【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、サンプル生体高分子とプローブ生体高分子とのハイブリダイゼーションを利用してサンプル生体高分子に目的とする配列が存在するか否かを分析するハイブリダイゼーション検出法、及びそれに用いられるバイオチップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、生体内の分子を同定・分画するために、特に目的ＤＮＡの検出、あるいは遺伝子ＤＮＡの有無検出などのために、既知の配列をもつ核酸や蛋白質をプローブとしてハイブリダイズする方法が多く用いられてきた。ハイブリダイゼーション検出の方法は、固定したプローブＤＮＡに蛍光物質を標識したサンプルＤＮＡを入れてハイブリダイズさせる。サンプルＤＮＡがプローブＤＮＡに結合すると、プローブＤＮＡと一緒に固定され、光源からの励起光で蛍光物質を励起し、発光する蛍光を検出することでハイブリダイゼーションを検出していた。
【０００３】
図７、図８、図９は、この従来のハイブリダイゼーション検出方法の原理を説明する図である。図７に示すように、一定量のプローブＤＮＡ１ａをガラスプレート４にスポット３ａとして固定化する。別種のプローブＤＮＡ１ｂ、プローブＤＮＡ１ｃも同様に、スポット３ｂ、スポット３ｃとして固定化する。このとき、各スポット１ａ，１ｂ，１ｃのプローブＤＮＡを全て同量にして固定化することはできない。
【０００４】
図８（ａ）に示すように、全てのサンプルＤＮＡ５ａ，５ｂ，５ｃ，…を蛍光物質６で標識する。図８（ｂ）に示すように、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡをハイブリダイズさせるために、スポットされたガラスプレート４と蛍光標識したサンプルＤＮＡ５ａ，５ｂ，５ｃ，…をハイブリダイゼーション溶液７に入れ、ハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション溶液７は、ホルムアルデヒド、ＳＳＣ（ＮａＣｌ，ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）、ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）、ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｄｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、蒸留水などからなる混合液であり、混合比率は使用するＤＮＡの性質により異なる。
【０００５】
このとき図８（ｃ）に示すように、サンプルＤＮＡとプローブＤＮＡが相補鎖であればプローブＤＮＡ１ａ，１ｂとサンプルＤＮＡ５ａ，５ｂのようにハイブリダイゼーションして二重らせん構造で結合する。一方、両者が相補鎖ＤＮＡでなければ、プローブＤＮＡ１ｃのようにサンプルＤＮＡが結合しないでそのままである。ハイブリダイゼーションの検出は、図９に示すように、励起光源としてのランプ９からの励起光でガラスプレート４を照射して蛍光物質６を励起し、発光波長域以外の光を光学フィルター１０でカットして、各スポットからの発光をＣＣＤカメラなどの二次元光センサー８で検出する。
【０００６】
この時、ハイブリダイゼーションが生じたスポット３ａ，３ｂには蛍光物質６が存在するため、ランプ９からの励起光によって蛍光物質６が励起され、発光が検出される。一方、ハイブリダイゼーションが生じていないスポット３ｃには蛍光物質が存在しないため、ランプ９からの励起光照射によっても発光は生じない。このようにして、ハイブリダイゼーションが生じたか否かによってスポット毎に明暗が観察される。二次元光センサー８からの画像データは、コントローラ１２によってコンピュータ１３に転送され、ディスプレイに画像表示される。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
プローブＤＮＡをガラスプレートに固定化するとき、全てのプローブを同じ量ずつ均等にスポットすることはできないため、プローブが多量に固定化されたスポットと少量に固定化されたスポットとではプローブＤＮＡの量が異なる。このため、ハイブリダイゼーションの検出ではサンプルＤＮＡがハイブリダイズしたか否かは判断できるが、どの位のプローブＤＮＡにどの程度のサンプルＤＮＡがハイブリダイスしたか定量的な測定を行うことはできなかった。
本発明は、このような従来技術の問題点に鑑みなされたもので、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡがどの程度ハイブリダイズしたか、定量的な測定が可能な検出方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するため、本発明では、プローブ生体高分子とサンプル生体高分子に各々異なる蛍光物質を標識し、蛍光物質の発光波長が異なることを利用して各スポット毎に、そのスポットに存在しているプローブ生体高分子とサンプル生体高分子を別々に検出できるようにする。また、ハイブリダイゼーションの検出で、プローブ生体高分子を標識している蛍光物質の発光波長とサンプル生体高分子を標識している蛍光物質の発光波長を分離検出することにより、各スポット毎にプローブ生体高分子の量及びそのプローブ生体高分子にハイブリダイズしたサンプル生体高分子の量を個別に検出して定量測定することを可能とする。
【０００９】
