JP2004268014A - 抗原性物質を失活させる方法および装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明は、抗原性物質に対して正イオンと負イオンとを作用させることにより、抗原性物質を失活させる方法に関する。
【選択図】 図3
Description
本発明が対象とする抗原性物質は、スギ、ヒノキ、ブタクサ等の花粉類やダニ等の生物に含まれる物質であって、生体に作用することにより抗原抗体反応の一種であるアレルギー反応を生ぜしめ、アレルギー疾患を誘発する物質をいうものとする。該抗原性物質は、通常、タンパク質もしくは糖タンパク質からなるものであるが、その形状または大きさは特に限定されず、それらのタンパク質や糖タンパク質自体の分子状のもの、あるいはそれらが集合して粒子状になったもの、またあるいはその分子状のものの一部である抗原決定基等が含まれるものとする。
抗体反応部位とは、抗原性物質に含まれる特定の部分であって、抗体と結合する部位をいう。抗原性物質は、この抗体反応部位が変性ないし破壊(分解)されると、抗体と結合することができなくなり、このためアレルギー反応を抑制することができる。
本発明に係る抗原性物質を失活させる方法は、抗原性物質に対して正イオンと負イオンとを作用させることにより達成されるものである。これらの正負両イオンは、正イオンもしくは負イオンそれぞれ単独では抗原性物質に対して格別の効果は示されない。しかし、これらのイオンが共存すると後述のような化学反応によって活性物質を発生し、この活性物質が抗原性物質を構成するタンパク質、とりわけその抗体反応部位を攻撃することによリ、該タンパク質を変性ないし破壊(分解)することによって抗原性物質を失活させるものと解せられる。
抗原性物質に対して正イオンと負イオンとを作用させる雰囲気における正負両イオンの濃度は、該正負両イオンがそれぞれ2.5万個/cm3以上、好ましくは5万個/cm3以上、さらに好ましくは10万個/cm3以上とすることが好適である。2.5万個/cm3未満の場合には、抗原性物質に対して十分に効果を発揮することができなくなると考えられるからである。
本発明に係る正負両イオンは、主としてイオン発生素子の放電現象により発生するものであり、通常、正負の電圧を交互に印加させることにより正負両イオンをほぼ同時に発生させ空気中に送出することができる。しかしながら、本発明の正負両イオンの送出方法はこれのみに限られることはなく、正負いずれか一方の電圧のみを一定時間印加し正負いずれか一方のみのイオンを先に送出させた後、次に逆の電圧を一定時間印加しすでに送出されたイオンとは逆の電荷をもったイオンを送出させることもできる。なお、これらの正負両イオンの発生、送出に必要な印加電圧は、電極の構造にもよるが電極間のピークトゥーピーク(peak to peak)電圧として2〜10kV、好ましくは3〜7kVの範囲とすることができる。
本発明の正イオンおよび負イオンは、放電素子の表面に存在する酸素分子および/または水分子を原料として発生させることができる。この発生方法によれば、特別な原料を必要としないためコスト的に有利であるばかりでなく、原料自体に有害性がなく、また他の有害なイオンや物質を発生することがないため好ましい。
本発明のイオン発生素子は、正イオンと負イオンとを発生させるものであり、また後述のような電気的衝撃により直接的に抗原性物質のアレルギー反応を失活させることができるものともなり得る。このようなイオン発生素子は、その付設箇所は特に限定されないものの、通常は抗原性物質を失活させる装置の風路に付設されていることが好ましい。イオン発生素子により発生させられる正負両イオンは短時間で消失するため、これらの正負両イオンを効率良く空気中に拡散させることができるようにするためである。なお、イオン発生素子の設置個数は、1個であっても、2個以上であっても差し支えない。
