【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明の利用分野は医薬・医療の分野におけるタンパク質水溶液の精製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医薬・医療の分野で、目的物であるタンパク質に不純物が混入した場合には、ウイルス性肝炎等の疾病に罹患する恐れがある（Ｋ． Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｅｌｅｃｔｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｓｃ． ４０， ３３７（１９９１））。よって、不純物、特に感染性ウイルスが不活化ないし除去された安全性の高い医薬・医療用タンパク質が希求されている。
【０００３】
不純物を実質的に含まない有用タンパク質を得る方法としては、その製造段階で該タンパク質を含む水溶液を加熱処理、放射線照射、クロマトグラム処理、溶剤及び界面活性剤による処理（いわゆるＳＤ法）、膜分離等で処理する方法が知られている（Ｓ． Ｈａｒａｄａ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ， ２２， ９０８ （１９８５））。しかしながら、膜分離を除く上記の方法は目的とする有用タンパク質を変性・失活させて回収率の低下、変性物による危険性の増加を招いたり、不活化のために加えた界面活性剤等の薬品の除去ないしは無害化が容易でなかったり、不純物の充分な除去効果が得られないなどの問題点を有している（Ｂ． Ｈｏｒｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ， ２５， ５１６ （１９８５））。
【０００４】
一方、膜分離法は、膜構造中に存在する細孔と通過すべき有用タンパク質と阻止すべき粒子（例えばウイルス）の相対的な大きさの差により、物理的にこれら粒子を分離して、結果的に不純物を除去する、いわゆる ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ 原理によっている。従って有用タンパク質の変性・失活の恐れがなく、また不活化のために薬品を添加することもないのでその除去・無害化も不要である。このため、医薬・医療の分野における有用タンパク質の精製用途において、膜分離の利用が広がっている。
【０００５】
しかし、ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ原理によれば、除去対象粒子としての不純物の効果的除去と、回収対象粒子としてのタンパク質の効率的な膜透過・回収は二律背反の現象となりがちである。すなわち、除去対象粒子の除去を効果的ならしめようとして膜の細孔の大きさを小さく設定すると、回収対象粒子の膜透過が抑制され、濾過効率すなわち、濾過速度及び透過率（ふるい係数）が低下する。一方、回収対象粒子の膜透過・回収を効率的ならしめようと膜の細孔の大きさを大きく設定すると、除去対象粒子の除去効果を犠牲にすることになる。また、一般に濾過時間の経過に従って、濾過効率を示すこれらのパラメーターは悪化してくる。その理由は、濾過の継続に従って、溶質による細孔の閉塞が発生するためである。この点においても、粒子の大きさと細孔の大きさの相対的関係が影響を及ぼす。不純物の高い除去効果を維持しながら、短時間で、高い透過率で回収対象粒子としてのタンパク質を濾過しようとすれば、膜面積の増大が必要となり、精製コストが増大する。
【０００６】
これらの問題を解決する手段として、膜による分離すなわち濾過に供する前段階で、通過すべき粒子の大きさを減じる方法が考案されている。例えば、後者に関しては、特表平１０−５０２０７４ には、「少なくとも１種の高分子を含む溶液をウイルス濾過する方法であって、該溶液の総塩含有量が約０．２ Ｍ 〜関係塩による該溶液の飽和状態の範囲であることを特徴とする前記方法」が開示されている。塩濃度を高めることにより、濾過効率が向上するのは、タンパク質粒子自体の大きさの収縮、タンパク質粒子同士及びまたはタンパク質と膜との相互作用が減少するためと考えられる。ただし、特表平１０−５０２０７４において、上記効果を奏する塩濃度は０．２Ｍ以上、さらに０．８〜１．５Ｍの範囲が特に好ましいとしているように、生理的に等張な塩濃度を大きく上回る塩濃度が必要とされている。このため静脈注射あるいは筋肉注射により人体に投与する医薬品の場合は、濾過後に透析等によって塩濃度を生理的等張濃度まで低減させる操作が必須である。また、塩濃度を高めていくと、塩析によりタンパク質の溶解度が低下し、逆効果となる可能性もある。
【０００７】
また、典型的なタンパク質水溶液中には、ｐｐｂオーダーのＤＮＡが不純物として含有しており、このＤＮＡとタンパク質との複合体が膜透過における透過流量の減少を引き起していることが動的光散乱法並びに蛍光分光光度法を用いて明らかにされている（Ａ． Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｃｉ．， １８６， ９ （２００１））．この改善策として、タンパク質水溶液中の ＤＮＡ並びにＲＮＡの濃度を低減させた後に、膜濾過を行なってタンパク質水溶液を精製する方法が報告されている（特開平２０００−３１９２９４）。しかしながら、この方法では、タンパク質水溶液中のＤＮＡ並びにＲＮＡの濃度を低減するための前処理に多大な時間がかかってしまい、たとえウイルス等不純物除去の膜濾過時間が低減したとしてもトータルとしての不純物処理精製時間は長くなり、本末転倒した方法であった。
【０００８】
従って、種々のタンパク質水溶液から不純物を、膜濾過により、高い効率すなわち高い濾過速度及び透過率で、安全に、分離・除去する方法が求められている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
医薬・医療の分野において、タンパク質水溶液から濾過により、ウイルス等の不純物を除去する手段として、膜濾過法は目的とするタンパク質の変性・失活がないため、回収率が高く、他の精製法に比し、優れた方法であるが、不純物の効果的な除去と目的とするタンパク質の濾過効率、すなわち高い濾過速度及び透過率との両立が困難である。本発明の課題はタンパク質水溶液中の不純物として含有するＤＮＡを一部切断することにより、タンパク質ーＤＮＡ複合体を解離させて、タンパク質中に混在しているウイルス等の不純物の効果的な除去を維持しつつ、かつ、高い濾過効率を得る方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は濾過すべきタンパク質水溶液中に不純物として含有するＤＮＡをＤＮａｓｅを用いることにより、優先的にＤＮＡを切断させることによりタンパク質ーＤＮＡ複合体を解離させて、膜濾過における目詰まりを低減させて、タンパク質水溶液の膜濾過を行なうことを特徴とするタンパク質水溶液精製方法である。タンパク質水溶液中のタンパク質ーＤＮＡ複合体を解離させて、濾過効率を向上させるために、特開平２０００−３１９２９４ではＤＮＡ濃度の低減を主に膜濾過法で行なうことを提言している。しかしながら、本発明者は、ＤＮＡ濃度を低減させなくとも、ＤＮＡ鎖をＤＮａｓｅで処理してＤＮＡ鎖を短くすることにより、タンパク質水溶液中のタンパク質ーＤＮＡ複合体を解離させることが可能であることを実証するに至り、本発明を考案するに至った。
また、本発明は膜濾過により除去すべき対象が主にウイルスであることを特徴とするタンパク質水溶液精製方法である。
【００１１】
本発明で用いられるＤＮａｓｅは、タンパク質水溶液中に溶解していても、胆体に固定化されていても、あるいは膜に固定化されていても良く、ＤＮａｓｅの形状には無関係である。
本発明で用いられるタンパク質の起源は本発明の使用には無関係である。従って、ヒト、動物、植物由来の遺伝子組み替え又は細胞融合技術を使って培養細胞で生産されたあらゆるタンパク質、さらには天然に生産されたタンパク質である。
本発明でいうタンパク質を例示すれば、血漿タンパク質、血清タンパク質、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、同第ＩＸ因子、ヘモグロビン、フィブリノーゲン、アンチトロンビンＩＩＩ、免疫ガンマグロブリン、アルブミン、インターフェロン、アポリポ蛋白質、細胞成長増殖因子、細胞外マトリックス、細胞接着因子及び成長ホルモンがあげられる。
本発明で言うタンパク質水溶液とは水を除いた構成成分のうち、タンパク質が１０％以上含有する水溶液を意味している。従って、ヒト並びに動物由来の血漿、血清もこの範疇である。
本発明でいう膜濾過による除去対象となる不純物は感染性ウイルス、細菌、真菌、原虫類、伝達性海綿状脳症病原因子である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明において用いられる濾過膜は１μｍ以下好ましくは１００ｎｍ以下の平均孔径を有する精密濾過膜（Ｍｉｃｒｏ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、限外濾過膜（Ｕｌｔｒａ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、ウイルス除去膜等である。
本発明に用いる濾過膜の素材は、水溶性溶液を濾過できる物であれば、いかなる素材でも良い。例えば、セルロース、セルロースアセテート、ポリフッ化ビニリデン、ポリスルホン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、ナイロン等であるが、これに限定されるものではない。その中でも、セルロースを素材としたものは親水性であることから、水溶液の透過速度が高く、タンパク質の吸着が少なく、その透過に適しており望ましい。
【００１３】
タンパク質水溶液からのウイルス等の不純物分離用途に用いられる濾過膜を例示すれば、旭化成株式会社製の Ｐｌａｎｏｖａ ３５Ｎ、Ｐｌａｎｏｖａ ２０Ｎ 及びＰｌａｎｏｖａ １５Ｎ（いずれも素材は再生セルロース）， 旭化成株式会社製のポリスルホン中空糸膜（例えば、ＳＩ−１膜）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ 社製の Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ ７０， Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ １８０（いずれも素材はポリフッ化ビニリデン）、住友電工社製のフロロポア膜（素材は４フッ化エチレン）、コーニングコスター社製ニュクリポァー膜（素材はポリカーボネート）などがあげられる。
