JP2004020547A

JP2004020547A - Target sensor, and target bonding substance and target bonding material with affinity to target substance

Info

Publication number: JP2004020547A
Application number: JP2002180416A
Authority: JP
Inventors: Masaaki Yoshiyama; 吉山　正章
Original assignee: Taiyo Kagaku Kogyo Co Ltd
Current assignee: Taiyo Kagaku Kogyo Co Ltd
Priority date: 2002-06-20
Filing date: 2002-06-20
Publication date: 2004-01-22

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a target sensor very easily prepared and capable of reducing the background while enhancing specificity in detecting a target substance, and a target bonding substance and a target bonding material comprising peptide with affinity to the target substance, or its derivative. <P>SOLUTION: At least two or more kinds of peptide with affinity to the target substance, or their derivatives are used as the sensor. It is preferable that the dissociation speed of the peptide with the weakest affinity to the target substance, or its derivative, and the dissociation speed of the peptide with the strongest affinity to the target substance, or its derivative out of two or more kinds of peptide or their derivatives are different more than twice. It is also preferable that the dissociation speed of the peptide with the weakest affinity to the target substance or its derivative is 10<SP>-2</SP>(mol/sec) or more. These peptide and derivatives are usable as reagents, medicine, or the like. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ターゲット物質に親和性を有する２種類以上のペプチド又はその誘導体を用いたターゲットセンサー、更には、ターゲットセンサー、試薬、医薬品等に利用可能なターゲット物質に親和性を有するペプチド又はその誘導体からなるターゲット結合性物質及びターゲット結合性材料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、目的とするターゲット物質を検出する際には、ターゲット物質と結合する物質をセンサーとして用いることが多い。このようなセンサーとしては、ターゲット物質に対する特異性及び結合力が高いものほど好ましいとされている。
【０００３】
例えば、免疫化学的測定方法は、抗体が抗原を特異的に認識する抗原抗体反応に基づいて抗原（ターゲット物質）の検出を行なう方法であり、検出方法として、酵素、放射性トレーサー、化学発光性及び蛍光性標識等の非常に多種の標識が用いられている。中でも、酵素を使用する酵素免疫（吸着）測定法（ＥＬＩＳＡ法）は、経済性及び利便性から一般に広く利用されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、例えば、上記のＥＬＩＳＡ法等においてセンサーとして用いられる抗体は、ターゲット物質に対する特異性や結合力の高さの点で有用であるが、以下のような問題もあった。
【０００５】
すなわち、抗体は、抗原（ターゲット物質）で動物を免疫することにより調製されるため、▲１▼大量に調製することが困難である、▲２▼その調製に非常に手間がかかる（特にモノクローナル抗体の場合）、▲３▼ポリクローナル抗体を用いた場合、ターゲット物質に類似する構造を有するものにも結合する可能性が高く、バックグラウンドの上昇の原因となる、▲４▼生体にとって毒性の強い物質を抗原として用いることができず、また、低分子化合物に対する抗体を調製することが難しいため、検出できるターゲット物質が限定されてしまう、▲５▼分子量が大きいため利用範囲に限界がある、等の問題があった。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、非常に調製が容易で、目的とするターゲット物質の検出の特異性を高めると共にバックグラウンドの低減が可能なターゲットセンサー、ターゲット物質に親和性を有するペプチド又はその誘導体からなるターゲット結合性物質及びターゲット結合性材料を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明の一つは、目的とするターゲット物質に対して親和性を有する少なくとも２種類以上のペプチド又はその誘導体を備えていることを特徴とするターゲットセンサーである。
【０００８】
上記発明によれば、ターゲット物質に親和性を有する２種類以上のペプチド又はその誘導体をセンサーとして用いることにより、抗体に比べて非常に調製が容易で、立体構造等の影響も受けにくく、様々なターゲット物質を検出可能なターゲットセンサーを提供できる。また、ペプチドは、抗体に比べて分子量が小さいため、ターゲット物質に対する結合力と選択性が低いという課題があったが、複数種類のペプチドを利用することで、ペプチドの弱点であったターゲット物質に対する認識率の向上が期待できる。
【０００９】
本発明のターゲットセンサーにおいては、前記２種類以上のペプチド又はその誘導体は、前記ターゲット物質に対して異なる親和性を有しており、前記ターゲット物質に対する最も親和性の弱いペプチド又はその誘導体の解離速度と、前記ターゲット物質に対する最も親和性の強いペプチド又はその誘導体の解離速度とが２倍以上異なっていることが好ましい。
【００１０】
この態様によれば、ターゲット物質の検出の特異性を高めると共にバックグラウンドの低減が可能なターゲットセンサーを提供できる。
【００１１】
本発明のターゲットセンサーにおいては、前記ターゲット物質に対する最も親和性の弱いペプチド又はその誘導体の解離速度が１０^−２（ｍｏｌ／ｓｅｃ）以上であることが好ましい。
【００１２】
この態様によれば、よりターゲット物質の検出の特異性を高めることができる共にバックグラウンドを低減することができる。
【００１３】
また、本発明のもう一つは、目的とするターゲット物質に親和性を有し、該ターゲット物質に対する解離速度が１０^−２（ｍｏｌ／ｓｅｃ）以上であるペプチド又はその誘導体からなることを特徴とするターゲット結合性物質である。
【００１４】
また、本発明のもう一つは、目的とするターゲット物質に親和性を有する少なくとも２種類以上のペプチド又はその誘導体からなるターゲット結合性材料である。
【００１５】
上記発明によれば、上記のようなターゲットセンサー以外にも試薬や医薬品等にも利用可能なターゲット結合性物質及びターゲット結合性材料を提供できる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明のターゲットセンサーを構成するペプチド又はその誘導体（以下、これらをまとめてペプチド類という。）は、目的とするターゲット物質に対して親和性を有する少なくとも２種類以上のペプチド類であり、それらのアミノ酸配列及びアミノ酸数は、ターゲット物質によって変わるため一概に決定することはできないが、ターゲット物質に対して親和性を示す最少数のアミノ酸からなるアミノ酸配列であってもよく、該最少アミノ酸配列を複数個有するようなものであってもよい。本発明においては、上記最少アミノ酸配列のアミノ酸数は、通常、３〜１００個が好ましく、６〜２０個がより好ましい。
