【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中の化学種、生化学種、生物種、及びそれらの検体間の相互作用を定性的及び定量的に検出するためのセンサチップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
一定の溝方向で形成されている回折格子を表面に備えた光学構造体は、化学種、生化学種、生物種などの検体（アナライト）を含む試料流体を、定量的および定性的に分析するセンサチップとして広範に使用されている。
例えば、検体と特異的に結合できる特定の機能性分子を表面に担持させた回折格子は、固定化された機能性分子と試料中の検体とが特異的に相互作用することにより、回折格子の光学特性が変化することから、バイオセンサとして使用できることが記載されている（例えば、特許文献１を参照）。その中でも、特異的な相互作用を表面プラズモン共鳴により検出できるセンサチップは、検出感度の点で優れていることから、特に有用とされている。
【０００３】
このような光学構造体をセンサチップとして使用する際、検出感度向上のため、次の３点が要求される。（１）共鳴条件の時間変化を測定する際、ドリフトが発生しない、（２）センサチップ表面に機能性分子を高密度で固定化できる、（３）センサチップ表面に機能性分子と特異的に結合する物質以外の物質が非特異的に吸着しない。
【０００４】
回折格子を表面に備えたセンサチップでは、直接チップ上に試料を流すため、チップ回折格子の表面（裏面）近傍で超微小変形が起こる。また、チップを構成するフローセルの構造体の変形も同時に引き起こすと考えられ、共鳴条件の時間変化をモニターする場合、検出量に時間ドリフトが生じる。本来、測定器内の諸条件（温度や流速等）が一定であれば、検出量の時間変化は起こらないはずである。ドリフトとは、測定器内の諸条件を一定にしておいても、時間と共に検出量が次第に変化していく現象のことをいう。ドリフトが生じている波形では、分子間相互作用の反応速度論解析が困難となるため、速度論解析するには、測定データ収集後に信号処理を施さなければならなかった。
【０００５】
また、表面に回折格子を備えたセンサチップ上への機能性分子の固定化は、通常、チップ表面への物理或いは化学吸着、または、リンカーと呼ばれる低分子化合物を介しての共有結合により行われる(例えば、非特許文献１参照)。この場合、機能性分子の固定化は、平面上(２次元)で行われるため、機能性分子の固定密度は、該表面の表面積により規定されることになるので、固定密度をさらに上げることはできなかった。
【０００６】
この種の問題の少なくとも一部分は、溶剤流延技術といわれる方法を用いて、センサチップ表面に有機ポリマーの薄層を形成させることにより解決される(例えば、特許文献２を参照)。しかし、この方法により例示されている硝酸セルロースでは、水への溶解度が低いため、固定密度の向上にはほとんど寄与していない。
【０００７】
また、従来の回折格子を表面に備えたセンサチップでは、検体と接する面が、金などの水との親和性が低い物質であるため、機能性分子に特異的に結合する物質以外の物質が該表面に非特異的に吸着して感度の低下を引き起こしてしまう。そのため、アルブミンやカゼイン等のブロッキング剤と呼ばれる吸着性の高いタンパク質で、センサチップ表面を覆う必要があった。しかし、ブロッキング操作を施しても、完全にチップ表面への吸着を防ぐことは難しいこと、また、ブロッキング剤への非特異的吸着が避けられないこと、さらに、ブロッキング操作があらかじめ固相化してあった機能性分子に影響を与えることなどから、ブロッキング操作を必要としないセンサチップが望まれている。
【０００８】
【特許文献１】
特公平６―２７７４２号公報
【０００９】
【特許文献２】
特許２５２８１３４号公報
【００１０】
【非特許文献１】
Biosensors. 3(4), 211-225(1987/88)
【００１１】
【発明が解決すべき課題】
このように、従来の回折格子を表面に備えたセンサチップでは、チップ表面近傍の微小変形が起こる結果、時間ドリフトが発生するため、測定データの後処理を施さなくては、機能性分子と検体との相互作用の反応速度解析をすることは難しかった。また、回折格子上に、機能性分子を２次元的に固定化する従来の方法では、機能性分子を単層以上に固定化することができないため、十分な感度を得ることができなかった。加えて、従来のセンサチップ表面には、機能性分子に特異的に結合する物質以外の物質も非特異的に吸着してしまうため、高感度で、再現性に優れた検出をすることができなかった。
【００１２】
従って本発明の課題は、従来技術の問題点を解消するため、時間ドリフトの発生が少なく、機能性分子を高密度に固定化でき、さらに、非特異的吸着が起こりにくい、回折格子を表面に備えたセンサチップを提供することにある。加えて、このセンサチップに機能性分子としてタンパク質やＤＮＡを固定化して、プロテインチップあるいはＤＮＡチップとして提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、これらの課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、一定の溝方向で形成されている回折格子の表面を、非ペプチド性の親水性高分子物質で被覆することにより、被覆していないセンサチップに比べて、ドリフトを著しく低減でき、また、機能性分子を高密度に固定化でき、さらには、非特異的吸着を効果的に抑制できるセンサチップが得られることを見出し、本発明を完成させた。
【００１４】
すなわち本発明により、（１）一定の溝方向で形成されている回折格子を表面に備え、かつ、該表面が非ペプチド性の親水性高分子物質で被覆されていることを特徴とするセンサチップが提供される。
この本発明の好ましい態様により、（２）水系分析用である上記センサチップ、あるいは、（３）表面プラズモン共鳴による分析用である上記センサチップが提供される。
【００１５】
また、上記発明の好ましい態様により、（４）親水性高分子物質が、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、デキストラン、アガロース、カラギーナン、アルギン酸、澱粉、セルロース、および、核酸よりなる群から選ばれる物質である上記センサチップが提供される。
【００１６】
また、上記発明の好ましい態様により、（５）親水性高分子物質が、他の物質を結合し得る部位を有するものである上記センサチップが提供される。
また、上記発明の好ましい態様により、（６）他の物質を結合し得る部位が、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、カルボニル基、エポキシ基、ビニル基、チオール基、マレイミド基、スクシニル基、リン酸基、及びイミダゾール基、並びにその誘導体よりなる群から選ばれる残基である上記センサチップが提供される。
【００１７】
また、上記発明の好ましい態様により、（７）他の物質を結合し得る部位が、ビオチン、マルトース、グルタチオン、ニッケルイオン、色素、酵素阻害剤、並びに、その誘導体よりなる群から選ばれる結合能を有する化学物質を有する部位である上記センサチップが提供される。
また、上記発明の好ましい態様により、（８）他の物質を結合し得る部位にＨｉｓタグ、ＧＳＴタグ、プロテインＡ、アビジン等よりなる群から選ばれる特異的結合能を有するペプチドまたはタンパク質が結合した上記センサチップが提供される。
【００１８】
また、本発明のさらに別の態様により、（９）一定の溝方向で形成されている回折格子を表面に備え、該表面が化学物質で被覆されており、かつ、以下（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかの特徴の組み合わせを有するセンサチップが提供される。
（Ａ）センサチップ表面を純水に浸漬し２０分間測定する時、表面プラズモン共鳴の測定値の変化量が、表面が被覆されていないセンサチップにおける変化量の２分の１以下である。
【００１９】
（Ｂ）センサチップ表面にマウスＩｇＧを１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドを用いて固定化する時、表面プラズモン共鳴の測定値の増加量が、表面が被覆されていないセンサチップにおける増加量の２倍以上である。
（Ｃ）センサチップ表面を１００μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧを含む２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ６．０）に浸漬し２０分間測定する時、表面プラズモン共鳴の測定値の変化量が、表面が被覆されていないセンサチップにおける変化量の２分の１以下である。
【００２０】
また、これらの発明の好ましい態様により、（１０）表面プラズモン共鳴による分析用である上記センサチップ、（１１）親水性高分子物質に特定の機能性分子が固定化された上記センサチップ、（１２）表面に特定の機能性分子が固定化された上記センサチップが提供される。
また、本発明のさらに別の態様により、（１３）上記センサチップに検体を含む溶液を流し、固定化されている機能性分子と検体との相互作用を表面プラズモン共鳴により測定することを特徴とする機能性分子と検体との相互作用解析方法が提供される。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明のセンサチップは、一定の溝方向で形成されている回折格子を表面に備え、かつ該表面が非ペプチド性の親水性高分子物質で覆われているものである。ここで、センサチップとは、該表面上で起こる物理学的または化学的特性変化を検出する際に使用される固相担体の総称である。固相担体の材質としては、透明なガラス、シリコン又はポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクレート等の高分子であることが好ましい。また、固相担体の厚さは、１００〜５０００μｍの範囲にあることが好ましい。また、上記固相担体はそのまま使用してもよいし、金属あるいは金属酸化物表面で被覆されたものを使用してもよい。
