JP2004091780A - Ａｎｔｒｏｄｉａｃａｍｐｈｏｒａｔａ菌体の多糖類 - Google Patents

Abstract

【課題】Ｂ型肝炎ウイルスを抑制する活性を有する物質を提供する。
【課題解決手段】１種の薬用真菌Antrodia camphorataの多糖類成分が、実験を経て抗B肝炎ウイルス表面抗原(anti- Hepatits B virus surface antigen)およびe抗原(e antigen)の活性を備えていることに注目したものであり、これらの多糖類を提供する。
【選択図】なし
　

Description

　本発明は一種の薬用真菌Antrodia camphorataの多糖類で、抗B型肝炎ウイルス表面抗原活性及びe抗原活性を備えていることが実験により証明されたものである。

　真菌は二次代謝産物の生合成能を有しており、また多様な二次代謝産物を生み出すものであり、薬用として利用し、注目されな植物である。真菌のこの能力は誘導することが可能で、また生み出しやすく、区域や地理、季節や環境の影響を受けにくいことが共通の特性を明らかしている。このため冬虫夏草、霊芝、ブクリョウなどの菌類を、発酵方式を通じて大量生産し、新薬の開発を進めることが可能となる。

Antrodia camphorataは、原名Ａ. cinnamomeaまたはGanoderma comphoratam と呼ばれ、台湾特有の真菌で、台湾特有の樹木牛樟樹(Cinnamum kanehirae)で育つ。擔子菌門(Basidiomycota) 、擔子菌亞門(Basidiomycotina)、同擔子菌綱(Homobasidiomycetes)、無摺菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、薄孔菌属(Antrodia)の新種である。

　Antrodia camphorataは台湾ですでに腫瘤疾病の治療での民間用薬品として用いられており、その化学組織には配糖体（グリコシド）、ステロイドおよびトリテルペンが含まれている。Chen, C.H.らはトリテルペンに抗レシチンと抗血清素での活性化作用があると報じている(非特許文献1)。多糖類は生体中におけるエネルギー貯蔵体である。

　活性測定の面で、Chen et al.はAntrodia camphorata菌糸体が少量でも肝臓腫瘍細胞(Hep G2)に強力な細胞毒殺作用があると報じている(非特許文献2)。C57BL/6 とBALB/cを以って試験を進めると、マウスの血液中のTNF-α、INF-γ、及びIL-2が明らかに増加していることがわかる。

　民間において、長期的に Antrodia camphorataが肝臓病と癌の治療、特にウイルス性肝炎の治療に使用されているが、これまでのところAntrodia camphorataについて菌種の確立、基因研究、培養条件、品質管理の関係を論述した論文報告は極めて少ない。
Chen, C.H. and Yang, S.W. (1995) J. Nat. Products volume 58: 1655-1661 Chen，et al.(2001) Fung.Sci.,16:7-22 Blumberg,B.S.,Alter,H.J.,Visnich, S.(1965) J.A.M.A.,191, 541-546 Ono, T. H. et al. (1983)Nucleic Acids Res.,11,1747-1747 Sung, J.-L. and Chen, D. S.(1977)Gastroenterol. Jpn．,12,5８６3 Garcia, P. D. (1988) J. Cell Biol.,106,1093-1104

　本発明の主要な目的は、Antrodia camphorata擔子菌類の多糖類、分離、品質管理方法に関する。また、これらの多糖類が坑Ｂ型肝炎ウイルスの活性を有することに関する。

　Antrodia camphorata擔子菌類の多糖類はAntrodia camphorata CCRC３５３９６、CCRC３５３９８、B７１、B８５、B８６菌株によって得られる。実験を経て抗B肝炎ウイルス表面抗原(anti-Hepatits B virus surface antigen)及びe抗原(e antigen)の活性を備えていることに注目したものである。