【００１７】
また、ペプチドの誘導体とは、上記のようなペプチドを、ターゲット物質に対する親和性を損わないように修飾したものを意味し、例えば、酵素、放射性トレーサー、化学発光性及び蛍光性標識等の標識で修飾したもの、Ｎ末端アミノ酸のアミノ基をアシル化したもの、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基をアミド化又はエステル化したもの等が挙げられる。
【００１８】
本発明においては、上記各ペプチド類は、ターゲット物質に対する親和性が異なっていることが好ましく、具体的には、ターゲット物質に対する最も親和性の弱いペプチド類の解離速度と、最も親和性の強いペプチド類の解離速度とが２倍以上異なっていることが好ましい。すなわち、ターゲット物質に対する親和性の高いセンサーは、ターゲット物質以外にもターゲット物質に類似の構造を有する物質に結合する可能性が高いが、ターゲット物質に対する親和性の低いセンサーは、相手の構造（結合部位）が少しでも変わると結合できなくなるので、ターゲット物質に対する親和性の高いセンサーに比べてより特異性の高いセンサーであると言える。従って、これらのセンサーを用いることにより、ターゲット物質の検出の特異性を高めると共にバックグラウンドを低減することができる。
【００１９】
更に、本発明においては、最も親和性の弱いペプチド類の解離速度が１０^−２（ｍｏｌ／ｓｅｃ）以上であることが好ましい。このようにターゲット物質に対する親和性の低いペプチド類を用いることにより、ターゲット物質の検出の特異性をより高めると共にバックグラウンドを低減することができる。なお、解離速度が大き過ぎると、センサーとして利用しにくくなるので、最も親和性の弱いペプチド類の解離速度は、通常、１０^−２〜１０^−１（ｍｏｌ／ｓｅｃ）程度であることが好ましい。
【００２０】
本発明において、ターゲット物質は、特に限定されるものではなく、例えば、抗体、タンパク質受容体、ホルモン、酵素、核酸、複合糖質、低分子化合物、細胞、ウイルス等が挙げられる。
【００２１】
ターゲットセンサーを構成する上記のようなターゲット物質に親和性を有するペプチド類は、例えば、ファージディスプレイ法（Ｓｍｉｔｈ，　Ｇ．Ｐ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２８８，１３１５−１３１７　（１９８５））によってスクリーニングすることにより得ることができる。本発明においては、ターゲット物質に親和性を有する２種類以上のペプチド類をより効率よく得るために、以下のようにしてスクリーニングを行なうことが好ましい。
【００２２】
（１）ファージライブラリーを調製する工程
スクリーニングに用いられるファージライブラリーは、任意のペプチドを表面に提示したファージの集団であって、種類（アミノ酸配列）の異なるペプチドを提示したファージをそれぞれほぼ均等に含有するものである。そして、ターゲット物質に結合する可能性のあるペプチドの存在確率を上げて効率よくスクリーニングを行なうために、提示されるペプチドのバリエーション（アミノ酸の組み合わせ）をできるだけ増やしたものを用いることが好ましい。このバリエーションの数は、提示されるペプチドのアミノ酸数によって変わるため一概に決定することはできない。
【００２３】
上記のようなファージライブラリーは、ランダム化したＤＮＡやｃＤＮＡライブラリー等を遺伝子工学的手法を用いてファージのＤＮＡに挿入し、このＤＮＡを適当な宿主に導入することにより得ることができる。例えば、ランダム化したＤＮＡを化学合成し、これをファージＤＮＡの外殻タンパク質をコードする遺伝子に挿入し、このＤＮＡを大腸菌に導入することにより、ファージの外殻タンパク質の先端に目的のペプチドが発現されたファージを得ることができる（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２８８，　１３１５−１３１７　（１９８５）、Ｊ．Ｋ．　Ｓｃｏｔｔ　ａｎｄ　Ｇ．Ｐ．　Ｓｍｉｔｈ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２４９，　３８６−３９０　（１９９０）等参照）。
【００２４】
本発明においては、上記のような公知の方法によってファージライブラリーを調製して用いてもよく、市販の製品を用いることもできる。市販品としては、例えば、商品名「Ｐｈａｇｅ　Ｄｉｓｐｌａｙ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｋｉｔ」（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製）等が挙げられる。
【００２５】
（２）ファージライブラリーを分割して、複数個の分割ライブラリーを調製する工程
ファージライブラリーを分割する際に、該ライブラリーに含まれる複数種類のペプチドのうち、少なくとも１種類のペプチドを含まないような、偏りを持ったライブラリーに分割することが好ましい。このような偏りを持った分割ライブラリーを用いることにより、ターゲット物質に対する親和性の異なる２種類以上のペプチド、特に、ターゲット物質に対する親和性の弱いペプチド（解離速度１０^−２ｍｏｌ／ｓｅｃ以上）を含む２種類以上のペプチドを効率よくスクリーニングすることができる。
【００２６】
そして、偏りを持った分割ライブラリーを効率よく得るために、ターゲット物質に親和性を有するタンパク質の取得希望数（ｍ）に応じて、ｍ通りのタンパク質が得られるもっともらしい確率に基いて母集団の分割数（ｒ）を決定することが好ましい。具体的には、分割数を下記式（１）に基いて求め、前記ファージライブラリーを少なくともそれ以上に分割して分割ライブラリーを調製することが好ましい。
【００２７】
【数１】
分割数ｒ＝ｍ^ｍ…（１）
ｍ：ターゲット物質に親和性を有するタンパク質の取得希望数（ｍ≧２の整数）
したがって、例えば、ターゲット物質に親和性を有するペプチドを２種類取りたい場合は、前記ファージライブラリーを少なくとも４つ以上に分割することにより、偏りを持った分割ライブラリーを効率よく調製することができる。なお、分割数が多過ぎると、ファージライブラリーの分割が困難になったり、各分割ライブラリーのスクリーニングに手間がかかるため、通常、分割数（ｒ）は４〜２５６（２≦ｍ≦４）が好ましい。
【００２８】
上記のようにしてファージライブラリーを分割して得られた各分割ライブラリーは、上記ファージライブラリーと少なくとも同等数以上のファージを含むように、それぞれ常法にしたがって増幅してからスクリーニングに用いることが好ましい。
【００２９】
（３）各分割ライブラリーを用いてスクリーニングを行なう工程
上記のようにして調製した分割ライブラリーを用いて、常法にしたがって選択操作（バイオパニング）を行なう。
【００３０】
すなわち、所定のターゲット物質を固相（例えば、プレート、ビーズ、磁気ビーズ等）に固定化し、好ましくはスキムミルク等のブロッキング剤で処理した後、該ターゲット物質と分割ライブラリーとを接触させる。そして、前記固相を洗浄してターゲット物質に結合していないファージを除去し、ターゲット物質に結合したファージを溶離して回収する。
【００３１】
次いで、回収したファージを常法にしたがって培養して増幅させ、次のラウンドのライブラリーとして用いる。このような操作を複数回（通常３〜４回）繰り返し、ターゲット物質に親和性を有するペプチドを提示したファージのスクリーニングを行ない、目的のファージを単離する。
【００３２】
上記の選択操作を各分割ライブラリーについてそれぞれ行ない、目的のファージを単離し、各分割ライブラリーから単離されたファージのＤＮＡを常法にしたがって解析することにより、ターゲット物質に親和性を有するタンパク質のアミノ酸配列を同定することができる。
【００３３】
このようにして同定したアミノ酸配列に基いて常法によりペプチドを合成し、必要に応じて標識物質等を結合させるなどして修飾することにより、目的のペプチド類を得ることができる。
【００３４】
なお、本発明においては、上記のようにして得られたターゲット物質に親和性を有する２種類以上のペプチド類は、ターゲットセンサーとしての用途以外にも試薬や医薬品等への利用可能である。特に、目的とするターゲット物質に対する解離速度が１０^−２（ｍｏｌ／ｓｅｃ）以上であるペプチド類は、ターゲット物質に対する特異性が高いので、試薬や医薬品等への利用可能性が高いものと考えられる。
