【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、神経系もしくは他の組織由来の細胞を選別，分離，調整する際、ならびに脳神経組織における蛋白質の部位特異的発現を調べる際に有用なモノクローナル抗体，ハイブリドーマ，神経系もしくは他の組織由来の細胞の分離方法，分離された細胞，免疫学的診断法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
疾病や外傷等で損傷したり失われたりした人体の組織を修復するため、従来から臓器移植と人工臓器を用いた治療が研究され、行なわれてきた。しかしながら、人工臓器は未だ開発段階であり、体内に埋め込んだ状態での永久使用に耐えるようなものは殆ど存在しない。また、臓器移植に関しては、臓器提供数が絶対的に不足している状況でその限界が指摘されているうえ、拒絶反応や倫理的問題等により未だ一般的な治療方法として定着していない。
【０００３】
このような状況のもと、近年では、人口臓器や臓器移植による治療に代わるものとして、複数の前駆細胞および分化細胞に分化する多分化能を有し、その組織を作り出すことができる幹細胞を利用した再生医療の研究が盛んに行なわれている。幹細胞は、複数の前駆細胞および分化細胞に分化する多分化能を有し、その組織を作り出すことができる細胞であり、幹細胞を培養し増殖・分化させたのち組織に戻すことにより、組織の再生を目指す再生治療は、上述した人口臓器や臓器移植による治療に代わる方法としてその進歩に大きな期待が寄せられている。
【０００４】
このような幹細胞には、大別して胚性幹細胞と体性幹細胞の２種類が存在し、いずれも再生治療への応用可能性があり、研究が進められている。これらのうち、胚性幹細胞は、培養による無限増殖が可能で、しかもどのような細胞にも分化しうる万能性を有することから注目を浴びている。ところが、ヒトの胚性幹細胞が、受精卵に由来するものでデザイナーベビーやクローンの作製につながる可能性もあり、倫理上の観点からヒトへの応用はその是非が議論されている。
【０００５】
胚性幹細胞より分化が進んだ体性幹細胞は、分化される細胞系列が限定され、成人の組織中にも存在することが確認されており、受精卵を必要としないことから、目的に合った安全な細胞としてヒトの再生治療への応用が期待されている。
【０００６】
脳や脊髄等の中枢神経系においては、生後まもなく分化を完了し、アルツハイマー病や脳出血等の病気や事故による損傷を受けても、成人では全く再生しないものと考えられてきた。ところが、近年、ヒトの成人の脳にも神経幹細胞が確認され、一定の条件下において増殖や分化をさせることが可能であることがわかってきた。これらの神経幹細胞の増殖・分化をコントロールすれば、脳神経系の疾患に対する有効な治療が可能になると考えられる。
【０００７】
このような体性幹細胞を再生治療に応用するためには、幹細胞もしくは前駆細胞を治療に必要な量まで分化させ増殖する必要があり、そのため、まず、目的とする細胞や組織に分化しうる幹細胞をいずれかのソースから効率的に分離しなければならない。
【０００８】
幹細胞を効率的に分離する方法としては、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）を用いた分離法等がある。この方法は、幹細胞に発現する選択的な表面マーカーの発現様式を、蛍光標識したモノクロナール抗体で認識し、その蛍光強度により幹細胞を分離する方法である。
【０００９】
しかしながら、神経幹細胞に関する表面マーカーは、ＣＤ１３３抗体が認識する表面マーカーに関する報告があるに留まる。ところが、このＣＤ１３３抗体は、神経幹細胞を直接認識して反応するものであることから、この抗体を用いて分離された神経幹細胞には、蛍光物質の沈着が避けられない。このように蛍光物質が沈着した神経幹細胞を増殖・分化させて医療に利用した場合、その長期的な安全性については全く確認されていないのが実情である。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明らは、本発明者は、脳神経細胞のうち、神経系の幹細胞もしくは前駆細胞を選択的に認識する抗体、あるいは逆に神経系の幹細胞もしくは前駆細胞以外の細胞を選択的に認識するモノクローナル抗体があれば、効率的でかつ安全な幹細胞の分離が可能となり、神経幹細胞の医療への応用が実現するのではないかとの着想に基づき、鋭意研究を重ねた。
【００１１】
それら一連の研究のなかで、ヒト脳神経組織に由来する細胞破砕標品を感作抗原として使用してモノクローナル抗体を作製したところ、新規モノクローナル抗体が得られた。
【００１２】
そして、この取得されたモノクローナル抗体のあるものは、ヒト脳組織の上衣層および上衣下層領域に局在する細胞に発現する抗原を認識し、また別の抗体はヒト脳組織の上衣層および上衣下層領域に局在する細胞に細胞に発現する抗原は認識せずにこれ以外の部位に存在する細胞に発現する抗原を認識する性質を有するものであることを見いだし、これらの抗体を用いて細胞の選別が可能であることを示し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、神経系の幹細胞もしくは前駆細胞を選択的に認識・結合することによりこれらの細胞を効率的に分離しうる新規モノクローナル抗体、もしくは神経系の幹細胞もしくは前駆細胞以外の細胞を選択的に認識・結合することにより、逆にこれらの抗体が認識・結合しない神経幹細胞もしくは前駆細胞を効率的に分離しうる新規モノクローナル抗体を提供することを目的とするものであり、さらには、当該モノクローナル抗体を産生させるハイブリドーマを提供することを目的とするものである。また、このようなモノクローナル抗体を用いた神経系の幹細胞もしくは前駆細胞の分離方法を提供することを目的とするものであり、さらには、上記方法で分離された神経系の幹細胞もしくは前駆細胞や神経系以外の組織由来の細胞を提供することを目的とするものである。さらに、このようなモノクローナル抗体を用いた免疫学的診断法を提供することを目的とするものである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト脳組織の断面における上衣層および上衣下層の領域に局在する神経系の幹細胞もしくは前駆細胞に発現する抗原を選択的に認識する新規なモノクローナル抗体、ならびに、ヒト脳組織切片を用いた免疫染色試験において上記上衣層および上衣下層の領域を選択的に免疫染色しうるモノクローナル抗体に係るものである。
【００１５】
また、本発明のモノクローナル抗体は、ヒト脳組織の上衣層および上衣下層領域に局在する細胞に発現する抗原を認識せず、これ以外の部位に存在する細胞に発現する抗原を認識する新規なモノクローナル抗体、ならびに、ヒト脳組織切片を用いた免疫染色試験において上衣層および上衣下層領域以外の部位を選択的に染色可能なモノクローナル抗体、ならびにこれらの抗体による細胞分離方法と分離された細胞に係るものである。
【００１６】
これらモノクローナル抗体は、神経幹細胞や前駆細胞以外の細胞の細胞に発現する抗原を選択的に認識・結合することにより、これらの細胞を除去して、神経幹細胞を効率的に分離しうる機能を有するとともに、分離された神経幹細胞や前駆細胞には蛍光物質の沈着がなく極めて安全な神経幹細胞を分離しうるものとして極めて有用なものである。
【００１７】
【発明の実施の形態】
このような本発明のモノクローナル抗体は、基本的には、例えば、次のようにして作製することができる。
【００１８】
すなわち、本発明のモノクローナル抗体は、例えば、ヒト胎児の脳細胞を感作抗原として使用して、基本的には、これを通常の免疫法を応用して免疫し、通常の細胞融合法を応用して細胞融合させ、通常のクローン化法を応用してクローン化したのち、スクリーングすることによって作製することができる。
【００１９】
本発明のモノクローナル抗体の作製方法は、より具体的には、例えば、前記感作抗原として、ヒト胎児の脳細胞を使用し、当該感作抗原で免疫した哺乳動物の形質細胞（免疫細胞）を、マウス等の哺乳動物のミエローマ細胞と融合させ、得られた融合細胞（ハイブリドーマ）をクローン化し、その中から前記細胞株を認識する本発明の抗体を産生するクローンを選別し、これを培養して目的とする抗体を回収する方法が好適なものとして例示される。
【００２０】
このようなモノクローナル抗体の作製方法において、前記感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用するミエローマ細胞との適合性などを考慮して選択するのが好ましく、一般的には、マウス、ラット、ハムスター等が好適なものとして使用される。
【００２１】
つぎに、免疫は、一般的方法により、例えば、前記ヒト胎児の脳細胞を哺乳動物に腹腔内注射等により投与することにより、行われる。より具体的には、ＰＢＳや生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを、動物に１ヶ月毎に数回投与することが好ましい。免疫細胞としては、前記細胞株の最終投与後に摘出した脾細胞を使用するのが好ましい。
【００２２】
つぎに、前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞としては、すでに公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７８）〕、ｐ３−Ｕ１〔ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１，１−７（１９７８）〕、ＮＳ−１〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９（１９７６）〕、ＭＰＣ−１１〔Ｃｅｌｌ，８，４０５−４１５（１９７６）〕、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０（１９７８）〕、ＦＯ〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，３５，１−２１（１９８０）〕、Ｓ１９４〔Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１４８，３１３−３２３（１９７８）〕、およびＲ２１０〔Ｎａｔｕｒｅ，２７７，１３１−１３３（１９７９）〕等が好適に使用される。
【００２３】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には通常の方法、例えば、ミルシュタインら（Ｍｉｌｓｔｅｉｎｅｔａｌ．）の方法〔ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，７３，３−４６（１９８１）〕等に準じて行うことができる。
【００２４】
より具体的には、前記細胞融合は、例えば、融合促進剤の存在下に通常の栄養培地中で実施される。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、さらに、所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を適宜添加使用することもできる。免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して、免疫細胞を１〜１０倍程度とするのが好ましい。また、前記細胞融合に用いる培地としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地、その他、この種の細胞培養に使用される通常の培地が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清補液を併用することも可能である。