　当該技術に熟練している人であれば、以下の異なる図説が示す詳細な説明を閲読した後、本発明が示す技術と目的をはっきりと理解するであろう。

　本発明は上記の課題を解決するために次のような構成を有する。　　
（１）一種の薬用真菌Antrodia camphorata擔子菌類の多糖類であって、高速陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC)図中における当該擔子菌類子実体に含まれ、中分子量化合物、およびいくつかの高分子量化合物の吸收ピークを有する多糖類。
（２）Antrodia camphorata擔子菌類の多糖類はAntrodia camphorata CCRC３５３９６、CCRC３５３９８、B７１、B８５、B８６菌株によって得られるものである上記（1）に記載の多糖類。
（３）一種の薬用真菌Antrodia camphorata擔子菌類の抗B肝炎ウイルス多糖類であって、高速陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC)図表中における当該擔子菌類子実体に含まれる中分子量化合物、およびいくつかの高分子量化合物の吸收ピークを有する多糖類。
（４）Antrodia camphorata擔子菌類の多糖類はAntrodia camphorataCCRC３５３９６、CCRC３５３９８、B７１、B８５、B８６菌株によって得られるものである上記（３）に記載の多糖類。
（５）一種の薬用真菌Antrodia camphorata擔子菌類が産生し得る、抗Ｂ型肝炎ウイルス活性を有する多糖類。
（６）抗Ｂ型肝炎ウイルス活性は、B型肝炎ウイルスe抗原(HBeAg)活性または／およびB型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)活性である上記（３）〜（５）に記載の多糖類。
（７）上記（３）〜（６）のいずれかに記載の多糖類を有効成分とする、抗Ｂ型肝炎ウイルス医薬組成物。

　本発明はAntrodia camphorataの菌糸から得られる全ての多糖類であり、これらは抗B型肝炎ウイルス(anti-hepatitis B virus) 活性を有しており、αインターフェロン と同等あるいはそれ以上の効果を得る。

　本発明のAntrodia camphorata多糖類はCCRC３５３９６、CCRC３５３９８、B７１、B８５、B８６菌株によるもので、図1の示す５種のAntrodia camphorataの生長曲線、生長速度は成長から第ｎ日目の菌糸乾燥重量と第0日目の菌糸乾燥重量の比較によって表示する。培養を経た後 CCRC３５３９６とCCRC３５３９８の２種の菌株の成長速度はそのほかの菌株よりも速く、培養から18日には成長対数期(log phase)に達している。高速陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC)の図２は、子実体中に数多くの中分子量、およびいくつかの高分子量吸収ピークが含まれていることを示す。しかしその濃度はいずれも低い。Antrodia camphorata多糖類は室温のもと、90分間以内にNaOAcを100-700mM程度、90mM NaOHの条件下で分析する。図4〜6はそれぞれB８５、B８６、CCRC３５３９６菌株に数多くの比較的小さな分子量化合物があることを示している。しかし高い分子量のあるところでは、いずれも2〜3個の多糖類の吸収ピークが出現している。図3、7が示すようにB７１菌株およびCCRC３５３９８菌株には、特に大量の吸収ピークが含まれている。上述の小さな分子量は、延滞時間30分以前に分布した吸収ピークで、中分子量では30〜65分間で吸収ピークが分布し、高分子量では66〜90分間に吸収ピークが分布する。

　菌糸体生産のための液体培養２６日目に、粗多糖類は水により抽出され、それに続いて加水分解される。Antrodia camphorataの子実体と菌糸に含まれた多糖類は異なるもので、即ち、各単糖の分量も異なる。各単糖成分は表１の示す通り、μmol ／gを単位とし、B７１菌株の多糖類には半乳糖(galactose)10.5μmol ／g、ブドウ糖(glucose)146.74μmol ／g、甘露糖(mannose)69.15μmol ／g、半乳糖アミン(galactosamine)10.5μmol ／g が含まれる。B８５菌株の多糖類には半乳糖283.76μmol ／g、ブドウ糖35.6μmol ／g、甘露糖19.21μmol ／g、半乳糖アミン4.41μmol ／gが含まれる。
　B８６菌株の多糖類には半乳糖381.22μmol ／g、ブドウ糖63.9μmol ／g、甘露糖43.05μmol ／g、半乳糖アミン5.72μmol ／gが含まれる。
　CCRC３５３９６菌株の多糖類には半乳糖104μmol ／g、ブドウ糖137.32μmol ／g、甘露糖63.6μmol ／g、半乳糖アミン9.33μmol ／g が含まれる。
　CCRC３５３９８菌株の多糖類には半乳糖109.35μmol ／g、ブドウ糖209.56μmol ／g、甘露糖70.82μmol ／g、半乳糖アミン2.1μmol ／gが含まれる。

　Blumberg, B. S.の報道によると、抗B型肝炎ウイルス表面抗原は当時Australia Antigenと呼ばれており(非特許文献3)、これはBlumbergにより初めてオーストラリア・アボリジニの血液中で発見されている。B型肝炎ウイルスは決定型a及び４つの亜型 d、y、w、rからなる表面抗原の皮膜（capsule）で覆われており、d、yとw、rは相互に重複しない。このためB型肝炎ウイルスは四種の亜型adw、adr、aywとayrに分類することができる。
　またOno, T. H. (非特許文献4)の報道によれば、異なる亜型では、ヌクレオチドの配列と長さが異なると信じられている。全世界のB型肝炎ウイルスには主要な３種類の血清型（adw、adr、ayw）があり、地域の格差によって異なる分布を見せている。