本発明に用いる濾過膜の形態は、平膜、中空糸膜、スパイラル膜、プリーツ状膜等いかなる形態を有していてもよい。また、濾過の形式は ｄｅａｄ ｅｎｄ 方式、ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ 方式のいずれでも適用可能である。
【００１４】
本発明に適したタンパク質水溶液の濃度は種類によって異なるが、例えば、ガンマグロブリン溶液の場合、０．０５〜１０％である。好ましくは３％〜８％である。１０％以下であるのはそれ以上の濃度では、ガンマグロブリン分子同士の会合が高まり、本発明を用いても濾過が非常に困難になるためである。一般にグロブリン溶液の濃度は高ければ高いほどＤＮＡが介在した会合の可能性も高くなり、ＤＮＡータンパク質複合体の解離による透過効率向上の効果が現れやすいので好ましい。
本発明を実施する際のタンパク質水溶液の温度及びｐＨはタンパク質が変性しない範囲であることが望ましい。例えば、ガンマグロブリン溶液の場合、通常、溶液の温度は２℃〜４０℃でｐＨは約７〜８の範囲が望ましい。
【００１５】
溶液中のＤＮＡの測定に関しては、従来ＰＣＲ法、紫外線可視分光光度法、蛍光法が使われてきた。 ＰＣＲ法においては、その検出限界は例えばλファージＤＮＡの場合、約１０ｐｐｍである（バイオ総合カタログ １９９７／１９９８ ｖｏｌ．１ 遺伝子工学、Ｄ−１７， 宝酒造株式会社）。また 、紫外線可視分光度法においては１．０ｐｐｍ程度とされている（Ａ． Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｃｉ．，１１６，１９１（１９９６））。また、エチレンブロマイド（インターカレート剤）を用いた蛍光測定法では、約０．１ｐｐｍである。しかし、蛍光プローブ（ＢＥＡＣＯＮ Ｖ２１６５， ＤＮＡ ＱＵＡＮＴＩＴＡＴＩＯＮ ＫＩＴ、 宝酒造株式会社製）を用いた蛍光測定法では、検出限界を０．５ｐｐｂ以下にすることが可能である（Ｒ． Ｂｏｌｇｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ２３，５３２（１９９７））。
【００１６】
タンパク質の産生は生体ないしは細胞により行われるので、通常、精製前の生物由来高分子タンパク質水溶液には、ＤＮＡが不可避的に含有されている。
例えば、シグマ社製凍結乾燥ガンマグロブリン（Ｇ−５００９、牛由来）を緩衝液に溶解し、５０００ｐｐｍ （０．５％） の水溶液を調製し、この時のＤＮＡ濃度を測定したところ、ＬｏｔによりＤＮＡ濃度は異なったが、８〜２５±２ｐｐｂであった（Ａ． Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｃｉ．， ｉｎ ｐｒｅｓｓ）。また、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製凍結ガンマグロブリン（１９７−７０００、牛由来）を溶解して得た５％溶液中のＤＮＡ濃度を測定したところ、３７±４ｐｐｂであった。
【００１７】
タンパク質水溶液中のタンパク質ーＤＮＡ複合体を解離させるために、ＤＮＡを切断しなくてはならない。このために用いられるＤＮａｓｅとしては、エンドヌクレアーゼあるいはエキソヌクレアーゼに分類されるいずれのＤＮａｓｅでもよい。またＤＮＡをランダムに切断するＭｉｃｒｏｃｏｃｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＤＮａｓｅ Ｉ （Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ）、ＤＮａｓｅ ＩＩ （Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩ）等もこの範疇である。また、ＤＮＡ中の特異的塩基配列部位で切断する制限エンドヌクレアーゼであるＡｃｃ１、Ａｃｃ２、Ａｃｃ３、Ａｃｙ１、Ａｆｌ２、Ａｇｅ１、Ａｌｕ１、Ａｌｗ ４４ １（ＡｐａＬ １）、Ａｐａ１、Ａｓｅ１、Ａｖａ １、Ａｖａ２、Ａｘｙ１、Ｂａｌ１、Ｂａｍ Ｈ１、Ｂｃｌ１、Ｂｇｌ１、Ｈｐａ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、ＥｃｏＲ Ｉ等いずれもこの範疇である。これらのうち、比較的安価で汎用性であるＭｉｃｒｏｃｏｃｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅは本特許の実施するに当たり取り扱いやすいＤＮａｓｅである。
【００１８】
タンパク質水溶液をＤＮａｓｅで処理する方法として、（１）ＤＮａｓｅを直接タンパク質水溶液に添加して撹拌放置する方法、（２）ＤＮａｓｅを胆体に固定化して、このＤＮａｓｅ固定化胆体をタンパク質水溶液中に投入して撹拌放置する方法、さらに（３）膜上にＤＮａｓｅを固定化して、濾過とともにタンパク質水溶液をＤＮａｓｅ処理する方法が考えられる。
【００１９】
（１）のＤＮａｓｅを直接タンパク質水溶液に添加して撹拌放置する方法においては、本発明においては、ＤＮａｓｅ濃度を０．００１ｕｎｉｔ／１００ ｍｌから１０００ｕｎｉｔ／１００ ｍｌの濃度で処理することが適切である。あまり酵素濃度が低いと処理時間が長く要するようになり、また酵素濃度が高くなるとタンパク質水溶液中にＤＮａｓｅという不純物が増大してしまうので、０．１ｕｎｉｔ／１００ ｍｌから１０ｕｎｉｔ／１００ ｍｌの濃度のＤＮａｓｅで処理することが好ましい。また、処理温度は酵素が機能し、かつ変性しない２℃〜５０℃で３０秒から２４時間処理することが適切である。長期時間処理は、前処理時間が長くなるために本発明の趣旨と異なってくるために、１分から１時間程度の処理時間が好ましい。
【００２０】
２）のＤＮａｓｅを胆体に固定化して、このＤＮａｓｅ固定化胆体をタンパク質水溶液中に投入して撹拌放置する方法においては、ＤＮａｓｅを胆体上に固定化されたＤＮａｓｅ固定化胆体をタンパク質水溶液中に投入してＤＮａｓｅ処理を２℃〜５０℃で３０秒から２４時間処理を行なう。長期時間処理は、前処理時間が長くなるために本発明の趣旨と異なってくるために、１分から１時間程度の処理時間が好ましい。また、処理温度は酵素が機能し、かつ変性しない２℃〜５０℃が好ましい。
ＤＮａｓｅ固定化用の胆体として、ポリスチレン、ポリアミド、ポリメチルメタクリレート等より調製されたカラムビーズ、並びにポリエステル、セルロース、ナイロン等より調製された不織布または布、さらに、セルロース、テフロン（登録商標）、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレン、ポリスルホン、ポリイミド等より調製された膜等、ＤＮａｓｅが水溶液中で不容化されていれば、いかなる形式でも良い。ＤＮａｓｅの胆体化反応としては、カルボジイミド法（住田秀司ら、高分子論文集、４３， ６６５ （１９８６））あるいは、スクシンイミド法（Ｈ． Ｋｉｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １１１， ６８０９ （１９８９）） を用いることが可能であるが、これらの方法にとらわれるものではない。
また、ＤＮａｓｅの胆体への固定化法として、物理吸着法でも良いが、一部のＤＮａｓｅが水溶液中に流出することが考えられるために上記（１）の効果もこの場合には含まれることになる。
【００２１】
３）の膜上にＤＮａｓｅを固定化して、濾過とともにタンパク質水溶液をＤＮａｓｅ処理する方法では、ＤＮａｓｅを膜上に固定化されたＤＮａｓｅ固定化膜を調製した後に、タンパク質水溶液をＤＮａｓｅ固定化膜に透過させればよい。この時の処理温度は酵素が機能し、かつ変性しない２℃〜５０℃が好ましい。
ＤＮａｓｅ固定化用の膜の素材は、水溶性溶液を濾過できる物であれば、いかなる素材でも良い。例えば、セルロース、セルロースアセテート、ポリフッ化ビニリデン、ポリスルホン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、ナイロン等であるが、これに限定されるものではない。その中でも、ウイルス除去膜を用いた場合には、タンパク質水溶液の前処理とともにウイルス除去双方を行なうために本発明では好ましい。同様に、ウイルス除去以外にも、本発明の主眼点である本濾過用の不純物濾過膜上にＤＮａｓｅを固定化した場合には、タンパク質水溶液の前処理とともに不純物除去双方を行なうために本発明では好ましい。しかしながら、ＤＮａｓｅ固定化膜を用いてタンパク質水溶液を処理（透過）させた後に、不純物濾過を膜を用いて行なっても本発明の範疇である。
【００２２】
本発明に従って、タンパク質水溶液をＤＮａｓｅ処理した後、適切に選択された膜を用いて膜濾過を行えば、効果的な不純物除去と同時に、従来の方法に比し、著しく効率的な濾過が実現される。また、不純物濾過用膜上に、ＤＮａｓｅを固定化した場合には、タンパク質水溶液の前処理無しに効果的な不純物除去と同時に、従来の方法に比し、著しく効率的な濾過が実現される。
ＤＮＡを含有するタンパク質水溶液を膜濾過する場合、ＤＮＡの介在により、タンパク質が会合し、その粒子サイズが大きくなり、膜細孔を通過しにくくなるため、濾過効率すなわち濾過速度、透過率が低下する。また、濾過を継続すると、時間の経過に伴い、膜表面及び膜内部の細孔が閉塞していき、濾過効率は通常さらに低下するが、会合によるタンパク質ーＤＮＡ複合体の巨大化により、この傾向が加速される。ＤＮａｓｅ処理を行なうことによりタンパク質ーＤＮＡ複合体を低減させた後、膜濾過することにより、これらの現象を解消することができる。
【００２３】
【実施例】
次に実施例によってこの発明をさらに具体的に説明する。
【実施例１】
ガンマグロブリン（シグマ社製、Ｇ−５００９、牛由来）をトリスアミノメタン塩酸塩（５ ｍＭ／ｌ）／エチレンジアミン−４酢酸−２ナトリウム（０．５ｍＭ／ｌ）緩衝液に溶解し、酢酸を添加してｐＨ８．０の ５０００ｐｐｍガンマグロブリン水溶液を調製した。
このガンマグロブリン水溶液 ３ｍｌに、Ｂｅａｃｏｎ ＤＮＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｖ２１６５、Ｐａｎ Ｖｅｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製、宝酒造株式会社より購入）中の蛍光プローブを３０μｌ添加した。励起波長 ４８５ｎｍ，蛍光波長 ５３０ｎｍ（日本分光製、分光蛍光光度計ＦＰ−７７７使用）の条件で、ガンマグロブリン水溶液中のＤＮＡ濃度を、ＤＮＡにインターカレートされた蛍光プローブの蛍光強度より定量した。この時のＤＮＡ濃度は、２５±２ｐｐｂであった。このガンマグロブリン水溶液２００ ｍｌを３７℃に保温した後に、Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製）３Ｕ添加させて、恒温槽中で１時間緩やかに震盪撹拌させた。調製したガンマグロブリン水溶液のＤＮＡ濃度を測定した所、２４±２ｐｐｂであった。このガンマグロブリン水溶液をウイルス除去用フィルター、ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ （旭化成株式会社製、有効膜面積０．００１ｍ２）を用いて圧力０．３気圧、２５℃の条件下で、デッドエンド法による濾過を行なった。透過液を５ ｇづつ採取して、透過液Ｎｏ．を１から順に番号を振った。この透過液に対するガンマグロブリンの透過率並びに透過速度を測定した。ここで、ガンマグロブリンの透過率は以下のように定義した。