【００３５】
本発明のターゲットセンサーを構成するペプチド類は、抗体と異なりターゲット物質に制限がなく、生体にとって毒性の強い物質等もターゲット物質とすることができる。また、人工的に合成することが可能であるため、大量調製が非常に容易であり、更に、分子量が小さく、立体構造等の影響を受けにくいため、利用範囲も広い。従って、例えば、ＥＬＩＳＡ（サンドイッチ法）に用いる抗体の代替品等の各種センサーとして好適に用いることができる。
【００３６】
図１には、本発明のターゲットセンサーをサンドイッチ法に用いた場合の作用原理が示されている。図１（ａ）は、プラスチックプレート等の固相１上に、目的とするターゲット物質２に対する親和性の高いペプチド類３を固定し、このペプチド類３に結合したターゲット物質２を、ターゲット物質２に対する親和性の低いペプチド類４で検出するものである。この場合、固相上に固定されたペプチド類３には、目的とするターゲット物質２以外にも、それに類似する構造を有する夾雑物質６、７も結合する。しかし、これらの夾雑物質は、上記ペプチド類４とは結合することができないので、このペプチド類４に結合した標識物質５を利用して、目的とするターゲット物質を精度よく検出することが可能となる。
【００３７】
一方、図１（ｂ）は、上記（ａ）の場合とは逆に、固相１上に、目的とするターゲット物質２に対する親和性の低いペプチド類４を固定し、このペプチド類４に結合したターゲット物質２を、ターゲット物質２に対する親和性の高いペプチド類３で検出するものである。この場合、固相上に固定されたペプチド類４には、目的とするターゲット物質２に類似する構造を有する夾雑物質６、７は結合することができず、目的のターゲット物質２だけを特異的に結合させることができるので、これを上記ペプチド類３を用いて精度よく検出することが可能となる。
【００３８】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、スクリーニングで得られた各ペプチドの解離定数及び解離速度は、ＢＩＡＣＯＲＥ　２０００（ＢＩＡＣＯＲＥ社製）を用いて表面プラズモン共鳴法により求めた。
【００３９】
実施例１
ターゲット物質として、ヒトの抗体の一部であるＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｈＦｃと略記する）を用い、ｈＦｃに結合する２種類のペプチドのスクリーニングを以下の方法により行なった。
【００４０】
（１）ターゲット物質の固定化
ターゲットｈＦｃは、常法にしたがってビオチン標識し、ストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズ（商品名「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ２８０　ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ」、Ｄｙａｎａｌ社製）に、ビオチン−ストレプトアビジン結合活性を利用して固定化した後、２％（ｗ／ｖ）スキムミルク溶液に懸濁してブロッキングを行なった。
【００４１】
（２）ペプチドのライブラリーを提示しているファージの調製
ランダムなアミノ酸配列（アミノ酸数１２個）のペプチドが表面に提示されたファージを含むペプチドライブラリー（ファージ数１０^１０ｐｆｕ／１０μＬ、商品名「Ｐｈａｇｅ　Ｄｉｓｐｌａｙ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｋｉｔ」、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製）１０μＬを４分割し、分割したペプチドライブラリー（２．５μＬ）に含まれるファージを常法にしたがって大腸菌に感染させて、それぞれ増幅、精製し、４つの分割ペプチドライブラリー（ファージ数：１０^１０ｐｆｕ／１０μＬ）を調製した。
【００４２】
そして、各分割ペプチドライブラリー１０μＬを、それぞれ０．２％（ｗ／ｖ）スキムミルク溶液１ｍＬに加えて室温で１５分間放置し、これらを用いて以下のパニングを行なった。
【００４３】
（３）パニング
上記のｈＦｃを固定化した磁気ビーズを懸濁したスキムミルク溶液１０００μＬと、上記分割ペプチドライブラリーを含むスキムミルク溶液１００μＬを混合して、２５℃で１時間放置した後、マグネットを用いて磁気ビーズを回収した。回収した磁気ビーズをＴＢＳ（０．１％　Ｔｗｅｅｎ）で洗浄して、未結合のファージを除去した後、グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．２）でターゲットｈＦｃに結合したファージを溶離して回収し、ＴＢＳ（１Ｍ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ９）で中和した後、常法にしたがって大腸菌に感染させてファージを増幅し、ＰＥＧ沈殿法によりファージを精製した。このファージ群を次のラウンドのペプチドライブラリーとして用いた。
【００４４】
そして、前記操作を１ラウンドとして、４ラウンド目で得られたファージを大腸菌に感染させてプラークを形成させ、ファージクローンを単離した。なお、パニングは、上記４つの分割ペプチドライブラリーについてそれぞれ行ない、各分割ペプチドライブラリーからファージクローンを単離した。
【００４５】
（４）解析
上記のようにして単離したファージの中から、各分割ライブラリーについて３個のクローンを任意に選び（合計１２個）、各ファージを常法にしたがって大腸菌に感染させて増幅し、精製後、ＥＬＩＳＡ法によってｈＦｃへの結合活性を調べた。
【００４６】
ＥＬＩＳＡ法は、９６穴プレートにストレプトアビジンを固定化して、スキムミルクでブロッキングした後、ビオチン標識したｈＦｃを加えて、ビオチン−ストレプトアビジン結合活性を利用してプレートに固定化した。このプレートに各ファージを加えて２５℃、１時間反応させた後、プレートをＰＢＳ−Ｔ（１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）、０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０、以下同じ）で洗浄した。そして、ＨＲＰ標識した抗Ｍ１３ファージ抗体を用いて、プレートに結合したファージの有無をＡＢＴＳの発色反応によって４０５ｎｍの吸光度で解析した。
【００４７】
比較例１（従来法）
実施例１と同じペプチドライブラリー１０μＬを分割せずにそのまま用いた以外は実施例１と同様にしてパニングを行なった。そして、単離したファージの中から１２個のクローンを任意に選び、実施例１と同様にして解析を行なった。
【００４８】
その結果、実施例１では、４つの分割ライブラリー中、２つの分割ライブラリーから選んだ６クローンで強い発色（Ａｂｓ４０５ｎｍ＝２．２前後）が見られ、１つの分割ライブラリーから選んだ３クローンでやや弱い発色（Ａｂｓ４０５ｎｍ＝０．８〜１．４前後）が見られ、残りの１つの分割ライブラリーから選んだクローンでは発色は見られなかった。一方、比較例１では、１２クローン中、１１クローンで強い発色（Ａｂｓ４０５ｎｍ＝２．２前後）が見られ、１クローンは発色が見られなかった。
【００４９】
そして、発色したクローンのＤＮＡをダイターミネータ法により解析し、ファージに提示されたペプチドのアミノ酸配列を決定したところ、実施例１で強い発色の見られた６クローンのうち、３クローン（同じ１つの分割ライブラリーから得られたもの）のペプチドは全て配列番号１に示されるアミノ酸配列であり、残りの３クローン（もう一つの分割ライブラリーから得られたもの）のペプチドは全て配列番号２に示されるアミノ酸配列であった。また、やや弱い発色の見られた分割ライブラリーから得られた３クローンのペプチドは配列番号３〜５に示されるアミノ酸配列であり、Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｘａａ　Ｌｅｕ（４番目のＸａａ：Ｔｙｒ又はＴｒｐ、５番目のＸａａ：Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＭｅｔ、８番目のＸａａ：Ａｌａ、Ｇｌｙ又はＳｅｒ）の共通するアミノ酸配列を有していた。
【００５０】
一方、比較例１の１１クローンのアミノ酸配列は全て配列番号６に示されるアミノ酸配列であった。
【００５１】
更に、上記の各ペプチドの解離定数及び解離速度を求め、その結果を表１に示した。
【００５２】
【表１】

