【０００１】
【発明の属する技術分野】
蛍光顕微鏡、特にＦＲＥＴの観察やクロスコリレーションの測定に使用できる蛍光顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞機能の動体観察において、細胞内カルシュウムイオン濃度の変動が重要なファクターとなっている。顕微鏡を用いた生体内細胞のカルシュウムイオン濃度の観察には、Ｉｎｄｏ−１， Ｃａｍｅｌｅｏｎといった１波長励起、２波長測光の蛍光指示薬が用いられる。１波長励起、２波長測光形の蛍光指示薬は、異なる２つの波長の蛍光強度の比を求めることにより、蛍光指示薬自体の濃度に左右されずに、定量的にカルシュウムイオン濃度を測定することができるので、多くの研究者に用いられている。Ｃａｍｅｌｅｏｎは、２種類の蛍光タンパクを組み合わせた蛍光指示薬である。
【０００３】
また、ＧＦＰ （ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ） を用いる観察もある。ＧＦＰ を使った観察法の一つにＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）があり、多くの研究者に利用されている。ＦＲＥＴでは、標本上の同一の位置でのドナーの蛍光とアクセプタの蛍光、ＦＲＥＴ光の明るさを測定する。この実験を行う場合にも、１波長励起２波長測光を行う場合がある。
【０００４】
つまり、カルシュウムの濃度を見たり、また、ＦＲＥＴで分子の相関をみたりする場合のは、１波長励起２波長測光をおこなう場合が非常に重要になる。このように、指示薬を用い、１波長励起２波長測光を行おうとすると、２つの異なる波長の蛍光でイメージングする必要がある。
【０００５】
このような場合、標本を複数の波長で同時に観察出来ることが好ましい。そこで、これまでは、蛍光顕微鏡に１つの撮像素子を装着し、この撮像素子の前に透過波長域の異なる複数個のバンドパスフィルターを有するフィルターホイールを配置し、このフィルターホーイールを回転させて各波長ごとの蛍光像を撮像していた。
【０００６】
また、複数の撮像素子を装着する構成では、各波長の蛍光が予め決まった撮像素子に向かうように、ダイクロイックミラーで蛍光を分離していた。図７は従来の蛍光顕微鏡の一つで、複数の撮像素子を装着した蛍光顕微鏡である。光源ＬＳからの照明光は、光路７に沿って進み、ダイクロイックミラー８に到達する。ダイクロイックミラー８では所定の波長域の励起光だけが反射される。ダイクロイックミラー８で反射した励起光は対物レンズ６に入射し、標本５を照明する。励起光で励起された蛍光色素は、蛍光を放射する。標本５から放射された蛍光は、対物レンズ６を通り、さらに、ダイクロイックミラー８を通過する。そして、結像レンズ１２を通過し、ダイクロイックミラー１０に到達する。ダイクロイックミラー１０では所定の波長域の蛍光が反射され、残りの波長域の蛍光は透過する。ダイクロイックミラー１０で反射された蛍光は、第１の撮像素子９上に蛍光像を形成する。一方、ダイクロイックミラー１０を透過した蛍光は光路１１に沿って進み、第２の撮像素子１４上に蛍光像を形成する。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、フィルターホイールを回転させる方法では、高速でバンドパスフィルターを切り替えるのが困難であった。そのため、カルシウムの変化や分子の相関の変化を高速で測定したい場合、バンドパスフィルターの切り替えに時間がかかるため２つの蛍光波長の撮像にタイムラグが生じ、測定精度が低下するという問題点があった。また、バンドパスフィルター切り替えによって、２つの波長の像がわずかにずれるという問題があった。さらに、フィルターホイールの回転によって振動が発生したり、複数の波長の蛍光を同時に撮像できないなどの問題があった。
【０００８】
また、複数の撮像素子を用いる方法では、光学系の収差や歪が影響したり、撮像素子の取り付けによるずれの影響から複数の撮像素子の像をピクセル単位で重ね合わせることは非常に困難であった。そのため、２つの蛍光波長の像強度比が正確に求められなかった。