【００２２】
金属としては、表面プラズモン波を誘起しうるものであればその材質に限定はない。例えば、金、銀、銅、アルミニウムやこれらを含む合金等、あるいは銀、銅、アルミニウムの酸化物等を用いることができる。感度や安価な点では銀が好ましいが、安定性の面では金が好ましい。金属層の厚みは、好ましくは２０〜３００ｎｍとし、より好ましくは３０〜１６０ｎｍとする。
【００２３】
また、センサチップ上に形成される回折格子の溝ピッチの範囲は２００ｎｍ〜２０００ｎｍ、好ましくは５００ｎｍ〜９００ｎｍである。また、溝深さは１０ｎｍ〜１００ｎｍが好ましい。
本発明のセンサチップは、該表面が親水性高分子物質で覆われていることから、水系分析用として使用することが好ましい。また、本発明のセンサチップは、検体を検出するための様々な方法と組み合わせて使用することが可能である。検出法の具体例としては、蛍光法、化学発光法、ＲＩ法、表面プラズモン共鳴法、質量分析法、水晶発振子法（例えば、特開昭６２−２０７９３０号公報参照）、電気化学的方法（例えば、特公昭５２−４７９１３号公報参照）等が挙げられる。この中で、表面プラズモン共鳴法による検出は、検体を無標識で分析することができるため、好適に用いられる。例えば、本発明のセンサチップを表面プラズモン共鳴に応用する場合には、一定の溝方向で形成されている回折格子の上面に、金または銀等の金属薄膜が、所定の膜厚（５〜２００ｎｍ）で成膜されており、さらに、その上面に親水性高分子物質が被覆されているという構成となる。
【００２４】
次に、非ペプチド性の親水性高分子物質について説明する。非ペプチド性の親水性高分子物質とは、分子量１０００以上で、水に溶解するもののうち、ペプチド性高分子物質（同種又は異種のαアミノ酸が２個またはそれ以上で、互いに一方のカルボキシル基と他方のアミノ基との間で脱水してペプチド結合を形成してできる化合物）を除いた高分子物質の総称である。ペプチド性高分子物質でセンサチップを被覆すると、検体中に共存する夾雑物が、ペプチド性高分子物質を分解したり、ペプチド性高分子物質と交差反応をしたりするおそれがある。このため、ペプチド性高分子物質はセンサチップを被覆する高分子物質としては不適と考えられる。
【００２５】
非ペプチド性の親水性高分子物質の具体例としては、デキストラン、アガロース、カラギーナン、セルロース、澱粉、加工澱粉、アラビアゴム、アルギン酸、ペクチン、核酸等の天然・生体高分子物質、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ビスコース等の半合成高分子物質、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン等の合成高分子物質が挙げられる。中でも、入手しやすく、取り扱いが容易であることから、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、デキストラン、アガロース、カラギーナン、アルギン酸、澱粉、セルロース、および、核酸の群よりなる高分子物質から、選択することが望ましい。これらの高分子物質は、単独で用いても、２種以上組み合わせてもよい。また、高分子物質の繰り返し単位は、水に溶解する限りは、同種であっても、２種以上であっても構わない。
【００２６】
センサチップ表面を非ペプチド性の親水性高分子物質で覆う方法は、特に限定されないが、例えば、センサチップ表面上に重合開始種を導入して、これを起点にモノマーを次々と重合させる方法、非ペプチド性親水性高分子物質の官能基を利用して、センサチップ表面上に共有結合により固定化する方法等が挙げられる。
【００２７】
センサチップを親水性高分子物質で被覆する方法として、具体的には、以下の方法が例示される。
先ず、センサチップ表面をモノマー溶液に浸漬し、γ線、電子線、紫外線を照射することにより、該表面を親水性高分子で覆うことができる。
また、センサチップ表面をγ線、電子線、紫外線、低温プラズマ、またはコロナ放電にて前処理して、該表面に過酸化基を生じさせた後、これを重合開始基として熱重合を行うことにより、センサチップ表面を親水性高分子物質で覆うことができる。
【００２８】
また、センサチップ表面にアミノ基等の反応性官能基を導入した後、ポリアクリル酸等とのカップリング反応を行うことにより、センサチップ表面を親水性高分子物質で覆うことができる。
センサチップ表面上の反応性官能基としては、カルボキシル基と共有結合する公知の官能基が好適に使用される。具体的には、アミノ基、水酸基、チオール基等が挙げられる。それらの中でも、官能基導入方法と高分子固定化反応の制御が容易であることから、アミノ基を使用することが好ましい。また、官能基の導入方法としては、固相担体の材質や導入する官能基の種類にもよるが、具体例としては、金属表面にアミノ基を導入するのであれば、アミノ基を有するチオール化合物（システアミン塩酸塩など）を金属表面に作用させることにより、また、ガラス表面にアミノ基を導入するのであれば、アミノ基を有するシランカップリング剤（アミノプロピルトリエトキシシラン等）を表面に作用させることにより、簡単に導入することができる。
【００２９】
センサチップ表面に高分子物質を共有結合にて固定化するためには、センサチップ表面上に導入された官能基と高分子物質の官能基（例えば、カルボキシル基）との化学反応を、縮合剤の存在下で行う必要がある。縮合剤を加えないと、常温・常圧の条件では、共有結合により高分子物質を固相担体表面に固定化することは難しい。
【００３０】
アミノ化センサチップ表面へのカルボキシル基を有する高分子物質の固定化の場合には、カルボジイミドのような縮合剤を添加することにより、アミド結合を形成させることができる。上記カルボジイミドとしては、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよびその塩酸塩、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドおよびそのトルエンスルホン酸塩、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドおよびそのメチオジド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド等が挙げられる。尚、縮合剤は、単独使用の他、２種以上の混合物として使用することが出来る。
【００３１】
縮合剤の使用量としては、高分子物質１００重量部に対して、通常０．０１〜５００重量部、好ましくは０．１〜１００重量部の範囲である。この範囲は、これら上限と下限を組み合わせた範囲であってもよい。縮合剤が０．０１重量部より少ないと、活性化されるカルボキシル基の数が少なくなるため、高分子物質固定化反応が進行しにくくなる。また、５００重量部より多いと、高分子鎖が多点結合しやすくなるため、高密度のカルボキシル化担体表面を得ることが難しくなる。
【００３２】
処理時間に関しては、固相担体表面の材質や固定化しようとする高分子の種類等、種々の条件を勘案して決定されてよいが、処理時間が短すぎると、高分子物質の密度が低くなってしまうことから、通常１０分間以上が適当である。
処理温度は、通常１５〜４０℃が適当である。温度が低すぎると反応の進行が遅くなるため、経済的でない。また、温度が高すぎると、反応の制御が困難になるため、所望の固相担体を得ることができない。
【００３３】
固相担体表面への高分子物質の結合は、高分子物質と縮合剤と溶媒とを混合し、溶液のｐＨを酸性条件に調製した後、カルボキシル基と共有結合しうる官能基を有する固相担体表面へ接触させることにより簡単に行うことができる。この反応に用いられる溶媒は、好ましくは水よりなるが、必要に応じて、水と非水極性液体、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、若しくはＮ−メチルピロリドン、２−ピロリドン等のピロリドン類の１種、または２種以上の非水極性液体と水との混合物よりなっていてもよい。
【００３４】
高分子物質の使用量は、溶媒１００重量部に対して、通常０．００１〜１００重量部の範囲である。高分子物質添加量が、０．００１重量部より少ない場合には、高分子物質の導入量が少なくなってしまうため、所望の固相担体を得ることができない。また、１００重量部より多い場合には、溶液の粘性が高すぎるため、反応が進みにくくなってしまう。
【００３５】
また、本センサチップは、該表面上に、検体と特異的に相互作用できる機能性分子を固定化して使用することも可能である。そのため、該センサチップ上の親水性高分子物質は、他の物質を結合し得る部位を有するものであることが望ましい。
他の物質を結合し得る部位としては、各種官能基、および特定の分子に親和性を示す化合物が好ましい。官能基の具体例としては、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、カルボニル基、エポキシ基、ビニル基、チオール基、マレイミド基、スクシニル基、リン酸基、イミダゾール基等が挙げられる。また、特定の分子に親和性を示す低分子化合物の具体例としては、ビオチン、マルトース、グルタチオン、ニッケルイオン、またはCibacron Blue等の各種色素、または、ベンザンミジン等の（酵素）阻害剤が挙げられる。これらの各種官能基、および、特定の分子に親和性を示す低分子化合物は、単独で用いても、２種以上組み合わせて使用してもよい。
