【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質Ｈ７ＴＢＡ６２の用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多くのホルモンや神経伝達物質などの生理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプター蛋白質を通じて生体の機能を調節している。これらのレセプター蛋白質のうち多くは共役しているｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、Ｇ蛋白質と略称する場合がある）の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行ない、また、７個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっていることから、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ＧＰＣＲ）あるいは７回膜貫通型レセプター蛋白質（７ＴＭＲ）と総称される。
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存在し、それら細胞や臓器の機能を調節する分子、例えば、ホルモン、神経伝達物質および生理活性物質等の標的として生理的に重要な役割を担っている。レセプターは生理活性物質との結合を介してシグナルを細胞内に伝達し、このシグナルにより細胞の賦活や抑制といった種々の反応が惹起される。
各種生体の細胞や臓器の内の複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプター蛋白質、特にはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との関係を明らかにすることは、各種生体の細胞や臓器の機能を解明し、それら機能と密接に関連した医薬品開発に非常に重要な手段を提供することとなる。
【０００３】
例えば、生体の種々の器官では、多くのホルモン、ホルモン様物質、神経伝達物質あるいは生理活性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわれている。特に、生理活性物質は生体内の様々な部位に存在し、それぞれに対応するレセプター蛋白質を通してその生理機能の調節を行っている。生体内には未知のホルモンや神経伝達物質その他の生理活性物質も多く、それらのレセプター蛋白質の構造に関しても、これまで報告されていないものが多い。さらに、既知のレセプター蛋白質においてもサブタイプが存在するかどうかについても分かっていないものが多い。
生体における複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプター蛋白質との関係を明らかにすることは、医薬品開発に非常に重要な手段である。また、レセプター蛋白質に対するアゴニスト、アンタゴニストを効率よくスクリーニングし、医薬品を開発するためには、生体内で発現しているレセプター蛋白質の遺伝子の機能を解明し、それらを適当な発現系で発現させることが必要であった。
近年、生体内で発現している遺伝子を解析する手段として、ｃＤＮＡの配列をランダムに解析する研究が活発に行なわれており、このようにして得られたｃＤＮＡの断片配列がＥｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ（ＥＳＴ）としてデータベースに登録され、公開されている。しかし、多くのＥＳＴは配列情報のみであり、その機能を推定することは困難である。
ヒト由来のＨ７ＴＢＡ６２のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡが知られている（特許文献１）。しかしながら、これらのＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の機能およびそのリガンドは解明されていなかった。
オキシメタゾリンはパーシャル α−アドレナリン受容体アゴニスト、セロトニン５−ＨＴ１Ａ／５−ＨＴ１Ｂ受容体アゴニストであることが知られている（非特許文献１）。
【０００４】
【特許文献１】
ＥＰ ８８５９６０−Ａ２
【非特許文献１】
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｒｍａｃｏｌｏｇｙ （１９９１） ｖｏｌ．１９６ ｐｐ．２１３−２１６
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従来、Ｇ蛋白質共役型レセプターと生理活性物質（すなわち、リガンド）との結合を阻害する物質や、結合して生理活性物質（すなわち、リガンド）と同様なシグナル伝達を引き起こす物質は、これらレセプターの特異的なアンタゴニストまたはアゴニストとして、生体機能を調節する医薬品として活用されてきた。従って、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の特異的リガンドを決定することは、医薬品開発の標的ともなりうるアゴニスト、アンタゴニストを見出す際に、非常に重要な手段となる。
しかし、現時点でもなお、機能未知のＧ蛋白質共役型レセプター、また対応するリガンドが同定されていない、いわゆるオーファンレセプターが多数存在しており、Ｇ蛋白質共役型レセプターのリガンド探索および機能解明が切望されている。
Ｇ蛋白質共役型レセプターは、そのシグナル伝達作用を指標とする、新たな生理活性物質（すなわち、リガンド）の探索、また、該レセプターに対するアゴニストまたはアンタゴニストの探索に有用である。一方、生理的なリガンドが見出されなくても、該レセプターの不活化実験（ノックアウト動物）から該レセプターの生理作用を解析することにより、該レセプターに対するアゴニストまたはアンタゴニストを作製することも可能である。これら該レセプターに対するリガンド、アゴニストまたはアンタゴニストなどは、Ｇ蛋白質共役型レセプターの機能不全や機能亢進に関連する疾患の予防・治療薬や診断薬として活用することが期待できる。
さらにまた、Ｇ蛋白質共役型レセプターの遺伝子変異に基づく、生体での該レセプターの機能の低下または昂進が、何らかの疾患の原因となっている場合も多い。この場合には、該レセプターに対するアンタゴニストやアゴニストの投与だけでなく、該レセプター遺伝子の生体内（またはある特定の臓器）への導入や、該レセプター遺伝子に対するアンチセンス核酸の導入による、遺伝子治療に応用することもできる。この場合には該レセプターの塩基配列は遺伝子上の欠失や変異の有無を調べるために必要不可欠な情報であり、該レセプターの遺伝子は、該レセプターの機能不全に関与する疾患の予防・治療薬や診断薬に応用することもできる。
本発明は、機能未知のオーファンＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質Ｈ７ＴＢＡ６２に対するリガンドの決定および該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質とそのリガンドの用途に関する。すなわち、本発明は、リガンドと該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）またはその塩のスクリーニング方法、該スクリーニング用キット、該スクリーニング方法もしくはスクリーニングキットを用いて得られうるリガンドと該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）またはその塩、およびリガンドと該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）もしくは該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬などを提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ヒト由来のＨ７ＴＢＡ６２のリガンドの１つがパーシャル α−アドレナリン受容体アゴニストやセロトニン５−ＨＴ１Ａ／５−ＨＴ１Ｂ受容体アゴニストとして知られているオキシメタゾリンであることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
［１］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる血管収縮剤、セロトニン作動剤、アセチルコリン遊離促進剤、消化管運動亢進剤、平滑筋収縮剤、血小板凝集剤、中枢神経興奮剤または強心剤、
［２］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる神経作用性鼻うっ血もしくは粘膜充血の除去剤、または急性循環不全もしくは低血圧症の予防・治療剤、
［３］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる血管収縮剤、セロトニン作動剤、アセチルコリン遊離促進剤、消化管運動亢進剤、平滑筋収縮剤、血小板凝集剤、中枢神経興奮剤または強心剤、
［４］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる神経作用性鼻うっ血もしくは粘膜充血の除去剤、または急性循環不全もしくは低血圧症の予防・治療剤、
［５］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる血管収縮もしくは拡張、セロトニン作動、アセチルコリン遊離、消化管運動、平滑筋収縮、血小板凝集、中枢神経調節または強心作用異常の診断剤、
［６］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる神経作用性鼻うっ血、粘膜充血、急性循環不全、低血圧症、末梢循環障害、高血圧症、うつ病、強迫性障害、強迫神経症、パニック障害、不安障害、摂食障害、虚血性疾患、抗悪性腫瘍薬投与に伴う消化器症状、急性心筋梗塞、急性膵炎、慢性膵炎、成人呼吸促迫症候群、アルコール離脱症候群、アルツハイマー病、硬直性脊椎炎、不整脈、コカイン離脱症候群、痴呆、下痢、胃炎、肝炎、感染症、オピエート離脱症候群、骨関節炎、骨粗しょう症、骨ペーチェット症、消化性潰瘍、末梢血管症、心筋梗塞後遺症、逆流性食道炎、リウマチ関節炎、精神分裂症、敗血症、敗血症ショック、潰瘍性大腸炎または不安定狭心症の診断剤、
［７］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる血管拡張剤、血管収縮抑制剤、抗セロトニン剤、アセチルコリン遊離阻害剤、消化管運動抑制剤、平滑筋収縮抑制剤、血小板凝集阻害剤または中枢神経抑制剤、
［８］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる末梢循環障害、高血圧症、うつ病、強迫性障害、強迫神経症、パニック障害、不安障害、摂食障害、虚血性疾患、抗悪性腫瘍薬投与に伴う消化器症状、急性心筋梗塞、急性膵炎、慢性膵炎、成人呼吸促迫症候群、アルコール離脱症候群、アルツハイマー病、硬直性脊椎炎、不整脈、コカイン離脱症候群、痴呆、下痢、胃炎、肝炎、感染症、オピエート離脱症候群、骨関節炎、骨粗しょう症、骨ペーチェット症、消化性潰瘍、末梢血管症、心筋梗塞後遺症、逆流性食道炎、リウマチ関節炎、精神分裂症、敗血症、敗血症ショック、潰瘍性大腸炎または不安定狭心症の予防・治療剤、
［９］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる血管収縮もしくは拡張、セロトニン作動、アセチルコリン遊離、消化管運動、平滑筋収縮、血小板凝集、中枢神経調節または強心作用異常の診断剤、
［１０］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる神経作用性鼻うっ血、粘膜充血、急性循環不全、低血圧症、末梢循環障害、高血圧症、うつ病、強迫性障害、強迫神経症、パニック障害、不安障害、摂食障害、虚血性疾患、抗悪性腫瘍薬投与に伴う消化器症状、急性心筋梗塞、急性膵炎、慢性膵炎、成人呼吸促迫症候群、アルコール離脱症候群、アルツハイマー病、硬直性脊椎炎、不整脈、コカイン離脱症候群、痴呆、下痢、胃炎、肝炎、感染症、オピエート離脱症候群、骨関節炎、骨粗しょう症、骨ペーチェット症、消化性潰瘍、末梢血管症、心筋梗塞後遺症、逆流性食道炎、リウマチ関節炎、精神分裂症、敗血症、敗血症ショック、潰瘍性大腸炎または不安定狭心症の診断剤、
［１１］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有してなる血管拡張剤、血管収縮抑制剤、抗セロトニン剤、アセチルコリン遊離阻害剤、消化管運動抑制剤、平滑筋収縮抑制剤、血小板凝集阻害剤または中枢神経抑制剤、
［１２］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなる末梢循環障害、高血圧症、うつ病、強迫性障害、強迫神経症、パニック障害、不安障害、摂食障害、虚血性疾患、抗悪性腫瘍薬投与に伴う消化器症状、急性心筋梗塞、急性膵炎、慢性膵炎、成人呼吸促迫症候群、アルコール離脱症候群、アルツハイマー病、硬直性脊椎炎、不整脈、コカイン離脱症候群、痴呆、下痢、胃炎、肝炎、感染症、オピエート離脱症候群、骨関節炎、骨粗しょう症、骨ペーチェット症、消化性潰瘍、末梢血管症、心筋梗塞後遺症、逆流性食道炎、リウマチ関節炎、精神分裂症、敗血症、敗血症ショック、潰瘍性大腸炎または不安定狭心症の予防・治療剤、
［１３］（１）配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）オキシメタゾリンを用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩とオキシメタゾリンとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
［１４］（１）配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）オキシメタゾリンを含有することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩とオキシメタゾリンとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
［１５］上記［１３］記載のスクリーニング方法または上記［１４］記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、オキシメタゾリンと配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
［１６］上記［１５］記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
［１７］配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストを含有してなる血管収縮剤、セロトニン作動剤、アセチルコリン遊離促進剤、消化管運動亢進剤、平滑筋収縮剤、血小板凝集剤、中枢神経興奮剤または強心剤、
［１８］配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストを含有してなる神経作用性鼻うっ血もしくは粘膜充血の除去剤、または急性循環不全もしくは低血圧症の予防・治療剤、
［１９］配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニストを含有してなる血管拡張剤、血管収縮抑制剤、抗セロトニン剤、アセチルコリン遊離阻害剤、消化管運動抑制剤、平滑筋収縮抑制剤、血小板凝集阻害剤または中枢神経抑制剤、
［２０］配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニストを含有してなる末梢循環障害、高血圧症、うつ病、強迫性障害、強迫神経症、パニック障害、不安障害、摂食障害、虚血性疾患、抗悪性腫瘍薬投与に伴う消化器症状、急性心筋梗塞、急性膵炎、慢性膵炎、成人呼吸促迫症候群、アルコール離脱症候群、アルツハイマー病、硬直性脊椎炎、不整脈、コカイン離脱症候群、痴呆、下痢、胃炎、肝炎、感染症、オピエート離脱症候群、骨関節炎、骨粗しょう症、骨ペーチェット症、消化性潰瘍、末梢血管症、心筋梗塞後遺症、逆流性食道炎、リウマチ関節炎、精神分裂症、敗血症、敗血症ショック、潰瘍性大腸炎または不安定狭心症の予防・治療剤、
［２１］試験化合物を配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を測定することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストのスクリーニング方法、
［２２］（１）配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）該レセプター蛋白質またはその塩とオキシメタゾリンとの結合性を変化させる化合物またはその塩を用いることを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、
［２３］（１）配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩および（２）該レセプター蛋白質またはその塩とオキシメタゾリンとの結合性を変化させる化合物またはその塩を含有することを特徴とする該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キット、
［２４］配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストまたはアンタゴニストを含有してなる医薬、
［２５］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、当該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させ、血管収縮もしくは拡張、セロトニン作動、アセチルコリン遊離、消化管運動、平滑筋収縮、血小板凝集または中枢神経を調節する作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
［２６］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる、当該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させ、血管収縮もしくは拡張、セロトニン作動、アセチルコリン遊離、消化管運動、平滑筋収縮、血小板凝集または中枢神経を調節する作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
［２７］上記［２１］記載のスクリーニング方法または上記［２２］記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させ、血管収縮もしくは拡張、セロトニン作動、アセチルコリン遊離、消化管運動、平滑筋収縮、血小板凝集または中枢神経を調節する作用を有する化合物またはその塩、
［２８］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩を含有してなる血管収縮剤、セロトニン作動剤、アセチルコリン遊離促進剤、消化管運動亢進剤、平滑筋収縮剤、血小板凝集剤、中枢神経興奮剤または強心剤、
［２９］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる化合物またはその塩を含有してなる神経作用性鼻うっ血もしくは粘膜充血の除去剤、または急性循環不全もしくは低血圧症の予防・治療剤、
［３０］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させる化合物またはその塩を含有してなる血管拡張剤、血管収縮抑制剤、抗セロトニン剤、アセチルコリン遊離阻害剤、消化管運動抑制剤、平滑筋収縮抑制剤、血小板凝集阻害剤または中枢神経抑制剤、
［３１］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させる化合物またはその塩を含有してなる末梢循環障害、高血圧症、うつ病、強迫性障害、強迫神経症、パニック障害、不安障害、摂食障害、虚血性疾患、抗悪性腫瘍薬投与に伴う消化器症状、急性心筋梗塞、急性膵炎、慢性膵炎、成人呼吸促迫症候群、アルコール離脱症候群、アルツハイマー病、硬直性脊椎炎、不整脈、コカイン離脱症候群、痴呆、下痢、胃炎、肝炎、感染症、オピエート離脱症候群、骨関節炎、骨粗しょう症、骨ペーチェット症、消化性潰瘍、末梢血管症、心筋梗塞後遺症、逆流性食道炎、リウマチ関節炎、精神分裂症、敗血症、敗血症ショック、潰瘍性大腸炎または不安定狭心症の予防・治療剤、
［３２］オキシメタゾリンを含有してなる配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質のシグナル伝達作用増強剤、
［３３］血管収縮剤、セロトニン作動剤、アセチルコリン遊離促進剤、消化管運動亢進剤、平滑筋収縮剤、血小板凝集剤、中枢神経興奮剤または強心剤である上記［３２］記載の剤、
［３４］神経作用性鼻うっ血もしくは粘膜充血の除去剤、または急性循環不全もしくは低血圧症の予防・治療剤である上記［３２］記載の剤、
［３５］哺乳動物に対して、▲１▼配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩、▲２▼配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、または▲３▼配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストの有効量を投与することを特徴とする血管収縮方法、セロトニン作動方法、アセチルコリン遊離促進方法、消化管運動亢進方法、平滑筋収縮方法、血小板凝集方法、中枢神経興奮方法、強心方法、神経作用性鼻うっ血もしくは粘膜充血の除去方法、または急性循環不全もしくは低血圧症の予防・治療方法、
［３６］哺乳動物に対して、▲１▼配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、▲２▼配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、または▲３▼配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニストの有効量を投与することを特徴とする血管拡張方法、血管収縮抑制方法、抗セロトニン方法、アセチルコリン遊離阻害方法、消化管運動抑制方法、平滑筋収縮抑制方法、血小板凝集阻害方法、中枢神経抑制方法または末梢循環障害、高血圧症、うつ病、強迫性障害、強迫神経症、パニック障害、不安障害、摂食障害、虚血性疾患、抗悪性腫瘍薬投与に伴う消化器症状、急性心筋梗塞、急性膵炎、慢性膵炎、成人呼吸促迫症候群、アルコール離脱症候群、アルツハイマー病、硬直性脊椎炎、不整脈、コカイン離脱症候群、痴呆、下痢、胃炎、肝炎、感染症、オピエート離脱症候群、骨関節炎、骨粗しょう症、骨ペーチェット症、消化性潰瘍、末梢血管症、心筋梗塞後遺症、逆流性食道炎、リウマチ関節炎、精神分裂症、敗血症、敗血症ショック、潰瘍性大腸炎もしくは不安定狭心症の予防・治療方法、
［３７］血管収縮剤、セロトニン作動剤、アセチルコリン遊離促進剤、消化管運動亢進剤、平滑筋収縮剤、血小板凝集剤、中枢神経興奮剤、強心剤、神経作用性鼻うっ血もしくは粘膜充血の除去剤、または急性循環不全もしくは低血圧症の予防・治療剤を製造するための▲１▼配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩、▲２▼配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、または▲３▼配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアゴニストの使用、
［３８］血管拡張剤、血管収縮抑制剤、抗セロトニン剤、アセチルコリン遊離阻害剤、消化管運動抑制剤、平滑筋収縮抑制剤、血小板凝集阻害剤、中枢神経抑制剤または末梢循環障害、高血圧症、うつ病、強迫性障害、強迫神経症、パニック障害、不安障害、摂食障害、虚血性疾患、抗悪性腫瘍薬投与に伴う消化器症状、急性心筋梗塞、急性膵炎、慢性膵炎、成人呼吸促迫症候群、アルコール離脱症候群、アルツハイマー病、硬直性脊椎炎、不整脈、コカイン離脱症候群、痴呆、下痢、胃炎、肝炎、感染症、オピエート離脱症候群、骨関節炎、骨粗しょう症、骨ペーチェット症、消化性潰瘍、末梢血管症、心筋梗塞後遺症、逆流性食道炎、リウマチ関節炎、精神分裂症、敗血症、敗血症ショック、潰瘍性大腸炎もしくは不安定狭心症の予防・治療剤を製造するための▲１▼配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、▲２▼配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、または▲３▼配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するアンタゴニストの使用を提供する。
【０００７】
さらに、本発明は、
［３９］（ｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質（以下、Ｈ７ＴＢＡ６２と略記する場合もある）その部分ペプチドまたはその塩と、オキシメタゾリンとを接触させた場合と、（ｉｉ）Ｈ７ＴＢＡ６２、その部分ペプチドまたはその塩と、オキシメタゾリンおよび試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする上記［１３］記載のスクリーニング方法、
［４０］（ｉ）標識したオキシメタゾリンをＨ７ＴＢＡ６２、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、（ｉｉ）標識したオキシメタゾリンおよび試験化合物をＨ７ＴＢＡ６２、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、標識したオキシメタゾリンのＨ７ＴＢＡ６２、その部分ペプチドまたはその塩に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記［１３］記載のスクリーニング方法、
［４１］（ｉ）標識したオキシメタゾリンをＨ７ＴＢＡ６２を含有する細胞に接触させた場合と、（ｉｉ）標識したオキシメタゾリンおよび試験化合物をＨ７ＴＢＡ６２を含有する細胞に接触させた場合における、標識したオキシメタゾリンの該細胞に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記［１３］記載のスクリーニング方法、
［４２］（ｉ）標識したオキシメタゾリンをＨ７ＴＢＡ６２を含有する細胞の膜画分に接触させた場合と、（ｉｉ）標識したオキシメタゾリンおよび試験化合物をＨ７ＴＢＡ６２を含有する細胞の膜画分に接触させた場合における、標識したオキシメタゾリンの該細胞の膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記［１３］記載のスクリーニング方法、
［４３］（ｉ）標識したオキシメタゾリンを、Ｈ７ＴＢＡ６２をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換した形質転換体を培養することによって当該形質転換体の細胞膜に発現したＨ７ＴＢＡ６２に接触させた場合と、（ｉｉ）標識したオキシメタゾリンおよび試験化合物を当該質転換体の細胞膜に発現したＨ７ＴＢＡ６２に接触させた場合における、標識したオキシメタゾリンのＨ７ＴＢＡ６２に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする上記［１３］記載のスクリーニング方法、
［４４］（ｉ）Ｈ７ＴＢＡ６２を活性化する化合物をＨ７ＴＢＡ６２を含有する細胞に接触させた場合と、（ｉｉ）Ｈ７ＴＢＡ６２を活性化する化合物および試験化合物をＨ７ＴＢＡ６２を含有する細胞に接触させた場合における、Ｈ７ＴＢＡ６２を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする上記［１３］記載のスクリーニング方法、
［４５］Ｈ７ＴＢＡ６２を活性化する化合物を、Ｈ７ＴＢＡ６２をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換した形質転換体を培養することによって当該形質転換体の細胞膜に発現したＨ７ＴＢＡ６２に接触させた場合と、Ｈ７ＴＢＡ６２を活性化する化合物および試験化合物を当該形質転換体の細胞膜に発現したＨ７ＴＢＡ６２に接触させた場合における、Ｈ７ＴＢＡ６２を介する細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする上記［１３］記載のスクリーニング方法、
［４６］Ｈ７ＴＢＡ６２を活性化する化合物がオキシメタゾリンである上記［４４］または［４５］記載のスクリーニング方法、
［４７］Ｈ７ＴＢＡ６２を含有する細胞またはその膜画分を含有することを特徴とする上記［１４］記載のスクリーニング用キット、
［４８］Ｈ７ＴＢＡ６２をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換した形質転換体を培養することによって当該形質転換体の細胞膜に発現したＨ７ＴＢＡ６２を含有することを特徴とする上記［１４］記載のスクリーニング用キット、
［４９］配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、血管収縮薬、セロトニン作動薬、アセチルコリン遊離促進薬、消化管運動亢進薬、平滑筋収縮薬、血小板凝集薬、中枢神経興奮薬、強心薬、神経作用性鼻うっ血もしくは粘膜充血の除去薬、急性循環不全もしくは低血圧症の予防・治療薬、血管拡張薬、血管収縮抑制薬、抗セロトニン薬、アセチルコリン遊離阻害薬、消化管運動抑制薬、平滑筋収縮抑制薬、血小板凝集阻害薬、中枢神経抑制薬または末梢循環障害、高血圧症、うつ病、強迫性障害、強迫神経症、パニック障害、不安障害、摂食障害、虚血性疾患、抗悪性腫瘍薬投与に伴う消化器症状、急性心筋梗塞、急性膵炎、慢性膵炎、成人呼吸促迫症候群、アルコール離脱症候群、アルツハイマー病、硬直性脊椎炎、不整脈、コカイン離脱症候群、痴呆、下痢、胃炎、肝炎、感染症、オピエート離脱症候群、骨関節炎、骨粗しょう症、骨ペーチェット症、消化性潰瘍、末梢血管症、心筋梗塞後遺症、逆流性食道炎、リウマチ関節炎、精神分裂症、敗血症、敗血症ショック、潰瘍性大腸炎もしくは不安定狭心症の予防・治療薬が該レセプター蛋白質またはその塩に結合することを確認する方法、
［５０］配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、血管収縮薬、セロトニン作動薬、アセチルコリン遊離促進薬、消化管運動亢進薬、平滑筋収縮薬、血小板凝集薬、中枢神経興奮薬、強心薬、神経作用性鼻うっ血もしくは粘膜充血の除去薬、または急性循環不全もしくは低血圧症の予防・治療薬が該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストであることを確認する方法、
［５１］配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする、血管拡張薬、血管収縮抑制薬、抗セロトニン薬、アセチルコリン遊離阻害薬、消化管運動抑制薬、平滑筋収縮抑制薬、血小板凝集阻害薬、中枢神経抑制薬または末梢循環障害、高血圧症、うつ病、強迫性障害、強迫神経症、パニック障害、不安障害、摂食障害、虚血性疾患、抗悪性腫瘍薬投与に伴う消化器症状、急性心筋梗塞、急性膵炎、慢性膵炎、成人呼吸促迫症候群、アルコール離脱症候群、アルツハイマー病、硬直性脊椎炎、不整脈、コカイン離脱症候群、痴呆、下痢、胃炎、肝炎、感染症、オピエート離脱症候群、骨関節炎、骨粗しょう症、骨ペーチェット症、消化性潰瘍、末梢血管症、心筋梗塞後遺症、逆流性食道炎、リウマチ関節炎、精神分裂症、敗血症、敗血症ショック、潰瘍性大腸炎もしくは不安定狭心症の予防・治療薬が該レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニストであることを確認する方法、および
［５２］各薬を該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、各薬と該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはその塩との結合量を測定することを特徴とする上記［４９］〜［５１］記載の確認方法等を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質Ｈ７ＴＢＡ６２は、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質である。
Ｈ７ＴＢＡ６２は、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞（例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）や血球系の細胞、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来する蛋白質であってもよく、また合成蛋白質であってもよい。
【０００９】
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
本発明の配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後に記載するスクリーニング方法に従って測定することができる。
【００１０】
また、Ｈ７ＴＢＡ６２としては、ａ）配列番号：２で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｂ）配列番号：２で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｃ）配列番号：２で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｄ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。
【００１１】
本明細書においてＨ７ＴＢＡ６２は、ペプチド標記の慣例に従って、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を含有するヒトＨ７ＴＢＡ６２をはじめとするＨ７ＴＢＡ６２は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
Ｈ７ＴＢＡ６２がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものもＨ７ＴＢＡ６２に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、Ｈ７ＴＢＡ６２には、上記した蛋白質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
Ｈ７ＴＢＡ６２の具体例としては、例えば、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列からなるヒト由来のＨ７ＴＢＡ６２などが用いられる。ヒトＨ７ＴＢＡ６２はＥＰ ８８５９６０−Ａ２に記載されている公知の蛋白質である。
【００１２】
Ｈ７ＴＢＡ６２の部分ペプチド（以下、単に部分ペプチドと略記する場合がある）としては、上記したＨ７ＴＢＡ６２の部分アミノ酸配列を有するペプチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、Ｈ７ＴＢＡ６２の蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、Ｈ７ＴＢＡ６２と実質的に同質のレセプター結合活性を有するものなどが用いられる。
具体的には、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有するＨ７ＴＢＡ６２の部分ペプチドとしては、疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記した本発明のレセプター蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
実質的に同一のアミノ酸配列とは、これらアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。
ここで、「実質的に同質のレセプター活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的に同質のレセプター活性」の測定は上記と同様に行なうことができる。
【００１３】
また、本発明の部分ペプチドは、上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、本発明の部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明の部分ペプチドには、上記したＨ７ＴＢＡ６２と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン酸残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
Ｈ７ＴＢＡ６２またはその部分ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００１４】
Ｈ７ＴＢＡ６２またはその塩は、上記したヒトや哺乳動物の細胞または組織から自体公知のレセプター蛋白質の精製方法によって製造することもできるし、後に記載するＨ７ＴＢＡ６２をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後に記載する蛋白質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１５】
Ｈ７ＴＢＡ６２もしくはその部分ペプチドまたはその塩またはそのアミド体の合成には、通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質またはそのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００１６】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。
【００１７】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００１８】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００１９】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
蛋白質のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（蛋白質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いた蛋白質とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去した蛋白質とを製造し、この両蛋白質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護蛋白質を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗蛋白質を得ることができる。この粗蛋白質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の蛋白質のアミド体を得ることができる。
蛋白質のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、蛋白質のアミド体と同様にして、所望の蛋白質のエステル体を得ることができる。
【００２０】
Ｈ７ＴＢＡ６２の部分ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいはＨ７ＴＢＡ６２を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、Ｈ７ＴＢＡ６２を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下のａ）〜ｅ）に記載された方法が挙げられる。
ａ）Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ および Ｍ．Ａ． Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド シンセシス （Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）， Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９６６年）
ｂ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ ペプチド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９６５年）
ｃ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善（株） （１９７５年）
ｄ）矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 １、 蛋白質の化学ＩＶ、 ２０５、（１９７７年）
ｅ）矢島治明監修、続医薬品の開発 第１４巻 ペプチド合成 広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００２１】
Ｈ７ＴＢＡ６２をコードするポリヌクレオチドとしては、上記したＨ７ＴＢＡ６２をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、Ｈ７ＴＢＡ６２をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
Ｈ７ＴＢＡ６２をコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、公知の実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」１５（７）、１９９７に記載の方法またはそれに準じた方法により、Ｈ７ＴＢＡ６２のｍＲＮＡを定量することができる。
Ｈ７ＴＢＡ６２をコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、Ｈ７ＴＢＡ６２をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列からなるＨ７ＴＢＡ６２と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプター蛋白質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：１で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１で表わされる塩基配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２２】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， １９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列からなるヒト由来Ｈ７ＴＢＡ６２をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
Ｈ７ＴＢＡ６２をコードするＤＮＡの塩基配列の一部、または該ＤＮＡと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、下記の本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡを包含するだけではなく、ＲＮＡをも包含する意味で用いられる。
本発明に従えば、Ｈ７ＴＢＡ６２遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決定されたＨ７ＴＢＡ６２をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうしたポリヌクレオチド（核酸）は、Ｈ７ＴＢＡ６２遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいはＨ７ＴＢＡ６２関連ＲＮＡとの相互作用を介してＨ７ＴＢＡ６２遺伝子の発現を調節・制御することができる。Ｈ７ＴＢＡ６２関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、およびＨ７ＴＢＡ６２関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外でＨ７ＴＢＡ６２遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド（蛋白質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド（蛋白質）のアミノ酸を通常指している。Ｈ７ＴＢＡ６２遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳開始コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、Ｈ７ＴＢＡ６２遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
【００２３】
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、対象物と「アンチセンス」であるということができる。アンチセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシリボヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【００２４】
本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えばＪ． Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ Ｔｅｃｈ Ｊａｐａｎ， Ｖｏｌ． ８， ｐｐ．２４７， １９９２； Ｖｏｌ． ８， ｐｐ．３９５， １９９２； Ｓ． Ｔ． Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ． ｅｄ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３ などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。
【００２５】
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、上記した本発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、（１）配列番号：１で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または（２）配列番号：１で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列からなるＨ７ＴＢＡ６２と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプター蛋白質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：１で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１で表わされる塩基配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２６】
Ｈ７ＴＢＡ６２またはその部分ペプチド（以下、包括的にＨ７ＴＢＡ６２と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、Ｈ７ＴＢＡ６２の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡをＨ７ＴＢＡ６２の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ Ｅｄｔｉｏｎ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００２７】
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））などを用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法などの自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたＨ７ＴＢＡ６２をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