【０００９】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたもので、波長選択素子を切替えることなく、複数の波長の蛍光像を同時に撮像できる蛍光顕微鏡、または分光顕微鏡を実現することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段および作用】
上記問題を解決するために、本発明の蛍光顕微鏡は、標本を照明する光源と、該光源と前記標本との間に配置された第１の波長選択素子と、該第１の波長選択素子と前記標本の間に配置された対物レンズと、前記標本の像を撮像する撮像素子と、該撮像素子と前記標本との間に配置された第２の波長選択素子とを備え、前記撮像素子が複数の波長の蛍光像を撮像でき、かつ、各ピクセル毎に波長分離が可能な撮像素子であることを特徴とする。
【００１１】
また、励起光と蛍光を分離する為のダイクロイックフィルターを有することを特徴とする。
また、像をテレセントリックな条件で撮像素子に投影することができる光学系を有することを特徴とする
【００１２】
【発明の実施の形態】
本実施の形態の蛍光顕微鏡は、複数の波長の蛍光をピクセル毎に波長分離して撮像できる撮像素子を用いている。ここで、複数の波長の蛍光像を波長分離して撮像できる撮像素子とは、たとえばＵＳＰ５，９６５，８７５号公報に示されている撮像素子である。ＵＳＰ５，９６５，８７５号公報に開示されている撮像素子４は、図１に示すように、複数のｐ層、ｎ層が光軸方向形成されている。このような構成にすることで、複数の波長の光３を深さ方向に分離することができる。ただし、ＵＳＰ５９６５８７５号公報に開示されている撮像素子の各ピクセルは、深さ方向に沿って、赤（Ｒ）、緑（Ｇ）、青（Ｂ）、に感度を有する。したがって、そのままこの撮像素子を用いても、目的の蛍光色素に対応する複数の蛍光を捕らえることができない。
【００１３】
そこで、撮像素子のＰ層やｎ層の厚さを最適化して検出する蛍光の波長に最適化する必要がある。たとえば、図２に示すように、この撮像素子は、３つのｐ−ｎ接合を有している。そして、それぞれの深さ方向の厚みは、蛍光色素の蛍光に最適化されている。例えば、ＣＦＰ， ＹＦＰ、ＤｓＲｅｄの３種類の蛍光色素を用いる場合は、ｐ層及びｎ層の厚みは、４７６ｎｍ， ５２９ｎｍ， ５８０ｎｍの３つの波長を深さ方向で分光できるような値となっている。この結果、各波長を効率よく捕らえることができる。
【００１４】
また、通常の顕微鏡には励起光のもれ光をカットするフィルターがもちいられているが、この撮像素子を用いた場合は、励起光の感度を有さないような位置のｐ−ｎ接合を設ければ励起光のもれ光をカットするフィルターは必ずしも必要ない。しかし、像のコントラストを非常に気にするのなら、励起光の漏れ光をカットする為のフィルターを挿入した方が励起光のもれ光の影響を撮像素子が受けないので望ましい。そうすると、よりコントラストの良い蛍光像が観察できる。
【００１５】
また、観察したい色素の蛍光以外の光、たとえば、標本の自家蛍光などををカットすると蛍光像のコントラストは向上する。そこで、像のコントラストを更に上げたい場合は、デュアルバンドフィルターを撮像素子の前に装着するとよい。例としては、ＦＲＥＴ像を観察したい場合は、ＣＦＰの蛍光波長４７６ｎｍとＹＦＰの蛍光波長５２９ｎｍの両方の波長を通し、それ以外の波長の光をカットするデュアルバンドフィルターを撮像素子の前に装着するとよい。
【００１６】
また、蛍光イメージングでよく使われる、ＧＦＰやＣＦＰ、ＹＦＰ、ＤｓＲｅｄなどの蛍光タンパクのイメージングを行う場合には、以下に示す蛍光波長を検出できなければならない。たとえば、ＧＦＰの場合は５１０ｎｍが蛍光波長のピーク、ＣＦＰの場合は４７６ｎｍが蛍光波長のピーク、ＹＦＰの場合は５２９ｎｍが蛍光波長のピーク、ＤｓＲｅｄの場合は５８０ｎｍが蛍光波長のピークである。２種類の蛍光色素を用いる場合は、上記蛍光波長を参考に設計されたデュアルバンドフィルターを用いればよい。また、３種類の蛍光色素を用いる場合は、上記蛍光波長を参考に設計されたトリプルバンドフィルターを用いればよい。例としては、３色同時に見るためにＣＦＰ， ＹＦＰ， ＤｓＲｅｄを加えて観察したい場合は、４７６ｎｍ， ５２９ｎｍ， ５８０ｎｍの３つの波長を通すトリプルバンドフィルターを装着すればよい。そうすると、測定に不必要な波長の光をカットして測定することができる。