【００３６】
他の物質を結合し得る部位を有する親水性高分子物質を得る方法は、特に限定されないが、例えば、各種官能基、及び特定の分子に親和性を示す化合物を有するモノマーを重合する方法、または、親水性高分子物質を化学的、或いは、物理的に改質して、他の物質を結合し得る部位を導入する方法等が挙げられる。
各種官能基、及び特定の分子に親和性を示す化合物を有するモノマーの具体例としては、カルボキシル基を有する（メタ）アクリル酸、ヒドロキシル基を有する２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、アルデヒド基を有するアクロレイン、エポキシ基を有するグリシジル（メタ）アクリレート、スクシニル基を有するＮ−ヒドロキシスクシイミド（メタ）アクリレート、リン酸基を有するホスマー、イミダゾール基を有するビニルイミダゾール等が挙げられる。また、反応性モノマーである（メタ）アクリル酸クロリドと求核基（アミノ基等）を有する化合物の反応から、上記モノマーを得ることも可能である。
【００３７】
また、親水性高分子物質で覆ったセンサチップ表面を、電子線照射、コロナ放電処理、プラズマ処理、或いは薬品処理することにより、各種官能基を導入することができる。
また、親水性高分子物質中に、既に、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基等の官能基が存在する場合には、有機化学の分野で公知の官能基変換を行うことにより、簡単に各種官能基を導入することができる。
【００３８】
また、ビオチン、マルトース等の特定の分子に親和性を示す低分子化合物を親水性高分子物質に導入するには、上記に示した、各種官能基を導入する方法と同様な方法を用いることができる。その中でも、反応性の高い基が導入されている低分子化合物を利用することが、特に好ましく用いられる。ビオチンを例にとると、親水性高分子物質のアミノ基に反応させるときには、ビオチンのカルボキシル基をＮ―ヒドロキシスクシンイミドエステルとしたものを、多糖類と反応させるときには、ヒドラジド誘導体を利用すればよい。
【００３９】
また、本発明のセンサチップは、他の物質を結合し得る部位に、さらに、特異的結合能を有するペプチドまたはタンパク質を結合させて使用することも可能である。特異的結合能を有するペプチドまたはタンパク質とは、特定の分子と選択的に結合するペプチドまたはタンパク質であり、具体的には、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、プロテインＡ、アビジン等よりなる群から選択することが好ましい。これらの特異的結合能を有するペプチドまたはタンパク質を、他の物質を結合し得る部位に導入する方法は、特に限定されないが、例えば、他の物質を結合し得る部位が、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシル基等の官能基である場合には、アフィニティークロマトグラフィーの分野で公知の方法を使い、これらの官能基を活性化することにより、簡単に導入することができる。
【００４０】
次に、センサチップに要求される性能について説明する。上述の通り、センサチップの検出感度を向上させるためには、以下の性能が必要とされる。（１）共鳴条件の時間変化を測定する際、ドリフトが発生しない、（２）センサチップ表面に機能性分子を高密度で固定化できる、（３）センサチップ表面に機能性分子に特異的に結合する物質以外の物質が非特異的に吸着しない。一定の溝方向で形成されている回折格子を表面に備え、かつ、該表面が化学物質で被覆されている本発明のセンサチップは、これらの特徴を有するものである。
【００４１】
本発明のセンサチップは、センサチップ表面を純水に浸漬し２０分間測定する時、表面プラズモン共鳴の測定値の変化量が、表面が被覆されていないセンサチップにおける変化量の２分の１以下であるというドリフト抑制能を有している。従来のセンサチップでは、送液の液性や送液システムが引き起こす圧力や流れ等により、超微細加工による表面回折格子が微小変形する。その結果、時間ドリフトが発生するため、機能性分子と検体の相互作用に基づく反応速度解析を、測定データの後処理なしで行うことは難しかった。本発明のセンサチップでは、該表面が化学物質で被覆されているため、チップそのものの微小変形を抑えることが可能となる。
【００４２】
時間ドリフトの低減は、検出感度の増大を可能とする。感度、安定性の面で最も優れているのは、ドリフトが全く起こらないことであるので、本発明のセンサチップにおける表面プラズモン共鳴の測定値の変化量が、表面が被覆されていないセンサチップにおける変化量の２分の１以下、好ましくは３分の１以下、特に好ましくは４分の１以下である。
【００４３】
本発明のセンサチップは、該表面にマウスＩｇＧを１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドを用いて固定化する時、表面プラズモン共鳴の測定値の増加量が、表面が被覆されていないセンサチップにおける増加量の２倍以上となる高い機能性分子結合容量を有することを特徴とする表面である。
【００４４】
従来のセンサチップへの機能性分子の固定化は、該表面に直接物理或いは化学吸着させるか、または、該表面をリンカ−と呼ばれる低分子化合物で前処理して、センサチップ表面に反応性官能基を導入してから、共有結合にて固定させることにより行われてきた。しかし、これらの方法では、平面上にしか機能性分子を固定化できないため、単層以上に機能性分子の固定密度を増やすことはできなかった。本発明のセンサチップは、機能性分子を３次元的に固定化できるように、該表面が化学物質で被覆されているため、機能性分子の固定密度を増やすことが可能となる。
【００４５】
機能性分子の固定密度の増加は、機能性分子と結合する検体の量を増やすことにつながると考えられるので、検出感度が向上したセンサチップを得ることが可能となる。機能性分子の結合容量は、多ければ多いほど、それに伴って、機能性分子と結合する検体の検出感度を高めることができると考えられるので、本発明のセンサチップにおける表面プラズモン共鳴の測定値の増加量は、表面が被覆されていないセンサチップにおける増加量の２倍以上、好ましくは５倍以上、特に好ましくは１０倍以上である。
【００４６】
本発明のセンサチップは、該表面を１００μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧを含む２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ６．０）に浸漬し２０分間測定する時、表面プラズモン共鳴の変化量が、表面が被覆されていないセンサチップにおける変化量の２分の１以下という非特異的吸着を起こしにくい表面を有している点が特徴であり、最初に機能性分子をセンサチップ表面に固定した後は、機能性分子と特異的に結合する検体以外の物質がセンサチップ表面に非特異的に吸着することはほとんどなく、検体のみが特異的な反応によりセンサチップ表面に捕捉されるため、高感度で安定した結果を得ることが可能となる。
【００４７】
従来のセンサチップ表面では、多くの非特異的吸着が起こるため、ブロッキング操作を施す必要があった。本発明のセンサチップにおいては、非特異的吸着が起こりにくいため、ブロッキング操作は不要となり、機能性分子と特異的に結合する検体のみを高感度で検出することが可能となる。
感度、安定性に最も優れているのは、機能性分子と特異的に結合する検体以外の物質の非特異的吸着が全く起こらない表面であるため、本発明のセンサチップにおける表面プラズモン共鳴の測定値の変化量は、表面が被覆されていないセンサチップにおける変化量の２分の１以下、好ましくは５分の１以下、特に好ましくは１０分の１以下である。
【００４８】
本発明のセンサチップは、該表面に様々な機能性分子を固定化することにより、生体分子間相互作用解析、創薬研究、疾病予防のためのプロテインチップやＤＮＡチップ等として利用することができる。機能性分子を固定化する方法は、公知の技術により簡単に行うことができる。例えば、機能性分子のアミノ基とセンサチップ表面上のカルボキシル基を、水溶性縮合剤１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドにより、結合させる方法等が挙げられる。
【００４９】
機能性分子として、具体的には酵素、抗体、レクチン等のタンパク質、ペプチド、ホルモン、核酸、糖、オリゴ糖、多糖等の糖鎖、脂質、低分子化合物、高分子有機物質、無機物質、若しくはこれらの融合体、または、ウイルス、若しくは細胞を構成する分子などが挙げられる。これら機能性分子が、検体と機能性分子との結合性（相互作用）を測定する際の標的分子となる。
【００５０】
タンパク質としては、タンパク質の全長であっても、結合活性部位を含む部分ペプチドであってもよい。また、アミノ酸配列、及びその機能が既知のタンパク質でも、未知のタンパク質でもよい。これらは、合成されたペプチド鎖、生体より精製されたタンパク質、あるいはｃＤＮＡライブラリー等から適当な翻訳系を用いて翻訳し、精製したタンパク質等でも標的分子として用いることができる。合成されたペプチド鎖は、これに糖鎖が結合した糖タンパク質であってもよい。これらのうち好ましくは、アミノ酸配列が既知の精製されたタンパク質か、あるいはｃＤＮＡライブラリー等から適当な方法を用いて翻訳、精製されたタンパク質である。
【００５１】
核酸としては、 特に制限はなく、ＤＮＡあるいはＲＮＡを用いることができる。また、塩基配列あるいは機能が、既知の核酸でも、未知の核酸でもよい。好ましくは、タンパク質に結合能力を有する、核酸としての機能及び塩基配列が既知のものか、あるいは、ゲノムライブラリー等から制限酵素等を用いて切断単離してきたものを用いることができる。
