JP2004057194A - Weed control metabolic protein, its gene and its use - Google Patents

Abstract

で示される化合物を式ＩＩＩ

で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
【選択図】　なしA method for converting a weed-controlling compound to a compound having a lower controlling activity, or a new method for imparting a weed-controlling agent resistance to a target plant, for performing a treatment for inactivating residual liquids and residues. Provide what can be used for the development of methods, etc.
The present invention provides a DNA encoding a weed control metabolic protein selected from the following group. A protein having an amino acid sequence represented by a specific sequence, an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by the specific sequence or 90% or more of any amino acid sequence represented by the specific sequence; Having an amino acid sequence having sequence identity and having the formula II in the presence of an electron transfer system from an electron donor;

With a compound of formula III

A protein having an ability to convert into a compound represented by the formula:
[Selection diagram] None

Description

で示される化合物を式（ＩＩＩ）

で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２８）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓもしくはＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉの染色体ＤＮＡを鋳型とし配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
２．以下の群から選ばれる塩基配列を有するＤＮＡ；
＜塩基配列群＞
（ａ１）配列番号６で示される塩基配列。
（ａ２）配列番号７で示される塩基配列。
（ａ３）配列番号８で示される塩基配列。
（ａ４）配列番号１０９で示される塩基配列。
（ａ５）配列番号１３９で示される塩基配列。
（ａ６）配列番号１４０で示される塩基配列。
（ａ７）配列番号１４１で示される塩基配列。
（ａ８）配列番号１４２で示される塩基配列。
（ａ９）配列番号１４３で示される塩基配列。
（ａ１０）配列番号２２５で示される塩基配列。
（ａ１１）配列番号２２６で示される塩基配列。
（ａ１２）配列番号２２７で示される塩基配列。
（ａ１３）配列番号２２８で示される塩基配列。
（ａ１４）配列番号２２９で示される塩基配列。
（ａ１５）配列番号２３０で示される塩基配列。
（ａ１６）配列番号２３１で示される塩基配列。
（ａ１７）配列番号２３２で示される塩基配列。
（ａ１８）配列番号２３３で示される塩基配列。
（ａ１９）配列番号２３４で示される塩基配列。
（ａ２０）配列番号６、７、８または１０９で示される塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列であって、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（ａ２１）配列番号１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３または２３４で示される塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列であって、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
３．ＧＣ含量が６０％以下４０％以上であって、かつ蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列のコドン使用率が、当該ＤＮＡが導入される宿主細胞が属する生物種の遺伝子のコドン使用率のプラスマイナス４％の範囲内である塩基配列を有する前項１に記載のＤＮＡ；
４．配列番号２１４で示される塩基配列を有するＤＮＡ；
５．配列番号３６８で示される塩基配列を有するＤＮＡ；
６．配列番号３９３で示される塩基配列を有するＤＮＡ；
７．前項１に記載のＤＮＡの上流に、細胞内オルガネラへの移行シグナル配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡが、その読み枠を合わせて連結されてなるＤＮＡ；
８．前項１に記載のＤＮＡと宿主細胞で機能可能なプロモーターとが機能可能な形で結合されてなるＤＮＡ；
９．前項１に記載のＤＮＡを含有するベクター；
１０．宿主細胞内で複製可能なベクターに、前項１に記載のＤＮＡを組込む工程を有することを特徴とするベクターの製造方法；
１１．前項１に記載のＤＮＡが宿主細胞に導入されてなる形質転換体；
１２．宿主細胞が微生物細胞または植物細胞である前項１１に記載の形質転換体；
１３．宿主細胞に、前項１に記載のＤＮＡを導入する工程を有することを特徴とする形質転換体の製造方法；
１４．上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質を製造する方法であって、前項１１に記載の形質転換体を培養し、産生された前記蛋白質を回収する工程を有することを特徴とする方法；
１５．上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質を製造するための、前項１に記載のＤＮＡの使用；
１６．雑草防除剤に対する耐性を植物に付与する方法であって、前項１に記載のＤＮＡを植物の細胞に導入し発現させる工程を有することを特徴とする方法；
１７．前項１に記載のＤＮＡの部分塩基配列または該部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド；
１８．上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質をコードするＤＮＡを検出する方法であって、前項１に記載のＤＮＡまたは前項１７に記載のポリヌクレオチドをプローブに用いるハイブリダイゼーションにおいて当該プローブがハイブリダイズするＤＮＡを検出する工程を有することを特徴とする方法；
１９．上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質をコードするＤＮＡを検出する方法であって、前項１７に記載のポリヌクレオチドをプライマーに用いるポリメラーゼチェイン反応において増幅されるＤＮＡを検出する工程を有することを特徴とする方法；
２０．プライマーの少なくとも一つが、配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するポリヌクレオチドおよび配列番号１２９で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドからなる群から選ばれるポリヌクレオチドであることを特徴とする前項１９に記載の方法；
２１．上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質をコードするＤＮＡを取得する方法であって、前項１８または１９に記載の方法により検出されるＤＮＡを回収する工程を有することを特徴とする方法；
２２．上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質をコードするＤＮＡを有する細胞をスクリーニングする方法であって、被験細胞から、前項１８または１９に記載の方法により前記ＤＮＡを検出する工程を有することを特徴とする方法；
２３．以下の群から選ばれる雑草防除剤代謝蛋白質；
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２８）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓもしくはＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉの染色体ＤＮＡを鋳型とし配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
２４．以下の群から選ばれる雑草防除剤代謝蛋白質を認識する抗体；
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２８）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓもしくはＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉの染色体ＤＮＡを鋳型とし配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
２５．以下の群から選ばれる雑草防除剤代謝蛋白質を検出する方法であって、
（１）前記蛋白質を認識する抗体と被験試料とを接触させる工程、および
（２）該接触により生じた前記の蛋白質と前記抗体との複合体を検出する工程、
を有する方法：
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２８）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓもしくはＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉの染色体ＤＮＡを鋳型とし配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
２６．前項２４に記載の抗体を含むことを特徴とする分析・検査用キット；
２７．以下の群から選ばれるフェレドキシンをコードするＤＮＡ；
＜蛋白質群＞
（Ｂ１）配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２）配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ３）配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ４）配列番号１１１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ５）配列番号１２、１３、１４または１１１で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ６）配列番号１２、１３、１４または１１１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ７）配列番号１４９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ８）配列番号１５０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ９）配列番号１５１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１０）配列番号１５２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１１）配列番号１５３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１２）配列番号１４９、１５１、１５２、１５３、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、もしくは２５３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１５０、２５２もしくは２５４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ１３）配列番号１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３もしくは２５４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ１４）配列番号２４５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１５）配列番号２４７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１６）配列番号２４８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１７）配列番号２４９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１８）配列番号２５０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１９）配列番号２５１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２０）配列番号２５２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２１）配列番号２５３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２２）配列番号２５４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
２８．以下の群から選ばれる塩基配列を有するＤＮＡ；
＜塩基配列群＞
（ｂ１）配列番号１５で示される塩基配列。
（ｂ２）配列番号１６で示される塩基配列。
（ｂ３）配列番号１７で示される塩基配列。
（ｂ４）配列番号１１２で示される塩基配列。
（ｂ５）配列番号１５４で示される塩基配列。
（ｂ６）配列番号１５５で示される塩基配列。
（ｂ７）配列番号１５６で示される塩基配列。
（ｂ８）配列番号１５７で示される塩基配列。
（ｂ９）配列番号１５８で示される塩基配列。
（ｂ１０）配列番号２５５で示される塩基配列。
（ｂ１１）配列番号２５７で示される塩基配列。
（ｂ１２）配列番号２５８で示される塩基配列。
（ｂ１３）配列番号２５９で示される塩基配列。
（ｂ１４）配列番号２６０で示される塩基配列。
（ｂ１５）配列番号２６１で示される塩基配列。
（ｂ１６）配列番号２６２で示される塩基配列。
（ｂ１７）配列番号２６３で示される塩基配列。
（ｂ１８）配列番号２６４で示される塩基配列。
（ｂ１９）配列番号１５、１６、１７、１１２、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、２５５、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３または２６４で示される塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列。
２９．前項２８に記載のＤＮＡを含有するベクター；
３０．前項２８に記載のＤＮＡが宿主細胞に導入されてなる形質転換体；
３１．以下の群から選ばれるフェレドキシン；
＜蛋白質群＞
（Ｂ１）配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２）配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ３）配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ４）配列番号１１１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ５）配列番号１２、１３、１４または１１１で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ６）配列番号１２、１３、１４または１１１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ７）配列番号１４９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ８）配列番号１５０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ９）配列番号１５１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１０）配列番号１５２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１１）配列番号１５３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１２）配列番号１４９、１５１、１５２、１５３、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１もしくは２５３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１５０、２５２もしくは２５４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ１３）配列番号１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３もしくは２５４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ１４）配列番号２４５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１５）配列番号２４７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１６）配列番号２４８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１７）配列番号２４９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１８）配列番号２５０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１９）配列番号２５１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２０）配列番号２５２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２１）配列番号２５３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２２）配列番号２５４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
３２．以下の群から選ばれる塩基配列を有するＤＮＡ；
＜塩基配列群＞
（ａｂ１）配列番号９で示される塩基配列。
（ａｂ２）配列番号１０で示される塩基配列。
（ａｂ３）配列番号１１で示される塩基配列。
（ａｂ４）配列番号１１０で示される塩基配列。
（ａｂ５）配列番号１４４で示される塩基配列。
（ａｂ６）配列番号１４５で示される塩基配列。
（ａｂ７）配列番号１４６で示される塩基配列。
（ａｂ８）配列番号１４７で示される塩基配列。
（ａｂ９）配列番号１４８で示される塩基配列。
（ａｂ１０）配列番号２３５で示される塩基配列。
（ａｂ１１）配列番号２３６で示される塩基配列。
（ａｂ１２）配列番号２３７で示される塩基配列。
（ａｂ１３）配列番号２３８で示される塩基配列。
（ａｂ１４）配列番号２３９で示される塩基配列。
（ａｂ１５）配列番号２４０で示される塩基配列。
（ａｂ１６）配列番号２４１で示される塩基配列。
（ａｂ１７）配列番号２４２で示される塩基配列。
（ａｂ１８）配列番号２４３で示される塩基配列。
（ａｂ１９）配列番号２４４で示される塩基配列。
３３．前項３２に記載のＤＮＡを含有するベクター；
３４．前項３２に記載のＤＮＡが宿主細胞に導入されてなる形質転換体；
３５．宿主細胞が微生物細胞または植物細胞である前項３４に記載の形質転換体；
３６．宿主細胞に、前項３２に記載のＤＮＡを導入する工程を有することを特徴とする形質転換体の製造方法；
３７．上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質を製造する方法であって、前項３４に記載の形質転換体を培養し、産生された前記蛋白質を回収する工程を有することを特徴とする方法；
３８．以下の群から選ばれる１以上の雑草防除剤代謝蛋白質を発現する植物の栽培域に、以下の一般式（Ｉ）で示される化合物を施用する工程を有することを特徴とする雑草防除方法；

［式中、Ｇは以下のＧ−１〜９のいずれかで示される基を表す。

ここで、Ｘ　は酸素原子または硫黄原子を表し、
Ｙ　は酸素原子または硫黄原子を表し、
Ｒ^１　は水素原子またはハロゲン原子を表し、
Ｒ^２　は水素原子、Ｃ_１−Ｃ_８　アルキル基、Ｃ_１−Ｃ_８　ハロアルキル基、ハロゲン原子、水酸基、−ＯＲ^９　基、−ＳＨ　基、−Ｓ（Ｏ）ｐＲ^９　基、−ＣＯＲ^９　基、−ＣＯ_２Ｒ^９　基、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ^９　基、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１１Ｒ^１２　基、−ＣＯＮＨ_２基、−ＣＨＯ　基、−ＣＲ^９＝ＮＯＲ^１８　基、−ＣＨ＝ＣＲ^１９ＣＯ_２Ｒ^９　基、−ＣＨ_２ＣＨＲ^１９ＣＯ_２Ｒ^９　基、−ＣＯ_２Ｎ＝ＣＲ^１３Ｒ^１４　基、ニトロ基、シアノ基、−ＮＨＳＯ_２Ｒ^１５　基、−ＮＨＳＯ_２ＮＨＲ^１５　基、−ＮＲ^９Ｒ^２０　基、−ＮＨ_２　基、または、１つ以上の同種もしくは異種の　Ｃ_１−Ｃ_４アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表し、
ｐ　は　０、１　または　２　を表し、
Ｒ^３　は　Ｃ_１−Ｃ_２　アルキル基、Ｃ_１−Ｃ_２　ハロアルキル基、−ＯＣＨ_３　基、−ＳＣＨ_３　基、−ＯＣＨＦ_２基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、または　環上でハロゲン原子、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル基、Ｃ_１−Ｃ_３　ハロアルキル基、ＯＲ^２８基、ＮＲ^１１Ｒ^２８基、ＳＲ^２８基、シアノ基、ＣＯ_２Ｒ^２８基　または　ニトロ基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいフェニル基で置換されたＣ_１−Ｃ_３アルコキシ基を表し、
Ｒ^４　は水素原子、Ｃ_１−Ｃ_３　アルキル基、またはＣ_１−Ｃ_３　ハロアルキル基を表し、
Ｒ^５　は水素原子、Ｃ_１−Ｃ_３　アルキル基、Ｃ_１−Ｃ_３　ハロアルキル基、シクロプロピル基、ビニル基、Ｃ_２　アルキニル基、シアノ基、−Ｃ（Ｏ）Ｒ^２０　基、−ＣＯ_２Ｒ^２０　基、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ^２０Ｒ^２１　基、−ＣＲ^１６Ｒ^１７ＣＮ　基、−ＣＲ^１６Ｒ^１７Ｃ（Ｏ）Ｒ^２０　基、−ＣＲ^１６Ｒ^１７ＣＯ_２Ｒ^２０　基、−ＣＲ^１６Ｒ^１７Ｃ（Ｏ）ＮＲ^２０Ｒ^２１　基、−ＣＨＲ^１６ＯＨ　基、−ＣＨＲ^１６ＯＣ（Ｏ）Ｒ^２０　基、または　−ＯＣＨＲ^１６ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^２０Ｒ^２１　基を表すか、あるいは、Ｇ　が　Ｇ−２　もしくは　Ｇ−６　の場合に　Ｒ^４　とＲ^５とはこれらが結合している炭素原子とで　Ｃ＝Ｏ　基を表していてもよく、
Ｒ^６　は　Ｃ_１−Ｃ_６　アルキル基、Ｃ_１−Ｃ_６　ハロアルキル基、Ｃ_２−Ｃ_６　アルコキシアルキル基、Ｃ_３−Ｃ_６　アルケニル基、または　Ｃ_３−Ｃ_６　アルキニル基を表し、
Ｒ^７　は水素原子、Ｃ_１−Ｃ_６　アルキル基、Ｃ_１−Ｃ_６　ハロアルキル基、ハロゲン原子、−Ｓ（Ｏ）_２（Ｃ_１−Ｃ_６アルキル）基、または　−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^２２　基を表し、
Ｒ^８　は水素原子、Ｃ_１−Ｃ_８　アルキル基、Ｃ_３−Ｃ_８　シクロアルキル基、Ｃ_３−Ｃ_８　アルケニル基、Ｃ_３−Ｃ_８　アルキニル基、Ｃ_１−Ｃ_８　ハロアルキル基、Ｃ_２−Ｃ_８　アルコキシアルキル基、Ｃ_３−Ｃ_８　アルコキシアルコキシアルキル基、Ｃ_３−Ｃ_８　ハロアルキニル基、Ｃ_３−Ｃ_８　ハロアルケニル基、Ｃ_１−Ｃ_８　アルキルスルホニル基、Ｃ_１−Ｃ_８　ハロアルキルスルホニル基、Ｃ_３−Ｃ_８　アルコキシカルボニルアルキル基、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＨ（Ｃ_１−Ｃ_８　アルキル）基、−Ｃ（Ｏ）Ｒ^２３　基、またはフェニル環上で　Ｒ^２４　で置換されていてもよいベンジル基を表し、
Ｒ^９　は　Ｃ_１−Ｃ_８　アルキル基、Ｃ_３−Ｃ_８　シクロアルキル基、Ｃ_３−Ｃ_８　アルケニル基、Ｃ_３−Ｃ_８　アルキニル基、Ｃ_１−Ｃ_８　ハロアルキル基、Ｃ_２−Ｃ_８　アルコキシアルキル基、Ｃ_２−Ｃ_８　アルキルチオアルキル基、Ｃ_２−Ｃ_８　アルキルスルフィニルアルキル基、Ｃ_２−Ｃ_８　アルキルスルフォニルアルキル基、Ｃ_４−Ｃ_８　アルコキシアルコキシアルキル基、Ｃ_４−Ｃ_８　シクロアルキルアルキル基、Ｃ_４−Ｃ_８　シクロアルコキシアルキル基、Ｃ_４−Ｃ_８　アルケニルオキシアルキル基、Ｃ_４−Ｃ_８　アルキニルオキシアルキル基、Ｃ_３−Ｃ_８　ハロアルコキシアルキル基、Ｃ_４−Ｃ_８　ハロアルケニルオキシアルキル基、Ｃ_４−Ｃ_８　ハロアルキニルオキシアルキル基、Ｃ_４−Ｃ_８シクロアルキルチオアルキル基、Ｃ_４−Ｃ_８　アルケニルチオアルキル基、Ｃ_４−Ｃ_８　アルキニルチオアルキル基、
環上でハロゲン原子、Ｃ_１−Ｃ_３　アルキル基および　Ｃ_１−Ｃ_３　ハロアルキル基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいフェノキシ基で置換された　Ｃ_１−Ｃ_４　アルキル基、環上でハロゲン原子、Ｃ_１−Ｃ_３　アルキル基および　Ｃ_１−Ｃ_３　ハロアルキル基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいベンジルオキシ基で置換されたＣ_１−Ｃ_４　アルキル基、
Ｃ_４−Ｃ_８トリアルキルシリルアルキル基、Ｃ_２−Ｃ_８シアノアルキル基、Ｃ_３−Ｃ_８　ハロシクロアルキル基、Ｃ_３−Ｃ_８　ハロアルケニル基、Ｃ_５−Ｃ_８　アルコキシアルケニル基、Ｃ_５−Ｃ_８　ハロアルコキシアルケニル基、Ｃ_５−Ｃ_８　アルキルチオアルケニル基、Ｃ_３−Ｃ_８　ハロアルキニル基、Ｃ_５−Ｃ_８　アルコキシアルキニル基、Ｃ_５−Ｃ_８　ハロアルコキシアルキニル基、Ｃ_５−Ｃ_８　アルキルチオアルキニル基、Ｃ_２−Ｃ_８　アルキルカルボニル基、
環上でハロゲン原子、Ｃ_１−Ｃ_３　アルキル基、Ｃ_１−Ｃ_３　ハロアルキル基、−ＯＲ^２８基、−ＮＲ^１１Ｒ^２８基、−ＳＲ^２８基、シアノ基、−ＣＯ_２Ｒ^２８基　または　ニトロ基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいベンジル基、
−ＣＲ^１６Ｒ^１７ＣＯＲ^１０　基、−ＣＲ^１６Ｒ^１７ＣＯ_２Ｒ^２０　基、−ＣＲ^１６Ｒ^１７Ｐ（Ｏ）（ＯＲ^１０）_２　基、−ＣＲ^１６Ｒ^１７Ｐ（Ｓ）（ＯＲ^１０）_２　基、−ＣＲ^１６Ｒ^１７Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１１Ｒ^１２　基、−ＣＲ^１６Ｒ^１７Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２　基、　　−Ｃ（＝ＣＲ^２６Ｒ^２７）ＣＯＲ^１０　基、−Ｃ（＝ＣＲ^２６Ｒ^２７）ＣＯ_２Ｒ^２０　基、−Ｃ（＝ＣＲ^２６Ｒ^２７）Ｐ（Ｏ）（ＯＲ^１０）_２　基、−Ｃ（＝ＣＲ^２６Ｒ^２７）Ｐ（Ｓ）（ＯＲ^１０）_２　基、−Ｃ（＝ＣＲ^２６Ｒ^２７）Ｃ（Ｏ）ＮＲ^１１Ｒ^１２　基、−Ｃ（＝ＣＲ^２６Ｒ^２７）Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２　基、環上でハロゲン原子、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル基、Ｃ_１−Ｃ_６ハロアルキル基、Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル基、Ｃ_２−Ｃ_６ハロアルケニル基、Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル基、Ｃ_３−Ｃ_６ハロアルキニル基、Ｃ_２−Ｃ_８アルコキシアルキル基、−ＯＲ^２８基、−ＳＲ^２８基、−ＮＲ^１１Ｒ^２８基、Ｃ_３−Ｃ_８アルコキシカルボニルアルキル基、Ｃ_２−Ｃ_４カルボキシアルキル基、−ＣＯ_２Ｒ^２８基　およびシアノ基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよい下記のＱ−１からＱ−７までのいずれかの環を表し、