【００２５】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培地内でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１，０００〜６，０００程度のＰＥＧを、通常、培地に約３０〜６０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で添加し、混合することによって行われる。続いて、適当な培地を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことにより目的とするハイブリドーマが形成される。
【００２６】
当該ハイブリドーマは、通常の選択培地、例えば、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培地）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培地による培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（未融合細胞）が死滅するのに充分な時間、通常、数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法に従って、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローン化が実施される。
【００２７】
このようにして作製される本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
【００２８】
当該ハイブリドーマから本発明のモノクローナル抗体を採取するには、当該ハイブリドーマを常法に従って培養し、その培養上清から得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳動物に投与して増殖させその腹水から得る方法など適宜の方法が採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適した方法であり、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適した方法である。
【００２９】
さらに、前記した方法により得られる抗体は、塩析法、ゲル濾過法、アフィニティークロマトフラフィー等の通常の精製手段を応用して高純度に精製することができる。
【００３０】
このようにして作製される本発明のモノクローナル抗体は、脳神経細胞のうちの神経幹細胞や前駆細胞以外の細胞を選択的に認識することにより、ヒトの脳組織から神経幹細胞を効率的に分離できる。しかも、神経幹細胞以外の細胞を選択的に認識するため、幹細胞に蛍光物質が沈着しないため、分離された幹細胞の安全性が確保できる。
【００３１】
そして、本発明は、上記モノクローナル抗体を用いてマーキングすることにより、上記抗体が認識した抗原を発現する細胞を分離する神経系の幹細胞もしくは前駆細胞の分離方法に係るものであり、さらには、上記分離方法により分離された神経系の幹細胞もしくは前駆細胞に係るものである。
【００３２】
上記細胞の分離方法としては、上記抗体を使用して表面マーキングすることにより細胞を分離しうる方法であれば各種の方法を適用することができる。例えば、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）、磁性分離（磁性ビーズに複合体化した抗体を使用する）、および特定の細胞表面「マーカー」として知られるタンパク質に対する抗体の親和性による他の方法が包含されるがこれらに限定されない。
【００３３】
このようにして、安全な神経幹細胞や前駆細胞を効率的に分離し、これらの神経幹細胞や前駆細胞の増殖・分化をコントロールすれば、脳神経系の疾患に対する医療診断や再生治療への応用が可能となる。
【００３４】
また、本発明は、上記モノクローナル抗体による抗原抗体反応を利用した免疫学的診断法に関するものである。
【００３５】
上記免疫学的診断法としては、上記モノクローナル抗体による抗原抗体反応を利用して免疫組織診断や生化学的診断を行いうる方法であれば、各種の方法を適用することができる。
【００３６】
例えば、上記モノクローナル抗体に蛍光色素等の色素を結合させて標識抗体として、モノクローナル抗体の結合の有無等を観察する蛍光抗体法や化学染色法、蛍光色素の代わりに酵素を用いて上記モノクローナル抗体を標識抗体とする酵素抗体法，酵素で標識した二次抗体を用いて抗原量等を測定するエライザ法，上記モノクローナル抗体をアイソトープで標識して標識抗体とするラジオイノムアッセイ，抗原抗体反応による凝集反応を利用する免疫沈降法等をあげることができる。
【００３７】
また、タンパク質をゲル電気泳動で分画し、これを上記モノクローナル抗体で検出するウェスタンブロット法をあげることができる。このようなウェスタンブロット法によれば、上記モノクローナル抗体に対する抗原タンパク質をコードするＤＮＡを直接クローニングするのに有用である。なお、上記ウェスタンブロット法としては、ウェスタン法，サウスウェスタン法，ノースウェスタン法，ウェストウェスタン法等のウェスタンブロット変法も含まれる趣旨である。
【００３８】
【実施例】
つぎに、本発明の実施例について詳しく説明する。
【００３９】
モノクローナル抗体作製法
【００４０】
動物の免疫：
モノクローナル抗体の作製は、Ｏｒｌｉｋ，Ｏ ＆ Ａｌｔａｎｅｒ，Ｃ （Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ．１１５：５５−５９，１９９８）による変法に従い、鼡径部リンパ節細胞を用いて行った。胎齢９，１４，２３週のヒト脳組織をすり潰した破砕物の懸濁液（ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅｓ）を抗原として、生後６週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウス４−５匹に注射し免疫した。抗原は１回につき０．２ｍｌづつＲＩＢＩ Ａｄｊｕｖａｎｔ（フナコシ）との混合液として、両足底より３−４日おきに３回接種した。更に５日後に最後の抗原注射（Ｌａｓｔ ｂｏｏｓｔｅｒ）を単独で接種した。
【００４１】
ハイブリドーマ細胞の作製：
株化Ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌ であるＦＯ−１ ｃｅｌｌを１５％牛胎児血清（ＦＣＳ）、８ａｚａｇｕａｎｉｎｅ（２０μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で３７℃、ＣＯ２インキュベーターを用いて培養。細胞融合の前２−３日は８ａｚａｇｕａｎｉｎｅを除去した同上組成の培地にて培養した。
Ｌａｓｔ ｂｏｏｓｔｅｒ後、３日で下記の方法にて細胞融合を行いハイブリドーマ細胞を作製した。
４−５匹のマウスの両鼡径部リンパ節を摘出。培養液にいれて、２枚のスリガラスに挟んでスリ合わせるようにしてリンパ球を取り出した（約１×１０８個）。
２−４×１０７個のＦＯ−１細胞を用意した。
【００４２】
操作１および２の細胞を増殖培地（ＲＰＭＩ１６４０培地＋１５％ＦＣＳ）の５０ｍｌ中で混合。１０００ｒｐｍ（回転数／分）、５分間室温で遠心分離後、上清を捨て２０ｍｌの増殖培地に細胞を懸濁した。
５０％ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ （ＰＥＧ）水溶液を１００μｌ加えて、３７℃のＣＯ２インキュベーターに９０分間入れて保温。１０００ｒｐｍ，５分遠心分離後、上清を捨て、さらに数秒度程度の回転数にて遠心分離して上清を出来るだけ吸いとった。
３７℃の恒温水槽の水面に細胞試料の入った容器を軽く打ち付けるようにして温めながら上記遠心分離沈殿を、ほぐした。
３７℃であらかじめ温めた５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の水溶液１ｍｌを１分間かけてゆっくり添加して振とうし、更に１ｍｌを１分間かけてゆっくり添加して振とうする。さらに８ｍｌを２−３分間かけて添加して混ぜてから１０００ｒｐｍで遠心分離した。
【００４３】
細胞からなる上記遠心分離の沈殿をＨＡＴ培地（増殖培地１００ｍｌあたりに５０ｘ ＨＡＴ２ｍｌを加える）の５０ｍｌに懸濁し、９６穴培養プレート（９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に０．１ｍｌ／ｗｅｌｌで播種（５ｐｌａｔｅｓ）して培養。このとき胸腺細胞をＦｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ（細胞の増殖を助けるため共存させる他の種類の細胞）として約１×１０５／ｗｅｌｌの割合で加えた。
３日目にＨＡＴ培養液を５０μｌ／ｗｅｌｌ加えた。以後ＨＡＴ培地の添加、交換を行い、ハイブリドーマ細胞の増殖コロニーが培養プレートの穴の１／４〜１／３程度になるまで待った。
細胞増殖巣が適当な大きさになったら培養上清をとり、抗体産生の陽性・陰性試験を行った。試験は胎齢９−１４週のヒト胎児脳パラフィン包埋切片で免疫組織染色を行うことで実施した（キット：ニチレイマルチステインを使用）。
【００４４】
抗体産生の認められたハイブリドーマ細胞については、限界希釈法によりハイブリドーマ細胞のクローニングを行った。すなわち、約０．５個ハイブリドーマ細胞／ｗｅｌｌになるように限界希釈したハイブリドーマ細胞を９６穴培養プレートに植え、培養液をＨＴ培養液＋Ｂｒｉｃｌｏｎｅ（増殖因子、大日本製薬）に替えて、ハイブリドーマ細胞のみが生存・増殖しやすい環境に置くことにより、ハイブリドーマ細胞１個由来の均質な細胞集団を得た。
【００４５】
上記のハイブリドーマ細胞の増殖コロニー形成から限界希釈法によるクローニングまでの行程を３回繰り返した。ただし培養液はＨＴ培養液＋Ｂｒｉｃｌｏｎｅを用い、ハイブリドーマ細胞中の抗体産生クローンの割合がほぼ１００％になった時点で、増殖のよい、抗体分泌能の高い、しかも安定なクローンをとって増殖培地で増やした。
【００４６】
ハイブリドーマ細胞の増殖：
２−３週間前からｐｒｉｓｔａｎｅを０．５ｍｌずつ２−３回腹腔内に接種しておいたマウスの腹腔内に１×１０７のハイブリドーマ細胞を接種した。
７−１０日後、腹水が多量に貯まってくるので、注射器等を用いて腹水を採取し、液体窒素にて急速凍結。−８０℃にて凍結保存した。
【００４７】
モノクローナル抗体の性質試験法
【００４８】
ＨＦＢ１１５抗体が認識する分子の同定
【００４９】
１１５抗体の認識する抗原の精製：