【００５３】
表１に示されるように、実施例１で得られたターゲットｈＦｃに対する解離速度の異なる３種類のペプチドのうち、最も親和性の低いペプチド（配列番号３〜５に示されるペプチド）と、最も親和性の高いペプチド（配列番号２に示されるペプチド）の解離速度とは約２．５倍異なっており、ヒトＩｇＧを検出する際のターゲットセンサーに利用可能なペプチドを得ることができた。一方、比較例１では、１種類のペプチドしか得ることができなかった。
【００５４】
実施例２
ターゲット物質として、蛍の発光酵素ルシフェラーゼを用い、ルシフェラーゼに結合する２種類のペプチドのスクリーニングを以下の方法により行なった。
【００５５】
（１）ターゲット物質の固定化
ターゲットルシフェラーゼは、常法にしたがってビオチン標識し、ストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズ（商品名「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ２８０　ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ」、Ｄｙａｎａｌ社製）に、ビオチン−ストレプトアビジン結合活性を利用して固定化した後、２％（ｗ／ｖ）スキムミルク溶液に懸濁してブロッキングを行なった。
【００５６】
（２）ペプチドのライブラリーを提示しているファージの調製
ランダムなアミノ酸配列（アミノ酸数７個）のペプチドが表面に提示されたファージを含むペプチドライブラリー（ファージ数１０^１０ｐｆｕ／１０μＬ、商品名「Ｐｈａｇｅ　Ｄｉｓｐｌａｙ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｋｉｔ」、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社製）１０μＬを４分割し、実施例１と同様にして分割ペプチドライブラリーをそれぞれ調製した。
【００５７】
そして、各分割ペプチドライブラリー１０μＬを、それぞれ０．２％（ｗ／ｖ）スキムミルク溶液１ｍＬに加えて室温で１５分間放置し、これらを用いてパニングを行なった。
【００５８】
（３）パニング
上記のルシフェラーゼを固定化した磁気ビーズを懸濁したスキムミルク溶液１０００μＬと、上記分割ペプチドライブラリーを含むスキムミルク溶液１００μＬを混合して、２５℃で１時間放置した後、マグネットを用いて磁気ビーズを回収した。回収した磁気ビーズをＴＢＳ（０．１％　Ｔｗｅｅｎ）で洗浄後、グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．２）でターゲットルシフェラーゼに結合したファージを溶離して回収し、ＴＢＳ（１Ｍ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ９）で中和した後、常法にしたがって大腸菌に感染させてファージを増幅し、ＰＥＧ沈殿法によりファージを精製した。このファージ群を次のラウンドのペプチドライブラリーとして用いた。
【００５９】
そして、前記操作を１ラウンドとして、４ラウンド目で得られたファージを大腸菌に感染させてプラークを形成させ、ファージクローンを単離した。なお、パニングは、上記４つの分割ペプチドライブラリーについてそれぞれ行ない、各分割ペプチドライブラリーからファージクローンを単離した。
【００６０】
（４）解析
上記のようにして単離したファージの中から、各分割ライブラリーについて３個のクローンを任意に選び（合計１２個）、各ファージを常法にしたがって大腸菌に感染させて増幅し、精製後、ＥＬＩＳＡ法によってルシフェラーゼへの結合活性を調べた。
【００６１】
ＥＬＩＳＡ法は、９６穴プレートにストレプトアビジンを固定化して、スキムミルクでブロッキングした後、ビオチン標識したルシフェラーゼを加えて、ビオチン−ストレプトアビジン結合活性を利用してプレートに固定化した。このプレートにファージを加えて２５℃、１時間反応させた後、プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄した。そして、ＨＲＰ標識した抗Ｍ１３ファージ抗体を用いて、プレートに結合したファージの有無をＡＢＴＳの発色反応によって４０５ｎｍの吸光度で解析した。
【００６２】
比較例２（従来法）
実施例２と同じペプチドライブラリー１０μＬを分割せずにそのまま用いた以外は実施例２と同様にしてパニングを行なった。そして、単離したファージの中から１２個のクローンを任意に選び、実施例２と同様にして解析を行なった。
【００６３】
その結果、実施例２では、４つの分割ライブラリー中、１つの分割ライブラリーから選んだ３クローンで強い発色（Ａｂｓ４０５ｎｍ＝１．３前後）が見られ、１つの分割ライブラリーから選んだ３クローンでやや弱い発色（Ａｂｓ４０５ｎｍ＝０．９５前後）が見られ、残りの２つの分割ライブラリーからは選んだクローンでは発色は見られなかった。一方、比較例２では、１２クローン中、８クローンで強い発色（Ａｂｓ４０５ｎｍ＝１．４前後）が見られ、４つは発色が見られなかった。
【００６４】
そして、発色したクローンのＤＮＡをダイターミネータ法により解析し、ファージに提示されたペプチドのアミノ酸配列を決定したところ、実施例２で強い発色の見られた分割ライブラリーから得られた３クローンのペプチドは全て配列番号７に示されるアミノ酸配列であった。また、やや弱い発色の見られた分割ライブラリーから得られた３クローンのペプチドは全て配列番号８に示されるアミノ酸配列であった。一方、比較例２の８クローンのペプチドは全て上記配列番号７に示されるアミノ酸配列と同じであった。
【００６５】
更に、上記の各ペプチドの解離定数及び解離速度を求め、その結果を表２に示した。
【００６６】
【表２】