抗原性物質を失活させる方法は、上述のように化学反応ばかりではなく、抗原性物質の抗体反応部位を電気的衝撃により変性ないし破壊させることにより実行することも可能である。すなわち、抗原性物質の抗体反応部位は、正負両イオンを発生させる際の電圧印加によるプラズマ放電自体によっても変性ないし破壊され、以ってこのような電気的衝撃によっても抗原性物質と抗体との結合能力は喪失し、抗原性物質を失活させることができる。したがって、抗原性物質の抗体反応部位を電気的衝撃および/または化学反応により変性ないし破壊させることによって抗原性物質を失活させることができるものであり、特に上記の作用、すなわち電気的衝撃と化学反応の両者が相乗的に奏されることにより抗原性物質の失活を促進すると思われる。
本実施例は、スギ花粉の抗原性物質を用いて、正負両イオンの作用による抗原性物質の失活を確認したものである。以下、図3〜8を参照して説明する。
まず、図3に示した装置では、イオン発生素子1021(図1に示したイオン発生素子と同じもの)として縦37mm、横15mmの平板状の沿面放電素子を用いた。電極間に正と負の電圧を交互に印加することにより表面電極部で沿面放電を起こし、大気圧下での放電プラズマにより正イオン1022と負イオン1023をほぼ同時に生成し送出させた。印加した電圧は電極間のピークトゥーピーク(peak to peak)電圧として3.3kV〜3.7kVであり、この範囲の電圧において有害な量のオゾンが発生することはなかった。該イオン発生素子は、内径140mm、長さ500mmのアクリル製の円筒型密閉容器1027の内部に4個取り付け固定し、この容器の一方には抗原性物質を含んだ溶液を噴霧する注入口1028を、もう一方には抗原性物質を含んだ溶液の回収容器1025を取り付けるとともに、この容器の底部に脱気用の脱気口1026を設けた。
抗原性物質としては、スギ花粉より抽出した抗原性物質を用いた。スギ花粉は広島県豊町に生育する日本杉(学名:Cryptomeria japonica)の枝より採取した。その際、メッシュを取り付けた掃除機を用い、その後ふるいにかけて収集した。収集後の保存は−30℃のフリーザーを用いた。
スギ抗原性物質を含んだ溶液0.2mlと下記D液1mlとを混合し、10分間放置した。つぎに、下記A液を0.1ml加え30分間放置した後750nmで吸光度を測定した。また、牛血清タンパク質(BSA)で標準系列を作成し、同手順で検量線を作成することにより、スギ抗原性物質のタンパク質の量をBSA換算量として定量した。その結果、そのタンパク質の濃度は200ng/mlであった。なお、ここで用いた各試薬は、以下の通りである。
(試薬)
A液;フェノール試薬を酸として1Nとしたもの。
B液;2%Na2CO3+0.1NのNaOH
C液;0.5%CuSO4・5H2O+1%クエン酸ナトリウム
D液;B液:C液=50:1(v/v)
<抗原性物質の噴霧と回収>
このようにして得られた抗原性物質であるスギ抗原性物質を含んだ溶液(タンパク質濃度200ng/ml)をネブライザー1024に8ml入れ、図3に示した装置の抗原性物質溶液噴霧用の注入口1028に接続した。一方、噴霧された抗原性物質を含んだ溶液を回収できるように、回収容器1025を円筒型密閉容器1027の底に設置した。
次いで、このようにして捕集されたスギ抗原性物質と、花粉症の患者19〜60より採取した血清IgE抗体との反応性をイライザ(ELISA:enzyme−liked immunosorbent assay)法で測定した。なお、抗原性物質については、上記の通り正イオンと負イオンとを作用させたもの(イオン処理スギ抗原性物質)と未処理のもの(未処理スギ抗原性物質)とを比較することにより該反応性を評価した。
(試薬)
炭酸水素ナトリウム緩衝溶液;100mMのNaHCO3(pH9.2〜9.5)
リン酸緩衝溶液(PBS);4gのNaCl、0.1gのNa2HPO4・12H2O、1.45gのKCl、1gのKH2PO4を蒸留水で500mlにメスアップ
PBST;PBS+0.5%ツウィーン20(Tween−20)
ブロッキング用緩衝溶液;PBS+3%スキムミルク+1%BSA
洗浄用緩衝溶液;43gのNa2HPO4・12H2O、3.6gのNaH2PO4、263gのNaCl、15mlのツウィーン20(Tween−20)を蒸留水で3Lにメスアップ
<イライザ(ELISA)法によるモノクローナル抗体との反応性評価>
