【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、呈味性物質反応性組成物に関する。また本発明は、呈味性物質の同定方法、及び呈味性物質の検出方法に関する。さらに本発明は、上記組成物を含む、呈味性物質の同定又は検出用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｇタンパク質共役型受容体１４（ＳＥＮＲ／ＧＰＲＥ／ウロテンシン−ＩＩ受容体としても知られている。以下「ＧＰＲ１４」という）は、Ｔａｌら（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２０９， ７５２−７５９， １９９５）により最初に報告され、その後、そのリガンド（アゴニスト）がウロテンシン−ＩＩであることが報告されている（Ａｍｅｓ， ＲＳ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４０１： ２８２−２８６， １９９９）。ウロテンシン−ＩＩは血圧上昇に関与するポリペプチドであり、ＧＰＲ１４は主に心臓血管組織に存在することが知られている。そのため、ＧＰＲ１４の研究は、大部分が血管収縮作用に焦点が当てられていた。しかし、ＧＰＲ１４に関して、ウロテンシン−ＩＩ以外のリガンド（アゴニスト）は知られていない。
【０００３】
一方、呈味性物質の受容体についての研究が近年進んでおり、現在Ｔ１Ｒ、Ｔ２Ｒ、ＴＨＴＲのシリーズが味覚受容体として知られている。しかし、これらの受容体がどのような物質をリガンド（アゴニスト）としているかはほとんど不明である。従って、味覚受容体を解明し、呈味性物質としてのリガンドを探索することが望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、呈味性物質に応答するセンサー、並びに呈味性物質の同定及び検出方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＧＰＲ１４遺伝子をクローニングし、それを細胞膜上に発現させた形質転換細胞を用いて、ＧＰＲ１４の各種呈味性物質への応答性を測定したところ、ＧＰＲ１４が呈味性物質への応答性を有し、生体内でこれらの物質のセンサーとして働いていることを見出した。さらに本発明者は、ＧＰＲ１４タンパク質及びＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞を利用して、呈味性物質の同定及び検出を行うことができるという知見を得て、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体１４タンパク質、該タンパク質を発現する細胞、及び該細胞の膜画分からなる群より選択されるものを含むことを特徴とする呈味性物質反応性組成物である。ここで該組成物としては、Ｇタンパク質共役型受容体１４タンパク質を発現する細胞を含むものであることが好ましい。また該細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）であることが好ましい。
【０００７】
また呈味性物質としては、甘味成分が挙げられる。呈味性物質は、グルコース、フラクトース、スクロース、ラクトース、マルトース、ソルビトール及び食塩からなる群より選択されるものが好ましい。
【０００８】
本発明はまた、上記組成物と試験化合物とを接触させたときの結合量又は細胞刺激活性を測定することを特徴とする、呈味性物質の同定方法である。
【０００９】
さらに本発明は、上記組成物と被検サンプルとを接触させ、該組成物と被検サンプル中の呈味性物質との結合量又は細胞刺激活性を測定することを特徴とする、被検サンプル中の呈味性物質の検出方法である。
また本発明は、上記組成物を含むことを特徴とする呈味性物質の同定又は検出用キットである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る呈味性物質反応性組成物（以下、「本組成物」という）は、Ｇタンパク質共役型受容体１４（以下、「ＧＰＲ１４」という）を含むことを特徴とするものであり、このＧＰＲ１４が呈味性物質に対して応答する味覚受容体であるという知見に基づくものである。従って、本組成物は、味覚センサー又は呈味性物質反応性センサーとして機能する。また本発明者は、ＧＰＲ１４が、グルコース、フラクトース、スクロース、ラクトース、マルトース、ソルビトール、食塩などの呈味性物質に対し応答することを見出し、さらにはこの応答が濃度依存的であったことから、ＧＰＲ１４を、呈味性物質の検出及び定量に利用可能であると考えた。
【００１１】
１．ＧＰＲ１４を含む呈味性物質反応性組成物
本組成物はＧＰＲ１４を含むことを特徴とし、具体的には、本組成物はＧＰＲ１４タンパク質又はＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞若しくは細胞膜画分を含む。以下に、ＧＰＲ１４タンパク質及びＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞に関して説明する。
【００１２】
（１）ＧＰＲ１４タンパク質
ＧＰＲ１４タンパク質は、既にＧＰＲ１４遺伝子及びタンパク質の塩基配列及びアミノ酸配列が公開されているため、それらの情報を利用して、当技術分野で公知の方法により製造することができる。例えば、ＧＰＲ１４に関する配列情報は、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓにアクセッション番号Ｕ２３４８３として登録されている。本発明において利用可能なＧＰＲ１４の配列情報を、配列番号１（塩基配列）及び配列番号２（アミノ酸配列）として例示した。
【００１３】
ＧＰＲ１４タンパク質は、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質がＧＰＲ１４として機能する限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは１個若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じているものであってもよい。
【００１４】
「ＧＰＲ１４としての機能」としては、例えば、呈味性物質との結合活性、呈味性物質を介したシグナル情報伝達作用などが挙げられる。「ＧＰＲ１４として機能する」とは、例えば配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質とほぼ同等の機能を有することを指す。従って、配列番号２に示すアミノ酸配列において変異が生じたアミノ酸を含むタンパク質の活性が、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質と同等（０．５〜１．５倍程度）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、当技術分野で公知の方法に従って行なうことができ、例えば、後述する「２．呈味性物質の同定方法」の項に記載のようにして測定することができる。
【００１５】
また、本発明において使用するＧＰＲ１４タンパク質としては、ＧＰＲ１４タンパク質の部分ペプチドも包含される。そのような部分ペプチドとしては、ＧＰＲ１４タンパク質としての機能を有する部分ペプチドであればいずれのものであってもよいが、例えば、ＧＰＲ１４タンパク質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、受容体結合活性を有するものなどが用いられる。具体的には、ＧＰＲ１４タンパク質の部分ペプチドとしては、ヒドロパシープロット解析において細胞外領域（親水性部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでもよい。
ＧＰＲ１４タンパク質の部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記ＧＰＲ１４タンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
【００１６】
本組成物に含まれるＧＰＲ１４タンパク質又はその部分ペプチドは、ヒトやラットなどの細胞又は組織から当技術分野で公知のタンパク質の精製方法によって製造することができる。また、ＧＰＲ１４タンパク質をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体を培養することによっても製造することができる（下記参照）。また、当技術分野で公知の化学的ペプチド合成方法、例えば固相合成法などによって製造することもできる。
【００１７】
（２）ＧＰＲ１４タンパク質の製造
ＧＰＲ１４タンパク質を遺伝子組換え手法により製造する場合には、ＧＰＲ１４タンパク質をコードするＤＮＡ（ＧＰＲ１４遺伝子）を導入した形質転換体を培養し、この培養物から該タンパク質を回収することができる。
【００１８】
（ａ） ＧＰＲ１４遺伝子のクローニング
ＧＰＲ１４遺伝子は、上述した通り、その塩基配列情報が公開されているため、その情報を利用して作製することができる。本発明において利用可能なＧＰＲ１４遺伝子の塩基配列として、配列番号１に示す塩基配列を例示する。また、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、ＧＰＲ１４として機能するタンパク質をコードする遺伝子もＧＰＲ１４遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸、すなわち６０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。ストリンジェントな条件とは、例えばナトリウム濃度が、１０〜３００ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭであり、温度が２５〜７０℃、好ましくは４２〜５５℃における条件をいう。
【００１９】
ＧＰＲ１４遺伝子は、上述した塩基配列情報により、化学合成によって、又は塩基配列情報に基づいて設計したプライマーを用いた増幅反応によって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって得ることができる。以下に、プライマーを用いた増幅反応によりＧＰＲ１４をクローニングする手法を説明する。
【００２０】
ＧＰＲ１４遺伝子の塩基配列を基にプライマーを設計する場合には、該配列の５’末端から約２０〜３０塩基及び３’の終止コドンを含む上流側の約２０〜３０塩基を選択し、プライマーを設計することが好ましい。例えば、本発明において利用可能なプライマーの例を以下に示す：
フォーワードプライマー：ＧＡＴ ＧＧＣ ＴＣＴ ＧＡＧ ＣＣＴ ＧＧＡ ＧＴＣ ＴＡＣ ＡＡＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＣ（配列番号３）
リバースプライマー：ＴＣＡ ＧＡＧ ＡＡＧ ＧＧＣ ＣＣＣ ＧＴＴ ＡＣＧ ＧＧＡ（配列番号４）
【００２１】
上述のように設計したプライマーの合成法は、当技術分野で周知である。例えば、ホスホアミダイト法などの一般的なオリゴヌクレオチド合成法を用いることができる。
【００２２】
続いて、上記設計したプライマーを用いて、ｃＤＮＡライブラリー又はｍＲＮＡを鋳型として増幅反応を行う。増幅反応としては、限定するものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などが挙げられる。本発明において増幅反応は、ＰＣＲが好ましい。ｍＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡライブラリーの作製は常法に従って行うことができる。
【００２３】
このようにして得られたｍＲＮＡを鋳型として、ランダムプライマーと共に逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、該一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成する。次に、得られた二本鎖ｃＤＮＡを適当なクローニングベクターに組み込んで組換えベクターを作製する。そしてこの組換えベクターを用いて大腸菌等を形質転換し、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性等を指標として形質転換体を選択することにより、ｃＤＮＡのライブラリーを得ることができる。
【００２４】
あるいは、上記組織から得られたｍＲＮＡを鋳型として、ランダムプライマーと共に逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作製することもできる。Ｐｏｌｙ Ａ＋ ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は市販されており、例えばヒト脳組織としては、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ Ｐｏｌｙ Ａ＋ ＲＮＡ（カタログ番号６５１６−１）などが挙げられる。
逆転写酵素としては、例えばＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素を利用可能である。
【００２５】
上記のようにして得られる形質転換体又はｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを有する株を選択するには、上記プライマー、例えば、配列番号３及び４に示すプライマーを合成し、これを用いて増幅反応を行い、得られた断片をプローブとして、ｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法、あるいはλファージ（λｇｔ１１等）を用いた場合は、λｇｔ１１インサート増幅用のプライマーを用いて増幅反応を行う方法を採用することができる。但し、本発明においてはこれらのプライマーに限定されるものではない。
【００２６】