Ｈ７ＴＢＡ６２の発現ベクターは、例えば、（イ）Ｈ７ＴＢＡ６２をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
【００２８】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００２９】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のレセプター蛋白質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築されたＨ７ＴＢＡ６２をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００３０】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ），６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。
【００３１】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ， Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ Ｖｉｖｏ），１３，２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記）、マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞、ヒトＨＥＫ２９３細胞などが用いられる。
【００３２】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Ｇｅｎｅ），１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、Ｈ７ＴＢＡ６２をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００３３】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリル アクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ， Ｋ． Ｌ． ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ），７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ， Ｇ． Ａ． ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００３４】
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ， Ｔ．Ｃ．Ｃ．， ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２））に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外にＨ７ＴＢＡ６２を生成せしめることができる。
【００３５】
上記培養物からＨ７ＴＢＡ６２を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
Ｈ７ＴＢＡ６２を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりＨ７ＴＢＡ６２の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にＨ７ＴＢＡ６２が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるＨ７ＴＢＡ６２の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的新和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００３６】
かくして得られるＨ７ＴＢＡ６２が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するＨ７ＴＢＡ６２を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成するＨ７ＴＢＡ６２の活性は、標識したリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
【００３７】
Ｈ７ＴＢＡ６２に対する抗体は、Ｈ７ＴＢＡ６２を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
Ｈ７ＴＢＡ６２に対する抗体は、Ｈ７ＴＢＡ６２を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
【００３８】
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
Ｈ７ＴＢＡ６２は、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化レセプター蛋白質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６巻、４９５頁（１９７５年）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウイルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００３９】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、レセプター蛋白質の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したレセプター蛋白質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００４０】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００４１】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（Ｈ７ＴＢＡ６２抗原）とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物からＨ７ＴＢＡ６２に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どのようなものをどのような比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００４２】
Ｈ７ＴＢＡ６２のリガンドの１つは、パーシャル α−アドレナリン受容体アゴニストやセロトニン５−ＨＴ１Ａ／５−ＨＴ１Ｂ受容体アゴニストとして知られ、眼科用薬や点鼻用局所血管収縮薬として用いられているオキシメタゾリンである。従って、Ｈ７ＴＢＡ６２をコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、Ｈ７ＴＢＡ６２に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）、本発明のＤＮＡに対するアンチセンスＤＮＡ（以下、本発明のアンチセンスＤＮＡと略記する場合がある）は、以下の用途を有している。
【００４３】
（１）Ｈ７ＴＢＡ６２の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤
Ｈ７ＴＢＡ６２に結合するオキシメタゾリンがパーシャル α−アドレナリン受容体アゴニストまたはセロトニン５−ＨＴ１Ａ／５−ＨＴ１Ｂ受容体アゴニストであることから、Ｈ７ＴＢＡ６２は血管収縮、セロトニン作動、アセチルコリン遊離、消化管運動、平滑筋収縮、血小板凝集、中枢神経調節または強心作用に関与すると考えられる。従って、ａ）Ｈ７ＴＢＡ６２またはｂ）Ｈ７ＴＢＡ６２をコードするＤＮＡを、血管収縮剤、セロトニン作動剤、アセチルコリン遊離促進剤、消化管運動亢進剤、平滑筋収縮剤、血小板凝集剤、中枢神経興奮剤または強心剤として使用することができ、Ｈ７ＴＢＡ６２のこれらの機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤などの医薬として使用することができる。
例えば、生体内においてＨ７ＴＢＡ６２が減少しているために、リガンドの生理作用が期待できない（Ｈ７ＴＢＡ６２の欠乏症）患者がいる場合に、ａ）Ｈ７ＴＢＡ６２を該患者に投与し該レセプターの量を補充したり、ｂ）（イ）Ｈ７ＴＢＡ６２をコードするＤＮＡを該患者に投与し発現させることによって、あるいは（ロ）対象となる細胞にＨ７ＴＢＡ６２をコードするＤＮＡを挿入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植することなどによって、患者の体内における該レセプターの量を増加させ、リガンドの作用を充分に発揮させることができる。すなわち、Ｈ７ＴＢＡ６２をコードするＤＮＡは、安全で低毒性な該レセプターの機能不全、特に血管収縮、セロトニン作動、アセチルコリン遊離、消化管運動、平滑筋収縮、血小板凝集、中枢神経調節または強心作用等の不全に関連する疾患の予防および／または治療剤として有用である。
具体的には、Ｈ７ＴＢＡ６２または本発明のＤＮＡは、例えば、神経作用性鼻うっ血もしくは粘膜充血の除去剤、または急性循環不全もしくは低血圧症等の疾患の予防・治療剤などとして使用することができる。
さらに、Ｈ７ＴＢＡ６２または本発明のＤＮＡは、例えば、癌（例、前立腺癌、大腸癌など）、感染症、疼痛、拒食症、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、精神・神経障害（不安、精神分裂、そううつ、せん妄、痴呆、重症状の精神遅延および運動異常、ハンチントン舞踏病、ジル・ド・ラ・ツレット症候群）等の疾患の予防・治療剤、眼科用薬、点鼻用局所血管収縮薬などとして使用することができる。
Ｈ７ＴＢＡ６２を上記医薬として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
一方、本発明のＤＮＡを上記医薬として使用する場合は、本発明のＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
例えば、ａ）Ｈ７ＴＢＡ６２またはｂ）本発明のＤＮＡは、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、ａ）Ｈ７ＴＢＡ６２またはｂ）本発明のＤＮＡを生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００４４】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００４５】
また、上記医薬は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
Ｈ７ＴＢＡ６２の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、急性循環不全患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、急性循環不全患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のＤＮＡの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、急性循環不全患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、急性循環不全患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４６】
（２）遺伝子診断剤
本発明のＤＮＡおよびアンチセンスＤＮＡは、プローブとして使用することにより、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）におけるＨ７ＴＢＡ６２またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
本発明のＤＮＡまたはアンチセンスＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションによりＨ７ＴＢＡ６２の発現低下が検出された場合は、例えば、Ｈ７ＴＢＡ６２の機能不全、特に血管収縮、セロトニン作動、アセチルコリン遊離、消化管運動、平滑筋収縮、血小板凝集、中枢神経調節または強心作用等の不全に関連する疾患に罹患している可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、ノーザンハイブリダイゼーションによりＨ７ＴＢＡ６２の発現過多が検出された場合は、例えば、Ｈ７ＴＢＡ６２の過剰発現に起因する疾患、特に血管収縮、セロトニン作動、アセチルコリン遊離、消化管運動、平滑筋収縮、血小板凝集、中枢神経調節または強心作用等の異常亢進に関連する疾患に罹患している可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
Ｈ７ＴＢＡ６２の機能不全に関連する疾患としては、例えば、神経作用性鼻うっ血もしくは粘膜充血、または急性循環不全もしくは低血圧症などが挙げられる。
Ｈ７ＴＢＡ６２の過剰発現に起因する疾患としては、例えば、末梢循環障害、高血圧症、うつ病、強迫性障害、強迫神経症、パニック障害、不安障害、摂食障害、虚血性疾患、抗悪性腫瘍薬投与に伴う消化器症状、急性心筋梗塞、急性膵炎、慢性膵炎、成人呼吸促迫症候群、アルコール離脱症候群、アルツハイマー病、硬直性脊椎炎、不整脈、コカイン離脱症候群、痴呆、下痢、胃炎、肝炎、感染症、オピエート離脱症候群、骨関節炎、骨粗しょう症、骨ペーチェット症、消化性潰瘍、末梢血管症、心筋梗塞後遺症、逆流性食道炎、リウマチ関節炎、精神分裂症、敗血症、敗血症ショック、潰瘍性大腸炎または不安定狭心症などが挙げられる。
さらに、本発明のＤＮＡおよびアンチセンスＤＮＡは、例えば、癌（例、前立腺癌、大腸癌など）、感染症、疼痛、拒食症、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、精神・神経障害（不安、精神分裂、そううつ、せん妄、痴呆、重症状の精神遅延および運動異常、ハンチントン舞踏病、ジル・ド・ラ・ツレット症候群）等の疾患の診断剤としても使用することができる。
【００４７】
（３）Ｈ７ＴＢＡ６２の発現量を変化させる化合物を含有する医薬
本発明のＤＮＡは、プローブとして用いることにより、Ｈ７ＴＢＡ６２の発現量を変化させる化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、例えば、（ｉ）非ヒト哺乳動物のａ）血液、ｂ）特定の臓器、ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞、または（ｉｉ）形質転換体等に含まれるＨ７ＴＢＡ６２のｍＲＮＡ量を測定することによる、Ｈ７ＴＢＡ６２の発現量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００４８】
Ｈ７ＴＢＡ６２のｍＲＮＡ量の測定は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には痴呆ラット、肥満マウス、動脈硬化ウサギ、担癌マウスなど）に対して、薬剤（例えば、抗痴呆薬、血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。
得られた細胞に含まれるＨ７ＴＢＡ６２のｍＲＮＡは、例えば、通常の方法により細胞等からｍＲＮＡを抽出し、例えば、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲなどの手法を用いることにより定量することができ、自体公知の手段によりノーザンブロットを行うことにより解析することもできる。
（ｉｉ）Ｈ７ＴＢＡ６２を発現する形質転換体を上記の方法に従い作製し、該形質転換体に含まれるＨ７ＴＢＡ６２のｍＲＮＡを同様にして定量、解析することができる。
【００４９】
Ｈ７ＴＢＡ６２の発現量を変化させる化合物のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検化合物を投与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、細胞に含まれるＨ７ＴＢＡ６２のｍＲＮＡ量を定量、解析することにより行なうことができ、
（ｉｉ）形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、該形質転換体に含まれるＨ７ＴＢＡ６２のｍＲＮＡ量を定量、解析することにより行なうことができる。
【００５０】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、Ｈ７ＴＢＡ６２の発現量を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）Ｈ７ＴＢＡ６２の発現量を増加させることにより、Ｈ７ＴＢＡ６２を介する細胞刺激活性を増強させる化合物、（ロ）Ｈ７ＴＢＡ６２の発現量を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。
細胞刺激活性としては、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性などが挙げられるが、なかでも細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性などが好ましい。
該化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記スクリーニング方法で得られるＨ７ＴＢＡ６２の発現量を変化させる化合物は、Ｈ７ＴＢＡ６２の機能異常、特に血管収縮、セロトニン作動、アセチルコリン遊離、消化管運動、平滑筋収縮、血小板凝集、中枢神経調節または強心作用等の異常に関連する疾患の予防および／または治療剤、眼科用薬、点鼻用局所血管収縮薬として用いることができる。
具体的には、Ｈ７ＴＢＡ６２の発現量を増加させ、細胞刺激活性を増強させる化合物は、Ｈ７ＴＢＡ６２の機能不全に関連する疾患に対する安全で低毒性な予防・治療薬として有用である。
Ｈ７ＴＢＡ６２の発現量を減少させ、細胞刺激活性を減弱させる化合物は、Ｈ７ＴＢＡ６２の発現過多に起因する疾患に対する安全で低毒性な予防・治療薬として有用である。
Ｈ７ＴＢＡ６２の機能不全に関連する疾患としては、例えば、神経作用性鼻うっ血もしくは粘膜充血、または急性循環不全もしくは低血圧症などが挙げられる。
Ｈ７ＴＢＡ６２の過剰発現に起因する疾患としては、例えば、末梢循環障害、高血圧症、うつ病、強迫性障害、強迫神経症、パニック障害、不安障害、摂食障害、虚血性疾患、抗悪性腫瘍薬投与に伴う消化器症状、急性心筋梗塞、急性膵炎、慢性膵炎、成人呼吸促迫症候群、アルコール離脱症候群、アルツハイマー病、硬直性脊椎炎、不整脈、コカイン離脱症候群、痴呆、下痢、胃炎、肝炎、感染症、オピエート離脱症候群、骨関節炎、骨粗しょう症、骨ペーチェット症、消化性潰瘍、末梢血管症、心筋梗塞後遺症、逆流性食道炎、リウマチ関節炎、精神分裂症、敗血症、敗血症ショック、潰瘍性大腸炎または不安定狭心症などが挙げられる。
さらに、上記スクリーニング方法で得られるＨ７ＴＢＡ６２の発現量を変化させる化合物は、例えば、癌（例、前立腺癌、大腸癌など）、感染症、疼痛、拒食症、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、精神・神経障害（不安、精神分裂、そううつ、せん妄、痴呆、重症状の精神遅延および運動異常、ハンチントン舞踏病、ジル・ド・ラ・ツレット症候群）等の疾患の予防・治療剤としても使用することができる。
【００５１】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００５２】
また、上記医薬は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、急性循環不全患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、急性循環不全患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００５３】
（４）Ｈ７ＴＢＡ６２に対するリガンドの定量法および診断方法
本発明の抗体は、Ｈ７ＴＢＡ６２を特異的に認識することができるので、被検液中の該レセプターの定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化されたＨ７ＴＢＡ６２とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたＨ７ＴＢＡ６２の割合を測定することを特徴とする被検液中の該レセプターの定量法、および
（ｉｉ）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のＨ７ＴＢＡ６２の定量法を提供する。
【００５４】
上記（ｉｉ）の定量法においては、一方の抗体がＨ７ＴＢＡ６２のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が該レセプターのＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、Ｈ７ＴＢＡ６２に対するモノクローナル抗体を用いて該レセプターの定量を行うことができるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いるＨ７ＴＢＡ６２の定量法は、 特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、Ｈ７ＴＢＡ６２量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
【００５５】
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常ＧＰＣＲあるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中のＨ７ＴＢＡ６２量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
【００５６】
本発明のサンドイッチ法によるＨ７ＴＢＡ６２の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、Ｈ７ＴＢＡ６２の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、Ｈ７ＴＢＡ６２のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてＨ７ＴＢＡ６２の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ． ７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ａ））、 同書 Ｖｏｌ． ７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｂ））、 同書 Ｖｏｌ． ７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｃ））、 同書 Ｖｏｌ． ８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｄ ： Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、 同書 Ｖｏｌ． ９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｅ ： Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ））、 同書 Ｖｏｌ． １２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｉ ： Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、Ｈ７ＴＢＡ６２を感度良く定量することができる。
【００５７】
さらには、本発明の抗体を用いてＨ７ＴＢＡ６２の濃度を定量することによって、該レセプターの濃度の減少が検出された場合、例えば、Ｈ７ＴＢＡ６２の機能不全、特に中枢および末梢神経機能異常に関連する疾患に罹患している可能性が高い、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、Ｈ７ＴＢＡ６２の濃度の増加が検出された場合には、例えば、該ＧＰＣＲの過剰発現に起因する疾患に罹患している可能性が高い、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
Ｈ７ＴＢＡ６２の機能不全に関連する疾患としては、例えば、神経作用性鼻うっ血もしくは粘膜充血、または急性循環不全もしくは低血圧症などが挙げられる。
Ｈ７ＴＢＡ６２の過剰発現に起因する疾患としては、例えば、末梢循環障害、高血圧症、うつ病、強迫性障害、強迫神経症、パニック障害、不安障害、摂食障害、虚血性疾患、抗悪性腫瘍薬投与に伴う消化器症状、急性心筋梗塞、急性膵炎、慢性膵炎、成人呼吸促迫症候群、アルコール離脱症候群、アルツハイマー病、硬直性脊椎炎、不整脈、コカイン離脱症候群、痴呆、下痢、胃炎、肝炎、感染症、オピエート離脱症候群、骨関節炎、骨粗しょう症、骨ペーチェット症、消化性潰瘍、末梢血管症、心筋梗塞後遺症、逆流性食道炎、リウマチ関節炎、精神分裂症、敗血症、敗血症ショック、潰瘍性大腸炎または不安定狭心症などが挙げられる。
さらに、本発明の抗体は、例えば、癌（例、前立腺癌、大腸癌など）、感染症、疼痛、拒食症、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、精神・神経障害（不安、精神分裂、そううつ、せん妄、痴呆、重症状の精神遅延および運動異常、ハンチントン舞踏病、ジル・ド・ラ・ツレット症候群）等の疾患の診断剤としても使用することができる。
【００５８】
（５）Ｈ７ＴＢＡ６２に対するアゴニストのスクリーニング方法
オキシメタゾリンがＨ７ＴＢＡ６２に結合することによって、細胞内ｃＡＭＰの生成抑制が見られる。したがって、Ｈ７ＴＢＡ６２は、細胞内ｃＡＭＰの生成抑制活性を指標としてＨ７ＴＢＡ６２に対するオキシメタゾリン以外のアゴニスト（天然リガンドを含む）を探索し、または決定するための試薬として有用である。
すなわち、本発明は、試験化合物をＨ７ＴＢＡ６２を含有する細胞に接触させた場合における、Ｈ７ＴＢＡ６２を介した細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性を測定することを特徴とするＨ７ＴＢＡ６２に対するアゴニストの決定方法を提供する。試験化合物としては、公知のリガンド（例えば、アンギオテンシン、ボンベシン、カナビノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシン、ＰＡＣＡＰ（例、ＰＡＣＡＰ２７，ＰＡＣＡＰ３８）、セクレチン、グルカゴン、カルシトニン、アドレノメジュリン、ソマトスタチン、ＧＨＲＨ、ＣＲＦ、ＡＣＴＨ、ＧＲＰ、ＰＴＨ、ＶＩＰ（バソアクティブ インテスティナル アンド リレイテッド ポリペプチド）、ソマトスタチン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレーティッドペプチド）、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プロスタグランジン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナリン、ケモカインスーパーファミリー（例、ＩＬ−８，ＧＲＯα，ＧＲＯβ，ＧＲＯγ，ＮＡＰ−２，ＥＮＡ−７８，ＧＣＰ−２，ＰＦ４，ＩＰ−１０，Ｍｉｇ，ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１などのＣＸＣケモカインサブファミリー；ＭＣＡＦ／ＭＣＰ−１，ＭＣＰ−２，ＭＣＰ−３，ＭＣＰ−４，ｅｏｔａｘｉｎ，ＲＡＮＴＥＳ，ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β，ＨＣＣ−１，ＭＩＰ−３α／ＬＡＲＣ、ＭＩＰ−３β／ＥＬＣ，Ｉ−３０９，ＴＡＲＣ，ＭＩＰＦ−１，ＭＩＰＦ−２／ｅｏｔａｘｉｎ−２，ＭＤＣ，ＤＣ−ＣＫ１／ＰＡＲＣ，ＳＬＣなどのＣＣケモカインサブファミリー；ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎなどのＣケモカインサブファミリー；ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅなどのＣＸ３Ｃケモカインサブファミリー等）、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パンクレアティックポリペプタイド、ガラニン、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、スフィンゴシン１−リン酸など）の他に、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サルなど）の組織抽出物、細胞培養上清、低分子合成化合物などが用いられる。例えば、該組織抽出物、細胞培養上清などをＨ７ＴＢＡ６２に添加し、細胞刺激活性などを測定しながら分画し、最終的に単一のリガンドを得ることができる。
【００５９】
（６）Ｈ７ＴＢＡ６２とリガンドとの結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニストなど）のスクリーニング方法、およびＨ７ＴＢＡ６２とリガンドとの結合性を変化させる化合物を含有する医薬
Ｈ７ＴＢＡ６２を用いるか、または組換え型のＨ７ＴＢＡ６２発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることによって、Ｈ７ＴＢＡ６２に対してリガンド様活性を有するオキシメタゾリンとＨ７ＴＢＡ６２との結合性を変化させる化合物（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。
このような化合物には、（イ）Ｈ７ＴＢＡ６２を介して細胞刺激活性を有する化合物（いわゆる、Ｈ７ＴＢＡ６２に対するアゴニスト）、（ロ）該細胞刺激活性を有しない化合物（いわゆる、Ｈ７ＴＢＡ６２に対するアンタゴニスト）、（ハ）オキシメタゾリンとＨ７ＴＢＡ６２との結合力を増強する化合物、あるいは（ニ）オキシメタゾリンとＨ７ＴＢＡ６２との結合力を減少させる化合物などが含まれる。
すなわち、本発明は、（ｉ）Ｈ７ＴＢＡ６２とオキシメタゾリンとを接触させた場合と（ｉｉ）Ｈ７ＴＢＡ６２とオキシメタゾリンおよび試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするオキシメタゾリンとＨ７ＴＢＡ６２との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）と（ｉｉ）の場合における、例えば、Ｈ７ＴＢＡ６２に対するオキシメタゾリンの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較することを特徴とする。
細胞刺激活性としては、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性などが挙げられるが、なかでも細胞内ｃＡＭＰ生成抑制活性などが好ましい。
【００６０】
より具体的には、本発明は、
ａ）標識したオキシメタゾリンを、Ｈ７ＴＢＡ６２に接触させた場合と、標識したオキシメタゾリンおよび試験化合物をＨ７ＴＢＡ６２に接触させた場合における、標識したオキシメタゾリンの該レセプターに対する結合量を測定し、比較することを特徴とするオキシメタゾリンと該レセプターとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
ｂ）標識したオキシメタゾリンを、Ｈ７ＴＢＡ６２を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識したオキシメタゾリンおよび試験化合物をＨ７ＴＢＡ６２を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識したオキシメタゾリンの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするオキシメタゾリンとＨ７ＴＢＡ６２との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
ｃ）標識したオキシメタゾリンを、本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＨ７ＴＢＡ６２に接触させた場合と、標識したオキシメタゾリンおよび試験化合物を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＨ７ＴＢＡ６２に接触させた場合における、標識したオキシメタゾリンの該レセプターに対する結合量を測定し、比較することを特徴とするオキシメタゾリンと該レセプターとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
【００６１】
ｄ）Ｈ７ＴＢＡ６２を活性化する化合物（例えば、オキシメタゾリンなど）をＨ７ＴＢＡ６２を含有する細胞に接触させた場合と、Ｈ７ＴＢＡ６２を活性化する化合物および試験化合物をＨ７ＴＢＡ６２を含有する細胞に接触させた場合における、Ｈ７ＴＢＡ６２を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とするリガンドと該ＧＰＣＲとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
ｅ）Ｈ７ＴＢＡ６２を活性化する化合物（例えば、オキシメタゾリンなど）を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＨ７ＴＢＡ６２に接触させた場合と、Ｈ７ＴＢＡ６２を活性化する化合物および試験化合物を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＨ７ＴＢＡ６２に接触させた場合における、レセプターを介する細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とするリガンドとＨ７ＴＢＡ６２との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。さらに、リガンドとしては、オキシメタゾリンに代えて、オキシメタゾリンとＨ７ＴＢＡ６２との結合性を変化させる化合物またはその塩を用いることもできる。このオキシメタゾリンとＨ７ＴＢＡ６２との結合性を変化させる化合物またはその塩は、例えば、リガンドとしてオキシメタゾリンを用いて、後述する本発明のスクーニング方法を実施することによって得ることができる。以下のスクリーニング方法においては、オキシメタゾリンとＨ７ＴＢＡ６２との結合性を変化させる化合物またはその塩を含めて、単にオキシメタゾリンと表記する。
【００６２】
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いるＨ７ＴＢＡ６２としては、上記したＨ７ＴＢＡ６２を含有するものであれば何れのものであってもよいが、Ｈ７ＴＢＡ６２を含有する哺乳動物の臓器の細胞膜画分が好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させたヒト由来のＨ７ＴＢＡ６２などが適している。
Ｈ７ＴＢＡ６２を製造するには、上記の方法が用いられるが、本発明のＤＮＡを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現させることにより行なうことが好ましい。目的とする蛋白質部分をコードするＤＮＡ断片には相補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いてもよい。Ｈ７ＴＢＡ６２をコードするＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。発現したレセプターの量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、文献〔Ｎａｍｂｉ，Ｐ．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．），２６７巻，１９５５５〜１９５５９頁，１９９２年〕に記載の方法に従って行なうことができる。
したがって、本発明のスクリーニング方法において、Ｈ７ＴＢＡ６２を含有するものとしては、それ自体公知の方法に従って精製したＨ７ＴＢＡ６２であってもよいし、該レセプターを含有する細胞を用いてもよく、また該レセプターを含有する細胞の膜画分を用いてもよい。
【００６３】
本発明のスクリーニング方法において、Ｈ７ＴＢＡ６２を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。
Ｈ７ＴＢＡ６２を含有する細胞としては、該レセプターを発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが好ましい。
細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＨ７ＴＢＡ６２と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
Ｈ７ＴＢＡ６２を含有する細胞や膜画分中の該Ｈ７ＴＢＡ６２の量は、１細胞当たり１０３〜１０８分子であるのが好ましく、１０５〜１０７分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
【００６４】
オキシメタゾリンとＨ７ＴＢＡ６２との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする上記のａ）〜ｃ）を実施するためには、例えば、適当なＨ７ＴＢＡ６２画分と、標識したオキシメタゾリンが必要である。
Ｈ７ＴＢＡ６２画分としては、天然型のＨ７ＴＢＡ６２画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型該ＧＰＣＲ画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などを示す。
標識したオキシメタゾリンとしては、標識したオキシメタゾリンまたはその塩、あるいは標識したオキシメタゾリンアナログなどが用いられる。例えば〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などで標識されたオキシメタゾリンなどが用いられる。
具体的には、オキシメタゾリンとＨ７ＴＢＡ６２との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行なうには、まずＨ７ＴＢＡ６２を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することにより該ＧＰＣＲ標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどの、オキシメタゾリンとＨ７ＴＢＡ６２との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０ＴＭ（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるレセプターやリガンドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０．０１〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００〜５０００００ｃｐｍ）の標識したオキシメタゾリンを添加し、同時に１０−４Ｍ〜１０−１０Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のオキシメタゾリンを加えた反応チューブも用意する。反応は約０〜５０℃、望ましくは約４〜３７℃で、約２０分から２４時間、望ましくは約３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント（Ｂ０）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ０−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が、例えば、５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００６５】
オキシメタゾリンとＨ７ＴＢＡ６２との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする上記のｄ）〜ｅ）の方法を実施するためには、例えば、Ｈ７ＴＢＡ６２を介する細胞刺激活性を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。
具体的には、まず、Ｈ７ＴＢＡ６２を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行なうにあたっては、前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当なＨ７ＴＢＡ６２を発現した細胞が必要である。Ｈ７ＴＢＡ６２を発現した細胞としては、天然型のＨ７ＴＢＡ６２を有する細胞株、上記の組換え型のＨ７ＴＢＡ６２を発現した細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
また、試験化合物としては、Ｈ７ＴＢＡ６２の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置に基づいて、リガンド結合ポケットに結合するように設計された化合物が好ましく用いられる。Ｈ７ＴＢＡ６２の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケットの位置の測定は、公知の方法あるいはそれに準じる方法を用いて行うことができる。
オキシメタゾリンとＨ７ＴＢＡ６２との結合性を変化させる化合物がアゴニストかアンタゴニストであるかは、上記したＨ７ＴＢＡ６２に対するアゴニストのスクリーニング方法を用いて確認することができる。
【００６６】
オキシメタゾリンとＨ７ＴＢＡ６２との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、Ｈ７ＴＢＡ６２、Ｈ７ＴＢＡ６２を含有する細胞、またはＨ７ＴＢＡ６２を含有する細胞の膜画分を含有するものなどである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
ａ）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ギブコ社製）に、０．０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
ｂ）Ｈ７ＴＢＡ６２標品
Ｈ７ＴＢＡ６２を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０５個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
ｃ）標識オキシメタゾリン
市販の〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などで標識したオキシメタゾリン
水溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
ｄ）オキシメタゾリン標準液
オキシメタゾリンを０．１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
【００６７】
２．測定法
ａ）１２穴組織培養用プレートにて培養したＨ７ＴＢＡ６２発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
ｂ）１０−３〜１０−１０Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識オキシメタゾリンを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに１０−３Ｍのオキシメタゾリンを５μｌ加えておく。
ｃ）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識リガンドを０．２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
ｄ）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Ｐｅｒｃｅｎｔ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｂｉｎｄｉｎｇ（ＰＭＢ）を次の式で求める。
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ０−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Ｐｅｒｃｅｎｔ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｂｉｎｄｉｎｇ
Ｂ ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｉｎｄｉｎｇ（非特異的結合量）
Ｂ０ ：最大結合量
【００６８】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、リガンドとＨ７ＴＢＡ６２との結合性を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）Ｈ７ＴＢＡ６２を介して細胞刺激活性を有する化合物（いわゆる、Ｈ７ＴＢＡ６２に対するアゴニスト）、（ロ）該細胞刺激活性を有しない化合物（いわゆる、Ｈ７ＴＢＡ６２に対するアンタゴニスト）、（ハ）リガンドとＨ７ＴＢＡ６２との結合力を増強する化合物、あるいは（ニ）リガンドとＨ７ＴＢＡ６２との結合力を減少させる化合物である。
該化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
Ｈ７ＴＢＡ６２に対するアゴニストは、Ｈ７ＴＢＡ６２に対してリガンド様活性を有するオキシメタゾリンと同様の生理活性を有しているので、Ｈ７ＴＢＡ６２のリガンドが有する生理活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。Ｈ７ＴＢＡ６２に対するアンタゴニストは、Ｈ７ＴＢＡ６２に対するリガンドの生理活性を抑制することができるので、Ｈ７ＴＢＡ６２リガンドの生理活性を抑制するための安全で低毒性な医薬として有用である。
オキシメタゾリンとＨ７ＴＢＡ６２との結合力を増強する化合物は、Ｈ７ＴＢＡ６２に対するリガンドが有する生理活性を増強することができるので、Ｈ７ＴＢＡ６２リガンドが有する生理活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。
オキシメタゾリンとＨ７ＴＢＡ６２との結合力を減少させる化合物は、Ｈ７ＴＢＡ６２に対するリガンドの生理活性を減少させることができるので、Ｈ７ＴＢＡ６２リガンドの生理活性を抑制するための安全で低毒性な医薬として有用である。
具体的には、本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる▲１▼Ｈ７ＴＢＡ６２に対するアゴニストまたは▲２▼オキシメタゾリンとＨ７ＴＢＡ６２との結合力を増強する化合物またはその塩は、血管収縮剤、セロトニン作動剤、アセチルコリン遊離促進剤、消化管運動亢進剤、平滑筋収縮剤、血小板凝集剤、中枢神経興奮剤または強心剤として使用することができる。具体的には、それらの化合物またはその塩は、例えば、神経作用性鼻うっ血もしくは粘膜充血の除去剤、または急性循環不全もしくは低血圧症の予防・治療剤、眼科用薬、点鼻用局所血管収縮薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる▲１▼Ｈ７ＴＢＡ６２に対するアンタゴニストまたは▲２▼オキシメタゾリンとＨ７ＴＢＡ６２との結合力を減少させる化合物またはその塩は、血管拡張剤、血管収縮抑制剤、抗セロトニン剤、アセチルコリン遊離阻害剤、消化管運動抑制剤、平滑筋収縮抑制剤、血小板凝集阻害剤または中枢神経抑制剤として使用することができる。具体的には、それらの化合物またはその塩は、例えば、末梢循環障害、高血圧症、うつ病、強迫性障害、強迫神経症、パニック障害、不安障害、摂食障害、虚血性疾患、抗悪性腫瘍薬投与に伴う消化器症状、急性心筋梗塞、急性膵炎、慢性膵炎、成人呼吸促迫症候群、アルコール離脱症候群、アルツハイマー病、硬直性脊椎炎、不整脈、コカイン離脱症候群、痴呆、下痢、胃炎、肝炎、感染症、オピエート離脱症候群、骨関節炎、骨粗しょう症、骨ペーチェット症、消化性潰瘍、末梢血管症、心筋梗塞後遺症、逆流性食道炎、リウマチ関節炎、精神分裂症、敗血症、敗血症ショック、潰瘍性大腸炎または不安定狭心症の予防・治療剤として有用である。