ネブライザー1024で噴霧後、イオン発生素子1021を作動させない未処理の場合と、該素子に電極間のピークトゥーピーク(peak to peak)電圧として3.3kV〜3.7kVの電圧をそれぞれ印加して正負両イオンを送出し、円筒型密閉容器1027内の正負両イオンの濃度を正負両イオンがそれぞれ10万個/cm3とした場合の抗原性物質Cry j 1およびCry j 2とそのモノクロ−ナル抗体との反応性の低下を調べた。
また、イオン処理スギ抗原性物質および未処理スギ抗原性物質と、花粉症患者の血清IgEとの反応性を定量的に評価するためにイライザインヒビッション(ELISA inhibition:enzyme−liked immunosorbent assay inhibition)法により確認した。
反応失活率%=(1−A/B)×100・・・(1)
A:50%阻害に必要な未処理スギ抗原性物質量
B:50%阻害に必要なイオン処理スギ抗原性物質量
<正負イオン濃度と反応失活率との関係>
上記のイライザ(ELISA)法における患者19の血清IgEを抗体として用い、抗原性物質(スギ抗原性物質)の濃度(タンパク質濃度として)を100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/mlの4通りの濃度として、上記と同様(すなわち装置としては図3の装置を用い、イオン処理する場合は正負イオンそれぞれ10万個/cm3の濃度とする)にしてイライザ法によりそれぞれ未処理スギ抗原性物質とイオン処理スギ抗原性物質の蛍光強度を求めた。そして、この蛍光強度から以下の式(2)に基づいてアレルギー反応の反応失活率を求めた。その結果を以下の表1に示す。
C:イオン処理スギ抗原性物質の蛍光強度
D:未処理スギ抗原性物質の蛍光強度
続いて、上記抗原性物質の濃度が200ng/mlの場合を基準として選択し、イオン濃度と抗原性物質の濃度との間には以下の関係が成り立つとの前提の下、正負それぞれのイオン濃度と反応失活率との関係を求めた。すなわち、反応失活率が一定であれば、イオン濃度と抗原性物質濃度との間には一定の関係が成立すると考えられ、たとえばイオン濃度を一定にしておき抗原性物質濃度を半分にした状態と、抗原性物質濃度を一定にしておきイオン濃度を2倍にした状態とでは、同じ反応失活率が得られると考えられる。このため、上記実験におけるイオン濃度が正負イオンそれぞれ10万個/cm3であることおよび上記抗原性物質の濃度が200ng/mlであることの2点を基準として、正負それぞれのイオン濃度と反応失活率との関係を図8に示した。すなわち、図8中の正負イオン濃度が2.5万個/cm3、5万個/cm3、10万個/cm3、20万個/cm3のデータは、それぞれ上記のイライザ法における抗原性物質濃度が800ng/ml、400ng/ml、200ng/ml、100ng/mlの場合のデータに対応している(なお、図8の横軸は、正負イオンそれぞれの濃度を示している)。
イオン処理スギ抗原性物質および未処理スギ抗原性物質を、それぞれ0.9%NaClでタンパク質濃度0.5μg/mlに希釈したものを、ツベルクリン用注射器で0.02mlスギ花粉症患者の前腕屈側皮内に注射した。約15分後に現れた紅斑、膨疹の直径と短径を測定し、それらの平均径から反応性を評価した。その結果を表2に示す。
イオン処理スギ抗原性物質および未処理スギ抗原性物質を、それぞれ0.9%NaClでタンパク質濃度5μg/mlに希釈したものをピペットマンで5μlスギ花粉症患者A〜Fの眼に滴下し、約15分後結膜反応の有無として半月皮壁、眼瞼皮および球結膜の充血、痒み、流涙等を観察した。
本実施例は、ダニ粉塵の抗原性物質を用いて、正負両イオンの作用による抗原性物質の失活を確認したものである。以下、図9〜10を参照して説明する。
まず、本実施例において使用する図9に示した装置は、図3に示した装置と同様のものであり(このため、図3と図9において同じ参照符号を付したものは同一部分または相当部分を示す)、ただオゾン濃度を減少させる装備を備えている点のみが異なっている。すなわち、図9の装置においては、一方の脱気口1026とネブライザー1024がフィルター1029を介して接続されている。該フィルター1029は、活性炭とモレキュラーシーブを含んでおり、円筒型密閉容器1027中で発生したオゾンを除去する作用を有するものである。このため、該円筒型密閉容器1027中のオゾン濃度は0.025ppm以下に維持されている。
