JP2004075666A - 造血器腫瘍の治療薬、免疫抑制剤、およびｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬 - Google Patents
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Abstract
【課題】副作用の少ない、新たな造血器腫瘍の治療薬および免疫抑制剤を提供すること。
【解決手段】カスパーゼを活性化することができる化合物またはその薬理上許容できる塩を含有する、造血器腫瘍の治療薬および免疫抑制剤。カプサイシン、カフェイン、カテキン及びそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物またはその薬理上許容される塩を含有する、ｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬。
【選択図】 なし
【解決手段】カスパーゼを活性化することができる化合物またはその薬理上許容できる塩を含有する、造血器腫瘍の治療薬および免疫抑制剤。カプサイシン、カフェイン、カテキン及びそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物またはその薬理上許容される塩を含有する、ｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、造血器腫瘍の治療薬、免疫抑制剤、およびｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬に関し、より詳細には、カスパーゼを活性化することができる化合物またはその薬理上許容できる塩を含有する造血器腫瘍の治療薬、免疫抑制剤、およびｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
白血病、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍に対しては、抗癌剤などによる化学療法や造血幹細胞移植を含め現在さまざまな治療法が行われているが、抗癌剤による重篤な副作用や薬剤耐性の問題・さらに造血幹細胞移植の際の移植片対宿主病等の致命的な合併症などさまざまな問題により、当該疾患患者の、長期生存率は依然として低いのが現状である。そこで、造血幹細胞移植や抗癌剤による治療に変わる新たな、副作用の少ない造血器腫瘍の治療の開発が不可欠な状況である。また、現在まで腫瘍細胞の増殖を抑制する化学物質は多数報告されているが、実際に実用化されたものは極めて少なく、さらにその分子機構はいまだ不明な点が多く、腫瘍細胞の増殖に直接関与する分子のみをターゲットとした新たな分子標的療法の発明も必要とされている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、副作用の少ない、新たな造血器腫瘍の治療薬を提供することを目的とする。
【０００４】
また、本発明は、副作用の少ない、新たな免疫抑制剤を提供することも目的とする。
【０００５】
さらに、本発明は、副作用の少ない、新たな造血器腫瘍細胞の増殖に関与する分子を標的とする分子標的治療薬を提供することも目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、唐辛子成分カプサイシン、食用生姜成分１’−アセトキシチャビコールアセテート、コーヒー成分カフェイン、緑茶成分カテキン及びウコン成分クルクミンが、造血器腫瘍細胞の増殖を抑制することを見出した。そして、これらの化合物が活性酸素を産生すること、カスパーゼを活性化すること、細胞にアポトーシスを誘導することも確認した。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。
【０００７】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１） カスパーゼを活性化することができる化合物またはその薬理上許容できる塩を含有する、造血器腫瘍の治療薬。
（２） カスパーゼを活性化することができる化合物が、カプサイシン、１’−アセトキシチャビコールアセテート、カフェイン、カテキン、クルクミン及びそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物である（１）記載の治療薬。
（３） カスパーゼを活性化することができる化合物またはその薬理上許容できる塩を含有する、免疫抑制剤。
（４） カスパーゼを活性化することができる化合物が、カプサイシン、１’−アセトキシチャビコールアセテート、カフェイン、カテキン、クルクミン及びそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物である（３）記載の免疫抑制剤。
（５） カプサイシン、カフェイン、カテキン及びそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物またはその薬理上許容される塩を含有する、ｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬。
【０００８】
カスパーゼは種々の刺激により活性化され、細胞の機能を不可逆的な状態に導く、細胞死（アポトーシス）の実行に直接関与するシステインプロテアーゼである。カスパーゼの活性化は、例えば、カスパーゼ活性キット（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）を用いて確認することができる。
【０００９】
カプサイシンは、唐辛子に含まれる食品成分であり、したがって、カプサイシンおよびその誘導体を用いた造血器腫瘍の治療は従来の抗がん剤による化学療法とは異なり、副作用の少ない安全な治療法と考えられる。カプサイシンの急性経口毒性（ＬＤ５０）は、ラットについて、６０〜７０ｍｇ／ｋｇである。造血器腫瘍の新たな治療薬としてカプサイシンおよびその誘導体が臨床応用されることにより、造血器腫瘍の長期予後の改善が期待される。同様に、カプサイシンおよびその誘導体は、副作用の少ない、安全な免疫抑制剤、ｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬としても、利用可能である。
【００１０】
１’−アセトキシチャビコールアセテートは、食用生姜に含まれる食品成分であり、したがって、１’−アセトキシチャビコールアセテートおよびその誘導体を用いた造血器腫瘍の治療は従来の抗がん剤による化学療法とは異なり、副作用の少ない安全な治療法と考えられる。１’−アセトキシチャビコールアセテートの急性経口毒性（ＬＤ５０）は、マウスについて、１ｇ／ｋｇであり、腹腔内投与では５０ｍｇ／ｋｇ以上である。造血器腫瘍の新たな治療薬として１’−アセトキシチャビコールアセテートおよびその誘導体が臨床応用されることにより、造血器腫瘍の長期予後の改善が期待される。同様に、１’−アセトキシチャビコールアセテートおよびその誘導体は、副作用の少ない、安全な免疫抑制剤としても、利用可能である。
【００１１】
カフェインは、茶、コーヒーなどに含まれる成分であり、したがって、カフェインおよびその誘導体を用いた造血器腫瘍の治療は従来の抗がん剤による化学療法とは異なり、副作用の少ない安全な治療法と考えられる。カフェインの急性経口毒性（ＬＤ５０）は、ラットについて、１７４〜２１０ｍｇ／ｋｇである。造血器腫瘍の新たな治療薬としてカフェインおよびその誘導体が臨床応用されることにより、造血器腫瘍の長期予後の改善が期待される。同様に、カフェインおよびその誘導体は、副作用の少ない、安全な免疫抑制剤、ｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬としても、利用可能である。
【００１２】
カテキンは、緑茶に含まれる成分であり、したがって、カテキンおよびその誘導体を用いた造血器腫瘍の治療は従来の抗がん剤による化学療法とは異なり、副作用の少ない安全な治療法と考えられる。カテキンを含有するチャ乾留物の急性経口毒性（ＬＤ５０）は、ラットについて、３２ ｇ／ｋｇ以上とされている。造血器腫瘍の新たな治療薬としてカテキンおよびその誘導体が臨床応用されることにより、造血器腫瘍の長期予後の改善が期待される。同様に、カテキンおよびその誘導体は、副作用の少ない、安全な免疫抑制剤、ｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬としても、利用可能である。
【００１３】
クルクミンは、ウコンに含まれる色素成分であり、したがって、クルクミンおよびその誘導体を用いた造血器腫瘍の治療は従来の抗がん剤による化学療法とは異なり、副作用の少ない安全な治療法と考えられる。ウコンとはショウガ科に属するクルクマ属の仲間で、世界中で約５０種が認められている。ウコンは、高温多湿を好み、アジア、アフリカ、インド、中南米の熱帯から亜熱帯にかけて広く自生分布し、又栽培されている。日本では沖縄県、鹿児島県が主な産地となっており、日本で栽培されているウコンには、主に秋ウコン（学名：Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ Ｌ．）（沖縄名うっちん）、春ウコン（学名：Ｃｕｒｃｕｍａ ａｒｏｍａｔｉｃａ Ｓａｌｉｓｂ）（キョウオウ）、紫ウコン（ガジュツ）（学名：Ｃｕｒｃｕｍａ ｚｅｄｏａｒｉａ Ｒｏｓｃｏｅ）の三種類がある。クルクミンの急性経口毒性（ＬＤ５０）は、ラットについて、５，０００ ｍｇ／ｋｇ、マウスについて、２，０００ ｍｇ／ｋｇ以上である。造血器腫瘍の新たな治療薬としてクルクミンおよびその誘導体が臨床応用されることにより、造血器腫瘍の長期予後の改善が期待される。同様に、クルクミンおよびその誘導体は、副作用の少ない、安全な免疫抑制剤としても、利用可能である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明は、カスパーゼを活性化することができる化合物またはその薬理上許容できる塩を含有する造血器腫瘍の治療薬を提供する。
【００１５】
また、本発明は、カスパーゼを活性化することができる化合物またはその薬理上許容できる塩を含有する免疫抑制剤を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、カプサイシン、カフェイン、カテキン及びそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物またはその薬理上許容される塩を含有する、ｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬を提供する。
【００１７】
カスパーゼとしては、カスパーゼ１〜１１が知られている。本発明に使用する化合物は、上記カスパーゼのいずれのものを活性化するものであってもよいが、カスパーゼ３、８または９のいずれか１つ又は２つ以上のものを活性化するものであるとよく、好ましくはカスパーゼ３を活性化するものであるとよい。
【００１８】
カスパーゼを活性化することができる化合物としては、カプサイシン、１’−アセトキシチャビコールアセテート、カフェイン、カテキン、クルクミン及びそれらの誘導体を例示することができる。
カプサイシンの構造式を以下に示す。
【００１９】
【化１】
カプサイシンおよびその誘導体としては、下記の一般式（Ｉ）で表される化合物を例示することができる。
【００２０】
【化２】
（式中、Ｒ１は炭素数６〜１１のアルキル基またはアルケニル基であり、Ｒ２は炭素数１〜１２の炭化水素基である。）
【００２１】
Ｒ１は、炭素数６〜１１のアルキル基またはアルケニル基である。炭素数６〜１１のアルキル基またはアルケニル基としては、Ｃ６−１１直鎖状または分枝状アルキル、Ｃ６−１１直鎖状または分枝状アルケニル（例えば、−（ＣＨ２）ｎＣＨ＝ＣＨＣＨ（ＣＨ３）２（ｎは１〜６の整数）で表される基）を挙げることができる。好ましくは、Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎＣＨ＝ＣＨＣＨ（ＣＨ３）２（ｎは１〜６の整数）で表される基、アルキル基である。
【００２２】
Ｒ２は炭素数１〜１２の炭化水素基（例えば、炭素数１〜１２のアルキル基、炭素数６〜１２のシクロアルキル基、炭素数２〜１２のアルケニル基、炭素数２〜１２のアルキニル基、炭素数３〜１２のシクロアルケニル基、炭素数６〜１２のアリール基、炭素数７〜１２のアラルキル基）であり、好ましくは、Ｒ２は炭素数１〜１２のアルキル基（具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル等の低級アルキル基）である。
【００２３】
カプサイシンおよびその誘導体の薬理上許容される塩としては、ナトリウム塩、カルシウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、リシン塩、アルギニン塩などを例示することができる。
【００２４】
カプサイシンおよびその誘導体は、下記の文献に記載の方法に従って、製造することができる。Ｓｐａｔｈ， Ｄａｒｌｉｎｇ， Ｂｅｒ． ６３， ７３７ （１９３０）； Ｌ． Ｃｒｏｍｏｂｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９５５， １０２５； Ｏ．Ｐ． Ｖｉｇ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｄｉａｎ Ｊ． Ｃｈｅｍ． １７Ｂ， ５５８ （１９７９）
【００２５】
また、カプサイシンおよびその誘導体は、常法により、薬理上許容される酸または塩基との塩に導くことができる。
【００２６】
カプサイシンおよびその誘導体ならびに薬理上許容されるそれらの塩は、白血病、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍の治療薬、免疫抑制剤、ｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬として有効である。これらの化合物は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、化学的治療剤）と組み合わせて使用してもよい。
【００２７】
１’−アセトキシチャビコールアセテートの構造式を以下に示す。
【００２８】
【化３】
【００２９】
１’−アセトキシチャビコールアセテートおよびその誘導体としては、下記の一般式（ＸＩ）で表される化合物を例示することができる。
【００３０】
【化４】
（式中、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立して、低級アルキル基または芳香族環基である。）
【００３１】
Ｒ１１は、低級アルキル基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル等のＣ１−４のアルキル基など）または芳香族環基（例えば、フェニル、ナフチル、アントリル等のＣ６−１４芳香族炭化水素残基、ピリジル、フリル、チエニル、イミダゾリル、チアゾリル等の芳香族複素環残基など）である。好ましくは、Ｒ１１は低級アルキル基である。より好ましくは、Ｒ１１はメチル基である。
【００３２】
Ｒ１２は低級アルキル基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル等のＣ１−４のアルキル基など）または芳香族環基（例えば、フェニル、ナフチル、アントリル等のＣ６−１４芳香族炭化水素残基、ピリジル、フリル、チエニル、イミダゾリル、チアゾリル等の芳香族複素環残基など）である。好ましくは、Ｒ１２は低級アルキル基である。より好ましくは、Ｒ１２はメチル基である。
【００３３】
１’−アセトキシチャビコールアセテートおよびその誘導体の薬理上許容される塩としては、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。無機塩基との塩の好適な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、アルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩などが挙げられる。
【００３４】
１’−アセトキシチャビコールアセテートおよびその誘導体は、下記の文献に記載の方法に従って、製造することができる。
・Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ５７（８）， １３４４−１３４５， １９９３
・特開２００２−７８４６４
【００３５】
また、１’−アセトキシチャビコールアセテートおよびその誘導体は、常法により、薬理上許容される酸または塩基との塩に導くことができる。
【００３６】
１’−アセトキシチャビコールアセテートおよびその誘導体ならびに薬理上許容されるそれらの塩は、白血病、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍の治療薬、免疫抑制剤として有効である。これらの化合物は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、化学的治療剤）と組み合わせて使用してもよい。
【００３７】
カフェインの構造式を以下に示す。
【００３８】
【化５】
【００３９】
カフェインおよびその誘導体としては、下記の一般式（ＸＸＩ）で表されるキサンチン誘導体を例示することができる。
【００４０】
【化６】
（式中、Ｒ２１は、メチル基または水素原子であり、Ｒ２２は水素原子または１〜２個のヒドロキシ基もしくは炭素数２〜１０のアルカノイル基が置換してもよい炭素数１〜１２のアルキル基である。）
【００４１】
一般式（ＸＸＩ）で表されるキサンチン誘導体としては、カフェインの他、キサンチン、アミノフィリン、テイフィリン、コリンテオフィリン、テオボブロミン、オクストリフィン、ジプロフィン、プロキシフィリンなどを例示することができる。これらの化合物は市販されており、入手可能である。
【００４２】
カフェインおよびその誘導体の薬理上許容される塩としては、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。無機塩基との塩の好適な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、アルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩などが挙げられる。
【００４３】
カフェインおよびその誘導体は市販されており、入手可能である。
【００４４】
また、カフェインおよびその誘導体は、常法により、薬理上許容される酸または塩基との塩に導くことができる。
【００４５】
カフェインおよびその誘導体ならびに薬理上許容されるその塩は、白血病、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍の治療薬、免疫抑制剤、ｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬として有効である。これらの化合物は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、化学的治療剤）と組み合わせて使用してもよい。
【００４６】
カテキンおよびその誘導体は、一般に、樹木に広く含まれる水溶性の天然多価フェノールを意味するが、本明細書においては、それらの天然多価フェノールのみならず、それらから誘導される化合物も包含する。
。具体的には、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、カテキン、ガロカテキン、エピカテキンジガレート及びエピガロカテキンジガレートなどを例示することができ、（−）−エピカテキン、（−）−エピガロカテキン、（−）−エピカテキンガレート、（−）−エピガロカテキンガレート、（＋）−カテキン、（＋）−ガロカテキン、（−）−エピカテキンジガレート及び（−）−エピガロカテキンジガレートなどの光学異性体が存在する。そのうちのいくつかを以下に示す。
【００４７】
【化７】
【００４８】
カテキンおよびその誘導体の薬理上許容される塩としては、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。無機塩基との塩の好適な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、アルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩などが挙げられる。
【００４９】
カテキンおよびその誘導体は、茶芽に多く含まれることが知られており、茶芽からの抽出により粗カテキンとして得ることができる。より高純度の粗カテキンを得る方法も公知である。
【００５０】
また、カテキンおよびその誘導体は、常法により、薬理上許容される酸または塩基との塩に導くことができる。
【００５１】
カテキンおよびその誘導体ならびに薬理上許容されるそれらの塩は、白血病、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍の治療薬、免疫抑制剤、ｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬として有効である。これらの化合物は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、化学的治療剤）と組み合わせて使用してもよい。
【００５２】
クルクミンの構造式を以下に示す。
【００５３】
【化８】
【００５４】
クルクミンおよびその誘導体としては、下記の一般式（ＸＸＸＩ）で表される化合物を例示することができる。
【００５５】
【化９】
（式中、式中、Ｒ３１、Ｒ３２ 、Ｒ３３ およびＲ３４ は、同一または異なって、水素原子、ヒドロキシ基または低級アルコキシ基である。）
【００５６】
Ｒ３１、Ｒ３２ 、Ｒ３３ およびＲ３４の低級アルコキシのアルキル部分は、炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐のアルキルであり、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等があげられる。具体的なアルコキシ基としては、炭素数１〜２のメトキシ基、エトキシ基が好ましい。式（ＸＸＸＩ）において、Ｒ３２およびＲ３４ がヒドロキシ基である化合物が好ましい。
【００５７】
一般式（ＸＸＸＩ）で表される化合物としては、Ｕ１［ジフェルロイルメタン（ｄｉｆｅｒｕｌｏｙｌｍｅｔｈａｎｅ）、（Ｅ，Ｅ）−１，７−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１，６−ヘプタジエン−３，５−ジオン、以下単にクルクミンというときもある］、Ｕ２［ジメトキシクルクミン（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙｃｕｒｃｕｍｉｎ）、ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシシンナモイル）メタン］、Ｕ３［ビスデメトキシクルクミン（ｂｉｓｄｅｍｅｔｈｏｘｙｃｕｒｃｕｍｉｎ）、ビス（４−ヒドロキシシンナモイル）メタン］、ＤＭＵ１［（Ｅ，Ｅ）−１，７−ビス（３，４−ジメトキシフェニル）−１，６−ヘプタジエン−３，５−ジオン］、ＤＨＵ１［（Ｅ，Ｅ）−１，７−ビス（３，４−ジヒドロキシフェニル）−１，６−ヘプタジエン−３，５−ジオン］等のクルクミン類化合物があげられ、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３およびＤＨＵ１が好ましく用いられ、Ｕ１が特に好ましく用いられる。
【００５８】
クルクミンおよびその誘導体の薬理上許容される塩としては、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。無機塩基との塩の好適な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、アルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩などが挙げられる。
【００５９】
クルクミン類は、熱帯性の生姜科植物ターメリック（Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ Ｌ．）に含まれる黄色色素であり、ターメリックの根茎の乾燥粉末およびそれから精製したクルクミンが市販されている。
【００６０】
また、クルクミンおよびその誘導体は、常法により、薬理上許容される酸または塩基との塩に導くことができる。
【００６１】
クルクミンおよびその誘導体ならびに薬理上許容されるその塩は、白血病、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍の治療薬、免疫抑制剤として有効である。これらの化合物は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、化学的治療剤）と組み合わせて使用してもよい。
【００６２】
カスパーゼを活性化することができる化合物および薬理上許容されるその塩は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの製剤にして、経口投与してもよいし、注射剤、坐剤などの製剤にして、腹腔内や静脈内への注射、直腸投与などにより非経口投与することもできる。
【００６３】
カスパーゼを活性化することができる化合物および薬理上許容される塩の製剤化は、賦形剤（乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトールなどの糖類、バレイショ、コムギ、トウモロコシなどのデンプン、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機物、結晶セルロースなど）、結合剤（デンプンのり液、アラビアゴム、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロースなど）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴール、シリコーン油）、崩壊剤（デンプン、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、ＣＭＣ・Ｎａ、ＣＭＣ・Ｃａ、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウムなど）、矯味矯臭剤（乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、芳香性精油類など）、溶剤（注射用水、滅菌精製水、ゴマ油、ダイズ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実油など）、安定剤（窒素、二酸化炭素などの不活性ガス、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸などのキレート剤、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸、ロンガリットなどの還元物質など）、保存剤（パラオキシ安息香酸エステル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェノール、塩化ベンザルコニウムなど）、界面活性剤（水素添加ヒマシ油、ポリソルベート８０、２０など）、緩衝剤（クエン酸、酢酸、リン酸のナトリウム塩、ホウ酸など）、希釈剤などの製剤添加物を用いて、公知の方法で行われる。
【００６４】
カスパーゼを活性化することができる化合物および薬理上許容されるその塩のヒトへの投与は、疾病の状態の重篤度や生体の応答性によるが、治療の有効性が認められるまで、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期間にわたり、適当な用量、投与方法、頻度で行えばよい。例えば、成人に対して、カプサイシンおよびその誘導体については、１日あたり約０．１〜２０００ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは１日あたり約１〜１０００ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量で、１’−アセトキシチャビコールアセテートおよびその誘導体については、１日あたり約０．０１〜２０００ ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは１日あたり約０．１〜１０００ ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量で、カフェインおよびその誘導体については、１日あたり約０．１〜２０００ ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは１日あたり約１〜１０００ ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量で、カテキンおよびその誘導体については、１日あたり約０．０１〜２０００ ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは１日あたり約０．１〜１０００ ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量で、クルクミン及びそれらの誘導体については、１日あたり約０．０１〜２０００ ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは１日あたり約０．１〜１０００ ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量で、１回または数回に分けて静脈注射により投与するとよいが、その投与量や投与回数は、症状、年齢、投与方法などにより適宜変更しうる。
【００６５】
本発明の分子標的治療薬は、ｐ５３が関与する疾患、例えば、造血器腫瘍（例えば、白血病、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫など）、皮膚癌、大腸癌、胃癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、甲状腺癌、腎癌、前立腺癌、膀胱癌、脳腫瘍などの治療に利用することができる。
【００６６】
【実施例】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６７】
〔実施例１〕
１．材料と方法
（１）材料
・カプサイシン：Ｗａｋｏ ｃｈｅｍｉｃａｌ． Ｃｏ． （Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）より入手
・各種造血器腫瘍細胞株：
ＮＢ４ Ｄｒ．Ｍ．Ｌａｎｏｔｔｅ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ Ｈｏｓｐｉｔａ．， Ｐａｒｉｓ， Ｆｒａｎｃｅ）より供与
ＨＬ−６０：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より入手
ＵＦ−１：我々の研究室にて確立した細胞株
Ｋ５６２、ＫＵ８１２、Ｕ２６６：理研細胞バンクより入手
・各種カスパーゼ阻害剤
Ｚ−ＶＡＤ、カスハ゜ーセ゛９阻害剤、カスハ゜ーセ゛８阻害剤：ＭＢＬより入手
