JP2004081057A

JP2004081057A - 蛍光ｒｎａプローブ

Info

Publication number: JP2004081057A
Application number: JP2002244724A
Authority: JP
Inventors: Akira Murakami; 村上　章; Reiko Iwase; 岩瀬　礼子; Atsushi Umahara; 馬原　淳; Takashi Sakamoto; 坂本　隆; Kazunari Yamana; 山名　一成; Tetsuji Yamaoka; 山岡　哲二
Original assignee: Kansai Technology Licensing Organization Co Ltd
Current assignee: Kansai Technology Licensing Organization Co Ltd
Priority date: 2002-08-26
Filing date: 2002-08-26
Publication date: 2004-03-18

Abstract

【課題】細胞内で目的とするＲＮＡにハイブリダイズし、蛍光発色するＲＮＡプローブを提供すること。
【解決手段】複数の多環式芳香族化合物が導入されたホスホロチオエート化ポリヌクレオチド。
【選択図】　なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、目的のＲＮＡにハイブリダイズし、蛍光発色するＲＮＡプローブに関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、疾患の原因を解明するために、また、効果の高い新薬を開発するために、遺伝子の機能解析が盛んに行われている。
【０００３】
本発明者は、以前、目的のＲＮＡを検出するための１つのピレンを導入したオリゴヌクレオチドを開発した（特開２０００−３２９９９号公報）。しかし、このオリゴヌクレオチドは、細胞の中にほとんど入らないために、ＲＮＡの抽出等の操作によるＲＮＡの構造変化等により、検出感度が非常に低かった。しかも、検出する目的とするＲＮＡと結合することができたとしても、発色強度が満足のいくものではなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の主な目的は、細胞内で目的とするＲＮＡにハイブリダイズし、強い蛍光を発色するＲＮＡプローブを提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ホスホロチオエート化されたポリヌクレオチドに少なくとも２つの多環式芳香族化合物を導入することにより、細胞内においても目的のＲＮＡとハイブリダイズし、しかも可視領域において強い蛍光を発することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は以下の項１〜６に関する。
【０００７】
１．少なくとも２つの多環式芳香族化合物が導入されたホスホロチオエート化ポリヌクレオチド。
【０００８】
２．多環式芳香族化合物が、ピレン、ペリレン、５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルフォネート及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種である上記項１に記載のポリヌクレオチド。
【０００９】
３．細胞内において、上記項１又は２に記載のポリヌクレオチドを目的とするＲＮＡにハイブリダイズさせ、ハイブリダイズにより生ずる蛍光に基いてＲＮＡを検出する方法。
【００１０】
４．上記項１又は２に記載のポリヌクレオチドを用いたスクリーニング方法であって、
該ポリヌクレオチド存在下に目的の化合物を作用させ、ＲＮＡの発現量又は該化合物とＲＮＡとの結合強度を、蛍光発色の強度の変化により確認する方法。
【００１１】
５．上記項１又は２に記載のポリヌクレオチドを用いたスクリーニング方法であって、
該ポリヌクレオチド存在下に目的のアンチセンスを作用させ、該ポリヌクレオチドと該アンチセンスとの結合強度を、蛍光発色の強度の変化により確認する方法。
【００１２】
