JP2004024095A

JP2004024095A - Protein production method, fusion protein and protein

Info

Publication number: JP2004024095A
Application number: JP2002184787A
Authority: JP
Inventors: Akira Ideno; 井手野　晃; Junichi Hata; 秦　純一; Akiko Tougi; 東儀　彰子; Masahiro Furuya; 古谷　昌弘
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 2002-06-25
Filing date: 2002-06-25
Publication date: 2004-01-29

Abstract

【課題】従来の宿主生物系又は無細胞翻訳系での組み換えタンパク質発現方法では活性型タンパク質の発現が困難であったタンパク質について、効率的にタンパク質を発現させることができ、精製も容易なタンパク質の生産方法、この方法により生産された融合タンパク質及びタンパク質を提供する。
【解決手段】シャペロニン遺伝子と目的タンパク質遺伝子とを含む遺伝子を転写・翻訳することによって、目的タンパク質をシャペロニンとペプチド結合を介して連結させた融合タンパク質として発現させる目的タンパク質の生産方法であって、前記融合タンパク質において、前記シャペロニンはＮ回連結体（Ｎは１〜２０）であり、前記シャペロニンのＮ末端及びＣ末端に同種又は異種の目的タンパク質が連結されているタンパク質の生産方法。
【選択図】　　　なしAn object of the present invention is to provide a protein which is difficult to express an active protein by a conventional method for expressing a recombinant protein in a host biological system or a cell-free translation system. Methods of production, fusion proteins and proteins produced by this method are provided.
The present invention provides a method for producing a target protein, wherein a gene containing a chaperonin gene and a target protein gene is transcribed and translated, whereby the target protein is expressed as a fusion protein linked to the chaperonin via a peptide bond. In the fusion protein, a method for producing a protein in which the chaperonin is an N-fold conjugate (N is 1 to 20), and a homologous or heterologous target protein is linked to the N-terminal and C-terminal of the chaperonin.
[Selection diagram] None