Ｒ^１０　は　Ｃ_１−Ｃ_６　アルキル基、Ｃ_２−Ｃ_６　アルケニル基、Ｃ_３−Ｃ_６　アルキニル基、またはテトラヒドロフラニル基を表し、
Ｒ^１１　および　Ｒ^１３　は独立して水素原子、または　Ｃ_１−Ｃ_４　アルキル基を表し、
Ｒ^１２　はＣ_１−Ｃ_６　アルキル基、Ｃ_３−Ｃ_６　シクロアルキル基、Ｃ_３−Ｃ_６　アルケニル基、Ｃ_３−Ｃ_６　アルキニル基、Ｃ_２−Ｃ_６　アルコキシアルキル基、Ｃ_１−Ｃ_６　ハロアルキル基、Ｃ_３−Ｃ_６　ハロアルケニル基、Ｃ_３−Ｃ_６　ハロアルキニル基、環上でハロゲン原子、Ｃ_１−Ｃ_４　アルキル基および　Ｃ_１−Ｃ_４　アルコキシ基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいフェニル基　または　−Ｃ　Ｒ^１６Ｒ^１７ＣＯ_２Ｒ^２５基を表し
あるいは、
Ｒ^１１と　Ｒ^１２とで　−（ＣＨ_２）_５−、−（ＣＨ_２）_４−、または　−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２−　を表していてもよく、このようにして形成されるそれぞれの環では、　Ｃ_１−Ｃ_３　アルキル基、フェニル基およびベンジル基からなるグループの中から選択される置換基で置換されていてもよく、
Ｒ^１４　はＣ_１−Ｃ_４　アルキル基、または環上でハロゲン原子、Ｃ_１−Ｃ_３　アルキル基およびＣ_１−Ｃ_３　ハロアルキル基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいフェニル基を表し、
あるいは、
Ｒ^１３と　Ｒ^１４とはこれらが結合している炭素原子とで　Ｃ_３−Ｃ_８　シクロアルキル基を表していてもよく、
Ｒ^１５　は　Ｃ_１−Ｃ_４　アルキル基、Ｃ_１−Ｃ_４　ハロアルキル基、または　Ｃ_３−Ｃ_６　アルケニル基を表し、
Ｒ^１６　および　Ｒ^１７　は独立して水素原子または　Ｃ_１−Ｃ_４　アルキル基、Ｃ_１−Ｃ_４ハロアルキル基、Ｃ_２−Ｃ_４　アルケニル基、Ｃ_２−Ｃ_４ハロアルケニル基、Ｃ_２−Ｃ_４　アルキニル基、Ｃ_３−Ｃ_４　ハロアルキニル基を表し、
あるいは、
Ｒ^１６　と　Ｒ^１７はこれらが結合している炭素原子とでＣ_３−Ｃ_６　シクロアルキル基を表していてもよく、このようにして形成されるそれぞれの環では、ハロゲン原子、Ｃ_１−Ｃ_３　アルキル基およびＣ_１−Ｃ_３　ハロアルキル基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよく、
Ｒ^１８　は水素原子、Ｃ_１−Ｃ_６　アルキル基、Ｃ_３−Ｃ_６　アルケニル基、または　Ｃ_３−Ｃ_６　アルキニル基を表し、
Ｒ^１９　は水素原子、Ｃ_１−Ｃ_４　アルキル基、またはハロゲン原子を表し、
Ｒ^２０　は水素原子、Ｃ_１−Ｃ_６　アルキル基、Ｃ_３−Ｃ_６　シクロアルキル基、Ｃ_３−Ｃ_６　アルケニル基、Ｃ_３−Ｃ_６　アルキニル基、Ｃ_２−Ｃ_６　アルコキシアルキル基、Ｃ_１−Ｃ_６　ハロアルキル基、Ｃ_３−Ｃ_６　ハロアルケニル基、Ｃ_３−Ｃ_６　ハロアルキニル基、環上でハロゲン原子、Ｃ_１−Ｃ_４　アルキル基および−ＯＲ^２８基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または　−Ｃ　Ｒ^１６Ｒ^１７ＣＯ_２Ｒ^２５基を表し、
Ｒ^２１　は水素原子、Ｃ_１−Ｃ_２　アルキル基、または　−ＣＯ_２（Ｃ_１−Ｃ_４アルキル）基を表し、
Ｒ^２２　は水素原子、Ｃ_１−Ｃ_６　アルキル基、Ｃ_１−Ｃ_６　アルコキシ基、または　ＮＨ（Ｃ_１−Ｃ_６　アルキル）基を表し、
Ｒ^２３　は　Ｃ_１−Ｃ_６　アルキル基、Ｃ_１−Ｃ_６　ハロアルキル基、Ｃ_１−Ｃ_６　アルコキシ基、ＮＨ（Ｃ_１−Ｃ_６　アルキル）基、Ｒ^２４　基で置換されていてもよいフェニル基、ベンジル基、または　Ｃ_２−Ｃ_８　ジアルキルアミノ基を表し、
Ｒ^２４　は　Ｃ_１−Ｃ_６　アルキル基、１　ないし　２　個のハロゲン原子、Ｃ_１−Ｃ_６　アルコキシ基、または　ＣＦ_３　基を表し、
Ｒ^２５は水素原子、Ｃ_１−Ｃ_６　アルキル基、Ｃ_１−Ｃ_６　ハロアルキル基、Ｃ_３−Ｃ_６　アルケニル基、Ｃ_３−Ｃ_６　ハロアルケニル基、Ｃ_３−Ｃ_６　アルキニル基、またはＣ_３−Ｃ_６　ハロアルキニル基を表し、
Ｒ^２６　および　Ｒ^２７　はそれぞれ独立して水素原子または　Ｃ_１−Ｃ_４　アルキル基、Ｃ_１−Ｃ_４ハロアルキル基、Ｃ_２−Ｃ_４　アルケニル基、Ｃ_２−Ｃ_４ハロアルケニル基、Ｃ_２−Ｃ_４　アルキニル基、Ｃ_３−Ｃ_４　ハロアルキニル基、−ＯＲ^２８基、−ＮＨＲ^２８基、または−ＳＲ^２８基を表し、あるいは、
Ｒ^２６　と　Ｒ^２７はこれらが結合している炭素原子とでＣ_３−Ｃ_６　シクロアルキル基を表していてもよく、このようにして形成されるそれぞれの環では、ハロゲン原子、Ｃ_１−Ｃ_３　アルキル基およびＣ_１−Ｃ_３　ハロアルキル基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよく、
Ｒ^２８　は水素原子、Ｃ_１−Ｃ_６　アルキル基、Ｃ_１−Ｃ_６　ハロアルキル基、Ｃ_３−Ｃ_６　アルケニル基、Ｃ_３−Ｃ_６　ハロアルケニル基、Ｃ_３−Ｃ_６　アルキニル基、Ｃ_３−Ｃ_６　ハロアルキニル基、Ｃ_２−Ｃ_４カルボキシアルキル基、Ｃ_３−Ｃ_８アルコシキカルボニルアルキル基、Ｃ_３−Ｃ_８ハロアルコキシカルボニルアルキル基、Ｃ_５−Ｃ_９アルケニルオキシカルボニルアルキル基、Ｃ_５−Ｃ_９ハロアルケニルオキシカルボニルアルキル基、Ｃ_５−Ｃ_９アルキニルオキシカルボニルアルキル基、Ｃ_５−Ｃ_９ハロアルキニルオキシカルボニルアルキル基、Ｃ_５−Ｃ_９シクロアルコキシカルボニルアルキル基　または　Ｃ_５−Ｃ_９ハロシクロアルコキシカルボニルアルキル基を表す。］
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ７）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ８）ストレプトミセス属またはサッカロポリスポラ属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ９）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
３９．以下の群から選ばれる１以上の雑草防除剤代謝蛋白質を発現する植物の栽培域に、上記一般式（Ｉ）で示される化合物を施用する工程を有することを特徴とする雑草防除方法；
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２８）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓもしくはＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉの染色体ＤＮＡを鋳型とし配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
４０．上記一般式（Ｉ）で示される化合物に対する細胞の耐性度を評価する方法であって、
（１）以下の群から選ばれる１以上の雑草防除剤代謝蛋白質を発現する細胞と、前記化合物とを接触させる工程、
（２）前記工程（１）で化合物と接触した細胞の傷害の度合いを評価する工程
を有することを特徴とする方法；
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ７）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ８）ストレプトミセス属またはサッカロポリスポラ属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ９）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
４１．細胞が微生物細胞または植物細胞である前項４０に記載の方法；
４２．上記一般式（Ｉ）で示される化合物に対して耐性を示す細胞の選抜方法であって、前項４０に記載の方法で評価された耐性度に基づき細胞を選抜する工程を有することを特徴とする方法；
４３．前項４２に記載の方法で選抜された雑草防除剤耐性細胞またはその培養物；
４４．上記一般式（Ｉ）で示される化合物に対する植物の耐性度を評価する方法であって、
（１）以下の群から選ばれる１以上の雑草防除剤代謝蛋白質を発現する植物と、前記化合物とを接触させる工程、
（２）前記工程（１）で化合物と接触した植物の傷害の度合いを評価する工程
を有することを特徴とする方法；
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ７）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ８）ストレプトミセス属またはサッカロポリスポラ属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ９）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
４５．上記一般式（Ｉ）で示される化合物に対して耐性を示す植物の選抜方法であって、前項４４に記載の方法で評価された耐性度に基づき植物を選抜する工程を有することを特徴とする方法；
４６．前項４５の方法で選抜された雑草防除剤耐性植物またはその後代；
４７．上記一般式（Ｉ）で示される化合物を処理するための方法であって、電子供与体からの電子伝達系の存在下、前記化合物に、以下の群から選ばれる１以上の雑草防除剤代謝蛋白質を作用させることを特徴とする方法；
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ７）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ８）ストレプトミセス属またはサッカロポリスポラ属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ９）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
４８．雑草防除剤代謝蛋白質をコードするＤＮＡが宿主細胞の発現可能な位置に導入されてなる形質転換体と前記化合物とを接触させることにより、前記化合物に前記蛋白質を作用させる前項４７に記載の方法；
４９．上記一般式（Ｉ）で示される化合物を処理するための、以下の群から選ばれる雑草防除剤代謝蛋白質の使用；
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ７）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ８）ストレプトミセス属またはサッカロポリスポラ属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ９）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
５０．上記一般式（Ｉ）で示される化合物を処理するための、以下の群から選ばれる雑草防除剤代謝蛋白質をコードする核酸の使用；
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ７）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ８）ストレプトミセス属またはサッカロポリスポラ属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ９）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
以下の蛋白質群から選ばれる雑草防除剤代謝蛋白質（以下、本発明蛋白質（Ａ）と記すことがある。）は、上記式（ＩＩ）で示される化合物（以下、化合物（ＩＩ）と記すことがある。）を、上記式（ＩＩＩ）で示される化合物（以下、化合物（ＩＩＩ）と記すことがある。）に変換する能力を有する。
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２８）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓもしくはＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉの染色体ＤＮＡを鋳型とし配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
本発明蛋白質（Ａ）の具体例としては、
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ１）と記すことがある。］、
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ２）と記すことがある。］、
配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ３）と記すことがある。］、
配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ４）と記すことがある。］、
配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ１１）と記すことがある。］、
配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ１２）と記すことがある。］、
配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ１３）と記すことがある。］、
配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ１４）と記すことがある。］、
配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ１５）と記すことがある。］、
配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ１６）と記すことがある。］、
配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ１７）と記すことがある。］、
配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ１８）と記すことがある。］、
配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ１９）と記すことがある。］、
配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ２０）と記すことがある。］、
配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ２１）と記すことがある。］、
配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ２２）と記すことがある。］、
配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ２３）と記すことがある。］、
配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ２４）と記すことがある。］、
配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ２５）と記すことがある。］等をあげることができる。
かかる本発明蛋白質（Ａ）を、例えば、上記一般式（Ｉ）で示されるＰＰＯ阻害型雑草防除活性化合物（以下、化合物（Ｉ）と記すことがある。）に作用させることにより、該化合物を雑草防除活性のより低い化合物に変換することができる。
また、化合物（Ｉ）を雑草防除活性のより低い化合物に変換する処理には、以下の蛋白質群から選ばれる雑草防除剤代謝蛋白質（以下、本蛋白質（Ａ）と記すことがある。）を利用することもできる。
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ７）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ８）ストレプトミセス属またはサッカロポリスポラ属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ９）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
本蛋白質（Ａ）の例としては、上記の本発明蛋白質（Ａ）をあげることができる。また、その他の例としては、
配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本蛋白質（Ａ９）と記すことがある。］、
配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本蛋白質（Ａ１０）と記すことがある。］等をあげることができる。
【０００６】
上記の蛋白質群のうち、（Ａ５）、（Ａ６）、（Ａ７）、（Ａ８）、（Ａ２６）、（Ａ２７）または（Ａ２８）に示される蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号１、２、３、１０８、１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列との間に認められることのある相違は、一部のアミノ酸の欠失、置換、付加等である。これらには、例えば、上記の配列番号１、２、３、１０８、１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質が細胞内で受けるプロセシングによる欠失が含まれる。また、該蛋白質が由来する生物の種差や個体差等により天然に生じる遺伝子変異や、部位特異的変異導入法、ランダム変異導入法、突然変異処理等によって人為的に導入される遺伝子変異等により生じるアミノ酸の欠失、置換、付加等が含まれる。
かかる欠失、置換、付加等を受けるアミノ酸の数は、本蛋白質（Ａ）に、化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力を見出すことのできる範囲内の数であれば良い。また、アミノ酸の置換としては、例えば、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似したアミノ酸への置換をあげることができる。このような置換としては、具体的には例えば、▲１▼グリシン、アラニン；▲２▼バリン、イソロイシン、ロイシン；▲３▼アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、▲４▼セリン、スレオニン；▲５▼リジン、アルギニン；▲６▼フェニルアラニン、チロシン等のグループ内での置換が挙げられる。一方、本蛋白質（Ａ）において、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号３５７で示されるシステインに相当する位置にあるシステイン；例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号３５０で示されるシステイン、配列番号３で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号３４４で示されるシステイン、配列番号１０８で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号３６０で示されるシステイン、配列番号４で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号３５９で示されるシステイン、配列番号５で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号３５５で示されるシステイン、配列番号１５９で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号３５８で示されるシステイン、配列番号１６０で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号３７４で示されるシステイン、配列番号１３６で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号３５１で示されるシステイン、配列番号１３７で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号３５８で示されるシステイン、配列番号１３８で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号３５８で示されるシステイン、配列番号２２２で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号３４７で示されるシステイン、配列番号２２４で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号３４７で示されるシステイン等；は、保存される（欠失や置換を受けない）ことが好ましい。
かかるアミノ酸の欠失、付加もしくは置換（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）を人為的に行う手法としては、例えば、配列番号１、２、３、１０８、１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードするＤＮＡに対して部位特異的変異導入を施し、その後このＤＮＡを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１２，９４４１−９４５６（１９８４））、変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等が挙げられる。また、アミノ酸の改変を人為的に行う手法としては、例えば、配列番号１、２、３、１０８、１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードするＤＮＡに対してランダムに変異導入を施し、その後このＤＮＡを常法により発現させる手法も挙げられる。ここでランダムに変異を導入する手法としては、例えば、上記のアミノ酸配列のいずれかをコードするＤＮＡを鋳型とし、それぞれのＤＮＡの全長を増幅できるようなプライマー対を用い、基質に用いるｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの各々の添加濃度を通常とは変化させた反応条件や、あるいはポリメラーゼの反応を促進させるＭｇ^２＋の濃度を通常よりも増加させた反応条件でＰＣＲを行う方法等が挙げられる。このようなＰＣＲの手法としては、例えば、Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　（３１），　１９９４，　９７−１１２　に記載の方法があげられる。また、ＷＯ０００９６８２号公報に記載の方法をあげることもできる。
【０００７】
本発明において「配列同一性」とは、２つの塩基配列または２つのアミノ酸配列間の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の全領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象の塩基配列またはアミノ酸配列の最適なアラインメントにおいては、付加又は欠失（例えばギャップ等）を許容してもよい。このような配列同一性は、例えば、ＦＡＳＴＡ［Ｐｅａｒｓｏｎ　＆　Ｌｉｐｍａｎ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，４，　２４４４−２４４８（１９８８）］、ＢＬＡＳＴ［Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　２１５，　４０３−４１０（１９９０）］、ＣＬＵＳＴＡＬ　Ｗ［Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｇｉｂｓｏｎ，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　２２，　４６７３−４６８０（１９９４ａ）］等のプログラムを用いて相同性解析を行いアラインメントを作成することによって算出することができる。上記のプログラムは、例えば、ＤＮＡ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ［国立遺伝学研究所　生命情報・ＤＤＢＪ研究センター　（Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ＤＮＡ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ　；ＣＩＢ／ＤＤＢＪ）内で運営される国際ＤＮＡデータバンク］のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ）等において、一般的に利用可能である。また、配列同一性は市販の配列解析ソフトウェアを用いて求めることもできる。具体的には例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ　Ｖｅｒ．５（ソフトウェア開発株式会社製）」を用い、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法［Ｌｉｐｍａｎ，　Ｄ．　Ｊ．　ａｎｄ　Ｐｅａｒｓｏｎ，　Ｗ．Ｒ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２２７，　１４３５−１４４１，（１９８５）］により相同性解析を行ってアラインメントを作成することにより算出することができる。
【０００８】
（Ａ７）に記載の「ストリンジェントな条件」としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．，　Ｆｒｉｓｃｈ　Ｅ．　Ｆ．，　Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｒｅｓｓ）等に記載される通常の方法に準じて行われるハイブリダイゼーションにおいて、例えば、６×ＳＳＣ（１．５Ｍ　ＮａＣｌ、０．１５Ｍ　クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする）を含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｎ．　Ｙ．　（１９８９），　６．３．１−６．３．６）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２×ＳＳＣ（低ストリンジェンシーな条件）から０．２×ＳＳＣ（高ストリンジェンシーな条件）までの条件から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）までの条件から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
「配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズ」するＤＮＡとしては、具体的には、例えば、配列番号１、２、３、４、５、１０８、１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号６、７、８、７８、８４、１０９、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３または２３４で示される塩基配列のいずれかを有するＤＮＡなどをあげることができ、配列番号６、７、８、７８、８４、１０９、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３または２３４で示される塩基配列のいずれかと約６０％程度以上の同一性を示す塩基配列を有するＤＮＡをあげることもできる。
【０００９】
本蛋白質（Ａ）の分子量は、ドデシル硫酸ナトリウムを含有するポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと記す。）で検出される分子量として、約３万程度〜約６万程度であり、一般に約４万程度〜約５万程度の分子量（例えば、配列番号１、２、３、１０８、１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４のいずれかで示されるアミノ酸配列からなる蛋白質と同等）が適している。また、本蛋白質（Ａ）は、化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力が失われない限りにおいて、そのアミノ末端から上流側やカルボキシ末端から下流側に、アミノ酸配列が付加された蛋白質として利用されてもよい。
【００１０】
本蛋白質（Ａ）が有する、上記一般式で示されるＰＰＯ阻害型雑草防除活性化合物を代謝する能力の指標としては、化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力をあげることができる。かかる能力は、例えば、補酵素ＮＡＤＰＨ等の電子供与体からの電子伝達系の存在下で、本蛋白質（Ａ）を化合物（ＩＩ）に作用させ、生成した化合物（ＩＩＩ）を検出することにより確認することができる。
「電子供与体からの電子伝達系」とは、酸化還元反応が連鎖的に起こって電子供与体から本蛋白質（Ａ）へと電子の移動が行われる系をいう。電子供与体としては、例えば補酵素ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨ等があげられる。例えば、ＮＡＤＰＨから本蛋白質（Ａ）への電子伝達系を構成する蛋白質としては、フェレドキシンとフェレドキシン−ＮＡＤＰ^＋還元酵素、チトクロムＰ−４５０還元酵素等があげられる。
化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力を確認するには、例えば、本蛋白質（Ａ）、β−ＮＡＤＰＨ、フェレドキシン、フェレドキシン−ＮＡＤＰ^＋還元酵素および放射性同位元素等で標識された化合物（ＩＩ）を含有するｐＨ７程度の反応液を、約３０℃にて、約１０分間から約１時間保温する。次いで、前記反応液に塩酸を添加して酸性にした後、酢酸エチルで抽出する。得られた酢酸エチル層を薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと記す。）に供した後、オートラジオグラフィーを行って、標識体の化合物（ＩＩＩ）を検出することにより、化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力を確認することができる。
【００１１】
本蛋白質（Ａ）を調製するには、例えばまず、本蛋白質（Ａ）をコードするＤＮＡ（以下、一括して本ＤＮＡ（Ａ）と記すことがある。）を、通常の遺伝子工学的方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．，　Ｆｒｉｓｃｈ　Ｅ．　Ｆ．，　Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｒｅｓｓ）等に記載されている方法）に準じて取得する。
本ＤＮＡ（Ａ）の例としては、上記の本発明蛋白質（Ａ）をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ）と記すことがある。］をあげることができる。本発明ＤＮＡ（Ａ）の具体例としては、
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ１）と記すことがある。］、
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ２）と記すことがある。］、
配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ３）と記すことがある。］、
配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ４）と記すことがある。］、
配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ１１）と記すことがある。］、
配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ１２）と記すことがある。］、
配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ１３）と記すことがある。］、
配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ１４）と記すことがある。］、
配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ１５）と記すことがある。］、
配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ１６）と記すことがある。］、
配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ１７）と記すことがある。］、
配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ１８）と記すことがある。］、
配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ１９）と記すことがある。］、
配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ２０）と記すことがある。］、
配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ２１）と記すことがある。］、
配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ２２）と記すことがある。］、
配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ２３）と記すことがある。］、
配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ２４）と記すことがある。］、
配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ２５）と記すことがある。］等をあげることができる。
さらに、本発明ＤＮＡ（Ａ）のより具体的な例としては、