【００６７】
表２に示されるように、実施例２で得られたターゲットルシフェラーゼに対する解離速度の異なる２種類のペプチドは、最も親和性の低いペプチド（配列番号８に示されるペプチド）と、最も親和性の高いペプチド（配列番号７に示されるペプチド）の解離速度とは約２７倍異なっており、ルシフェラーゼを検出する際のターゲットセンサーに利用可能なペプチドを得ることができた。特に、配列番号８に示されるペプチドは、ターゲットルシフェラーゼに対する解離速度が１０^−２（ｍｏｌ／ｓｅｃ）以上であり、ルシフェラーゼに対する特異性が高いペプチドである。一方、比較例２では、１種類のペプチドしか得ることができなかった。
【００６８】
「配列表フリーテキスト」
配列番号１：ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントと親和性を有するペプチド。
配列番号２：ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントと親和性を有するペプチド。
配列番号３：ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントと親和性を有するペプチド。
配列番号４：ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントと親和性を有するペプチド。
配列番号５：ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントと親和性を有するペプチド。
配列番号６：ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントと親和性を有するペプチド。
配列番号７：ルシフェラーゼと親和性を有するペプチド。
配列番号８：ルシフェラーゼと親和性を有するペプチド。
【００６９】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、目的とするターゲット物質に親和性を有する少なくとも２種類以上のペプチド類をセンサーとして用いることにより、抗体に比べて非常に調製が容易で、立体構造等の影響も受けにくく、様々なターゲット物質を検出可能な利用範囲の広いターゲットセンサーを提供できる。ペプチドは、抗体に比べて分子量が小さいため、ターゲット物質に対する結合力と選択性が低いという課題があったが、本発明のように、複数種類のペプチドを利用することで、ペプチドの弱点であったターゲット物質に対する認識率の向上が期待できる。そして、前記ターゲット物質に対する最も親和性の弱いペプチド類の解離速度と、前記ターゲット物質に対する最も親和性の強いペプチド類の解離速度とが２倍以上異なっている少なくとも２種類以上のペプチド類を用いることにより、ターゲット物質の検出の特異性を高めると共にバックグラウンドの低減が可能なターゲットセンサーを得ることができる。
【００７０】
また、目的とするターゲット物質に親和性を有する少なくとも２種類以上のペプチド類、特に、ターゲット物質に対する解離速度が１０^−２（ｍｏｌ／ｓｅｃ）以上であるペプチド類は、ターゲット物質に対する特異性が高いので、上記のようなセンサーとしてだけでなく、試薬や医薬品等への利用可能性もある。
【００７１】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のターゲットセンサーをサンドイッチ法に用いた場合の作用原理を模式的に示した説明図である。
【符号の説明】
１．固相
２．ターゲット物質
３．ターゲット物質に対する親和性の高いペプチド類
４．ターゲット物質に対する親和性の低いペプチド類
５．標識物質
６、７．ターゲット物質と類似の構造を有する夾雑物質[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a target sensor using two or more kinds of peptides having an affinity for a target substance or a derivative thereof, and a peptide or a derivative thereof having an affinity for a target substance which can be used as a target sensor, a reagent, a drug, or the like. And a target binding material comprising:
[0002]
[Prior art]
Generally, when a target substance is detected, a substance that binds to the target substance is often used as a sensor. As such a sensor, a sensor having higher specificity and binding force for a target substance is considered preferable.
[0003]
For example, an immunochemical measurement method is a method for detecting an antigen (target substance) based on an antigen-antibody reaction in which an antibody specifically recognizes an antigen. As a detection method, an enzyme, a radioactive tracer, a chemiluminescent and A very wide variety of labels, such as fluorescent labels, have been used. Above all, an enzyme immunoassay (adsorption) assay using an enzyme (ELISA) is generally widely used from the viewpoint of economy and convenience.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
However, for example, an antibody used as a sensor in the above-described ELISA method or the like is useful in terms of specificity for a target substance and high binding power, but has the following problems.
[0005]
That is, since antibodies are prepared by immunizing animals with an antigen (target substance), (1) it is difficult to prepare them in large quantities, and (2) it takes a lot of time to prepare them (particularly monoclonal antibodies). ), (3) When a polyclonal antibody is used, there is a high possibility of binding to a substance having a structure similar to the target substance, which causes an increase in background. Cannot be used as an antigen, and it is difficult to prepare an antibody against a low-molecular compound, so that the target substance that can be detected is limited. (5) The use range is limited due to its large molecular weight. There was a problem.
[0006]
Therefore, an object of the present invention is to prepare a target sensor, a peptide or a derivative thereof having an affinity for a target substance, which is very easy to prepare and can increase the detection specificity of the target substance and reduce the background. To provide a target binding substance and a target binding material.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, one aspect of the present invention is a target sensor including at least two or more peptides having an affinity for a target substance of interest or a derivative thereof.
[0008]
According to the above invention, by using two or more kinds of peptides having an affinity for a target substance or a derivative thereof as a sensor, the preparation is extremely easy as compared with an antibody, and it is hardly affected by a three-dimensional structure or the like. A target sensor capable of detecting a target substance can be provided. In addition, peptides have a problem of low binding strength and selectivity to a target substance because of their low molecular weight compared to antibodies.However, by using a plurality of peptides, peptides have a weak point against the target substance, which was a weak point of peptides. An improvement in recognition rate can be expected.
[0009]
In the target sensor of the present invention, the two or more peptides or derivatives thereof have different affinities for the target substance, and the dissociation rate of the peptide or the derivative thereof having the weakest affinity for the target substance And the dissociation rate of the peptide or its derivative having the highest affinity for the target substance is preferably at least two times different.
[0010]
According to this aspect, it is possible to provide a target sensor capable of increasing the specificity of detecting a target substance and reducing the background.
[0011]
In the target sensor of the present invention, it is preferable that the dissociation rate of the peptide or its derivative having the lowest affinity for the target substance is 10 ⁻² (mol / sec) or more.
[0012]
According to this aspect, the specificity of the detection of the target substance can be further increased, and the background can be reduced.
[0013]
Another feature of the present invention is that the peptide or the derivative thereof has an affinity for a target substance of interest and has a dissociation rate with respect to the target substance of 10 ⁻² (mol / sec) or more. Target binding substance.
[0014]
Another aspect of the present invention is a target binding material comprising at least two or more peptides having an affinity for a target substance of interest or a derivative thereof.
[0015]
According to the above invention, it is possible to provide a target binding substance and a target binding material that can be used for reagents, pharmaceuticals, and the like in addition to the above target sensors.
[0016]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Peptides or derivatives thereof (hereinafter, collectively referred to as peptides) constituting the target sensor of the present invention are at least two or more peptides having an affinity for a target substance of interest. Although the amino acid sequence and the number of amino acids vary depending on the target substance, they cannot be unconditionally determined, but may be an amino acid sequence consisting of the minimum number of amino acids exhibiting affinity for the target substance. May be provided. In the present invention, the number of amino acids in the minimum amino acid sequence is usually preferably 3 to 100, and more preferably 6 to 20.
[0017]
Peptide derivatives mean those obtained by modifying the peptide as described above so as not to impair the affinity for the target substance, and include, for example, enzymes, radioactive tracers, labels such as chemiluminescent and fluorescent labels. And N-terminal amino acid acylated, C-terminal amino acid carboxyl amidated or esterified, and the like.
[0018]
In the present invention, each of the above-mentioned peptides preferably has a different affinity for the target substance. Specifically, the dissociation rate of the peptides having the weakest affinity for the target substance and the peptide having the strongest affinity for the target substance are preferred. Preferably, the dissociation rates of the species differ by a factor of two or more. That is, a sensor having a high affinity for a target substance is likely to bind to a substance having a structure similar to the target substance in addition to the target substance, while a sensor having a low affinity for the target substance is likely to bind to the structure of the partner (binding). Since the binding becomes impossible if the site changes slightly, it can be said that the sensor has higher specificity than a sensor having high affinity for the target substance. Therefore, by using these sensors, the specificity of detection of the target substance can be increased and the background can be reduced.
