JP2004081147A - Ceramide kinase gene promoter dna - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、各種セラミドおよびその各種光学異性体をリン酸化し、神経性疾患、炎症、感染症、血栓症、免疫疾患、ＨＩＶ、２型糖尿病、肥満、敗血症、心疾患、脂質代謝異常、動脈硬化、癌およびその転移の原因となりうるセラミドキナーゼのプロモーター活性を有する新規ＤＮＡおよび該プロモーター活性を調節する物質のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
スフィンゴ脂質は従来、グリセロリン脂質およびコレステロールとならぶ細胞膜の主要な構成成分の一つと考えられてきた。グリセロリン脂質は細胞膜構造の維持だけでなく、その代謝産物として多くの生理活性物質を産生させることが知られてきたが、スフィンゴ脂質についてはその代謝産物の生理活性については最近までほとんど知られていなかった。近年、いくつかのスフィンゴ脂質の代謝産物にアポトーシスの誘導や細胞増殖刺激作用などの生理活性が知られるようになり、スフィンゴ脂質の代謝酵素が生理的反応や種々の病態に密接に関連する可能性が示唆されるようになった。なかでも、セラミドは多くの細胞機能を調節するレギュレーターとして注目を集めている（Ｈａｎｎｕｎ， Ｙ． Ａ． ａｎｄ Ｏｂｅｉｄ， Ｌ． Ｍ． （１９９５） ＴＩＢＳ ２０， ７３−７７）。
【０００３】
例えば、セラミドはＴＮＦ−αやＩＬ−１βなどの炎症性サイトカインのセカンドメッセンジャーとして機能し、ホスホリパーゼＡ２等のアラキドン酸経路を活性化することが知られている（Ｓｐｉｅｇｅｌ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ８， １５９−１６７およびＭａｔｈｉａｓ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９， ５１９−５２２参照）。すなわち、セラミドを各種炎症性疾患の増悪因子として捕らえることができる。また、ＨＩＶに感染した患者におけるＣＤ４＋Ｔ細胞のアポトーシスを伴う減少や脳細胞への感染の際にもセラミドが増悪因子として機能しているという報告がある（Ｃｏｌｉｎｅ， Ｍ． Ｇ． ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ａｓｓｏｃ． Ａｍ． Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ １０９， １４６−１５３およびＷｉｌｔ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． ３７， ３８１−３９４参照）。さらには、２型糖尿病や肥満においてＴＮＦ−αがインシュリン抵抗性を引き起こすことが知られているが、セラミドはその下流においても増悪因子として機能していると考えられている（Ｂｅｇｕｍ， Ｎ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３８， ２１４−２２０およびＨｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ， Ｇ． Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１， ６６５−６６８参照）。また、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）等が引き金になり起こる敗血症においてもセラミドがセカンドメッセンジャーとして機能していると報告されている（Ｂｅｕｔｌｅｒ， Ｂ． ａｎｄ Ｋｒｕｙｓ， Ｖ． （１９９５） Ｊ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２５， Ｓ１−Ｓ８ 参照）。さらには、動脈硬化層形成の引き金となるＬＤＬの凝集反応においてもスフィンゴミエリナーゼの活性化に伴うセラミドの上昇が増悪因子として機能するという報告がある（Ｓｃｈｉｓｓｅｌ， Ｓ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９８， １４５５−１４６４参照）。
【０００４】
またこれらとは逆に、癌治療における放射線療法や化学療法において、癌細胞のアポトーシスをセラミドが促進することが知られている（Ｍｉｃｈａｅｌ， Ｊ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７， ３６００−３６０５およびＢｏｓｅ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｃｅｌｌ ８２， ４０５−４１４およびＪａｆｆｒｅｚｏｕ， Ｊ． Ｐ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） ＥＭＢＯＪ． １５， ２４１７−２４２４参照）。
【０００５】
一方、セラミドの代謝産物であるセラミド−１−リン酸およびその生成酵素であるセラミドキナーゼに関してもいくつかの生理活性が知られている。例えば、脳のシナプスにおいて、カルシウム刺激に応答してセラミドキナーゼが活性化され、生成したセラミド−１−リン酸がシナプスからの神経伝達物質の放出を調節している（Ｂａｊｊａｌｉｅｈ， Ｓ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４， １４３５４−１４３６０およびＳｈｉｎｇｈａｌ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ６１， ２２７９−２２８５参照）。したがって、薬剤やプロモーター等によりセラミドキナーゼの活性を調節することは、アルツハイマー病を含めた各種神経性疾患の治療法となる可能性がある。また、セラミド−１−リン酸は上述した各種セラミドの機能をブロックする作用があると考えられている（Ｄｒｅｓｓｌｅｒ， Ｋ． Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９０）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５， １４９１７−１４９２１参照）。すなわち、慢性関節炎等の各種炎症性疾患、ＨＩＶ、インシュリン抵抗性が引き金となる２型糖尿病や肥満、さらには敗血症、動脈硬化といったセラミドが増悪因子として作用する疾患をセラミド−１−リン酸により抑制できると考えられる。さらに、セラミドキナーゼは好中球の貪食作用・活性化に関与していることから（Ｈｉｎｋｏｖｓｋａ−Ｇａｌｃｈｅｖａ ＶＴｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３， ３３２０３−３３２０９参照）、各種感染症の進展や虚血後の臓器障害に関与する可能性が考えられる。したがって、プロモーター活性調節等によりセラミドキナーゼを活性化することは、神経性疾患、炎症、感染症、ＨＩＶ、２型糖尿病、肥満、敗血症、脂質代謝異常および動脈硬化の治療法となる可能性がある。逆に、癌の放射線療法や化学療法においてはセラミドキナーゼ活性を抑制する事により、セラミド量を保ち、治療効果を向上させる可能性も考えられる。さらに、セラミドキナーゼは心臓や脾臓、血小板、末梢白血球で遺伝子の発現量が高いため、心疾患や血栓症、免疫疾患に関与する可能性も考えられる（Ｓｕｇｉｕｒａ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７， ２３２９４−２３３３０参照）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、セラミドキナーゼ遺伝子の転写制御に関わるプロモーター領域を特定し、該プロモーターの活性を調節する物質のスクリーニング方法を提供することにある。より具体的には、神経性疾患、炎症、感染症、血栓症、免疫疾患、ＨＩＶ、２型糖尿病、肥満、敗血症、心疾患、脂質代謝異常、動脈硬化、癌およびその転移等の予防薬および治療薬の候補物質を探索するための新規な手段を提供することにある。治療または予防薬を試験するための新規な方法および該方法において用いられるＤＮＡが提供される。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（１） 下記のａ）乃至ｃ）のいずれか一つに記載されたＤＮＡ：
ａ）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
ｂ）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ；
ｃ）上記ａ）に記載のＤＮＡと９５％以上のヌクレオチド配列同一性を有し、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ。
（２） 形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２ ＳＡＮＫ ７０８０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−８０８７）が保有する組換えプラスミドにおいて、ホタルルシフェラーゼをコードするヌクレオチド配列の５’末端に連結されている２５１５ｂｐのＤＮＡ。
（３） 下記のａ）乃至ｃ）のいずれか一つに記載されたＤＮＡ：
ａ）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１０８７で示されるヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号２５１５で示されるヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
ｂ）上記ａ）に記載のＤＮＡのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ；
ｃ）上記ａ）に記載のＤＮＡと９５％以上のヌクレオチド配列同一性を有し、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ。
（４） 形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２ ＳＡＮＫ ７０８０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−８０８７）が保有する組換えプラスミドにおいて、ホタルルシフェラーゼをコードするヌクレオチド配列の５’末端に連結されている２５１５ｂｐのＤＮＡ中の３’末端側の１４２９ｂｐからなるＤＮＡ。
（５） 配列表の配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含み、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ。
（６） 配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１０８７から２５１５で示されるヌクレオチド配列を含み、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ。
（７） 下記のａ）乃至ｄ）に表される特徴を有するＤＮＡ：
ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１０８７から２５１５で示されるヌクレオチド配列を含み；
ｂ）ヌクレオチド番号２５１５で示されるヌクレオチドを３’末端とし；
ｃ）ヌクレオチド番号１０８７で示されるヌクレオチドの５’末端に少なくとも１ｂｐ、最長で１０８６ｂｐのポリヌクレオチドが付加し；
ｄ）哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有する。
（８） （１）乃至（７）のいずれか１つに記載のＤＮＡを含む組換えプラスミド。
（９） （１）乃至（７）のいずれか１つに記載のＤＮＡの３’末端に、タンパク質をコードするＤＮＡが連結されていることを特徴とする、（８）記載の組換えプラスミド。
（１０） タンパク質が、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、からなる群から選択されることを特徴とする、（９）記載の組換えプラスミド。
（１１） タンパク質がルシフェラーゼであることを特徴とする、（９）または（１０）記載の組換えプラスミド。
（１２） 形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２ ＳＡＮＫ７０８０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−８０８７）が保有する組換えプラスミド、ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２。
（１３） （８）乃至（１２）のいずれか１つに記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞。
（１４） 宿主細胞が原核細胞である、（１３）記載の宿主細胞。
（１５） 宿主細胞が真核細胞である、（１３）記載の宿主細胞。
（１６） 宿主細胞が哺乳動物由来の細胞である、（１３）または（１５）記載の宿主細胞。
（１７） 形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２ ＳＡＮＫ７０８０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−８０８７）。
（１８） 下記の工程ｉ）からｉｉｉ）からなる、セラミドキナーゼ遺伝子プロモーター活性調節作用を有する物質のスクリーニング方法：
ｉ）（８）乃至（１２）のいずれか一つに記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞を被験物質の存在下、または非存在下で培養する工程；
ｉｉ）上記ｉ）の宿主細胞における、（８）乃至（１２）のいずれか一つに記載の組換えプラスミド中の、（１）乃至（７）のいずれか１つに記載のＤＮＡの３’末端に連結されているＤＮＡにコードされているタンパク質の発現量を検出する工程；
ｉｉｉ）上記ｉｉ）の検出結果を、被験物質の存在下で培養した細胞と被験物質非存在下で培養した細胞との間で比較する工程。
（１９） 下記の工程ｉ）からｉｉｉ）からなる、神経性疾患、炎症、感染症、血栓症、免疫疾患、ＨＩＶ、２型糖尿病、肥満、敗血症、心疾患、脂質代謝異常および動脈硬化から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防効果を有する物質のスクリーニング方法：
ｉ）（８）乃至（１２）のいずれか一つに記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞を被験物質の存在下、または非存在下で培養する工程；
ｉｉ）上記ｉ）の宿主細胞における、（８）乃至（１２）のいずれか一つに記載の組換えプラスミド中の、（１）乃至（７）のいずれか１つに記載のＤＮＡの３’末端に連結されているＤＮＡにコードされているタンパク質の発現量を検出する工程；
ｉｉｉ）上記ｉｉ）の検出結果を、被験物質の存在下で培養した細胞と被験物質非存在下で培養した細胞との間で比較し、発現量が増加している場合、該被験物質が該治療または予防効果を有すると判断する工程。
（２０） 下記の工程ｉ）からｉｉｉ）からなる、癌およびその転移の治療または予防効果を有する物質のスクリーニング方法：
ｉ）（８）乃至（１２）のいずれか一つに記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞を被験物質の存在下、または非存在下で培養する工程；
ｉｉ）上記ｉ）の宿主細胞における、（８）乃至（１２）のいずれか一つに記載の組換えプラスミド中の、（１）乃至（７）のいずれか１つに記載のＤＮＡの３’末端に連結されているＤＮＡにコードされているタンパク質の発現量を検出する工程；
ｉｉｉ）上記ｉｉ）の検出結果を被験物質の存在下で培養した細胞と被験物質非存在下で培養した細胞との間で比較し、発現量が減少している場合、該被験物質が該治療または予防効果を有すると判断する工程。
（２１） 下記の工程ｉ）乃至ｉｉｉ）からなる、神経性疾患、炎症、感染症、血栓症、免疫疾患、ＨＩＶ、２型糖尿病、肥満、敗血症、心疾患、脂質代謝異常および動脈硬化から選択される一つまたは二つ以上の疾患の治療または予防効果を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡを同定する方法：
ｉ）（８）乃至（１２）のいずれか一つに記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞（以下「細胞Ａ」という）と、細胞Ａを被験ｃＤＮＡが哺乳動物用発現ベクターに組み込まれた組換えプラスミドで形質転換することにより該被験ｃＤＮＡを一過性または安定的に発現する細胞（以下「細胞Ｂ」という）と、細胞Ａを該被験ｃＤＮＡを含まない別の組換えプラスミドで形質転換した細胞（以下「細胞Ｃ」という）からなる群から選択される細胞を個別に培養する工程；
ｉｉ）上記ｉ）の細胞Ｂおよび細胞ＣまたはＡにおける、（８）乃至（１２）のいずれか一つに記載の組換えプラスミド中の、（１）乃至（７）のいずれか１つに記載のＤＮＡの３’末端に連結されているＤＮＡにコードされているタンパク質の発現量を測定する工程；
ｉｉｉ）上記ｉｉ）の測定結果を比較し、該タンパク質の発現量が細胞Ｂにおいて細胞ＣまたはＡよりも増加している場合、該ｃＤＮＡがコードするタンパク質が該治療または予防効果を有すると判断する工程。
（２２） 下記の工程ｉ）乃至ｉｉｉ）からなる、癌およびその転移の治療または予防効果を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡを同定する方法：
ｉ）（８）乃至（１２）のいずれか一つに記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞（以下「細胞Ａ」という）と、細胞Ａを被験ｃＤＮＡが哺乳動物用発現ベクターに組み込まれた組換えプラスミドで形質転換することにより該被験ｃＤＮＡを一過性または安定的に発現する細胞（以下「細胞Ｂ」という）と、細胞Ａを該被験ｃＤＮＡを含まない別の組換えプラスミドで形質転換した細胞（以下「細胞Ｃ」という）からなる群から選択される細胞を個別に培養する工程；
ｉｉ）上記ｉ）の細胞Ｂおよび細胞ＣまたはＡにおける、（８）乃至（１２）のいずれか一つに記載の組換えプラスミド中の、（１）乃至（７）のいずれか１つに記載のＤＮＡの３’末端に連結されているＤＮＡにコードされているタンパク質の発現量を測定する工程；