Ｃａｒｐｅｎｔａｒ等の方法（ＭＫＣａｒｐｅｎｔｅｒＭＫ他、ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＮｅｕｒｏｌ．ｏｇｙ１５８巻 ２６５〜２７８頁、１９９９年、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）により培養したヒト胎児由来の神経幹細胞もしくは神経系前駆細胞を含む細胞凝集塊（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）を、３００×ｇ，５分間で遠心し、上清の培地を取り除いた。その後、沈殿した細胞凝集塊をＰＢＳ（１３７ｍＭＮａＣｌ，８．１ｍＭＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ，２．６８ｍＭＫＣｌ，１．４７ｍＭＫＨ２ＰＯ４）で３回（３００×ｇ，５分間）洗浄し、液体窒素で凍結後、−８０℃下で保存した。
【００５０】
マイナス８０℃下で保存している細胞塊を氷上で融かし、プロテアーゼインヒビター（Ｓｉｇｍａ社製，ｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｏｃｋｔａｉｌ，ｐ−８３４０）を加えたホモジェナイズバッファー（ＨＢ；０．１４７ｍＭＫＣｌ，５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］，１ｍＭＥＤＴＡ）５ｍｌを加え、ホモジェナイズ（５００ｒｐｍ，５回）した。これを、８，０００×ｇ，１５分間で遠心し、上清は新たな遠沈管に移した。沈殿は、再度、プロテアーゼインヒビターを加えたＨＢを５ｍｌ加え、ホモジェナイズ（１０００ｒｐｍ，５回）後、８，０００×ｇ，１５分間で遠心し、上清を先に分取したものと合わせた。合わせた上清画分を１００，０００×ｇ，９０分間で遠心し、沈殿を得た。この沈殿にＨＢ，０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（以降ＨＢ’と呼ぶ）２ｍｌを加え、ホモジェナイズ（５０００ｒｐｍ，２０回）した。これを、３０，０００×ｇ，３０分間で遠心し、上清を細胞膜画分とした。
【００５１】
細胞膜画分のカラムクロマトグラフィーを、ＨｉｔｒａｐＨｅｐａｒｉｎＨＲ１ｍｌ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて下記の条件で行った。平衡化バッファーにＨＢ’、溶出バッファーにＨＢ’，１ＭＮａＣｌを用いた。ヘパリンカラムに細胞膜画分２ｍｌをアプライし、平衡化バッファー２ｍｌでカラムの洗いを行った。この後、５０％溶出バッファー５ｍｌで溶出を行い、この溶出画分を１ｍｌずつ（Ｎｏ．Ａ８−Ａ１２）分取した。続いて５０％溶出バッファーから１００％まで１５ｍｌのグラジエントの溶出を行い、溶出画分を０．５ｍｌずつ（画分Ｎｏ．Ｂ１２からＤ８）分取した。
【００５２】
ヘパリンカラムクロマトグラフィーの各溶出画分を、Ｌａｅｍｍｌｉの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．Ｎａｔｕｒｅ，２２７，ｐ６８０−６８５）の方法に従って、５％−２０％ポリアクリルアミドゲル濃度勾配ゲル（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いたＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った後、セミドライトランスファー法によりニトロセルロース膜（Ａｄｖａｎｔｅｃ社製）にゲル中の蛋白質を転写した。
【００５３】
抗体の膜への非特異的吸着を抑止するためＰＢＳ，０．５％ｔｗｅｅｎ２０（以下、ＰＢＳ−Ｔ），５％スキムミルクで室温で１時間処理した後、ＰＢＳ−Ｔで希釈した一次抗体溶液（抗ＨＦＢ１１５モノクローナル抗体；１０００倍）を加え、４℃下で一晩抗原抗体反応を行った。この後ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、二次抗体との反応を行った。二次抗体には抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰもしくはＩｇＭ−ＨＲＰ（イムノグロブリンＧと西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼの架橋物，ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を１００００倍希釈したものを用い、室温で１時間反応させた。この後、ＰＢＳ，０．５％ｔｗｅｅｎ２０でよく洗い、ＥＣＬＰｌｕｓｋｉｔ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）の方法に従い、化学発光を行った。この膜をＸ線フィルムと一緒にカセットに入れて暗室で露光し現像した。
【００５４】
抗ＨＦＢ１１５抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った結果、ＨＦＢ１１５抗原タンパク質を含むＢ２からＣ２画分を分取した。
【００５５】
図１にＨＦＢ１１５抗原タンパク質の精製後のＳＤＳ−ＰＡＧＥならびにＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇの結果を例示する。ＨＦＢ１１５抗原タンパク質は、分子量約３３ｋＤａの分子であることが分った。また、ＨＦＢ１１５抗原タンパク質は、ヘパリンカラムを用いた精製法で精製されることも確認した。
【００５６】
抗体２７番および抗体１６番の認識する抗原：
前述のＣａｒｐｅｎｔａｒらの方法により培養したヒト胎児由来の神経幹細胞もしくは神経系前駆細胞を含む細胞凝集塊（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）を５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ−４０），ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ社製）を含むＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ中で破砕した試料（ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅｓ）を調製し、前項の方法で、５％−２０％ポリアクリルアミドゲル濃度勾配ゲル（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いたＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った後、セミドライトランスファー法によりＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ社製）にゲル中の蛋白質を転写し、ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇをおこなった。
【００５７】
抗体２７番は１６ｋＤａおよび３４ｋＤａのバンドを認識、抗体１６番は３４ｋＤａのバンドを認識した。
【００５８】
図２は、抗体１１５番の抗体によるＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果の第２例である。ＩｇＧ−ＨＲＰもしくはＩｇＭ−ＨＲＰを二次抗体として用いたこれらＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇの実験結果ならびに抗体サブクラス検定キットを用いた測定により、抗体１１５番、抗体２７番はＩｇＭに属し、抗体１６番、抗体２１１番はＩｇＧに属すると考えられた。
【００５９】
ＨＦＢ１１５抗体の認識する抗原タンパク質の内部アミノ酸配列の解析
ＨＦＢ１１５抗原タンパク質を含むＢ２，Ｂ１，Ｃ１，Ｃ２画分をアセトン沈殿法で濃縮した。各画分サンプル４００ｕｌにアセトン（−８０℃）を１２００ｕｌ加え、−８０℃で３時間放置した。これを２０，０００×ｇ，１５ｍｉｎ遠心し、沈殿したＨＦＢ１１５抗原タンパク質を得た。この沈殿を乾かし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー１５ｕｌでとかした。これを１２％不連続ポリアクリルアミドゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クマシーＧ−２５０で染色・脱色後、ＨＦＢ１１５抗原タンパク質のバンド（３３ｋＤａ）を切りだし−２０℃で保存した。このバンドの内部アミノ酸配列を解析した（株式会社アプロサイエンス）。
【００６０】
図３にＨＦＢ１１５抗原蛋白質の内部アミノ酸配列の解析結果を例示する。３種のペプチド、最長１３アミノ酸配列を解析した結果、ＨＦＢ１１５抗原蛋白質はｈｕｍａｎｈｉｓｔｏｎｅＨ１．Ｄ（Ｈ１．２）と１００％のホモロジーがあった。
【００６１】
前述のＣａｒｐｅｎｔａｒらの方法により培養したヒト胎児由来の神経幹細胞もしくは神経系前駆細胞を含む細胞凝集塊（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）の凍結切片を作成した。切片をＰＢＳで洗い、１０％ＧｏａｔＳｅｒｕｍ，０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，ＰＢＳで室温、１時間ブロッキングした。一次抗体（抗ＨＦＢ１１５抗体；５００倍、抗ヒストンＨ１モノクローナル抗体；５００倍、抗ヒストンＨ１ポリクローナル抗体；５００倍，ｓａｎｔａｃｒｕｚ社製）で４度、一晩反応した。反応後、ＰＢＳで洗い、二次抗体（Ａｌｅｘｓａａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＭａｎｔｉｂｏｄｙ６４７，Ａｌｅｘｓａａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧａｎｔｉｂｏｄｙ４８８，Ａｌｅｘｓａａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔＩｇＧａｎｔｉｂｏｄｙ５６８，ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｂｅ社製）で室温、１時間反応した。ＰＢＳ，ｄｄＨ２Ｏで洗った後、マウントした。共焦点レーザースキャン顕微鏡（ＬＳＭ５１０，ＣａｒｌＺｅｉｓｓ社製）で観察を行った。
【００６２】
抗ＨＦＢ１１５抗体と抗ヒストンＨ１抗体（市販品）の認識部位の比較
図４に示すように、Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ凍結切片で抗ＨＦＢ１１５抗体と抗ヒストンＨ１抗体の認識部位の比較を行った結果、両者の認識部位が異なることがわかった。抗ＨＦＢ１１５抗体は、細胞膜、もしくは細胞間を認識し、抗ヒストンＨ１抗体は核を（抗ヒストンＨ１モノクローナル抗体）、細胞質（抗ヒストンＨ１ポリクローナル抗体）を認識していた。
【００６３】
抗体を用いたヒト胎児脳の免疫染色：