透過率 （％）＝（（透過液中のガンマグロブリン濃度）／（原液中のガンマグロブリン濃度））×１００
これらの結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】
【比較例１】
実施例１と同様にして、ＤＮａｓｅ未処理の５０００ｐｐｍガンマグロブリン水溶液（ｐＨ８．０）を調製した。さらに、実施例１と同様にしてガンマグロブリン水溶液をウイルス除去用フィルター、ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ （旭化成株式会社製、有効膜面積０．００１ｍ２）を用いて圧力０．３気圧、２５℃の条件下で、デッドエンド法による濾過を行なった。透過液を５ ｇづつ採取して、透過液Ｎｏ．を１から順に番号を振った。この透過液に対するガンマグロブリンの透過率並びに透過速度を測定した。この結果を表２に示す。透過液５０ｇ採取後におけるガンマグロブリン水溶液の透過速度は、０．０１１±０．００２ｍ３／ｍ２ｄａｙであり、実施例１の透過液５０ｇ採取後におけるガンマグロブリン水溶液の透過速度に比べて、１／４２と著しく減少していた。また、ガンマグロブリンの透過率は、実施例１に比べて、いずれの透過液採取後においても、２０％〜４０％減少していた。
【００２６】
【表２】
【００２７】
【実施例２】
酵素処理条件を変化させた以外は実施例１と同様の実験を行なった。酵素処理条件（酵素の種類、酵素処理濃度、処理時間、処理温度）並びに透過液５０ｇ採取後におけるガンマグロブリン水溶液の透過速度と透過率を表３に示す。ここで、Ｍ．Ｎａｓｅは、Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製）を意味し、ＤＮａｓｅ Ｉは、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．製（コード番号８９８３５）の酵素を用いた。いずれの場合も、ＤＮａｓｅ処理後のガンマグロブンリン水溶液中には、１０ｐｐｂ以上のＤＮＡが含有していた。透過液５０ｇ採取後における比較例１（表２）並びに表３中の実験１（ＤＮａｓｅ未処理）の値と比較すると、ガンマグロブリン水溶液をＤＮａｓｅ処理することにより、透過速度並びに透過率が共に向上していた。
【００２８】
【表３】
【００２９】
【実施例３】
実施例１と同様に、ガンマグロブリン水溶液を調製し、さらにＤＮａｓｅ処理を行なった。このガンマグロブリン水溶液を、ａ）ウイルス除去用フィルター、ＰＬＡＮＯＶＡ １５Ｎ （旭化成株式会社製、有効膜面積０．００１ｍ２）、ｂ）ＰＬＡＮＯＶＡ ７５Ｎ （旭化成株式会社製、有効膜面積０．００１ｍ２）、ｃ）精密濾過膜、フロロポア膜（ＦＰ−１００、平膜、孔径１．０μｍ、膜面積 １７．３ｃｍ２、住友電工社製）、ｄ）精密濾過膜、ニュクリポァー膜（１１１１０５、平膜、孔径０．１μｍ、膜面積 １７．３ｃｍ２、コーニングコスター社製）並びにｅ）限外濾過膜、ＳＩ−１（ポリスルホン製、中空糸膜、長さ１ｍ、旭化成株式会社製）を用いて圧力０．３気圧、２５℃の条件下で、デッドエンド法による濾過を行なった。透過液５０ｇ採取後におけるガンマグロブリン水溶液の透過速度並びに透過率を表４に示す。
【００３０】
【表４】
【００３１】
【比較例２】
実施例１と同様にして、ＤＮａｓｅ未処理の５０００ｐｐｍガンマグロブリン水溶液（ｐＨ８．０）を調製した。さらに、実施例３と同様にしてガンマグロブリン水溶液を、ａ）ウイルス除去用フィルター、ＰＬＡＮＯＶＡ １５Ｎ （旭化成株式会社製、有効膜面積０．００１ｍ２）、ｂ）ＰＬＡＮＯＶＡ ７５Ｎ （旭化成株式会社製、有効膜面積０．００１ｍ２）、ｃ）精密濾過膜、フロロポア膜（ＦＰ−１００、平膜、孔径１．０μｍ、膜面積 １７．３ｃｍ２、住友電工社製）、ｄ）精密濾過膜、ニュクリポァー膜（１１１１０５、平膜、孔径０．１μｍ、膜面積 １７．３ｃｍ２、コーニングコスター社製）並びにｅ）限外濾過膜、ＳＩ−１（ポリスルホン製、中空糸膜、長さ１ｍ、旭化成株式会社製）を用いて圧力０．３気圧、２５℃の条件下で、デッドエンド法による濾過を行なった。透過液５０ｇ採取後におけるガンマグロブリン水溶液の透過速度並びに透過率を表５に示す。
透過液５０ｇ採取後における実施例３（表４）の値と比較すると、ガンマグロブリン水溶液をＤＮａｓｅ処理することにより、いずれの膜を用いても透過速度が共に向上していた。
【００３２】
【表５】
【００３３】
【実施例４】
８ｗｔ％濃度のガンマグロブリン水溶液を調製した以外は、実施例１と同様な実験を行なった。この時のＤＮＡ濃度は４００±３０ｐｐｂであった。透過液５０ｇ採取後におけるガンマグロブリン水溶液の透過速度は、ＤＮａｓｅ未処理の８ｗｔ％濃度のガンマグロブリン水溶液を用いて測定した透過速度より２３５倍向上していた。
【００３４】
【実施例５】
５００ｐｐｍの濃度のガンマグロブリン水溶液を調製した以外は、実施例１と同様な実験を行なった。透過液５０ｇ採取後におけるガンマグロブリン水溶液の透過速度は、ＤＮａｓｅ未処理の５００ｐｐｍ濃度のガンマグロブリン水溶液を用いて測定した透過速度より１１倍向上していた。
【００３５】
【実施例６】
血液凝固因子ＩＸ水溶液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ社製、Ｎａｎｏｔｉｖ、ヒト血漿由来）２００ ｍｌを３７℃に保温した後に、Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製）３Ｕ添加させて、恒温槽中で１時間緩やかに震盪撹拌させた。調製した血液凝固因子ＩＸ水溶液のＤＮＡ濃度を測定した所、７±２ｐｐｂであった。この血液凝固因子ＩＸ水溶液をウイルス除去用フィルター、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ／１８０ （ミリポア社製、有効膜面積１／３ｆｔ２）を用いて圧力０．３気圧、２５℃の条件下で、デッドエンド法による濾過を行なった。透過液５０ｇ採取後における血液凝固因子ＩＸ水溶液の透過速度は、ＤＮａｓｅ未処理の血液凝固因子ＩＸ水溶液を用いて測定した透過速度より４．８倍向上していた。
【００３６】
【実施例７】
ヒト血清アルブミン４ｗｔ％水溶液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ社製）２００ ｍｌを３７℃に保温した後に、Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製）３Ｕ添加させて、恒温槽中で１時間緩やかに震盪撹拌させた。調製したヒト血清アルブミン水溶液のＤＮＡ濃度を測定した所、４３±２ｐｐｂであった。このヒト血清アルブミン水溶液をウイルス除去用フィルター、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ／１８０ （ミリポア社製、有効膜面積１／３ｆｔ２）を用いて圧力０．３気圧、２５℃の条件下で、デッドエンド法による濾過を行なった。透過液５０ｇ採取後における血液凝固因子ＩＸ水溶液の透過速度は、ＤＮａｓｅ未処理のヒト血清アルブミン水溶液を用いて測定した透過速度より５６．３倍向上していた。
【００３７】
【実施例８】
アンチトロンビン（ＡＴＩＩＩ）水溶液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ社製、ＡＴｅｎａｔｉｖ、ヒト血漿由来）２００ ｍｌを３７℃に保温した後に、Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製）３Ｕ添加させて、恒温槽中で１時間緩やかに震盪撹拌させた。調製したアンチトロンビン水溶液のＤＮＡ濃度を測定した所、９±２ｐｐｂであった。このアンチトロンビン水溶液をウイルス除去用フィルター、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ／１８０ （ミリポア社製、有効膜面積１／３ｆｔ２）を用いて圧力０．３気圧、２５℃の条件下で、デッドエンド法による濾過を行なった。透過液５０ｇ採取後におけるアンチトロンビンＩＸ水溶液の透過速度は、ＤＮａｓｅ未処理の血液凝固因子ＩＸ水溶液を用いて測定した透過速度より６．２倍向上していた。
【００３８】
【実施例９】
ウイルス除去用フィルター、ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ （旭化成株式会社製、有効膜面積０．００１ｍ２）へのＤＮａｓｅの固定化を行なった。すなわち、ｐＨ１０．５に調製した１０ｍｇ／ｍｌのＣＮＢｒ水溶液をＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜中にマイクロチューブポンプ（ＭＰ−３Ｎ、東京理化器械社製）を用いて６０分間、２５℃で循環させた。６０分経過した後、０．１ｍｏｌ／ｌ炭酸水素ナトリウム水溶液でＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜を洗浄した。次にマイクロチューブポンプを用いて、ｐＨ９．１に調製したエタノールアミン溶液を６０分間、２５℃でＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜中に循環させた。このＣＮＢｒ活性化ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜を０．５ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、続いて超純水で洗浄を行なった。ヒドラジン１水和物５０ｍｌに超純水１５０ｍｌを溶解させたヒドラジン水溶液をＣＮＢｒ活性化ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜中にマイクロチューブポンプを用いて１０時間、２５℃で循環させた。１０時間後、このＮＨ２基導入ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜を超純水で洗浄した。二塩化ズベジミン酸ジメチル０．００８２ｇを２００ｍｌの超純水に溶解させたｐＨ１０の水溶液をＮＨ２基導入ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜中にマイクロチューブポンプを用いて３０分間、２５℃で循環させた。超純水で二塩化ズベジミン酸ジメチル処理済みＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜を洗浄した後に、２００ｍｌのｐＨ８．５の１０００ｕｎｉｔＤＮａｓｅ（Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製））水溶液をマイクロチューブポンプを用いて１８時間、２５℃で循環させた。その後、超純水でＤＮａｓｅ固定化ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜を洗浄した。ＤＮａｓｅ固定化ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜に固定されたＤＮａｓｅ量を水溶液中の既知量のＤＮａｓｅによるＤＮＡの分解量と比較検討したところ、１１ｕｎｉｔ／０．００１ｍ２量がＤＮａｓｅ固定化ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ膜上にＤＮａｓｅが固定化されていることが確認された。
