p265, John Wiley & Sons Lyd., Chichester (1998)). These promoters and secretion signals are obtained by known methods, for example, PCR methods using primers prepared based on known sequences and using the genomic DNA of the microorganism as a template, Appl. Microbiol. Biotechnol. , 51, 65-70 (1995) and Appl. Microbiol. Biotechnol. , 57, 697-701 (2001), and can be obtained by excising the plasmids pGA11 and pGPM6 by an appropriate restriction enzyme reaction.
[0036]
The type of yeast is not particularly limited. For example, yeasts belonging to the genus Saccharomyces, Dizosaccharomyces, and Candida can be used. Among these, yeasts belonging to the genus Saccharomyces are preferable, and Saccharomyces cerevisiae MT8. -1 etc. are particularly preferred (Tajima, M., Yeast, 1, 67-77 (1985)). The agglutinin gene or a fragment thereof is obtained from yeast, but is preferably obtained from, for example, Saccharomyces cerevisiae MT8-1. Agglutinin may be either a-arginine or α-agglutinin, and the fragment thereof may have any sequence as long as it does not adversely affect the enzyme activity expressed on the surface layer. As the sequence encoding agglutinin or a part thereof, a sequence encoding the AGA2 sequence of a-agglutinin derived from the genus Saccharomyces is preferably used. This AGA2 is immobilized on the cell surface layer by binding to AGA1 immobilized on the cell wall via a GPI anchor with two disulfide bonds. In addition, a sequence encoding a sequence of 320 amino acids from the C-terminal of α-agglutinin derived from the genus Saccharomyces is preferably used. There are four sugar chain binding sites in this amino acid sequence. After the glycosyl phosphatidylinositol (GPI) anchor is cleaved by phosphatidylinositol-dependent phospholipase (PI-PLC), the sugar chain and the polysaccharide constituting the cell wall are covalently bound to each other, so that α-agglutinin The C-terminal sequence part is retained in association with the cell wall.
[0037]
When the a-arginine is used, a sequence encoding the target protein can be fused to the 3 ′ end side of the AGA1 sequence. As a result, the N-terminus of the target protein is fused to the a-arginine. . On the other hand, when α-agglutinin is used, a sequence encoding the target protein can be fused to the 5 ′ end of α-agglutinin, and the C-terminus of the target protein is fused to α-arginine. Become.
[0038]
In yeast into which the above recombinant vector has been introduced, the above recombinant vector may exist in the form of a plasmid or a form integrated into a chromosome. In addition, the above recombinant vector is preferably a shuttle vector with E. coli from the viewpoint of easy acquisition. For example, the DNA preparation material has, for example, a replication origin (2 μm) of yeast 2 μm plasmid and a replication origin (ori) of ColE1, and a yeast selection marker (eg, TRP, URA3, etc.) and More preferably, it has an E. coli selection marker (drug resistance gene or the like). In addition, in order to express the target protein, it is desirable to include so-called regulatory sequences such as an operator, promoter, terminator, enhancer and the like that regulate the expression of the gene encoding the target protein.
[0039]
Transformation of yeast with the above recombinant vector can be performed according to a conventional method. For example, a transformant can be obtained by the lithium acetate method, the electric pulse method, the protoplast method, or the like. Methods for culturing transformants are also known, and for example, those skilled in the art can appropriately carry out the methods described in, for example, “MD Rose et al,“ Method In Yeast Genetics ”, Gold Spring Harbor Laboratory Press (1990)”. it can.
[0040]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the scope of the present invention is not limited to these examples.
Example 1: Preparation of yeast expressing the ZZ domain on the surface
A: Construction of a plasmid capable of surface expression of ZZ domain
The base sequence encoding the repeated portion of the α-helix involved in protein A antibody (Fc site) recognition was amplified by PCR using pEZZ18 (Amersham pharmacia biotech, USA) as a template DNA and the following two types of primers. The amplified product was cleaved with restriction enzymes Sac II and Xho I. Appl. Microbiol. Biotechnol. , 55, 471-475 (2001), the plasmid pCAS1 was inserted into a vector cleaved with restriction enzymes Sac II and Xho I to construct a plasmid capable of expressing the ZZ domain as a surface layer, and named pCZZ.