[0019]
Furthermore, in the present invention, the dissociation rate of the peptides having the weakest affinity is preferably 10 ⁻² (mol / sec) or more. By using peptides having a low affinity for the target substance, the specificity of detection of the target substance can be further increased and the background can be reduced. If the dissociation rate is too high, it becomes difficult to use the sensor as a sensor. Therefore, the dissociation rate of peptides having the weakest affinity is usually preferably about 10 ⁻² to 10 ⁻¹ (mol / sec).
[0020]
In the present invention, the target substance is not particularly limited, and examples thereof include an antibody, a protein receptor, a hormone, an enzyme, a nucleic acid, a glycoconjugate, a low molecular compound, a cell, and a virus.
[0021]
Peptides having an affinity for the target substance as described above constituting the target sensor can be obtained by, for example, screening by the phage display method (Smith, GP, Science, 288, 1315-1317 (1985)). be able to. In the present invention, in order to more efficiently obtain two or more peptides having an affinity for a target substance, it is preferable to perform screening as follows.
[0022]
(1) Step of preparing a phage library A phage library used for screening is a population of phages displaying an arbitrary peptide on the surface, and phages displaying peptides of different types (amino acid sequences) are substantially equal to each other. Is contained. Then, in order to increase the probability of existence of a peptide that may bind to the target substance and carry out screening efficiently, it is preferable to use a peptide whose variation (combination of amino acids) of the presented peptide is increased as much as possible. The number of these variations cannot be determined unconditionally because it depends on the number of amino acids in the presented peptide.
[0023]
The phage library as described above can be obtained by inserting a randomized DNA or cDNA library or the like into phage DNA using genetic engineering techniques and introducing this DNA into an appropriate host. For example, by chemically synthesizing randomized DNA, inserting this into a gene encoding a coat protein of phage DNA, and introducing this DNA into Escherichia coli, the desired peptide is expressed at the tip of the coat protein of phage. (Smith, GP, Science, 288, 1315-1317 (1985), JK Scott and GP Smith, Science, 249, 386-390 (1990), etc.) reference).
[0024]
In the present invention, a phage library may be prepared and used by a known method as described above, or a commercially available product may be used. Examples of commercially available products include “Phase Display Peptide Library Kit” (manufactured by New England Biolab) and the like.
[0025]
(2) Step of dividing a phage library to prepare a plurality of divided libraries When the phage library is divided, at least one peptide among a plurality of peptides contained in the library is contained. It is preferable to divide the library into biased ones. By using a split library having such a bias, two or more peptides having different affinities for the target substance, particularly peptides having a low affinity for the target substance (dissociation rate of 10 ⁻² mol / sec or more) can be obtained. It is possible to efficiently screen two or more kinds of peptides including the peptide.
[0026]
Then, in order to obtain a biased split library efficiently, the population is determined based on the plausible probability of obtaining m kinds of proteins in accordance with the desired number (m) of proteins having affinity for the target substance. It is preferable to determine the number of divisions (r). Specifically, it is preferable to determine the number of divisions based on the following formula (1), and to divide the phage library into at least more parts to prepare a division library.
[0027]
(Equation 1)
Division number r = m ^m (1)
m: desired number of proteins having an affinity for the target substance (m is an integer of 2 or more)
Therefore, for example, when it is desired to obtain two kinds of peptides having an affinity for the target substance, the biased divided library can be efficiently prepared by dividing the phage library into at least four or more. . If the number of divisions is too large, it becomes difficult to divide the phage library or it takes time to screen each divided library. Therefore, the number of divisions (r) is usually 4 to 256 (2 ≦ m ≦ 4). Is preferred.
[0028]
Each of the divided libraries obtained by dividing the phage library as described above should be amplified according to a conventional method so as to contain at least the same number of phages as the phage library, and then used for screening. Is preferred.
[0029]
(3) Step of Screening Using Each Split Library Using the split libraries prepared as described above, a selection operation (biopanning) is performed according to a conventional method.
[0030]
That is, a predetermined target substance is immobilized on a solid phase (for example, a plate, beads, magnetic beads, or the like), and is preferably treated with a blocking agent such as skim milk, and then the target substance is brought into contact with the split library. Then, the solid phase is washed to remove phages not bound to the target substance, and the phages bound to the target substance are eluted and collected.
[0031]
Next, the recovered phage is cultured and amplified according to a conventional method, and used as a library in the next round. Such an operation is repeated a plurality of times (usually 3 to 4 times), and a phage displaying a peptide having an affinity for the target substance is screened to isolate a target phage.
[0032]
The above selection operation is performed for each of the divided libraries, the objective phage is isolated, and the DNA of the phage isolated from each of the divided libraries is analyzed in accordance with a conventional method, whereby a protein having an affinity for the target substance is obtained. Can be identified.
[0033]
The desired peptides can be obtained by synthesizing a peptide by a conventional method based on the amino acid sequence identified in this way and modifying it by, for example, binding a labeling substance or the like, if necessary.
[0034]
In the present invention, the two or more peptides having an affinity for the target substance obtained as described above can be used for reagents, pharmaceuticals, and the like in addition to use as target sensors. In particular, peptides having a dissociation rate of 10 ⁻² (mol / sec) or more for a target substance of interest have high specificity for the target substance, and thus are considered to have high applicability to reagents and pharmaceuticals. .
[0035]
Peptides constituting the target sensor of the present invention are not limited to target substances, unlike antibodies, and substances that are highly toxic to living organisms can be used as target substances. In addition, since it can be artificially synthesized, it is very easy to prepare it in large quantities. Further, it has a small molecular weight and is hardly affected by a steric structure and the like, so that it can be used in a wide range of applications. Therefore, for example, it can be suitably used as various sensors such as a substitute for an antibody used in ELISA (sandwich method).
[0036]
FIG. 1 shows the principle of operation when the target sensor of the present invention is used in a sandwich method. FIG. 1A shows that a peptide 3 having a high affinity for a target substance 2 of interest is immobilized on a solid phase 1 such as a plastic plate, and the target substance 2 bound to the peptide 3 is converted into a target substance 2. Is detected with peptides 4 having low affinity for In this case,