ＤＮａｓｅ固定化ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎを用いた以外は、比較例１と同様な実験を行なった。透過液５０ｇ採取後における透過速度は比較例１より４７％向上しており、ガンマグロブリンの透過率は比較例１より１６％向上していた。
【００３９】
【実施例１０】
乾燥ポリスルホン中空糸膜（ＳＩ−１、公称分画分子量６０００、旭化成株式会社製）を１００％のエタノール溶液に１時間浸漬させた。その後、５０％エタノール＋５０％ヘキサン溶液中に中空糸を１時間浸漬させた。さらに、１００％ヘキサン溶液中に中空糸を１時間浸漬させた。上記処理により、中空糸膜に含有するグリセリンを除去した。
上記ポリスルホン中空糸膜（３ｍ）をクロロジメチルエーテル（東京化成工業製、７．７２ｇ）、塩化第２スズ（和光純薬製、２５ｇ）、ヘキサン（和光純薬、２２８ｍｌ）の混合溶液中（上記試薬のモル比は、５：５：９０）に浸漬させ、２８℃で、６時間反応させた。このクロロメチル化ポルスルホン中空糸膜は、赤外吸収スペクトルより７６０ｃｍ−１にＣ−Ｃｌ結合に基づく赤外吸収が観察された。また、上記で調製したクロロメチル化ポルスルホン中空糸膜を重水素化クロロホルムに溶解させて１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルよりクロロメチル基のメチレン部位のプロトンに基づくピークが４．５ｐｐｍに観察された。元素分析より、ポリスルホンの繰り返し構造単位当たり０．４３個のクロロメチル基が導入されていることを確認した。
次にクロロメチル化ポルスルホン中空糸膜をエチレンジアミン溶液２００ｍｌ中に浸漬させ、２０分間穏やかに攪拌しながらエチレンジアミン化反応を行った。エチレンジアミン化ポリスルホン中空糸膜は、赤外吸収スペクトルより３３００ｃｍ−１にＮＨ２基に基づく赤外吸収が観察された。また、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルより４．５ｐｐｍに観察されたクロロメチル基のメチレン部位のプロトンに基づくピークがほぼ消失していた。エチレンジアミン化ポリスルホン中空糸膜のイオン交換容量よりポリスルホンの繰り返し構造単位当たり０．０６個のエチレンジアミン基が導入されていることを確認した。
二塩化ズベジミン酸ジメチル０．００８２ｇを２００ｍｌの超純水に溶解させたｐＨ１０の水溶液中にエチレンジアミン化ポリスルホン中空糸膜を、３０分間、２５℃の条件下で浸漬させた。超純水で二塩化ズベジミン酸ジメチル処理済みポリスルホン中空糸膜を洗浄した後に、２００ｍｌのｐＨ８．５の１０００ｕｎｉｔＤＮａｓｅ（Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製））水溶液中に１８時間、２５℃の条件下で浸漬させた。その後、超純水でＤＮａｓｅ固定化ポリスルホン中空糸膜を洗浄した。ＤＮａｓｅ固定化ポリスルホン中空糸膜に固定されたＤＮａｓｅ量を水溶液中の既知量のＤＮａｓｅによるＤＮＡの分解量と比較検討したところ、４ｕｎｉｔ／０．００１ｍ２量のＤＮａｓｅがＤＮａｓｅ固定化ポリスルホン中空糸膜上に固定化されていることが確認された。
ＤＮａｓｅ固定化ポリスルホン中空糸膜を用いた以外は、比較例１と同様な実験を行なった。透過液５０ｇ採取後における透過速度はＤＮａｓｅが固定化されていないポリスルホン中空糸膜より２３％向上しており、ガンマグロブリンの透過率は比較例１より７％向上していた。
【００４０】
【実施例１１】
０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３と０．５Ｍ ＮａＣｌを含有するｐＨ８．３の水溶液１０ｍｌに１００ｕｎｉｔのＤＮａｓｅ（Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製））を溶解させた。このＤＮａｓｅ水溶液をリガンド固定化用カップリング担体（ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ ｃｏｌｕｍｎ、アマシャムファルマシアバイオテク株式会社製）に注入して、１時間室温で放置した。その後、ブロッキング水溶液（Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ ４倍希釈液、ＵＫ−Ｂ８０、大日本製薬株式会社）を５０ｍｌ上記調製カラムに流した。酵素固定化率は、８５％であることが、カラム流出液中の酵素濃度より算出された。
比較例１と同様にして、ＤＮａｓｅ未処理の５０００ｐｐｍガンマグロブリン水溶液（ｐＨ８．０）を調製した。このガンマグロブリン水溶液をＤＮａｓｅ固定化カラム中に１ｍｌ／ｍｉｎの速度で流した。次に、カラム処理ガンマグロブリン水溶液を実施例１と同様にしてウイルス除去用フィルター、ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ （旭化成株式会社製、有効膜面積０．００１ｍ２）を用いて圧力０．３気圧、２５℃の条件下で、デッドエンド法による濾過を行なった。透過液５０ｇ採取後における透過速度は比較例１と比較して、５８倍上昇しており、ガンマグロブリンの透過率は比較例１より１８％向上していた。
【００４１】
【実施例１２】
ポリエステル製不織布０．５ｇをクロロジメチルエーテル（東京化成工業製、７．７２ｇ）、塩化第２スズ（和光純薬製、２５ｇ）、ヘキサン（和光純薬、２２８ｍｌ）の混合溶液中（上記試薬のモル比は、５：５：９０）に浸漬させ、２８℃、６時間反応させて、クロロメチル化ポリエステル不織布を調製した。次にクロロメチル化ポリエステル不織布をエチレンジアミン溶液２００ｍｌ中に浸漬させ、２０分間穏やかに攪拌しながらエチレンジアミン化反応を行った。その後、超純水でエチレンジアミン化ポリエステル不織布を洗浄した。
二塩化ズベジミン酸ジメチル０．００８２ｇを２００ｍｌの超純水に溶解させたｐＨ１０の水溶液中にエチレンジアミン化ポリエステル不織布を、３０分間、２５℃の条件下で浸漬させた。超純水で二塩化ズベジミン酸ジメチル処理済みポリエステル不織布を洗浄した後に、２００ｍｌのｐＨ８．５の１０００ｕｎｉｔＤＮａｓｅ（Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ （Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 社製））水溶液中に１８時間、２５℃の条件下で浸漬させた。その後、超純水でＤＮａｓｅ固定化ポリエステル不織布を洗浄した。ＤＮａｓｅ固定化ポリエステル不織布に固定されたＤＮａｓｅ量を水溶液中の既知量のＤＮａｓｅによるＤＮＡの分解量と比較検討したところ、２０ｕｎｉｔ／０．００１ｍ２量がＤＮａｓｅ固定化ポリエステル不織布上にＤＮａｓｅが固定化されていることが確認された。
比較例１で調製したガンマグロブリン水溶液をＤＮａｓｅ固定化ポリエステル不織布に３０分接触させた。その後、実施例１と同様にしてガンマグロブリン水溶液をウイルス除去用フィルター、ＰＬＡＮＯＶＡ ３５Ｎ （旭化成株式会社製、有効膜面積０．００１ｍ２）を用いて圧力０．３気圧、２５℃の条件下で、デッドエンド法による濾過を行なった。透過液５０ｇ採取後における透過速度は比較例１と比較して、３４倍上昇しており、ガンマグロブリンの透過率は比較例１より１５％向上していた。
【００４２】
【実施例１３】
実施例１におけるガンマグロブリン水溶液に、ブタ日本脳炎ウイルスを加え、実施例１に従って、５０ｇの溶液（原液）を濾過し、透過液を採取した。これを実験Ａとする。比較例１におけるガンマグロブリン水溶液に、ブタ日本脳炎ウイルスを加え、比較例１に従って、５０ｇの溶液（原液）を濾過し、透過液を採取した。これを実験Ｂとする。濾過前の水溶液（原液）は実験Ａ及び実験Ｂのいずれについても、その中のウイルスの感染力価はいずれも８．２ｌｏｇであった。Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ処理した実験Ａの透過液中のウイルス感染力価を分析したところ、ウイルス除去率は５．５であった。また、Ｍｉｃｒｏｃｃｏｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ処理していない実験Ｂの透過液中のウイルス感染力価を分析してウイルス除去率を求めたところ、５．８であった。ここで、ウイルス除去率（ＬＲＶ）は、下記の定義によった。
ＬＲＶ ＝ −ｌｏｇ（（透過液中のウイルス感染力価）／（原液中のウイルス感染力価））
上記の結果はウイルス安全性に関する規制当局のガイドラインを充分満たすものであり、本発明によっても、従来の方法と同様に高効率でのウイルス除去が可能である。
【００４３】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、タンパク質水溶液をＤＮａｓｅで処理することにより、ウイルス等の不純物をタンパク質水溶液から除去するに際し、従来の方法に比較して、タンパク質水溶液の濾過速度及び透過率が向上し、これにより、生産効率が向上し、製造コストが低減できる。[0001]
[Industrial applications]
The field of application of the present invention relates to a method for purifying an aqueous protein solution in the fields of medicine and medical treatment.