６．チップ表面に上記項１又は２に記載のポリヌクレオチドが結合させてある、目的のＲＮＡを検出するためのチップ。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の少なくとも２つの多環式芳香族化合物が導入されたホスホロチオエート化ポリヌクレオチドは、目的とするＲＮＡにハイブリダイズし、可視領域において強い蛍光を発することができる。
【００１４】
目的とするＲＮＡとは、本発明のプローブにより検出するＲＮＡのことをいい、スプライシングを受けたｍＲＮＡのみならず、スプライシングを受けていないＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡ等あらゆるＲＮＡを含むものとする。
【００１５】
本発明の多環式芳香族化合物が導入されたホスホロチオエート化ポリヌクレオチドの長さは、目的とするＲＮＡにハイブリダイズする限り限定されず、目的、用途等に応じて適宜選択することができる。
【００１６】
本発明のポリヌクレオチドに導入される多環式芳香族化合物としては、蛍光を発する限り限定されない。その中でも、少なくとも２つの多環式芳香族化合物の相互作用によって、発する蛍光が増強されるものが好適に使用できる。
【００１７】
例えば、多環式芳香族化合物としては、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、キノリン、ピレン、フルオランテン、クリセン、ベンゾ［ａ］ピレン、ペリレン、５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルフォネート、それらの化合物等が例示できる。好ましくは、ピレン、ペリレン、５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルフォネート及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種である。
【００１８】
また、該多環式芳香族化合物は、置換基を有していてもよく、例えば、炭素数１〜４で表される炭化水素基、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、エステル、カルボニル、ニトリル、アミド、ハロゲン元素等が例示できる。該化合物は、上記置換基を１又は２以上有していてもよく、２以上有する場合は、同じ置換基を有していても異なる置換基を有していてもよい。
【００１９】
これらの多環式芳香族化合物が導入されるヌクレオチドの種類については特に限定されないが、例えば、連続するヌクレオチドにそれぞれ導入されるのが好ましく、更には、連続して存在する２以上のウリジンにそれぞれ多環式芳香族化合物が導入されるのが好ましい。
【００２０】
多環式芳香族化合物が導入される位置は、ヌクレオチドの２’位が好ましい。また、多環式芳香族化合物が導入されたヌクレオチド以外の全てのヌクレオチドの２’位を全てメチル化するのが好ましい。ヌクレアーゼに対して耐性を示し、また、目的とするＲＮＡとより安定にハイブリダイズすることができるからである。
【００２１】
本発明の２以上の多環式芳香族化合物が導入されたホスホロチオエート化ポリヌクレオチドは、公知の方法によって製造できる。
【００２２】
まず、多環式芳香族化合物が導入されたヌクレオチドの製造方法であるが、これも特に限定されず、公知の方法により製造することができる（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．　Ｖｏｌ．３２，　Ｎｏ．４４，　６３７４−６３５０，　１９９１、特開２０００−３２９９９）。以下にその一例を挙げる。
【００２３】
例えば、ヌクレオチド１当量に対して水酸基を保護するための保護基を約１．５〜８０（好ましくは約２〜５当量）、ピリジン等の有機溶媒中で約１〜２０時間、好ましくは約２〜６時間還流条件下（約７０〜１５０℃、好ましくは約８０〜１２０℃）で反応させ、ヌクレオチドの３’位及び５’位の水酸基を保護する。
【００２４】
保護基としては、例えば、ベンジル基、フェネチル基等の非置換アリール低級アルキル基、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、マロニル基、アクリロイル基、ベンゾイル基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基等のトリアルキルシリル基、トリチル基、２−シアノエチル基等の保護基が挙げられ、トリチル基等が特に好ましい。