抗原性物質としては、ダニ粉塵より抽出した抗原性物質を用いた。ダニ粉塵は一般家庭に存在するものを対象とし、座布団や絨毯からメッシュを取り付けた掃除機を用いて捕集し、その後ふるいにかけて収集した。収集後の保存は−30℃のフリーザーを用いた。
ダニ抗原性物質を含んだ溶液0.2mlと下記D液1mlとを混合し、10分間放置した。つぎに、下記A液を0.1ml加え30分間放置した後750nmで吸光度を測定した。また、牛血清タンパク質(BSA)で標準系列を作成し、同手順で検量線を作成することにより、ダニ抗原性物質のタンパク質の量をBSA換算量として定量した。その結果、そのタンパク質の濃度は94.1μg/mlであった。なお、ここで用いた各試薬は、以下の通りである。
(試薬)
A液;フェノール試薬を酸として1Nとしたもの。
B液;2%Na2CO3+0.1NのNaOH
C液;0.5%CuSO4・5H2O+1%クエン酸ナトリウム
D液;B液:C液=50:1(v/v)
<抗原性物質の噴霧と回収>
このようにして得られた抗原性物質であるダニ抗原性物質を含んだ溶液(タンパク質濃度94.1μg/ml)をネブライザー1024に8ml入れ、図9に示した装置の抗原性物質溶液噴霧用の注入口1028に接続した。一方、噴霧された抗原性物質を含んだ溶液を回収できるように、回収容器1025を円筒型密閉容器1027の底に設置した。
次いで、このようにして捕集されたダニ抗原性物質と、ダニアレルギーの患者a〜rより採取した血清IgE抗体との反応性をイライザ(ELISA:enzyme−liked immunosorbent assay)法で測定した。なお、抗原性物質については、上記の通り正イオンと負イオンとを作用させたもの(イオン処理ダニ抗原性物質)と未処理のもの(未処理ダニ抗原性物質)とを比較することにより該反応性を評価した。
(試薬)
炭酸水素ナトリウム緩衝溶液;100mMのNaHCO3(pH9.2〜9.5)
リン酸緩衝溶液(PBS);4gのNaCl、0.1gのNa2HPO4・12H2O、1.45gのKCl、1gのKH2PO4を蒸留水で500mlにメスアップ
PBST;PBS+0.5%ツウィーン20(Tween−20)
ブロッキング用緩衝溶液;PBS+3%スキムミルク+1%BSA
洗浄用緩衝溶液;43gのNa2HPO4・12H2O、3.6gのNaH2PO4、263gのNaCl、15mlのツウィーン20(Tween−20)を蒸留水で3Lにメスアップ
<反応失活率>
上記のイライザ(ELISA)法における患者a〜rの血清IgEを抗体として用い、イライザ法によりそれぞれ未処理ダニ抗原性物質とイオン処理ダニ抗原性物質の蛍光強度を求め、そして、この蛍光強度から以下の式(3)に基づいてアレルギー反応の反応失活率を求めた。その結果を以下の表3に示す。
E:イオン処理ダニ抗原性物質の蛍光強度
F:未処理ダニ抗原性物質の蛍光強度
表3より明らかな通り、患者a〜rの平均反応失活率は57.8%であり、ダニアレルギー疾患を効果的に抑制することが期待できる。
本実施例は、ダニ粉塵を直接用いて、正負両イオンの作用によるダニ粉塵(中に含まれる抗原性物質)の失活を確認したものである。以下図11〜13を参照して説明する。なお、ダニ粉塵に含まれるダニ抗原性物質中のタンパク質量のフォーリンローリー法による定量は、実施例2と同じ操作により行なった。
ダニ粉塵の拡散と回収は、図11に示した装置を用いて行なった(なお、図11中他の図と同一の参照付号を付したものは、同一部分または相当部分を示す)。すなわち、該装置は、送風機1033と作業用の窓1034とを備えた密閉状態のボックス1030からなり、該送風機1033の空気噴出し口のところにはイオン発生素子1021が付設されている。