ｉｉｉ）上記ｉｉ）の測定結果を比較し、該タンパク質の発現量が細胞Ｂにおいて細胞ＣまたはＡよりも減少している場合、該ｃＤＮＡがコードするタンパク質が該治療または予防効果を有すると判断する工程。
（２３） セラミドキナーゼ遺伝子プロモーター活性を調節する物質を分離する方法であって、（１）乃至（７）のいずれか一つに記載のＤＮＡに該物質を含む試料を接触させ、次いで、該ＤＮＡに結合した該物質を分離することを特徴とする方法。
（２４） （１）乃至（７）のいずれか一つに記載のＤＮＡにヒト細胞の核抽出液を含む試料を接触させ、次いで、該ＤＮＡに結合したタンパク質を分離することを特徴とする、セラミドキナーゼ遺伝子プロモーター活性調節因子の検出方法。
（２５） 下記の工程ｉ）およびｉｉ）を含む、セラミドキナーゼ遺伝子プロモーター活性を調節する活性を有する物質を選抜する方法：
ｉ）（１）乃至（７）のいずれか一つに記載のＤＮＡを標識したものに、ヒト細胞の核抽出液および被験物質を加えたもの、ならびにヒト細胞の核抽出液のみを加えたものをそれぞれ調製する；
ｉｉ）上記ｉ）の各混合物試料を電気泳動し、標識されたＤＮＡを含むバンドを検出し、ヒト細胞の核抽出液のみを加えた試料で見出されるバンドと被験物質を加えた試料で見出されるバンドの間で移動度を比較し、移動度が増大するものを選択する。
（２６） 該標識が放射標識である（２５）記載の方法。
（２７） 下記ａ）乃至ｂ）のいずれかで表される特徴を有し、セラミドキナーゼ遺伝子プロモーター活性を調節する活性を持つヌクレオチドまたはその誘導体：
ａ）配列表の配列番号１に記載のヌクレオチド配列中の、連続した少なくとも１０ヌクレオチドからなる；
ｂ）配列表の配列番号１に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列中の、連続した少なくとも１０ヌクレオチドからなる；
に関する。
【０００８】
本発明者らは、ヒトゲノムにおけるセラミドキナーゼ遺伝子の転写開始点と予測される部位（配列表の配列番号１のヌクレオチド番号２３９７）を「１」として、その５’末端側上流２３９６ヌクレオチドの部位から、３’末端側下流１１９ヌクレオチド（以下、「−２３９６〜＋１１９」のように表記する。配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１〜２５１５）のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、および「−１３１０〜＋１１９」のヌクレオチド配列からなるＤＮＡにルシフェラーゼをコードするＤＮＡを連結したレポーター遺伝子をヒトＨＥＫ２９３細胞に導入し、ルシフェラーゼの産生量を測定することにより、セラミドキナーゼ遺伝子の「−２３９６〜＋１１９」領域がプロモーター活性を有することを見出した。また本発明者らは、ルシフェラーゼ遺伝子に連結するセラミドキナーゼ遺伝子の５’末端側領域を「−１３１０〜＋１１９」（配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１０８７〜２５１５）に短縮しても、同等のプロモーター活性があることも見いだした。また、プロモーター配列解析ソフトを用いて、プロモーター活性の発現により重要な領域を絞り込む予測をした結果、−１１１０〜−８６１（配列番号１のヌクレオチド番号１２８６〜１５３５）の領域が予測された。この領域にはＭＬＴＦ（Ｍａｊｏｒ ｌａｔｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）の結合配列として予測される配列などが含まれていた。本発明者らは、さらに、上記プロモーター活性を有するＤＮＡを用いることにより、該プロモーター活性を調節する化合物をスクリーニングできることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
本発明のＤＮＡは、哺乳動物由来の細胞においてプロモーター活性を有する限り、セラミドキナーゼ遺伝子の５’末端側上流域のいかなるヌクレオチド配列を含んでいてもよい。好適には、配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡを挙げることができるが、本発明はこれに限定されず、配列表の配列番号１に記載のヌクレオチド配列の少なくとも一部を含む。また、より好適には、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１０８７〜２５１５に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡを挙げることができ、哺乳動物由来の細胞においてプロモーター活性を有する限り、このＤＮＡの５’末端側に任意のヌクレオチド配列が付加していても良い。好適には１乃至１０８６塩基長の任意のヌクレオチド配列からなるＤＮＡが付加したものが挙げられるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のＤＮＡは、ヒトゲノムより作成した遺伝子ライブラリーから、例えば、ヒトセラミドキナーゼｃＤＮＡのヌクレオチド配列（Ｓｕｇｉｕｒａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （２００２） ２７７， ２３２９４−２３３３０）の５’末端側をプローブとして利用したスクリーニングにより単離することができる。または、この配列の情報もしくはヒトゲノムプロジェクトにより公開された配列情報に基いて、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）により、ライブラリーのスクリーニングの工程を経ずに直接本発明のＤＮＡを増幅することもできる。
【００１１】
なお、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から２５１５に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挿入されている組換えプラスミドｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２で形質転換した大腸菌、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２ ＳＡＮＫ ７０８０２は、２００２年（平成１４年）６月２１日付で独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに国際寄託され、受託番号 ＦＥＲＭＢＰ−８０８７が付されている。したがって、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から２５１５に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡは、当該大腸菌から取得することもできる。また、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１０８７から２５１５に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡは、ＳＡＮＫ７０８０２が保有する組換えプラスミドｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２から、ＰＣＲ法を利用して取得することができる。
【００１２】
なお、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、天然型のプロモーターＤＮＡのヌクレオチド配列の一部を他のヌクレオチドへの置換やヌクレオチドの欠失、付加などの改変により、天然型のプロモーターＤＮＡと同等のプロモーター活性を有するＤＮＡを調製することが可能である。このように天然型のヌクレオチド配列においてヌクレオチドが置換、欠失、もしくは付加したヌクレオチド配列を有し、天然型のプロモーターＤＮＡと同等のプロモーター活性を有するＤＮＡもまた本発明のＤＮＡに含まれる。ヌクレオチド配列の改変は、例えば、制限酵素あるいはＤＮＡエキソヌクレアーゼによる欠失導入、部位特異的変異誘発法による変異導入、変異プライマーを用いたＰＣＲ法によるプロモーター配列の改変、合成変異ＤＮＡの直接導入などの方法により行うことができる。これらのうち好適なものは、配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列または配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１０８７からヌクレオチド番号２５１５で示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡである。
【００１３】
また、本発明のＤＮＡとしては、配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列または配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１０８７からヌクレオチド番号２５１５で示されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含むものが挙げられる。このようにハイブリダイズし得るＤＮＡは、プロモーター活性を有するものであればよい。このようなＤＮＡは、配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列または配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１０８７からヌクレオチド番号２５１５で示されるヌクレオチド配列と、通常、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９５％以上のヌクレオチド配列の同一性を有する。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型ＤＮＡ、人為的に改変した変異型ＤＮＡ、異種生物由来の相同ＤＮＡ等が含まれる。
【００１４】
本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションを、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ 塩化ナトリウム、０．０７５Ｍ クエン酸ナトリウム）またはこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７℃乃至４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。また、さらに０．１×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行なっても良い。
【００１５】
このようにして得られた本発明のＤＮＡがプロモーター活性を有するか否かは、下記に説明するように、本発明のＤＮＡの３’末端側下流にルシフェラーゼ等のマーカー遺伝子を連結したもの（以下「レポーター遺伝子」という）で哺乳動物細胞を形質転換し、この形質転換細胞におけるマーカー遺伝子の発現が亢進されるか否かを調べることによって確認することができる。
【００１６】
以下、本発明のＤＮＡを含んだレポーター遺伝子により哺乳動物細胞を形質転換する方法について記載する。
【００１７】
この方法において、本発明のＤＮＡの３’末端側に連結されるマーカー遺伝子にコードされるマーカータンパク質は、宿主である哺乳動物細胞が本発明の方法の一連の過程において産生し得る他のいかなるタンパク質とも区別可能なもの（好ましくは、形質転換前の哺乳動物細胞が該マーカータンパク質と同一または類似のタンパク質をコードする遺伝子を持たないようなもの）であればよい。例えば、マーカータンパク質が該細胞に対して毒性を有するようなものや、該細胞が感受性を有する抗生物質の耐性を付与するものであるような場合でも、マーカー遺伝子の発現の有無は細胞の生存率で判定することが可能である。しかしながら、本発明で用いられるマーカー遺伝子としてより好ましいものは、発現量を特異的かつ定量的に検出することができる（例えば該マーカー遺伝子にコードされるタンパク質に対する特異的抗体が取得されているような）構造遺伝子である。さらに好ましくは、外来の基質と特異的に反応することにより定量的測定が容易な代謝産物を生じるような酵素等をコードする遺伝子である。そのようなものとして、以下に挙げるようなタンパク質をコードする遺伝子を例示することができるが、本発明はそれらに限定されない：
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ： クロラムフェニコールにアセチル基を付加する。いわゆるＣＡＴアッセイ等で検出可能。プロモーターを組み込むだけでレポーターアッセイ用のベクターを調製できるベクターとしてｐＣＡＴ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）が市販されている；
ホタルルシフェラーゼ： ルシフェリンを代謝した際に生じる生物発光を測定することにより定量する。同じくレポーターアッセイ用のベクターとしてｐＧＢ−Ｂ２ベクター（東洋インキ製造株式会社製）が市販されている；
β−ガラクトシダーゼ： 呈色反応、蛍光または化学発光でそれぞれ測定可能な基質がある。レポーターアッセイ用のベクターとしてｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）が市販されている；
分泌型アルカリホスファターゼ： 呈色反応、生物発光または化学発光でそれぞれ測定可能な基質がある。レポーターアッセイ用のベクターとしてｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ（クロンテック社製）が市販されている；
緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）： 酵素ではないが、自らが蛍光を発するので直接定量できる。同じくレポーターアッセイ用のベクターとしてｐＥＧＦＰ−１（クロンテック社製）が市販されている。
【００１８】
培養細胞株に発現プラスミドを導入する方法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ， Ｈ． ａｎｄ Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ， Ｇ． （１９８３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １１， １２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ， Ｆ． Ｌ． ａｎｄｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ， Ａ． Ｊ． （１９７３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２， ４５６−４５７）、電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． （１９８２） ＥＭＢＯ Ｊ． １， ８４１−８４５）、リポフェクション法（Ｌｏｐａｔａ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２， ５７０７−５７１７， Ｓｕｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｍｉｌｍａｎ （１９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４， １６４１−１６４３）等を挙げることができるが、これらに限定されず、本発明の属する技術分野において汎用される他の方法も採用することができる。ただし、培養細胞株がいわゆる浮遊細胞である場合は、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法以外の方法を用いることが好ましい。いずれの方法においても、用いる細胞に応じて、至適化されたトランスフェクション条件を用いる。
【００１９】
このようにして本発明のＤＮＡを含むレポーター遺伝子をトランスフェクションした細胞を培養すると、マーカー遺伝子の転写が促進される。培養の条件としては、細胞が生存して、タンパク質の生産が可能な条件であればよいが、好ましくは、使用される細胞株に適合した培地（ウシ胎児血清等の血清成分を添加してもよい）を使用し、４乃至６％（最も好適には５％）の炭酸ガスを含む空気存在下、３６乃至３８℃（最も好適には３７℃）で２乃至３日間（最も好適には２日間）培養する。
【００２０】
以下、本発明のＤＮＡの使用方法について述べる。
１）誘導型発現ベクターとしての利用
本発明のＤＮＡが、ある特異的な刺激によりプロモーター活性を表すことが判明した場合、所望の遺伝子の上流に本発明のＤＮＡを挿入したベクターなどを作製して体細胞に導入し、該刺激を与えることにより、該所望の遺伝子を誘導的に発現させることができる。
２）ＤＮＡによる拮抗阻害を利用したＤＮＡのプロモーター活性調節
本発明のＤＮＡのプロモーター活性の調節には、該プロモーターＤＮＡのヌクレオチド配列と同一の配列、または該プロモーターＤＮＡのヌクレオチド配列と相補的な配列、の少なくとも一部を含むＤＮＡ（その誘導体を含む。以下「部分配列」という）を用いることができる。このような部分配列を用いることにより、該部分配列自体がプロモーター活性を有するか否かを問わず、上記プロモーターＤＮＡとこれに結合しうるタンパク質（例えば、転写因子）との結合を拮抗阻害する方法を実施することが可能である。例えば、該部分配列が、本発明のＤＮＡ配列上においてそのプロモーター活性を阻害するタンパク質の結合部位に相当する場合には、この方法によりプロモーター活性を促進することができ、逆にプロモーター活性を促進するタンパク質（転写因子を含む）の結合部位に相当する場合には、プロモーター活性を阻害することができる。このような拮抗阻害に用いる部分配列ＤＮＡは、通常少なくとも６ヌクレオチド以上、好ましくは１０ヌクレオチド以上の鎖長を有する。また、拮抗阻害に用いるために選択される部分配列の種類としては、例えば、プロモーター上の転写因子の結合コンセンサス部位を含む配列が挙げられる。また、そうした部分配列ＤＮＡの誘導体としては、いくつかの部分配列を連結したものや、それをアデノウイルスベクター等に組み込んで動物細胞への遺伝子導入を可能にしたもの、また、ＤＮＡの３’末端もしくは５’末端にビオチンを連結したもの等が用いられ得る。
