JP2004059509A

JP2004059509A - Amino acid reagent for liquid phase peptide synthesis

Info

Publication number: JP2004059509A
Application number: JP2002220569A
Authority: JP
Inventors: Kazuhiro Chiba; 千葉一裕; Tomotaka Marui; 丸井智敬
Original assignee: Tokyo University of Agriculture and Technology NUC
Current assignee: Tokyo University of Agriculture and Technology NUC
Priority date: 2002-07-30
Filing date: 2002-07-30
Publication date: 2004-02-26

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To improve the efficiency of liquid phase synthesis by omitting a reaction for bonding the C-terminal amino acid of a peptide to a soluble carrier; to make the selection of a raw material of the C-terminal amino acid corresponding to various kinds of peptides easy; and to make the detection of the interface of the first and the second solvent solutions required for elimination of the second solvent solution in phase separation in a liquid phase synthetic process easy. <P>SOLUTION: The amino acid reagent for the liquid phase peptide synthesis is obtained by bonding the C-terminal amino acid of a peptide to be synthesized to an amino acid functional group of the soluble carrier. The amino acid reagent is obtained by adding an additive by which a kind of a C-terminal amino acid can be distinguished by its properties, or the interface in a phase separation state can be easily detected. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、相溶状態と相分離状態とが温度で可逆的に変化する溶媒の組み合わせを好適に利用した液相ペプチド合成装置（特願２００２−１９８２４２）で用いるアミノ酸試薬である。
【０００２】
【従来の技術】
医学、薬学、生物学など広範囲の分野においてペプチドの合成技術の重要性はいうまでもない。アミノ酸を特定の順序でペプチド結合させたペプチドは、抗原−抗体相互作用の研究、臨床診断に利用するペプチド抗原の研究、種々の遺伝子研究などきわめて多くの研究にかかわる。免疫でも感染源でもタンパク質の活性はたかだかアミノ酸５個から１０個が結合したペプチドで決まる。したがって、その部分の合成は非常に重要であり研究用として多くの需要がある。
【０００３】
もちろんアミノ酸１０個以上結合したペプチドも重要である。合成可能とされるペプチドの結合数（残基数）の限界は５０程度であり、このアミノ酸結合数の限界を超えたペプチドの合成技術も望まれている。研究の成果として、特定のタンパクやペプチドの薬効が検証されれば、化学合成ワクチン等の医薬品向けペプチドの大量需要が発生する。よって、商用規模の大量の需要に対応できるペプチド量産技術が強く望まれている。
【０００４】
固体表面に化学的にアミノ酸を連結していく、固相合成法が現在のペプチド合成の主流となっている。しかし、この固相ペプチド合成法（Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法）には、以下のような欠点がある。まず第一に、固体表面で化学反応を行わなければならないため、試薬が固体表面に接近しにくく、液相反応に比べると反応が起こりにくい。すなわち、固体担体がアミノ酸に比べてきわめて巨大な分子であり、その巨大分子のごく小さな反応部にアミノ酸を結合させる必要があるが、それが確率的に起こりにくい。そのため高価なアミノ酸反応試薬を大量に供給しなければならない。通常反応量の１００倍程度を供給する。その結果として反応に関与できない反応試薬が大量に発生し無駄になる。
【０００５】
第二には、ｎ番目のアミノ酸の未反応部には次の結合工程で、ｎ＋１番目のアミノ酸がｎ番目として結合してしまうので所望のペプチドではない不純物となってしまう。こういった未反応が、個々の結合反応で５％しか発生しないとしても、５０アミノ酸（残基）のペプチドを合成すると、最終的な収率はたったの７．７％となってしまう（０．９５の５０乗）。３０アミノ酸（残基）でも２１．５％である（０．９５の３０乗）。そのため反応時間を十二分に長く取らざるを得ない、という生産効率上の問題があった。この他にも固相ペプチド合成では、目的の反応が進行したことを簡便に確認することができない、固体担体が微小とはいえ数ミクロンの大きさがあるため反応槽をスケールアップすると、巨大なものになってしまう、固相担体が高価で再利用ができない（使い捨て）といった問題があった。
【０００６】
上記のように固相合成法は、固体担体を用いて所望のアミノ酸を確実にひとつずつ結合していくことを可能ならしめる画期的なものではあったが、量産性の面などで欠点が多い。そこで、発明者は固相合成法の長所を確保しながら、液相でペプチド合成する新たな方法を開発した。それは、特願２００１−２５４１０９「相溶性−多相有機溶媒システム」、特願２００１−３８５４９３「相溶性−多相有機溶媒システムによりアミノ酸を逐次的に付加する液相ペプチド合成法」、特願２００２−１９８２４２「液相ペプチド合成装置」、および”Ａ　ｌｉｑｕｉｄ−ｐｈａｓｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−ｂａｓｅｄ　ｂｉｐｈａｓｉｃ　ｔｈｅｒｍｏｍｏｒｐｈｉｃ　ｓｙｓｔｅｍｓ”，Ｋａｚｕｈｉｒｏ　Ｃｈｉｂａ，　Ｙｕｓｕｋｅ　Ｋｏｎｏ，　Ｓｈｏｋａｋｕ　Ｋｉｍ，　Ｋｏｈｓｕｋｅ　Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙｏｓｈｉｋａｚｕ　Ｋｉｔａｎｏ　ａｎｄ　Ｍａｓａｈｉｒｏ　Ｔａｄａ，．Ｃｈｅｍ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　２００２，　（Ａｄｖａｎｃｅ　Ａｒｔｉｃｌｅ），Ｔｈｅ　Ｒｏｙａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１７６６−１７６７，２００２，．（Ｆｉｒｓｔ　ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｗｅｂ　１５ｔｈ　Ｊｕｌｙ　２００２）に開示された液相合成法および液相合成装置である。
【０００７】
固相合成法以前にもペプチドの液相合成がなされていた。しかし、固相合成法の普及後は主流ではなくなった。以下液相合成と記載した場合は、本発明者が上記特許で開示した技術を示すものとする。液相ペプチド合成法を説明する。
【０００８】
＜液相ペプチド合成法の溶媒セット＞
特願２００１−２５４１０９「相溶性−多相有機溶媒システム」にて、温度により相溶状態と相分離状態とが可逆的に変化する第一の溶媒と第二の溶媒のセット（組み合わせ）が開示されている。ここで第一の溶媒と第二の溶媒のそれぞれは、複数の溶媒の混合溶媒でもよい。
【０００９】
液相ペプチド合成に好適な溶媒セットは、特願２００１−３８５４９３「相溶性−多相有機溶媒システムによりアミノ酸を逐次的に付加する液相ペプチド合成法」に開示されているように、一方の溶媒または混合溶媒（第一の溶媒）を構成する有機溶媒がシクロアルカン系の化合物からなる。
【００１０】
第一の溶媒は、基本的には低極性有機溶媒であり、該溶媒を構成する化合物群としては、アルカン、シクロアルカン、アルケン、アルキン、芳香族化合物などで、中でも好ましいものが、シクロアルカン系の化合物であり、特に好適なものとして「シクロヘキサン」を挙げることができる。シクロヘキサンのイス型−舟形配座異性体の変換が他の溶媒との関連で温度的に比較的穏やかな条件で起こることに関連していると推測できる。シクロヘキサンは融点が６．５℃と比較的高く、反応後の生成物などを固化して分離できるという利点もあり、最終工程である回収工程でもメリットがありこの面からも好ましい。回収工程の説明は略す。
【００１１】
一方、第一の溶媒と組み合わせる他方の溶媒または混合溶媒（第二の溶媒）を構成する有機溶媒は、基本的には高極性有機溶媒である。好ましいものとしては、ニトロアルカン、ニトリル、アルコール、ハロゲン化アルキル、アミド化合物およびスルフォキサイドからなる群から選択される少なくとも一種から構成されたものである。
【００１２】
第二の溶媒は、さらに具体的には、ニトロアルカンのアルキル基は炭素数が１、２または３であり、ニトリルのアルキル基の炭素数が１、２または３であり、アミド化合物はＮ−ジアルキルまたはＮ−モノアルキルアミドのアルキル基およびアシル基またはホルミル基の炭素数の合計は６以下であり、アルコールは炭素数が８以下であり、スルフォキサイドのアルキル基は炭素数が１、２または３であり、またハロゲン化アルキルのアルキル基は炭素数が６以下である。
【００１３】
上記の第一の溶媒と第二の溶媒との溶媒セットは、温度により可逆的に均一相溶混合溶媒系の状態（相溶状態）と複数相に分離した分離溶媒系の状態（相分離状態）とを可逆的に取り得る。
【００１４】
＜可溶性担体（液体担体）＞
さて、特願２００１−３８５４９３（液相ペプチド合成法）において上記の溶媒セットを用いてアミノ酸を逐次的に付加する液相ペプチド合成法を提案しているが、この合成法にて溶媒セットと共に重要なものは、固相ペプチド合成の固体担体に相当する「可溶性担体（液体担体）」である。これは、特願２００１−２５４１０９（溶媒システム）において、「第一の溶媒あるいは第二の溶媒いずれか一方のみ溶解する反応に関与する化学成分」と記載したものに相当する。
【００１５】
すなわち、第一の溶媒に対し可溶性であり、第二の溶媒に対し難溶性である化合物から誘導され、かつ、アミノ酸系物質と結合する液体の担体である。（ここで「アミノ酸系物質」とは、単独のアミノ酸あるいはアミノ酸残基、複数のアミノ酸がペプチド結合したペプチドを含む。）この担体は、反応状態で液体であるが、常温で固体であってもよい。機能について固体担体と等価であり、これと対比するため特願２００２−１９８２４２「液相ペプチド合成装置」では「液体担体」と呼称していたが、本明細書では「可溶性担体」と記載する。以下に可溶性担体について説明する。
【００１６】
従来技術の固相表面反応を液相の反応に置換すれば、従来問題であった反応性の悪さ（固体担体がアミノ酸に比べてきわめて巨大な分子であり反応部位に接近しにくい）を改善できる。さらに、前述の相分離する溶媒セットをうまく使えば、得られた反応生成物の分離が極めて容易に実現できる。このように画期的な利点をもつ液相ペプチド合成法の実現には、固相ペプチド合成の固体担体に相当する可溶性担体が必要で、発明者はこれを見出した。その可溶性担体は以下の機能を必要とする。
【００１７】
すなわち可溶性担体は、ペプチドの形成を開始するアミノ酸との結合部を有すること、アミノ酸を順次結合させ伸長させたペプチド鎖を担持できること、さらにアミノ酸と結合した化合物および合成中のペプチド鎖を担持した化合物が、第一の溶媒に溶解されること、という機能である。つまり担体は、第一の溶媒への溶解性を高める部分を具備して可溶性であり、かつ、アミノ酸と結合する官能基を具備していればよい。
【００１８】
これら機能を持つ可溶性担体の候補化合物（親シクロアルカン系溶媒部分とアミノ酸と結合する官能基を有するもの）は、下記の一般式Ａ（化４）で表される芳香族炭化水素環からなる基本骨格化合物である。ここで、担体が具備すべき第一の溶媒への溶解性を高める部分は一般式Ａ（化４）の（ＲＸ）ｎで表される炭素数１０以上の炭化水素基をもつ親シクロアルカン系溶媒部分である。
【００１９】
【化４】