【００１７】
また、ＧＦＰはおわんくらげのたんぱく質をもとに作成されているが、光るたんぱく質はおわんくらげ以外のタンパクからも作成することができる。このような光るたんぱく質なら何でも蛍光顕微鏡の蛍光色素として使うことができる。また、このような光るタンパク質を使わなくても、ナノクリスタルと呼ばれる量子ドットを用いて、量子ドットの発色で標本の変化を観察できる。この場合、標本でおきているＦＲＥＴの現象や、クロスコリレーションなどの分子の相関を観察することができる。この場合、目的のタンパクや、ペプチドにそれぞれ、光る波長の異なるナノクリスタルを着けてあげればよい。
【００１８】
このような撮像素子（複数のｐ層、ｎ層が光軸方向構成されていることで複数の波長の光を分離できる素子）を用い、撮像範囲全体で光量ムラや色むらがない像を撮像したい場合は、像をテレセントリックな条件で撮像素子に投影することが重要となる。つまり、像を瞳位置無限遠で撮像素子に投影させなければならない。もし、テレセントリックにならない光学系で像を撮像素子に投影すると、像の中心と周辺では素子に入射する光線の角度が異なることになる。そのため、波長ごとの深さ方向の到達距離が像位置で異なる。その結果、像にシエーディングや、光量ムラ、色むらが生じる場合がある。
【００１９】
また、撮像素子に入射する光は波長によって、光軸方向に到達する距離が異なる。そのため、光学系の色収差を素子の感度特性にあわせて最適化するのが望ましい。たとえば、先の３つの蛍光タンパクを用いた例では、４７６ｎｍの波長の光は、素子の表面近傍で光が収束するように光学系を設計する。また、５２９ｎｍの波長の光は、撮像素子の中間部に収束するように、光学系を設計する。さらに、５８０ｎｍの光は、撮像素子の深部に結像するように光学系を設計する。このように光学系を設計すると、撮像素子に到達した光を無駄なく検出することができる。
【００２０】
さらに、多波長を分離してイメージングしたい場合は、Ｐ層とｎ層の組合せを多くすれば良い。たとえば、ｐ層、ｎ層、ｐ層、ｎ層、ｐ層、ｎ層、ｐ層という構造にすれば、更に波長を細かく分けて検出できる。
【００２１】
実施例１
図３に実施例１の蛍光顕微鏡を示す。光源ＬＳからの照明光は、光路１７に沿って進み、ダイクロイックミラー２２に到達する。ダイクロイックミラー２２では所定の波長域の励起光だけが反射される。ダイクロイックミラー２２で反射した照明光は対物レンズ１６に入射し、標本１５を照明する。照明光で励起された蛍光色素は、蛍光を放射する。標本１５から放射された蛍光は、対物レンズ１６を通り、さらに、ダイクロイックミラー２２を通過する。そして、ダイクロイックミラー２２を通過した光は、ミラー１９で反射され、２０の位置に像を形成する。
【００２２】
この２０の位置には図２に示した撮像素子が配置されている。本実施例では、撮像素子はＣＦＰ、ＹＦＰ、ＤｓＲｅｄに最適化されている。撮像素子は、入射側から三層構造で構成され、１層目、入射面側は、５８０ｎｍより短い波長が到達できる厚みを設定してある。中間の層は、５２９ｎｍより短い光が到達できる厚みに設定してある。そして、最後の最も深い層は５２９ｎｍより長い光が到達する厚みとなっている。そして、それぞれの層に隣接するｐ−ｎ接合部で発生する電位変化を検出し、それから、計算を行い、各波長の光量を算出する。これを各画素ごとに行い、各波長における蛍光像の情報を得る。
【００２３】
実施例２
実施例２の蛍光顕微鏡を図４に示す。本実施例は、実施例１に特定の蛍光波長のみ通すフィルターを組み合わせたものである。フィルター２３がトリプルバンドパスフィルターを表す。
標本１５から放射された蛍光は、対物レンズ１６を通り、さらに、ダイクロイックミラー２２を通過する。そして、目的の蛍光のみを取り出すトリプルバンドパスフィルター２３に入射する。トリプルバンドパスフィルター２３では、所定の波長の蛍光のみが透過する。目的の蛍光のみを取り出すトリプルバンドパスフィルター２３を透過した蛍光は結像レンズ１８を通過し、ミラー１９で反射され、２０の位置に像を形成する。