すなわち、プローブ生体高分子を標識した蛍光物質を発光させてガラスプレートのスポットに固定化されたプローブ生体高分子の量を求め、更にサンプル生体高分子を標識した蛍光物質を発光させてプローブ生体高分子にハイブリダイズしたサンプル生体高分子の量を求める。そして、その差分を前記プローブの量で規格化した値で、基板上にスポットされたプローブ量に対して、サンプルがどれくらいハイブリダイズしたかを測定する。ここで生体高分子とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質など、生体を構成する高分子をいう。
【００１０】
以上をまとめると、本発明によるハイブリダイゼーション検出方法は、プローブとサンプルとのハイブリダイゼーションを検出するハイブリダイゼーション検出方法において、プローブの量と前記プローブに結合したサンプルの量とを検出することを特徴とする。ここでいうプローブとは、基板に固定する生体高分子（例えばＤＮＡ）を示し、サンプルとはハイブリダイズに用いる生体高分子（例えばＤＮＡ）を示す。
本発明によるハイブリダイゼーション検出方法は、また、プローブとサンプルとのハイブリダイゼーションを検出するハイブリダイゼーション検出方法において、プローブの量と前記プローブに結合したサンプルの量との差分を前記プローブの量で規格化した値を検出することを特徴とする。
【００１１】
プローブの量とプローブに結合したサンプルの量の検出は、ハイブリダイゼーションを行う前にプローブの量を検出し、ハイブリダイゼーション終了後にプローブに結合したサンプルの量を検出するようにしてもよいし、ハイブリダイゼーション終了後にプローブの量とプローブに結合したサンプルの量を共に検出するようにしてもよい。
【００１２】
プローブの量とプローブに結合したサンプルの量の検出は、プローブとサンプルに各々異なる検出用の標識を付けておき、その標識を検出することで行うことができる。
検出されたプローブの量とプローブに結合したサンプルの量との差分を前記プローブの量で規格化した値はディスプレイに表示することができる。
本発明によるバイオチップは、蛍光物質で標識したプローブをスポットしたことを特徴とする。
【００１３】
基板に固定されるプローブ量は、各プローブごと、各基板ごとに異なる。同じプローブが固定されている２個のバイオチップ１，２を用いて、異なるサンプルＡ、Ｂについて実験を行ったときを例に挙げて説明する。用いたサンプル及びプローブはＤＮＡであるとする。バイオチップ上のあるプローブが、バイオチップ１には１０ｎｇ固定され、バイオチップ２には８ｎｇ固定されていて、ハイブリダイズ前の蛍光強度が例えば２５６階調の１００と８０あったとする。サンプルＡ、Ｂをそれぞれこのバイオチップ１，２上のプローブとハイブリダイズしたとき、ハイブリダイズ後の蛍光強度がサンプルＡは７０、サンプルＢは６０となったとすると、このままではサンプルＡの方がサンプルＢよりもそのＤＮＡ量が多いと判断される。しかし、バイオチップにもともと固定されていたプローブの量とそのプローブに結合したサンプルの量との差分をプローブの量で規格化した値を計算して、どのくらいの割合でハイブリダイズしているのかを考えると、
サンプルＡ：（１００−７０）÷１００＝０．３
サンプルＢ：（８０−６０）÷８０＝０．２５
となり、プローブとハイブリダイズしたＤＮＡの割合は実際にはサンプルＡの方がサンプルＢより少ないといえる。このようにハイブリダイズ後の蛍光強度だけでサンプルのＤＮＡ量を考えるより、より精密な解析ができる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。ここでは、本発明の一例として、プローブ生体高分子及びサンプル生体高分子が共にＤＮＡである場合について説明するが、ＤＮＡ以外のＲＮＡや蛋白質に対しても本発明が同様に適用可能であるのは勿論である。
【００１５】
図１〜図３は、本発明によるハイブリダイゼーション検出方法の一例の原理を説明する図である。図１に示すように、全てのプローブＤＮＡ１ａ，１ｂ，１ｃ，…に同一の蛍光物質２を標識する。蛍光物質２としては、例えばイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）を使用する。プローブＤＮＡ１ａをガラスプレート４にスポット３ａとして固定化し、別種のプローブＤＮＡ１ｂ、プローブＤＮＡ１ｃ、…も同様に、スポット３ｂ、スポット３ｃ、…としてガラスプレート４に固定化する。
【００１６】
また、図２（ａ）に示すように、サンプルＤＮＡは全てのサンプルＤＮＡ５ａ，５ｂ，５ｃ，…を蛍光物質６で標識する。蛍光物質６としては、例えばＣｙ５を使用する。ハイブリダイゼーションに当たっては、図２（ｂ）に示すように、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡをハイブリダイズさせるために、プローブＤＮＡ１ａ，１ｂ，１ｃ，…がスポットされたガラスプレート４（図１参照）と蛍光標識したサンプルＤＮＡ５ａ，５ｂ，５ｃ，…とをハイブリダイゼーション溶液７に入れ、ハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション溶液７は、ホルムアルデヒド、ＳＳＣ（ＮａＣｌ，ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）、ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）、ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｄｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、蒸留水などからなる混合液であり、混合比率は使用するＤＮＡの性質により異なる。
【００１７】