３）プロモーター活性を調節するタンパク質のスクリーニング
本発明のＤＮＡのプロモーター活性の調節には、上記のような部分配列等を用いた拮抗阻害の他に、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節するタンパク質を利用する方法を用いることもできる。本発明のＤＮＡは、そのプロモーター活性を調節するタンパク質のスクリーニングに利用することが可能である。したがって、本発明は、下記に示すような、該ＤＮＡのプロモーター活性を調節するタンパク質のスクリーニング方法に関する。そのようなタンパク質としては、直接本発明のＤＮＡに結合してそのプロモーター活性を促進あるいは阻害するタンパク質の他に、細胞膜受容体や細胞内タンパク質に作用して間接的に本発明のＤＮＡのプロモーター活性を促進あるいは阻害するタンパク質が含まれる。
【００２１】
３−１）プロモーターＤＮＡに結合するタンパク質のスクリーニング
この方法は、本発明のＤＮＡに被験タンパク質試料を接触させ、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質を選択する工程を含む。このような方法としては、例えば、本発明のプロモーターＤＮＡを用いた、これに結合するタンパク質のアフィニティー精製が挙げられる。具体的な方法の一例を示せば、本発明のプロモーターＤＮＡをビオチン化し、ストレプトアビジンを結合した磁気ビーズに結合させてＤＮＡアフィニティービーズを作製する。次いで、これを細胞の核抽出液とインキュベートして本発明のＤＮＡと特異的に結合する核抽出液中のタンパク質を精製し、この構造を決定する。これにより、直接本発明のＤＮＡと結合するタンパク質、およびＤＮＡ結合活性は持たないがサブユニットとして該タンパク質と複合体を形成し本発明のＤＮＡに結合するタンパク質が精製できる（Ｇａｂｒｉｅｌｓｅｎ， Ｏ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７， ６２５３−６２６７、Ｓａｖｏｙｓｋｙ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９， １８３９−１８４６）。
【００２２】
３−２）プロモーター活性を指標にしたタンパク質のスクリーニング
この方法は、レポーター遺伝子を保持する細胞に被験ＤＮＡを導入し、マーカー遺伝子の発現を調節する発現産物を選択する工程を含む。このような方法には、例えば、酵母や動物細胞を用いたｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ法が含まれる。具体的には、本発明のＤＮＡとマーカー遺伝子を挿入したレポーター遺伝子を細胞に安定に導入し、次いでこれに遺伝子ライブラリーを導入して、レポーター遺伝子の発現促進あるいは発現阻害を示すようなクローンを選択し、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質を選択する。この方法により、直接本発明のＤＮＡと結合するタンパク質の他に、細胞内の内在性タンパク質に作用して間接的に本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節するタンパク質を得ることができる。なお、酵母のｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ法（Ｌｉ， Ｊ． Ｊ． ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ， Ｉ．， （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２， １８７０−１８７３、Ｗａｎｇ， Ｍ． Ｍ． ａｎｄ Ｒｅｅｄ， Ｒ． Ｒ．， （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６４， １２１−１２６）などで、「Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ ｓｙｓｔｅｍ（クロンテック社）」等がキットとして発売されている。
【００２３】
さらに他の一つの態様は、本発明のＤＮＡを含むレポーター遺伝子を保持する細胞に被験試料を接触させ、マーカー遺伝子の発現を調節するタンパク質を選択する工程を含む。具体的な方法の一例としては、本発明のＤＮＡとマーカー遺伝子が挿入されたレポーター遺伝子を安定に導入した細胞と、被験試料（例えば、遺伝子ライブラリーを導入した細胞の培養上清）とをインキュベートして、マーカー遺伝子の発現促進あるいは発現阻害を示すようなタンパク質を選択する。この方法では、細胞膜受容体などを介して間接的に本発明のＤＮＡのプロモーター活性に影響を与えるタンパク質が得られる。
４）プロモーター活性を調節するタンパク質をコードするｃＤＮＡのスクリーニング方法
本発明のＤＮＡを用いて、そのプロモーター活性を調節するタンパク質をコードするＤＮＡを直接単離することも可能である。本発明は、また、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節するタンパク質をコードするｃＤＮＡのスクリーニング方法に関する。このスクリーニング方法の一つの態様は、本発明のＤＮＡに被験ＤＮＡの発現産物を接触させ、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡを選択する工程を含む。このような方法には、例えば、サウスウエスタン法が含まれる。具体的には、遺伝子ライブラリーを導入した大腸菌で各タンパク質を発現させ、これらをフィルター膜に転写した後、本発明のＤＮＡをプローブとして直接ブロットし、該ＤＮＡプローブと結合するタンパク質を発現するクローンを選択して、これをコードする遺伝子を単離する。この方法により本発明のＤＮＡに結合する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を得ることができる（実験医学別冊 バイオマニュアルシリーズ「転写因子研究法」（株）羊土社刊、１７７−１８８頁参照）。
【００２４】
他の一つの態様は、本発明のＤＮＡを含むレポーター遺伝子を保持する細胞に被験ｃＤＮＡを導入し、マーカー遺伝子の発現を調節する発現産物をコードするｃＤＮＡを選択する工程を含む。このような方法には、例えば、上記した酵母や動物細胞を用いたｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ法が含まれる。
【００２５】
すなわち、本発明のＤＮＡとマーカー遺伝子を挿入したレポーター遺伝子を哺乳動物由来の培養細胞に安定に導入した細胞（以下「細胞Ａ」という）に、さらに該細胞に哺乳動物細胞用発現ベクターに被験ｃＤＮＡが挿入された組換えプラスミドを導入した細胞（以下「細胞Ｂ」という）を培養する。比較対照としては、細胞Ａをそのまま培養するか、あるいは、細胞Ａに被験ｃＤＮＡを含まない哺乳動物細胞用発現ベクターや、被験ｃＤＮＡを含んでいてもそれが発現しない組換えプラスミドを導入した細胞（以下「細胞Ｃ」という）を培養する。細胞Ｂと、細胞Ａまたは細胞Ｃとの間で、マーカー遺伝子の発現量を比較し、マーカー遺伝子の発現を促進するかまたは阻害するようなｃＤＮＡクローンを選択する。この方法では、本発明のＤＮＡと直接結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡだけでなく、細胞内の内在性タンパク質に作用して間接的に本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節するタンパク質をコードするｃＤＮＡも得ることができる。
【００２６】
さらに他の一つの態様は、本発明のＤＮＡを含むレポーター遺伝子を保持する細胞に被験ｃＤＮＡの発現産物を接触させ、マーカー遺伝子の発現を調節する発現産物をコードするｃＤＮＡを選択する工程を含む。具体的な方法の一例を示せば、本発明のＤＮＡとマーカー遺伝子を挿入したレポーター遺伝子を安定に導入した細胞と、被験ｃＤＮＡの発現産物（例えば、ｃＤＮＡライブラリーを導入した細胞の培養上清）とをインキュベートして、マーカー遺伝子の発現促進あるいは発現阻害を示すようなタンパク質あるいはそれをコードするｃＤＮＡを単離する。この方法により細胞膜受容体などを介して間接的に本発明のＤＮＡのプロモーター活性に作用するタンパク質をコードするｃＤＮＡを得ることができる。
５）プロモーター活性を調節する化合物のスクリーニング
本発明のＤＮＡを用いて、そのプロモーター活性を調節する化合物のスクリーニングを行うことも可能である。すなわち本発明は、下記に示すような、該ＤＮＡのプロモーター活性を調節する化合物のスクリーニング方法に関する。
【００２７】
５−１）プロモーターとタンパク質との結合を指標としたスクリーニング
この方法は、被験化合物の存在下で本発明のＤＮＡと被験試料とを接触させ、本発明のＤＮＡと被験試料中のタンパク質との結合を促進または阻害する化合物を選択する工程を含む。具体的には例えば、細胞の核抽出液を、本発明のＤＮＡを検出可能な標識を付したプローブと結合させ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、核抽出液中のタンパク質と本発明のＤＮＡとの複合体のバンドをゲルシフト法により検出する（実験医学別冊 バイオマニュアルシリーズ「転写因子研究法」（株）羊土社刊、１０７−１１２頁参照）という方法が挙げられる。検出可能な標識としては、放射性同位元素標識、蛍光色素標識、ビオチン標識等を挙げることができるが、好適には放射性同位元素標識である。ＤＮＡプローブ添加の際、被験化合物も添加し、核抽出液中のタンパク質と本発明のＤＮＡとの複合体のバンドの形成を促進あるいは阻害する化合物を選択する。この方法では、直接本発明のＤＮＡに作用する化合物および本発明のＤＮＡに結合するタンパク質に作用する化合物が得られる。例えば、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質が生体内で本発明のＤＮＡのプロモーター活性を阻害するような場合、このタンパク質と本発明のＤＮＡとの結合を阻害するような化合物は、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を促進できると考えられる。なお、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質が既に単離されていれば、細胞の核抽出液に代えて、該タンパク質の組み換えタンパク質を利用することも可能である。
【００２８】
５−２）プロモーター活性を指標としたスクリーニング
この方法は、本発明のＤＮＡを含むレポーター遺伝子を保持する細胞に被験化合物を接触させ、マーカー遺伝子の発現を調節する化合物を選択する工程を含む。このような方法には、例えば、上記した酵母や動物細胞を用いたｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ法が含まれる。
【００２９】
すなわち、本発明のＤＮＡとマーカー遺伝子を挿入したレポーター遺伝子を哺乳動物由来の培養細胞に導入した細胞をマーカー遺伝子が発現可能な条件で培養する。培養するにあたって、培地中に任意の被験物質を添加した条件および添加しない条件を設定し、培養後マーカー遺伝子の発現量を測定し、被験物質の添加によりマーカー遺伝子の発現量に変化が生じるか否かを検定する。この方法では、直接、間接的に本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節する化合物が得られる。
【００３０】
このような系において、本発明のＤＮＡを含むレポーター遺伝子を導入した際のマーカー遺伝子の発現誘導を促進するような被験物質は、神経性疾患、炎症、感染症、血栓症、免疫疾患、ＨＩＶ、２型糖尿病、肥満、敗血症、心疾患、脂質代謝異常および動脈硬化の治療または予防薬として有用な物質として選択され、また、該マーカー遺伝子の発現を抑制するような被験物質は、癌およびその転移の治療または予防薬として有用な物質として選択される。
【００３１】
なお、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節するタンパク質が同定された場合には、被験化合物の存在下で該タンパク質（またはその誘導体）と本発明のＤＮＡとを接触させ、該タンパク質（またはその誘導体）と本発明のＤＮＡとの結合を促進または阻害する化合物を選択して、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を調節する化合物をスクリーニングすることが可能である。具体的には、例えば、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質（ＤＮＡ結合ドメインのみでもよい）とグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質を精製して、抗グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ抗体で覆ったマイクロプレートに結合させた後、ビチオン化した本発明のＤＮＡをこのタンパク質と接触させ、該タンパク質と本発明ＤＮＡとの結合をストレプトアビジン化アルカリホスファターゼで検出する。本発明のＤＮＡ添加の際、被験化合物も添加し、該タンパク質と本発明のＤＮＡとの結合を促進あるいは阻害する化合物を選択する。この方法では、直接本発明のＤＮＡに作用する化合物および本発明のＤＮＡに結合するタンパク質に作用する化合物が得られる。例えば、本発明のＤＮＡに結合するタンパク質が生体内で本発明のＤＮＡのプロモーター活性を阻害する場合、このタンパク質と本発明のＤＮＡとの結合を阻害するような化合物は本発明のＤＮＡのプロモーター活性を促進できると考えられる。
【００３２】
【実施例】
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記実施例において、遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ．および Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． 著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には、特に明示がない限りは該市販品の指示書に従って使用した。
実施例１． ヒトセラミドキナーゼ遺伝子プロモーター領域の解析
１）ヒトセラミドキナーゼ５’側上流域の検索
既知のヒトセラミドキナーゼ配列を基に、ＮＣＢＩのヒトゲノムＤＮＡのデータベースよりヒトセラミドキナーゼの５’側末端上流域を含む配列（ＧｅｎＢａｎｋＴＭａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＴ０１１５２３）を見出した。解析の結果、配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡが目的のプロモーターＤＮＡとして選択された。ヒトセラミドキナーゼをコードする遺伝子の転写開始点（エクソン１の５’末端境界部位）はＧｅｎＢａｎｋデータベースに登録されているヒトセラミドキナーゼの配列であるＡＢ０７９０６６を参照して決定した。すなわち、ＡＢ０７９０６６のヌクレオチド配列のうち、ベクター部分を除いた最初のヌクレオチドを転写開始点と判断し、その位置を「１」と定義した。このようにして、ヒトセラミドキナーゼ遺伝子の転写開始点より上流の５’末端側２３９６ｂｐから転写開始点の下流の３’末端側１１９ｂｐまでの領域に相当するヌクレオチド配列からなるＤＮＡを同定した。
【００３３】
２）コンピュータープログラムによるプロモーター領域の予測
１）で同定したＤＮＡ配列をもとに、プロモーター配列予測プログラム（ＰＲＯＭＯＴＥＲ ＳＣＡＮ Ｐｒｅｓｔｒｉｄｇｅ， Ｄ． Ｓ． （１９９５） ＪＭＢ ２４９， ９２３−３２）を用いて解析した。その結果、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１２８６から１５３５の領域がプロモーター領域として予測された。この領域の中には、ＭＬＴＦ（ｍａｊｏｒ ｌａｔｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）の結合領域として予測される配列などが含まれている。
実施例２． ルシフェラーゼ発現プラスミドベクターの構築
１）プラスミドｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ１およびｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２の構築実施例１の結果を基に、ヒトセラミドキナーゼをコードする遺伝子の５’末端側上流域のｃＤＮＡを有するレポータープラスミドを構築した。５’末端側上流域を特異的に増幅するために、下記のオリゴヌクレオチドプライマー：
５’−ＴＣＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＣＡＧＡＧＴＣＡＴＧＧ−３’ （ＣＫｐ−１、配列表の配列番号２）；
５’−ＡＴＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＣＴＣＧＴＣＣＧＣ−３’ （ＣＫｐ−２、配列表の配列番号３）；および
５’−ＡＴＣＣＡＣＡＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣＣＴＣＡＧＡＧＣ−３’ （ＣＫｐ−３、配列表の配列番号４）；
を合成した。
【００３４】