【００２０】
（ＲＸ）ｎのＲは、Ｏ、Ｓ、またはＮを結合原子として含んでいても良い炭素数１０以上の炭化水素基であり、（ＲＸ）ｎのＸはＯ、Ｃ、Ｓ、またはＮを介して芳香族炭化水素環に結合する任意の残基があっても良い結合部、または、エステル基、イミノ基を介して芳香族炭化水素環に結合する結合部であり、（ＲＸ）ｎのｎは、１から５の整数である。Ｒの例を具体的に図７、Ｘの例を具体的に図８、図９に示す。これらの説明は略す。
【００２１】
一般式Ａ（化４）において、Ｌ１は、アミノ酸と結合する水酸基、チオール基、アミノ基、またはカルボニル基と結合する単結合、該水酸基、チオール基、アミノ基、またはカルボニル基と結合する原子団、または点線とも結合して２環の縮合芳香族環を形成する原子団である。また、一般式Ａ（化４）において、点線はＨとの結合または前記Ｌ１と結合して前記縮合芳香族環を形成する原子団の結合である。
【００２２】
さらにまた、担体が具備すべきアミノ酸と結合する官能基が、前記の炭素数が１０以上の炭化水素基の分枝鎖または置換基にあってもよいし、前記の炭素数が１０以上の炭化水素基の分枝鎖および置換基にあってもよい。
【００２３】
一般式Ａ（化４）は、より具体的には、下記の一般式群Ｂ（化５）から選択される。一般式群Ｂ（化５）において、Ｘ、Ｒおよびｎは一般式Ａ（化４）と同じ。Ｑ_１は、単結合または炭化水素基であり、Ｒ_２はアミノ酸と結合する水酸基、チオール基、アミノ基、またはカルボニル基であり、Ｒ_３およびＲ_４は、一般式Ｃ（化６）の基である。また、一般式Ｃ（化６）のＲ_５は、アミノ酸と結合する水酸基、チオール基、アミノ基、またはカルボニル基である。（ここで、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５は後で記載されるＲ１、Ｒ２、Ｒ３とは同一ではないので注意されたい。）
【００２４】
【化５】