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、従来の宿主生物系又は無細胞翻訳系での組み換えタンパク質発現方法では活性型タンパク質の発現が困難であったタンパク質について、効率的にタンパク質を発現させることができ、精製も容易なタンパク質の生産方法、この方法により生産された融合タンパク質及びタンパク質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまでにバクテリア、酵母、昆虫、動植物細胞、トランスジェニック動・植物等多くの宿主生物での組み換えタンパク質発現系及び無細胞翻訳系が確立されてきた。なかでも、哺乳類動物の培養細胞による組み換えタンパク質の生産方法は、適当な翻訳後修飾が施されることから治療薬製造の標準システムとなりつつある。
【０００３】
しかし、哺乳類動物の培養細胞による組み換えタンパク質の生産方法は、微生物を用いる系に比べてタンパク質の発現レベルが低く、より大きな培養槽を必要とすることから、新薬を手がけるバイオテクノロジー産業では今後、製造設備が不足すると考えられている（Ｇａｒｂｅｒ，Ｋ．，２００１，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９，１８４−１８５）。近年、生産効率の向上が図られているトランスジェニック動・植物を用いるタンパク質生産技術も、全幅の信頼を得られるには至っていない（Ｇａｒｂｅｒ，Ｋ．，２００１，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９，１８４−１８５）。
【０００４】
一方、これまでに開発された組み換えタンパク質発現系では、活性型タンパク質を大量に得ることが困難な場合が多々ある。
例えば、目的タンパク質が宿主生物に対するなんらかの毒性を有する場合には発現が抑制され発現量が低下する。
また、目的タンパク質が可溶性タンパク質として発現しても宿主プロテアーゼによって分解されてしまい生産量が極めて少なくなる場合もある。
更に、目的タンパク質が発現しても折り畳みがうまくいかず、可溶化が困難な封入体を形成してしまう場合もある。この場合、可溶化して再折り畳みを行っても最終的に得られる活性型タンパク質の量は極めて少なくなってしまう。特に無細胞翻訳系の場合には、生成したポリペプチドは互いに凝集してしまい、不溶化しやすくなる。このような封入体の生成に対しては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．，ｅｔ　ａｌ．，１９８８，Ｇｅｎｅ６７，３１−４０）やチオレドキシン　（ＬａＶａｌｌｉｅ，Ｅ．Ｒ．ｅｔａｌ．，１９９３，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１，１８７−１９３）、マルトース結合タンパク質（Ｇｕａｎ，Ｃ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ６７，２１−３０）等との融合タンパク質として発現させる方法等が提案されているが、封入体の形成を高効率で解消することは困難であった。
【０００５】
このような従来の組み換えタンパク質発現系では活性型タンパク質が得にくいタンパク質としては、例えば、抗体等が挙げられる。
抗体は、医療・診断分野等での利用が近年非常に期待されているが、その組み換え体を得るために大腸菌等を宿主としてその細胞質内に発現しようとすると、ほとんどが不溶性の封入体として発現されることが知られている。抗体は４本のポリペプチド鎖からなる基本構造を持ち、これらがジスルフィド結合等を介して高次構造を形成している。抗体分子が大腸菌等の宿主細胞内で機能を持った形態で発現しにくい原因は、このポリペプチド鎖の折り畳み反応だけでなく、ポリペプチド鎖同士のアセンブリーが起こりにくいことに起因している（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９，５４５−，１９９１年）。また、近年の研究によると、抗体重鎖部分の宿主菌への毒性も指摘されている。
【０００６】
このように、従来のタンパク質発現系には宿主に対する毒性、宿主プロテアーゼによる分解及び封入体形成等の大きな問題点を回避するとともに、抗体や酵素等のように高次構造が重要となる場合には、そのアセンブリーをうまく制御する必要があった。そのため、従来はタンパク質ごとに発現条件を試行錯誤で検討する必要があり、上記問題点を根本的に解決する技術の開発が望まれていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記現状に鑑み、従来の宿主生物系又は無細胞翻訳系での組み換えタンパク質発現方法では活性型タンパク質の発現が困難であったタンパク質について、効率的にタンパク質を発現させることができ、精製も容易なタンパク質の生産方法、この方法により生産された融合タンパク質及びタンパク質を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、シャペロニン遺伝子と目的タンパク質遺伝子とを含む遺伝子を転写・翻訳することによって、目的タンパク質をシャペロニンとペプチド結合を介して連結させた融合タンパク質として発現させる目的タンパク質の生産方法であって、前記融合タンパク質において、前記シャペロニンはＮ回連結体（Ｎは１〜２０）であり、前記シャペロニンのＮ末端及びＣ末端に同種又は異種の目的タンパク質が連結されているタンパク質の生産方法である。
以下に本発明を詳述する。
【０００９】
本発明のタンパク質の生産方法は、目的タンパク質をシャペロニンとの融合タンパク質として発現させる方法である。
細胞に熱ショック等のストレスを与えると、分子シャペロンと呼ばれるタンパク質群の発現が誘導される。これらはエネルギー物質であるＡＴＰの存在下又は非存在下でタンパク質の折り畳みを支援したり、構造安定化に貢献したりする。
分子シャペロンの中でも、分子量が約６０ｋＤａのものはシャペロニンといわれ、バクテリア、古細菌及び真核生物の全ての生物に存在し、タンパク質の折り畳み支援や変性防御の機能を有している。
【００１０】
シャペロニンは、図１に示したように、１４〜１８個のシャペロニンサブユニットからなる２層のリング構造（以下、構造体をシャペロニン複合体、リングをシャペロニンリングという）を形成する。大腸菌シャペロニンの場合、シャペロニン複合体は内径４．５ｎｍ、高さ１４．５ｎｍの空洞（キャビティ）を有する。１層シャペロニンリングのキャビティは６０ｋＤａの球状タンパク質１つが充分に納まる空間を有する。シャペロニン複合体は、このキャビティに様々なタンパク質の折り畳み中間体や変性タンパク質を一時的に納める機能を有し、タンパク質の折り畳み構造が形成されるとＡＴＰの分解と共役して納めていたタンパク質をキャビティから放出させる。バクテリア、古細菌由来のシャペロニンは、遺伝子工学的に大腸菌細胞質可溶性画分にシャペロニン複合体として容易に大量生産させることが可能である。このことは、様々のシャペロニンが大腸菌でも自己集合し、１４〜１８量体からなる２層リング構造のシャペロニン複合体を形成できることを示している。
【００１１】
上記シャペロニン複合体のＸ線結晶構造解析によって明らかにされた立体構造は、シャペロニンのＮ末端及びＣ末端はともにキャビティ側に位置し、フレキシビリティの高い構造となっている。特にＣ末端の少なくとも２０アミノ酸はフレキシビリティの高い構造を示す（Ｇｅｏｒｇｅら、２０００、Ｃｅｌｌ、１００、Ｐ．５６１−５７３）。
【００１２】
上記シャペロニンとしては特に限定されないが、バクテリア、古細菌又は真核生物に由来することが好ましい。上記シャペロニン複合体の構造は由来生物によって異なった構造のものが形成される。例えば、バクテリア由来シャペロニンリングのシャペロニンサブユニットの構成数は７個であり、古細菌由来のそれは８〜９個、真核生物由来のものは８個である。本発明では、使用するシャペロニンの由来により、融合タンパク質におけるシャペロニンと目的タンパク質の数の比を選択することが好ましい。
【００１３】
本発明のタンパク質の生産方法では、目的とするタンパク質をシャペロニンとペプチド結合を介して連結させた融合タンパク質として発現させ、目的タンパク質を確実にシャペロニンリングのキャビティ内部に納めることにより、目的タンパク質の宿主への毒性、プロテアーゼによる分解及び封入体の形成を解消し、可溶性タンパク質として大量発現させることができる。
また、強力なプロモーターによって発現が誘導されたときに見られるようにタンパク質の折り畳み中間体同士が多数会合することなく、個々にシャペロニンリングのキャビティ内に固定されるため、宿主生物を用いた発現及び無細胞翻訳系に見られる封入体形成も抑えられる。シャペロニンは宿主生物の細胞質あるいは体液等の可溶性画分へ発現するため、シャペロニンリングに格納されたタンパク質が膜結合性又は膜貫通性のタンパク質であっても膜へ移行し宿主生物の膜構造を破壊することもなく、宿主生物に対する毒性は発現しない。また、いかなるタンパク質も同一のシャペロニンリングに格納されているため、同一の精製条件で融合タンパク質として精製可能である。
【００１４】
上記融合タンパク質においては、シャペロニンのＮ末端及びＣ末端に同種又は異種の目的タンパク質が連結されている。
タンパク質の多くは２量体又はそれ以上の四次構造を形成することにより初めて機能を発現するものであるが、従来の組み換えタンパク質発現系ではこのようなタンパク質の高次構造を制御することは困難であった。本発明のタンパク質の生産方法においては、シャペロニンのＮ末端及びＣ末端に同種又は異種の目的タンパク質を連結することにより、目的タンパク質の各々のサブユニットはシャペロニンとの融合タンパク質として確実にシャペロニンリングのキャビティ内部に納められると同時に、個々のサブユニット同士が、キャビティ内部でアセンブリーされることにより、宿主生体内環境から保護され、プロテアーゼによる消化を受けにくくなり、可溶体として発現される。
なお、目的タンパク質が宿主に対する毒性が極めて高い、又は、宿主プロテアーゼによる消化を極めて受けやすい場合には、複数のシャペロニン連結間に配置されてもよい。
【００１５】
上記融合タンパク質は、例えば、シャペロニンサブユニットが１〜２０個、好ましくは１〜９個連結された複合体のＮ末端及びＣ末端の両末端に、目的タンパク質がシャペロニン複合体のキャビティ内に収められ封入された構造をとる。シャペロニン同士の連結間に目的タンパク質を配置することも可能である。
バクテリア由来のシャペロニンを用いる場合には、シャペロニン複合体の構造形成のしやすさからシャペロニン：目的タンパク質の数比が７：２である融合タンパク質が好ましく、サブユニット構成数８個の古細菌由来のシャペロニンを用いる場合には、シャペロニン複合体の構造形成のしやすさからシャペロニン：目的タンパク質の数比が２：１、２：２、４：２又は８：２のものが好ましい。
【００１６】
例えば、古細菌のシャペロニンを用い、そのサブユニットが８つ連結した複合体との融合体として目的タンパク質を発現させた場合、図２に示したように、８連複合体１分子でリング構造を形成し、そのキャビティ内部に目的タンパク質が格納される。シャペロニンのＮ末端及びＣ末端に結合した目的タンパク質同士がダイマーを形成する場合には、シャペロニンのキャビティ内でアセンブリーすることとなる。発現したシャペロニンリングは、更にリング面を介して非共有結合的に会合した２層構造を形成し、安定化する。古細菌のシャペロニンサブユニット４つが連結した複合体との融合体として目的タンパク質を発現させた場合、図２に示したように４連複合体２分子でリング構造を形成し、そのキャビティ内部に目的タンパク質が格納される。但し、目的タンパク質の形状や分子量によっては上記以外の数比も適する可能性はある。例えば、大腸菌由来シャペロニンと目的タンパク質の比率が３：１である融合タンパク質であってもこれらが２又は３分子会合してリング構造を形成する可能性もある。
【００１７】
シャペロニン：目的タンパク質の比は１：２〜２０：１まで可能であるが、このましくは１：２〜１２：２である。この範囲を越える発現した融合タンパク質中の目的タンパク質の実質的な生産量が少なくなるとともに、リング構造の形成も困難となる可能性がある。本発明では、シャペロニンがそのリング構造への自己集合能が維持されていれば、野生型のみならずアミノ酸変異体も使用可能である。例えば、シャペロニンの各サブユニットの会合力が弱められた変異体である場合、格納された目的蛋白の回収はより容易となる。
【００１８】
シャペロニン複合体は単に、外部環境から仕切られたスペースを提供するだけでなく、タンパク質折り畳み機能を有するため、目的タンパク質の折り畳みも正常に行われ、かつ構造が安定することも期待できる。通常シャペロニン複合体のタンパク質折り畳み反応は基質タンパク質（シングルポリペプチドとして）と１：１で起こるため、本発明においてシャペロニンによる折り畳み機能を発現させるには、シャペロニンリング又はシャペロニン複合体に１個の目的タンパク質が格納されるよう融合タンパク質を設計することが好ましいが、目的タンパク質の分子量によっては２分子以上格納させても正常に折り畳まれる可能性はある。
【００１９】
Ｍｇ−ＡＴＰの存在化では、シャペロニンは高濃度（１ｍｇ／ｍＬ以上）の濃度でリング面又は側面を介して非共有結合的に会合し，繊維状構造を形成する場合がある（Ｔｒｅｎｔ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４，５３８３−５３８８：Ｆｕｒｕｔａｎｉ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２８３９９−２８４０７）。本発明では、上記融合タンパク質が生体内において高濃度で発現するため、繊維状構造が形成される可能性が有り、このことにより、目的タンパク質が宿主生物に毒性があってもシャペロニンリング内への格納が促進され、目的タンパク質の高度発現が達成される可能性がある。繊維状構造が形成されても希釈することによってシャペロニン二層リング構造に解離するので、目的タンパク質は回収可能である。
【００２０】
本発明のタンパク質の生産方法としては特に限定されないが、例えば、目的タンパク質遺伝子を制限酵素を用いる方法又はＰＣＲ法等の通常の遺伝子工学的方法により作製し、これとシャペロニン遺伝子とを組み合わせて設計した発現ベクターを宿主内で発現させる方法が好ましい。即ち、遺伝子工学的に調製した目的タンパク質に対応するｃＤＮＡ又は６残基以上のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの部分遺伝子を目的タンパク質をコードする遺伝子とし、これを別に調製したシャペロニン遺伝子と組み合わせて融合タンパク質をコードする遺伝子を調製する。そして、シャペロニンと目的タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子と、シャペロニン又はシャペロニン連結体のみをコードする遺伝子とをポリシストロニックに連結したプラスミドを作製し、これを宿主に導入して、宿主内で共発現させる。
【００２１】
ただし、一般的に大腸菌等では発現プラスミドは１０ｋｂ以上になるとコピー数が減少し、結果的に目的タンパク質の発現量が低下することがある。例えば、シャペロニンが８つ連結した融合タンパク質を生産する場合、発現プラスミドは１５ｋｂｐ以上になる。
これに対しては、シャペロニンと目的タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子と、シャペロニン又はシャペロニン連結体のみをコードする遺伝子とを同一の宿主内で共存・複製可能な２種の異なるプラスミドにそれぞれ導入し、同一の宿主内で共発現させる方法が好ましい。この方法により、高発現をもたらすことが可能である。
例えばシャペロニンと目的タンパク質の数比が４：２である融合タンパク質を生産する場合において、１個又は２〜４個連結したシャペロニンのみを含むベクターを組み込んで共発現させることにより、シャペロニンと目的タンパク質の数比が８：２のシャペロニンリングを形成することが可能である。
【００２２】
上記宿主としては特に限定されず、例えば大腸菌等のバクテリア、その他の原核細胞、酵母、昆虫細胞、哺乳動物培養細胞、植物培養細胞及びトランスジェニック動・植物等が挙げられる。なかでも、培養コストが安価である点、培養日数が短い点、培養操作が簡便な点から、大腸菌等のバクテリア又は酵母が好ましい。またバクテリア、真核生物抽出液等を用いた無細胞翻訳系（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ１１，２６５６−２６６４：Ｆａｌｃｏｎｅ，Ｄ．ｅｔ　ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１，２６５６−２６６４）にて、上記融合タンパク質を可溶性タンパク質として発現させることも可能である。
【００２３】
本発明のタンパク質の生産方法により生産される上記融合タンパク質は、分子量が約６５〜６００ｋＤａと巨大分子であるため、転写されたｍＲＮＡの特定のリボヌクレアーゼによる分解、翻訳された融合タンパク質のプロテアーゼによる２段階の切断を受ける可能性がある。これに対しては、例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｍＲＮＡの分解に関与するリボヌクレアーゼであるＲＮａｓｅＥ遺伝子を欠損させた宿主を用いることでｍＲＮＡの分解は抑制可能である（Ｇｒｕｎｂｅｒｇ−Ｍａｎａｇｏ，Ｍ．，１９９９，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．，３３，１９３−２２７）。また、翻訳後にプロテーゼによる分解を抑制するためには、１５〜２５℃の低温で発現させたり、ｌｏｎ、ｏｍｐＴ　（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ　ｅｔ　ａｌ．１９８４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９，２８３−２８７）、Ｃｌｐ、ＨｓｌＶＵ（Ｋａｎｅｍｏｒｉ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，７２１９）のようなプロテアーゼの構造遺伝子を欠損させた大腸菌を宿主として用いることが好ましい。
【００２４】
本発明のタンパク質の生産方法では、例えば、上述の方法により宿主内で融合タンパク質を発現させた後、細胞を回収し破砕し、上清を回収する。シャペロニン複合体は分子量が約８４０〜９６０ＫＤａの巨大タンパク質であるため、４０％飽和程度の硫酸アンモニウムを用いた塩析によって沈殿させることができる。沈殿タンパク質を回収した後、適当な緩衝液に溶解し、疎水クロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィーによって融合タンパク質の存在するフラクションを回収する。これらを限外ろ過によって濃縮した後、濃縮液を５〜５０ｍＭ程度の塩化マグネシウム及び５０〜３００ｍＭ程度の塩化ナトリウム又は塩化カリウムが含有された緩衝液を展開液としてゲルろ過を行い、排除限界直後のピークを回収することによって融合タンパク質の発現を確認し、精製することができる。
【００２５】
あらかじめ、融合タンパク質のＮ末端又はＣ末端に６〜１０個のヒスチジンが並んだタッグを連結させた場合には、ニッケル等の金属キレートカラムを用いれば、融合タンパク質の回収はより簡便で効率的である。また、用いるシャペロニンに対する抗体を用いて、免疫沈降又はアフィニティクロマトグラフィーによっても迅速・簡便に精製することも可能である。しかしながら、リング構造を形成した融合タンパク質のみを回収するためには、これらにイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過を組み合わせることが好ましい。シャペロニンが耐熱性のものである場合、大腸菌の抽出液を６０〜８０℃で熱処理することによって大部分の大腸菌由来タンパク質は沈殿してしまい、融合タンパク質の精製をより簡略化させることができる。目的タンパク質自身が耐熱性のものでなくとも、シャペロニンの空洞内部に保持されているので、変性することはない。
上記いずれの方法によっても融合タンパク質の形態は透過型電子顕微鏡によって観察可能である。目的タンパク質がシャペロニンリングに格納されている場合、外径１４〜１６ｎｍ程度のシャペロニン特有のリング構造が観察される。融合タンパク質のリング構造が不安定な場合は、精製の過程でマグネシウム及びＡＴＰを存在させておくことで、リング構造である融合タンパク質を効率的に回収することが可能である。
なお、目的タンパク質の回収のみが目的である場合は、融合タンパク質は必ずしも均一に精製する必要はなく、粗精製サンプルにＥＤＴＡ処理を施した後、プロテアーゼを作用させ、目的タンパク質に応じた精製操作を施せば良い。
【００２６】
生成した融合タンパク質から目的タンパク質を回収する方法としては特に限定されず従来公知の方法を用いることができる。
多くのシャペロニンのサブユニット間の会合は、マグネシウムイオン及びＡＴＰによって安定化されている。従って得られた融合タンパク質から目的タンパク質のみを分離する場合には、上記のようにして回収した画分をエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で処理した後、マグネシウム及びＡＴＰが入っていない緩衝液に対して透析を行いマグネシウム及びＡＴＰを取り除く。これによってシャペロニンサブユニット間の相互作用は解除され立体構造は壊れ、目的タンパク質が露出する。また、あらかじめシャペロニンサブユニット同士の連結部にトロンビン、エンテロカイネース、活性型血液凝固第１０因子等の限定分解型プロテアーゼの切断配列を有するように融合タンパク質を設計した場合には、該限定分解型プロテアーゼにより融合タンパク質のシャペロニンリング構造を容易に分解することができ好ましい。
【００２７】
また、あらかじめ、シャペロニンと目的タンパク質の連結部にトロンビン、エンテロカイネース、活性型血液凝固第１０因子等の限定分解型プロテアーゼの切断配列を有するように融合タンパク質を設計した場合には、目的タンパク質を該限定分解型プロテアーゼにより容易に融合タンパク質から切り出すことができ好ましい。この場合、透析内液に限定分解型プロテアーゼを作用させ、目的タンパク質とシャペロニンの切断を行う。この反応液をイオン交換クロマトグラフィーや疎水クロマトグラフィー又は抗体を用いるアフィニィティクロマトグラフィーに供することによって容易に高純度の目的タンパク質を回収することが可能である。
また、シャペロニンと目的タンパク質の連結部にメチオニン残基を有する場合には、目的タンパク質をＣＮＢｒにより融合タンパク質から切り出すことができる。
なお、本発明の融合タンパク質を目的に応じてそのまま用いる場合は、プロテアーゼ等の切断配列を介在させる必要はない。
【００２８】
目的タンパク質が膜結合性又は膜貫通性タンパク質である場合には、目的タンパク質とシャペロニンの切断によって不溶化することもあるが、不溶化物のみを遠心分離によって回収した後、疎水性アルキル鎖がオクチル（Ｃ８）からドデシル（Ｃ１２）程度の長さである非イオン性界面活性剤等を用いると、ミセルの直径がほぼ生体膜の厚さに相応し、可溶化しやすい。このような非イオン性界面活性剤としては、例えば、β−オクチルグルコシド、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、Ｔｗｅｅｎ２０等が挙げられる。
【００２９】
本発明のタンパク質の生産方法の対象となる目的タンパク質としては特に限定されないが、本発明は特に目的タンパク質が２量体又はそれ以上の四次構造を形成して機能を発揮するタンパク質である場合に有効である。このようなタンパク質としては、例えば、哺乳動物由来の抗体の重鎖、軽鎖等が挙げられる。
抗体は重鎖と軽鎖が正しいアセンブリーが起こらないと機能を発揮しない。本発明のタンパク質の生産方法では、シャペロニン内部で重鎖と軽鎖とを正しくアセンブリーさせることで、凝集体を形成することなく発現させることができる。
これ以外のタンパク質としては、例えば、抗体の部分断片やこれまで発現が困難であったＢ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、ＨＩＶ、インフルエンザ等の病原性ウィルスゲノムにコードされるタンパク質（外被タンパク質、コアタンパク質、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼ等）、７回膜貫通型受容体（Ｇタンパク質共役型受容体）、血小板増殖因子、血液幹細胞成長因子、肝細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子、神経成長・栄養因子、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子等の成長因子に属するもの、腫瘍壊死因子、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージ・コロニー刺激因子、アルブミン、ヒト成長ホルモン等に属するものが挙げられる。その他、ヒト、マウス等高等動物由来の疾病関連遺伝子産物の全てが、本発明の発現系の対象タンパク質となり得る。また、化学プロセス食品加工、その他の産業分野に有効な酵素、タンパク質も本発明の対象である。
【００３０】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００３１】
（実施例１）
（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ＫＳ−１株シャペロニンβサブユニット連結体の発現）
配列１に示されたシャペロニンβサブユニット（ＴＣＰβ）遺伝子をＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ＫＳ−１株ゲノムを鋳型とするＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によってクローニングした。ＴＣＰβ遺伝子が一方向に４又は８回連結した遺伝子断片が挿入されたＴ７プロモーターを有する発現ベクターｐＥＴＤ２（ＴＣＰβ）_ｎ（ｎは４又は８）を構築した（図３）。