このようにして得られたＤＮＡ増幅断片を、３２Ｐ、３５Ｓ又はビオチン等で標識してプローブとし、これを形質転換体のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られたポジティブ株を検索することによりスクリーニングすることができる。
【００２７】
次に、得られたクローンから全長のｃＤＮＡをクローニングする。ｃＤＮＡのクローニングには、例えばＴＡクローニング法が用いられる。ＴＡクローニング法は、市販のキット、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＴＡクローニングキットを用いて行うことができる。
上記スクリーニングにおいて得られたｃＤＮＡの単離クローンについて、増幅産物をテンプレートにしてｃＤＮＡの塩基配列を決定する。
【００２８】
塩基配列の決定はマキサム−ギルバートの化学修飾法、又はＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＡＢＩ３７３シークエンサー等）を用いて配列決定が行われる。
【００２９】
（ｂ） 組換えベクター及び形質転換体の作製
宿主を形質転換するための組換えベクターは、上記ＧＰＲ１４遺伝子を適当なベクターに連結することにより得ることができ、形質転換体は、上記組換えベクターを、目的の遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。
【００３０】
ベクターとしては、形質転換用のベクターとして当技術分野で公知のベクターが使用され、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルスベクター、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などが挙げられる。
【００３１】
ベクターにＧＰＲ１４遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００３２】
ＧＰＲ１４遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、組換えベクターには、プロモーター、ＧＰＲ１４遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。さらに、大腸菌及び酵母などの２種以上の宿主微生物で自律的増殖が可能なベクターのほか、各種のシャトルベクターを使用することもできる。このようなベクターについても、前記制限酵素で切断し、その断片を得ることができる。
【００３３】
ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。そして、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングさせた後に連結させ、組換えベクターを作製する。
【００３４】
形質転換に使用する宿主としては、ＧＰＲ１４遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
【００３５】
細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、ＧＰＲ１４遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５αなどが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３６】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）などが用いられる。この場合、プロモーターは酵母中で発現できるものであれば特に限定されない。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００３７】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等が用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００３８】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００３９】
形質転換体は、導入する遺伝子内に構成されるマーカー遺伝子の性質を利用して選択される。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を用いた場合には、Ｇ４１８薬剤に抵抗性を示す細胞を選択する。
【００４０】
（ｃ） ＧＰＲ１４タンパク質の生産
本発明において、ＧＰＲ１４タンパク質は、ＧＰＲ１４遺伝子を保有する前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００４１】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。ここで、培地に添加される炭素源、窒素源、無機物などについては当技術分野で公知である。
【００４２】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、約３７℃で約５時間〜３０日間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４３】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００４４】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で約５時間〜３０日間行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４５】
培養後、目的のＧＰＲ１４タンパク質は細胞表面上に生産されるため、菌体又は細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から目的のタンパク質を単離精製することができる。
目的のタンパク質が得られたか否かは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認することができる。
【００４６】
（３）ＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞
ＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞は、上記「１．ＧＰＲ１４を含む呈味性物質反応性組成物」の項の「（ｂ） 組換えベクター及び形質転換体の作製」に記載の方法と同様にして作製することができる。すなわち、ＧＰＲ１４遺伝子を組み込んだ組換えベクターを作製し、それを用いて宿主細胞を形質転換する。
【００４７】
組換えベクターは、宿主細胞を形質転換するためのベクターであれば特に限定されるものではない。特に、哺乳動物において高発現するものが好ましく、例えばｐＥＦ−ＢＯＳベクター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ， Ｓ． ａｎｄ Ｎａｇａｔａ， Ｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９０，
１８， １７： ５３２２）が挙げられる。
【００４８】
宿主細胞は、ＧＰＲ１４遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＣＯＳ細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。本組成物においては、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞を宿主として用いることが好ましい。
【００４９】
上記組換えベクターを、宿主細胞に導入し、組換えベクターが導入された細胞を培養する。宿主として動物細胞を使用した場合には、培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で７〜１４日行う。ＣＨＯ細胞を培養する場合には、ＨａｍＦ−１２培地を用いて、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１０〜１４日間培養する。
上記のようにして、ＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞を作製することができる。
【００５０】
本組成物において、ＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞を用いる場合には、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は、当技術分野で公知の方法に従って行なうことができる。また本組成物として使用するＧＰＲ１４タンパク質は、細胞膜上に発現するＧタンパク質共役型受容体であるため、ＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞として、細胞膜画分を用いることも可能である。細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、当技術分野で公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＧＰＲ１４タンパク質と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。ＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞又はその膜画分中のＧＰＲ１４タンパク質の量は、１細胞当たり１０３〜１０７分子であるのが好ましく、１０５〜１０７分子であるのがさらに好適である。
【００５１】
（４）呈味性物質反応性組成物（センサー）としての機能
ＧＰＲ１４タンパク質は、以下の実施例２及び３において、呈味性物質に対し濃度依存的に応答することが示された。また、以下の実施例４において、ＧＰＲ１４遺伝子が舌組織で発現することを確認したため、ＧＰＲ１４は味覚受容体として機能していると考えられる。従って、本組成物、すなわちＧＰＲ１４タンパク質又はＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞は、呈味性物質のセンサーとして利用可能である。
【００５２】
本発明において「呈味性物質」とは、甘味、苦み、うま味、塩味、酸味、辛味、えぐ味などの味覚のシグナルを生ずる成分又は化合物を指す。具体的には、呈味性物質としては、限定するものではないが、グルコース、フラクトース、スクロース、ラクトース、マルトース、ソルビトール及び食塩が挙げられる。本組成物は特に、グルコース、フラクトース、スクロース、ラクトース、マルトース、ソルビトールなどの甘味成分に対し応答する。
【００５３】
２．呈味性物質の同定方法
本組成物は、呈味性物質を単離し、同定するための試薬として有用である。すなわち、本発明に係る呈味性物質の同定方法（以下、「本同定方法」という）は、本組成物と試験化合物とを接触させ、それらの結合量又はそれらによる細胞刺激活性を測定することを特徴とするものである。
【００５４】
試験化合物としては、呈味性物質であるかどうかを判定することが望まれる候補化合物や、コンビナトリアルケミストリーなどのライブラリーなどが用いられる。例えば、試験化合物としては、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられる。
【００５５】
具体的に説明すると、本同定方法は、本組成物を用いることによって、ＧＰＲ１４タンパク質に結合する試験化合物、又はＧＰＲ１４と結合して細胞刺激活性を有する試験化合物を同定する方法である。細胞刺激活性としては、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内カルシウム遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、ｐＨの低下などを促進する活性又は抑制する活性などが挙げられる。本同定方法においては、例えば、本組成物と試験化合物とを接触させた場合のＧＰＲ１４タンパク質に対する試験化合物の結合量や、試験化合物による細胞刺激活性などを測定することを特徴とする。
【００５６】
本同定方法において、ＧＰＲ１４タンパク質に対する試験化合物の結合量、又は試験化合物による細胞刺激活性は、限定するものではないが、以下の（１）〜（５）に記載するいずれかの手法により測定することができる。すなわち、
（１） 標識した試験化合物を、本組成物に接触させて、標識した試験化合物とＧＰＲ１４タンパク質との結合量を測定する。
（２） 標識した試験化合物を、本組成物に含まれるＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞又は細胞膜画分に接触させて、標識した試験化合物とこの細胞又は膜画分との結合量を測定する。
（３） 標識した試験化合物を、本組成物に含まれるＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞を培養することによって細胞膜上に発現したＧＰＲ１４タンパク質に接触させて、標識した試験化合物とＧＰＲ１４タンパク質との結合量を測定する。
（４） 試験化合物を、本組成物に含まれるＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞又は細胞膜画分に接触させて、ＧＰＲ１４タンパク質を介した細胞刺激活性を測定する。
（５） 試験化合物を、本組成物に含まれるＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞を培養することによって細胞膜上に発現したＧＰＲ１４タンパク質に接触させて、ＧＰＲ１４タンパク質を介する細胞刺激活性を測定する。
【００５７】