【００２５】
【化６】

【００２６】
前に説明した第一の溶媒は、分離状態において、上記可溶性担体および可溶性担体とアミノ酸系物質との結合物質を溶解するが、可溶性担体と結合していないアミノ酸（ペプチド結合させるべきアミノ酸）は溶解しない（難溶である）。ここで、アミノ酸系物質とは、単一のアミノ酸あるいはペプチドである。
【００２７】
また逆に、第二の溶媒は、分離状態において、アミノ酸（ペプチド結合させるアミノ酸）を溶解するが、上記可溶性担体および可溶性担体とアミノ酸系物質との結合物質を溶解しない（難溶である）特性を持っている。
【００２８】
可溶性担体の好適な具体例を図４の１に示す。１は、前記の一般式群Ｂにおいて、ＲがＣ_１８Ｈ_３７−であり、ＸがＯであり、ｎが３であり、ＱがＣＨ_２であり、Ｒ_２がＯＨである。名称は、（３，４，５−トリオクタデシルオキシフェニル）メタン−１−オール、〔（３，４，５−ｔｒｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈａｎ−１−ｏｌ　〕である。この可溶性担体１は、第一の溶媒に対し可溶性であり、第二の溶媒に対し難溶性である化合物から誘導され、かつ、アミノ酸系物質と結合する。
【００２９】
＜液相ペプチド合成法＞
可溶性担体は１に限定されることはないが以下、この可溶性担体具体例１を用いて、本発明者の液相ペプチド合成法を説明する。図４から図６は、固相ペプチド合成法の固体担体を可溶性担体１に置換した本案液相ペプチド合成の説明図である。
【００３０】
図４は、Ｎ末端を保護され、Ｃ末端を活性化された（活性化基Ｘを結合された）Ｒ１残基アミノ酸１２のＣ末端を、可溶性担体１に結合する反応（図４中の８）を示す反応フロー図である。ここで、可溶性担体１は、第一の溶媒（Ａ）に１が溶解された第一溶媒溶液（Ａ１）という溶液の状態であり、Ｒ１残基アミノ酸１２は、あらかじめ第二の溶媒（Ｂ）に溶解され、第二溶媒溶液（Ｂ１２）として準備される。（Ａ、Ｂ、Ａ１、Ｂ１２という表記は図４から図６では略す。）
【００３１】
前記第一の溶媒（Ａ）に１が溶解された第一溶媒溶液（Ａ１）と、Ｒ１残基アミノ酸１２が第二の溶媒（Ｂ）に溶解された第二溶媒溶液（Ｂ１２）とが混合される。第二溶媒溶液（Ｂ１２）は多少過剰に投入されるのが好ましい。その理由は、相対的に第一溶媒溶液が多いとすべてのペプチド反応が生じても、未反応の末端をもつ担体が残留するからである。これは固相合成法と同様であるが、固相合成法のように必要量の１００倍も過剰に投入する必要はない。
【００３２】
両溶液混合後、それらが相溶状態となる温度に加熱される。すると、可溶性担体１の末端はアミノ酸と結合する水酸基であるので、Ｒ１残基アミノ酸Ｃ末端とペプチド結合反応（図４中の８）して１ａｆとなる。この１ａｆも、相溶化状態の両溶媒に溶けている。
【００３３】
ペプチド反応後、固相合成では未反応アミノ酸等との分離のために洗浄除去などを行っていたが、本発明では、第一溶媒溶液と第二溶媒溶液とが相分離する温度に冷却すればよい。このことで、１ａｆは分離された第一の溶媒（Ａ）に溶解されたＡ１ａｆとして、第二溶媒溶液から分離される。その分離状態で第二溶媒溶液を排除する。
【００３４】
排除される第二溶媒溶液中には、過剰に投入したため未反応で残留したＲ１残基アミノ酸、および反応副生物などが溶解している。この分離操作は、従来と比較にならない単純操作であり、かつ不純物の混入もきわめて少ない。したがってクロマトグラフィ等による精製工程も省略が可能である。
【００３５】
分離状態にある第一・第二溶媒溶液にて、第二溶媒溶液を排除するのであるが、この排除操作で第一溶媒溶液だけが残留することが重要である。したがって歩留まりは悪くなるが、第二溶媒溶液と共に、多少の第一溶媒溶液も排除してもかまわない。残留した第一溶媒溶液には、１にＲ１残基アミノ酸Ｃ末端が結合した１ａｆが溶解している（Ａ１ａｆ）。
【００３６】
次の工程である図５では、第一溶媒溶液中の可溶性担体１とＲ１残基アミノ酸が結合した物質１ａｆのアミノ末端を保護しているＦｍｏｃを除去して活性化（図５中の１０）する。図４同様に、Ｎ末端を保護したＲ２残基アミノ酸１２を、あらかじめ第二の溶媒に溶解し、第二溶媒溶液Ｂ１２として準備し、これら第一溶媒溶液Ａ１ａと第二溶媒溶液Ｂ１２とを混合する。同様に第二溶媒溶液Ｂ１２は過剰に混合されるのが好ましい。
【００３７】
その混合後、再び混合液を相溶化温度に加熱して、相溶状態で溶液中の１ａと、Ｒ２残基アミノ酸Ｃ末端をペプチド結合させる（図５中の１１）。その結果、相溶化溶液中に可溶性担体１にＲ１、Ｒ２残基ペプチドが結合した物質１ｂｆができる。
【００３８】
上記ペプチド反応後、第一溶媒溶液と第二溶媒溶液とが相分離する温度に冷却し、１ｂｆを分離された第一溶媒溶液に溶解されたＡ１ｂｆとし、第二溶媒溶液から分離する。その分離状態で第二溶媒溶液を排除する。同様に第二溶媒溶液と共に、多少の第一溶媒溶液も排除してもかまわない。
【００３９】
次の工程である図６も同様に、第一溶媒溶液中の可溶性担体１とＲ１、Ｒ２残基ペプチドが結合した物質１ｂｆのアミノ末端を保護しているＦｍｏｃを除去して活性化（図６中の１０）する。同様に、Ｎ末端を保護したＲ３残基アミノ酸１２を、あらかじめ第二の溶媒に溶解し、第二溶媒溶液Ｂ１２として準備し、これら第一溶媒溶液Ａ１ｂと第二溶媒溶液Ｂ１２とを混合する。
【００４０】
その混合後、再び混合液を相溶化温度に加熱して、相溶状態で溶液中の１ｂと、Ｒ３残基アミノ酸Ｃ末端をペプチド結合させる（図６中の１１）。その結果、相溶化溶液中に可溶性担体１にＲ１、Ｒ２、Ｒ３残基ペプチドが結合した物質１ｃｆができる。以下同様の操作でペプチドを伸長させていく。
【００４１】
このように一連のペプチド結合を行い、それが完了したら、ペプチドＣ末端を可溶性担体から必要に応じて開裂し、同じく必要に応じて保護基を除去したり付加したりする。このクリーベイジ（ｃｌｅａｖａｇｅ）工程は固相合成と同様である。すなわち、可溶性担体に結合したペプチドは、そのまま使用時まで低温保存してもよいし、結合部分を開裂させる公知の化合物ないしは酵素試薬をもちいて結合を切り離し保存してもよい。開裂後のペプチドＮ末端は、そのまま保存してもよいし公知の保護基を結合してもよい。
【００４２】
固相合成との大きな相違は、溶媒に溶解された溶液での反応であるので、ペプチド合成の個々のペプチド結合での未反応がきわめて少ないことである。したがって、多少は過剰に加えるものの、固相合成のように１００倍といった大量の反応試薬を過剰に投入しなくともよい。液相反応なので当然反応時間も短縮される。
【００４３】
また、溶媒を染料等で着色するなどして、目的の反応の進行を色によって確認することもできる。さらにまた、反応槽などからなる後述の装置のスケールアップも通常の液相プロセス同様に容易に可能となる。
【００４４】
Ｒ１をバリン（Ｖａｌ）、Ｒ２をグリシン（Ｇｌｙ）、Ｒ３をフェニルアラニン（Ｐｈｅ）とした図４から図６のペプチド液相合成を実施した結果、収率は９５％、９７％、９９％であった。収率１００％とならないのは、可溶性担体または可溶性担体とアミノ酸系物質との結合物質が、第二の溶媒に全く溶解しないと言うのではない（難溶性である）ためである。
【００４５】
＜液相ペプチド合成装置＞
液相ペプチド合成装置の第一例を図１に示す。本案の液相ペプチド合成装置は、液体担体と第一の溶媒を供給する手段（図１では省略）、および結合前処理後のアミノ酸を第二の溶媒に溶解した、第二溶媒溶液を供給する手段（図１の５）に連結され、液体担体または液体担体とアミノ酸系物質との結合物質を第一の溶媒に溶解した、第一溶媒溶液と、供給された第二溶媒溶液とを混合する混合槽（図１の３）と、前記混合槽の温度を、混合された第一溶媒溶液と第二溶媒溶液が相溶状態となる温度、または混合された第一溶媒溶液と第二溶媒溶液が相分離状態となる温度に制御する混合槽の温度制御手段（図１の６）と、前記混合槽の第一溶媒溶液／第二溶媒溶液の界面を検知する界面検知手段（図１の２０）と、該手段によって得られる界面位置に基づいて第二溶媒溶液の量を判定し、その判定量に基づいて混合槽から第二溶媒溶液を排除する手段（図１の７）とを有する。
【００４６】
ここで、アミノ酸とは、アミノ酸残基に任意化合物が結合したアミノ酸誘導物質を含むものであり、アミノ酸系物質とは、単一のアミノ酸あるいはペプチドであり、結合前処理とは、合成すべきペプチドを構成するアミノ酸のアミノ基側末端を不活性化、カルボキシル基側を活性化する処理である。
【００４７】
合成工程の初期にて、液体担体と第一の溶媒を供給する手段（図１では省略）によって、あらかじめ液体担体を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液を混合槽３に供給する。あるいは、液体担体、第一の溶媒をそれぞれ個別に供給して混合槽３で溶解してもよい。説明の簡単のため、液体担体を１とし、第一の溶媒をＡ、第一の溶媒に液体担体を溶解した第一溶媒溶液をＡ１と記載する。
【００４８】
第二の溶媒をＢと記載し、Ｎ末端に保護基Ｆｍｏｃなどを結合した結合前処理後のアミノ酸を１２と記載し、１２をＢに溶解した、第二溶媒溶液をＢ１２と記載する。合成工程の初期に、混合槽３に供給されたＡ１にＢ１２が供給され混合される。
【００４９】
混合槽３には、温度制御手段６が配備されている。これは公知の加熱ヒータや湯浴や高温ガスによる加熱装置、ぺルチェ素子や冷浴や低温ガスによる冷却装置を任意に採用すればよい。なお図１にて、Ａ０は任意物質を溶解した第一溶媒溶液を示す。Ａ０には、Ａ１、Ａ１ａ、Ａ１ａｆ、Ａ１ｂ、Ａ１ｂｆ、Ａ１ｃ、Ａ１ｃｆ　が例として含まれる。これらの意味は符号の説明の項を参照のこと。
【００５０】
混合槽３へＢ１２を供給する手段５が、３に連結されており、これはＢ１２の準備槽４からＢ１２を移送する流路（配管）５ａ、流路開閉手段（バルブ等）および移送ポンプ５ｂなどで構成されている。図１に示すように複数の準備槽を配備し、結合前処理後の異なったアミノ酸を第二の溶媒Ｂに溶解させ、あらかじめ準備しておくと便利である。（ここで、この準備槽に本案で提案される試薬を準備しておけばさらに便利である。これについては後で説明する。）
【００５１】
すなわち、図１のごとく複数のＢ１２の準備槽４から、逐次合成すべき結合前処理後のアミノ酸を選択的に混合槽３へ供給される構成が好適である。
【００５２】
混合槽３を加熱して第一・第二溶媒を相溶状態としてペプチド合成反応が行われる。この反応の終了は、たとえば溶媒の着色などによる反応マーカで確認することもできる。もちろん、供給量と反応時間のデータをあらかじめ採取しておき、反応時間で反応終了を判定してもよい。その判定後、相溶化温度より低温である任意の温度に冷却して相分離状態とする。（この溶媒の着色については、本案では「担体の添加物」として提案する。これについては後で説明する。）
【００５３】
相分離状態で、第一溶媒溶液／第二溶媒溶液の界面を検知する界面検知手段２０で、第一溶媒溶液／第二溶媒溶液の界面を検知する。界面の位置がわかれば、既知である混合槽の形状、容量にて、第二溶媒溶液の量の判定は容易である。よって界面位置に基づいて第二溶媒溶液の量を判定する。
【００５４】
前記第二溶媒溶液の判定量に基づいて、混合槽３より第二溶媒溶液を排除手段７で排除する。この排除の量は、第二溶媒溶液が完全に排除されるように、前記判定された第二溶媒溶液量よりも多少多めが好適である。図１の７ａは７の一部で、第二溶媒溶液を排除する流路（配管）、流路開閉手段（バルブ等）、ポンプなどである。
【００５５】
第一溶媒溶液／第二溶媒溶液の界面を検知する界面検知手段２０は、たとえば図２のように混合槽３内に挿入される溶媒物性センサーのプローブ（探触子）２０ａ、２０ａのセンサーヘッド２０ｂとからなるものであって、センサーヘッド電極間の導電率など溶液の電気特性を検出し、その相違で界面を検出するもの等を採用すればよい。なお、２０ｃは２０ａの内部電気配線である。
【００５６】
図３は、図中に第一溶媒溶液／第二溶媒溶液の界面を検知する界面検知手段２０を別の例とした本案装置の第二例（温度制御手段６は省略した）である。図３中の２０ｅは、光（放射エネルギー）発生器であり、２０ｆは、光（放射エネルギー）受信器である。この受信器で溶液の光学特性、エネルギー透過特性を検知し、その相違で界面を検出する。
【００５７】
界面検知を容易とするために、一方の溶媒に染料を添加して着色するなどすれば上記の光学的界面検知手段は有効であろう。なお図９中、混合槽３の部分のＢ０は、反応後の第二溶媒溶液で未反応の１２、その他の副産物も第二の溶媒に溶解しているのでＢ０（任意物質を溶解した第二溶媒溶液）と記載した。
【００５８】
【発明が解決しようとする課題】
本案は、以上説明した液相合成プロセスにて好適なアミノ酸試薬を提供し、液相合成のプロセスの効率を向上させることを課題とする。具体的には、開示された液相合成法にて図４に示されるような可溶性担体にＲ１残基アミノ酸を結合する反応を省略して効率向上させる。また本案は、多様なペプチドの種類に対応したペプチドの多品種少量生産にも対応すべく合成すべきペプチドのＣ末端アミノ酸原料の選択を容易にする。さらにまた、本案は液相合成プロセスの重要な工程である相分離における第二溶媒溶液の排除にて必要な第一・第二溶媒溶液の界面の検知を容易にする。
【００５９】
【課題を解決するための手段】
本案は、温度により相溶状態と相分離状態とが可逆的に変化する第一の溶媒と第二の溶媒の組み合わせを用いて、第一の溶媒に対し可溶性であり、第二の溶媒に対し難溶性である担体に合成すべきペプチドのアミノ酸を逐次ペプチド結合させる液相ペプチド合成において用いられるアミノ酸試薬であって、第一の溶媒への溶解性を高める部分を具備して可溶性であり、かつ、アミノ酸と結合する官能基を具備した前記担体のアミノ酸官能基に、合成すべきペプチドＣ末端アミノ酸が結合した液相ペプチド合成用アミノ酸試薬である。
【００６０】
本案試薬の構成要素である担体（可溶化担体）については、特願２００１−３８５４９３「相溶性−多相有機溶媒システムによりアミノ酸を逐次的に付加する液相ペプチド合成法」、特願２００２−１９８２４２「液相ペプチド合成装置」にて開示されたものと同様であり本明細書の従来技術の項の説明と重複するが、下記のようである。
【００６１】
すなわち担体は第一の溶媒としてシクロアルカン系の化合物を選定した場合には、一般式Ａ（化１、化４）で表される芳香族炭化水素環からなる基本骨格化合物であり、担体が具備する第一の溶媒への溶解性を高める部分は、一般式Ａ（化１、化４）の（ＲＸ）ｎで表される炭素数１０以上の炭化水素基をもつ親シクロアルカン系溶媒部分である。（ＲＸ）ｎのＲは、Ｏ、Ｓ、またはＮを結合原子として含んでいても良い炭素数１０以上の炭化水素基であり、（ＲＸ）ｎのＸはＯ、Ｃ、Ｓ、またはＮを介して芳香族炭化水素環に結合する任意の残基があっても良い結合部、または、エステル基、イミノ基を介して芳香族炭化水素環に結合する結合部であり、（ＲＸ）ｎのｎは、芳香族炭化水素環の結合部位の制約で１から５の整数である。
【００６２】
担体が具備するアミノ酸官能基は、一般式Ａ（化１、化４）においてＬ１で示される、アミノ酸と結合する水酸基、チオール基、アミノ基、またはカルボニル基と結合する単結合などである。また担体が具備するアミノ酸と結合する官能基は、炭素数が１０以上の炭化水素基の分枝鎖および／または置換基として、（ＲＸ）ｎの一部にあってもよい。一般式Ａ（化１、化４）で表される化合物が、一般式群Ｂ（化２、化５）であって、その一部が一般式Ｃ（化３、化５）の基でもよい。
【００６３】
本案液相ペプチド合成用アミノ酸試薬は、合成すべきペプチドＣ末端アミノ酸のＮ末端に保護基が結合されたものであれば、望ましくない反応からＮ末端を保護できるので保存に好適である。保護基については、Ｆｍｏｃ　（９−ｆｌｏｕｒｅｎｙｌｍｅｔｈｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）　またはｔ−Ｂｏｃ　（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）などが好適である。
【００６４】
以上の構成により本案試薬は、図５にて「１ａ」で示される可溶性担体とＲ１残基アミノ酸の結合物質、あるいは図４にて「１ａｆ」で示される１ａのＲ１残基アミノ酸のＮ末端に保護基Ｆｍｏｃが結合した物質である。これを試薬として用意すれば、液相合成のプロセスの効率向上できる。具体的には、図４に示されるような可溶性担体にＲ１残基アミノ酸を結合する反応を省略して効率向上できる。本案試薬を用いれば、これを混合槽に入れるだけで図４の８に示されるプロセスが省略される効果が得られる。合成装置においては、図１に示される複数の準備槽のいずれかに本案試薬をあらかじめ準備しておき、合成のイニシャルプロセスでその準備槽から混合槽へ本案試薬を移送するだけでよいことになる。
【００６５】
【発明の実施の形態】
本案液相ペプチド合成用アミノ酸試薬を実施するにあたって実用的な２、３の形態を説明する。まずアミノ酸の種類が多いので、本案試薬もその数だけできることになりこれらを取り違えやすい。担体と結合したアミノ酸の種類ごとに色分けされるなどで目視弁別しやすいほうが望ましい。すなわち一般的には、本試薬担体に結合したアミノ酸の種類に応じて物性の異なった添加物を混合し、該添加物の物性によって、アミノ酸の種類を弁別できるようにしたら便利である。たとえば、添加物が色素であれば色で目視弁別できるのでマニュアル作業では便利である。また、蛍光材、光学的透過率、反射率、屈折率の違う光学材料物質を添加して、それらの違いでそういった光学センサーによって弁別しても良い。これはロボット技術を用いた自動合成装置で有効である。さらに同様に導電物質を添加して導電度センサーで自動弁別しても良い。
【００６６】
また、本案は液相合成プロセスの重要な工程である相分離における第二溶媒溶液の排除にて必要な第一・第二溶媒溶液の界面の検知に利用することもできる。すなわち、第一の溶媒と第二の溶媒との物性の差にもとづいて両溶媒の相違を強調する添加物を混合しておけば、該添加物の物性によって相分離状態の界面検出をより容易にできる。ここにおいて添加物が相分離状態で第一・第二溶媒のいずれかに滞留することが望ましいが、第一溶媒が低極性溶媒、第二の溶媒が高極性溶媒であることから、いずれかに滞留する特性を得るものを適宜選定すればよい。これは、たとえば担体同様の第一の溶媒への溶解性を高める部分を添加物に導入すれば実現できる。
【００６７】
すなわち、添加物が第一の溶媒または第二の溶媒への溶解性を高める部分を具備し、かつその添加物の物性が検知可能であれば、分離状態の第一・第二溶媒溶液の界面の検知が可能である。特に第一の溶媒が、シクロアルカン系の化合物からなる場合には、前に記載したように第一の溶媒への溶解性を高める部分がＲＸで表される炭素数が１０以上の炭化水素基をもつ親シクロアルカン系溶媒部分であり、Ｒは、Ｏ、Ｓ、またはＮを結合原子として含んでいても良い炭素数１０以上の炭化水素基であり、ＸはＯ、Ｃ、Ｓ、またはＮを介して該添加物の他の部分に結合する任意の残基があっても良い結合部、または、エステル基、イミノ基を介して該添加物の他の部分に結合する結合部であれがよい。これらＲ、Ｘについては図７、図８、図９を参照のこと。
【００６８】
上記界面検知のために混合する添加物の例は、色素を含む光学材料物質、または導電物質であり、添加物が色素であれば色で界面を目視弁別できるのでマニュアル作業では便利である。また、蛍光材、光学的透過率、反射率、屈折率の違う光学材料物質を添加して、それらの違いでそういった光学センサーによって界面を検出しても良い。これはロボット技術を用いた自動合成装置で有効である。さらに同様に導電物質を添加して導電度センサーで界面検出しても良い。
【００６９】
本試薬に、第一の溶媒と第二の溶媒との物性の差にもとづいて両溶媒の相違を強調する添加物を混合し、該添加物の物性によって、相分離状態の界面を検出する装置としては、図２に図示されるセンサーヘッド、あるいは図３に図示される光・放射線のセンサーで上記の検出をおこなえばよい。
【００７０】
相溶状態としてペプチド合成反応が行われるが、この反応の過程や反応の終了は、たとえば溶媒の着色などによる反応マーカで確認することもできる。この反応マーカも本試薬の添加物として添加しても良い。もちろん、色素以外の光学材料物質、または導電物質を反応マーカとして添加しても良い。合成反応の過程や終了でかかる添加物の物性が変化し、それを外部から検知できる種類の反応性物質を反応マーカとして選定し、適宜添加すれば良く、上記で説明したごとく自動装置に配備されたセンサーで添加した反応マーカの物性を検知するなどの装置構成を採用すればよい。その具体例は省略する。
【００７１】
【発明の効果】
本案は、以上説明した液相合成プロセスにて好適なアミノ酸試薬を提供し、液相合成のプロセスの効率向上を課題とする。具体的には、開示された液相合成法にて図４に示されるような可溶性担体にＲ１残基アミノ酸を結合する反応を省略して効率向上させる。また本案は、多様なペプチドの種類に対応したペプチドの多品種少量生産にも対応すべく合成すべきペプチドのＣ末端アミノ酸原料の選択を容易にする。さらにまた、本案は液相合成プロセスの重要な工程である相分離における第二溶媒溶液の排除にて必要な第一・第二溶媒溶液の界面の検知を容易にする。
【００７２】
本案試薬を用いることで、本案試薬を混合槽に入れるだけで図４の８に示されるプロセスが省略される効果が得られる。たとえば図１に示される複数の準備槽のいずれかに本案試薬をあらかじめ準備しておき、合成のイニシャルプロセスでその準備槽から混合槽へ本案試薬を移送するだけでよい。
【図面の簡単な説明】
【図１】液相ペプチド合成装置の第一例
【図２】液体導電率センサーヘッド
【図３】液相ペプチド合成装置の第二例（温度制御手段６は省略した）
【図４】可溶性担体１にＲ１残基アミノ酸を結合する反応フロー図
【図５】可溶性担体１とＲ１残基アミノ酸が結合した物質１ａｆのＦｍｏｃを除去活性化し、Ｒ２残基アミノ酸を結合する反応フロー図
【図６】可溶性担体１とＲ１、Ｒ２残基アミノ酸鎖が結合した物質１ｂｆのＦｍｏｃを除去活性化し、Ｒ３残基アミノ酸を結合する反応フロー図
【図７】一般式Ａ（化１、化４）の（ＲＸ）ｎのＲの具体例
【図８】一般式Ａ（化１、化４）の（ＲＸ）ｎのＸの具体例であってＯ、Ｓ、またはＮを介して芳香族炭化水素環に結合する任意の残基があっても良い結合部、または、エステル基、イミノ基を介して芳香族炭化水素環に結合する例
【図９】一般式Ａ（化１、化４）の（ＲＸ）ｎのＸの具体例であって、Ｃを介して芳香族炭化水素環に結合する任意の残基があっても良い結合部の例
【符号の説明】
１　可溶性担体の例
１ａ　可溶性担体とＲ１残基アミノ酸の結合物質（本案の試薬）
１ａｆ　１ａのＲ１残基アミノ酸のＮ末端に保護基Ｆｍｏｃが結合した物質（本案の試薬）
１ｂ　可溶性担体とＲ１、Ｒ２残基アミノ酸の結合物質
１ｂｆ　１ｂのＲ２残基アミノ酸のＮ末端に保護基Ｆｍｏｃが結合した物質
１ｃ　可溶性担体とＲ１、Ｒ２、Ｒ３残基アミノ酸の結合物質
１ｃｆ　１ｃのＲ３残基アミノ酸のＮ末端に保護基Ｆｍｏｃが結合した物質
３　第一溶媒溶液と第二溶媒溶液とを混合する混合槽
４　第二の溶媒に、結合前処理後のアミノ酸を溶解した、第二溶媒溶液Ｂ１２の準備槽
５　第二溶媒溶液Ｂ１２を混合槽３に供給する手段
５ａ　５の一部で、第二溶媒溶液の移送流路（配管）
５ｂ　５の一部で、流路開閉手段（バルブ等）および移送ポンプなど
６　合成槽３の温度制御手段
７　第二溶媒溶液の量を２０より得られる界面位置から判定して混合槽３から排除する手段
７ａ　７の一部で、第二溶媒溶液を排除する流路（配管）、流路開閉手段（バルブ等）、ポンプなど
８　液相担体にＲ１残基アミノ酸のＮ末端に保護基Ｆｍｏｃを結合したＲ１残基アミノ酸を結合
する反応
１０　Ｎ末端の保護基であるＦｍｏｃ等を除去して活性化する操作
１１　活性化されたＮ末端部分に１２をペプチド結合反応させる操作
１２　Ｎ末端に保護基Ｆｍｏｃなどを結合した結合前処理後のアミノ酸
２０　第一溶媒溶液／第二溶媒溶液の界面を検知する界面検知手段
２０ａ　合成槽３内に挿入される溶媒物性センサーのプローブ（探触子）
２０ｂ　２０ａのセンサーヘッドの例で、２０ａの先端に配設された電気特性測定電極
２０ｃ　２０ａの内部電気配線
２０ｅ　光（放射エネルギー）発生器
２０ｆ　光（放射エネルギー）受信器
Ａ　第一の溶媒
Ａ０　任意物質を溶解した第一溶媒溶液
Ａ１　可溶性担体を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１ａ　可溶性担体とＲ１残基アミノ酸との結合物質（１ａ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１ａｆ　１ａに保護基を結合した物質（１ａｆ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１ｂ　可溶性担体とＲ１、Ｒ２残基アミノ酸との結合物質（１ｂ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１ｂｆ　１ｂに保護基を結合した物質（１ｂｆ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１ｃ　可溶性担体とＲ１、Ｒ２、Ｒ３残基アミノ酸鎖の結合物質（１ｃ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１ｃｆ　１ｃに保護基を結合した物質（１ｃｆ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
媒溶液
Ｂ　第二の溶媒
Ｂ０　任意物質を溶解した第二溶媒溶液
Ｂ１２　１２を第二の溶媒に溶解した第二溶媒溶液