さらに、本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、癌（例、前立腺癌、大腸癌など）、感染症、疼痛、拒食症、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、精神・神経障害（不安、精神分裂、そううつ、せん妄、痴呆、重症状の精神遅延および運動異常、ハンチントン舞踏病、ジル・ド・ラ・ツレット症候群）等の疾患の予防・治療剤などとして有用である。
【００６９】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上記の医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００７０】
また、上記医薬は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、急性循環不全患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、急性循環不全患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００７１】
（７）各種薬物の作用メカニズムの解明方法
Ｈ７ＴＢＡ６２を用いることによって、各種薬物がＨ７ＴＢＡ６２を介して薬理効果を発揮しているか否かを確認することができる。
すなわち、本発明は、
（１）Ｈ７ＴＢＡ６２を用いることを特徴とする、（ｉ）血管収縮薬、（ｉｉ）セロトニン作動薬、（ｉｉｉ）アセチルコリン遊離促進薬、（ｉｖ）消化管運動亢進薬、（ｖ）平滑筋収縮薬、（ｖｉ）血小板凝集薬、（ｖｉｉ）中枢神経興奮薬、（ｖｉｉｉ）強心薬、（ｉｘ）神経作用性鼻うっ血もしくは粘膜充血の除去薬、（ｘ）急性循環不全もしくは低血圧症の予防・治療薬、（ｘｉ）眼科用薬、（ｘｉｉ）点鼻用局所血管収縮薬、（ｘｉｉｉ）血管拡張薬、（ｘｉｖ）血管収縮抑制薬、（ｘｖ）抗セロトニン薬、（ｘｖｉ）アセチルコリン遊離阻害薬、（ｘｖｉｉ）消化管運動抑制薬、（ｘｖｉｉｉ）平滑筋収縮抑制薬、（ｘｉｘ）血小板凝集阻害薬、（ｘｘ）中枢神経抑制薬または（ｘｘｉ）末梢循環障害、高血圧症、うつ病、強迫性障害、強迫神経症、パニック障害、不安障害、摂食障害、虚血性疾患、抗悪性腫瘍薬投与に伴う消化器症状、急性心筋梗塞、急性膵炎、慢性膵炎、成人呼吸促迫症候群、アルコール離脱症候群、アルツハイマー病、硬直性脊椎炎、不整脈、コカイン離脱症候群、痴呆、下痢、胃炎、肝炎、感染症、オピエート離脱症候群、骨関節炎、骨粗しょう症、骨ペーチェット症、消化性潰瘍、末梢血管症、心筋梗塞後遺症、逆流性食道炎、リウマチ関節炎、精神分裂症、敗血症、敗血症ショック、潰瘍性大腸炎もしくは不安定狭心症の予防・治療薬が該レセプター蛋白質またはその塩に結合することを確認する方法、
（２）Ｈ７ＴＢＡ６２を用いることを特徴とする、（ｉ）血管収縮薬、（ｉｉ）セロトニン作動薬、（ｉｉｉ）アセチルコリン遊離促進薬、（ｉｖ）消化管運動亢進薬、（ｖ）平滑筋収縮薬、（ｖｉ）血小板凝集薬、（ｖｉｉ）中枢神経興奮薬、（ｖｉｉｉ）強心薬、（ｉｘ）神経作用性鼻うっ血もしくは粘膜充血の除去薬、（ｘ）急性循環不全もしくは低血圧症の予防・治療薬、（ｘｉ）眼科用薬または（ｘｉｉ）点鼻用局所血管収縮薬が該レセプター蛋白質またはその塩に対するアゴニストであることを確認する方法、
（３）Ｈ７ＴＢＡ６２を用いることを特徴とする、（ｉ）血管拡張薬、（ｉｉ）血管収縮抑制薬、（ｉｉｉ）抗セロトニン薬、（ｉｖ）アセチルコリン遊離阻害薬、（ｖ）消化管運動抑制薬、（ｖｉ）平滑筋収縮抑制薬、（ｖｉｉ）血小板凝集阻害薬、（ｖｉｉｉ）中枢神経抑制薬または（ｉｘ）末梢循環障害、高血圧症、うつ病、強迫性障害、強迫神経症、パニック障害、不安障害、摂食障害、虚血性疾患、抗悪性腫瘍薬投与に伴う消化器症状、急性心筋梗塞、急性膵炎、慢性膵炎、成人呼吸促迫症候群、アルコール離脱症候群、アルツハイマー病、硬直性脊椎炎、不整脈、コカイン離脱症候群、痴呆、下痢、胃炎、肝炎、感染症、オピエート離脱症候群、骨関節炎、骨粗しょう症、骨ペーチェット症、消化性潰瘍、末梢血管症、心筋梗塞後遺症、逆流性食道炎、リウマチ関節炎、精神分裂症、敗血症、敗血症ショック、潰瘍性大腸炎もしくは不安定狭心症の予防・治療薬が該レセプター蛋白質またはその塩に対するアンタゴニストであることを確認する方法、
（４）各薬をＨ７ＴＢＡ６２に接触させた場合における、各薬とＨ７ＴＢＡ６２との結合量を測定することを特徴とする上記（１）〜（３）記載のスクリーニング方法を提供する。
さらに、薬物としては、例えば、癌（例、前立腺癌、大腸癌など）、感染症、疼痛、拒食症、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、精神・神経障害（不安、精神分裂、そううつ、せん妄、痴呆、重症状の精神遅延および運動異常、ハンチントン舞踏病、ジル・ド・ラ・ツレット症候群）等の疾患の予防・治療薬などを使用することもできる。
この確認方法は、前記したオキシメタゾリンとＨ７ＴＢＡ６２との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法において、試験化合物に代えて、上記の薬物を使用することによって実施することができる。
また、本発明の確認方法用キットは、前記したリガンドとＨ７ＴＢＡ６２との結合性を変化させる化合物のスクリーニング用キットにおいて、試験化合物に代えて、上記の薬物を含有するものである。
このように、本発明の確認方法を用いることによって、市販または開発途中の各種薬物がＨ７ＴＢＡ６２を介して薬理効果を発揮していることを確認することができる。
【００７２】
（８）細胞膜におけるＨ７ＴＢＡ６２またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物を含有する医薬
本発明の抗体は、Ｈ７ＴＢＡ６２を特異的に認識することができるので、細胞膜におけるＨ７ＴＢＡ６２の量を変化させる化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち本発明は、例えば、
（ｉ）非ヒト哺乳動物のａ）血液、ｂ）特定の臓器、ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれるＨ７ＴＢＡ６２を定量することによる、細胞膜におけるＨ７ＴＢＡ６２の量を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｉｉ）Ｈ７ＴＢＡ６２を発現する形質転換体等を破壊した後、細胞膜画分を単離し、細胞膜画分に含まれるＨ７ＴＢＡ６２を定量することによる、細胞膜におけるＨ７ＴＢＡ６２の量を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ｉｉｉ）非ヒト哺乳動物のａ）血液、ｂ）特定の臓器、ｃ）臓器から単離した組織もしくは細胞等を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層での該レセプター蛋白質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該蛋白質を確認することによる、細胞膜におけるＨ７ＴＢＡ６２の量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
（ｉｖ）Ｈ７ＴＢＡ６２を発現する形質転換体等を切片とした後、免疫染色法を用いることにより、細胞表層での該レセプター蛋白質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該蛋白質を確認することによる、細胞膜におけるＨ７ＴＢＡ６２の量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００７３】
細胞膜画分に含まれるＨ７ＴＢＡ６２の定量は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には痴呆ラット、肥満マウス、動脈硬化ウサギ、担癌マウスなど）に対して、薬剤（例えば、抗痴呆薬、血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。得られた臓器、組織または細胞等を、例えば、適当な緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ヘペス緩衝液など）等に懸濁し、臓器、組織あるいは細胞を破壊し、界面活性剤（例えば、トリトンＸ１００ＴＭ、ツイーン２０ＴＭなど）などを用い、さらに遠心分離や濾過、カラム分画などの手法を用いて細胞膜画分を得る。
細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＨ７ＴＢＡ６２と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
細胞膜画分に含まれるＨ７ＴＢＡ６２は、例えば、本発明の抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法、ウエスタンブロット解析などにより定量することができる。
かかるサンドイッチ免疫測定法は上記の方法と同様にして行なうことができ、ウエスタンブロットは自体公知の手段により行なうことができる。
（ｉｉ）Ｈ７ＴＢＡ６２を発現する形質転換体を上記の方法に従い作製し、細胞膜画分に含まれるＨ７ＴＢＡ６２を定量することができる。
【００７４】
細胞膜におけるＨ７ＴＢＡ６２の量を変化させる化合物のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検化合物を投与し、投与後一定時間経過後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、細胞膜におけるＨ７ＴＢＡ６２の量を定量することにより行なうことができ、
（ｉｉ）形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、細胞膜におけるＨ７ＴＢＡ６２の量を定量することにより行なうことができる。
細胞膜画分に含まれるＨ７ＴＢＡ６２の確認は具体的には以下のようにして行なう。
（ｉｉｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、より具体的には痴呆ラット、肥満マウス、動脈硬化ウサギ、担癌マウスなど）に対して、薬剤（例えば、抗痴呆薬、血圧低下薬、抗癌剤、抗肥満薬など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、または臓器から単離した組織、あるいは細胞を得る。得られた臓器、組織または細胞等を、常法に従い組織切片とし、本発明の抗体を用いて免疫染色を行う。細胞表層での該レセプター蛋白質の染色度合いを定量化することにより、細胞膜上の該蛋白質を確認することにより、定量的または定性的に、細胞膜におけるＨ７ＴＢＡ６２の量を確認することができる。
（ｉｖ）Ｈ７ＴＢＡ６２を発現する形質転換体等を用いて同様の手段をとることにより確認することもできる。
【００７５】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、細胞膜におけるＨ７ＴＢＡ６２の量を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）細胞膜におけるＨ７ＴＢＡ６２の量を増加させることにより、該Ｇ蛋白質共役型レセプターを介する細胞刺激活性を増強させる化合物、（ロ）細胞膜におけるＨ７ＴＢＡ６２の量を減少させることにより、該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。
該化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
細胞膜におけるＨ７ＴＢＡ６２の量を増加させることにより、細胞刺激活性を増強させる化合物は、Ｈ７ＴＢＡ６２の機能不全に関連する疾患に対する安全で低毒性な予防・治療薬として有用である。
細胞膜におけるＨ７ＴＢＡ６２の量を減少させることにより、細胞刺激活性を減弱させる化合物は、Ｈ７ＴＢＡ６２の発現過多に起因する疾患に対する安全で低毒性な予防・治療薬として有用である。
具体的には、Ｈ７ＴＢＡ６２の量を増加する化合物またはその塩は、血管収縮剤、セロトニン作動剤、アセチルコリン遊離促進剤、消化管運動亢進剤、平滑筋収縮剤、血小板凝集剤、中枢神経興奮剤または強心剤として使用することができる。具体的には、それらの化合物またはその塩は、例えば、神経作用性鼻うっ血もしくは粘膜充血の除去剤、または急性循環不全もしくは低血圧症の予防・治療剤、眼科用薬、点鼻用局所血管収縮薬として有用である。
細胞膜におけるＨ７ＴＢＡ６２の量を減少させる化合物またはその塩は、血管拡張剤、血管収縮抑制剤、抗セロトニン剤、アセチルコリン遊離阻害剤、消化管運動抑制剤、平滑筋収縮抑制剤、血小板凝集阻害剤または中枢神経抑制剤として使用することができる。具体的には、それらの化合物またはその塩は、例えば、末梢循環障害、高血圧症、うつ病、強迫性障害、強迫神経症、パニック障害、不安障害、摂食障害、虚血性疾患、抗悪性腫瘍薬投与に伴う消化器症状、急性心筋梗塞、急性膵炎、慢性膵炎、成人呼吸促迫症候群、アルコール離脱症候群、アルツハイマー病、硬直性脊椎炎、不整脈、コカイン離脱症候群、痴呆、下痢、胃炎、肝炎、感染症、オピエート離脱症候群、骨関節炎、骨粗しょう症、骨ペーチェット症、消化性潰瘍、末梢血管症、心筋梗塞後遺症、逆流性食道炎、リウマチ関節炎、精神分裂症、敗血症、敗血症ショック、潰瘍性大腸炎または不安定狭心症の予防・治療剤として有用である。
さらに、細胞膜におけるＨ７ＴＢＡ６２の量を変化させる化合物またはその塩は、例えば、癌（例、前立腺癌、大腸癌など）、感染症、疼痛、拒食症、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、精神・神経障害（不安、精神分裂、そううつ、せん妄、痴呆、重症状の精神遅延および運動異常、ハンチントン舞踏病、ジル・ド・ラ・ツレット症候群）等の疾患の予防・治療剤などとして有用である。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、該化合物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００７６】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、上記予防・治療薬は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、急性循環不全患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、急性循環不全患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００７７】
（９）Ｈ７ＴＢＡ６２に対する抗体を含有してなる医薬
Ｈ７ＴＢＡ６２に対する抗体の中和活性とは、該レセプターの関与するシグナル伝達機能を不活性化する活性を意味する。従って、該抗体が中和活性を有する場合は、該レセプターの関与するシグナル伝達、例えば、該レセプターを介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を不活性化することができる。
したがって、Ｈ７ＴＢＡ６２に対する抗体（例、中和抗体）は、該レセプターの過剰発現などに起因する疾患（例えば、末梢循環障害、高血圧症、うつ病、強迫性障害、強迫神経症、パニック障害、不安障害、摂食障害、虚血性疾患、抗悪性腫瘍薬投与に伴う消化器症状、急性心筋梗塞、急性膵炎、慢性膵炎、成人呼吸促迫症候群、アルコール離脱症候群、アルツハイマー病、硬直性脊椎炎、不整脈、コカイン離脱症候群、痴呆、下痢、胃炎、肝炎、感染症、オピエート離脱症候群、骨関節炎、骨粗しょう症、骨ペーチェット症、消化性潰瘍、末梢血管症、心筋梗塞後遺症、逆流性食道炎、リウマチ関節炎、精神分裂症、敗血症、敗血症ショック、潰瘍性大腸炎または不安定狭心症などの疾患）の予防・治療薬として用いることができる。
さらに、Ｈ７ＴＢＡ６２に対する抗体は、例えば、癌（例、前立腺癌、大腸癌など）、感染症、疼痛、拒食症、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、精神・神経障害（不安、精神分裂、そううつ、せん妄、痴呆、重症状の精神遅延および運動異常、ハンチントン舞踏病、ジル・ド・ラ・ツレット症候群）等の疾患の予防・治療剤などとして使用することもできる。
【００７８】
（１０）本発明のアンチセンスＤＮＡを含有してなる医薬
本発明のアンチセンスＤＮＡは、Ｈ７ＴＢＡ６２の過剰発現などに起因する疾患（例えば、末梢循環障害、高血圧症、うつ病、強迫性障害、強迫神経症、パニック障害、不安障害、摂食障害、虚血性疾患、抗悪性腫瘍薬投与に伴う消化器症状、急性心筋梗塞、急性膵炎、慢性膵炎、成人呼吸促迫症候群、アルコール離脱症候群、アルツハイマー病、硬直性脊椎炎、不整脈、コカイン離脱症候群、痴呆、下痢、胃炎、肝炎、感染症、オピエート離脱症候群、骨関節炎、骨粗しょう症、骨ペーチェット症、消化性潰瘍、末梢血管症、心筋梗塞後遺症、逆流性食道炎、リウマチ関節炎、精神分裂症、敗血症、敗血症ショック、潰瘍性大腸炎または不安定狭心症などの疾患）の予防・治療薬として用いることができる。
さらに、本発明のアンチセンスＤＮＡは、例えば、癌（例、前立腺癌、大腸癌など）、感染症、疼痛、拒食症、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、精神・神経障害（不安、精神分裂、そううつ、せん妄、痴呆、重症状の精神遅延および運動異常、ハンチントン舞踏病、ジル・ド・ラ・ツレット症候群）等の疾患の予防・治療剤などとして使用することもできる。
例えば、該アンチセンスＤＮＡを用いる場合、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
【００７９】
（１１）本発明のＤＮＡ導入動物の作製
本発明は、外来性の本発明のＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
〔１〕本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
〔２〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔１〕記載の動物、
〔３〕ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第〔２〕記載の動物、および
〔４〕本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
【００８０】
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常なＨ７ＴＢＡ６２を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常なＨ７ＴＢＡ６２の機能を抑制するレセプターを発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
【００８１】
Ｈ７ＴＢＡ６２の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、▲１▼ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、▲２▼各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性蛋白質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存蛋白質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン三リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎蛋白質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネーターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネーターなどが用いられる。
【００８２】
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流 に連結することも目的により可能である。
正常なＨ７ＴＢＡ６２の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なＨ７ＴＢＡ６２の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
【００８３】
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的にＨ７ＴＢＡ６２の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、Ｈ７ＴＢＡ６２の機能亢進症や、Ｈ７ＴＢＡ６２が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離したＨ７ＴＢＡ６２の増加症状を有することから、Ｈ７ＴＢＡ６２に関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
【００８４】
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的にＨ７ＴＢＡ６２の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、Ｈ７ＴＢＡ６２の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、Ｈ７ＴＢＡ６２の機能不活性型不応症における本発明の異常ＧＰＣＲによる正常ＧＰＣＲの機能阻害（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離したＨ７ＴＢＡ６２の増加症状を有することから、Ｈ７ＴＢＡ６２の機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
▲１▼組織培養のための細胞源としての使用、
▲２▼本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたＨ７ＴＢＡ６２を分析することによる、Ｈ７ＴＢＡ６２により特異的に発現あるいは活性化するＨ７ＴＢＡ６２との関連性についての解析、
▲３▼ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
▲４▼上記▲３▼記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
▲５▼本発明の変異ＧＰＣＲを単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、Ｈ７ＴＢＡ６２の機能不活性型不応症などを含む、Ｈ７ＴＢＡ６２に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、Ｈ７ＴＢＡ６２に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどの蛋白質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、Ｈ７ＴＢＡ６２産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、Ｈ７ＴＢＡ６２およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、Ｈ７ＴＢＡ６２の機能不活性型不応症を含む、Ｈ７ＴＢＡ６２に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、Ｈ７ＴＢＡ６２が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
【００８５】
（１２）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
〔１〕本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
〔２〕該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔３〕ネオマイシン耐性である第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔４〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔１〕項記載の胚幹細胞、
〔５〕ゲッ歯動物がマウスである第〔４〕項記載の胚幹細胞、
〔６〕本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
〔７〕該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第〔６〕項記載の非ヒト哺乳動物、
〔８〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔６〕項記載の非ヒト哺乳動物、
〔９〕ゲッ歯動物がマウスである第〔８〕項記載の非ヒト哺乳動物、および
〔１０〕第〔７〕項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしているＨ７ＴＢＡ６２の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的にＨ７ＴＢＡ６２の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
【００８６】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知 ＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
【００８７】
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１〜１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０．００１〜０．５％トリプシン／０．１〜５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０．１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔Ｍ． Ｊ． Ｅｖａｎｓ及びＭ． Ｈ． Ｋａｕｆｍａｎ， ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２９２巻、１５４頁、１９８１年；Ｇ． Ｒ． Ｍａｒｔｉｎ プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．）第７８巻、７６３４頁、１９８１年；Ｔ． Ｃ． Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第８７巻、２７頁、１９８５年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおけるＨ７ＴＢＡ６２またはＨ７ＴＢＡ６２の細胞生物学的検討において有用である。
【００８８】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、Ｈ７ＴＢＡ６２のヘテロ発現不全個体であり、Ｈ７ＴＢＡ６２のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔からＨ７ＴＢＡ６２のホモ発現不全個体を得ることができる。
【００８９】
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、Ｈ７ＴＢＡ６２により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、Ｈ７ＴＢＡ６２の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【００９０】
（１２ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【００９１】
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の血糖値が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上低下した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、Ｈ７ＴＢＡ６２の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患（例えば、血管収縮、セロトニン作動、アセチルコリン遊離、消化管運動、平滑筋収縮、血小板凝集、中枢神経調節または強心作用などの機能不全に起因する疾患（例えば、神経作用性鼻うっ血、粘膜充血、急性循環不全、低血圧症など））に対する安全で低毒性な治療・予防剤、眼科用薬、点鼻用局所血管収縮薬などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
さらに、該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、例えば、癌（例、前立腺癌、大腸癌など）、感染症、疼痛、拒食症、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、精神・神経障害（不安、精神分裂、そううつ、せん妄、痴呆、重症状の精神遅延および運動異常、ハンチントン舞踏病、ジル・ド・ラ・ツレット症候群）等の疾患の予防・治療剤などとして使用することもできる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記したＨ７ＴＢＡ６２とリガンドとの結合性を変化させる化合物を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に例えば、急性循環不全患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、急性循環不全患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００９２】
（１２ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、Ｈ７ＴＢＡ６２をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、Ｈ７ＴＢＡ６２の発現する組織で、Ｈ７ＴＢＡ６２の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便にＨ７ＴＢＡ６２の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、Ｈ７ＴＢＡ６２欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【００９３】
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、Ｈ７ＴＢＡ６２の発現を促進し、該レセプターの機能を促進することができるので、例えば、Ｈ７ＴＢＡ６２の機能不全に関連する疾患などの予防・治療薬、眼科用薬、点鼻用局所血管収縮薬などの医薬として有用である。
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、Ｈ７ＴＢＡ６２の発現を阻害し、該レセプターの機能を阻害することができるので、例えば、Ｈ７ＴＢＡ６２の発現過多に関連する疾患などの予防・治療薬などの医薬として有用である。
Ｈ７ＴＢＡ６２の機能不全に関連する疾患としては、例えば、神経作用性鼻うっ血、粘膜充血、急性循環不全、低血圧症などが挙げられる。
Ｈ７ＴＢＡ６２の過剰発現に起因する疾患としては、例えば、末梢循環障害、高血圧症、うつ病、強迫性障害、強迫神経症、パニック障害、不安障害、摂食障害、虚血性疾患、抗悪性腫瘍薬投与に伴う消化器症状、急性心筋梗塞、急性膵炎、慢性膵炎、成人呼吸促迫症候群、アルコール離脱症候群、アルツハイマー病、硬直性脊椎炎、不整脈、コカイン離脱症候群、痴呆、下痢、胃炎、肝炎、感染症、オピエート離脱症候群、骨関節炎、骨粗しょう症、骨ペーチェット症、消化性潰瘍、末梢血管症、心筋梗塞後遺症、逆流性食道炎、リウマチ関節炎、精神分裂症、敗血症、敗血症ショック、潰瘍性大腸炎または不安定狭心症などが挙げられる。
さらに、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩は、例えば、癌（例、前立腺癌、大腸癌など）、感染症、疼痛、拒食症、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、精神・神経障害（不安、精神分裂、そううつ、せん妄、痴呆、重症状の精神遅延および運動異常、ハンチントン舞踏病、ジル・ド・ラ・ツレット症候群）等の疾患の予防・治療剤などとして使用することもできる。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【００９４】
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記したＨ７ＴＢＡ６２またはその塩とリガンドとの結合性を変化させる化合物を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に例えば、急性循環不全患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、急性循環不全患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、Ｈ７ＴＢＡ６２のプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々の蛋白質をコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのレセプターを合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、Ｈ７ＴＢＡ６２そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
【００９５】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
【００９６】
Ｇｌｙ ：グリシン
Ａｌａ ：アラニン
Ｖａｌ ：バリン
Ｌｅｕ ：ロイシン
Ｉｌｅ ：イソロイシン
Ｓｅｒ ：セリン
Ｔｈｒ ：スレオニン
Ｃｙｓ ：システイン
Ｍｅｔ ：メチオニン
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ａｓｐ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ ：リジン
Ａｒｇ ：アルギニン
Ｈｉｓ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ ：チロシン
Ｔｒｐ ：トリプトファン
Ｐｒｏ ：プロリン
Ａｓｎ ：アスパラギン
Ｇｌｎ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
＊ ：終止コドンに対応する
Ｍｅ ：メチル基
Ｅｔ ：エチル基
Ｂｕ ：ブチル基
Ｐｈ ：フェニル基
ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
【００９７】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ ：ホルミル
Ｂｚｌ ：ベンジル
Ｃｌ２Ｂｚｌ ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル
Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ ：ジニトロフェノール
Ｔｒｔ ：トリチル
Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ ：３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−
１，２，３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ ：１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド
ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
【００９８】
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
配列番号：１
ヒト由来Ｈ７ＴＢＡ６２をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：２
ヒト由来Ｈ７ＴＢＡ６２のアミノ酸配列を示す。
配列番号：３
実施例３におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：４
実施例３におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号：５
実施例３におけるＰＣＲ反応で使用したプローブの塩基配列を示す。
【００９９】
【実施例】
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作は、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ）に記載されている方法に従った。
【０１００】
実施例１ Ｈ７ＴＢＡ６２を一過的に発現させたＨＥＫ２９３細胞におけるレポーター遺伝子の発現に及ぼすオキシメタゾリンの効果
動物細胞用発現プラスミドベクターｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， Ｈｉｎｕｍａ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． １２１９巻、２５１−２５９頁、１９９４年記載のｐＡＫＫＯ−１．１１Ｈと同一のプラスミドベクター）に公知の方法によってＨ７ＴＢＡ６２ｃＤＮＡを挿入して作製した発現ベクタープラスミドｐＡＫ−Ｈ７ＴＢＡ６２および特定の遺伝子を挿入していないもとのｐＡＫＫＯ−１１１Ｈを以下の方法によってＨＥＫ２９３細胞へトランスフェクションした。
まずこれらのベクターを用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られたコロニーを単離・培養後、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてプラスミドの調製を行なった。また、ｃＡＭＰレスポンスエレメント（ＣＲＥ）の下流にレポーターとしてルシフェラーゼ遺伝子が連結されたｐＣＲＥ−Ｌｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のプラスミドを同様にして調製した。ＨＥＫ２９３細胞をコラーゲンＩをコートした９６−ｗｅｌｌ黒色プレート（ベクトンデッキンソン社）に１００，０００細胞／ｗｅｌｌ、培養液量１００μｌで播種し、一晩培養した。プレートで培養するための培地はＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ社）１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ，ＧｉｂｃｏＢＲＬ社）のみを添加したものを用いた。各プラスミドはｐＡＫ−Ｈ７ＴＢＡ６２とレポータープラスミドｐＣＲＥ−Ｌｕｃを９：１の割合で２４０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ−Ｉ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社）に添加した。これを、同じく２４０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ−Ｉに１０μｌのリポフェクトアミン２０００（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社）を添加したものと等量混合して、リポフェクトアミン２０００に添付のマニュアル記載の方法に従ってリポソームとプラスミドの複合体を形成させた。これらを２５μｌ／ｗｅｌｌずつＨＥＫ２９３細胞の培養液に添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。
一晩培養後、上記でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞をアッセイバッファー（０．１％のウシ血清アルブミンを添加したＤＭＥＭ）１５０μｌ／ｗｅｌｌで２回洗浄し、アッセイバッファーを６０μｌ／ｗｅｌｌで添加した。ここに、アッセイバッファーにて希釈したオキシメタゾリン（ｏｘｙｍｅｔａｚｏｌｉｎ、ＳＩＧＭＡ）５００μＭを４０μｌ／ｗｅｌｌで添加した。さらに、ホルスコリン（Ｆｏｒｓｋｌｉｎ，和光純薬）１０μＭを２０μｌ／ｗｅｌｌで添加した後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で４時間培養した。培養上清を捨てて、ルシフェラーゼ活性測定用の基質であるピッカジーンＬＴ２．０（東洋インキ製造株式会社）を５０μｌ添加し、プレートリーダー（ＡＲＶＯ ｓｘマルチラベルカウンター、Ｗａｌｌａｃ社）を用いてルシフェラーゼの発光量を測定した。
その結果、Ｈ７ＴＢＡ６２遺伝子を導入した細胞において、ホルスコリンにより上昇したルシフェラーゼ活性のオキシメタゾリンによる抑制が認められた（図１）。
【０１０１】
実施例２ オキシメタゾリンによるＨ７ＴＢＡ６２発現ＨＥＫ細胞の細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性の測定
実施例１にて作製したＨ７ＴＢＡ６２発現用プラスミドを用いて自体公知の方法によりＨ７ＴＢＡ６２の安定的な発現ＨＥＫ細胞、ＨＥＫ−Ｈ７ＴＢＡ６２を作製した。ＨＥＫ−Ｈ７ＴＢＡ６２あるいは受容体遺伝子を導入していないＨＥＫ細胞を１００，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度でコラーゲンＩをコートした９６−ｗｅｌｌ黒色プレート（ベクトンデッキンソン社）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で１晩培養したものをアッセイに使用した。サンプルバッファーはＨＢＳＳに０．１％ＢＳＡおよび０．２ｍＭ ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ社）を添加したものを用いた。細胞をサンプルバッファーで２回洗浄し、３７℃で３０分間プレインキュベーションした後、さらに細胞を２回洗浄し、サンプルを添加して３７℃で３０分間インキュベーションした。サンプルは終濃度２μＭのホルスコリンを含むサンプルバッファーを用いて、オキシメタゾリンが終濃度２００、２０μＭとなるよう添加した。サンプルとのインキュベーションの後、細胞内のｃＡＭＰ産生量はｃＡＭＰ Ｓｃｒｅｅｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）を用いて測定した。その結果、図２に示すようにオキシメタゾリンを添加した際、ＨＥＫ−Ｈ７ＴＢＡ６２細胞特異的に、２μＭのホルスコリン添加で上昇した細胞内ｃＡＭＰの産生を抑制することが分かった。
【０１０２】
実施例３ ヒトＨ７ＴＢＡ６２ｍＲＮＡの発現分布
ｍＲＮＡの発現量の定量にはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒ（アプライドバイオシステムズ社）を用いた。発現量の定量に用いるプライマー［５’−ＴＣＧＧＣＡＣＴＧＧＡＣＴＴＴＣＡＣＴ−３’（配列番号：３）、５’−ＴＧＣＴＧＧＣＡＴＡＧＡＣＧＴＴＧＡＧ−３’（配列番号：４）］とプローブ［５’−ＴＧＣＡＡＧＡＴＧＧＴＴＣＴＧＡＣＧＧＣＣＡ−３’（配列番号：５）］は、ヒトＨ７ＴＢＡ６２の塩基配列（配列番号：１）をもとにＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒ専用のソフトウエアＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ（アプライドバイオシステムズ社）を利用してデザインした。鋳型となるｃＤＮＡは、ヒト各種組織由来のｔｏｔａｌ ＲＮＡ １μｇからランダムプライマーを用いて逆転写反応して合成したものを使用した。逆転写反応は逆転写酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を使用し、添付のプロトコールにしたがって行った。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００ ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒの反応液はＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を１２．５μｌ、各プライマーを０．９μＭ、プローブを０．２５μＭ、ｃＤＮＡ溶液を混ぜ合わせ、蒸留水で２５μｌとして調製した。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒでの反応は、５０℃で２分、９５℃で１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返して行った。ヒト各種組織でのｍＲＮＡの発現分布を図３に示す。また、前立腺ガン細胞株であるＤＵ１４５、ＰＣ３、また大腸がん細胞株であるＳＷ１４１７、ＷｉＤｒ、ＳＷ８３７、ＳＷ１４６３などでｍＲＮＡの高発現が検出された（図４）。
【０１０３】
【発明の効果】
Ｈ７ＴＢＡ６２、その部分ペプチドまたはその塩、またはＨ７ＴＢＡ６２もしくはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、血管収縮剤、セロトニン作動剤、アセチルコリン遊離促進剤、消化管運動亢進剤、平滑筋収縮剤、血小板凝集剤、中枢神経興奮剤または強心剤として、例えば、神経作用性鼻うっ血や粘膜充血の除去、あるいは急性循環不全、低血圧症などの予防・治療に有用である。
また、Ｈ７ＴＢＡ６２、その部分ペプチドまたはその塩とリガンド様活性を有するオキシメタゾリンとを用いることによって、リガンドとＨ７ＴＢＡ６２、その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物を効率良くスクリーニングすることができる。
【０１０４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｈ７ＴＢＡ６２を一過的に発現させたＨＥＫ２９３細胞におけるレポーター（ルシフェラーゼ）遺伝子の発現に及ぼすオキシメタゾリンの効果を示す図である。縦軸はルシフェラーゼ活性（カウント／秒 （ｃｐｓ））を示す。コントロールはホルスコリン無添加・オキシメタゾリン無添加、ホルスコリンはホルスコリン添加・オキシメタゾリン無添加、ホルスコリン＋オキシメタゾリンはホルスコリン添加・オキシメタゾリン添加を示す。□はベクターのみを導入した細胞、■はＨ７ＴＢＡ６２ｃＤＮＡを導入した細胞を示す。
【図２】オキシメタゾリンによるＨ７ＴＢＡ６２発現ＨＥＫ細胞の細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を示す図である。ＨＥＫは非トランスフェクトＨＥＫ細胞、ＨＥＫ−Ｈ７ＴＢＡ６２はＨ７ＴＢＡ６２発現ＨＥＫ細胞での結果をそれぞれ示す。縦軸は細胞内ｃＡＭＰ濃度（ｐｍｏｌ）を示す。コントロールはホルスコリン無添加・オキシメタゾリン無添加、ホルスコリンはホルスコリン添加・オキシメタゾリン無添加、オキシメタゾリンはホルスコリン添加・オキシメタゾリン添加を示す。
【図３】ヒト各種組織でのＨ７ＴＢＡ６２ｍＲＮＡの発現分布を示す。Ｃｏｐｉｅｓ／２５ｎｇ ｔｏｔａｌ ＲＮＡはｔｏｔａｌＲＮＡ ２５ｎｇ当たりのコピー数を示す。
【図４】前立腺がん細胞株および大腸がん細胞株でのＨ７ＴＢＡ６２ｍＲＮＡの発現量を示す。Ｃｏｐｉｅｓ／２５ｎｇ ｔｏｔａｌ ＲＮＡはｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２５ｎｇ当たりのコピー数を示す。ＤＵ１４５およびＰＣ３はそれぞれ前立腺ガン細胞株の名称を、ＳＷ１４１７、ＷｉＤｒ、ＳＷ８３７およびＳＷ１４６３はそれぞれ大腸がん細胞株の名称である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to the use of human-derived G protein-coupled receptor protein H7TBA62.