このとき、サンプルＤＮＡ５ａ，５ｂ，５ｃ，…とプローブＤＮＡが相補鎖であれば、図２（ｃ）に示すスポット３ａのプローブＤＮＡ１ａやスポット３ｂのプローブＤＮＡ１ｂのように、サンプルＤＮＡ５ａ，５ｂ，５ｃ，…とハイブリダイゼーションして二重らせん構造で結合する。一方、両者が相補鎖ＤＮＡでなければ、図２（ｃ）に示すスポット３ｃのプローブＤＮＡ１ｃのように、サンプルＤＮＡが結合しないでそのままである。つまり、ハイブリダイゼーションが生じたスポット３ａや３ｂには、プローブＤＮＡ１ａ，１ｂを標識している蛍光物質２と、プローブＤＮＡ１ａ，１ｂに結合したサンプルＤＮＡ５ａ，５ｂを標識している蛍光物質６が存在する。一方、ハイブリダイゼーションが生じていないスポット３ｃには、プローブＤＮＡ１ｃを標識している蛍光物質２のみが存在する。
【００１８】
ハイブリダイゼーションの検出は、図３に示すように、励起光源としてのランプ９からの励起光でサンプルを標識する蛍光物質６とプローブＤＮＡを蛍光物質２を励起して発光させる。励起光源のランプとしては例えば、発光波長域が約３００−約７００ｎｍであるキセノンランプを使用する。これは、ＦＩＴＣが励起波長４９０ｎｍ、発光波長５２０ｎｍであり、Ｃｙ５が励起波長６５０ｎｍ、発光波長６６７ｎｍであるため、両方の蛍光物質を同時に発光させることができるからである。発光の検出にあたっては、ＦＩＴＣの発光を読み取るときは透過波長５２０ｎｍの光学フィルター１０を、Ｃｙ５の発光を読み取るときは透過波長６６７ｎｍの光学フィルター１１を用いて二次元光センサー８で読み取る。二次元光センサー８からのデータは、コントローラー１２によってコンピュータ１３へ転送される。二次元光センサー８としては例えばＣＣＤカメラを使用し、２枚の光学フィルター１０，１１はステージ１４の駆動によって矢印の方向に移動され、交換される。
【００１９】
コンピュータ１３では、ＦＩＴＣの発光を読み取ったデータ値から各スポットにおけるプローブＤＮＡの量を求め、Ｃｙ５の発光を読み取ったデータ値から各スポットにおいてプローブＤＮＡとハイブリダイズしたサンプルＤＮＡの量を求める。ＦＩＴＣの発光量ＡｉからＣｙ５の発光量Ｂｉを引いて得られた差分をＦＩＴＣの発光量で割った評価値Ｃｉ〔Ｃｉ＝（Ａｉ−Ｂｉ）／Ａｉ〕を計算すれば、プローブＤＮＡ量からの相対値でハイブリダイズしたサンプルＤＮＡ量を求めることができ、高精度な定量測定ができる。
【００２０】
上記評価値Ｃｉを計算することにより、評価値Ｃｉ〔Ｃｉ＝（Ａｉ−Ｂｉ）／Ａｉ〕が大きいほどプローブＤＮＡにハイブリダイズしたサンプルＤＮＡの量が少ないことを意味し、反対に評価値Ｃｉが小さいほどプローブＤＮＡにハイブリダイズしたサンプルＤＮＡの量が多い、即ちプローブＤＮＡと相補性があると判断できる。ここで、評価値としてＣｉ＝（Ａｉ−Ｂｉ）／Ａｉを採用したのは、プローブＤＮＡ量からハイブリダイズしたサンプルＤＮＡ量を引いた方が比較を簡単に行えるからである。つまり、どんな状態でも、基板上に固定されたプローブＤＮＡの方が、そのＤＮＡにハイブリダイズしたサンプルＤＮＡの量より少ないということはないからである。
【００２１】
図４は、評価値の処理手順を示すフローチャートである。ステップ１１において、評価値を計算するスポットの番号を初期設定する。ステップ１２では、スポットｉのＦＩＴＣの発光量ＡｉとＣｙ５の発光量Ｂｉを求める。ステップ１３では、発光量の差分を発光量Ａｉで割った値Ｃｉ＝（Ａｉ−Ｂｉ）／Ａｉを計算する。得られた評価値ＣｉはハイブリダイズしなかったプローブＤＮＡ量に対応し、これからサンプルＤＮＡとプローブＤＮＡとの相補性の程度を判断することができる。ステップ１４では、求めた相対値Ｃｉをコンピュータ１３の表示部に階調として表示する。このとき、評価値の大きい値は明るく、小さい値は暗く表示する。また、ポジフィルムのようにその反対で表示してもよい。ステップ１５では、全てのスポットを処理したかチェックし、全てのスポットの処理が終了してないときはステップ１６で次のスポットの位置を求め、ステップ１２からの処理を繰り返す。全てのスポットの計算が終了したときは処理を終了する。
【００２２】
図５及び図６は、本発明による検出方法の他の例の原理を説明する図である。この検出方法は、ハイブリダイゼーションする前にプローブＤＮＡの量、すなわちプローブＤＮＡに標識したＦＩＴＣ等の発光量を読み取っておき、ハイブリダイゼーション後、サンプルＤＮＡの量、すなわちサンプルＤＮＡに標識したＣｙ５等の発光量を読み取り、評価値を求める方法である。
【００２３】
図５（ａ）に示すように、例えばＦＩＴＣのような蛍光物質で標識したプローブＤＮＡをスポット３ａ，３ｂ，３ｃ，…としてガラスプレート４に固定化する。これは、先に図１にて説明したのと同様の方法で行う。次に、ハイブリダイゼーション前に各スポット３ａ，３ｂ，３ｃ，…のプローブＤＮＡの量を読み取るため、図５（ｂ）に示すように、ランプ９からの励起光を照射してプローブＤＮＡに標識したＦＩＴＣの発光量を二次元光センサー８で読み取る。このとき、二次元光センサー８の光路中には透過波長５２０ｎｍの光学フィルター１０を配置する。これは、先に図３によって説明したＦＩＴＣの発光量読み取りと同様にして行われる。読み取った各スポットの発光量データＡｉは、フロッピーディスク１４などの記憶媒体に格納しておく。
【００２４】