そして、上記（１）〜（３）の試験のいずれかにより測定した本組成物と試験化合物とを接触させた場合の結合量を、本組成物と呈味性物質ではない物質とを接触させた場合の結合量（ネガティブコントロール）、又は本組成物とウロテンシンＩＩとを接触させた場合の結合量（ポジティブコントロール）と比較する。それにより、試験化合物と接触させた場合の結合量が、呈味性物質ではない物質と接触させた場合の結合量と比較して有意に上昇した場合に、試験化合物を呈味性物質と決定する。ここで、「呈味性物質ではない物質」としては、純水などが挙げられる。
【００５８】
あるいは、上記（４）又は（５）の試験により測定した本組成物と試験化合物とを接触させた場合の細胞刺激活性を、呈味性物質ではない物質と接触させた場合若しくは試験化合物と接触させていない場合の細胞刺激活性（ネガティブコントロールコントロール）、又は、ウロテンシンＩＩと接触させた場合の細胞刺激活性（ポジティブコントロール）と比較する。それにより、試験化合物と接触させた場合の結合量が、呈味性物質ではない物質と接触させた場合若しくは試験化合物と接触させていない場合の細胞刺激活性と比較して有意に上昇した場合に、試験化合物を呈味性物質と決定する。ここで、試験化合物と接触させない場合の細胞刺激活性は、上記（４）又は（５）の試験において、試験化合物を接触させずに、ＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞又は細胞膜画分の細胞刺激活性を測定することにより、決定することができる。
【００５９】
本同定方法に関して上記の（１）〜（５）の手法を実施するためには、本組成物と、標識した試験化合物が必要である。本組成物は、上記「１．ＧＰＲ１４を含む呈味性物質反応性組成物」の項に記載のようにして作製することができる。また標識した試験化合物としては、〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などの放射性同位体、フルオレセイン、スルホローダミン、テトラメチルローダミンなどの蛍光標識、ルシフェリンなどの化学発光標識、標識用抗体で標識した化合物（例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物）などが好適である。あるいは、本組成物を、上記標識により標識してもよい。
【００６０】
呈味性物質を同定するには、本組成物に、一定量の標識で標識した試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために、過剰量の未標識の試験化合物を加えた反応チューブも用意する。反応の温度及び時間は、組成物に含まれるＧＰＲ１４タンパク質量、試験化合物量などを考慮して適宜決定する。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量のバッファーなどで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する標識量を計測する。放射性同位体で標識した場合には、放射活性を、例えば液体シンチレーションカウンター、γ−カウンターなどにより計測することができる。蛍光標識した場合には、蛍光強度を、例えば蛍光プレートリーダー、蛍光レーザースキャナーなどにより計測することができる。抗体で標識した場合には、抗体結合量を一般的なプレートリーダーを用いて計測することができる。全結合量（Ｂ）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ−ＮＳＢ）が０ｃｐｍを越える試験化合物を呈味性物質として選択することができる。
【００６１】
本同定方法に関して上記の（１）〜（５）の手法を実施するためには、ＧＰＲ１４タンパク質を介する細胞刺激活性を公知の方法又は市販の測定用キットを用いて測定することができる。ここで細胞刺激活性としては、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内カルシウム遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性又は抑制する活性などが挙げられる。
具体的には、まず、本組成物のＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。本同定方法を行なうにあたっては前もって新鮮な培地又は細胞に毒性を示さない適当なバッファーで交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出又は上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
【００６２】
以下に、細胞内カルシウム濃度を測定して、細胞刺激活性を測定する方法を記載する。細胞内カルシウム濃度の測定は、当技術分野で公知であり、例えばＦｕｒａ−２を用いた蛍光法などが挙げられる。その他、細胞内カルシウムの上昇に伴って細胞内の産生・放出が変化するプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を測定することによって間接的に細胞内カルシウム濃度を測定することができる。この産生が変化したＰＧＥ２は、細胞外に放出されるため、リガンド刺激の４時間後の培養上清を回収し、該上清中のＰＧＥ２濃度を測定する。ＰＧＥ２の測定には、例えばＣａｙｍａｎ社製のＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２ ＥＩＡ測定キットを用いることができる。
【００６３】
試験化合物と接触させた、ＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞の細胞内カルシウム濃度が、呈味性物質以外の物質と接触させた場合又は試験化合物を接触させない場合の細胞内カルシウム濃度と比較して増大している場合には、この試験化合物が呈味性物質であるといえる。
【００６４】
上述のようにして同定された呈味性物質は、ＧＰＲ１４に結合して味覚として感知されるため、本同定方法は、食品の分野で、調味料、加工食品などにおいて利用するための新規な呈味性物質を同定するのに有用である。
【００６５】
３．呈味性物質の検出方法
ＧＰＲ１４は呈味性物質に対し濃度依存的に応答するため、本組成物は、呈味性物質を検出するために使用することができる。本発明において「検出」とは、被検サンプル中に含まれる呈味性物質の有無を判定することを指し、また、被検サンプル中に含まれる呈味性物質量を測定する定量的な検出をも指す。
【００６６】
本発明に係る、被検サンプル中の呈味性物質の検出方法（以下、「本検出方法」という）は、本組成物と被検サンプルとを接触させ、本組成物と被検サンプル中の呈味性物質との結合量又は呈味性物質による細胞刺激活性を測定することを特徴とするものである。
【００６７】
被検サンプルとしては、含まれる呈味性物質を検出又は定量することが望まれるサンプル、呈味性物質の有無を判定することが望まれるサンプルなどが用いられる。例えば、被検サンプルとしては、液体状、固形状及び気体状の化合物、例えば食品などが挙げられる。
【００６８】
具体的に説明すると、本検出方法は、本組成物と被検サンプルとを接触させた場合の、被検サンプル中に含まれる呈味性物質のＧＰＲ１４タンパク質との結合量、又は呈味性物質による細胞刺激活性を測定し、被検サンプル中の呈味性物質を検出するものである。
【００６９】
ＧＰＲ１４タンパク質と呈味性物質との結合量、及び呈味性物質による細胞刺激活性は、上記「２．呈味性物質の同定方法」に記載のようにして測定することができる。従って、上記（１）〜（５）に記載したいずれかの手法において、「試験化合物」を「呈味性物質」に置き換えて行う。本検出方法は、本組成物を標識して実施することが好ましい。
【００７０】
本検出方法においては、特に、上記（１）〜（５）の試験を行ない、被検サンプル中に呈味性物質が存在すること、すなわち被検サンプル中の呈味性物質がＧＰＲ１４タンパク質に結合することを確認（定性的確認）した後に、改めて、（１）〜（５）の試験方法によりその結合活性又は細胞刺激活性の定量的確認を行なうことが好ましい。この定量的確認を行うことによって、被検サンプル中に含まれる呈味性物質量を測定することが可能となる。定量的な検出を行う場合には、既知濃度の呈味性物質を用いて、予め検量線を作成しておくことが好ましい。
【００７１】
本検出方法により、被検サンプル中の呈味性物質の存在の検出及び呈味性物質量の測定が可能になる。従って、従来では数値化が困難であった味覚の数値化・定量化に有用である。
【００７２】
４．呈味性物質の同定又は検出用キット
本組成物は、呈味性物質を同定又は検出するためのキットとして提供することができる。本発明に係る呈味性物質の同定又は検出用キット（以下、「本キット」という）は、本組成物の他、本同定方法又は検出方法を行うために有用な成分を含むものである。そのような成分としては、例えば、本組成物を懸濁するためのバッファー、標識、非特異的結合を低減させるための界面活性剤又は各種タンパク質、プロテアーゼによるＧＰＲ１４タンパク質又は呈味性物質の分解を抑制するためのプロテアーゼ阻害剤、細胞刺激活性を測定するための成分などが挙げられる。バッファーは、ＧＰＲ１４タンパク質と呈味性物質との結合を阻害しないものであればいずれでもよい。例えば、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどが挙げられる。
【００７３】
また、界面活性剤としては、例えばＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０ＴＭ、ジギトニン、デオキシコレートなどが挙げられ、各種タンパク質としては、例えばウシ血清アルブミン、ゼラチンなどが挙げられる。さらに、プロテアーゼ阻害剤としては、例えばＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４、ペプスタチンなどが挙げられる。
本キットを利用することにより、本同定方法又は検出方法を簡便に行うことができる。
【００７４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は下記実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００７５】
〔実施例１〕ＧＰＲ１４のクローニングとＣＨＯ細胞への導入
ラットＧＰＲ１４は、膀胱より得た。すなわち、埼玉実験動物供給所より得たＷｉｓｔａｒ系雄性ラット（体重２００ｇ前後）６匹を断頭、脱血したのち膀胱を採取し、滅菌した生理食塩水で洗った。その後、採取した膀胱を氷冷したＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社のＴＲＩｚｏｌ １０ｍｌ中に加え、ポリトロン社のポリトロンホモジナイザーを最高速度で１〜２分間使用して、膀胱組織をホモジナイズした。これからＴＲＩｚｏｌに添付されたマニュアルに従って、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを２３０μｇ得た。この２３０μｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡ全量に対して、タカラのＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０を用いてＰｏｌｙ （Ａ）＋ ＲＮＡを精製した。その結果１１μｇのラット膀胱Ｐｏｌｙ （Ａ）＋ ＲＮＡを得た。このうち１μｇをＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社の逆転写酵素Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩを用いてｃＤＮＡ溶液２０μｌを得た。ここから１μｌを使用して、プライマー（配列番号３及び４）を用いてタカラのＥＸ Ｔａｑを使用して、次のＰＣＲ条件でシングルバンドのＰＣＲ産物を得た。すなわち、ＰＣＲ条件は、９４℃にて３分の後、９４℃１分、５５℃１分及び７２℃１．５分からなるサイクルを３５サイクル行い、その後７２℃にて７分とした。
【００７６】
このようにして得られたＰＣＲ産物は、ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社の低融点アガロースＳｅａＰｌａｑｕｅ ＧＴＧアガロース（１％）を用いて電気泳動を行い、１１６１ｂｐのＧＰＲ１４のバンドの部分のみを剃刀で切り出した。切り出したアガロース小片は、ＴＡＥが入ったＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社の透析バックを用いて電気透析を行い、アガロースとＰＣＲ産物を分離した。ＴＡＥに溶けたＰＣＲ産物はエタノール沈殿法によって回収し、１５μｌのＴＥに溶かした。このうち１μｌをエチジウムブロマイドを含んだアガロースゲルで泳動し、ＰＣＲ産物のバンドがＵＶ照射のもとで肉眼で観察できるかを確認した。バンドが泳動ゲル上で確認できたため、１５μｌ中の２μｌをインビトロゲン社のＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔに使用してクローニングを行った。Ｘ−ｇａｌを使用したブルー／ホワイトセレクションによってインサートが存在すると思われるクローンを、アンピシリン含有Ｌ／Ｂプレートより採取した。ＧＰＲ１４クローンは次のプライマーを用いてＰＣＲを施行した（５’−ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＴＣ ＡＴＧ ＧＣＴ ＣＴＧ ＡＧＣ ＣＴＧ ＧＡＧ−３’（配列番号５）、下線部はＢａｍ ＨＩサイトを表す；５’−ＡＣＧ ＣＧＴ ＣＧＡ ＣＴＣ ＡＧＡ ＧＡＡ ＧＧＧ ＣＣＣ ＧＴＴ ＡＣ−３’（配列番号６）下線部はＳａｌ Ｉサイトを表す）。これをｐＥＦ−ＢＯＳのＢａｍ ＨＩ ／ Ｓａｌ Ｉサイトに導入した。ｐＥＦ−ＢＯＳは、Ｎａｇａｔａ， Ｓ． ａｎｄ Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ， Ｓ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８：５３２２ （１９９０）に記載のものである。
【００７７】