・ワートマニン：Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より入手
・ピフィスリンα：Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ） より入手
・ＮＡＣ（Ｎ−アセチルシステイン）：Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ） より入手
・ＢＳＯ（ブチオニンスルフォキシド）：Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ） より入手・ＤＮＡマイクロアレイ：ＴＯＹＯＢＯ Ｃｏ．Ｌｔｄより入手
・白血病患者サンプル：慶応義塾大学病院入院患者及び外来患者より、文書と同意のもと末梢血または骨髄血を入手
・正常者サンプル：有志より説明と同意のもと入手
ＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）：Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ） より入手
【００６８】
（２）実験方法
各種造血器腫瘍細胞株に対する増殖抑制効果及びアポトーシスの誘導を調べる実験：カプサイシン１００μＭの添加培養で、各種造血器腫瘍細胞株（１Ｘ１０４／ｍｌ）に対しカプサイシン１００μＭの添加培養を行い、トリパンブルー染色を用いて細胞数を算定する。
【００６９】
細胞周期を調べる実験：カプサイシン１００μＭ添加培養各時間後、１Ｘ１０５の細胞を採取し、ＰＩ（最終濃度 ０．５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳにて、ＭｏｄｉＦＩＴ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞周期を解析する。
【００７０】
ＤＮＡラダー形成を調べる実験：ＮＢ４細胞１Ｘ１０５／ｍｌにＣＡＰ１００μＭを添加して０、２４、４８、７２時間培養後に、ＤＮＡを採取し、２％ アガロースゲルにて電気泳動しラダー形成の有無につき検討する。
【００７１】
細胞形態を調べる実験：ＮＢ４細胞１Ｘ１０４ 個をサイトスピンにてスライドグラスに遠心し、ギムザ染色し光学顕微鏡にて（１Ｘ１０４倍）観察する。
【００７２】
アネキシンＶ、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）染色の実験：１Ｘ１０５の細胞を採取し、アネキシンＶ （Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＰＩ（最終濃度 ０．５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳで解析し、アネキシンＶ陽性細胞の割合を測定する。
【００７３】
カスパーゼ３活性を調べる実験：カプサイシン１００μＭ添加培養各時間後、５Ｘ１０５の細胞を採取し、カスハ゜ーセ゛３活性キット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、ＦＡＣＳにて活性を測定する。
【００７４】
発現解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 解析）（プロカスパーゼ３とカスパーゼ３ａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍ、アポトーシス関連蛋白、チトクロームｃ及びβ−アクチン、細胞周期関連蛋白、ｐ５３関連蛋白、Ｓｅｒ ６，９，２０，３７のリン酸化ｐ５３、β−アクチンとｐ５３）カプサイシン１００μＭ添加培養各時間後、蛋白を採取し各レーン １５μｇの蛋白を泳動し各種抗体を用いて解析する。
【００７５】
ミトコンドリア膜電位の変化を調べる実験：カプサイシン１００μＭ添加培養各時間後、５Ｘ１０５の細胞を採取しローダミン１２３（最終濃度１０μＭ）を投与し、１５分間３７℃で静置する。１５００ｇで５分間遠心後上清を捨て、沈殿をＰＢＳに懸濁し、ＰＩ（最終濃度 １０μＭ）を加え、ＦＡＣＳにて解析する。
【００７６】
活性酸素の解析：カプサイシン１００μＭ添加培養各時間後、５Ｘ１０５の細胞を採取し、ジヒドロエチジウム（最終濃度 １０μＭ）をマーカーとして、ＦＡＣＳにて解析する。
【００７７】
ＭＴＴ アッセイ：カプサイシン１００μＭ添加培養各時間後、培養液１００μｌを９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移し、「ＭＴＴ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ （Ｒｏｃｈｅ）」の実験方法に従い、ＭＴＴ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ（１Ｘ） １０μｌを加え、３７℃４時間静置後、ＭＴＴ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ １００μｌを加え、３７℃にて静置後、ＯＤ４５０値をプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）にて解析する。
【００７８】
２．結果
各種造血器腫瘍細胞株の増殖に対するカプサイシンの効果を図１に示す。カプサイシン（以下、「ＣＡＰ」という）１００μＭの添加培養で、各種造血器腫瘍細胞株（１Ｘ１０４／ｍｌ）に対し強い増殖抑制効果が認められた。
【００７９】
ＮＢ４細胞に対し、各種濃度のＣＡＰ及び各種培養時間での細胞周期とアポト−シスの検討を行った結果を図２〜５に示す。
【００８０】
図２から、ＣＡＰ １００μＭ添加培養によりコントロール（ｂａｓｅ：エタノール０．０１％）に対し、優位に細胞の増殖抑制効果を認めることがわかる。
【００８１】
図３から、ＣＡＰが濃度依存性にアポトーシスを誘導することがわかる。
【００８２】
図４から、ＣＡＰ １００μＭ添加培養が時間依存性に細胞周期をＧ１期に止め、アポトーシスに相当する ｐｒｅ−Ｇ１期が増加させることがわかる。
【００８３】
図５から、ＣＡＰが濃度依存性に細胞周期のＧ１期への停止とアポトーシスを増加させることがわかる。
【００８４】
図２〜５の結果から、ＣＡＰが濃度依存的 及び時間依存的にアポト−シスを誘導し・Ｇ１期に細胞周期を停止させる（Ｇ１ ａｒｒｅｓｔ）ことが分かった。
【００８５】
ＮＢ４細胞１Ｘ１０５／ｍｌにＣＡＰ１００μＭを添加して０、２４、４８、７２時間培養後に、ＤＮＡラダー形成を調べた結果を図６に示すＣＡＰ添加培養後（１００μＭ ２４時間）のＮＢ４細胞株はＤＮＡラダー形成を認めた。
【００８６】
ＮＢ４細胞１Ｘ１０５／ｍｌにＣＡＰ１００μＭを添加して２４時間培養して、細胞の形態を観察した結果を図７に示す。ＣＡＰ添加培養後（１００μＭ ２４時間）のＮＢ４細胞株は、アポト−シスに典型的な核の濃縮、断片化を認めた。
【００８７】
ＮＢ４細胞１Ｘ１０４／ｍｌにＣＡＰ１００μＭを添加して２４時間培養して、細胞周期を解析した結果を図８に示す。細胞周期の解析では、Ｇ１ ａｒｒｅｓｔ・Ｓ期の減少とともにＣＡＰ １００ｕＭ投与２４時間後にアポト−シスを示す、Ｓｕｂ Ｇ１分画の増加を認めた。
【００８８】
さらに、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いたアネキシンＶ ， ＰＩ染色による早期アポトーシスの検討結果を図９に示す。ＣＡＰ投与後、経時的にアネキシンＶ陽性細胞の増加を認めた。以上の結果からＣＡＰはＮＢ４細胞の細胞周期をＧ１期に停止させ、アポトーシス誘導を介して増殖を抑制することが示された。
【００８９】
次に、ＣＡＰによるアポートシス誘導機構に関する解析を行った。まず、ＦＡＣＳを用いてカスパーゼ３の活性化を検討した。結果を図１０に示す。ＣＡＰ １００μＭ投与３時間後よりカスハ゜ーセ゛３の活性化を認めた。経時的な増加を認めた。
【００９０】
種々のカスパーゼ阻害剤（Ｚ−ＶＡＤ、カスハ゜ーセ゛９阻害剤）を用いて検討した。結果を図１１および１２に示す。カスハ゜ーセ゛３， ９阻害剤投与にてＣＡＰによるアポトーシスが解除された（図１１）。また、４８時間後よりＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔ解析で１７ｋＤのカスパーゼ ３のａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍを認めた（図１２）。一方、カスパーゼ ３及びｐａｎ‐カスパーゼ阻害剤投与時は、細胞増殖抑制は解除されないものの、ＦＡＣＳ解析にてアポト−シスの減少を認めた（図３８）。以上の結果から、ＮＢ４におけるアポト−シスにカスパーゼ‐３，９が関与することが示された。
【００９１】
次に、アポト−シス関連蛋白について検討を行った結果を図１３に示す。Ｂｃｌ−２， Ｂｃｌ−ｘＬは発現変化を認めなかったが、図１７に示すように、アポト−シス誘導を促進するＢａｘの経時的な発現増加を認めた。また、カスパーゼ ３ ａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍの出現も認めた。（図１２）
以上の結果より、カプサイシンがＢａｘ 蛋白を介して、カスハ゜ーセ゛９を活性化し、カスハ゜ーセ゛３が活性化されアポトーシスが誘導されることが示された。
【００９２】
ＣＡＰ→Ｂａｘ→カスパーゼ９→カスパーゼ３→アポト−シス
【００９３】
ミトコンドリア膜電位の変化を検討した結果を図１４に示す。ＣＡＰ １００μＭ投与９時間後よりミトコンドリア膜電位の低下を認め、さらに細胞質分画のチトクロームｃの経時的な発現増加を認めた（図１５）。以上の結果より、ＣＡＰによるアポト−シスはＢａｘを介するミトコンドリア膜電位の低下、チトクロームｃの遊離、カスパーゼ ９、カスパーゼ ３を介すると示唆された。
【００９４】
次に、細胞周期関連蛋白について検討を行った結果を図１６に示す。ＣＡＰ １００μＭ投与時にｐ２１の経時的な増加およびｃｙｃｌｉｎＤ１の経時的な減少を認めた。一方、ｐ２７、ｃｙｃｌｉｎ Ａ，Ｂ１，Ｄ２，Ｄ３，Ｅには経時的な発現の変化は認められなかった。また、Ｒｂ（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）蛋白のリン酸化の低下も認めた。（データは示さず）
以上の結果より、ＣＡＰはｐ２１の増加、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１の減少、Ｒｂ蛋白の脱リン酸化を介してＧ１ ａｒｒｅｓｔを起こす事が示唆された。
【００９５】
ＣＡＰ→ｐ２１↑，ｃｙｃｌｉｎＤ１↓→Ｇ１ ａｒｒｅｓｔ
【００９６】
前記のようにＮＢ４細胞と比較し、ＡＰＬ細胞株であるＨＬ−６０，ＵＦ−１やＣＭＬ細胞株であるＫ５６２，ＫＵ８１２では、ＣＡＰに対する感受性が低い。Ｋ５６２・ＨＬ６０
では、ｐ５３の欠損や機能異常が報告されている（Ｔｒｅｐｅｌ Ｍ， Ｓｃｈｅｄｉｎｇ Ｓ， Ｇｒｏｓｃｕｒｔｈ Ｐ， Ｈｏｒｎｙ ＨＰ， Ｍｌｉｐｉｅｒｏ Ｕ， Ｂｒｕｇｇｅｒ Ｗ， Ｄｉｃｈｇａｎｓ Ｊ， Ｗｅｌｌｅｒ Ｍ． Ａ ｎｅｗ ｌｏｏｋ ａｔ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｐ５３ ｉｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｌｅｕｋｅｍｉａ １９９７；１１（１１）：１８４２−９． Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｔ， Ｐｏｍｍｉｅｒ Ｙ． Ｃａｍｐｔｏｔｅｎｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｐ５３−ｎｕｌｌ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ ＨＬ６０ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉ： ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ ａｎｄ ｄｉｃｈｌｏｒｏｉｓｏｃｏｕｍａｒｉｎ ｓｕｇｇｅｓｔ ａｎ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｖｏｔｈ ｃａｓｐａｓｅｓ ａｎｄ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ． Ｌｅｕｋｅｍｉａ １９９７；１１（８）：１２３８−４４）。そこで、本発明者らは、ＮＢ４，ＵＦ−１， ＫＵ８１２のｐ５３の発現を解析したところ、ＫＵ８１２ではｍＲＮＡの発現が見られなかった（データは示さず）。また、ＨＬ−６０、ＵＦ−１、Ｕ２６６においてｐ５３の蛋白の発現は認められなかった（データは示さず）。また、細胞周期関連蛋白の解析の際に認めたｐ２１の増加及びｃｙｃｌｉｎＤ１の経時的な減少とｐ５３の関連性が以前から報告されている（Ｌｉ Ｙ， Ｊｅｎｋｉｎｓ ＣＷ， Ｎｉｃｈｏｌｓ ＭＡ， Ｘｉｏｎｇ Ｙ． Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐ５３ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐ２１． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９９４；９（８）：２２６１−８））。以上の結果から、我々はＣＡＰにおけるＮＢ４細胞のアポトーシスにおいてｐ５３の関連の可能性につき検討を進めることとした。一方ＮＢ４細胞では、野生型のｐ５３のｍＲＮＡ及び蛋白の発現を認めた（データは示さず）。
【００９７】
まず、本発明者らはＣＡＰ １００μＭ投与時のＮＢ４細胞におけるｐ５３及びその関連蛋白の発現解析をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔ解析にて行った。結果を図１７に示す。ＣＡＰ １００μＭ投与にて、ｐ５３ 蛋白の経時的な増加を認めた。一方ＭＤＭ２、ｐ７３には発現の変化は認められなかった。
【００９８】
ｐ５３の活性化のメカニズムとして以前よりセリン残基（Ｓｅｒ）のリン酸化が知られている（Ｂａｎｉｎ， Ｓ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ ｂｙ ＡＴＭ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８１， １６７４−１６７７））。ＤＮＡ ｄａｍａｇｅや放射線照射、各種抗がん剤（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａなど）投与時のｐ５３の活性化にセリン残基リン酸化が関与すると報告されている。（Ｂａｎｉｎ， Ｓ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ ｂｙ ＡＴＭ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８１， １６７４−１６７７Ｃａｎｍａｎ， ｅｔ ａｌ（１９９８） Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＡＴＭ ｋｉｎａｓｅ ｂｙ ｉｏｎｉｓｉｎｇ ｒａｄｉａｔｉｏｎａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８１，１６７７−１６７９）。そこで、本発明者らは、ＣＡＰ １００μＭ投与時のｐ５３のリン酸化につき解析を行った。結果を図１８に示す。ＣＡＰ １００μＭ投与時Ｓｅｒ １５のリン酸化の経時的な増加を認めた。一方、Ｓｅｒ ６，９，２０，３７のリン酸化に経時的な変化は認められなかった。
【００９９】
以上の結果より、カプサイシン投与により、ｐ５３蛋白のセリン１５残基がリン酸化され、ｐ５３蛋白が増加し、ｐ２１の増加・ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１の減少が生じ、Ｇ１期に細胞周期が停止することが示唆された。
【０１００】
ｐ５３の阻害剤として最近ピフィスリンα（ＰＦＴα）が報告されている。（Ｋｏｍａｒｏｖ ＰＧ． Ｋｏｍａｒｏｖａ ＥＡ． Ｋｏｎｄｒａｔｏｖ ＲＶ． Ｃｈｒｉｓｔｏｖ−Ｔｓｅｌｋｏｖ Ｋ． Ｃｏｏｎ ＪＳ． Ｃｈｅｒｎｏｖ ＭＶ． Ｇｕｄｋｏｖ ＡＶ． Ａ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｐ５３ ｔｈａｔ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｍｉｃｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｉｄｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｒａｐｙ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９；２８５（５４３４）：１７３３−７）ＰＦＴαはｐ５３の発現そのものは変化させないものの、その下流の分子であるｐ２１やＢａｘなどの発現を抑制することにより、ｐ５３の作用を阻害するといわれている。そこで、本発明者らは、ＣＡＰによるＮＢ４細胞のアポト−シスにおけるｐ５３の関連性を解析するためにＰＦＴαを用いてその抑制ができるかを検討した。結果を図２０及び２１に示す。Ｐ５３ 阻害剤であるＰＦＴα （１００ｎＭ ３時間前投与）を投与したところ、ＣＡＰによるＮＢ４細胞のアポト−シス及びＧ１ ａｒｒｅｓｔを抑制した。以上の結果より、ＣＡＰによるＮＢ４細胞への影響において、ｐ５３が重要な役割を果たしていることが示された。また、ＰＦＴα投与時の発現蛋白を調べたところｐ２１， Ｂａｘの発現低下および、ＣＡＰ投与時の、発現増加の抑制を認めた（データは示さず）。
【０１０１】
さらに、本発明者らは、ｐ５３のアンチセンスを用いて、ＣＡＰによるＮＢ４細胞のＧ１ ａｒｒｅｓｔ及びアポト−シスが抑制できるかを検討した。ｐ５３のアンチセンス， コントロールセンス， ミスマッチセンス（アンチセンスとは６０％ ミスマッチ）を以下のように作成し、各々１μＭ ２４時間前投与し、アンチセンスの分解を少なくするために、培養液をＲＰＭＩ＋５％ＦＢＳ＋ＰＣ／ＳＭとし実験を行った。
１） アンチセンス オリゴヌクレオチド
５’−ＣＧＧＣＴＣＣＴＣＣＡＴＧＧＣＡＧＴ−３’（配列番号１）
２） コントロール オリゴヌクレオチド
５’−ＣＴＧＡＧＧＣＴＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣ−３’（配列番号２）
３） ミスマッチ オリゴヌクレオチド
５’−ＣＧＧＧＴＣＣＴＣＴＡＣＧＣＴＡＧＴ−３’（配列番号３）
【０１０２】
結果を図２２及び２３に示す。アンチセンスを前投与した細胞では、ＣＡＰによるＮＢ４細胞の、Ｇ１ ａｒｒｅｓｔ及びアポト−シスが抑制することが分かった。以上の結果より、ＣＡＰにＮＢ４細胞へのアポト−シス及び細胞周期の停止にｐ５３が重要な役割をしていることが分かった。
【０１０３】
ｐ５３の活性化のメカニズムの一つとして活性酸素の産生が知られている（Ｓｈａｃｋｅｌｆｏｒｄ， Ｒ．Ｅ．，Ｉｎｎｅｓ， Ｃ．Ｌ．，Ｓｉｅｖｅｒ， Ｓ．Ｏ．， Ｈｅｉｎｌｏｔｈ， Ａ．Ｎ．， Ｌｅａｄｏｎ， Ｓ．Ａ．， ａｎｄＰａｕｌｅｓ， Ｒ．Ｓ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７６，２１９５１−２１９５９）。また、抗癌剤、放射線による種々の癌細胞のアポト−シス誘導や亜ヒ酸によるＡＰＬや多発性骨髄腫細胞のアポト−シス誘導に活性酸素が重要な役割を果たしていることが報告されている（Ｄａｉ Ｊ， Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ＲＳ， Ｗａｘｍａｎ Ｓ， Ｊｉｎｇ Ｙ． Ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｃｅｌｌｓ ｃａｎ ｂｅ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ ｔｏ ｕｎｄｅｒｇｏ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ａｒｓｅｎｉｃ ｔｏｒｉｏｘｉｄｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｒｅｄｏｘ ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｌｏｏｄ １９９９ ；９３（１）２６８−９７）。また、ＮＢ４細胞はク゛ルタチオンが他の白血病細胞株と比較し、少ないことが知られている（（Ｄａｉ Ｊ， Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ＲＳ， Ｗａｘｍａｎ Ｓ， Ｊｉｎｇ Ｙ． Ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｃｅｌｌｓ ｃａｎ ｂｅ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ ｔｏ ｕｎｄｅｒｇｏ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ａｒｓｅｎｉｃ ｔｏｒｉｏｘｉｄｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｒｅｄｏｘ ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｌｏｏｄ １９９９ ；９３（１）２６８−９７）。そこで、本発明者らは、ＣＡＰによるＮＢ４細胞のアポト−シス誘導における活性酸素の解析を行った。結果を図２４に示す。ＮＢ４細胞では、ＣＡＰ １００μＭ投与４時間後に、細胞内活性酸素濃度の増加が認められた。一般に細胞内には有害な活性酸素を除去するＳＯＤ、ク゛ルタチオン、カタラーセ゛、チオレト゛キシンなどの抗酸化物質が存在する。
本発明者らは、ク゛ルタチオン前駆体であるＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）によりＣＡＰによるアポートシスを抑制することができるか、また、ク゛ルタチオン阻害作用を有するフ゛チオニンスルフォキシト゛（ＢＳＯ）を用いて（１ｍＭ ８時間前投与）アポト−シスが増強されるかを解析することによりク゛ルタチオン（ＧＳＨ）とＣＡＰによるアポト−シスとの関連を検討した。結果を図２５及び２６に示す。ク゛ルタチオン前駆体であるＮＡＣ（１００μＭ １時間前投与）を前投与し活性酸素を除去すると、ＣＡＰによるＮＢ４細胞のアポト−シス誘導、細胞周期のＧ１ ａｒｒｅｓｔが抑制されることがわかった。
【０１０４】
以上の結果より、カプサイシンによる白血病細胞のアポトーシス誘導および細胞周期Ｇ１期への停止の機序として、ｐ５３セリン１５残基のリン酸化において、ＡＴＲ／ＡＴＭ等のリン酸化酵素の重要性が示唆された。また、そのリン酸化酵素の活性化に対し活性酸素の産生の関与も示された。
【０１０５】
以上よりカプサイシン投与により、活性酸素・ＡＴＲ／ＡＴＭなどを介し、ｐ５３セリン残基がリン酸化されＢａｘ蛋白・ミトコンドリア膜電位の低下・チトクローム ｃ遊離を介し、カスハ゜ーセ゛の系が活性化され、アポトーシスが誘導されることが示唆された。
【０１０６】
ＣＡＰ→活性酸素産生→ＡＴＲ→ｐ５３ Ｓｅｒ １５ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ→ｐ５３↑→Ｂａｘ→ミトコント゛リア膜電位低下→チトクローム ｃ 遊離→カスパーゼ ９→カスパーゼ ３→アポトーシス→ｐ２１↑、ｃｙｃｌｉｎＤ１↓→Ｇ１ ａｒｒｅｓｔ
【０１０７】
次に、本発明者らは、実際の患者サンプルでのＣＡＰの効果につき検討を行った。計１１検体（急性骨髄性白血病・急性リンパ急性白血病・慢性骨髄性白血病・骨髄腫等含む）につき、ＭＴＴ アッセイ， アネキシン Ｖ−ＰＩ解析を含め、ＣＡＰの効果につき検討を行った。１１検体のうち１０検体にＣＡＰの効果を認めた。
【０１０８】
患者検体のｐ５３の発現につき検討を行った結果を図２７に示す。ＣＡＰの効果のあった１０検体にはｐ５３のｍＲＮＡの発現を認めたが、効果の見られなかった１検体にはｐ５３の発現は見られなかった。以上の結果より、実際の患者検体においてもｐ５３とＣＡＰの効果の関連性が示唆された。
【０１０９】
次に、本発明者らは、実際の患者サンプル（Ｊ．Ｕ氏）でのＣＡＰの効果につき検討を行った。フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病の骨髄を採取後、フィコールで分離し、１Ｘ１０７／ｍｌにＲＰＭＩ（＋２０％ ＦＢＳ＋ＰＣ／ＳＭ）で薄め、採取日当日から２４時間・４８時間後のＣＡＰ １０μＭ、５０μＭ及び１００μＭ 各濃度の効果を検討した。
【０１１０】
まず、ＭＴＴ アッセイ及びｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔを用いて細胞増殖抑制につき検討を行ったところ、濃度依存性に細胞増殖が抑制された（図２８）。
【０１１１】
次に、この患者サンプルでのＣＡＰによるアポト−シス及び細胞周期についての検討を行った。結果を図２９〜３１に示す。ＣＡＰ １００μＭ投与２４時間後にアネキシンＶ陽性細胞の著明な増加を認めた。また、ＣＡＰ投与後、濃度及び時間依存性にアネキシンＶ（＋）の増加を認めた（図２９）。培養４８時間の条件下での、ＣＡＰ濃度とアネキシンＶ−ＰＩ染色によるアポトーシスの検討結果を図３１に、ＣＡＰ濃度とアポト−シス（％）の関係を図３２に示す。
【０１１２】
この患者サンプルを用いて、ｐ５３の発現の有無につき検討したところ、正常なｐ５３の発現を認めた（データは示さず）。
【０１１３】
次に、本発明者らは、実際の慢性骨髄性白血病 慢性期の患者サンプルでのＣＡＰの効果につき検討を行った。患者の末梢血を採取後、フィコールで分離し、１Ｘ１０７／ｍｌにＲＰＭＩ（＋２０％ ＦＢＳ＋ＰＣ／ＳＭ）で薄め、採取日当日から２４時間・４８時間・７２時間後のＣＡＰ １０μＭ、５０μＭ及び１００μＭ 各濃度の効果を検討した。結果を図３３に示す。ＣＡＰ投与により、濃度依存的・時間依存的にアネキシンＶ（＋）の増加が認められた。
【０１１４】
次に我々は、急性前骨髄球性白血病の患者の末梢血を採取後、フィコールで分離し、１Ｘ１０７／ｍｌにＲＰＭＩ（＋２０％ ＦＢＳ＋ＰＣ／ＳＭ）で薄め、採取日当日から２４時間後のＣＡＰ １０μＭ、５０μＭ及び１００μＭ 各濃度の効果を検討した。
【０１１５】
まず、ＭＴＴ アッセイ及びアネキシンＶ−ＰＩ 染色法を用いて細胞増殖抑制及びアポト−シス誘導につき検討を行ったところ、細胞増殖抑制およびアポト−シスの誘導は起こらなかった（図３４）。
【０１１６】
本検体のｐ５３の発現につき検討したところ、ｐ５３ ｍＲＮＡの発現を認めなかった（データは示さず）。
【０１１７】
また、急性骨髄性白血病および急性前骨髄球性白血病患者サンプルへのカプサイシンの効果（アポトーシス誘導）を図３９に示す。ＣＡＰ投与により、濃度依存的にアネキシンＶ（＋）の増加が認められた。
【０１１８】
さらに、多発性骨髄腫患者サンプルへのカプサイシンの効果を図４０に示す。ＣＡＰ投与により、濃度依存的に細胞増殖が抑制された。
【０１１９】
次に、正常者末梢血単核球でのＣＡＰ１０μＭおよび１００μＭによる細胞増殖抑制についての検討を行った。結果を図３５に示す。ＣＡＰ投与による細胞増殖抑制効果は認めなかった。
【０１２０】
正常のヒト末梢血より単核球を分離し、ＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）で刺激し、活性化したリンパ球（主にＴ細胞）１×１０６／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して２４時間培養した時のＭＴＴアッセイの結果を図３５に示す。ＭＴＴアッセイで細胞増殖が抑制され、また、図３６に示すようにアポトーシス分画が増加していることが確認された。このことは、ＣＡＰが活性化されたＴ細胞を抑制することを示している。また、活性化されていない正常リンパ球には影響を与えなかった（データは示さず）。これらのことは、ＣＡＰが免疫抑制剤として利用可能であることを示している。
【０１２１】
以上の結果から、以下の結論が導かれる。
・唐辛子の成分ＣＡＰは、ＮＢ４細胞をはじめｐ５３を正常発現する種々の白血病、多発性骨髄腫などの造血器腫瘍細胞の細胞周期の停止を誘導した。
・その誘導には、ｐ５３の活性化を介したｐ２１／ｃｙｃｌｉｎＤ１の経路による細胞周期の停止および、ＢＡＸ／チトクロームｃ／カスパーゼ−３によるアポトーシス誘導の経路が重要な働きをしていることが示唆された。
【０１２２】
以上の結果より、ｐ５３はＮＢ４細胞をはじめｐ５３を正常発現する種々の白血病、多発性骨髄腫などの造血器腫瘍細胞のアポト−シス誘導の標的分子として重要な役割を果たしていることが示唆される。
【０１２３】
以上の結果から予測される、ＣＡＰの作用機序を図３７にまとめた。ＮＢ４細胞においてＣＡＰは活性酸素を細胞内（あるいはミトコンドリアで）産生し、ＡＴＲなどを介してｐ５３のＳｅｒ１５残基のリン酸化を起こすことにより、ＭＤＭ２との会合を抑制しｐ５３を安定化させる一方で転写を活性化する。そのことにより、一方でｐ２１の発現の上昇・ｃｙｃｌｉｎＤ１の低下等を開始、細胞周期をＧ１期で停止させる。また、一方でＢＡＸを介しミトコンドリア膜電位を低下させ、ミトコンドリアから細胞質内にチトクロームＣ遊離が起こり、その後カスパーゼ９及び３あるいは８を活性化することによりアポト−シスを誘導すると考えられる。
【０１２４】
〔実施例２〕
１．材料と方法
（１）材料
・１’−アセトキシチャビコールアセテート：京都大学農学部大東先生、村上先生より供与
・各種造血器腫瘍細胞株：
ＮＢ４ Ｄｒ．Ｍ．Ｌａｎｏｔｔｅ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ Ｈｏｓｐｉｔａ．， Ｐａｒｉｓ， Ｆｒａｎｃｅ）より供与
ＨＬ−６０：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ； Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より入手
ＵＦ−１：我々の研究室にて確立した細胞株
Ｋ５６２、ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ、Ｕ２６６：理研細胞バンクより入手
・各種カスパーゼ阻害剤
Ｚ−ＶＡＤ、カスハ゜ーセ゛９阻害剤、カスハ゜ーセ゛８阻害剤：ＭＢＬより入手
・抗Ｆａｓ抗体、抗Ｆａｓ−ｌｉｇａｎｄ（Ｆａｓ−Ｌ）抗体：ＭＢＬより入手
・ＮＡＣ（Ｎ−アセチルシステイン）：Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ） より入手
・ＢＳＯ（ブチオニンスルフォキシド）：Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ） より入手・カスパーゼ８および９活性キット：Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎより入手
・白血病患者サンプル：慶応義塾大学病院入院患者及び外来患者より、文書による同意のもと末梢血または骨髄血を入手
・正常者サンプル：有志より説明と同意のもと入手
・ＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）：Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ） より入手
【０１２５】
（２）実験方法
・各種造血器腫瘍細胞株に対する増殖抑制効果及びアポトーシスの誘導を調べる実験：各種造血器腫瘍細胞株（１Ｘ１０５／ｍｌ）に対し１’−アセトキシチャビコールアセテート １０μＭ（または０−２０μＭ）の添加培養を行い、トリパンブルー染色を用いて細胞数を算定する。
【０１２６】
・細胞形態を調べる実験：ＮＢ４細胞１Ｘ１０４ 個をサイトスピンにてスライドグラスに遠心し、ギムザ染色し光学顕微鏡にて（１Ｘ１０４倍）観察する。
・アネキシンＶ、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）染色の実験：１Ｘ１０５の細胞を採取し、 アネキシンＶ （Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＰＩ（最終濃度 ０．５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳで解析し、アネキシンＶ陽性細胞の割合を測定する。
【０１２７】
・カスパーゼ３活性を調べる実験：１’−アセトキシチャビコールアセテート １０μＭ添加培養各時間後、５Ｘ１０５の細胞を採取し、カスハ゜ーセ゛３活性キット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、ＦＡＣＳにて活性を測定する。
【０１２８】
・細胞周期を調べる実験：１’−アセトキシチャビコールアセテートを各濃度で添加培養２４時間後、１Ｘ１０５の細胞を採取し、ＰＩ（最終濃度 ０．５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳにて、ＭｏｄｉＦＩＴ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞周期を解析する。
【０１２９】
・発現解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 解析）（カスパーゼ３、カスパーゼ８、Ｂａｘ、チトクロームｃ、Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ及びβ−アクチン）１’−アセトキシチャビコールアセテート１０μＭ添加培養各時間後、蛋白を採取し各レーン １５μｇの蛋白を泳動し各種抗体を用いて解析する。チトクローム ｃ， Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＲＯ， Ｂａｘでは細胞質分画およびミトコンドリア分画を採取し、同様に泳動し各種抗体を用いて解析する。
【０１３０】
・ミトコンドリア膜電位の変化を調べる実験：１’−アセトキシチャビコールアセテート １０μＭ添加培養１２時間後、５Ｘ１０５の細胞を採取しローダミン１２３（最終濃度１０μＭ）を投与し、１５分間３７℃で静置する。１５００ｇで５分間遠心後上清を捨て、沈殿をＰＢＳに懸濁し、ＰＩ（最終濃度 １０μＭ）を加え、ＦＡＣＳにて解析する。
【０１３１】
・活性酸素の解析：１’−アセトキシチャビコールアセテート １０μＭ添加培養各時間後、５Ｘ１０５の細胞を採取し、ジヒドロエチジウム（最終濃度 １０ｕＭ）をマーカーとして、ＦＡＣＳにて解析する。
【０１３２】
・Ｆａｓ発現解析：１’−アセトキシチャビコールアセテート １０μＭ添加培養各時間後、５Ｘ１０５の細胞を採取し、抗Ｆａｓ／ＣＤ９５抗体（ＺＢ４ ＭＢＬ）（最終濃度 １０ｕｇ／ｍｌ）を加え、ＦＡＣＳにて解析する。
【０１３３】
・ＭＴＴ アッセイ：１’−アセトキシチャビコールアセテート を各濃度で添加培養各時間後、培養液１００μｌを９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移し、「ＭＴＴ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ （Ｒｏｃｈｅ）」の実験方法に従い、ＭＴＴ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ（１Ｘ） １０μｌを加え、３７℃４時間静置後、ＭＴＴ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ １００μｌを加え、３７℃にて静置後、ＯＤ４５０値をプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）にて解析する。
【０１３４】
２．結果
各種造血器腫瘍細胞株の増殖に対する１’−アセトキシチャビコールアセテートの効果を図４１に示す。１’−アセトキシチャビコールアセテート（以下、「ＡＣＡ」という）１０μＭの添加培養で、各種造血器腫瘍細胞株（１Ｘ１０５／ｍｌ）に対し濃度および時間依存性に増殖抑制効果を認めた。
【０１３５】
ＮＢ４細胞１Ｘ１０５／ｍｌにＡＣＡ １０μＭを添加し、ＨＳ−ｓｕｌｔａｎでは４時間・ＮＢ４では１２時間培養して、細胞の形態を観察した結果を図４２に示す。ＡＣＡ添加培養後のＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞株およびＮＢ４細胞株は、アポト−シスに典型的な核の濃縮、断片化を認めた。
【０１３６】
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いたアネキシンＶ ， ＰＩ染色による早期アポトーシスの検討結果を図４３に示す。ＡＣＡ投与後、経時的にアネキシンＶ陽性細胞の増加を認めた。以上の結果からＡＣＡはＮＢ４細胞およびＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞に、アポトーシス誘導を介して増殖を抑制することが示された。
【０１３７】
次に、種々のカスパーゼ阻害剤（Ｚ−ＶＡＤ、カスハ゜ーセ゛８、カスハ゜ーセ゛９阻害剤）を用いて検討した。結果を図４４に示す。カスハ゜ーセ゛３，８，９阻害剤投与にてＡＣＡによるアポトーシスが解除された。また、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔ解析でカスパーゼ ３および８のａｃｔｉｖｅｆｏｒｍをの出現を確認した（図４５）。以上の結果から、ＮＢ４におけるアポト−シスにカスパーゼ‐３，８，９が関与することが示された。
【０１３８】
ＮＢ４細胞１Ｘ１０４／ｍｌにＡＣＡ １、５または１０μＭ添加して２４時間培養して、細胞周期を解析した結果を図５４に示す。細胞周期の解析では、Ｇ１ ａｒｒｅｓｔ・Ｓ期の減少とともにＡＣＡ ５μＭ投与２４時間後にアポト−シスを示す、Ｓｕｂ−Ｇ１分画の増加を認めた。
【０１３９】
ＡＣＡによるアポト−シス誘導における活性酸素の産生の解析を行った。結果を図４７に示す（図４７はＨＳ−ｓｕｌｔａｎにおける結果であるがＮＢ４に関しても同様の結果が得られている。データは示さず）。ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞では、ＡＣＡ １０μＭ投与１時間後に、細胞内活性酸素濃度の増加が認められた。一般に細胞内には有害な活性酸素を除去するＳＯＤ、ク゛ルタチオン、カタラーセ゛、チオレト゛キシンなどの抗酸化物質が存在する。
本発明者らは、ク゛ルタチオン前駆体であるＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）によりＡＣＡによるアポートシスを抑制することができるか、また、ク゛ルタチオン阻害作用を有するフ゛チオニンスルフォキシト゛（ＢＳＯ）を用いて（１ｍＭ ８時間前投与）アポト−シスが増強されるかを解析することによりク゛ルタチオン（ＧＳＨ）とＡＣＡによるアポト−シスとの関連を検討した。結果を図４８に示す。ク゛ルタチオン前駆体であるＮＡＣ（１ｍＭ １時間前）を前投与し活性酸素を除去すると、ＡＣＡによるＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞のアポト−シス誘導が抑制されることがわかった。（ＮＢ４細胞においてもＮＡＣ １００μＭ １時間前投与にてアポトーシスの誘導の抑制が得られた。データは示さず）
【０１４０】
また、ＢＳＯ投与にてアポトーシスが促進されること、ＡＣＡ投与にてＧＳＨが低下することも確認した。（データは示さず）
【０１４１】
活性酸素の産生によるミトコンドリア膜電位の変化には、Ｂａｘ蛋白の重要性が多数報告されている。そこで我々は、Ｂａｘ蛋白の変化につきＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ解析を用いて解析を行った。結果を図４６に示す。総Ｂａｘ蛋白には大きな変動は認められなかった。しかし、ミトコンドリア分画、細胞質分画をそれぞれ採取し、Ｂａｘ蛋白の発現につき検討を行ったところ、時間依存性に細胞質分画での減少とミトコンドリア分画での増加を認めた。以上の結果より、ＡＣＡによるアポトーシスの誘導にＢａｘ蛋白の関与が考えられた。また、細胞質分画においてチトクローム ｃ，
Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ蛋白の発現の増加も認めた。
以上の結果より、Ｂａｘが細胞質からミトコンドリアに転送され、ミトコンドリア膜電位が変化、チトクローム ｃの遊離が生じ、アポトーシスが誘導されると考えられた。
ＡＣＡ→ＲＯＳ→Ｂａｘ→カスパーゼ ９→カスパーゼ ３→アポト−シス
【０１４２】
ミトコンドリア膜電位の変化を検討した結果を図５５に示す。ＡＣＡ １０μＭ投与９時間後よりミトコンドリア膜電位の低下を認めた。以上の結果より、ＡＣＡによるアポト−シスはＢａｘを介するミトコンドリア膜電位の低下、チトクロームｃの遊離、カスパーゼ ９、カスパーゼ ３を介することが示された。
【０１４３】
以上の結果より、ＡＣＡによる造血器腫瘍細胞のアポトーシス誘導の機序として、活性酸素の産生、Ｂａｘ蛋白のミトコンドリアへの移行、ミトコンドリア膜電位の低下、カスハ゜ーセ゛９活性化の重要性が示された。
ＡＣＡ→活性酸素産生→Ｂａｘ→ミトコント゛リア膜電位低下→チトクローム ｃ 遊離→カスパーゼ ９→カスパーゼ ３→アポトーシス
【０１４４】
カスハ゜ーセ゛８の活性化に関しては、以前よりＦａｓ（ＣＤ９５）をはじめとする死受容体（Ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の関与が報告されている。今回我々は、Ｆａｓ／Ｆａｓ−Ｌの関与につき抗Ｆａｓ 抗体（ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｎｄ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ２種類）、蛋白の発現につきＦＡＣＳを用いて検討を行った。
【０１４５】
ＮＢ４においてａｇｏｎｉｓｔｉｃ Ｆａｓ抗体（ＣＨ１１）にて、アポトーシスの誘導、ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ Ｆａｓ抗体（ＺＢ４）にて、アポトーシスの抑制を認めた（図５０）。また、ＮＢ４における、ＡＣＡ １０μＭ投与時のａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ抗体によるアポトーシスの抑制につき検討を行ったところ、ＡＣＡによるアポトーシスをほほ完全に抑制した（図５０）。また、ＦＡＣＳにてＡＣＡ投与時のＦａｓおよびＦａｓ−Ｌの発現誘導を認めた（図４９）。以上の結果より、ＡＣＡによるアポトーシスの誘導には、Ｆａｓの系が関与していることが示された。
【０１４６】
次に、本発明者らは、実際の患者サンプルでのＡＣＡの効果につき検討を行った。計２検体（急性骨髄性白血病・骨髄腫）につき、ＭＴＴ アッセイにてＡＣＡの効果につき検討を行った。図５１に示したように、２検体ともにＡＣＡの濃度依存性の細胞増殖抑制効果を認めた。また、アネキシンＶをマーカーとしてアポトーシスの誘導についての検討も行い、ＡＣＡにてアポトーシスが誘導されていることを確認した（データは示さず）。また、ＦＡＣＳを用いてＦａｓの誘導についての検討も行い、ＡＣＡ添加培養にてＦａｓが誘導されていることも確認した。以上の結果より、実際の患者検体においてもＦａｓとＡＣＡの効果の関連性が示唆された。
【０１４７】
正常のヒト末梢血より単核球を分離し、ＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）で刺激し、活性化したリンパ球（主にＴ細胞）１×１０６／ｍｌにＡＣＡ １０μＭを添加して２４時間培養した時のＭＴＴアッセイの結果を図５２に示す。ＭＴＴアッセイで細胞増殖が抑制され、また、アネキシン−Ｖを用いたアッセイでアポトーシス分画が増加していることを確認した。（データは示さず）このことは、ＡＣＡが活性化されたＴ細胞を抑制することを示している。これらのことは、ＡＣＡが免疫抑制剤として利用可能であることを示している。
【０１４８】
以上の結果から、以下の結論が導かれる。
・食用生姜の成分１’−アセトキシチャビコールアセテートは、ＮＢ４およびＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞に対し、アポト−シスと細胞周期の停止を誘導した。
・その誘導には、活性酸素の産生の経路によるカスハ゜ーセ゛９及び３の活性化および、Ｆａｓの系を介したカスハ゜ーセ゛８及び３の活性化によるアポトーシス誘導の経路が重要な働きをしていることが示唆された。
【０１４９】
以上の結果より、Ｆａｓおよび活性酸素はＮＢ４およびＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞のアポト−シス誘導の標的分子として重要な役割を果たしていることが示唆される。
【０１５０】
以上の結果から予測される、ＡＣＡの作用機序を図５３にまとめた。ＮＢ４およびＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞においてＡＣＡは活性酸素を細胞内（あるいはミトコンドリアで）産生し、ＢＡＸを細胞質からミトコンドリアに移行させることにより、ミトコンドリアの膜電位を低下させる。その後、チトクローム ｃがミトコンドリアから細胞質に放出され、カスハ゜ーセ゛９を活性化し、カスハ゜ーセ゛３が活性化しアポトーシスが誘導される。
一方で、Ｆａｓの系を介し、カスハ゜ーセ゛８を活性化させ、カスハ゜ーセ゛３を活性化し、双方の系を介し非常に早期にアポト−シスを誘導すると考えられる。
【０１５１】
〔実施例３〕
１．材料と方法
（１）材料
・カフェイン：Ｓｉｇｍａより入手
・各種造血器腫瘍細胞株：
ＮＢ４ Ｄｒ．Ｍ．Ｌａｎｏｔｔｅ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ Ｈｏｓｐｉｔａ．， Ｐａｒｉｓ， Ｆｒａｎｃｅ）より供与
・各種カスパーゼ阻害剤
Ｚ−ＶＡＤ、カスハ゜ーセ゛９阻害剤、カスハ゜ーセ゛８阻害剤：ＭＢＬより入手
【０１５２】
（２）実験方法
各種造血器腫瘍細胞株に対する増殖抑制効果及びアポトーシスの誘導を調べる実験：造血器腫瘍細胞株ＮＢ４（１Ｘ１０４／ｍｌ）に対しカフェイン４ ｍＭの添加培養を行い、トリパンブルー染色を用いて細胞数を算定する。
【０１５３】
細胞周期を調べる実験：カフェイン４ ｍＭ添加培養各時間後、１Ｘ１０６の細胞を採取し、ＰＩ（最終濃度 ０．５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳにて、ＭｏｄｉＦＩＴ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞周期を解析する。
【０１５４】
アネキシンＶ、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）染色の実験：１Ｘ１０５の細胞を採取し、アネキシンＶ （Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＰＩ（最終濃度 ０．５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳで解析し、アネキシンＶ陽性細胞の割合を測定する。
【０１５５】
カスパーゼ３活性を調べる実験：カフェイン４ ｍＭ添加培養各時間後、１Ｘ１０５の細胞を採取し、カスハ゜ーセ゛３活性キット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、ＦＡＣＳにて活性を測定する。
【０１５６】
発現解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 解析）（ｐ５３、ｐＴｙｒ−ｃｄｃ ２、ｃｄｃ ２、ｃｄｃ ２５ｃ、Ｂａｘ、ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰＩ、ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１及びＳｅｒ １５のリン酸化ｐ５３）（ｐＴｙｒ−ｃｄｃ ２、ｃｄｃ ２、ｃｄｃ ２５ｃ、ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰＩ及びｃｙｃｌｉｎ Ｂ１は、細胞周期関連蛋白である）カフェイン４ ｍＭ添加培養各時間後、蛋白を採取し各レーン １５μｇの蛋白を泳動し各種抗体を用いて解析する。
【０１５７】
ミトコンドリア膜電位の変化を調べる実験：カフェイン４ ｍＭ添加培養各時間後、１Ｘ１０５の細胞を採取しローダミン１２３（最終濃度１０μＭ）を投与し、１５分間３７℃で静置する。１５００ｇで５分間遠心後上清を捨て、沈殿をＰＢＳに懸濁し、ＰＩ（最終濃度 １０μＭ）を加え、ＦＡＣＳにて解析する。
【０１５８】
２．結果
結果を図５６〜５９に示す。
【０１５９】
カフェインは時間（０−９６ 時間）（濃度は４ ｍＭ）および濃度（０−８ ｍＭ）依存性に白血病細胞株ＮＢ４の増殖を抑制した（図５６Ａ）。さらに、その際の細胞周期を検討すると、Ｇ２／Ｍ期に細胞周期は停止した（図５６Ｂ）。
【０１６０】
カフェインは、カスパーゼ３の活性を増加させ（図５７Ａ）、アネキシンＶによる検討では、カフェインン ４ ｍＭ， ７２ 時間処理でアネキシンＶ陽性細胞が５６．９％と増加し、アポトーシスが誘導された（図５７Ｂ）。さらに、カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ（２０ μＭ）により、カフェイン（４ ｍＭ）によるアポトーシス誘導は阻害され（図５７Ｂ）、カフェインによるアポトーシス誘導は、カスパーゼ依存性であった。また、同時にミトコンドリアの膜電位が低下し、チトクロームｃが誘導されることより（図５７Ｃ）、ミトコンドリアを介するアポトーシス誘導であることが明らかになった。
【０１６１】
アポトーシスおよび細胞周期関連タンパクを検討すると、カフェイン処理にて、ｐ５３の増加、リン酸化ｃｄｃ２の増加、Ｂａｘ， ｐ２１の誘導が認められた（図５８Ａ）。
さらに、興味あることにｐ５３のセリン１５残基のリン酸化が誘導された（図５８Ｂ）。
【０１６２】
カフェインによる白血病細胞の細胞周期停止、アポトーシス誘導におけるｐ５３の意義を検討するために、ｐ５３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）を作製し、細胞内のｐ５３をノックアウトした状態にてカフェインの効果を検討した（図５９）。操作手順は実施例１の記載に従った。但しカプサイシン５０μＭの代わりにカフェイン４ｍＭを用いた。また、ＮＢ４細胞にカフェイン及びｐ５３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチチドを添加して、２４時間培養した時のｐ５３、β−アクチン、ｐＴｙｒ−ｃｄｃ ２及びｃｄｃ ２の発現も調べた。ＡＳによりｐ５３をノックアウトすると、カフェインによる白血病細胞のアポトーシス誘導はキャンセルされた（図５９Ｂ）。以上より、カフェインは白血病細胞のｐ５３を標的とし、そのセリン１５残基をリン酸化することにより、白血病細胞の細胞周期停止およびアポトーシスを誘導すると考えられた。
【０１６３】
〔実施例４〕
１．材料と方法
（１）材料
・（−）−Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−ｇａｌｌａｔｅ（以下、「ＥＧＣＧ」と記す）：和光純薬より入手
・各種造血器腫瘍細胞株：
ＮＢ４ Ｄｒ．Ｍ．Ｌａｎｏｔｔｅ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ Ｈｏｓｐｉｔａ．， Ｐａｒｉｓ， Ｆｒａｎｃｅ）より供与
ＨＬ−６０：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ； Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より入手
ＵＦ−１：我々の研究室にて確立した細胞株
Ｕ９３７：理研細胞バンクより入手
Ｋａｓｕｍｉ−１：広島大学原医研 麻生博也先生より供与
ＴＨＰ−１：理研細胞バンクより入手
・各種抗酸化剤
カタラーゼ：Ｓｉｇｍａより入手
ｓｕｐｅｒ ｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ（以下、「ＳＯＤ」と記す）：和光純薬より入手
・各種カスパーゼ阻害剤
カスハ゜ーセ゛９阻害剤、カスハ゜ーセ゛８阻害剤：ＭＢＬより入手
カスハ゜ーセ゛３阻害剤：Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ （Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）より入手
・ＤＮＡマイクロアレイ：ＴＯＹＯＢＯ Ｃｏ．Ｌｔｄより入手
【０１６４】
（２）実験方法
各種造血器腫瘍細胞株に対する増殖抑制効果及びアポトーシスの誘導を調べる実験：各種造血器腫瘍細胞株（２Ｘ１０４／ｍｌ）に対しＥＧＣＧの添加培養を行い、トリパンブルー染色を用いて細胞数を算定する。
【０１６５】
細胞周期を調べる実験：ＥＧＣＧ ２０ μＭ添加培養各時間後、２Ｘ１０４の細胞を採取し、ＰＩ（最終濃度 ０．５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳにて、ＭｏｄｉＦＩＴ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞周期を解析する。
【０１６６】
ＤＮＡラダー形成を調べる実験：各種造血器腫瘍細胞株２Ｘ１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０ μＭを添加して３時間培養後に、ＤＮＡを採取し、２％ アガロースゲルにて電気泳動しラダー形成の有無につき検討する。
【０１６７】
細胞形態を調べる実験：各種造血器腫瘍細胞株２Ｘ１０４ 個をサイトスピンにてスライドグラスに遠心し、ギムザ染色し光学顕微鏡にて（１Ｘ１０４倍）観察する。
【０１６８】
アネキシンＶ、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）染色の実験：２Ｘ１０４の細胞を採取し、アネキシンＶ （Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＰＩ（最終濃度 ０．５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳで解析し、アネキシンＶ陽性細胞の割合を測定する。
【０１６９】
カスパーゼ３活性を調べる実験：ＥＧＣＧ ２０ μＭ添加培養各時間後、２Ｘ１０４の細胞を採取し、カスハ゜ーセ゛３活性キット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、ＦＡＣＳにて活性を測定する。
【０１７０】
発現解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 解析）（ｐ５３、ｐＴｙｒ−ｃｄｃ ２、ｃｄｃ ２、ｃｄｃ ２５ｃ、Ｂａｘ、ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰＩ、ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１及びＳｅｒ １５のリン酸化ｐ５３）（ｐＴｙｒ−ｃｄｃ ２、ｃｄｃ ２、ｃｄｃ ２５ｃ、ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰＩ及びｃｙｃｌｉｎ Ｂ１は、細胞周期関連蛋白である。）ＥＧＣＧ ２０ μＭ添加培養各時間後、蛋白を採取し各レーン １５μｇの蛋白を泳動し各種抗体を用いて解析する。
【０１７１】
ミトコンドリア膜電位の変化を調べる実験：ＥＧＣＧ ２０ μＭ添加培養各時間後、２Ｘ１０４の細胞を採取しローダミン１２３（最終濃度１０μＭ）を投与し、１５分間３７℃で静置する。１５００ｇで５分間遠心後上清を捨て、沈殿をＰＢＳに懸濁し、ＰＩ（最終濃度 １０μＭ）を加え、ＦＡＣＳにて解析する。
【０１７２】
活性酸素の解析：ＥＧＣＧ ２０ μＭ添加培養各時間後、２Ｘ１０４の細胞を採取し、ジヒドロエチジウム（最終濃度 １０ μＭ）をマーカーとして、ＦＡＣＳにて解析する。
【０１７３】
２．結果
結果を図６１〜７４に示す。なお、緑茶成分カテキンには種々の誘導体が存在するが、最も活性が高いとされるＥＧＣＧを実験に用いた（図６０）。
【０１７４】
ＥＧＣＧは種々の白血病細胞株（ＮＢ４， Ｕ９３７， Ｋａｓｕｍｉ−１， ＵＦ−１， ＨＬ６０， ＴＨＰ−１）の増殖を濃度および時間依存的に抑制した（図６１）。特に、ＮＢ４細胞への効果が著しかった。
【０１７５】
ＥＧＣＧ １０， ２０ μＭ、２４時間処理にて、種々の白血病細胞株ではアネキシンＶ陽性細胞が誘導され、ＥＧＣＧによる白血病細胞のアポトーシス誘導が確認された（図６２）。さらに、ギムザ染色により形態学的に検討するとＥＧＣＧ処理により、白血病細胞は核の濃染、分断化、アポトーシス小体の出現などアポトーシスに特異的な所見が認められた（図６３）。同時に、ゲノムＤＮＡを抽出してゲル上で泳動すると、アポトーシスに典型的なラダー形成が認められた（図６４）。以上より、種々の方法により、ＥＧＣＧによる白血病細胞のアポトーシス誘導が確認された。
【０１７６】
細胞周期はＥＧＣＧ処理にてＧ１期に停止した（図６５）。
【０１７７】
ＥＧＣＧによる白血病細胞のアポトーシス誘導は抗酸化剤、カタラーゼ， ＳＯＤ （ｓｕｐｅｒ ｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）によりキャンセルされた（図６６）。また、ＥＧＣＧによるラダー形成もカタラーゼによりキャンセルされた（図６４）。したがって、ＥＧＣＧによる白血病細胞のアポトーシス誘導は活性酸素（ＲＯＳ）を介する可能性が示唆された。
【０１７８】
ＥＧＣＧによる白血病細胞のアポトーシス誘導では、カスパーゼ ３の活性が誘導された（図６７）。また、阻害剤による実験ではカスパーゼ３， カスパーゼ９に特異的な阻害剤でアポトーシス誘導は阻害されたが、カスパーゼ８特異的阻害剤では抑制されなかった（図６８）。したがって、ＥＧＣＧによる白血病細胞のアポトーシス誘導はミトコンドリアを介するものと考えられた。
【０１７９】
ＥＧＣＧ処理にて種々の白血病細胞ではＲＯＳの産生、ＭＭＰ（ミトコンドリア膜電位）の低下が認められた（図６９）。ＮＢ４細胞で詳細に検討したところ、ＥＧＣＧ ２０ μＭ処理にて時間依存的にＲＯＳ産生、ミトコンドリア膜電位の低下が認められた（図７０）。
【０１８０】
ＥＧＣＧ処理した際のアポトーシス、細胞周期関連タンパクについてＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔにて発現を検討した。ＥＧＣＧ処理にてアポトーシス誘導に関与するＢａｘが誘導されたが、抗酸化剤カタラーゼ処理にて発現は抑制された（図７１）。ｐ５３の誘導も認められたが、やはりカタラーゼで発現は抑制された（図７２）。したがって、ＥＧＣＧによる白血病細胞のアポトーシス誘導の引き金になるＲＯＳはＢａｘ， ｐ５３の誘導に直接関与するものと考えられる。ＥＧＣＧ処理によって、ミトコンドリアの膜電位が低下するが、その際にミトコンドリアから細胞質にチトクロームｃが放出されることが明らかになり、またこの放出はカタラーゼで抑制された（図７３）。
【０１８１】
ＥＧＣＧによる白血病細胞のアポトーシス誘導機構のまとめを図７４に示す。ＥＧＣＧは活性酸素（ＲＯＳ； ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）を産生し、ＲＯＳがＢａｘを誘導することで、ミトコンドリアの膜電位を低下させ、ミトコンドリアからのチトクロームｃの細胞質への放出を促進する。チトクロームｃはカスパーゼ９， カスパーゼ３を活性化し、白血病細胞のアポトーシスを誘導する。また、同時にＥＧＣＧはｐ５３の発現も誘導するが、このことによっても細胞周期停止、アポトーシス誘導シグナルが入るものと思われるが、直接的な証明はしていない。カプサイシン、カフェインではｐ５３のセリン１５残基のリン酸化が証明され、それらの誘導に関与することが明らかとなった。
【０１８２】
〔実施例５〕
１．材料と方法
（１）材料
・クルクミン：和光純薬より入手
・各種造血器腫瘍細胞株：
Ｕ２６６：理研細胞バンクより入手
ＨＳ−Ｓｕｌｔａｎ：理研細胞バンクより入手
ＲＰＭＩ１６４０：理研細胞バンクより入手
ＩＭ９：理研細胞バンクより入手
【０１８３】
（２）実験方法
各種造血器腫瘍細胞株に対する増殖抑制効果及びアポトーシスの誘導を調べる実験：各種造血器腫瘍細胞株（１Ｘ１０５／ｍｌ）に対しクルクミン ５、１０、２０μＭの添加培養を行い、トリパンブルー染色を用いて細胞数を算定する。
【０１８４】
細胞周期を調べる実験：クルクミン ５、１０、２０μＭの添加培養１２時間後、１Ｘ１０５の細胞を採取し、アネキシンＶ（最終濃度 ５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳにて、ＭｏｄｉＦＩＴ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞周期を解析する。
【０１８５】
細胞形態を調べる実験：ＨＳ−Ｓｕｌｔａｎ細胞１Ｘ１０５ 個をサイトスピンにてスライドグラスに遠心し、ギムザ染色し光学顕微鏡にて（１Ｘ１０４倍）観察する。
【０１８６】
アネキシンＶ、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）染色の実験：１Ｘ１０５個の細胞を採取し、アネキシンＶ （Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＰＩ（最終濃度 ０．５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳで解析し、アネキシンＶ陽性細胞の割合を測定する。
【０１８７】
カスパーゼ３活性を調べる実験：クルクミン１０μＭ添加培養各時間後、１Ｘ１０５個の細胞を採取し、カスハ゜ーセ゛３活性キット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、ＦＡＣＳにて活性を測定する。
【０１８８】
カスパーゼ８活性を調べる実験：クルクミン１０μＭ添加培養各時間後、１Ｘ１０５個の細胞を採取し、カスハ゜ーセ゛８活性キット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、ＦＡＣＳにて活性を測定する。