[0002]
[Prior art]
Many physiologically active substances such as hormones and neurotransmitters regulate the functions of living organisms through specific receptor proteins present in cell membranes. Many of these receptor proteins perform intracellular signal transduction through activation of a conjugated guanine nucleotide-binding protein (hereinafter sometimes abbreviated as G protein), and have seven transmembrane regions. Because they have a common structure, they are collectively called G protein-coupled receptor protein (GPCR) or seven-transmembrane receptor protein (7TMR).
G protein-coupled receptor proteins are present on the surface of various functional cells of living cells and organs, and are physiologically targeted as molecules that regulate the functions of those cells and organs, such as hormones, neurotransmitters and bioactive substances. Plays an important role. The receptor transmits a signal into a cell through binding to a physiologically active substance, and this signal causes various reactions such as activation and suppression of the cell.
To clarify the relationship between substances that regulate complex functions in cells and organs of various organisms and their specific receptor proteins, especially G protein-coupled receptor proteins, it is necessary to clarify the functions of cells and organs of various organisms. And provide a very important means for drug development closely related to their functions.
[0003]
For example, in various organs of a living body, physiological functions are regulated under the regulation by many hormones, hormone-like substances, neurotransmitters or physiologically active substances. In particular, physiologically active substances are present at various sites in a living body, and regulate their physiological functions through their corresponding receptor proteins. There are many unknown hormones, neurotransmitters and other physiologically active substances in the living body, and many of the structures of their receptor proteins have not yet been reported. Furthermore, it is often unknown whether subtypes exist in known receptor proteins.
It is a very important tool for drug development to clarify the relationship between a substance that regulates a complex function in a living body and its specific receptor protein. In addition, in order to efficiently screen for agonists and antagonists for receptor proteins and to develop pharmaceuticals, it is necessary to elucidate the functions of receptor protein genes expressed in vivo and to express them in an appropriate expression system. Was needed.
In recent years, as a means for analyzing a gene expressed in a living body, studies for randomly analyzing the sequence of cDNA have been actively conducted, and the fragment sequence of the cDNA obtained in this manner is expressed in an Expressed Sequence Tag (EST). ) Is registered in the database and published. However, many ESTs have only sequence information, and it is difficult to estimate their functions.
The amino acid sequence of human-derived H7TBA62 and the DNA encoding it are known (Patent Document 1). However, the functions of these G protein-coupled receptor proteins and their ligands have not been elucidated.
Oxymetazoline is known to be a partial α-adrenergic receptor agonist, a serotonin 5-HT1A / 5-HT1B receptor agonist (Non-Patent Document 1).
[0004]
[Patent Document 1]
EP 885960-A2
[Non-patent document 1]
European Journal of Pharmacology (1991) vol. 196 pp. 213-216
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
Conventionally, substances that inhibit the binding of a G protein-coupled receptor to a physiologically active substance (ie, a ligand) or substances that bind to cause the same signal transduction as a physiologically active substance (ie, a ligand) are specific to these receptors. Has been utilized as a potential antagonist or agonist as a drug for regulating biological functions. Therefore, determining a specific ligand for a G protein-coupled receptor protein is a very important means for finding agonists and antagonists that can also be targets for drug development.
However, even at present, there are a large number of so-called orphan receptors, the functions of which are unknown G protein-coupled receptors, and the corresponding ligands have not been identified. ing.
The G protein-coupled receptor is useful for searching for a new physiologically active substance (that is, a ligand) and for searching for an agonist or antagonist for the receptor using the signal transduction action as an index. On the other hand, even if a physiological ligand is not found, it is also possible to prepare an agonist or antagonist for the receptor by analyzing the physiological action of the receptor from an inactivation experiment (knockout animal) of the receptor. . These ligands, agonists or antagonists for the receptor can be expected to be used as preventive / therapeutic or diagnostic agents for diseases associated with dysfunction or hyperfunction of G protein-coupled receptors.
Furthermore, a decrease or increase in the function of a G protein-coupled receptor in a living body based on a gene mutation thereof often causes some disease. In this case, not only administration of an antagonist or agonist to the receptor, but also application to gene therapy by introducing the receptor gene into a living body (or a specific organ) or introducing an antisense nucleic acid to the receptor gene. You can also. In this case, the nucleotide sequence of the receptor is indispensable information for examining the presence or absence of a deletion or mutation in the gene, and the gene of the receptor is a preventive / therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of the receptor. And diagnostics.
The present invention relates to the determination of a ligand for the orphan G protein-coupled receptor protein H7TBA62 of unknown function, and the use of the G protein-coupled receptor protein and its ligand. That is, the present invention provides a method for screening a compound (antagonist, agonist) or a salt thereof that alters the binding property between a ligand and the G protein-coupled receptor protein, or a salt thereof, using the screening kit, the screening method or the screening kit. Compounds (antagonists, agonists) or salts thereof that alter the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor protein or compounds thereof, and compounds (antagonists, agonists) that alter the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor protein ) Or a compound containing a compound that changes the expression level of the G protein-coupled receptor protein or a salt thereof, and the like.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies and found that one of human-derived H7TBA62 ligands is oxymetazoline, which is known as a partial α-adrenergic receptor agonist or a serotonin 5-HT1A / 5-HT1B receptor agonist. I found something. The present inventors have further studied based on these findings, and have completed the present invention.
That is, the present invention
[1] A vasoconstrictor comprising a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a partial peptide thereof or a salt thereof, serotonin action Agent, acetylcholine release promoter, gastrointestinal motility enhancer, smooth muscle constrictor, platelet aggregating agent, central nervous stimulant or inotropic agent,
[2] A neuroactive nasal congestion comprising a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or Remover of mucosal hyperemia, or preventive or therapeutic agent for acute circulatory failure or hypotension,
[3] a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a polynucleotide encoding a partial peptide thereof; Vasoconstrictors, serotonin agonists, acetylcholine release promoters, gastrointestinal motility enhancers, smooth muscle contractors, platelet aggregating agents, central nervous stimulants or inotropic agents,
[4] a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a polynucleotide encoding a partial peptide thereof; A neuroactive nasal congestion or mucosal congestion remover, or an agent for preventing or treating acute circulatory failure or hypotension,
[5] a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a polynucleotide encoding a partial peptide thereof; Vasoconstriction or dilation, serotonergic action, acetylcholine release, gastrointestinal motility, smooth muscle contraction, platelet aggregation, central nervous regulation or inotropic effect diagnostic agent,
[6] a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a polynucleotide encoding a partial peptide thereof; Become neuroactive nasal congestion, mucosal hyperemia, acute circulatory insufficiency, hypotension, peripheral circulatory disorders, hypertension, depression, obsessive-compulsive disorder, obsessive-compulsive disorder, panic disorder, anxiety disorder, eating disorder, ischemic disease, Gastrointestinal symptoms associated with antineoplastic drug administration, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, chronic pancreatitis, adult respiratory distress syndrome, alcohol withdrawal syndrome, Alzheimer's disease, stiff spondylitis, arrhythmia, cocaine withdrawal syndrome, dementia, diarrhea, gastritis, Hepatitis, infectious disease, opiate withdrawal syndrome, osteoarthritis, osteoporosis, bone pechet disease, peptic ulcer, peripheral vascular disease, after myocardial infarction Disease, reflux esophagitis, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, diagnostic agent for ulcerative colitis or unstable angina,
[7] a vasodilator comprising an antibody against a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof, which has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; Vasoconstriction inhibitor, anti-serotonin agent, acetylcholine release inhibitor, gastrointestinal motility inhibitor, smooth muscle contraction inhibitor, platelet aggregation inhibitor or central nervous system inhibitor,
[8] a peripheral circulatory disorder comprising an antibody against a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, Hypertension, depression, obsessive-compulsive disorder, obsessive-compulsive disorder, panic disorder, anxiety disorder, eating disorder, ischemic disease, gastrointestinal symptoms associated with antineoplastic drug administration, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, chronic pancreatitis, adult Respiratory distress syndrome, alcohol withdrawal syndrome, Alzheimer's disease, ankylosing spondylitis, arrhythmia, cocaine withdrawal syndrome, dementia, diarrhea, gastritis, hepatitis, infectious disease, opiate withdrawal syndrome, osteoarthritis, osteoporosis, bone petchet disease, peptic Ulcer, peripheral vascular disease, sequela of myocardial infarction, reflux esophagitis, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, ulcerative colon Or unstable angina pectoris of prophylactic and therapeutic agent,
[9] Vascular constriction or dilation comprising an antibody against a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 , A diagnostic agent for serotonergic, acetylcholine release, gastrointestinal motility, smooth muscle contraction, platelet aggregation, central nervous regulation or inotropic effect,
[10] A neuroactive nose comprising an antibody against a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Congestion, mucosal hyperemia, acute circulatory insufficiency, hypotension, peripheral circulatory disorders, hypertension, depression, obsessive-compulsive disorder, obsessive-compulsive disorder, panic disorder, anxiety disorder, eating disorder, ischemic disease, anticancer drug administration Gastrointestinal symptoms, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, chronic pancreatitis, adult respiratory distress syndrome, alcohol withdrawal syndrome, Alzheimer's disease, ankylosing spondylitis, arrhythmia, cocaine withdrawal syndrome, dementia, diarrhea, gastritis, hepatitis, infection, Opiate withdrawal syndrome, osteoarthritis, osteoporosis, bone pechet disease, peptic ulcer, peripheral vasculopathy, sequelae of myocardial infarction, reflux esophagitis, rheumatism Arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, diagnostic agent for ulcerative colitis or unstable angina,
[11] Complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Vasodilators, vasoconstrictors, anti-serotonin agents, acetylcholine release inhibitors, gastrointestinal motility inhibitors, smooth muscle contraction inhibitors, platelet aggregation comprising a polynucleotide comprising a base sequence or a part thereof Inhibitors or central nervous system depressants,
[12] Complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Peripheral circulatory disorder containing the nucleotide sequence or a part thereof, hypertension, depression, obsessive-compulsive disorder, obsessive-compulsive disorder, panic disorder, anxiety disorder, eating disorder, ischemic disease, anticancer drug administration Gastrointestinal symptoms, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, chronic pancreatitis, adult respiratory distress syndrome, alcohol withdrawal syndrome, Alzheimer's disease, ankylosing spondylitis, arrhythmia, cocaine withdrawal syndrome, dementia, diarrhea, gastritis, hepatitis, infection, opiate withdrawal Syndrome, osteoarthritis, osteoporosis, bone pechet disease, peptic ulcer, peripheral vascular disease, sequelae of myocardial infarction, reflux esophagitis, Rheumatic arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, prophylactic or therapeutic agent for ulcerative colitis or unstable angina,
[13] (1) G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, its partial peptide or its salt, and (2) oxymetazoline A method for screening a compound or a salt thereof, which alters the binding property between the receptor protein or a salt thereof and oxymetazoline, the method comprising:
[14] (1) G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, its partial peptide or its salt, and (2) oxymetazoline A screening kit for a compound or a salt thereof that alters the binding property between the receptor protein or a salt thereof and oxymetazoline, the kit comprising:
[15] An amino acid identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and obtainable by using the screening method according to [13] or the screening kit according to [14]. A compound or a salt thereof that alters the binding property to a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing a sequence,
[16] a medicine comprising the compound of the above-mentioned [15] or a salt thereof,
[17] A vasoconstrictor, a serotonin agonist, an acetylcholine containing an agonist for a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a salt thereof Release enhancers, gastrointestinal motility enhancers, smooth muscle contractors, platelet aggregating agents, central nervous stimulants or inotropic agents,
[18] Neuroactive nasal congestion or mucosal hyperemia comprising an agonist to a G protein-coupled receptor protein or an salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Remover, or preventive or therapeutic agent for acute circulatory failure or hypotension,
[19] a vasodilator or vasoconstrictor comprising an antagonist to a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a salt thereof, Anti-serotonin agent, acetylcholine release inhibitor, gastrointestinal motility inhibitor, smooth muscle contraction inhibitor, platelet aggregation inhibitor or central nervous system inhibitor,
[20] peripheral circulatory disorders, hypertension, depression comprising an antagonist to a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a salt thereof , Obsessive-compulsive disorder, obsessive-compulsive disorder, panic disorder, anxiety disorder, eating disorder, ischemic disease, gastrointestinal symptoms associated with antineoplastic drug administration, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, chronic pancreatitis, adult respiratory distress syndrome, alcohol Withdrawal syndrome, Alzheimer's disease, ankylosing spondylitis, arrhythmia, cocaine withdrawal syndrome, dementia, diarrhea, gastritis, hepatitis, infectious disease, opiate withdrawal syndrome, osteoarthritis, osteoporosis, bone pechet disease, peptic ulcer, peripheral vasculopathy , Sequelae of myocardial infarction, reflux esophagitis, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, ulcerative colitis or An agent for the prophylaxis or treatment of constant angina,
[21] Inhibition of intracellular cAMP production when a test compound is brought into contact with a cell containing a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A method for screening an agonist for the receptor protein or a salt thereof, which comprises measuring the activity;
[22] (1) a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, its partial peptide or a salt thereof, and (2) the receptor protein or its A method for screening for an agonist or antagonist for the receptor protein or a salt thereof, which comprises using a compound that changes the binding property between a salt and oxymetazoline or a salt thereof,
[23] (1) a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, its partial peptide or a salt thereof, and (2) the receptor protein or its A kit for screening an agonist or antagonist for the receptor protein or a salt thereof, which comprises a compound that changes the binding property between a salt and oxymetazoline or a salt thereof,
[24] a medicament comprising an agonist or antagonist to a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a salt thereof,
[25] Use of a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A compound having an action of changing the expression level of the G protein-coupled receptor protein, regulating vasoconstriction or expansion, serotonin action, acetylcholine release, gastrointestinal motility, smooth muscle contraction, platelet aggregation or central nervous system, or Screening method for its salts,
[26] a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a polynucleotide encoding a partial peptide thereof; A compound or a salt thereof, which has an effect of changing the expression level of the G protein-coupled receptor protein and regulating vasoconstriction or expansion, serotonin action, acetylcholine release, gastrointestinal motility, smooth muscle contraction, platelet aggregation or central nervous system. Screening kit,
[27] contains an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, which can be obtained by using the screening method according to [21] or the screening kit according to [22]. A compound having an effect of changing the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof to regulate vasoconstriction or dilation, serotonin action, acetylcholine release, gastrointestinal motility, smooth muscle contraction, platelet aggregation or central nervous system, or Its salt,
[28] a compound or a salt thereof that increases the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; Vasoconstrictors, serotonin agonists, acetylcholine release promoters, gastrointestinal motility enhancers, smooth muscle contractors, platelet aggregating agents, central nervous stimulants or inotropic agents,
[29] a compound or a salt thereof that increases the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; A neuroactive nasal congestion or mucosal congestion remover, or an agent for preventing or treating acute circulatory failure or hypotension,
[30] a compound or a salt thereof that reduces the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; Vasodilators, vasoconstrictors, anti-serotonin agents, acetylcholine release inhibitors, gastrointestinal motility inhibitors, smooth muscle contraction inhibitors, platelet aggregation inhibitors or central nervous system depressants,
[31] a compound or a salt thereof that decreases the expression level of a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; Peripheral circulatory disorder, hypertension, depression, obsessive-compulsive disorder, obsessive-compulsive disorder, panic disorder, anxiety disorder, eating disorder, ischemic disease, gastrointestinal symptoms associated with antineoplastic drug administration, acute myocardial infarction, acute pancreatitis , Chronic pancreatitis, adult respiratory distress syndrome, alcohol withdrawal syndrome, Alzheimer's disease, ankylosing spondylitis, arrhythmia, cocaine withdrawal syndrome, dementia, diarrhea, gastritis, hepatitis, infection, opiate withdrawal syndrome, osteoarthritis, osteoporosis, bone Pechet disease, peptic ulcer, peripheral vasculopathy, sequela of myocardial infarction, reflux esophagitis, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock , Prophylactic or therapeutic agent for ulcerative colitis or unstable angina,
[32] a signal transduction enhancer of a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 containing oxymetazoline,
[33] The agent of the above-mentioned [32], which is a vasoconstrictor, a serotonin agonist, an acetylcholine release promoter, a gastrointestinal motility enhancer, a smooth muscle constrictor, a platelet aggregating agent, a central nervous system stimulant or a cardiotonic agent,
[34] the agent of the above-mentioned [32], which is an agent for removing neuroactive nasal congestion or mucosal hyperemia, or an agent for preventing or treating acute circulatory insufficiency or hypotension;
[35] With respect to mammals, {1} a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a partial peptide thereof, or a salt thereof; 2) a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or [3] A method for vasoconstriction, comprising administering an effective amount of an agonist to a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, serotonin. Actuation method, acetylcholine release promotion method, gastrointestinal motility enhancement method, smooth muscle contraction method, blood Plate agglomeration process, central nervous system stimulant method, cardiotonic method, the method of removing the nerve-acting nasal congestion or mucosal hyperemia or prevention and treatment method for acute circulatory failure or hypotension,
[36] An antibody against a G protein-coupled receptor protein, a partial peptide thereof or a salt thereof, which has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 against mammals (2) complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a partial peptide thereof Or a G protein-coupled receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a polynucleotide comprising the same or a part thereof. Vasodilation method, vasoconstriction characterized by administering an effective amount of an antagonist to a salt Control method, anti-serotonin method, acetylcholine release inhibition method, gastrointestinal motility suppression method, smooth muscle contraction suppression method, platelet aggregation inhibition method, central nervous system suppression method or peripheral circulatory disorder, hypertension, depression, obsessive-compulsive disorder, obsessive-compulsive nerve Disease, panic disorder, anxiety disorder, eating disorder, ischemic disease, gastrointestinal symptoms associated with antineoplastic drug administration, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, chronic pancreatitis, adult respiratory distress syndrome, alcohol withdrawal syndrome, Alzheimer's disease, stiffness Spondylitis, arrhythmia, cocaine withdrawal syndrome, dementia, diarrhea, gastritis, hepatitis, infection, opiate withdrawal syndrome, osteoarthritis, osteoporosis, bone petchet disease, peptic ulcer, peripheral vascular disease, myocardial infarction sequelae, reflux How to prevent and treat esophagitis, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, ulcerative colitis or unstable angina;
[37] vasoconstrictors, serotonin agonists, acetylcholine release promoters, gastrointestinal motility enhancers, smooth muscle constrictors, platelet aggregating agents, central nervous stimulants, inotropic agents, agents for removing neuroactive nasal congestion or mucosal congestion, Or (1) a G protein-coupled receptor protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 for producing a prophylactic / therapeutic agent for acute circulatory failure or hypotension A partial peptide or a salt thereof, (2) a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Containing the polynucleotide or (3) the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Use of an agonist for G protein coupled receptor protein containing the amino acid sequence,
[38] vasodilators, vasoconstrictors, anti-serotonin agents, acetylcholine release inhibitors, gastrointestinal motility inhibitors, smooth muscle contraction inhibitors, platelet aggregation inhibitors, central nervous system depressants or peripheral circulatory disorders, hypertension, Depression, obsessive-compulsive disorder, obsessive-compulsive disorder, panic disorder, anxiety disorder, eating disorder, ischemic disease, digestive symptoms associated with antineoplastic drug administration, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, chronic pancreatitis, adult respiratory distress syndrome , Alcohol withdrawal syndrome, Alzheimer's disease, ankylosing spondylitis, arrhythmia, cocaine withdrawal syndrome, dementia, diarrhea, gastritis, hepatitis, infection, opiate withdrawal syndrome, osteoarthritis, osteoporosis, bone Petchet disease, peptic ulcer, peripheral Prevention of vasculopathy, sequelae of myocardial infarction, reflux esophagitis, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, ulcerative colitis or unstable angina (1) an antibody against a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a partial peptide thereof or a salt thereof, for producing a therapeutic agent; ▼ A nucleotide sequence complementary to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Or (3) use of an antagonist to a G protein-coupled receptor protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; provide.
[0007]
Further, the present invention provides
[39] (i) a G protein-coupled receptor protein (hereinafter sometimes abbreviated as H7TBA62, which is characterized by containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2) ) A comparison is made between the case where the partial peptide or its salt is contacted with oxymetazoline and the case where (ii) H7TBA62, its partial peptide or its salt is contacted with oxymetazoline and a test compound. The screening method according to the above [13], wherein
[40] (i) The case where the labeled oxymetazoline is brought into contact with H7TBA62, its partial peptide or its salt; and (ii) the case where the labeled oxymetazoline and the test compound are brought into contact with H7TBA62, its partial peptide or its salt. Wherein the amount of labeled oxymetazoline bound to H7TBA62, a partial peptide thereof or a salt thereof is measured and compared,
[41] Labeling was performed between (i) the case where the labeled oxymetazoline was brought into contact with the cells containing H7TBA62 and (ii) the case where the labeled oxymetazoline and the test compound were brought into contact with the cells containing H7TBA62. The screening method according to the above [13], wherein the amount of oxymetazoline bound to the cells is measured and compared.
[42] (i) When the labeled oxymetazoline is brought into contact with the membrane fraction of the cell containing H7TBA62, and (ii) When the labeled oxymetazoline and the test compound are brought into contact with the membrane fraction of the cell containing H7TBA62. The screening method according to the above [13], wherein the amount of labeled oxymetazoline bound to the membrane fraction of the cell when contacted is measured and compared;
[43] (i) H7TBA62 expressed on the cell membrane of a transformant obtained by culturing a transformant obtained by transforming a labeled oxymetazoline with a recombinant vector containing a DNA containing a DNA encoding H7TBA62; And when (ii) the labeled oxymetazoline and the test compound were contacted with H7TBA62 expressed on the cell membrane of the transformant, the amount of labeled oxymetazoline bound to H7TBA62 was measured; The screening method according to the above [13], wherein the comparison is performed.
[44] (i) a case where a compound activating H7TBA62 is brought into contact with a cell containing H7TBA62; and (ii) a case where a compound activating H7TBA62 and a test compound are brought into contact with a cell containing H7TBA62. The screening method according to the above [13], wherein the cell stimulating activity mediated by H7TBA62 is measured and compared.
[45] Contacting H7TBA62 expressed on the cell membrane of the transformant by culturing a transformant transformed with a recombinant vector containing a DNA containing a DNA encoding H7TBA62 with a compound that activates H7TBA62 Measuring and comparing the H7TBA62-mediated cell stimulating activity in the case of contacting the compound that activates H7TBA62 and the test compound with H7TBA62 expressed in the cell membrane of the transformant. [13] The screening method according to the above,
[46] the screening method of the above-mentioned [44] or [45], wherein the compound that activates H7TBA62 is oxymetazoline;
[47] The screening kit of the above-mentioned [14], which comprises a cell containing H7TBA62 or a membrane fraction thereof.