[0002]
[Prior art]
In the field of medicine and medical treatment, when impurities are mixed in the target protein, there is a risk of suffering from diseases such as viral hepatitis (K. Yamaguchi et al. J. Electron. Microsc. 40, 337 ( 1991)). Therefore, there is a need for a highly safe drug / medical protein from which impurities, particularly infectious viruses, are inactivated or removed.
[0003]
As a method for obtaining a useful protein substantially free of impurities, an aqueous solution containing the protein is heated, irradiated, irradiated with a chromatogram, treated with a solvent and a surfactant (so-called SD method), and subjected to membrane separation at the production stage. And the like (S. Harada et al. J. Clin. Microbiol., 22, 908 (1985)). However, the above-described method except membrane separation denatures and inactivates the target useful protein, lowers the recovery rate, increases the danger due to denatured products, and adds surfactants and the like added for inactivation. There are problems that it is not easy to remove or detoxify chemicals, and it is not possible to obtain a sufficient effect of removing impurities (B. Horowitz et al., Transfusion, 25, 516 (1985)).
[0004]
On the other hand, the membrane separation method physically separates these particles due to the relative size difference between pores present in the membrane structure, useful proteins to pass through, and particles (eg, viruses) to be blocked, As a result, it is based on the so-called size exclusion principle of removing impurities. Therefore, there is no fear of denaturation and inactivation of the useful protein, and there is no need to add a chemical for inactivation, so that its removal and detoxification are unnecessary. For this reason, the use of membrane separation has been widespread in purification of useful proteins in the fields of medicine and medical treatment.
[0005]
However, according to the size exclusion principle, effective removal of impurities as particles to be removed and efficient membrane permeation / recovery of proteins as particles to be recovered tend to be a trade-off phenomenon. That is, if the size of the pores of the membrane is set small in order to effectively remove the particles to be removed, the permeation of the particles to be recovered is suppressed, and the filtration efficiency, that is, the filtration rate and the transmittance (sieving coefficient) are reduced. descend. On the other hand, if the size of the pores of the membrane is set to be large in order to make the permeation and collection of the particles to be collected more efficient, the effect of removing the particles to be removed is sacrificed. In general, these parameters indicating the filtration efficiency deteriorate as the filtration time elapses. The reason is that the pores are blocked by the solute as the filtration is continued. In this respect, the relative relationship between the particle size and the pore size also has an effect. If it is attempted to filter the protein as the particles to be recovered in a short time and with a high transmittance while maintaining a high effect of removing impurities, the membrane area needs to be increased, and the purification cost increases.
[0006]
As a means for solving these problems, a method has been devised in which the size of the particles to be passed is reduced before the membrane is separated or filtered. For example, regarding the latter, Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-502074 discloses a method for virus-filtering a solution containing at least one kind of polymer, wherein the total salt content of the solution is about 0.2 M to the related salt. Wherein said solution is in the range of saturation. It is considered that the filtration efficiency is improved by increasing the salt concentration because the shrinkage of the size of the protein particles themselves and the interaction between the protein particles and / or the protein and the membrane are reduced. However, in Japanese Patent Application Laid-Open Publication No. H10-502074, the physiologically isotonic salt concentration is increased so that the salt concentration exhibiting the above-mentioned effects is preferably 0.2 M or more, and more preferably in the range of 0.8 to 1.5 M. Higher salt concentrations are needed. Therefore, in the case of a drug administered to the human body by intravenous injection or intramuscular injection, an operation of reducing the salt concentration to a physiological isotonic concentration by filtration or the like after filtration is essential. In addition, when the salt concentration is increased, the solubility of the protein is reduced by salting out, which may have an adverse effect.
[0007]
In addition, a typical aqueous protein solution contains ppb-order DNA as an impurity, and the complex of the DNA and the protein causes a decrease in the permeation flow rate in membrane permeation. It has been determined using scattering and fluorescence spectrophotometry (A. Higuchi et al., J. Membrane Sci., 186, 9 (2001)). As a remedy, a method has been reported in which the concentration of DNA and RNA in the aqueous protein solution is reduced and then the aqueous protein solution is purified by membrane filtration (JP-A-2000-319294). However, in this method, a large amount of time is required for the pretreatment for reducing the concentrations of DNA and RNA in the aqueous protein solution, and even if the membrane filtration time for removing impurities such as viruses is reduced, the total amount of impurity treatment is reduced. The purification time was long and the method was overturned.
[0008]
Therefore, there is a need for a method for safely separating and removing impurities from various protein aqueous solutions at high efficiency, that is, at a high filtration rate and transmittance by membrane filtration.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
In the field of medicine and medical treatment, as a means of removing impurities such as viruses from aqueous protein solutions by filtration, membrane filtration does not denature or inactivate the target protein. In comparison, it is an excellent method, but it is difficult to achieve both effective removal of impurities and filtration efficiency of a target protein, that is, high filtration rate and transmittance. An object of the present invention is to dissociate a protein-DNA complex by partially cutting DNA contained as an impurity in an aqueous protein solution to maintain effective removal of impurities such as viruses mixed in the protein. And a method for obtaining high filtration efficiency.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The present invention reduces the clogging in membrane filtration by dissociating the protein-DNA complex by preferentially cleaving the DNA by using DNA containing impurities as an impurity in the aqueous protein solution to be filtered. A method for purifying an aqueous protein solution, comprising performing membrane filtration of the aqueous protein solution. In order to dissociate the protein-DNA complex in the aqueous protein solution and improve the filtration efficiency, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-319294 proposes that the DNA concentration be reduced mainly by a membrane filtration method. However, the present inventor has shown that, without reducing the DNA concentration, it is possible to dissociate the protein-DNA complex in the aqueous protein solution by treating the DNA chain with DNase to shorten the DNA chain. Demonstration has led to the invention of the present invention.
Further, the present invention is a method for purifying an aqueous protein solution, wherein a target to be removed by membrane filtration is mainly a virus.
[0011]
The DNase used in the present invention may be dissolved in an aqueous protein solution, may be immobilized on the bile, or may be immobilized on a membrane, regardless of the shape of the DNase.
The origin of the protein used in the present invention is irrelevant for the use of the present invention. Thus, any protein produced in cultured cells using genetically modified or cell fusion techniques derived from humans, animals and plants, as well as naturally produced proteins.
Examples of the protein according to the present invention include plasma protein, serum protein, blood coagulation factor VIII, factor IX, hemoglobin, fibrinogen, antithrombin III, immunogamma globulin, albumin, interferon, apolipoprotein, and cell growth factor. , Extracellular matrix, cell adhesion factors and growth hormone.
The aqueous protein solution referred to in the present invention means an aqueous solution containing 10% or more of protein among the constituent components excluding water. Therefore, plasma and serum derived from humans and animals are also included in this category.
The impurities to be removed by membrane filtration in the present invention are infectious viruses, bacteria, fungi, protozoa, and transmissible spongiform encephalopathy pathogens.
[0012]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The filtration membrane used in the present invention is a microfiltration membrane (Micro-filtration membrane) having an average pore size of 1 μm or less, preferably 100 nm or less, an ultra-filtration membrane (Ultra-filtration membrane), a virus removal membrane, or the like.
The material of the filtration membrane used in the present invention may be any material as long as it can filter an aqueous solution. Examples include, but are not limited to, cellulose, cellulose acetate, polyvinylidene fluoride, polysulfone, polyvinyl chloride, polyester, polymethyl methacrylate, polyacrylonitrile, nylon, and the like. Among them, those made of cellulose are hydrophilic and therefore have a high permeation rate of an aqueous solution and a small amount of protein adsorption, and are suitable for permeation thereof.
[0013]
Examples of filtration membranes used for separating impurities such as viruses from protein aqueous solutions are Planova 35N, Planova 20N and Planova 15N (all materials are regenerated cellulose) manufactured by Asahi Kasei Corporation, and polysulfone hollow fibers manufactured by Asahi Kasei Corporation Membrane (for example, SI-1 film), Millipore's Viresolve 70, Viresolve 180 (all materials are polyvinylidene fluoride), Sumitomo Electric Co., Ltd.'s Fluoropore membrane (Material is ethylene tetrafluoride), Corning Costar's Nuclepoa Film (material is polycarbonate) and the like.