配列番号６で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号９で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号７で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１０で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号８で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１１で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１０９で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１１０で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１３９で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１４４で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１４０で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１４５で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１４１で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１４６で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１４２で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１４７で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１４３で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１４８で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２２５で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２３５で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２２６で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２３６で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２２７で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２３７で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２２８で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２３８で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２２９で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２３９で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２３０で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２４０で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２３１で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２４１で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２３２で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２４２で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２３３で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２４３で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２３４で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２４４で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２１４で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号３６８で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号３９３で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号６、７、８または１０９で示される塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列であって、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３または２３４で示される塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列であって、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
等をあげることができる。
また、本ＤＮＡ（Ａ）の例としては、上記のような本発明ＤＮＡ（Ａ）の他、
配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本ＤＮＡ（Ａ９）と記すことがある。］、
配列番号７８で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本ＤＮＡ（Ａ１０）と記すことがある。］、
配列番号８４で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号８５で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
等をあげることもできる。
本ＤＮＡ（Ａ）としては、自然界からクローニングされたＤＮＡであってもよいし、自然界からクローニングされたＤＮＡに、例えば部位特異的変異導入法やランダム変異導入法などによって塩基の欠失、置換または付加が導入されたＤＮＡであってもよく、また、人為的に合成されたＤＮＡであってもよい。次いで、得られた本ＤＮＡ（Ａ）を通常の遺伝子工学的方法に準じて発現させることにより本蛋白質（Ａ）を製造・取得する。このようにして本蛋白質（Ａ）を調製することができる。
【００１２】
本ＤＮＡ（Ａ）は、例えば、以下のような方法で調製することができる。まず、化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力を有する微生物、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ等のストレプトミセス属に属する微生物、より具体的には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２７３５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ　　ＡＴＣＣ１１７９６、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ　ＳＡＮＫ６２５８５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ　ＩＦＯ　１２８７０ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ　ＩＦＯ　１４２７３ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ　ＩＦＯ　１３４４５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３７８２、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１３６７３ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２４４４、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１３０６９ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＡＴＣＣ　１０１３７、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＩＦＯ　１３８４９Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１２７８７Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３８５５Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ　ＩＦＯ　１３４３４Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ　ＩＦＯ　１３６８２Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１５８７５Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３４４６Ｔなど、または、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ等のサッカロポリスポラ属に属する微生物、より具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔなどから、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．等に記載される通常の遺伝子工学的方法に準じた方法により染色体ＤＮＡを調製する。次いで該染色体ＤＮＡを、例えばＳａｕ３ＡＩ等の制限酵素で部分消化処理した後、約２ｋｂ程度のＤＮＡを回収する。回収したＤＮＡを「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２^ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．等に記載されている通常の遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニングする。ベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＵＣ　１１９（宝酒造社製）、ｐＴＶ　１１８Ｎ（宝酒造社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　（東洋紡社製）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、ｐＫＫ３３１−１Ａ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）などを利用することができる。得られたクローンからプラスミドを抽出することによって、染色体ＤＮＡライブラリーを得ることができる。
【００１３】
得られた染色体ＤＮＡライブラリーに、配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有する約２０塩基以上の塩基からなるＤＮＡをプローブとして、後述する条件にてハイブリダイズさせ、該プローブが特異的に結合するＤＮＡを検出しこれを回収することによって本ＤＮＡ（Ａ）を取得することができる。プローブとして用い得るＤＮＡの具体例としては、配列番号６、７、８または１０９で示される塩基配列のいずれかを有するＤＮＡ、配列番号６、７、８または１０９のいずれかで示される塩基配列の部分塩基配列を有するＤＮＡ、該部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡ等があげられる。
プローブとして用いるＤＮＡは、放射性同位元素や蛍光色素等で標識される。ＤＮＡを放射性同位元素により標識するには、例えば、ベーリンガー社または宝酒造社製のＲａｎｄｏｍ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ等を用いることができる。また、通常のＰＣＲ反応液中のｄＣＴＰを（α−^３２Ｐ）ｄＣＴＰに替えて、プローブに用いるＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、^３２Ｐ標識されたＤＮＡを調製することもできる。また、ＤＮＡを蛍光色素で標識する場合には例えば、ＤＩＧ−Ｈｉｇｈ　Ｐｒｉｍｅ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｔａｒｔｅｒ　Ｋｉｔ　ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ社製）等を用いることができる。プローブの調製の具体例を次に示す。例えば、上記のようにしてＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８から調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として用い、配列番号９３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号９４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、例えばＰＣＲ　ＤＩＧ　Ｐｒｏｂｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＧｍｂＨ製）を用いて添付のマニュアルに従って後述の実施例に記載されるようにＰＣＲを行うと、配列番号６で示される塩基配列の全長を有しジゴシキゲニンで標識されたＤＮＡが得られる。また同様にして、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８から調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として用い、配列番号１３０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１３１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うと、配列番号６で示される塩基配列の塩基番号５７〜７３０で示される塩基配列を有しジゴシキゲニンで標識されたＤＮＡが得られる。また、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ９３８３ｔの染色体ＤＮＡから調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として用い、配列番号６１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号６２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うと、配列番号７で示される塩基配列の全長を有しジゴシキゲニンで標識されたＤＮＡが得られる。また、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９の染色体ＤＮＡから調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として用い、配列番号７０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号７１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行うと、配列番号８で示される塩基配列の全長を有しジゴシキゲニンで標識されたＤＮＡが得られる。また、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９の染色体ＤＮＡから調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として用い、配列番号１３２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１３３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行うと、配列番号８で示される塩基配列の塩基番号２１〜６９１で示される塩基配列を有しジゴシキゲニンで標識されたＤＮＡが得られる。
【００１４】
染色体ＤＮＡライブラリーにプローブをハイブリダイズさせる方法としては、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションを挙げることができ、ライブラリーの作製に用いられたベクターの種類に応じて方法を選択するとよい。使用されるライブラリーがプラスミドベクターを用いて構築されている場合には、コロニーハイブリダイゼーションを行う。具体的にはまず、ライブラリーのＤＮＡを、ライブラリーの作製に用いられたプラスミドベクターが複製可能な微生物に導入して形質転換体を取得し、得られた形質転換体を希釈して寒天培地にまき、コロニーが現れるまで培養を行う。ライブラリーがファージベクターを用いて作製されている場合には、プラークハイブリダイゼーションを行う。具体的にはまず、ライブラリーの作製に用いられたファージベクターが複製可能な微生物とライブラリーのファージとを感染可能な条件下で混合した後、更に軟寒天培地と混合し、これを寒天培地にまく。その後、プラークが現れるまで培養を行う。
次いで、前記のいずれのハイブリダイゼーションの場合も、前記の培養を行った寒天培地の表面にメンブレンを載せ、形質転換体コロニーまたはプラーク中のファージ粒子を該メンブレンに転写する。このメンブレンをアルカリ処理した後、中和処理し、次いで、形質転換体もしくはファージ粒子から溶出したＤＮＡを該メンブレンに固定する処理を行う。より具体的に例えば、プラークハイブリダイゼーションの場合には、前記寒天培地の上にニトロセルロースメンブレンまたはナイロンメンブレン等、具体的には例えば、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ^＋（アマシャムファルマシアバイオテク社登録商標）等を置き、約１分間静置してファージ粒子をメンブレンに吸着させる。次に、該メンブレンをアルカリ溶液（１．５Ｍ　塩化ナトリウム、０．５Ｎ　ＮａＯＨ）に約３分間浸してファージ粒子を溶解させてファージＤＮＡをメンブレン上に溶出させた後、中和溶液（１．５Ｍ　塩化ナトリウム、０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５）に約５分間浸す。該メンブレンを洗浄液（０．３Ｍ塩化ナトリウム、３０　ｍＭクエン酸ナトリウム、０．２Ｍ　トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５）で約５分間洗った後、例えば、約８０℃で約９０分間減圧下に保温することによりファージＤＮＡをメンブレンに固定する。
このように調製されたメンブレンを用いて、上記ＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションは、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２^ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）」　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ等の記載に準じて行うことができる。
ハイブリダイゼーションを行う際の試薬及び温度条件は多種存在するが、例えば、４５０ｍＭ〜９００ｍＭの塩化ナトリウムおよび４５ｍＭ〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、ドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳと記す。）を０．１％〜１．０％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ０％〜０．２％の濃度で含んでいてもよいプレハイブリダイゼーション液を、上記のようにして作製したメンブレン１ｃｍ^２当たり５０μｌ〜２００μｌの割合で準備し、該溶液に前記メンブレンを浸して４２℃〜６５℃で１時間〜４時間程度保温する。次いで例えば、４５０ｍＭ〜９００ｍＭの塩化ナトリウムおよび４５ｍＭ〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、ＳＤＳを０．１％〜１．０％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ０％〜０．２％の濃度で含んでいてもよいハイブリダイゼーション溶液と、前述の方法で調製して得られたプローブ（メンブレン１ｃｍ^２当たり１．０ｘ１０^４ｃｐｍ〜２．０ｘ１０^６ｃｐｍ相当量）とを混合した溶液をメンブレン１ｃｍ^２当たり５０μｌ〜２００μｌの割合で準備し、該溶液にメンブレンを浸し４２℃〜６５℃で１２時間〜２０時間程度保温する。次いで、メンブレンを取り出し、１５ｍＭ〜３００ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭ〜３０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび０．１％〜１．０％のＳＤＳ等を含む４２℃〜６５℃の洗浄液等を用い、５分間〜１５分間の洗浄を２回〜４回程度行う。さらに、メンブレンを２ｘＳＳＣ溶液（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム）等で軽くすすいだ後乾燥させる。このメンブレンを、例えば、オートラジオグラフィーなどに供してメンブレン上のプローブの位置を検出することにより、用いたプローブとハイブリダイズするＤＮＡのメンブレン上の位置を検出する。また、ＤＩＧ−Ｈｉｇｈ　Ｐｒｉｍｅ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｔａｒｔｅｒ　Ｋｉｔ　ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ社製）等の市販のハイブリダイゼーション用キットを使用し、該キットに含まれるハイブリダイゼーション用溶液を用いてプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを行うこともできる。ハイブリダイゼーションの後、例えば、メンブレンを０．１％　ＳＤＳを含む２ＸＳＳＣ中、室温で５分間２回洗浄し、引き続き０．１％　ＳＤＳ　を含む０．５ＸＳＳＣ中、６５℃で１５分間２回洗浄する。洗浄されたメンブレンを、該キットに含まれる検出用処理液で順次処理してメンブレン上のプローブの位置を検出することにより、用いたプローブとハイブリダイズするＤＮＡのメンブレン上の位置を検出する。
上記のようにして検出されたＤＮＡのメンブレン上の位置に相当するクローンをもとの寒天培地上で特定しこれを釣菌することにより、当該ＤＮＡを有するクローンを単離することができる。
【００１５】
上記のようにして得られる本ＤＮＡ（Ａ）は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２^ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．等に記載されている通常の遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニングすることができる。ベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＵＣＡ１１９（宝酒造社製）、ｐＴＶＡ１１８Ｎ（宝酒造社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　（東洋紡社製）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＫＫ３３１−１Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などを利用することができる。
また、上述のようにして得られる本ＤＮＡ（Ａ）の塩基配列は、Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ，　Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ，　Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ著、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７７）　７４：　５４６３−５４６７頁等に記載されているダイデオキシターミネーター法等により解析することができる。塩基配列分析用の試料調製には、例えば、パーキンエルマー社のＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ等の市販の試薬を用いてもよい。
【００１６】
また、本ＤＮＡ（Ａ）は次のようにして調製することもできる。化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力を有する微生物、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ等のストレプトミセス属に属する微生物、より具体的には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２７３５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ　　ＡＴＣＣ１１７９６、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ　ＳＡＮＫ６２５８５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ　ＩＦＯ　１２８７０ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ　ＩＦＯ　１４２７３ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ　ＩＦＯ　１３４４５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３７８２、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１３６７３ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２４４４、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１３０６９ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＡＴＣＣ　１０１３７、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＩＦＯ　１３８４９Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１２７８７Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３８５５Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ　ＩＦＯ　１３４３４Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ　ＩＦＯ　１３６８２Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１５８７５Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３４４６Ｔなど、または、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ等のサッカロポリスポラ属に属する微生物、より具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔなどから上記のようにして調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１、２、３、４、５、１０８、１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列の５’末端側の約２０塩基程度以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、上記アミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列の３’末端近傍もしくは３’末端より下流の約２０塩基程度以上の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、以下に示すような反応条件にてＰＣＲを行うことにより、本ＤＮＡ（Ａ）を増幅することができる。尚、上記のようにしてＰＣＲに用いられるプライマーの５’末端側には、制限酵素認識配列等が付加されていてもよい。
より具体的には例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８から調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号５１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号５２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号６で示される塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅することができる。また、配列番号５１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号５３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号９で示される塩基配列（配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを増幅することができる。
例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔから調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号６１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号６２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号７で示される塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅することができる。また、配列番号６１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号６３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１０で示される塩基配列（配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを増幅することができる。
例えばＳｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２７３５から調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１０９で示される塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅することができる。また、配列番号１１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１１０で示される塩基配列（配列番号１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを増幅することができる。
例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ　ＩＦＯ　１３４４５から調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１６５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１６６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１４４で示される塩基配列（配列番号１５９で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを増幅することができる。
例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３７８２から調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１７１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１７２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１４５で示される塩基配列（配列番号１６０で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを増幅することができる。
例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ　ＩＦＯ　１４２７３ｔから調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１７７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１７８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１４６で示される塩基配列（配列番号１３６で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを増幅することができる。
例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１３６７３ｔから調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１８３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１８４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１４７で示される塩基配列（配列番号１３７で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを増幅することができる。
例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２４４４から調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１８５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１８４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１４８で示される塩基配列（配列番号１３８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを増幅することができる。
【００１７】