　Sung, J.-L. と Chen, D. S. (非特許文献5)の研究で明示したところによると、わが国（中国）の長江以北をadr血清型、長江以南をadw血清型とする。HBeAgは、２つのp17サブユニットからなり、プレC遺伝子(pre gene) とC遺伝子から翻訳される。オープンリ−デイングフレームの最初のコドンAUGの上流で転写が開始され、25Kdの先核心(precore) 蛋白を形成する。

　Garcia, P. D.の報道(非特許文献6)によると、アミノ酸配列分析装置により、先核心(precore)蛋白のN末端の29個のアミノ酸は、シグナル分泌性タンパク質(hydrophobic animo acids signal secretory protein)の疎水性アミノ酸であることがわかった。タンパク質はその後細胞外にまで分泌され、17k HBeAgとなる。

　台湾の民間で長期間Antrodia camphorataが使用され、肝臓病やガンの治療が普遍的に行なわれており、特にウイルス性の肝炎の治療に多く使用されてきた。しかし、これまで関連の論文報告は存在しない。

　患者はB型肝炎ウイルスを感染しているかどうか、B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)の測定だけで評価すると、いずれも不明瞭な結果になる。主な理由は、B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)は未感染患者、感染したばかりで潜伏期の患者、及び感染後すでに完治した患者の評価に対してすべて陰性の反応を示す。このため、多くの場合、B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)を測定するほかに、B型肝炎ウイルスe抗原(HBeAg)の測定も行なわなければならない。

　本発明のAntrodia camphorata多糖類はB型肝炎ウイルスを産生する細胞株MS-G2を経て５種のAntrodia camphorataの抗ウイルス能力の評価を進めており、またAntrodia camphorata多糖類のB型肝炎ウイルスe抗原(HBeAg)とB型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)能力について、αインターフェロンを正のコントロールとして定量される。その計算公式は下記の通りである。
　　抑制百分率＝(コントロール OD 値−サンプルOD値) /コントロールOD 値

　図8は、菌糸から得られる全ての多糖類が抗B型肝炎ウイルス(anti-hepatitis B virus) 活性を有していることを示している。B８６菌株の多糖類は50 μg/mlのもとで最高の表面抗原反応を示しており、そのデータとαインターフェロン 1,000 units/mlを使用した結果と比較すると、αインターフェロンよりも良好である。
　図9は、B８６とCCRC３５３９８の菌株のみが本質的な抗B型肝炎e抗原(substain anti-hepatitis B e antivities)活性を有していること示している。すべての菌糸の多糖類には細胞毒性はない。

　 B型肝炎ウイルス細胞株MS-G2を用いて、B型肝炎ウイルスに抵抗する程度について、５種のAntrodia camphorataの多糖類ウイルスの能力を測定すると、B８６が最も効果的であることがわかった。また抗B型肝炎ウイルス表面抗原(Anti-HBsAg)の抑制率は、1,000 units/ml αインターフェロンがわりと高く、またB７１、B８５、CCRC３５３９６、CCRC３５３９８はいずれも250 units/ml αインターフェロンよりも効果的である。B８６、CCRC３５３９８のみが抗B型肝炎ウイルス表面抗原(Anti-HBsAg)の活性を有しており、その有効性は1,000 units/ml αインターフェロンよりも低いが、２５０ units/ml αインターフェロンよりも高い。

　多糖類は通常、アスパラギン酸塩アミノ基転移酵素(AST, aspartate transaminase) Kキットを以って細胞への損傷の測定を行なっており、もしアスパラギン酸塩アミノ基転移酵素(AST)値が２５I.U. L^-1よりも高ければ、細胞に対して有害であることを示す。５種のAntrodia camphorataの多糖類は細胞損傷の測定を経て、アスパラギン酸塩アミノ基転移酵素(AST)値がいずれも２５よりも低い結果が明らかになっており、Antrodia camphorataから得られた多糖類が、いずれも細胞毒性がないことを示している。

　本発明の多糖類（ＰＳ）はAntrodia camphorataの野生子実体および実験室で培養された５種の菌糸抽出物から得られたものである。５種の菌糸の多糖類は高速陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC, high performance anion exchange chromatography)を用いて分析したものであり、産生の多様化および単糖の組成を示している。

　本発明は様々な修飾と変形が認められる。開示された特徴的なフォームに限定されず、しかし、意図はクレームに定義される発明の精神と目的を失うことなく、すべての修飾、等価なもの及び代案を含むと理解されるべきである。