例えばＣｙ５からなる蛍光物質６で標識したサンプルＤＮＡ５ａ，５ｂ，５ｃ，…とプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションは、図６（ａ）に示すように、図２（ｂ）で説明したのと同様にして行われる。ハイブリダイゼーションの検出は、図６（ｂ）に示すように、ランプ９からの励起光でガラスプレート４を照射し、Ｃｙ５からの発光量を二次元光センサー８で読み取ることによって行われる。このとき、二次元光センサー８の光路中には透過波長６６７ｎｍの光学フィルター１１を配置する。これは、図３で説明したＣｙ５の発光読取りと同様である。このあと、フロッピーディスク１４に格納されているＦＩＴＣの発光量データＡｉを読み込み、Ｃｙ５の発光量データＢｉとの差分をとる。各差分はＦＩＴＣの発光量データＡｉで割る。差分の取り方は、図３に示す処理と同様であり、この方法によっても定量測定ができる。
【００２５】
この方法は、基板にどの程度プローブＤＮＡが固定化されたか、ハイブリダイゼーションを行う前に分かるため、サンプルＤＮＡの量をどの程度にしてハイブリダイゼーションすればよいか、また、プローブＤＮＡが固定化できなかった無効なスポットの位置などをハイブリダイゼーション前に知ることができるため、事前の対処ができ、効率の良い実験ができる。
【００２６】
【発明の効果】
本発明によると、スポットされたプローブの量と、プローブにハイブリダイゼーションしたサンプルの量を知ることができ、その差分を前記プローブの量で規格化した値を求めることでより厳密なハイブリダイズ量（相補性の程度）を計算でき、プローブに結合したサンプルの量を高精度に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるハイブリダイゼーション検出方法の一例の原理を説明する図。
【図２】本発明によるハイブリダイゼーション検出方法の一例の原理を説明する図。
【図３】本発明によるハイブリダイゼーション検出方法の一例の原理を説明する図。
【図４】評価値の処理手順を示すフローチャート。
【図５】本発明による検出方法の他の例の原理を説明する図。
【図６】本発明による検出方法の他の例の原理を説明する図。
【図７】従来のハイブリダイゼーション検出方法の原理を説明する図。
【図８】従来のハイブリダイゼーション検出方法の原理を説明する図。
【図９】従来のハイブリダイゼーション検出方法の原理を説明する図。
【符号の説明】
１ａ，１ｂ，１ｃ…プローブＤＮＡ、２…蛍光物質、３ａ，３ｂ，３ｃ…プローブＤＮＡのスポット、４…ガラスプレート、５ａ，５ｂ，５ｃ…サンプルＤＮＡ、６…蛍光物質、７…ハイブリダイゼーション溶液、８…二次元光センサー、９…励起光源、１０，１１…光学フィルター、１２…コンピュータ、１３…コントローラ、１４…フロッピーディスク[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention provides a hybridization detection method for analyzing whether a target sequence is present in a sample biopolymer by using hybridization between a sample biopolymer and a probe biopolymer, and a biochip used therefor. About.
[0002]
[Prior art]
2. Description of the Related Art Conventionally, there are many methods of hybridizing a nucleic acid or protein having a known sequence as a probe to identify and fractionate a molecule in a living body, particularly for detecting a target DNA or detecting the presence or absence of gene DNA. Has been used. In the hybridization detection method, a sample DNA labeled with a fluorescent substance is added to an immobilized probe DNA and hybridized. When the sample DNA binds to the probe DNA, it is fixed together with the probe DNA, and the fluorescent substance is excited by the excitation light from the light source, and the fluorescence is emitted to detect the hybridization.
[0003]
FIG. 7, FIG. 8, and FIG. 9 are diagrams illustrating the principle of this conventional hybridization detection method. As shown in FIG. 7, a fixed amount of the probe DNA 1a is immobilized on the glass plate 4 as a spot 3a. Similarly, other types of probe DNAs 1b and 1c are immobilized as spots 3b and 3c. At this time, the probe DNAs of the spots 1a, 1b, 1c cannot all be immobilized in the same amount.
[0004]