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３　合成すべきペプチド鎖を構成するアミノ酸残基[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an amino acid reagent used in a liquid-phase peptide synthesizer (Japanese Patent Application No. 2002-198242) that suitably uses a combination of solvents in which a compatible state and a phase-separated state change reversibly with temperature.
[0002]
[Prior art]
It goes without saying that peptide synthesis technology is important in a wide range of fields such as medicine, pharmacy, and biology. Peptides in which amino acids are peptide-bonded in a specific order are involved in an extremely large number of studies such as studies on antigen-antibody interactions, studies on peptide antigens used for clinical diagnosis, and studies on various genes. The activity of a protein, whether immunized or infected, is determined by a peptide of at most 5 to 10 amino acids. Therefore, the synthesis of that part is very important and in great demand for research.
[0003]
Of course, peptides having 10 or more amino acids are also important. The limit of the number of bonds (residue number) of a peptide that can be synthesized is about 50, and a technique for synthesizing a peptide exceeding the limit of the number of amino acid bonds is also desired. If the efficacy of specific proteins and peptides is verified as a result of research, mass demand for peptides for pharmaceuticals such as chemically synthesized vaccines will arise. Therefore, there is a strong demand for a peptide mass production technology that can meet a large demand on a commercial scale.
[0004]
Solid phase synthesis, in which amino acids are chemically linked to a solid surface, has become the mainstream of peptide synthesis at present. However, this solid phase peptide synthesis method (Solid Phase Peptide Synthesis method) has the following disadvantages. First, since a chemical reaction must be performed on the solid surface, the reagent is less likely to approach the solid surface, and the reaction is less likely to occur as compared with the liquid phase reaction. That is, the solid carrier is a molecule that is extremely large compared to the amino acid, and it is necessary to bind the amino acid to a very small reaction part of the macromolecule, but this is unlikely to occur stochastically. Therefore, a large amount of expensive amino acid reaction reagents must be supplied. Usually about 100 times the reaction amount is supplied. As a result, a large amount of reaction reagents that cannot participate in the reaction is generated and wasted.
[0005]
Second, since the (n + 1) th amino acid binds to the unreacted portion of the nth amino acid in the next binding step as the nth amino acid, it becomes an impurity which is not a desired peptide. Even if such unreacted reactions occur in only 5% of the individual coupling reactions, the synthesis of a peptide of 50 amino acids (residues) results in a final yield of only 7.7% (0%). .95 to the 50th power). Even 30 amino acids (residues) are 21.5% (0.95 to the 30th power). For this reason, there is a problem in production efficiency that the reaction time must be longer than necessary. In addition, in solid-phase peptide synthesis, it is not possible to easily confirm that the target reaction has proceeded. There is a problem that the solid phase carrier is expensive and cannot be reused (disposable).
[0006]
As described above, the solid-phase synthesis method was an epoch-making method that made it possible to reliably bind desired amino acids one by one using a solid carrier, but had drawbacks in terms of mass productivity. Many. Thus, the inventor has developed a new method for synthesizing peptides in the liquid phase while securing the advantages of the solid phase synthesis method. Japanese Patent Application No. 2001-254109, "Compatibility-Multiphase Organic Solvent System", Japanese Patent Application No. 2001-385493, "Liquid Phase Peptide Synthesis Method for Sequentially Adding Amino Acids Using Compatibility-Multiphase Organic Solvent System", Japanese Patent Application 2002 -198242 "liquid phase peptide synthesizer," and "A liquid-phase peptide synthesis in cyclohexane-based biphasic thermomorphic systems", Kazuhiro Chiba, Yusuke Kono, shokaku Kim, Kohsuke Nishimoto, Yoshikazu Kitano and Masahiro Tada ,. Chem. Commun. , 2002, (Advanced Article), The Royal Society of Chemistry, 1766-1767, 2002. (First published on the web 15th July 2002).
[0007]
Prior to solid-phase synthesis, liquid-phase synthesis of peptides had been performed. However, after the spread of solid phase synthesis, it was no longer mainstream. Hereinafter, the term “liquid phase synthesis” indicates the technique disclosed by the present inventor in the above patent. The liquid phase peptide synthesis method will be described.
[0008]
<Solvent set for liquid phase peptide synthesis>
Japanese Patent Application No. 2001-254109 “Compatibility—Multiphase Organic Solvent System” discloses a set (combination) of a first solvent and a second solvent in which a compatible state and a phase-separated state are reversibly changed depending on temperature. Have been. Here, each of the first solvent and the second solvent may be a mixed solvent of a plurality of solvents.
[0009]
A solvent set suitable for liquid-phase peptide synthesis includes one solvent, as disclosed in Japanese Patent Application No. 2001-385493, "Liquid-phase peptide synthesis method for sequentially adding amino acids by a compatible-multiphase organic solvent system". Alternatively, the organic solvent constituting the mixed solvent (first solvent) is a cycloalkane-based compound.
[0010]
The first solvent is basically a low-polarity organic solvent, and as a group of compounds constituting the solvent, alkanes, cycloalkanes, alkenes, alkynes, aromatic compounds and the like, among which preferred are cycloalkane-based compounds And "cyclohexane" as a particularly preferred compound. It can be speculated that the conversion of the chair-boat conformer of cyclohexane is related to the relatively mild thermal conditions occurring with other solvents. Cyclohexane has a relatively high melting point of 6.5 ° C., and has the advantage of solidifying and separating the product after the reaction, and has an advantage also in the recovery step as the final step. The description of the recovery step is omitted.
[0011]
On the other hand, the organic solvent constituting the other solvent or the mixed solvent (second solvent) combined with the first solvent is basically a highly polar organic solvent. Preferred are those composed of at least one selected from the group consisting of nitroalkanes, nitriles, alcohols, alkyl halides, amide compounds and sulfoxides.
[0012]
More specifically, the second solvent has a nitroalkane alkyl group having 1, 2 or 3 carbon atoms, a nitrile alkyl group having 1, 2 or 3 carbon atoms, and an amide compound having N- The total number of carbon atoms of the alkyl group and acyl group or formyl group of the dialkyl or N-monoalkylamide is 6 or less, the alcohol has 8 or less carbon atoms, and the alkyl group of the sulfoxide has 1, 2 or 3 carbon atoms. And the alkyl group of the alkyl halide has 6 or less carbon atoms.
[0013]
The above-mentioned solvent set of the first solvent and the second solvent is reversibly changed depending on temperature into a state of a homogeneously compatible mixed solvent system (compatible state) and a state of a separated solvent system separated into a plurality of phases (phase separation state). ) Can be taken reversibly.
[0014]
<Soluble carrier (liquid carrier)>
Now, Japanese Patent Application No. 2001-385493 (liquid-phase peptide synthesis method) proposes a liquid-phase peptide synthesis method in which amino acids are sequentially added using the above-mentioned solvent set. What is a "soluble carrier (liquid carrier)" corresponding to a solid carrier for solid phase peptide synthesis. This corresponds to the description in Japanese Patent Application No. 2001-254109 (solvent system) as “a chemical component involved in a reaction in which only one of the first solvent and the second solvent is dissolved”.
[0015]
That is, it is a liquid carrier derived from a compound that is soluble in the first solvent and hardly soluble in the second solvent, and that binds to the amino acid-based substance. (Here, “amino acid-based substance” includes a single amino acid or an amino acid residue, and a peptide in which a plurality of amino acids are peptide-bonded.) This carrier is liquid in a reaction state, but may be solid at room temperature. Good. The function is equivalent to that of a solid carrier. For comparison, in Japanese Patent Application No. 2002-198242 "Liquid phase peptide synthesizer", it was referred to as "liquid carrier", but is herein referred to as "soluble carrier". Hereinafter, the soluble carrier will be described.
[0016]
Replacing the solid-phase surface reaction of the prior art with a liquid-phase reaction can improve the problem of poor reactivity (the solid support is a very large molecule compared to amino acids and it is difficult to access the reaction site). . Furthermore, if the above-mentioned solvent set for phase separation is used properly, the obtained reaction product can be very easily separated. The realization of the liquid-phase peptide synthesis method having such epoch-making advantages requires a soluble carrier corresponding to a solid carrier for solid-phase peptide synthesis, and the inventors have found this. The soluble carrier requires the following functions.
[0017]
That is, the soluble carrier has a binding portion with an amino acid that initiates peptide formation, can carry a peptide chain that is extended by binding amino acids sequentially, and further has a compound that binds to an amino acid and a compound that carries a peptide chain during synthesis. Is dissolved in the first solvent. That is, the carrier only needs to be soluble with a portion that enhances solubility in the first solvent and have a functional group that binds to an amino acid.
[0018]
Candidate compounds of soluble carriers having these functions (compounds having a cycloalkane-based solvent moiety and a functional group that binds to an amino acid) include a basic compound having an aromatic hydrocarbon ring represented by the following general formula A (Formula 4). It is a skeletal compound. Here, the portion of the carrier that enhances the solubility in the first solvent should be a parent cycloalkane-based compound having a hydrocarbon group having 10 or more carbon atoms represented by (RX) n of the general formula A (Formula 4). The solvent part.
[0019]
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[0020]
R of (RX) n is a hydrocarbon group having 10 or more carbon atoms which may contain O, S, or N as a bonding atom, and X of (RX) n represents O, C, S, or N. A bond that may have an arbitrary residue bonded to the aromatic hydrocarbon ring through a bond, or a bond that is bonded to the aromatic hydrocarbon ring through an ester group or an imino group; n is an integer of 1 to 5. FIG. 7 shows an example of R, and FIGS. 8 and 9 show an example of X. These descriptions are omitted.
[0021]