Antrodia camphorataの菌株をジャガイモブドウ糖寒天(PDA, potato dextrose agar)の中において、３週間に１回交換する。菌種は滅菌した25ml ジャガイモブドウ糖寒天(PDA)の培養皿の中央に接種し、28℃の状態で19日間保存し、培養した菌糸を1x1センチ(cm)に切り、再び25mlのジャガイモブドウ糖肉汁(PDB, potato- dextrose-broth)に置く。20g/Lブドウ糖を加えた後、pH =5.6 　250ml瓶のなかに入れ、暗闇のなかで、26日間培養した後、250 mM NaCl遠心性速やかに細胞外の多糖体および培養液を洗浄し、冷凍乾燥を経た後、4℃冷蔵庫にて保存する。

　Antrodia camphorata 菌種をジャガイモブドウ糖寒天(PDA) (Sigma社から購入、馬鈴薯萃殻の摂取物、ブドウ糖および洋菜を含む)に置いて培養、当該の菌糸をジャガイモブドウ糖肉汁(PDB)培養液で光を避けて２６日間放置して保存した。遠心分離、冷凍乾燥を経て菌糸体から１：１００ (w/w)の ８０℃の水で抽取した後、４倍の95体積％のアルコールを加えて、4℃の冷蔵庫のなかで一晩保存した。さらに遠心分離で、沈殿物を除き去った後、冷凍乾燥で粗多糖類を得た。粗多糖類を高速陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC)に置いて、室温のもとNaOAcと９０mM NaOHの混合溶媒分析を行い、最後にPRIME DAK systemのソフトウェアでデータを収集した。HClによる加水分解を行い、その後冷却し、真空ポンプ(vacuum pump, Spe-Vac)で酸抽出した後、再び水によって、ナイロン膜(０．２μm) でろ過を経た後、炭水化物濃度、タンパク質濃度、光学旋光度又は多糖類構造の鑑定を行なった。
　冷凍乾燥後の菌糸体を、水で６hr抽出し、冷凍放置した後に４倍の９５体積％のアルコールを加え、４℃の冷蔵庫で一晩保存した後、再び遠心分離し、冷凍乾燥によって粗多糖類を得た。
　高速陰イオン交換クロマトグラフィー(high performance anion exchange chromatography)を利用して多糖類を分析した。
２００mgの粗多糖類を、Gradient pump、金の作用電極を使ったPulsed Amperometric Detector(ＰＡＤ−ＩＩ)、陰イオン交換カラム(Carbopac　PA-１００，４．６×２５０ｍｍ)を備えたＨＰＥＡＣ（Dionex　BiolＣ）によって分離した。
　サンプルは、自動サンプリング(ＡＳ３５００、Spectra　ＳＹＳＴＥＭ（登録商標))を使用して、200 μlのサンプルループ(sample loop)のマイクロインジェクションにより注入した。多糖類分析は、室温で、９０ 分間(min)、９０mM NaOH中で、１００-７００mM NaOAcの線形変化率(linear gradient)、のもとで行われた。データはPRIME DAK system上で収集され、積分された。

多糖類の加水分解
　多糖類の加水分解は、粗多糖類試料の１ｍｇを６N HCl、８０℃のヒーテイングブロック中、６−８時間で行われる。その後試料を冷却し、酸を蒸発する。加水分解された多糖類を、精製水で再懸濁し、Millipore-Gxナイロン膜で濾過し、分析に供した。

一般的糖分析方法
全炭水化物濃度は、フェノール硫酸(phenol-sulfuric acid)法により測定した。全蛋白濃度は、Bradford 法(Bradford,(1976) Analytical Biochemistry, 72, 248-254)により測定した。自動旋光計により５８９nmで特定の光学旋光度を測定する。

多糖類の構造決定
　多糖類の加水分解産物である単糖類は、上述した陰イオン交換カラム(Carbopac PA-１０，４．６x２５mm，Dionex)によって高速陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC)で分離された。単糖類の分析は、１８mM NaOH中、室温のもとで行なわれた

抗B型肝炎ウイルステスト
　B型肝炎ウイルスを産生する細胞株MS-G2は、２４ wellの底が平らな組織培養皿の上に、３×１０⁵ cells/ml-wellになるように置かれた。一晩培養し、その細胞が完全に付着していることを確認し、多糖類または比較のためのインターフェロンα−２ａの試験を行なう。テストサンプルは、いろいろな濃度（例えば、１０、２５，５０μｇ／ｍｌ）になるように滅菌された精製水で溶解した。追加の組が、対照として、等量の滅菌精製水で処理された。その結果として、培養物は３日ごとに、収集され、坑ウイルス活性の分析がなされた。