【００２５】
１．５〜３．０Ｎ程度の水酸化カリウムのようなアルカリ性化合物存在下で、上記保護基で保護されたヌクレオチド１当量に対して、約１〜５当量、好ましくは１．５〜３当量のベンゼン等の有機溶媒に溶解させた多環式芳香族化合物を、還流条件下（約７０〜１５０℃、好ましくは約８０〜１２０℃）に、１分〜５時間程度、好ましくは３分〜２時間程度反応させることにより、多環式芳香族化合物が導入されたヌクレオチドを得ることができる。
【００２６】
その後、酢酸、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ギ酸等の酸を添加し、１〜１０時間程度、好ましくは２〜６時間程度反応させ、脱保護を行うことにより２’−Ｏ−（多環式芳香族化合物）ヌクレオチドを得ることができる。
【００２７】
次いで、好ましくは氷浴中で冷却しながら、上記化合物１当量に対し、硝酸銀、ジメチルアミノピリジンを作用させ、４，４’−ジメトキシトリチル等の保護基を１〜１０当量程度、好ましくは３〜８当量程度、ベンゼン−ジオキサン等の有機溶媒中で反応させることにより、再度５’位の水酸基を保護することができる。
【００２８】
得られた化合物１当量に対して、テトラゾール等を０．５〜５当量程度、好ましくは１〜３当量程度、次いで、２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトライソプロピルホスホジアミド等の亜リン酸化剤０．５〜５当量程度、好ましくは１〜２当量程度添加し、１分〜１０時間程度、好ましくは０．５〜３時間程度反応させることにより、多環式芳香族化合物が導入されたヌクレオチドのホスホロアミダイト体が得られる。
【００２９】
また、ヌクレオチド又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドは、公知の方法で製造でき、又は市販のものを使用できる。
【００３０】
ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、上記の多環式芳香族化合物が導入されたヌクレオチドを用いて、例えば、生物学的な方法、化学的な方法等の公知の方法により、本発明のポリヌクレオチドを作ることができる。好ましくは、市販されているＤＮＡ自動合成機等を使用すればよい。また、例えば、ＤＮＡ自動合成機の酸化剤であるヨウ素溶液を取り付ける部分に、１５％ＴＥＴＤ（テトラエチルチウラムジスルフィド）等を取り付けることにより、ホスホロチオエート化ポリヌクレオチドを得ることができる。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート化しており、ヌクレアーゼ等の酵素に分解されにくく、細胞内に取り込まれやすい。更に、２’位がメチル化されている場合は、更にヌクレアーゼに分解されにくくなる。本発明のポリヌクレオチドは、細胞内に入って目的とするＲＮＡとハイブリダイズできるので、セルフリーのシステムを調製しなくても使用でき、非常に便利である。
【００３２】
更に、複数の多環式芳香族化合物をポリヌクレオチド中に有しているので、１つの多環式芳香族化合物を有している場合よりも高波長側で蛍光発色し、しかも蛍光強度も非常に強いので、目的のＲＮＡとハイブリダイズしたことが肉眼でも確認できる。
【００３３】
本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡを中心とする様々な遺伝子の機能解析に用いられるだけでなく、新規化合物のスクリーニング等にも用いることもできる。例えば、スクリーニング等の目的とする化合物を細胞に作用させ、その化合物によるＲＮＡの発現の増減又はＲＮＡと該化合物との結合強度を、本発明のポリヌクレオチドとＲＮＡとのハイブリダイズによる蛍光発色の強度の変化により、確認できる。
【００３４】
スクリーニングを行う場合、本発明のポリヌクレオチドと目的とする化合物のどちらを先に作用させても、又は両者を同時に細胞に作用させてもかまわないが、本発明のポリヌクレオチドを細胞に作用させ、次いで、該ポリヌクレオチド存在下に目的の化合物を作用させるのが好ましい。
【００３５】