5'-gctgcgcaacacgatgccgcggggggacaacaaa-3 '
5'-ccgggtaccgagctcgaagagagctcggtacttt-3 '
[0041]
B: Preparation of yeast containing pCZZ
The plasmid DNA obtained in A above, pCZZ, was transformed into yeast MT8-1 by the lithium acetate method to prepare yeast MT8-1 / pCZZ. The obtained yeast MT8-1 / pCZZ was cultured in an SD medium containing 0.67% Yeast nitrogen base w / o amino acids, 2% glucose, 2% casamino acid for 18 hours, and then the obtained yeast was centrifuged ( The solution was separated by 3000 rpm for 5 minutes, and further washed twice with a phosphate buffer (pH 7.4).
[0042]
C: Modification of gold thin film with alkanethiol
In the following operations, a sensor cup (measurement chip) created based on the technique disclosed in Japanese Patent Laid-Open No. 2002-296172 was used. 2.4 μL of dodecanethiol was dissolved in 10 mL of ethanol, 70 μL each was added to the sensor cup immediately after gold deposition, and then stored in a refrigerator for 24 hours. After the ethanol solution was pipetted out from the sensor cup, the cup was washed 10 times with 100 μL of water and stored in the refrigerator. As a control, 11-hydroxy-undecanthiol was immobilized on a gold thin film, an epichlorohydrin aqueous solution was added and reacted at 25 ° C. for 4 hours, and then a dextran (T-100) aqueous solution was added and reacted at 25 ° C. for 20 hours. Modification with T500 was performed.
[0043]
D: Immobilization of rabbit IgG on a gold thin film
After filling the inside of a sensor cup having a gold thin film modified with dodecanethiol obtained in C with 100 M μL of PBS, removing 70 μL from the sensor cup and adding 70 μL of acetate buffer (Biacore) 3 Repeated times. 50 μL was removed from the sensor cup, 50 μL of acetate buffer containing rabbit IgG (25 μg / mL) was added, and reacted (immobilized) at room temperature for 30 minutes. Next, after removing 70 μL from the cup and adding PBS (70 μL) five times, the baseline was stabilized, and the difference from the signal value at the start of immobilization was defined as the immobilized amount.
[0044]
Immobilization of rabbit IgG on a gold thin film modified with dextran T500 was performed as follows. After filling the sensor cup with 100 μL of PBS and stabilizing the baseline, the operation of removing 70 μL from the cup and adding 70 μL of distilled water was repeated three times. After removing 70 μL from the cup, a mixed aqueous solution of 0.4 mM EDC and 0.2 mM NHS was added and reacted at room temperature for 10 minutes to carry out active esterification of the carboxyl group. The procedure of removing 70 μL from the cup and adding acetate buffer (70 μL) was repeated three times, then 50 μL was removed from the cup, 50 μL of acetate buffer containing rabbit IgG (25 μg / mL) was added, and the reaction was allowed to proceed at room temperature for 30 minutes. (Immobilization). Further, the operation of removing 70 μL from the cup and adding 70 μL of PBS was repeated three times, and then 70 μL of 1M ethanolamine was added, followed by blocking at room temperature for 10 minutes. Finally, the operation of removing 70 μL from the cup and adding PBS (70 μL) was repeated 5 times, the baseline was stabilized, and the difference from the signal value at the start of immobilization was defined as the immobilized amount.
[0045]
E: Effect of SAM on interaction between rabbit IgG and yeast surface ZZ domain
The sensor cup to which the rabbit IgG obtained by D was immobilized was completely replaced with PBS (100 μL) to stabilize the baseline, and then 50 μL was removed from the cup, and yeast (MT8) expressing the ZZ domain on the surface was removed. -1 / pCZZ, absorbance at 600 nm = 1.0) was added, and reacted at room temperature for 10 minutes (concentration of yeast in the cup after addition at 600 nm absorbance = 0.5). The operation of removing 70 μL from the cup and adding PBS (70 μL) was repeated 5 times, then the baseline was stabilized, and the difference from the signal value at the start was taken as the amount of interaction. As a control, the same operation was performed for yeast (MT8-1 / pCAS) in which the ZZ domain was not expressed on the surface. As a result, no interaction signal was detected when a sensor cup modified with dextran T500 was used. On the other hand, when a sensor cup modified with alkanethiol was used, a signal of 50 RU (Resonance Unit) was detected in MT8-1 / pCZZ, and a signal of 20 RU was detected in MT8-1 / pCAS.
[0046]
F: Yeast concentration dependence of interaction between rabbit IgG and yeast surface ZZ domain
When the alkanethiol was used as the SAM, the interaction between the rabbit IgG and the yeast surface layer ZZ domain was detected by the E. In order to confirm this due to the interaction between the two, the yeast concentration dependency was examined. The experiment was performed in the same manner as E described above, and was continuously performed using yeasts having absorbances at 600 nm of 0.05, 0.5, and 5 in the cup after addition. The results are shown in Table 1.