また、染色体ＤＮＡがベクターに挿入されてなるＤＮＡライブラリーを鋳型とする場合には、例えば、配列番号１、２、３、４、５、１０８、１５９、１６０、１３６、１３７または１３８で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列から選ばれる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の５’末端側の約２０塩基程度以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）と、ライブラリー構築に用いられたベクターのＤＮＡ挿入部位近傍の塩基配列に相補的な塩基配列を有する約２０塩基程度以上のオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、本ＤＮＡ（Ａ）を増幅することもできる。尚、このようにしてＰＣＲに用いられるプライマーの５’末端側には、制限酵素認識配列等が付加されていてもよい。
【００１８】
上記のようなＰＣＲの条件としては、具体的には例えば、染色体ＤＮＡを５０ｎｇ含み、上記のような組合せの２種類のプライマーをそれぞれ３００ｎＭ含み、ｄＮＴＰミックス（それぞれ２．０ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を５．０μｌ含み、１０×Ｅｘｐａｎｄ　ＨＦバッファー（ＭｇＣｌ_２含有、ロッシュモレキュラーバイオケミカルズ社製）を５．０μｌ含み、Ｅｘｐａｎｄ　ＨｉＦｉ酵素ミックス（ロッシュモレキュラーバイオケミカルズ社製）を０．７５μｌ含む５０μｌの反応液を用い、９７℃で２分間保温した後、９７℃で１５秒間次いで６５℃で３０秒間さらに７２℃で２分間の保温を１サイクルとしてこれを１０サイクル繰り返し、続いて、９７℃で１５秒間次いで６８℃で３０秒間さらに７２℃で２分間（１サイクル毎に２０秒間ずつ増加させる）の保温を１サイクルとしてこれを１５サイクル行い、さらに、７２℃で７分間保温する条件をあげることができる。
また、染色体ＤＮＡを２５０ｎｇ含み、上記のような組合せの２種類のプライマーをそれぞれ２００ｎＭ含み、ｄＮＴＰミックス（それぞれ２．５ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を５．０μｌ含み、１０×ＥｘＴａｑバッファー（ＭｇＣｌ_２含有、宝酒造社製）を５．０μｌ含み、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）を０．５μｌ含む５０μｌの反応液を用い、９７℃で２分間保温し、９７℃で１５秒間次いで６０℃で３０秒間次いで７２℃で９０秒のサイクルを３０サイクル繰り返し、さらに７２℃で４分間保温する条件をあげることもできる。
【００１９】
また、例えば、配列番号６、７、８または１０９で示される塩基配列において配列同一性が特に高い領域の塩基配列に基づきプライマー用オリゴヌクレオチドを設計して調製する。得られたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力を有する微生物、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ等のストレプトミセス属に属する微生物、より具体的には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２７３５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ　　ＡＴＣＣ１１７９６、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ　ＳＡＮＫ６２５８５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ　ＩＦＯ　１２８７０ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ　ＩＦＯ　１４２７３ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ　ＩＦＯ　１３４４５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３７８２、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１３６７３ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２４４４、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１３０６９ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＡＴＣＣ　１０１３７、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＩＦＯ　１３８４９Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１２７８７Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３８５５Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ　ＩＦＯ　１３４３４Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ　ＩＦＯ　１３６８２Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１５８７５Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３４４６Ｔなど、または、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ等のサッカロポリスポラ属に属する微生物、より具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔなどから上記のようにして調製される染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことによって、本ＤＮＡ（Ａ）を取得することもできる。「配列番号６、７、８または１０９で示される塩基配列において配列同一性が特に高い領域」としては、例えば、配列番号６で示される塩基配列の塩基番号２９０〜３１５、４５８〜４８５、４９６〜５２５、１０４６〜１０７３でそれぞれ示される領域に相当する領域等をあげることができる。かかる領域の塩基配列に基づいて設計されるプライマーとしては、例えば、次に示す配列番号１２４〜１２９のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーをあげることができる。
配列番号１２４；上記塩基番号２９０〜３１５で示される領域に相当する領域の塩基配列に基づく。
配列番号１２５；上記塩基番号４５８〜４８５で示される領域に相当する領域の塩基配列に基づく。
配列番号１２６；上記塩基番号４５８〜４８５で示される領域に相当する領域の塩基配列に基づく。
配列番号１２７；上記塩基番号４９６〜５２５で示される領域に相当する領域の塩基配列に基づく。
配列番号１２８；上記塩基番号４９６〜５２５で示される領域に相当する領域の塩基配列に基づく。
配列番号１２９；上記塩基番号１０４６〜１０７３で示される領域に相当する領域の塩基配列に基づく。
例えば、配列番号１２４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合せをプライマーに用いることにより、約８００ｂｐのＤＮＡが増幅される。配列番号１２５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合せをプライマーに用いることにより、約６００ｂｐのＤＮＡが増幅される。配列番号１２６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合せをプライマーに用いることにより、約６００ｂｐのＤＮＡが増幅される。配列番号１２７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合せをプライマーに用いることにより、約５８０ｂｐのＤＮＡが増幅される。また、配列番号１２８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合せをプライマーに用いることにより、約５８０ｂｐのＤＮＡが増幅される。
ここで、ＰＣＲの条件としては、具体的には例えば、染色体ＤＮＡを１０ｎｇ含み、２種類のプライマーをそれぞれ２００ｎＭ含み、ｄＮＴＰミックス（それぞれ１０ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を０．５μｌ含み、５ｘＧＣゲノミックＰＣＲ反応バッファーを５μｌ含み、２５ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）_２を１．１μｌ含み、５Ｍ　ＧＣ−Ｍｅｌｔを５μｌ含み、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣゲノミックポリメラーゼミックス（クロンテック社製）を０．５μｌ含む２５μｌの反応液を、９５℃で１分間保温し、９４℃で１５秒間次いで６０℃で３０秒間次いで７２℃で１分間のサイクルを３０サイクル繰り返し、さらに７２℃で５分間保温する条件をあげることができる。
【００２０】
上記のようにして増幅されたＤＮＡを回収することにより、本ＤＮＡ（Ａ）の部分塩基配列を有するＤＮＡを取得することができる。次いで、取得された「本ＤＮＡ（Ａ）の部分塩基配列を有するＤＮＡ」が有する塩基配列に基づき、該塩基配列の約２０塩基程度以上の部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチドや、該塩基配列の約２０塩基程度以上の部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを設計し調製する。そして、例えば上記のような化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力を有する微生物等から調製された染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、上記のように「本ＤＮＡ（Ａ）の部分塩基配列を有するＤＮＡ」が有する塩基配列に基づき調製されたオリゴヌクレオチドを、上記ライブラリーの構築に用いられたベクターのＤＮＡ挿入部位近傍の塩基配列を有する約２０塩基程度以上のオリゴヌクレオチドまたはかかる塩基配列に相補的な塩基配列を有する約２０塩基程度以上のオリゴヌクレオチドと組合わせてプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、上記のようにして取得された「本ＤＮＡ（Ａ）の部分塩基配列を有するＤＮＡ」の５’末端より上流側または３’末端より下流側に伸長する本ＤＮＡ（Ａ）の部分塩基配列を有するＤＮＡを得ることができる。上記のようにして得られた本ＤＮＡ（Ａ）の部分塩基配列を有するＤＮＡを連結することによって、本ＤＮＡ（Ａ）を得ることができる。このような取得方法には、例えばユニバーサルゲノムウォーカーキット（クロンテック社製）等の市販のキットを用いることもできる。また、上記のようにして得られた本ＤＮＡ（Ａ）の部分塩基配列を連結することによって得られる本ＤＮＡ（Ａ）の全長塩基配列に基づいてプライマーを調製し、該プライマーを用いて上記染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行なうことにより、本ＤＮＡ（Ａ）を得ることもできる。
【００２１】
例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ　ＩＦＯ　１３４４５から調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１２４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１３９で示される塩基配列の塩基番号３１６〜１０４８に示される塩基配列（配列番号１５９で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の部分塩基配列）を有するＤＮＡを得ることができる。得られたＤＮＡの塩基配列に基づき上述のようにして、その５’末端より上流側または３’末端より下流側に伸長する塩基配列を有するＤＮＡを取得し、得られたＤＮＡを連結することによって、配列番号１４４で示される塩基配列（配列番号１５９で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列および配列番号１４９で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを得ることができる。
例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３７８２から調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１２４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１４０で示される塩基配列の塩基番号３６４〜１０９６に示される塩基配列（配列番号１６０で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の部分塩基配列）を有するＤＮＡを得ることができる。得られたＤＮＡの塩基配列に基づき上述のようにして、その５’末端より上流側または３’末端より下流側に伸長する塩基配列を有するＤＮＡを取得し、得られたＤＮＡを連結することによって、配列番号１４５で示される塩基配列（配列番号１６０で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列および配列番号１５０で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを得ることができる。
例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ　ＩＦＯ　１４２７３ｔから調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１２４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１４１で示される塩基配列の塩基番号２９５〜１０２７に示される塩基配列（配列番号１３６で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の部分塩基配列）を有するＤＮＡを得ることができる。得られたＤＮＡの塩基配列に基づき上述のようにして、その５’末端より上流側または３’末端より下流側に伸長する塩基配列を有するＤＮＡを取得し、得られたＤＮＡを連結することによって、配列番号１４６で示される塩基配列（配列番号１３６で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列および配列番号１５１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを得ることができる。
例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１３６７３ｔから調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１２４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１４２で示される塩基配列の塩基番号３１６〜１０４８に示される塩基配列（配列番号１３７で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の部分塩基配列）を有するＤＮＡを得ることができる。得られたＤＮＡの塩基配列に基づき上述のようにして、その５’末端より上流側または３’末端より下流側に伸長する塩基配列を有するＤＮＡを取得し、得られたＤＮＡを連結することによって、配列番号１４７で示される塩基配列（配列番号１３７で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列および配列番号１５２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを得ることができる。
例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２４４４から調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１２４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１４３で示される塩基配列の塩基番号３１６〜１０４８に示される塩基配列（配列番号１３８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の部分塩基配列）を有するＤＮＡを得ることができる。得られたＤＮＡの塩基配列に基づき上述のようにして、その５’末端より上流側または３’末端より下流側に伸長する塩基配列を有するＤＮＡを取得し、得られたＤＮＡを連結することによって、配列番号１４８で示される塩基配列（配列番号１３８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列および配列番号１５３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを得ることができる。
例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ　ＩＦＯ　１３６８２Ｔから調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１２４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号２３２で示される塩基配列の塩基番号２８９〜１０１５に示される塩基配列（配列番号２２２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の部分塩基配列）を有するＤＮＡを得ることができる。得られたＤＮＡの塩基配列に基づき上述のようにして、その５’末端より上流側または３’末端より下流側に伸長する塩基配列を有するＤＮＡを取得し、得られたＤＮＡを連結することによって、配列番号２４２で示される塩基配列（配列番号２３２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列および配列番号２５２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを得ることができる。
例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３４４６Ｔから調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１２４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号２３４で示される塩基配列の塩基番号２８９〜１０１５に示される塩基配列（配列番号２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の部分塩基配列）を有するＤＮＡを得ることができる。得られたＤＮＡの塩基配列に基づき上述のようにして、その５’末端より上流側または３’末端より下流側に伸長する塩基配列を有するＤＮＡを取得し、得られたＤＮＡを連結することによって、配列番号２４４で示される塩基配列（配列番号２３４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列および配列番号２５４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを得ることができる。
【００２２】
上記のようにしてＰＣＲを用いて得られた本ＤＮＡ（Ａ）は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２^ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．等に記載されている通常の遺伝子工学的方法に準じた方法によりベクターにクローニングすることができる。具体的には、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴＡクローニングキットに含まれるプラスミドベクターやＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩなどのプラスミドベクターを用いてクローニングすることができる。
【００２３】
また、本ＤＮＡ（Ａ）は、例えば、以下のようにして調製することもできる。まず、本ＤＮＡ（Ａ）がコードする蛋白質のアミノ酸配列をコードし、ＧＣ含量が６０％以下４０％以上、好ましくは５５％以下４５％以上であって、かつ前記蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列のコドン使用率（ｃｏｄｏｎ　ｕｓａｇｅ）が、該本ＤＮＡ（Ａ）が導入される宿主細胞が属する生物種の遺伝子のコドン使用率のプラスマイナス４％の範囲内である塩基配列を設計する。設計された塩基配列を有するＤＮＡを通常の遺伝子工学的方法に準じて調製することにより、本ＤＮＡ（Ａ）を得ることができる。
例えば、本発明蛋白質（Ａ１）のアミノ酸配列（配列番号１）をコードし、ＧＣ含量が５５％以下４５％以上であって、かつ前記蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列のコドン使用率が、ダイズの遺伝子のコドン使用率のプラスマイナス４％の範囲内である塩基配列を以下のようにして設計する。まず、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８から得られうる本発明蛋白質（Ａ１）のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号６）のコドン使用率（表２２および表２３）とダイズのコドン使用率（表２４および表２５）とを比較する。比較結果に基づいて、ＧＣ含量が５５％以下４５％以上であって、かつコドン使用率がダイズのコドン使用率のプラスマイナス４％の範囲内となるように、配列番号６で示される塩基配列に塩基置換を加える。かかる塩基置換としては、アミノ酸置換を生じない塩基置換を選択する。例えば、ロイシンをコードするＣＴＧコドンの使用率は、ダイズの遺伝子において１．２２％であるのに対し、配列番号６で示される塩基配列においては７．０９％である。そこで、例えば、配列番号６で示される塩基配列の塩基番号１０６、１６３、１８１、２２６、２８９、２９２、５４４、１１１１、１２１０からそれぞれ始まるＣＴＧコドンをＣＴＴコドンに、塩基番号２１１、５４７、１０８４からそれぞれ始まるＣＴＧコドンをＣＴＡコドンに、塩基番号３３４から始まるＣＴＧコドンをＴＴＡコドンに、塩基番号６６４、７１８、７３３、７７２、８３５、１１２０、１１４１からそれぞれ始まるＣＴＧコドンをＴＴＧコドンに、塩基番号７８７から始まるＣＴＧコドンをＴＴＡコドンに、それぞれ置換する。このようにして設計された塩基配列の一例を配列番号２１４に示し、該塩基配列のコドン使用率を表２６および表２７に示す。配列番号２１４で示される塩基配列においては、例えば、上記のロイシンをコードするＣＴＧコドンの使用率は１．７１％であり、ダイズのコドン使用率（１．２２％）のプラスマイナス４％の範囲内となっている。配列番号２１４で示される塩基配列を有するＤＮＡは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．，　Ｆｒｉｓｃｈ　Ｅ．　Ｆ．，　Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｒｅｓｓ）等に記載されている部位特異的変異導入法等に準じて、配列番号６で示される塩基配列を有するＤＮＡに塩基置換を導入することにより調製することができる。また、後述の実施例４６に示すようなＰＣＲを利用したＤＮＡ合成方法等により、配列番号２１４で示される塩基配列を有するＤＮＡを調製することもできる。
同様にして、本発明蛋白質（Ａ２３）のアミノ酸配列（配列番号２２２）をコードし、ＧＣ含量が５５％以下４５％以上であって、かつ前記蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列のコドン使用率が、ダイズの遺伝子のコドン使用率のプラスマイナス４％の範囲内である塩基配列を設計した例として、配列番号３６８で示される塩基配列をあげることができる。また、本発明蛋白質（Ａ２５）のアミノ酸配列（配列番号２２４）をコードし、ＧＣ含量が５５％以下４５％以上であって、かつ前記蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列のコドン使用率が、ダイズの遺伝子のコドン使用率のプラスマイナス４％の範囲内である塩基配列を設計した例として、配列番号３９３で示される塩基配列をあげることができる。
上記のようにして得られる本ＤＮＡ（Ａ）は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２^ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．等に記載されている通常の遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニングすることができる。ベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＵＣＡ１１９（宝酒造社製）、ｐＴＶＡ１１８Ｎ（宝酒造社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　（東洋紡社製）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＫＫ３３１−１Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などを利用することができる。
また、上記のようにして得られる本ＤＮＡ（Ａ）の塩基配列は、Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ，　Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ，　Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ著、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７７）　７４：　５４６３−５４６７頁等に記載されているダイデオキシターミネーター法等により解析することができる。
【００２４】
上述のようにして得られる本ＤＮＡ（Ａ）にコードされる本蛋白質（Ａ）の、上記一般式で示されるＰＰＯ阻害型雑草防除活性化合物を代謝する能力は、例えば以下のようにして化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力を指標として確認することができる。まず、該ＤＮＡを後述のように、宿主細胞において機能可能なプロモーターの下流に接続されるようにベクターに挿入し、これを宿主細胞に導入して形質転換体を取得する。次いで、該形質転換体の培養物または該培養物を破砕して得られる抽出物を、補酵素ＮＡＤＰＨ等の電子供与体からの電子伝達系の存在下に化合物（ＩＩ）に作用させ、その結果生じた反応生成物を分析して化合物（ＩＩＩ）を検出する。このようにして、化合物（ＩＩ）を代謝して化合物（ＩＩＩ）を生成する能力を有する形質転換体を特定することができ、当該形質転換体はかかる能力を有する蛋白質をコードする本ＤＮＡ（Ａ）を保有していると判断することができる。より具体的には例えば、上記形質転換体の培養物もしくは抽出物、終濃度２ｍＭ程度のβ−ＮＡＤＰＨ等の電子供与体、終濃度２ｍｇ／ｍｌ程度のホウレンソウ由来のフェレドキシン、終濃度０．１Ｕ／ｍｌ程度のフェレドキシン還元酵素および放射性同位元素で標識された３ｐｐｍ程度の化合物（ＩＩ）を含有する０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液３０μｌを調製し、約３０℃〜約４０℃で１０分間〜１時間保温する。保温後の反応液に、３μｌの２Ｎ塩酸および９０μｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、８，０００×ｇで遠心分離し上清を回収する。該上清を減圧下で乾固した後、残渣を酢酸エチルに溶解させ、得られた溶解液をシリカゲルのＴＬＣプレートで展開する。該ＴＬＣプレートをラジオオートグラフィー分析して、放射性同位元素で標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットを検出することにより、化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力を確認することができる。
【００２５】
本発明ＤＮＡ（Ａ）や、該ＤＮＡの部分塩基配列もしくは該部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いて、上述のようなハイブリダイゼーションやＰＣＲを行うことにより、化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力を有する蛋白質をコードするＤＮＡや該ＤＮＡを有する微生物をさらに検索してもよい。
具体的には例えば、本発明ＤＮＡ（Ａ）、または、本発明ＤＮＡ（Ａ）の部分塩基配列もしくは該部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドをプローブとして用いて、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓなどのストレプトミセス属に属する微生物、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉなどのサッカロポリスポラ属に属する微生物等の天然の微生物由来のゲノムＤＮＡと上述のようなハイブリダイゼーションを行い、当該プローブがハイブリダイズするＤＮＡを検出する。プローブとして用い得るＤＮＡの具体例としては、配列番号６、７、８、１０９、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３または２３４のいずれかで示される塩基配列の全長を有するＤＮＡや、配列番号６で示される塩基配列の塩基番号５７〜７３０で示される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号８で示される塩基配列の塩基番号２１〜６９１で示される塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。
また、本発明ＤＮＡ（Ａ）の部分塩基配列もしくは該部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドをプライマーとして使用し、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓなどのストレプトミセス属に属する微生物、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉなどのサッカロポリスポラ属に属する微生物等の天然の微生物由来のゲノムＤＮＡを鋳型として上述のようなＰＣＲを行い、増幅されるＤＮＡを検出してもよい。プライマーとしては、上述のような「配列番号６、７、８または１０９で示される塩基配列において配列同一性が特に高い領域」の塩基配列に基づいて設計されたプライマーをあげることができる。より具体的なプライマーの例としては、上述の配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとの組合わせ等があげられる。
このようにして検出されたＤＮＡを回収する。回収されたＤＮＡが本ＤＮＡ（Ａ）の全長塩基配列に満たない場合は、該ＤＮＡを利用して上述のようにして全長塩基配列に相当するＤＮＡを調製する。得られたＤＮＡを宿主細胞に導入して形質転換体を作出する。得られた形質転換体の培養物を用いて上述のようにして化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力を検定することにより、該形質転換体に導入されたＤＮＡがコードする蛋白質が、化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力を評価することができる。
【００２６】
本ＤＮＡ（Ａ）を宿主細胞で発現させるには、本ＤＮＡ（Ａ）を宿主細胞内の発現可能な位置に導入する。本ＤＮＡ（Ａ）を「発現可能な位置に」導入するとは、本ＤＮＡ（Ａ）が、その塩基配列からの転写及び翻訳を指向する（即ち、例えば、本蛋白質（Ａ）をコードするＲＮＡおよび本蛋白質（Ａ）の産生を促進する）塩基配列と隣接した位置に置かれるように宿主細胞に導入することを意味する。
本ＤＮＡ（Ａ）を、該ＤＮＡが発現可能な位置に置かれるように宿主細胞に導入するには、例えば、宿主細胞で機能可能なプロモーターと本ＤＮＡ（Ａ）とが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡを宿主細胞に導入する。ここで、「機能可能な形で」とは、該ＤＮＡが宿主細胞に導入された際に、本ＤＮＡ（Ａ）が、プロモーターの制御下に発現するようにプロモーターと結合された状態にあることを意味する。
宿主細胞が微生物細胞である場合、機能可能なプロモーターとしては、例えば、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター、大腸菌のトリプトファンオペロンのプロモーター、Ｔ７ファージプロモーター、または、ｔａｃプロモーターもしくはｔｒｃプロモーター等の大腸菌内で機能可能な合成プロモーターなどをあげることができる。また、ストレプトミセス属、サッカロポリスポラ属等に属する微生物の染色体において本ＤＮＡ（Ａ）の上流に存在する元来のプロモーターを利用してもよい。
宿主細胞が植物細胞である場合には、機能可能なプロモーターとしては、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子プロモーター、オクトピン合成酵素遺伝子プロモーター等のＴ−ＤＮＡ由来の構成型プロモーター、カリフラワーモザイクウィルス由来の１９Ｓプロモーターもしくは３５Ｓプロモーター等の植物ウィルス由来のプロモーター、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ遺伝子プロモーター、カルコンシンターゼ遺伝子プロモーター、Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子プロモーター等の誘導型プロモーター、特開２０００−１６６５７７号公報に記載の植物プロモーターなどを挙げることができる。また、上記のような植物細胞で機能可能なプロモーターと本ＤＮＡ（Ａ）とが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡに植物細胞で機能可能なターミネーターを連結させてもよい。この場合、本ＤＮＡ（Ａ）の下流にターミネーターが位置するように連結すると一般的によい。機能可能なターミネーターとしては、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子（ＮＯＳ）ターミネーターなどのＴ−ＤＮＡ由来の構成型ターミネーター、ニンニクウィルスＧＶ１，ＧＶ２のターミネーターなどの植物ウィルス由来のターミネーター、特開２０００−１６６５７７号公報に記載の植物ターミネーターなどをあげることができる。