【０１８９】
ＭＴＴアッセイ：各種造血器腫瘍細胞株（１Ｘ１０５／ｍｌ）に対しクルクミン ５、１０、２０μＭの添加培養を４８時間行い、培養液１００μｌを９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移し、「ＭＴＴ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ （Ｒｏｃｈｅ）」の実験方法に従い、ＭＴＴ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ（１Ｘ） １０μｌを加え、３７℃４時間静置後、ＭＴＴ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ １００μｌを加え、３７℃にて静置後、ＯＤ４５０値をプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）にて解析する。
【０１９０】
２．結果
結果を図７６〜８１に示す。
【０１９１】
ウコン成分クルクミンの構造式を図７５に示す。
【０１９２】
種々の濃度のクルクミンを骨髄腫細胞（ＨＳ−Ｓｕｌｔａｎ， ＲＰＭＩ１６４０， Ｕ２６６， ＩＭ９）に添加し、４８時間後に細胞増殖をＭＴＴ アッセイにて検討すると、クルクミンは濃度依存性に骨髄腫細胞の増殖を抑制した（図７６）。
【０１９３】
ＨＳ−Ｓｕｌｔａｎ細胞を用いてアネキシンＶにより検討したところクルクミンは濃度依存性にアネキシンＶ陽性細胞を誘導した（図７７）。また、ギムザ染色による形態学的観察においても、アポトーシスに特異的な所見が得られた（図７８）。
【０１９４】
クルクミンは時間依存的にカスパーゼ３， カスパーゼ８活性を誘導した（図７９，８０）。
【０１９５】
以上の結果から、以下の結論が導かれる。
・クルクミンは各種骨髄腫細胞株のアポトーシスを早期に誘導した。
・クルクミンによるＨＳ−ｓｕｌｔａｎのアポトーシス誘導はカスパーゼ−８／カスパーゼ−３経路を介していると考えられた。
・ミトコンドリア膜電位の低下、カスパーゼ−９活性化を認めず、ミトコンドリア非依存性のアポトーシス経路が考えられた。
・活性酸素濃度の上昇を認めたが、アポトーシス誘導の直接の原因ではないと考えられた。
・カスパーゼ−８の活性化を認めるが、Ｆａｓ非依存性であり、他のカスパーゼ−８活性化経路の関与が示唆された。
【０１９６】
以上のことから予測される、クルクミンによる骨髄腫細胞のアポトーシス誘導機構のまとめを図８１に示す。
【０１９７】
【発明の効果】
従来の抗癌剤を主体とした治療法に対し抵抗性の造血器腫瘍患者や、副作用の強い症例に対し、食品成分でもある唐辛子成分カプサイシン、食用生姜成分１’−アセトキシチャビコールアセテート、コーヒー成分カフェイン、緑茶成分カテキン及びウコン成分クルクミンおよびそれらの誘導体は抗腫瘍効果を有し、有効な副作用の少ない治療法となる。また、造血器腫瘍の治療成績の向上が期待できる。さらに、免疫抑制剤としても有用である。また、カプサイシン、カフェイン、カテキンおよびそれらの誘導体は、ｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬としても有用である。
【０１９８】
【配列表】
【０１９９】
【配列表フリーテキスト】
【配列番号１】
配列番号１は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
【０２００】
【配列番号２】
配列番号２は、コントロールオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
【０２０１】
【配列番号３】
配列番号３は、ミスマッチオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】各種造血器腫瘍細胞株の増殖に対するＣＡＰの効果を示す。
【図２】ＮＢ４細胞１×１０４／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して培養した時の培養時間と細胞数を示す。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある。
【図３】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌに、それぞれ、ＣＡＰ ０μＭ、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭ、１００μＭ及び１０００μＭを添加して培養した時のＣＡＰ濃度とアネキシンＶ陽性細胞の％を示す。
【図４】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して、０時間、１２時間、２４時間、７２時間培養した時の細胞周期解析の結果を示す。
【図５】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌに、それぞれ、ＣＡＰ ０μＭ（コントロール）、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭ、１００μＭ及び１ｍＭを添加して培養した時の細胞周期解析の結果を示す。
【図６】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して、０時間、２４時間、４８時間、７２時間培養した時のラダー形成の結果を示す。
【図７】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して、２４時間培養した時の細胞の形態を観察した結果を示す（右）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある（左）。
【図８】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して、２４時間培養した時の細胞周期の解析結果を示す（右）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある（左）。
【図９】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して、２４時間培養した時のアネキシンＶとＰＩ染色による早期アポトーシスの検討結果を示す（右）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある（左）。
【図１０】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して、０時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、２４時間培養した時のカスパーゼ３の活性を示す。
【図１１】ＣＡＰによるアポトーシスに対する、カスパーゼ阻害剤の効果を示す。
【図１２】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して、０時間、２４時間、４８時間培養した時のプロカスパーゼ３と活性型カスパーゼ３の発現解析の結果を示す。
【図１３】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して、０時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間培養した時のアポトーシス関連タンパク質の発現解析の結果を示す。
【図１４】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して９時間培養した時のミトコンドリア膜電位（低膜電位の占有率）を示す（右）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある（左）。
【図１５】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して、２４時間、４８時間培養した時のチトクロームＣ及びβ−アクチンの発現解析の結果を示す。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある。
【図１６】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して、０時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間培養した時の細胞周期関連タンパク質の発現解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔ解析）の結果を示す。
【図１７】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して、０時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間培養した時のｐ５３関連タンパク質の発現解析の結果を示す。
【図１８】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間培養した時の、Ｓｅｒ１５がリン酸化されたｐ５３並びにｐ５３の発現解析の結果を示す。
【図１９】ＣＡＰによるアポトーシスに対する、ワートマニン（ｐ５３リン酸化酵素の阻害剤）の効果を示す（右の棒）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある（左の棒）。
【図２０】ＣＡＰによるアポトーシスに対する、ピフィスリンα（ｐ５３に対する特異的阻害剤）の効果を示す（右の棒）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある（左の棒）。
【図２１】ＣＡＰによる細胞周期の停止に対する、ピフィスリンα（ｐ５３に対する特異的阻害剤）の効果を示す（右下）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）（左上）、ＣＡＰ １００μＭのみ添加（右上）、ピフィスリンα １００ ｎＭのみ添加（左下）の結果も併せて示してある。
【図２２】ｐ５３遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果（アポトーシス、細胞周期の停止）をまとめた。
【図２３】ＣＡＰによるアポトーシスに対する、ｐ５３遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示す。
【図２４】細胞内活性酸素の産生に対する、ＣＡＰの効果を示す。
【図２５】ＣＡＰによるアポトーシスに対する、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）（グルタチオン前駆体）の効果を示す（右の棒）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある（左の棒）。
【図２６】ＣＡＰによる細胞周期の停止に対する、ＮＡＣの効果を示す（右下）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）（左上）、ＣＡＰ １００μＭのみ添加（左下）、ＮＡＣ １００ μＭのみ添加（右上）の結果も併せて示してある。
【図２７】白血病および骨髄腫患者の骨髄細胞におけるｐ５３及びβ−アクチンの発現解析の結果を示す。
【図２８】白血病患者の骨髄細胞１×１０７／ｍｌに、それぞれ、ＣＡＰ ０μＭ、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭを添加して、４８時間培養した時の、ＣＡＰ濃度とＭＴＴ アッセイにおけるＯＤ４５０値を示す。
【図２９】白血病患者の末梢血細胞１×１０７／ｍｌに、それぞれ、ＣＡＰ １０μＭ、５０μＭ及び１００μＭを添加して培養した時の培養時間とアネキシンＶ陽性細胞の％を示す。
【図３０】白血病患者の骨髄細胞１×１０７／ｍｌに、ＣＡＰ １００μＭを添加して、２４時間培養した時の、アネキシンＶ陽性の細胞数を示す（灰色の線）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある（黒色の線）。
【図３１】白血病患者の骨髄細胞１×１０７／ｍｌに、それぞれ、ＣＡＰ ０μＭ（コントロール）、１０μＭ、５０μＭ及び１００μＭを添加して４８時間培養した時の細胞周期解析の結果を示す。
【図３２】白血病患者の骨髄細胞１×１０７／ｍｌに、それぞれ、ＣＡＰ ０μＭ（コントロール）、１０μＭ、５０μＭ及び１００μＭを添加して４８時間培養した時のアポトーシス（％）の結果を示す。
【図３３】ＣＭＬ ＣＰ患者の末梢血細胞１×１０７／ｍｌに、それぞれ、ＣＡＰ １０μＭ、５０μＭ及び１００μＭを添加して０時間、２４時間、４８時間、７２時間培養した時の培養時間とアネキシンＶ陽性細胞の％を示す。
【図３４】ＰＬＬ患者の末梢血細胞１×１０７／ｍｌに、それぞれ、ＣＡＰ １０μＭ、５０μＭ及び１００μＭを添加して０時間、２４時間、４８時間培養した時の培養時間と細胞生存率（％）を示す。
【図３５】正常者の末梢血細胞１×１０７／ｍｌに、それぞれ、ＣＡＰ １０μＭ、１００μＭを添加して、０時間、２４時間、４８時間培養した時の、培養時間とＭＴＴ アッセイのＯＤ４５０値を示す。
【図３６】ＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）刺激により活性化したリンパ球 １ ｘ １０６／ｍｌにＣＡＰ １００ μＭを添加し、２４時間培養した時のアネキシンＶとＰＩ染色による早期アポトーシスの検討結果を示す。コントロール（上）、ＣＡＰを添加（上から２段目）、ＰＨＡによる活性化リンパ球（上から３段目）、活性化リンパ球にＣＡＰ添加（下段）
【図３７】ＣＡＰの作用機序を説明するスキームである。
【図３８】ＣＡＰによるアポトーシスに対する、カスパーゼ阻害剤の効果を示す（ＦＡＣＳ解析による）。
【図３９】急性骨髄性白血病および急性前骨髄球性白血病患者サンプルへのカプサイシンの効果（アポトーシス誘導）を示す。
【図４０】多発性骨髄腫患者サンプルへのカプサイシンの効果を示す。
【図４１】各種造血器腫瘍細胞株１×１０５／ｍｌに、それぞれ、ＡＣＡ ０μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭを添加して培養した時のＡＣＡ濃度と細胞数を示す（左図）。各種造血器腫瘍細胞株１×１０５／ｍｌにＡＣＡ １０μＭを添加して、０時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間培養した時の培養時間と細胞数を示す（右図）。
【図４２】ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞およびＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＡＣＡ １０μＭを添加して、４時間または１２時間培養した時の細胞の形態を観察した結果を示す（左 ＮＢ４細胞／右 ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞）。コントロール（ＡＣＡの添加なし）の結果も併せて示してある（上）。
【図４３】ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞１×１０５／ｍｌにＡＣＡ １０μＭを添加して、各種時間培養した時のアネキシンＶとＰＩ染色による早期アポトーシスの検討結果を示す。
【図４４】ＡＣＡによるアポトーシスに対する、カスパーゼ阻害剤の効果を示す。
【図４５】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＡＣＡ １０μＭを添加して、０時間、３時間、６時間、１２時間培養した時のカスハ゜ーセ゛３および８タンパクの発現解析の結果を示す。
【図４６】ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞１×１０５／ｍｌにＡＣＡ １０μＭを添加して、０時間、１時間、３時間培養した時の総Ｂａｘ、ミトコンドリア分画及び細胞質分画のＢａｘ、細胞質分画のチトクローム ｃおよびＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯの発現解析の結果を示す。
【図４７】細胞内活性酸素の産生に対する、ＡＣＡの効果を示す。
【図４８】ＡＣＡによるアポトーシスに対する、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）（グルタチオン前駆体）の効果を示す（右の棒）。コントロール（ＡＣＡの添加なし）の結果も併せて示してある（左の棒）。
【図４９】ＮＢ４における、ＡＣＡによるＦａｓ発現に対する効果を示す（左図）。また、ＨＳ−ｓｕｌｔａｎにおける、ＡＣＡによるＦａｓ発現に対する効果を示す（右図）。
【図５０】ＮＢ４における、抗Ｆａｓ抗体（アゴニストおよびアンタゴニスト）のアポトーシスの誘導／抑制効果を示す。
【図５１】多発性骨髄腫患者の末梢血細胞（左図）および白血病患者の骨髄細胞（右図）１×１０７／ｍｌに、それぞれ、ＡＣＡ ０μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭを添加して、２４時間培養した時の、ＡＣＡ濃度とＭＴＴ アッセイにおけるＯＤ４５０値を示す。（左図）
【図５２】ＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）刺激により活性化したリンパ球１×１０６／ｍｌに、ＡＣＡ １０μＭを添加して、２４時間培養した時のＭＴＴ アッセイにおけるＯＤ４５０値を示す（右の棒）。コントロール（ＡＣＡの添加なし）の結果も併せて示してある（左の棒）。
【図５３】ＡＣＡの作用機序を説明するスキームである。
【図５４】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌに、それぞれ、ＡＣＡ ０μＭ（ｃｏｎｔｒｏｌ）、１μＭ、５μＭおよび１０μＭを添加して培養した時の細胞周期解析の結果を示す。
【図５５】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＡＣＡ １０μＭを添加して１２時間培養した時のミトコンドリア膜電位（低膜電位の占有率）を示す（右）。コントロール（ＡＣＡの添加なし）の結果も併せて示してある（左）。
【図５６】カフェインがＮＢ４細胞の増殖能（図５６のＡ）、細胞周期（図５６のＢ）に及ぼす影響を示す。図５６のＢは、ＮＢ４細胞１×１０６／ｍｌにカフェイン ４ ｍＭを添加して、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間培養した時の細胞周期解析の結果を示す。コントロール（カフェインの添加なし）の結果も併せて示してある。
【図５７】カフェインによるＮＢ４細胞のアポトーシス誘導がミトコンドリア依存性であることを示す。図５７のＡは、ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにカフェイン ４ ｍＭを添加して、７２時間培養した時のカスパーゼ３の活性を示す。図５７のＢは、ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにカフェイン ４ ｍＭを添加して、７２時間培養した時のアネキシンＶとＰＩ染色による早期アポトーシスの検討結果を示す。コントロール（カフェインの添加なし）の結果も併せて示してある。図５７のＣは、ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにカフェイン ４ ｍＭを添加して、７２時間培養した時のミトコンドリア膜電位を示す。コントロール（カフェインの添加なし）の結果も併せて示してある。また、チトクロームｃの発現解析結果を枠で囲って上部に示した。
【図５８】カフェイン処理ＮＢ４細胞におけるアポトーシス、細胞周期関連タンパクの発現解析の結果を示す。
【図５９】カフェインによるＮＢ４細胞のアポトーシス誘導におけるｐ５３の意義を示す。図５９のＡは、ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにカフェイン ４ ｍＭ及びｐ５３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド１ μＭを添加して、２４時間培養した時のｐ５３及びβ−アクチンの発現解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔ解析）の結果を示す（ＭＳ）。カフェインの添加なし（コントロール）、ｐ５３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのみ添加（ＡＳ）、カフェインのみ添加（ＣＳ）の結果も併せて示してある。図５９のＢは、ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにカフェイン ４ ｍＭ及びｐ５３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド１ μＭを添加して、２４時間培養した時のアネキシンＶとＰＩ染色による早期アポトーシスの検討結果を示す（ＡＳ＋カフェイン）。カフェインの添加なし（コントロール）、ｐ５３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのみ添加（ＡＳ）、カフェインのみ添加（カフェイン）の結果も併せて示してある。図５９のＣは、ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにカフェイン ４ ｍＭ及びｐ５３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド１ μＭを添加して、２４時間培養した時のｐＴｙｒ−ｃｄｃ ２、ｃｄｃ ２及びβ−アクチンの発現解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔ解析）の結果を示す（カフェイン＋ＡＳ）。カフェインの添加なし（コントロール）、ｐ５３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのみ添加（ＡＳ）、カフェインのみ添加（カフェイン）の結果も併せて示してある。
【図６０】緑茶に含まれる多価ポリフェノールのうち主なものの構造式を示す。
【図６１】各種造血器腫瘍細胞株の増殖に対するＥＧＣＧの効果を示す。左図は、各種造血器腫瘍細胞株２×１０４／ｍｌに、それぞれ、ＥＧＣＧ ０、１０、２０及び５０μＭを添加して、２４時間培養した時のＥＧＣＧ濃度とＶｉａｂｉｌｉｔｙを示す。右図は、各種造血器腫瘍細胞株２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ １０μＭを添加して培養した時の培養日数とＶｉａｂｉｌｉｔｙを示す。
【図６２】各種造血器腫瘍細胞株２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ １０μＭ又は２０μＭを添加して、２４時間培養した時のアネキシンＶとＰＩ染色による早期アポトーシスの検討結果を示す。ＥＧＣＧの添加なし（コントロール）の結果も併せて示してある。
【図６３】各種造血器腫瘍細胞株１×１０５／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭを添加して、２４時間培養した時の細胞の形態を観察した結果を示す。ＥＧＣＧの添加なし（コントロール）の結果も併せて示してある。
【図６４】各種造血器腫瘍細胞株２×１０５／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭを添加して、３時間（Ｕ９３７細胞については１２時間）培養した時のラダー形成の結果（ＥＧＣＧ ２０μＭ ３ｈｒ）を示す。ＥＧＣＧの添加なしの結果（コントロール）も併せて示してある。さらに、各種造血器腫瘍細胞株２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭ及びカタラーゼ ５００Ｕ／ｍｌを添加して、３時間（Ｕ９３７細胞については１２時間）培養した時のラダー形成の結果（ＥＧＣＧ ２０μＭ ＋カタラーゼ）を示す。
【図６５】各種造血器腫瘍細胞株２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭを添加して、２４時間培養した時の細胞周期解析の結果を示す（右）。ＥＧＣＧの添加なし（コントロール）の結果も併せて示してある（左）。
【図６６】ＥＧＣＧが誘導するアポトーシスに対する抗酸化剤の効果を示す。各種造血器腫瘍細胞株２×１０４／ｍｌに、ＥＧＣＧ ２０μＭ及びカタラーゼ ５００ Ｕ／ｍｌ（ＥＧＣＧ ２０μＭ＋ｃａｔａｌａｓｅ ５００ Ｕ／ｍｌ）又はＳＯＤ ５００ Ｕ／ｍｌ（ＥＧＣＧ ２０μＭ＋ＳＯＤ ５００ Ｕ／ｍｌ）を添加して、２４時間培養した時のＶｉａｂｉｌｉｔｙを示す。ＥＧＣＧの添加なし（コントロール）、ＥＧＣＧのみ添加（ＥＧＣＧ ２０μＭ）の結果も併せて示してある。
【図６７】各種造血器腫瘍細胞株２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭを添加して、６時間培養した時のカスパーゼ３の活性を示す。
【図６８】ＮＢ４細胞２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭ及びカスパーゼ阻害剤カスパーゼ−３阻害剤 １０ μＭ， カスパーゼ−８阻害剤 ２０ μＭ， カスパーゼ−９阻害剤 ５０ μＭを添加して、２時間培養した時にアポトーシス誘導が見られた細胞の百分率を示す。ＥＧＣＧの添加なし（コントロール）、ＥＧＣＧのみ添加（ＥＧＣＧ ２０μＭ）の結果も併せて示してある。
【図６９】細胞内活性酸素の産生（ＲＯＳ）及びミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）に対する、ＥＧＣＧの効果を示す。左図は、各種造血器腫瘍細胞株２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭを添加して、３時間培養した時の活性酸素の産生を示す。右図は、各種造血器腫瘍細胞株２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭを添加して、３時間培養した時のミトコンドリア膜電位の低下を示す。ＥＧＣＧの添加なし（コントロール）の結果も併せて示してある（黒ベタで表示）。
【図７０】細胞内活性酸素の産生及びミトコンドリア膜電位に対する、ＥＧＣＧの効果の経時変化を示す。上図は、ＮＢ４細胞２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭを添加して、３時間、６時間及び１２時間培養した時の活性酸素の産生を示す。下図は、ＮＢ４細胞２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭを添加して、３時間、６時間及び１２時間培養した時のミトコンドリア膜電位の低下を示す。ＥＧＣＧの添加なし（コントロール）の結果も併せて示してある（黒ベタで表示）。
【図７１】上図は、ＮＢ４細胞２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭを添加して、０時間、３時間、６時間培養した時のＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂａｘ、アクチンの発現解析の結果を示す。下図は、ＵＦ−１細胞２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭを添加して、０時間、３時間、６時間培養した時のＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂａｘ、アクチンの発現解析の結果を示す。さらに、ＮＢ４細胞またはＵＦ−１細胞２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭ及びカタラーゼ ５００ Ｕ／ｍｌを添加して、１時間培養した時のＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂａｘ、アクチンの発現解析の結果（ＥＧＣＧ ２０μＭ ＋ カタラーゼ５００ Ｕ／ｍｌ）も示す（上図及び下図）。
【図７２】ＮＢ４細胞２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭを添加して、０時間、３時間、６時間培養した時のｐ５３、ｐ２７、アクチンの発現解析の結果を示す。さらに、ＮＢ４細胞２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭ及びカタラーゼ ５００ Ｕ／ｍｌを添加して、１時間培養した時のｐ５３、ｐ２７、アクチンの発現解析の結果（ＥＧＣＧ ２０μＭ ＋カタラーゼ ５００ Ｕ／ｍｌ）も示す。
【図７３】上図は、ＮＢ４細胞２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭを添加して、０時間、３時間培養した時の細胞質（Ｃｙｔｏｃｏｌｉｃ ｃｙｔ．ｃ）及びミトコンドリア（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃｙｔ．ｃ）におけるチトクロームｃならびにアクチンの発現解析の結果を示す。下図は、ＵＦ−１細胞２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭを添加して、０時間、３時間培養した時の細胞質及びミトコンドリアにおけるチトクロームｃ ならびにアクチンの発現解析の結果を示す。さらに、ＮＢ４細胞またはＵＦ−１細胞２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭ及びカタラーゼ ５００ Ｕ／ｍｌを添加して、１時間培養した時の細胞質及びミトコンドリアにおけるチトクロームｃならびにアクチンの発現解析の結果（ＥＧＣＧ ２０μＭ ＋ カタラーゼ５００ Ｕ／ｍｌ）も示す（上図及び下図）。
【図７４】ＥＧＣＧの作用機序を説明するスキームである。
【図７５】クルクミンの構造式を示す。
【図７６】各種造血器腫瘍細胞株の増殖に対するクルクミンの効果を示す。各種造血器腫瘍細胞株１×１０５／ｍｌに、それぞれ、クルクミン ０、５、１０及び２０μＭを添加して、４８時間培養した時のＶｉａｂｉｌｉｔｙを示す。
【図７７】上図は、ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞１×１０５／ｍｌに、それぞれ、クルクミン ５、１０及び２０μＭを添加して、１２時間培養した時のアネキシン ＶとＰＩ染色による早期アポトーシスの検討結果を示す。下図は、ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞１×１０５／ｍｌに、それぞれ、クルクミン ５、１０及び２０μＭを添加して、１２時間培養した時の細胞周期解析の結果を示す。クルクミンの添加なし（コントロール）の結果も併せて示してある（上図及び下図）。
【図７８】ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞１×１０５／ｍｌにクルクミン １０μＭを添加して、２４時間培養した時の細胞の形態を観察した結果を示す（右）。クルクミンの添加なし（コントロール）の結果も併せて示してある（左）。