各発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入しカルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む２ＸＹ．Ｔ．培地（バクトトリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ）で３０℃で２４時間培養し、シャペロニン連結体を発現させた。培養終了後、細胞を回収し超音波で破砕した。遠心分離で上清を回収後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、（ＴＣＰβ）_ｎ（ｎは４又は８）が可溶性画分に大量発現していることが確認できた。
【００３２】
（実施例２）
（ＴＣＰβ連結体の透過型電子顕微鏡による観察）
ｐＥＴＤ２（ＴＣＰβ）_ｎ（ｎは４又は８）をＳｐｅＩで切断後、セルフライゲーションさせることによってＴＣＰβ８量体のＣ末端に６残基のヒスチジンが付加された組み換えタンパク質を合成する発現ベクターｐＥＴＤＨ２（ＴＣＰβ）_４及びｐＥＴＤＨ２（ＴＣＰβ）_８を得た（図３）。得られたベクターを用いて
ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した後、実施例１と同様の条件でシャペロニン連結体を発現させ、大腸菌抽出液を得た。
得られた菌体抽出液を５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で７５℃で３０分間加熱処理を行い、大腸菌由来タンパク質の大部分を変性沈殿させた。遠心分離によって上清を回収し、ニッケルキレートセファロースカラムにアプライした。１ｍＭイミダゾールを含有する５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で充分に洗浄後、１００ｍＭイミダゾールを含有する同緩衝液でニッケルキレートセファロースに吸着した画分を溶出した。
溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果、ＴＣＰβ８量体が回収されていることがわかった。得られた画分を５ｍＭＭｇＣｌ２を含む２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した後、透析内液をＴＳＫｇｅｌ　ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラム（トーソー社製）によるアニオン交換クロマトグラフィーによって分離し、ＴＣＰβ８量体をそれぞれ均一に精製した。
精製標品それぞれを０．２％酢酸ウラニルによるネガティブ染色法によって透過型電子顕微鏡による形態観察を行った。結果を図４に示した。図４から、ＴＣＰβはサブユニット間を連結させても各分子が集合し、シャペロニン特有のリング構造を形成することがわかった。
【００３３】
（実施例３）
（ＴＣＰβ８量体とＨＢｓの融合タンパク質の発現）
配列２に示されるＢ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓ）遺伝子をＰＣＲ法によって、５’末端にＳｐｅＩサイトを３’末端にＨｐａＩサイトを設けた断片と、５’末端にＥｃｏＩを３’末端にＨｉｎｄＩＩＩサイトを設けた断片とをそれぞれ増幅し、順次ＳｐｅＩ及びＨｐａＩ処理、ＥｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ処理が施されたｐＥＴＤＨ２（ＴＣＰβ）_ｎ　（ｎは４又は８）に導入し、ＴＣＰβ４量体及びＴＣＰβ８量体のＮ末端及びＣ末端にＨＢｓ（Ｃ末端に６残基のヒスチジンが導入される）が融合した融合タンパク質を合成する発現ベクターｐＥＴＤＨ２（ＴＣＰβ）_ｎ・ＨＢｓ（ｎは４又は８）を構築した。
得られたｐＥＴＤＨ２（ＴＣＰβ）_８・ＨＢｓを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した後、実施例１と同様の条件で融合タンパク質を発現させた。大腸菌破砕物の可溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離後、クマシーブリラントブルー染色によって分析した結果、融合タンパク質に相当するサイズのバンドが検出された。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ブロッティングメンブランに転写した後、抗ＨＢｓ抗原ポリクローナル抗体を用いてウエスターンブロッティングを行った結果、ＴＣＰβ８量体のみを発現させた大腸菌抽出液では陰性であったが、融合タンパク質の場合のみ、そのサイズ相当（約５３０ＫＤａ）の陽性バンドが検出された。このことからＨＢｓ抗原がＴＣＰβ８量体との融合タンパク質として大腸菌可溶性画分に発現することがわかった。ＨＢｓ抗原単独での発現実験では、大腸菌の可溶性画分にも沈殿画分にも同様のウエスターンブロッティングで陰性であった。
【００３４】
（組み換えＨＢｓ抗原の精製）
実施例２と同様にニッケルキレートカラムによって融合タンパク質を回収し、透析によってイミダゾールを除いた後、５ｍＭＭｇＣｌ_２を含む展開液を用いるＴＳＫｇｅｌ　ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラムによるアニオン交換クロマトグラフィーによってＴＣＰβ８量体とＨＢｓとの融合タンパク質を精製した。また、抗ＨＢｓポリクローナル抗体を用いるウエスターンブロッティングによってＨＢｓが存在することを確認した。
得られた融合タンパク質を透過型電子顕微鏡によって観察した結果、シャペロニン特有のリング構造が観察された。このことから融合タンパク質がリング構造を形成するものと考えられた。
回収された画分を１ｍＭＥＤＴＡ−２Ｎａ（エチレンジアミン四酢酸・二ナトリウム）存在下でインキュベーションした後、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅａｓｅ（アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）を作用させ、４℃で一昼夜インキュベーションした。生成した不溶物を遠心分離によって回収後、１．０％β―オクチルグルコシドに溶解した。得られた可溶化物中のＨＢｓ抗原をＨＢｓ抗原測定用ＥＩＡキット「エンザイグノスト−ＨＢｓＡｇ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ」（ヘキスト・ベーリングダイアグノスティック社製）を用いて検出した。また、ウエスターンブロッティンッグによって分析した結果約２５ｋＤａのＨＢｓ抗原に相当する分子量のバンドが特異的に検出された。
以上のことから組み換えＨＢｓはシャペロニンから限定分解型プロテアーゼによって切り出しが可能であることがわかった。また、本実施例の発現法によって大腸菌培養液１Ｌ当たり約４０ｍｇのＨＢｓが可溶性画分に発現していると推定できた。
【００３５】
（実施例４）
（シャペロニンとＨＢｓの数比が４：２の融合タンパク質とシャペロニン２回連結体の共発現）
実施例１、２と同様の方法でＴＣＰβ遺伝子が一方向に２回連結した遺伝子断片が挿入されたＴ７プロモーターを有する発現ベクターｐＥＴＤ２（ＴＣＢβ）_２を構築した。この発現ベクターから、ＢｇｌＩＩ及びＮｏｔＩによる切断によってＴ７プロモーターを含む（ＴＣＰＮ）_２の発現ユニットを回収した。これをｐＡＣＹＣ１８４プラスミド（日本ジーン社製）にクローン化し、ｐＡＴＨ（ＴＣＰＮβ）_２（クロラムフェニコール耐性）を構築した。
得られたｐＥＴＤＨ２（ＴＣＰＮβ）_４とｐＡＴＨ（ＴＣＰＮβ）_２で、大腸菌をアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）及びクロラムフェニコール（１５μｇ／ｍＬ）含むＬＢ寒天培地にて形質転換し、生育してきた１０コロニーを２ＸＹＴ液体培地（バクトトリプトン１６ｇ、酵母エキス　１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ）に接種し、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）及びクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍＬ）の存在下３０℃で培養し一昼夜培養した。
得られた菌体からＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質発現の確認を行った結果、約３００ｋＤａの融合タンパク質と約１２０ｋＤａのシャペロニン２量体が発現していることが確認できた。また、抗ＨＢｓポリクローナル抗体を用いるウエスターンブロッティングによって３００ＫＤａ相当のバンドのみが検出された。大腸菌抽出液から、実施例２と同様の方法によりニッケルキレートカラムによって融合タンパク質が含まれるシャペロニン複合体を回収した。更に透析によってイミダゾールを除いた後、ＴＳＫｇｅｌ　ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラムによるアニオン交換クロマトグラフィーを行い、シャペロニン複合体を精製した。得られたシャペロニン複合体を透過型電子顕微鏡によって観察した結果、シャペロニン特有のリング構造を形成していた。以上のことから、シャペロニンとＨＢｓの数比が４：２の融合タンパク質とシャペロニン２回連結体は互いに集合することによってリング構造を形成し、ＨＢｓをキャビティ内部に格納することによってＨＢｓを大量発現させることがわかった。本実施例の発現法によって大腸菌培養液１Ｌ当たり約７０ｍｇのＨＢｓが可溶性画分に発現していると推定できた。
【００３６】
（実施例５）
（ＴＣＰβ８量体とＨＣＶコア抗原の融合タンパク質の発現）
配列３に示されるＣ型肝炎ウィルスコア抗原（ＨＣＶｃ）遺伝子をＰＣＲ法によって、５’末端にＳｐｅＩサイトを３’末端にＨｐａＩサイトを設けた断片と、５’末端にＥｃｏＩサイトを３’末端にＨｉｎｄＩＩＩサイトを設けた断片とをそれぞれ増幅し、順次ＳｐｅＩ及びＨｐａＩ処理、ＥｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ処理が施されたｐＥＴＤＨ２（ＴＣＰβ）_８に導入し、ＴＣＰβ８量体のＮ末端及びＣ末端にＨＣＶｃが融合した融合タンパク質を合成する発現ベクターｐＥＴＤＨ２（ＴＣＰβ）_８・ＨＣＶｃを構築した。
得られたベクターを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した後、実施例１と同様の条件で融合タンパク質を発現させた。大腸菌破砕物の可溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離後、クマシーブリラントブルー染色によって分析した結果、融合タンパク質に相当するサイズのバンドが検出された。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ブロッティングメンブランに転写した後、抗ＨＣＶコア抗原モノクロナル抗体を用いてウエスターンブロッティングを行った結果、ＴＣＰβ４量体のみを発現させた大腸菌抽出液では陰性であったが、融合タンパク質の場合のみ相当サイズ（約５２０ＫＤａ）の陽性バンドが検出された。このことからＨＣＶｃ抗原がＴＣＰβ８量体との融合タンパク質として大腸菌可溶性画分に発現することがわかった。ＨＣＶコア抗原単独での発現実験をコントロールとして行った結果、大腸菌の沈殿画分では同様のウエスターンブロッティングで陽性であったが、可溶性画分は陰性であった。このことからＨＣＶコア抗原は単独では全てが封入体として発現するが、シャペロニン８量体との融合タンパク質として可溶性画分に発現させることができることがわかった。
【００３７】
実施例３と同様の方法により、ニッケルキレートカラム及びＴＳＫｇｅｌ　ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラムによって融合タンパク質を精製した。得られた融合タンパク質を透過型電子顕微鏡によって観察した結果、シャペロニン特有のリング構造を形成していた。このことから融合タンパク質が２分子集合してリング構造を形成するものと考えられた。
回収された画分を１ｍＭＥＤＴＡ−Ｎａ存在下でインキュベーションした後、５０ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析を行った。透析内液にＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅａｓｅ（アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）を作用させ、４℃で一昼夜インキュベーションした。その後、反応液をＴＳＫｇｅｌ　ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラムによって分画した。各フラクションのタンパク質を９６穴マイクロタイタープレートにコートした後、牛血清アルブミンでブロッキングを施し、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液（１０　ｍＭＮａ−リン酸緩衝液ｐＨ７．５／０．８％塩化ナトリウム／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。次にＰＢＳ−Ｔ緩衝液で希釈したヒト陽性又は陰性血清を加え反応させた。ＰＢＳ−Ｔ緩衝液で洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ヒトＩｇＧ抗体を作用させた。反応終了後、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液で４回洗浄し、基質発色液（フェニルジアミン及び過酸化水素を含む）を加え反応させた。４Ｎ硫酸添加によって反応を止めた後、４９０ｎｍにおける吸収を測定した。検出されたＨＣＶｃ抗原陽性フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した結果、ほぼ均一な約２２ｋＤａのＨＣＶｃ抗原が精製されたことがわかった。以上のことから組み換えＨＣＶｃはシャペロニンから限定分解型プロテアーゼによって切り出しが可能であることがわかった。また、本実施例の発現法によって大腸菌培養液１Ｌ当たり約８０ｍｇのＨＣＶｃが可溶性画分に発現していると推定できた。
【００３８】
（実施例６）
（ＴＣＰβ８量体と抗リゾチームｓｃＦＶ抗体の融合タンパク質の発現）
配列４に示されるマウス由来抗ニワトリリゾチーム単鎖抗体（抗ＨＥＬ−ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　Ｆｖ抗体：ＨｓｃＦＶ）遺伝子をＰＣＲ法によって、５’末端にＳｐｅＩサイトを３’末端にＨｐａＩサイトを設けた断片と、５’末端にＥｃｏＩサイトを３’末端にＨｉｎｄＩＩＩサイトを設けた断片とをそれぞれ増幅し、順次ＳｐｅＩ及びＨｐａＩ処理、ＥｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ処理が施されたｐＥＴＤＨ２（ＴＣＰβ）_８に導入し、ＴＣＰβ８量体のＮ末端及びＣ末端にＨｓｃＦＶの融合タンパク質を合成する発現ベクターｐＥＴＤＨ２（ＴＣＰβ）_８・ＨｓｃＦＶを構築した。
得られたベクターを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した後、実施例１と同様の条件で融合タンパク質を発現させた。大腸菌破砕物の可溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離後、クマシーブリラントブルー染色によって分析した結果、融合タンパク質に相当するサイズのバンドが検出された。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ブロッティングメンブランに転写した後、抗６Ｈｉｓモノクロナル抗体（６残基のヒスチジン残基を認識する抗体）を用いてウエスターンブロッティングを行った結果、ＴＣＰβ８量体のみを発現させた大腸菌抽出液では陰性であったが、融合タンパク質の場合のみ相当サイズ（約５４０ＫＤａ）の陽性バンドが検出された。このことからＨｓｃＦＶがＴＣＰβ８量体との融合タンパク質として大腸菌可溶性画分に発現することがわかった。ＨｓｃＦＶ単独での発現実験をコントロールとして行った結果、大腸菌の沈殿画分では同様のウエスターンブロッティングで陽性であったが、可溶性画分は陰性であった。このことからＨｓｃＦＶは単独では全てが封入体として発現するが、シャペロニン８量体との融合タンパク質として可溶性画分に発現させることができることがわかった。また、本実施例の発現法によって大腸菌培養液１Ｌ当たり約７５ｍｇのＨｓｃＦＶが可溶性画分に発現していると推定できた。
【００３９】
（実施例７）
（ＴＣＰβ８量体とヒト抗体重鎖定常領域の融合タンパク質の発現）
配列５に示されるヒト由来抗体重鎖定常領域（ＡｂＨＣ）遺伝子をＰＣＲ法によって、５’末端にＳｐｅＩサイトを３’末端にＨｐａＩサイトを設けた断片と、５’末端にＥｃｏＩサイトを３’末端にＨｉｎｄＩＩＩサイトを設けた断片とをそれぞれ増幅し、順次ＳｐｅＩ及びＨｐａＩ処理、ＥｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ処理が施されたｐＥＴＤＨ２（ＴＣＰβ）_８に導入し、ＴＣＰβ８量体のＮ末端及びＣ末端にＡｂＨＣが融合した融合タンパク質を合成する発現ベクターｐＥＴＤＨ２（ＴＣＰβ）_８・ＡｂＨＣを構築した。
得られたベクターを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した後、実施例１と同様の条件で融合タンパク質を発現させた。大腸菌破砕物の可溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離後、クマシーブリラントブルー染色によって分析した結果、融合タンパク質に相当するサイズのバンドが検出された。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ブロッティングメンブランに転写した後、抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（抗体Ｆｃ領域を認識する抗体）を用いてウエスターンブロッティングを行った結果、ＴＣＰβ８量体のみを発現させた大腸菌抽出液では陰性であったが、融合タンパク質の場合のみ相当サイズ（約５２０ＫＤａ）の陽性バンドが検出された。このことからＡｂＨＣがＴＣＰβ８量体との融合タンパク質として大腸菌可溶性画分に発現することがわかった。ＡｂＨＣ単独での発現実験をコントロールとして行った結果、大腸菌の可溶性画分及び沈殿画分で、同様のウエスターンブロッティングで陰性であった。このことからはＡｂＨＣ単独では大腸菌ではほとんど発現しないが、シャペロニン８量体との融合タンパク質として可溶性画分に発現させることができることがわかった。抗体重鎖定常領域は、２分子がアセンブリーして安定性が保たれることから、シャペロニン８両体のＮ末端及びＣ末端に発現した重鎖定常領域は、シャペロニンリング内でアセンブリーしていることが示唆された。また、本実施例の発現法によって大腸菌培養液１Ｌ当たり約７５ｍｇのＡｂＨＣが可溶性画分に発現していると推定できた。
【００４０】
（実施例８）
（大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬ連結体の発現）
配列６に示された大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬ遺伝子を大腸菌Ｋ１２株ゲノムを鋳型とするＰＣＲ法によってクローニングした。ＧｒｏＥＬ遺伝子が一方向に７回連結した遺伝子断片が挿入されたｔｒｃプロモーターを有する発現ベクターｐＴｒ（ＧｒｏＥ）_７を構築した（図５）。各発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入しカルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む２ＸＹ．Ｔ．培地（バクトトリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ）で２５℃で２４時間培養し、シャペロニン連結体を発現させた。培養終了後、細胞を回収し超音波で破砕した。遠心分離で上清を回収後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した結果、（ＧｒｏＥ）_７が可溶性画分に大量発現していることが確認できた。組み換え（ＧｒｏＥ）_７を発現させた大腸菌抽出液からＤＥＡＥ−セファロース及、ＴＳＫｇｅｌ　ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷ及びゲルろ過によって精製した。得られた精製標品を透過型電子顕微鏡によって観察した結果、シャペロニン特有のリング構造が観察された。このことから、大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬは全てのサブユニットを連結しても７回回転対称構造は維持されることがわかった。
【００４１】
（実施例９）
（大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬ７回連結体とヒトインターフェロンの融合タンパク質の発現）
配列７に示されたヒトインターフェロンα２ｂ（ＩＮＦ）遺伝子をＰＣＲ法によって、５’末端にＮｈｅＩサイトを３’末端にＸｈｏＩサイトを設けた断片と、５’末端にＮａｅＩサイトを３’末端にＳｍａＩサイトを設けた断片とをそれぞれ増幅し、順次ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ処理、ＮａｅＩ及びＳｍａＩ処理が施されたｐＴｒ２（ＧｒｏＥ）_７に導入し、ＧｒｏＥＬ７回連結体のＮ末端及びＣ末端にＩＮＦが融合した融合タンパク質を合成する発現ベクターｐＴｒ２（ＧｒｏＥ）_７・ＩＮＦを構築した。
得られた発現ベクターを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した後、実施例８と同様の条件で融合タンパク質の発現を行った。コントロールとしてｐＴｒ２（ＧｒｏＥ）_７を用いた発現及びＩＮＦ単独の発現も行った。
各大腸菌抽出液の上清と沈澱画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、ブロッティングメンブランに転写し、抗ＩＮＦポリクローナル抗体を用いてウエスターンブロッティングを行った。その結果、ｐＴｒ２（ＧｒｏＥ）_７・ＩＮＦ保持の大腸菌抽出液サンプルのみが可溶性画分に融合タンパク質の分子量相当（約３００ＫＤａ）の位置に強くバンドが検出された。ＩＮＦ単独での発現では大部分が不溶性画分に生産されていることがわかった。以上のことから、ＩＮＦは大腸菌ＧｒｏＥＬ７回連結体との融合蛋白として発現させることで、可溶性蛋白として発現することがわかった。
ｐＴｒ２（ＧｒｏＥ）_７・ＩＮＦ保持の大腸菌抽出液から塩析、ＤＥＡＥ−セファロース及びＴＳＫｇｅｌ　ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラムによるアニオン交換クロマトグラフィー及びＳｕｐｅｒｏｓｅ６（アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）によるゲルろ過によって融合タンパク質を精製した。精製標品を透過型電子顕微鏡によって観察した結果、シャペロニン特有のリング構造が観察された。以上のことから、ＩＮＦはＧｒｏＥＬのキャビティ内部に２分子ごとに格納されることによって可溶性画分に発現したと考えられる。
【００４２】
（実施例１０）
（無細胞翻訳系による（ＴＣＰβ）_８とＨＢｓの融合タンパク質の合成）
無細胞翻訳系発現ベクターｐＩＶＥＸ２．３（ロシュダイアグノスティックス社）にＴＣＰβ８回連結体のＮ末端及びＣ末端にＨＢｓ２分子が結合した融合タンパク質をコードする遺伝子を導入しｐＩＶ２（ＴＣＰβ）_８・ＨＢｓを構築した。この発現ベクターを用いてＲａｐｉｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ＳｙｓｙｔｅｍＲＴＳ　５００（ロシュダイアグノスティックス社製）を用いてタンパク質合成を行った。反応方法は本無細胞翻訳システムのＩｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｖｅｒｓｉｏｎ　１，Ｊｕｎｅ２０００）に従った。
反応終了後、反応液からニッケルキレートクロマトグラフィー及び、Ｔｓｋ　ｇｅｌ　ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラムによって融合タンパク質を精製した。
精製された融合タンパク質を透過型電子顕微鏡で観察した結果、シャペロニン特有のリング構造が見られた。精製された融合タンパク質より実施例３と同様の方法によりＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅａｓｅで切り出した後、遠心分離によって不溶性ＨＢｓをβ―オクチルグルコシドによって可溶化させた。本サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、抗ＨＢｓポリクローナル抗体によるウエスターンブロッティングすると分子量相当の約２５ＫＤａのバンドが検出された。ＨＢｓ単独で発現させた場合は、同様に不溶性画分にＨＢｓは蓄積したが、β―オクチルグルコシドによる可溶化は困難であった。以上のように、融合タンパク質は無細胞翻訳系において発現することができた。
【００４３】
【発明の効果】
本発明によれば、従来の宿主生物系又は無細胞翻訳系での組み換えタンパク質発現方法では活性型タンパク質の発現が困難であったタンパク質について、効率的にタンパク質を発現させることができ、精製も容易なタンパク質の生産方法、この方法により生産された融合タンパク質及びタンパク質を提供できる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】大腸菌シャペロニン（ＧｒｏＥＬ）複合体の立体構造を模式的に表す図である。
【図２】サブユニット構成数４又は８個の古細菌由来のシャペロニンと目的タンパク質からなる融合タンパク質の設計例を示す図である。
【図３】サブユニット構成数４又は８個の古細菌由来のシャペロニンと目的タンパク質を発現させるベクターの構成例を示す図である。
【図４】サブユニット構成数８個の古細菌由来のシャペロニンの透過型電子顕微鏡による形態観察結果を示す図である。