[48] The above-mentioned [], wherein the transformant obtained by culturing the transformant transformed with the recombinant vector containing the DNA containing the DNA encoding H7TBA62 contains H7TBA62 expressed on the cell membrane of the transformant. 14] The screening kit according to the above,
[49] a vasoconstrictor, a serotonin agonist, comprising using a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; Acetylcholine release enhancer, gastrointestinal motility enhancer, smooth muscle constrictor, platelet aggregator, central nervous system stimulant, cardiotonic, remover of neuroactive nasal congestion or mucosal hyperemia, prevention of acute circulatory failure or hypotension Therapeutic agents, vasodilators, vasoconstrictors, anti-serotonin agents, acetylcholine release inhibitors, gastrointestinal motility inhibitors, smooth muscle contraction inhibitors, platelet aggregation inhibitors, central nervous system depressants or peripheral circulatory disorders, hypertension, Depression, obsessive-compulsive disorder, obsessive-compulsive disorder, panic disorder, anxiety disorder, eating disorder, ischemic disease, gastrointestinal symptoms associated with antineoplastic drug administration, acute myocardial infarction Acute pancreatitis, chronic pancreatitis, adult respiratory distress syndrome, alcohol withdrawal syndrome, Alzheimer's disease, ankylosing spondylitis, arrhythmia, cocaine withdrawal syndrome, dementia, diarrhea, gastritis, hepatitis, infection, opiate withdrawal syndrome, osteoarthritis, osteoporosis Prophylaxis / treatment for bone disease, bone Pechet disease, peptic ulcer, peripheral vascular disease, sequelae of myocardial infarction, reflux esophagitis, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, ulcerative colitis or unstable angina Is bound to the receptor protein or a salt thereof,
[50] a vasoconstrictor, a serotonin agonist, comprising using a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; Acetylcholine release enhancer, gastrointestinal motility enhancer, smooth muscle constrictor, platelet aggregating agent, central nervous stimulant, inotropic agent, agent for removing neuroactive nasal congestion or mucosal hyperemia, or prevention of acute circulatory failure or hypotension A method for confirming that a therapeutic agent is an agonist for the receptor protein or a salt thereof,
[51] A vasodilator or a vasoconstrictor, which comprises using a G protein-coupled receptor protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a salt thereof. , Anti-serotonin, acetylcholine release inhibitor, gastrointestinal motility inhibitor, smooth muscle contraction inhibitor, platelet aggregation inhibitor, central nervous system depressant or peripheral circulatory disorder, hypertension, depression, obsessive-compulsive disorder, obsessive-compulsive disorder, Panic disorder, anxiety disorder, eating disorder, ischemic disease, gastrointestinal symptoms associated with antineoplastic drug administration, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, chronic pancreatitis, adult respiratory distress syndrome, alcohol withdrawal syndrome, Alzheimer's disease, rigid spine Inflammation, arrhythmia, cocaine withdrawal syndrome, dementia, diarrhea, gastritis, hepatitis, infection, opiate withdrawal syndrome, osteoarthritis, osteoporosis, bone peche Prophylactic / therapeutic agents for gut syndrome, peptic ulcer, peripheral vascular disease, sequelae of myocardial infarction, reflux esophagitis, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, ulcerative colitis or unstable angina A method for confirming that it is an antagonist to a protein or a salt thereof, and
[52] The method of measuring the binding amount of each drug to the receptor protein, its partial peptide or its salt when each drug is brought into contact with the receptor protein, its partial peptide or its salt. 49] to [51].
[0008]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The G protein-coupled receptor protein H7TBA62 used in the present invention is a receptor protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
H7TBA62 is, for example, a human or mammal (eg, guinea pig, rat, mouse, rabbit, pig, sheep, cow, monkey, etc.) in any cell (eg, spleen cell, nerve cell, glial cell, pancreatic β cell, bone marrow cell) , Mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, Neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, osteocytes, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or of these cells. Progenitor cells, stem cells or cancer cells, etc.) or cells of the blood cell lineage, or any tissue in which these cells are present, such as the brain, various parts of the brain (eg, olfactory bulb, squamous nucleus, basal cerebrum) , Hippocampus, thalamus, hypothalamus, hypothalamic nucleus, cerebral cortex, medulla, cerebellum, occipital lobe, frontal lobe, temporal lobe, putamen, caudate nucleus, brain stain, substantia nigra), spinal cord, pituitary, stomach, pancreas , Kidney, liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessels, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, peripheral blood cells, prostate It may be a protein derived from testis, testis, ovary, placenta, uterus, bone, joint, skeletal muscle, or the like, or may be a synthetic protein.
[0009]
The amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 includes, for example, about 85% or more, preferably 90% or more, more preferably about 95% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. And the like.
The protein of the present invention having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has, for example, an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; A protein having substantially the same activity as the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is preferred.
Examples of substantially the same activity include a ligand binding activity and a signal transduction effect. Substantially the same indicates that their activities are the same in nature. Therefore, the activities such as ligand binding activity and signal transduction activity are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 2 times). However, quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different.
The activity such as the ligand binding activity and the signal information transduction activity can be measured according to a method known per se, for example, according to a screening method described later.
[0010]
As H7TBA62, a) one or two or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and still more preferably several (1) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; To 5)), and b) one or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. More preferably, an amino acid sequence to which several (1 to 5) amino acids are added; c) one or more (preferably about 1 to 30, more preferably 1 to 30) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Is a protein containing an amino acid sequence in which about 1 to 10, more preferably several (1 to 5) amino acids are substituted with another amino acid, or d) an amino acid sequence obtained by combining them. Domo used.
[0011]
In the present specification, H7TBA62 has an N-terminus (amino terminus) at the left end and a C-terminus (carboxyl terminus) at the right end, in accordance with the convention of peptide labeling. H7TBA62, including human H7TBA62 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, has a C-terminal having a carboxyl group (-COOH) and a carboxylate (-COO). − ), Amide (-CONH 2 )) Or an ester (—COOR).
Here, R in the ester is, for example, C, such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl. 1-6 Alkyl groups such as C, cyclopentyl, cyclohexyl, etc. 3-8 Cycloalkyl groups such as phenyl, α-naphthyl and the like; 6-12 Aryl groups, for example phenyl-C such as benzyl, phenethyl, etc. 1-2 An alkyl group or α-naphthyl-C such as α-naphthylmethyl 1-2 C such as an alkyl group 7-14 In addition to aralkyl groups, pivaloyloxymethyl groups commonly used as oral esters are used.
When H7TBA62 has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus, H7TBA62 includes a carboxyl group amidated or esterified. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
Furthermore, in the above-mentioned protein, the amino group of the N-terminal methionine residue has a protecting group (for example, C7 such as formyl group and acetyl) in H7TBA62. 2-6 C such as alkanoyl group 1-6 Acyl group), a glutamyl group formed by cleavage of the N-terminal side in vivo and pyroglutamine oxidation, a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule (for example, -OH, -SH, An amino group, an imidazole group, an indole group, a guanidino group, etc. are suitable protecting groups (for example, formyl group, C 2-6 C such as alkanoyl group 1-6 (Eg, an acyl group), or a complex protein such as a so-called glycoprotein to which a sugar chain is bound.
As a specific example of H7TBA62, for example, human-derived H7TBA62 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is used. Human H7TBA62 is a known protein described in EP 885960-A2.
[0012]
The partial peptide of H7TBA62 (hereinafter, may be simply abbreviated as a partial peptide) may be any peptide having the partial amino acid sequence of H7TBA62 described above. Among them, a site exposed outside the cell membrane and having substantially the same receptor binding activity as H7TBA62 is used.
Specifically, the partial peptide of H7TBA62 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is a peptide containing a portion analyzed as an extracellular region (hydrophilic site) in a hydrophobic plot analysis. is there. Further, a peptide partially containing a hydrophobic (Hydrophobic) site can also be used. A peptide containing individual domains may be used, but a peptide containing a plurality of domains at the same time may be used.
The number of amino acids in the partial peptide of the present invention is preferably a peptide having an amino acid sequence of at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more among the constituent amino acid sequences of the above-described receptor protein of the present invention. .
A substantially identical amino acid sequence refers to an amino acid sequence having about 85% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more homology with these amino acid sequences.
Here, “substantially the same receptor activity” has the same meaning as described above. "Substantially the same receptor activity" can be measured in the same manner as described above.
[0013]
Further, the partial peptide of the present invention has one or two or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids in the amino acid sequence, or One or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and still more preferably several (1 to 5)) amino acids are added to the amino acid sequence, or the amino acid One or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, and still more preferably about 1 to 5) amino acids in the sequence may be substituted with another amino acid.
The partial peptide of the present invention has a carboxyl group (—COOH) and a carboxylate (—COO) − ), Amide (-CONH 2 )) Or an ester (—COOR). When the partial peptide of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminal, those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the partial peptide of the present invention. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
Furthermore, the partial peptide of the present invention includes, as in the case of H7TBA62 described above, one in which the amino group of the methionine residue at the N-terminus is protected by a protecting group, and a glutamic acid residue generated by cleavage of the N-terminal side in vivo. Pyroglutamine-oxidized products, those in which the substituents on the side chains of the amino acids in the molecule are protected with an appropriate protecting group, and so-called glycopeptides such as so-called glycopeptides having a sugar chain bonded thereto are also included.
Examples of the salt of H7TBA62 or a partial peptide thereof include a physiologically acceptable salt with an acid or a base, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) Acids, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like are used.
[0014]
H7TBA62 or a salt thereof can be produced from the aforementioned human or mammalian cells or tissues by a method for purifying a receptor protein known per se, or by culturing a transformant containing a DNA encoding H7TBA62 described later. Can also be manufactured. Further, the protein can also be produced according to the protein synthesis method described later or according thereto.
When producing from human or mammalian tissues or cells, the homogenized human or mammalian tissues or cells are extracted with an acid or the like, and the extract is subjected to chromatography such as reverse phase chromatography or ion exchange chromatography. Can be purified and isolated.
[0015]
For the synthesis of H7TBA62 or a partial peptide thereof, a salt thereof, or an amide thereof, a commercially available resin for protein synthesis can be generally used. Examples of such a resin include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, and 4-hydroxymethylmethyl. Phenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin, and the like. it can. Using such a resin, an amino acid having an α-amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods. At the end of the reaction, the protein is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed. Further, an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain a target protein or its amide.
Regarding the condensation of the above protected amino acids, various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable. As the carbodiimides, DCC, N, N′-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide and the like are used. For activation by these, the protected amino acid is directly added to the resin together with a racemization inhibitor additive (for example, HOBt, HOOBt), or the protected amino acid is previously activated as a symmetric acid anhydride or a HOBt ester or a HOOBt ester. After that, it can be added to the resin.
[0016]
The solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction. For example, acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol, and dimethyl sulfoxide. Sulfoxides, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, and appropriate mixtures thereof are used. The reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about −20 to 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess. As a result of the test using the ninhydrin reaction, if the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. When a sufficient condensation cannot be obtained by repeating the reaction, the unreacted amino acid can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole.
[0017]
Examples of the protecting group for the amino group of the raw material include, for example, Z, Boc, tertiarypentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, adamantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl , Phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like.
The carboxyl group may be, for example, a linear, branched or cyclic alkyl ester such as an alkyl esterified ester (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl). ), Aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarbonyl hydrazide, tertiary butoxy It can be protected by carbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
The hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification. As a group suitable for this esterification, for example, a lower alkanoyl group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, and a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group and an ethoxycarbonyl group are used. Examples of the group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
Examples of the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bzl, Cl 2 -Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, tert-butyl and the like are used.
As the imidazole protecting group for histidine, for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
[0018]
Examples of the activated carboxyl group of the raw material include, for example, a corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol, Cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and an ester with HOBt). As the activated amino group of the raw material, for example, a corresponding phosphoric amide is used.
As a method for removing (eliminating) the protecting group, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, trifluoromethane, etc. Acid treatment with dichloromethane, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, and the like are also used. The elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally performed at a temperature of about -20 to 40 ° C. In the acid treatment, for example, anisole, phenol, thioanisole, meta-cresol, para-cresol, dimethyl sulfide, 1,4- It is effective to add a cation scavenger such as butanedithiol or 1,2-ethanedithiol. Further, the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group of tryptophan is the above 1,2-ethanedithiol, 1,4-butane. In addition to deprotection by acid treatment in the presence of dithiol or the like, it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia or the like.
[0019]
The protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw materials, the protective group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
As another method for obtaining an amide form of a protein, for example, after amidating and protecting the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid, a peptide (protein) chain is extended to a desired chain length on the amino group side, and A protein from which only the protecting group for the N-terminal α-amino group of the peptide chain has been removed and a protein from which only the protecting group for the carboxyl group at the C-terminal has been removed, and these proteins are mixed in the above-mentioned mixed solvent. To condense. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method, and a desired crude protein can be obtained. The crude protein is purified by various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired protein.
In order to obtain an ester of a protein, for example, after condensing the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, an ester of the desired protein is obtained in the same manner as the amide of the protein be able to.
[0020]
The partial peptide of H7TBA62 or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving H7TBA62 with an appropriate peptidase. As a method for synthesizing a peptide, for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting H7TBA62 with the remaining portion and, when the product has a protecting group, removing the protecting group. Examples of the known condensation method and elimination of the protecting group include the methods described in the following a) to e).
a) M. Bodanszky and M.A. A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
b) Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)
c) Nobuo Izumiya et al., Fundamentals and experiments of peptide synthesis, Maruzen Co., Ltd. (1975)
d) Haruaki Yajima and Shunpei Sakakibara, Laboratory of Biochemistry 1, Protein Chemistry IV, 205, (1977)
e) Supervision of Haruaki Yajima, Development of Continuing Drugs Volume 14 Peptide Synthesis Hirokawa Shoten
After the reaction, the partial peptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization. When the partial peptide obtained by the above method is in a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method, and when it is obtained in a salt, it can be converted to a free form by a known method. Can be.
[0021]
The polynucleotide encoding H7TBA62 may be any polynucleotide containing the above-described nucleotide sequence (DNA or RNA, preferably DNA) encoding H7TBA62. The polynucleotide is RNA such as DNA or mRNA encoding H7TBA62, and may be double-stranded or single-stranded. In the case of double-stranded, it may be double-stranded DNA, double-stranded RNA or DNA: RNA hybrid. In the case of a single strand, it may be a sense strand (ie, a coding strand) or an antisense strand (ie, a non-coding strand).
Using the polynucleotide encoding H7TBA62, for example, the mRNA of H7TBA62 can be quantified by the method described in the well-known experimental medicine special edition “New PCR and its Applications” 15 (7), 1997 or a method analogous thereto. .
The DNA encoding H7TBA62 may be any of a genomic DNA, a genomic DNA library, the above-described cell / tissue-derived cDNA, the above-described cell / tissue-derived cDNA library, and a synthetic DNA. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, amplification can be directly performed by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the above-described cells / tissues.
Specifically, as the DNA encoding H7TBA62, for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or hybridizing with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 under high stringent conditions Any DNA encoding a receptor protein having a base sequence and having substantially the same activity (eg, ligand binding activity, signal information transduction activity, etc.) as H7TBA62 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 It may be.
Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, about 85% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. For example, DNA containing a base sequence having a property is used.
[0022]
Hybridization can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, a method described in Molecular Cloning 2nd Edition (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). it can. When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed under high stringent conditions.
The high stringent conditions are, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable.
More specifically, as the DNA encoding human-derived H7TBA62 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is used.
A polynucleotide comprising a part of the base sequence of the DNA encoding H7TBA62 or a part of the base sequence complementary to the DNA is not limited to a DNA encoding the following partial peptide of the present invention. But also used to include RNA.
According to the present invention, an antisense polynucleotide (nucleic acid) capable of inhibiting the replication or expression of the H7TBA62 gene is designed based on the cloned or determined nucleotide sequence information of the DNA encoding H7TBA62, Can be synthesized. Such a polynucleotide (nucleic acid) can hybridize to the RNA of the H7TBA62 gene and inhibit the synthesis or function of the RNA, or inhibit the expression of the H7TBA62 gene through interaction with an H7TBA62-related RNA. It can be adjusted and controlled. Polynucleotides complementary to a selected sequence of H7TBA62-related RNA, and polynucleotides capable of specifically hybridizing to H7TBA62-related RNA, are useful in regulating and controlling H7TBA62 gene expression in vivo and in vitro. It is useful, and is useful for treating or diagnosing diseases and the like. The term “corresponding” means having homology or being complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes. "Corresponding" between a nucleotide, base sequence or nucleic acid and a peptide (protein) usually refers to the amino acid of the peptide (protein) as directed by the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement. . H7TBA62 gene 5 'end hairpin loop, 5' end 6-base pair repeat, 5 'end untranslated region, polypeptide translation start codon, protein coding region, ORF translation start codon, 3' end untranslated region, 3 ' The terminal palindrome region and the 3 'terminal hairpin loop may be selected as preferred regions of interest, but any region within the H7TBA62 gene may be selected as a target.
[0023]
The relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide that is complementary to at least a part of the target region and can hybridize can be said to be “antisense” with the target. Antisense polynucleotides include polydeoxyribonucleotides containing 2-deoxy-D-ribose, polyribonucleotides containing D-ribose, N-glycosides of purine or pyrimidine bases and other types of polynucleotides. Other polymers with nucleotides or non-nucleotide backbones (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special bonds, provided that the polymers are found in DNA or RNA Base pairs and nucleotides having a configuration that allows base attachment). They can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and also DNA: RNA hybrids, and can be unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides), or even known. Such as labeled, capped, methylated, one or more naturally-occurring nucleotides replaced by analogs, intramolecular nucleotides Modified, such as those having uncharged bonds (eg, methylphosphonates, phosphotriesters, phosphoramidates, carbamates, etc.), charged or sulfur-containing bonds (eg, phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.) ), Such as proteins (nucleases, nuclease inhibitors, toxic , Antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.) or sugars (for example, monosaccharides) having side chain groups, interacting compounds (for example, acridine, psoralen, etc.), chelates Those containing compounds (eg, metals, radioactive metals, boron, oxidizing metals, etc.), those containing alkylating agents, those having modified bonds (eg, α-anomeric nucleic acids, etc.) It may be. Here, "nucleoside", "nucleotide", and "nucleic acid" may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups have been replaced by halogens, aliphatic groups, etc., or by functional groups such as ethers, amines, etc. It may have been converted.
[0024]
The antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA). Specific examples of the modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives and thiophosphate derivatives of nucleic acids, and those that are resistant to degradation of polynucleoside amides and oligonucleoside amides. The antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to make the antisense nucleic acid more cell permeable, to have a greater affinity for the target sense strand, and to be more toxic if it is toxic. Minimize the toxicity of sense nucleic acids.
Many such modifications are known in the art, and are described, for example, in J. et al. Kawakami et al. , Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp. 247, 1992; Vol. 8, pp. 395, 1992; T. Crooke et al. ed. , Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993.
The antisense nucleic acid of the present invention may contain altered or modified sugars, bases or bonds, may be provided in a special form such as liposomes or microspheres, may be applied by gene therapy, It could be provided in an added form. Thus, in the form of addition, polycations such as polylysine which acts to neutralize the charge of the phosphate skeleton, lipids which enhance the interaction with the cell membrane or increase the uptake of nucleic acids ( For example, hydrophobic substances such as phospholipid and cholesterol can be mentioned. Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chloroformate, cholic acid, etc.). These can be attached to the 3 'end or 5' end of the nucleic acid, and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond. Other groups include cap groups specifically arranged at the 3 ′ end or 5 ′ end of a nucleic acid for preventing degradation by nucleases such as exonuclease and RNase. Such capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
The inhibitory activity of an antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of a G protein-coupled receptor protein. it can. The nucleic acid can be applied to cells by various methods known per se.
[0025]
The DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the present invention. In addition, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-described cells / tissues, cDNA library derived from the above-described cells / tissues, and synthetic DNA may be used. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can be directly amplified by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR) using an mRNA fraction prepared from the above-described cells / tissues.
Specifically, the DNA encoding the partial peptide of the present invention includes, for example, (1) DNA having a partial base sequence of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (2) SEQ ID NO: 1 Has a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, and has substantially the same activity as H7TBA62 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (eg, ligand binding activity, signal information For example, a DNA having a partial base sequence of a DNA encoding a receptor protein having a transducing action or the like is used.
Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, about 85% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. For example, DNA containing a base sequence having a property is used.
[0026]
As a means for cloning DNA that completely encodes H7TBA62 or a partial peptide thereof (hereinafter sometimes abbreviated as H7TBA62 in some cases), amplification is performed by a PCR method using a synthetic DNA primer having a partial base sequence of H7TBA62. Alternatively, the DNA can be selected by hybridization with a DNA incorporated into an appropriate vector and labeled with a DNA fragment encoding a part or the entire region of H7TBA62 or a synthetic DNA. The hybridization can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd Edition (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
[0027]
Conversion of the base sequence of DNA can be performed by PCR or a known kit, for example, Mutan. TM -Super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM Using -K (Takara Shuzo Co., Ltd.) or the like, it can be carried out according to a method known per se such as the ODA-LA PCR method, the Gapped Duplex method, the Kunkel method, or a method analogous thereto.
The cloned DNA encoding H7TBA62 can be used as it is depending on the purpose, or it can be used after digesting with a restriction enzyme or adding a linker, if desired. The DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
The H7TBA62 expression vector can be produced, for example, by (A) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding H7TBA62 and (B) ligating the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. it can.
[0028]
Examples of the vector include plasmids derived from Escherichia coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194), plasmids derived from yeast (eg, pSH19, pSH15), λ phage, etc. In addition to animal viruses such as bacteriophage, retrovirus, vaccinia virus, and baculovirus, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo, and the like are used.
The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression. For example, when an animal cell is used as a host, SRα promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
Among them, it is preferable to use the CMV promoter, SRα promoter and the like. When the host is Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter, λP L When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, an SPO1 promoter, an SPO2 promoter, a penP promoter, and the like are preferable. When the host is a yeast, a PHO5 promoter, a PGK promoter, a GAP promoter, an ADH promoter, and the like are preferable. When the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
[0029]
In addition to the above, an expression vector containing an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), and the like may be used, if desired. it can. Examples of the selectable marker include a dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance] and an ampicillin resistance gene (hereinafter Amp). r Neomycin resistance gene (hereinafter Neo). r G418 resistance). In particular, CHO (dhfr − ) When the dhfr gene is used as a selection marker using cells, the target gene can be selected using a thymidine-free medium.
If necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the receptor protein of the present invention. When the host is a genus Escherichia, a PhoA signal sequence, an OmpA signal sequence, or the like is used. When the host is a Bacillus genus, an α-amylase signal sequence, a subtilisin signal sequence, or the like is used. In some cases, MFα signal sequence, SUC2 signal sequence, etc., and when the host is an animal cell, insulin signal sequence, α-interferon signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. can be used.
Using the vector containing the DNA encoding H7TBA62 thus constructed, a transformant can be produced.
[0030]
As the host, for example, Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.
Specific examples of the genus Escherichia include Escherichia coli K12 DH1 [Processings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology (Journal of Molecular Biology)]. 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], C600 [Genetics (Ge) netics), Vol. 39, 440 (1954)].
Examples of Bacillus spp. Include Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)]. )] Is used.
Examples of yeast include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R − , NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Pichia pastoris and the like.
[0031]
When the virus is AcNPV, for example, when the virus is AcNPV, a cell line derived from a larva of night roth moth (Spodoptera frugiperda cell; Sf cell), MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, and Hig derived from Trichoplusia ni egg. TM Cells, cells derived from Mamestra brassicae, cells derived from Estigmena acrea, and the like are used. When the virus is BmNPV, a silkworm-derived cell line (Bombyx mori N; BmN cell) or the like is used. As the Sf cells, for example, Sf9 cells (ATCC CRL 1711), Sf21 cells (Vaughn, JL, et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like are used. .
As insects, for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
Examples of animal cells include monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO cells), and dhfr gene-deficient Chinese hamster cells CHO (hereinafter CHO (dhfr). − ) Cells), mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, human HEK293 cells, and the like.
[0032]
In order to transform Escherichia, for example, Procesings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 69, 2110 ( 1972) and Gene, Vol. 17, 107 (1982).
Transformation of Bacillus spp. Can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, Vol. 168, 111 (1979).
To transform yeast, for example, Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991), Proceedings of the National Academy of Sciences of Science -The USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), Vol. 75, 1929 (1978).
Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
To transform animal cells, for example, see Cell Engineering Separate Volume 8, New Cell Engineering Experiment Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha) and Virology, Vol. 52, 456 (1973).
Thus, a transformant transformed with the expression vector containing the DNA encoding H7TBA62 is obtained.
When culturing a transformant whose host is a genus Escherichia or Bacillus, a liquid medium is suitable as a medium used for the culturing, and a carbon source necessary for growth of the transformant is used therein. Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are included. As a carbon source, for example, glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc., as a nitrogen source, for example, ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract and the like Examples of the inorganic or organic substance and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride. In addition, yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added. The pH of the medium is preferably about 5 to 8.
[0033]
Examples of a medium for culturing Escherichia include, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics]. , 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]. If necessary, an agent such as 3β-indolyl acrylic acid can be added in order to make the promoter work efficiently.
When the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, the cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added.
When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
When culturing a transformant in which the host is yeast, for example, Burkholder's minimum medium [Bostian, K. et al. L. Procurings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 77, 4505 (1980)] and 0.5% casamino acid. SD medium containing [Bitter, G .; A. Processing of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 81, 5330 (1984)]. Preferably, the pH of the medium is adjusted to about 5-8. The cultivation is usually performed at about 20 to 35 ° C. for about 24 to 72 hours, and aeration and / or agitation are added as necessary.
[0034]
When culturing a transformant in which the host is an insect cell or an insect, the culture medium is inactivated by Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)). For example, those to which an additive such as 10% bovine serum or the like is appropriately added are used. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. The cultivation is usually performed at about 27 ° C. for about 3 to 5 days, and if necessary, aeration or stirring is added.
When culturing a transformant in which the host is an animal cell, examples of the medium include a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], a DMEM medium. [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], 199 medium. [Proceding of the Society for the Biological Medicine, Vol. 73, 1 (1950) [Proceding of the Society for the Biological Medicine] ], Such as is used. Preferably, the pH is between about 6 and 8. The cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 60 hours, and if necessary, aeration and stirring are added.
As described above, H7TBA62 can be produced in the transformant, in the cell membrane, or outside the cell.
[0035]
The H7TBA62 can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
When H7TBA62 is extracted from the cultured cells or cells, the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and sonicated, lysozyme and / or freeze-thaw, etc. Alternatively, a method of obtaining a crude extract of H7TBA62 by centrifugation or filtration after disrupting cells is used as appropriate. In a buffer, a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or Triton X-100 is used. TM And the like. When H7TBA62 is secreted into the culture solution, after completion of the culture, the supernatant is separated from the cells or cells by a method known per se, and the supernatant is collected.
Purification of H7TBA62 contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be carried out by appropriately combining known separation and purification methods. These known separation and purification methods include methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly molecular weight. Method using difference in charge, method using charge difference such as ion exchange chromatography, method using specific novelty such as affinity chromatography, use of difference in hydrophobicity such as reversed-phase high-performance liquid chromatography And a method utilizing the difference in isoelectric points such as isoelectric focusing.
[0036]
When H7TBA62 thus obtained is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when it is obtained as a salt, a method known per se or analogous thereto Can be converted to a free form or another salt.
The H7TBA62 produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by applying an appropriate protein modifying enzyme before or after purification. As the protein modifying enzyme, for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
The activity of H7TBA62 thus produced can be measured by a binding experiment with a labeled ligand, an enzyme immunoassay using a specific antibody, or the like.
[0037]
The antibody to H7TBA62 may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize H7TBA62.
An antibody against H7TBA62 can be produced using H7TBA62 as an antigen according to a method for producing an antibody or antiserum known per se.
[0038]
[Preparation of monoclonal antibody]
(A) Preparation of monoclonal antibody-producing cells
H7TBA62 is administered to a mammal at a site capable of producing an antibody by administration, itself or together with a carrier or diluent. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. Examples of mammals to be used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep and goats, and mice and rats are preferably used.
When producing monoclonal antibody-producing cells, a warm-blooded animal immunized with the antigen, for example, an individual having an antibody titer was selected from a mouse, and the spleen or lymph node was collected 2 to 5 days after the final immunization. By fusing the contained antibody-producing cells with myeloma cells, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared. The antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled receptor protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of a labeling agent bound to the antibody. The fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)]. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
Examples of myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2 / 0 and the like, and P3U1 is preferably used. The preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is added at a concentration of about 10 to 80%. Incubation at about 20 to 40 ° C., preferably about 30 to 37 ° C. for about 1 to 10 minutes allows efficient cell fusion.
[0039]
Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas. For example, a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) on which the antigen of the receptor protein is directly or adsorbed together with a carrier, and then radioactively. A method of detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase by adding an anti-immunoglobulin antibody (anti-mouse immunoglobulin antibody is used when the cell used for cell fusion is a mouse) or protein A labeled with a substance or enzyme, A method in which a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase to which an anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, a receptor protein labeled with a radioactive substance or an enzyme is added, and a monoclonal antibody bound to the solid phase is detected. .
The selection of the monoclonal antibody can be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be carried out in a medium for animal cells to which HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added. As a selection and breeding medium, any medium can be used as long as a hybridoma can grow. For example, RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 1 to 10% fetal bovine serum, or serum-free for hybridoma culture A medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) or the like can be used. The culturing temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. The culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. The culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
[0040]
(B) Purification of monoclonal antibody
Monoclonal antibodies can be separated and purified by immunoglobulin separation and purification methods [eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchangers (eg, DEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, specific purification method in which an antibody alone is collected using an antigen-binding solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G, and the bond is dissociated to obtain the antibody. Can be performed according to
[0041]
(Preparation of polyclonal antibody)
The polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (H7TBA62 antigen) and a carrier protein is formed, a mammal is immunized in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody, and an antibody-containing substance for H7TBA62 is collected from the immunized animal. Can be produced by separation and purification of
Regarding a complex of an immunizing antigen and a carrier protein used to immunize a mammal, the type of the carrier protein and the mixing ratio of the carrier and the hapten should be such that the antibody can be efficiently produced against the hapten immunized by crosslinking the carrier. Any one may be cross-linked at any ratio. For example, bovine serum albumin, bovine thyroglobulin, keyhole limpet hemocyanin, etc. may be used in a weight ratio of about 0.1 to 20 with respect to 1 hapten. Preferably, a method of coupling at a ratio of about 1 to 5 is used.
Various coupling agents can be used for coupling the hapten and the carrier, and glutaraldehyde, carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
The condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. The administration can usually be performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times. The polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood of the mammal immunized by the above method.
The measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the serum described above. The separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-mentioned separation and purification of the monoclonal antibody.
[0042]
One of the ligands of H7TBA62 is oxymetazoline, which is known as a partial α-adrenergic receptor agonist or a serotonin 5-HT1A / 5-HT1B receptor agonist, and is used as an ophthalmic drug or a local vasoconstrictor for nasal drops. It is. Therefore, DNA encoding H7TBA62 (hereinafter sometimes abbreviated as the DNA of the present invention), an antibody against H7TBA62 (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention), and an antisense DNA against the DNA of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) , May be abbreviated as antisense DNA of the present invention) has the following uses.
[0043]
(1) An agent for preventing and / or treating a disease associated with dysfunction of H7TBA62
Since oxymetazoline binding to H7TBA62 is a partial α-adrenergic receptor agonist or a serotonin 5-HT1A / 5-HT1B receptor agonist, H7TBA62 has vasoconstriction, serotonin action, acetylcholine release, gastrointestinal motility, and smooth muscle contraction. , May be involved in platelet aggregation, central nervous regulation or inotropic effects. Therefore, a) H7TBA62 or b) DNA encoding H7TBA62 can be used as a vasoconstrictor, a serotonin agonist, an acetylcholine release promoter, a gastrointestinal motility enhancer, a smooth muscle constrictor, a platelet aggregating agent, a central nervous stimulant or a cardiotonic agent It can be used as a medicament such as an agent for preventing and / or treating a disease associated with these dysfunctions of H7TBA62.