ＥＬＩＳＡ法(ELISA,enzyme-linked immunosorbent assay)試験用材（キット）を使用して、４９２ ｎｍの状況のもとでB型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)およびB型肝炎ウイルス表面e抗原(HBeAg)の値を測定した。
　また対照組とウイルス抑制での百分率を比較し、抗ウイルスでの活性を評価し、３組の結果は平均値の標準偏差(standard deviation of the mean,SDM)統計を使用し、またアスパラギン酸塩アミノ基転移酵素試験用材(AST Kit)を以って細胞損傷の測定を行なった。
ＡＳＴ値は２５ＩＵ／Ｌより高く、細胞損傷を示した。

　本発明に係る一種の薬用真菌Antrodia camphorataの多糖類が、抗B型肝炎ウイルス表面抗原活性及びe抗原活性を備えていることが実験により証明されたことからこれらを当該患者の治療に用いることが可能となる。

５種のAntrodia camphorataの生長曲線を示す。生長速度は成長第何ｎ日目の菌糸乾燥重量を第０日目の菌糸乾燥重量と比較し、相対的な乾燥重量変化を表示する。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1. B７１菌株　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2. B８５菌株　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　3. B８６菌株　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　4. CCRC３５３９６菌株　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　5. CCRC３５３９８ 菌株 Antrodia camphorata子実体の多糖類の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)図。 Antrodia camphorata B７１菌株の多糖類の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)図。 Antrodia camphorata B８５菌株多糖類の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)図。 Antrodia camphorata B８６菌株多糖類の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)図。 Antrodia camphorata CCRC３５３９６菌株多糖類の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)図。 Antrodia camphorata CCRC35398 菌株多糖類の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)図。 Antrodia camphorata多糖類の抗B型肝炎表面抗原能力とαインターフェロンの抗B型肝炎表面抗原能力との比較。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1. １，０００ units/ml α-インターフェロン　　　　　　　　　　　　　　　　　2. ２５０ units/ml α-インターフェロン　　　　　　　　　　　　　　　　　　3. １００ units/ml α-インターフェロン　　　　　　　　　　　　　　　　　　4. ５０ μg/ml B７１菌株　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　5. ５０ μg/ml B８５ 菌株　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　6. ５０ μg/ml B８６ 菌株　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　7. ５０ μg/ml CCRC ３５３９６菌株　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　8. ５０ μg/ml CCRC ３５３９８菌株 Antrodia camphorata多糖類の抗B型肝炎表面e抗原能力とαインターフェロンの抗B型肝炎表面e抗原の能力との比較。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1. １，０００ units/ml α-インターフェロン　　　　　　　　　　　　　　　　　2. ２５０ units/ml α-インターフェロン　　　　　　　　　　　　　　　　　　3. １００ units/ml α-インターフェロン　　　　　　　　　　　　　　　　　　4. ５０ μg/ml B７１菌株　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　5. ５０ μg/ml B８５ 菌株　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　6. ５０ μg/ml B８６ 菌株　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　7. ５０ μg/ml CCRC ３５３９６菌株　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　8. ５０ μg/ml CCRC ３５３９８菌株

Claims (7)

1. 　一種の薬用真菌Antrodia camphorata擔子菌類の多糖類であって、高速陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC)図中における当該擔子菌類子実体に含まれ、中分子量化合物、およびいくつかの高分子量化合物の吸収ピークを有する多糖類。
2. 　Antrodia camphorata擔子菌類の多糖類はAntrodia camphorata CCRC３５３９６、CCRC３５３９８、B７１、B８５、B８６菌株によって得られるものである請求項1に記載の多糖類。
3. 　一種の薬用真菌Antrodia camphorata擔子菌類の抗B型肝炎ウイルス多糖類であって、高速陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC)図中における当該擔子菌類子実体に含まれる中分子量化合物、およびいくつかの高分子量化合物の吸収ピークを有する多糖類。
4. 　Antrodia camphorata擔子菌類の多糖類はAntrodia camphorata CCRC３５３９６、CCRC３５３９８、B７１、B８５、B８６菌株によって得られるものである請求項３に記載の多糖類。
5. 一種の薬用真菌Antrodia camphorata擔子菌類が産生し得る、抗Ｂ型肝炎ウイルス活性を有する多糖類。
6. 　抗Ｂ型肝炎ウイルス活性は、B型肝炎ウイルスe抗原(HBeAg)活性または／およびB型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)活性である請求項３〜５に記載の多糖類。
7. 　請求項３〜６のいずれかに記載の多糖類を有効成分とする、抗Ｂ型肝炎ウイルス医薬組成物。

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