【００２７】
上記のように本ＤＮＡ（Ａ）を、該ＤＮＡが発現可能な位置に置かれるように植物細胞に導入する際に、例えば、細胞内オルガネラへの移行シグナル配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡが、本ＤＮＡ（Ａ）の上流に、その読み枠を合わせて連結されてなるＤＮＡを用いることもできる。ここで「読み枠を合わせて連結されて」とは、細胞内オルガネラへの移行シグナル配列をコードする読み枠と、本ＤＮＡ（Ａ）にコードされる本蛋白質（Ａ）の読み枠とが接続されて一続きの読み枠が形成されるように連結されていることを意味する。植物細胞において蛋白質の細胞内オルガネラへの移行と局在化をもたらす移行シグナル配列としては、例えば、米国特許５７１７０８４号公報に記載される植物の葉緑体に局在するタンパク質の細胞質前駆体タンパク質由来の移行シグナル配列や、米国特許ＲＥ３６４４９号公報に記載される複数種の移行シグナル配列から構成されるキメラ配列等をあげることができる。より具体的には、後述の実施例１５に示される方法によって取得可能なダイズのｒｉｂｕｌｏｓｅ−１，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ小サブユニット由来の葉緑体トランジットペプチド等があげられる。
【００２８】
一般的には、本ＤＮＡ（Ａ）、細胞内オルガネラへの移行シグナル配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと上記のように連結されてなる本ＤＮＡ（Ａ）、またはこれらのＤＮＡと宿主細胞で機能可能なプロモーターとが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡ等は、それぞれ宿主細胞で利用可能なベクターに組込んで、これを宿主細胞に導入する。宿主細胞において機能可能なプロモーターをあらかじめ保有するベクターを使用する場合には、ベクター保有のプロモーターと本ＤＮＡ（Ａ）とが機能可能な形で結合するように、該プロモーターの下流に本ＤＮＡ（Ａ）を挿入すればよい。
ベクターとしては、具体的には大腸菌を宿主細胞とする場合、例えばｐＵＣ１１９（宝酒造社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴＶＡ１１８Ｎ（宝酒造社製）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、ｐＫＫ３３１−１Ａ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、ｐＥＴ１１ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等をあげることができる。選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子など）を含むベクターを用いると、本ＤＮＡ（Ａ）が導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選択する際に便利である。
【００２９】
宿主細胞が、大腸菌、枯草菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属細菌、乳酸菌、酢酸菌、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ属細菌や、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ等の酵母、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ等のカビなどの微生物細胞である場合には、本ＤＮＡ（Ａ）または本ＤＮＡ（Ａ）を含むベクターを宿主細胞に導入する方法としては、日本生化学会編新生化学講座第１７巻微生物実験法（東京化学同人）等に記載の方法をあげることができる。また、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２^ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．等に記載される塩化カルシウム法や、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ：Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ　／Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｐｕｌｓｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍ」　Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　（１９９３）等に記載されるエレクトロポレーション法等を用いてもよい。
本ＤＮＡ（Ａ）または本ＤＮＡ（Ａ）を含むベクターが導入された形質転換体は、例えば、前述のような本ＤＮＡ（Ａ）が組込まれたベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選抜することができる。また、形質転換体が本ＤＮＡ（Ａ）または本ＤＮＡ（Ａ）を含むベクターを保有していることは、該形質転換体からＤＮＡを調製した後、調製されたＤＮＡについて、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２^ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ等に記載される遺伝子工学的分析方法（制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等）を行うことにより確認することができる。
【００３０】
また、例えば宿主細胞が植物細胞の場合、例えば、タバコ、ワタ、ナタネ、テンサイ、シロイヌナズナ、カノーラ、アマ、ヒマワリ、バレイショ、アルファルファ、レタス、バナナ、ダイズ、エンドウ、その他のマメ類、マツ、ポプラ、リンゴ、ブドウ、オレンジ、レモン、その他の柑橘類、アーモンド、クルミ、その他のナッツ類等の双子葉植物、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、ソルガム、オートムギ、サトウキビ、芝類等の単子葉植物等の植物種をあげることができ、本ＤＮＡ（Ａ）を導入する細胞としては、植物組織、植物個体、培養細胞、種子などを用いることができる。
本ＤＮＡ（Ａ）または本ＤＮＡ（Ａ）を含むベクターを宿主細胞に導入する方法としては、アグロバクテリウム感染方法（特公平２−５８９１７および特開昭６０−７００８０）、プロトプラストへのエレクトロポーレーション方法（特開昭６０−２５１８８７及び特開平５−６８５７５）、またはパーティクルガン方法（特表平５−５０８３１６及び特開昭６３−２５８５２５）等の手段をあげることができる。
この際、例えばハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等から選ばれる選択マーカー遺伝子を本ＤＮＡ（Ａ）を含むベクターと同時に植物細胞に導入すると、本ＤＮＡ（Ａ）が導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選択することができる。選択マーカー遺伝子と本ＤＮＡ（Ａ）とを同一のベクター上に組み込んで導入してもよいし、選択マーカー遺伝子を有するベクターと本ＤＮＡ（Ａ）を含むベクターとを同時に導入してもよい。また、本ＤＮＡ（Ａ）または本ＤＮＡ（Ａ）を含むベクターが導入された植物細胞を、上記一般式（Ｉ）で示されるＰＰＯ阻害型雑草防除活性化合物を含む培地で培養し増殖可能なクローンを単離することによっても、本ＤＮＡ（Ａ）が導入された形質転換体を選抜することができる。形質転換体が本ＤＮＡ（Ａ）を保有していることは、該形質転換体からＤＮＡを調製した後、調製されたＤＮＡについて、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２^ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ等に記載される遺伝子工学的分析方法（制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等）を行うことにより確認することもできる。植物細胞に導入された本ＤＮＡ（Ａ）は、核に含まれるＤＮＡの他、葉緑体等の細胞内オルガネラに含まれるＤＮＡに組み込まれて細胞内で維持されていても良い。
このようにして得られた形質転換植物細胞から、例えば、植物遺伝子操作マニュアル：トランスジェニック植物の作り方（内宮著、講談社サイエンティフィック１９９０年）、２７−５５頁などに記載されている植物細胞培養方法により植物体を再生させることによって、本ＤＮＡ（Ａ）が導入された形質転換植物を得ることができる。さらに、本ＤＮＡ（Ａ）が導入された形質転換植物と目的とする品種の植物とを交配させることにより、当該目的品種の植物の染色体に本ＤＮＡ（Ａ）を導入し、本ＤＮＡ（Ａ）が導入された目的品種の植物を取得することもできる。
【００３１】
具体的には、例えば、モデル植物の実験プロトコール　イネ・シロイヌナズナ編（島本功、岡田清孝監修、秀潤社１９９６年）、第４章に記載の方法によって、本ＤＮＡ（Ａ）が導入され本蛋白質（Ａ）を発現するイネやシロイヌナズナを得ることができる。また、特開平３−２９１５０１に記載されている方法で、パーティクルガンを用いてダイズ不定胚に導入して、本ＤＮＡ（Ａ）が導入され本蛋白質（Ａ）を発現するダイズを得ることができる。同様に、Ｆｒｏｍｍ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　８；　ｐ８３８　（１９９０）に記載されている方法に準じて、パーティクルガンを用いてトウモロコシ不定胚に導入して、本ＤＮＡ（Ａ）が導入され本蛋白質（Ａ）を発現するトウモロコシを得ることができる。宅見ら著、育種学会雑誌、１９９５年、第４４巻、別冊１号、５７頁に記載されている通常の方法に準じて、パーティクルガンを用いて無菌培養したコムギ未熟胚盤に導入して、本ＤＮＡ（Ａ）が導入され本蛋白質（Ａ）を発現するコムギを得ることができる。同様に、萩尾ら著、育種学会雑誌、１９９５年、第４４巻、別冊１号、６７頁に記載されている通常の方法に準じて、パーティクルガンを用いて無菌培養したオオムギ未熟胚盤に導入して、本ＤＮＡ（Ａ）が導入され本蛋白質（Ａ）を発現するオオムギを得ることができる。
【００３２】
本ＤＮＡ（Ａ）が導入され本蛋白質（Ａ）を発現する形質転換体は、その細胞内で、化合物（Ｉ）を雑草防除活性のより低い化合物に変換することによって、当該雑草防除活性化合物による植物傷害を軽減することができる。具体的には、例えば、目的品種の植物の種子を播種する前に、本蛋白質（Ａ）を発現する微生物を目的の栽培植物の栽培域土壌に散布することによって、土壌中に残留している上記雑草防除活性化合物を代謝し雑草防除活性化合物による目的植物の傷害を軽減することができる。また、本蛋白質（Ａ）を目的品種の植物で発現させることによって、該植物に、一般式（Ｉ）で示されるＰＰＯ阻害型雑草防除活性化合物を活性のより低い化合物へと代謝する能力が付与される。その結果、当該植物において上記雑草防除活性化合物による植物傷害が軽減されたり、該化合物に対する耐性が付与されたりする。
【００３３】
本蛋白質（Ａ）は、例えば本ＤＮＡ（Ａ）を有する細胞を培養することによって調製することができる。かかる細胞としては、本ＤＮＡ（Ａ）を発現し本蛋白質（Ａ）を産生する能力を有する微生物であって、例えば、本ＤＮＡ（Ａ）を有する自然界から分離された微生物株、該微生物株から薬剤や紫外線等の処理によって誘導された変異株等をあげることができる。より具体的には例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２７３５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ　　ＡＴＣＣ１１７９６、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ　ＳＡＮＫ６２５８５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ　ＩＦＯ　１２８７０ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ　ＩＦＯ　１４２７３ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ　ＩＦＯ　１３４４５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３７８２、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１３６７３ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２４４４、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１３０６９ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＡＴＣＣ　１０１３７、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＩＦＯ　１３８４９Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１２７８７Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３８５５Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ　ＩＦＯ　１３４３４Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ　ＩＦＯ　１３６８２Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１５８７５Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３４４６Ｔなどのストレプトミセス属に属する微生物や、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔなどのサッカロポリスポラ属に属する微生物等があげられる。また、本ＤＮＡ（Ａ）または本ＤＮＡ（Ａ）を含むベクターが宿主細胞に導入された形質転換体等をあげることもできる。具体的には例えば、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーターまたはＴ７ファージプロモーターと機能可能な形で接続された本ＤＮＡ（Ａ）が大腸菌に導入されてなる形質転換体をあげることができ、より具体的な例としては、後述の実施例に記載されるＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７Ｆ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ９２３、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ９２３Ｆ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１１７９６、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１１７９６Ｆ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６７１、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６７１Ｆ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮＳＣＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６４６、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６４６Ｆ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ８４９ＡＦ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６１８Ｆ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ４７４Ｆ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１４９１ＡＦ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５５５ＡＦ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５８４Ｆ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６０９Ｆ等があげられる。
【００３４】
上記のような本ＤＮＡ（Ａ）を有する微生物を培養する為の培地としては、微生物の培養に通常使用される炭素源や窒素源、有機ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。アミノレブリン酸などのヘムの前駆体となる化合物を培地に添加してもよい。
炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、シュクロース、デキストリン等の糖類、グリセロール、ソルビトール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸等があげられる。これら炭素源の培地への添加量は、培地全量に対し、通常約０．１％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）程度である。
窒素源としては、例えば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーンステイープリカー、綿実粉、乾燥酵母、カゼイン加水分解物等の天然有機窒素源又はアミノ酸類等があげられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は、多くの場合、炭素源としても使用することができる。窒素源の添加量は培地全量に対し通常、約０．１％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）程度である。
無機塩類としては、例えば、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム等のリン酸塩、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化コバルト６水和物等の塩化物塩、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄７水和物、硫酸亜鉛７水和物、硫酸マンガン３水和物等の硫酸金属塩等をあげることができ、その添加量は培地全量に対し通常、約０．０００１％（ｗ／ｖ）〜約１％（ｗ／ｖ）程度である。
また、Ｔ７ファージプロモーターの下流に接続された本ＤＮＡ（Ａ）と、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ（λＤＥ３　ｌｙｓｏｇｅｎ）をコードする塩基配列がｌａｃＵＶ５プロモーターの下流に接続されてなるＤＮＡとを保有する形質転換体を培養する場合には、通常、本蛋白質（Ａ）の生産を誘導するための誘導剤として、例えばｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（以下、ＩＰＴＧと記す。）を培地に少量加える。ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等のラクトースで誘導されるタイプのプロモーターと本ＤＮＡ（Ａ）とが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡが宿主細胞に導入されてなる形質転換体を培養する場合にも、ＩＰＴＧを培地に加えてもよい。
【００３５】
本ＤＮＡ（Ａ）を有する微生物の培養は、微生物の培養に通常使用される方法に準じて行うことができ、例えば旋回振盪培養、往復振盪培養、ジャーファーメンター（Ｊａｒ　Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）培養もしくはタンク培養等の液体培養、または、固体培養等の方法が可能である。ジャーファーメンターを用いる場合には、ジャーファーメンター内に無菌空気を導入する必要があり、通常、培養液容量の約０．１倍〜約２倍／分の通気条件が用いられる。培養温度は、微生物が生育可能な範囲で適宜変更できるが、約１５℃〜約４０℃の範囲の培養温度が一般的であり、培地のｐＨとしては、約６〜約８の範囲が好ましい。培養時間は、培養条件によって異なるが、通常は約１日間〜約１０日間程度である。
【００３６】
本ＤＮＡ（Ａ）を有する微生物によって産生される本蛋白質（Ａ）は、例えば、本蛋白質（Ａ）を産生する微生物の培養物、本蛋白質（Ａ）を産生する微生物の菌体、かかる菌体の処理物、無細胞抽出液、粗精製蛋白質、精製蛋白質等の種々の形態で、例えば上記一般式（Ｉ）で示されるＰＰＯ阻害型雑草防除活性化合物の処理に用いることができる。ここで菌体の処理物としては、例えば、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体摩砕物、菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物、菌体のアルカリ処理物、菌体の有機溶媒処理物等をあげることができる。また、上記のような種々の形態の本蛋白質（Ａ）を、例えば、シリカゲルやセラミックス等の無機担体、ＤＥＡＥ−セルロース等の多糖類の誘導体、もしくはアンバーライトＩＲＡ９３５（商品名、ローム・アンド・ハース社製）等の合成高分子等へ吸着させる担体結合法や、ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲルもしくは寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に閉じ込める包括法などの公知の方法に準じて固定化して上記雑草防除活性化合物の処理に用いることもできる。
【００３７】
本蛋白質（Ａ）を本ＤＮＡ（Ａ）を有する微生物の培養物から精製する方法としては、蛋白質の精製において通常使用される方法を適用することができ、例えば次のような方法をあげることができる。
まず、微生物の培養物から遠心分離等により菌体を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理もしくはフレンチプレス処理等の物理的破砕方法、または界面活性剤もしくはリゾチーム等の菌体溶菌酵素を用いる化学的破砕方法などによって破砕する。得られた破砕液から、遠心分離、メンブレンフィルターろ過等により不溶物を除去して無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって本蛋白質（Ａ）を精製することができる。クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、フェニル基、もしくはブチル基等を導入したセルロース、デキストランまたはアガロース等の樹脂担体が挙げられる。市販の担体充填済みカラムを用いることもでき、例えば、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＨＰ、ＰＤ−１０、ＨｉＬｏａｄ　２６／１０　ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ　ＨＰ（商品名、いずれもアマシャム　ファルマシア　バイオテク社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷ（商品名、東ソー社製）等があげられる。
【００３８】
本蛋白質（Ａ）の精製操作の一例を示す。
本蛋白質（Ａ）を産生する微生物の菌体を遠心分離により集めた後、例えば０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．０）等の緩衝液に懸濁する。これを超音波破砕機にて破砕処理し、得られた菌体破砕液を約４０，０００×ｇで３０分間程度遠心分離した後、上清を回収してこれを１５０，０００×ｇで１時間程度遠心分離し、上清（無細胞抽出液）を回収する。得られた無細胞抽出液を硫安分画し、４５％飽和硫酸アンモニウム存在下に可溶性であり、５５％飽和硫酸アンモニウム存在下に沈殿する画分を得る。この画分の溶媒を、ＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等を用いて例えば０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．０）等の硫酸アンモニウムを含まない緩衝液に置換した後、例えば　ＨｉＬｏａｄ　２６／１０　Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＨＰカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に導入し、塩化ナトリウム直線濃度勾配を付した２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）を流して溶出液を分画回収し、補酵素ＮＡＤＰＨ等の電子供与体からの電子伝達系の存在下に化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する活性が検出される画分を集める。次いで該画分を例えばＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等を用いてバッファー置換した後、Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ　Ｃｅｒａｍｉｃ　例えばＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ，　ＴｙｐｅＩｃｏｌｕｍ　ＣＨＴ１０−Ｉ（バイオラッド社製）に注入する。該カラムをＡバッファー（１．５ｍＭの塩化カルシウムを含む２ｍＭリン酸カリウムバッファー；ｐＨ７．０）で洗浄した後、Ｂバッファー（０．０３ｍＭの塩化カルシウムを含む１００ｍＭリン酸カリウムバッファー；ｐＨ７．０）の添加による直線濃度勾配を付したＡバッファーを流し、溶出液を分画回収して、補酵素ＮＡＤＰＨ等の電子供与体からの電子伝達系の存在下に化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する活性が検出される画分を集める。得られた画分を例えばＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等を用いてバッファー置換した後、例えば限外ろ過（マイクロコンフィルターユニットマイクロコン−３０、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）にて濃縮する。得られた画分を例えばＨｉＬｏａｄ　１６／６０　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　７５　ｐｇ　カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に注入し、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ、溶出液を分画回収し、補酵素ＮＡＤＰＨ等の電子供与体からの電子伝達系の存在下に化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する活性が検出される画分を集める。必要に応じて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画することにより、本蛋白質（Ａ）を精製することもできる。
【００３９】
上述のようにして本発明蛋白質（Ａ）を精製し、得られた本発明蛋白質（Ａ）を免疫抗原として用いることにより、本発明蛋白質（Ａ）を認識する抗体（以下、本発明抗体（Ａ）と記すことがある。）を作製することができる。
具体的には、例えば、上述のようにして精製した本発明蛋白質（Ａ）を抗原として動物を免疫感作化する。例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ラット、ウサギ、イヌ等の動物を免疫するには、例えば、Ｊ．ＡＳＳＯＣ．ＯＦＦ．ＡＮＡＬ．ＣＨＥＭ　７０（６）　１０２５−１０２７　（１９８７）等に記載されるＷ．Ｈ．Ｎｅｗｓｏｍｅ　等の通常の免疫感作の方法を用いて、抗原を１回またはそれ以上の回数投与する。投与のスケジュールとしては、例えば、７日ないし３０日間隔、好ましくは１２日ないし１６日間隔で、２または３回の投与等があげられる。投与量は１回につき、例えば抗原約０．０５ｍｇから約２ｍｇ程度を目安とする。投与経路は、皮下投与、皮内投与、腹膜腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等を選択することができるが、静脈内、腹膜腔内もしくは皮下に行う注射が一般的な投与形態である。抗原は、適当な緩衝液、例えば完全フロイントアジュバント（Ａｒａｃｅｌ　Ａ．Ｂａｙｏｌ　Ｆ　　結核死菌を混合したもの）、ＲＡＳ〔ＭＰＬ（Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ　Ｌｉｐｉｄ　Ａ）＋ＴＤＭ（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ　Ｄｉｃｏｒｙｎｏｍｙｃｏｌａｔｅ）＋ＣＷＳ（Ｃｅｌｌ　Ｗａｌｌ　Ｓｋｅｌｅｔｏｎ）　アジュバントシステム〕　、水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントの１種を含有するナトリウム系リン酸緩衝液、生理食塩水等に溶解して用いられるが、投与経路や条件等によっては、上記のようなアジュバントを使用しないこともある。アジュバントとは、抗原とともに投与したとき、非特異的にその抗原に対する免疫反応を増強する物質である。そして、上記のようにして抗原を投与した動物を、０．５ケ月間ないし４ケ月間飼育した後、該動物の血液を耳静脈等から少量サンプリングし、抗体価を測定する。抗体価が上昇していたら、状況に応じて、抗原の投与をさらに適当回数実施する。例えば、約１００μｇないし約１０００μｇの投与量でもう１回抗原の投与を行う。最後の投与の１ケ月ないし２ケ月後に、免疫感作した動物から通常の方法により血液を採取する。採取された血液を、例えば、遠心分離、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコールを用いることによる沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等の通常の方法によって分画することにより、ポリクローナル抗血清として本発明抗体（Ａ）を得ることができる。なお血清を、例えば、５６℃で３０分間保温することによって補体系の不活性化してもよい。
また、本発明蛋白質（Ａ）の部分アミノ酸配列を有するポリペプチドを化学合成し、これを免疫抗原として動物に投与することにより、本発明抗体（Ａ）を作製することもできる。免疫抗原として用いるポリペプチドのアミノ酸配列としては、例えば、本発明蛋白質（Ａ）のアミノ酸配列の中から、他の蛋白質のアミノ酸配列とのホモロジーがなるべく低いアミノ酸配列を選択する。選択されたアミノ酸配列からなる１０アミノ酸から１５アミノ酸程度の長さのポリペプチドを、通常の方法に準じて化学合成し、Ｌｉｍｕｌｕｓ　ｐｌｙｈｅｍｕｓのｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ等のキャリアー蛋白質とＭＢＳ等により架橋した後、上記と同様にウサギ等の動物に免疫する。
このようにして作製される本発明抗体（Ａ）と被験試料とを接触させ、被験試料中の蛋白質と前記抗体との複合体を、例えば、通常の免疫学的手法に準じて検出することにより、該被験試料中の本発明蛋白質（Ａ）もしくはその部分アミノ酸配列を有するポリペプチドを検出することができる。具体的には、例えば、後述の実施例４５または７３に示されるような本発明抗体（Ａ）を用いたウェスタンブロット分析によって、供試した試料中における本発明蛋白質（Ａ）の有無の判断や、本発明蛋白質（Ａ）の定量を行うことが可能である。
また、例えば、本発明抗体（Ａ）と被験細胞または被験細胞から調製された試料とを接触させ、被験細胞または被験細胞から調製された試料中の蛋白質と前記抗体との複合体を通常の免疫学的手法に準じて検出することにより、本発明蛋白質（Ａ）を発現する細胞を検出することもできる。このようにして本発明蛋白質（Ａ）を発現する細胞を検出することにより、種々の細胞の中から本発明蛋白質（Ａ）を発現する細胞を選抜することも可能である。例えば、本発明蛋白質（Ａ）を発現する細胞からゲノムＤＮＡを抽出して発現ベクターに挿入することによりゲノムＤＮＡライブラリーを作製し、それらを細胞に導入する。得られた細胞集団の中から、上記のようにして本発明抗体（Ａ）を用いて本発明蛋白質（Ａ）を発現する細胞を選抜することにより、本発明蛋白質（Ａ）をコードするＤＮＡを含有するクローンを選抜・クローニングすることも可能である。
本発明抗体（Ａ）を含有するキットは、例えば、上述のような本発明蛋白質（Ａ）の検出や、本発明蛋白質（Ａ）を発現する細胞の分析、検出、検査等に利用することができる。かかる本発明のキットは、本発明抗体（Ａ）のほかに、上記のような分析手法に必要な試薬を含んでいてもよいし、かかる試薬と組合わせて使用しても良い。
【００４０】
上記一般式（Ｉ）で示されるＰＰＯ阻害型雑草防除活性化合物に、補酵素ＮＡＤＰＨ等の電子供与体からの電子伝達系の存在下、本蛋白質（Ａ）を作用させると、前記化合物は代謝され、雑草防除活性がより低い化合物に変換される。具体的には例えば、補酵素ＮＡＤＰＨ等の電子供与体からの電子伝達系の存在下、化合物（ＩＩ）に本蛋白質（Ａ）を作用させると、化合物（ＩＩ）は、雑草防除活性を実質的に示さない化合物（ＩＩＩ）に変換される。ここで本蛋白質（Ａ）としては、例えば、本発明蛋白質（Ａ）をあげることができる。本蛋白質（Ａ）のうちの１種類の蛋白質を作用させてもよいし、複数種の蛋白質を併用してもよい。
上記一般式（Ｉ）で示されるウラシル化合物の具体例としては、上記化合物（ＩＩ）や、以下の式（ＩＶ）〜（ＩＸ）のいずれかで示される化合物［以下、それぞれ化合物（ＩＶ）〜化合物（ＩＸ）と記す。］等をあげることができる。化合物（ＩＩ）および化合物（ＩＸ）は特開２０００−３１９２６４号公報に、化合物（ＩＶ）および化合物（Ｖ）は米国特許５１８３４９２号公報に、化合物（ＶＩ）は米国特許５６７４８１０号公報に、化合物（ＶＩＩ）は特開平３−２０４８６５号公報に、化合物（ＶＩＩＩ）は特開平６−３２１９４１号公報に、それぞれ記載の方法に準じて合成することが可能である。
【００４１】