For example, when there is a patient who cannot expect the physiological action of the ligand (H7TBA62 deficiency) due to a decrease in H7TBA62 in the living body, a) administering H7TBA62 to the patient to supplement the amount of the receptor, b) (a) administering H7TBA62-encoding DNA to the patient and expressing it, or (ii) inserting H7TBA62-encoding DNA into target cells and expressing the cells, and then transplanting the cells into the patient. By doing so, the amount of the receptor in the patient's body can be increased, and the effect of the ligand can be sufficiently exerted. That is, DNA encoding H7TBA62 is a deficiency of the safe and low toxic function of the receptor, particularly deficiency such as vasoconstriction, serotonin action, acetylcholine release, gastrointestinal motility, smooth muscle contraction, platelet aggregation, central nervous control or inotropic action. It is useful as a prophylactic and / or therapeutic agent for diseases related to.
Specifically, H7TBA62 or the DNA of the present invention can be used, for example, as an agent for removing neuroactive nasal congestion or mucosal hyperemia, or as an agent for preventing or treating diseases such as acute circulatory failure or hypotension. .
Furthermore, H7TBA62 or the DNA of the present invention can be used, for example, for cancer (eg, prostate cancer, colorectal cancer, etc.), infection, pain, anorexia nervosa, bulimia, asthma, Parkinson's disease, acute heart failure, hypotension, hypertension, urinary retention. Osteoporosis, angina, myocardial infarction, ulcer, allergy, benign prostatic hyperplasia, psychiatric / neurological disorders (anxiety, schizophrenia, depression, delirium, dementia, severe mental retardation and motor abnormalities, Huntington's chorea, It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases such as Jill de la Tourette syndrome), an ophthalmic drug, and a local vasoconstrictor for nasal drops.
When H7TBA62 is used as the above drug, it can be formulated according to conventional means.
On the other hand, when the DNA of the present invention is used as the above medicine, the DNA of the present invention may be used alone or after being inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like, followed by a routine procedure. can do. The DNA of the present invention can be administered as it is or together with an auxiliary agent for promoting uptake, using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
For example, a) H7TBA62 or b) DNA of the present invention may be orally administered as tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc., if necessary, or water or other pharmaceutically acceptable. It can be used parenterally in the form of injections, such as sterile solutions with the liquid obtained, or suspensions. For example, a) H7TBA62 or b) the DNA of the present invention is required for the generally accepted formulation practice together with known physiologically acceptable carriers, flavors, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. It can be manufactured by mixing in a unit dosage form. The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
[0044]
Examples of additives that can be incorporated into tablets, capsules, and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Useful bulking agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry and the like are used. When the unit dosage form is a capsule, a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As the aqueous solution for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used. For example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80) TM , HCO-50) and the like. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and they may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
[0045]
The above-mentioned medicines include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum albumin, (Eg, polyethylene glycol), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, and should be administered to humans and mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be.
The dose of H7TBA62 varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. In the case of oral administration, for example, in an acute circulatory insufficiency patient (with a body weight of 60 kg), it is generally about 0% per day. 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc., but, for example, usually in the form of an injection, for example, an acute circulatory failure patient (with a body weight of 60 kg) In the above, it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
The dosage of the DNA of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. However, in the case of oral administration, for example, in an acute circulatory failure patient (with a body weight of 60 kg), the daily dose is generally one day. About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, and more preferably about 1.0 to 20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc., but, for example, usually in the form of an injection, for example, an acute circulatory failure patient (with a body weight of 60 kg) In the above, it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
[0046]
(2) Gene diagnostic agent
The DNA and antisense DNA of the present invention can be used as probes to convert H7TBA62 or its partial peptide in humans or mammals (eg, rat, mouse, rabbit, sheep, pig, cow, cat, dog, monkey). Since abnormalities (encoding abnormalities) of the encoding DNA or mRNA can be detected, they can be used, for example, as genetic diagnostic agents for damage, mutation or decreased expression of the DNA or mRNA, and increased or excessive expression of the DNA or mRNA. Useful.
The above-described genetic diagnosis using the DNA or the antisense DNA of the present invention can be performed, for example, by the known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Processing). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, pp. 2766-2770 (1986), pp. 86--2770, etc., in the Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. be able to.
For example, if Northern hybridization detects decreased expression of H7TBA62, for example, dysfunction of H7TBA62, particularly vasoconstriction, serotonin action, acetylcholine release, gastrointestinal motility, smooth muscle contraction, platelet aggregation, central nervous control or inotropic It can be diagnosed that there is a high possibility of suffering from a disease associated with a deficiency in action or the like, or that there is a high possibility of suffering in the future.
In addition, when overexpression of H7TBA62 is detected by Northern hybridization, for example, diseases caused by overexpression of H7TBA62, particularly vasoconstriction, serotonin action, acetylcholine release, gastrointestinal motility, smooth muscle contraction, platelet aggregation, central It can be diagnosed that there is a high possibility of suffering from a disease associated with abnormal enhancement such as neuromodulation or inotropic activity, or a high possibility of suffering in the future.
Diseases associated with H7TBA62 dysfunction include, for example, neuroactive nasal congestion or mucosal hyperemia, or acute circulatory failure or hypotension.
Examples of the disease caused by overexpression of H7TBA62 include peripheral circulatory disorder, hypertension, depression, obsessive-compulsive disorder, obsessive-compulsive disorder, panic disorder, anxiety disorder, eating disorder, ischemic disease, and administration of antineoplastic drug. Gastrointestinal symptoms, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, chronic pancreatitis, adult respiratory distress syndrome, alcohol withdrawal syndrome, Alzheimer's disease, ankylosing spondylitis, arrhythmia, cocaine withdrawal syndrome, dementia, diarrhea, gastritis, hepatitis, infection, Opiate withdrawal syndrome, osteoarthritis, osteoporosis, osteoporotic disease, peptic ulcer, peripheral vasculopathy, sequelae of myocardial infarction, reflux esophagitis, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, ulcerative colitis or non- And stable angina.
Furthermore, the DNA and antisense DNA of the present invention include, for example, cancer (eg, prostate cancer, colorectal cancer, etc.), infection, pain, anorexia nervosa, bulimia, asthma, Parkinson's disease, acute heart failure, hypotension, hypertension, Urinary retention, osteoporosis, angina, myocardial infarction, ulcer, allergy, benign prostatic hypertrophy, mental and neurological disorders (anxiety, schizophrenia, depression, delirium, dementia, severe mental retardation and motor abnormalities, Huntington's dance) Disease, Jill de la Tourette syndrome) and the like.
[0047]
(3) A medicine containing a compound that changes the expression level of H7TBA62
The DNA of the present invention can be used for screening for a compound that changes the expression level of H7TBA62 by using it as a probe.
That is, the present invention relates to, for example, H7TBA62 contained in (i) a) blood of a non-human mammal, b) a specific organ, c) a tissue or cell isolated from an organ, or (ii) a transformant. A method for screening a compound that changes the expression level of H7TBA62 by measuring the amount of mRNA is provided.
[0048]
The measurement of the mRNA amount of H7TBA62 is specifically performed as follows.
(I) Normal or disease model non-human mammals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, dementia rats, obese mice, arteriosclerotic rabbits, cancer-bearing A drug (eg, an anti-dementia drug, a blood pressure lowering drug, an anti-cancer drug, an anti-obesity drug, etc.) or a physical stress (eg, waterlogging stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.), etc. After the passage, blood or a specific organ (eg, brain, liver, kidney, etc.), or a tissue or cell isolated from the organ is obtained.
The mRNA of H7TBA62 contained in the obtained cells can be quantified by, for example, extracting mRNA from cells or the like by an ordinary method and using, for example, a technique such as TaqMan PCR, and Northern blotting by a method known per se. The analysis can also be performed by performing.
(Ii) A transformant expressing H7TBA62 is prepared according to the above method, and the mRNA of H7TBA62 contained in the transformant can be quantified and analyzed in the same manner.
[0049]
Screening for a compound that alters the expression level of H7TBA62 involves:
(I) A given time (30 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 12 hours, more preferably 1 hour) before giving a drug or physical stress to a normal or disease model non-human mammal Before to 6 hours before) or after a certain time (after 30 minutes to 3 days, preferably after 1 hour to 2 days, more preferably after 1 hour to 24 hours), or at the same time as the drug or physical stress. After a certain period of time (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours) after the administration, the amount of H7TBA62 mRNA contained in the cells is quantified, Can be done by analyzing
(Ii) When culturing the transformant according to a conventional method, the test compound is mixed in the medium, and after culturing for a certain period of time (1 day to 7 days, preferably 1 day to 3 days, more preferably 2 days to 3 days) Days after), the amount of H7TBA62 mRNA contained in the transformant can be quantified and analyzed.
[0050]
The compound obtained by using the screening method of the present invention or a salt thereof is a compound having an effect of changing the expression level of H7TBA62. Specifically, (a) increasing the expression level of H7TBA62 And (b) a compound that reduces the cell stimulating activity by decreasing the expression level of H7TBA62.
Cell stimulating activity includes, for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, etc. Among them, the activity of inhibiting intracellular cAMP production is preferred.
Such compounds include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like, and these compounds may be novel compounds or known compounds.
Compounds that alter the expression level of H7TBA62 obtained by the above screening method include dysfunctions of H7TBA62, particularly vasoconstriction, serotonin action, acetylcholine release, gastrointestinal motility, smooth muscle contraction, platelet aggregation, central nervous control or cardiotonic effect, etc. It can be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for diseases related to abnormalities, ophthalmic drug, and local vasoconstrictor for nasal drops.
Specifically, a compound that increases the expression level of H7TBA62 and enhances cell stimulating activity is useful as a safe and low-toxic prophylactic / therapeutic agent for diseases associated with dysfunction of H7TBA62.
A compound that reduces the expression level of H7TBA62 and attenuates the cell stimulating activity is useful as a safe and low-toxic prophylactic / therapeutic agent for diseases caused by excessive expression of H7TBA62.
Diseases associated with H7TBA62 dysfunction include, for example, neuroactive nasal congestion or mucosal hyperemia, or acute circulatory failure or hypotension.
Examples of the disease caused by overexpression of H7TBA62 include peripheral circulatory disorder, hypertension, depression, obsessive-compulsive disorder, obsessive-compulsive disorder, panic disorder, anxiety disorder, eating disorder, ischemic disease, and administration of antineoplastic drug. Gastrointestinal symptoms, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, chronic pancreatitis, adult respiratory distress syndrome, alcohol withdrawal syndrome, Alzheimer's disease, ankylosing spondylitis, arrhythmia, cocaine withdrawal syndrome, dementia, diarrhea, gastritis, hepatitis, infection, Opiate withdrawal syndrome, osteoarthritis, osteoporosis, osteoporotic disease, peptic ulcer, peripheral vasculopathy, sequelae of myocardial infarction, reflux esophagitis, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, ulcerative colitis or non- And stable angina.
Furthermore, compounds that change the expression level of H7TBA62 obtained by the above screening method include, for example, cancer (eg, prostate cancer, colorectal cancer, etc.), infectious disease, pain, anorexia nervosa, bulimia, asthma, Parkinson's disease, acute heart failure , Hypotension, hypertension, urinary retention, osteoporosis, angina, myocardial infarction, ulcer, allergy, benign prostatic hypertrophy, psychiatric / neurological disorders (anxiety, schizophrenia, depression, delirium, dementia, severe mental retardation) It can also be used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases such as dyskinesia, Huntington's chorea, Jill de la Tourette syndrome).
[0051]
When a compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is used as a pharmaceutical composition, it can be formulated according to a conventional method.
For example, the compound may be a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule, or the like, as needed, orally, or a sterile solution of water or other pharmaceutically acceptable liquid, Alternatively, they can be used parenterally in the form of injections such as suspensions. For example, the compound may be mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like, in a unit dosage form required for generally accepted pharmaceutical practice. Can be manufactured by The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
Examples of additives that can be incorporated into tablets, capsules, and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Useful bulking agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry and the like are used. When the unit dosage form is a capsule, a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As the aqueous solution for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used. For example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80) TM , HCO-50) and the like. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and they may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
[0052]
The above-mentioned medicines include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum albumin, (Eg, polyethylene glycol), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, and should be administered to humans and mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, condition, administration method, etc., but, for example, usually in the form of an injection, for example, an acute circulatory failure patient (with a body weight of 60 kg) In this case, it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
[0053]
(4) Method for quantifying and diagnosing ligand for H7TBA62
Since the antibody of the present invention can specifically recognize H7TBA62, it can be used for quantification of the receptor in a test liquid, particularly for quantification by sandwich immunoassay.
That is, the present invention
(I) reacting the antibody of the present invention with a test solution and labeled H7TBA62 competitively, and measuring the ratio of labeled H7TBA62 bound to the antibody in the test solution. A method for quantifying the receptor, and
(Ii) After reacting a test solution with the antibody of the present invention immobilized on a carrier and another labeled antibody of the present invention simultaneously or continuously, the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier is measured. A method for quantifying H7TBA62 in a test solution is provided.
[0054]
In the quantitative method (ii), it is preferable that one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of H7TBA62 and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of the receptor.
In addition, the receptor can be quantified using a monoclonal antibody against H7TBA62, and can also be detected by tissue staining or the like. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, and the F (ab ') 2 , Fab ′ or Fab fraction may be used.
The method for quantifying H7TBA62 using the antibody of the present invention is not particularly limited, and the amount of an antibody, an antigen, or an antibody-antigen complex corresponding to the amount of an antigen (for example, the amount of H7TBA62) in a liquid to be measured is determined. Any measurement method may be used as long as it is detected by physical or physical means and calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephelometry, competition method, immunometric method and sandwich method are suitably used, but it is particularly preferable to use the sandwich method described later in terms of sensitivity and specificity.
[0055]
As a labeling agent used in a measuring method using a labeling substance, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. As the radioisotope, for example, [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C] is used. As the above-mentioned enzyme, a stable enzyme having a large specific activity is preferable. For example, β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used. As the fluorescent substance, for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used. As the luminescent substance, for example, luminol, a luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used. Further, a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
For the insolubilization of the antigen or the antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing and immobilizing a GPCR or an enzyme may be used. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
In the sandwich method, the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction). By measuring the activity of the labeling agent, the amount of H7TBA62 in the test solution can be determined. The primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times. The labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above. In addition, in the immunoassay by the sandwich method, the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. You may.
[0056]
In the method for measuring H7TBA62 by the sandwich method of the present invention, as the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction, an antibody having a different site to which H7TBA62 binds is preferably used. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of H7TBA62, the antibody used in the primary reaction is preferably the C-terminal. In addition, for example, an antibody that recognizes the N-terminal is used.
The monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, a nephrometry, or the like.
In the competition method, after the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated. (B / F separation), the amount of any of B and F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified. In this reaction method, a soluble antibody is used as the antibody, B / F separation is performed using polyethylene glycol, a liquid phase method using a second antibody against the antibody, or a solid phase antibody is used as the first antibody. A solid-phase method using a soluble antibody as the first antibody and using a solid-phased antibody as the second antibody is used.
In the immunometric method, the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a fixed amount of the labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. And an excess amount of the labeled antibody, and then immobilized antigen is added to bind unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in any phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
In nephelometry, the amount of insoluble sediment produced as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
In applying these individual immunological measurement methods to the quantification method of the present invention, no special conditions, operations, and the like need to be set. What is necessary is just to construct the measurement system of H7TBA62 by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews, books, and the like.
For example, Hiroe Irie, "Radio Immunoassay" (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie, "Radio Immunoassay" (Kodansha, published in 1974), Eiji Ishikawa et al., "Enzyme Immunoassay" (Medical Shoin, Showa Ed. Ishikawa et al., “Enzyme Immunoassay” (2nd edition) (Issue Shoin, 1982), Eiji Ishikawa et al. “Enzyme Immunoassay” (Third Edition), 3rd edition (Medical Shoin, Showa) 62)), "Methods in ENZYMOLOGY" Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), ibid., Vol. 73 (Immunochemical Technologies (Part B)), ibid., Vol. 74 (Immunochemical Technologies (Part C)), ibid., Vol. 84 (Immunochemical Technologies (Part D: Selected Immunoassays)), ibid., Vol. 92 (Immunochemical Technologies (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibid., Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (all published by Academic Press) can be referred to.
As described above, H7TBA62 can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
[0057]
Furthermore, when a decrease in the concentration of the H7TBA62 is detected by quantifying the concentration of the H7TBA62 using the antibody of the present invention, for example, in a disease associated with dysfunction of the H7TBA62, particularly a disorder related to central and peripheral nerve dysfunction. It can be diagnosed that they are likely to be affected or likely to be affected in the future.
In addition, when an increase in the concentration of H7TBA62 is detected, for example, it can be diagnosed that there is a high possibility of suffering from a disease caused by overexpression of the GPCR, or that there is a high possibility of suffering from the disease in the future. .
Diseases associated with H7TBA62 dysfunction include, for example, neuroactive nasal congestion or mucosal hyperemia, or acute circulatory failure or hypotension.
Examples of the disease caused by overexpression of H7TBA62 include peripheral circulatory disorder, hypertension, depression, obsessive-compulsive disorder, obsessive-compulsive disorder, panic disorder, anxiety disorder, eating disorder, ischemic disease, and administration of antineoplastic drug. Gastrointestinal symptoms, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, chronic pancreatitis, adult respiratory distress syndrome, alcohol withdrawal syndrome, Alzheimer's disease, ankylosing spondylitis, arrhythmia, cocaine withdrawal syndrome, dementia, diarrhea, gastritis, hepatitis, infection, Opiate withdrawal syndrome, osteoarthritis, osteoporosis, osteoporotic disease, peptic ulcer, peripheral vasculopathy, sequelae of myocardial infarction, reflux esophagitis, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, ulcerative colitis or non- And stable angina.
Furthermore, the antibody of the present invention can be used, for example, for cancer (eg, prostate cancer, colorectal cancer, etc.), infectious disease, pain, anorexia nervosa, bulimia, asthma, Parkinson's disease, acute heart failure, hypotension, hypertension, urinary retention, bone Osteoporosis, angina, myocardial infarction, ulcer, allergy, benign prostatic hyperplasia, psychiatric / neurological disorders (anxiety, schizophrenia, depression, delirium, dementia, severe mental retardation and motor abnormalities, Huntington's chorea, Jill It can also be used as a diagnostic agent for diseases such as de la Tourette syndrome).
[0058]
(5) Method for screening agonist for H7TBA62
The binding of oxymetazoline to H7TBA62 inhibits the production of intracellular cAMP. Therefore, H7TBA62 is useful as a reagent for searching for or determining agonists (including natural ligands) other than oxymetazoline for H7TBA62 using the activity of inhibiting the production of intracellular cAMP as an index.
That is, the present invention provides a method for determining an agonist for H7TBA62, which comprises measuring the activity of suppressing H7TBA62-mediated intracellular cAMP production when a test compound is brought into contact with cells containing H7TBA62. Test compounds include known ligands (eg, angiotensin, bombesin, cannabinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasopressin, oxytocin, PACAP (eg, PACAP27, PACAP38), secretin, Glucagon, calcitonin, adrenomedullin, somatostatin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (Vasoactive Intestinal and Related Polypeptide), somatostatin, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcitonin gene relayed peptide) ), Leukotriene, pancreastatin, prostaglandin, thromboxane, adenosine, adrenaline And chemokine superfamily (eg, CXC chemokine subfamily such as IL-8, GROα, GROβ, GROγ, NAP-2, ENA-78, GCP-2, PF4, IP-10, Mig, PBSF / SDF-1; MCAF / MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, eotaxin, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, HCC-1, MIP-3α / LARC, MIP-3β / ELC, I-309, TARC , MIPF-1, MIPF-2 / eotaxin-2, MDC, DC-CK1 / PARC, CC chemokine subfamily such as SLC; C chemokine subfamily such as lymphotoactin; CX3C chemokine subfamily such as fractionalkine, etc.), endothelin, entero Gust Histamine, neurotensin, TRH, pancreatic polypeptide, galanin, lysophosphatidic acid (LPA), sphingosine 1-phosphate, etc.), as well as, for example, humans or mammals (eg, mice, rats, pigs, Tissue extracts of bovine, ovine, monkey, etc.), cell culture supernatants, low molecular weight synthetic compounds and the like are used. For example, the tissue extract, the cell culture supernatant, and the like are added to H7TBA62, and fractionated while measuring cell stimulating activity and the like, to finally obtain a single ligand.
[0059]
(6) Screening method for compounds (agonists, antagonists, etc.) that change the binding between H7TBA62 and ligand, and pharmaceuticals containing compounds that change the binding between H7TBA62 and ligand
By using H7TBA62 or constructing a recombinant H7TBA62 expression system and using a receptor binding assay system using the expression system, the binding between H7TBA62 and oxymetazoline having ligand-like activity for H7TBA62 (Eg, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc.) or salts thereof can be efficiently screened.
Such compounds include (a) compounds having a cell stimulating activity via H7TBA62 (so-called agonists against H7TBA62), (b) compounds having no cell-stimulating activity (so-called antagonists against H7TBA62), and (c) Examples include a compound that enhances the binding force between oxymetazoline and H7TBA62, and (d) a compound that decreases the binding force between oxymetazoline and H7TBA62.
That is, the present invention provides a method for comparing (i) a case where H7TBA62 is brought into contact with oxymetazoline and (ii) a case where H7TBA62 is brought into contact with oxymetazoline and a test compound. A method for screening a compound or a salt thereof that alters the binding between zoline and H7TBA62 is provided. The screening method of the present invention is characterized in that, in the cases (i) and (ii), for example, the amount of oxymetazoline bound to H7TBA62, the cell stimulating activity, and the like are measured and compared.
Cell stimulating activity includes, for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, etc. Among them, the activity of inhibiting intracellular cAMP production is preferred.
[0060]
More specifically, the present invention provides
a) The amount of labeled oxymetazoline bound to the receptor was measured when the labeled oxymetazoline was brought into contact with H7TBA62 and when the labeled oxymetazoline and the test compound were brought into contact with H7TBA62. A method for screening a compound or a salt thereof, which alters the binding property between oxymetazoline and the receptor, comprising:
b) When the labeled oxymetazoline is brought into contact with the cell containing H7TBA62 or the membrane fraction of the cell, and when the labeled oxymetazoline and the test compound are brought into contact with the cell containing H7TBA62 or the membrane fraction of the cell. Measuring the amount of binding of the labeled oxymetazoline to the cell or the membrane fraction in the case of contact, and comparing the amount of the compound or the salt thereof, which changes the binding property between oxymetazoline and H7TBA62. Screening method,
c) When the labeled oxymetazoline is brought into contact with H7TBA62 expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention, the labeled oxymetazoline and the test compound are combined with the DNA of the present invention. Oxymetazoline characterized by measuring and comparing the amount of labeled oxymetazoline bound to the receptor when H7TBA62 expressed on the cell membrane is contacted by culturing a transformant containing A method for screening a compound or a salt thereof that alters the binding to the receptor,
[0061]
d) When a compound that activates H7TBA62 (eg, oxymetazoline) is brought into contact with cells containing H7TBA62, and when a compound that activates H7TBA62 and a test compound are brought into contact with cells that contain H7TBA62. Measuring and comparing cell stimulating activities mediated by H7TBA62, and a method for screening a compound or a salt thereof that alters the binding property between a ligand and the GPCR, and
e) H7TBA62 is activated when a compound that activates H7TBA62 (for example, oxymetazoline) is brought into contact with H7TBA62 expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention. The method comprises measuring and comparing receptor-mediated cell stimulating activity when a compound and a test compound are brought into contact with H7TBA62 expressed on a cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention. Provided is a method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between a ligand and H7TBA62. Further, instead of oxymetazoline, a compound that changes the binding property between oxymetazoline and H7TBA62 or a salt thereof can be used as the ligand. The compound that changes the binding property between oxymetazoline and H7TBA62 or a salt thereof can be obtained, for example, by using the oxymetazoline as a ligand and performing the below-described screening method of the present invention. In the following screening methods, oxymetazoline is simply referred to as including a compound that changes the binding property between oxymetazoline and H7TBA62 or a salt thereof.
[0062]
The specific description of the screening method of the present invention is as follows.
First, as the H7TBA62 used in the screening method of the present invention, any H7TBA62 may be used as long as it contains the above-described H7TBA62, but a cell membrane fraction of a mammalian organ containing the H7TBA62 is preferable. However, since human-derived organs are particularly difficult to obtain, human-derived H7TBA62 and the like, which are expressed in large amounts using recombinants, are suitable for screening.
The above-mentioned method is used for producing H7TBA62, but it is preferably carried out by expressing the DNA of the present invention in mammalian cells or insect cells. A complementary DNA is used as the DNA fragment encoding the target protein portion, but is not necessarily limited thereto. For example, a gene fragment or a synthetic DNA may be used. In order to introduce the DNA fragment encoding H7TBA62 into host animal cells and express them efficiently, the DNA fragment must be isolated from a nuclear polyhedrosis virus (NPV) belonging to a baculovirus using an insect as a host. It is preferable to incorporate the gene into the downstream of a polyhedrin promoter, an SV40-derived promoter, a retrovirus promoter, a metallothionein promoter, a human heat shock promoter, a cytomegalovirus promoter, and an SRα promoter. The quantity and quality of the expressed receptor can be examined by a method known per se. For example, the literature [Nambi, P .; Et al., The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 267, 19555-19559, 1992].
Therefore, in the screening method of the present invention, H7TBA62 may be H7TBA62 purified according to a method known per se, or may be a cell containing the receptor, or may be a cell containing the receptor. Alternatively, the membrane fraction of the cells to be used may be used.
[0063]
When cells containing H7TBA62 are used in the screening method of the present invention, the cells may be immobilized with glutaraldehyde, formalin, or the like. The immobilization method can be performed according to a method known per se.
The H7TBA62-containing cell refers to a host cell that has expressed the receptor, and the host cell is preferably Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, and the like.
The cell membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se. As a method for crushing the cells, a method of crushing the cells with a Potter-Elvehjem type homogenizer, crushing with a Waring blender or a polytron (manufactured by Kinematica), crushing with an ultrasonic wave, ejection of the cells from a thin nozzle while applying pressure by a French press or the like. Crushing and the like. For fractionation of cell membranes, fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation or density gradient centrifugation is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500-3000 rpm) for a short time (usually about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (15000 to 30000 rpm) for usually 30 minutes to 2 hours. Is the membrane fraction. The membrane fraction contains a large amount of expressed H7TBA62 and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
The amount of H7TBA62 in cells containing H7TBA62 and in the membrane fraction was 10 per cell. 3 -10 8 Preferably a molecule 5 -10 7 Preferably it is a molecule. The higher the expression level, the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, which makes it possible not only to construct a highly sensitive screening system, but also to measure a large number of samples in the same lot. .
[0064]
In order to carry out the above a) to c) for screening a compound that changes the binding property between oxymetazoline and H7TBA62, for example, an appropriate H7TBA62 fraction and labeled oxymetazoline are required.
The H7TBA62 fraction is preferably a natural H7TBA62 fraction or a recombinant GPCR fraction having an activity equivalent thereto. Here, “equivalent activity” refers to equivalent ligand binding activity, signal transduction action, and the like.
As the labeled oxymetazoline, labeled oxymetazoline or a salt thereof, or a labeled oxymetazoline analog is used. For example, [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 S] and the like.
Specifically, to screen for a compound that changes the binding property between oxymetazoline and H7TBA62, first, cells containing H7TBA62 or a membrane fraction of the cells are suspended in a buffer suitable for screening. Prepare the GPCR standard. Any buffer may be used as long as it does not inhibit the binding between oxymetazoline and H7TBA62, such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a tris-hydrochloric acid buffer. Further, in order to reduce non-specific binding, CHAPS, Tween-80 are used. TM Surfactants such as (Kao-Atlas), digitonin and deoxycholate can also be added to the buffer. Furthermore, a protease inhibitor such as PMSF, leupeptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Laboratories), pepstatin and the like can be added for the purpose of suppressing the degradation of the receptor or ligand by the protease. To 0.01 to 10 ml of the receptor solution, a fixed amount (5000 to 500000 cpm) of labeled oxymetazoline is added, and -4 M-10 -10 M test compounds are allowed to coexist. A reaction tube containing a large excess of unlabeled oxymetazoline is also prepared to determine the non-specific binding amount (NSB). The reaction is carried out at about 0-50 ° C, preferably about 4-37 ° C, for about 20 minutes to 24 hours, preferably for about 30 minutes to 3 hours. After the reaction, the mixture is filtered with a glass fiber filter or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured with a liquid scintillation counter or a γ-counter. Count when there is no antagonist (B 0 ) Minus the amount of non-specific binding (NSB) (B 0 -NSB) as 100%, a test compound having a specific binding amount (B-NSB) of, for example, 50% or less can be selected as a candidate substance having competitive inhibitory ability.
[0065]
In order to carry out the above-mentioned methods d) to e) of screening for a compound that alters the binding property between oxymetazoline and H7TBA62, for example, a known method or a commercially available kit for measuring H7TBA62-mediated cell stimulating activity Can be measured.
Specifically, first, cells containing H7TBA62 are cultured in a multiwell plate or the like. When performing screening, replace the cells with a fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to the cells in advance, add the test compound, etc., incubate for a certain period of time, and then extract the cells or collect the supernatant to generate the cells. The quantified product is quantified according to each method. When the production of a substance (for example, arachidonic acid) as an indicator of cell stimulating activity is difficult due to a degrading enzyme contained in a cell, an assay may be performed by adding an inhibitor to the degrading enzyme. In addition, the activity such as cAMP production suppression can be detected as a production suppression effect on cells whose basic production has been increased by forskolin or the like.
In order to perform screening by measuring cell stimulating activity, cells expressing appropriate H7TBA62 are required. As the cells expressing H7TBA62, cell lines having natural H7TBA62, the above-described cell lines expressing recombinant H7TBA62, and the like are desirable.