In the general formula A (Formula 4), L1 is a single bond bonded to a hydroxyl group, a thiol group, an amino group, or a carbonyl group bonded to an amino acid, an atomic group bonded to the hydroxyl group, a thiol group, an amino group, or a carbonyl group. Or an atomic group forming a two-ring condensed aromatic ring by combining with a dotted line. Further, in the general formula A (Formula 4), a dotted line is a bond with H or a bond of an atomic group which forms the condensed aromatic ring by bonding with L1.
[0022]
Furthermore, the functional group that binds to the amino acid to be provided in the carrier may be a branched chain or a substituent of the hydrocarbon group having 10 or more carbon atoms, or may be a hydrocarbon group having 10 or more carbon atoms. It may be in the branch and substituent of the hydrogen group.
[0023]
The general formula A (Chemical formula 4) is more specifically selected from the following general formula group B (Chemical formula 5). In the general formula group B (Chemical formula 5), X, R and n are the same as those in the general formula A (Chemical formula 4). Q ₁ Is a single bond or a hydrocarbon group; ₂ Is a hydroxyl group, a thiol group, an amino group, or a carbonyl group bonded to an amino acid; ₃ And R ₄ Is a group of the general formula C (Formula 6). Further, R of the general formula C (Chem. 6) ₅ Is a hydroxyl group, a thiol group, an amino group, or a carbonyl group bonded to an amino acid. (Where R ₂ , R ₃ , R ₄ , R ₅ Note that is not identical to R1, R2, R3 described below. )
[0024]
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[0025]
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[0026]
The first solvent described above dissolves the soluble carrier and the binding substance between the soluble carrier and the amino acid-based substance in a separated state, but dissolves the amino acid not bound to the soluble carrier (the amino acid to be peptide-bonded). Not (slightly soluble). Here, the amino acid-based substance is a single amino acid or a peptide.
[0027]
Conversely, the second solvent dissolves amino acids (amino acids to be peptide-bonded) in a separated state, but does not dissolve (slightly soluble) the soluble carrier and the binding substance between the soluble carrier and the amino acid-based substance. have.
[0028]
A preferred specific example of the soluble carrier is shown in FIG. 1 is a compound represented by the general formula group B, wherein R is C ₁₈ H ₃₇ , X is O, n is 3, Q is CH ₂ And R ₂ Is OH. The name is (3,4,5-trioctadecyloxyphenyl) methane-1-ol, [(3,4,5-trioctadecyloxyphenyl) methan-1-ol]. The soluble carrier 1 is derived from a compound that is soluble in the first solvent and hardly soluble in the second solvent, and binds to an amino acid-based substance.
[0029]
<Solution-phase peptide synthesis method>
The number of the soluble carrier is not limited to one, but the method of synthesizing the liquid phase peptide of the present inventor will be described below using the specific example of the soluble carrier. FIGS. 4 to 6 are explanatory diagrams of the liquid phase peptide synthesis of the present invention in which the solid support in the solid phase peptide synthesis method is replaced with the soluble support 1.
[0030]
FIG. 4 shows the reaction of binding the C-terminus of amino acid 12 of R1 residue amino acid 12 protected at the N-terminus and activated at the C-terminus (to which an activating group X is attached) to soluble carrier 1 (8 in FIG. 4). FIG. Here, the soluble carrier 1 is in a state of a solution called a first solvent solution (A1) in which 1 is dissolved in the first solvent (A), and the R1 residue amino acid 12 is previously prepared in the second solvent (B). And prepared as a second solvent solution (B12). (The notations A, B, A1, and B12 are omitted in FIGS. 4 to 6.)
[0031]
A first solvent solution (A1) in which 1 is dissolved in the first solvent (A) is mixed with a second solvent solution (B12) in which R1 residue amino acid 12 is dissolved in a second solvent (B). Is done. It is preferable that the second solvent solution (B12) is introduced in a slightly excessive amount. The reason is that if the first solvent solution is relatively large, even if all peptide reactions occur, the carrier having unreacted ends remains. This is the same as the solid phase synthesis method, but it is not necessary to add 100 times the required amount as in the solid phase synthesis method.
[0032]
After mixing both solutions, they are heated to a temperature at which they become compatible. Then, since the terminal of the soluble carrier 1 is a hydroxyl group bonded to an amino acid, a peptide bond reaction (8 in FIG. 4) with the C terminal of the amino acid at the R1 residue results in 1af. This 1af is also dissolved in both solvents in the compatibilized state.
[0033]
After the peptide reaction, in solid phase synthesis, washing and removal were performed for separation from unreacted amino acids and the like, but in the present invention, if the first solvent solution and the second solvent solution are cooled to a temperature at which phase separation occurs, Good. As a result, 1af is separated from the second solvent solution as A1af dissolved in the separated first solvent (A). In the separated state, the second solvent solution is eliminated.
[0034]
In the second solvent solution to be eliminated, the R1 residue amino acid, the reaction by-product, and the like which have remained unreacted due to the excessive addition are dissolved. This separation operation is a simple operation that is incomparable with the conventional one, and contains very little impurities. Therefore, the purification step by chromatography or the like can be omitted.
[0035]
In the first and second solvent solutions in the separated state, the second solvent solution is excluded. It is important that only the first solvent solution remains in this removing operation. Therefore, although the yield is deteriorated, some first solvent solution may be excluded together with the second solvent solution. In the remaining first solvent solution, 1af in which the R1 residue amino acid C-terminal is bonded to 1 is dissolved (A1af).
[0036]
In the next step, FIG. 5, activation is performed by removing Fmoc protecting the amino terminus of the substance 1af in which the soluble carrier 1 and the R1 residue amino acid are bound in the first solvent solution (10 in FIG. 5). I do. Similarly to FIG. 4, the R2-residue amino acid 12 having the N-terminal protected is dissolved in a second solvent in advance to prepare a second solvent solution B12, and the first solvent solution A1a and the second solvent solution B12 are mixed. I do. Similarly, the second solvent solution B12 is preferably mixed in excess.
[0037]
After the mixing, the mixed solution is heated again to the compatibilizing temperature, and 1a in the solution and the C-terminal of the R2 residue amino acid are peptide-bonded in the compatible state (11 in FIG. 5). As a result, a substance 1bf in which the R1 and R2 residue peptides are bound to the soluble carrier 1 in the compatibilizing solution is formed.
[0038]
After the peptide reaction, the mixture is cooled to a temperature at which the first solvent solution and the second solvent solution are phase-separated, and 1bf is converted into A1bf dissolved in the separated first solvent solution, and separated from the second solvent solution. In the separated state, the second solvent solution is eliminated. Similarly, some first solvent solution may be excluded along with the second solvent solution.
[0039]
Similarly, in the next step, FIG. 6, the Fmoc protecting the amino terminus of the substance 1bf in which the soluble carrier 1 and the R1 and R2 residue peptides are bound in the first solvent solution is removed and activated (FIG. 6). Of 10). Similarly, the R3 residue amino acid 12 whose N-terminal is protected is dissolved in a second solvent in advance to prepare a second solvent solution B12, and the first solvent solution A1b and the second solvent solution B12 are mixed.
[0040]
After the mixing, the mixed solution is heated again to the compatibilization temperature, and 1b in the solution and the C-terminal of the amino acid at the R3 residue are peptide-bonded in the compatible state (11 in FIG. 6). As a result, a substance 1cf in which the R1, R2, and R3 residue peptides are bound to the soluble carrier 1 in the compatibilizing solution is formed. Hereinafter, the peptide is extended by the same operation.
[0041]
In this manner, a series of peptide bonds is performed, and upon completion, the peptide C-terminal is cleaved as necessary from the soluble carrier, and the protecting group is removed or added as necessary. This cleavage step is similar to solid phase synthesis. That is, the peptide bound to the soluble carrier may be stored as it is at low temperature until use, or the peptide may be cut off and stored using a known compound or enzyme reagent that cleaves the binding portion. The N-terminus of the peptide after cleavage may be preserved as it is, or may be bound with a known protecting group.
[0042]
The major difference from solid phase synthesis is that there is very little unreacted individual peptide bond in peptide synthesis, as it is a reaction in a solution dissolved in a solvent. Therefore, although it is added in a slightly excessive amount, it is not necessary to excessively inject a large amount of reaction reagent such as 100 times as in solid phase synthesis. Since it is a liquid phase reaction, the reaction time is naturally shortened.
[0043]
The progress of the desired reaction can also be confirmed by color, for example, by coloring the solvent with a dye or the like. Furthermore, the scale-up of an apparatus described below including a reaction tank or the like can be easily performed in the same manner as in a normal liquid phase process.
[0044]
As a result of performing the peptide liquid phase synthesis shown in FIGS. 4 to 6 using R1 as valine (Val), R2 as glycine (Gly), and R3 as phenylalanine (Phe), the yields were 95%, 97%, and 99%. Was. The reason why the yield is not 100% is not that the soluble carrier or the binding substance of the soluble carrier and the amino acid-based substance is not completely dissolved in the second solvent (it is hardly soluble).
[0045]
<Liquid phase peptide synthesizer>
FIG. 1 shows a first example of a liquid-phase peptide synthesizer. The liquid-phase peptide synthesizer of the present invention supplies means for supplying a liquid carrier and a first solvent (omitted in FIG. 1), and supplies a second solvent solution in which the amino acid after the pretreatment for binding is dissolved in a second solvent. A first solvent solution in which a liquid carrier or a binding substance of a liquid carrier and an amino acid-based substance is dissolved in a first solvent, and a supplied second solvent solution is connected to means (5 in FIG. 1). The temperature of the mixing tank (3 in FIG. 1) and the mixing tank is set to a temperature at which the mixed first solvent solution and second solvent solution become compatible, or the mixed first solvent solution and second solvent solution Temperature control means (6 in FIG. 1) for controlling the temperature of the mixing vessel to a phase separation state, and interface detection means (20 in FIG. 1) for detecting the interface of the first solvent solution / second solvent solution in the mixing vessel. ) And determining the amount of the second solvent solution based on the interface position obtained by the means. And means (7 in FIG. 1) to eliminate the second solvent solution from the mixing tank on the basis of the determination amount.