【図７９】ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞１×１０５／ｍｌにクルクミン１０ μＭを添加して、０、１，３、６時間培養した時のカスパーゼ３の活性を示す。
【図８０】ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞１×１０５／ｍｌにクルクミン １０μＭを添加して、０、１，３、６時間培養した時のカスパーゼ８の活性を示す。
【図８１】クルクミンの作用機序を説明するスキームである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、造血器腫瘍の治療薬、免疫抑制剤、およびｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬に関し、より詳細には、カスパーゼを活性化することができる化合物またはその薬理上許容できる塩を含有する造血器腫瘍の治療薬、免疫抑制剤、およびｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
白血病、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍に対しては、抗癌剤などによる化学療法や造血幹細胞移植を含め現在さまざまな治療法が行われているが、抗癌剤による重篤な副作用や薬剤耐性の問題・さらに造血幹細胞移植の際の移植片対宿主病等の致命的な合併症などさまざまな問題により、当該疾患患者の、長期生存率は依然として低いのが現状である。そこで、造血幹細胞移植や抗癌剤による治療に変わる新たな、副作用の少ない造血器腫瘍の治療の開発が不可欠な状況である。また、現在まで腫瘍細胞の増殖を抑制する化学物質は多数報告されているが、実際に実用化されたものは極めて少なく、さらにその分子機構はいまだ不明な点が多く、腫瘍細胞の増殖に直接関与する分子のみをターゲットとした新たな分子標的療法の発明も必要とされている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、副作用の少ない、新たな造血器腫瘍の治療薬を提供することを目的とする。
【０００４】
また、本発明は、副作用の少ない、新たな免疫抑制剤を提供することも目的とする。
【０００５】
さらに、本発明は、副作用の少ない、新たな造血器腫瘍細胞の増殖に関与する分子を標的とする分子標的治療薬を提供することも目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、唐辛子成分カプサイシン、食用生姜成分１’−アセトキシチャビコールアセテート、コーヒー成分カフェイン、緑茶成分カテキン及びウコン成分クルクミンが、造血器腫瘍細胞の増殖を抑制することを見出した。そして、これらの化合物が活性酸素を産生すること、カスパーゼを活性化すること、細胞にアポトーシスを誘導することも確認した。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。
【０００７】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１） カスパーゼを活性化することができる化合物またはその薬理上許容できる塩を含有する、造血器腫瘍の治療薬。
（２） カスパーゼを活性化することができる化合物が、カプサイシン、１’−アセトキシチャビコールアセテート、カフェイン、カテキン、クルクミン及びそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物である（１）記載の治療薬。
（３） カスパーゼを活性化することができる化合物またはその薬理上許容できる塩を含有する、免疫抑制剤。
（４） カスパーゼを活性化することができる化合物が、カプサイシン、１’−アセトキシチャビコールアセテート、カフェイン、カテキン、クルクミン及びそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物である（３）記載の免疫抑制剤。
（５） カプサイシン、カフェイン、カテキン及びそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物またはその薬理上許容される塩を含有する、ｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬。
【０００８】
カスパーゼは種々の刺激により活性化され、細胞の機能を不可逆的な状態に導く、細胞死（アポトーシス）の実行に直接関与するシステインプロテアーゼである。カスパーゼの活性化は、例えば、カスパーゼ活性キット（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）を用いて確認することができる。
【０００９】
カプサイシンは、唐辛子に含まれる食品成分であり、したがって、カプサイシンおよびその誘導体を用いた造血器腫瘍の治療は従来の抗がん剤による化学療法とは異なり、副作用の少ない安全な治療法と考えられる。カプサイシンの急性経口毒性（ＬＤ５０）は、ラットについて、６０〜７０ｍｇ／ｋｇである。造血器腫瘍の新たな治療薬としてカプサイシンおよびその誘導体が臨床応用されることにより、造血器腫瘍の長期予後の改善が期待される。同様に、カプサイシンおよびその誘導体は、副作用の少ない、安全な免疫抑制剤、ｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬としても、利用可能である。
【００１０】
１’−アセトキシチャビコールアセテートは、食用生姜に含まれる食品成分であり、したがって、１’−アセトキシチャビコールアセテートおよびその誘導体を用いた造血器腫瘍の治療は従来の抗がん剤による化学療法とは異なり、副作用の少ない安全な治療法と考えられる。１’−アセトキシチャビコールアセテートの急性経口毒性（ＬＤ５０）は、マウスについて、１ｇ／ｋｇであり、腹腔内投与では５０ｍｇ／ｋｇ以上である。造血器腫瘍の新たな治療薬として１’−アセトキシチャビコールアセテートおよびその誘導体が臨床応用されることにより、造血器腫瘍の長期予後の改善が期待される。同様に、１’−アセトキシチャビコールアセテートおよびその誘導体は、副作用の少ない、安全な免疫抑制剤としても、利用可能である。
【００１１】
カフェインは、茶、コーヒーなどに含まれる成分であり、したがって、カフェインおよびその誘導体を用いた造血器腫瘍の治療は従来の抗がん剤による化学療法とは異なり、副作用の少ない安全な治療法と考えられる。カフェインの急性経口毒性（ＬＤ５０）は、ラットについて、１７４〜２１０ｍｇ／ｋｇである。造血器腫瘍の新たな治療薬としてカフェインおよびその誘導体が臨床応用されることにより、造血器腫瘍の長期予後の改善が期待される。同様に、カフェインおよびその誘導体は、副作用の少ない、安全な免疫抑制剤、ｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬としても、利用可能である。
【００１２】
カテキンは、緑茶に含まれる成分であり、したがって、カテキンおよびその誘導体を用いた造血器腫瘍の治療は従来の抗がん剤による化学療法とは異なり、副作用の少ない安全な治療法と考えられる。カテキンを含有するチャ乾留物の急性経口毒性（ＬＤ５０）は、ラットについて、３２ ｇ／ｋｇ以上とされている。造血器腫瘍の新たな治療薬としてカテキンおよびその誘導体が臨床応用されることにより、造血器腫瘍の長期予後の改善が期待される。同様に、カテキンおよびその誘導体は、副作用の少ない、安全な免疫抑制剤、ｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬としても、利用可能である。
【００１３】
クルクミンは、ウコンに含まれる色素成分であり、したがって、クルクミンおよびその誘導体を用いた造血器腫瘍の治療は従来の抗がん剤による化学療法とは異なり、副作用の少ない安全な治療法と考えられる。ウコンとはショウガ科に属するクルクマ属の仲間で、世界中で約５０種が認められている。ウコンは、高温多湿を好み、アジア、アフリカ、インド、中南米の熱帯から亜熱帯にかけて広く自生分布し、又栽培されている。日本では沖縄県、鹿児島県が主な産地となっており、日本で栽培されているウコンには、主に秋ウコン（学名：Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ Ｌ．）（沖縄名うっちん）、春ウコン（学名：Ｃｕｒｃｕｍａ ａｒｏｍａｔｉｃａ Ｓａｌｉｓｂ）（キョウオウ）、紫ウコン（ガジュツ）（学名：Ｃｕｒｃｕｍａ ｚｅｄｏａｒｉａ Ｒｏｓｃｏｅ）の三種類がある。クルクミンの急性経口毒性（ＬＤ５０）は、ラットについて、５，０００ ｍｇ／ｋｇ、マウスについて、２，０００ ｍｇ／ｋｇ以上である。造血器腫瘍の新たな治療薬としてクルクミンおよびその誘導体が臨床応用されることにより、造血器腫瘍の長期予後の改善が期待される。同様に、クルクミンおよびその誘導体は、副作用の少ない、安全な免疫抑制剤としても、利用可能である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明は、カスパーゼを活性化することができる化合物またはその薬理上許容できる塩を含有する造血器腫瘍の治療薬を提供する。
【００１５】
また、本発明は、カスパーゼを活性化することができる化合物またはその薬理上許容できる塩を含有する免疫抑制剤を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、カプサイシン、カフェイン、カテキン及びそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物またはその薬理上許容される塩を含有する、ｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬を提供する。
【００１７】
カスパーゼとしては、カスパーゼ１〜１１が知られている。本発明に使用する化合物は、上記カスパーゼのいずれのものを活性化するものであってもよいが、カスパーゼ３、８または９のいずれか１つ又は２つ以上のものを活性化するものであるとよく、好ましくはカスパーゼ３を活性化するものであるとよい。
【００１８】
カスパーゼを活性化することができる化合物としては、カプサイシン、１’−アセトキシチャビコールアセテート、カフェイン、カテキン、クルクミン及びそれらの誘導体を例示することができる。
カプサイシンの構造式を以下に示す。
【００１９】
【化１】
【００２０】
【化２】
【００２１】
Ｒ１は、炭素数６〜１１のアルキル基またはアルケニル基である。炭素数６〜１１のアルキル基またはアルケニル基としては、Ｃ６−１１直鎖状または分枝状アルキル、Ｃ６−１１直鎖状または分枝状アルケニル（例えば、−（ＣＨ２）ｎＣＨ＝ＣＨＣＨ（ＣＨ３）２（ｎは１〜６の整数）で表される基）を挙げることができる。好ましくは、Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎＣＨ＝ＣＨＣＨ（ＣＨ３）２（ｎは１〜６の整数）で表される基、アルキル基である。
【００２２】
Ｒ２は炭素数１〜１２の炭化水素基（例えば、炭素数１〜１２のアルキル基、炭素数６〜１２のシクロアルキル基、炭素数２〜１２のアルケニル基、炭素数２〜１２のアルキニル基、炭素数３〜１２のシクロアルケニル基、炭素数６〜１２のアリール基、炭素数７〜１２のアラルキル基）であり、好ましくは、Ｒ２は炭素数１〜１２のアルキル基（具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル等の低級アルキル基）である。
【００２３】
カプサイシンおよびその誘導体の薬理上許容される塩としては、ナトリウム塩、カルシウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、リシン塩、アルギニン塩などを例示することができる。
【００２４】
カプサイシンおよびその誘導体は、下記の文献に記載の方法に従って、製造することができる。Ｓｐａｔｈ， Ｄａｒｌｉｎｇ， Ｂｅｒ． ６３， ７３７ （１９３０）； Ｌ． Ｃｒｏｍｏｂｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９５５， １０２５； Ｏ．Ｐ． Ｖｉｇ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｄｉａｎ Ｊ． Ｃｈｅｍ． １７Ｂ， ５５８ （１９７９）
【００２５】
また、カプサイシンおよびその誘導体は、常法により、薬理上許容される酸または塩基との塩に導くことができる。
【００２６】
カプサイシンおよびその誘導体ならびに薬理上許容されるそれらの塩は、白血病、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍の治療薬、免疫抑制剤、ｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬として有効である。これらの化合物は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、化学的治療剤）と組み合わせて使用してもよい。
【００２７】
１’−アセトキシチャビコールアセテートの構造式を以下に示す。
【００２８】
【化３】
１’−アセトキシチャビコールアセテートおよびその誘導体としては、下記の一般式（ＸＩ）で表される化合物を例示することができる。
【００３０】
【化４】
【００３１】
Ｒ１１は、低級アルキル基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル等のＣ１−４のアルキル基など）または芳香族環基（例えば、フェニル、ナフチル、アントリル等のＣ６−１４芳香族炭化水素残基、ピリジル、フリル、チエニル、イミダゾリル、チアゾリル等の芳香族複素環残基など）である。好ましくは、Ｒ１１は低級アルキル基である。より好ましくは、Ｒ１１はメチル基である。
【００３２】
Ｒ１２は低級アルキル基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル等のＣ１−４のアルキル基など）または芳香族環基（例えば、フェニル、ナフチル、アントリル等のＣ６−１４芳香族炭化水素残基、ピリジル、フリル、チエニル、イミダゾリル、チアゾリル等の芳香族複素環残基など）である。好ましくは、Ｒ１２は低級アルキル基である。より好ましくは、Ｒ１２はメチル基である。
【００３３】
１’−アセトキシチャビコールアセテートおよびその誘導体の薬理上許容される塩としては、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。無機塩基との塩の好適な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、アルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩などが挙げられる。
【００３４】
１’−アセトキシチャビコールアセテートおよびその誘導体は、下記の文献に記載の方法に従って、製造することができる。
・Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ５７（８）， １３４４−１３４５， １９９３
・特開２００２−７８４６４
【００３５】
また、１’−アセトキシチャビコールアセテートおよびその誘導体は、常法により、薬理上許容される酸または塩基との塩に導くことができる。
【００３６】
１’−アセトキシチャビコールアセテートおよびその誘導体ならびに薬理上許容されるそれらの塩は、白血病、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍の治療薬、免疫抑制剤として有効である。これらの化合物は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、化学的治療剤）と組み合わせて使用してもよい。
【００３７】
カフェインの構造式を以下に示す。
【００３８】
【化５】
カフェインおよびその誘導体としては、下記の一般式（ＸＸＩ）で表されるキサンチン誘導体を例示することができる。
【００４０】
【化６】
【００４１】
一般式（ＸＸＩ）で表されるキサンチン誘導体としては、カフェインの他、キサンチン、アミノフィリン、テイフィリン、コリンテオフィリン、テオボブロミン、オクストリフィン、ジプロフィン、プロキシフィリンなどを例示することができる。これらの化合物は市販されており、入手可能である。
【００４２】
カフェインおよびその誘導体の薬理上許容される塩としては、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。無機塩基との塩の好適な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、アルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩などが挙げられる。
【００４３】
カフェインおよびその誘導体は市販されており、入手可能である。
【００４４】
また、カフェインおよびその誘導体は、常法により、薬理上許容される酸または塩基との塩に導くことができる。
【００４５】
カフェインおよびその誘導体ならびに薬理上許容されるその塩は、白血病、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍の治療薬、免疫抑制剤、ｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬として有効である。これらの化合物は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、化学的治療剤）と組み合わせて使用してもよい。
【００４６】
カテキンおよびその誘導体は、一般に、樹木に広く含まれる水溶性の天然多価フェノールを意味するが、本明細書においては、それらの天然多価フェノールのみならず、それらから誘導される化合物も包含する。
。具体的には、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、カテキン、ガロカテキン、エピカテキンジガレート及びエピガロカテキンジガレートなどを例示することができ、（−）−エピカテキン、（−）−エピガロカテキン、（−）−エピカテキンガレート、（−）−エピガロカテキンガレート、（＋）−カテキン、（＋）−ガロカテキン、（−）−エピカテキンジガレート及び（−）−エピガロカテキンジガレートなどの光学異性体が存在する。そのうちのいくつかを以下に示す。
【００４７】
【化７】
カテキンおよびその誘導体の薬理上許容される塩としては、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。無機塩基との塩の好適な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、アルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩などが挙げられる。
【００４９】
カテキンおよびその誘導体は、茶芽に多く含まれることが知られており、茶芽からの抽出により粗カテキンとして得ることができる。より高純度の粗カテキンを得る方法も公知である。
【００５０】
また、カテキンおよびその誘導体は、常法により、薬理上許容される酸または塩基との塩に導くことができる。
【００５１】
カテキンおよびその誘導体ならびに薬理上許容されるそれらの塩は、白血病、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍の治療薬、免疫抑制剤、ｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬として有効である。これらの化合物は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、化学的治療剤）と組み合わせて使用してもよい。
【００５２】
クルクミンの構造式を以下に示す。
【００５３】
【化８】
クルクミンおよびその誘導体としては、下記の一般式（ＸＸＸＩ）で表される化合物を例示することができる。
【００５５】
【化９】
【００５６】
Ｒ３１、Ｒ３２ 、Ｒ３３ およびＲ３４の低級アルコキシのアルキル部分は、炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐のアルキルであり、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等があげられる。具体的なアルコキシ基としては、炭素数１〜２のメトキシ基、エトキシ基が好ましい。式（ＸＸＸＩ）において、Ｒ３２およびＲ３４ がヒドロキシ基である化合物が好ましい。
【００５７】
一般式（ＸＸＸＩ）で表される化合物としては、Ｕ１［ジフェルロイルメタン（ｄｉｆｅｒｕｌｏｙｌｍｅｔｈａｎｅ）、（Ｅ，Ｅ）−１，７−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１，６−ヘプタジエン−３，５−ジオン、以下単にクルクミンというときもある］、Ｕ２［ジメトキシクルクミン（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙｃｕｒｃｕｍｉｎ）、ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシシンナモイル）メタン］、Ｕ３［ビスデメトキシクルクミン（ｂｉｓｄｅｍｅｔｈｏｘｙｃｕｒｃｕｍｉｎ）、ビス（４−ヒドロキシシンナモイル）メタン］、ＤＭＵ１［（Ｅ，Ｅ）−１，７−ビス（３，４−ジメトキシフェニル）−１，６−ヘプタジエン−３，５−ジオン］、ＤＨＵ１［（Ｅ，Ｅ）−１，７−ビス（３，４−ジヒドロキシフェニル）−１，６−ヘプタジエン−３，５−ジオン］等のクルクミン類化合物があげられ、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３およびＤＨＵ１が好ましく用いられ、Ｕ１が特に好ましく用いられる。
【００５８】
クルクミンおよびその誘導体の薬理上許容される塩としては、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。無機塩基との塩の好適な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、アルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩などが挙げられる。
【００５９】
クルクミン類は、熱帯性の生姜科植物ターメリック（Ｃｕｒｃｕｍａ ｌｏｎｇａ Ｌ．）に含まれる黄色色素であり、ターメリックの根茎の乾燥粉末およびそれから精製したクルクミンが市販されている。
【００６０】
また、クルクミンおよびその誘導体は、常法により、薬理上許容される酸または塩基との塩に導くことができる。
【００６１】
クルクミンおよびその誘導体ならびに薬理上許容されるその塩は、白血病、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍の治療薬、免疫抑制剤として有効である。これらの化合物は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、化学的治療剤）と組み合わせて使用してもよい。
【００６２】
カスパーゼを活性化することができる化合物および薬理上許容されるその塩は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの製剤にして、経口投与してもよいし、注射剤、坐剤などの製剤にして、腹腔内や静脈内への注射、直腸投与などにより非経口投与することもできる。
【００６３】
カスパーゼを活性化することができる化合物および薬理上許容される塩の製剤化は、賦形剤（乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトールなどの糖類、バレイショ、コムギ、トウモロコシなどのデンプン、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機物、結晶セルロースなど）、結合剤（デンプンのり液、アラビアゴム、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロースなど）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴール、シリコーン油）、崩壊剤（デンプン、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、ＣＭＣ・Ｎａ、ＣＭＣ・Ｃａ、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウムなど）、矯味矯臭剤（乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、芳香性精油類など）、溶剤（注射用水、滅菌精製水、ゴマ油、ダイズ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実油など）、安定剤（窒素、二酸化炭素などの不活性ガス、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸などのキレート剤、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸、ロンガリットなどの還元物質など）、保存剤（パラオキシ安息香酸エステル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェノール、塩化ベンザルコニウムなど）、界面活性剤（水素添加ヒマシ油、ポリソルベート８０、２０など）、緩衝剤（クエン酸、酢酸、リン酸のナトリウム塩、ホウ酸など）、希釈剤などの製剤添加物を用いて、公知の方法で行われる。
【００６４】
カスパーゼを活性化することができる化合物および薬理上許容されるその塩のヒトへの投与は、疾病の状態の重篤度や生体の応答性によるが、治療の有効性が認められるまで、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期間にわたり、適当な用量、投与方法、頻度で行えばよい。例えば、成人に対して、カプサイシンおよびその誘導体については、１日あたり約０．１〜２０００ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは１日あたり約１〜１０００ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量で、１’−アセトキシチャビコールアセテートおよびその誘導体については、１日あたり約０．０１〜２０００ ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは１日あたり約０．１〜１０００ ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量で、カフェインおよびその誘導体については、１日あたり約０．１〜２０００ ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは１日あたり約１〜１０００ ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量で、カテキンおよびその誘導体については、１日あたり約０．０１〜２０００ ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは１日あたり約０．１〜１０００ ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量で、クルクミン及びそれらの誘導体については、１日あたり約０．０１〜２０００ ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは１日あたり約０．１〜１０００ ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量で、１回または数回に分けて静脈注射により投与するとよいが、その投与量や投与回数は、症状、年齢、投与方法などにより適宜変更しうる。
【００６５】
本発明の分子標的治療薬は、ｐ５３が関与する疾患、例えば、造血器腫瘍（例えば、白血病、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫など）、皮膚癌、大腸癌、胃癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、甲状腺癌、腎癌、前立腺癌、膀胱癌、脳腫瘍などの治療に利用することができる。
【００６６】
【実施例】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６７】
〔実施例１〕
１．材料と方法
（１）材料
・カプサイシン：Ｗａｋｏ ｃｈｅｍｉｃａｌ． Ｃｏ． （Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）より入手
・各種造血器腫瘍細胞株：
ＮＢ４ Ｄｒ．Ｍ．Ｌａｎｏｔｔｅ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ Ｈｏｓｐｉｔａ．， Ｐａｒｉｓ， Ｆｒａｎｃｅ）より供与
ＨＬ−６０：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より入手
ＵＦ−１：我々の研究室にて確立した細胞株
Ｋ５６２、ＫＵ８１２、Ｕ２６６：理研細胞バンクより入手
・各種カスパーゼ阻害剤
Ｚ−ＶＡＤ、カスハ゜ーセ゛９阻害剤、カスハ゜ーセ゛８阻害剤：ＭＢＬより入手
・ワートマニン：Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より入手
・ピフィスリンα：Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ） より入手
・ＮＡＣ（Ｎ−アセチルシステイン）：Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ） より入手
・ＢＳＯ（ブチオニンスルフォキシド）：Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ） より入手・ＤＮＡマイクロアレイ：ＴＯＹＯＢＯ Ｃｏ．Ｌｔｄより入手
・白血病患者サンプル：慶応義塾大学病院入院患者及び外来患者より、文書と同意のもと末梢血または骨髄血を入手
・正常者サンプル：有志より説明と同意のもと入手
ＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）：Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ） より入手
【００６８】
（２）実験方法
各種造血器腫瘍細胞株に対する増殖抑制効果及びアポトーシスの誘導を調べる実験：カプサイシン１００μＭの添加培養で、各種造血器腫瘍細胞株（１Ｘ１０４／ｍｌ）に対しカプサイシン１００μＭの添加培養を行い、トリパンブルー染色を用いて細胞数を算定する。
【００６９】