このトリプルバンドフィルターは、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＤｓＲｅｄの蛍光波長、４７６ｎｍ， ５２９ｎｍ， ５８０ｎｍに対応するようになっている。図５が透過率を示す図である。
【００２４】
本実施例の顕微鏡は、目的の波長を取り出すトリプルバンドパスフィルターの波長を最適化すれば、ナノクリスタルと呼ばれる量子ドットを用いても、標本でおきているＦＲＥＴの現象や、クロスコリレーションなどの分子の相関を観察することができる。ここで用いるトリプルバンドフィルターは、２波長を通すデュアルバンドフィルターでも、３波長が選択できるトリプルバンドフィルターでも良い。この場合、目的のタンパクや、ペプチドにそれぞれ、光る波長の異なるナノクリスタルを着けてあげればよい。
【００２５】
実施例３
図６は蛍光顕微鏡の撮像光学系を示す図である。２５、２６は、撮像素子に入射する光線をテレセントリックにするレンズである。このようなレンズ２５、２６を有することで、撮像素子に入射する主光線を撮像素子の面と垂直にすることができる。レンズ２６から射出する主光線は射出瞳無限遠になっている。
【００２６】
本発明には以下の構成が含まれる。
（１） 標本を照明する光源と、該光源と前記標本との間に配置された第１の波長選択素子と、該第１の波長選択素子と前記標本の間に配置された対物レンズと、前記標本の像を撮像する撮像素子と、該撮像素子と前記標本との間に配置された第２の波長選択素子とを備えた蛍光顕微鏡であって、前記撮像素子が複数の波長の蛍光像を撮像でき、かつ、各ピクセル毎に波長分離が可能な撮像素子である蛍光顕微鏡。
（２） 励起光と蛍光を分離する為のダイクロイックフィルターを有する。
（３） 像をテレセントリックな条件で撮像素子に投影することができる光学系を有する。
（４） 標本にＦＲＥＴ観察をおこなう場合に必要なドナーとアクセプターを有することを特徴とする。
（５） 複数の波長の光を通す為のバンドパスフィルターを有することを特徴とする。
（６） 標本に光るたんぱく質、たとえば、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ、を用いて観察することを特徴とする。
（７） ナノクリスタルなどの光を放射する半導体でできたヒ゛ース゛を標本として用い、ＦＲＥＴ観察を行う。
（８） 撮像素子を冷却できることを特徴とする。
【００２７】
【発明の効果】
本発明の蛍光顕微鏡では、撮像素子の横方向には色ずれが生じないので、１点からの複数の波長の像が撮れる。
【図面の簡単な説明】
【図１】１つのピクセルが赤（Ｒ）、青（Ｂ）、緑（Ｇ）に感度を有する撮像素子を示す図である。
【図２】１つのピクセルが４７６ｎｍ， ５２９ｎｍ， ５８０ｎｍ感度を有する撮像素子を示す図である。
【図３】実施例１の蛍光顕微鏡の構成を示す図である。
【図４】実施例２の蛍光顕微鏡の構成を示す図である。
【図５】トリプルバンドフィルターの透過率を示す図である。
【図６】蛍光顕微鏡の撮像光学系の構成を示す図である。
【図７】従来の蛍光顕微鏡の構成を示す図である。
【符号の説明】
３ 複数の波長の光
４ 撮像素子
５ 標本
６ 対物レンズ
７ 光路
８ ダイクロイックミラー
９ 第１の撮像素子
１０ ダイクロイックミラー
１１ 光路
１２ 結像レンズ
１４ 第２の撮像素子
１５ 標本
１６ 対物レンズ、
１７ 光路
１８ 結像レンズ
１９ ミラー
２０ 像位置
２２ ダイクロイックミラー
２３ トリプルバンドパスフィルター
２５、２６ レンズ
ＬＳ 光源[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a fluorescence microscope, particularly to a fluorescence microscope that can be used for observation of FRET and measurement of cross correlation.