【図５】サブユニット構成数７個の大腸菌由来のシャペロニンと目的タンパク質を発現させるベクターの構成例を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a protein which can express a protein efficiently and which can be easily purified, for a protein which was difficult to express an active protein by a conventional method for expressing a recombinant protein in a host biological system or a cell-free translation system. And a fusion protein and a protein produced by the method.
[0002]
[Prior art]
Up to now, recombinant protein expression systems and cell-free translation systems in many host organisms such as bacteria, yeast, insects, animal and plant cells, transgenic animals and plants, and the like have been established. In particular, a method for producing a recombinant protein using cultured mammalian cells is becoming a standard system for producing a therapeutic drug because of appropriate post-translational modification.
[0003]
However, the recombinant protein production method using cultured mammalian cells has a lower protein expression level than a system using microorganisms and requires a larger culture tank. It is believed that equipment is scarce (Garber, K., 2001, Nat. Biotech. 19, 184-185). In recent years, protein production technology using transgenic animals and plants whose production efficiency has been improved has not yet gained the full range of reliability (Garber, K., 2001, Nat. Biotech. 19, 184-185). ).
[0004]
On the other hand, in the recombinant protein expression systems developed so far, it is often difficult to obtain a large amount of active protein.
For example, when the target protein has any toxicity to the host organism, the expression is suppressed and the expression level is reduced.
In addition, even if the target protein is expressed as a soluble protein, it may be degraded by the host protease, resulting in extremely low production.
Furthermore, even if the target protein is expressed, the protein may not be properly folded and may form an inclusion body that is difficult to solubilize. In this case, even if the protein is solubilized and refolded, the amount of the active protein finally obtained becomes extremely small. In particular, in the case of a cell-free translation system, the produced polypeptides are aggregated with each other and are easily insoluble. For the production of such inclusion bodies, glutathione-S-transferase (GST) (Smith, DB, et al., 1988, Gene 67, 31-40) and thioredoxin (LaVallie, ER et al.) , 1993, Bio / Technology 11, 187-193), a method of expressing as a fusion protein with maltose binding protein (Guan, C., et al., Gene 67, 21-30), and the like. It has been difficult to eliminate body formation with high efficiency.
[0005]
An example of such a protein in which an active protein is difficult to obtain in a conventional recombinant protein expression system is an antibody.
Antibodies are expected to be used in the medical and diagnostic fields in recent years, but when they are expressed in the cytoplasm of Escherichia coli or the like to obtain recombinants, most of them are expressed as insoluble inclusion bodies. Is known to be. An antibody has a basic structure consisting of four polypeptide chains, which form a higher-order structure via a disulfide bond or the like. The reason that antibody molecules are difficult to express in a functional form in host cells such as Escherichia coli is not only due to the folding reaction of the polypeptide chains, but also due to the difficulty of assembly between the polypeptide chains (Pluckthun). , Biotechnology, 9, 545, 1991). In addition, recent studies have indicated the toxicity of the antibody heavy chain to host bacteria.
[0006]
Thus, conventional protein expression systems avoid major problems such as toxicity to the host, degradation by host protease and formation of inclusion bodies, and when a higher-order structure such as an antibody or an enzyme is important, , The assembly needed to be well controlled. For this reason, conventionally, it has been necessary to examine the expression conditions for each protein by trial and error, and there has been a demand for the development of a technique that fundamentally solves the above problems.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made in view of the above-mentioned circumstances, and it is possible to efficiently express a protein, which is difficult to express an active protein by a conventional method for expressing a recombinant protein in a host biological system or a cell-free translation system, An object of the present invention is to provide a method for producing a protein that can be easily purified, and a fusion protein and a protein produced by this method.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present invention provides a method for producing a target protein, wherein the target protein is expressed as a fusion protein in which the target protein is linked to a chaperonin through a peptide bond by transcribing and translating a gene containing the chaperonin gene and the target protein gene. In the fusion protein, the chaperonin is an N-fold conjugate (N is 1 to 20), and a method for producing a protein in which a homologous or heterologous target protein is linked to the N-terminal and C-terminal of the chaperonin.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0009]
The protein production method of the present invention is a method of expressing a target protein as a fusion protein with chaperonin.
When stress such as heat shock is applied to cells, expression of a group of proteins called molecular chaperones is induced. These assist in protein folding in the presence or absence of ATP, which is an energy substance, and contribute to structural stabilization.
Among molecular chaperones, those having a molecular weight of about 60 kDa are called chaperonins, and are present in all bacteria, archaea, and eukaryotes, and have functions of supporting protein folding and preventing degeneration.
[0010]
As shown in FIG. 1, chaperonin forms a two-layered ring structure composed of 14 to 18 chaperonin subunits (hereinafter, the structure is called a chaperonin complex, and the ring is called a chaperonin ring). In the case of Escherichia coli chaperonin, the chaperonin complex has an inner diameter of 4.5 nm and a height of 14.5 nm. The cavity of the single-layer chaperonin ring has a space enough to accommodate one globular protein of 60 kDa. The chaperonin complex has the function of temporarily storing intermediates of various protein folding and denatured proteins in this cavity. When the protein folding structure is formed, the protein stored in conjugate with ATP degradation is stored in the cavity. Release from Bacterial and archaeal chaperonins can be easily mass-produced as chaperonin complexes in E. coli cytoplasmic soluble fractions by genetic engineering. This indicates that various chaperonins can self-assemble even in Escherichia coli and form a chaperonin complex having a two-layer ring structure composed of 14 to 18 mer.
[0011]
The three-dimensional structure revealed by the X-ray crystal structure analysis of the chaperonin complex has a highly flexible structure in which both the N-terminal and the C-terminal of the chaperonin are located on the cavity side. In particular, at least 20 amino acids at the C-terminus show a highly flexible structure (George et al., 2000, Cell, 100, P.561-573).
[0012]
The chaperonin is not particularly limited, but is preferably derived from bacteria, archaea or eukaryotes. The structure of the chaperonin complex varies depending on the origin organism. For example, the number of chaperonin subunits of a bacterial chaperonin ring is 7, the archaeal one is 8 to 9, and the eukaryotic one is 8. In the present invention, it is preferable to select the ratio of the number of chaperonin and the number of target proteins in the fusion protein according to the origin of the chaperonin used.
[0013]
In the method for producing a protein of the present invention, the target protein is expressed as a fusion protein linked to a chaperonin via a peptide bond, and the target protein is reliably placed inside the cavity of the chaperonin ring. Can be dissolved in a large amount as a soluble protein.
In addition, as seen when the expression is induced by a strong promoter, many folding intermediates of the protein do not associate with each other, but are individually fixed in the cavities of the chaperonin ring. Inclusion body formation seen in cell-free translation systems is also suppressed. Because chaperonin is expressed in the soluble fraction of the host organism's cytoplasm or body fluid, even if the protein stored in the chaperonin ring is a membrane-bound or transmembrane protein, it is transferred to the membrane and disrupts the host organism's membrane structure. And no toxicity to the host organism. Also, since any protein is stored in the same chaperonin ring, it can be purified as a fusion protein under the same purification conditions.
[0014]
In the fusion protein, the same or different target protein is linked to the N-terminal and C-terminal of the chaperonin.
Many proteins express their functions only by forming a dimeric or higher quaternary structure, but it is difficult to control the higher-order structure of such proteins using a conventional recombinant protein expression system. Met. In the method for producing a protein of the present invention, the same or different target protein is linked to the N-terminal and C-terminal of the chaperonin, whereby each subunit of the target protein can be reliably used as a fusion protein with the chaperonin to ensure the presence of the chaperonin ring cavity. At the same time as being housed inside, the individual subunits are assembled inside the cavity, so that they are protected from the host in vivo environment, are less susceptible to protease digestion, and are expressed as a soluble form.
When the target protein has extremely high toxicity to the host or is extremely susceptible to digestion by the host protease, it may be arranged between a plurality of linked chaperonins.
[0015]
In the fusion protein, for example, the target protein is contained in the cavity of the chaperonin complex at both the N-terminal and the C-terminal of the complex in which 1 to 20, preferably 1 to 9 chaperonin subunits are linked. Take the enclosed structure. It is also possible to arrange the target protein between the linkages of chaperonins.
When a bacterial chaperonin is used, a fusion protein having a chaperonin: target protein number ratio of 7: 2 is preferable from the viewpoint of easy formation of a chaperonin complex structure. When chaperonin is used, it is preferable that the number ratio of chaperonin to the target protein is 2: 1, 2: 2, 4: 2 or 8: 2, because the structure of the chaperonin complex is easily formed.
[0016]
For example, when an archaeal chaperonin is used to express a target protein as a fusion with a complex in which eight subunits are linked, as shown in FIG. The target protein is stored inside the cavity. When the target proteins bound to the N-terminal and C-terminal of the chaperonin form a dimer, they are assembled in the chaperonin cavity. The expressed chaperonin ring further forms a non-covalently associated two-layer structure via the ring face and stabilizes. When the target protein is expressed as a fusion with a complex in which four archaeal chaperonin subunits are linked, a ring structure is formed by two molecules of a quadruple complex as shown in FIG. The protein is stored. However, depending on the shape and molecular weight of the target protein, a number ratio other than the above may be suitable. For example, even a fusion protein in which the ratio of Escherichia coli-derived chaperonin to the target protein is 3: 1 may be associated with two or three molecules to form a ring structure.