パラフィンブロックより切り出した切片を脱パラフィン処理の為、ヒストクリアにて１０分間、３回処理した後、１００％、９５％、９０％、８０％、７０％の各濃度のエタノール水溶液にて上記の順番に５分間づつ処理した。ＰＢＳで５分間、３回洗浄後、ブロッキング溶液（１０％正常ヤギ血清、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳ）にて１時間洗浄し抗体の非特的吸着を抑制する為のブロッキングを行った。１０％正常ヤギ血清、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳに０．０２％に希釈した抗体をこれらの組織切片試料に４℃、１５時間反応させた。ＰＢＳにて５分間、５回洗浄した後、ブロッキング溶液に０．０２％程度に希釈した抗マウスイムノグロブリン−ＦＩＴＣ複合体を含む二次抗体溶液を室温で１時間反応させた。ＰＢＳにて５分間、５回洗浄した後、蛍光顕微鏡にて観察し、染色部位を確認した。４種のモノクローナル抗体は、図２に抗体１１５番の例をもって示したように、ウェスタンブロット法等の生化学的診断法に用いることが可能である。
【００６４】
図５〜図８は、ヒト胎児脳組織に対する抗体２７番の免疫染色像を示す。これらのうち図５はＤＮＡ染色色素ＴＯ−ＰＲＯ−３を用いた核染色による染色像、細胞の所在を示すもの、図６は神経幹細胞または前駆細胞に発現することが既知のマーカー蛋白質ネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）に対する抗体による免疫染色像、図７は抗体２７番による免疫染色像、図８は上記３つの染色像の重ね合わせた多重染色像である。抗体２７番では、脳室近くの上衣層、上衣下層付近が選択的に染色されている。同様の順序にて図９〜図１２に抗体１６番、図１３〜図１６に抗体１１５番、図１７〜図２０に抗体２１１番の免疫染色像を示す。抗体１６番、２１１番では上衣層は脳室壁付近がごく一部染色されているものの、上衣下層は殆ど染色されておらず、上衣層、上衣下層以外の部分は染色されている。抗体１１５番では、上衣層、上衣下層は殆ど染色されておらず、これら以外の脳室から遠い部位が染色されている。
【００６５】
以上の結果より、抗体２７番はヒト脳組織切片を用いた免疫染色試験において上衣層および上衣下層領域を選択的に染色することの可能なモノクローナル抗体であり、抗体１６番、抗体１１５番、抗体２１１番の３種類のモノクローナル抗体は、ヒト脳組織切片を用いた免疫染色試験において上衣層、上衣下層領域を選択的に染色せず、上衣層、上衣下層以外の部位を選択的に染色することの可能なモノクローナル抗体であることが明らかである。上記４種のモノクローナル抗体は、脳組織切片の免疫組織化学診断法に用いることが可能である。
【００６６】
細胞の標識とＦＡＣＳ：
ヒト胎児由来の神経幹細胞もしくは神経系前駆細胞を含む細胞凝集塊（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）の構成細胞をパスツールピペットにて出し入れして、物理的にバラバラに分離し、３００ｇ、５分間程度の遠心分離で細胞を集めた。０．８％一次抗体、１７％ヤギＩｇＧを含む培地にて４℃、３０分処理した後、一次抗体を含まない培地にて５分間、３回洗浄。二次抗体溶液（１％の抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ複合体、もしくは抗マウスＩｇＭ−ＦＩＴＣ複合体）を加えて４℃、２５分間、遮光条件にて反応させ、二次抗体を含まない培地にて５分間、３回洗浄した後、１ｕｇ／ｍｌの７−ａｍｉｎｏ−ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製、ＶＩＡ−ＰＲＯＢＥ）を含む培地に細胞を懸濁してＦＡＣＳ分析の試料とし、セルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製、ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ ＳＥ）を用いてソーテイングを行った。Ｊｕｒｋａｔを用いた場合には、ＶＩＡ−ＰＲＯＢＥの代わりにＰｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）を用いた。
【００６７】
図２１に抗体１１５番を用いたｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ構成細胞のソーテイング結果の例を示す。横軸は二次抗体のＦＩＴＣに由来する蛍光強度を示し、細胞表面に結合した抗体の量を反映している。縦軸は死細胞を選択的に染色する色素による蛍光強度を示し、この値が高い細胞は死細胞である可能性が高い。図２１中の細胞の集団は２つのクラスターに分かれているが、縦軸の中央部、横軸で見るとやや左よりの水平方向に伸びた細胞集団は死細胞を多く含む可能性が考えられた。一方、図２１の左下から右側中央部にのびる細胞集団は、細胞外に抗原を持つ生細胞である可能性が高い。以上のような検討より、抗体１１５番を用いたソーテイングでは、Ｒ２の枠内に含まれる細胞が多く見られたので、細胞表面抗原を認識していると考えられた。抗体１６番、２１１番についてもこれにほぼ類似したソーテイング結果を得た。
【００６８】
図２２に抗体２１１を用いた、リンパ球系の細胞Ｊｕｒｋａｔのソーテイング結果の例を示す。この例に示されるように、神経系以外の細胞でも、同じ抗原を発現していれば、モノクローナル抗体をソーテイング等の方法により細胞分離に用いることができる。
【００６９】
上述したように、４種類のモノクローナル抗体の一つの１１５番抗体（ＦＥＲＭ Ｐ−１８７８０）の抗原は、ヒストンＨ１であることが同定された。通常、ヒストンＨ１は細胞核あるいは細胞質に存在し、市販されている抗ヒストンＨ１抗体は核（抗ヒストンＨ１モノクローナル抗体）、細胞質（抗ヒストンＨ１ポリクローナル抗体）に存在するヒストンＨ１を認識する。しかし今回開発した１１５番抗体は他の市販されている抗体とは異なり、核内あるいは細胞質内に存在するヒストンＨ１を認識せず、むしろ細胞表面に存在するヒストンＨ１を認識していると考えられる。このことは、１１５番抗体は細胞表面に存在するヒストンＨ１の特異的な抗原を認識しているためと考えられる。
【００７０】
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、新規な融合細胞であり、公的微生物寄託機関である特許微生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、下記のとおりである。
抗体 １６番産生ハイブリドーマ：ＦＥＲＭ Ｐ−１８７７８
抗体 ２７番産生ハイブリドーマ：ＦＥＲＭ Ｐ−１８７７９
抗体１１５番産生ハイブリドーマ：ＦＥＲＭ Ｐ−１８７８０
抗体２１１番産生ハイブリドーマ：ＦＥＲＭ Ｐ−１８７８１
【００７１】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、脳神経細胞のうちの神経幹細胞や前駆細胞以外の細胞を選択的に認識することにより、ヒトの脳組織から神経幹細胞や前駆細胞を効率的に分離できる。しかも、神経幹細胞や前駆細胞以外の細胞を選択的に認識するため、目的とする幹細胞や前駆細胞に蛍光物質が沈着しないため、分離された幹細胞や前駆細胞の安全性が確保できる。そして、安全な神経幹細胞や前駆細胞を効率的に分離し、これらの神経幹細胞や前駆細胞の増殖・分化をコントロールすれば、脳神経系の疾患に対する医療診断や再生治療への応用が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＦＢ１１５抗原タンパク質の精製後のＳＤＳ−ＰＡＧＥならびにＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇの結果を示す。
【図２】抗体１１５番の抗体によるＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果の一例である。
【図３】ＨＦＢ１１５抗原蛋白質の内部アミノ酸配列の解析結果を示す。
【図４】抗ＨＦＢ１１５抗体と抗ヒストンＨ１抗体の認識部位の比較を行なった結果を示す。
【図５】ヒト胎児脳組織に対する抗体２７番のＤＮＡ染色色素ＴＯ−ＰＲＯ−３を用いた核染色による染色像である。
【図６】ヒト胎児脳組織に対する抗体２７番のネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）に対する免疫染色像である。
【図７】ヒト胎児脳組織に対する抗体２７番の免疫染色像である。
【図８】抗体２７番による上記３つの染色像の重ね合わせた多重染色像である。
【図９】ヒト胎児脳組織に対する抗体１６番のＤＮＡ染色色素ＴＯ−ＰＲＯ−３を用いた核染色による染色像である。
【図１０】ヒト胎児脳組織に対する抗体１６番のネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）に対する免疫染色像である。
【図１１】ヒト胎児脳組織に対する抗体１６番の免疫染色像である。
【図１２】抗体１６番による上記３つの染色像の重ね合わせた多重染色像である。
【図１３】ヒト胎児脳組織に対する抗体１１５番のＤＮＡ染色色素ＴＯ−ＰＲＯ−３を用いた核染色による染色像である。
【図１４】ヒト胎児脳組織に対する抗体１１５番のネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）に対する免疫染色像である。
【図１５】ヒト胎児脳組織に対する抗体１１５番の免疫染色像である。
【図１６】抗体１１５番による上記３つの染色像の重ね合わせた多重染色像である。
【図１７】ヒト胎児脳組織に対する抗体２１１番のＤＮＡ染色色素ＴＯ−ＰＲＯ−３を用いた核染色による染色像である。
【図１８】ヒト胎児脳組織に対する抗体２１１番のネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）に対する免疫染色像である。
【図１９】ヒト胎児脳組織に対する抗体２１１番の免疫染色像である。
【図２０】抗体２１１番による上記３つの染色像の重ね合わせた多重染色像である。
【図２１】抗体１１５番を用いたｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ構成細胞のソーテイング結果の一例である。
【図２２】抗体２１１を用いたリンパ球系の細胞Ｊｕｒｋａｔのソーテイング結果の一例である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a monoclonal antibody, a hybridoma, a cell derived from a nervous system or other tissues useful for selecting, separating, and adjusting cells derived from the nervous system or other tissues, and for examining the site-specific expression of a protein in brain nerve tissue. The present invention relates to a method for separating cells, separated cells, and immunological diagnostic methods.