【００５２】
糖鎖としては、その糖配列あるいは機能が、既知の糖鎖でも未知の糖鎖でもよい。好ましくは、既に分離解析され、糖配列あるいは機能が既知の糖鎖が用いられる。
低分子化合物としては、相互作用する能力を有する限り、特に制限はない。機能が未知のものでも、あるいはタンパク質に結合する能力が既に知られているものでも用いることができる。
【００５３】
また、機能性分子が固定化されたセンサチップは、該機能性分子と相互作用する分子を検出するバイオセンサとして好適に使用できる。
機能性分子と検体の「相互作用」とは、通常は、標的分子と検体間の共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合、及び静電力による結合のうち少なくとも１つから生じる分子間に働く力による作用を示すが、この用語は最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。共有結合としては、配位結合、双極子結合を含有する。また静電力による結合とは、静電結合の他、電気的反発も含有する。また、上記作用の結果生じる結合反応、合成反応、分解反応も相互作用に含有される。
【００５４】
相互作用の具体例としては、抗原と抗体間の結合及び解離、タンパク質レセプターとリガンドの間の結合及び解離、接着分子と相手方分子の間の結合及び解離、酵素と基質の間の結合及び解離、アポ酵素と補酵素の間の結合及び解離、核酸とそれに結合するタンパク質の間の結合及び解離、情報伝達系におけるタンパク質同士の間の結合と解離、糖タンパク質とタンパク質との間の結合及び解離、あるいは糖鎖とタンパク質との間の結合及び解離が挙げられるが、この範囲に限られるものではない。例えば、イムノグロブリンやその派生物であるF(ab')2、Fab'、Fab、レセプターや酵素とその派生物、核酸、天然あるいは人工のペプチド、人工ポリマー、糖質、脂質、無機物質あるいは有機配位子、ウイルス、細胞、薬物等が挙げられる。
【００５５】
機能性分子を固定化したセンサチップを用いた相互作用の検出方法としては、例えば、いわゆるＤＮＡアレイ若しくはＤＮＡチップ又はプロテインアレイ若しくはプロテインチップと呼ばれるＤＮＡまたはタンパク質を固定化したセンサチップを用いて解析する方法が適用可能である。具体例としては、蛍光法、化学発光法、ＲＩ法、表面プラズモン共鳴法、質量分析法、水晶発振子、電気化学的方法による検出法が挙げられる。この中で、表面プラズモン共鳴法による検出は、検体を無標識で分析することができるため好適に用いられる。
【００５６】
【発明の効果】
本発明のセンサチップは、ドリフトが起こりにくく、該表面への非特異的吸着が起こりにくいという特徴を有することから、高感度での測定を行うことが可能となる。
さらに、機能性分子を高密度に固定化できる大きな結合容量を有していることから、センサチップに機能性分子を固定化することにより、該機能性分子と相互作用する分子を検出するためのバイオセンサとして好適に使用できる。
【００５７】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１ 親水性高分子物質で被覆されたセンサチップの作製
（１）アミノ基を有するセンサチップ表面の作製
６０ｍｌの水に、システアミン塩酸塩３４ｍｇを溶かした。この溶液に、大きさが２．５ｃｍ×２．５ｃｍの金被覆グレーティングチップ（平板状のポリカーボネート製の基体の表面に、溝ピッチ約８７０ｎｍ、溝深さ約４０ｎｍの凸凹形状を形成し、この凸凹形状を回折格子として、さらに基体の表面に厚さ約８０ｎｍで金を蒸着したセンサチップ）を浸漬させ、室温で２０分間反応させた。反応終了後、センサチップを蒸留水で洗浄した。この処理は、金被覆センサチップ表面に、金−硫黄結合を介してアミノ基を導入するものである。
【００５８】
（２）ポリアクリル酸のセンサチップ表面への固定化
２５ｍｌの水に、１．２５ｇのポリアクリル酸（分子量５０，０００）（ポリサイエンス社製）と２４ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を溶解させた。溶液のｐＨを２．２に調整した後、この溶液２．５ｍｌに、上記（１）で得たアミノ化センサチップを浸漬させ、１時間反応させた。反応終了後、チップを蒸留水で洗浄した。この処理は、金表面上のアミノ基と高分子のカルボキシル基をＥＤＣにより縮合させて、アミド結合を形成させるものである。この処理により、センサチップ表面を親水性高分子で覆うことができる。
【００５９】
実施例２ 親水性高分子物質で被覆されたセンサチップにおいて発生する時間ドリフトの評価
時間ドリフトは、共鳴角検出型のＳＰＲ測定装置FLEX CHIPSTM Kinetic Analysis System（HTS Biosystems Inc.）を用いて評価した。実施例１の（２）で得たセンサチップを、ＳＰＲ測定装置FLEX CHIPSTM Kinetic Analysis System（HTS Biosystems Inc.）に装着し、１時間純水を流したときの共鳴角度の時間変化を測定した。比較例として、実施例１の（１）で得たセンサチップ表面が親水性高分子物質で被覆されていない金被覆グレーティングチップを用いて同様に測定した。
【００６０】
図１に、測定直後を０としたときの、共鳴角度の時間変化の結果を示す。また、表１には、２０分間ごとの、共鳴角度の平均変化量の結果をまとめた。図表から明らかなように、親水性高分子物質で表面を被覆することにより、ドリフトの発生が３分の１以下に抑えられることがわかった。
【００６１】
【表１】
【００６２】
実施例３ 親水性高分子物質で被覆されたセンサチップ表面へのリガンド固定密度
リガンド固定密度は、親水性高分子を被覆したセンサチップ表面へのタンパク質固定化反応を行い、センサチップ表面へのタンパク質固定化に伴う共鳴角の変化を、共鳴角検出型のＳＰＲ測定装置FLEX CHIPSTM Kinetic Analysis System（HTS Biosystems Inc.）で角度スキャンを行いながら反射光の強度を測定することにより、評価した。４０ｍｌの水に、２３ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシイミドと１５３ｍｇのＥＤＣを溶かした。この溶液４ｍｌ中に実施例１の（２）で得たセンサチップを浸漬させ、室温で１０分間振とうすることにより、カルボキシル基を活性化させた。反応終了後、センサチップを蒸留水で洗浄した。次に、この活性エステル基を有するセンサチップをＳＰＲ測定装置FLEX CHIPSTM Kinetic Analysis System（HTS Biosystems Inc.）に装着し、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ６．０）：１０分間、０．１ｍｇ／ｍＬマウスＩｇＧを含むＭＥＳ緩衝液：１５分間、１Ｍエタノールアミン水溶液（ｐＨ８．５）：１０分間、ＭＥＳ緩衝液：１０分間の順番で、溶液を流した。流速は、０．２ｍＬ／ｍｉｎとした。タンパク質注入前の共鳴角と注入後の共鳴角の差から、タンパク質固定化に伴う共鳴角変化の値を算出した。
【００６３】
その結果、タンパク質固定化に伴う共鳴角変化は、８９６ｍｄｅｇであった。一方、比較例では、タンパク質固定化に伴う共鳴角変化は、１４５ｍｄｅｇであることから、親水性高分子物質で表面を被覆することにより、リガンド固定密度が５倍以上増加することが明らかとなった。
【００６４】
実施例４ 親水性高分子物質で被覆されたセンサチップ表面への非特異的吸着性の評価
非特異的吸着性は、センサチップをタンパク質溶液に浸漬させたときの、センサチップ表面へのタンパク質非特異的吸着に伴う共鳴角の変化を、共鳴角検出型のＳＰＲ測定装置FLEX CHIPSTM Kinetic Analysis System（HTS Biosystems Inc.）で角度スキャンを行いながら反射光の強度を測定することにより評価した。実施例１の（２）で得たセンサチップを、ＳＰＲ測定装置FLEX CHIPSTM KineticAnalysis System（HTS Biosystems Inc.）に装着し、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ６．０）：１０分間、０．１ｍｇ／ｍＬマウスＩｇＧを含むＭＥＳ緩衝液：１５分間、１Ｍエタノールアミン水溶液（ｐＨ８．５）：１０分間、ＭＥＳ緩衝液：１０分間の順番で、溶液を流した。流速は、０．２ｍＬ／ｍｉｎとした。タンパク質注入前の共鳴角と注入後の共鳴角の差から、タンパク質吸着に伴う共鳴角変化の値を算出した。
【００６５】
その結果、タンパク質溶液を流したことによる共鳴角変化は、１４ｍｄｅｇであった。一方、比較例では、共鳴角変化が１４５ｍｄｅｇであることから、親水性高分子物質で表面を被覆することにより、非特異的吸着が１０分の１以下に抑えられることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２における本発明のセンサチップと比較例のセンサチップを、ＳＰＲ測定装置に装着して、純水を１時間流したときの、共鳴角の時間変化を示す図である。図の横軸は装着してからの時間、縦軸は測定直後からの共鳴角の変化量（ｍｄｅｇ）を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a sensor chip for qualitatively and quantitatively detecting a chemical species, a biochemical species, a biological species in a sample, and an interaction between those analytes.