[0017]
The ratio of chaperonin: protein of interest can be from 1: 2 to 20: 1, but is preferably from 1: 2 to 12: 2. The actual production amount of the target protein in the expressed fusion protein exceeding this range may be reduced, and the formation of a ring structure may be difficult. In the present invention, not only wild-type but also amino acid variants can be used as long as the ability of chaperonin to self-assemble into its ring structure is maintained. For example, in the case of a mutant in which the association of each subunit of chaperonin is weakened, the stored target protein can be more easily recovered.
[0018]
Since the chaperonin complex not only provides a space separated from the external environment but also has a protein folding function, it can be expected that the target protein is normally folded and the structure is stable. Normally, the protein folding reaction of the chaperonin complex occurs 1: 1 with the substrate protein (as a single polypeptide). Therefore, in order to express the folding function by the chaperonin in the present invention, one target protein is added to the chaperonin ring or the chaperonin complex. It is preferable to design the fusion protein so that is stored, but depending on the molecular weight of the target protein, it may be possible to fold normally even if two or more molecules are stored.
[0019]
In the presence of Mg-ATP, chaperonin may associate non-covalently at a high concentration (1 mg / mL or more) via the ring surface or side surface to form a fibrous structure (Trent, J. et al. D., et al., 1997, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 94, 5383-5388: Furutani, M. et al., 1998, J. Biol.Chem.273, 28399-28407. ). In the present invention, since the fusion protein is expressed in a living body at a high concentration, a fibrous structure may be formed, and thus, even if the target protein is toxic to the host organism, it may be introduced into the chaperonin ring. Storage may be facilitated and high expression of the protein of interest may be achieved. Even if a fibrous structure is formed, the protein is dissociated into a chaperonin bilayer ring structure by dilution, so that the target protein can be recovered.
[0020]
The method for producing the protein of the present invention is not particularly limited. For example, the target protein gene was prepared by a method using a restriction enzyme or a conventional genetic engineering method such as a PCR method, and was designed by combining this with a chaperonin gene. A method of expressing an expression vector in a host is preferred. That is, a cDNA corresponding to a target protein prepared by genetic engineering or a partial gene of a cDNA encoding an amino acid sequence of 6 or more residues is used as a gene encoding a target protein, and this is combined with a separately prepared chaperonin gene to obtain a fusion protein. Is prepared. Then, a plasmid encoding a gene encoding a fusion protein of a chaperonin and a target protein and a gene encoding only a chaperonin or a conjugate of a chaperonin are prepared in a polycistronic plasmid, and this is introduced into a host. Co-express.
[0021]
However, in Escherichia coli and the like, when the expression plasmid becomes 10 kb or more, the copy number decreases, and as a result, the expression level of the target protein may decrease. For example, when producing a fusion protein in which eight chaperonins are linked, the expression plasmid becomes 15 kbp or more.
In contrast, a gene encoding a fusion protein of a chaperonin and a target protein and a gene encoding only a chaperonin or a chaperonin conjugate are respectively introduced into two different plasmids which can coexist and replicate in the same host. However, a method of co-expression in the same host is preferred. By this method, high expression can be obtained.
For example, when producing a fusion protein in which the number ratio of chaperonin to the target protein is 4: 2, the vector containing only one or 2 to 4 linked chaperonins is co-expressed and co-expressed. It is possible to form a chaperonin ring with a number ratio of 8: 2.
[0022]
The host is not particularly limited, and includes, for example, bacteria such as Escherichia coli, other prokaryotic cells, yeast, insect cells, cultured mammalian cells, cultured plant cells, transgenic animals and plants, and the like. Among them, bacteria such as Escherichia coli and yeast are preferable in terms of low culture cost, short culture days, and simple culture operation. Cell-free translation systems using bacteria, eukaryotic extracts and the like (Spirin, AS, 1991, Science 11, 265-2664: Falcone, D. et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11, 2656-2644), it is also possible to express the fusion protein as a soluble protein.
[0023]
Since the fusion protein produced by the protein production method of the present invention is a macromolecule having a molecular weight of about 65 to 600 kDa, the transcribed mRNA is degraded by a specific ribonuclease, and the translated fusion protein is subjected to two steps by protease. May be disconnected. In contrast, for example, when Escherichia coli is used as a host, mRNA degradation can be suppressed by using a host deficient in the RNaseE gene, a ribonuclease involved in mRNA degradation (Grunberg-Manago, M., 1999, Annu. Rev. Gen., 33, 193-227). In order to suppress the degradation by the prosthesis after translation, expression at a low temperature of 15 to 25 ° C., lon, ompT (Phillips et al. 1984, J. Bacteriol. 159, 283-287), Clp, HslVU ( It is preferable to use Escherichia coli deficient in a protease structural gene such as Kanemori, M. et al., 1997, J. Bacteriol., 179, 7219) as a host.
[0024]
In the protein production method of the present invention, for example, after expressing the fusion protein in the host by the above-described method, the cells are collected, crushed, and the supernatant is collected. Since the chaperonin complex is a giant protein having a molecular weight of about 840 to 960 KDa, it can be precipitated by salting out using ammonium sulfate of about 40% saturation. After recovering the precipitated protein, the precipitate is dissolved in an appropriate buffer, and the fraction containing the fusion protein is recovered by hydrophobic chromatography or ion exchange chromatography. After these were concentrated by ultrafiltration, the concentrated solution was subjected to gel filtration using a buffer solution containing about 5 to 50 mM magnesium chloride and about 50 to 300 mM sodium chloride or potassium chloride as a developing solution, and immediately after the exclusion limit. By collecting the peak, the expression of the fusion protein can be confirmed and purified.
[0025]
In the case where a tag having 6 to 10 histidines is linked to the N-terminus or C-terminus of the fusion protein in advance, if a metal chelate column such as nickel is used, recovery of the fusion protein is simpler and more efficient. is there. It is also possible to purify quickly and easily by immunoprecipitation or affinity chromatography using an antibody against chaperonin. However, in order to collect only the fusion protein having a ring structure, it is preferable to combine them with ion exchange chromatography and gel filtration. When the chaperonin is heat-resistant, most of the E. coli-derived proteins are precipitated by heat-treating the E. coli extract at 60 to 80 ° C., and the purification of the fusion protein can be further simplified. Even if the target protein itself is not heat-resistant, it is not denatured because it is retained inside the chaperonin cavity.
By any of the above methods, the form of the fusion protein can be observed with a transmission electron microscope. When the target protein is stored in the chaperonin ring, a ring structure unique to the chaperonin having an outer diameter of about 14 to 16 nm is observed. When the ring structure of the fusion protein is unstable, the fusion protein having the ring structure can be efficiently collected by allowing magnesium and ATP to be present during the purification process.
When the objective is to collect only the target protein, the fusion protein does not necessarily need to be purified uniformly. After subjecting the crudely purified sample to EDTA treatment, the protease is allowed to act, and a purification operation according to the target protein is performed. You only need to give it.
[0026]
The method for recovering the target protein from the generated fusion protein is not particularly limited, and a conventionally known method can be used.
The association between many chaperonin subunits is stabilized by magnesium ions and ATP. Therefore, when only the target protein is separated from the obtained fusion protein, the fraction collected as described above is treated with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), and then treated with a buffer containing no magnesium or ATP. Perform dialysis to remove magnesium and ATP. Thereby, the interaction between the chaperonin subunits is released, the three-dimensional structure is broken, and the target protein is exposed. Further, when a fusion protein is designed in advance to have a cleavage sequence for a limited-degradable protease such as thrombin, enterokinase, and activated blood coagulation factor 10 at the junction between chaperonin subunits, the limited-degradable type It is preferable because the protease can easily decompose the chaperonin ring structure of the fusion protein.
[0027]
When a fusion protein is designed in advance so as to have a cleavage sequence of a limited degradable protease such as thrombin, enterokinase, and activated blood coagulation factor 10 at the junction between the chaperonin and the target protein, the target protein is It is preferable because it can be easily cleaved from the fusion protein by the limited-degraded protease. In this case, the target protein and the chaperonin are cleaved by causing a limited-decomposition type protease to act on the inner dialysis solution. By subjecting this reaction solution to ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, or affinity chromatography using an antibody, a highly pure target protein can be easily recovered.
Further, when a methionine residue is present at the link between the chaperonin and the target protein, the target protein can be cut out from the fusion protein by CNBr.
When the fusion protein of the present invention is used as it is according to the purpose, it is not necessary to intervene a cleavage sequence such as a protease.
[0028]
When the target protein is a membrane-bound or transmembrane protein, it may be insolubilized by cleavage of the target protein and the chaperonin. However, after only the insolubilized product is recovered by centrifugation, the hydrophobic alkyl chain becomes octyl (C8 ) To dodecyl (C12), the use of a nonionic surfactant or the like allows the micelle diameter to substantially correspond to the thickness of the biological membrane and facilitates solubilization. Examples of such a nonionic surfactant include β-octyl glucoside, Triton X-100, Nonidet P-40, Tween 20, and the like.
[0029]
Although the target protein to be subjected to the method for producing the protein of the present invention is not particularly limited, the present invention is particularly applicable to the case where the target protein is a protein which forms a dimeric or higher quaternary structure and exerts its function. It is valid. Such proteins include, for example, heavy chains and light chains of mammal-derived antibodies.