このＧＰＲ１４−ｐＥＦ−ＢＯＳベクター５μｌと２μｌのｐＥＦ−ｎｅｏ（Ｎａｇａｔａら）を、プロメガ社のＴｒａｎｓＦａｓｔ ｋｉｔを用いてＣＨＯ細胞に導入した。これらの遺伝子を導入されたＣＨＯ細胞は、シグマ社のＨａｍ’ｓ Ｆ−１２培養液（ＪＨＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社の熱不活化ウシ胎児血清を１０％含む）にＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社の抗生物質（ペニシリン５０Ｕ／ｍｌ／ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ）と４００μｇ／ｍｌのナカライテスク社のＧ４１８を加えて５％の炭酸ガスのもと３７℃で２週間培養し、ネオマシン耐性の細胞を得た。この細胞はＣＨＯ−Ｓ株と名付け、セルバンカー（ダイアヤトロン社製）に懸濁後、−８０℃で保存した。
【００７８】
〔実施例２〕ＧＰＲ１４の呈味性物質に対する応答
実施例１で取得した細胞（以降ＣＨＯ−Ｓ株と呼ぶ）を、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２ ＨＡＭ（ＳＩＧＭＡ社製）に１０％ウシ血清、並びに５０μｇ／ｍｌペニシリン及びストレプトマイシンを添加した培地（以降Ｆ−１２培地と呼ぶ）中で２４穴培養フラスコを用いて３７℃、炭酸ガス濃度５．０％で４日間培養した。培養後、×１０リン酸緩衝液（以降ＰＢＳと呼ぶ）で３回洗浄した。これをＣＨＯ−Ｓ株試験細胞とした。
【００７９】
このＣＨＯ−Ｓ株試験細胞に、Ｆ−１２培地に以下の２５種の呈味性物質を溶解した溶液及びＦ−１２培地を０．２ｍｌずつ添加し、３７℃、炭酸ガス濃度５．０％で４時間恒温処理した。呈味性物質としては、１５０ｍＭグルコース、７０ｍＭフラクトース、４５ｍＭスクロース、６０ｍＭラクトース、４５ｍＭマルトース、１７０ｍＭソルビトール、７５ｍＭグリシン、３５ｍＭアラニン、０．２５ｍＭアスパルテーム、０．０１ｍＭリゾチーム、０．０５ｍＭステビオサイド、０．３７ｍＭアセスルファム Ｋ、０．０１ｍＭ塩酸キニーネ、８．０ｍＭカフェイン、４５ｍＭフェニルアラニン、２２ｍＭトリプトファン、２．９ｍＭアルギニン、８．０ｍＭグルタミン酸ナトリウム、０．４５ｍＭグアノシン ５’−モノフォスフェート２ナトリウム塩、１．５ｍＭイノシン ５’−モノフォスフェート２ナトリウム塩、０．６５ｍＭクエン酸、４５ｍＭ食塩、ウロテンシン−ＩＩ １０−９Ｍを使用した。
【００８０】
処理後培地を回収し、遠心分離によってＣＨＯ−Ｓ株試験細胞を除去した（ＰＧＥ試験液）。ＰＧＥ試験液は、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２ ＥＩＡ Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ製）を用いてＰＧＥ２量を測定した。 ＣＨＯ−Ｓ株は、ウロテンシン ＩＩの他に、グルコース、フラクトース、スクロース、ラクトース、マルトース、ソルビトール及び食塩の添加により、培養液中のＰＧＥ２濃度が上昇した（図１）。図１において、１〜２４は、１：グルコース、２：フラクトース、３：スクロース、４：ラクトース、５：マルトース、６：ソルビトール、７：アラニン、８：グリシン、９：アスパルテーム、１０：リゾチーム、１１：ステビオサイド、１２：アセスルファム Ｋ、１３：塩酸キニーネ、１４：カフェイン、１５：フェニルアラニン、１６：トリプトファン、１７：アルギニン、１８：グルタミン酸ナトリウム、１９：グアノシン ５’−モノフォスフェート２ナトリウム塩、２０：イノシン ５’−モノフォスフェート２ナトリウム塩、２１：クエン酸、２２：食塩、２３：ウロテンシン−ＩＩ １０−９Ｍ、２４：ｍｉｌｉ−Ｑ、を表す。以上の実験から、ＧＰＲ１４はこれらの呈味性物質に応答することが明らかである。これに対し、その他の呈味性物質を添加した場合には、培養液中のＰＧＥ量は上昇せず、応答は起こらなかった。
また同時に実施例１と同様の方法で得られたフラクタルカイン受容体を発現するＣＸ３ＲＣＲ発現株を用いて、同じ測定を行った。
【００８１】
ラットフラクタルカイン受容体（ＣＸ３ＣＲ；アクセッション番号ＮＭ＃１３３５３４）を発現するＣＨＯ細胞は以下のように調製した。ラット脳ｃＤＮＡライブラリーをＥｃｏＲＩ Ｌｉｎｋｅｒを用いてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のλＺＡＰ ＩＩのＥｃｏＲＩサイトに組み込み、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＧｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄでｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングを行った。ラットフラクタルカイン受容体の５’側の３４個の塩基配列をもとにしてプローブを作製し、プラークハイブリダイゼーションを施行した。得られたポジティブプラークに対して、ヘルパーファージを用いたｉｎ ｖｉｖｏ Ｅｘｃｉｓｉｏｎによって、フラクタルカイン受容体を含んだベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＣＸ３ＣＲ１を得た。このｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＣＸ３ＣＲ１に対して、２つの制限酵素Ｓａｌ Ｉ及びＳｐｅ Ｉ処理を行い、ＣＸ３ＣＲ１フラグメントを得た。このフラグメントは同様の制限酵素で処理したｐＥＦ−ＢＯＳベクターに組み込んだ。
【００８２】
シーケンスによって確認されたフラクタルカイン受容体を含むｐＥＦ−ＢＯＳベクター３μｇ、ヒトＧα１６（ヒトＧα１６：塩基配列を配列番号７に示す）を組み込んだｐＥＦ−ＢＯＳを３μｇ、及び１μｇのｐＥＦ−ＢＯＳにネオマイシン耐性遺伝子を組み込んだｐＥＦ−ｎｅｏ（Ｎａｇａｔａらより得た）を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣより入手）にプロメガ社のＴｒａｎｓＦａｓｔ ｋｉｔを用いて導入した。これらの遺伝子を導入したＣＨＯ細胞は、シグマ社のＨａｍ’ｓ Ｆ−１２培養液（ＪＨＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社の熱不活化ウシ胎児血清を１０％含む）にＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社の抗生物質（ペニシリン５０Ｕ／ｍｌ／ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ）と４００μｇ／ｍｌのナカライテスク社のＧ４１８を加えて５％の炭酸ガスのもと３７℃で２週間培養し、ネオマシン耐性の細胞を得た。
【００８３】
Ｇ４１８存在下で増殖した細胞をクローニングシリンダーを用いて細胞を単離した。単離した細胞よりＧＩＢＣＯ ＢＲＬ 社のＴＲＩｚｏｌを用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡ を抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを施行した。その結果、図２に示すようにＣＸ３ＣＲとＧα１６とを共発現（ＣＸ３ＣＲ＋Ｇ１６）させた場合には、ＣＸ３ＣＲとＧα１６についてＰＣＲの明瞭なバンドが確認された（図２の右端のレーン）。
【００８４】
さらにＣＸ３ＣＲ、フラクタルカイン受容体及びＧα１６を共発現させた細胞に対して同仁社のＦｕｒａ−２をロードし、アゴニストであるフラクタルカインを作用させた時の細胞内カルシウム濃度変化について検討した。結果を図３に示す。細胞内で上昇したｃＡＭＰ濃度を低下する働きのあるＧタンパク質Ｇｉに共役するフラクタルカイン受容体ＣＸ３ＣＲは、細胞内で一緒に発現したＧα１６と共役して、図３の１番上のＣＸ３ＣＲ−Ｇ１６及び上から２番目のＣＸ３ＣＲ＋Ｇ１６のように、矢印で示した１０−７Ｍのフラクタルカインを作用させた場合に細胞内カルシウム濃度の上昇が認められた。従って、フラクタルカイン受容体は、ＣＨＯ細胞内でＧタンパク質と共役して機能することが明らかになった。
【００８５】
しかしながらこの受容体はＧＰＲ１４のアゴニストであるウロテンシンＩＩには刺激されないため、今回の実験においてはネガティブコントロールとして使用した。
ＣＨＯ−Ｓ株と同様に、呈味性物質を添加した場合のＰＧＥ量を測定した（図１）。ＣＸ３ＲＣＲ発現株においては、全ての呈味性物質の場合にＰＧＥ２量の上昇が起こらず、これらの物質に対し応答していないことが明らかであった（図１）。
【００８６】
〔実施例３〕ＧＰＲ１４の呈味性物質に対する濃度依存的応答
実施例１で調製したＣＨＯ−Ｓ株を、Ｆ−１２培地で２４穴培養フラスコを用いて３７℃、炭酸ガス濃度５．０％で４日間培養した。培養後、×１０ ＰＢＳで３回洗浄した。これをＣＨＯ−Ｓ株試験細胞とした。ＣＨＯ−Ｓ株試験細胞に、Ｆ−１２培地に以下に記載する種々の濃度の呈味性物質を溶解した溶液及びＦ−１２培地を０．２ｍｌずつ添加し、３７℃、炭酸ガス濃度５．０％で４時間恒温処理した。試験に使用した呈味性物質は、３００、１５０、７５、３７．５、１８．８ｍＭグルコース；１４０、７０、３５、１７．５ｍＭフラクトース；９０、４５、２２．５、１１．３ｍＭスクロース；並びに９０、４５、２２．５、１１．３ｍＭ食塩である。処理後培地を回収し、遠心分離によってＣＨＯ−Ｓ株試験細胞を除去した（ＰＧＥ試験液）。ＰＧＥ試験液を、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２ ＥＩＡ Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ製）を用いて、ＰＧＥ２量を測定した。
【００８７】
グルコース、フラクトース、スクロース及び食塩を添加したＣＨＯ−Ｓ株においては、ＰＧＥ２濃度が呈味性物質の濃度に依存して増加した（図４）。すなわち、ＧＰＲ１４はこれらの呈味性物質に濃度依存的に応答することは明らかであった。
【００８８】
〔実施例４〕ＧＰＲ１４の舌組織における発現確認
ＧＰＲ１４の舌組織での発現をｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより検討した。
プローブは、ラットＧＰＲ１４の塩基配列８８−１４７ｂｐの一部の配列を相補的にした配列（ｒＧＰＲ１４／ＡＳ：５’− ＣＣＡ ＣＡＡ ＧＧＴ ＣＴＴ ＴＣＡ ＧＧＧ ＡＧＣ ＴＧＧ ＧＡＴ ＣＴＧ ＴＴＧ ＧＧＣ ＣＧＧ ＡＣＣ ＡＧＧ ＡＡＣ ＴＧＴ ＴＧＡ ＧＧＧ ＡＣＡ Ｃ −３’；配列番号８）を使用した。一方、ネガティブコントロールとして、８８−１４７ｂｐの一部の塩基配列（ｒＧＰＲ１４／Ｓ：５’− ＧＴＧ ＴＣＣ ＣＴＣ ＡＡＣ ＡＧＴ ＴＣＣ ＴＧＧ ＴＣＣ ＧＧＣ ＣＣＡ ＡＣＡ ＧＡＴ ＣＣＣ ＡＧＣ ＴＣＣ ＣＴＧ ＡＡＡ ＧＡＣ ＣＴＴ ＧＴＧ Ｇ −３’；配列番号９）をプローブとして使用した。なお、この配列は、ヒト、マウス及びラットに共通な塩基配列である。この２つのプローブの３’側にビオチンをラベルし、ＨＰＬＣによって精製した。
【００８９】
マウス舌組織は採取後すぐに冷ＰＢＳで洗った後、ＯＴＣコンパウンドに包埋し、−２０℃で保存した。この組織はクライオスタットで５μｍに薄切し、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ及び過酸化水素水を作用させた後、ＤＡＫＯ社超高感度核酸プローブ検出キットを用いて、ＧＰＲ１４を薄い褐色から濃い褐色として組織中で検出した。組織の対比染色にはメチルグリーンを用いた。
【００９０】
図５Ａに示すように、マウスの舌組織ではＧＰＲ１４が薄い褐色として、舌の表層部分に染まることが観察された（図中、矢印）。ネガティブコントロールを示す図５Ｂでは、褐色に染まる部分はない。従って、褐色に染まる染色部位は非特異的な反応ではなく、特異的な反応であることがわかる。この試験より、ＧＰＲ１４は舌組織において発現していることがわかった。
【００９１】
【発明の効果】
本発明によれば、呈味性物質反応性組成物が提供される。本組成物は、呈味性物質の同定及び検出に有用である。従って、本組成物を利用することにより、新規な呈味性物質を同定することが可能となる。
【００９２】
【配列表】
【００９３】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３〜９：合成ＤＮＡ
【図面の簡単な説明】
【図１】ＧＰＲ１４の呈味性物質に対する応答を示す図である。
【図２】ＣＨＯ細胞におけるＣＸ３ＣＲとＧ１６αの発現を示す図である。
【図３】ＣＸ３ＣＲ３アゴニストであるフルクタルカインを作用させた場合の、ＣＸ３ＣＲ発現ＣＨＯ細胞、ＣＸ３ＣＲ及びＧ１６α発現ＣＨＯ細胞、並びにＣＸ２ＣＲ−Ｇ１６α発現ＣＨＯ細胞におけるカルシウム濃度の変化を示すグラフである。
【図４】ＧＰＲ１４の呈味性物質に対する濃度依存的な応答を示す図である。
【図５】マウスの舌組織において発現するＧＰＲ１４を示す図である。ＡはプローブとしてｒＧＰＲ１４／ＡＳを使用した場合を示し、ＢはプローブとしてｒＧＰＲ１４／Ｓを使用したネガティブコントロールを示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a taste-tasting substance-reactive composition. Further, the present invention relates to a method for identifying a taste substance and a method for detecting a taste substance. Furthermore, the present invention relates to a kit for identifying or detecting a tasty substance, comprising the above composition.