[0002]
[Prior art]
In order to repair tissues of a human body that have been damaged or lost due to illness or trauma, treatments using organ transplantation and artificial organs have been studied and performed. However, artificial organs are still in the development stage, and there are almost no artificial organs that can withstand permanent use when implanted in the body. In addition, regarding organ transplantation, the number of donated organs is absolutely insufficient, and its limitations have been pointed out, and it has not yet been established as a general treatment method due to rejection reactions and ethical problems.
[0003]
Under these circumstances, in recent years, as an alternative to treatment by artificial organs or organ transplantation, stem cells that have the multipotential ability to differentiate into a plurality of progenitor cells and differentiated cells and can produce the tissue have been used. Research on regenerative medicine has been actively conducted. Stem cells are pluripotent cells capable of differentiating into a plurality of progenitor cells and differentiated cells, and are capable of producing the tissue.Stem cells are cultured, expanded and differentiated, and then returned to the tissue to regenerate the tissue. The regenerative treatment aiming at is expected to make great progress as an alternative to the above-mentioned treatment by artificial organs or organ transplantation.
[0004]
Such stem cells are roughly classified into two types, ie, embryonic stem cells and somatic stem cells, and both of them have potential application to regenerative therapy, and are being studied. Among them, embryonic stem cells have attracted attention because they can be expanded indefinitely by culture and have the versatility to differentiate into any cells. However, human embryonic stem cells are derived from fertilized eggs and may lead to the creation of designer babies and clones. From an ethical point of view, the possibility of their application to humans is being discussed.
[0005]
Somatic stem cells that have differentiated more than embryonic stem cells have a limited cell lineage that has been confirmed to be present in adult tissues and do not require fertilized eggs. It is expected to be applied to human regenerative therapy as a safe cell.
[0006]
In the central nervous system such as the brain and spinal cord, differentiation has been completed shortly after birth, and it has been considered that adults do not reproduce at all even if they are damaged by diseases or accidents such as Alzheimer's disease or cerebral hemorrhage. However, in recent years, neural stem cells have been confirmed in the human adult brain, and it has been found that they can be proliferated and differentiated under certain conditions. It is thought that controlling the proliferation and differentiation of these neural stem cells will enable effective treatment for diseases of the cerebral nervous system.
[0007]
In order to apply such somatic stem cells to regenerative therapy, it is necessary to differentiate and proliferate the stem cells or progenitor cells to the amount required for the therapy, and therefore, first, stem cells capable of differentiating into target cells or tissues Must be efficiently separated from either source.
[0008]
Methods for efficiently separating stem cells include a separation method using FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting). This method is a method of recognizing the expression mode of a selective surface marker expressed on a stem cell with a fluorescently labeled monoclonal antibody, and separating the stem cells based on the fluorescence intensity.
[0009]
However, there are only reports on surface markers for neural stem cells that are recognized by the CD133 antibody. However, since the CD133 antibody directly recognizes and reacts with neural stem cells, it is inevitable that a fluorescent substance is deposited on neural stem cells separated using this antibody. When neural stem cells on which fluorescent substances are deposited are proliferated and differentiated and used for medical treatment, their long-term safety has not been confirmed at all.
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, the present inventors have proposed that the present inventors selectively recognize, among brain nerve cells, antibodies selectively recognizing neural stem cells or progenitor cells, or conversely, cells other than neural stem cells or progenitor cells. Based on the idea that the use of such monoclonal antibodies would enable efficient and safe separation of stem cells, and the application of neural stem cells to medical treatment would be realized, intensive research was conducted.
[0011]
In a series of these studies, a monoclonal antibody was prepared using a cell crushed sample derived from human brain nerve tissue as a sensitizing antigen, and a novel monoclonal antibody was obtained.
[0012]
Some of the obtained monoclonal antibodies recognize antigens expressed on cells located in the ependymal layer and the lower ependymal region of human brain tissue, and another antibody recognizes the ependymal layer and lower ependymal layer of human brain tissue. It is found that cells that have the property of recognizing antigens expressed on cells located in other regions without recognizing antigens expressed on cells in cells located in the region are used. It has been shown that sorting is possible, and the present invention has been completed.
[0013]
That is, the present invention provides a novel monoclonal antibody capable of efficiently separating these cells by selectively recognizing and binding nervous system stem cells or progenitor cells, or selecting cells other than nervous system stem cells or progenitor cells. The purpose of the present invention is to provide a novel monoclonal antibody that can efficiently separate neural stem cells or progenitor cells that are not recognized and bound by these antibodies by recognizing and binding the same. It is an object of the present invention to provide a hybridoma that produces a monoclonal antibody. It is another object of the present invention to provide a method for separating nervous system stem cells or progenitor cells using such a monoclonal antibody. It is intended to provide cells derived from tissues other than the system. It is another object of the present invention to provide an immunological diagnostic method using such a monoclonal antibody.
[0014]
[Means for Solving the Problems]
The monoclonal antibody of the present invention is a novel monoclonal antibody selectively recognizing an antigen expressed on stem cells or progenitor cells of the nervous system located in the ependymal layer and the lower ependymal region in a cross section of human brain tissue, and a human brain. The present invention relates to a monoclonal antibody capable of selectively immunostaining the above-mentioned ependymal layer and lower ependymal layer in an immunostaining test using a tissue section.
[0015]
In addition, the monoclonal antibody of the present invention does not recognize an antigen expressed on cells located in the ependymal layer and ependymal region of human brain tissue, and a novel antibody that recognizes an antigen expressed on cells present in other regions. Monoclonal antibodies, and monoclonal antibodies capable of selectively staining sites other than the ependymal layer and the lower ependymal region in immunostaining tests using human brain tissue sections, and cell separation methods using these antibodies and cells separated Things.
[0016]
These monoclonal antibodies have a function of selectively recognizing and binding antigens expressed on cells other than neural stem cells and progenitor cells, thereby removing these cells and efficiently separating neural stem cells. At the same time, the separated neural stem cells and progenitor cells are extremely useful as those capable of separating extremely safe neural stem cells without deposition of a fluorescent substance.
[0017]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Such a monoclonal antibody of the present invention can be basically produced, for example, as follows.
[0018]
That is, the monoclonal antibody of the present invention is obtained, for example, by using human fetal brain cells as a sensitizing antigen, basically immunizing it using a normal immunization method, and applying a normal cell fusion method. The cells can be produced by subjecting the cells to cell fusion, cloning by applying a usual cloning method, and then screening.
[0019]
More specifically, the method for producing the monoclonal antibody of the present invention uses, for example, a human fetal brain cell as the sensitizing antigen and a mammalian plasma cell (immune cell) immunized with the sensitizing antigen. Fusion with a myeloma cell of a mammal such as a mouse, the obtained fused cell (hybridoma) is cloned, and a clone producing an antibody of the present invention recognizing the cell line is selected from the cloned cell and cultured. A method for recovering a desired antibody is exemplified as a suitable method.
[0020]
In the method for producing such a monoclonal antibody, the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, and is selected in consideration of compatibility with a myeloma cell used for cell fusion and the like. Preferably, mice, rats, hamsters and the like are generally used as suitable ones.