[0046]
Here, an amino acid includes an amino acid derivative in which an arbitrary compound is bonded to an amino acid residue, an amino acid-based substance is a single amino acid or a peptide, and a pre-bonding treatment is a peptide to be synthesized. Is a process for inactivating the amino group side terminal of the amino acid constituting the above and activating the carboxyl group side.
[0047]
At the beginning of the synthesis step, a first solvent solution in which the liquid carrier is previously dissolved in the first solvent is supplied to the mixing tank 3 by means for supplying the liquid carrier and the first solvent (omitted in FIG. 1). Alternatively, the liquid carrier and the first solvent may be individually supplied and dissolved in the mixing tank 3. For the sake of simplicity, the liquid carrier is referred to as 1, the first solvent is referred to as A, and the first solvent solution obtained by dissolving the liquid carrier in the first solvent is referred to as A1.
[0048]
The second solvent is described as B, the amino acid after the pre-binding treatment in which a protecting group Fmoc or the like is bonded to the N-terminus is described as 12, and the second solvent solution obtained by dissolving 12 in B is described as B12. At the beginning of the synthesis step, B12 is supplied to A1 supplied to the mixing tank 3 and mixed.
[0049]
The mixing tank 3 is provided with a temperature control means 6. For this, a known heater, a heating device using a hot water bath or a high-temperature gas, a Peltier element, a cooling device using a cold bath or a low-temperature gas may be arbitrarily employed. In FIG. 1, A0 indicates a first solvent solution in which an arbitrary substance is dissolved. A0 includes A1, A1a, A1af, A1b, A1bf, A1c, and A1cf as examples. See the description of the sign for the meaning of these.
[0050]
A means 5 for supplying B12 to the mixing tank 3 is connected to 3, and includes a flow path (piping) 5a for transferring B12 from the preparation tank 4 for B12, a flow path opening / closing means (valve or the like), and a transfer pump 5b. It is composed of As shown in FIG. 1, it is convenient to provide a plurality of preparation tanks, dissolve different amino acids after the pretreatment for binding in the second solvent B, and prepare them in advance. (Here, it is more convenient to prepare the reagent proposed in the present invention in this preparation tank. This will be described later.)
[0051]
That is, as shown in FIG. 1, it is preferable that a plurality of B12 preparation tanks 4 are selectively supplied to the mixing tank 3 from the pre-bonding amino acids to be sequentially synthesized.
[0052]
The peptide synthesizing reaction is carried out by heating the mixing tank 3 to make the first and second solvents compatible. Completion of this reaction can also be confirmed by a reaction marker obtained by coloring the solvent, for example. Of course, the data of the supply amount and the reaction time may be collected in advance, and the end of the reaction may be determined based on the reaction time. After the determination, the mixture is cooled to an arbitrary temperature lower than the compatibilization temperature to be in a phase separated state. (This coloring of the solvent is proposed in the present invention as a "carrier additive", which will be described later.)
[0053]
In the phase separation state, the interface between the first solvent solution and the second solvent solution is detected by the interface detecting means 20 for detecting the interface between the first solvent solution and the second solvent solution. If the position of the interface is known, it is easy to determine the amount of the second solvent solution using the known shape and volume of the mixing tank. Therefore, the amount of the second solvent solution is determined based on the interface position.
[0054]
The second solvent solution is removed from the mixing tank 3 by the removing means 7 based on the determination amount of the second solvent solution. The amount of the elimination is preferably slightly larger than the determined amount of the second solvent solution so that the second solvent solution is completely eliminated. In FIG. 1, reference numeral 7a denotes a part of a flow path (pipe) for removing the second solvent solution, a flow path opening / closing means (a valve or the like), a pump, and the like.
[0055]
The interface detecting means 20 for detecting the interface between the first solvent solution and the second solvent solution is, for example, a sensor head of a solvent physical property sensor inserted into the mixing tank 3 as shown in FIG. 20b, which detects the electrical properties of the solution such as the electrical conductivity between the sensor head electrodes and detects the interface based on the difference. 20c is an internal electric wiring of 20a.
[0056]
FIG. 3 shows a second example (the temperature control means 6 is omitted) of the apparatus of the present invention in which the interface detecting means 20 for detecting the interface between the first solvent solution and the second solvent solution is another example. In FIG. 3, 20e is a light (radiant energy) generator, and 20f is a light (radiant energy) receiver. This receiver detects the optical characteristics and energy transmission characteristics of the solution, and detects the interface based on the difference.
[0057]
The above-mentioned optical interface detecting means would be effective if a dye is added to one of the solvents and colored to make the interface detection easier. In FIG. 9, B0 in the portion of the mixing tank 3 is unreacted 12 in the second solvent solution after the reaction, and other byproducts are also dissolved in the second solvent. Solvent solution).
[0058]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a suitable amino acid reagent in the above-described liquid phase synthesis process and to improve the efficiency of the liquid phase synthesis process. Specifically, the efficiency of the disclosed liquid phase synthesis method is improved by omitting the reaction of binding the R1 residue amino acid to the soluble carrier as shown in FIG. Further, the present invention facilitates selection of a C-terminal amino acid raw material of a peptide to be synthesized in order to cope with high-mix low-volume production of peptides corresponding to various peptide types. Furthermore, the present invention facilitates the detection of the interface between the first and second solvent solutions required in the elimination of the second solvent solution in phase separation, which is an important step in the liquid phase synthesis process.
[0059]
[Means for Solving the Problems]
The present invention uses a combination of a first solvent and a second solvent in which a compatible state and a phase-separated state change reversibly depending on temperature, is soluble in the first solvent, and is soluble in the second solvent. An amino acid reagent used in liquid-phase peptide synthesis in which amino acids of a peptide to be synthesized are sequentially peptide-bonded to a poorly soluble carrier, which is soluble with a portion that enhances solubility in a first solvent, and An amino acid reagent for liquid-phase peptide synthesis, wherein a C-terminal amino acid of a peptide to be synthesized is bonded to an amino acid functional group of the carrier having a functional group that binds to an amino acid.
[0060]
Regarding the carrier (solubilizing carrier) which is a component of the reagent of the present invention, Japanese Patent Application No. 2001-385493, "Liquid-phase peptide synthesis method for sequentially adding amino acids by a compatible-multiphase organic solvent system", Japanese Patent Application No. 2002-198242. It is the same as that disclosed in "Liquid phase peptide synthesizer" and overlaps with the description of the prior art section of this specification, but is as follows.
[0061]
That is, when a cycloalkane-based compound is selected as the first solvent, the carrier is a basic skeleton compound composed of an aromatic hydrocarbon ring represented by the general formula A (Chemical Formula 1, Chemical Formula 4). The portion that enhances the solubility in the first solvent is a cycloalkane-based solvent portion having a hydrocarbon group having 10 or more carbon atoms represented by (RX) n in the general formula A (Chemical Formula 1, Chemical Formula 4). is there. R of (RX) n is a hydrocarbon group having 10 or more carbon atoms which may contain O, S, or N as a bonding atom, and X of (RX) n represents O, C, S, or N. A bond that may have an arbitrary residue bonded to the aromatic hydrocarbon ring through a bond, or a bond that is bonded to the aromatic hydrocarbon ring through an ester group or an imino group; n is an integer of 1 to 5 due to the restriction of the binding site of the aromatic hydrocarbon ring.
[0062]
The amino acid functional group included in the carrier is a single bond bonded to an amino acid, a hydroxyl group, a thiol group, an amino group, or a carbonyl group represented by L1 in the general formula A (Chemical Formula 1, Chemical Formula 4). The functional group that binds to the amino acid of the carrier may be a part of (RX) n as a branched chain and / or a substituent of a hydrocarbon group having 10 or more carbon atoms. The compound represented by the general formula A (Chemical formula 1, Chemical formula 4) may be a general formula group B (Chemical formula 2, Chemical formula 5), and a part thereof may be a group of the general formula C (Chemical formula 3, Chemical formula 5). .
[0063]
The amino acid reagent for synthesizing a liquid phase peptide of the present invention is suitable for storage as long as a protecting group is bonded to the N-terminal of the C-terminal amino acid of the peptide to be synthesized, since the N-terminal can be protected from undesired reactions. As the protective group, Fmoc (9-fluorenylmethylcarbonyl) or t-Boc (tert-butyloxycarbonyl) is suitable.
[0064]
With the above configuration, the reagent of the present invention can be used as a binding substance between the soluble carrier represented by "1a" in FIG. 5 and the R1 residue amino acid, or the N-terminal of the R1 residue amino acid of 1a represented by "1af" in FIG. It is a substance to which the protecting group Fmoc is bonded. If this is prepared as a reagent, the efficiency of the liquid phase synthesis process can be improved. Specifically, efficiency can be improved by omitting the reaction of binding the R1 residue amino acid to a soluble carrier as shown in FIG. When the reagent of the present invention is used, an effect that the process shown in FIG. In the synthesis device, the reagent of the present invention is prepared in advance in any of the plurality of preparation tanks shown in FIG. 1, and the reagent of the present invention only needs to be transferred from the preparation tank to the mixing tank in the initial process of synthesis. .
[0065]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