【００４２】
また、上記一般式（Ｉ）で示される化合物の具体例として、以下の式（Ｘ）〜（ＸＶＩＩ）のいずれかで示される化合物［以下、それぞれ化合物（Ｘ）〜化合物（ＸＶＩＩ）と記す。］等をあげることもできる。

【００４３】
本蛋白質（Ａ）による代謝反応の基質となり得る化合物は、例えば、該化合物を、補酵素ＮＡＤＰＨ等の電子供与体からの電子伝達系の存在下において、放射性同位元素等で標識された化合物（ＩＩ）に本蛋白質（Ａ）を作用させる反応系に共存させると、標識された化合物（ＩＩ）から標識された化合物（ＩＩＩ）への本蛋白質（Ａ）による変換反応が競争阻害されることを指標に選抜することができる。このようにして被験化合物による競争阻害の有無を検定する場合には、被験化合物は、標識された化合物（ＩＩ）に対して、通常、１倍〜１００倍程度のモル濃度となるよう添加する。
【００４４】
本蛋白質（Ａ）を化合物（Ｉ）に作用させる反応は、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩などの無機酸塩や、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸アルカリ金属塩などの有機酸塩等を含む水性緩衝液中で行うことができる。上記一般式（Ｉ）で示される化合物の代謝反応液中における濃度は通常３０％（ｗ／ｖ）程度以下が適しており、好ましくは０．００１％（ｗ／ｖ）〜２０％（ｗ／ｖ）程度である。ＮＡＤＰＨ等の電子供与体からの電子伝達系や本蛋白質（Ａ）の量は、例えば反応時間等を考慮して適宜決めることができる。反応温度は通常、約１０℃〜約７０℃の範囲から選ばれ、好ましくは約２０℃〜約５０℃程度である。反応液のｐＨは通常約４〜約１２の範囲から選ばれ、好ましくは約５〜約１０程度である。反応時間は、任意に設定することができ、通常は約１時間〜約１０日間程度である。
また、本蛋白質（Ａ）を化合物（Ｉ）に作用させる反応は、本ＤＮＡ（Ａ）を有する細胞の細胞内で行わせることもできる。本ＤＮＡ（Ａ）を有する細胞としては、例えば、本ＤＮＡ（Ａ）を発現し本蛋白質（Ａ）を産生する能力を有する微生物であって、例えば、自然界から分離された本ＤＮＡ（Ａ）を有する微生物株、該微生物株から薬剤や紫外線等の処理によって誘導された変異株、本ＤＮＡ（Ａ）または本ＤＮＡ（Ａ）を含むベクターが宿主細胞に導入されてなる形質転換微生物細胞等をあげることができる。また、本ＤＮＡ（Ａ）が導入された形質転換植物細胞や、本ＤＮＡ（Ａ）が導入された形質転換植物体の細胞をあげることもできる。このような場合、上記一般式（Ｉ）で示される化合物は、本ＤＮＡ（Ａ）を有する細胞に取り込まれるように、該細胞の培養液や該細胞が接触する土壌等に含有させてもよく、該細胞に直接施用してもよい。ＮＡＤＰＨ等の電子供与体からの電子伝達系は、該細胞が本来細胞内に保有する系を利用してもよいし、細胞外から添加されてもよい。
【００４５】
本蛋白質（Ａ）による化合物（Ｉ）の代謝は、例えば、化合物（Ｉ）の代謝により生成した化合物を検出することにより確認することができる。具体的には例えば、化合物（ＩＩ）の代謝により生成する化合物（ＩＩＩ）は、上述のようなＨＰＬＣ分析やＴＬＣ分析により検出することができる。
また、本蛋白質（Ａ）による化合物（Ｉ）の代謝は、化合物（Ｉ）に本蛋白質（Ａ）を作用させた後の反応液の雑草防除活性が、本蛋白質（Ａ）を作用させなかった場合と比べて低下することをもって確認することもできる。雑草防除活性の試験方法としては、例えば、イヌビエ、ノスズメノテッポウ、アメリカアサガオ、イチビ等の雑草に上記の反応液を散布し、雑草防除効果を調べる方法や、上記の反応液を散布した土壌で雑草を栽培し、雑草防除効果を調べる方法等をあげることができる。また、植物から採取した葉片に上記の反応液を滴下し、該反応液による植物傷害（白化）の有無を調べる方法をあげることもできる。
また、本蛋白質（Ａ）による化合物（Ｉ）の代謝は、化合物（Ｉ）に本蛋白質（Ａ）を作用させた後の反応液のＰＰＯ阻害活性が、化合物（Ｉ）に本蛋白質（Ａ）を作用させなかった反応液の該活性と比べて低下することを指標として確認することもできる。ＰＰＯは、プロトポルフィリノーゲンＩＸからプロトポルフィリンＩＸ（以下、ＰＰＩＸと記す。）への変換を触媒する酵素である。そこで、例えば、ＰＰＯの反応系に上記の反応液を添加した後、ＰＰＯの基質であるプロトポルフィリノーゲンＩＸを添加し、３０℃の暗所にて１時間〜２時間保温する。次いで、ＨＰＬＣ等を用いて各保温液中のＰＰＩＸの量を測定する。化合物（Ｉ）に本蛋白質（Ａ）を作用させた後の反応液を添加した系のＰＰＩＸ量が、化合物（Ｉ）に本蛋白質（Ａ）を作用させなかった反応液を添加した系のＰＰＩＸ量と比べて多い場合に、本蛋白質（Ａ）により化合物（Ｉ）が代謝されたと判定する。ＰＰＯとしては、植物等から精製された蛋白質を用いてもよいし、植物から抽出された葉緑体画分を用いてもよい。葉緑体画分を用いる場合には、ＰＰＯの反応系に、プロトポルフィリノーゲンＩＸの代わりに、クロロフィル・ヘム生合成経路におけるプロトポルフィリノーゲンＩＸの前駆体物質であるアミノレブリン酸などを用いてもよい。より具体的な例を、後述の実施例４２に示す。
【００４６】
このように本蛋白質（Ａ）を作用させることにより、上記一般式（Ｉ）で示されるＰＰＯ阻害型雑草防除活性化合物を代謝し、該化合物をより雑草防除活性の低い化合物に変換する処理を行うことができる。植物の栽培域に散布された該化合物、具体的には例えば、植物の栽培域に散布され土壌や植物残渣等に残留した該化合物などに本蛋白質（Ａ）を作用させて処理することにより、該化合物による植物傷害を軽減することもできる。
【００４７】
本蛋白質（Ａ）を化合物（Ｉ）に作用させる際に利用され得る「電子供与体からの電子伝達系」としては、例えば、補酵素ＮＡＤＰＨ、フェレドキシンおよびフェレドキシン−ＮＡＤＰ^＋還元酵素を含む系をあげることができる。
本蛋白質（Ａ）を化合物（Ｉ）に作用させる反応系に「電子供与体からの電子伝達系」を存在させる方法としては、例えば、ＮＡＤＰＨ、ホウレンソウ等の植物由来のフェレドキシン、ホウレンソウ等の植物由来のフェレドキシン−ＮＡＤＰ^＋還元酵素を上記反応系に添加する方法をあげることができる。また、本蛋白質（Ａ）の反応系において電子伝達系として機能可能な成分を含む画分を、大腸菌などの微生物等から調製し、該反応系に添加してもよい。かかる画分を調製するには、例えば、上記のような微生物等の培養物から遠心分離等により菌体を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理もしくはフレンチプレス処理等の物理的破砕方法、または界面活性剤もしくはリゾチーム等の菌体溶菌酵素を用いる化学的破砕方法などによって破砕する。得られた破砕液から、遠心分離、メンブレンフィルターろ過等により不溶物を除去して無細胞抽出液を調製する。該無細胞抽出液をそのまま、本蛋白質（Ａ）の反応系において電子伝達体として機能可能な成分を含む画分として、上記のフェレドキシンに替えて利用することができる。また、例えば本蛋白質（Ａ）と化合物（Ｉ）との反応が微生物や植物細胞等の細胞内で行われる場合のように、その細胞内に、電子供与体からの電子を本蛋白質（Ａ）に伝達可能な系が存在する場合には、電子伝達系を新たに反応系に添加しなくてもよい。
【００４８】
フェレドキシンとしては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ等のストレプトミセス属に属する微生物、より具体的には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２７３５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ　　ＡＴＣＣ１１７９６、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ　ＩＦＯ１４２７３ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ　ＩＦＯ　１３４４５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ１３７８２、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１３６７３ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２４４４、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１３０６９ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＡＴＣＣ　１０１３７、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＩＦＯ　１３８４９Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ　ＩＦＯ１２７８７Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３８５５Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ　ＩＦＯ１３４３４Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ　ＩＦＯ　１３６８２Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１５８７５Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３４４６Ｔなど、または、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉのサッカロポリスポラ属に属する微生物、より具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔなどから調製され得るフェレドキシン［以下、一括して本蛋白質（Ｂ）と記すことがある。］を用いることもできる。具体的には例えば、以下の群から選ばれるフェレドキシン［以下、一括して本発明蛋白質（Ｂ）と記すことがある。］をあげることができる。
＜蛋白質群＞
（Ｂ１）配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ｂ１）と記すことがある。］。
（Ｂ２）配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ｂ２）と記すことがある。］。
（Ｂ３）配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ｂ３）と記すことがある。］。
（Ｂ４）配列番号１１１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ｂ４）と記すことがある。］。
（Ｂ５）配列番号１２、１３、１４または１１１で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ６）配列番号１２、１３、１４または１１１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ７）配列番号１４９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ｂ７）と記すことがある。］。
（Ｂ８）配列番号１５０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ｂ８）と記すことがある。］。
（Ｂ９）配列番号１５１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ｂ９）と記すことがある。］。
（Ｂ１０）配列番号１５２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ｂ１０）と記すことがある。］。
（Ｂ１１）配列番号１５３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ｂ１１）と記すことがある。］。
（Ｂ１２）配列番号１４９、１５１、１５２、１５３、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１もしくは２５３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１５０、２５２もしくは２５４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ１３）配列番号１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３もしくは２５４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ１４）配列番号２４５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１５）配列番号２４７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１６）配列番号２４８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１７）配列番号２４９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１８）配列番号２５０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１９）配列番号２５１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２０）配列番号２５２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２１）配列番号２５３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２２）配列番号２５４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
【００４９】
本蛋白質（Ｂ）をコードするＤＮＡ（以下、本ＤＮＡ（Ｂ）と記すことがある。）は、例えば、本発明蛋白質（Ｂ）のアミノ酸配列である配列番号１２、１３、１４、１１１、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３もしくは２５４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列に基づいて、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．等に記載される通常の遺伝子工学的方法に準じた方法により取得することができる。
【００５０】
本発明蛋白質（Ｂ）をコードするＤＮＡ（以下、一括して本発明ＤＮＡ（Ｂ）と記すことがある。）としては、
配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ｂ１）と記すことがある。］、
配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ｂ２）と記すことがある。］、
配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ｂ３）と記すことがある。］、
配列番号１１１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ｂ４）と記すことがある。］、
配列番号１２、１３、１４または１１１で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフェレドキシンをコードするＤＮＡ、
配列番号１２、１３、１４または１１１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するフェレドキシンをコードするＤＮＡ、
配列番号１４９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ｂ７）と記すことがある。］、
配列番号１５０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ｂ８）と記すことがある。］、
配列番号１５１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ｂ９）と記すことがある。］、
配列番号１５２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ｂ１０）と記すことがある。］、
配列番号１５３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明蛋白質（Ｂ１１）と記すことがある。］、
配列番号１４９、１５１、１５２、１５３、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１もしくは２５３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１５０、２５２もしくは２５４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフェレドキシンをコードするＤＮＡ、
配列番号１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３もしくは２５４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するフェレドキシンをコードするＤＮＡ、
配列番号２４５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
配列番号２４７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
配列番号２４８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
配列番号２４９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
配列番号２５０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
配列番号２５１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
配列番号２５２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
配列番号２５３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
配列番号２５４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
をあげることができる。
本発明ＤＮＡ（Ｂ）のより具体的な例としては、配列番号１５、１６、１７、１１２、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、２５５、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３または２６４で示される塩基配列のいずれかを有するＤＮＡや、配列番号１５、１６、１７、１１２、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、２５５、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３もしくは２６４で示される塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。かかるＤＮＡは、その塩基配列の部分塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲや該ＤＮＡをプローブとしたハイブリダイゼーション等の方法を、上述の本ＤＮＡ（Ａ）の調製方法において記載した条件等に準拠して行うことにより調製することができる。
具体的には例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８から調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１０５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号５３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１５で示される塩基配列を有するＤＮＡを得ることができる。
また、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔから調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１０６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号６３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１６で示される塩基配列を有するＤＮＡを得ることができる。
また、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９から調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１０７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号７２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１７で示される塩基配列を有するＤＮＡを得ることができる。
また、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ等のストレプトミセス属に属する微生物、より具体的には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２７３５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ　ＩＦＯ　１４２７３ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ　ＩＦＯ　１３４４５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３７８２、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１３６７３ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２４４４４、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１３０６９ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＡＴＣＣ　１０１３７、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＩＦＯ　１３８４９Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１２７８７Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３８５５Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ　ＩＦＯ　１３４３４Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ　ＩＦＯ　１３６８２Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１５８７５Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３４４６Ｔなど、または、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ等のサッカロポリスポラ属に属する微生物　より具体的にはＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔなどから上述のようにして調製された染色体ＤＮＡライブラリーに、配列番号１２、１３、１４、１１１、１４９、１５０、１５１、１５２または１５３で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有する約２０塩基以上の塩基からなるＤＮＡをプローブとして、上述する条件にてハイブリダイズさせ、該プローブが特異的に結合するＤＮＡを検出しこれを回収することによって本発明ＤＮＡ（Ｂ）を取得することもできる。かかるプローブとして用いられるＤＮＡの具体例としては、配列番号１５、１６、１７、１１２、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、２５５、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３または２６４で示される塩基配列のいずれかを有するＤＮＡ、かかる塩基配列の部分塩基配列を有するＤＮＡ、該部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡ等があげられる。
【００５１】
本ＤＮＡ（Ｂ）を宿主細胞で発現させるには、例えば、宿主細胞で機能可能なプロモーターと本ＤＮＡ（Ｂ）とが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡを、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．等に記載される通常の遺伝子工学的方法に準じた方法により調製し、これを宿主細胞に導入する。得られた形質転換体が本ＤＮＡ（Ｂ）を保有していることは、該形質転換体からＤＮＡを調製した後、調製されたＤＮＡについて、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２^ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ等に記載される遺伝子工学的分析方法（制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等）を行うことにより確認することができる。宿主細胞で機能可能なプロモーターと本ＤＮＡ（Ｂ）とが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡを、本ＤＮＡ（Ａ）を有する細胞に導入することにより、本ＤＮＡ（Ｂ）と本ＤＮＡ（Ａ）とを同一細胞内で発現させることもできる。
【００５２】
本蛋白質（Ｂ）は、例えば本ＤＮＡ（Ｂ）を有する細胞を培養することによって調製することができる。かかる細胞としては、本ＤＮＡ（Ｂ）を発現し本蛋白質（Ｂ）を産生する能力を有する微生物であって、例えば本ＤＮＡ（Ｂ）を有する自然界から分離された微生物株、該微生物株から薬剤や紫外線等の処理によって誘導された変異株等をあげることができる。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ等のストレプトミセス属に属する微生物、より具体的には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２７３５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ　　ＡＴＣＣ１１７９６、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ　ＩＦＯ　１４２７３ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ　ＩＦＯ　１３４４５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３７８２、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１３６７３ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２４４４４、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１３０６９ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＡＴＣＣ　１０１３７、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＩＦＯ　１３８４９Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１２７８７Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３８５５Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ　ＩＦＯ　１３４３４Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ　ＩＦＯ　１３６８２Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１５８７５Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３４４６Ｔなど、または、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ等のサッカロポリスポラ属に属する微生物、より具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔなどがあげられる。また、本ＤＮＡ（Ｂ）が宿主細胞に導入された形質転換体等をあげることもできる。具体的には例えば、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーターまたはＴ７ファージプロモーターと機能可能な形で接続された本ＤＮＡ（Ｂ）が大腸菌に導入されてなる形質転換体をあげることができ、より具体的な例としては、後述の実施例に記載されるＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７ＦＤ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ９２３ＦＤ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６７１ＦＤ等があげられる。
【００５３】
本ＤＮＡ（Ｂ）を有する微生物の培養は、微生物の培養に通常使用される方法に準じて、より具体的には、上述の本ＤＮＡ（Ａ）を有する微生物の培養方法において記載した条件等に準拠して行うことができる。
本ＤＮＡ（Ｂ）を有する微生物によって産生される本蛋白質（Ｂ）は、例えば、本蛋白質（Ｂ）を産生する微生物の培養物、本蛋白質（Ｂ）を産生する微生物の菌体、かかる菌体の処理物、無細胞抽出液、粗精製蛋白質、精製蛋白質等の種々の形態で本蛋白質（Ａ）の反応系に用いることができる。ここで菌体の処理物としては、例えば、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体摩砕物、菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物、菌体のアルカリ処理物、菌体の有機溶媒処理物等をあげることができる。また、上記のような種々の形態の本蛋白質（Ｂ）を、例えば、合成高分子等へ吸着させる担体結合法や、高分子の網目構造の中に閉じ込める包括法などの公知の方法に準じて固定化して本蛋白質（Ａ）の反応系に用いることもできる。
【００５４】
本蛋白質（Ｂ）を、本ＤＮＡ（Ｂ）を有する微生物の培養物から精製する方法としては、蛋白質の精製において通常使用される方法を適用することができ、例えば次のような方法をあげることができる。
まず、微生物の培養物から遠心分離等により菌体を集めた後、これを超音波処理等の物理的破砕方法、またはリゾチーム等の菌体溶菌酵素を用いる化学的破砕方法などによって破砕する。得られた破砕液から、遠心分離、メンブレンフィルターろ過等により不溶物を除去して無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって本蛋白質（Ｂ）を精製することができる。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等で分画することにより、本蛋白質（Ｂ）をさらに精製することもできる。
【００５５】
本蛋白質（Ｂ）のフェレドキシンとしての機能は、本蛋白質（Ａ）を化合物（Ｉ）に作用させる反応系におけるフェレドキシン−ＮＡＤＰ^＋還元酵素から本蛋白質（Ａ）への電子伝達体としての機能として確認することができる。具体的には例えば、本蛋白質（Ａ）を化合物（ＩＩ）に作用させる反応系に、ＮＡＤＰＨ、フェレドキシン−ＮＡＤＰ^＋還元酵素、本蛋白質（Ａ）とともに本蛋白質（Ｂ）を添加し、化合物（ＩＩ）から化合物（ＩＩＩ）への変換を検出することにより確認することができる。
【００５６】
本発明の雑草防除方法においては、本蛋白質（Ａ）を発現する植物の栽培域に化合物（Ｉ）を施用する。かかる植物は、１種類の本蛋白質（Ａ）を発現していてもよいし、複数種の本蛋白質（Ａ）を発現していてもよい。本蛋白質（Ａ）としては、例えば、本発明蛋白質（Ａ）をあげることができる。本蛋白質（Ａ）を発現する植物は、例えば上述のようにして本ＤＮＡ（Ａ）を、該ＤＮＡが発現可能な位置に置かれるように植物細胞に導入し、得られた形質転換細胞から植物体を再生させることによって、本ＤＮＡ（Ａ）が導入された形質転換植物として得ることができる。植物細胞に導入される本ＤＮＡ（Ａ）には、その上流に、細胞内オルガネラへの移行シグナル配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡが、その読み枠を合わせて連結されていてもよい。
本ＤＮＡ（Ａ）が導入され本蛋白質（Ａ）を発現する植物においては、その細胞中で、化合物（Ｉ）が雑草防除活性のより低い化合物へと代謝され、その結果として該化合物（Ｉ）による植物傷害が軽減されたり、該化合物（Ｉ）に対する耐性が付与されたりする。従って、本ＤＮＡ（Ａ）が導入され本蛋白質（Ａ）を発現する植物の栽培域に化合物（Ｉ）が施用された場合も良好に生育することができる。そこで、本ＤＮＡ（Ａ）が導入され本蛋白質（Ａ）を発現する植物を栽培してその栽培域に上記の雑草防除剤を施用することにより、該植物以外の雑草を効率よく取り除くことができ、該植物の収量の向上、高品質化、使用する除草剤の量の軽減、省力化などが可能となる。
【００５７】
本蛋白質（Ａ）を発現する細胞の上記一般式（Ｉ）で示される化合物または該化合物を含有する雑草防除剤に対する耐性度の評価は、本蛋白質（Ａ）をコードする遺伝子を発現する細胞と前記化合物または前記雑草防除剤とを接触させ、該細胞の傷害の度合いを評価することによって実施できる。
具体的には、本蛋白質（Ａ）を発現する微生物細胞の化合物（Ｉ）または該化合物を含有する雑草防除剤に対する耐性度を評価するには、例えば、特願平１１−１０２５３４に記載されたＰＰＯ活性阻害能を評価するために利用できる組換え大腸菌、より具体的には、Ｆ．Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｈ．Ｉｎｏｋｕｔｉ、Ｈ．Ｏｚａｋｉ，、（１９８８年）　Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、６３巻、２３７−２４９頁等に記載されているＰＰＯ遺伝子が欠失し増殖能を失った大腸菌ＢＴ３株等に、例えば、米国特許５９３９６０２号公報等に記載の植物のＰＰＯ遺伝子が機能可能な形で導入されてなり、該遺伝子を発現する組換え大腸菌に、さらに本ＤＮＡ（Ａ）を導入することにより、上記の植物のＰＰＯと本蛋白質（Ａ）とを発現する組換え大腸菌を作製する。当該組換え大腸菌を、化合物（Ｉ）または該化合物を含有する雑草防除剤を０〜１．０ｐｐｍ含む培養液中で３７℃で１８〜２４時間振とう培養し、当該組換え大腸菌の増殖を６００ｎｍの吸光度で測定することによって該化合物または該雑草防除剤に対する耐性度を評価することができる。本蛋白質（Ａ）としては、例えば、本発明蛋白質（Ａ）をあげることができる。
【００５８】
本蛋白質（Ａ）を発現する植物の上記一般式（Ｉ）で示される化合物または該化合物を含有する雑草防除剤に対する耐性度を評価する方法としては、該植物に雑草防除剤を散布し、該植物の生育度を測定する方法をあげることができる。より定量的に確認する方法としては、例えば、まず、該植物の葉片を様々な濃度の化合物（Ｉ）を含む水溶液中に浸すか、または、該植物の葉片に化合物（Ｉ）の水溶液を噴霧して寒天培地上で明所室温で放置する。数日後、該葉片からＭａｃｋｎｎｅｙ，　Ｇ．，　Ｊ．　Ｂｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，１４０；　ｐ３１５（１９４１）に記載の方法に準じてクロロフィルを抽出してクロロフィル含量を測定する。具体的には、例えば、該植物の葉を採取し主葉脈に沿って左右均等に２分割し、一方の葉片に雑草防除剤を全面に塗布し他方の葉片は未処理とする。これらの葉片を、０．８％寒天を含むＭＳ培地上に置き、明所、室温にて７日間放置する。次いで、各葉片を、それぞれ乳鉢と乳棒で５ｍｌの８０％アセトン水溶液中で磨砕してクロロフィルを抽出する。抽出液を８０％アセトン水溶液で１０倍に希釈した後、７５０ｎｍ、６６３ｎｍ、６４５ｎｍにおける吸光度を測定し、Ｍａｃｋｎｎｅｙ　Ｇ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　（１９４１）　１４０，　ｐ３１５記載の方法によって総クロロフィル含量を算出する。化合物（Ｉ）に対する耐性度は、処理した葉片の総クロロフィル含量の、未処理の葉片の総クロロフィル含量に対する百分率で表し比較評価することができる。本蛋白質（Ａ）としては、例えば、本発明蛋白質（Ａ）をあげることができる。
【００５９】
化合物（Ｉ）または該化合物を含有する雑草防除剤に対する耐性度を評価する上記の方法に基づいて、化合物（Ｉ）または該化合物を含有する雑草防除剤に対する耐性を示す植物や植物細胞を選抜することができる。例えば、該植物の栽培域に化合物（Ｉ）または該化合物を含有する雑草防除剤を散布し薬害が見られない植物を選抜するか、該植物細胞を化合物（Ｉ）の存在下で培養し継続的に生育する細胞を選抜する。具体的には、例えば、直径１０ｃｍ、深さ１０ｃｍの円筒形プラスチックポットに土壌を詰め、該植物の種子を播種し、温室内で栽培する。化合物（Ｉ）を含有する雑草防除剤５部、ソルポール３００５Ｘ（東邦化学）６部およびキシレン８９部をよく混合して乳剤とし、その所定量を、０．１％（Ｖ／Ｖ）の展着剤を含む１ヘクタールあたり１０００リットル相当の水で希釈し、上記のポットで栽培された植物体の上方からその茎葉部全面に均一に噴霧器で散布する。これらの植物体を１６日間温室内で栽培した後、該植物の薬害を調査し、薬害が認められない植物もしくは薬害が軽減されている植物を選抜するとよい。さらに、このようにして選抜された植物を交配させることにより、後代植物を得ることもできる。
【００６０】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【００６１】
実施例１、４１および４２における化合物の定量分析のためのＨＰＬＣ、ならびに化合物の分画精製のためのＨＰＬＣは、以下の条件にて行った。
（ＨＰＬＣ分析条件１）
カラム：スミパックスＯＤＳ２１１（住化分析センター製）
カラム温度：３５℃
流速：１ｍｌ／分
検出波長：ＵＶ２５４ｎｍ
溶出液Ａ：０．０１％ＴＦＡ水溶液
溶出液Ｂ：アセトニトリル
溶出条件：溶出液Ａが９０％、溶出液Ｂが１０％の割合で混合された溶出液で平衡化されたカラムにサンプルを注入した後、溶出液Ａが９０％、溶出液Ｂが１０％の割合で混合された溶出液を５分間流し、続いて２０分間かけて溶出液Ｂの割合を１０％から９０％にまで上げながら溶出液Ａと溶出液Ｂとの混合液を流し、さらに溶出液Ａが１０％、溶出液Ｂが９０％の割合で混合された溶出液を８分間流した。
【００６２】
実施例１　微生物による化合物（ＩＩ）の代謝
（１）化合物（ＩＩ）の代謝
表１および表２に示す種々の微生物を、ＩＳＰ２寒天培地（麦芽エキス１．０％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．４％（ｗ／ｖ）、グルコース　０．４％（ｗ／ｖ）、寒天２．０％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．３）上に生育させ、それらの１白金耳をＴＧＹ培地（トリプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）、グルコース　０．１％（ｗ／ｖ）、ＫＨ_２ＰＯ_４　０．０１％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．０）に植菌し、３０℃で２日間〜４日間振とう培養した。得られた培養液の０．１ｍｌを、化合物（ＩＩ）を１００ｐｐｍ含む３ｍｌの胞子形成培地（肉エキス０．１％（ｗ／ｖ）、トリプトース０．２％（ｗ／ｖ）、グルコース１％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．１）に植菌して３０℃で７日間〜８日間振とう培養した。得られた培養液に５０μｌの２Ｎ塩酸を添加し、これを３ｍｌの酢酸エチルで抽出した。得られた酢酸エチル層をＨＰＬＣで分析した。化合物（ＩＩ）（カラム保持時間２３．９分）の濃度は減少し、一方保持時間２１．６分と保持時間２２．２分の化合物（以下、それぞれ代謝物（Ｉ）と代謝物（ＩＩ）と記す。）の新たなピークが検出された。結果を表１および表２に示す。
【００６３】
【表１】