contaminants

6 and 7 having a structure similar to the target target substance 2 as well as the target substance 2 are bound to the peptides 3 immobilized on the solid phase. However, since these contaminants cannot bind to the above-mentioned peptides 4, it is possible to accurately detect a target substance of interest using the labeling substance 5 bound to the peptides 4. Become.
[0037]
On the other hand, FIG. 1 (b) shows that, contrary to the above (a), peptides 4 having low affinity for the target substance 2 of interest are immobilized on the solid phase 1 and bound to the peptides 4 The detected target substance 2 is detected by the peptides 3 having a high affinity for the target substance 2. In this case, the

contaminants

6 and 7 having a structure similar to the target substance 2 cannot bind to the peptides 4 immobilized on the solid phase, and only the target substance 2 is specifically bound. Can be detected with high accuracy using the above-mentioned peptides 3.
[0038]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto. The dissociation constant and dissociation rate of each peptide obtained by the screening were determined by surface plasmon resonance using BIACORE 2000 (manufactured by BIACORE).
[0039]
Example 1
Using an Fc fragment of IgG (hereinafter abbreviated as hFc), which is a part of a human antibody, as a target substance, screening of two kinds of peptides that bind to hFc was performed by the following method.
[0040]
(1) Immobilization of target substance The target hFc was labeled with biotin according to a conventional method, and then applied to magnetic beads (trade name “Dynabeads M280 streptavidin”, manufactured by Dynal) coated with streptavidin to bind biotin-streptavidin. After immobilization using a suspension, the suspension was suspended in a 2% (w / v) skim milk solution to perform blocking.
[0041]
(2) Preparation of a phage displaying a library of peptides A peptide library containing a phage having a peptide with a random amino acid sequence (12 amino acids) displayed on the surface (10 ¹⁰ pfu / 10 μL phage, trade name) 10 μL of “Phase Display Peptide Library Kit”, manufactured by New England Biolab, was divided into four parts, and the phage contained in the divided peptide library (2.5 μL) was infected to Escherichia coli according to a conventional method, and amplified and purified. , 4 split peptide libraries (phage count: 10 ¹⁰ pfu / 10 μL) were prepared.
[0042]
Then, 10 μL of each split peptide library was added to 1 mL of a 0.2% (w / v) skim milk solution, left at room temperature for 15 minutes, and the following panning was performed using these.
[0043]
(3) Panning A mixture of 1000 μL of the skim milk solution in which the hFc-immobilized magnetic beads are suspended and 100 μL of the skim milk solution containing the split peptide library are allowed to stand at 25 ° C. for 1 hour, and then magnetized. The magnetic beads were collected. The collected magnetic beads were washed with TBS (0.1% Tween) to remove unbound phage, and the phage bound to the target hFc was eluted and recovered with a glycine-HCl buffer (pH 2.2). After neutralization with TBS (1M Tris, pH 9), E. coli was infected according to a conventional method to amplify the phage, and the phage was purified by the PEG precipitation method. This phage group was used as the next round peptide library.
[0044]
The above procedure was defined as one round, and the phage obtained in the fourth round was infected with Escherichia coli to form plaques, and phage clones were isolated. The panning was performed on each of the above-mentioned four divided peptide libraries, and a phage clone was isolated from each of the divided peptide libraries.
[0045]
(4) Analysis From the phages isolated as described above, three clones were arbitrarily selected for each of the divided libraries (total of 12 clones), and each phage was amplified by infecting Escherichia coli according to a conventional method. After purification, the binding activity to hFc was examined by ELISA.
[0046]
In the ELISA method, streptavidin was immobilized on a 96-well plate, blocked with skim milk, biotin-labeled hFc was added, and immobilized on the plate using the biotin-streptavidin binding activity. After adding each phage to this plate and reacting at 25 ° C. for 1 hour, the plate was washed with PBS-T (10 mM phosphate buffer (pH 7.4), 0.1% Tween 20, the same hereinafter). Then, using an HRP-labeled anti-M13 phage antibody, the presence / absence of phage bound to the plate was analyzed by absorbance at 405 nm by a color reaction of ABTS.
[0047]
Comparative Example 1 (conventional method)
Panning was performed in the same manner as in Example 1, except that 10 μL of the same peptide library as in Example 1 was used without being divided. Then, 12 clones were arbitrarily selected from the isolated phages and analyzed in the same manner as in Example 1.
[0048]
As a result, in Example 1, strong color development (Abs 405 nm = around 2.2) was observed in 6 clones selected from the 2 divided libraries among the 4 divided libraries, and 3 clones selected from the 1 divided library Slightly weak color development (Abs 405 nm = about 0.8 to 1.4) was observed, and no color development was observed in the clones selected from the remaining one divided library. On the other hand, in Comparative Example 1, strong color development (Abs 405 nm = around 2.2) was observed in 11 out of 12 clones, and no color development was observed in 1 clone.
[0049]
Then, the DNA of the color-developed clone was analyzed by the dye terminator method, and the amino acid sequence of the peptide displayed on the phage was determined. All the peptides of the split library (obtained from the split library) have the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the peptides of the remaining three clones (obtained from the other split library) are all shown in SEQ ID NO: 2. Amino acid sequence. The peptides of the three clones obtained from the split library showing slightly weak color development have the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 5, and have Trp Arg Lys Xaa Xaa Arg His Xaa Leu (4th Xaa: Tyr) Or Trp, the fifth Xaa: Leu, Ile or Met, and the eighth Xaa: Ala, Gly or Ser).
[0050]
On the other hand, the amino acid sequences of the 11 clones of Comparative Example 1 were all the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 6.
[0051]
Further, the dissociation constant and dissociation rate of each of the above peptides were determined, and the results are shown in Table 1.
[0052]
[Table 1]