[0002]
[Prior art]
G protein-coupled receptor 14 (also known as SENR / GPRE / urotensin-II receptor; hereinafter referred to as “GPR14”) has been described by Tal et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 209, 752-759, 1995). ), And subsequently reported that its ligand (agonist) was urotensin-II (Ames, RS, et al., Nature, 401: 282-286, 1999). Urotensin-II is a polypeptide involved in increasing blood pressure, and GPR14 is known to be present mainly in cardiovascular tissues. As such, studies of GPR14 have largely focused on vasoconstrictor effects. However, no ligand (agonist) other than urotensin-II is known for GPR14.
[0003]
On the other hand, research on taste receptor substances has been advanced in recent years, and a series of T1R, T2R, and THTR is currently known as a taste receptor. However, it is almost unknown what substances these receptors use as ligands (agonists). Therefore, it has been desired to elucidate taste receptors and to search for ligands as taste substances.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a sensor that responds to a taste substance, and a method for identifying and detecting a taste substance.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, cloned GPR14 gene and expressed the responsiveness of GPR14 to various taste substances using a transformed cell in which it was expressed on the cell membrane. As a result of the measurement, it was found that GPR14 has responsiveness to taste substances and functions as a sensor for these substances in vivo. Furthermore, the present inventor has found that a taste substance can be identified and detected using a GPR14 protein and a cell that expresses the GPR14 protein, thereby completing the present invention.
[0006]
That is, the present invention provides a taste-reactive substance-reactive composition comprising a protein selected from the group consisting of a G protein-coupled receptor 14 protein, a cell expressing the protein, and a membrane fraction of the cell. Things. Here, the composition preferably contains cells expressing the G protein-coupled receptor 14 protein. The cells are preferably Chinese hamster ovary cells (CHO cells).
[0007]
In addition, examples of the tasty substance include a sweet component. The taste substance is preferably selected from the group consisting of glucose, fructose, sucrose, lactose, maltose, sorbitol and salt.
[0008]
The present invention is also a method for identifying a taste-imparting substance, which comprises measuring a binding amount or a cell stimulating activity when the above-mentioned composition is brought into contact with a test compound.
[0009]
Further, the present invention provides a test sample, comprising contacting the above composition with a test sample, and measuring the amount of binding of the composition to a taste substance in the test sample or cell stimulating activity. This is a method for detecting taste substances in the food.
Further, the present invention is a kit for identifying or detecting a taste substance, comprising the above composition.
[0010]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The taste substance-reactive composition according to the present invention (hereinafter, referred to as “the present composition”) is characterized by containing a G protein-coupled receptor 14 (hereinafter, referred to as “GPR14”), This is based on the finding that GPR14 is a taste receptor that responds to taste substances. Therefore, the present composition functions as a taste sensor or a taste substance responsive sensor. Further, the present inventors have found that GPR14 responds to taste substances such as glucose, fructose, sucrose, lactose, maltose, sorbitol, and salt, and furthermore, since this response was concentration-dependent, It was considered that GPR14 could be used for detection and quantification of a tasty substance.
[0011]
1. Taste substance reactive composition containing GPR14
The composition is characterized by comprising GPR14, and specifically, the composition comprises GPR14 protein or a cell or cell membrane fraction that expresses GPR14 protein. Hereinafter, the GPR14 protein and cells expressing the GPR14 protein will be described.
[0012]
(1) GPR14 protein
Since the base sequence and amino acid sequence of the GPR14 gene and protein have already been published, the GPR14 protein can be produced by a method known in the art using such information. For example, sequence information on GPR14 is registered in EMBL / GenBank Data Libraries as an accession number U23483. GPR14 sequence information that can be used in the present invention is exemplified as SEQ ID NO: 1 (base sequence) and SEQ ID NO: 2 (amino acid sequence).
[0013]
The GPR14 protein may have mutations such as deletions, substitutions, and additions in a plurality, preferably one or several amino acids in the amino acid sequence, as long as the protein including the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 functions as GPR14. May be available.
[0014]
Examples of the “function as GPR14” include a binding activity with a taste substance, a signal information transmission action via the taste substance, and the like. “Functioning as GPR14” refers to having almost the same function as a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, for example. Therefore, it is preferable that the activity of the protein containing the amino acid having a mutation in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is equivalent to that of the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (about 0.5 to 1.5 times). However, quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different. Measurement of activities such as ligand binding activity and signal signal transduction can be carried out according to methods known in the art, for example, as described in the section “2. Can be measured.
[0015]
The GPR14 protein used in the present invention also includes a partial peptide of the GPR14 protein. As such a partial peptide, any partial peptide having a function as a GPR14 protein may be used. For example, in a GPR14 protein molecule, a site exposed outside the cell membrane may be used. And those having receptor binding activity are used. Specifically, the partial peptide of the GPR14 protein is a peptide containing a portion analyzed as an extracellular region (hydrophilic site) in hydropathy plot analysis. Further, a peptide partially containing a hydrophobic site can also be used. A peptide containing individual domains may be used, but a peptide containing a plurality of domains at the same time may be used.
The number of amino acids in the partial peptide of the GPR14 protein is preferably a peptide having an amino acid sequence of at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more of the constituent amino acid sequences of the GPR14 protein.
[0016]
The GPR14 protein or its partial peptide contained in the present composition can be produced from cells or tissues such as humans and rats by a protein purification method known in the art. It can also be produced by culturing a transformant transformed with DNA encoding the GPR14 protein (see below). Further, it can also be produced by a chemical peptide synthesis method known in the art, for example, a solid phase synthesis method.
[0017]
(2) Production of GPR14 protein
When the GPR14 protein is produced by a genetic recombination technique, a transformant into which a DNA encoding the GPR14 protein (GPR14 gene) has been introduced can be cultured, and the protein can be recovered from the culture.
[0018]
(A) Cloning of GPR14 gene
As described above, since the nucleotide sequence information of the GPR14 gene is disclosed, it can be prepared using the information. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is exemplified as the nucleotide sequence of the GPR14 gene that can be used in the present invention. Also, a DNA that can hybridize under stringent conditions to a sequence complementary to all or part of the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and encodes a protein that functions as GPR14. The gene is also included in the GPR14 gene. Stringent conditions refer to conditions under which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. For example, a condition may be mentioned in which complementary strands of nucleic acids having high homology, that is, DNAs having homology of 60% or more, preferably 80% or more hybridize, and complementary strands of nucleic acids having lower homology do not hybridize. . The stringent condition refers to, for example, a condition in which the sodium concentration is 10 to 300 mM, preferably 20 to 100 mM, and the temperature is 25 to 70 ° C, preferably 42 to 55 ° C.
[0019]
The GPR14 gene is obtained by the above-mentioned nucleotide sequence information, by chemical synthesis, by an amplification reaction using a primer designed based on the nucleotide sequence information, or by hybridizing with a DNA fragment having the nucleotide sequence as a probe. Can be. Hereinafter, a method of cloning GPR14 by an amplification reaction using primers will be described.
[0020]
When a primer is designed based on the base sequence of the GPR14 gene, about 20 to 30 bases from the 5 ′ end of the sequence and about 20 to 30 bases upstream including a 3 ′ stop codon are selected, and the primer is used. It is preferable to design. For example, the following are examples of primers that can be used in the present invention:
Forward primer: GAT GGC TCT GAG CCT GGA GTC TAC AAC AAG CTT TC (SEQ ID NO: 3)
Reverse primer: TCA GAG AAG GGC CCC GTT ACG GGA (SEQ ID NO: 4)
[0021]
Methods for synthesizing primers designed as described above are well known in the art. For example, a general oligonucleotide synthesis method such as a phosphoramidite method can be used.
[0022]
Subsequently, an amplification reaction is performed using the designed primers and a cDNA library or mRNA as a template. Examples of the amplification reaction include, but are not limited to, a polymerase chain reaction (PCR) and a LAMP method (Loop-mediated Isothermal Amplification). In the present invention, the amplification reaction is preferably PCR. Extraction of mRNA and preparation of a cDNA library can be performed according to a conventional method.
[0023]
Using the thus obtained mRNA as a template, a single-stranded cDNA is synthesized using a reverse transcriptase together with a random primer, and then a double-stranded cDNA is synthesized from the single-stranded cDNA. Next, the obtained double-stranded cDNA is inserted into an appropriate cloning vector to prepare a recombinant vector. Then, Escherichia coli or the like is transformed with the recombinant vector, and a transformant is selected using tetracycline resistance, ampicillin resistance and the like as an index, whereby a cDNA library can be obtained.
[0024]
Alternatively, cDNA can be prepared using reverse transcriptase together with random primers, using mRNA obtained from the above tissue as a template. Poly A + RNA (mRNA) is commercially available. Examples of human brain tissue include Human Brain Poly A + RNA (Catalog No. 6516-1) manufactured by Clontech.
As the reverse transcriptase, for example, Superscript II reverse transcriptase manufactured by GIBCO BRL can be used.
[0025]
In order to select a transformant or a strain having the target DNA from the cDNA library obtained as described above, the above primers, for example, the primers shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 are synthesized, and an amplification reaction is performed using the primers. And a method of screening from a cDNA library using the obtained fragment as a probe, or a method of performing an amplification reaction using a primer for amplifying λgt11 insert when λ phage (λgt11 or the like) is used. Can be. However, the present invention is not limited to these primers.
[0026]
The DNA amplified fragment obtained in this way is 32 P, 35 The probe can be screened by labeling with S or biotin or the like to obtain a probe, hybridizing the probe with a nitrocellulose filter on which the DNA of the transformant is denatured and fixed, and searching the obtained positive strain.
[0027]
Next, a full-length cDNA is cloned from the obtained clone. For cloning of the cDNA, for example, the TA cloning method is used. The TA cloning method can be performed using a commercially available kit, for example, a TA cloning kit manufactured by Invitrogen.
With respect to the isolated clone of the cDNA obtained in the above screening, the nucleotide sequence of the cDNA is determined using the amplification product as a template.
[0028]
The nucleotide sequence can be determined by a known method such as the Maxam-Gilbert chemical modification method or the dideoxynucleotide chain termination method using M13 phage. Usually, an automatic nucleotide sequencer (for example, ABI373 sequencer manufactured by Applied Biosystems) is used. ) Is used for sequencing.
[0029]
(B) Preparation of recombinant vector and transformant
A recombinant vector for transforming a host can be obtained by ligating the above-mentioned GPR14 gene to an appropriate vector, and a transformant is prepared by transforming the above-mentioned recombinant vector into a host such that the desired gene can be expressed. It can be obtained by introducing it into.