【００６４】
【表２】

表２中の注釈
１）　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｒｇｅｎｔｅｏｌｕｓ　ｖａｒ．ｔｏｙｏｎａｋｅｎｓｉｓ　ＡＴＣＣ２１４６８
２）　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｒｇｅｎｔｅｏｌｕｓ　ｖａｒ．ｔｏｙｏｎ　ＡＴＣＣ２１４６８ｔ
【００６５】
（２）代謝物（Ｉ）と代謝物（ＩＩ）の構造決定
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　　ＡＴＣＣ１１４２９　のグリセロールストックを３ｍｌの細菌用培地（ポリペプトン０．７％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）、グルコース　１．０％（ｗ／ｖ）、Ｋ_２ＨＰＯ_４　０．５％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．２）に植菌し、試験管を用い３０℃で一晩振とう培養して前培養液を得た。この前培養液を、１００ｐｐｍの化合物（ＩＩ）を含む３００ｍｌの細菌用培地に植菌し、これを小型試験管１００本に３ｍｌずつ分注して３０℃で６日間往復振とう培養した。こうして得られた２５０ｍｌの培養液に塩酸を添加してｐＨ２に調整した後、２５０ｍｌの酢酸エチルで抽出した。得られた酢酸エチル層から溶媒を留去し、残渣を３ｍｌのアセトンに溶解し、シリカゲルＴＬＣプレート（ＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ_２５４、２０ｃｍ×２０ｃｍ、０．２５ｍｍ厚、メルク社製）にスポットした。該ＴＬＣプレートを、トルエン−ぎ酸エチル−ぎ酸混合液（トルエン：ぎ酸：ぎ酸エチル＝５：７：１）を展開溶媒として展開し、Ｒｆ値０．５８付近のシリカゲルをかきとり、アセトンで抽出した。この抽出液からアセトンを留去し、残渣を１０ｍｌのアセトニトリルに溶解し、ＨＰＬＣによって分画して代謝物（Ｉ）と代謝物（ＩＩ）のみを含む画分を分取し、３．７ｍｇの代謝物（以下、代謝物Ａと記す。）を得た。
得られた代謝物Ａの質量分析を行った。代謝物Ａは化合物（ＩＩ）に比べて質量が１４小さかった。また、Ｈ‐ＮＭＲ解析により、代謝物Ａは上記式（ＩＩＩ）で示される構造を持つ化合物であることが判った。
【００６６】
（３）化合物（ＩＩＩ）の雑草防除活性試験
直径１０ｃｍ、深さ１０ｃｍの円筒形プラスチックポットに土壌を詰め、イヌビエ、ノスズメノテッポウおよびアメリカアサガオを播種し、温室内で１０日間栽培した。供試化合物５部、ソルポール３００５Ｘ（東邦化学）６部およびキシレン８９部をよく混合して乳剤とし、その所定量を、０．１％（Ｖ／Ｖ）の展着剤（特製リノー（日本農薬株式会社製））を含む１ヘクタールあたり１０００リットル相当の水で希釈し、上記のポットで栽培された植物体の上方からその茎葉部全面に均一に噴霧器で散布した。これらの植物体を１６日間温室内で栽培した後、供試化合物の雑草防除効力を調査した。結果を表３に示す。
【００６７】
【表３】

直径１０ｃｍ、深さ１０ｃｍの円筒形プラスチックポットに土壌を詰め、イヌビエ、ノスズメノテッポウおよびアメリカアサガオを播種した。供試化合物５部、ソルポール３００５Ｘ（東邦化学）６部およびキシレン８９部を混合して乳剤とし、その所定量を、１ヘクタール当たり１０００リットル相当の水で希釈し、上記のポットの土壌表面全面に均一に噴霧器で散布した。これらのポットで１９日間温室内にて上記の植物を栽培した後、雑草防除効力を調査した。結果を表４に示す。
【００６８】
【表４】