[0053]
As shown in Table 1, of the three peptides having different dissociation rates with respect to the target hFc obtained in Example 1, the peptide having the lowest affinity (the peptide shown in SEQ ID NOS: 3 to 5) and the peptide having the lowest affinity The dissociation rate of the highly potent peptide (peptide shown in SEQ ID NO: 2) was about 2.5 times different, and a peptide usable as a target sensor for detecting human IgG could be obtained. On the other hand, in Comparative Example 1, only one kind of peptide could be obtained.
[0054]
Example 2
As a target substance, firefly luminescent enzyme luciferase was used, and two kinds of peptides binding to luciferase were screened by the following method.
[0055]
(1) Immobilization of target substance Target luciferase was labeled with biotin according to a conventional method, and was then applied to magnetic beads (trade name “Dynabeads M280 streptavidin”, manufactured by Dyanal) coated with streptavidin to bind biotin-streptavidin. After immobilization using a suspension, the suspension was suspended in a 2% (w / v) skim milk solution to perform blocking.
[0056]
(2) Preparation of Phage Displaying Peptide Library Peptide library containing phage having a peptide with a random amino acid sequence (7 amino acids) displayed on the surface (10 ¹⁰ pfu / 10 μL phage, trade name) 10 μL of “Phase Display Peptide Library Kit”, manufactured by New England Biolab) was divided into 4 parts, and a divided peptide library was prepared in the same manner as in Example 1.
[0057]
Then, 10 μL of each split peptide library was added to 1 mL of a 0.2% (w / v) skim milk solution, left at room temperature for 15 minutes, and panning was performed using these.
[0058]
(3) Panning The above-mentioned luciferase-immobilized magnetic beads suspended in 1000 μL of the skim milk solution and 100 μL of the skim milk solution containing the split peptide library were mixed, left at 25 ° C. for 1 hour, and then magnetized. The magnetic beads were collected. After the collected magnetic beads were washed with TBS (0.1% Tween), the phage bound to the target luciferase was eluted with a glycine-hydrochloric acid buffer (pH 2.2), collected, and then washed with TBS (1M Tris, pH 9). After the addition, the phage was amplified by infecting Escherichia coli according to a conventional method, and the phage was purified by the PEG precipitation method. This phage group was used as the next round peptide library.
[0059]
The above procedure was defined as one round, and the phage obtained in the fourth round was infected with Escherichia coli to form plaques, and phage clones were isolated. The panning was performed on each of the above-mentioned four divided peptide libraries, and a phage clone was isolated from each of the divided peptide libraries.
[0060]
(4) Analysis From the phages isolated as described above, three clones were arbitrarily selected for each of the divided libraries (total of 12 clones), and each phage was amplified by infecting Escherichia coli according to a conventional method. After purification, the binding activity to luciferase was examined by ELISA.
[0061]
In the ELISA method, streptavidin was immobilized on a 96-well plate, and after blocking with skim milk, biotin-labeled luciferase was added and immobilized on the plate using the biotin-streptavidin binding activity. Phage was added to this plate and reacted at 25 ° C. for 1 hour, and then the plate was washed with PBS-T. Then, using an HRP-labeled anti-M13 phage antibody, the presence / absence of phage bound to the plate was analyzed by absorbance at 405 nm by a color reaction of ABTS.
[0062]
Comparative Example 2 (conventional method)
Panning was performed in the same manner as in Example 2 except that 10 μL of the same peptide library as in Example 2 was used without being divided. Then, 12 clones were arbitrarily selected from the isolated phages and analyzed in the same manner as in Example 2.
[0063]
As a result, in Example 2, strong color development (Abs405nm = about 1.3) was observed in three clones selected from one divided library among the four divided libraries, and three clones selected from one divided library were used. Slightly weak color development (Abs 405 nm = 0.95) was observed, and no color development was observed in the clones selected from the remaining two split libraries. On the other hand, in Comparative Example 2, 8 out of 12 clones exhibited strong color development (Abs 405 nm = around 1.4), and 4 did not show color development.
[0064]
Then, the DNA of the color-developed clone was analyzed by the dye terminator method, and the amino acid sequence of the peptide displayed on the phage was determined. Were all the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 7. In addition, the peptides of the three clones obtained from the split library showing slightly weak color development all had the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8. On the other hand, all the peptides of the eight clones of Comparative Example 2 had the same amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 7.
[0065]
Further, the dissociation constant and dissociation rate of each of the above peptides were determined, and the results are shown in Table 2.
[0066]
[Table 2]

[0067]
As shown in Table 2, the two types of peptides having different dissociation rates with respect to the target luciferase obtained in Example 2 were the peptide with the lowest affinity (the peptide shown in SEQ ID NO: 8) and the peptide with the highest affinity The dissociation rate of the peptide (peptide shown in SEQ ID NO: 7) was about 27 times different, and a peptide usable as a target sensor for detecting luciferase could be obtained. In particular, the peptide represented by SEQ ID NO: 8 has a dissociation rate with respect to the target luciferase of 10 ⁻² (mol / sec) or more, and has high specificity with respect to the luciferase. On the other hand, in Comparative Example 2, only one type of peptide could be obtained.
[0068]
"Sequence List Free Text"
SEQ ID NO: 1: Peptide having affinity for Fc fragment of human IgG.
SEQ ID NO: 2: Peptide having affinity for Fc fragment of human IgG.
SEQ ID NO: 3: Peptide having affinity for Fc fragment of human IgG.
SEQ ID NO: 4: Peptide having affinity for Fc fragment of human IgG.
SEQ ID NO: 5: Peptide having affinity for Fc fragment of human IgG.
SEQ ID NO: 6: Peptide having affinity for Fc fragment of human IgG.
SEQ ID NO: 7: Peptide having affinity for luciferase
SEQ ID NO: 8: Peptide having affinity for luciferase
[0069]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, by using at least two or more kinds of peptides having an affinity for a target substance of interest as a sensor, preparation is extremely easy as compared with an antibody, A target sensor that is not easily affected and can detect various target substances and can be used widely can be provided. Peptides have the problem of low binding strength and selectivity to target substances due to their lower molecular weight than antibodies, but the use of multiple types of peptides, as in the present invention, is a weak point of peptides. It can be expected that the recognition rate for the target material will improve. And using at least two or more peptides having a dissociation rate of peptides having the lowest affinity for the target substance and a dissociation rate of peptides having the highest affinity for the target substance which is at least twice as large. Accordingly, it is possible to obtain a target sensor capable of increasing the specificity of detection of a target substance and reducing the background.
[0070]
In addition, at least two or more peptides having an affinity for a target substance of interest, in particular, peptides having a dissociation rate of 10 ⁻² (mol / sec) or more for the target substance have high specificity for the target substance. Therefore, the present invention can be used not only as a sensor as described above but also as a reagent or a pharmaceutical.
[0071]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an explanatory diagram schematically showing an operation principle when a target sensor of the present invention is used for a sandwich method.
[Explanation of symbols]
1. Solid phase 2. 2. Target substance 3. Peptides with high affinity for the target substance 4. Peptides with low affinity for the target

substance Labeling substances

6,7. Contaminants with a structure similar to the target material

Claims

A target sensor comprising at least two or more peptides having an affinity for a target substance of interest or derivatives thereof.

The two or more peptides or derivatives thereof have different affinities for the target substance. 2. The target sensor according to claim 1, wherein the dissociation rate of the strong peptide or its derivative differs from the dissociation rate by at least two times.

The target sensor according to claim 2, wherein the dissociation rate of the peptide or its derivative having the lowest affinity for the target substance is 10 ^-2 (mol / sec) or more.

A target binding substance comprising a peptide having an affinity for a target substance and having a dissociation rate with respect to the target substance of 10 ⁻² (mol / sec) or more, or a derivative thereof.

A target binding material comprising at least two or more peptides having an affinity for a target substance of interest or a derivative thereof.