As shown in FIG. 8A, all the sample DNAs 5a, 5b, 5c,. As shown in FIG. 8 (b), in order to hybridize the probe DNA and the sample DNA, the spotted glass plate 4 and the fluorescently labeled sample DNAs 5a, 5b, 5c,. Let it. The hybridization solution 7 is a mixed solution composed of formaldehyde, SSC (NaCl, trisodium citrate), SDS (sodium dodecyl sulfate), EDTA (ethylenediamidetetraacetic acid), distilled water, etc. The mixing ratio differs depending on the nature of the DNA used.
[0005]
At this time, as shown in FIG. 8 (c), if the sample DNA and the probe DNA are complementary chains, they hybridize to each other in a double helical structure like the probe DNAs 1a and 1b and the sample DNAs 5a and 5b. On the other hand, if both are not complementary strand DNAs, the sample DNAs remain as they are, unlike the probe DNA 1c. As shown in FIG. 9, the detection of hybridization is performed by irradiating the glass plate 4 with excitation light from a lamp 9 as an excitation light source to excite the fluorescent substance 6, and cutting light outside the emission wavelength range with the optical filter 10. Then, light emission from each spot is detected by a two-dimensional optical sensor 8 such as a CCD camera.
[0006]
At this time, since the fluorescent substance 6 exists in the spots 3a and 3b where the hybridization has occurred, the fluorescent substance 6 is excited by the excitation light from the lamp 9, and the light emission is detected. On the other hand, since no fluorescent substance is present in the spot 3c where no hybridization occurs, no light emission occurs even when the excitation light is irradiated from the lamp 9. In this way, light and dark are observed for each spot depending on whether or not hybridization has occurred. Image data from the two-dimensional optical sensor 8 is transferred to the computer 13 by the controller 12 and displayed on a display.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
When the probe DNA is immobilized on a glass plate, all the probes cannot be spotted equally by the same amount. Therefore, the amount of the probe DNA differs between the spot where the probe is immobilized in a large amount and the spot where the probe is immobilized in a small amount. Are different. For this reason, in the detection of hybridization, it can be determined whether or not the sample DNA has hybridized, but it has not been possible to quantitatively measure the amount of the probe DNA and the amount of the hybridized sample DNA.