As the test compound, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts and the like are used, and even if these compounds are novel compounds, Or a known compound.
As the test compound, a compound designed to bind to the ligand binding pocket based on the atomic coordinates of the active site of H7TBA62 and the position of the ligand binding pocket is preferably used. The atomic coordinates of the active site of H7TBA62 and the position of the ligand binding pocket can be measured by a known method or a method analogous thereto.
Whether the compound that alters the binding property between oxymetazoline and H7TBA62 is an agonist or an antagonist can be confirmed using the above-described method for screening an agonist for H7TBA62.
[0066]
Screening kits for compounds or salts thereof that alter the binding between oxymetazoline and H7TBA62 include those containing H7TBA62, cells containing H7TBA62, or membrane fractions of cells containing H7TBA62.
Examples of the screening kit of the present invention include the following.
1. Screening reagent
a) Measurement buffer and washing buffer
Hanks' Balanced Salt Solution (manufactured by Gibco) plus 0.05% bovine serum albumin (manufactured by Sigma).
The solution may be sterilized by filtration through a 0.45 μm filter and stored at 4 ° C., or may be prepared at use.
b) H7TBA62 standard
CHO cells expressing H7TBA62 were placed in a 12-well plate at 5 × 10 5 5 Passage at 37 ° C, 5% CO 2 , Cultured at 95% air for 2 days.
c) Labeled oxymetazoline
Commercially available [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 Oxymetazoline labeled with [S]
The aqueous solution is stored at 4 ° C. or −20 ° C., and diluted to 1 μM with a measuring buffer before use.
d) Oxymetazoline standard solution
Oxymetazoline is dissolved to a concentration of 1 mM in PBS containing 0.1% bovine serum albumin (manufactured by Sigma) and stored at -20 ° C.
[0067]
2. Measurement method
a) H7TBA62-expressing CHO cells cultured on a 12-well tissue culture plate are washed twice with 1 ml of the measurement buffer, and 490 μl of the measurement buffer is added to each well.
b) 10 -3 -10 -10 After adding 5 μl of the test compound solution of M, 5 μl of labeled oxymetazoline is added, and reacted at room temperature for 1 hour. To determine the amount of non-specific binding, 10 -3 Add 5 μl of M oxymetazoline.
c) Remove the reaction solution and wash three times with 1 ml of washing buffer. The labeled ligand bound to the cells is dissolved in 0.2N NaOH-1% SDS, and mixed with 4 ml of liquid scintillator A (manufactured by Wako Pure Chemical Industries).
d) Radioactivity is measured using a liquid scintillation counter (manufactured by Beckman), and Percent Maximum Binding (PMB) is determined by the following equation.
PMB = [(B-NSB) / (B 0 −NSB)] × 100
PMB: Percent Maximum Binding
B: Value when the sample was added
NSB: Non-specific Binding (Non-specific binding amount)
B 0 : Maximum binding amount
[0068]
The compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a compound having an effect of changing the binding property between a ligand and H7TBA62, and specifically, (a) a cell via H7TBA62 A compound having a stimulating activity (so-called agonist for H7TBA62), (b) a compound having no such cell-stimulating activity (a so-called antagonist to H7TBA62), (c) a compound for enhancing the binding force between a ligand and H7TBA62, or (d) ) A compound that decreases the binding force between a ligand and H7TBA62.
Such compounds include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like, and these compounds may be novel compounds or known compounds.
Since an agonist for H7TBA62 has the same physiological activity as oxymetazoline having a ligand-like activity for H7TBA62, it is useful as a safe and low-toxic drug according to the physiological activity of the ligand for H7TBA62. Since an antagonist to H7TBA62 can suppress the physiological activity of the ligand for H7TBA62, it is useful as a safe and low-toxic drug for suppressing the physiological activity of the H7TBA62 ligand.
A compound that enhances the binding strength between oxymetazoline and H7TBA62 can enhance the physiological activity of the ligand for H7TBA62, and is therefore useful as a safe and low-toxic drug according to the physiological activity of the H7TBA62 ligand.
A compound that decreases the binding force between oxymetazoline and H7TBA62 can reduce the physiological activity of the ligand for H7TBA62, and is therefore useful as a safe and low-toxic drug for suppressing the physiological activity of the H7TBA62 ligand.
Specifically, (1) an agonist for H7TBA62 or (2) a compound that enhances the binding force between oxymetazoline and H7TBA62 or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a vasoconstrictor , A serotonin agonist, an acetylcholine release promoter, a gastrointestinal motility enhancer, a smooth muscle constrictor, a platelet aggregating agent, a central nervous system stimulant or a cardiotonic agent. Specifically, these compounds or salts thereof are used, for example, as agents for removing neuroactive nasal congestion or mucosal congestion, or as agents for preventing or treating acute circulatory insufficiency or hypotension, ophthalmic drugs, and topical vessels for nasal drops. Useful as a contractile.
(1) an antagonist to H7TBA62 or (2) a compound or a salt thereof that reduces the binding force between oxymetazoline and H7TBA62, which is obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention, is a vasodilator, a vasoconstriction inhibitor , A serotonin agent, an acetylcholine release inhibitor, a gastrointestinal motility inhibitor, a smooth muscle contraction inhibitor, a platelet aggregation inhibitor or a central nervous system inhibitor. Specifically, those compounds or salts thereof include, for example, peripheral circulatory disorder, hypertension, depression, obsessive-compulsive disorder, obsessive-compulsive disorder, panic disorder, anxiety disorder, eating disorder, ischemic disease, antineoplastic tumor Gastrointestinal symptoms associated with drug administration, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, chronic pancreatitis, adult respiratory distress syndrome, alcohol withdrawal syndrome, Alzheimer's disease, stiff spondylitis, arrhythmia, cocaine withdrawal syndrome, dementia, diarrhea, gastritis, hepatitis, infection Syndrome, opiate withdrawal syndrome, osteoarthritis, osteoporosis, bone pechet disease, peptic ulcer, peripheral vasculopathy, sequelae of myocardial infarction, reflux esophagitis, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, ulcerative colitis Or it is useful as a prophylactic / therapeutic agent for unstable angina.
Furthermore, compounds or salts thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention include, for example, cancer (eg, prostate cancer, colorectal cancer, etc.), infectious disease, pain, anorexia nervosa, bulimia, asthma, Parkinson Disease, acute heart failure, hypotension, hypertension, urinary retention, osteoporosis, angina, myocardial infarction, ulcer, allergy, benign prostatic hypertrophy, psychiatric / neurological disorders (anxiety, schizophrenia, depression, delirium, dementia, severe It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for diseases such as mental retardation and motor abnormalities of symptoms, Huntington's chorea, and Jill de la Tourette syndrome.
[0069]
When the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned pharmaceutical composition, it can be formulated according to a conventional method.
For example, the compound may be a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule, or the like, as needed, orally, or a sterile solution of water or other pharmaceutically acceptable liquid, Alternatively, they can be used parenterally in the form of injections such as suspensions. For example, the compound may be mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like, in a unit dosage form required for generally accepted pharmaceutical practice. Can be manufactured by The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
Examples of additives that can be incorporated into tablets, capsules, and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Useful bulking agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry and the like are used. When the unit dosage form is a capsule, a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As the aqueous solution for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used. For example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80) TM , HCO-50) and the like. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and they may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
[0070]
The above-mentioned medicines include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum albumin, (Eg, polyethylene glycol), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, and should be administered to humans and mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc., but, for example, usually in the form of an injection, for example, an acute circulatory failure patient (with a body weight of 60 kg) In the above, it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
[0071]
(7) Elucidation of the mechanism of action of various drugs
By using H7TBA62, it is possible to confirm whether or not various drugs exert a pharmacological effect via H7TBA62.
That is, the present invention
(1) H7TBA62 is used, (i) vasoconstrictor, (ii) serotonin agonist, (iii) acetylcholine release promoter, (iv) gastrointestinal motility enhancer, (v) smooth muscle constrictor , (Vi) platelet aggregating agent, (vii) central nervous system stimulant, (viii) inotropic agent, (ix) agent for removing neuroactive nasal congestion or mucosal hyperemia, (x) prevention of acute circulatory failure or hypotension Therapeutic, (xi) ophthalmic drug, (xii) local vasoconstrictor for nasal drops, (xiii) vasodilator, (xiv) vasoconstrictor, (xv) antiserotonin, (xvi) acetylcholine release inhibitor (Xvii) gastrointestinal motility inhibitor, (xviii) smooth muscle contraction inhibitor, (xix) platelet aggregation inhibitor, (xx) central nervous system inhibitor or (xxi) peripheral circulatory disorder, hypertension, depression, obsessive-compulsive Disorder, obsessive-compulsive disorder, panic disorder, anxiety disorder, eating disorder, ischemic disease, gastrointestinal symptoms associated with antineoplastic drug administration, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, chronic pancreatitis, adult respiratory distress syndrome, alcohol withdrawal syndrome, Alzheimer's disease, ankylosing spondylitis, arrhythmia, cocaine withdrawal syndrome, dementia, diarrhea, gastritis, hepatitis, infectious disease, opiate withdrawal syndrome, osteoarthritis, osteoporosis, bone Petchet disease, peptic ulcer, peripheral vasculopathy, myocardial infarction Sequelae, reflux esophagitis, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, a method for confirming that a preventive or therapeutic agent for ulcerative colitis or unstable angina binds to the receptor protein or a salt thereof,
(2) H7TBA62 is used, (i) vasoconstrictor, (ii) serotonin agonist, (iii) acetylcholine release promoter, (iv) gastrointestinal motility enhancer, (v) smooth muscle constrictor , (Vi) platelet aggregating agent, (vii) central nervous system stimulant, (viii) inotropic agent, (ix) agent for removing neuroactive nasal congestion or mucosal hyperemia, (x) prevention of acute circulatory failure or hypotension A method for confirming that a therapeutic drug, (xi) an ophthalmic drug or (xii) a local vasoconstrictor for nasal drops is an agonist for the receptor protein or a salt thereof,
(3) using H7TBA62, (i) a vasodilator, (ii) a vasoconstrictor, (iii) an anti-serotonin, (iv) acetylcholine release inhibitor, (v) a gastrointestinal motility inhibitor (Vi) smooth muscle contraction inhibitors, (vii) platelet aggregation inhibitors, (viii) central nervous system depressants or (ix) peripheral circulatory disorders, hypertension, depression, obsessive-compulsive disorder, obsessive-compulsive disorder, panic disorder, Anxiety disorder, eating disorder, ischemic disease, gastrointestinal symptoms associated with antineoplastic drug administration, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, chronic pancreatitis, adult respiratory distress syndrome, alcohol withdrawal syndrome, Alzheimer's disease, ankylosing spondylitis, arrhythmia , Cocaine withdrawal syndrome, dementia, diarrhea, gastritis, hepatitis, infectious disease, opiate withdrawal syndrome, osteoarthritis, osteoporosis, osteopechemia, peptic ulcer, peripheral vascular disease, myocardial infarction Confirm that the preventive / therapeutic agent for sequelae, reflux esophagitis, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, ulcerative colitis or unstable angina is an antagonist to the receptor protein or a salt thereof. Method,
(4) The screening method according to any one of (1) to (3) above, wherein the amount of binding between each drug and H7TBA62 when each drug is brought into contact with H7TBA62 is measured.
Further, examples of the drug include cancer (eg, prostate cancer, colorectal cancer, etc.), infectious disease, pain, anorexia nervosa, bulimia, asthma, Parkinson's disease, acute heart failure, hypotension, hypertension, urinary retention, osteoporosis Angina, myocardial infarction, ulcer, allergy, benign prostatic hyperplasia, psychiatric / neurological disorders (anxiety, schizophrenia, depression, delirium, dementia, severe mental retardation and motor abnormalities, Huntington's chorea, Jill de Drugs for preventing or treating diseases such as La Tourette syndrome) can also be used.
This confirmation method can be carried out by using the above-mentioned drug instead of the test compound in the above-mentioned method for screening a compound that changes the binding property between oxymetazoline and H7TBA62.
The kit for a confirmation method of the present invention is a kit for screening a compound that changes the binding property between the ligand and H7TBA62, and contains the above drug in place of the test compound.
As described above, by using the confirmation method of the present invention, it is possible to confirm that various drugs that are commercially available or under development are exhibiting pharmacological effects via H7TBA62.
[0072]
(8) A medicine containing a compound that changes the amount of H7TBA62 or a partial peptide thereof in a cell membrane
Since the antibody of the present invention can specifically recognize H7TBA62, it can be used for screening a compound that changes the amount of H7TBA62 in a cell membrane.
That is, the present invention, for example,
(I) After destruction of a) blood of a non-human mammal, b) a specific organ, c) tissue or cells isolated from the organ, the cell membrane fraction is isolated, and H7TBA62 contained in the cell membrane fraction is determined. A method for screening a compound that changes the amount of H7TBA62 in a cell membrane,
(Ii) a method for screening a compound that changes the amount of H7TBA62 in a cell membrane by disrupting a transformant or the like that expresses H7TBA62, isolating a cell membrane fraction, and quantifying H7TBA62 contained in the cell membrane fraction;
(Iii) a) a non-human mammal's blood, b) a specific organ, c) a tissue or cells isolated from an organ, and then using the immunostaining method to obtain the receptor protein on the cell surface. The present invention provides a method for screening for a compound that changes the amount of H7TBA62 in a cell membrane by confirming the protein on the cell membrane by quantifying the degree of staining.
(Iv) H7TBA62-expressing transformants and the like are sectioned, and the staining level of the receptor protein on the cell surface is quantified by immunostaining to confirm the protein on the cell membrane. And a method for screening a compound that alters the amount of H7TBA62 in a cell membrane.
[0073]
The quantification of H7TBA62 contained in the cell membrane fraction is specifically performed as follows.
(I) Normal or disease model non-human mammals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, dementia rats, obese mice, arteriosclerotic rabbits, cancer-bearing A drug (eg, an anti-dementia drug, a blood pressure lowering drug, an anti-cancer drug, an anti-obesity drug, etc.) or a physical stress (eg, waterlogging stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.), etc. After the passage, blood or a specific organ (eg, brain, liver, kidney, etc.), or a tissue or cell isolated from the organ is obtained. The obtained organ, tissue or cell is suspended in, for example, an appropriate buffer (eg, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, Hepes buffer, etc.), and the organ, tissue or cell is destroyed. Activator (eg, Triton X100 TM , Tween 20 TM And the like, and further using a method such as centrifugation, filtration, or column fractionation to obtain a cell membrane fraction.
The cell membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se. As a method for crushing the cells, a method of crushing the cells with a Potter-Elvehjem type homogenizer, crushing with a Waring blender or a polytron (manufactured by Kinematica), crushing by ultrasonic waves, and squirting the cells from a thin nozzle while applying pressure by a French press or the like. Crushing and the like. For fractionation of cell membranes, fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation or density gradient centrifugation is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500-3000 rpm) for a short time (usually about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (15000 to 30000 rpm) for usually 30 minutes to 2 hours. Is the membrane fraction. The membrane fraction contains a large amount of expressed H7TBA62 and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
H7TBA62 contained in the cell membrane fraction can be quantified by, for example, sandwich immunoassay using the antibody of the present invention, Western blot analysis, or the like.
Such a sandwich immunoassay can be performed in the same manner as described above, and the Western blot can be performed by a means known per se.
(Ii) A transformant expressing H7TBA62 is prepared according to the method described above, and H7TBA62 contained in the cell membrane fraction can be quantified.
[0074]
Screening for compounds that alter the amount of H7TBA62 in the cell membrane
(I) A given time (30 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 12 hours, more preferably 1 hour) before giving a drug or physical stress to a normal or disease model non-human mammal Before to 6 hours before) or after a certain time (after 30 minutes to 3 days, preferably after 1 hour to 2 days, more preferably after 1 hour to 24 hours), or at the same time as the drug or physical stress. After a certain period of time (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours) after the administration, the amount of H7TBA62 in the cell membrane is determined. It is possible,
(Ii) When culturing the transformant according to a conventional method, the test compound is mixed in the medium, and after culturing for a certain period of time (1 day to 7 days, preferably 1 day to 3 days, more preferably 2 days to 3 days) Days later) by quantifying the amount of H7TBA62 in the cell membrane.
The confirmation of H7TBA62 contained in the cell membrane fraction is specifically performed as follows.
(Iii) Normal or disease model non-human mammals (eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, dementia rats, obese mice, arteriosclerotic rabbits, cancer-bearing A drug (eg, an anti-dementia drug, a blood pressure lowering drug, an anti-cancer drug, an anti-obesity drug, etc.) or a physical stress (eg, waterlogging stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.), etc. After the passage, blood or a specific organ (eg, brain, liver, kidney, etc.), or a tissue or cell isolated from the organ is obtained. The obtained organ, tissue or cell is cut into a tissue section according to a conventional method, and immunostaining is performed using the antibody of the present invention. By quantifying the degree of staining of the receptor protein on the cell surface and confirming the protein on the cell membrane, the amount of H7TBA62 in the cell membrane can be confirmed quantitatively or qualitatively.
(Iv) It can also be confirmed by using a transformant expressing H7TBA62 or the like and performing the same procedure.
[0075]
The compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is a compound having an action of changing the amount of H7TBA62 in the cell membrane. Specifically, (a) increasing the amount of H7TBA62 in the cell membrane A compound that enhances the cell stimulating activity via the G protein-coupled receptor, and (b) a compound that reduces the cell stimulating activity by decreasing the amount of H7TBA62 in the cell membrane.
Such compounds include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like, and these compounds may be novel compounds or known compounds.
A compound that enhances the cell stimulating activity by increasing the amount of H7TBA62 in the cell membrane is useful as a safe and low-toxic prophylactic / therapeutic agent for diseases associated with dysfunction of H7TBA62.
Compounds that decrease the cell stimulating activity by reducing the amount of H7TBA62 in the cell membrane are useful as safe and low-toxic prophylactic / therapeutic agents for diseases caused by overexpression of H7TBA62.
Specifically, a compound or a salt thereof that increases the amount of H7TBA62 is a vasoconstrictor, a serotonin agonist, an acetylcholine release promoter, a gastrointestinal motility enhancer, a smooth muscle constrictor, a platelet aggregating agent, a central nervous system stimulant or Can be used as a cardiotonic. Specifically, these compounds or salts thereof are used, for example, as agents for removing neuroactive nasal congestion or mucosal congestion, or as agents for preventing or treating acute circulatory insufficiency or hypotension, ophthalmic drugs, and topical vessels for nasal drops. Useful as a contractile.
Compounds or salts thereof that reduce the amount of H7TBA62 in the cell membrane are vasodilators, vasoconstrictors, antiserotonins, acetylcholine release inhibitors, gastrointestinal motility inhibitors, smooth muscle contraction inhibitors, platelet aggregation inhibitors or central It can be used as a neurodepressant. Specifically, those compounds or salts thereof include, for example, peripheral circulatory disorder, hypertension, depression, obsessive-compulsive disorder, obsessive-compulsive disorder, panic disorder, anxiety disorder, eating disorder, ischemic disease, antineoplastic tumor Gastrointestinal symptoms associated with drug administration, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, chronic pancreatitis, adult respiratory distress syndrome, alcohol withdrawal syndrome, Alzheimer's disease, stiff spondylitis, arrhythmia, cocaine withdrawal syndrome, dementia, diarrhea, gastritis, hepatitis, infection Syndrome, opiate withdrawal syndrome, osteoarthritis, osteoporosis, bone pechet disease, peptic ulcer, peripheral vasculopathy, sequelae of myocardial infarction, reflux esophagitis, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, ulcerative colitis Or it is useful as a prophylactic / therapeutic agent for unstable angina.
Furthermore, compounds or salts thereof that alter the amount of H7TBA62 in the cell membrane include, for example, cancer (eg, prostate cancer, colorectal cancer, etc.), infectious disease, pain, anorexia nervosa, bulimia, asthma, Parkinson's disease, acute heart failure, Blood pressure, hypertension, urinary retention, osteoporosis, angina pectoris, myocardial infarction, ulcer, allergy, benign prostatic hypertrophy, mental and neurological disorders (anxiety, schizophrenia, depression, delirium, dementia, severe mental retardation and exercise) It is useful as a preventive or therapeutic agent for diseases such as abnormalities, Huntington's chorea, and Jill de la Tourette syndrome.
When a compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is used as a pharmaceutical composition, it can be formulated according to a conventional method.
For example, the compound may be a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule, or the like, as needed, orally, or a sterile solution of water or other pharmaceutically acceptable liquid, Alternatively, they can be used parenterally in the form of injections such as suspensions. For example, the compound may be mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like, in a unit dosage form required for generally accepted pharmaceutical practice. Can be manufactured by The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
[0076]
Examples of additives that can be incorporated into tablets, capsules, and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Useful bulking agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry and the like are used. When the unit dosage form is a capsule, a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As the aqueous solution for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used. For example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80) TM , HCO-50) and the like. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and they may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
Examples of the prophylactic / therapeutic agents include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human Serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like may be added. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
The preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, and should be administered to humans and mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc., but, for example, usually in the form of an injection, for example, an acute circulatory failure patient (with a body weight of 60 kg) In the above, it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
[0077]
(9) A drug containing an antibody against H7TBA62
The neutralizing activity of an antibody against H7TBA62 means an activity of inactivating a signal transduction function involving the receptor. Therefore, when the antibody has neutralizing activity, signal transduction involving the receptor, for example, cell stimulating activity via the receptor (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuations, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, etc. Can be inactivated.
Therefore, an antibody against H7TBA62 (eg, a neutralizing antibody) can be used for a disease caused by overexpression of the receptor (eg, peripheral circulatory disorder, hypertension, depression, obsessive-compulsive disorder, obsessive-compulsive disorder, panic disorder, anxiety disorder) , Eating disorders, ischemic diseases, gastrointestinal symptoms associated with antineoplastic drug administration, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, chronic pancreatitis, adult respiratory distress syndrome, alcohol withdrawal syndrome, Alzheimer's disease, ankylosing spondylitis, arrhythmia, cocaine Withdrawal syndrome, dementia, diarrhea, gastritis, hepatitis, infectious disease, opiate withdrawal syndrome, osteoarthritis, osteoporosis, bone petchet disease, peptic ulcer, peripheral vasculopathy, sequelae of myocardial infarction, reflux esophagitis, rheumatoid arthritis, psychiatric Schizophrenia, sepsis, septic shock, diseases such as ulcerative colitis or unstable angina).
Furthermore, antibodies to H7TBA62 include, for example, cancer (eg, prostate cancer, colon cancer, etc.), infectious disease, pain, anorexia nervosa, bulimia, asthma, Parkinson's disease, acute heart failure, hypotension, hypertension, urinary retention, osteoporosis Disease, angina, myocardial infarction, ulcer, allergy, benign prostatic hyperplasia, psychiatric / neurological disorders (anxiety, schizophrenia, depression, delirium, dementia, severe mental retardation and motor abnormalities, Huntington's chorea, Jill de It can also be used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases such as La Tourette syndrome).
[0078]
(10) A medicine comprising the antisense DNA of the present invention
The antisense DNA of the present invention can be used for diseases caused by overexpression of H7TBA62 (eg, peripheral circulatory disorder, hypertension, depression, obsessive-compulsive disorder, obsessive-compulsive disorder, panic disorder, anxiety disorder, eating disorder, ischemic disorder). Disease, digestive symptoms associated with antineoplastic drug administration, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, chronic pancreatitis, adult respiratory distress syndrome, alcohol withdrawal syndrome, Alzheimer's disease, ankylosing spondylitis, arrhythmia, cocaine withdrawal syndrome, dementia, diarrhea, Gastritis, hepatitis, infectious disease, opiate withdrawal syndrome, osteoarthritis, osteoporosis, bone pechet disease, peptic ulcer, peripheral vasculopathy, sequelae of myocardial infarction, reflux esophagitis, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock Ulcerative colitis or diseases such as unstable angina pectoris).
Furthermore, the antisense DNA of the present invention can be used, for example, for cancer (eg, prostate cancer, colorectal cancer, etc.), infectious disease, pain, anorexia nervosa, bulimia, asthma, Parkinson's disease, acute heart failure, hypotension, hypertension, urinary retention. Osteoporosis, angina, myocardial infarction, ulcer, allergy, benign prostatic hyperplasia, psychiatric / neurological disorders (anxiety, schizophrenia, depression, delirium, dementia, severe mental retardation and motor abnormalities, Huntington's chorea, It can also be used as an agent for preventing or treating diseases such as Jill de la Tourette syndrome).
For example, when using the antisense DNA, the antisense DNA can be used alone or after being inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like, followed by a conventional method. The antisense DNA can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and can be administered using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
Furthermore, the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence of the DNA of the present invention in tissues or cells and the state of expression thereof.
[0079]
(11) Preparation of the DNA-introduced animal of the present invention
The present invention relates to a non-human mammal having a foreign DNA of the present invention (hereinafter abbreviated as the foreign DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the foreign mutant DNA of the present invention). provide.
That is, the present invention
[1] a non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof,
[2] the animal of [1], wherein the non-human mammal is a rodent;
[3] the animal of [2], wherein the rodent is a mouse or a rat, and
[4] It is to provide a recombinant vector containing the exogenous DNA of the present invention or its mutant DNA and capable of being expressed in mammals.
Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof (hereinafter abbreviated as the DNA-transferred animal of the present invention) can be used for non-fertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, And preferably at the stage of embryonic development in non-human mammal development (more preferably at the stage of single cells or fertilized eggs and generally before the 8-cell stage), the calcium phosphate method, the electric pulse method, the lipofection method, the agglutination method, It can be produced by transferring a target DNA by a microinjection method, a particle gun method, a DEAE-dextran method, or the like. Further, by the DNA transfer method, the exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like, and can be used for cell culture, tissue culture, and the like. The DNA-transferred animal of the present invention can also be produced by fusing the above-mentioned germ cells with a cell fusion method known per se.
As the non-human mammal, for example, cow, pig, sheep, goat, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, mouse, rat and the like are used. Among them, rodents, which are relatively short in ontogeny and biological cycle in terms of preparation of disease animal model systems, and are easy to breed, especially mice (for example, hybrids such as C57BL / 6 strain and DBA2 strain as pure strains) B6C3F as a system 1 System, BDF 1 System, B6D2F 1 Strain, BALB / c strain, ICR strain, etc.) or rat (eg, Wistar, SD etc.) is preferred.
"Mammals" in a recombinant vector that can be expressed in mammals include humans in addition to the above-mentioned non-human mammals.
[0080]
The exogenous DNA of the present invention refers to the DNA of the present invention once isolated and extracted from a mammal, not the DNA of the present invention originally possessed by a non-human mammal.
As the mutant DNA of the present invention, those having a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, base addition, deletion, substitution with another base, etc. The resulting DNA or the like is used, and also includes abnormal DNA.
The abnormal DNA means a DNA that expresses abnormal H7TBA62, and for example, a DNA that expresses a receptor that suppresses the function of normal H7TBA62 is used.
The exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal that is the same or different from the animal of interest. In transferring the DNA of the present invention to a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a DNA construct linked downstream of a promoter capable of being expressed in animal cells. For example, when the human DNA of the present invention is transferred, DNA derived from various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) having the DNA of the present invention having high homology thereto is expressed. Highly expressing the DNA of the present invention by microinjecting a DNA construct (eg, vector, etc.) in which the human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters that can be made into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg. DNA-transferring mammals can be created.
[0081]
As an expression vector for H7TBA62, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, a bacteriophage such as λ phage, a retrovirus such as Moloney leukemia virus, or an animal virus such as vaccinia virus or baculovirus is used. Can be Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast is preferably used.
Examples of the promoter for controlling the DNA expression include, but are not limited to, promoters for DNA derived from (1) viruses (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moloney leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, polio virus, etc.); ▼ Promoters derived from various mammals (human, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.), for example, albumin, insulin II, uroplakin II, elastase, erythropoietin, endothelin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acid Protein, glutathione S-transferase, platelet-derived growth factor β, keratins K1, K10 and K14, collagen type I and type II, cyclic AMP-dependent protein kinase βI subunit, dystrophin, Tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor tyrosine kinase (commonly abbreviated as Tie2), sodium potassium adenosine triphosphatase (Na, K-ATPase), neurofilament light chains, metallothionein I and IIA, Metalloproteinase 1 tissue inhibitor, MHC class I antigen (H-2L), H-ras, renin, dopamine β-hydroxylase, thyroid peroxidase (TPO), peptide chain elongation factor 1α (EF-1α), β actin, α And β-myosin heavy chain, myosin light chain 1 and 2, myelin basic protein, thyroglobulin, Thy-1, immunoglobulin, heavy chain variable region (VNP), serum amyloid P component, myoglobin, troponin C, smooth muscle α-actin, Pre Russia enkephalin A, such as a promoter, such as vasopressin is used. Among them, a cytomegalovirus promoter capable of high expression throughout the body, a human peptide chain elongation factor 1α (EF-1α) promoter, a human and chicken β-actin promoter, and the like are preferable.
The vector preferably has a sequence (generally called a terminator) that terminates transcription of a messenger RNA of interest in a DNA-transferred mammal. For example, a sequence of each DNA derived from a virus and various mammals is preferably used. A simian virus SV40 terminator or the like is preferably used.
[0082]
In addition, a splicing signal of each DNA, an enhancer region, a part of an intron of a eukaryotic DNA, and the like are placed 5 ′ upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or between the translation region for the purpose of further expressing the desired foreign DNA. It is also possible to connect 3 ′ downstream of the above depending on the purpose.
The normal H7TBA62 translation region is derived from liver, kidney, thyroid cells, fibroblast-derived DNA from humans or various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) and various commercially available genomes. From the DNA library, it is possible to obtain the whole or a part of the genomic DNA, or the complementary DNA prepared from the liver, kidney, thyroid cells and fibroblast-derived RNA by a known method as a raw material. In addition, a translation region obtained by mutating a normal H7TBA62 translation region obtained from the above-mentioned cells or tissues by a point mutagenesis method can be used for the exogenous abnormal DNA.
The translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transposed animal by a conventional DNA engineering technique in which it is ligated downstream of the above-mentioned promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer means that all the progeny of the produced animal retain the exogenous DNA of the present invention in all of the germinal cells and somatic cells. means. The offspring of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the exogenous DNA of the present invention in all of their germ cells and somatic cells.