次いで、市販ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、ＬＡ ＰＣＲキット・バージョン２．１（宝酒造（株）社製）を用いて、１回目のＰＣＲ反応を行なった。すなわち、ヒトゲノムＤＮＡ（クロンテック社製）５μｌとプライマーセット ＣＫｐ−１とＣＫｐ−２、およびＣＫｐ−２とＣＫｐ−３各０．４μＭ、ならびにｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ各４００μＭ、２．５ｍＭ 塩化マグネシウムを含む１×ＬＡＰＣＲ ＧＣ Ｉ緩衝液、０．０５単位のＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（以上キットに添付）からなる５０μｌの反応液を調製した。この反応液を９４℃で２分間加熱した後、９４℃で３０秒、６８℃で３０秒、７２℃で４分の温度サイクルで３０サイクル繰り返してから、７２℃で１０分保温した（タカラ ＰＣＲ サーマルサイクラー ＭＰ（宝酒造（株）社製）を使用。以下において同じ）。ＰＣＲ産物をゲルよりＱＩＡクイックゲルエクストラクションキット（キアゲン社製）を用いて回収し、Ｔ／Ａクローニング法（Ｃｌａｒｋ， Ｊ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １６， ９６７７−９６８６）によりｐＣＲ２．１ベクター（オリジナル ＴＡ クローニングキット（インビトロゲン社製）に添付）に連結し、大腸菌ＩＮＶαＦ’株（キットに添付）に導入した。陽性のクローンにつき、挿入されたｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチド鎖終結法により解析し、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から配列番号２５１５に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挿入されたプラスミドをｐＣＲ２．１‐ｈｃｅｒｋｐ２、１０８７〜２５１５に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挿入されたプラスミドをｐＣＲ２．１‐ｈｃｅｒｋｐ１と命名した。ｐＣＲ２．１‐ｈｃｅｒｋｐ２を制限酵素Ｘｂａ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、挿入ｃＤＮＡを含む約２．５ｋｂｐの断片を単離した。一方、ルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＶ‐Ｂ２（東洋インキ製造株式会社製）を制限酵素ＮｈｅＩとＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、アルカリホスファターゼで脱リン酸化した。上記２．５ｋｂｐ断片およびｐＧＶ‐Ｂ２ベクターをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造（株）社製）を用いた反応により連結し、大腸菌ＪＭ１０９株に導入した。得られた形質転換株よりプラスミドＤＮＡ ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２を抽出し、挿入されているｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチド鎖終結法により確認した。同様に、ｐＣＲ２．１‐ｈｃｅｒｋｐ１よりＳａｃ ＩとＮｈｅ Ｉで挿入ｃＤＮＡ約１．５ｋｂｐを単離し、Ｓａｃ ＩとＮｈｅ Ｉで消化したｐＧＶ‐Ｂ２に連結し、プラスミドＤＮＡ ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ１を得た。
【００３５】
なお、このルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２を保持する形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２ ＳＡＮＫ ７０８０２は、２００２年（平成１４年）６月２１日付けで産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに国際寄託され、受託番号、ＦＥＲＭ ＢＰ−８０８７が付された。
【００３６】
ルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＶ−Ｂ２（東洋インキ製造株式会社製）ＤＮＡでも同様にして大腸菌ＪＭ１０９のコンピテント細胞（宝酒造（株）社製）を形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーを培養し、ＤＮＡを回収し精製した。このプラスミドＤＮＡをネガティブコントロールとして使用した。
【００３７】
２）プラスミドｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ１の構築
ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ１は、ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２を用いて作成することもできる。形質転換大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２ ＳＡＮＫ ７０８０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−８０８７）から抽出した組換えプラスミドｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２を鋳型とし、ＣＫｐ−２とＣＫｐ−３をプライマーとして、ＬＡ ＰＣＲキット・バージョン２．１（宝酒造（株）社製）を用いてＰＣＲ反応を行なう。すなわち、ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２ １ｎｇとプライマーＣＫｐ−２とＣＫｐ−３各０．４μＭ、ならびにｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ各４００μＭ、２．５ｍＭ 塩化マグネシウムを含む１×ＬＡ ＰＣＲ ＧＣ Ｉ緩衝液、０．０５単位のＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（以上キットに添付）からなる５０μｌの反応液を調製する。この反応液を９４℃で２分間加熱した後、９４℃で３０秒、６８℃で３０秒、７２℃で４分の温度サイクルで３０サイクル繰り返してから、７２℃で１０分保温する（タカラ ＰＣＲ サーマルサイクラー ＭＰ（宝酒造（株）社製）を使用。以下において同じ）。ＰＣＲ産物をゲルよりＱＩＡクイックゲルエクストラクションキット（キアゲン社製）を用いて回収し、Ｔ／Ａクローニング法（Ｃｌａｒｋ， Ｊ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １６， ９６７７−９６８６）によりｐＣＲ２．１ベクター（オリジナル ＴＡ クローニングキット（インビトロゲン社製）に添付）に連結し、大腸菌ＩＮＶαＦ’株（キットに添付）に導入する。陽性のクローンにつき、挿入されたｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチド鎖終結法により解析し、１０８７〜２５１５に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡが挿入されたプラスミドがｐＣＲ２．１‐ｈｃｅｒｋｐ１である。ｐＣＲ２．１‐ｈｃｅｒｋｐ１よりＳａｃ ＩとＮｈｅ Ｉで挿入ｃＤＮＡ約１．５ｋｂｐを単離し、Ｓａｃ ＩとＮｈｅ Ｉで消化したｐＧＶ‐Ｂ２に連結し、プラスミドＤＮＡ ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ１を作製することが出来る。
実施例３． プロモーター活性
実施例２で単離したＤＮＡのプロモーター活性について評価するため、レポーターアッセイを実施した。すなわち、実施例２で構築したプロモーターＤＮＡを含んだホタルルシフェラーゼ発現プラスミド（ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ１およびｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２）およびプロモーターＤＮＡを含まないホタルルシフェラーゼ発現プラスミドｐＧＶ−Ｂ２のそれぞれを、ヒト胎児腎由来細胞株ＨＥＫ２９３にトランスフェクションして、各プラスミドをトランスフェクションした細胞の細胞抽出液中のホタルルシフェラーゼ活性を測定し、その結果を比較した。なお、細胞へのトランスフェクション効率についての各プラスミド間の実験ロット差を補正するための内部標準として、ウミシイタケルシフェラーゼ発現プラスミドｐＲＬ−ＴＫ（東洋インキ製造株式会社製）を用いた。まず、ヒト胚子腎臓細胞ＨＥＫ２９３に、リポフェクタミン プラス（ライフテクノロジー社製）を用いて、添付のプロトコールにしたがって、トランスフェクションした。すなわち、１ウェルあたり６×１０５個のＨＥＫ２９３細胞に、０．９３μｇの被験プラスミド（ｐＧＶ−Ｂ２、ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ１またはｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２）と０．０７μｇのｐＲＬ−ＴＫ ＤＮＡを混合して、トランスフェクションした。３７℃で２日間培養した後、培地を除去して１０００μｌ／ウエルの細胞溶解剤（ＰＬＤ−３０（東洋インキ製造株式会社製））に溶解して、細胞抽出液を調製した。次に、その細胞抽出液を１００倍希釈し、その希釈溶液２０μｌを用いて、デュアル−ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ・システム（東洋インキ製造株式会社製）を添付のプロトコールに従って用いることにより、ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した（ルミナスＣＴ−９０００Ｄ、ダイアヤトロン社製を使用）。実験結果については、内部標準のウミシイタケルシフェラーゼ活性で補正したホタルルシフェラーゼ活性として表した。
【００３８】
その結果、ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ１を導入したＨＥＫ２９３細胞では、ｐＧＶ−Ｂ２を導入した細胞に比べて約２７倍、ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２では２４倍のルシフェラーゼ活性が観察されたことから、ｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ１およびｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２に組み込まれた配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡにはプロモーターとしての活性が存在することが明らかとなった。以上の結果より、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１〜２５１５に示されるＤＮＡ、すなわちヒトセラミドキナーゼ遺伝子の５’末端側上流−２３９６〜＋１１９に相当する領域にプロモーター活性が存在することが明らかとなった。また、５’末端側上流を短縮した−１３１０〜＋１１９に相当する領域でも同等のプロモーター活性が存在することも示された。
本実施例の方法において、例えばｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ１およびｐＧＶ−ｈｃｅｒｋｐ２で形質転換したＨＥＫ２９３細胞を被験物質存在下で培養したときのルシフェラーゼ活性を測定することにより、本発明のＤＮＡのプロモーター活性を阻害する物質の試験を行うことができる。このプロモーター活性を阻害する物質は、神経性疾患、炎症、感染症、血栓症、免疫疾患、ＨＩＶ、２型糖尿病、肥満、敗血症、心疾患、脂質代謝異常、動脈硬化、癌およびその転移の治療または予防薬となりうる。
【００３９】
【発明の効果】
上記のごとく、本発明により、プロモーター活性を有する新規ＤＮＡが提供された。本発明のＤＮＡは、セラミドキナーゼの発現量を促進または抑制する物質を試験するための方法に用いることができるので、新しい作用機作を有する神経性疾患、炎症、感染症、血栓症、免疫疾患、ＨＩＶ、２型糖尿病、肥満、敗血症、心疾患、脂質代謝異常、動脈硬化、癌およびその転移の治療または予防薬の開発に有用である。
【００４０】
【配列表フリーテキスト】
配列番号２： ＰＣＲプライマー ＣＫｐ−１
配列番号３： ＰＣＲプライマー ＣＫｐ−２
配列番号４： ＰＣＲプライマー ＣＫｐ−３
【００４１】
【配列表】
TECHNICAL FIELD The present invention relates to phosphorylation of various ceramides and various optical isomers thereof, which are used for neurological diseases, inflammation, infectious diseases, thrombosis, immunological diseases, HIV, type 2 diabetes, obesity, sepsis, heart disease, etc. The present invention relates to a novel DNA having a ceramide kinase promoter activity that can cause diseases, lipid metabolism disorders, arteriosclerosis, cancer and its metastasis, and a method for screening a substance that regulates the promoter activity.
[0002]
[Prior art]
Sphingolipids have traditionally been considered one of the major components of cell membranes alongside glycerophospholipids and cholesterol. Glycerophospholipids have been known not only to maintain cell membrane structure, but also to produce many bioactive substances as metabolites, but little is known about the bioactivity of sphingolipids until recently. Was. In recent years, some metabolites of sphingolipids have become known to have physiological activities such as inducing apoptosis and stimulating cell growth. Metabolic enzymes of sphingolipids may be closely related to physiological responses and various disease states. Came to be suggested. In particular, ceramides have attracted attention as regulators that regulate many cell functions (Hannun, YA and Obeid, LM (1995) TIBS 20, 73-77).
[0003]
For example, ceramide functions as a second messenger for inflammatory cytokines such as TNF-α and IL-1β, and phospholipase A 2 It is known to activate the arachidonic acid pathway (Spiegel, S. et al. (1996) Curr. Opini. Cell Biol. 8, 159-167 and Mathias, S. et al. (1993) Science 259). , 519-522). That is, ceramide can be regarded as an exacerbation factor of various inflammatory diseases. Also, CD4 in HIV infected patients + It has been reported that ceramide also functions as an exacerbating factor during T cell apoptosis-related reduction and brain cell infection (Colline, MG et al. (1997) Proc. Assoc. Am. Physicians). 109, 146-153 and Wilt, S. et al. (1995) Ann. Neurol. 37, 381-394). Furthermore, it is known that TNF-α causes insulin resistance in type 2 diabetes and obesity, but ceramide is thought to function as an exacerbating factor downstream thereof (Begum, N. et al.). al. (1996) Eur. J. Biochem. 238, 214-220 and Hotamisiligil, G. S. et al. (1996) Science 271, 665-668). Also, it has been reported that ceramide functions as a second messenger in sepsis caused by lipopolysaccharide (LPS) or the like (Beutler, B. and Kruys, V. (1995) J. Cardiovasc. Pharmacol. 25, S1-S8). Furthermore, there is a report that an increase in ceramide accompanying the activation of sphingomyelinase functions as an exacerbating factor also in the agglutination reaction of LDL, which triggers formation of an atherosclerotic layer (Schissel, SL et al. (1996) ) J. Clin. Invest. 98, 1455-1464).
