【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、サイクロオキシゲナーゼ２を認識するペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
サイクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）は炎症などを引き起こすプロスタグランジンの合成酵素の一つとして知られる。従来の非ステロイド抗炎症剤はサイクロオキシゲナーゼ１（ＣＯＸ１）とサイクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ２）の両方を阻害した。ＣＯＸ１の阻害は上部消化管潰瘍や血小板凝集阻害作用などの副作用の原因となるのでＣＯＸ２だけを特異的に阻害する物質の開発が望まれていた。
【０００３】
また、ＣＯＸ２は、種々の癌組織において過剰に産生されることが報告されており、ＣＯＸ２と特異的に結合する試薬は、発癌メカニズムの解明に有用であると考えられる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＣＯＸ２のみに特異的に結合し、また、それを阻害する作用を持つ物質を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ＣＯＸ２と特異的に結合するペプチドを得ることに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すペプチドである。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、又は配列番号１２記載のアミノ酸配列により表されるペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、又は配列番号１２記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつＣＯＸ２を認識するペプチド
また、本発明は、上記ペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明のペプチドは、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すものである。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、又は配列番号１２記載のアミノ酸配列により表されるペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、又は配列番号１２記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつＣＯＸ２を認識するペプチド（ｂ）のペプチドにおける欠失等されたアミノ酸の個数は特に限定されないが、通常は７個以下であり、好ましくは５個以下であり、更に好ましくは２個以下である。
【０００９】
本発明のペプチドは、ＣＯＸ２と特異的に結合することから、ＣＯＸ２の検出に利用することができる。
【００１０】
また、本発明のペプチドのうち、ＣＯＸ２の酵素活性を阻害する作用を持つペプチドは、抗炎症剤として利用できる。
【００１１】
【実施例】
〔実施例１〕 ＣＯＸ２認識ペプチドを含むクローンの選択
精製したヒツジ由来ＣＯＸ２（Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）をポリスチレンのカラムに固相化し、次いで、２％カゼイン溶液によりＣＯＸ２の付着していない部分をブロッキングした。ランダムペプチドライブラリーを加え、１〜数時間反応させた。ランダムペプチドライブラリーは、ＮＥＢ社の＃８１２０Ｓ Ｐｈ．Ｄ． −Ｃ７ＣＴＭ Ｋｉｔを用いた。このライブラリーでは、９アミノ酸残基からなる約１０１０種類のペプチドがファージのコートタンパク質ＰＩＩＩと融合した状態で提示される。
【００１２】
反応終了後、０．０５〜０．５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（以下、「Ｔｗｅｅｎ ２０」という）含有ＰＢＳで１０〜数十回洗浄し、その後、５％カゼイン溶液を加え１〜数時間静置した。再びＴｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで洗浄したのち、トリエチルアミン（１００ｍＭ）を加え、１０分間、ゆっくりと室温にて揺すった後、半量の１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ７．４）を加えヴォルッテクスし、得られた画分を溶出画分とした。
【００１３】
溶出画分をＥ．ｃｏｌｉ （ＥＲ２５３７）に感染させ、ＩＰＴＧ−Ｘ Ｇａｌ プレート上に生育させた。そこから１００クローンを拾い培養した後、精製ＣＯＸ２固相化プレートを用いてＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡは、以下のように行った。まず、精製ＣＯＸ２（１０μｇ／ｍｌ， １００μｌ）をプレートに固定し、これにペプチド提示ファージ溶液（１００μｌ）を加え、室温で２時間静置した。次に、プレートを洗浄し、未結合のファージを取り除いた後、ペルオキシダーゼで標識された二次抗体（ファルマシア社製抗Ｍ１３ファージ抗体、２０００倍希釈）１００μｌを加え、室温で２時間静置した。プレートを洗浄後、ＡＢＴＳ基質溶液（フナコシ社製）を加え、発色させた。ＥＬＩＳＡの結果、ＣＯＸ２と強く反応するクローンが幾つかみつかった（クローンＮｏ．１〜６）。これらのクローンを含む溶液の吸光度、及びバックグラウンド（ＣＯＸ２をプレートに固定せず、他は同様の操作を行った。）の吸光度を図１に示す。
【００１４】
〔実施例２〕 ペプチドのアミノ酸配列の解析
実施例１でＣＯＸ２に対する反応性が確認されたクローン（クローンＮｏ．１〜６）の培養上清中に含まれるＤＮＡを、キアゲン社のＱＩＡｐｒｅｐ Ｍ１３システムにより精製した。得られたＤＮＡをエタノール沈殿し、配列解析の鋳型とした。ＡＢＩ社製３７００シークエンサーで配列を解析し、前記クローンが提示していたペプチドのアミノ酸配列を決定した。クローンＮｏ．１、２、３、４、５、６が提示していたペプチドのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２に示す。また、これらのペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列をそれぞれ１、３、５、７、９、１１に示す。
【００１５】
【発明の効果】
本発明のペプチドは、ＣＯＸ２の検出、定量等に有用である。
【００１６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のペプチドとＣＯＸ２との反応性を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a peptide recognizing cyclooxygenase 2 and a polynucleotide encoding the same.