The form of the filtration membrane used in the present invention may have any form such as a flat membrane, a hollow fiber membrane, a spiral membrane, and a pleated membrane. In addition, any of a dead end method and a tangential flow method can be applied as a filtration form.
[0014]
The concentration of the aqueous protein solution suitable for the present invention varies depending on the type, and is, for example, 0.05 to 10% in the case of a gamma globulin solution. Preferably it is 3% to 8%. The reason why the concentration is 10% or less is that if the concentration is higher than that, the association between gamma globulin molecules is increased, and it becomes very difficult to perform filtration using the present invention. In general, the higher the concentration of the globulin solution, the higher the possibility of DNA-mediated association, which is preferable because the effect of dissociation of the DNA-protein complex to improve the permeation efficiency tends to appear.
It is desirable that the temperature and pH of the aqueous protein solution in practicing the present invention be in a range that does not denature the protein. For example, in the case of a gamma globulin solution, it is usually desirable that the temperature of the solution is 2 ° C to 40 ° C and the pH is in the range of about 7 to 8.
[0015]
For the measurement of DNA in a solution, a PCR method, an ultraviolet-visible spectrophotometric method, and a fluorescent method have been conventionally used. In the PCR method, the detection limit is, for example, about 10 ppm in the case of λ phage DNA (Bio-General Catalog 1997/1998 vol. 1 Genetic Engineering, D-17, Takara Shuzo Co., Ltd.). Further, it is determined to be about 1.0 ppm in an ultraviolet-visible spectrophotometry (A. Higuchi et al. J. Membrane Sci., 116, 191 (1996)). In a fluorescence measurement method using ethylene bromide (an intercalating agent), it is about 0.1 ppm. However, in the fluorescence measurement method using a fluorescent probe (BEACON V2165, DNA QUANTATION KIT, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), the detection limit can be set to 0.5 ppb or less (R. Bolger et al. Biotechniques, 23, 532 (1997)).
[0016]
Since the production of proteins is carried out by living organisms or cells, usually, the DNA solution is inevitably contained in the aqueous solution of a biologically-derived polymer protein before purification.
For example, lyophilized gamma globulin (G-5009, bovine) manufactured by Sigma is dissolved in a buffer solution to prepare a 5000 ppm (0.5%) aqueous solution, and the DNA concentration at this time is measured. The concentration varied, but was 8-25 ± 2 ppb (A. Higuchi et al., J. Membrane Sci., In press). The DNA concentration of a 5% solution obtained by dissolving frozen gamma globulin (197-7000, bovine) manufactured by Life Technologies was 37 ± 4 ppb.
[0017]
In order to dissociate the protein-DNA complex in the aqueous protein solution, the DNA must be cut. The DNase used for this purpose may be any DNase classified as an endonuclease or an exonuclease. Also included are Micrococcal nuclease, DNase I (Deoxyribonuclease I), DNase II (Deoxyribonuclease II), which randomly cuts DNA, and the like. Acc1, Acc2, Acc3, Acy1, Afl2, Age1, Alu1, Alw441 (ApaL1), Apa1, Ase1, Ava1, Ava2, Axy1 are restriction endonucleases that cleave at specific base sequence sites in DNA. , Bal1, Bam H1, Bcl1, Bgl1, Hpa I, Hind III, EcoR I, etc. all fall within this category. Of these, Micrococcal nuclease, which is relatively inexpensive and versatile, is a DNase that is easy to handle when implementing the present patent.
[0018]
As a method of treating an aqueous protein solution with DNase, (1) a method in which DNase is directly added to an aqueous protein solution and the mixture is allowed to stand, and (2) a DNase is immobilized on bile, and this DNase-immobilized bile is added to the aqueous protein solution. A method in which the solution is charged and left to stir, and (3) a method in which the DNase is immobilized on the membrane and the aqueous solution of the protein is subjected to the DNase treatment together with the filtration are considered.
[0019]
In the method of (1), in which the DNase is directly added to the aqueous protein solution and left to stir, it is appropriate in the present invention to treat the DNase at a concentration of 0.001 unit / 100 ml to 1000 unit / 100 ml. If the enzyme concentration is too low, the treatment time will be long, and if the enzyme concentration is high, impurities called DNase will increase in the aqueous protein solution, so that the concentration of DNase of 0.1 unit / 100 ml to 10 unit / 100 ml is increased. It is preferred to treat with. Further, it is appropriate to perform the treatment at a temperature of 2 ° C. to 50 ° C. for 30 seconds to 24 hours at which the enzyme functions and does not denature. Since the long-term processing is different from the purpose of the present invention because the pre-processing time is longer, a processing time of about 1 minute to 1 hour is preferable.
[0020]
In the method of 2) in which the DNase is immobilized on the bile, the DNase-immobilized bile is poured into an aqueous protein solution and left to stir, the DNase-immobilized bile in which the DNase is immobilized on the bile is converted into a protein. The solution is put into an aqueous solution and subjected to DNase treatment at 2 ° C. to 50 ° C. for 30 seconds to 24 hours. Since the long-term processing is different from the purpose of the present invention because the pre-processing time is longer, a processing time of about 1 minute to 1 hour is preferable. Further, the treatment temperature is preferably 2 ° C. to 50 ° C. at which the enzyme functions and does not denature.
As a bile for DNase immobilization, column beads prepared from polystyrene, polyamide, polymethyl methacrylate, and the like, and nonwoven fabric or cloth prepared from polyester, cellulose, nylon, and the like, as well as cellulose, Teflon (registered trademark), Any form may be used as long as DNase is inactivated in an aqueous solution, such as a membrane prepared from vinylidene chloride, polyethylene, polysulfone, polyimide, or the like. The bile conversion reaction of DNase can be performed by the carbodiimide method (Hideshi Sumita et al., High Polymers, 43, 665 (1986)) or the succinimide method (H. Kitano et al., J. Am. Chem. Soc., 111). , 6809 (1989)), but is not limited to these methods.
As a method for immobilizing DNase to the bile, a physical adsorption method may be used, but the effect of the above (1) is also included in this case because some DNase may flow out into an aqueous solution. become.
[0021]
In the method of 3) in which DNase is immobilized on the membrane and the protein aqueous solution is treated with DNase together with filtration, a DNase-immobilized membrane in which DNase is immobilized on the membrane is prepared, and then the aqueous protein solution is permeated through the DNase-immobilized membrane. You can do it. The treatment temperature at this time is preferably 2 ° C. to 50 ° C. at which the enzyme functions and does not denature.
The material of the membrane for immobilizing DNase may be any material as long as it can filter a water-soluble solution. Examples include, but are not limited to, cellulose, cellulose acetate, polyvinylidene fluoride, polysulfone, polyvinyl chloride, polyester, polymethyl methacrylate, polyacrylonitrile, nylon, and the like. Among them, the use of a virus removal membrane is preferable in the present invention because both the pretreatment of the protein aqueous solution and the virus removal are performed. Similarly, in addition to virus removal, when DNase is immobilized on the impurity filtration membrane for the main filtration, which is the main point of the present invention, both the pretreatment of the protein aqueous solution and the impurity removal are performed. preferable. However, it is also within the scope of the present invention that after the protein aqueous solution is treated (permeated) using the DNase-immobilized membrane, the impurity filtration is performed using the membrane.
[0022]
According to the present invention, if the aqueous protein solution is subjected to DNase treatment and then subjected to membrane filtration using an appropriately selected membrane, effective impurity removal and, at the same time, extremely efficient filtration can be realized as compared with the conventional method. You. Further, when DNase is immobilized on the impurity filtration membrane, effective removal of impurities without pretreatment of the aqueous protein solution is achieved, and at the same time, extremely efficient filtration is realized as compared with the conventional method.
When a protein aqueous solution containing DNA is subjected to membrane filtration, due to the presence of DNA, the protein associates, the particle size increases, and it becomes difficult to pass through the membrane pores, so that the filtration efficiency, that is, the filtration rate and the transmittance decrease. . Further, if the filtration is continued, the pores on the membrane surface and inside the membrane are closed with the passage of time, and the filtration efficiency is usually further reduced. However, this tendency is caused by the enlargement of the protein-DNA complex due to the association. Is accelerated. These phenomena can be eliminated by performing membrane filtration after reducing the protein-DNA complex by performing the DNase treatment.
[0023]
【Example】
Next, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
Embodiment 1
Gamma globulin (Sigma, G-5009, derived from cattle) is dissolved in a trisaminomethane hydrochloride (5 mM / l) / ethylenediamine-4 acetate disodium (0.5 mM / l) buffer, and acetic acid is added. As a result, an aqueous 5000 ppm gamma globulin solution having a pH of 8.0 was prepared.
To 3 ml of this aqueous gamma globulin solution, 30 μl of a fluorescent probe in Beacon DNA Quantitation Kit (V2165, manufactured by Pan Vera Corporation, purchased from Takara Shuzo Co., Ltd.) was added. Under the conditions of an excitation wavelength of 485 nm and a fluorescence wavelength of 530 nm (manufactured by JASCO Corporation, using a spectrofluorometer FP-777), the DNA concentration in the gamma globulin aqueous solution was quantified from the fluorescence intensity of a fluorescent probe intercalated into DNA. The DNA concentration at this time was 25 ± 2 ppb. After 200 ml of this gamma globulin aqueous solution was kept at 37 ° C., 3 U of Micrococcal nuclease (manufactured by Worthington Biochemical) was added, and the mixture was gently shaken and stirred in a thermostat for 1 hour. When the DNA concentration of the prepared aqueous gamma globulin solution was measured, it was 24 ± 2 ppb. This gamma globulin aqueous solution is used as a virus removal filter, PLANOVA 35N (manufactured by Asahi Kasei Corporation, effective membrane area 0.001 m). 2 ) And filtration at a pressure of 0.3 atm and 25 ° C. by the dead end method. A 5 g portion of the permeate was collected, and permeate No. Were numbered sequentially from 1. The transmittance and permeation rate of gamma globulin to this permeate were measured. Here, the transmittance of gamma globulin was defined as follows.