[0030]
As the vector, a vector known in the art as a vector for transformation is used, for example, plasmid DNA, phage DNA, animal virus vector such as retrovirus or vaccinia virus, insect virus vector such as baculovirus, and bacterial artificial vector. Chromosome (BAC), yeast artificial chromosome (YAC) and the like.
[0031]
In order to insert the GPR14 gene into a vector, first, a method is used in which the purified DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme, inserted into an appropriate restriction enzyme site or a multiple cloning site of the vector DNA, and ligated to the vector. You.
[0032]
The GPR14 gene needs to be inserted into a vector so that the function of the gene can be exhibited. Therefore, a cis element such as an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, a ribosome binding sequence (SD sequence), and the like can be linked to the recombinant vector, if desired, in addition to the promoter and GPR14 gene. In addition, examples of the selection marker include a dihydrofolate reductase gene, an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance gene, and the like. Furthermore, in addition to vectors capable of autonomous propagation in two or more host microorganisms such as Escherichia coli and yeast, various shuttle vectors can be used. Such a vector can also be cut with the restriction enzyme to obtain a fragment thereof.
[0033]
A known DNA ligase is used to link the DNA fragment and the vector fragment. Then, the DNA fragment and the vector fragment are annealed and then ligated to prepare a recombinant vector.
[0034]
The host used for transformation is not particularly limited as long as it can express the GPR14 gene. Examples include bacteria (such as Escherichia coli and Bacillus subtilis), yeast, animal cells (such as COS cells and CHO cells), and insect cells.
[0035]
When a bacterium is used as a host, it is preferable that the recombinant vector of the present invention is capable of autonomous replication in the bacterium, and is composed of a promoter, a ribosome binding sequence, a GPR14 gene, and a transcription termination sequence. Further, a gene controlling a promoter may be included. Escherichia coli includes, for example, Escherichia coli DH5α, and Bacillus subtilis includes, for example, Bacillus subtilis. Any promoter can be used as long as it can be expressed in a host such as Escherichia coli. The method for introducing the recombinant vector into bacteria is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into bacteria. For example, a method using calcium ions, an electroporation method and the like can be mentioned.
[0036]
When yeast is used as a host, for example, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, or the like is used. In this case, the promoter is not particularly limited as long as it can be expressed in yeast. The method for introducing the recombinant vector into yeast is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into yeast, and examples thereof include an electroporation method, a spheroplast method, and a lithium acetate method.
[0037]
When an animal cell is used as a host, monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster ovary cells (CHO cells), mouse L cells, rat GH3, human FL cells, and the like are used. As the promoter, SRα promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter and the like are used, and an early gene promoter of human cytomegalovirus may be used. Examples of a method for introducing a recombinant vector into animal cells include an electroporation method, a calcium phosphate method, and a lipofection method.
[0038]
When an insect cell is used as a host, an Sf9 cell or the like is used. Examples of a method for introducing a recombinant vector into insect cells include a calcium phosphate method, a lipofection method, and an electroporation method.
[0039]
Transformants are selected based on the properties of the marker gene comprised in the gene to be introduced. For example, when a neomycin resistance gene is used, cells showing resistance to the G418 drug are selected.
[0040]
(C) Production of GPR14 protein
In the present invention, the GPR14 protein can be obtained by culturing the transformant having the GPR14 gene and collecting the transformant from the culture. The term “culture” means any of cultured cells, cultured cells, and crushed cells or cells. The method for culturing the transformant in a medium is performed according to a usual method used for culturing a host.
[0041]
The culture medium for culturing the transformant obtained by using a microorganism such as Escherichia coli or yeast as a host contains a carbon source, a nitrogen source, and inorganic salts that can be used by the microorganism to efficiently culture the transformant. As long as the medium can be used, either a natural medium or a synthetic medium may be used. Here, a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, and the like added to the medium are known in the art.
[0042]
The cultivation is usually performed at about 37 ° C. for about 5 hours to 30 days under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and stirring culture. During the culture period, the pH is kept near neutral. Adjustment of the pH is performed using an inorganic or organic acid, an alkaline solution or the like. During the culture, an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium as needed.
[0043]
When culturing a microorganism transformed with an expression vector using an inducible promoter as a promoter, an inducer may be added to the medium as necessary. For example, when culturing a microorganism transformed with an expression vector using the Lac promoter, isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) or the like is used. When culturing a microorganism transformed with an expression vector using the trp promoter, indoleacetic acid is used. (IAA) and the like may be added to the medium.
[0044]
As a medium for culturing a transformant obtained by using an animal cell as a host, a commonly used RPMI1640 medium, a DMEM medium, or a medium obtained by adding fetal calf serum or the like to such a medium is used. Culture is usually performed with 5% CO 2 Perform in the presence at 37 ° C. for about 5 hours to 30 days. During the culture, antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium as needed.
[0045]
After culturing, since the target GPR14 protein is produced on the cell surface, the protein is extracted by disrupting the cells or cells. Thereafter, by using a general biochemical method used for isolation and purification of proteins, for example, ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, or the like, alone or in appropriate combination, the above-mentioned culture is performed. Can be isolated and purified from the target protein.
Whether or not the desired protein has been obtained can be confirmed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis or the like.
[0046]
(3) Cells expressing GPR14 protein
Cells expressing the GPR14 protein are prepared in the same manner as described in “(b) Preparation of recombinant vector and transformant” in the section “1. Taste substance-reactive composition containing GPR14”. can do. That is, a recombinant vector incorporating the GPR14 gene is prepared, and a host cell is transformed with the recombinant vector.
[0047]
The recombinant vector is not particularly limited as long as it is a vector for transforming a host cell. Particularly, those highly expressed in mammals are preferable. For example, pEF-BOS vectors (Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. 1990,
18, 17: 5322).
[0048]
The host cell is not particularly limited as long as it can express the GPR14 gene. For example, bacteria (Escherichia coli, Bacillus subtilis, etc.), yeast, animal cells (Chinese hamster ovary cells (CHO cells), COS cells, etc.), and insect cells can be mentioned. In the present composition, it is preferable to use a mammalian cell such as a CHO cell as a host.
[0049]
The recombinant vector is introduced into a host cell, and the cell into which the recombinant vector has been introduced is cultured. When an animal cell is used as a host, a commonly used RPMI1640 medium, DMEM medium, or a medium obtained by adding fetal bovine serum or the like to such a medium is used as the medium. Culture is usually performed with 5% CO 2 Perform in the presence at 370C for 7-14 days. When culturing CHO cells, HamF-12 medium was used and 5% CO 2 was used. 2 Culture for 10-14 days at 37 ° C in the presence.
As described above, cells expressing the GPR14 protein can be prepared.
[0050]
When cells expressing the GPR14 protein are used in the present composition, the cells may be immobilized with glutaraldehyde, formalin, or the like. The immobilization method can be performed according to a method known in the art. Since the GPR14 protein used as the present composition is a G protein-coupled receptor expressed on a cell membrane, a cell membrane fraction can also be used as a cell expressing the GPR14 protein. The cell membrane fraction refers to a cell membrane-rich fraction obtained by disrupting cells and then obtained by a method known in the art. As a method for crushing the cells, a method of crushing the cells with a Potter-Elvehjem type homogenizer, crushing with a Waring blender or a polytron (manufactured by Kinematica), crushing by ultrasonic waves, and squirting the cells from a thin nozzle while applying pressure by a French press or the like. Crushing and the like. For fractionation of cell membranes, fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation or density gradient centrifugation is mainly used. For example, the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (generally about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (15000 to 30000 rpm) for usually 30 minutes to 2 hours. The precipitate is the membrane fraction. The membrane fraction is rich in the expressed GPR14 protein and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins. The amount of GPR14 protein in cells expressing GPR14 protein or its membrane fraction is 10 per cell. 3 -10 7 Preferably a molecule 5 -10 7 More preferably, it is a molecule.
[0051]
(4) Function as a taste substance reactive composition (sensor)
The GPR14 protein was shown to respond to taste substances in a concentration-dependent manner in Examples 2 and 3 below. In Example 4 below, it was confirmed that the GPR14 gene was expressed in the tongue tissue, and it is considered that GPR14 functions as a taste receptor. Therefore, the present composition, that is, the GPR14 protein or a cell that expresses the GPR14 protein can be used as a sensor for taste substances.
[0052]
In the present invention, the “taste substance” refers to a component or a compound that produces a taste signal such as sweetness, bitterness, umami, saltiness, sourness, pungency, and harshness. Specifically, examples of the tasty substance include, but are not limited to, glucose, fructose, sucrose, lactose, maltose, sorbitol, and salt. The composition is particularly responsive to sweet ingredients such as glucose, fructose, sucrose, lactose, maltose, sorbitol.
[0053]
2. Taste substance identification method
The composition is useful as a reagent for isolating and identifying a tasty substance. That is, the method for identifying a tasty substance according to the present invention (hereinafter, referred to as “the present identification method”) comprises contacting the present composition with a test compound and measuring the amount of binding thereof or the cell stimulating activity thereby. It is characterized by the following.
[0054]
As the test compound, a candidate compound for which it is desired to determine whether or not the substance is a tasty substance, a library such as a combinatorial chemistry, or the like is used. For example, test compounds include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like.
[0055]
More specifically, the present identification method is a method for identifying a test compound that binds to GPR14 protein or a test compound that binds to GPR14 and has a cell stimulating activity by using the present composition. Cell stimulating activity includes, for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular calcium release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activity Activity that promotes or suppresses the degradation and pH reduction. The present identification method is characterized in that, for example, when the present composition is brought into contact with a test compound, the amount of the test compound bound to the GPR14 protein and the cell stimulating activity of the test compound are measured.
[0056]
In the present identification method, the binding amount of the test compound to the GPR14 protein or the cell stimulating activity of the test compound is not limited, but may be measured by any of the methods described in (1) to (5) below. Can be. That is,
(1) A labeled test compound is brought into contact with the present composition, and the amount of binding between the labeled test compound and GPR14 protein is measured.
(2) The labeled test compound is brought into contact with a cell or cell membrane fraction expressing the GPR14 protein contained in the present composition, and the amount of binding between the labeled test compound and the cell or membrane fraction is measured.
(3) The labeled test compound is brought into contact with the GPR14 protein expressed on the cell membrane by culturing cells expressing the GPR14 protein contained in the present composition, and the amount of binding between the labeled test compound and the GPR14 protein is determined. Measure.
(4) The test compound is brought into contact with a cell or cell membrane fraction expressing the GPR14 protein contained in the present composition, and the cell stimulating activity mediated by the GPR14 protein is measured.
(5) The test compound is brought into contact with the GPR14 protein expressed on the cell membrane by culturing cells expressing the GPR14 protein contained in the present composition, and the cell stimulating activity mediated by the GPR14 protein is measured.