[0002]
[Prior art]
Cyclooxygenase (COX) is known as one of prostaglandin synthases that cause inflammation and the like. Conventional non-steroidal anti-inflammatory drugs inhibited both cyclooxygenase 1 (COX1) and cyclooxygenase 2 (COX2). Since inhibition of COX1 causes side effects such as an upper gastrointestinal ulcer and an inhibitory action on platelet aggregation, development of a substance that specifically inhibits only COX2 has been desired.
[0003]
In addition, it has been reported that COX2 is excessively produced in various cancer tissues, and a reagent that specifically binds to COX2 is considered to be useful for elucidation of a carcinogenic mechanism.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a substance that specifically binds only to COX2 and has an action of inhibiting it.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, have succeeded in obtaining a peptide that specifically binds to COX2, and have completed the present invention.
[0006]
That is, the present invention is a peptide shown in the following (a) or (b).
(A) peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 12 (b) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 12, a peptide which is represented by an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and recognizes COX2. Is a polynucleotide encoding the peptide.
[0007]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0008]
The peptide of the present invention is as shown in the following (a) or (b).
(A) peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 12 (b) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 12, represented by an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and which recognizes COX2, The number of deleted amino acids in the peptide is not particularly limited, but is usually 7 or less, preferably 5 or less, and more preferably 2 or less.
[0009]
Since the peptide of the present invention specifically binds to COX2, it can be used for detection of COX2.
[0010]
Further, among the peptides of the present invention, peptides having an action of inhibiting the enzyme activity of COX2 can be used as anti-inflammatory agents.
[0011]
【Example】
[Example 1] A clone containing a COX2-recognizing peptide was selectively purified from a sheep-derived COX2 (manufactured by Alexis Biochemicals) and immobilized on a polystyrene column, and then a 2% casein solution was used to block the portion where COX2 was not attached. A random peptide library was added and reacted for one to several hours. The random peptide library was obtained from NEB # 8120S Ph. D. -The C7C ™ Kit was used. In this library, about 10 10 kinds of peptides consisting of 9 amino acid residues are displayed in a state of being fused with phage coat protein PIII.
[0012]
After the completion of the reaction, the plate was washed with PBS containing 0.05 to 0.5% polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate (hereinafter referred to as “Tween 20”) for 10 to several tens of times, and then a 5% casein solution was added. It was left for one to several hours. After washing with PBS containing Tween 20 again, triethylamine (100 mM) was added, the mixture was slowly shaken at room temperature for 10 minutes, and then half a volume of 1 M Tris-HCl buffer (pH 7.4) was added thereto, followed by vortexing. Was used as the elution fraction.
[0013]
The eluted fraction was used as E. coli. E. coli (ER2537) and grown on IPTG-X Gal plates. After 100 clones were picked and cultured, ELISA was performed using a purified COX2 solid-phased plate. The ELISA was performed as follows. First, purified COX2 (10 μg / ml, 100 μl) was immobilized on a plate, a peptide-displayed phage solution (100 μl) was added thereto, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 hours. Next, the plate was washed to remove unbound phage, and then 100 μl of a peroxidase-labeled secondary antibody (Pharmacia anti-M13 phage antibody, diluted 2000-fold) was added, and the plate was allowed to stand at room temperature for 2 hours. After washing the plate, an ABTS substrate solution (Funakoshi) was added to develop the color. As a result of ELISA, several clones that strongly reacted with COX2 were found (clone Nos. 1 to 6). FIG. 1 shows the absorbance of the solution containing these clones and the absorbance of the background (the same operation was performed except that COX2 was not immobilized on the plate, and the rest was performed).
[0014]
Example 2 Analysis of Amino Acid Sequence of Peptide The DNA contained in the culture supernatant of clones (clone Nos. 1 to 6) confirmed to have reactivity to COX2 in Example 1 was analyzed by QIAGEN's QIAprep M13 system. Purified. The obtained DNA was precipitated with ethanol and used as a template for sequence analysis. The sequence was analyzed using an ABI 3700 sequencer, and the amino acid sequence of the peptide presented by the clone was determined. Clone No. The amino acid sequences of the peptides presented by 1, 2, 3, 4, 5, and 6 are shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, and 12, respectively. The nucleotide sequences of the DNAs encoding these peptides are shown in 1, 3, 5, 7, 9, and 11, respectively.
[0015]
【The invention's effect】
The peptide of the present invention is useful for detection, quantification, etc. of COX2.
[0016]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the reactivity of a peptide of the present invention with COX2.