また、上記目的とする化合物には、アンチセンスも含まれる。アンチセンスの場合も上記の化合物と同様に、本発明のポリヌクレオチド及びアンチセンス等を細胞に作用させ（作用させる順序は限定されない）、ＲＮＡと本発明のポリヌクレオチドとのハイブリダイズによる蛍光発色の強度等を確認する。
【００３６】
例えば、成長因子等による細胞の刺激等、種々の要因によって発現するＲＮＡがアンチセンスと結合することにより、本発明のポリヌクレオチドが該ＲＮＡと結合できなくなり、蛍光発色が弱くなる。そのような方法に基いて実験、疾患の治療等で用いるためのアンチセンスの最適の配列、長さ等を決定することができる。
【００３７】
更に、公知の方法により、本発明のポリヌクレオチドをチップの表面に結合させたり、ＲＮＡとハイブリダイズした複合体をチップの表面に結合できるようにしたりして、本発明ポリヌクレオチドをＲＮＡ検出用チップにも使用することができる。
【００３８】
例えば、タンパク質等の過剰発現により引き起こされる疾患の場合は、そのタンパク質をコードするＲＮＡと該ＲＮＡとハイブリダイズする本発明のポリヌクレオチドとのハイブリダイズにより、強く蛍光発色することができる。このような疾患としては、例えば、癌、ＡＩＤＳ等が挙げられる。
【００３９】
また、タンパク質等の発現が欠損又は不足しているために引き起こされる疾患の場合、そのタンパク質等をコードしているＲＮＡ等の発現レベルが低いため、本発明のポリヌクレオチドとのハイブリダイズによる蛍光発色が弱いため、発色の減弱により確認できる。このような疾患としては、例えば、ＡＤＡ欠損症等が挙げられる。
【００４０】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するために実施例を挙げるが、いうまでもなく本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４１】
実施例１（ｃ−ｆｏｓに対するプローブの合成）
ｃ−ｆｏｓ　ｍＲＮＡに対するプローブを配列を決定するために、コンピュータにより、ｃ−ｆｏｓ　ｍＲＮＡの配列に基いてＲＮＡの二次構造予測を行った。この予測に基いて、
【００４２】
【化１】
５’−ＧＡＵＧＵＧＵＵｐｙＵｐｙＣＵＣＣＵＣ−３’
をｃ−ｆｏｓ　ｍＲＮＡに対するプローブと配列して採用した（「ｐｙ」はピレンを示す。）。以下に合成法を示す。
【００４３】
ビスピレン修飾２’−メチルポリヌクレオチドは、まずピレンを導入したウリジンを合成し、これをポリヌクレオチドの合成に用いることで得た。
【００４４】
３．０ｇのウリジンに対して３当量のトリチルクロライド１０．３ｇ（アルドリッチ社製）を２０ｍｌのｄｒｙピリジン溶媒中、４時間還流条件下で反応させ、ウリジンの水酸基の３’位と５’位をトリチル基（以下、「Ｔｒ基」という。）で保護した。
【００４５】
６０ｍｌのベンゼン溶媒中に２．７ｇの１−ピレンメタノール（アルドリッチ社製）を溶解させ、塩化チオニルを２．５当量を添加し、還流条件下で１０分反応させることによって、ピレニルメチルクロライドを得た。
【００４６】
次に、Ｔｒ基で保護されたウリジン３．３ｍｍｏｌを、２０ｍｌのベンゼン−ジオキサン溶媒中、１．８Ｎ水酸化カリウム存在下に、ピレニルメチルクロライド０．３３Ｍ（Ｔｒ基で保護されたウリジンに対して２当量）とリフラックス条件（９０〜１００℃）で３時間反応させた。続いて、得られた反応物を、３０ｍｌの８０％酢酸で４時間処理することによりＴｒ基の脱保護を行い、２’−Ｏ−（１−ピレニルメチル）ウリジンを得た。
【００４７】
２’−Ｏ−（１−ピレニルメチル）ウリジン２３５ｍｇにテトラヒドロフラン及びピリジンを共に７ｍｌ加え、アイスバス中で冷却を行いながら、硝酸銀（４２７ｍｇ）及びジメトキシトリチルクロライド（８４４ｍｇ）を共に５当量添加し、１時間反応させて、５’位がジメトキシトリチル化された２’−Ｏ−（１−ピレニルメチル）ウリジンを得た。
【００４８】
５’位がジメトキシトリチル化された２’−Ｏ−（１−ピレニルメチル）ウリジン１０５ｍｇ（０．１３ｍｍｏｌ）を塩化メチレン１ｍｌ、アセトニトリル１ｍｌに溶解させ、テトラゾール（東京化成社製）３０ｍｇ（０．２８ｍｍｏｌ，　２当量）を添加した。次いで、亜リン酸化剤（２−シアノエチルＮ，　Ｎ，　Ｎ’，　Ｎ’，−テトライソプロピルホスホジアミド、アルドリッチ社製）６５μｌ（０．２１ｍｍｏｌ，　１．５当量）添加して、１時間反応させることでピレンが導入されたウリジンのホスホロアミダイト体を得た。