Transmittance (%) = ((gamma globulin concentration in permeate) / (gamma globulin concentration in stock solution)) × 100
Table 1 shows the results.
[0024]
[Table 1]
[0025]
[Comparative Example 1]
In the same manner as in Example 1, a DNase-untreated 5000 ppm gamma globulin aqueous solution (pH 8.0) was prepared. Further, in the same manner as in Example 1, the aqueous gamma globulin solution was filtered with a virus removal filter, PLANOVA 35N (manufactured by Asahi Kasei Corporation, effective membrane area 0.001 m). 2 ) And filtration at a pressure of 0.3 atm and 25 ° C. by the dead end method. A 5 g portion of the permeate was collected, and permeate No. Were numbered sequentially from 1. The transmittance and permeation rate of gamma globulin to this permeate were measured. Table 2 shows the results. The permeation rate of the aqueous gamma globulin solution after collecting 50 g of the permeate is 0.011 ± 0.002 m 3 / M 2 and the permeation rate of the aqueous gamma globulin solution after collection of 50 g of the permeate in Example 1 was remarkably reduced to 1/42. In addition, the transmittance of gamma globulin was reduced by 20% to 40% as compared with Example 1 after any permeate collection.
[0026]
[Table 2]
[0027]
Embodiment 2
The same experiment as in Example 1 was performed except that the enzyme treatment conditions were changed. Table 3 shows the enzyme treatment conditions (enzyme type, enzyme treatment concentration, treatment time, treatment temperature) and the transmission rate and transmittance of the aqueous gamma globulin solution after collecting 50 g of the permeate. Here, M. Nase means Microcological nuclease (manufactured by Worthington Biochemical), and DNase I means Pierce Biotechnology Inc. (Code No. 89835) was used. In each case, the DNA solution of 10 ppb or more was contained in the aqueous gamma globulin solution after the DNase treatment. Compared with the values of Comparative Example 1 (Table 2) after collecting 50 g of the permeate and Experiment 1 (untreated with DNase) in Table 3, both the permeation rate and the transmittance were improved by treating the aqueous gamma globulin solution with DNase. I was
[0028]
[Table 3]
[0029]
Embodiment 3
An aqueous gamma globulin solution was prepared and further treated with DNase in the same manner as in Example 1. This gamma globulin aqueous solution was used for a) a virus removal filter, PLANOVA 15N (manufactured by Asahi Kasei Corporation, effective membrane area 0.001 m). 2 ), B) PLANOVA 75N (manufactured by Asahi Kasei Corporation, effective membrane area 0.001 m) 2 ), C) Microfiltration membrane, Fluoropore membrane (FP-100, flat membrane, pore size 1.0 μm, membrane area 17.3 cm) 2 D) Microfiltration membrane, Nuclepore membrane (111105, flat membrane, pore diameter 0.1 μm, membrane area 17.3 cm) 2 And Corning Costar) and e) ultrafiltration membrane, SI-1 (polysulfone, hollow fiber membrane, length 1 m, manufactured by Asahi Kasei Corporation) at a pressure of 0.3 atm and 25 ° C. Filtration by the dead end method was performed. Table 4 shows the permeation rate and permeation rate of the aqueous gamma globulin solution after collecting 50 g of permeate.
[0030]
[Table 4]
[0031]
[Comparative Example 2]
In the same manner as in Example 1, a DNase-untreated 5000 ppm gamma globulin aqueous solution (pH 8.0) was prepared. Further, an aqueous gamma globulin solution was prepared in the same manner as in Example 3 by using a) a virus removal filter, PLANOVA 15N (manufactured by Asahi Kasei Corporation, effective membrane area 0.001 m). 2 ), B) PLANOVA 75N (manufactured by Asahi Kasei Corporation, effective membrane area 0.001 m) 2 ), C) Microfiltration membrane, Fluoropore membrane (FP-100, flat membrane, pore size 1.0 μm, membrane area 17.3 cm) 2 D) Microfiltration membrane, Nuclepore membrane (111105, flat membrane, pore diameter 0.1 μm, membrane area 17.3 cm) 2 And Corning Costar) and e) ultrafiltration membrane, SI-1 (polysulfone, hollow fiber membrane, length 1 m, manufactured by Asahi Kasei Corporation) at a pressure of 0.3 atm and 25 ° C. Filtration by the dead end method was performed. Table 5 shows the permeation rate and permeation rate of the aqueous gamma globulin solution after collecting 50 g of permeate.
Compared with the value of Example 3 (Table 4) after collecting 50 g of the permeate, the DNase treatment of the aqueous gamma globulin solution improved the permeation rate with any of the membranes.
[0032]
[Table 5]
[0033]
Embodiment 4
The same experiment as in Example 1 was performed except that an 8 wt% aqueous solution of gamma globulin was prepared. The DNA concentration at this time was 400 ± 30 ppb. The permeation rate of the aqueous gamma globulin solution after collecting 50 g of the permeate was 235 times higher than the permeation rate measured using an 8 wt% aqueous gamma globulin solution without DNase treatment.
[0034]
Embodiment 5
The same experiment as in Example 1 was performed, except that an aqueous gamma globulin solution having a concentration of 500 ppm was prepared. The permeation rate of the aqueous gamma globulin solution after collecting 50 g of the permeate was 11 times higher than the permeation rate measured using a 500 ppm gamma globulin aqueous solution without DNase treatment.
[0035]
Embodiment 6
After keeping 200 ml of an aqueous solution of blood coagulation factor IX (manufactured by Pharmacia AB, Nanotiv, derived from human plasma) at 37 ° C., 3 U of Micrococcal nuclease (manufactured by Worthington Biochemical) was added thereto, followed by gentle shaking for 1 hour in a thermostat. I let it. When the DNA concentration of the prepared aqueous solution of blood coagulation factor IX was measured, it was 7 ± 2 ppb. This blood coagulation factor IX aqueous solution was applied to a virus removal filter, Viresolve / 180 (manufactured by Millipore, effective membrane area 1/3 ft). 2 ) And filtration at a pressure of 0.3 atm and 25 ° C. by the dead end method. The permeation rate of the aqueous solution of blood coagulation factor IX after collecting 50 g of the permeate was 4.8 times higher than the permeation rate measured using the aqueous solution of blood coagulation factor IX not treated with DNase.
[0036]
Embodiment 7
After 200 ml of a 4 wt% human serum albumin aqueous solution (manufactured by Pharmacia AB) was kept at 37 ° C., 3 U of Micrococcal nuclease (manufactured by Worthington Biochemical) was added, followed by gentle shaking for 1 hour in a thermostat. When the DNA concentration of the prepared aqueous human serum albumin solution was measured, it was 43 ± 2 ppb. This human serum albumin aqueous solution was applied to a virus removal filter, Viresolve / 180 (Millipore, effective membrane area 1/3 ft). 2 ) And filtration at a pressure of 0.3 atm and 25 ° C. by the dead end method. The permeation rate of the aqueous solution of blood coagulation factor IX after collecting 50 g of the permeate was 56.3 times higher than the permeation rate measured using an aqueous solution of human serum albumin not treated with DNase.
[0037]
Embodiment 8
After 200 ml of an antithrombin (ATIII) aqueous solution (Pharmacia AB, Atenativ, derived from human plasma) was kept at 37 ° C., 3 U of Micrococo nuclease (Worthington Biochemical) was added, and the mixture was gently shaken for 1 hour in a constant temperature bath. Allowed to stir. When the DNA concentration of the prepared antithrombin aqueous solution was measured, it was 9 ± 2 ppb. This antithrombin aqueous solution was filtered using a virus removal filter, Viresolve / 180 (Millipore, effective membrane area 1/3 ft) 2 ) And filtration at a pressure of 0.3 atm and 25 ° C. by the dead end method. The permeation rate of the antithrombin IX aqueous solution after collecting 50 g of the permeate was 6.2 times higher than the permeation rate measured using the DNase-untreated blood coagulation factor IX aqueous solution.
[0038]
Embodiment 9
Virus removal filter, PLANOVA 35N (Asahi Kasei Corporation, effective membrane area 0.001m 2 ) Was immobilized on DNase. That is, a 10 mg / ml aqueous solution of CNBr adjusted to pH 10.5 was circulated through a PLanoVA 35N membrane at 25 ° C. for 60 minutes using a microtube pump (MP-3N, manufactured by Tokyo Rikakikai Co., Ltd.). After 60 minutes, the PLanoVA 35N membrane was washed with a 0.1 mol / l aqueous sodium hydrogen carbonate solution. Next, using a microtube pump, the ethanolamine solution adjusted to pH 9.1 was circulated through the PLANOVA 35N membrane at 25 ° C. for 60 minutes. This CNBr-activated PLANOVA 35N membrane was washed with a 0.5 mol / l aqueous sodium chloride solution, and then washed with ultrapure water. An aqueous hydrazine solution obtained by dissolving 150 ml of ultrapure water in 50 ml of hydrazine monohydrate was circulated at 25 ° C. for 10 hours using a microtube pump through a CNBr-activated PLANOVA 35N membrane. Ten hours later, the NH 2 The group-introduced PLANOVA 35N membrane was washed with ultrapure water. An aqueous solution of pH 10 obtained by dissolving 0.0082 g of dimethyl dibezimate dichloride in 200 ml of ultrapure water was treated with NH 3 2 It was circulated at 25 ° C. for 30 minutes using a microtube pump in the group-introduced PLANOVA 35N membrane. After washing the PLANOVA 35N membrane treated with dimethyl dibezimate dichloride with ultrapure water, 200 ml of a pH 8.5 8.5 unit DNase (Microc nuclease (manufactured by Worthington Biochemical)) aqueous solution at 25 ° C. for 18 hours using a micro tube pump. Circulated. After that, the DNase-immobilized PLanoVA 35N membrane was washed with ultrapure water. When the amount of DNase immobilized on the DNase-immobilized PLANOVA 35N membrane was compared with the amount of DNA degraded by a known amount of DNase in the aqueous solution, 11 units / 0.001 m 2 It was confirmed that DNase was immobilized on the DNASE-immobilized PLANOVA 35N membrane.