[0002]
[Prior art]
In observing dynamics of cell function, fluctuation of intracellular calcium ion concentration is an important factor. In order to observe the calcium ion concentration of cells in a living body using a microscope, a fluorescent indicator of one-wavelength excitation and two-wavelength photometry such as Indo-1 and Cameleon is used. For a one-wavelength excitation, two-wavelength photometric fluorescent indicator, the calcium ion concentration can be quantitatively measured without being influenced by the concentration of the fluorescent indicator itself by calculating the ratio of the fluorescence intensities of two different wavelengths. So it is used by many researchers. Cameleon is a fluorescent indicator that combines two types of fluorescent proteins.
[0003]
There is also observation using GFP (green fluorescen protein). One observation method using GFP is FRET (fluorescent resonance energy transfer), which is used by many researchers. In FRET, the fluorescence of the donor and the fluorescence of the acceptor and the brightness of the FRET light at the same position on the specimen are measured. Also when performing this experiment, there is a case where one-wavelength excitation and two-wavelength photometry are performed.
[0004]
In other words, when looking at the concentration of calcium or looking at the correlation of molecules by FRET, it is very important to perform one-wavelength excitation and two-wavelength photometry. As described above, when performing one-wavelength excitation and two-wavelength photometry using an indicator, it is necessary to perform imaging with two different wavelengths of fluorescence.
[0005]
In such a case, it is preferable that the specimen can be observed at a plurality of wavelengths simultaneously. So far, one image sensor has been mounted on a fluorescence microscope, a filter wheel having a plurality of band-pass filters having different transmission wavelength ranges has been arranged in front of the image sensor, and each of the filter wheels has been rotated by rotating the filter wheel. Fluorescent images were taken for each wavelength.
[0006]
In a configuration in which a plurality of image sensors are mounted, the fluorescence is separated by a dichroic mirror so that the fluorescence of each wavelength goes to a predetermined image sensor. FIG. 7 shows one of the conventional fluorescence microscopes, in which a plurality of image pickup devices are mounted. The illumination light from the light source LS travels along the optical path 7 and reaches the dichroic mirror 8. The dichroic mirror 8 reflects only excitation light in a predetermined wavelength range. The excitation light reflected by the dichroic mirror 8 enters the objective lens 6 and illuminates the specimen 5. The fluorescent dye excited by the excitation light emits fluorescence. The fluorescence emitted from the specimen 5 passes through the objective lens 6 and further passes through the dichroic mirror 8. Then, the light passes through the imaging lens 12 and reaches the dichroic mirror 10. The dichroic mirror 10 reflects fluorescence in a predetermined wavelength range, and transmits fluorescence in the remaining wavelength range. The fluorescent light reflected by the dichroic mirror 10 forms a fluorescent image on the first image sensor 9. On the other hand, the fluorescent light transmitted through the dichroic mirror 10 travels along the optical path 11 and forms a fluorescent image on the second image sensor 14.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
However, it is difficult to switch the bandpass filter at high speed by the method of rotating the filter wheel. Therefore, when it is desired to measure a change in calcium or a change in molecular correlation at a high speed, it takes time to switch the band-pass filter, so that there is a time lag in imaging of two fluorescent wavelengths, and there is a problem that measurement accuracy is reduced. . Further, there is a problem that the images of the two wavelengths are slightly shifted by switching the bandpass filter. Further, there are problems that vibration is generated by rotation of the filter wheel and that fluorescence of a plurality of wavelengths cannot be imaged simultaneously.