[0002]
[Prior art]
An optical structure equipped with a diffraction grating formed on the surface in a fixed groove direction quantitatively and qualitatively analyzes a sample fluid containing analytes (analytes) such as chemical species, biochemical species, and biological species. It has been widely used as a sensor chip.
For example, a diffraction grating having a specific functional molecule capable of specifically binding to an analyte on the surface thereof, the immobilized functional molecule and the analyte in the sample specifically interact with each other to form a diffraction grating. It is described that since the optical characteristics change, it can be used as a biosensor (for example, see Patent Document 1). Among them, a sensor chip that can detect a specific interaction by surface plasmon resonance is particularly useful because of its excellent detection sensitivity.
[0003]
When such an optical structure is used as a sensor chip, the following three points are required to improve detection sensitivity. (1) No drift occurs when measuring the time change of resonance conditions; (2) Functional molecules can be immobilized on the sensor chip surface at high density; (3) Functional molecules specifically on the sensor chip surface Substances other than the substance to be bound do not non-specifically adsorb.
[0004]
In a sensor chip provided with a diffraction grating on the surface, a sample flows directly on the chip, so that a very small deformation occurs near the front surface (back surface) of the chip diffraction grating. Further, it is considered that the deformation of the structure of the flow cell constituting the chip is also caused at the same time, and when monitoring the time change of the resonance condition, a time drift occurs in the detection amount. Originally, if the various conditions (temperature, flow velocity, etc.) in the measuring instrument are constant, the detected amount should not change with time. The drift refers to a phenomenon in which the amount of detection gradually changes with time even when various conditions in the measuring instrument are kept constant. Since it is difficult to analyze the kinetic analysis of the intermolecular interaction in the waveform in which the drift has occurred, the signal processing must be performed after the measurement data collection in order to perform the kinetic analysis.
[0005]
The immobilization of functional molecules on a sensor chip having a diffraction grating on the surface is usually performed by physical or chemical adsorption on the chip surface or by covalent bonding via a low molecular compound called a linker. (For example, see Non-Patent Document 1). In this case, since the immobilization of the functional molecule is performed on a plane (two-dimensional), the immobilization density of the functional molecule is determined by the surface area of the surface. could not.
[0006]
At least a part of this kind of problem is solved by forming a thin layer of an organic polymer on the sensor chip surface using a method called a solvent casting technique (see, for example, Patent Document 2). However, since cellulose nitrate exemplified by this method has low solubility in water, it hardly contributes to improvement in fixed density.
[0007]
In a conventional sensor chip having a diffraction grating on the surface, the surface in contact with the sample is a substance having a low affinity for water, such as gold, and therefore, substances other than the substance that specifically binds to the functional molecule are used. Non-specific adsorption to the surface causes a decrease in sensitivity. Therefore, it is necessary to cover the sensor chip surface with a highly adsorbable protein called a blocking agent such as albumin or casein. However, even if a blocking operation is performed, it is difficult to completely prevent adsorption to the chip surface, non-specific adsorption to a blocking agent is unavoidable, and furthermore, the blocking operation must be performed beforehand on a solid phase. Therefore, a sensor chip that does not require a blocking operation is desired because it affects functional molecules.
[0008]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Publication No. Hei 6-27742
[0009]
[Patent Document 2]
Japanese Patent No. 2528134
[0010]
[Non-patent document 1]
Biosensors. 3 (4), 211-225 (1987/88)
[0011]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, in a sensor chip having a conventional diffraction grating on its surface, a minute deformation near the chip surface occurs, resulting in a time drift. It was difficult to analyze the kinetics of the interaction with. In addition, the conventional method of two-dimensionally immobilizing functional molecules on the diffraction grating cannot immobilize the functional molecules in a single layer or more, and thus cannot obtain sufficient sensitivity. In addition, substances other than those that specifically bind to functional molecules are also nonspecifically adsorbed to the conventional sensor chip surface, enabling highly sensitive and highly reproducible detection. Did not.
[0012]
Therefore, an object of the present invention is to solve the problems of the prior art, to reduce the occurrence of time drift, to fix functional molecules at a high density, and furthermore, to provide a non-specific adsorption-resistant diffraction grating on the surface. Provided is a sensor chip having the same. Another object of the present invention is to provide a protein chip or a DNA chip by immobilizing a protein or DNA as a functional molecule on the sensor chip.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to solve these problems, and as a result, by coating the surface of the diffraction grating formed in a certain groove direction with a non-peptidic hydrophilic polymer substance, Compared to uncoated sensor chips, we have found that a sensor chip can be obtained that can significantly reduce drift, can immobilize functional molecules at high density, and can effectively suppress nonspecific adsorption. The present invention has been completed.
[0014]
That is, according to the present invention, (1) a sensor chip characterized in that a diffraction grating formed in a certain groove direction is provided on the surface, and the surface is coated with a non-peptidic hydrophilic polymer substance. Is provided.
According to a preferred aspect of the present invention, there is provided (2) the above-described sensor chip for water-based analysis or (3) the above-mentioned sensor chip for analysis by surface plasmon resonance.
[0015]
According to a preferred embodiment of the above invention, (4) the hydrophilic polymer substance is a group consisting of polyacrylic acid, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, polyacrylamide, dextran, agarose, carrageenan, alginic acid, starch, cellulose, and nucleic acid The sensor chip is a substance selected from the group consisting of:
[0016]
Further, according to a preferred aspect of the present invention, there is provided the above-mentioned sensor chip, wherein (5) the hydrophilic polymer substance has a site capable of binding to another substance.
According to a preferred aspect of the above invention, (6) a site capable of binding to another substance is a carboxyl group, an amino group, a hydroxyl group, an aldehyde group, a carbonyl group, an epoxy group, a vinyl group, a thiol group, a maleimide group, a succinyl group. The sensor chip is a residue selected from the group consisting of a group, a phosphate group, an imidazole group, and a derivative thereof.
[0017]
According to a preferred aspect of the present invention, (7) the site capable of binding to another substance has a binding ability selected from the group consisting of biotin, maltose, glutathione, nickel ions, dyes, enzyme inhibitors, and derivatives thereof. The above-mentioned sensor chip, which is a site having a chemical substance, is provided.
According to a preferred embodiment of the above invention, (8) a peptide or protein having a specific binding ability selected from the group consisting of a His tag, a GST tag, protein A, avidin, and the like is bound to a site capable of binding to another substance. The sensor chip is provided.
[0018]
According to still another aspect of the present invention, (9) a diffraction grating formed in a certain groove direction is provided on the surface, the surface is coated with a chemical substance, and the following (A) to (C) A sensor chip having a combination of any of the above features is provided.
(A) When the sensor chip surface is immersed in pure water and measured for 20 minutes, the amount of change in the measured value of the surface plasmon resonance is less than half the amount of change in the sensor chip whose surface is not coated.
[0019]
(B) When mouse IgG is immobilized on the sensor chip surface using 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide, the increase in the measured value of surface plasmon resonance indicates that the surface is not coated. It is more than twice the amount of increase in the sensor chip.
(C) When the surface of the sensor chip is immersed in 2-morpholinoethanesulfonic acid buffer (10 mM, pH 6.0) containing 100 μg / mL mouse IgG and measured for 20 minutes, the amount of change in the measured value of surface plasmon resonance is as follows: It is less than half the amount of change in the sensor chip whose surface is not coated.
[0020]
According to a preferred embodiment of the present invention, (10) the sensor chip for analysis by surface plasmon resonance, (11) the sensor chip in which a specific functional molecule is immobilized on a hydrophilic polymer substance, (12) The present invention provides the above sensor chip having a specific functional molecule immobilized on the surface.
According to still another aspect of the present invention, (13) a solution containing a specimen is passed through the sensor chip, and the interaction between the functional molecule and the specimen immobilized is measured by surface plasmon resonance. The present invention provides a method for analyzing the interaction between a functional molecule and an analyte.
[0021]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The sensor chip of the present invention is provided with a diffraction grating formed in a certain groove direction on the surface, and the surface is covered with a non-peptidic hydrophilic polymer. Here, the sensor chip is a general term for a solid phase carrier used when detecting a physical or chemical property change occurring on the surface. The material of the solid support is preferably transparent glass, silicon or a polymer such as polyethylene terephthalate, cellulose acetate, polycarbonate, polystyrene, polymethyl methacrylate, or the like. Further, the thickness of the solid support is preferably in the range of 100 to 5000 μm. The solid support may be used as it is, or may be one coated with a metal or metal oxide surface.