The non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred can be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the exogenous DNA is stably retained by mating. .
Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal. Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in germ cells of a produced animal after DNA transfer means that all offspring of the produced animal have an excessive amount of the exogenous DNA of the present invention in all of their germ cells and somatic cells. Means Progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
By obtaining a homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes and mating the male and female animals, all offspring can be bred to have the DNA in excess.
[0083]
The non-human mammal having the normal DNA of the present invention has high expression of the normal DNA of the present invention, and eventually develops hyperactivity of H7TBA62 by promoting the function of endogenous normal DNA. And can be used as a disease model animal. For example, using the normal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of hyperactivity of H7TBA62 and diseases associated with H7TBA62, and to examine methods for treating these diseases.
In addition, since the mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of free H7TBA62, it can be used for a screening test for a therapeutic drug for a disease associated with H7TBA62.
On the other hand, a non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention can be subcultured in an ordinary breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the exogenous DNA is stably maintained by mating. Furthermore, the desired foreign DNA can be used as a raw material by incorporating it into the aforementioned plasmid. The DNA construct with the promoter can be prepared by a usual DNA engineering technique. The transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. The progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the abnormal DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells. A homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing these male and female animals, it is possible to breed the cells so that all offspring have the DNA.
[0084]
The non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention, in which the abnormal DNA of the present invention is highly expressed, inhibits the function of endogenous normal DNA, and eventually causes a functionally inactive refractory disease of H7TBA62. It can be used as a disease model animal. For example, using the abnormal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of H7TBA62 function-inactive refractory disease and to examine a method for treating this disease.
Further, as a specific possibility, the abnormal DNA-highly expressing animal of the present invention is a model for elucidating the function inhibition (dominant negative action) of the normal GPCR by the abnormal GPCR of the present invention in H7TBA62 function-inactive refractory disease. It becomes.
In addition, since the mammal to which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of free H7TBA62, it can be used for a therapeutic drug screening test for H7TBA62 function-inactive refractory disease.
In addition, other possible uses of the above two DNA-transferred animals of the present invention include, for example,
(1) Use as a cell source for tissue culture,
(2) Relevance to H7TBA62 which is specifically expressed or activated by H7TBA62 by directly analyzing DNA or RNA in the tissue of the DNA-transferred animal of the present invention or analyzing H7TBA62 expressed by DNA Analysis about the
{Circle around (3)} The cells of a tissue having DNA are cultured by standard tissue culture techniques, and these are used to study the function of cells from tissues that are generally difficult to culture.
(4) screening for a drug that enhances the function of the cell by using the cell described in (3) above, and
{Circle around (5)} The mutant GPCR of the present invention may be isolated and purified, and its antibody may be prepared.
Furthermore, using the DNA-transferred animal of the present invention, clinical symptoms of H7TBA62-related diseases, including H7TBA62-function inactive refractory, can be examined. A more detailed pathological finding is obtained, which can contribute to the development of a new treatment method, and further to the research and treatment of a secondary disease caused by the disease.
In addition, it is possible to take out each organ from the DNA-transferred animal of the present invention, cut it into pieces, and then use a protease such as trypsin to obtain the released DNA-transferred cells, culture them, or systematize the cultured cells. . Furthermore, it is possible to investigate the specification of a H7TBA62-producing cell, its relationship with apoptosis, differentiation or proliferation, or its signal transduction mechanism, and to investigate its abnormalities. It becomes.
Further, using the DNA transgenic animal of the present invention, to develop a therapeutic agent for a disease associated with H7TBA62, including a functionally inactive refractory H7TBA62, using the above-described test method and quantitative method, It is possible to provide an effective and rapid screening method for the therapeutic agent for the disease. Further, using the transgenic animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention, it is possible to examine and develop a DNA treatment method for H7TBA62-related diseases.
[0085]
(12) Knockout animal
The present invention provides a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated, and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
That is, the present invention
[1] a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated,
[2] the embryonic stem cell according to [1], wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a β-galactosidase gene derived from Escherichia coli);
[3] the embryonic stem cell according to [1], which is neomycin-resistant;
[4] the embryonic stem cell according to [1], wherein the non-human mammal is a rodent;
[5] the embryonic stem cell of [4], wherein the rodent is a mouse;
[6] a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, wherein the DNA is inactivated;
[7] The DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a β-galactosidase gene derived from Escherichia coli), and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention [6]. The non-human mammal according to the item,
[8] the non-human mammal according to [6], wherein the non-human mammal is a rodent;
[9] the non-human mammal of [8], wherein the rodent is a mouse, and
[10] A method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to the animal according to [7] and detecting the expression of a reporter gene. I will provide a.
A non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated is a DNA which is artificially mutated to the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal to suppress the DNA expression ability, or By substantially losing the activity of H7TBA62 encoded by the DNA, the non-human mammal which does not substantially have the ability to express H7TBA62 (hereinafter sometimes referred to as the knockout DNA of the present invention) can be obtained. Refers to embryonic stem cells (hereinafter abbreviated as ES cells).
As the non-human mammal, the same one as described above is used.
The method of artificially mutating the DNA of the present invention can be performed, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA by a genetic engineering technique. With these mutations, the knockout DNA of the present invention may be prepared, for example, by shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon.
[0086]
Specific examples of the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated (hereinafter abbreviated as the DNA-inactivated ES cells of the present invention or the knockout ES cells of the present invention) include, for example, The DNA of the present invention possessed by a non-human mammal is isolated and its exon portion is a drug resistance gene typified by a neomycin resistance gene or a hygromycin resistance gene, or lacZ (β-galactosidase gene), cat (chloramphenicol acetyl). A reporter gene or the like typified by a transferase gene) to disrupt the exon function, or insert a DNA sequence that terminates gene transcription into an intron between exons (for example, a polyA addition signal); Inability to synthesize complete messenger RNA Thus, a DNA strand having a DNA sequence constructed so as to eventually destroy the gene (hereinafter abbreviated as a targeting vector) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination, and the resulting ES cells PCR using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, and using the DNA sequence on the targeting vector and the DNA sequence in the neighboring region other than the DNA of the present invention used for the preparation of the targeting vector as primers And selecting the knockout ES cells of the present invention.
As the ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like, for example, those already established as described above may be used, or according to the known Evans and Kaufma method. It may be a newly established one. For example, in the case of mouse ES cells, currently, 129-line ES cells are generally used. For example, for the purpose of obtaining ES cells in which BDF is clearly known, for example, BDF in which the number of eggs collected by C57BL / 6 mice or C57BL / 6 has been improved by hybridization with DBA / 2 1 Mouse (F of C57BL / 6 and DBA / 2) 1 ) Can also be used favorably. BDF 1 In addition to the advantage that the number of eggs collected and the eggs are robust, the mice have C57BL / 6 mice as a background, and thus, the ES cells obtained using the C57BL / 6 mice were used to produce C57BL / 6 mice. / 6 mice can be advantageously used in that the genetic background can be replaced by C57BL / 6 mice by backcrossing.
In addition, when ES cells are established, blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used. In addition, a large number of blastocysts can be efficiently obtained by collecting embryos at the 8-cell stage and culturing them until blastocysts are used. Early embryos can be obtained.
Either male or female ES cells may be used, but generally male ES cells are more convenient for producing a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce cumbersome culture labor.
[0087]
As a method for determining the sex of ES cells, for example, a method of amplifying and detecting a gene in a sex-determining region on the Y chromosome by a PCR method can be mentioned. If this method is used, it is conventionally necessary to perform about 10 karyotype analyses. 6 Since the number of ES cells is required, the number of ES cells of about 1 colony (approximately 50) is sufficient, so that primary selection of ES cells in the early stage of culture can be performed by discriminating between male and female. In addition, by enabling selection of male cells at an early stage, labor in the initial stage of culture can be significantly reduced.
The secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method. The number of chromosomes in the obtained ES cells is desirably 100% of the normal number. However, when it is difficult due to physical operations at the time of establishment, after knocking out the gene of the ES cells, the normal cells (for example, chromosomes in mice) are knocked out. It is desirable to clone again into cells (number 2n = 40).
The embryonic stem cell line obtained in this way usually has very good growth properties, but it must be carefully subcultured because it tends to lose its ontogenic ability. For example, on a suitable feeder cell such as STO fibroblast in the presence of LIF (1 to 10,000 U / ml) in a carbon dioxide incubator (preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen, 5% The cells are cultured by a method such as culturing at about 37 ° C. in carbon dioxide gas and 90% air. At the time of subculture, for example, trypsin / EDTA solution (usually 0.001 to 0.5% trypsin / 0.1 to 5 mM EDTA, Preferably, a method is used in which cells are made into single cells by treatment with about 0.1% trypsin / 1 mM EDTA and seeded on freshly prepared feeder cells. Such passage is usually carried out every 1 to 3 days. At this time, it is desirable to observe the cells and, if any morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.
ES cells are differentiated into various types of cells, such as parietal muscle, visceral muscle, and cardiac muscle, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions. [M. J. Evans and M.E. H. Kaufman, Nature, 292, 154, 1981; R. Martin Proc. Of National Academy of Sciences USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 78, 7634, 1981; C. Doetschman, et al., Journal of Embryology and Experimental Morphology, Vol. 87, p. 27, 1985], that the DNA-deficient cell of the present invention obtained by differentiating the ES cell of the present invention is characterized by in vitro Is useful in H7TBA62 or cell biological studies of H7TBA62.
[0088]
The non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level.
As the non-human mammal, those similar to the aforementioned can be used.
The non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is, for example, a DNA in which the targeting vector prepared as described above is introduced into mouse embryonic stem cells or mouse egg cells, and the DNA of the targeting vector is inactivated by the introduction. The DNA of the present invention can be knocked out by homologous recombination in which the sequence replaces the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by homologous recombination.
Cells in which the DNA of the present invention has been knocked out can be used as a DNA sequence on a Southern hybridization analysis or targeting vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, and the DNA of the present invention derived from the mouse used for the targeting vector. It can be determined by analysis by PCR using a DNA sequence of a nearby region other than DNA as a primer. When non-human mammalian embryonic stem cells are used, a cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cells are cultured at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage of non-human mammalian cells. The chimeric embryo is injected into an animal embryo or blastocyst, and the resulting chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudopregnant non-human mammal. The produced animal is a chimeric animal comprising both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially mutated DNA locus of the present invention. When a part of the germ cells of the chimeric animal has a mutated DNA locus of the present invention, all tissues are artificially mutated from a population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting individuals composed of cells having the added DNA locus of the present invention, for example, by judging coat color or the like. The individuals obtained in this manner are usually H7TBA62 heterozygous expression-deficient individuals, and mated with H7TBA62 heteroexpression-deficient individuals to obtain H7TBA62 homo-expression-deficient individuals from their offspring.
[0089]
In the case of using an egg cell, for example, a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into a chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into a nucleus of an egg by a microinjection method, and these transgenic non-human mammals can be obtained. Compared to mammals, they can be obtained by selecting those having a mutation in the DNA locus of the present invention by homologous recombination.
In this manner, the individual in which the DNA of the present invention is knocked out can be bred in an ordinary breeding environment after confirming that the DNA of the animal obtained by the breeding is also knocked out.
Further, the acquisition and maintenance of the germ line may be performed according to a conventional method. That is, by crossing male and female animals having the inactivated DNA, a homozygous animal having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in such a manner that there are one normal animal and one homozygote. By mating male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
The non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are extremely useful for producing a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention.
In addition, since the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention lacks various biological activities that can be induced by H7TBA62, it can serve as a model for diseases caused by inactivation of the biological activities of H7TBA62. It is useful for investigating the causes of diseases and studying treatment methods.
[0090]
(12a) A method for screening a compound having a therapeutic / preventive effect on diseases caused by DNA deficiency or damage of the present invention
The non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention can be used for screening for a compound having a therapeutic / preventive effect against diseases caused by deficiency or damage of the DNA of the present invention.
That is, the present invention is characterized by administering a test compound to a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention, and observing and measuring a change in the animal. Provided is a method for screening a compound or a salt thereof having a therapeutic / prophylactic effect against a disease.
Examples of the non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention used in the screening method include the same as described above.
Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma, and these compounds are novel compounds. Or a known compound.
Specifically, a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound, compared with an untreated control animal, and tested using changes in each organ, tissue, disease symptoms, etc. of the animal as an index. The therapeutic / preventive effects of the compounds can be tested.
As a method of treating a test animal with a test compound, for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like. The dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
[0091]
In the screening method, when a test compound is administered to a test animal and the blood glucose level of the test animal decreases by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more, the test compound Can be selected as compounds having a therapeutic / preventive effect on the above diseases.
The compound obtained by using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and is a disease caused by H7TBA62 deficiency or damage (eg, vasoconstriction, serotonergic action, acetylcholine release, gastrointestinal motility, smoothness). Safe and low-toxic treatment for diseases caused by dysfunctions such as muscle contraction, platelet aggregation, central nervous regulation or inotropic action (eg, neuroactive nasal congestion, mucosal hyperemia, acute circulatory failure, hypotension, etc.) It can be used as a medicament such as a prophylactic agent, an ophthalmic drug, and a local vasoconstrictor for nasal drops. Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.
Further, compounds obtained using the screening method include, for example, cancer (eg, prostate cancer, colorectal cancer, etc.), infectious disease, pain, anorexia nervosa, bulimia, asthma, Parkinson's disease, acute heart failure, hypotension, hypertension , Urinary retention, osteoporosis, angina, myocardial infarction, ulcer, allergy, benign prostatic hypertrophy, psychiatric / neurological disorders (anxiety, schizophrenia, depression, delirium, dementia, severe mental retardation and motor abnormalities, Huntington It can also be used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases such as chorea and Jill de la Tourette syndrome).
The compound obtained by the screening method may form a salt. Examples of the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, alkali metals, etc.). ) Is used, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, For example, salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
A medicament containing the compound obtained by the screening method or a salt thereof can be produced in the same manner as the above-mentioned medicament containing a compound that changes the binding property between H7TBA62 and a ligand.
Since the preparation thus obtained is safe and low toxic, it can be used, for example, in humans or mammals (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey, etc.). Can be administered.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like. For example, when the compound is orally administered, generally, for example, in an acute circulatory failure patient (with a body weight of 60 kg) Is about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc., but, for example, usually in the form of an injection, for example, an acute circulatory failure patient (with a body weight of 60 kg) In the above, it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
[0092]
(12b) Method for screening for a compound that promotes or inhibits the activity of a promoter for the DNA of the present invention
The present invention provides a compound which promotes or inhibits the activity of a promoter for the DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention, and detecting the expression of a reporter gene, or a compound thereof. A method for screening a salt is provided.
In the above-mentioned screening method, the non-human mammal deficient in expression of DNA of the present invention may be a non-human mammal deficient in expression of DNA of the present invention in which the DNA of the present invention is inactivated by introducing a reporter gene, A reporter gene that can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention is used.
Examples of the test compound include the same compounds as described above.
As the reporter gene, the same one as described above is used, and a β-galactosidase gene (lacZ), a soluble alkaline phosphatase gene, a luciferase gene and the like are preferable.
In a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention in which the DNA of the present invention is replaced with a reporter gene, since the reporter gene is under the control of the promoter for the DNA of the present invention, the expression of the substance encoded by the reporter gene is traced. By doing so, the activity of the promoter can be detected.
For example, when a part of the DNA region encoding H7TBA62 is replaced with a β-galactosidase gene (lacZ) derived from Escherichia coli, β-galactosidase is originally expressed instead of H7TBA62 in a tissue expressing H7TBA62. Therefore, for example, H7TBA62 can be easily prepared by staining with a reagent serving as a substrate for β-galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactopyranoside (X-gal). The expression state in the animal body can be observed. Specifically, an H7TBA62-deficient mouse or a tissue section thereof is fixed with glutaraldehyde or the like, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-gal-containing staining solution at room temperature or around 37 ° C. After reacting for 30 minutes to 1 hour, the β-galactosidase reaction may be stopped by washing the tissue sample with a 1 mM EDTA / PBS solution, and the coloration may be observed. Further, mRNA encoding lacZ may be detected according to a conventional method.
The compound or a salt thereof obtained by using the above-mentioned screening method is a compound selected from the above-mentioned test compounds, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity for the DNA of the present invention.
The compound obtained by the screening method may form a salt, and the salt of the compound may include a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid) and a base (eg, an organic acid). And particularly preferably a physiologically acceptable acid addition salt. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, For example, salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
[0093]
Since the compound or its salt of the present invention which promotes the promoter activity for DNA can promote the expression of H7TBA62 and promote the function of the receptor, for example, prevention / treatment of a disease associated with dysfunction of H7TBA62, etc. It is useful as a medicine such as a medicine, an ophthalmic medicine, and a local vasoconstrictor for nasal drops.
Since the compound of the present invention that inhibits promoter activity on DNA or a salt thereof can inhibit the expression of H7TBA62 and inhibit the function of the receptor, for example, prevention and treatment of a disease associated with excessive expression of H7TBA62, and the like. It is useful as a medicine such as a medicine.
Diseases associated with dysfunction of H7TBA62 include, for example, neuroactive nasal congestion, mucosal hyperemia, acute circulatory failure, hypotension and the like.
Examples of the disease caused by overexpression of H7TBA62 include peripheral circulatory disorder, hypertension, depression, obsessive-compulsive disorder, obsessive-compulsive disorder, panic disorder, anxiety disorder, eating disorder, ischemic disease, and administration of antineoplastic drug. Gastrointestinal symptoms, acute myocardial infarction, acute pancreatitis, chronic pancreatitis, adult respiratory distress syndrome, alcohol withdrawal syndrome, Alzheimer's disease, ankylosing spondylitis, arrhythmia, cocaine withdrawal syndrome, dementia, diarrhea, gastritis, hepatitis, infection, Opiate withdrawal syndrome, osteoarthritis, osteoporosis, osteoporotic disease, peptic ulcer, peripheral vasculopathy, sequelae of myocardial infarction, reflux esophagitis, rheumatoid arthritis, schizophrenia, sepsis, septic shock, ulcerative colitis or non- And stable angina.
Further, the compound of the present invention that promotes or inhibits the promoter activity for DNA or a salt thereof includes, for example, cancer (eg, prostate cancer, colorectal cancer, etc.), infectious disease, pain, anorexia nervosa, bulimia, asthma, Parkinson's disease, Acute heart failure, hypotension, hypertension, urinary retention, osteoporosis, angina, myocardial infarction, ulcer, allergy, benign prostatic hypertrophy, psychiatric / neurological disorders (anxiety, schizophrenia, depression, delirium, dementia, severe symptoms It can also be used as a preventive / therapeutic agent for diseases such as mental retardation and motor abnormalities, Huntington's chorea, and Jill de la Tourette syndrome.
Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.
[0094]
A drug containing a compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as a drug containing a compound that alters the binding between H7TBA62 or a salt thereof and a ligand.
Since the preparation thus obtained is safe and low toxic, it can be used, for example, in humans or mammals (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey, etc.). Can be administered.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject to be administered, the administration route, and the like.For example, when a compound that promotes or inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention is orally administered, generally For patients with acute circulatory insufficiency (with a body weight of 60 kg), the dose is about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc., but, for example, usually in the form of an injection, for example, an acute circulatory failure patient (with a body weight of 60 kg) In the above, it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
As described above, the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is extremely useful for screening for a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter for the DNA of the present invention, It can greatly contribute to investigating the cause of various diseases caused by it or to develop preventive and therapeutic drugs.
In addition, using a DNA containing the promoter region of H7TBA62, genes encoding various proteins are ligated downstream thereof and injected into egg cells of an animal to produce a so-called transgenic animal (gene-transferred animal). It is also possible to specifically synthesize the receptor and examine its action in the living body. Furthermore, by linking an appropriate reporter gene to the above promoter portion and establishing a cell line that expresses the reporter gene, a search system for a low-molecular compound having an action of specifically promoting or suppressing the production ability of H7TBA62 itself in the body. Can be used as
[0095]
In the present specification and drawings, bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or by abbreviations commonly used in the art, and examples thereof are described below. When an amino acid can have an optical isomer, the L-form is indicated unless otherwise specified.
DNA: deoxyribonucleic acid
cDNA: complementary deoxyribonucleic acid
A: Adenine
T: Thymine
G: Guanine
C: Cytosine
RNA: ribonucleic acid
mRNA: messenger ribonucleic acid
dATP: deoxyadenosine triphosphate
dTTP: deoxythymidine triphosphate
dGTP: deoxyguanosine triphosphate
dCTP: deoxycytidine triphosphate
ATP: Adenosine triphosphate
EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid
SDS: Sodium dodecyl sulfate
[0096]
Gly: glycine
Ala: Alanine
Val: Valine
Leu: Leucine
Ile: Isoleucine
Ser: Serine
Thr: Threonine
Cys: cysteine
Met: methionine
Glu: glutamic acid
Asp: Aspartic acid
Lys: lysine
Arg: Arginine
His: histidine
Phe: phenylalanine
Tyr: Tyrosine
Trp: Tryptophan
Pro: Proline
Asn: Asparagine
Gln: Glutamine
pGlu: pyroglutamic acid
*: Corresponds to the stop codon
Me: methyl group
Et: ethyl group
Bu: butyl group
Ph: phenyl group
TC: thiazolidine-4 (R) -carboxamide group
[0097]
Further, substituents, protecting groups and reagents frequently used in the present specification are represented by the following symbols.
Tos: p-toluenesulfonyl
CHO: Formyl
Bzl: benzyl
Cl 2 Bzl: 2,6-dichlorobenzyl
Bom: benzyloxymethyl
Z: benzyloxycarbonyl
Cl-Z: 2-chlorobenzyloxycarbonyl
Br-Z: 2-bromobenzyloxycarbonyl
Boc: t-butoxycarbonyl
DNP: dinitrophenol
Trt: Trityl
Bum: t-butoxymethyl
Fmoc: N-9-fluorenylmethoxycarbonyl
HOBt: 1-hydroxybenztriazole
HOOBt: 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-
1,2,3-benzotriazine
HONB: 1-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide
DCC: N, N'-dicyclohexylcarbodiimide
[0098]
The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
SEQ ID NO: 1
1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding human-derived H7TBA62.
SEQ ID NO: 2
2 shows the amino acid sequence of human-derived H7TBA62.
SEQ ID NO: 3
7 shows the nucleotide sequence of a primer used in the PCR reaction in Example 3.
SEQ ID NO: 4
7 shows the nucleotide sequence of a primer used in the PCR reaction in Example 3.
SEQ ID NO: 5
7 shows the nucleotide sequence of a probe used in the PCR reaction in Example 3.
[0099]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but these do not limit the scope of the present invention. In addition, the genetic manipulation using Escherichia coli followed the method described in Molecular cloning (Molecular cloning).
[0100]
Example 1 Effect of oxymetazoline on reporter gene expression in HEK293 cells transiently expressing H7TBA62
A method known to the expression plasmid vector pAKKO-111H for animal cells (the same plasmid vector as pAKKO-1.11H described in Biochem. Biophys. Acta, Hinuma, S. et al., 1219, 251-259, 1994). HEK293 cells were transfected with the expression vector plasmid pAK-H7TBA62 prepared by inserting the H7TBA62 cDNA and the original pAKKO-111H without the specific gene inserted by the following method.
First, Escherichia coli JM109 was transformed with these vectors, the obtained colonies were isolated and cultured, and then plasmids were prepared using QIAGEN Plasmid Maxi Kit (Qiagen). Further, a plasmid of pCRE-Luc (Clontech) in which a luciferase gene was linked as a reporter downstream of the cAMP response element (CRE) was prepared in the same manner. HEK293 cells were seeded on a 96-well black plate (Becton Dickinson) coated with collagen I at 100,000 cells / well at a culture volume of 100 μl and cultured overnight. The medium for culturing on the plate was a medium to which only 10% fetal bovine serum (FBS, GibcoBRL) was added with DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, GibcoBRL). For each plasmid, pAK-H7TBA62 and reporter plasmid pCRE-Luc were added at a ratio of 9: 1 to 240 μl of Opti-MEM-I (Gibco BRL). This was mixed with an equal amount of 240 μl of Opti-MEM-I to which 10 μl of Lipofectamine 2000 (GibcoBRL) was added. Body was formed. These were added to the culture solution of HEK293 cells at 25 μl / well at 37 ° C., 5% CO 2. 2 The cells were cultured overnight under the conditions.
After overnight culture, the transfected HEK293 cells were washed twice with 150 μl / well of assay buffer (DMEM supplemented with 0.1% bovine serum albumin), and the assay buffer was added at 60 μl / well. Here, 500 μM of oxymetazoline (SIGMA) diluted with an assay buffer was added at 40 μl / well. Furthermore, after adding 10 μM of forskolin (Forsklin, Wako Pure Chemical Industries) at 20 μl / well, 37 ° C., 5% CO 2 was added. 2 The cells were cultured under the conditions for 4 hours. The culture supernatant is discarded, 50 μl of Picagene LT2.0 (Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.), a substrate for luciferase activity measurement, is added, and the luciferase luminescence is measured using a plate reader (ARVO sx multilabel counter, Wallac). Was measured.
As a result, in the cells into which the H7TBA62 gene was introduced, suppression of luciferase activity increased by forskolin by oxymetazoline was observed (FIG. 1).
[0101]
Example 2 Measurement of Intracellular cAMP Production Inhibitory Activity of H7TBA62-Expressing HEK Cells by Oxymetazoline
Using the H7TBA62 expression plasmid prepared in Example 1, a stable expression HEK cell, HEK-H7TBA62, for H7TBA62 was prepared by a method known per se. HEK cells not transfected with HEK-H7TBA62 or the receptor gene were seeded on a 96-well black plate (Becton Dickinson) coated with collagen I at a concentration of 100,000 cells / well, at 37 ° C. and 5% CO 2. 2 Was used for the assay. The sample buffer used was HBSS to which 0.1% BSA and 0.2 mM IBMX (Sigma) were added. After washing the cells twice with the sample buffer and preincubating at 37 ° C. for 30 minutes, the cells were further washed twice, adding the sample, and incubating at 37 ° C. for 30 minutes. Oxymetazoline was added to the sample at a final concentration of 200 and 20 μM using a sample buffer containing forskolin at a final concentration of 2 μM. After incubation with the sample, the amount of intracellular cAMP production was measured using the cAMP Screen System (ABI). As a result, as shown in FIG. 2, it was found that when oxymetazoline was added, the production of intracellular cAMP, which was increased by the addition of 2 μM forskolin, was suppressed specifically for HEK-H7TBA62 cells.
[0102]
Example 3 Expression distribution of human H7TBA62 mRNA
ABI PRISM 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems) was used for quantification of the mRNA expression level. Primers [5′-TCGGCACTGGACTTTCACT-3 ′ (SEQ ID NO: 3), 5′-TGCTGGCATAGACGTTGAG-3 ′ (SEQ ID NO: 4)] and probe [5′-TGCAAGATGGTTCTGACGGCCA-3 ′ (SEQ ID NO: 5)] was designed based on the base sequence of human H7TBA62 (SEQ ID NO: 1) using PrimerExpress (Applied Biosystems), a software dedicated to ABI PRISM Sequence Detector. The cDNA used as the template was synthesized from 1 μg of total RNA derived from various human tissues by a reverse transcription reaction using random primers. The reverse transcription reaction was carried out using SuperScript II (GIBCO BRL) as a reverse transcriptase according to the attached protocol. A reaction solution of ABI PRISM7700 Sequence Detector was prepared by preparing 12.5 μl of TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 0.9 μM of each primer, 0.25 μM of a probe, and mixing a cDNA solution to 25 μl with distilled water. The reaction with ABI PRISM 7700 Sequence Detector was performed by repeating a cycle of 50 ° C. for 2 minutes, 95 ° C. for 10 minutes, 95 ° C. for 15 seconds, and 60 ° C. for 1 minute 40 times. FIG. 3 shows the distribution of mRNA expression in various human tissues. In addition, high expression of mRNA was detected in prostate cancer cell lines such as DU145 and PC3 and colorectal cancer cell lines such as SW1417, WiDr, SW837 and SW1463 (FIG. 4).
[0103]
【The invention's effect】
H7TBA62, its partial peptide or its salt, or DNA encoding H7TBA62 or its partial peptide may be a vasoconstrictor, a serotonin agonist, an acetylcholine release promoter, a gastrointestinal motility enhancer, a smooth muscle constrictor, a platelet aggregating agent, As a nerve stimulant or a cardiotonic agent, it is useful for, for example, removal of neuroactive nasal congestion or mucosal hyperemia, or prevention / treatment of acute circulatory failure, hypotension and the like.
Further, by using H7TBA62, its partial peptide or a salt thereof and oxymetazoline having ligand-like activity, it is possible to efficiently screen for a compound that changes the binding property between the ligand and H7TBA62, its partial peptide or its salt. it can.
[0104]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the effect of oxymetazoline on reporter (luciferase) gene expression in HEK293 cells transiently expressing H7TBA62. The vertical axis indicates luciferase activity (counts / second (cps)). Controls show no forskolin addition and no oxymetazoline addition, forskolin shows forskolin addition and no oxymetazoline addition, and forskolin + oxymetazoline shows forskolin addition and oxymetazoline addition. □ indicates cells into which only the vector has been introduced, and Δ indicates cells into which H7TBA62 cDNA has been introduced.
FIG. 2 is a graph showing the activity of oxymetazoline to suppress the intracellular cAMP production of H7TBA62-expressing HEK cells. HEK shows the results for untransfected HEK cells, and HEK-H7TBA62 shows the results for H7TBA62-expressing HEK cells. The vertical axis indicates the intracellular cAMP concentration (pmol). Controls show no forskolin addition and no oxymetazoline addition, forskolin shows no forskolin addition and no oxymetazoline addition, and oxymetazoline shows forskolin addition and oxymetazoline addition.
FIG. 3 shows the expression distribution of H7TBA62 mRNA in various human tissues. Copies / 25 ng total RNA indicates the number of copies per 25 ng of total RNA.
FIG. 4 shows the expression level of H7TBA62 mRNA in a prostate cancer cell line and a colon cancer cell line. Copies / 25ng total RNA indicates the number of copies per 25ng of total RNA. DU145 and PC3 are the names of prostate cancer cell lines, respectively, and SW1417, WiDr, SW837 and SW1463 are the names of colon cancer cell lines, respectively.