[0008]
Also, in the method using a plurality of image sensors, it is very difficult to superimpose the images of the plurality of image sensors in pixel units due to the influence of aberration and distortion of the optical system and the influence of displacement due to the attachment of the image sensors. Was. Therefore, the image intensity ratio between the two fluorescence wavelengths could not be determined accurately.
[0009]
The present invention has been made in view of the above problems, and has as its object to realize a fluorescence microscope or a spectroscopic microscope that can simultaneously capture fluorescence images of a plurality of wavelengths without switching a wavelength selection element.
[0010]
Means and action for solving the problem
In order to solve the above problem, the fluorescence microscope of the present invention includes a light source for illuminating a specimen, a first wavelength selection element disposed between the light source and the specimen, and a first wavelength selection element. An objective lens arranged between the specimens, an imaging element for capturing an image of the specimen, and a second wavelength selection element arranged between the imaging element and the specimen, wherein the imaging element The image sensor is characterized by being able to capture fluorescent images of a plurality of wavelengths and capable of wavelength separation for each pixel.
[0011]
Further, it is characterized by having a dichroic filter for separating excitation light and fluorescence.
In addition, the optical system has an optical system capable of projecting an image on an image sensor under telecentric conditions.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The fluorescence microscope according to the present embodiment uses an image sensor that can image fluorescence with a plurality of wavelengths separated by wavelength for each pixel. Here, an image pickup device capable of separating fluorescent images of a plurality of wavelengths into wavelengths and taking an image is, for example, an image pickup device disclosed in US Pat. No. 5,965,875. The imaging device 4 disclosed in US Pat. No. 5,965,875 has a plurality of p layers and n layers formed in the optical axis direction as shown in FIG. With such a configuration, the light 3 having a plurality of wavelengths can be separated in the depth direction. However, each pixel of the imaging device disclosed in US Pat. No. 5,965,875 has sensitivities to red (R), green (G), and blue (B) along the depth direction. Therefore, even if this imaging device is used as it is, it is not possible to capture a plurality of fluorescences corresponding to the target fluorescent dye.
[0013]
Therefore, it is necessary to optimize the thickness of the P layer or the n layer of the image sensor to optimize the wavelength of the fluorescence to be detected. For example, as shown in FIG. 2, this imaging device has three pn junctions. Each thickness in the depth direction is optimized for the fluorescence of the fluorescent dye. For example, when three types of fluorescent dyes of CFP, YFP, and DsRed are used, the thicknesses of the p-layer and the n-layer are such that three wavelengths of 476 nm, 529 nm, and 580 nm can be separated in the depth direction. . As a result, each wavelength can be efficiently caught.
[0014]
In addition, a filter that cuts off leakage light of excitation light is used in a normal microscope, but when this imaging device is used, a pn junction at a position that does not have sensitivity to excitation light is used. If provided, a filter for cutting the leakage light of the excitation light is not necessarily required. However, if the contrast of the image is very important, it is desirable to insert a filter for cutting off the leakage light of the excitation light because the image pickup element is not affected by the leakage light of the excitation light. Then, a fluorescent image with better contrast can be observed.
[0015]
Further, when light other than the fluorescence of the dye to be observed, for example, the autofluorescence of the specimen is cut, the contrast of the fluorescent image is improved. Therefore, when it is desired to further increase the contrast of an image, a dual band filter may be mounted in front of the image sensor. As an example, if you want to observe a FRET image, you can attach a dual band filter that passes both the CFP fluorescence wavelength of 476 nm and the YFP fluorescence wavelength of 529 nm and cuts light of other wavelengths in front of the image sensor. Good.