Antibodies do not function without proper assembly of the heavy and light chains. In the method for producing a protein of the present invention, the heavy chain and the light chain are correctly assembled inside the chaperonin, whereby the protein can be expressed without forming an aggregate.
Other proteins include, for example, a partial fragment of an antibody and a protein encoded by a pathogenic virus genome such as hepatitis B virus, hepatitis C virus, HIV, and influenza which have been difficult to express (envelope protein). , Core protein, protease, reverse transcriptase, integrase, etc.), seven transmembrane receptors (G protein-coupled receptors), platelet growth factor, blood stem cell growth factor, hepatocyte growth factor, transforming growth factor, Belonging to growth factors such as nerve growth / nutritional factor, fibroblast growth factor, insulin-like growth factor, tumor necrosis factor, interferon, interleukin, erythropoietin, granulocyte colony stimulating factor, macrophage colony stimulating factor, albumin, human Those belonging to growth hormone and the like can be mentioned. In addition, all disease-related gene products derived from higher animals such as humans and mice can be target proteins of the expression system of the present invention. Enzymes and proteins that are effective in chemical process food processing and other industrial fields are also an object of the present invention.
[0030]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
[0031]
(Example 1)
(Expression of Thermococcus KS-1 strain chaperonin β subunit conjugate)
The chaperonin β subunit (TCPβ) gene shown in sequence 1 was cloned by PCR (Polymerase chain reaction) using Thermococcus KS-1 strain genome as a template. Expression vector pETD2 (TCPβ) having a T7 promoter into which a gene fragment in which a TCPβ gene is linked four or eight times in one direction is inserted _n (N is 4 or 8) (FIG. 3).
Each expression vector was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3) strain, and 2XY. T. The cells were cultured at 30 ° C. for 24 hours in a medium (16 g of bactotryptone, 10 g of yeast extract, and 5 g / L of NaCl) to express a chaperonin conjugate. After completion of the culture, the cells were collected and disrupted by ultrasonication. After collecting the supernatant by centrifugation, it was analyzed by SDS-PAGE. From the result of SDS-PAGE, (TCPβ) _n (N was 4 or 8) was confirmed to be expressed in large amounts in the soluble fraction.
[0032]
(Example 2)
(Observation of TCP β-linked product by transmission electron microscope)
pETD2 (TCPβ) _n (N is 4 or 8) after cutting with SpeI and self-ligating to synthesize a recombinant protein in which 6 residues of histidine are added to the C-terminus of TCPβ octamer pETDH2 (TCPβ) ₄ And pETDH2 (TCPβ) ₈ Was obtained (FIG. 3). Using the obtained vector
After transforming the BL21 (DE3) strain, a chaperonin conjugate was expressed under the same conditions as in Example 1 to obtain an E. coli extract.
The obtained bacterial cell extract was subjected to heat treatment at 75 ° C. for 30 minutes at a protein concentration of 5 mg / mL to denature and precipitate most of Escherichia coli-derived proteins. The supernatant was recovered by centrifugation and applied to a nickel chelating Sepharose column. After sufficiently washing with 50 mM Na-phosphate buffer (pH 7.0) containing 1 mM imidazole, the fraction adsorbed on nickel chelate sepharose was eluted with the same buffer containing 100 mM imidazole.
As a result of confirming the eluted fraction by SDS-PAGE, it was found that the TCP β-mer was recovered. The obtained fraction was dialyzed against 25 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 5 mM MgCl2, and the inner solution of the dialyzed solution was separated by anion exchange chromatography using a TSKgel SuperQ-5PW column (manufactured by Tosoh Corporation), and TCPβ8 Each of the monomers was uniformly purified.
Each of the purified samples was observed for morphology by a transmission electron microscope by a negative staining method using 0.2% uranyl acetate. The results are shown in FIG. From FIG. 4, it was found that each molecule of TCPβ aggregated even when the subunits were linked, forming a ring structure unique to chaperonin.
[0033]
(Example 3)
(Expression of fusion protein of TCP β8 mer and HBs)
Hepatitis B virus surface antigen (HBs) gene shown in sequence 2 was fragmented by PCR with a SpeI site at the 5 ′ end and an HpaI site at the 3 ′ end, and EcoI at the 5 ′ end and HindIII at the 3 ′ end. PETDH2 (TCPβ) which has been subjected to SpeI and HpaI treatment, EcoI and HindIII treatment, respectively, _n (N is 4 or 8) to synthesize a fusion protein in which HBs (6 residues of histidine is introduced at the C-terminus) are fused to the N-terminus and the C-terminus of the TCP β-mer and the TCP β-mer. pETDH2 (TCPβ) _n -HBs (n is 4 or 8) was constructed.
Obtained pETDH2 (TCPβ) ₈ -After transforming BL21 (DE3) strain using HBs, the fusion protein was expressed under the same conditions as in Example 1. After separating the soluble fraction of Escherichia coli by SDS-PAGE and analyzing by Coomassie Brilliant Blue staining, a band having a size corresponding to the fusion protein was detected. After SDS-PAGE and transfer to a blotting membrane, Western blotting was performed using an anti-HBs antigen polyclonal antibody. As a result, an E. coli extract expressing only TCPβ 8 mer was negative, but the fusion protein was negative. Only in the case of, a positive band corresponding to the size (about 530 KDa) was detected. This indicates that the HBs antigen is expressed in the soluble fraction of E. coli as a fusion protein with the TCP β-mer. In the expression experiment using the HBs antigen alone, the soluble and precipitated fractions of E. coli were negative by the same Western blotting.
[0034]
(Purification of recombinant HBs antigen)
The fusion protein was recovered by a nickel chelate column in the same manner as in Example 2, and the imidazole was removed by dialysis. ₂ A fusion protein of TCPβ 8mer and HBs was purified by anion exchange chromatography using a TSKgel SuperQ-5PW column using a developing solution containing. The presence of HBs was confirmed by Western blotting using an anti-HBs polyclonal antibody.
As a result of observing the obtained fusion protein with a transmission electron microscope, a ring structure unique to chaperonin was observed. This suggests that the fusion protein forms a ring structure.
The collected fraction was incubated in the presence of 1 mM EDTA-2Na (ethylenediaminetetraacetic acid / disodium), and then incubated with PreScission protease (Amersham Pharmacia Biotech) at 4 ° C. overnight. The resulting insolubles were collected by centrifugation and then dissolved in 1.0% β-octylglucoside. The HBs antigen in the obtained lysate was detected using an EIA kit for measurement of HBs antigen "Enzygnost-HBsAg monoclonal" (manufactured by Hoechst Behring Diagnostics). Further, as a result of analysis by Western blotting, a band having a molecular weight of about 25 kDa corresponding to the HBs antigen was specifically detected.
From the above, it was found that recombinant HBs can be excised from chaperonin by a limited-degradation protease. Further, it was estimated that about 40 mg of HBs was expressed in the soluble fraction per liter of the E. coli culture by the expression method of this example.
[0035]
(Example 4)
(Co-expression of a fusion protein with a chaperonin / HBs ratio of 4: 2 and a chaperonin double conjugate)
Expression vector pETD2 (TCBβ) having a T7 promoter into which a gene fragment in which the TCPβ gene is ligated twice in one direction is inserted in the same manner as in Examples 1 and 2. ₂ Was built. From this expression vector, contains the T7 promoter by cleavage with BglII and NotI (TCPN) ₂ Was recovered. This was cloned into pACYC184 plasmid (manufactured by Nippon Gene), and pATH (TCPNβ) ₂ (Chloramphenicol resistance) was constructed.
Obtained pETDH2 (TCPNβ) ₄ And pATH (TCPNβ) ₂ E. coli was transformed on an LB agar medium containing ampicillin (100 μg / mL) and chloramphenicol (15 μg / mL), and 10 colonies that had grown were grown on a 2XYT liquid medium (16 g of bactotryptone, 10 g of yeast extract, 5 g of NaCl). / L) and cultured at 30 ° C. in the presence of ampicillin (100 μg / mL) and chloramphenicol (34 μg / mL), followed by overnight culture.
From the obtained cells, protein expression was confirmed by SDS-PAGE. As a result, it was confirmed that a fusion protein of about 300 kDa and a chaperonin dimer of about 120 kDa were expressed. Further, only a band corresponding to 300 KDa was detected by Western blotting using an anti-HBs polyclonal antibody. A chaperonin complex containing the fusion protein was recovered from the Escherichia coli extract using a nickel chelate column in the same manner as in Example 2. Further, after removing imidazole by dialysis, anion exchange chromatography was performed using a TSKgel SuperQ-5PW column to purify the chaperonin complex. As a result of observing the obtained chaperonin complex with a transmission electron microscope, a ring structure unique to chaperonin was formed. From the above, the fusion protein having a chaperonin and HBs ratio of 4: 2 and a double-linked chaperonin form a ring structure by assembling with each other and store HBs in the cavity to express HBs in large amounts. I understand. According to the expression method of this example, it was estimated that about 70 mg of HBs was expressed in the soluble fraction per liter of E. coli culture.
[0036]
(Example 5)
(Expression of fusion protein of TCPβ 8mer and HCV core antigen)
The hepatitis C virus core antigen (HCVc) gene shown in SEQ ID NO: 3 was fragmented by PCR with a SpeI site at the 5 ′ end and an HpaI site at the 3 ′ end, and an EcoI site at the 5 ′ end at the 3 ′ end. PETDH2 (TCPβ) treated with SpeI and HpaI treatments, EcoI and HindIII treatments, respectively. ₈ And an expression vector pETDH2 (TCPβ) for synthesizing a fusion protein in which HCVc is fused to the N-terminal and C-terminal of the TCPβ 8-mer ₈ -HCVc was constructed.
After transforming the BL21 (DE3) strain using the obtained vector, the fusion protein was expressed under the same conditions as in Example 1. After separating the soluble fraction of Escherichia coli by SDS-PAGE and analyzing by Coomassie Brilliant Blue staining, a band having a size corresponding to the fusion protein was detected. After SDS-PAGE and transfer to a blotting membrane, Western blotting was performed using an anti-HCV core antigen monoclonal antibody. As a result, an E. coli extract expressing only TCP β tetramer was negative, Only in the case of the fusion protein, a positive band of a considerable size (about 520 KDa) was detected. This indicates that the HCVc antigen is expressed in the soluble fraction of E. coli as a fusion protein with the TCP β-mer. As a result of performing an expression experiment using the HCV core antigen alone as a control, the precipitated fraction of E. coli was positive by the same Western blotting, but the soluble fraction was negative. This indicates that the HCV core antigen alone is entirely expressed as an inclusion body, but can be expressed in a soluble fraction as a fusion protein with a chaperonin octamer.
[0037]
In the same manner as in Example 3, the fusion protein was purified using a nickel chelate column and a TSKgel SuperQ-5PW column. Observation of the obtained fusion protein with a transmission electron microscope revealed that a ring structure unique to chaperonin was formed. From this, it was considered that two molecules of the fusion protein aggregated to form a ring structure.