[0057]
Then, the amount of binding in the case where the present composition and the test compound were brought into contact with each other, which was measured by any of the tests (1) to (3) above, was measured by bringing the present composition into contact with a substance that is not a taste substance. And the amount of binding (positive control) when the composition is brought into contact with urotensin II (negative control). Thereby, when the binding amount when contacted with the test compound is significantly increased as compared with the binding amount when contacted with a substance that is not a taste substance, the test compound is determined to be a taste substance. I do. Here, the “substance that is not a tasty substance” includes pure water.
[0058]
Alternatively, the cell stimulating activity when the present composition and the test compound measured by the test of the above (4) or (5) are brought into contact with the test compound is compared with the case where the cell stimulating activity is brought into contact with a substance that is not a taste substance. The cell stimulating activity in the absence of the stimulator (negative control control) or the cell stimulating activity in the case of contact with urotensin II (positive control) is compared. Thereby, when the amount of binding when brought into contact with the test compound is significantly increased as compared with the cell stimulating activity when brought into contact with a substance that is not a taste substance or when not brought into contact with the test compound. , The test compound is determined as a tasty substance. Here, the cell stimulating activity when not contacting with a test compound is the cell stimulating activity of the GPR14 protein-expressing cell or the cell membrane fraction in the above test (4) or (5) without contact with the test compound. It can be determined by measuring.
[0059]
In order to carry out the above methods (1) to (5) with respect to the present identification method, the present composition and a labeled test compound are required. The present composition can be prepared as described in the section “1. Taste substance-reactive composition containing GPR14”. As a labeled test compound, [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 S] or the like, a fluorescent label such as fluorescein, sulforhodamine, or tetramethylrhodamine, a chemiluminescent label such as luciferin, or a compound labeled with a labeling antibody (eg, a peptide, a protein, or a non-peptidic compound). is there. Alternatively, the present composition may be labeled with the label.
[0060]
In order to identify the taste substance, a test compound labeled with a certain amount of a label is allowed to coexist with the present composition. In order to know the non-specific binding amount (NSB), a reaction tube containing an excess amount of an unlabeled test compound is also prepared. The reaction temperature and time are appropriately determined in consideration of the amount of the GPR14 protein, the amount of the test compound, and the like contained in the composition. After the reaction, the mixture is filtered with a glass fiber filter or the like, washed with an appropriate amount of a buffer or the like, and then the amount of the label remaining on the glass fiber filter is measured. When labeled with a radioisotope, the radioactivity can be measured by, for example, a liquid scintillation counter, a γ-counter, or the like. When fluorescently labeled, the fluorescence intensity can be measured by, for example, a fluorescent plate reader, a fluorescent laser scanner, or the like. When labeled with an antibody, the amount of the antibody bound can be measured using a general plate reader. A test compound in which the count (B-NSB) obtained by subtracting the non-specific binding amount (NSB) from the total binding amount (B) exceeds 0 cpm can be selected as the taste substance.
[0061]
In order to carry out the above methods (1) to (5) with respect to the present identification method, the cell stimulating activity mediated by the GPR14 protein can be measured using a known method or a commercially available measurement kit. The cell stimulating activity includes, for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular calcium release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c- An activity that promotes or suppresses the activation of fos, a decrease in pH, and the like.
Specifically, first, cells expressing the GPR14 protein of the present composition are cultured in a multiwell plate or the like. In carrying out the present identification method, the medium is replaced in advance with a fresh medium or an appropriate buffer that does not show toxicity to the cells, and after adding a test compound and incubating for a certain period of time, the cells are extracted or the supernatant is collected. The products produced are quantified according to the respective method. When the production of a substance (for example, arachidonic acid) as an indicator of cell stimulating activity is difficult due to a degrading enzyme contained in a cell, an assay may be performed by adding an inhibitor to the degrading enzyme. In addition, the activity such as cAMP production suppression can be detected as a production suppression effect on cells whose basic production has been increased by forskolin or the like.
[0062]
Hereinafter, a method for measuring the cell stimulating activity by measuring the intracellular calcium concentration will be described. Measurement of intracellular calcium concentration is known in the art, and includes, for example, a fluorescence method using Fura-2. In addition, the intracellular calcium concentration can be measured indirectly by measuring prostaglandin E2 (PGE2) whose production and release in the cell changes with an increase in the intracellular calcium. Since the PGE2 whose production has changed is released outside the cells, the culture supernatant 4 hours after ligand stimulation is collected, and the PGE2 concentration in the supernatant is measured. For the measurement of PGE2, for example, a Prostaglandin E2 EIA measurement kit manufactured by Cayman can be used.
[0063]
The intracellular calcium concentration of the cells expressing the GPR14 protein, which has been brought into contact with the test compound, is increased as compared with the intracellular calcium concentration when the cells are brought into contact with a substance other than the taste substance or when the test compound is not brought into contact. In this case, it can be said that the test compound is a tasty substance.
[0064]
Since the taste substance identified as described above binds to GPR14 and is sensed as a taste, the present identification method is a novel taste for use in the field of foods, seasonings, processed foods, and the like. Useful for identifying tastants.
[0065]
3. Taste substance detection method
Since GPR14 responds to taste substances in a concentration-dependent manner, the present composition can be used to detect taste substances. In the present invention, "detection" refers to determining the presence or absence of a taste substance contained in a test sample, and quantitative detection for measuring the amount of a taste substance contained in a test sample. Also refers to.
[0066]
The method for detecting a taste-extracting substance in a test sample according to the present invention (hereinafter, referred to as “the present detection method”) comprises bringing the present composition and the test sample into contact with each other, and mixing the present composition with the test sample. The present invention is characterized in that the amount of binding to a taste substance or the cell stimulating activity by the taste substance is measured.
[0067]
As the test sample, a sample in which it is desired to detect or quantify the contained taste substance, a sample in which it is desired to determine the presence or absence of the taste substance, and the like are used. For example, examples of the test sample include liquid, solid, and gaseous compounds such as foods.
[0068]
More specifically, the present detection method comprises the steps of: providing a test sample and a test sample in contact with each other, the amount of a taste substance contained in the test sample binding to the GPR14 protein, or the taste substance; Is used to detect the taste-imparting substance in the test sample.
[0069]
The binding amount between the GPR14 protein and the taste substance and the cell stimulating activity of the taste substance can be measured as described in the above-mentioned “2. Method for identifying taste substance”. Therefore, in any of the methods described in the above (1) to (5), the test is performed by replacing the “test compound” with the “taste substance”. The present detection method is preferably performed by labeling the present composition.
[0070]
In this detection method, in particular, the above tests (1) to (5) are performed, and the presence of a taste substance in the test sample, that is, the binding of the taste substance in the test sample to the GPR14 protein. It is preferable to confirm the binding activity or the cell stimulating activity again by the test methods (1) to (5) after confirming that the binding activity is performed (qualitative confirmation). By performing this quantitative confirmation, it becomes possible to measure the amount of the tasty substance contained in the test sample. In the case of performing quantitative detection, it is preferable to prepare a calibration curve in advance using a taste substance having a known concentration.
[0071]
According to the present detection method, it is possible to detect the presence of a taste substance in a test sample and measure the amount of the taste substance. Therefore, it is useful for digitizing and quantifying taste, which was conventionally difficult to digitize.
[0072]
4. Kit for identification or detection of taste substances
The present composition can be provided as a kit for identifying or detecting a tasty substance. The kit for identification or detection of a tasty substance according to the present invention (hereinafter, referred to as “the kit”) contains, in addition to the present composition, a component useful for performing the present identification method or detection method. Such components include, for example, a buffer for suspending the composition, a label, a surfactant or a variety of proteins for reducing non-specific binding, a degradation of GPR14 protein or a taste substance by a protease. Examples include protease inhibitors for suppressing the activity, and components for measuring cell stimulating activity. The buffer may be any buffer as long as it does not inhibit the binding between the GPR14 protein and the tasty substance. For example, a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8), a tris-hydrochloric acid buffer, and the like can be used.
[0073]
As the surfactant, for example, CHAPS, Tween-80 TM , Digitonin, deoxycholate, etc., and various proteins include, for example, bovine serum albumin, gelatin and the like. Furthermore, examples of the protease inhibitor include PMSF, leupeptin, E-64, pepstatin and the like.
By using this kit, the present identification method or detection method can be easily performed.
[0074]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to the following examples.
[0075]
[Example 1] Cloning of GPR14 and introduction into CHO cells
Rat GPR14 was obtained from the bladder. That is, six male Wistar rats (weighing around 200 g) obtained from the Saitama Experimental Animal Supply Center were decapitated and bled, and the bladder was collected and washed with sterile physiological saline. Then, the collected bladder was added to 10 ml of ice-cold TRIzol manufactured by GIBCO BRL, and the bladder tissue was homogenized using a Polytron homogenizer at the maximum speed for 1 to 2 minutes. From this, 230 μg of total RNA was obtained according to the manual attached to TRIzol. Poly (A) was added to the total amount of 230 μg of Total RNA using Oligotex-dT30 of Takara. + RNA was purified. As a result, 11 μg of rat bladder Poly (A) + RNA was obtained. 1 μg of the cDNA was used to obtain 20 μl of a cDNA solution using reverse transcriptase Superscript II of GIBCO BRL. From here, 1 μl was used to obtain a single band PCR product under the following PCR conditions using Takara's EX Taq using primers (SEQ ID NOs: 3 and 4). That is, the PCR conditions were as follows: a cycle consisting of 94 ° C. for 3 minutes, 94 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 1.5 minutes was performed 35 times, and then at 72 ° C. for 7 minutes.
[0076]
The PCR product thus obtained was subjected to electrophoresis using low melting point agarose SeaPlaque GTG agarose (1%) manufactured by FMC BioProducts, and only the 1161 bp GPR14 band was cut out with a razor. The cut out agarose pieces were subjected to electrodialysis using a dialysis bag of GIBCO BRL containing TAE to separate agarose and PCR products. The PCR product dissolved in TAE was recovered by an ethanol precipitation method, and dissolved in 15 μl of TE. Of these, 1 μl was electrophoresed on an agarose gel containing ethidium bromide, and it was confirmed whether the band of the PCR product could be visually observed under UV irradiation. Since the band was confirmed on the electrophoresis gel, cloning was performed using 2 μl of 15 μl in a TA Cloning kit of Invitrogen. Clones that appeared to have inserts by blue / white selection using X-gal were picked from ampicillin-containing L / B plates. The GPR14 clone was subjected to PCR using the following primers (5′-CGC GGA TTC ATG GCT CTG AGC CTG GAG-3 ′ (SEQ ID NO: 5), the underlined portion represents the Bam HI site; 5′-ACG CGT CGA CTC AGA GAA GGG CCC GTT AC-3 ′ (SEQ ID NO: 6) The underlined part indicates the Sal I site). This was introduced into the BamHI / SalI site of pEF-BOS. pEF-BOS is available from Nagata, S .; and Mizushima, S.M. , Nucleic Acid Research 18: 5322 (1990).