細胞周期を調べる実験：カプサイシン１００μＭ添加培養各時間後、１Ｘ１０５の細胞を採取し、ＰＩ（最終濃度 ０．５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳにて、ＭｏｄｉＦＩＴ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞周期を解析する。
【００７０】
ＤＮＡラダー形成を調べる実験：ＮＢ４細胞１Ｘ１０５／ｍｌにＣＡＰ１００μＭを添加して０、２４、４８、７２時間培養後に、ＤＮＡを採取し、２％ アガロースゲルにて電気泳動しラダー形成の有無につき検討する。
【００７１】
細胞形態を調べる実験：ＮＢ４細胞１Ｘ１０４ 個をサイトスピンにてスライドグラスに遠心し、ギムザ染色し光学顕微鏡にて（１Ｘ１０４倍）観察する。
【００７２】
アネキシンＶ、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）染色の実験：１Ｘ１０５の細胞を採取し、アネキシンＶ （Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＰＩ（最終濃度 ０．５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳで解析し、アネキシンＶ陽性細胞の割合を測定する。
【００７３】
カスパーゼ３活性を調べる実験：カプサイシン１００μＭ添加培養各時間後、５Ｘ１０５の細胞を採取し、カスハ゜ーセ゛３活性キット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、ＦＡＣＳにて活性を測定する。
【００７４】
発現解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 解析）（プロカスパーゼ３とカスパーゼ３ａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍ、アポトーシス関連蛋白、チトクロームｃ及びβ−アクチン、細胞周期関連蛋白、ｐ５３関連蛋白、Ｓｅｒ ６，９，２０，３７のリン酸化ｐ５３、β−アクチンとｐ５３）カプサイシン１００μＭ添加培養各時間後、蛋白を採取し各レーン １５μｇの蛋白を泳動し各種抗体を用いて解析する。
【００７５】
ミトコンドリア膜電位の変化を調べる実験：カプサイシン１００μＭ添加培養各時間後、５Ｘ１０５の細胞を採取しローダミン１２３（最終濃度１０μＭ）を投与し、１５分間３７℃で静置する。１５００ｇで５分間遠心後上清を捨て、沈殿をＰＢＳに懸濁し、ＰＩ（最終濃度 １０μＭ）を加え、ＦＡＣＳにて解析する。
【００７６】
活性酸素の解析：カプサイシン１００μＭ添加培養各時間後、５Ｘ１０５の細胞を採取し、ジヒドロエチジウム（最終濃度 １０μＭ）をマーカーとして、ＦＡＣＳにて解析する。
【００７７】
ＭＴＴ アッセイ：カプサイシン１００μＭ添加培養各時間後、培養液１００μｌを９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移し、「ＭＴＴ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ （Ｒｏｃｈｅ）」の実験方法に従い、ＭＴＴ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ（１Ｘ） １０μｌを加え、３７℃４時間静置後、ＭＴＴ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ １００μｌを加え、３７℃にて静置後、ＯＤ４５０値をプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）にて解析する。
【００７８】
２．結果
各種造血器腫瘍細胞株の増殖に対するカプサイシンの効果を図１に示す。カプサイシン（以下、「ＣＡＰ」という）１００μＭの添加培養で、各種造血器腫瘍細胞株（１Ｘ１０４／ｍｌ）に対し強い増殖抑制効果が認められた。
【００７９】
ＮＢ４細胞に対し、各種濃度のＣＡＰ及び各種培養時間での細胞周期とアポト−シスの検討を行った結果を図２〜５に示す。
【００８０】
図２から、ＣＡＰ １００μＭ添加培養によりコントロール（ｂａｓｅ：エタノール０．０１％）に対し、優位に細胞の増殖抑制効果を認めることがわかる。
【００８１】
図３から、ＣＡＰが濃度依存性にアポトーシスを誘導することがわかる。
【００８２】
図４から、ＣＡＰ １００μＭ添加培養が時間依存性に細胞周期をＧ１期に止め、アポトーシスに相当する ｐｒｅ−Ｇ１期が増加させることがわかる。
【００８３】
図５から、ＣＡＰが濃度依存性に細胞周期のＧ１期への停止とアポトーシスを増加させることがわかる。
【００８４】
図２〜５の結果から、ＣＡＰが濃度依存的 及び時間依存的にアポト−シスを誘導し・Ｇ１期に細胞周期を停止させる（Ｇ１ ａｒｒｅｓｔ）ことが分かった。
【００８５】
ＮＢ４細胞１Ｘ１０５／ｍｌにＣＡＰ１００μＭを添加して０、２４、４８、７２時間培養後に、ＤＮＡラダー形成を調べた結果を図６に示すＣＡＰ添加培養後（１００μＭ ２４時間）のＮＢ４細胞株はＤＮＡラダー形成を認めた。
【００８６】
ＮＢ４細胞１Ｘ１０５／ｍｌにＣＡＰ１００μＭを添加して２４時間培養して、細胞の形態を観察した結果を図７に示す。ＣＡＰ添加培養後（１００μＭ ２４時間）のＮＢ４細胞株は、アポト−シスに典型的な核の濃縮、断片化を認めた。
【００８７】
ＮＢ４細胞１Ｘ１０４／ｍｌにＣＡＰ１００μＭを添加して２４時間培養して、細胞周期を解析した結果を図８に示す。細胞周期の解析では、Ｇ１ ａｒｒｅｓｔ・Ｓ期の減少とともにＣＡＰ １００ｕＭ投与２４時間後にアポト−シスを示す、Ｓｕｂ Ｇ１分画の増加を認めた。
【００８８】
さらに、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いたアネキシンＶ ， ＰＩ染色による早期アポトーシスの検討結果を図９に示す。ＣＡＰ投与後、経時的にアネキシンＶ陽性細胞の増加を認めた。以上の結果からＣＡＰはＮＢ４細胞の細胞周期をＧ１期に停止させ、アポトーシス誘導を介して増殖を抑制することが示された。
【００８９】
次に、ＣＡＰによるアポートシス誘導機構に関する解析を行った。まず、ＦＡＣＳを用いてカスパーゼ３の活性化を検討した。結果を図１０に示す。ＣＡＰ １００μＭ投与３時間後よりカスハ゜ーセ゛３の活性化を認めた。経時的な増加を認めた。
【００９０】
種々のカスパーゼ阻害剤（Ｚ−ＶＡＤ、カスハ゜ーセ゛９阻害剤）を用いて検討した。結果を図１１および１２に示す。カスハ゜ーセ゛３， ９阻害剤投与にてＣＡＰによるアポトーシスが解除された（図１１）。また、４８時間後よりＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔ解析で１７ｋＤのカスパーゼ ３のａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍを認めた（図１２）。一方、カスパーゼ ３及びｐａｎ‐カスパーゼ阻害剤投与時は、細胞増殖抑制は解除されないものの、ＦＡＣＳ解析にてアポト−シスの減少を認めた（図３８）。以上の結果から、ＮＢ４におけるアポト−シスにカスパーゼ‐３，９が関与することが示された。
【００９１】
次に、アポト−シス関連蛋白について検討を行った結果を図１３に示す。Ｂｃｌ−２， Ｂｃｌ−ｘＬは発現変化を認めなかったが、図１７に示すように、アポト−シス誘導を促進するＢａｘの経時的な発現増加を認めた。また、カスパーゼ ３ ａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍの出現も認めた。（図１２）
以上の結果より、カプサイシンがＢａｘ 蛋白を介して、カスハ゜ーセ゛９を活性化し、カスハ゜ーセ゛３が活性化されアポトーシスが誘導されることが示された。
【００９２】
ＣＡＰ→Ｂａｘ→カスパーゼ９→カスパーゼ３→アポト−シス
【００９３】
ミトコンドリア膜電位の変化を検討した結果を図１４に示す。ＣＡＰ １００μＭ投与９時間後よりミトコンドリア膜電位の低下を認め、さらに細胞質分画のチトクロームｃの経時的な発現増加を認めた（図１５）。以上の結果より、ＣＡＰによるアポト−シスはＢａｘを介するミトコンドリア膜電位の低下、チトクロームｃの遊離、カスパーゼ ９、カスパーゼ ３を介すると示唆された。
【００９４】
次に、細胞周期関連蛋白について検討を行った結果を図１６に示す。ＣＡＰ １００μＭ投与時にｐ２１の経時的な増加およびｃｙｃｌｉｎＤ１の経時的な減少を認めた。一方、ｐ２７、ｃｙｃｌｉｎ Ａ，Ｂ１，Ｄ２，Ｄ３，Ｅには経時的な発現の変化は認められなかった。また、Ｒｂ（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）蛋白のリン酸化の低下も認めた。（データは示さず）
以上の結果より、ＣＡＰはｐ２１の増加、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１の減少、Ｒｂ蛋白の脱リン酸化を介してＧ１ ａｒｒｅｓｔを起こす事が示唆された。
【００９５】
ＣＡＰ→ｐ２１↑，ｃｙｃｌｉｎＤ１↓→Ｇ１ ａｒｒｅｓｔ
【００９６】
前記のようにＮＢ４細胞と比較し、ＡＰＬ細胞株であるＨＬ−６０，ＵＦ−１やＣＭＬ細胞株であるＫ５６２，ＫＵ８１２では、ＣＡＰに対する感受性が低い。Ｋ５６２・ＨＬ６０
では、ｐ５３の欠損や機能異常が報告されている（Ｔｒｅｐｅｌ Ｍ， Ｓｃｈｅｄｉｎｇ Ｓ， Ｇｒｏｓｃｕｒｔｈ Ｐ， Ｈｏｒｎｙ ＨＰ， Ｍｌｉｐｉｅｒｏ Ｕ， Ｂｒｕｇｇｅｒ Ｗ， Ｄｉｃｈｇａｎｓ Ｊ， Ｗｅｌｌｅｒ Ｍ． Ａ ｎｅｗ ｌｏｏｋ ａｔ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｐ５３ ｉｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｌｅｕｋｅｍｉａ １９９７；１１（１１）：１８４２−９． Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｔ， Ｐｏｍｍｉｅｒ Ｙ． Ｃａｍｐｔｏｔｅｎｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｐ５３−ｎｕｌｌ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ ＨＬ６０ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉ： ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ ａｎｄ ｄｉｃｈｌｏｒｏｉｓｏｃｏｕｍａｒｉｎ ｓｕｇｇｅｓｔ ａｎ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｖｏｔｈ ｃａｓｐａｓｅｓ ａｎｄ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ． Ｌｅｕｋｅｍｉａ １９９７；１１（８）：１２３８−４４）。そこで、本発明者らは、ＮＢ４，ＵＦ−１， ＫＵ８１２のｐ５３の発現を解析したところ、ＫＵ８１２ではｍＲＮＡの発現が見られなかった（データは示さず）。また、ＨＬ−６０、ＵＦ−１、Ｕ２６６においてｐ５３の蛋白の発現は認められなかった（データは示さず）。また、細胞周期関連蛋白の解析の際に認めたｐ２１の増加及びｃｙｃｌｉｎＤ１の経時的な減少とｐ５３の関連性が以前から報告されている（Ｌｉ Ｙ， Ｊｅｎｋｉｎｓ ＣＷ， Ｎｉｃｈｏｌｓ ＭＡ， Ｘｉｏｎｇ Ｙ． Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐ５３ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐ２１． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９９４；９（８）：２２６１−８））。以上の結果から、我々はＣＡＰにおけるＮＢ４細胞のアポトーシスにおいてｐ５３の関連の可能性につき検討を進めることとした。一方ＮＢ４細胞では、野生型のｐ５３のｍＲＮＡ及び蛋白の発現を認めた（データは示さず）。
【００９７】
まず、本発明者らはＣＡＰ １００μＭ投与時のＮＢ４細胞におけるｐ５３及びその関連蛋白の発現解析をＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔ解析にて行った。結果を図１７に示す。ＣＡＰ １００μＭ投与にて、ｐ５３ 蛋白の経時的な増加を認めた。一方ＭＤＭ２、ｐ７３には発現の変化は認められなかった。
【００９８】
ｐ５３の活性化のメカニズムとして以前よりセリン残基（Ｓｅｒ）のリン酸化が知られている（Ｂａｎｉｎ， Ｓ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ ｂｙ ＡＴＭ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８１， １６７４−１６７７））。ＤＮＡ ｄａｍａｇｅや放射線照射、各種抗がん剤（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａなど）投与時のｐ５３の活性化にセリン残基リン酸化が関与すると報告されている。（Ｂａｎｉｎ， Ｓ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ ｂｙ ＡＴＭ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８１， １６７４−１６７７Ｃａｎｍａｎ， ｅｔ ａｌ（１９９８） Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＡＴＭ ｋｉｎａｓｅ ｂｙ ｉｏｎｉｓｉｎｇ ｒａｄｉａｔｉｏｎａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８１，１６７７−１６７９）。そこで、本発明者らは、ＣＡＰ １００μＭ投与時のｐ５３のリン酸化につき解析を行った。結果を図１８に示す。ＣＡＰ １００μＭ投与時Ｓｅｒ １５のリン酸化の経時的な増加を認めた。一方、Ｓｅｒ ６，９，２０，３７のリン酸化に経時的な変化は認められなかった。
【００９９】
以上の結果より、カプサイシン投与により、ｐ５３蛋白のセリン１５残基がリン酸化され、ｐ５３蛋白が増加し、ｐ２１の増加・ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１の減少が生じ、Ｇ１期に細胞周期が停止することが示唆された。
【０１００】
ｐ５３の阻害剤として最近ピフィスリンα（ＰＦＴα）が報告されている。（Ｋｏｍａｒｏｖ ＰＧ． Ｋｏｍａｒｏｖａ ＥＡ． Ｋｏｎｄｒａｔｏｖ ＲＶ． Ｃｈｒｉｓｔｏｖ−Ｔｓｅｌｋｏｖ Ｋ． Ｃｏｏｎ ＪＳ． Ｃｈｅｒｎｏｖ ＭＶ． Ｇｕｄｋｏｖ ＡＶ． Ａ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｐ５３ ｔｈａｔ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｍｉｃｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｉｄｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｒａｐｙ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９；２８５（５４３４）：１７３３−７）ＰＦＴαはｐ５３の発現そのものは変化させないものの、その下流の分子であるｐ２１やＢａｘなどの発現を抑制することにより、ｐ５３の作用を阻害するといわれている。そこで、本発明者らは、ＣＡＰによるＮＢ４細胞のアポト−シスにおけるｐ５３の関連性を解析するためにＰＦＴαを用いてその抑制ができるかを検討した。結果を図２０及び２１に示す。Ｐ５３ 阻害剤であるＰＦＴα （１００ｎＭ ３時間前投与）を投与したところ、ＣＡＰによるＮＢ４細胞のアポト−シス及びＧ１ ａｒｒｅｓｔを抑制した。以上の結果より、ＣＡＰによるＮＢ４細胞への影響において、ｐ５３が重要な役割を果たしていることが示された。また、ＰＦＴα投与時の発現蛋白を調べたところｐ２１， Ｂａｘの発現低下および、ＣＡＰ投与時の、発現増加の抑制を認めた（データは示さず）。
【０１０１】
さらに、本発明者らは、ｐ５３のアンチセンスを用いて、ＣＡＰによるＮＢ４細胞のＧ１ ａｒｒｅｓｔ及びアポト−シスが抑制できるかを検討した。ｐ５３のアンチセンス， コントロールセンス， ミスマッチセンス（アンチセンスとは６０％ ミスマッチ）を以下のように作成し、各々１μＭ ２４時間前投与し、アンチセンスの分解を少なくするために、培養液をＲＰＭＩ＋５％ＦＢＳ＋ＰＣ／ＳＭとし実験を行った。
１） アンチセンス オリゴヌクレオチド
５’−ＣＧＧＣＴＣＣＴＣＣＡＴＧＧＣＡＧＴ−３’（配列番号１）
２） コントロール オリゴヌクレオチド
５’−ＣＴＧＡＧＧＣＴＣＴＡＣＣＧＣＴＧＣ−３’（配列番号２）
３） ミスマッチ オリゴヌクレオチド
５’−ＣＧＧＧＴＣＣＴＣＴＡＣＧＣＴＡＧＴ−３’（配列番号３）
【０１０２】
結果を図２２及び２３に示す。アンチセンスを前投与した細胞では、ＣＡＰによるＮＢ４細胞の、Ｇ１ ａｒｒｅｓｔ及びアポト−シスが抑制することが分かった。以上の結果より、ＣＡＰにＮＢ４細胞へのアポト−シス及び細胞周期の停止にｐ５３が重要な役割をしていることが分かった。
【０１０３】
ｐ５３の活性化のメカニズムの一つとして活性酸素の産生が知られている（Ｓｈａｃｋｅｌｆｏｒｄ， Ｒ．Ｅ．，Ｉｎｎｅｓ， Ｃ．Ｌ．，Ｓｉｅｖｅｒ， Ｓ．Ｏ．， Ｈｅｉｎｌｏｔｈ， Ａ．Ｎ．， Ｌｅａｄｏｎ， Ｓ．Ａ．， ａｎｄＰａｕｌｅｓ， Ｒ．Ｓ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７６，２１９５１−２１９５９）。また、抗癌剤、放射線による種々の癌細胞のアポト−シス誘導や亜ヒ酸によるＡＰＬや多発性骨髄腫細胞のアポト−シス誘導に活性酸素が重要な役割を果たしていることが報告されている（Ｄａｉ Ｊ， Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ＲＳ， Ｗａｘｍａｎ Ｓ， Ｊｉｎｇ Ｙ． Ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｃｅｌｌｓ ｃａｎ ｂｅ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ ｔｏ ｕｎｄｅｒｇｏ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ａｒｓｅｎｉｃ ｔｏｒｉｏｘｉｄｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｒｅｄｏｘ ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｌｏｏｄ １９９９ ；９３（１）２６８−９７）。また、ＮＢ４細胞はク゛ルタチオンが他の白血病細胞株と比較し、少ないことが知られている（（Ｄａｉ Ｊ， Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ＲＳ， Ｗａｘｍａｎ Ｓ， Ｊｉｎｇ Ｙ． Ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｃｅｌｌｓ ｃａｎ ｂｅ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ ｔｏ ｕｎｄｅｒｇｏ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ａｒｓｅｎｉｃ ｔｏｒｉｏｘｉｄｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｒｅｄｏｘ ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｌｏｏｄ １９９９ ；９３（１）２６８−９７）。そこで、本発明者らは、ＣＡＰによるＮＢ４細胞のアポト−シス誘導における活性酸素の解析を行った。結果を図２４に示す。ＮＢ４細胞では、ＣＡＰ １００μＭ投与４時間後に、細胞内活性酸素濃度の増加が認められた。一般に細胞内には有害な活性酸素を除去するＳＯＤ、ク゛ルタチオン、カタラーセ゛、チオレト゛キシンなどの抗酸化物質が存在する。
本発明者らは、ク゛ルタチオン前駆体であるＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）によりＣＡＰによるアポートシスを抑制することができるか、また、ク゛ルタチオン阻害作用を有するフ゛チオニンスルフォキシト゛（ＢＳＯ）を用いて（１ｍＭ ８時間前投与）アポト−シスが増強されるかを解析することによりク゛ルタチオン（ＧＳＨ）とＣＡＰによるアポト−シスとの関連を検討した。結果を図２５及び２６に示す。ク゛ルタチオン前駆体であるＮＡＣ（１００μＭ １時間前投与）を前投与し活性酸素を除去すると、ＣＡＰによるＮＢ４細胞のアポト−シス誘導、細胞周期のＧ１ ａｒｒｅｓｔが抑制されることがわかった。
【０１０４】
以上の結果より、カプサイシンによる白血病細胞のアポトーシス誘導および細胞周期Ｇ１期への停止の機序として、ｐ５３セリン１５残基のリン酸化において、ＡＴＲ／ＡＴＭ等のリン酸化酵素の重要性が示唆された。また、そのリン酸化酵素の活性化に対し活性酸素の産生の関与も示された。
【０１０５】
以上よりカプサイシン投与により、活性酸素・ＡＴＲ／ＡＴＭなどを介し、ｐ５３セリン残基がリン酸化されＢａｘ蛋白・ミトコンドリア膜電位の低下・チトクローム ｃ遊離を介し、カスハ゜ーセ゛の系が活性化され、アポトーシスが誘導されることが示唆された。
【０１０６】
ＣＡＰ→活性酸素産生→ＡＴＲ→ｐ５３ Ｓｅｒ １５ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ→ｐ５３↑→Ｂａｘ→ミトコント゛リア膜電位低下→チトクローム ｃ 遊離→カスパーゼ ９→カスパーゼ ３→アポトーシス→ｐ２１↑、ｃｙｃｌｉｎＤ１↓→Ｇ１ ａｒｒｅｓｔ
【０１０７】
次に、本発明者らは、実際の患者サンプルでのＣＡＰの効果につき検討を行った。計１１検体（急性骨髄性白血病・急性リンパ急性白血病・慢性骨髄性白血病・骨髄腫等含む）につき、ＭＴＴ アッセイ， アネキシン Ｖ−ＰＩ解析を含め、ＣＡＰの効果につき検討を行った。１１検体のうち１０検体にＣＡＰの効果を認めた。
【０１０８】
患者検体のｐ５３の発現につき検討を行った結果を図２７に示す。ＣＡＰの効果のあった１０検体にはｐ５３のｍＲＮＡの発現を認めたが、効果の見られなかった１検体にはｐ５３の発現は見られなかった。以上の結果より、実際の患者検体においてもｐ５３とＣＡＰの効果の関連性が示唆された。
【０１０９】
次に、本発明者らは、実際の患者サンプル（Ｊ．Ｕ氏）でのＣＡＰの効果につき検討を行った。フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病の骨髄を採取後、フィコールで分離し、１Ｘ１０７／ｍｌにＲＰＭＩ（＋２０％ ＦＢＳ＋ＰＣ／ＳＭ）で薄め、採取日当日から２４時間・４８時間後のＣＡＰ １０μＭ、５０μＭ及び１００μＭ 各濃度の効果を検討した。
【０１１０】
まず、ＭＴＴ アッセイ及びｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔを用いて細胞増殖抑制につき検討を行ったところ、濃度依存性に細胞増殖が抑制された（図２８）。
【０１１１】
次に、この患者サンプルでのＣＡＰによるアポト−シス及び細胞周期についての検討を行った。結果を図２９〜３１に示す。ＣＡＰ １００μＭ投与２４時間後にアネキシンＶ陽性細胞の著明な増加を認めた。また、ＣＡＰ投与後、濃度及び時間依存性にアネキシンＶ（＋）の増加を認めた（図２９）。培養４８時間の条件下での、ＣＡＰ濃度とアネキシンＶ−ＰＩ染色によるアポトーシスの検討結果を図３１に、ＣＡＰ濃度とアポト−シス（％）の関係を図３２に示す。
【０１１２】
この患者サンプルを用いて、ｐ５３の発現の有無につき検討したところ、正常なｐ５３の発現を認めた（データは示さず）。
【０１１３】
次に、本発明者らは、実際の慢性骨髄性白血病 慢性期の患者サンプルでのＣＡＰの効果につき検討を行った。患者の末梢血を採取後、フィコールで分離し、１Ｘ１０７／ｍｌにＲＰＭＩ（＋２０％ ＦＢＳ＋ＰＣ／ＳＭ）で薄め、採取日当日から２４時間・４８時間・７２時間後のＣＡＰ １０μＭ、５０μＭ及び１００μＭ 各濃度の効果を検討した。結果を図３３に示す。ＣＡＰ投与により、濃度依存的・時間依存的にアネキシンＶ（＋）の増加が認められた。
【０１１４】
次に我々は、急性前骨髄球性白血病の患者の末梢血を採取後、フィコールで分離し、１Ｘ１０７／ｍｌにＲＰＭＩ（＋２０％ ＦＢＳ＋ＰＣ／ＳＭ）で薄め、採取日当日から２４時間後のＣＡＰ １０μＭ、５０μＭ及び１００μＭ 各濃度の効果を検討した。
【０１１５】
まず、ＭＴＴ アッセイ及びアネキシンＶ−ＰＩ 染色法を用いて細胞増殖抑制及びアポト−シス誘導につき検討を行ったところ、細胞増殖抑制およびアポト−シスの誘導は起こらなかった（図３４）。
【０１１６】
本検体のｐ５３の発現につき検討したところ、ｐ５３ ｍＲＮＡの発現を認めなかった（データは示さず）。
【０１１７】
また、急性骨髄性白血病および急性前骨髄球性白血病患者サンプルへのカプサイシンの効果（アポトーシス誘導）を図３９に示す。ＣＡＰ投与により、濃度依存的にアネキシンＶ（＋）の増加が認められた。
【０１１８】
さらに、多発性骨髄腫患者サンプルへのカプサイシンの効果を図４０に示す。ＣＡＰ投与により、濃度依存的に細胞増殖が抑制された。
【０１１９】
次に、正常者末梢血単核球でのＣＡＰ１０μＭおよび１００μＭによる細胞増殖抑制についての検討を行った。結果を図３５に示す。ＣＡＰ投与による細胞増殖抑制効果は認めなかった。
【０１２０】
正常のヒト末梢血より単核球を分離し、ＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）で刺激し、活性化したリンパ球（主にＴ細胞）１×１０６／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して２４時間培養した時のＭＴＴアッセイの結果を図３５に示す。ＭＴＴアッセイで細胞増殖が抑制され、また、図３６に示すようにアポトーシス分画が増加していることが確認された。このことは、ＣＡＰが活性化されたＴ細胞を抑制することを示している。また、活性化されていない正常リンパ球には影響を与えなかった（データは示さず）。これらのことは、ＣＡＰが免疫抑制剤として利用可能であることを示している。
【０１２１】
以上の結果から、以下の結論が導かれる。
・唐辛子の成分ＣＡＰは、ＮＢ４細胞をはじめｐ５３を正常発現する種々の白血病、多発性骨髄腫などの造血器腫瘍細胞の細胞周期の停止を誘導した。
・その誘導には、ｐ５３の活性化を介したｐ２１／ｃｙｃｌｉｎＤ１の経路による細胞周期の停止および、ＢＡＸ／チトクロームｃ／カスパーゼ−３によるアポトーシス誘導の経路が重要な働きをしていることが示唆された。
【０１２２】
以上の結果より、ｐ５３はＮＢ４細胞をはじめｐ５３を正常発現する種々の白血病、多発性骨髄腫などの造血器腫瘍細胞のアポト−シス誘導の標的分子として重要な役割を果たしていることが示唆される。
【０１２３】
以上の結果から予測される、ＣＡＰの作用機序を図３７にまとめた。ＮＢ４細胞においてＣＡＰは活性酸素を細胞内（あるいはミトコンドリアで）産生し、ＡＴＲなどを介してｐ５３のＳｅｒ１５残基のリン酸化を起こすことにより、ＭＤＭ２との会合を抑制しｐ５３を安定化させる一方で転写を活性化する。そのことにより、一方でｐ２１の発現の上昇・ｃｙｃｌｉｎＤ１の低下等を開始、細胞周期をＧ１期で停止させる。また、一方でＢＡＸを介しミトコンドリア膜電位を低下させ、ミトコンドリアから細胞質内にチトクロームＣ遊離が起こり、その後カスパーゼ９及び３あるいは８を活性化することによりアポト−シスを誘導すると考えられる。
【０１２４】
〔実施例２〕
１．材料と方法
（１）材料
・１’−アセトキシチャビコールアセテート：京都大学農学部大東先生、村上先生より供与
・各種造血器腫瘍細胞株：
ＮＢ４ Ｄｒ．Ｍ．Ｌａｎｏｔｔｅ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ Ｈｏｓｐｉｔａ．， Ｐａｒｉｓ， Ｆｒａｎｃｅ）より供与
ＨＬ−６０：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ； Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より入手
ＵＦ−１：我々の研究室にて確立した細胞株
Ｋ５６２、ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ、Ｕ２６６：理研細胞バンクより入手
・各種カスパーゼ阻害剤
Ｚ−ＶＡＤ、カスハ゜ーセ゛９阻害剤、カスハ゜ーセ゛８阻害剤：ＭＢＬより入手
・抗Ｆａｓ抗体、抗Ｆａｓ−ｌｉｇａｎｄ（Ｆａｓ−Ｌ）抗体：ＭＢＬより入手
・ＮＡＣ（Ｎ−アセチルシステイン）：Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ） より入手
・ＢＳＯ（ブチオニンスルフォキシド）：Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ） より入手・カスパーゼ８および９活性キット：Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎより入手
・白血病患者サンプル：慶応義塾大学病院入院患者及び外来患者より、文書による同意のもと末梢血または骨髄血を入手
・正常者サンプル：有志より説明と同意のもと入手
・ＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）：Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ） より入手
【０１２５】
（２）実験方法
・各種造血器腫瘍細胞株に対する増殖抑制効果及びアポトーシスの誘導を調べる実験：各種造血器腫瘍細胞株（１Ｘ１０５／ｍｌ）に対し１’−アセトキシチャビコールアセテート １０μＭ（または０−２０μＭ）の添加培養を行い、トリパンブルー染色を用いて細胞数を算定する。
【０１２６】
・細胞形態を調べる実験：ＮＢ４細胞１Ｘ１０４ 個をサイトスピンにてスライドグラスに遠心し、ギムザ染色し光学顕微鏡にて（１Ｘ１０４倍）観察する。
・アネキシンＶ、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）染色の実験：１Ｘ１０５の細胞を採取し、 アネキシンＶ （Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＰＩ（最終濃度 ０．５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳで解析し、アネキシンＶ陽性細胞の割合を測定する。
【０１２７】
・カスパーゼ３活性を調べる実験：１’−アセトキシチャビコールアセテート １０μＭ添加培養各時間後、５Ｘ１０５の細胞を採取し、カスハ゜ーセ゛３活性キット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、ＦＡＣＳにて活性を測定する。
【０１２８】