[0022]
The metal is not particularly limited as long as it can induce surface plasmon waves. For example, gold, silver, copper, aluminum, an alloy containing any of these, or an oxide of silver, copper, or aluminum can be used. Silver is preferred in terms of sensitivity and low cost, but gold is preferred in terms of stability. The thickness of the metal layer is preferably 20 to 300 nm, more preferably 30 to 160 nm.
[0023]
The range of the groove pitch of the diffraction grating formed on the sensor chip is 200 nm to 2000 nm, preferably 500 nm to 900 nm. Further, the groove depth is preferably 10 nm to 100 nm.
The sensor chip of the present invention is preferably used for aqueous analysis because the surface is covered with a hydrophilic polymer substance. Further, the sensor chip of the present invention can be used in combination with various methods for detecting a sample. Specific examples of the detection method include a fluorescence method, a chemiluminescence method, an RI method, a surface plasmon resonance method, a mass spectrometry method, a crystal oscillator method (for example, see JP-A-62-207930), an electrochemical method ( For example, Japanese Patent Publication No. 52-47913). Among them, detection by the surface plasmon resonance method is suitably used because the sample can be analyzed without labeling. For example, when the sensor chip of the present invention is applied to surface plasmon resonance, a metal thin film such as gold or silver has a predetermined thickness (5 to 200 nm) on the upper surface of a diffraction grating formed in a certain groove direction. ), And the upper surface thereof is coated with a hydrophilic polymer substance.
[0024]
Next, the non-peptidic hydrophilic polymer substance will be described. The non-peptidic hydrophilic polymer substance is a peptidic polymer substance having two or more α-amino acids of the same type or different types, which has a molecular weight of 1,000 or more and is soluble in water. This is a generic term for polymer substances excluding a compound formed by dehydration with the other amino group to form a peptide bond). If the sensor chip is coated with the peptide-based polymer substance, impurities coexisting in the sample may degrade the peptide-based polymer substance or cross-react with the peptide-based polymer substance. For this reason, it is considered that the peptidic polymer is unsuitable as a polymer for coating the sensor chip.
[0025]
Specific examples of the non-peptidic hydrophilic polymer include dextran, agarose, carrageenan, cellulose, starch, modified starch, gum arabic, alginic acid, pectin, nucleic acids and other natural and biopolymers, carboxymethylcellulose, methylcellulose, Semi-synthetic polymer substances such as viscose, and synthetic polymer substances such as polyvinyl alcohol, polyacrylamide, polyethyleneimine, polyacrylic acid, polyethylene glycol, and polyvinylpyrrolidone. Among them, polyacrylic acid, polyethylene glycol, poly (vinyl alcohol), polyacrylamide, dextran, agarose, carrageenan, alginic acid, starch, cellulose, and a high molecular substance consisting of a group of nucleic acids, because they are easily available and easy to handle. It is desirable to choose. These polymer substances may be used alone or in combination of two or more. Further, as long as the repeating unit of the polymer substance is dissolved in water, it may be of the same type or of two or more types.
[0026]
The method of covering the sensor chip surface with a non-peptidic hydrophilic polymer substance is not particularly limited.For example, a method of introducing a polymerization initiator onto the sensor chip surface and polymerizing the monomers one after another starting from this, A method in which a functional group of a non-peptidic hydrophilic high molecular substance is used and immobilized on a sensor chip surface by a covalent bond, and the like can be mentioned.
[0027]
The following method is specifically exemplified as a method of coating the sensor chip with a hydrophilic polymer substance.
First, the surface of the sensor chip is immersed in a monomer solution and irradiated with γ-rays, electron beams, or ultraviolet rays, so that the surface can be covered with a hydrophilic polymer.
In addition, the surface of the sensor chip is pre-treated with γ-rays, electron beams, ultraviolet rays, low-temperature plasma, or corona discharge to generate a peroxide group on the surface, and then heat polymerization is performed using this as a polymerization initiation group. Thereby, the surface of the sensor chip can be covered with the hydrophilic polymer substance.
[0028]
Further, after introducing a reactive functional group such as an amino group into the surface of the sensor chip, a coupling reaction with polyacrylic acid or the like is performed, whereby the surface of the sensor chip can be covered with a hydrophilic polymer substance.
As the reactive functional group on the sensor chip surface, a known functional group that covalently bonds to a carboxyl group is suitably used. Specific examples include an amino group, a hydroxyl group, and a thiol group. Among them, it is preferable to use an amino group because the method of introducing a functional group and the control of the polymer immobilization reaction are easy. The method for introducing a functional group depends on the material of the solid support and the type of the functional group to be introduced. Specific examples include a thiol compound having an amino group if an amino group is introduced on the metal surface. (Eg, cysteamine hydrochloride) acts on the metal surface, and if an amino group is introduced into the glass surface, a silane coupling agent having an amino group (eg, aminopropyltriethoxysilane) acts on the surface. Therefore, it can be easily introduced.
[0029]
In order to immobilize a polymer substance on the sensor chip surface by a covalent bond, a chemical reaction between a functional group introduced on the sensor chip surface and a functional group (for example, a carboxyl group) of the polymer substance is performed by using a condensing agent. Need to be done in the presence of Unless a condensing agent is added, it is difficult to immobilize the polymer substance on the surface of the solid support by covalent bonding under normal temperature and normal pressure conditions.
[0030]
In the case of immobilizing a polymer substance having a carboxyl group on the surface of an aminated sensor chip, an amide bond can be formed by adding a condensing agent such as carbodiimide. Examples of the carbodiimide include 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide and its hydrochloride, 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinoethyl) carbodiimide and its toluenesulfonate, 1- (3 -Dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide and its methoxide, N, N'-dicyclohexylcarbodiimide and the like. The condensing agent can be used alone or as a mixture of two or more.
[0031]
The amount of the condensing agent to be used is generally 0.01 to 500 parts by weight, preferably 0.1 to 100 parts by weight, based on 100 parts by weight of the polymer substance. This range may be a combination of these upper and lower limits. When the amount of the condensing agent is less than 0.01 part by weight, the number of carboxyl groups to be activated becomes small, so that the reaction of immobilizing the polymer substance hardly proceeds. On the other hand, if the amount is more than 500 parts by weight, it becomes difficult to obtain a high-density carboxylated carrier surface because the polymer chains are liable to form multipoint bonds.
[0032]
The processing time may be determined in consideration of various conditions, such as the material of the surface of the solid support or the type of polymer to be immobilized.However, if the processing time is too short, the density of the polymer material is low. Therefore, usually 10 minutes or more is appropriate.
An appropriate treatment temperature is usually 15 to 40 ° C. If the temperature is too low, the progress of the reaction is slowed down, which is not economical. On the other hand, if the temperature is too high, control of the reaction becomes difficult, so that a desired solid phase carrier cannot be obtained.
[0033]
The binding of the polymer substance to the solid phase carrier surface is performed by mixing the polymer substance, the condensing agent, and the solvent, adjusting the pH of the solution to an acidic condition, and then forming a solid phase having a functional group capable of covalently bonding with a carboxyl group. It can be easily carried out by contacting the surface of the carrier. The solvent used for this reaction is preferably water, but if necessary, water and a non-aqueous polar liquid, for example, alcohols such as methanol, ethanol and isopropyl alcohol, or N-methylpyrrolidone, 2-pyrrolidone and the like Or a mixture of two or more non-aqueous polar liquids and water.
[0034]
The amount of the polymer substance used is usually in the range of 0.001 to 100 parts by weight based on 100 parts by weight of the solvent. When the amount of the polymer substance added is less than 0.001 part by weight, the amount of the polymer substance introduced becomes small, so that a desired solid phase carrier cannot be obtained. On the other hand, when the amount is more than 100 parts by weight, the viscosity of the solution is too high, so that the reaction hardly proceeds.
[0035]
Further, the present sensor chip can be used by immobilizing a functional molecule capable of specifically interacting with a specimen on the surface. Therefore, it is desirable that the hydrophilic polymer substance on the sensor chip has a site capable of binding another substance.
As a site capable of binding to another substance, various functional groups and a compound exhibiting affinity for a specific molecule are preferable. Specific examples of the functional group include a carboxyl group, an amino group, a hydroxyl group, an aldehyde group, a carbonyl group, an epoxy group, a vinyl group, a thiol group, a maleimide group, a succinyl group, a phosphate group, and an imidazole group. Further, specific examples of the low-molecular compound having an affinity for a specific molecule include various dyes such as biotin, maltose, glutathione, nickel ion, and Cibacron Blue, and (enzyme) inhibitors such as benzamidine. These various functional groups and low-molecular compounds exhibiting affinity for specific molecules may be used alone or in combination of two or more.