[0077]
5 μl of this GPR14-pEF-BOS vector and 2 μl of pEF-neo (Nagata et al.) Were introduced into CHO cells using Promega's TransFast kit. The CHO cells transfected with these genes were added to a Ham's F-12 culture solution of Sigma (containing 10% of heat-inactivated fetal bovine serum of JHR Biosciences) in an antibiotic of GIBCO BRL (50 U / ml of penicillin). / Streptomycin (50 μg / ml) and 400 μg / ml of G418 (Nacalai Tesque, Inc.), and cultured at 37 ° C. under 5% carbon dioxide for 2 weeks to obtain neomycin-resistant cells. The cells were named CHO-S strain, suspended in Cell Banker (Diatron) and stored at -80 ° C.
[0078]
[Example 2] Response of GPR14 to taste substances
The cells obtained in Example 1 (hereinafter referred to as the CHO-S strain) were cultured in Nutrient Mixture F-12 HAM (manufactured by SIGMA) supplemented with 10% bovine serum, 50 μg / ml penicillin and streptomycin (hereinafter referred to as F-cell). 12 medium) at 37 ° C. in a 24-well culture flask at a carbon dioxide concentration of 5.0% for 4 days. After the culture, the cells were washed three times with a × 10 phosphate buffer (hereinafter referred to as PBS). This was used as a CHO-S strain test cell.
[0079]
To the CHO-S strain test cells, 0.2 ml of a solution obtained by dissolving the following 25 kinds of taste substances in F-12 medium and 0.2 ml of F-12 medium were added at 37 ° C. and a carbon dioxide concentration of 5.0%. For 4 hours. As taste substances, 150 mM glucose, 70 mM fructose, 45 mM sucrose, 60 mM lactose, 45 mM maltose, 170 mM sorbitol, 75 mM glycine, 35 mM alanine, 0.25 mM aspartame, 0.01 mM lysozyme, 0.05 mM stevioside, 0.37 mM acesulfame K, 0.01 mM quinine hydrochloride, 8.0 mM caffeine, 45 mM phenylalanine, 22 mM tryptophan, 2.9 mM arginine, 8.0 mM sodium glutamate, 0.45 mM guanosine 5'-monophosphate disodium salt, 1.5 mM inosine 5 '-Monophosphate disodium salt, 0.65 mM citric acid, 45 mM salt, urotensin-II 10-9M was used.
[0080]
After the treatment, the medium was recovered, and the CHO-S strain test cells were removed by centrifugation (PGE test solution). For the PGE test solution, the amount of PGE2 was measured using Prostaglandin E2 EIA Kit (manufactured by Cayman Chemical Company). In the CHO-S strain, the addition of glucose, fructose, sucrose, lactose, maltose, sorbitol and sodium chloride, in addition to urotensin II, increased the concentration of PGE2 in the culture solution (FIG. 1). In FIG. 1, 1 to 24 are 1: glucose, 2: fructose, 3: sucrose, 4: lactose, 5: maltose, 6: sorbitol, 7: alanine, 8: glycine, 9: aspartame, 10: lysozyme, 11 : Stevioside, 12: Acesulfame K, 13: Quinine hydrochloride, 14: Caffeine, 15: Phenylalanine, 16: Tryptophan, 17: Arginine, 18: Sodium glutamate, 19: Guanosine 5'-monophosphate disodium salt, 20: Inosine 5′-monophosphate disodium salt, 21: citric acid, 22: salt, 23: urotensin-II 10-9M, 24: mili-Q. From the above experiments, it is clear that GPR14 responds to these taste substances. On the other hand, when other taste substances were added, the amount of PGE in the culture solution did not increase, and no response occurred.
At the same time, the same measurement was performed using a CX3RCR-expressing strain expressing a fractalkine receptor obtained by the same method as in Example 1.
[0081]
CHO cells expressing rat fractalkine receptor (CX3CR; accession number NM # 133534) were prepared as follows. The rat brain cDNA library was incorporated into the EcoRI site of λZAP II from Stratagene using EcoRI Linker, and in vitro packaging was performed using Gigapack III Gold from Stratagene. A probe was prepared based on the 34 base sequences on the 5 'side of the rat fractalkine receptor, and plaque hybridization was performed. A vector pBluescript-CX3CR1 containing a fractalkine receptor was obtained from the obtained positive plaques by in vivo Excision using helper phage. This pBluescript-CX3CR1 was treated with two restriction enzymes Sal I and Spe I to obtain a CX3CR1 fragment. This fragment was incorporated into a pEF-BOS vector treated with the same restriction enzymes.
[0082]
Neomycin resistance to 3 μg of pEF-BOS vector containing a fractalkine receptor confirmed by sequencing, 3 μg of pEF-BOS incorporating human Gα16 (human Gα16: base sequence is shown in SEQ ID NO: 7), and 1 μg of pEF-BOS The gene-incorporated pEF-neo (obtained from Nagata et al.) Was introduced into Chinese hamster ovary (CHO) cells (obtained from ATCC) using Promega's TransFast kit. CHO cells transfected with these genes were added to Sigma's Ham's F-12 culture solution (containing 10% heat-inactivated fetal bovine serum from JHR Biosciences) and GIBCO BRL's antibiotic (penicillin 50 U / ml / Streptomycin (50 μg / ml) and 400 μg / ml of G418 (Nacalai Tesque, Inc.) were added, and cultured at 37 ° C. under 5% carbon dioxide for 2 weeks to obtain neomycin-resistant cells.
[0083]
Cells grown in the presence of G418 were isolated using a cloning cylinder. Total RNA was extracted from the isolated cells using TRIzol from GIBCO BRL and subjected to RT-PCR. As a result, when CX3CR and Gα16 were co-expressed (CX3CR + G16) as shown in FIG. 2, a clear PCR band was confirmed for CX3CR and Gα16 (the rightmost lane in FIG. 2).
[0084]
Further, Fura-2 of Dojinsha was loaded on cells in which CX3CR, fractalkine receptor and Gα16 were co-expressed, and the change in intracellular calcium concentration when fractalkine as an agonist was allowed to act was examined. The results are shown in FIG. The fractalkine receptor CX3CR, which is coupled to a G protein Gi that serves to reduce the intracellularly raised cAMP concentration, is coupled to Gα16, which is co-expressed in the cell, to form CX3CR-G16 and Like the second CX3CR + G16 from the top, 10 -7 An increase in intracellular calcium concentration was observed when M fractalkine was allowed to act. Therefore, it was revealed that the fractalkine receptor functions in CHO cells by coupling with the G protein.
[0085]
However, this receptor was not stimulated by urotensin II, an agonist of GPR14, and was used as a negative control in this experiment.
As in the case of the CHO-S strain, the amount of PGE when a taste-imparting substance was added was measured (FIG. 1). In the CX3RCR-expressing strain, the amount of PGE2 did not increase in the case of all taste substances, and it was clear that there was no response to these substances (FIG. 1).
[0086]
Example 3 Concentration-Dependent Response of GPR14 to Taste Substances
The CHO-S strain prepared in Example 1 was cultured in an F-12 medium in a 24-well culture flask at 37 ° C. and a carbon dioxide concentration of 5.0% for 4 days. After the culture, the cells were washed three times with × 10 PBS. This was used as a CHO-S strain test cell. To the CHO-S strain test cells, 0.2 ml each of a solution obtained by dissolving various concentrations of taste substances described below in F-12 medium and F-12 medium were added at 37 ° C. and a carbon dioxide concentration of 5. The solution was thermostated at 0% for 4 hours. The taste substances used in the test were 300, 150, 75, 37.5, 18.8 mM glucose; 140, 70, 35, 17.5 mM fructose; 90, 45, 22.5, 11.3 mM sucrose; 90, 45, 22.5, 11.3 mM salt. After the treatment, the medium was recovered, and the CHO-S strain test cells were removed by centrifugation (PGE test solution). The PGE2 amount of the PGE test solution was measured using Prostaglandin E2 EIA Kit (manufactured by Cayman Chemical Company).
[0087]
In the CHO-S strain to which glucose, fructose, sucrose and salt were added, the PGE2 concentration increased depending on the concentration of the taste substance (FIG. 4). In other words, it was clear that GPR14 responded to these taste substances in a concentration-dependent manner.
[0088]
[Example 4] Confirmation of expression of GPR14 in tongue tissue
The expression of GPR14 in tongue tissue was examined by in situ hybridization.
The probe was a sequence obtained by complementing a part of the base sequence of rat GPR14 of 88 to 147 bp (rGPR14 / AS: 5'-CCA CAA GGT CTT TCA GGG AGC TGG GAT CTG TTG GGC CGG ACC AGG AGA TGA TGA TGA C-3 ′; SEQ ID NO: 8) was used. On the other hand, as a negative control, a part of the base sequence of 88-147 bp (rGPR14 / S: 5′-GTG TCC CTC AAC AGT TCC TGG TCC GGC CCA AGA GAT CCC AGC TCC CTG AAA GAC CTT GTG G; 9) was used as a probe. This sequence is a base sequence common to humans, mice and rats. Biotin was labeled on the 3 'side of the two probes and purified by HPLC.
[0089]
The mouse tongue tissue was washed with cold PBS immediately after collection, embedded in an OTC compound, and stored at -20 ° C. This tissue was sliced to 5 μm with a cryostat, and after reacting with Proteinase K and aqueous hydrogen peroxide, GPR14 was detected in the tissue as light brown to dark brown using DAKO ultra-sensitive nucleic acid probe detection kit. . Methyl green was used for counterstaining of the tissue.
[0090]
As shown in FIG. 5A, in the tongue tissue of the mouse, GPR14 was observed to be light brown and stained on the surface layer of the tongue (arrow in the figure). In FIG. 5B showing the negative control, there is no portion stained brown. Therefore, it can be seen that the stained site stained brown is not a nonspecific reaction but a specific reaction. From this test, GPR14 was found to be expressed in tongue tissue.
[0091]
【The invention's effect】
According to the present invention, there is provided a taste substance-reactive composition. The present composition is useful for identification and detection of a taste substance. Therefore, by using the present composition, it is possible to identify a new taste-imparting substance.
[0092]
[Sequence list]
[0093]
[Sequence List Free Text]
SEQ ID NOS: 3 to 9: Synthetic DNA
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the response of GPR14 to taste substances.
FIG. 2 shows the expression of CX3CR and G16α in CHO cells.
FIG. 3 is a graph showing changes in calcium concentration in CX3CR-expressing CHO cells, CX3CR and G16α-expressing CHO cells, and CX2CR-G16α-expressing CHO cells when fructalkine, which is a CX3CR3 agonist, acts.
FIG. 4 is a graph showing a concentration-dependent response of GPR14 to a taste-exhibiting substance.
FIG. 5 shows GPR14 expressed in mouse tongue tissue. A shows the case where rGPR14 / AS was used as a probe, and B shows the negative control using rGPR14 / S as a probe.