The present invention has been made in view of such problems of the related art, and has as its object to provide a detection method capable of quantitatively measuring the degree of hybridization between a probe DNA and a sample DNA.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, in the present invention, the probe biopolymer and the sample biopolymer are labeled with different fluorescent substances, and the fact that the emission wavelengths of the fluorescent substances are different is used for each spot. The probe biopolymer and the sample biopolymer are separately detected. In addition, in the detection of hybridization, the emission wavelength of the fluorescent substance labeling the probe biopolymer and the emission wavelength of the fluorescent substance labeling the sample biopolymer are separately detected, so that the probe biomolecule is detected for each spot. The amount of the polymer and the amount of the sample biopolymer hybridized to the probe biopolymer can be individually detected and quantitatively measured.
[0009]
That is, the amount of the probe biopolymer immobilized on the spot on the glass plate is determined by emitting a fluorescent substance labeled with the probe biopolymer, and the fluorescent substance labeled with the sample biopolymer is further emitted by emitting the probe biopolymer. Determine the amount of sample biopolymer hybridized to the molecule. Then, a value obtained by normalizing the difference with the amount of the probe is used to measure how much the sample has hybridized to the amount of the probe spotted on the substrate. Here, the biopolymer refers to a polymer constituting the living body, such as DNA, RNA, and protein.
[0010]
In summary, the hybridization detection method according to the present invention is characterized in that in a hybridization detection method for detecting hybridization between a probe and a sample, the amount of the probe and the amount of the sample bound to the probe are detected. I do. The probe here refers to a biopolymer (eg, DNA) immobilized on a substrate, and the sample refers to a biopolymer (eg, DNA) used for hybridization.
In the hybridization detection method according to the present invention, in the hybridization detection method for detecting hybridization between a probe and a sample, the difference between the amount of the probe and the amount of the sample bound to the probe is normalized by the amount of the probe. The detected value is detected.
[0011]
The detection of the amount of the probe and the amount of the sample bound to the probe may be performed by detecting the amount of the probe before performing the hybridization and detecting the amount of the sample bound to the probe after the hybridization is completed. After the hybridization, the amount of the probe and the amount of the sample bound to the probe may be detected together.
[0012]
The detection of the amount of the probe and the amount of the sample bound to the probe can be performed by attaching different detection labels to the probe and the sample, respectively, and detecting the label.
A value obtained by normalizing the difference between the detected amount of the probe and the amount of the sample bound to the probe by the amount of the probe can be displayed on a display.
The biochip according to the present invention is characterized in that a probe labeled with a fluorescent substance is spotted.
[0013]
The amount of the probe fixed to the substrate differs for each probe and each substrate. An example will be described in which experiments are performed on different samples A and B using two biochips 1 and 2 on which the same probe is immobilized. The samples and probes used are assumed to be DNA. It is assumed that a certain probe on the biochip is fixed to the biochip 1 at 10 ng and the biochip 2 is fixed at 8 ng, and the fluorescence intensity before hybridization is, for example, 100 and 80 of 256 gradations. When the samples A and B are hybridized with the probes on the biochips 1 and 2, respectively, the fluorescence intensity after hybridization is 70 for sample A and 60 for sample B. It is determined that the amount of DNA is larger than B. However, the difference between the amount of the probe originally fixed on the biochip and the amount of the sample bound to the probe was calculated by normalizing the difference with the amount of the probe, and the percentage of hybridization was determined. Thinking,
Sample A: (100−70) ÷ 100 = 0.3
Sample B: (80-60) ÷ 80 = 0.25
Thus, it can be said that the ratio of the DNA hybridized with the probe is actually smaller in sample A than in sample B. Thus, more precise analysis can be performed than when the amount of DNA in a sample is considered only by the fluorescence intensity after hybridization.
[0014]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings. Here, as an example of the present invention, a case where both the probe biopolymer and the sample biopolymer are DNA will be described. However, the present invention can be similarly applied to RNA and protein other than DNA. Of course.
[0015]
1 to 3 are diagrams illustrating the principle of an example of a hybridization detection method according to the present invention. As shown in FIG. 1, the same fluorescent substance 2 is labeled on all the probe DNAs 1a, 1b, 1c,. As the fluorescent substance 2, for example, fluorescein isothiocyanate (FITC) is used. Probe DNA 1a is immobilized on glass plate 4 as spot 3a, and other types of probe DNA 1b, probe DNA 1c,... Are similarly immobilized on glass plate 4 as spot 3b, spot 3c,.