・細胞周期を調べる実験：１’−アセトキシチャビコールアセテートを各濃度で添加培養２４時間後、１Ｘ１０５の細胞を採取し、ＰＩ（最終濃度 ０．５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳにて、ＭｏｄｉＦＩＴ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞周期を解析する。
【０１２９】
・発現解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 解析）（カスパーゼ３、カスパーゼ８、Ｂａｘ、チトクロームｃ、Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ及びβ−アクチン）１’−アセトキシチャビコールアセテート１０μＭ添加培養各時間後、蛋白を採取し各レーン １５μｇの蛋白を泳動し各種抗体を用いて解析する。チトクローム ｃ， Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＲＯ， Ｂａｘでは細胞質分画およびミトコンドリア分画を採取し、同様に泳動し各種抗体を用いて解析する。
【０１３０】
・ミトコンドリア膜電位の変化を調べる実験：１’−アセトキシチャビコールアセテート １０μＭ添加培養１２時間後、５Ｘ１０５の細胞を採取しローダミン１２３（最終濃度１０μＭ）を投与し、１５分間３７℃で静置する。１５００ｇで５分間遠心後上清を捨て、沈殿をＰＢＳに懸濁し、ＰＩ（最終濃度 １０μＭ）を加え、ＦＡＣＳにて解析する。
【０１３１】
・活性酸素の解析：１’−アセトキシチャビコールアセテート １０μＭ添加培養各時間後、５Ｘ１０５の細胞を採取し、ジヒドロエチジウム（最終濃度 １０ｕＭ）をマーカーとして、ＦＡＣＳにて解析する。
【０１３２】
・Ｆａｓ発現解析：１’−アセトキシチャビコールアセテート １０μＭ添加培養各時間後、５Ｘ１０５の細胞を採取し、抗Ｆａｓ／ＣＤ９５抗体（ＺＢ４ ＭＢＬ）（最終濃度 １０ｕｇ／ｍｌ）を加え、ＦＡＣＳにて解析する。
【０１３３】
・ＭＴＴ アッセイ：１’−アセトキシチャビコールアセテート を各濃度で添加培養各時間後、培養液１００μｌを９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移し、「ＭＴＴ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ （Ｒｏｃｈｅ）」の実験方法に従い、ＭＴＴ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ（１Ｘ） １０μｌを加え、３７℃４時間静置後、ＭＴＴ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ １００μｌを加え、３７℃にて静置後、ＯＤ４５０値をプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）にて解析する。
【０１３４】
２．結果
各種造血器腫瘍細胞株の増殖に対する１’−アセトキシチャビコールアセテートの効果を図４１に示す。１’−アセトキシチャビコールアセテート（以下、「ＡＣＡ」という）１０μＭの添加培養で、各種造血器腫瘍細胞株（１Ｘ１０５／ｍｌ）に対し濃度および時間依存性に増殖抑制効果を認めた。
【０１３５】
ＮＢ４細胞１Ｘ１０５／ｍｌにＡＣＡ １０μＭを添加し、ＨＳ−ｓｕｌｔａｎでは４時間・ＮＢ４では１２時間培養して、細胞の形態を観察した結果を図４２に示す。ＡＣＡ添加培養後のＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞株およびＮＢ４細胞株は、アポト−シスに典型的な核の濃縮、断片化を認めた。
【０１３６】
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いたアネキシンＶ ， ＰＩ染色による早期アポトーシスの検討結果を図４３に示す。ＡＣＡ投与後、経時的にアネキシンＶ陽性細胞の増加を認めた。以上の結果からＡＣＡはＮＢ４細胞およびＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞に、アポトーシス誘導を介して増殖を抑制することが示された。
【０１３７】
次に、種々のカスパーゼ阻害剤（Ｚ−ＶＡＤ、カスハ゜ーセ゛８、カスハ゜ーセ゛９阻害剤）を用いて検討した。結果を図４４に示す。カスハ゜ーセ゛３，８，９阻害剤投与にてＡＣＡによるアポトーシスが解除された。また、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔ解析でカスパーゼ ３および８のａｃｔｉｖｅｆｏｒｍをの出現を確認した（図４５）。以上の結果から、ＮＢ４におけるアポト−シスにカスパーゼ‐３，８，９が関与することが示された。
【０１３８】
ＮＢ４細胞１Ｘ１０４／ｍｌにＡＣＡ １、５または１０μＭ添加して２４時間培養して、細胞周期を解析した結果を図５４に示す。細胞周期の解析では、Ｇ１ ａｒｒｅｓｔ・Ｓ期の減少とともにＡＣＡ ５μＭ投与２４時間後にアポト−シスを示す、Ｓｕｂ−Ｇ１分画の増加を認めた。
【０１３９】
ＡＣＡによるアポト−シス誘導における活性酸素の産生の解析を行った。結果を図４７に示す（図４７はＨＳ−ｓｕｌｔａｎにおける結果であるがＮＢ４に関しても同様の結果が得られている。データは示さず）。ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞では、ＡＣＡ １０μＭ投与１時間後に、細胞内活性酸素濃度の増加が認められた。一般に細胞内には有害な活性酸素を除去するＳＯＤ、ク゛ルタチオン、カタラーセ゛、チオレト゛キシンなどの抗酸化物質が存在する。
本発明者らは、ク゛ルタチオン前駆体であるＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）によりＡＣＡによるアポートシスを抑制することができるか、また、ク゛ルタチオン阻害作用を有するフ゛チオニンスルフォキシト゛（ＢＳＯ）を用いて（１ｍＭ ８時間前投与）アポト−シスが増強されるかを解析することによりク゛ルタチオン（ＧＳＨ）とＡＣＡによるアポト−シスとの関連を検討した。結果を図４８に示す。ク゛ルタチオン前駆体であるＮＡＣ（１ｍＭ １時間前）を前投与し活性酸素を除去すると、ＡＣＡによるＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞のアポト−シス誘導が抑制されることがわかった。（ＮＢ４細胞においてもＮＡＣ １００μＭ １時間前投与にてアポトーシスの誘導の抑制が得られた。データは示さず）
【０１４０】
また、ＢＳＯ投与にてアポトーシスが促進されること、ＡＣＡ投与にてＧＳＨが低下することも確認した。（データは示さず）
【０１４１】
活性酸素の産生によるミトコンドリア膜電位の変化には、Ｂａｘ蛋白の重要性が多数報告されている。そこで我々は、Ｂａｘ蛋白の変化につきＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ解析を用いて解析を行った。結果を図４６に示す。総Ｂａｘ蛋白には大きな変動は認められなかった。しかし、ミトコンドリア分画、細胞質分画をそれぞれ採取し、Ｂａｘ蛋白の発現につき検討を行ったところ、時間依存性に細胞質分画での減少とミトコンドリア分画での増加を認めた。以上の結果より、ＡＣＡによるアポトーシスの誘導にＢａｘ蛋白の関与が考えられた。また、細胞質分画においてチトクローム ｃ，
Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ蛋白の発現の増加も認めた。
以上の結果より、Ｂａｘが細胞質からミトコンドリアに転送され、ミトコンドリア膜電位が変化、チトクローム ｃの遊離が生じ、アポトーシスが誘導されると考えられた。
ＡＣＡ→ＲＯＳ→Ｂａｘ→カスパーゼ ９→カスパーゼ ３→アポト−シス
【０１４２】
ミトコンドリア膜電位の変化を検討した結果を図５５に示す。ＡＣＡ １０μＭ投与９時間後よりミトコンドリア膜電位の低下を認めた。以上の結果より、ＡＣＡによるアポト−シスはＢａｘを介するミトコンドリア膜電位の低下、チトクロームｃの遊離、カスパーゼ ９、カスパーゼ ３を介することが示された。
【０１４３】
以上の結果より、ＡＣＡによる造血器腫瘍細胞のアポトーシス誘導の機序として、活性酸素の産生、Ｂａｘ蛋白のミトコンドリアへの移行、ミトコンドリア膜電位の低下、カスハ゜ーセ゛９活性化の重要性が示された。
ＡＣＡ→活性酸素産生→Ｂａｘ→ミトコント゛リア膜電位低下→チトクローム ｃ 遊離→カスパーゼ ９→カスパーゼ ３→アポトーシス
【０１４４】
カスハ゜ーセ゛８の活性化に関しては、以前よりＦａｓ（ＣＤ９５）をはじめとする死受容体（Ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の関与が報告されている。今回我々は、Ｆａｓ／Ｆａｓ−Ｌの関与につき抗Ｆａｓ 抗体（ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｎｄ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ２種類）、蛋白の発現につきＦＡＣＳを用いて検討を行った。
【０１４５】
ＮＢ４においてａｇｏｎｉｓｔｉｃ Ｆａｓ抗体（ＣＨ１１）にて、アポトーシスの誘導、ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ Ｆａｓ抗体（ＺＢ４）にて、アポトーシスの抑制を認めた（図５０）。また、ＮＢ４における、ＡＣＡ １０μＭ投与時のａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ抗体によるアポトーシスの抑制につき検討を行ったところ、ＡＣＡによるアポトーシスをほほ完全に抑制した（図５０）。また、ＦＡＣＳにてＡＣＡ投与時のＦａｓおよびＦａｓ−Ｌの発現誘導を認めた（図４９）。以上の結果より、ＡＣＡによるアポトーシスの誘導には、Ｆａｓの系が関与していることが示された。
【０１４６】
次に、本発明者らは、実際の患者サンプルでのＡＣＡの効果につき検討を行った。計２検体（急性骨髄性白血病・骨髄腫）につき、ＭＴＴ アッセイにてＡＣＡの効果につき検討を行った。図５１に示したように、２検体ともにＡＣＡの濃度依存性の細胞増殖抑制効果を認めた。また、アネキシンＶをマーカーとしてアポトーシスの誘導についての検討も行い、ＡＣＡにてアポトーシスが誘導されていることを確認した（データは示さず）。また、ＦＡＣＳを用いてＦａｓの誘導についての検討も行い、ＡＣＡ添加培養にてＦａｓが誘導されていることも確認した。以上の結果より、実際の患者検体においてもＦａｓとＡＣＡの効果の関連性が示唆された。
【０１４７】
正常のヒト末梢血より単核球を分離し、ＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）で刺激し、活性化したリンパ球（主にＴ細胞）１×１０６／ｍｌにＡＣＡ １０μＭを添加して２４時間培養した時のＭＴＴアッセイの結果を図５２に示す。ＭＴＴアッセイで細胞増殖が抑制され、また、アネキシン−Ｖを用いたアッセイでアポトーシス分画が増加していることを確認した。（データは示さず）このことは、ＡＣＡが活性化されたＴ細胞を抑制することを示している。これらのことは、ＡＣＡが免疫抑制剤として利用可能であることを示している。
【０１４８】
以上の結果から、以下の結論が導かれる。
・食用生姜の成分１’−アセトキシチャビコールアセテートは、ＮＢ４およびＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞に対し、アポト−シスと細胞周期の停止を誘導した。
・その誘導には、活性酸素の産生の経路によるカスハ゜ーセ゛９及び３の活性化および、Ｆａｓの系を介したカスハ゜ーセ゛８及び３の活性化によるアポトーシス誘導の経路が重要な働きをしていることが示唆された。
【０１４９】
以上の結果より、Ｆａｓおよび活性酸素はＮＢ４およびＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞のアポト−シス誘導の標的分子として重要な役割を果たしていることが示唆される。
【０１５０】
以上の結果から予測される、ＡＣＡの作用機序を図５３にまとめた。ＮＢ４およびＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞においてＡＣＡは活性酸素を細胞内（あるいはミトコンドリアで）産生し、ＢＡＸを細胞質からミトコンドリアに移行させることにより、ミトコンドリアの膜電位を低下させる。その後、チトクローム ｃがミトコンドリアから細胞質に放出され、カスハ゜ーセ゛９を活性化し、カスハ゜ーセ゛３が活性化しアポトーシスが誘導される。
一方で、Ｆａｓの系を介し、カスハ゜ーセ゛８を活性化させ、カスハ゜ーセ゛３を活性化し、双方の系を介し非常に早期にアポト−シスを誘導すると考えられる。
【０１５１】
〔実施例３〕
１．材料と方法
（１）材料
・カフェイン：Ｓｉｇｍａより入手
・各種造血器腫瘍細胞株：
ＮＢ４ Ｄｒ．Ｍ．Ｌａｎｏｔｔｅ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ Ｈｏｓｐｉｔａ．， Ｐａｒｉｓ， Ｆｒａｎｃｅ）より供与
・各種カスパーゼ阻害剤
Ｚ−ＶＡＤ、カスハ゜ーセ゛９阻害剤、カスハ゜ーセ゛８阻害剤：ＭＢＬより入手
【０１５２】
（２）実験方法
各種造血器腫瘍細胞株に対する増殖抑制効果及びアポトーシスの誘導を調べる実験：造血器腫瘍細胞株ＮＢ４（１Ｘ１０４／ｍｌ）に対しカフェイン４ ｍＭの添加培養を行い、トリパンブルー染色を用いて細胞数を算定する。
【０１５３】
細胞周期を調べる実験：カフェイン４ ｍＭ添加培養各時間後、１Ｘ１０６の細胞を採取し、ＰＩ（最終濃度 ０．５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳにて、ＭｏｄｉＦＩＴ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞周期を解析する。
【０１５４】
アネキシンＶ、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）染色の実験：１Ｘ１０５の細胞を採取し、アネキシンＶ （Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＰＩ（最終濃度 ０．５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳで解析し、アネキシンＶ陽性細胞の割合を測定する。
【０１５５】
カスパーゼ３活性を調べる実験：カフェイン４ ｍＭ添加培養各時間後、１Ｘ１０５の細胞を採取し、カスハ゜ーセ゛３活性キット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、ＦＡＣＳにて活性を測定する。
【０１５６】
発現解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 解析）（ｐ５３、ｐＴｙｒ−ｃｄｃ ２、ｃｄｃ ２、ｃｄｃ ２５ｃ、Ｂａｘ、ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰＩ、ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１及びＳｅｒ １５のリン酸化ｐ５３）（ｐＴｙｒ−ｃｄｃ ２、ｃｄｃ ２、ｃｄｃ ２５ｃ、ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰＩ及びｃｙｃｌｉｎ Ｂ１は、細胞周期関連蛋白である）カフェイン４ ｍＭ添加培養各時間後、蛋白を採取し各レーン １５μｇの蛋白を泳動し各種抗体を用いて解析する。
【０１５７】
ミトコンドリア膜電位の変化を調べる実験：カフェイン４ ｍＭ添加培養各時間後、１Ｘ１０５の細胞を採取しローダミン１２３（最終濃度１０μＭ）を投与し、１５分間３７℃で静置する。１５００ｇで５分間遠心後上清を捨て、沈殿をＰＢＳに懸濁し、ＰＩ（最終濃度 １０μＭ）を加え、ＦＡＣＳにて解析する。
【０１５８】
２．結果
結果を図５６〜５９に示す。
【０１５９】
カフェインは時間（０−９６ 時間）（濃度は４ ｍＭ）および濃度（０−８ ｍＭ）依存性に白血病細胞株ＮＢ４の増殖を抑制した（図５６Ａ）。さらに、その際の細胞周期を検討すると、Ｇ２／Ｍ期に細胞周期は停止した（図５６Ｂ）。
【０１６０】
カフェインは、カスパーゼ３の活性を増加させ（図５７Ａ）、アネキシンＶによる検討では、カフェインン ４ ｍＭ， ７２ 時間処理でアネキシンＶ陽性細胞が５６．９％と増加し、アポトーシスが誘導された（図５７Ｂ）。さらに、カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ（２０ μＭ）により、カフェイン（４ ｍＭ）によるアポトーシス誘導は阻害され（図５７Ｂ）、カフェインによるアポトーシス誘導は、カスパーゼ依存性であった。また、同時にミトコンドリアの膜電位が低下し、チトクロームｃが誘導されることより（図５７Ｃ）、ミトコンドリアを介するアポトーシス誘導であることが明らかになった。
【０１６１】
アポトーシスおよび細胞周期関連タンパクを検討すると、カフェイン処理にて、ｐ５３の増加、リン酸化ｃｄｃ２の増加、Ｂａｘ， ｐ２１の誘導が認められた（図５８Ａ）。
さらに、興味あることにｐ５３のセリン１５残基のリン酸化が誘導された（図５８Ｂ）。
【０１６２】
カフェインによる白血病細胞の細胞周期停止、アポトーシス誘導におけるｐ５３の意義を検討するために、ｐ５３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）を作製し、細胞内のｐ５３をノックアウトした状態にてカフェインの効果を検討した（図５９）。操作手順は実施例１の記載に従った。但しカプサイシン５０μＭの代わりにカフェイン４ｍＭを用いた。また、ＮＢ４細胞にカフェイン及びｐ５３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチチドを添加して、２４時間培養した時のｐ５３、β−アクチン、ｐＴｙｒ−ｃｄｃ ２及びｃｄｃ ２の発現も調べた。ＡＳによりｐ５３をノックアウトすると、カフェインによる白血病細胞のアポトーシス誘導はキャンセルされた（図５９Ｂ）。以上より、カフェインは白血病細胞のｐ５３を標的とし、そのセリン１５残基をリン酸化することにより、白血病細胞の細胞周期停止およびアポトーシスを誘導すると考えられた。
【０１６３】
〔実施例４〕
１．材料と方法
（１）材料
・（−）−Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−ｇａｌｌａｔｅ（以下、「ＥＧＣＧ」と記す）：和光純薬より入手
・各種造血器腫瘍細胞株：
ＮＢ４ Ｄｒ．Ｍ．Ｌａｎｏｔｔｅ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ Ｈｏｓｐｉｔａ．， Ｐａｒｉｓ， Ｆｒａｎｃｅ）より供与
ＨＬ−６０：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ； Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より入手
ＵＦ−１：我々の研究室にて確立した細胞株
Ｕ９３７：理研細胞バンクより入手
Ｋａｓｕｍｉ−１：広島大学原医研 麻生博也先生より供与
ＴＨＰ−１：理研細胞バンクより入手
・各種抗酸化剤
カタラーゼ：Ｓｉｇｍａより入手
ｓｕｐｅｒ ｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ（以下、「ＳＯＤ」と記す）：和光純薬より入手
・各種カスパーゼ阻害剤
カスハ゜ーセ゛９阻害剤、カスハ゜ーセ゛８阻害剤：ＭＢＬより入手
カスハ゜ーセ゛３阻害剤：Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ （Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）より入手
・ＤＮＡマイクロアレイ：ＴＯＹＯＢＯ Ｃｏ．Ｌｔｄより入手
【０１６４】
（２）実験方法
各種造血器腫瘍細胞株に対する増殖抑制効果及びアポトーシスの誘導を調べる実験：各種造血器腫瘍細胞株（２Ｘ１０４／ｍｌ）に対しＥＧＣＧの添加培養を行い、トリパンブルー染色を用いて細胞数を算定する。
【０１６５】
細胞周期を調べる実験：ＥＧＣＧ ２０ μＭ添加培養各時間後、２Ｘ１０４の細胞を採取し、ＰＩ（最終濃度 ０．５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳにて、ＭｏｄｉＦＩＴ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞周期を解析する。
【０１６６】
ＤＮＡラダー形成を調べる実験：各種造血器腫瘍細胞株２Ｘ１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０ μＭを添加して３時間培養後に、ＤＮＡを採取し、２％ アガロースゲルにて電気泳動しラダー形成の有無につき検討する。
【０１６７】
細胞形態を調べる実験：各種造血器腫瘍細胞株２Ｘ１０４ 個をサイトスピンにてスライドグラスに遠心し、ギムザ染色し光学顕微鏡にて（１Ｘ１０４倍）観察する。
【０１６８】
アネキシンＶ、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）染色の実験：２Ｘ１０４の細胞を採取し、アネキシンＶ （Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＰＩ（最終濃度 ０．５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳで解析し、アネキシンＶ陽性細胞の割合を測定する。
【０１６９】
カスパーゼ３活性を調べる実験：ＥＧＣＧ ２０ μＭ添加培養各時間後、２Ｘ１０４の細胞を採取し、カスハ゜ーセ゛３活性キット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、ＦＡＣＳにて活性を測定する。
【０１７０】
発現解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 解析）（ｐ５３、ｐＴｙｒ−ｃｄｃ ２、ｃｄｃ ２、ｃｄｃ ２５ｃ、Ｂａｘ、ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰＩ、ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１及びＳｅｒ １５のリン酸化ｐ５３）（ｐＴｙｒ−ｃｄｃ ２、ｃｄｃ ２、ｃｄｃ ２５ｃ、ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰＩ及びｃｙｃｌｉｎ Ｂ１は、細胞周期関連蛋白である。）ＥＧＣＧ ２０ μＭ添加培養各時間後、蛋白を採取し各レーン １５μｇの蛋白を泳動し各種抗体を用いて解析する。
【０１７１】
ミトコンドリア膜電位の変化を調べる実験：ＥＧＣＧ ２０ μＭ添加培養各時間後、２Ｘ１０４の細胞を採取しローダミン１２３（最終濃度１０μＭ）を投与し、１５分間３７℃で静置する。１５００ｇで５分間遠心後上清を捨て、沈殿をＰＢＳに懸濁し、ＰＩ（最終濃度 １０μＭ）を加え、ＦＡＣＳにて解析する。
【０１７２】
活性酸素の解析：ＥＧＣＧ ２０ μＭ添加培養各時間後、２Ｘ１０４の細胞を採取し、ジヒドロエチジウム（最終濃度 １０ μＭ）をマーカーとして、ＦＡＣＳにて解析する。
【０１７３】
２．結果
結果を図６１〜７４に示す。なお、緑茶成分カテキンには種々の誘導体が存在するが、最も活性が高いとされるＥＧＣＧを実験に用いた（図６０）。
【０１７４】
ＥＧＣＧは種々の白血病細胞株（ＮＢ４， Ｕ９３７， Ｋａｓｕｍｉ−１， ＵＦ−１， ＨＬ６０， ＴＨＰ−１）の増殖を濃度および時間依存的に抑制した（図６１）。特に、ＮＢ４細胞への効果が著しかった。
【０１７５】
ＥＧＣＧ １０， ２０ μＭ、２４時間処理にて、種々の白血病細胞株ではアネキシンＶ陽性細胞が誘導され、ＥＧＣＧによる白血病細胞のアポトーシス誘導が確認された（図６２）。さらに、ギムザ染色により形態学的に検討するとＥＧＣＧ処理により、白血病細胞は核の濃染、分断化、アポトーシス小体の出現などアポトーシスに特異的な所見が認められた（図６３）。同時に、ゲノムＤＮＡを抽出してゲル上で泳動すると、アポトーシスに典型的なラダー形成が認められた（図６４）。以上より、種々の方法により、ＥＧＣＧによる白血病細胞のアポトーシス誘導が確認された。
【０１７６】
細胞周期はＥＧＣＧ処理にてＧ１期に停止した（図６５）。
【０１７７】
ＥＧＣＧによる白血病細胞のアポトーシス誘導は抗酸化剤、カタラーゼ， ＳＯＤ （ｓｕｐｅｒ ｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）によりキャンセルされた（図６６）。また、ＥＧＣＧによるラダー形成もカタラーゼによりキャンセルされた（図６４）。したがって、ＥＧＣＧによる白血病細胞のアポトーシス誘導は活性酸素（ＲＯＳ）を介する可能性が示唆された。
【０１７８】
ＥＧＣＧによる白血病細胞のアポトーシス誘導では、カスパーゼ ３の活性が誘導された（図６７）。また、阻害剤による実験ではカスパーゼ３， カスパーゼ９に特異的な阻害剤でアポトーシス誘導は阻害されたが、カスパーゼ８特異的阻害剤では抑制されなかった（図６８）。したがって、ＥＧＣＧによる白血病細胞のアポトーシス誘導はミトコンドリアを介するものと考えられた。
【０１７９】
ＥＧＣＧ処理にて種々の白血病細胞ではＲＯＳの産生、ＭＭＰ（ミトコンドリア膜電位）の低下が認められた（図６９）。ＮＢ４細胞で詳細に検討したところ、ＥＧＣＧ ２０ μＭ処理にて時間依存的にＲＯＳ産生、ミトコンドリア膜電位の低下が認められた（図７０）。
【０１８０】
ＥＧＣＧ処理した際のアポトーシス、細胞周期関連タンパクについてＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔにて発現を検討した。ＥＧＣＧ処理にてアポトーシス誘導に関与するＢａｘが誘導されたが、抗酸化剤カタラーゼ処理にて発現は抑制された（図７１）。ｐ５３の誘導も認められたが、やはりカタラーゼで発現は抑制された（図７２）。したがって、ＥＧＣＧによる白血病細胞のアポトーシス誘導の引き金になるＲＯＳはＢａｘ， ｐ５３の誘導に直接関与するものと考えられる。ＥＧＣＧ処理によって、ミトコンドリアの膜電位が低下するが、その際にミトコンドリアから細胞質にチトクロームｃが放出されることが明らかになり、またこの放出はカタラーゼで抑制された（図７３）。
【０１８１】
ＥＧＣＧによる白血病細胞のアポトーシス誘導機構のまとめを図７４に示す。ＥＧＣＧは活性酸素（ＲＯＳ； ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）を産生し、ＲＯＳがＢａｘを誘導することで、ミトコンドリアの膜電位を低下させ、ミトコンドリアからのチトクロームｃの細胞質への放出を促進する。チトクロームｃはカスパーゼ９， カスパーゼ３を活性化し、白血病細胞のアポトーシスを誘導する。また、同時にＥＧＣＧはｐ５３の発現も誘導するが、このことによっても細胞周期停止、アポトーシス誘導シグナルが入るものと思われるが、直接的な証明はしていない。カプサイシン、カフェインではｐ５３のセリン１５残基のリン酸化が証明され、それらの誘導に関与することが明らかとなった。
【０１８２】
〔実施例５〕
１．材料と方法
（１）材料
・クルクミン：和光純薬より入手
・各種造血器腫瘍細胞株：
Ｕ２６６：理研細胞バンクより入手
ＨＳ−Ｓｕｌｔａｎ：理研細胞バンクより入手
ＲＰＭＩ１６４０：理研細胞バンクより入手
ＩＭ９：理研細胞バンクより入手
【０１８３】
（２）実験方法
各種造血器腫瘍細胞株に対する増殖抑制効果及びアポトーシスの誘導を調べる実験：各種造血器腫瘍細胞株（１Ｘ１０５／ｍｌ）に対しクルクミン ５、１０、２０μＭの添加培養を行い、トリパンブルー染色を用いて細胞数を算定する。
【０１８４】
細胞周期を調べる実験：クルクミン ５、１０、２０μＭの添加培養１２時間後、１Ｘ１０５の細胞を採取し、アネキシンＶ（最終濃度 ５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳにて、ＭｏｄｉＦＩＴ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて細胞周期を解析する。
【０１８５】
細胞形態を調べる実験：ＨＳ−Ｓｕｌｔａｎ細胞１Ｘ１０５ 個をサイトスピンにてスライドグラスに遠心し、ギムザ染色し光学顕微鏡にて（１Ｘ１０４倍）観察する。
【０１８６】
アネキシンＶ、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）染色の実験：１Ｘ１０５個の細胞を採取し、アネキシンＶ （Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＰＩ（最終濃度 ０．５μｇ／ｍｌ）をマーカーとしてＦＡＣＳで解析し、アネキシンＶ陽性細胞の割合を測定する。
【０１８７】
カスパーゼ３活性を調べる実験：クルクミン１０μＭ添加培養各時間後、１Ｘ１０５個の細胞を採取し、カスハ゜ーセ゛３活性キット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、ＦＡＣＳにて活性を測定する。
【０１８８】
カスパーゼ８活性を調べる実験：クルクミン１０μＭ添加培養各時間後、１Ｘ１０５個の細胞を採取し、カスハ゜ーセ゛８活性キット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、ＦＡＣＳにて活性を測定する。
【０１８９】
ＭＴＴアッセイ：各種造血器腫瘍細胞株（１Ｘ１０５／ｍｌ）に対しクルクミン ５、１０、２０μＭの添加培養を４８時間行い、培養液１００μｌを９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移し、「ＭＴＴ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ （Ｒｏｃｈｅ）」の実験方法に従い、ＭＴＴ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ（１Ｘ） １０μｌを加え、３７℃４時間静置後、ＭＴＴ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ １００μｌを加え、３７℃にて静置後、ＯＤ４５０値をプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）にて解析する。
【０１９０】
２．結果
結果を図７６〜８１に示す。
【０１９１】
ウコン成分クルクミンの構造式を図７５に示す。
【０１９２】
種々の濃度のクルクミンを骨髄腫細胞（ＨＳ−Ｓｕｌｔａｎ， ＲＰＭＩ１６４０， Ｕ２６６， ＩＭ９）に添加し、４８時間後に細胞増殖をＭＴＴ アッセイにて検討すると、クルクミンは濃度依存性に骨髄腫細胞の増殖を抑制した（図７６）。
【０１９３】
ＨＳ−Ｓｕｌｔａｎ細胞を用いてアネキシンＶにより検討したところクルクミンは濃度依存性にアネキシンＶ陽性細胞を誘導した（図７７）。また、ギムザ染色による形態学的観察においても、アポトーシスに特異的な所見が得られた（図７８）。
【０１９４】
クルクミンは時間依存的にカスパーゼ３， カスパーゼ８活性を誘導した（図７９，８０）。