A few practical embodiments for implementing the amino acid reagent for liquid phase peptide synthesis of the present invention will be described. First, since there are many types of amino acids, the reagents of the present invention can be formed in the same number, and these can be easily mixed. It is desirable that visual discrimination is easy, for example, by color-coding for each type of amino acid bound to the carrier. That is, in general, it is convenient to mix additives having different physical properties according to the type of amino acid bound to the present reagent carrier, so that the type of amino acid can be discriminated based on the physical properties of the additive. For example, if the additive is a pigment, it can be visually discriminated by color, which is convenient for manual work. Alternatively, a fluorescent material, an optical material having an optical transmittance, a reflectance, and a refractive index different from each other may be added, and the difference may be discriminated by such an optical sensor. This is effective in an automatic synthesizer using robot technology. Further, a conductive substance may be added in the same manner and the conductivity may be automatically discriminated by a conductivity sensor.
[0066]
The present invention can also be used to detect the interface between the first and second solvent solutions required for eliminating the second solvent solution in phase separation, which is an important step in the liquid phase synthesis process. That is, if an additive that emphasizes the difference between the two solvents is mixed based on the difference between the physical properties of the first solvent and the second solvent, it is easier to detect an interface in a phase separation state by the physical properties of the additive. Can be. Here, it is desirable that the additive stays in one of the first and second solvents in a phase-separated state, but the first solvent is a low-polarity solvent, and the second solvent is a high-polarity solvent. What satisfies the property of staying may be appropriately selected. This can be achieved, for example, by introducing a portion of the additive that enhances solubility in the first solvent as in the case of the carrier.
[0067]
That is, if the additive has a portion that enhances the solubility in the first solvent or the second solvent, and if the physical properties of the additive can be detected, the interface between the separated first and second solvent solutions is provided. Can be detected. In particular, when the first solvent is a cycloalkane-based compound, as described above, the portion that enhances the solubility in the first solvent is a hydrocarbon group having 10 or more carbon atoms represented by RX. R is a hydrocarbon group having 10 or more carbon atoms which may contain O, S, or N as a bonding atom, and X is O, C, S, or N. Or a bond that may be bound to any other portion of the additive through an ester group or an imino group. Good. See FIG. 7, FIG. 8, and FIG. 9 for these R and X.
[0068]
An example of the additive mixed for the interface detection is an optical material containing a dye or a conductive material. If the additive is a dye, the interface can be visually discriminated by color, which is convenient in manual work. Alternatively, a fluorescent material, an optical material having an optical transmittance, a reflectance, and a refractive index different from each other may be added, and the interface may be detected by such an optical sensor based on the difference. This is effective in an automatic synthesizer using robot technology. Further, similarly, a conductive substance may be added and the interface may be detected by a conductivity sensor.
[0069]
An apparatus for detecting an interface in a phase-separated state by mixing an additive that emphasizes the difference between the two solvents based on the difference in physical properties between the first solvent and the second solvent, based on the physical properties of the first solvent and the second solvent. The above detection may be performed by the sensor head shown in FIG. 2 or the light / radiation sensor shown in FIG.
[0070]
The peptide synthesis reaction is carried out in a compatible state, and the course of the reaction and the end of the reaction can be confirmed by a reaction marker, for example, by coloring the solvent. This reaction marker may also be added as an additive to the present reagent. Of course, an optical material other than a dye or a conductive material may be added as a reaction marker. The physical properties of such additives change during the course or end of the synthesis reaction, and a reactive substance of a type that can be detected from the outside is selected as a reaction marker, and may be added as appropriate, and is provided in an automatic device as described above. An apparatus configuration such as detecting the physical properties of the added reaction marker with the added sensor may be adopted. Specific examples thereof are omitted.
[0071]
【The invention's effect】
An object of the present invention is to provide a suitable amino acid reagent in the liquid phase synthesis process described above, and to improve the efficiency of the liquid phase synthesis process. Specifically, the efficiency of the disclosed liquid phase synthesis method is improved by omitting the reaction of binding the R1 residue amino acid to the soluble carrier as shown in FIG. Further, the present invention facilitates selection of a C-terminal amino acid raw material of a peptide to be synthesized in order to cope with high-mix low-volume production of peptides corresponding to various peptide types. Furthermore, the present invention facilitates the detection of the interface between the first and second solvent solutions required in the elimination of the second solvent solution in phase separation, which is an important step in the liquid phase synthesis process.
[0072]
The use of the reagent of the present invention has the effect of omitting the process shown in FIG. 4 by simply putting the reagent of the present invention into the mixing tank. For example, it is only necessary to prepare the reagent of the present invention in any of the plurality of preparation tanks shown in FIG. 1 and transfer the reagent of the present invention from the preparation tank to the mixing tank in the initial process of synthesis.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a first example of a liquid-phase peptide synthesizer.
FIG. 2 is a liquid conductivity sensor head.
FIG. 3 shows a second example of a liquid-phase peptide synthesizer (temperature control means 6 is omitted).
FIG. 4 is a reaction flow diagram for binding an R1 residue amino acid to a soluble carrier 1.
FIG. 5 is a reaction flow chart for removing and activating Fmoc of substance 1af in which soluble carrier 1 and R1 residue amino acid are bound, and binding R2 residue amino acid.
FIG. 6 is a reaction flow chart for removing and activating Fmoc of substance 1bf in which soluble carrier 1 and amino acid chains of R1 and R2 residues are bound, and binding R3 residue amino acids.
FIG. 7 is a specific example of R of (RX) n in the general formula A (Chemical Formula 1, Chemical Formula 4).
FIG. 8 is a specific example of X of (RX) n in the general formula A (Chemical Formula 1, Chemical Formula 4), in which any residue bonded to an aromatic hydrocarbon ring via O, S, or N is present. Example of bonding to an aromatic hydrocarbon ring via a bonding moiety or an ester group or an imino group
FIG. 9 is a specific example of X of (RX) n in the general formula A (Chemical Formula 1, Chemical Formula 4), in which any residue may be bonded via C to an aromatic hydrocarbon ring. Example of department
[Explanation of symbols]
1. Examples of soluble carriers
1a Binding substance of soluble carrier and R1 residue amino acid (reagent of the present invention)
1af A substance in which a protecting group Fmoc is bound to the N-terminal of the R1 residue amino acid of 1a (reagent of the present invention)
1b Binding substance of soluble carrier and R1, R2 residue amino acids
1bf Substance in which a protecting group Fmoc is bound to the N-terminal of the R2 residue amino acid of 1b
1c Binding substance between soluble carrier and R1, R2, R3 residue amino acids
1cf A substance in which a protecting group Fmoc is bonded to the N-terminal of R3 residue amino acid of 1c
3 Mixing tank for mixing the first solvent solution and the second solvent solution
4 Preparation tank for the second solvent solution B12 in which the amino acid after the pre-binding treatment is dissolved in the second solvent
5 means for supplying the second solvent solution B12 to the mixing tank 3
5a In a part of 5, the transfer channel (piping) of the second solvent solution
5b Part of 5, including flow path opening / closing means (valves, etc.) and transfer pumps
6 Temperature control means for synthesis tank 3
7 means for judging the amount of the second solvent solution from the interface position obtained from 20, and excluding it from the mixing tank 3
7a A part of 7, a flow path (pipe) for removing the second solvent solution, a flow path opening / closing means (valve, etc.), a pump, etc.
8 R1 residue amino acid with protecting group Fmoc bound to N terminal of R1 residue amino acid bound to liquid phase carrier
Reaction
Operation to remove 10N-terminal protecting group such as Fmoc and activate
11 An operation for peptide-bonding 12 to the activated N-terminal part
12 Amino acids after pre-binding treatment in which a protecting group Fmoc or the like is bound to the N-terminal
20 Interface detecting means for detecting the interface between the first solvent solution and the second solvent solution
20a Probe (probe) of the solvent physical property sensor inserted into the synthesis tank 3
20b is an example of a sensor head of 20a, and an electrical characteristic measuring electrode disposed at the tip of 20a.
20c 20a internal electrical wiring
20e Light (radiant energy) generator
20f light (radiant energy) receiver
A First solvent
A0 First solvent solution in which any substance is dissolved
A1 First solvent solution in which a soluble carrier is dissolved in a first solvent
A1a First solvent solution in which binding substance (1a) of soluble carrier and R1 residue amino acid is dissolved in first solvent
A1af A first solvent solution in which a substance (1af) in which a protecting group is bonded to 1a is dissolved in a first solvent.
A1b First solvent solution in which a binding substance (1b) of a soluble carrier and R1 and R2 residue amino acids is dissolved in a first solvent
A1bf First solvent solution in which substance (1bf) in which a protecting group is bonded to 1b is dissolved in a first solvent
A1c First solvent solution in which a soluble carrier and a binding substance (1c) of amino acid chains of R1, R2, and R3 residues are dissolved in a first solvent
A1cf First solvent solution obtained by dissolving substance (1cf) in which protecting group is bonded to 1c in first solvent
Medium solution
B Second solvent
B0 Second solvent solution in which any substance is dissolved
B12 A second solvent solution in which 12 is dissolved in a second solvent
R1, R2, R3 Amino acid residues constituting the peptide chain to be synthesized