【００４９】
ＤＭＴｒ−Ｕ（ｐｙｒ）アミダイトの確認は^３１Ｐ−ＮＭＲで行い、その他の合成中間体の確認は^ｌＨ−ＮＭＲで行った。
【００５０】
得られたホスホロジアミダイト体及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチド（グレンリサーチ社製）を用いてＡＢＩ　ＤＮＡ自動合成機により、１．０μｍｏｌの合成スケールで行い、Ｕ（ｐｙｒ）アミダイトユニット導入時以外は、通常の合成サイクル（縮合時間：１５分、投入アミダイト量：１００μｌ）により合成し、Ｕ（ｐｙｒ）アミダイトユニット導入時は、縮合時間を３０分に延長し投入アミダイト量を１２０μｌにすることにより合成した。なお、ＡＢＩ　ＤＮＡ合成機に、酸化剤であるヨウ素溶液を取り付ける部分に、１５％ＴＥＴＤを取り付けて合成することにより、ホスホロチオエート化を行った。
【００５１】
実施例２（スクランブルプローブの合成）
実施例１と同様にして、細胞内のｍＲＮＡに結合しないようなプローブ配列（スクランブルプローブ）；
【００５２】
【化２】
５’−ＣＵＵＣＡＡＣＧＵｐｙＵｐｙＣＡＵＵＣ−３’
を合成した（「ｐｙ」はピレンを示す。）。
【００５３】
Ｕ（ｐｙ）アミダイトユニット導入時の縮合効率は９８％以上に達し、通常の未修飾のアミダイト試薬の縮合効率とほとんど変わらない結果が得られた。
【００５４】
試験例１
２．０×１０^５個のＣ４ＩＩ細胞を３．５ｃｍのガラスボトムディッシュに播種し、１０％ＦＢＳが入ったＤＭＥＭ培地で３日間細胞を培養し、その後、０．２％ＦＢＳが入ったＤＭＥＭ培地で４日間培養した。
【００５５】
その後、５μＭのプローブが入った０．２％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地を添加し、３時間、３７℃で培養した。この段階でプローブは細胞の中に取り込まれる。３７℃でインキュベートを行った後、細胞を０．２％ＦＢＳが入ったＤＭＥＭ培地１ｍｌで１０回洗浄後、１０％ＦＢＳが入ったＤＭＥＭ培地を添加し（これで細胞が刺激され、種々のｍＲＮＡを産生し始め、結果としてタンパク質が産生される）、１０分後に細胞を観察した（図１）。
【００５６】
図１のＡ及びＣより、プローブを作用させても細胞の形態は変化しない（即ち、細胞毒性はない）ことがわかる。また、ｃ−ｆｏｓ　ｍＲＮＡとハイブリダイズする本発明のプローブを作用させた細胞の場合において青い蛍光発光が観察された（図Ｄ）。一方、スクランブル配列をもつ本発明のオリゴマーを添加したした場合（図Ｂ）では図Ｄに示されるような青い蛍光発光は観察されなかった。この結果より、ｃ−ｆｏｓ　ｍＲＮＡとハイブリダイズする本発明のプローブは細胞内で標的ｍＲＮＡと結合し、青い蛍光発光を示したことがわかる。
【００５７】
試験例２
合成したビスピレン修飾２’−Ｏ−メチルポリヌクレオチドと、その相補的な塩基配列をもつＤＮＡあるいはＲＮＡとの相互作用を観察した。
【００５８】
本発明のビスピレン修飾２’−Ｏ−メチルポリヌクレオチド（５’−ＧＵｐｙＵｐｙＣＧＧＣＡＵＧ−３’）と、その相補的な塩基配列をもつＤＮＡおよびＲＮＡとの結合状態を観察するため、２本鎖の温度変化に対する２６０ｎｍおよび、３４２ｎｍにおける吸光度変化を測定した。
【００５９】
０．１Ｍ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　７．０）中で、本発明のポリヌクレオチドと相補鎖ＲＮＡポリヌクレオチドとを１：１で混合し核酸の濃度を６．０μＭに調製後、これを７５℃まで加温後に室温まで徐冷してアニールさせたものをサンプルとした。
【００６０】
昇温速度１．０℃／ｍｉｎ．で８０℃まで繰り返しＵＶ吸光度を測定した。相補鎖ＲＮＡに関して得られた吸光度を測定温度に対してプロットしたものを図２（Ｂ）に、相補鎖ＤＮＡのに関する結果を図２（Ａ）に示した。本発明のポリヌクレオチドに相補鎖ＲＮＡポリヌクレオチド及びＤＮＡポリヌクレオチドを添加した場合の２６０ｎｍにおけるＵＶ融解曲線は、典型的シグモイドカーブを示した。
【００６１】
これらの結果より、ＲＮＡポリヌクレオチド及びＤＮＡポリヌクレオチドは、低温においては本発明のオリゴマーと２本鎖を形成し、温度の上昇に伴って一本鎖に解離することが示された。
【００６２】