[0004]
Conversely, it is known that ceramide promotes apoptosis of cancer cells in radiation therapy or chemotherapy in cancer treatment (Michael, JM et al. (1997) Cancer Res. 57, 3600-3605 and Bose, R. et al. (1995) Cell 82, 405-414 and Jaffrezou, JP et al. (1996) EMBOJ. 15, 2417-2424).
[0005]
On the other hand, ceramide-1-phosphate which is a metabolite of ceramide and ceramide kinase which is an enzyme for producing ceramide are also known to have some physiological activities. For example, at the synapse of the brain, ceramide kinase is activated in response to calcium stimulation, and the generated ceramide-1-phosphate regulates the release of neurotransmitters from the synapse (Bajjarieh, SM et al.). al. (1989) J. Biol. Chem. 264, 14354-14360 and Shinghal, R. et al. (1993) J. Neurochem. 61, 2279-2285). Therefore, regulating the activity of ceramide kinase with a drug, a promoter, or the like may be a therapeutic method for various neurological diseases including Alzheimer's disease. In addition, ceramide-1-phosphate is considered to have an action of blocking the functions of the above-mentioned various ceramides (Dressler, KA et al. (1990) J. Biol. Chem. 265, 14917-14921). reference). In other words, ceramide-1-phosphate suppresses various inflammatory diseases such as chronic arthritis, HIV, and type 2 diabetes and obesity triggered by insulin resistance, as well as diseases in which ceramide acts as an exacerbating factor, such as sepsis and arteriosclerosis. It is considered possible. Furthermore, since ceramide kinase is involved in phagocytosis and activation of neutrophils (see Hinkovska-Galcheva VT et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 33203-33209), the progress of various infectious diseases And may be involved in organ damage after ischemia. Therefore, activating ceramide kinase by regulating promoter activity or the like may be a therapeutic method for neurological diseases, inflammation, infectious diseases, HIV, type 2 diabetes, obesity, sepsis, lipid metabolism disorder and arteriosclerosis. . Conversely, in radiotherapy or chemotherapy for cancer, there is a possibility that suppressing the ceramide kinase activity may maintain the amount of ceramide and improve the therapeutic effect. Furthermore, since ceramide kinase has a high gene expression level in the heart, spleen, platelets, and peripheral leukocytes, it may be involved in heart disease, thrombosis, and immune diseases (Sugiura, M., et al. (2002)). J. Biol. Chem. 277, 23294-23330).
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a method for screening a substance that regulates the activity of a promoter by specifying a promoter region involved in the transcriptional control of a ceramide kinase gene. More specifically, preventive drugs for neurological diseases, inflammation, infectious diseases, thrombosis, immune diseases, HIV, type 2 diabetes, obesity, sepsis, heart disease, dyslipidemia, arteriosclerosis, cancer and metastasis thereof, and An object of the present invention is to provide a novel means for searching for a candidate substance for a therapeutic drug. A novel method for testing a therapeutic or prophylactic agent and DNA used in the method are provided.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present invention
(1) DNA described in any one of the following a) to c):
a) DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
b) DNA that hybridizes with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing under stringent conditions and has promoter activity in mammalian cells;
c) DNA having 95% or more nucleotide sequence identity with the DNA described in a) above, and having promoter activity in mammalian cells.
(2) Transformed E. coli strain E. coli pGV-hcerkp2 SANK 70802 (FERM BP-8087), a recombinant plasmid carried by 2515 bp of DNA linked to the 5 ′ end of the nucleotide sequence encoding firefly luciferase.
(3) DNA described in any one of the following a) to c):
a) DNA comprising a nucleotide sequence having a nucleotide represented by nucleotide No. 1087 as a 5 ′ end and a nucleotide represented by nucleotide No. 2515 as a 3 ′ end in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
b) DNA that hybridizes with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the DNA described in a) above under stringent conditions and has promoter activity in mammalian cells;
c) DNA having 95% or more nucleotide sequence identity with the DNA described in a) above, and having promoter activity in mammalian cells.
(4) Transformed E. coli strain In a recombinant plasmid carried by E. coli pGV-hcerkp2 SANK 70802 (FERM BP-8087), a DNA consisting of 1429 bp at the 3 'end of the 2515 bp DNA linked to the 5' end of the nucleotide sequence encoding firefly luciferase .
(5) A DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and having promoter activity in mammalian cells.
(6) A DNA comprising a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1087 to 2515 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and having promoter activity in mammalian cells.
(7) DNA having the characteristics shown in the following a) to d):
a) comprising the nucleotide sequence of nucleotide numbers 1087 to 2515 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
b) the nucleotide represented by nucleotide number 2515 as the 3 'end;
c) a polynucleotide of at least 1 bp and a maximum of 1086 bp is added to the 5 ′ end of the nucleotide represented by nucleotide number 1087;
d) It has promoter activity in mammalian cells.
(8) A recombinant plasmid containing the DNA according to any one of (1) to (7).
(9) The recombinant plasmid according to (8), wherein a DNA encoding a protein is linked to the 3 'end of the DNA according to any one of (1) to (7).
(10) The recombinant plasmid according to (9), wherein the protein is selected from the group consisting of luciferase, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase, and green fluorescent protein.
(11) The recombinant plasmid according to (9) or (10), wherein the protein is luciferase.
(12) Transformed E. coli strain E. coli pGV-hcerkp2 pGV-hcerkp2, a recombinant plasmid carried by SANK70802 (FERM BP-8087).
(13) A host cell transformed with the recombinant plasmid according to any one of (8) to (12).
(14) The host cell according to (13), wherein the host cell is a prokaryotic cell.
(15) The host cell according to (13), wherein the host cell is a eukaryotic cell.
(16) The host cell according to (13) or (15), wherein the host cell is a cell derived from a mammal.
(17) Transformed E. coli strain E. coli coli pGV-hcerkp2 SANK70802 (FERM BP-8087).
(18) A method for screening a substance having a ceramide kinase gene promoter activity regulating activity, comprising the following steps i) to iii):
i) a step of culturing a host cell transformed with the recombinant plasmid according to any one of (8) to (12) in the presence or absence of a test substance;
ii) 3 ′ of the DNA according to any one of (1) to (7) in the recombinant plasmid according to any one of (8) to (12) in the host cell of i) above. Detecting the expression level of the protein encoded by the DNA linked to the end;
iii) a step of comparing the detection results of the above ii) between cells cultured in the presence of the test substance and cells cultured in the absence of the test substance.
(19) selected from neurological disease, inflammation, infection, thrombosis, immune disease, HIV, type 2 diabetes, obesity, sepsis, heart disease, lipid metabolism abnormality and arteriosclerosis, which comprises the following steps i) to iii): A method for screening a substance having a therapeutic or preventive effect on one or more diseases to be performed:
i) a step of culturing a host cell transformed with the recombinant plasmid according to any one of (8) to (12) in the presence or absence of a test substance;
ii) 3 ′ of the DNA according to any one of (1) to (7) in the recombinant plasmid according to any one of (8) to (12) in the host cell of i) above. Detecting the expression level of the protein encoded by the DNA linked to the end;
iii) The detection result of ii) above is compared between cells cultured in the presence of the test substance and cells cultured in the absence of the test substance. A step of determining that it has a therapeutic or prophylactic effect.
(20) A method for screening a substance having a therapeutic or preventive effect on cancer and its metastasis, comprising the following steps i) to iii):
i) a step of culturing a host cell transformed with the recombinant plasmid according to any one of (8) to (12) in the presence or absence of a test substance;
ii) 3 ′ of the DNA according to any one of (1) to (7) in the recombinant plasmid according to any one of (8) to (12) in the host cell of i) above. Detecting the expression level of the protein encoded by the DNA linked to the end;
iii) The detection result of ii) above is compared between cells cultured in the presence of the test substance and cells cultured in the absence of the test substance. Or a step of determining that it has a preventive effect.
(21) selected from neurological diseases, inflammation, infectious diseases, thrombosis, immune diseases, HIV, type 2 diabetes, obesity, sepsis, heart disease, lipid metabolism disorders and arteriosclerosis, comprising the following steps i) to iii): Methods for identifying a cDNA encoding a protein having a therapeutic or prophylactic effect on one or more of the following diseases:
i) A host cell transformed with the recombinant plasmid according to any one of (8) to (12) (hereinafter, referred to as “cell A”), and the test cDNA is incorporated into the mammalian A expression vector. A cell that transiently or stably expresses the test cDNA by transforming with the obtained recombinant plasmid (hereinafter referred to as “cell B”), and a cell A is transformed with another recombinant plasmid not containing the test cDNA. Individually culturing cells selected from the group consisting of transformed cells (hereinafter referred to as "cells C");
ii) Any one of (1) to (7) in the recombinant plasmid according to any one of (8) to (12) in the cell B and the cell C or A of the above i). Measuring the expression level of the protein encoded by the DNA linked to the 3 ′ end of the DNA;
iii) Comparing the measurement results of ii) above, when the expression level of the protein is higher in cell B than in cell C or A, it is determined that the protein encoded by the cDNA has the therapeutic or preventive effect. Process.
(22) A method for identifying a cDNA encoding a protein having a therapeutic or preventive effect on cancer and its metastasis, comprising the following steps i) to iii):
i) A host cell transformed with the recombinant plasmid according to any one of (8) to (12) (hereinafter, referred to as “cell A”), and the test cDNA is incorporated into the mammalian A expression vector. A cell that transiently or stably expresses the test cDNA by transforming with the obtained recombinant plasmid (hereinafter referred to as “cell B”), and a cell A is transformed with another recombinant plasmid not containing the test cDNA. Individually culturing cells selected from the group consisting of transformed cells (hereinafter referred to as "cells C");
ii) Any one of (1) to (7) in the recombinant plasmid according to any one of (8) to (12) in the cell B and the cell C or A of the above i). Measuring the expression level of the protein encoded by the DNA linked to the 3 ′ end of the DNA;
iii) Comparing the measurement results of the above ii), when the expression level of the protein is smaller in cell B than in cell C or A, it is determined that the protein encoded by the cDNA has the therapeutic or preventive effect. Process.
(23) A method for separating a substance that regulates ceramide kinase gene promoter activity, comprising contacting a sample containing the substance with the DNA according to any one of (1) to (7), Separating the substance bound to the substrate.
(24) A sample containing a human cell nuclear extract is brought into contact with the DNA according to any one of (1) to (7), and then a protein bound to the DNA is separated. A method for detecting a ceramide kinase gene promoter activity regulator.
(25) A method for selecting a substance having an activity of regulating ceramide kinase gene promoter activity, comprising the following steps i) and ii):
i) A DNA obtained by labeling the DNA according to any one of (1) to (7) to which a human cell nuclear extract and a test substance are added, and a human cell nuclear extract alone added Are respectively prepared;
ii) Electrophoresis of each mixture sample of the above i) to detect a band containing labeled DNA, and a band found in a sample to which only a nuclear extract of human cells is added and a band found in a sample to which a test substance is added Compare the mobility between the bands and select the one with the increased mobility.
(26) The method according to (25), wherein the label is a radiolabel.
(27) A nucleotide or a derivative thereof having a characteristic represented by any one of the following a) and b) and having an activity of regulating a ceramide kinase gene promoter activity:
a) Consisting of at least 10 contiguous nucleotides in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
b) consisting of at least 10 contiguous nucleotides in a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
About.
[0008]
The present inventors set the site predicted to be the transcription start point of the ceramide kinase gene in the human genome (nucleotide number 2397 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) as “1”, and from the site of 2396 nucleotides upstream of the 5 ′ terminal side, DNA consisting of a nucleotide sequence of 119 nucleotides downstream of the 3 ′ terminal side (hereinafter referred to as “−2396 to +119”; nucleotide numbers 1 to 2515 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) and “−1310 to +119” By introducing a reporter gene obtained by linking a DNA encoding a luciferase to a DNA consisting of a nucleotide sequence into human HEK293 cells and measuring the amount of luciferase produced, the “-2396 to +119” region of the ceramide kinase gene has promoter activity. I found that. In addition, the present inventors have reduced the 5 ′ terminal region of the ceramide kinase gene linked to the luciferase gene to “−1310 to +119” (nucleotide numbers 1087 to 2515 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing), and have the same effect. They also found that they had promoter activity. In addition, as a result of using a promoter sequence analysis software to narrow down important regions based on the expression of the promoter activity, a region of -1110 to -861 (nucleotide numbers 1286 to 1535 of SEQ ID NO: 1) was predicted. This region contained a sequence predicted as a binding sequence of MLTF (Major late transcription factor) and the like. The present inventors have further found that a compound that regulates the promoter activity can be screened by using DNA having the above promoter activity, and completed the present invention.
[0009]
The DNA of the present invention may contain any nucleotide sequence in the 5'-terminal upstream region of the ceramide kinase gene as long as it has promoter activity in mammalian cells. Preferably, a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing can be mentioned, but the present invention is not limited thereto. Including. More preferably, a DNA comprising a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1087 to 2515 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing can be mentioned. As long as the DNA has a promoter activity in mammalian cells, the 5 ' An arbitrary nucleotide sequence may be added to the terminal side. Preferably, a DNA having an arbitrary nucleotide sequence having a length of 1 to 1086 bases is added, but the present invention is not limited to this.
[0010]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The DNA of the present invention is, for example, 5 'of the nucleotide sequence of human ceramide kinase cDNA (Sugiura, M. et al. J. Biol. Chem. (2002) 277, 23294-23330) from a gene library prepared from the human genome. It can be isolated by screening using the terminal side as a probe. Alternatively, based on this sequence information or the sequence information published by the Human Genome Project, the present invention can be directly performed by a polymerase chain reaction (hereinafter referred to as “PCR”) using human genomic DNA as a template without going through a library screening step. Can also be amplified.