[0016]
When imaging a fluorescent protein such as GFP, CFP, YFP, or DsRed, which is often used in fluorescent imaging, it is necessary to detect the following fluorescent wavelengths. For example, in the case of GFP, the peak of the fluorescence wavelength is 510 nm, in the case of CFP, the peak of the fluorescence wavelength is 476 nm, in the case of YFP, the peak of the fluorescence wavelength is 529 nm, and in the case of DsRed, the peak of the fluorescence wavelength is 580 nm. When two types of fluorescent dyes are used, a dual band filter designed with reference to the above fluorescence wavelength may be used. When three kinds of fluorescent dyes are used, a triple band filter designed with reference to the above-mentioned fluorescence wavelength may be used. As an example, if it is desired to add CFP, YFP, and DsRed to observe three colors at the same time, a triple band filter that passes three wavelengths of 476 nm, 529 nm, and 580 nm may be attached. Then, it is possible to perform measurement by cutting off light having a wavelength unnecessary for measurement.
[0017]
In addition, GFP is made based on the protein of the jellyfish, but the glowing protein can also be created from a protein other than the jellyfish. Any such luminescent protein can be used as a fluorescent dye in a fluorescent microscope. In addition, even without using such a glowing protein, it is possible to observe the change of the sample by the color development of the quantum dots using quantum dots called nanocrystals. In this case, it is possible to observe the phenomenon of FRET occurring in the sample and the correlation of molecules such as cross-correlation. In this case, nanocrystals having different emission wavelengths may be attached to the target protein or peptide.
[0018]
Using such an image sensor (an element capable of separating light of a plurality of wavelengths by forming a plurality of p-layers and n-layers in the optical axis direction), an image without unevenness in light amount or color unevenness is captured over the entire imaging range. To do so, it is important to project the image onto the image sensor under telecentric conditions. That is, the image must be projected on the image sensor at the pupil position at infinity. If an image is projected on an image sensor by an optical system that does not become telecentric, the angles of light rays incident on the device differ between the center and the periphery of the image. Therefore, the reaching distance in the depth direction for each wavelength differs depending on the image position. As a result, shading, light amount unevenness, and color unevenness may occur in the image.
[0019]
In addition, the distance of light incident on the image pickup device in the optical axis direction differs depending on the wavelength. Therefore, it is desirable to optimize the chromatic aberration of the optical system in accordance with the sensitivity characteristics of the element. For example, in the example using the above three fluorescent proteins, the optical system is designed so that light having a wavelength of 476 nm converges near the surface of the element. The optical system is designed so that light having a wavelength of 529 nm converges on an intermediate portion of the image sensor. Further, the optical system is designed so that 580 nm light forms an image at a deep part of the image sensor. By designing the optical system in this way, it is possible to detect light that has reached the image sensor without waste.
[0020]
Furthermore, when it is desired to separate multiple wavelengths for imaging, the number of combinations of the P layer and the n layer may be increased. For example, if a structure such as a p-layer, an n-layer, a p-layer, an n-layer, a p-layer, an n-layer, and a p-layer is used, the wavelength can be further finely divided and detected.
[0021]
Example 1
FIG. 3 shows a fluorescence microscope of Example 1. The illumination light from the light source LS travels along the optical path 17 and reaches the dichroic mirror 22. The dichroic mirror 22 reflects only excitation light in a predetermined wavelength range. The illumination light reflected by the dichroic mirror 22 enters the objective lens 16 and illuminates the sample 15. The fluorescent dye excited by the illumination light emits fluorescence. The fluorescence emitted from the specimen 15 passes through the objective lens 16 and further passes through the dichroic mirror 22. The light that has passed through the dichroic mirror 22 is reflected by the mirror 19 and forms an image at the position 20.
[0022]
The image sensor shown in FIG. 2 is arranged at the position of 20. In the present embodiment, the imaging device is optimized for CFP, YFP, and DsRed. The image sensor has a three-layer structure from the incident side, and the thickness of the first layer and the incident surface side is set so that a wavelength shorter than 580 nm can be reached. The thickness of the intermediate layer is set so that light shorter than 529 nm can reach. The last deepest layer has a thickness that allows light longer than 529 nm to reach. Then, a change in potential generated at a pn junction adjacent to each layer is detected, and then calculation is performed to calculate the amount of light at each wavelength. This is performed for each pixel to obtain information of a fluorescent image at each wavelength.