また、３４２ｎｍにおけるＵＶ融解曲線は、本発明のポリヌクレオチドと相補鎖ＤＮＡポリヌクレオチドを混合した場合、温度増加に伴って典型的シグモイドカーブ様に吸光度が増加する結果となった。３４２ｎｍにピレンの吸収スペクトルが存在することから、この変化はオリゴマー中のピレンの挙動を反映しているものと考えられる。
【００６３】
更に、この変化は２６０ｎｍのＵＶ融解曲線と同様のプロファイルを示していることから、温度増加に伴ってピレンと核酸塩基とのスタッキングが融解したため３４２ｎｍの吸光度は増加を示したものと考察される。
【００６４】
一方、本発明のオリゴマーと相補鎖ＤＮＡオリゴマーを混合した場合では温度増加に伴って３４２ｎｍの吸光度は減少しているが、５５℃付近を境にして吸光度の増加が観察された。
【００６５】
この結果より、低温ではピレンは核酸塩基とスタッキングしていないが、温度増加による二重鎖の融解に伴ってピレンと核酸塩基とのスタッキングする割合が増加したものと考えられる。その後の温度増加による吸光度の増加は、ピレンと核酸塩基とが温度により再びスタッキング環境から解放されたことを示しているものと考察する。
【００６６】
以上の結果より、本発明のオリゴマーは中性水溶液と同様に相補鎖ＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチドと２本鎖を形成できることが確認できた。また、本発明のオリゴマー中に導入したピレンは、相補鎖ＲＮＡオリゴマーと二重鎖形成した場合にのみ核酸とスタッキングしない環境に存在していることが示された。
【００６７】
次に、本発明のオリゴマーが相補鎖ＲＮＡオリゴマーと二重鎖を形成したときに示す４８０ｎｍ付近のブロードな蛍光発光が、ピレンのエキサイマー形成由来であるのか、あるいは基底状態の２量化に由来する発光であるのかを検討するため、励起スペクトル（試験例３）、ＵＶ吸収スペクトル（試験例４）、及び時間分解蛍光減衰曲線（試験例５）の測定を行った。
【００６８】
試験例３
２分子のピレンが、エキサイマー形成由来の蛍光発光を４８０ｎｍに示す場合、４８０ｎｍ付近でモニターした励起スペクトルとピレンのモノマー発光である３７５ｎｍ付近でモニターした励起スペクトルとが一致することが報告されている（Ｆｒａｎｃｏｉｓｅ　Ｍ．Ｗｉｎｎｉｋ，　Ｃｈｅｍ．　Ｒｅｖ．，　１９９３，　９３，　５８７−６１４）。
【００６９】
そこで、４８０ｎｍ及び３７５ｎｍでモニターした場合の励起スペクトル測定した結果を図３に示す。本発明のポリヌクレオチドと相補鎖ＲＮＡポリヌクレオチドとが二重鎖形成した条件下で、３４２ｎｍでモニターした場合と４８０ｎｍでモニターした場合の励起スペクトルを比較すると、長波長側に存在するピークトップが３ｎｍ程度ずれている結果が観測された。
【００７０】
試験例４
基底状態における２分子のピレンの相互作用について評価するため、ピレンを１分子導入したポリヌクレオチド及び本発明のピレンを２分子導入したポリヌクレオチドのそれぞれが、相補鎖ＲＮＡポリヌクレオチドと二重鎖を形成した場合のピレンの吸収スペクトルを測定した結果を図４に示す。
【００７１】
この結果より、１分子のピレンをオリゴマーに導入した場合のピレンのスペクトル形状と、２分子のピレンを導入したオリゴマーの場合のスペクトル形状が異なっていることが示された。
【００７２】
従って、２分子のピレンが導入されたポリヌクレオチドが相補鎖ＲＮＡポリヌクレオチドと二重鎖を形成した場合、導入されている２分子のピレン同士は基底状態で相互作用していることが示された。
【００７３】
試験例５
２分子のピレンがエキサイマー形成により４８０ｎｍに蛍光発光を示している場合、４８０ｎｍの蛍光減衰曲線の立ち上がりは、励起光源の減衰曲線の立ち上がりと比較して数ナノ秒程度ずれることが知られている。
【００７４】
そこで、本発明のポリヌクレオチドが相補鎖ＲＮＡポリヌクレオチドと二重鎖形成した場合の４８０ｎｍにおける蛍光減衰曲線と、ピレンエキサイマー発光を示すことが知られているシクロヘキサン溶媒に存在する５ｍＭピレン溶液の蛍光減衰曲線の測定を行った。結果を図５に示す。
【００７５】
シクロヘキサン中におけるピレンの減衰曲線の立ち上がりは、励起光源の減衰曲線の立ち上がりと比較して３ナノ秒程度遅れていることが確認された。
【００７６】