The collected fraction was incubated in the presence of 1 mM EDTA-Na, and then dialyzed against 50 mM K-phosphate buffer (pH 7.0). PreScission protease (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) was allowed to act on the inner solution of the dialysis, followed by incubation at 4 ° C. overnight. Thereafter, the reaction solution was fractionated by a TSKgel SuperQ-5PW column. After coating the protein of each fraction on a 96-well microtiter plate, blocking was performed with bovine serum albumin, and PBS-T buffer (10 mM Na-phosphate buffer pH 7.5 / 0.8% sodium chloride / 0.05). % Tween 20). Next, human positive or negative serum diluted with PBS-T buffer was added and reacted. After washing with a PBS-T buffer, a peroxidase-labeled human IgG antibody was allowed to act. After the completion of the reaction, the plate was washed four times with a PBS-T buffer, and a substrate color solution (containing phenyldiamine and hydrogen peroxide) was added to react. After stopping the reaction by adding 4N sulfuric acid, the absorption at 490 nm was measured. Analysis of the detected HCVc antigen-positive fraction by SDS-PAGE revealed that a substantially uniform HCVc antigen of about 22 kDa was purified. From the above, it was found that recombinant HCVc can be excised from chaperonin by a limited protease. In addition, according to the expression method of this example, it was estimated that about 80 mg of HCVc was expressed in the soluble fraction per 1 L of E. coli culture.
[0038]
(Example 6)
(Expression of fusion protein of TCP β8-mer and anti-lysozyme scFV antibody)
A fragment obtained by providing a mouse-derived anti-chicken lysozyme single-chain antibody (anti-HEL-single chain Fv antibody: HscFV) gene shown in SEQ ID NO: 4 by PCR and having a SpeI site at the 5 'end and an HpaI site at the 3'end; A fragment having an EcoI site at the 'end and a HindIII site at the 3' end was amplified, and pETDH2 (TCPβ) treated with SpeI and HpaI and EcoI and HindIII sequentially. ₈ And an expression vector pETDH2 (TCPβ) for synthesizing a fusion protein of HscFV at the N-terminus and the C-terminus of the TCPβ 8-mer ₈ -HscFV was constructed.
After transforming the BL21 (DE3) strain using the obtained vector, the fusion protein was expressed under the same conditions as in Example 1. After separating the soluble fraction of Escherichia coli by SDS-PAGE and analyzing by Coomassie Brilliant Blue staining, a band having a size corresponding to the fusion protein was detected. After SDS-PAGE and transfer to a blotting membrane, Western blotting was performed using an anti-6His monoclonal antibody (an antibody recognizing 6 histidine residues). As a result, only TCP β-mer was expressed. The E. coli extract was negative, but a positive band of a considerable size (about 540 KDa) was detected only in the case of the fusion protein. From this, it was found that HscFV was expressed in the soluble fraction of Escherichia coli as a fusion protein with the TCP β-mer. As a result of performing an expression experiment using HscFV alone as a control, the precipitated fraction of Escherichia coli was positive by the same Western blotting, but the soluble fraction was negative. This indicates that HscFV alone is all expressed as inclusion bodies, but can be expressed in the soluble fraction as a fusion protein with a chaperonin octamer. In addition, it was estimated that about 75 mg of HscFV was expressed in the soluble fraction per liter of E. coli culture by the expression method of this example.
[0039]
(Example 7)
(Expression of fusion protein between TCP β8 mer and human antibody heavy chain constant region)
The human-derived antibody heavy chain constant region (AbHC) gene shown in SEQ ID NO: 5 was fragmented by PCR with a SpeI site at the 5 'end and an HpaI site at the 3' end, and an EcoI site at the 5 'end at the 3' end. PETDH2 (TCPβ) treated with SpeI and HpaI treatments, EcoI and HindIII treatments, respectively. ₈ And an expression vector pETDH2 (TCPβ) for synthesizing a fusion protein in which AbHC is fused to the N-terminus and C-terminus of the TCP β-mer ₈ -AbHC was constructed.
After transforming the BL21 (DE3) strain using the obtained vector, the fusion protein was expressed under the same conditions as in Example 1. After separating the soluble fraction of Escherichia coli by SDS-PAGE and analyzing by Coomassie Brilliant Blue staining, a band having a size corresponding to the fusion protein was detected. In addition, after SDS-PAGE and transfer to a blotting membrane, Western blotting was performed using an anti-human IgG-Fc antibody (an antibody recognizing the antibody Fc region). As a result, Escherichia coli extraction expressing only TCP β8 mer was performed. Although the solution was negative, a positive band of a considerable size (about 520 KDa) was detected only in the case of the fusion protein. This indicated that AbHC was expressed in the soluble fraction of E. coli as a fusion protein with the TCP β-mer. As a result of performing an expression experiment using AbHC alone as a control, the soluble fraction and the precipitated fraction of Escherichia coli were negative by the same Western blotting. This indicates that AbHC alone hardly expresses in Escherichia coli, but can be expressed in a soluble fraction as a fusion protein with a chaperonin octamer. Since the antibody heavy chain constant region is maintained as a result of the assembly of two molecules, the heavy chain constant regions expressed at the N- and C-termini of both chaperonin 8 members must be assembled within the chaperonin ring. Was suggested. In addition, according to the expression method of this example, it was estimated that about 75 mg of AbHC was expressed in the soluble fraction per liter of the E. coli culture.
[0040]
(Example 8)
(Expression of E. coli chaperonin GroEL conjugate)
The Escherichia coli chaperonin GroEL gene shown in Sequence 6 was cloned by PCR using the E. coli K12 strain genome as a template. Expression vector pTr (GroE) having a trc promoter into which a gene fragment in which the GroEL gene is linked seven times in one direction is inserted ₇ Was constructed (FIG. 5). Each expression vector was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3) strain, and 2XY. T. The cells were cultured at 25 ° C. for 24 hours in a medium (16 g of bactotryptone, 10 g of yeast extract, and 5 g / L of NaCl) to express a chaperonin conjugate. After completion of the culture, the cells were collected and disrupted by ultrasonication. After collecting the supernatant by centrifugation, it was analyzed by SDS-PAGE (GroE). ₇ Was found to be expressed in large amounts in the soluble fraction. Recombination (GroE) ₇ Was purified by DEAE-Sepharose, TSKgel SuperQ-5PW and gel filtration. As a result of observing the obtained purified sample with a transmission electron microscope, a ring structure unique to chaperonin was observed. This indicates that the E. coli chaperonin GroEL maintains the seven-fold rotationally symmetric structure even when all the subunits are linked.
[0041]
(Example 9)
(Expression of fusion protein of Escherichia coli chaperonin GroEL seven-fold conjugate and human interferon)
A fragment having a NheI site at the 5 ′ end and an XhoI site at the 3 ′ end, and a NaeI site at the 5 ′ end and a SmaI site at the 3 ′ end were prepared by PCR using the human interferon α2b (INF) gene shown in SEQ ID NO: 7. PTr2 (GroE) treated with NheI and XhoI treatment, and NaeI and SmaI treatment, respectively. ₇ And an expression vector pTr2 (GroE) for synthesizing a fusion protein in which INF is fused to the N-terminus and C-terminus of a GroEL 7-fold conjugate ₇ ・ Established INF.
After transforming Escherichia coli BL21 (DE3) with the obtained expression vector, the fusion protein was expressed under the same conditions as in Example 8. PTr2 (GroE) as control ₇ And expression of INF alone was also performed.
The supernatant and the precipitate fraction of each E. coli extract were separated by SDS-PAGE, transferred to a blotting membrane, and subjected to Western blotting using an anti-INF polyclonal antibody. As a result, pTr2 (GroE) ₇ -Only in the E. coli extract sample holding INF, a band was strongly detected in the soluble fraction at a position corresponding to the molecular weight of the fusion protein (about 300 KDa). It was found that most of the expression of INF alone was produced in the insoluble fraction. From the above, it was found that INF was expressed as a soluble protein when expressed as a fusion protein with Escherichia coli GroEL seven-fold conjugate.
pTr2 (GroE) ₇ -The fusion protein was purified from the E. coli extract retained by INF by salting out, anion exchange chromatography using DEAE-Sepharose and TSKgel SuperQ-5PW columns, and gel filtration using Superose 6 (Amersham Pharmacia Biotech). As a result of observing the purified sample with a transmission electron microscope, a ring structure unique to chaperonin was observed. From the above, it is considered that INF was expressed in the soluble fraction by being stored every two molecules inside the cavity of GroEL.
[0042]
(Example 10)
(By cell-free translation system (TCPβ) ₈ Of fusion protein of HBs and HBs)
A gene encoding a fusion protein in which an HBs2 molecule is bound to the N-terminus and C-terminus of a TCPβ eight-fold linkage was introduced into a cell-free translation system expression vector pIVEX2.3 (Roche Diagnostics), and pIV2 (TCPβ) ₈ -HBs were constructed. Using this expression vector, protein synthesis was performed using Rapid Translation System RTS 500 (manufactured by Roche Diagnostics). The reaction method followed the Instruction Manual (Version 1, June 2000) of the cell-free translation system.
After the completion of the reaction, the fusion protein was purified from the reaction solution by nickel chelate chromatography and Tsk gel SuperQ-5PW column.
Observation of the purified fusion protein with a transmission electron microscope revealed a ring structure unique to chaperonin. After excising from the purified fusion protein by PreScission protease in the same manner as in Example 3, insoluble HBs were solubilized by β-octylglucoside by centrifugation. After subjecting this sample to SDS-PAGE, Western blotting with an anti-HBs polyclonal antibody detected a band of about 25 KDa corresponding to the molecular weight. When HBs was expressed alone, HBs similarly accumulated in the insoluble fraction, but solubilization with β-octylglucoside was difficult. As described above, the fusion protein was able to be expressed in a cell-free translation system.
[0043]
【The invention's effect】
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, about the protein which was difficult to express an active form protein by the conventional method of expressing a recombinant protein in a host biological system or a cell-free translation system, a protein can be efficiently expressed and purification is easy. A protein production method, a fusion protein produced by this method, and a protein.
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram schematically showing a three-dimensional structure of an Escherichia coli chaperonin (GroEL) complex.
FIG. 2 is a diagram showing a design example of a fusion protein consisting of a chaperonin derived from archaea having 4 or 8 subunits and a target protein.
FIG. 3 is a diagram showing an example of the configuration of a vector expressing a chaperonin derived from an archaea having 4 or 8 subunits and a target protein.
FIG. 4 is a view showing the results of morphological observation of a chaperonin derived from archaea having eight subunits by a transmission electron microscope.
FIG. 5 is a diagram showing a configuration example of a vector for expressing a target protein and a chaperonin derived from Escherichia coli having 7 subunits.