[0023]
Example 2
FIG. 4 shows a fluorescence microscope of Example 2. This embodiment is obtained by combining the first embodiment with a filter that passes only a specific fluorescence wavelength. Filter 23 represents a triple bandpass filter.
The fluorescence emitted from the specimen 15 passes through the objective lens 16 and further passes through the dichroic mirror 22. Then, the light enters the triple bandpass filter 23 for extracting only the target fluorescence. In the triple bandpass filter 23, only the fluorescence having a predetermined wavelength is transmitted. The fluorescent light that has passed through the triple band-pass filter 23 that extracts only the target fluorescent light passes through the imaging lens 18, is reflected by the mirror 19, and forms an image at the position 20.
This triple band filter is adapted to correspond to the fluorescence wavelengths of 476 nm, 529 nm and 580 nm of CFP, YFP and DsRed. FIG. 5 shows the transmittance.
[0024]
By optimizing the wavelength of the triple bandpass filter that extracts the target wavelength, the microscope of the present embodiment can use the quantum dots called nanocrystals to prevent the phenomenon of FRET and cross-correlation occurring in the sample. The correlation of the molecules can be observed. The triple band filter used here may be a dual band filter passing two wavelengths or a triple band filter capable of selecting three wavelengths. In this case, nanocrystals having different emission wavelengths may be attached to the target protein or peptide.
[0025]
Example 3
FIG. 6 is a diagram showing an imaging optical system of the fluorescence microscope. Reference numerals 25 and 26 denote lenses that make light rays incident on the imaging element telecentric. By having such lenses 25 and 26, the principal ray incident on the image sensor can be made perpendicular to the surface of the image sensor. The principal ray emitted from the lens 26 is at an exit pupil at infinity.
[0026]
The present invention includes the following configurations.
(1) a light source for illuminating a specimen, a first wavelength selection element disposed between the light source and the specimen, an objective lens disposed between the first wavelength selection element and the specimen, What is claimed is: 1. A fluorescence microscope comprising: an image pickup device for picking up an image of the specimen; and a second wavelength selection element disposed between the image pickup device and the sample, wherein the image pickup device has a fluorescence image of a plurality of wavelengths. A fluorescence microscope, which is an image sensor capable of imaging a pixel and capable of wavelength separation for each pixel.
(2) It has a dichroic filter for separating excitation light and fluorescence.
(3) It has an optical system that can project an image on an image sensor under telecentric conditions.
(4) The sample has a donor and an acceptor necessary for performing FRET observation.
(5) It is characterized by having a band-pass filter for transmitting light of a plurality of wavelengths.
(6) The specimen is observed using a luminescent protein, for example, CFP, YFP, GFP, RFP, or DsRed.
(7) FRET observation is performed using a sample made of a semiconductor such as a nanocrystal that emits light.
(8) The imaging device can be cooled.
[0027]
【The invention's effect】
In the fluorescence microscope of the present invention, since color shift does not occur in the lateral direction of the image sensor, images of a plurality of wavelengths can be taken from one point.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram illustrating an image sensor in which one pixel has sensitivity to red (R), blue (B), and green (G).
FIG. 2 is a diagram illustrating an imaging device in which one pixel has 476 nm, 529 nm, and 580 nm sensitivity.
FIG. 3 is a diagram illustrating a configuration of a fluorescence microscope according to the first embodiment.
FIG. 4 is a diagram illustrating a configuration of a fluorescence microscope according to a second embodiment.
FIG. 5 is a diagram showing the transmittance of a triple band filter.
FIG. 6 is a diagram illustrating a configuration of an imaging optical system of a fluorescence microscope.
FIG. 7 is a diagram showing a configuration of a conventional fluorescence microscope.
[Explanation of symbols]
3 light of a plurality of wavelengths 4 image sensor 5 sample 6 objective lens 7 optical path 8 dichroic mirror 9 first image sensor 10 dichroic mirror 11 optical path 12 imaging lens 14 second image sensor 15 sample 16 objective lens
17 Optical path 18 Image forming lens 19 Mirror 20 Image position 22 Dichroic mirror 23 Triple band pass filter 25, 26 Lens LS Light source