[0021]
Next, immunization is performed by a general method, for example, by administering the aforementioned human fetal brain cells to a mammal by intraperitoneal injection or the like. More specifically, it is preferable to administer an animal diluted and suspended in an appropriate amount with PBS, physiological saline or the like several times a month to animals. It is preferable to use splenocytes extracted after the final administration of the cell line as immune cells.
[0022]
Next, various mammalian cell lines, such as P3 (P3X63Ag8.653) [J. Immunol. , 123, 1548 (1978)], p3-U1 [CurrentTopics in Micro-biology and Immunology, 81, 1-7 (1978)], NS-1 [Eur. J. Immunol. , 6, 511-519 (1976)], MPC-11 [Cell, 8, 405-415 (1976)], Sp2 / 0-Ag14 [Nature, 276, 269-270 (1978)], FO [J. Immunol. Meth. , 35, 1-21 (1980)], S194 [J. Exp. Med. , 148, 313-323 (1978)] and R210 [Nature, 277, 131-133 (1979)] and the like are preferably used.
[0023]
Cell fusion between the immune cells and myeloma cells is basically performed by a usual method, for example, the method of Milstein et al. [Methods Enzymol. , 73, 3-46 (1981)].
[0024]
More specifically, the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient medium in the presence of a fusion promoter. As the fusion promoter, for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) and the like are used, and if necessary, an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be appropriately added and used to increase the fusion efficiency. The ratio of the use of the immune cells and the myeloma cells is preferably, for example, about 1 to 10 times the number of the immune cells to the myeloma cells. Further, as the medium used for the cell fusion, for example, RPMI-1640 medium suitable for the growth of the myeloma cell line, MEM medium, and others, a normal medium used for this kind of cell culture can be used, Furthermore, a serum replacement solution such as fetal bovine serum (FBS) can be used in combination.
[0025]
The cell fusion is performed by mixing a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells in the medium and heating the PEG solution to about 37 ° C. in advance, for example, a PEG having an average molecular weight of about 1,000 to 6,000, Usually, it is performed by adding to a medium at a concentration of about 30 to 60% (W / V) and mixing. Subsequently, a desired hybridoma is formed by repeatedly adding an appropriate medium and centrifuging to remove the supernatant.
[0026]
The hybridoma is selected by culturing it in a normal selection medium, for example, a HAT medium (a medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). The culturing in the HAT medium is continued for a period of time sufficient to kill cells (unfused cells) other than the target hybridoma, usually several days to several weeks. Next, screening and monocloning of hybridomas producing the desired antibody are performed according to the usual limiting dilution method.
[0027]
The hybridoma producing the monoclonal antibody of the present invention thus produced can be subcultured in a usual medium, and can be stored for a long time in liquid nitrogen.
[0028]
The monoclonal antibody of the present invention can be collected from the hybridoma by culturing the hybridoma according to a conventional method and obtaining the hybridoma from the culture supernatant, or by administering the hybridoma to a mammal compatible with the hybridoma and growing the ascites. An appropriate method such as a method obtained from The former method is suitable for obtaining high-purity antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
[0029]
Further, the antibody obtained by the above-mentioned method can be purified to a high purity by applying ordinary purification means such as salting-out method, gel filtration method, affinity chromatography and the like.
[0030]
The monoclonal antibody of the present invention thus produced can efficiently separate neural stem cells from human brain tissue by selectively recognizing cells other than neural stem cells and progenitor cells among brain neural cells. Moreover, since cells other than neural stem cells are selectively recognized, no fluorescent substance is deposited on the stem cells, so that the safety of the separated stem cells can be ensured.
[0031]
And, the present invention relates to a method for separating stem cells or progenitor cells of the nervous system for separating cells expressing the antigen recognized by the antibody by marking using the monoclonal antibody, It relates to stem cells or progenitor cells of the nervous system separated by the separation method.
[0032]
As a method for separating the cells, various methods can be applied as long as the cells can be separated by performing surface marking using the antibody. For example, fluorescence activated cell sorting (FACS), magnetic separation (using antibodies conjugated to magnetic beads), and other methods based on the affinity of antibodies for proteins known as specific cell surface "markers". Included, but not limited to.
[0033]
In this way, by efficiently separating safe neural stem cells and progenitor cells and controlling the proliferation and differentiation of these neural stem cells and progenitor cells, it can be applied to medical diagnosis and regenerative treatment for diseases of the cerebral nervous system It becomes.
[0034]
The present invention also relates to an immunological diagnostic method utilizing an antigen-antibody reaction of the monoclonal antibody.
[0035]
As the immunological diagnosis method, various methods can be applied as long as the immunohistological diagnosis or the biochemical diagnosis can be performed using the antigen-antibody reaction by the monoclonal antibody.
[0036]
For example, by binding a dye such as a fluorescent dye to the monoclonal antibody as a labeled antibody, a fluorescent antibody method or a chemical staining method for observing the presence or absence of the binding of the monoclonal antibody, the monoclonal antibody using an enzyme in place of the fluorescent dye Enzyme antibody method using a labeled antibody, ELISA method to measure the amount of antigen using a secondary antibody labeled with an enzyme, radioinomic assay using the above monoclonal antibody as a labeled antibody by labeling with an isotope, aggregation by antigen-antibody reaction An immunoprecipitation method using a reaction can be used.
[0037]
In addition, a western blotting method in which proteins are fractionated by gel electrophoresis and detected by the above monoclonal antibody can be used. Such a Western blot method is useful for directly cloning a DNA encoding an antigen protein for the monoclonal antibody. It is to be noted that the Western blotting method includes modified Western blotting methods such as the Western method, the Southwestern method, the Northwestern method, and the Westwestern method.
[0038]
【Example】
Next, examples of the present invention will be described in detail.
[0039]
Monoclonal antibody production method
[0040]
Animal immunity:
Monoclonal antibodies were prepared using inguinal lymph node cells according to a modified method by Orlik, O & Altanaer, C (J. Immunol. Methods. 115: 55-59, 1998). Using a suspension (homogenates) of a crushed human brain tissue of 9, 14, and 23 weeks of fetal age as an antigen, 4 to 5 6-week-old female Balb / c mice were injected and immunized. The antigen was inoculated three times every 3-4 days from both plantars as a mixture with RIBI Adjuvant (Funakoshi) 0.2 ml each time. Five days later, the last antigen injection (Last booster) was inoculated alone.
[0041]
Preparation of hybridoma cells:
The established Myeloma cell, FO-1 cell, was cultured in an RPMI1640 medium (GIBCO, Life Technology) containing 15% fetal calf serum (FCS) and 8 azaguanine (20 μg / ml) at 37 ° C. using a CO2 incubator. Two to three days before the cell fusion, the cells were cultured in a medium having the same composition as above except that 8azaguanine was removed.
Three days after the last booster, cell fusion was performed by the following method to prepare hybridoma cells.
Both inguinal lymph nodes of 4-5 mice were removed. Lymphocytes were taken out by placing them in a culture solution and sandwiching them with two pieces of ground glass so that they were ground together (about 1 × 10 8 Pieces).
2-4 × 10 7 Pieces of FO-1 cells were prepared.
[0042]
Mix cells from Runs 1 and 2 in 50 ml of growth medium (RPMI 1640 medium + 15% FCS). After centrifugation at 1000 rpm (rotation speed / minute) for 5 minutes at room temperature, the supernatant was discarded and the cells were suspended in 20 ml of a growth medium.
100 μl of a 50% aqueous solution of Polyethylene glycol (PEG) was added, and CO 2 Put in incubator for 90 minutes to keep warm. After centrifugation at 1,000 rpm for 5 minutes, the supernatant was discarded, and further centrifuged at a rotation speed of about several seconds to absorb the supernatant as much as possible.
The centrifuged precipitate was loosened while gently tapping the container containing the cell sample on the surface of the water bath at 37 ° C.
1 ml of an aqueous solution of 50% polyethylene glycol (PEG) pre-warmed at 37 ° C. is slowly added over 1 minute and shaken, and further 1 ml is slowly added over 1 minute and shaken. An additional 8 ml was added over 2-3 minutes, mixed, and centrifuged at 1000 rpm.
[0043]
The precipitate of the above centrifugation consisting of cells is suspended in 50 ml of HAT medium (50 ml of HAT is added per 100 ml of growth medium), and seeded (5 plates) at 0.1 ml / well on a 96-well culture plate (96 well plate) and cultured. . At this time, the thymocytes were converted to feeder cells (other types of cells coexisting to assist cell growth) of about 1 × 10 5 / Well.
On the third day, a HAT culture solution was added at 50 μl / well. Thereafter, the HAT medium was added and exchanged, and the system was waited until the growth colonies of the hybridoma cells became about 1/4 to 1/3 of the hole of the culture plate.
When the cell growth foci reached an appropriate size, the culture supernatant was taken and subjected to a positive / negative test for antibody production. The test was performed by performing immunohistochemical staining on sections embedded in paraffin embedded in human fetal brain at the age of 9 to 14 weeks (kit: Nichirei Multistain).