[0016]
2A, all the sample DNAs 5a, 5b, 5c,... Are labeled with the fluorescent substance 6. As the fluorescent substance 6, for example, Cy5 is used. In the hybridization, as shown in FIG. 2 (b), in order to hybridize the probe DNA with the sample DNA, a glass plate 4 (see FIG. 1) on which probe DNAs 1a, 1b, 1c,. The sample DNAs 5a, 5b, 5c,... Are put into the hybridization solution 7 and hybridized. The hybridization solution 7 is a mixed solution composed of formaldehyde, SSC (NaCl, trisodium citrate), SDS (sodium dodecyl sulfate), EDTA (ethylenediamidetetraacetic acid), distilled water, etc. The mixing ratio differs depending on the nature of the DNA used.
[0017]
At this time, if the sample DNAs 5a, 5b, 5c,... And the probe DNAs are complementary chains, the sample DNAs 5a, 5b, 5c, ... and binds in a double helix structure. On the other hand, if both are not complementary strand DNAs, the sample DNAs remain unbound, as in the case of the probe DNA 1c of the spot 3c shown in FIG. 2 (c). That is, in the spots 3a and 3b where hybridization has occurred, the fluorescent substance 2 labeling the probe DNAs 1a and 1b and the fluorescent substance 6 labeling the sample DNAs 5a and 5b bound to the probe DNAs 1a and 1b are present. . On the other hand, only the fluorescent substance 2 labeling the probe DNA 1c is present in the spot 3c where no hybridization has occurred.
[0018]
In the detection of hybridization, as shown in FIG. 3, the fluorescent substance 6 and the probe DNA for labeling the sample are excited by the excitation light from the lamp 9 as the excitation light source, and the fluorescent substance 2 is excited to emit light. As a lamp of the excitation light source, for example, a xenon lamp having an emission wavelength range of about 300 to about 700 nm is used. This is because FITC has an excitation wavelength of 490 nm and an emission wavelength of 520 nm, and Cy5 has an excitation wavelength of 650 nm and an emission wavelength of 667 nm, so that both fluorescent substances can emit light simultaneously. In detecting the light emission, the optical filter 10 having a transmission wavelength of 520 nm is used to read the emission of FITC, and the optical filter 11 having the transmission wavelength of 667 nm is used to read the emission of Cy5. Data from the two-dimensional optical sensor 8 is transferred to the computer 13 by the controller 12. For example, a CCD camera is used as the two-dimensional optical sensor 8, and the two optical filters 10 and 11 are moved in the direction of the arrow by the driving of the stage 14, and are replaced.
[0019]
The computer 13 determines the amount of probe DNA in each spot from the data value obtained by reading the emission of FITC, and obtains the amount of sample DNA hybridized with the probe DNA in each spot from the data value obtained by reading the emission of Cy5. By calculating an evaluation value Ci [Ci = (Ai−Bi) / Ai] by dividing the difference obtained by subtracting the emission amount Bi of Cy5 from the emission amount Ai of FITC, the difference obtained by subtracting the emission amount Bi of Cy5 from the emission amount Ai of FITC, The amount of hybridized sample DNA can be determined by the relative value, and highly accurate quantitative measurement can be performed.
[0020]
By calculating the evaluation value Ci, the larger the evaluation value Ci [Ci = (Ai−Bi) / Ai], the smaller the amount of the sample DNA hybridized to the probe DNA. It can be determined that the smaller the amount, the larger the amount of the sample DNA hybridized to the probe DNA, that is, the more complementary the sample DNA. Here, the reason why Ci = (Ai-Bi) / Ai was adopted as the evaluation value is that the comparison can be more easily performed by subtracting the amount of the hybridized sample DNA from the amount of the probe DNA. That is, in any state, the amount of the probe DNA immobilized on the substrate is not smaller than the amount of the sample DNA hybridized to the DNA.