イオン処理ダニ抗原性物質および未処理ダニ抗原性物質と、ダニアレルギー患者の血清IgEとの反応性を定量的に評価するためにイライザインヒビッション(ELISA inhibition:enzyme−liked immunosorbent assay inhibition)法により確認した。
実施例3において、正負両イオンそれぞれの空間平均濃度を10000個/cm3とすること(該イオン発生素子1021の電極間のピークトゥーピーク(peak to peak)電圧を100Vとし、該送風機1033のファン風量を8m3/分とすること)を除き、その他は実施例3と全て同様にしてダニ粉塵に対する正負両イオンの作用を確認した。その結果を図14に示す。
Claims (18)
- 抗原性物質に対して正イオンと負イオンとを作用させることにより、抗原性物質を失活させる方法。
- 正負両イオンの濃度が、それぞれ略5万個/cm3以上となる雰囲気中において、正イオンと負イオンとを作用させることを特徴とする、請求項1記載の抗原性物質を失活させる方法。
- 正負両イオンの濃度が、それぞれ略10万個/cm3以上となる雰囲気中において、正イオンと負イオンとを作用させることを特徴とする、請求項1記載の抗原性物質を失活させる方法。
- 正負両イオンの濃度が、それぞれ略3000個/cm3以上となる空間平均濃度において、正イオンと負イオンとを作用させることを特徴とする、請求項1記載の抗原性物質を失活させる方法。
- 正負両イオンの濃度が、それぞれ略10000個/cm3以上となる空間平均濃度において、正イオンと負イオンとを作用させることを特徴とする、請求項1記載の抗原性物質を失活させる方法。
- 正イオンがH3O+(H2O)n(nは0または自然数)であり、負イオンがO2 -(H2O)m(mは0または自然数)であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載の抗原性物質を失活させる方法。
- 正イオンと負イオンとが、化学反応することによって過酸化水素H2O2、二酸化水素HO2またはヒドロキシラジカル・OHの少なくとも1種を生成することを特徴とする、請求項1〜6のいずれかに記載の抗原性物質を失活させる方法。
- 抗原性物質が、スギ抗原性物質であることを特徴とする、請求項1記載の抗原性物質を失活させる方法。
- 抗原性物質が、ダニ抗原性物質またはダニ粉塵であることを特徴とする、請求項1記載の抗原性物質を失活させる方法。
- 抗原性物質に対して正イオンと負イオンとを作用させるために、正イオンと負イオンとを空気中に送出する機構を有することを特徴とする、抗原性物質を失活させる装置。
- 過酸化水素H2O2、二酸化水素HO2またはヒドロキシラジカル・OHの少なくとも1種を生成することを特徴とする、請求項10記載の抗原性物質を失活させる装置。
- 正負両イオンの濃度が、それぞれ略5万個/cm3以上となる雰囲気を提供するように、正イオンと負イオンとを空気中に送出することを特徴とする、請求項10または11記載の抗原性物質を失活させる装置。
- 正負両イオンの濃度が、それぞれ略10万個/cm3以上となる雰囲気を提供するように、正イオンと負イオンとを空気中に送出することを特徴とする、請求項10または11記載の抗原性物質を失活させる装置。
- 正負両イオンの濃度が、それぞれ略3000個/cm3以上となる空間平均濃度を提供するように、正イオンと負イオンとを空気中に送出することを特徴とする、請求項10または11記載の抗原性物質を失活させる装置。
- 正負両イオンの濃度が、それぞれ略10000個/cm3以上となる空間平均濃度を提供するように、正イオンと負イオンとを空気中に送出することを特徴とする、請求項10または11記載の抗原性物質を失活させる装置。
- 抗原性物質が、スギ抗原性物質であることを特徴とする、請求項10記載の抗原性物質を失活させる装置。
- 抗原性物質が、ダニ抗原性物質またはダニ粉塵であることを特徴とする、請求項10記載の抗原性物質を失活させる装置。
- 空気調節機構を備えていることを特徴とする、請求項10〜17のいずれかに記載の抗原性物質を失活させる装置。
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