[0044]
Hybridoma cells in which antibody production was observed were cloned by the limiting dilution method. That is, about 0.5 hybridoma cells / well, hybridoma cells which had been limitingly diluted to a well were inoculated in a 96-well culture plate, and the culture solution was replaced with HT culture solution + Briclone (growth factor, Dainippon Pharmaceutical), and only By placing the cells in an environment where cells easily survive and proliferate, a homogeneous cell population derived from one hybridoma cell was obtained.
[0045]
The process from the formation of the proliferating colonies of the hybridoma cells to the cloning by the limiting dilution method was repeated three times. However, the culture medium was HT culture medium + Briclone, and when the ratio of antibody-producing clones in the hybridoma cells reached almost 100%, clones with good growth, high antibody secretion ability, and stable were taken and used in a growth medium. Increased.
[0046]
Proliferation of hybridoma cells:
1 × 10 5 mice were inoculated intraperitoneally 2-3 times with 0.5 ml of pristane 2-3 weeks ago. 7 Of hybridoma cells.
7-10 days later, ascites accumulates in a large amount, so ascites is collected using a syringe or the like and rapidly frozen with liquid nitrogen. Stored frozen at -80 ° C.
[0047]
Testing methods for properties of monoclonal antibodies
[0048]
Identification of molecules recognized by HFB115 antibody
[0049]
Purification of the antigen recognized by the 115 antibody:
A cell aggregate (neurosphere) containing neural stem cells or neural progenitor cells derived from human fetuses cultured by the method of Carpentar et al. (MK Carpenter MK et al., Experimental Neurol. After centrifugation for 5 minutes, the medium of the supernatant was removed. Thereafter, the precipitated cell aggregates were removed from PBS (137 mM NaCl, 8.1 mM Na). 2 HPO 4 ・ 12H 2 O, 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH 2 PO 4 ) Three times (300 × g, 5 minutes), frozen in liquid nitrogen, and stored at −80 ° C.
[0050]
The cell mass stored at −80 ° C. is thawed on ice, and a homogenization buffer (HB; 0.147 mM KCl, 50 mM Tris-HCl [pH 7.5]) to which a protease inhibitor (manufactured by Sigma, protease inhibitor, tailclip, p-8340) is added. ], 1 mM EDTA) and homogenized (500 rpm, 5 times). This was centrifuged at 8,000 × g for 15 minutes, and the supernatant was transferred to a new centrifuge tube. For the precipitation, 5 ml of HB to which a protease inhibitor was added again was added, homogenized (1000 rpm, 5 times), and then centrifuged at 8,000 × g for 15 minutes, and the supernatant was combined with the previously collected one. The combined supernatant fraction was centrifuged at 100,000 × g for 90 minutes to obtain a precipitate. 2 ml of HB, 0.5% Triton X-100 (hereinafter referred to as HB ') was added to the precipitate, and homogenized (5000 rpm, 20 times). This was centrifuged at 30,000 × g for 30 minutes, and the supernatant was used as a cell membrane fraction.
[0051]
Column chromatography of the cell membrane fraction was performed using 1 ml of HitrapHeparinHR (manufactured by Amersham Biosciences) under the following conditions. HB 'was used for the equilibration buffer, and HB', 1M NaCl was used for the elution buffer. 2 ml of the cell membrane fraction was applied to a heparin column, and the column was washed with 2 ml of equilibration buffer. Thereafter, elution was performed with 5 ml of a 50% elution buffer, and the eluted fraction was fractionated by 1 ml (No. A8-A12). Subsequently, a 15 ml gradient was eluted from the 50% elution buffer to 100%, and the eluted fraction was fractionated by 0.5 ml (fraction Nos. B12 to D8).
[0052]
Each eluted fraction of the heparin column chromatography was subjected to a 5% -20% polyacrylamide gel gradient gel (manufactured by BioRad) according to the method of Laemmli (Laemmli, UK Nature, 227, p680-685). After performing SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), the proteins in the gel were transferred to a nitrocellulose membrane (manufactured by Advantec) by a semi-dry transfer method.
[0053]
The antibody was treated with PBS, 0.5% tween 20 (hereinafter, PBS-T) and 5% skim milk for 1 hour at room temperature to prevent nonspecific adsorption of the antibody to the membrane, and then the primary antibody solution diluted with PBS-T ( (Anti-HFB115 monoclonal antibody; 1000-fold) was added, and the antigen-antibody reaction was performed at 4 ° C. overnight. Thereafter, the plate was washed with PBS-T and reacted with a secondary antibody. Anti-mouse IgG-HRP or IgM-HRP (crosslinked product of immunoglobulin G and horseradish peroxidase, manufactured by Amersham Biosciences) diluted 10,000 times was used as the secondary antibody, and reacted at room temperature for 1 hour. Thereafter, the plate was washed well with PBS and 0.5% tween 20, and chemiluminescence was performed according to the method of ECLPluskit (manufactured by Amersham Biosciences). This film was placed in a cassette together with an X-ray film and exposed and developed in a dark room.
[0054]
As a result of performing Western blotting using an anti-HFB115 antibody, a C2 fraction was collected from B2 containing HFB115 antigen protein.
[0055]
FIG. 1 illustrates the results of SDS-PAGE and Western Blotting after purification of the HFB115 antigen protein. The HFB115 antigen protein was found to be a molecule with a molecular weight of about 33 kDa. It was also confirmed that the HFB115 antigen protein was purified by a purification method using a heparin column.
[0056]
Antigens recognized by antibody 27 and antibody 16:
A cell aggregate (neurosphere) containing neural stem cells or neural progenitor cells derived from human fetuses cultured by the method of Carpentar et al. Described above was treated with 50 mM TrisHCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40 (NP-40). ), A crushed sample (homogenates) in Lysis buffer containing protease inhibitor cocktail (manufactured by Sigma) was prepared, and a 5% -20% polyacrylamide gel concentration gel (BioRad) was used according to the method described in the preceding section. After performing SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), the proteins in the gel were transferred to a PVDF membrane (manufactured by BioRad) by a semi-dry transfer method, and Western blotting was performed. I got this.
[0057]
Antibody # 27 recognized the 16 kDa and 34 kDa bands, and antibody # 16 recognized the 34 kDa band.
[0058]
FIG. 2 is a second example of the result of Western Blotting using antibody 115. Based on the results of these Western Blotting experiments using IgG-HRP or IgM-HRP as a secondary antibody and measurement using an antibody subclass assay kit, antibody 115 and antibody 27 belonged to IgM, antibody 16 and antibody 211 Was considered to belong to IgG.
[0059]
Analysis of internal amino acid sequence of antigen protein recognized by HFB115 antibody
The B2, B1, C1, and C2 fractions containing the HFB115 antigen protein were concentrated by acetone precipitation. 1200 ul of acetone (−80 ° C.) was added to 400 ul of each fraction sample, and the mixture was left at −80 ° C. for 3 hours. This was centrifuged at 20,000 × g for 15 minutes to obtain a precipitated HFB115 antigen protein. The precipitate was dried and dissolved with 15 ul of SDS-PAGE sample buffer. This was subjected to SDS-PAGE on a 12% discontinuous polyacrylamide gel, stained and decolored with Coomassie G-250, and then the HFB115 antigen protein band (33 kDa) was cut out and stored at -20 ° C. The internal amino acid sequence of this band was analyzed (Aproscience Inc.).
[0060]
FIG. 3 illustrates an analysis result of the internal amino acid sequence of the HFB115 antigen protein. As a result of analyzing three types of peptides and a maximum of 13 amino acid sequences, HFB115 antigen protein was found to be humanhistone H1. There was 100% homology with D (H1.2).
[0061]
Frozen sections of cell aggregates (neurospheres) containing human embryonic neural stem cells or neural progenitor cells cultured by the method of Carpentar et al. Described above were prepared. The sections were washed with PBS and blocked with 10% GoatSerum, 0.01% Triton X-100, and PBS for 1 hour at room temperature. Reaction was carried out four times overnight with a primary antibody (anti-HFB115 antibody; 500-fold, anti-histone H1 monoclonal antibody; 500-fold, anti-histone H1 polyclonal antibody; 500-fold, manufactured by Santacruz). After the reaction, the cells were washed with PBS, and a secondary antibody (Alexsaanti-mouseIgMantibody647, Alexaanti-mouseIgGantibody488, Alexaanti-rabbitIgGantibody 568, manufactured by Molecular Probe for 1 hour at room temperature). PBS, ddH 2 After washing with O, mounting was performed. Observation was performed with a confocal laser scanning microscope (LSM510, manufactured by Carl Zeiss).
[0062]
Comparison of recognition sites between anti-HFB115 antibody and anti-histone H1 antibody (commercially available)
As shown in FIG. 4, the recognition sites of the anti-HFB115 antibody and the anti-histone H1 antibody were compared on a frozen section of Neurosphere. As a result, it was found that the two recognition sites were different. The anti-HFB115 antibody recognized the cell membrane or between cells, the anti-histone H1 antibody recognized the nucleus (anti-histone H1 monoclonal antibody) and the cytoplasm (anti-histone H1 polyclonal antibody).