【０１９５】
以上の結果から、以下の結論が導かれる。
・クルクミンは各種骨髄腫細胞株のアポトーシスを早期に誘導した。
・クルクミンによるＨＳ−ｓｕｌｔａｎのアポトーシス誘導はカスパーゼ−８／カスパーゼ−３経路を介していると考えられた。
・ミトコンドリア膜電位の低下、カスパーゼ−９活性化を認めず、ミトコンドリア非依存性のアポトーシス経路が考えられた。
・活性酸素濃度の上昇を認めたが、アポトーシス誘導の直接の原因ではないと考えられた。
・カスパーゼ−８の活性化を認めるが、Ｆａｓ非依存性であり、他のカスパーゼ−８活性化経路の関与が示唆された。
【０１９６】
以上のことから予測される、クルクミンによる骨髄腫細胞のアポトーシス誘導機構のまとめを図８１に示す。
【０１９７】
【発明の効果】
従来の抗癌剤を主体とした治療法に対し抵抗性の造血器腫瘍患者や、副作用の強い症例に対し、食品成分でもある唐辛子成分カプサイシン、食用生姜成分１’−アセトキシチャビコールアセテート、コーヒー成分カフェイン、緑茶成分カテキン及びウコン成分クルクミンおよびそれらの誘導体は抗腫瘍効果を有し、有効な副作用の少ない治療法となる。また、造血器腫瘍の治療成績の向上が期待できる。さらに、免疫抑制剤としても有用である。また、カプサイシン、カフェイン、カテキンおよびそれらの誘導体は、ｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬としても有用である。
【０１９８】
【配列表】
【配列表フリーテキスト】
【配列番号１】
配列番号１は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
【０２００】
【配列番号２】
配列番号２は、コントロールオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
【０２０１】
【配列番号３】
配列番号３は、ミスマッチオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】各種造血器腫瘍細胞株の増殖に対するＣＡＰの効果を示す。
【図２】ＮＢ４細胞１×１０４／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して培養した時の培養時間と細胞数を示す。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある。
【図３】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌに、それぞれ、ＣＡＰ ０μＭ、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭ、１００μＭ及び１０００μＭを添加して培養した時のＣＡＰ濃度とアネキシンＶ陽性細胞の％を示す。
【図４】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して、０時間、１２時間、２４時間、７２時間培養した時の細胞周期解析の結果を示す。
【図５】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌに、それぞれ、ＣＡＰ ０μＭ（コントロール）、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭ、１００μＭ及び１ｍＭを添加して培養した時の細胞周期解析の結果を示す。
【図６】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して、０時間、２４時間、４８時間、７２時間培養した時のラダー形成の結果を示す。
【図７】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して、２４時間培養した時の細胞の形態を観察した結果を示す（右）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある（左）。
【図８】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して、２４時間培養した時の細胞周期の解析結果を示す（右）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある（左）。
【図９】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して、２４時間培養した時のアネキシンＶとＰＩ染色による早期アポトーシスの検討結果を示す（右）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある（左）。
【図１０】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して、０時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、２４時間培養した時のカスパーゼ３の活性を示す。
【図１１】ＣＡＰによるアポトーシスに対する、カスパーゼ阻害剤の効果を示す。
【図１２】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して、０時間、２４時間、４８時間培養した時のプロカスパーゼ３と活性型カスパーゼ３の発現解析の結果を示す。
【図１３】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して、０時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間培養した時のアポトーシス関連タンパク質の発現解析の結果を示す。
【図１４】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して９時間培養した時のミトコンドリア膜電位（低膜電位の占有率）を示す（右）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある（左）。
【図１５】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して、２４時間、４８時間培養した時のチトクロームＣ及びβ−アクチンの発現解析の結果を示す。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある。
【図１６】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して、０時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間培養した時の細胞周期関連タンパク質の発現解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔ解析）の結果を示す。
【図１７】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して、０時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間培養した時のｐ５３関連タンパク質の発現解析の結果を示す。
【図１８】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＣＡＰ １００μＭを添加して、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間培養した時の、Ｓｅｒ１５がリン酸化されたｐ５３並びにｐ５３の発現解析の結果を示す。
【図１９】ＣＡＰによるアポトーシスに対する、ワートマニン（ｐ５３リン酸化酵素の阻害剤）の効果を示す（右の棒）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある（左の棒）。
【図２０】ＣＡＰによるアポトーシスに対する、ピフィスリンα（ｐ５３に対する特異的阻害剤）の効果を示す（右の棒）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある（左の棒）。
【図２１】ＣＡＰによる細胞周期の停止に対する、ピフィスリンα（ｐ５３に対する特異的阻害剤）の効果を示す（右下）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）（左上）、ＣＡＰ １００μＭのみ添加（右上）、ピフィスリンα １００ ｎＭのみ添加（左下）の結果も併せて示してある。
【図２２】ｐ５３遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果（アポトーシス、細胞周期の停止）をまとめた。
【図２３】ＣＡＰによるアポトーシスに対する、ｐ５３遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示す。
【図２４】細胞内活性酸素の産生に対する、ＣＡＰの効果を示す。
【図２５】ＣＡＰによるアポトーシスに対する、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）（グルタチオン前駆体）の効果を示す（右の棒）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある（左の棒）。
【図２６】ＣＡＰによる細胞周期の停止に対する、ＮＡＣの効果を示す（右下）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）（左上）、ＣＡＰ １００μＭのみ添加（左下）、ＮＡＣ １００ μＭのみ添加（右上）の結果も併せて示してある。
【図２７】白血病および骨髄腫患者の骨髄細胞におけるｐ５３及びβ−アクチンの発現解析の結果を示す。
【図２８】白血病患者の骨髄細胞１×１０７／ｍｌに、それぞれ、ＣＡＰ ０μＭ、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭを添加して、４８時間培養した時の、ＣＡＰ濃度とＭＴＴ アッセイにおけるＯＤ４５０値を示す。
【図２９】白血病患者の末梢血細胞１×１０７／ｍｌに、それぞれ、ＣＡＰ １０μＭ、５０μＭ及び１００μＭを添加して培養した時の培養時間とアネキシンＶ陽性細胞の％を示す。
【図３０】白血病患者の骨髄細胞１×１０７／ｍｌに、ＣＡＰ １００μＭを添加して、２４時間培養した時の、アネキシンＶ陽性の細胞数を示す（灰色の線）。コントロール（ＣＡＰの添加なし）の結果も併せて示してある（黒色の線）。
【図３１】白血病患者の骨髄細胞１×１０７／ｍｌに、それぞれ、ＣＡＰ ０μＭ（コントロール）、１０μＭ、５０μＭ及び１００μＭを添加して４８時間培養した時の細胞周期解析の結果を示す。
【図３２】白血病患者の骨髄細胞１×１０７／ｍｌに、それぞれ、ＣＡＰ ０μＭ（コントロール）、１０μＭ、５０μＭ及び１００μＭを添加して４８時間培養した時のアポトーシス（％）の結果を示す。
【図３３】ＣＭＬ ＣＰ患者の末梢血細胞１×１０７／ｍｌに、それぞれ、ＣＡＰ １０μＭ、５０μＭ及び１００μＭを添加して０時間、２４時間、４８時間、７２時間培養した時の培養時間とアネキシンＶ陽性細胞の％を示す。
【図３４】ＰＬＬ患者の末梢血細胞１×１０７／ｍｌに、それぞれ、ＣＡＰ １０μＭ、５０μＭ及び１００μＭを添加して０時間、２４時間、４８時間培養した時の培養時間と細胞生存率（％）を示す。
【図３５】正常者の末梢血細胞１×１０７／ｍｌに、それぞれ、ＣＡＰ １０μＭ、１００μＭを添加して、０時間、２４時間、４８時間培養した時の、培養時間とＭＴＴ アッセイのＯＤ４５０値を示す。
【図３６】ＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）刺激により活性化したリンパ球 １ ｘ １０６／ｍｌにＣＡＰ １００ μＭを添加し、２４時間培養した時のアネキシンＶとＰＩ染色による早期アポトーシスの検討結果を示す。コントロール（上）、ＣＡＰを添加（上から２段目）、ＰＨＡによる活性化リンパ球（上から３段目）、活性化リンパ球にＣＡＰ添加（下段）
【図３７】ＣＡＰの作用機序を説明するスキームである。
【図３８】ＣＡＰによるアポトーシスに対する、カスパーゼ阻害剤の効果を示す（ＦＡＣＳ解析による）。
【図３９】急性骨髄性白血病および急性前骨髄球性白血病患者サンプルへのカプサイシンの効果（アポトーシス誘導）を示す。
【図４０】多発性骨髄腫患者サンプルへのカプサイシンの効果を示す。
【図４１】各種造血器腫瘍細胞株１×１０５／ｍｌに、それぞれ、ＡＣＡ ０μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭを添加して培養した時のＡＣＡ濃度と細胞数を示す（左図）。各種造血器腫瘍細胞株１×１０５／ｍｌにＡＣＡ １０μＭを添加して、０時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間培養した時の培養時間と細胞数を示す（右図）。
【図４２】ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞およびＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＡＣＡ １０μＭを添加して、４時間または１２時間培養した時の細胞の形態を観察した結果を示す（左 ＮＢ４細胞／右 ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞）。コントロール（ＡＣＡの添加なし）の結果も併せて示してある（上）。
【図４３】ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞１×１０５／ｍｌにＡＣＡ １０μＭを添加して、各種時間培養した時のアネキシンＶとＰＩ染色による早期アポトーシスの検討結果を示す。
【図４４】ＡＣＡによるアポトーシスに対する、カスパーゼ阻害剤の効果を示す。
【図４５】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＡＣＡ １０μＭを添加して、０時間、３時間、６時間、１２時間培養した時のカスハ゜ーセ゛３および８タンパクの発現解析の結果を示す。
【図４６】ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞１×１０５／ｍｌにＡＣＡ １０μＭを添加して、０時間、１時間、３時間培養した時の総Ｂａｘ、ミトコンドリア分画及び細胞質分画のＢａｘ、細胞質分画のチトクローム ｃおよびＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯの発現解析の結果を示す。
【図４７】細胞内活性酸素の産生に対する、ＡＣＡの効果を示す。
【図４８】ＡＣＡによるアポトーシスに対する、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）（グルタチオン前駆体）の効果を示す（右の棒）。コントロール（ＡＣＡの添加なし）の結果も併せて示してある（左の棒）。
【図４９】ＮＢ４における、ＡＣＡによるＦａｓ発現に対する効果を示す（左図）。また、ＨＳ−ｓｕｌｔａｎにおける、ＡＣＡによるＦａｓ発現に対する効果を示す（右図）。
【図５０】ＮＢ４における、抗Ｆａｓ抗体（アゴニストおよびアンタゴニスト）のアポトーシスの誘導／抑制効果を示す。
【図５１】多発性骨髄腫患者の末梢血細胞（左図）および白血病患者の骨髄細胞（右図）１×１０７／ｍｌに、それぞれ、ＡＣＡ ０μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭを添加して、２４時間培養した時の、ＡＣＡ濃度とＭＴＴ アッセイにおけるＯＤ４５０値を示す。（左図）
【図５２】ＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）刺激により活性化したリンパ球１×１０６／ｍｌに、ＡＣＡ １０μＭを添加して、２４時間培養した時のＭＴＴ アッセイにおけるＯＤ４５０値を示す（右の棒）。コントロール（ＡＣＡの添加なし）の結果も併せて示してある（左の棒）。
【図５３】ＡＣＡの作用機序を説明するスキームである。
【図５４】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌに、それぞれ、ＡＣＡ ０μＭ（ｃｏｎｔｒｏｌ）、１μＭ、５μＭおよび１０μＭを添加して培養した時の細胞周期解析の結果を示す。
【図５５】ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにＡＣＡ １０μＭを添加して１２時間培養した時のミトコンドリア膜電位（低膜電位の占有率）を示す（右）。コントロール（ＡＣＡの添加なし）の結果も併せて示してある（左）。
【図５６】カフェインがＮＢ４細胞の増殖能（図５６のＡ）、細胞周期（図５６のＢ）に及ぼす影響を示す。図５６のＢは、ＮＢ４細胞１×１０６／ｍｌにカフェイン ４ ｍＭを添加して、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間培養した時の細胞周期解析の結果を示す。コントロール（カフェインの添加なし）の結果も併せて示してある。
【図５７】カフェインによるＮＢ４細胞のアポトーシス誘導がミトコンドリア依存性であることを示す。図５７のＡは、ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにカフェイン ４ ｍＭを添加して、７２時間培養した時のカスパーゼ３の活性を示す。図５７のＢは、ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにカフェイン ４ ｍＭを添加して、７２時間培養した時のアネキシンＶとＰＩ染色による早期アポトーシスの検討結果を示す。コントロール（カフェインの添加なし）の結果も併せて示してある。図５７のＣは、ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにカフェイン ４ ｍＭを添加して、７２時間培養した時のミトコンドリア膜電位を示す。コントロール（カフェインの添加なし）の結果も併せて示してある。また、チトクロームｃの発現解析結果を枠で囲って上部に示した。
【図５８】カフェイン処理ＮＢ４細胞におけるアポトーシス、細胞周期関連タンパクの発現解析の結果を示す。
【図５９】カフェインによるＮＢ４細胞のアポトーシス誘導におけるｐ５３の意義を示す。図５９のＡは、ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにカフェイン ４ ｍＭ及びｐ５３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド１ μＭを添加して、２４時間培養した時のｐ５３及びβ−アクチンの発現解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔ解析）の結果を示す（ＭＳ）。カフェインの添加なし（コントロール）、ｐ５３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのみ添加（ＡＳ）、カフェインのみ添加（ＣＳ）の結果も併せて示してある。図５９のＢは、ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにカフェイン ４ ｍＭ及びｐ５３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド１ μＭを添加して、２４時間培養した時のアネキシンＶとＰＩ染色による早期アポトーシスの検討結果を示す（ＡＳ＋カフェイン）。カフェインの添加なし（コントロール）、ｐ５３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのみ添加（ＡＳ）、カフェインのみ添加（カフェイン）の結果も併せて示してある。図５９のＣは、ＮＢ４細胞１×１０５／ｍｌにカフェイン ４ ｍＭ及びｐ５３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド１ μＭを添加して、２４時間培養した時のｐＴｙｒ−ｃｄｃ ２、ｃｄｃ ２及びβ−アクチンの発現解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔ解析）の結果を示す（カフェイン＋ＡＳ）。カフェインの添加なし（コントロール）、ｐ５３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのみ添加（ＡＳ）、カフェインのみ添加（カフェイン）の結果も併せて示してある。
【図６０】緑茶に含まれる多価ポリフェノールのうち主なものの構造式を示す。
【図６１】各種造血器腫瘍細胞株の増殖に対するＥＧＣＧの効果を示す。左図は、各種造血器腫瘍細胞株２×１０４／ｍｌに、それぞれ、ＥＧＣＧ ０、１０、２０及び５０μＭを添加して、２４時間培養した時のＥＧＣＧ濃度とＶｉａｂｉｌｉｔｙを示す。右図は、各種造血器腫瘍細胞株２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ １０μＭを添加して培養した時の培養日数とＶｉａｂｉｌｉｔｙを示す。
【図６２】各種造血器腫瘍細胞株２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ １０μＭ又は２０μＭを添加して、２４時間培養した時のアネキシンＶとＰＩ染色による早期アポトーシスの検討結果を示す。ＥＧＣＧの添加なし（コントロール）の結果も併せて示してある。
【図６３】各種造血器腫瘍細胞株１×１０５／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭを添加して、２４時間培養した時の細胞の形態を観察した結果を示す。ＥＧＣＧの添加なし（コントロール）の結果も併せて示してある。
【図６４】各種造血器腫瘍細胞株２×１０５／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭを添加して、３時間（Ｕ９３７細胞については１２時間）培養した時のラダー形成の結果（ＥＧＣＧ ２０μＭ ３ｈｒ）を示す。ＥＧＣＧの添加なしの結果（コントロール）も併せて示してある。さらに、各種造血器腫瘍細胞株２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭ及びカタラーゼ ５００Ｕ／ｍｌを添加して、３時間（Ｕ９３７細胞については１２時間）培養した時のラダー形成の結果（ＥＧＣＧ ２０μＭ ＋カタラーゼ）を示す。
【図６５】各種造血器腫瘍細胞株２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭを添加して、２４時間培養した時の細胞周期解析の結果を示す（右）。ＥＧＣＧの添加なし（コントロール）の結果も併せて示してある（左）。
【図６６】ＥＧＣＧが誘導するアポトーシスに対する抗酸化剤の効果を示す。各種造血器腫瘍細胞株２×１０４／ｍｌに、ＥＧＣＧ ２０μＭ及びカタラーゼ ５００ Ｕ／ｍｌ（ＥＧＣＧ ２０μＭ＋ｃａｔａｌａｓｅ ５００ Ｕ／ｍｌ）又はＳＯＤ ５００ Ｕ／ｍｌ（ＥＧＣＧ ２０μＭ＋ＳＯＤ ５００ Ｕ／ｍｌ）を添加して、２４時間培養した時のＶｉａｂｉｌｉｔｙを示す。ＥＧＣＧの添加なし（コントロール）、ＥＧＣＧのみ添加（ＥＧＣＧ ２０μＭ）の結果も併せて示してある。
【図６７】各種造血器腫瘍細胞株２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭを添加して、６時間培養した時のカスパーゼ３の活性を示す。
【図６８】ＮＢ４細胞２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭ及びカスパーゼ阻害剤カスパーゼ−３阻害剤 １０ μＭ， カスパーゼ−８阻害剤 ２０ μＭ， カスパーゼ−９阻害剤 ５０ μＭを添加して、２時間培養した時にアポトーシス誘導が見られた細胞の百分率を示す。ＥＧＣＧの添加なし（コントロール）、ＥＧＣＧのみ添加（ＥＧＣＧ ２０μＭ）の結果も併せて示してある。
【図６９】細胞内活性酸素の産生（ＲＯＳ）及びミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）に対する、ＥＧＣＧの効果を示す。左図は、各種造血器腫瘍細胞株２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭを添加して、３時間培養した時の活性酸素の産生を示す。右図は、各種造血器腫瘍細胞株２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭを添加して、３時間培養した時のミトコンドリア膜電位の低下を示す。ＥＧＣＧの添加なし（コントロール）の結果も併せて示してある（黒ベタで表示）。
【図７０】細胞内活性酸素の産生及びミトコンドリア膜電位に対する、ＥＧＣＧの効果の経時変化を示す。上図は、ＮＢ４細胞２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭを添加して、３時間、６時間及び１２時間培養した時の活性酸素の産生を示す。下図は、ＮＢ４細胞２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭを添加して、３時間、６時間及び１２時間培養した時のミトコンドリア膜電位の低下を示す。ＥＧＣＧの添加なし（コントロール）の結果も併せて示してある（黒ベタで表示）。
【図７１】上図は、ＮＢ４細胞２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭを添加して、０時間、３時間、６時間培養した時のＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂａｘ、アクチンの発現解析の結果を示す。下図は、ＵＦ−１細胞２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭを添加して、０時間、３時間、６時間培養した時のＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂａｘ、アクチンの発現解析の結果を示す。さらに、ＮＢ４細胞またはＵＦ−１細胞２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭ及びカタラーゼ ５００ Ｕ／ｍｌを添加して、１時間培養した時のＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｂａｘ、アクチンの発現解析の結果（ＥＧＣＧ ２０μＭ ＋ カタラーゼ５００ Ｕ／ｍｌ）も示す（上図及び下図）。
【図７２】ＮＢ４細胞２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭを添加して、０時間、３時間、６時間培養した時のｐ５３、ｐ２７、アクチンの発現解析の結果を示す。さらに、ＮＢ４細胞２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭ及びカタラーゼ ５００ Ｕ／ｍｌを添加して、１時間培養した時のｐ５３、ｐ２７、アクチンの発現解析の結果（ＥＧＣＧ ２０μＭ ＋カタラーゼ ５００ Ｕ／ｍｌ）も示す。
【図７３】上図は、ＮＢ４細胞２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭを添加して、０時間、３時間培養した時の細胞質（Ｃｙｔｏｃｏｌｉｃ ｃｙｔ．ｃ）及びミトコンドリア（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃｙｔ．ｃ）におけるチトクロームｃならびにアクチンの発現解析の結果を示す。下図は、ＵＦ−１細胞２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭを添加して、０時間、３時間培養した時の細胞質及びミトコンドリアにおけるチトクロームｃ ならびにアクチンの発現解析の結果を示す。さらに、ＮＢ４細胞またはＵＦ−１細胞２×１０４／ｍｌにＥＧＣＧ ２０μＭ及びカタラーゼ ５００ Ｕ／ｍｌを添加して、１時間培養した時の細胞質及びミトコンドリアにおけるチトクロームｃならびにアクチンの発現解析の結果（ＥＧＣＧ ２０μＭ ＋ カタラーゼ５００ Ｕ／ｍｌ）も示す（上図及び下図）。
【図７４】ＥＧＣＧの作用機序を説明するスキームである。
【図７５】クルクミンの構造式を示す。
【図７６】各種造血器腫瘍細胞株の増殖に対するクルクミンの効果を示す。各種造血器腫瘍細胞株１×１０５／ｍｌに、それぞれ、クルクミン ０、５、１０及び２０μＭを添加して、４８時間培養した時のＶｉａｂｉｌｉｔｙを示す。
【図７７】上図は、ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞１×１０５／ｍｌに、それぞれ、クルクミン ５、１０及び２０μＭを添加して、１２時間培養した時のアネキシン ＶとＰＩ染色による早期アポトーシスの検討結果を示す。下図は、ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞１×１０５／ｍｌに、それぞれ、クルクミン ５、１０及び２０μＭを添加して、１２時間培養した時の細胞周期解析の結果を示す。クルクミンの添加なし（コントロール）の結果も併せて示してある（上図及び下図）。
【図７８】ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞１×１０５／ｍｌにクルクミン １０μＭを添加して、２４時間培養した時の細胞の形態を観察した結果を示す（右）。クルクミンの添加なし（コントロール）の結果も併せて示してある（左）。
【図７９】ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞１×１０５／ｍｌにクルクミン１０ μＭを添加して、０、１，３、６時間培養した時のカスパーゼ３の活性を示す。
【図８０】ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ細胞１×１０５／ｍｌにクルクミン １０μＭを添加して、０、１，３、６時間培養した時のカスパーゼ８の活性を示す。
【図８１】クルクミンの作用機序を説明するスキームである。
Claims (5)
- カスパーゼを活性化することができる化合物またはその薬理上許容できる塩を含有する、造血器腫瘍の治療薬。
- カスパーゼを活性化することができる化合物が、カプサイシン、１’−アセトキシチャビコールアセテート、カフェイン、カテキン、クルクミン及びそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物である請求項１記載の治療薬。
- カスパーゼを活性化することができる化合物またはその薬理上許容できる塩を含有する、免疫抑制剤。
- カスパーゼを活性化することができる化合物が、カプサイシン、１−アセトキシチャビコールアセテート、カフェイン、カテキン、クルクミン及びそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物である請求項３記載の免疫抑制剤。
- カプサイシン、カフェイン、カテキン及びそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物またはその薬理上許容される塩を含有する、ｐ５３を標的分子とする分子標的治療薬。
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