Claims

Using a combination of a first solvent and a second solvent in which a compatible state and a phase-separated state are reversibly changed depending on temperature, the compound is soluble in the first solvent and hardly soluble in the second solvent. A reagent used in liquid-phase peptide synthesis in which amino acids of a peptide to be synthesized are sequentially peptide-bonded to a certain carrier, wherein the carrier has a portion that enhances solubility in a first solvent, and is soluble, and An amino acid reagent for synthesizing a liquid phase peptide, wherein the carrier has a functional group that binds to an amino acid, and the amino acid binds to a functional group that binds to the amino acid of the carrier.

2. The amino acid reagent for liquid phase peptide synthesis according to claim 1, wherein the C-terminal of the amino acid is bonded to the functional group that binds to the amino acid of the carrier, and the protecting group is bonded to the N-terminal of the amino acid.

The first solvent is a cycloalkane-based compound, the carrier is a basic skeleton compound composed of an aromatic hydrocarbon ring represented by the following general formula A, and the carrier is dissolved in the first solvent. The portion that enhances the property is a cycloalkane-based solvent portion having a hydrocarbon group having 10 or more carbon atoms represented by (RX) n of the following general formula A bonded to an aromatic hydrocarbon ring, and R is , O, S, or N is a hydrocarbon group having 10 or more carbon atoms which may contain a bonding atom, and X is any group bonded to an aromatic hydrocarbon ring via O, C, S, or N. The liquid phase peptide according to claim 1, which is a bonding part which may have a residue, or a bonding part bonded to an aromatic hydrocarbon ring via an ester group or an imino group, and n is an integer of 1 to 5. Synthetic amino acid reagents

[In the general formula A, L1 represents a single bond bonded to a hydroxyl group, a thiol group, an amino group, or a carbonyl group bonded to an amino acid, an atomic group bonded to the hydroxyl group, a thiol group, an amino group, or a carbonyl group, or a dotted line. Is an atomic group that forms a condensed two-ring aromatic ring by bonding to Further, in the general formula A, the dotted line is a bond to H or a bond of an atomic group forming the condensed aromatic ring by bonding to L1. ]

4. The amino acid reagent for synthesizing a liquid phase peptide according to claim 3, wherein the functional group that binds to the amino acid provided in the carrier is a branched chain and / or a substituent of a hydrocarbon group having 10 or more carbon atoms.

4. The amino acid reagent according to claim 3, wherein the compound represented by the general formula A is selected from the following general formula group B:

[In the general formula group B, X, R and n are the same as in the general formula A. Q ₁ is a single bond or a hydrocarbon group, R ₂ is a hydroxyl group, a thiol group, an amino group, or a carbonyl group bonded to an amino acid, and R ₃ and R ₄ are groups of the following general formula C . ]

[R ₅ is a hydroxyl group, a thiol group, an amino group, or a carbonyl group bonded to an amino acid. ]

4. The liquid phase peptide according to claim 3, wherein the carbon number and / or n of R in (RX) n of general formula A is determined based on the number of amino acids of the peptide to be synthesized, the amino acid species of the peptide, or the molecular weight of the peptide. Synthetic amino acid reagents

7. The amino acid reagent for liquid phase peptide synthesis according to claim 1, wherein an additive having different physical properties is mixed according to the type of the amino acid to discriminate the type of the amino acid bound to the carrier.

8. The liquid phase peptide synthesis according to claim 7, wherein the additive is an optical material or a conductive material containing a dye, and the physical properties of the additive that vary according to the type of amino acid are optical properties including color or electrical conductivity. Amino acid reagent

In order to detect the interface between the first solvent and the second solvent in a phase-separated state, an addition having a unique physical property, and a portion having a portion that enhances the solubility in the first solvent or the second solvent 7. An amino acid reagent for liquid-phase peptide synthesis according to claim 1, wherein the amino acid reagent is a mixture of the reagents.

10. The amino acid reagent for liquid phase peptide synthesis according to claim 9, wherein the additive is an optical material or a conductive material containing a dye, and the intrinsic property of the additive is an optical property including a color or electrical conductivity.

The first solvent is a cycloalkane-based compound, and the part of the additive that enhances solubility in the first solvent is a parent cycloalkyl having a hydrocarbon group having 10 or more carbon atoms represented by RX. An alkane-based solvent moiety, R is a hydrocarbon group having 10 or more carbon atoms which may contain O, S, or N as a bonding atom, and X is a group represented by O, C, S, or N; 11. The bonding portion according to claim 10, wherein the bonding portion may have any residue bonded to another portion of the additive, or a bonding portion bonded to another portion of the additive via an ester group or an imino group. Amino acid reagent for liquid phase peptide synthesis