[0011]
Escherichia coli transformed with the recombinant plasmid pGV-hcerkp2 into which DNA having the nucleotide sequence shown in nucleotide numbers 1 to 2515 of SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing has been inserted, E. coli E. coli pGV-hcerkp2 SANK 70802 has been internationally deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology and the Patent Organism Depositary on June 21, 2002 (Heisei 14), and is assigned the accession number FERMBP-8087. Therefore, DNA consisting of the nucleotide sequence shown in nucleotide numbers 1 to 2515 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing can also be obtained from the Escherichia coli. In addition, DNA consisting of the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1087 to 2515 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing can be obtained from the recombinant plasmid pGV-hcerkp2 carried by SANK70802 by using the PCR method.
[0012]
In addition, those having ordinary knowledge in the technical field to which the present invention pertains, by modifying a part of the nucleotide sequence of the natural promoter DNA by substitution or deletion or addition of another nucleotide with another nucleotide, natural It is possible to prepare a DNA having a promoter activity equivalent to that of the type of promoter DNA. Thus, a DNA having a nucleotide sequence in which a nucleotide has been substituted, deleted or added in a natural nucleotide sequence and having a promoter activity equivalent to that of a natural promoter DNA is also included in the DNA of the present invention. Modification of the nucleotide sequence includes, for example, introduction of a deletion by a restriction enzyme or DNA exonuclease, introduction of a mutation by site-directed mutagenesis, modification of a promoter sequence by a PCR method using a mutation primer, direct introduction of a synthetic mutant DNA, etc. It can be done by a method. Among them, preferred is a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing or the nucleotide sequence represented by nucleotides 1087 to 2515 of SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.
[0013]
The DNA of the present invention includes a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or a DNA having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by nucleotides 1087 to 2515 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. And those containing DNA that can hybridize under stringent conditions. The DNA capable of hybridizing in this manner may be any DNA having promoter activity. Such a DNA is usually at least 70%, preferably at least 80%, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1087 to 2515 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. , More preferably 95% or more nucleotide sequence identity. Such DNAs include mutant DNAs found in nature, artificially modified mutant DNAs, and homologous DNAs derived from heterologous organisms.
[0014]
In the present invention, the hybridization under stringent conditions is performed by hybridization in 5 × SSC (0.75 M sodium chloride, 0.075 M sodium citrate) or a hybridization solution having a salt concentration equivalent thereto. C. to 42.degree. C. for about 12 hours, pre-washing as necessary with a solution having a salt concentration of 5.times.SSC or equivalent, etc. This can be performed by performing washing in a solution. Further, washing may be performed in 0.1 × SSC or a solution having a salt concentration equivalent thereto.
[0015]
As described below, whether or not the thus obtained DNA of the present invention has a promoter activity is determined by ligating a marker gene such as luciferase to the downstream of the 3 ′ end of the DNA of the present invention (hereinafter, referred to as the following). This can be confirmed by transforming a mammalian cell with the “reporter gene”) and examining whether or not the expression of the marker gene in the transformed cell is enhanced.
[0016]
Hereinafter, a method for transforming a mammalian cell with a reporter gene containing the DNA of the present invention will be described.
[0017]
In this method, the marker protein encoded by the marker gene linked to the 3 ′ end of the DNA of the present invention is any other protein that can be produced by a host mammalian cell in a series of steps of the method of the present invention. Any type can be used as long as the mammalian cell before transformation does not have a gene encoding the same or similar protein as the marker protein. For example, even if the marker protein is toxic to the cell or if the cell confers resistance to sensitive antibiotics, the presence or absence of the marker gene will determine the viability of the cell. Can be determined. However, a more preferable marker gene used in the present invention can specifically and quantitatively detect the expression level (for example, when a specific antibody against the protein encoded by the marker gene has been obtained). ) It is a structural gene. More preferably, it is a gene encoding an enzyme or the like which specifically reacts with an exogenous substrate to generate a metabolite which can be easily measured quantitatively. Such may include, for example, the genes encoding the proteins listed below, but the invention is not limited thereto:
Chloramphenicol acetyltransferase: Adds an acetyl group to chloramphenicol. Detectable by so-called CAT assay. A pCAT3-Basic vector (promega) is commercially available as a vector that can be used to prepare a vector for a reporter assay simply by incorporating a promoter;
Firefly luciferase: quantified by measuring bioluminescence generated when luciferin is metabolized. Similarly, a pGB-B2 vector (manufactured by Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.) is commercially available as a vector for a reporter assay;
β-galactosidase: There are substrates that can be measured by color reaction, fluorescence or chemiluminescence, respectively. Pβgal-Basic (Promega) is commercially available as a vector for reporter assays;
Secreted alkaline phosphatase: There are substrates that can be measured by color reaction, bioluminescence or chemiluminescence, respectively. PSEAP2-Basic (Clontech) is commercially available as a vector for reporter assays;
Green-fluorescent protein: Although not an enzyme, it can quantify directly because it emits fluorescence by itself. Similarly, pEGFP-1 (manufactured by Clontech) is commercially available as a vector for a reporter assay.
[0018]
As a method for introducing an expression plasmid into a cultured cell line, a DEAE-dextran method (Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308), a calcium phosphate-DNA coprecipitation method (Graham, FL L. and van der Eb, AJ (1973) Virology 52, 456-457), electric pulse perforation (Neumann, E. et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845), lipofection. (Lopata et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12, 5707-5717, Sussman and Milman (1984) Mol. Cell. Biol. 4, 1641-1643). However, the present invention is not limited to these, and other methods widely used in the technical field to which the present invention belongs can be employed. However, when the cultured cell line is a so-called floating cell, it is preferable to use a method other than the calcium phosphate-DNA coprecipitation method. In each case, optimized transfection conditions are used according to the cells used.
[0019]
By culturing cells transfected with the reporter gene containing the DNA of the present invention, transcription of the marker gene is promoted. The culture conditions may be any conditions under which the cells can survive and produce proteins. Preferably, the culture medium is suitable for the cell line used (even if a serum component such as fetal bovine serum is added). Good) in the presence of air containing 4-6% (most preferably 5%) carbon dioxide at 36-38 ° C (most preferably 37 ° C) for 2-3 days (most preferably 2%). Days).
[0020]
Hereinafter, a method for using the DNA of the present invention will be described.
1) Use as an inducible expression vector
When the DNA of the present invention is found to exhibit promoter activity by a specific stimulus, a vector or the like in which the DNA of the present invention is inserted upstream of a desired gene is prepared and introduced into somatic cells. By giving, the desired gene can be induced to be expressed.
2) Regulation of promoter activity of DNA using competitive inhibition by DNA
For controlling the promoter activity of the DNA of the present invention, DNA containing at least a part of the same sequence as the nucleotide sequence of the promoter DNA or a sequence complementary to the nucleotide sequence of the promoter DNA (including derivatives thereof. "Subsequence") can be used. A method for competitively inhibiting the binding between the above promoter DNA and a protein capable of binding to the promoter DNA (for example, a transcription factor) irrespective of whether or not the partial sequence itself has promoter activity, by using such a partial sequence. Can be implemented. For example, when the partial sequence corresponds to a binding site of a protein that inhibits the promoter activity on the DNA sequence of the present invention, the promoter activity can be promoted by this method, and conversely, the promoter activity can be promoted. When it corresponds to the binding site of a protein (including a transcription factor), the promoter activity can be inhibited. The partial sequence DNA used for such competitive inhibition usually has a chain length of at least 6 nucleotides or more, preferably 10 nucleotides or more. Examples of the type of partial sequence selected for use in competitive inhibition include, for example, a sequence containing a binding consensus site of a transcription factor on a promoter. Derivatives of such partial sequence DNA include those obtained by linking several partial sequences, those obtained by incorporating them into an adenovirus vector or the like to enable gene transfer into animal cells, and the 3′-terminal of DNA. Alternatively, one in which biotin is linked to the 5 ′ end can be used.
3) Screening for proteins that regulate promoter activity
In order to regulate the promoter activity of the DNA of the present invention, in addition to the above-described competitive inhibition using the partial sequence or the like, a method using a protein that regulates the promoter activity of the DNA of the present invention can also be used. The DNA of the present invention can be used for screening a protein that regulates its promoter activity. Therefore, the present invention relates to a method for screening a protein that regulates the promoter activity of the DNA as described below. Such proteins include proteins directly binding to the DNA of the present invention to promote or inhibit its promoter activity, and indirectly acting on cell membrane receptors or intracellular proteins to promote the promoter activity of the DNA of the present invention. And proteins that promote or inhibit the activity.
[0021]
3-1) Screening for protein binding to promoter DNA
This method includes a step of bringing a test protein sample into contact with the DNA of the present invention and selecting a protein that binds to the DNA of the present invention. Such a method includes, for example, affinity purification of a protein binding thereto using the promoter DNA of the present invention. As an example of a specific method, the promoter DNA of the present invention is biotinylated and bound to streptavidin-bound magnetic beads to prepare DNA affinity beads. This is then incubated with the nuclear extract of the cells to purify the proteins in the nuclear extract that specifically bind to the DNA of the invention, and to determine its structure. As a result, a protein that directly binds to the DNA of the present invention and a protein that does not have DNA binding activity but forms a complex with the protein as a subunit and binds to the DNA of the present invention can be purified (Gabrielsen, OS. et al., (1989) Nucleic acid Research 17, 6253-6267, Savoysky, E. et al., (1994) Oncogene 9, 1839-1846).
[0022]
3-2) Screening of protein using promoter activity as an index
This method includes a step of introducing a test DNA into a cell holding a reporter gene and selecting an expression product that regulates the expression of a marker gene. Such a method includes, for example, a one-hybrid method using yeast or animal cells. Specifically, a reporter gene into which the DNA of the present invention and a marker gene have been inserted is stably introduced into a cell, and then a gene library is introduced thereinto to obtain a clone exhibiting promotion or inhibition of expression of the reporter gene. Select and select a protein that binds to the DNA of the invention. According to this method, in addition to the protein directly binding to the DNA of the present invention, a protein that acts on an endogenous protein in a cell and indirectly regulates the promoter activity of the DNA of the present invention can be obtained. The yeast one-hybrid method (Li, JJ and Herskowitz, I., (1993) Science 262, 1870-1873, Wang, MMM and Reed, RR, (1993) Nature 364) And “Matchmaker system (Clontech)” and the like are sold as kits.
[0023]
Still another embodiment includes a step of bringing a test sample into contact with cells holding a reporter gene containing the DNA of the present invention, and selecting a protein that regulates the expression of a marker gene. As an example of a specific method, a cell into which a reporter gene having the DNA of the present invention and a marker gene inserted therein is stably introduced is incubated with a test sample (for example, a culture supernatant of a cell into which a gene library has been introduced). Then, a protein that promotes or inhibits the expression of the marker gene is selected. In this method, a protein that indirectly affects the promoter activity of the DNA of the present invention via a cell membrane receptor or the like is obtained.
4) Method for screening cDNA encoding a protein that regulates promoter activity
Using the DNA of the present invention, it is also possible to directly isolate a DNA encoding a protein that regulates its promoter activity. The present invention also relates to a method for screening a cDNA encoding a protein that regulates the promoter activity of the DNA of the present invention. One embodiment of this screening method includes a step of contacting an expression product of a test DNA with the DNA of the present invention and selecting a cDNA encoding a protein that binds to the DNA of the present invention. Such methods include, for example, the Southwestern method. Specifically, each protein is expressed in Escherichia coli into which a gene library has been introduced, and these proteins are transferred to a filter membrane, and then directly blotted using the DNA of the present invention as a probe, and clones expressing proteins that bind to the DNA probe are used. To isolate the gene encoding it. By this method, a gene encoding a protein having an activity of binding to the DNA of the present invention can be obtained (see Experimental Medicine Separate Volume, Bio Manual Series, “Transcription Factor Research Method”, published by Yodosha Co., Ltd., pp. 177-188). .
[0024]
Another embodiment includes a step of introducing a test cDNA into a cell containing a reporter gene containing the DNA of the present invention, and selecting a cDNA encoding an expression product that regulates the expression of a marker gene. Such methods include, for example, the above-mentioned one-hybrid method using yeast or animal cells.
[0025]
That is, a reporter gene into which a DNA of the present invention and a marker gene have been inserted is stably introduced into cultured cells derived from a mammal (hereinafter referred to as “cell A”), and the test cDNA is further transformed into an expression vector for mammalian cells. The cells (hereinafter, referred to as "cell B") into which the recombinant plasmid into which is inserted are introduced are cultured. As a control, cells A were cultured as they were, or an expression vector for mammalian cells containing no test cDNA in cells A, or a cell into which a recombinant plasmid containing test cDNA but not expressing it was introduced ( (Hereinafter referred to as “cell C”). The expression level of the marker gene is compared between cell B and cell A or cell C, and a cDNA clone that promotes or inhibits the expression of the marker gene is selected. In this method, not only cDNA encoding a protein that directly binds to the DNA of the present invention, but also cDNA encoding a protein that acts on an endogenous protein in a cell and indirectly regulates the promoter activity of the DNA of the present invention. Obtainable.
[0026]
Still another embodiment includes a step of contacting an expression product of a test cDNA with a cell holding a reporter gene containing the DNA of the present invention, and selecting a cDNA encoding an expression product that regulates the expression of a marker gene. As an example of a specific method, a cell into which a reporter gene into which a DNA of the present invention and a marker gene have been inserted is stably introduced, and an expression product of a test cDNA (for example, a culture supernatant of a cell into which a cDNA library has been introduced) To isolate a protein or a cDNA encoding the same, which promotes or inhibits expression of the marker gene. According to this method, a cDNA encoding a protein that acts on the promoter activity of the DNA of the present invention indirectly via a cell membrane receptor or the like can be obtained.