これに対し、本発明のポリヌクレオチドと相補鎖ＲＮＡポリヌクレオチドが二重鎖形成した場合の蛍光減衰曲線の立ち上がりは、励起光源の減衰曲線の立ち上がり時間に大きな差は確認されなかった。
【００７７】
また、ピレンエキサイマー形成に由来する４８０ｎｍの蛍光減衰曲線の立ち上がりの遅れは、本発明のオリゴマーと相補鎖ＲＮＡオリゴマーが二重鎖を形成した場合に示す４８０ｎｍの蛍光減衰曲線においては観察されなかった。
【００７８】
以上の結果より、本発明のオリゴマーが相補鎖ＲＮＡオリゴマーと二重鎖を形成した場合に示す４８０ｎｍの蛍光発光は、本発明のオリゴマーに導入した２分子のピレンが基底状態で二量体を形成することに由来していることがわかった。
【００７９】
【発明の効果】
本発明のポリヌクレオチドは、細胞内に入り、目的とするＲＮＡにハイブリダイズすることによって強い蛍光を発色することができるので、目的とするＲＮＡを容易に検出でき、しかも高感度である。
【図面の簡単な説明】
【図１】試験例１により得られた結果（細胞の写真）を示す。図Ａ及びＢはスクランブル配列をもつ本発明のオリゴマーを、図Ｃ及びＤはｃ−ｆｏｓ　ｍＲＮＡとハイブリダイズする本発明のプローブを作用させた結果を示す。また、図Ａ及びＣは、位相差顕微鏡写真による結果を、図Ｂ及びＤは、波長３３０−３５０ｎｍの紫外線を照射した際の蛍光顕微鏡写真を示す。
【図２】本発明によるビスピレン修飾２’−Ｏ−メチルＲＮＡポリヌクレオチドと、相補鎖ＤＮＡポリヌクレオチド（図Ａ）又は相補鎖ＲＮＡポリヌクレオチド（図Ｂ）による２本鎖の、２６０ｎｍおよび３４２ｎｍにおけるＵＶ融解曲線を示す。縦軸は相対吸光度を示し、横軸は温度を示す。
【図３】１１℃における、本発明のビスピレン修飾２’−Ｏ−メチルＲＮＡポリヌクレオチドと相補鎖ＲＮＡポリヌクレオチドとの２重鎖形成による蛍光励起スペクトルを示す。縦軸は蛍光強度、横軸は測定波長（ｎｍ）を示す。
【図４】１１℃における、本発明のビスピレン修飾２’−Ｏ−メチルＲＮＡポリヌクレオチドと相補鎖ＲＮＡポリヌクレオチドが二重鎖形成したときのＵＶ吸収スペクトルを実線で示す。また、ピレン修飾２’−Ｏ−メチルＲＮＡポリヌクレオチドと相補鎖ＲＮＡポリヌクレオチドが二重鎖形成したときのＵＶ吸収スペクトルを破線で示す。縦軸は吸光度を、横軸は測定波長（ｎｍ）を示す。
【図５】図Ａは、１１℃における、本発明のビスピレン修飾２’−Ｏ−メチルＲＮＡポリヌクレオチドと相補鎖ＲＮＡオリゴマーが二重鎖形成したときの時間変化に対する蛍光強度変化（時間分解蛍光減衰曲線）を点線で示す。図Ｂは、１１℃における、シクロヘキサン溶媒中に存在する５ｍＭピレンの時間変化に対する蛍光強度変化を点線で示す。なお、両図とも、実線は励起光源の時間変化に対する蛍光強度変化を示し、縦軸は光子のカウント数、横軸は時間（ナノ秒）を示す。

Claims

少なくとも２つの多環式芳香族化合物が導入されたホスホロチオエート化ポリヌクレオチド。
多環式芳香族化合物が、ピレン、ペリレン、５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルフォネート及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載のポリヌクレオチド。
細胞内において、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドを目的とするＲＮＡにハイブリダイズさせ、ハイブリダイズにより生ずる蛍光に基いてＲＮＡを検出する方法。
請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドを用いたスクリーニング方法であって、
該ポリヌクレオチド存在下に目的の化合物を作用させ、ＲＮＡの発現量又は該化合物とＲＮＡとの結合強度を、蛍光発色の強度の変化により確認する方法。
請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドを用いたスクリーニング方法であって、
該ポリヌクレオチド存在下に目的のアンチセンスを作用させ、該ポリヌクレオチドと該アンチセンスとの結合強度を、蛍光発色の強度の変化により確認する方法。
チップ表面に請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドが結合させてある、目的のＲＮＡを検出するためのチップ。