[0021]
FIG. 4 is a flowchart illustrating a procedure for processing the evaluation value. In step 11, the number of the spot for which the evaluation value is calculated is initialized. In step 12, the light emission amount Ai of FITC and the light emission amount Bi of Cy5 at the spot i are obtained. In step 13, a value Ci = (Ai-Bi) / Ai is calculated by dividing the difference between the light emission amounts by the light emission amount Ai. The obtained evaluation value Ci corresponds to the amount of unhybridized probe DNA, from which the degree of complementarity between the sample DNA and the probe DNA can be determined. In step 14, the obtained relative value Ci is displayed on the display unit of the computer 13 as a gradation. At this time, a large value of the evaluation value is displayed bright, and a small value is displayed dark. Also, the opposite may be displayed like a positive film. In step 15, it is checked whether all the spots have been processed. If all the spots have not been processed, the position of the next spot is obtained in step 16, and the processing from step 12 is repeated. When the calculation of all the spots is completed, the process ends.
[0022]
5 and 6 are diagrams for explaining the principle of another example of the detection method according to the present invention. In this detection method, the amount of probe DNA, that is, the amount of luminescence of FITC or the like labeled on the probe DNA is read before hybridization, and the amount of sample DNA, that is, the amount of luminescence of Cy5 or the like labeled on sample DNA is read after hybridization. This is a method of reading an evaluation value and obtaining an evaluation value.
[0023]
As shown in FIG. 5A, a probe DNA labeled with a fluorescent substance such as FITC is immobilized on the glass plate 4 as spots 3a, 3b, 3c,. This is performed in the same manner as described with reference to FIG. Next, in order to read the amount of probe DNA in each spot 3a, 3b, 3c,... Before hybridization, as shown in FIG. 5B, the probe DNA was labeled by irradiating it with excitation light from a lamp 9. The light emission amount of FITC is read by the two-dimensional optical sensor 8. At this time, an optical filter 10 having a transmission wavelength of 520 nm is arranged in the optical path of the two-dimensional optical sensor 8. This is performed in the same manner as the reading of the light emission amount of FITC described with reference to FIG. The read light emission amount data Ai of each spot is stored in a storage medium such as the floppy disk 14.
[0024]
For example, the hybridization between the sample DNAs 5a, 5b, 5c,... Labeled with the fluorescent substance 6 composed of Cy5 and the probe DNA is performed in the same manner as described with reference to FIG. Done. As shown in FIG. 6B, the detection of hybridization is performed by irradiating the glass plate 4 with excitation light from a lamp 9 and reading the amount of light emitted from Cy 5 with a two-dimensional optical sensor 8. At this time, an optical filter 11 having a transmission wavelength of 667 nm is arranged in the optical path of the two-dimensional optical sensor 8. This is the same as the light emission reading of Cy5 described with reference to FIG. Thereafter, the light emission amount data Ai of FITC stored in the floppy disk 14 is read, and a difference from the light emission amount data Bi of Cy5 is obtained. Each difference is divided by the emission amount data Ai of FITC. The method of obtaining the difference is the same as the processing shown in FIG. 3, and quantitative measurement can be performed by this method.
[0025]
In this method, since the amount of the probe DNA immobilized on the substrate can be known before the hybridization, the amount of the sample DNA to be hybridized and the amount of the probe DNA cannot be immobilized. Since the position of an invalid spot or the like can be known before hybridization, it is possible to deal with the problem in advance and to perform an efficient experiment.
[0026]
【The invention's effect】
According to the present invention, the amount of the probe spotted and the amount of the sample hybridized to the probe can be known, and the difference is normalized to the amount of the probe to obtain a more strict hybridization amount ( (The degree of complementarity) can be calculated, and the amount of sample bound to the probe can be measured with high accuracy.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram illustrating the principle of an example of a hybridization detection method according to the present invention.
FIG. 2 is a view for explaining the principle of an example of a hybridization detection method according to the present invention.
FIG. 3 is a view for explaining the principle of an example of a hybridization detection method according to the present invention.
FIG. 4 is a flowchart showing a procedure for processing an evaluation value.
FIG. 5 is a diagram illustrating the principle of another example of the detection method according to the present invention.
FIG. 6 is a diagram illustrating the principle of another example of the detection method according to the present invention.
FIG. 7 is a diagram illustrating the principle of a conventional hybridization detection method.
FIG. 8 is a view for explaining the principle of a conventional hybridization detection method.
FIG. 9 is a diagram illustrating the principle of a conventional hybridization detection method.
[Explanation of symbols]
1a, 1b, 1c: probe DNA, 2: fluorescent substance, 3a, 3b, 3c: spot of probe DNA, 4: glass plate, 5a, 5b, 5c: sample DNA, 6: fluorescent substance, 7: hybridization solution, 8 two-dimensional optical sensor, 9 excitation light source, 10, 11 optical filter, 12 computer, 13 controller, 14 floppy disk