5) Screening for compounds that regulate promoter activity
Using the DNA of the present invention, a compound that regulates its promoter activity can be screened. That is, the present invention relates to a method for screening a compound that regulates the promoter activity of the DNA as described below.
[0027]
5-1) Screening using binding between promoter and protein as an index
This method includes a step of contacting a DNA of the present invention with a test sample in the presence of a test compound, and selecting a compound that promotes or inhibits the binding between the DNA of the present invention and a protein in the test sample. Specifically, for example, a nuclear extract of a cell is bound to a probe with a label capable of detecting the DNA of the present invention, and the protein in the nuclear extract and the DNA of the present invention are subjected to polyacrylamide gel electrophoresis. A band of a complex is detected by a gel shift method (see Experimental Medicine Separate Volume, Bio Manual Series, “Transcription Factor Research Method”, Yodosha Co., Ltd., pp. 107-112). Examples of the detectable label include a radioisotope label, a fluorescent dye label, and a biotin label, and a radioisotope label is preferable. When a DNA probe is added, a test compound is also added, and a compound that promotes or inhibits the formation of a band of a complex between the protein in the nuclear extract and the DNA of the present invention is selected. In this method, a compound that directly acts on the DNA of the present invention and a compound that acts on a protein that binds to the DNA of the present invention are obtained. For example, when a protein that binds to the DNA of the present invention inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention in vivo, a compound that inhibits the binding of the protein to the DNA of the present invention is a DNA of the present invention. Is considered to be able to promote the promoter activity. If a protein that binds to the DNA of the present invention has already been isolated, a recombinant protein of the protein can be used instead of the cell nuclear extract.
[0028]
5-2) Screening using promoter activity as an index
This method includes a step of bringing a test compound into contact with cells containing a reporter gene containing the DNA of the present invention, and selecting a compound that regulates the expression of a marker gene. Such methods include, for example, the above-mentioned one-hybrid method using yeast or animal cells.
[0029]
That is, cells in which a reporter gene having the DNA of the present invention and a marker gene inserted therein are introduced into cultured cells derived from mammals are cultured under conditions in which the marker gene can be expressed. In culturing, conditions under which any test substance is added to the medium and conditions under which no test substance is added are set, and after culturing, the expression level of the marker gene is measured. Test for In this method, a compound that directly or indirectly regulates the promoter activity of the DNA of the present invention is obtained.
[0030]
In such a system, a test substance that promotes the induction of marker gene expression when a reporter gene containing the DNA of the present invention is introduced includes neurological diseases, inflammation, infectious diseases, thrombosis, immune diseases, HIV, A test substance which is selected as a substance useful as a therapeutic or preventive agent for type 2 diabetes, obesity, sepsis, heart disease, dyslipidemia and arteriosclerosis, and which suppresses the expression of the marker gene, includes cancer and its metastases. Is selected as a substance useful as a therapeutic or prophylactic agent for.
[0031]
When a protein that regulates the promoter activity of the DNA of the present invention is identified, the protein (or a derivative thereof) is brought into contact with the DNA of the present invention in the presence of a test compound, and the protein (or a derivative thereof) is contacted. ) And the DNA of the present invention can be selected to screen for compounds that regulate the promoter activity of the DNA of the present invention. Specifically, for example, a fusion protein of a protein (or only a DNA binding domain) that binds to the DNA of the present invention and glutathione S-transferase is purified and bound to a microplate covered with an anti-glutathione S-transferase antibody. After that, the DNA of the present invention, which has been biotinylated, is brought into contact with the protein, and the binding between the protein and the DNA of the present invention is detected with streptavidinated alkaline phosphatase. When the DNA of the present invention is added, a test compound is also added, and a compound that promotes or inhibits the binding between the protein and the DNA of the present invention is selected. In this method, a compound that directly acts on the DNA of the present invention and a compound that acts on a protein that binds to the DNA of the present invention are obtained. For example, when a protein that binds to the DNA of the present invention inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention in vivo, a compound that inhibits the binding of the protein to the DNA of the present invention is used as a compound that inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention. It is thought that it can promote.
[0032]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto. In the following Examples, unless otherwise specified, each operation relating to gene manipulation is referred to as "Molecular Cloning" (Sambrook, J., Fritsch, EF, and Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory). Press, published in 1989), or when a commercially available reagent or kit was used, it was used according to the instructions for the commercially available product unless otherwise specified.
Embodiment 1 FIG. Analysis of human ceramide kinase gene promoter region
1) Search for 5 'upstream region of human ceramide kinase
Based on the known human ceramide kinase sequence, a sequence containing the 5'-terminal upstream region of human ceramide kinase from the NCBI human genomic DNA database (GenBank) TM accession number NT015233). As a result of the analysis, DNA containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing was selected as the target promoter DNA. The transcription start point of the gene encoding human ceramide kinase (5 ′ terminal boundary site of exon 1) was determined with reference to the sequence of human ceramide kinase AB079066 registered in the GenBank database. That is, in the nucleotide sequence of AB079066, the first nucleotide excluding the vector portion was determined as the transcription start point, and the position was defined as "1". In this manner, DNA consisting of a nucleotide sequence corresponding to a region from 2396 bp on the 5 ′ end upstream of the transcription start point of the human ceramide kinase gene to 119 bp on the 3 ′ end downstream of the transcription start point was identified.
[0033]
2) Prediction of promoter region by computer program
Based on the DNA sequence identified in 1), analysis was carried out using a promoter sequence prediction program (PROMOTER SCAN Prestridge, DS (1995) JMB 249, 923-32). As a result, the region from nucleotide numbers 1286 to 1535 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing was predicted as a promoter region. This region includes a sequence predicted as a binding region of a major late transcription factor (MLTF), and the like.
Embodiment 2. FIG. Construction of luciferase expression plasmid vector
1) Construction of Plasmids pGV-hcerkp1 and pGV-hcerkp2 Based on the results of Example 1, a reporter plasmid having a cDNA in the 5'-terminal upstream region of the gene encoding human ceramide kinase was constructed. To specifically amplify the 5'-end upstream region, the following oligonucleotide primers:
5′-TCCAGTGCTGTGCCCAGAGTCATGG-3 ′ (CKp-1, SEQ ID NO: 2 in Sequence Listing);
5'-ATCTCCGCCGCCGGGCTCGTCCGC-3 '(CKp-2, SEQ ID NO: 3 in Sequence Listing); and
5'-ATCCACATTTCCCAGGCTCCAGAGC-3 '(CKp-3, SEQ ID NO: 4 in Sequence Listing);
Was synthesized.
[0034]
Next, the first PCR reaction was performed using LA PCR Kit Version 2.1 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) using commercially available human genomic DNA as a template. That is, 5 μl of human genomic DNA (manufactured by Clontech), primer sets CKp-1 and CKp-2, and CKp-2 and CKp-3 each 0.4 μM, and dATP, dGTP, dCTP, dTTP each 400 μM, 2.5 mM magnesium chloride A 50 μl reaction solution was prepared comprising 1 × LAPCR GC I buffer solution containing 0.05 units of LA Taq DNA polymerase (attached to the above kit). This reaction solution was heated at 94 ° C. for 2 minutes, and then repeated 30 times at a temperature cycle of 94 ° C. for 30 seconds, 68 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 4 minutes, and then kept at 72 ° C. for 10 minutes (Takara PCR). Thermal cycler MP (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd .; the same applies hereinafter). The PCR product was recovered from the gel using a QIA Quick Gel Extraction Kit (Qiagen) and subjected to the T / A cloning method (Clark, JM et al. (1988) Nucleic Acid Res. 16, 9677-9686). To the pCR2.1 vector (attached to the original TA cloning kit (manufactured by Invitrogen)) and introduced into E. coli INVαF ′ strain (attached to the kit). For the positive clone, the entire nucleotide sequence of the inserted cDNA was analyzed by the dideoxynucleotide chain termination method, and a plasmid having a DNA comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 from nucleotide number 1 to SEQ ID NO: 2515 was inserted. The plasmid into which the DNA consisting of the nucleotide sequence shown in pCR2.1-hcerkp2, 1087-2515 was inserted was named pCR2.1-hcerkp1. pCR2.1-hcerkp2 was digested with restriction enzymes Xba I and Hind III, and an approximately 2.5 kbp fragment containing the inserted cDNA was isolated. On the other hand, the luciferase expression vector pGV-B2 (manufactured by Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.) was digested with restriction enzymes NheI and HindIII, and dephosphorylated with alkaline phosphatase. The 2.5 kbp fragment and the pGV-B2 vector were ligated by a reaction using T4 DNA ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) and introduced into E. coli JM109 strain. Plasmid DNA pGV-hcerkp2 was extracted from the resulting transformant, and the entire nucleotide sequence of the inserted cDNA was confirmed by the dideoxynucleotide chain termination method. Similarly, about 1.5 kbp of the inserted cDNA was isolated from pCR2.1-hcerkp1 with SacI and NheI, and ligated to pGV-B2 digested with SacI and NheI to obtain plasmid DNA pGV-hcerkp1.
[0035]
The transformed E. coli strain E. coli harboring the luciferase expression vector pGV-hcerkp2. E. coli pGV-hcerkp2 SANK 70802 was internationally deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology and the Patent Organism Depositary on June 21, 2002 (Heisei 14), and was assigned an accession number, FERM BP-8087.
[0036]
Similarly, competent cells of Escherichia coli JM109 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) were transformed with the luciferase expression vector pGV-B2 (manufactured by Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.), ampicillin-resistant colonies were cultured, and the DNA was recovered. Purified. This plasmid DNA was used as a negative control.
[0037]
2) Construction of plasmid pGV-hcerkp1
pGV-hcerkp1 can also be created using pGV-hcerkp2. Transformed E. coli strain E. coli LA PCR kit version 2.1 (Takara Shuzo Co., Ltd.) using the recombinant plasmid pGV-hcerkp2 extracted from E. coli pGV-hcerkp2 SANK 70802 (FERM BP-8087) as a template and CKp-2 and CKp-3 as primers. PCR). That is, 1 × LA PCR GC I buffer containing 1 ng of pGV-hcerkp2, 0.4 μM each of primers CKp-2 and CKp-3, 400 μM each of dATP, dGTP, dCTP, and dTTP, and 2.5 mM magnesium chloride, 0.05 Prepare a 50 μl reaction mixture consisting of units of LA Taq DNA polymerase (above attached to the kit). After heating this reaction solution at 94 ° C. for 2 minutes, a temperature cycle is repeated 30 times at 94 ° C. for 30 seconds, 68 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 4 minutes, and then kept at 72 ° C. for 10 minutes (Takara PCR). Thermal cycler MP (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd .; the same applies hereinafter). The PCR product was recovered from the gel using a QIA Quick Gel Extraction Kit (Qiagen) and subjected to the T / A cloning method (Clark, JM et al. (1988) Nucleic Acid Res. 16, 9677-9686). To the pCR2.1 vector (attached to the original TA cloning kit (manufactured by Invitrogen)), and introduced into E. coli INVαF ′ strain (attached to the kit). For the positive clone, the entire nucleotide sequence of the inserted cDNA was analyzed by the dideoxynucleotide chain termination method, and the plasmid into which the DNA consisting of the nucleotide sequence represented by 1087 to 2515 was inserted is pCR2.1-hcerkp1. About 1.5 kbp of the inserted cDNA is isolated from pCR2.1-hcerkp1 with SacI and NheI, and ligated to pGV-B2 digested with SacI and NheI to prepare plasmid DNA pGV-hcerkp1.
Embodiment 3 FIG. Promoter activity
To evaluate the promoter activity of the DNA isolated in Example 2, a reporter assay was performed. That is, the firefly luciferase expression plasmids (pGV-hcerkp1 and pGV-hcerkp2) containing the promoter DNA and the firefly luciferase expression plasmid pGV-B2 containing no promoter DNA, which were constructed in Example 2, were respectively transferred to a human embryonic kidney-derived cell line HEK293. And the firefly luciferase activity in the cell extract of cells transfected with each plasmid was measured, and the results were compared. In addition, Renilla luciferase expression plasmid pRL-TK (manufactured by Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.) was used as an internal standard for correcting experimental lot differences between plasmids with respect to transfection efficiency into cells. First, human embryonic kidney cells HEK293 were transfected using Lipofectamine Plus (manufactured by Life Technology) according to the attached protocol. That is, 6 × 10 5 HEK293 cells were transfected by mixing 0.93 μg of the test plasmid (pGV-B2, pGV-hcerkp1 or pGV-hcerkp2) with 0.07 μg of pRL-TK DNA. After culturing at 37 ° C. for 2 days, the medium was removed and dissolved in 1000 μl / well of a cell lysing agent (PLD-30 (manufactured by Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.)) to prepare a cell extract. Next, the cell extract was diluted 100-fold and firefly luciferase and firefly luciferase were prepared by using a dual-luciferase reporter assay system (manufactured by Toyo Ink Mfg. Co., Ltd.) according to the attached protocol using 20 μl of the diluted solution. Renilla luciferase activity was measured (using Luminous CT-9000D, manufactured by Diatron). The experimental results were expressed as firefly luciferase activities corrected for the Renilla luciferase activity of the internal standard.