[0036]
A method for obtaining a hydrophilic polymer substance having a site capable of binding to another substance is not particularly limited, for example, a method of polymerizing a monomer having a compound exhibiting affinity for various functional groups and a specific molecule, or And a method in which a hydrophilic polymer substance is chemically or physically modified to introduce a site capable of binding to another substance.
Specific examples of the monomer having a compound exhibiting affinity for various functional groups and specific molecules include (meth) acrylic acid having a carboxyl group, 2-hydroxyethyl (meth) acrylate having a hydroxyl group, and having an aldehyde group. Examples include acrolein, glycidyl (meth) acrylate having an epoxy group, N-hydroxysuccinimide (meth) acrylate having a succinyl group, phosmer having a phosphoric acid group, and vinylimidazole having an imidazole group. Further, it is also possible to obtain the above monomer from the reaction between (meth) acrylic acid chloride, which is a reactive monomer, and a compound having a nucleophilic group (such as an amino group).
[0037]
Various functional groups can be introduced by subjecting the surface of the sensor chip covered with the hydrophilic polymer substance to electron beam irradiation, corona discharge treatment, plasma treatment, or chemical treatment.
In addition, when a functional group such as a hydroxyl group, a carboxyl group, or an amino group already exists in the hydrophilic polymer substance, various functional groups can be easily converted by performing a functional group conversion known in the field of organic chemistry. Groups can be introduced.
[0038]
In addition, in order to introduce a low-molecular compound having an affinity for a specific molecule such as biotin or maltose into a hydrophilic high-molecular substance, a method similar to the above-described method for introducing various functional groups may be used. it can. Among them, it is particularly preferable to use a low molecular compound into which a highly reactive group is introduced. Taking biotin as an example, a hydrazide derivative may be used when the carboxyl group of biotin is converted to N-hydroxysuccinimide ester when reacting with an amino group of a hydrophilic polymer substance, and when a saccharide is reacted with a polysaccharide.
[0039]
Further, the sensor chip of the present invention can be used by further binding a peptide or protein having specific binding ability to a site capable of binding another substance. The peptide or protein having specific binding ability is a peptide or protein that selectively binds to a specific molecule, and specifically, is selected from the group consisting of His tag, GST tag, protein A, avidin, and the like. Is preferred. The method of introducing a peptide or protein having these specific binding capabilities into a site capable of binding another substance is not particularly limited, but, for example, a site capable of binding another substance includes an amino group, a carboxyl group, When it is a functional group such as a thiol group or a hydroxyl group, it can be easily introduced by activating these functional groups using a method known in the field of affinity chromatography.
[0040]
Next, the performance required for the sensor chip will be described. As described above, the following performance is required to improve the detection sensitivity of the sensor chip. (1) no drift occurs when measuring the time change of resonance conditions; (2) functional molecules can be immobilized on the sensor chip surface at high density; (3) functional molecules specific to the sensor chip surface Substances other than the substance to be bound do not non-specifically adsorb. The sensor chip of the present invention, which has a diffraction grating formed on the surface in a fixed groove direction on the surface and the surface is coated with a chemical substance, has these features.
[0041]
In the sensor chip of the present invention, when the sensor chip surface is immersed in pure water and measured for 20 minutes, the amount of change in the measured value of surface plasmon resonance is less than half the amount of change in the sensor chip whose surface is not coated. And has the ability to suppress drift. In the conventional sensor chip, the surface diffraction grating by ultra-fine processing is minutely deformed due to the liquid property of the liquid sending or the pressure or flow caused by the liquid sending system. As a result, since a time drift occurs, it has been difficult to perform a reaction rate analysis based on the interaction between the functional molecule and the sample without post-processing the measurement data. In the sensor chip of the present invention, since the surface is coated with the chemical substance, it is possible to suppress minute deformation of the chip itself.
[0042]
Reducing time drift allows for increased detection sensitivity. Since the most excellent in terms of sensitivity and stability is that no drift occurs, the amount of change in the measured value of surface plasmon resonance in the sensor chip of the present invention is smaller in the sensor chip whose surface is not coated. It is at most ２, preferably at most 、, particularly preferably at most の of the amount of change.
[0043]
In the sensor chip of the present invention, when mouse IgG is immobilized on the surface using 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide, the amount of increase in the measured value of surface plasmon resonance indicates that the surface is coated. The surface is characterized by having a high functional molecular binding capacity that is at least twice as large as the increase in the sensor chip that is not used.
[0044]
Conventionally, functional molecules are immobilized on a sensor chip by direct physical or chemical adsorption on the surface or by pre-treating the surface with a low-molecular compound called a linker to form a reactive functional group on the sensor chip surface. This has been done by introducing a group and then immobilizing it with a covalent bond. However, in these methods, the functional molecules can be immobilized only on a flat surface, so that it was not possible to increase the fixing density of the functional molecules beyond a single layer. The surface of the sensor chip of the present invention is coated with a chemical substance so that the functional molecules can be immobilized three-dimensionally, so that the fixing density of the functional molecules can be increased.
[0045]
An increase in the fixed density of the functional molecule is considered to lead to an increase in the amount of the analyte that binds to the functional molecule, so that a sensor chip with improved detection sensitivity can be obtained. It is considered that the larger the binding capacity of the functional molecule, the more the detection sensitivity of the analyte that binds to the functional molecule can be increased.Therefore, the measured value of the surface plasmon resonance in the sensor chip of the present invention can be increased. The amount of increase is at least twice, preferably at least five times, particularly preferably at least ten times the amount of increase in the sensor chip whose surface is not coated.
[0046]
When the sensor chip of the present invention is immersed in 2-morpholinoethanesulfonic acid buffer (10 mM, pH 6.0) containing 100 μg / mL mouse IgG and measured for 20 minutes, the amount of change in surface plasmon resonance is as follows: It is characterized by having a surface that is less likely to cause non-specific adsorption, less than half the amount of change in the sensor chip whose surface is not coated. After the functional molecules are first fixed on the sensor chip surface, Is highly sensitive because substances other than the analyte that specifically binds to the functional molecules hardly nonspecifically adsorb to the sensor chip surface, and only the analyte is captured on the sensor chip surface by a specific reaction. And a stable result can be obtained.
[0047]
Since many nonspecific adsorptions occur on the surface of a conventional sensor chip, it was necessary to perform a blocking operation. In the sensor chip of the present invention, since non-specific adsorption hardly occurs, a blocking operation is not required, and only a sample that specifically binds to a functional molecule can be detected with high sensitivity.
The surface with the highest sensitivity and stability has no non-specific adsorption of substances other than the analyte that specifically binds to the functional molecule. Therefore, the measurement of surface plasmon resonance in the sensor chip of the present invention. The amount of change in the value is not more than one-half, preferably not more than one-fifth, particularly preferably not more than one-tenth the amount of change in the sensor chip whose surface is not coated.
[0048]
By immobilizing various functional molecules on the surface, the sensor chip of the present invention can be used as a protein chip, a DNA chip, and the like for analysis of biomolecular interaction, drug discovery research, disease prevention, and the like. . The method for immobilizing the functional molecule can be easily performed by a known technique. For example, there is a method in which an amino group of a functional molecule and a carboxyl group on the sensor chip surface are bound by a water-soluble condensing agent 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide.
[0049]
As the functional molecule, specifically, enzymes, antibodies, proteins such as lectins, peptides, hormones, nucleic acids, sugars, oligosaccharides, sugar chains such as polysaccharides, lipids, low molecular weight compounds, high molecular weight organic substances, inorganic substances, or These fusions, or a virus or a molecule constituting a cell, and the like can be mentioned. These functional molecules serve as target molecules when measuring the binding (interaction) between the sample and the functional molecule.
[0050]
The protein may be a full-length protein or a partial peptide containing a binding active site. Further, the protein may have a known amino acid sequence and its function, or may have an unknown protein. These can be used as a target molecule, even if they are translated from a synthesized peptide chain, a protein purified from a living body, or a cDNA library using an appropriate translation system, and then purified, etc. The synthesized peptide chain may be a glycoprotein having a sugar chain bonded thereto. Of these, a purified protein having a known amino acid sequence, or a protein translated and purified from a cDNA library or the like using an appropriate method is preferable.
[0051]
The nucleic acid is not particularly limited, and DNA or RNA can be used. In addition, a nucleic acid whose base sequence or function is known or unknown may be used. Preferably, those having a function of binding to a protein and having a known function and base sequence as a nucleic acid, or those cut and isolated from a genomic library or the like using a restriction enzyme or the like can be used.