[0047]
[Table 1]
[0048]
In ZZ, 5, 50 and 240 RU signals were detected for absorbance at 600 nm = 0.05, 0.5 and 5 respectively, and in MT8-1 / pCAS, 0, 20, and 190 RU signals were also detected. . Since the difference in signal at the same absorbance at 600 nm increased depending on the yeast concentration as 5, 30, 50, it was estimated that these differences were due to the interaction between IgG and the yeast surface ZZ domain.
[0049]
G: Effect of BSA in interaction between rabbit IgG and yeast surface ZZ domain
When alkanethiol was used as SAM, the interaction between rabbit IgG and the yeast surface ZZ domain was detected depending on the yeast concentration, but the interaction with rabbit IgG was also detected in the control yeast (MT8-1 / pCAS). Therefore, the suppression of non-specific interaction by BSA was examined. The experiment was performed in the same manner as in E above, and both the case where BSA was coexisting when rabbit IgG was immobilized and the case where BSA was immobilized again after immobilizing rabbit IgG were examined.
[0050]
The results for the amount of immobilized rabbit IgG are shown in Table 2. When BSA was allowed to coexist, there was no significant effect on the amount of immobilization of rabbit IgG and BSA combined. On the other hand, it was found that when BSA was immobilized again after immobilization, 40% of the rabbit IgG immobilized amount of BSA was immobilized.
[0051]
[Table 2]
[0052]
Next, the interaction between rabbit IgG coexisting in the presence of BSA and yeast (absorbance at a yeast concentration of 600 nm in the cup after addition = 0.5) was examined. The results are shown in Table 3. When 25 μg / mL of BSA was allowed to coexist during IgG immobilization, interaction with the control yeast (MT8-1 / pCAS) was not detected, but yeast expressing the ZZ domain surface (MT8-1 / pCZZ) ) Was found to be detectable. Similar results were obtained when BSA was once again immobilized after the rabbit IgG had been immobilized. Thus, it was found that non-specific interaction can be suppressed by using BSA.
[0053]
[Table 3]
[0054]
Furthermore, Table 4 shows the results of examining the concentration dependency of the interaction between rabbit IgG immobilized in the presence of 25 μg / mL BSA and yeast. It was found that the interaction signal with yeast (MT8-1 / pCZZ) that surface-expressed the ZZ domain increased in a concentration-dependent manner within an absorbance range of 0.25 to 2.5 at 600 nm in the cup. On the other hand, the interaction signal with the control yeast (MT8-1 / pCAS) was not detected until the absorbance was 0.5, but was slightly detected at the absorbance of 2.5. From this result, it was found that in order to eliminate non-specific interaction, it was necessary to measure at least at an absorbance of 0.5 or less.
[0055]
[Table 4]
[0056]
H: Effect of stirring on the interaction between rabbit IgG and yeast surface ZZ domain
Although it was found that the nonspecific interaction was suppressed by G when blocked with albumin, the influence of stirring was next examined. The experiment was performed in the same manner as F described above. For the interaction examination time of 3 minutes, 10 minutes, and 10 minutes, the presence or absence of stirring was compared. As a result, the interaction signal was significantly detected when the interaction examination time was 10 minutes rather than 3 minutes. In addition, it was found that almost no interaction was detected when stirring was carried out every other minute even for the same 10 minutes. This was presumed to be because the yeast is very large relative to the protein, so that it would dissociate even if it once interacted with the fluid pressure. Therefore, in the flow method, when large cells such as yeast are used, there is a concern about such dissociation of cells.
[0057]
[Table 5]
[0058]
【The invention's effect】
According to the method of the present invention, there is no need for complicated steps of isolation and purification of the target protein and dye labeling of the target protein. The action can be accurately detected.
[0059]
[Sequence Listing]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing an overall view of an example of a surface plasmon resonance measuring apparatus using a surface plasmon resonance measuring chip for performing a method of the present invention.
2 is a partially broken side view showing a main part of the surface plasmon resonance measuring apparatus of FIG. 1. FIG.
FIG. 3 is a perspective view showing an example of a surface plasmon resonance measuring chip.
FIG. 4 is a graph showing a schematic relationship between a light beam incident angle and a light intensity detected by a photodetector in a surface plasmon resonance measuring apparatus.