Claims

A method for producing a target protein in which a gene containing a chaperonin gene and a target protein gene is transcribed and translated, whereby the target protein is expressed as a fusion protein linked via a chaperonin and a peptide bond,
In the fusion protein, the chaperonin is an N-fold conjugate (N is 1 to 20), and a homologous or heterologous target protein is linked to the N-terminal and C-terminal of the chaperonin. Method.

The method for producing a protein according to claim 1, wherein in the fusion protein, the chaperonin forms a two-layer structure in which a chaperonin ring composed of a chaperonin subunit is non-covalently associated via a ring surface.

The protein production method according to claim 2, wherein the chaperonin ring associates noncovalently via the ring surface or the side surface to form a fibrous structure.

The method for producing a protein according to claim 2 or 3, wherein the fusion protein has a structure in which the target protein is bound to the chaperonin ring via a peptide bond and encapsulated inside the chaperonin ring.

The method for producing a protein according to claim 1, 2, 3, or 4, wherein the chaperonin is derived from a bacterium, an archaeon, or a eukaryote.

The method according to claim 1, 2, 3, 4, or 5, wherein the target protein gene is a partial gene of cDNA or cDNA encoding an amino acid sequence of 6 or more residues.

3. A method comprising co-expressing a plasmid in which a gene encoding a fusion protein of a chaperonin and a target protein and a gene encoding only a chaperonin or a chaperonin conjugate are polycistronic in a host. 7. The method for producing a protein according to 3, 4, 5, or 6.

A gene encoding a fusion protein of a chaperonin and a target protein and a gene encoding only a chaperonin or a chaperonin conjugate are introduced into two different plasmids which can coexist and replicate in the same host, and are introduced into the same host. The method for producing a protein according to claim 1, 2, 3, 4, 5, or 6, wherein the protein is co-expressed.

9. The method according to claim 7, wherein the host is a bacterium, yeast, animal cell, plant cell, insect cell, animal individual, plant individual or insect individual.

9. The method for producing a protein according to claim 7, wherein the method is performed in a cell-free translation system.

The fusion protein has a cleavage sequence of a limited-degraded protease at the junction between the chaperonin and the target protein,
The method for producing a protein according to any one of claims 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, and 10, further comprising a step of cleaving the target protein from the fusion protein using the limited-degradation protease.

The fusion protein has a methionine residue at the junction between the chaperonin and the target protein,
The method for producing a protein according to any one of claims 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, and 10, further comprising a step of cleaving the target protein from the fusion protein with CNBr.

The fusion protein has a cleavage sequence for a limited-degraded protease at the junction between the chaperonin subunits,
13. The method according to claim 1, further comprising a step of decomposing the chaperonin ring structure of the fusion protein with the limited-degradation type protease. How to produce proteins.

10. The target protein forms a dimer or higher quaternary structure in a homo- or hetero-form, wherein the target protein forms a dimer or a higher quaternary structure. 14. The method for producing a protein according to claim 10, 11, 12, or 13.

The target protein is a full-length peptide or a peptide having 6 or more residues of a heavy chain, a light chain, and an Fv region single chain antibody (scFv antibody) of a mammal-derived antibody, wherein the target protein is a peptide. The method for producing a protein according to 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, or 14.

The target protein is a viral antigen, a seven-transmembrane receptor protein (G protein-coupled receptor protein), or a cytokine. The method for producing a protein according to 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15.

A fusion protein produced by the method for producing a protein according to claim 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, or 16.

A protein produced by the protein production method according to claim 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, or 16.