[0038]
As a result, approximately 27-fold luciferase activity was observed in pKV-hcerkp1-introduced HEK293 cells and pGV-hcerkp2 in a 24-fold luciferase activity compared to pGV-B2-introduced cells. It has been clarified that a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing incorporated in the above has an activity as a promoter. From the above results, it is apparent that the promoter activity is present in the DNA represented by nucleotide numbers 1 to 2515 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, that is, in the region corresponding to −2396 to +119 at the 5′-end upstream of the human ceramide kinase gene. It became. It was also shown that the same promoter activity was present in the region corresponding to -1310 to +119 in which the 5 'terminal side upstream was shortened.
In the method of the present example, for example, a substance that inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention is measured by measuring luciferase activity when HEK293 cells transformed with pGV-hcerkp1 and pGV-hcerkp2 are cultured in the presence of a test substance. Can be tested. Substances that inhibit this promoter activity include the treatment of neurological diseases, inflammation, infections, thrombosis, immune diseases, HIV, type 2 diabetes, obesity, sepsis, heart disease, lipid metabolism disorders, arteriosclerosis, cancer and its metastases. Or it can be a prophylactic.
[0039]
【The invention's effect】
As described above, the present invention provides a novel DNA having a promoter activity. Since the DNA of the present invention can be used in a method for testing a substance that promotes or suppresses the expression level of ceramide kinase, neurological diseases, inflammation, infectious diseases, thrombosis, and immune diseases having a new mechanism of action can be used. , HIV, type 2 diabetes, obesity, sepsis, heart disease, dyslipidemia, arteriosclerosis, cancer and its metastasis, and is useful for the development of a medicament.
[0040]
[Sequence List Free Text]
SEQ ID NO: 2: PCR primer CKp-1
SEQ ID NO: 3: PCR primer CKp-2
SEQ ID NO: 4: PCR primer CKp-3
[0041]
[Sequence list]
Claims (27)
ａ）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
ｂ）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ；
ｃ）上記ａ）に記載のＤＮＡと９５％以上のヌクレオチド配列同一性を有し、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ。DNA described in any one of the following a) to c):
a) DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
b) DNA that hybridizes with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing under stringent conditions and has promoter activity in mammalian cells;
c) DNA having 95% or more nucleotide sequence identity with the DNA described in a) above, and having promoter activity in mammalian cells.
ａ）配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号１０８７で示されるヌクレオチドを５’末端とし、ヌクレオチド番号２５１５で示されるヌクレオチドを３’末端とするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
ｂ）上記ａ）に記載のＤＮＡのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ；
ｃ）上記ａ）に記載のＤＮＡと９５％以上のヌクレオチド配列同一性を有し、哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有するＤＮＡ。DNA described in any one of the following a) to c):
a) DNA comprising a nucleotide sequence having a nucleotide represented by nucleotide No. 1087 as a 5 ′ end and a nucleotide represented by nucleotide No. 2515 as a 3 ′ end in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
b) DNA that hybridizes with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the DNA described in a) above under stringent conditions and has promoter activity in mammalian cells;
c) DNA having 95% or more nucleotide sequence identity with the DNA described in a) above, and having promoter activity in mammalian cells.
ａ）配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１０８７から２５１５で示されるヌクレオチド配列を含み；
ｂ）ヌクレオチド番号２５１５で示されるヌクレオチドを３’末端とし；
ｃ）ヌクレオチド番号１０８７で示されるヌクレオチドの５’末端に少なくとも１ｂｐ、最長で１０８６ｂｐのポリヌクレオチドが付加し；
ｄ）哺乳動物由来の細胞中においてプロモーター活性を有する。DNA having the characteristics shown in the following a) to d):
a) comprising the nucleotide sequence of nucleotide numbers 1087 to 2515 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
b) the nucleotide represented by nucleotide number 2515 as the 3 'end;
c) a polynucleotide of at least 1 bp and a maximum of 1086 bp is added to the 5 ′ end of the nucleotide represented by nucleotide number 1087;
d) It has promoter activity in mammalian cells.
ｉ）請求項８乃至１２のいずれか一つに記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞を被験物質の存在下、または非存在下で培養する工程；
ｉｉ）上記ｉ）の宿主細胞における、請求項８乃至１２のいずれか一つに記載の組換えプラスミド中の、請求項１乃至７のいずれか１つに記載のＤＮＡの３’末端に連結されているＤＮＡにコードされているタンパク質の発現量を検出する工程；
ｉｉｉ）上記ｉｉ）の検出結果を、被験物質の存在下で培養した細胞と被験物質非存在下で培養した細胞との間で比較する工程。A method for screening a substance having a ceramide kinase gene promoter activity regulating activity, comprising the following steps i) to iii):
i) a step of culturing a host cell transformed with the recombinant plasmid according to any one of claims 8 to 12 in the presence or absence of a test substance;
ii) linked to the 3 ′ end of the DNA according to any one of claims 1 to 7 in the recombinant plasmid according to any one of claims 8 to 12 in the host cell of i). Detecting the expression level of the protein encoded by the DNA;
iii) a step of comparing the detection results of the above ii) between cells cultured in the presence of the test substance and cells cultured in the absence of the test substance.
ｉ）請求項８乃至１２のいずれか一つに記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞を被験物質の存在下、または非存在下で培養する工程；
ｉｉ）上記ｉ）の宿主細胞における、請求項８乃至１２のいずれか一つに記載の組換えプラスミド中の、請求項１乃至７のいずれか１つに記載のＤＮＡの３’末端に連結されているＤＮＡにコードされているタンパク質の発現量を検出する工程；
ｉｉｉ）上記ｉｉ）の検出結果を、被験物質の存在下で培養した細胞と被験物質非存在下で培養した細胞との間で比較し、発現量が増加している場合、該被験物質が該治療または予防効果を有すると判断する工程。One selected from neurological disease, inflammation, infectious disease, thrombosis, immune disease, HIV, type 2 diabetes, obesity, sepsis, heart disease, dyslipidemia and atherosclerosis, comprising the following steps i) to iii): A method for screening a substance having a therapeutic or preventive effect on one or more diseases:
i) a step of culturing a host cell transformed with the recombinant plasmid according to any one of claims 8 to 12 in the presence or absence of a test substance;
ii) linked to the 3 ′ end of the DNA according to any one of claims 1 to 7 in the recombinant plasmid according to any one of claims 8 to 12 in the host cell of i). Detecting the expression level of the protein encoded by the DNA;
iii) The detection result of ii) above is compared between cells cultured in the presence of the test substance and cells cultured in the absence of the test substance. A step of determining that it has a therapeutic or prophylactic effect.
ｉ）請求項８乃至１２のいずれか一つに記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞を被験物質の存在下、または非存在下で培養する工程；
ｉｉ）上記ｉ）の宿主細胞における、請求項８乃至１２のいずれか一つに記載の組換えプラスミド中の、請求項１乃至７のいずれか１つに記載のＤＮＡの３’末端に連結されているＤＮＡにコードされているタンパク質の発現量を検出する工程；
ｉｉｉ）上記ｉｉ）の検出結果を被験物質の存在下で培養した細胞と被験物質非存在下で培養した細胞との間で比較し、発現量が減少している場合、該被験物質が該治療または予防効果を有すると判断する工程。A method for screening a substance having a therapeutic or preventive effect on cancer and its metastasis, comprising the following steps i) to iii):
i) a step of culturing a host cell transformed with the recombinant plasmid according to any one of claims 8 to 12 in the presence or absence of a test substance;
ii) linked to the 3 ′ end of the DNA according to any one of claims 1 to 7 in the recombinant plasmid according to any one of claims 8 to 12 in the host cell of i). Detecting the expression level of the protein encoded by the DNA;
iii) The detection result of ii) above is compared between cells cultured in the presence of the test substance and cells cultured in the absence of the test substance. Or a step of determining that it has a preventive effect.
ｉ）請求項８乃至１２のいずれか一つに記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞（以下「細胞Ａ」という）と、細胞Ａを被験ｃＤＮＡが哺乳動物用発現ベクターに組み込まれた組換えプラスミドで形質転換することにより該被験ｃＤＮＡを一過性または安定的に発現する細胞（以下「細胞Ｂ」という）と、細胞Ａを該被験ｃＤＮＡを含まない別の組換えプラスミドで形質転換した細胞（以下「細胞Ｃ」という）からなる群から選択される細胞を個別に培養する工程；
ｉｉ）上記ｉ）の細胞Ｂおよび細胞ＣまたはＡにおける、請求項８乃至１２のいずれか一つに記載の組換えプラスミド中の、請求項１乃至７のいずれか１つに記載のＤＮＡの３’末端に連結されているＤＮＡにコードされているタンパク質の発現量を測定する工程；
ｉｉｉ）上記ｉｉ）の測定結果を比較し、該タンパク質の発現量が細胞Ｂにおいて細胞ＣまたはＡよりも増加している場合、該ｃＤＮＡがコードするタンパク質が該治療または予防効果を有すると判断する工程。One selected from neurological disease, inflammation, infection, thrombosis, immune disease, HIV, type 2 diabetes, obesity, sepsis, heart disease, lipid metabolism abnormality and arteriosclerosis, comprising the following steps i) to iii): Methods for identifying a cDNA encoding a protein having a therapeutic or prophylactic effect on one or more diseases:
i) a host cell transformed with the recombinant plasmid according to any one of claims 8 to 12 (hereinafter referred to as "cell A"), and the test cDNA of cell A was incorporated into a mammalian expression vector. A cell that transiently or stably expresses the test cDNA by transforming with a recombinant plasmid (hereinafter referred to as “cell B”), and a cell A is transformed with another recombinant plasmid not containing the test cDNA Individually culturing cells selected from the group consisting of isolated cells (hereinafter referred to as "cells C");
ii) The DNA of any one of claims 1 to 7 in the recombinant plasmid according to any one of claims 8 to 12 in the cell B and the cell C or A of the above i). 'A step of measuring the expression level of the protein encoded by the DNA linked to the terminus;
iii) Comparing the measurement results of ii) above, when the expression level of the protein is higher in cell B than in cell C or A, it is determined that the protein encoded by the cDNA has the therapeutic or preventive effect. Process.
ｉ）請求項８乃至１２のいずれか一つに記載の組換えプラスミドで形質転換された宿主細胞（以下「細胞Ａ」という）と、細胞Ａを被験ｃＤＮＡが哺乳動物用発現ベクターに組み込まれた組換えプラスミドで形質転換することにより該被験ｃＤＮＡを一過性または安定的に発現する細胞（以下「細胞Ｂ」という）と、細胞Ａを該被験ｃＤＮＡを含まない別の組換えプラスミドで形質転換した細胞（以下「細胞Ｃ」という）からなる群から選択される細胞を個別に培養する工程；
ｉｉ）上記ｉ）の細胞Ｂおよび細胞ＣまたはＡにおける、請求項８乃至１２のいずれか一つに記載の組換えプラスミド中の、請求項１乃至７のいずれか１つに記載のＤＮＡの３’末端に連結されているＤＮＡにコードされているタンパク質の発現量を測定する工程；
ｉｉｉ）上記ｉｉ）の測定結果を比較し、該タンパク質の発現量が細胞Ｂにおいて細胞ＣまたはＡよりも減少している場合、該ｃＤＮＡがコードするタンパク質が該治療または予防効果を有すると判断する工程。A method for identifying a cDNA encoding a protein having a therapeutic or preventive effect on cancer and its metastasis, comprising the following steps i) to iii):
i) a host cell transformed with the recombinant plasmid according to any one of claims 8 to 12 (hereinafter referred to as "cell A"), and the test cDNA of cell A was incorporated into a mammalian expression vector. A cell that transiently or stably expresses the test cDNA by transforming with a recombinant plasmid (hereinafter referred to as “cell B”), and a cell A is transformed with another recombinant plasmid not containing the test cDNA Individually culturing cells selected from the group consisting of isolated cells (hereinafter referred to as "cells C");
ii) The DNA of any one of claims 1 to 7 in the recombinant plasmid according to any one of claims 8 to 12 in the cell B and the cell C or A of the above i). 'A step of measuring the expression level of the protein encoded by the DNA linked to the terminus;
iii) Comparing the measurement results of the above ii), when the expression level of the protein is smaller in cell B than in cell C or A, it is determined that the protein encoded by the cDNA has the therapeutic or preventive effect. Process.
ｉ）請求項１乃至７のいずれか一つに記載のＤＮＡを標識したものに、ヒト細胞の核抽出液および被験物質を加えたもの、ならびにヒト細胞の核抽出液のみを加えたものをそれぞれ調製する；
ｉｉ）上記ｉ）の各混合物試料を電気泳動し、標識されたＤＮＡを含むバンドを検出し、ヒト細胞の核抽出液のみを加えた試料で見出されるバンドと被験物質を加えた試料で見出されるバンドの間で移動度を比較し、移動度が増大するものを選択する。A method for selecting a substance having an activity of regulating ceramide kinase gene promoter activity, comprising the following steps i) and ii):
i) a DNA obtained by labeling the DNA according to any one of claims 1 to 7 and a human cell nuclear extract and a test substance added thereto, and a human cell nuclear extract alone added thereto Prepare;
ii) Electrophoresis of each mixture sample of the above i) to detect a band containing labeled DNA, and a band found in a sample to which only a nuclear extract of human cells is added and a band found in a sample to which a test substance is added Compare the mobility between the bands and select the one with the increased mobility.
ａ）配列表の配列番号１に記載のヌクレオチド配列中の、連続した少なくとも１０ヌクレオチドからなる；
ｂ）配列表の配列番号１に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列中の、連続した少なくとも１０ヌクレオチドからなる。A nucleotide or a derivative thereof having a characteristic represented by any one of the following a) to b) and having an activity of regulating a ceramide kinase gene promoter activity:
a) Consisting of at least 10 contiguous nucleotides in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
b) Consists of at least 10 contiguous nucleotides in a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
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