The same experiment as in Comparative Example 1 was performed except that DNase-immobilized PLANOVA 35N was used. The permeation rate after collecting 50 g of the permeate was 47% higher than that of Comparative Example 1, and the gamma globulin transmittance was 16% higher than that of Comparative Example 1.
[0039]
Embodiment 10
The dried polysulfone hollow fiber membrane (SI-1, nominal molecular weight cut-off 6000, manufactured by Asahi Kasei Corporation) was immersed in a 100% ethanol solution for 1 hour. Thereafter, the hollow fiber was immersed in a 50% ethanol + 50% hexane solution for 1 hour. Further, the hollow fiber was immersed in a 100% hexane solution for 1 hour. Glycerin contained in the hollow fiber membrane was removed by the above treatment.
The above polysulfone hollow fiber membrane (3 m) was mixed with a mixed solution of chlorodimethyl ether (7.72 g, manufactured by Tokyo Kasei Kogyo), stannic chloride (25 g, manufactured by Wako Pure Chemical), and hexane (228 ml of Wako Pure Chemical) (the above reagent) (5: 5: 90), and reacted at 28 ° C. for 6 hours. This chloromethylated porsulfone hollow fiber membrane has a wavelength of 760 cm from the infrared absorption spectrum. -1 In addition, infrared absorption based on a C-Cl bond was observed. Also, the chloromethylated porsulfone hollow fiber membrane prepared above was dissolved in deuterated chloroform. 1 1 H-NMR spectrum was measured. 1 From the 1 H-NMR spectrum, a peak based on a proton at the methylene site of the chloromethyl group was observed at 4.5 ppm. From the elemental analysis, it was confirmed that 0.43 chloromethyl groups were introduced per repeating unit of the polysulfone.
Next, the chloromethylated porsulfone hollow fiber membrane was immersed in 200 ml of an ethylenediamine solution, and an ethylenediamine-forming reaction was performed with gentle stirring for 20 minutes. The ethylenediamine-modified polysulfone hollow fiber membrane was 3300 cm from the infrared absorption spectrum. -1 To NH 2 Infrared absorption based on the group was observed. Also, 1 From the 1 H-NMR spectrum, the peak based on the proton at the methylene site of the chloromethyl group, which was observed at 4.5 ppm, almost disappeared. From the ion exchange capacity of the ethylenediamine-modified polysulfone hollow fiber membrane, it was confirmed that 0.06 ethylenediamine groups were introduced per repeating unit of the polysulfone.
The ethylenediamine-modified polysulfone hollow fiber membrane was immersed in an aqueous solution of pH 10 in which 0.0082 g of dimethyl dibezimate dichloride was dissolved in 200 ml of ultrapure water for 30 minutes at 25 ° C. After washing the polysulfone hollow fiber membrane that has been treated with dimethyl dibezimate dichloride with ultrapure water, it is immersed in a 200 ml aqueous solution of 1,000 unit DNase (Micrococ nuclease (Worthington Biochemical)) at 25 ° C. for 18 hours. I let it. Thereafter, the DNase-immobilized polysulfone hollow fiber membrane was washed with ultrapure water. When the amount of DNase immobilized on the DNase-immobilized polysulfone hollow fiber membrane was compared with the amount of DNA degraded by a known amount of DNase in the aqueous solution, 4 units / 0.001 m 2 It was confirmed that the amount of DNase was immobilized on the DNase-immobilized polysulfone hollow fiber membrane.
The same experiment as in Comparative Example 1 was performed except that the DNase-immobilized polysulfone hollow fiber membrane was used. The permeation rate after collecting 50 g of the permeate was 23% higher than that of the polysulfone hollow fiber membrane on which DNase was not immobilized, and the permeation rate of gamma globulin was 7% higher than that of Comparative Example 1.
[0040]
Embodiment 11
0.2M NaHCO 3 100 units of DNase (Microc coco nuclease (manufactured by Worthington Biochemical)) was dissolved in 10 ml of a pH 8.3 aqueous solution containing 0.5M NaCl. This DNase aqueous solution was injected into a coupling carrier for immobilizing a ligand (HiTrap NHS-activated HP column, manufactured by Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd.), and left at room temperature for 1 hour. Thereafter, 50 ml of a blocking aqueous solution (Block Ace 4-fold diluted solution, UK-B80, Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was flowed through the above prepared column. The enzyme immobilization rate of 85% was calculated from the enzyme concentration in the column effluent.
In the same manner as in Comparative Example 1, a 5000 ppm gamma globulin aqueous solution (pH 8.0) not treated with DNase was prepared. This gamma globulin aqueous solution was passed through a DNase-immobilized column at a rate of 1 ml / min. Next, a column-treated gamma globulin aqueous solution was used in the same manner as in Example 1 for a virus removal filter, PLANOVA 35N (manufactured by Asahi Kasei Corporation, effective membrane area 0.001 m). 2 ) And filtration at a pressure of 0.3 atm and 25 ° C. by the dead end method. The permeation rate after collecting 50 g of the permeate was 58 times higher than that of Comparative Example 1, and the transmittance of gamma globulin was 18% higher than that of Comparative Example 1.
[0041]
Embodiment 12
0.5 g of a polyester non-woven fabric was mixed in a mixed solution of chlorodimethyl ether (7.72 g, manufactured by Tokyo Kasei Kogyo), stannic chloride (25 g, manufactured by Wako Pure Chemical), and hexane (228 ml of Wako Pure Chemical) (moles of the above reagents). (The ratio was 5: 5: 90) and reacted at 28 ° C. for 6 hours to prepare a chloromethylated polyester nonwoven fabric. Next, the chloromethylated polyester non-woven fabric was immersed in 200 ml of an ethylenediamine solution, and an ethylenediamine-forming reaction was performed with gentle stirring for 20 minutes. Thereafter, the ethylenediamine-modified polyester nonwoven fabric was washed with ultrapure water.
An ethylenediamine-modified polyester nonwoven fabric was immersed in an aqueous solution of pH 10 in which 0.0082 g of dimethyl dibezimate dichloride was dissolved in 200 ml of ultrapure water for 30 minutes at 25 ° C. After washing the polyester non-woven fabric treated with dimethyl dibezimate dichloride with ultrapure water, it was immersed in a 200 ml aqueous solution of 1000 unit DNase (Micrococ nuclease (Worthington Biochemical)) at 25 ° C. for 18 hours. . Thereafter, the DNase-immobilized polyester nonwoven fabric was washed with ultrapure water. When the amount of DNase immobilized on the DNase-immobilized polyester nonwoven fabric was compared with the amount of DNA degraded by a known amount of DNase in the aqueous solution, 20 units / 0.001 m 2 It was confirmed that DNase was immobilized on the DNase-immobilized polyester nonwoven fabric.
The aqueous gamma globulin solution prepared in Comparative Example 1 was brought into contact with the DNase-immobilized polyester nonwoven fabric for 30 minutes. Thereafter, a gamma globulin aqueous solution was applied to a virus removal filter in the same manner as in Example 1, PLANOVA 35N (manufactured by Asahi Kasei Corporation, effective membrane area 0.001 m). 2 ) And filtration at a pressure of 0.3 atm and 25 ° C. by the dead end method. The permeation rate after collecting 50 g of the permeate was 34 times higher than that of Comparative Example 1, and the transmittance of gamma globulin was 15% higher than that of Comparative Example 1.
[0042]
Embodiment 13
Porcine Japanese encephalitis virus was added to the aqueous gamma globulin solution in Example 1, and 50 g of the solution (stock solution) was filtered according to Example 1 to collect a permeate. This is referred to as Experiment A. Porcine Japanese encephalitis virus was added to the gamma globulin aqueous solution in Comparative Example 1, and 50 g of the solution (stock solution) was filtered according to Comparative Example 1 to collect a permeate. This is referred to as Experiment B. Regarding the aqueous solution (undiluted solution) before filtration, the infectious titer of the virus in each of Experiments A and B was 8.2 log. When the virus infection titer in the permeate of Experiment A that had been treated with Microc coco nuclease was analyzed, the virus removal rate was 5.5. In addition, the virus infection titer in the permeate of Experiment B, which was not treated with Micrococcal nuclease, was analyzed to determine the virus removal rate, which was 5.8. Here, the virus removal rate (LRV) was based on the following definition.
LRV = -log ((virus infection titer in permeate) / (virus infection titer in stock solution))
The above results sufficiently satisfy the guidelines of the regulatory authorities on virus safety, and the present invention also enables highly efficient virus removal as in the conventional method.
[0043]
【The invention's effect】
According to the method of the present invention, by treating the aqueous protein solution with DNase, when removing impurities such as viruses from the aqueous protein solution, the filtration rate and permeability of the aqueous protein solution are improved as compared with conventional methods, As a result, production efficiency is improved, and manufacturing costs can be reduced.