[0063]
Immunostaining of human fetal brain with antibodies:
The section cut out from the paraffin block is treated three times for 10 minutes with Histoclear for deparaffinization, and then the above sequence is performed with 100%, 95%, 90%, 80%, and 70% ethanol aqueous solutions. For 5 minutes each. After washing 3 times with PBS for 5 minutes, the plate is washed with a blocking solution (PBS containing 10% normal goat serum and 0.01% Triton X-100) for 1 hour to perform blocking for suppressing non-specific adsorption of antibodies. Was. An antibody diluted to 0.02% in PBS containing 10% normal goat serum and 0.01% Triton X-100 was reacted with these tissue section samples at 4 ° C. for 15 hours. After washing 5 times with PBS for 5 minutes, the blocking solution was reacted with a secondary antibody solution containing an anti-mouse immunoglobulin-FITC complex diluted to about 0.02% for 1 hour at room temperature. After washing 5 times with PBS for 5 minutes, the cells were observed with a fluorescence microscope to confirm the stained site. The four types of monoclonal antibodies can be used in biochemical diagnostic methods such as Western blotting, as shown in FIG. 2 with the example of antibody No. 115.
[0064]
5 to 8 show immunostained images of antibody No. 27 on human fetal brain tissue. Among them, FIG. 5 shows a stained image by nuclear staining using the DNA staining dye TO-PRO-3 and the location of cells, and FIG. 6 shows a marker protein nestin (nestin) known to be expressed in neural stem cells or progenitor cells. ), FIG. 7 is an immunostained image with antibody No. 27, and FIG. 8 is a multi-stained image obtained by superimposing the three stained images. In the case of antibody 27, the ependymal layer near the ventricle and the vicinity of the lower ependymal layer are selectively stained. FIGS. 9 to 12 show immunostained images of antibody No. 16, FIGS. 13 to 16 show antibody No. 115, and FIGS. 17 to 20 show immunostained images of antibody No. 211 in the same order. In antibody Nos. 16 and 211, the ependymal layer was slightly stained in the vicinity of the ventricle wall, but the lower ependymal layer was hardly stained, and the portions other than the ependymal layer and the lower ependymal layer were stained. In the case of antibody No. 115, the ependymal layer and the lower ependymal layer were hardly stained, and the other parts far from the ventricle were stained.
[0065]
From the above results, Antibody No. 27 is a monoclonal antibody capable of selectively staining the ependymal layer and the lower ependymal region in an immunostaining test using a human brain tissue section. In the immunostaining test using human brain tissue slices, the three types of monoclonal antibodies No. 211 do not selectively stain the ependymal layer and the lower ependymal region, but selectively stain portions other than the ependymal layer and the lower ependymal layer. It is clear that this is a possible monoclonal antibody. The above four monoclonal antibodies can be used for immunohistochemical diagnosis of brain tissue sections.
[0066]
Cell labeling and FACS:
The constituent cells of a cell aggregate (neurosphere) containing human embryonic neural stem cells or neural progenitor cells are taken in and out with a Pasteur pipette, physically separated into cells, and centrifuged at 300 g for about 5 minutes to obtain cells. Collected. After treatment with a medium containing 0.8% primary antibody and 17% goat IgG at 4 ° C. for 30 minutes, the plate was washed three times with a medium containing no primary antibody for 5 minutes. A secondary antibody solution (1% anti-mouse IgG-FITC complex or anti-mouse IgM-FITC complex) was added and reacted at 4 ° C. for 25 minutes under light-shielded conditions. After washing three times for 5 minutes, the cells were suspended in a medium containing 1 ug / ml of 7-amino-actinomycin D (manufactured by Becton Dickinson, VIA-PROBE) to prepare a sample for FACS analysis. , FACS Vantage SE). When Jurkat was used, Propidium Iodide (PI) was used instead of VIA-PROBE.
[0067]
FIG. 21 shows an example of the result of sorting neurosphere constituent cells using antibody No. 115. The horizontal axis indicates the fluorescence intensity derived from the secondary antibody FITC, and reflects the amount of the antibody bound to the cell surface. The vertical axis indicates the fluorescence intensity of the dye that selectively stains dead cells, and cells with a high value indicate a high possibility of dead cells. Although the cell population in FIG. 21 is divided into two clusters, the cell population extending in the horizontal direction slightly from the left in the central part of the vertical axis and the horizontal axis may have many dead cells. Was. On the other hand, the cell population extending from the lower left to the right center of FIG. 21 is likely to be living cells having an extracellular antigen. From the above examination, it was considered that the cell surface antigen was recognized because many cells contained in the frame of R2 were found in the sorting using antibody No. 115. For antibody Nos. 16 and 211, a similar sorting result was obtained.
[0068]
FIG. 22 shows an example of the results of sorting lymphocyte cells Jurkat using the antibody 211. As shown in this example, a monoclonal antibody can be used for cell separation by a method such as sorting as long as the same antigen is expressed in cells other than the nervous system.
[0069]
As described above, the antigen of antibody 115 (FERM P-18780), one of the four types of monoclonal antibodies, was identified to be histone H1. Usually, histone H1 is present in the cell nucleus or cytoplasm, and commercially available anti-histone H1 antibodies recognize histone H1 present in the nucleus (anti-histone H1 monoclonal antibody) and cytoplasm (anti-histone H1 polyclonal antibody). However, unlike the other commercially available antibodies, the antibody No. 115 developed this time does not recognize histone H1 present in the nucleus or cytoplasm, but rather recognizes histone H1 present on the cell surface. . This is presumably because antibody 115 recognizes a specific antigen of histone H1 present on the cell surface.
[0070]
The hybridoma producing the monoclonal antibody of the present invention is a novel fused cell and has been deposited at the Patent Microorganisms Depositary, which is a public microbial depository, and its accession number is as follows.
Antibody No. 16-producing hybridoma: FERM P-18778
Antibody No. 27-producing hybridoma: FERM P-18779
Antibody No. 115-producing hybridoma: FERM P-18780
Antibody No. 211-producing hybridoma: FERM P-18787
[0071]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, neural stem cells and progenitor cells can be efficiently separated from human brain tissue by selectively recognizing cells other than neural stem cells and progenitor cells among brain neural cells. Moreover, since cells other than neural stem cells and progenitor cells are selectively recognized, a fluorescent substance is not deposited on target stem cells and progenitor cells, so that the safety of the separated stem cells and progenitor cells can be ensured. If safe neural stem cells and progenitor cells are efficiently separated and the proliferation and differentiation of these neural stem cells and progenitor cells are controlled, application to medical diagnosis and regenerative therapy for diseases of the cerebral nervous system becomes possible.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results of SDS-PAGE and Western Blotting after purification of HFB115 antigen protein.
FIG. 2 shows an example of the result of Western Blotting using antibody 115.
FIG. 3 shows the results of analyzing the internal amino acid sequence of the HFB115 antigen protein.
FIG. 4 shows the results of comparing the recognition sites of the anti-HFB115 antibody and the anti-histone H1 antibody.
FIG. 5 is a staining image of human fetal brain tissue stained by nuclear staining using DNA staining dye TO-PRO-3 of antibody No. 27.
FIG. 6 is an immunostaining image of antibody No. 27 for human fetal brain tissue against nestin.
FIG. 7 is an immunostaining image of antibody No. 27 against human fetal brain tissue.
FIG. 8 is a multi-stained image obtained by superimposing the three stained images with antibody No. 27.
FIG. 9 is a stained image of human fetal brain tissue stained by nuclear staining using antibody DNA No. 16 DNA staining dye TO-PRO-3.
FIG. 10 is an immunostaining image of antibody No. 16 for human fetal brain tissue against nestin.
FIG. 11 is an immunostained image of antibody No. 16 on human fetal brain tissue.
FIG. 12 is a multi-stained image obtained by superimposing the three stained images by antibody No. 16;
FIG. 13 is a stained image of human fetal brain tissue stained with nucleus using antibody 115 DNA staining dye TO-PRO-3.
FIG. 14 is an immunostained image of nestin, antibody 115, against human fetal brain tissue.
FIG. 15 is an immunostained image of antibody # 115 against human fetal brain tissue.
FIG. 16 is a multi-stained image obtained by superimposing the three stained images by antibody No. 115.
FIG. 17 is a stained image of human fetal brain tissue stained by nuclear staining using antibody stain number 211 DNA staining dye TO-PRO-3.
FIG. 18 is an immunostaining image of antibody No. 211 against nestin, which is a human fetal brain tissue.
FIG. 19 is an immunostained image of antibody number 211 on human fetal brain tissue.
FIG. 20 is a multi-stained image obtained by superimposing the three stained images by antibody No. 211.
FIG. 21 shows an example of the results of sorting neurosphere-constituting cells using antibody # 115.
FIG. 22 shows an example of the result of sorting lymphocyte cells Jurkat using antibody 211.