[0052]
The sugar chain may be a known sugar chain or an unknown sugar chain whose sugar sequence or function is known. Preferably, a sugar chain which has already been separated and analyzed and whose sugar sequence or function is known is used.
The low molecular weight compound is not particularly limited as long as it has an ability to interact. Those whose function is unknown or whose ability to bind to a protein is already known can be used.
[0053]
In addition, a sensor chip on which a functional molecule is immobilized can be suitably used as a biosensor for detecting a molecule that interacts with the functional molecule.
The “interaction” between a functional molecule and an analyte is usually defined as an intermolecular interaction resulting from at least one of a covalent bond, a hydrophobic bond, a hydrogen bond, a van der Waals bond, and an electrostatic bond between the target molecule and the analyte. The term should be interpreted in the broadest sense and not in any sense in any way. The covalent bond includes a coordination bond and a dipole bond. The coupling by electrostatic force includes not only electrostatic coupling but also electric repulsion. In addition, a binding reaction, a synthesis reaction, and a decomposition reaction resulting from the above action are also included in the interaction.
[0054]
Specific examples of the interaction include binding and dissociation between an antigen and an antibody, binding and dissociation between a protein receptor and a ligand, binding and dissociation between an adhesion molecule and a partner molecule, binding and dissociation between an enzyme and a substrate, Binding and dissociation between an apoenzyme and a coenzyme, binding and dissociation between a nucleic acid and a protein bound thereto, binding and dissociation between proteins in a signal transduction system, binding and dissociation between a glycoprotein and a protein, Alternatively, binding and dissociation between a sugar chain and a protein may be mentioned, but the present invention is not limited to this range. For example, immunoglobulin and its derivative F (ab ')Two, Fab ′, Fab, receptors and enzymes and their derivatives, nucleic acids, natural or artificial peptides, artificial polymers, carbohydrates, lipids, inorganic or organic ligands, viruses, cells, drugs and the like.
[0055]
As a method for detecting an interaction using a sensor chip on which a functional molecule is immobilized, for example, analysis is performed using a so-called DNA array or DNA chip or a sensor chip on which DNA or protein called a protein array or protein chip is immobilized. The method is applicable. Specific examples include a fluorescence method, a chemiluminescence method, an RI method, a surface plasmon resonance method, a mass spectrometry, a quartz oscillator, and a detection method using an electrochemical method. Among them, detection by the surface plasmon resonance method is suitably used because the sample can be analyzed without labeling.
[0056]
【The invention's effect】
The sensor chip of the present invention has characteristics that drift hardly occurs and non-specific adsorption to the surface hardly occurs, so that measurement with high sensitivity can be performed.
Furthermore, since it has a large binding capacity for immobilizing functional molecules at high density, by immobilizing the functional molecules on the sensor chip, it is possible to detect molecules that interact with the functional molecules. It can be suitably used as a biosensor.
[0057]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
Example 1 Fabrication of a sensor chip coated with a hydrophilic polymer substance
(1) Preparation of sensor chip surface having amino group
34 mg of cysteamine hydrochloride was dissolved in 60 ml of water. In this solution, a gold-coated grating chip having a size of 2.5 cm × 2.5 cm (an irregular shape having a groove pitch of about 870 nm and a groove depth of about 40 nm is formed on the surface of a flat polycarbonate substrate. Using a diffraction grating as the shape, a sensor chip (gold-deposited with a thickness of about 80 nm) was immersed in the surface of the substrate, and reacted at room temperature for 20 minutes. After the reaction, the sensor chip was washed with distilled water. In this treatment, an amino group is introduced into the surface of the gold-coated sensor chip via a gold-sulfur bond.
[0058]
(2) Immobilization of polyacrylic acid on the sensor chip surface
In 25 ml of water, 1.25 g of polyacrylic acid (molecular weight: 50,000) (manufactured by Polyscience) and 24 mg of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride (EDC) are dissolved. Was. After adjusting the pH of the solution to 2.2, the aminated sensor chip obtained in the above (1) was immersed in 2.5 ml of the solution, and reacted for 1 hour. After the reaction, the chips were washed with distilled water. In this treatment, the amino group on the gold surface and the carboxyl group of the polymer are condensed by EDC to form an amide bond. By this treatment, the surface of the sensor chip can be covered with the hydrophilic polymer.
[0059]
Example 2 Evaluation of time drift generated in a sensor chip coated with a hydrophilic polymer substance
Time drift is measured by FLEX CHIPS, a SPR measurement system with resonance angle detection.TM Evaluation was performed using the Kinetic Analysis System (HTS Biosystems Inc.). The sensor chip obtained in (2) of Example 1 was used as an SPR measurement device FLEX CHIPSTM It was attached to a Kinetic Analysis System (HTS Biosystems Inc.), and the time change of the resonance angle when flowing pure water for 1 hour was measured. As a comparative example, measurement was similarly performed using a gold-coated grating chip in which the surface of the sensor chip obtained in (1) of Example 1 was not coated with a hydrophilic polymer substance.
[0060]
FIG. 1 shows a result of a time change of the resonance angle when the value immediately after the measurement is set to 0. Table 1 summarizes the results of the average change amount of the resonance angle every 20 minutes. As is clear from the chart, it was found that the generation of the drift was suppressed to one third or less by coating the surface with the hydrophilic polymer substance.
[0061]
[Table 1]
[0062]
Example 3 Density of immobilization of ligand on sensor chip surface coated with hydrophilic polymer
The ligand immobilization density is determined by performing a protein immobilization reaction on the surface of the sensor chip coated with the hydrophilic polymer, and measuring the change in the resonance angle accompanying the immobilization of the protein on the sensor chip surface by using the resonance angle detection type SPR measurement device FLEX CHIPSTM The evaluation was performed by measuring the intensity of the reflected light while performing an angular scan with a Kinetic Analysis System (HTS Biosystems Inc.). 23 mg of N-hydroxysuccinimide and 153 mg of EDC were dissolved in 40 ml of water. The carboxyl group was activated by immersing the sensor chip obtained in (2) of Example 1 in 4 ml of this solution and shaking at room temperature for 10 minutes. After the reaction, the sensor chip was washed with distilled water. Next, the sensor chip having the active ester group is connected to an SPR measurement device FLEX CHIPSTM Attached to Kinetic Analysis System (HTS Biosystems Inc.), 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) buffer (10 mM, pH 6.0): 10 minutes, MES buffer containing 0.1 mg / mL mouse IgG: 15 minutes The solution was flowed in the order of 1 M aqueous ethanolamine solution (pH 8.5): 10 minutes, MES buffer: 10 minutes. The flow rate was 0.2 mL / min. From the difference between the resonance angle before the protein injection and the resonance angle after the injection, the value of the change in the resonance angle due to the immobilization of the protein was calculated.
[0063]
As a result, the change in resonance angle due to immobilization of the protein was 896 mdeg. On the other hand, in the comparative example, since the change in resonance angle due to immobilization of the protein was 145 mdeg, it was revealed that coating the surface with a hydrophilic polymer substance increased the ligand immobilization density by a factor of 5 or more. .
[0064]
Example 4 Evaluation of non-specific adsorption on the surface of a sensor chip coated with a hydrophilic polymer substance
Non-specific adsorptivity is measured by measuring the change in resonance angle due to non-specific adsorption of protein to the sensor chip surface when the sensor chip is immersed in a protein solution.TM The evaluation was performed by measuring the intensity of reflected light while performing an angular scan with a Kinetic Analysis System (HTS Biosystems Inc.). The sensor chip obtained in (2) of Example 1 was used as an SPR measurement device FLEX CHIPSTM Attached to KineticAnalysis System (HTS Biosystems Inc.), 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) buffer (10 mM, pH 6.0): 10 minutes, MES buffer containing 0.1 mg / mL mouse IgG: 15 minutes, The solution was allowed to flow in the order of 1M ethanolamine aqueous solution (pH 8.5): 10 minutes, MES buffer: 10 minutes. The flow rate was 0.2 mL / min. From the difference between the resonance angle before the protein injection and the resonance angle after the injection, the value of the change in the resonance angle accompanying the protein adsorption was calculated.
[0065]
As a result, the change in resonance angle due to the flow of the protein solution was 14 mdeg. On the other hand, in the comparative example, since the change in the resonance angle was 145 mdeg, it became clear that the nonspecific adsorption was suppressed to 1/10 or less by coating the surface with the hydrophilic polymer substance.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a view showing a change over time of a resonance angle when a sensor chip of the present invention and a sensor chip of a comparative example in Example 2 are mounted on an SPR measuring apparatus and pure water is flown for one hour. In the figure, the horizontal axis indicates the time after mounting, and the vertical axis indicates the amount of change (mdeg) in the resonance angle immediately after the measurement.