尚、上記の表３および表４において、雑草防除効力は、試験に用いた植物体の調査時の出芽または生育の状態が、供試化合物無処理のそれと比較してまったく違いが無いかもしくはほとんど違いが無い場合を「０」とし、植物体が完全枯死したかまたは出芽もしくは生育が完全に抑制された場合を「１０」として、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の１１段階で示す。
【００６９】
実施例２　本発明蛋白質（Ａ１）の調製
（１）菌体粗抽出液の調製
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８株のグリセロールストックを、１００ｍｌのＡ培地（グルコース０．１％（ｗ／ｖ）、トリプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）、リン酸水素二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．０）を入れた５００ｍｌ容三角フラスコに添加し、３０℃で一日間旋回培養して、前培養液を得た。この前培養液８ｍｌを２００ｍｌのＡ培地に植菌し、５００ｍｌ容羽付フラスコ内で３０℃で２日間、旋回培養した。このようにして得られた培養液から遠心分離（３，０００×ｇ、５分間）によって湿菌体を回収した。この湿菌体を１００ｐｐｍの化合物（ＩＩ）を含む１００ｍｌのＢ培地（グルコース１％（ｗ／ｖ）、牛肉エキス０．１％、トリプトース０．２％（ｗ／ｖ））に懸濁して、５００ｍｌ容坂口フラスコ内で３０℃で１６時間往復振とう培養した。このようにして得られた培養液１０Ｌから遠心分離（３，０００×ｇ、５分間）によって湿菌体を回収した。得られた湿菌体を１Ｌの０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）にて２回洗浄し、１６２ｇの湿菌体を得た。
この湿菌体を、菌体湿重量１ｇあたり２ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、この懸濁液に、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、５ｍＭ　ベンザミジン塩酸、１ｍＭ　ＥＤＴＡおよび１ｍＭ　ジチオトレイトールを添加した。これをフレンチプレス（大岳製作所製）で２回繰り返し破砕（１０００ｋｇ／ｃｍ^２）して菌体破砕液を得た。この菌体破砕液を遠心分離（４０，０００×ｇ、３０分間）した後、上清を回収してこれを１５０，０００×ｇで１時間遠心分離し、上清（以下、菌体粗抽出液と記す。）を分取した。
【００７０】
（２）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
^１４Ｃで標識された３ｐｐｍの化合物（ＩＩ）、２．４ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（以下、Ａ成分と記す。オリエンタル酵母社製）、０．５ｍｇ／ｍｌ　ホウレンソウ由来のフェレドキシン（以下、Ｂ成分と記す。ＳＩＧＭＡ社製）、１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（以下、Ｃ成分と記す。ＳＩＧＭＡ社製）および実施例２（１）で回収された菌体粗抽出液１８μｌを含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液３０μｌを調製し、３０℃で１時間保温した。また、前記の反応液組成中のＡ成分、Ｂ成分およびＣ成分のうちの１以上の画分を添加しない反応液を調製し、同様に保温した。保温後の各反応液に、３．０μｌの２Ｎ塩酸および９０μｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、８，０００×ｇで遠心分離し７５μｌの酢酸エチル相を回収した。該酢酸エチル相を減圧下で乾固させた後、残渣を６．０μｌの酢酸エチルに溶解させそのうち５．０μｌをシリカゲルＴＬＣプレート（ＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ_２５４、２０ｃｍ×２０ｃｍ、０．２５ｍｍ厚、メルク社製）にスポットした。該ＴＬＣプレートを、クロロホルム−酢酸−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸：酢酸エチル＝６：１：２）を展開溶媒として約１時間展開した後、溶媒を蒸発させ、イメージングプレート（富士写真フィルム社製）に一晩露光した。次いで、イメージングプレートをイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム社製）で解析し、^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。結果を表５に示す。
【００７１】
【表５】

【００７２】
（３）菌体粗抽出液の分画
実施例２（１）で得られた菌体粗抽出液に４５％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して氷上で攪拌した後、１２，０００×ｇ、１０分間遠心分離して上清を回収した。得られた上清に５５％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して氷上で攪拌した後、１２，０００×ｇ、１０分間遠心分離し、沈殿を回収して２７．５ｍｌの２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）に溶解した。この溶解液をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ、蛋白質を含む画分（以下、硫安沈殿４５−５５％画分と記す。）３８．５ｍｌを分取した。
【００７３】
（４）本発明蛋白質（Ａ１）の単離
実施例２（３）で調製された硫安沈殿４５−５５％画分を、ＨｉＬｏａｄ２６／１０　Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＨＰカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に注入した。次いで、前記カラムに１０６ｍｌの２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）を流した後、塩化ナトリウム直線濃度勾配を付して２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）を流し（塩化ナトリウム濃度勾配０．００１４１５Ｍ／分、塩化ナトリウム濃度範囲　０Ｍから　０．３７５Ｍ、流速３ｍｌ／分）、塩化ナトリウム濃度０．２１Ｍ〜０．２２Ｍにて溶出された画分２５ｍｌを分取した。さらにこの分取した画分をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ、蛋白質を含む画分を回収した。
回収された画分をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、Ａバッファー（１．５ｍＭの塩化カルシウムを含む２ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０）で溶出させ蛋白質を含む画分を回収した。次いで、該画分をＢｉｏ−ＳｃａｌｅＣｅｒａｍｉｃ　Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ，　ＴｙｐｅＩｃｏｌｕｍ　ＣＨＴ１０−Ｉ（バイオラッド社製）に注入し、該カラムに３０ｍｌのＡバッファーを流した。次いで、前記カラムにＢバッファー（０．０３ｍＭの塩化カルシウムを含む１００ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０）の直線濃度勾配を付してＡバッファーを流し（Ａバッファー１００％から開始し、１００分間かけてＢバッファー濃度を５０％にまで増加させる直線濃度勾配、流速２ｍｌ／分）、Ｂバッファー濃度１７％〜２０％にて溶出された画分を分取した。さらにこの分取した画分をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、０．０５Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ蛋白質を含む画分を回収した。
回収された画分を限外ろ過フィルター（マイクロコンＹＭ−３０、ミリポア社製）を用いて２０倍濃縮し、ＨｉＬｏａｄ１６／６０　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　７５　ｐｇカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に注入した。前記カラムに、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）を流し（流速１ｍｌ／ｍｉｎ）、溶出液を２ｍｌずつ分画し、溶出体積５６ｍｌ〜６６ｍｌに溶出した画分をそれぞれ分取した。各画分に含まれる蛋白質をＳＤＳ−１０％〜２０％ＰＡＧＥで分析した。
分取された各画分を実施例２（２）に記載の反応液における菌体粗抽出液の代わりに添加し、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩ）の存在下に、実施例２（２）と同様に保温した。保温後の反応液をＴＬＣ分析し、^１４Ｃで標識された　化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットの強度を調べた。上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約４７ｋＤａの位置に泳動された蛋白質は、連続した画分における蛋白質バンドの濃さの変動と、^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットの強度の変動がパラレルに観察された。該蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルから回収し、プロテインシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製Ｐｒｏｃｉｓｅ　４９４ＨＴ型、Ｐｕｌｓｅｄ　ｌｉｑｉｄ法で分析）によるアミノ末端アミノ酸配列解析に供した。その結果、配列番号１８で示されるアミノ酸配列が読み取られた。また、前記蛋白質をトリプシンにより消化した後、得られた消化物を質量分析した（ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ社製イオントラップ質量分析計ＬＣＱ、カラム：ＬＣ　Ｐａｃｋｉｎｇｓ社製ＰｅｐＭＡＰ　Ｃ１８　７５μｍ×１５０ｍｍ、移動相Ａ：０．１％ＨＯＡｃ−Ｈ_２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＨＯＡｃ−メタノール、グラジエント：移動相Ａ９５％、移動相Ｂ５％の割合で混合された溶出液から開始し、３０分間かけて移動相Ｂ濃度を１００％にまで増加させる直線濃度勾配、流速：０．２μｌ／分）。その結果、配列番号１９で示されるアミノ酸配列が読み取られた。
【００７４】
実施例３　本発明ＤＮＡ（Ａ１）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８の染色体ＤＮＡの調製
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８を５０ｍｌのＹＥＭＥ培地（酵母エキス　０．３％（ｗ／ｖ）、バクトペプトン　０．５％（ｗ／ｖ）、麦芽エキス　０．３％（ｗ／ｖ）、グルコース１．０％（ｗ／ｖ）、ショ糖３４％（ｗ／ｖ）、２．５Ｍ　ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ　０．２％（ｖ／ｖ））で１日間〜３日間、３０℃で振とう培養した後、集菌した。得られた菌体を、グリシン１．４％（ｗ／ｖ）、６０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む上記ＹＥＭＥ培地に懸濁し、さらに１日間振とう培養した。得られた培養液から菌体を集めて、蒸留水で１回洗浄した後に、菌体２００ｍｇ湿重当り１ｍｌのバッファー（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），　１００ｍＭ　ＥＤＴＡ，　１０ｍＭ　ＮａＣｌ）に再懸濁し、２００μｇ／ｍｌ卵白リゾチームを添加し３０℃で１時間振とうした。さらに、０．５％ＳＤＳ、１ｍｇ／ｍｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋを加えて５５℃で３時間インキュベートした。この菌体懸濁液を、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールで２回抽出してそれぞれ水層を回収し、次いでクロロホルム・イソアミルアルコールで１回抽出して水層を回収し、該水層からエタノール沈殿によって染色体ＤＮＡを得た。
【００７５】
（２）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８の染色体ＤＮＡライブラリーの調製
実施例３（１）で調製された染色体ＤＮＡ９４３ｎｇを１Ｕの制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで３７℃で６０分間消化した。得られた消化液を、０．７％アガロースゲル電気泳動で分画して、約２．０ｋｂｐのＤＮＡをゲルから回収した。Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ^Ｒ　ＤＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＢＩＯ‐ＲＡＤ社製）を用いて当該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製し、目的とするＤＮＡを含む溶液１０μｌを得た。得られたＤＮＡ溶液のうち１μｌと、制限酵素ＢａｍＨＩで消化され脱リン酸化処理されたプラスミドベクターｐＵＣ１１８　９８ｎｇとライゲーションキットＶｅｒ．２（宝酒造社製）のＩ液１１μｌとを混合し、１６℃、終夜保温した。このライゲーション液５μｌを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、該大腸菌を３０℃で一晩振とう培養した。得られた培養液から大腸菌を集菌してプラスミドを抽出し、染色体ＤＮＡライブラリーとした。
【００７６】
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ１）の単離
実施例３（１）で調製された染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った（図１）。プライマーとしては、配列番号３５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ（以下、プライマー対１と記す。）を用いた。ここで、配列番号３５で示される塩基配列は配列番号１８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列に基づいて設計した。また、配列番号３６で示される塩基配列は配列番号１９で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列に基づいて設計した。ＰＣＲ反応液には、２種類のプライマーをそれぞれ２００ｎＭとなるよう添加し、上記染色体ＤＮＡを２５０ｎｇ、ｄＮＴＰミックス（それぞれ１０ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）（クロンテック社製）を０．５μｌ、５ｘＧＣゲノミックＰＣＲ反応バッファー（クロンテック社製）を５μｌ、２５ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）_２を１．１μｌ、５Ｍ　ＧＣ−Ｍｅｌｔ（クロンテック社製）を５μｌおよびＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣゲノミックポリメラーゼミックス（クロンテック社製）を０．５μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を２５μｌにした。ＰＣＲの反応条件は９５℃で１分間保温した後、９４℃で１５秒間次いで６０℃で３０秒間次いで７２℃で１分間の保温を１サイクルとしてこれを３０サイクル繰り返し、さらに７２℃で５分間保温した。保温後の反応液を４％のアガロースゲル電気泳動に供し、約１５０ｂｐのＤＮＡを含むゲル部分を回収した。回収されたゲルからＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡを、ＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に、該ベクターに付属の取扱説明書に従いライゲーションして、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に導入した。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、−２１Ｍ１３プライマー（アプライドバイオシステムズジャパン社製）とＭ１３Ｒｅｖプライマー（アプライドバイオシステムズジャパン社製）をプライマーとして、ダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。反応物をＤＮＡシーケンサ３７３Ａ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。その結果、配列番号９で示される塩基配列の塩基番号３６〜１３２に示される塩基配列が読み取られた。該塩基配列には配列番号１８で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１２〜２３で示されるアミノ酸配列がコードされていた。従って、このＤＮＡは、本発明蛋白質（Ａ１）の一部をコードするＤＮＡであると推定された。
【００７７】
次に、実施例３（２）で調製された染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、上記と同様の条件でＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣゲノミックポリメラーゼミックス（クロンテック社製）によるＰＣＲを行った。プライマーとしては配列番号３７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ（以下、プライマー対２と記す。）、または、配列番号３９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号４０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ（以下、プライマー対３と記す。）を用いた。
次いで、プライマー対２を用いて得られた反応液を鋳型溶液とし、配列番号４１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの組合わせ（以下、プライマー対４と記す）をプライマーとして用いＰＣＲを行うことにより、配列番号９で示される塩基配列の塩基番号１３２で示される塩基より３’側下流に伸長する塩基配列を有するＤＮＡを増幅した。同様に、プライマー対３を用いて得られた反応液を鋳型溶液とし、配列番号４２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号４０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合わせ（以下、プライマー対５と記す）をプライマーとして用いＰＣＲを行うことにより、配列番号９で示される塩基配列の塩基番号３６で示される塩基の５’側上流に伸長する塩基配列を有するＤＮＡを増幅した。プライマー対４を用いて増幅された約２ｋｂｐのＤＮＡ、および、プライマー対５を用いて増幅された約１５０ｂｐのＤＮＡは、上記と同様にしてＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１にクローニングした。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、−２１Ｍ１３プライマー（アプライドバイオシステムズジャパン社製）とＭ１３Ｒｅｖプライマー（アプライドバイオシステムズジャパン社製）および配列番号４３〜５０で示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。反応物をＤＮＡシーケンサ３７３Ａ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。プライマー対４を用いて増幅された約２ｋｂｐのＤＮＡの塩基配列を解析した結果から、配列番号９で示される塩基配列の塩基番号１３３〜１４３９で示される塩基配列が読み取られた。また、プライマー対５を用いて増幅された約１５０ｂｐのＤＮＡの塩基配列を解析した結果から、配列番号９で示される塩基配列の塩基番号１〜３５で示される塩基配列が読み取られた。得られた塩基配列を連結した結果、配列番号９で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２２７塩基（終止コドンを含む）からなり４０８アミノ酸残基をコードする塩基配列（配列番号６）と、２０１塩基（終止コドンを含む）からなり６６アミノ酸残基をコードする塩基配列（配列番号１５）とが含まれた。配列番号６で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１）からなる蛋白質の分子量は４５２１３Ｄａと計算された。また、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列には、本発明蛋白質（Ａ１）のＮ末端アミノ酸配列解析から決定されたアミノ酸配列（配列番号１８）とトリプシン消化断片の質量分析によるアミノ酸配列解析から決定されたアミノ酸配列（配列番号１９）とが含まれていた。配列番号１５で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１２）からなる蛋白質の分子量は６８１８Ｄａと計算された。
【００７８】
実施例４　本発明蛋白質（Ａ１）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ１）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例３（１）でＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８から調製された染色体ＤＮＡを鋳型とし、Ｅｘｐａｎｄ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（ロッシュモレキュラーバイオケミカルズ社製）を使用してＰＣＲを行った。プライマーとしては、配列番号５１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号５２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合わせ（以下、プライマー対１９と記す。）、または、配列番号５１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号５３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合わせ（以下、プライマー対２０と記す。）を用いた。ＰＣＲ反応液には、２種類のプライマーをそれぞれ３００ｎＭとなるよう添加し、染色体ＤＮＡを５０ｎｇ、ｄＮＴＰミックス（それぞれ２．０ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を５．０μｌ、１０×Ｅｘｐａｎｄ　ＨＦバッファー（ＭｇＣｌ_２含有）を５．０μｌ、およびＥｘｐａｎｄ　ＨｉＦｉ酵素ミックスを０．７５μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を５０μｌとした。保温条件は、９７℃で２分間保温した後、９７℃で１５秒間次いで６５℃で３０秒間さらに７２℃で２分間の保温を１サイクルとしてこれを１０サイクル繰り返し、続いて、９７℃で１５秒間次いで６８℃で３０秒間さらに７２℃で２分間（７２℃での保温は１サイクル毎に２０秒間ずつ増加させる）の保温を１サイクルとしてこれを１５サイクル行い、さらに、７２℃で７分間保温した。保温後の反応液をそれぞれ１％アガロースゲル電気泳動に供し、プライマー対１９を用いた反応液を供したゲルからは約１．２ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出し、プライマー対２０を用いた反応液を供したゲルからは約１．５ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出した。回収されたそれぞれのゲルから、ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡとｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とを、該ベクター添付の取扱説明書に従ってライゲーションし、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’に導入した。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。次いで、該ＤＮＡを鋳型とし、−２１Ｍ１３プライマー（アプライドバイオシステムズジャパン社製）、Ｍ１３Ｒｅｖプライマー（アプライドバイオシステムズジャパン社製）、配列番号４３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび４６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。得られた反応物をＤＮＡシーケンサ３７３Ａ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号６で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ６５７とし、配列番号９で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ６５７Ｆとした。
一方、プラスミドｐＫＳＮ２４Ｒ２（Ａｋｉｙｏｓｈｉ−ＳｈｉｂａＴａ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４：　Ｐ３３５（１９９４）に記載）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｍｎＩで消化した。得られた約３ｋｂのＤＮＡに、配列番号１３４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１３５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをアニールさせて得られるリンカー（図４７）を挿入し、得られたプラスミドをｐＫＳＮ２（図４）とした。
次に、上記のプラスミドｐＣＲ６５７とｐＣＲ６５７Ｆをそれぞれ制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物をアガロースゲル電気泳動に供した。ｐＣＲ６５７の消化物を供したゲルからは約１．２ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出し、ｐＣＲ６５７Ｆの消化物を供したゲルからは約１．５ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出した。得られたゲルからそれぞれ、ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたそれぞれのＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とを、ライゲーションキットＶｅｒ．１（宝酒造社製）を用い、該キット付属の取扱説明書に従いライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、その構造を解析した。配列番号６で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ１）をコードする上記の約１．２ｋｂｐのＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドをｐＫＳＮ６５７とした。また、配列番号９で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ１）をコードする上記の約１．５ｋｂｐのＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドをｐＫＳＮ６５７Ｆとした。これらプラスミドｐＫＳＮ６５７およびｐＫＳＮ６５７Ｆをそれぞれ大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をそれぞれＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７およびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７Ｆとした。また、プラスミドｐＫＳＮ２を大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２とした。
【００７９】
（２）本発明蛋白質（Ａ１）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７Ｆ、およびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＴＢ培地（トリプトン１．２％（ｗ／ｖ）、酵母エキス２．４％（ｗ／ｖ）、グリセロール０．４％（ｖ／ｖ）、リン酸二水素カリウム１７ｍＭ、リン酸水素二カリウム７２ｍＭ）で３７℃で一晩培養した。得られた培養液のうち１ｍｌを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＴＢ培地に植菌して２６℃で培養し、ＯＤ６６０が約０．５になったところで、最終濃度５００μＭになるよう５−アミノレブリン酸を添加し培養を継続した。その３０分後に最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加しさらに１７時間培養した。
各培養液から菌体を回収し、それぞれ０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄した後、１ｍＭ　ＰＭＳＦを含む前記バッファー１０ｍｌに懸濁した。得られた菌体懸濁液を超音波破砕機（ＳＯＮＩＦＩＥＲ（Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｓｏｎｉｃ　Ｐｏｗｅｒ　社登録商標））を用いてｏｕｔ　ｐｕｔ　３、ｄｕｔｙ　ｃｙｃｌｅ　３０％の条件で３分間ずつ６回超音波処理して菌体破砕液を得た。得られた破砕液を、遠心分離（１，２００×ｇ、５分間）した後、上清を回収してこれを遠心分離（１５０，０００×ｇ、７０分間）し、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７Ｆから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７Ｆ、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を回収した。該上清画分のうち１μｌをＳＤＳ−１５％〜２５％ＰＡＧＥで分析し、クマージ−ブリリアントブルー（以下、ＣＢＢと記す。）染色した。その結果、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７Ｆのいずれにおいても、分子量約４７ｋＤａに相当する泳動位置に、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２よりも顕著に濃いバンドが検出された。このバンドは、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７Ｆにおいて大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７よりも、濃く検出された。大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７Ｆのほうが、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７よりも本発明蛋白質（Ａ１）を多く発現していることが示された。
【００８０】
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
^１４Ｃで標識された３ｐｐｍの化合物（ＩＩ）、２ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Ａ成分、オリエンタル酵母社製）、２ｍｇ／ｍｌのホウレンソウ由来のフェレドキシン（Ｂ成分、ＳＩＧＭＡ社製）、０．１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（Ｃ成分、ＳＩＧＭＡ社製）および実施例４（２）で回収された上清画分１８μｌを含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液３０μｌを調製し、３０℃で１時間保温した。また、前記の反応液組成中のＡ成分、Ｂ成分およびＣ成分のうちの１以上の画分を添加しない反応液を調製し、同様に保温した。保温後の各反応液に、３．０μｌの２Ｎ塩酸および９０μｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、８，０００×ｇで遠心分離し７５μｌの酢酸エチル相を回収した。該酢酸エチル相を減圧下で乾固させた後、残渣を６．０μｌの酢酸エチルに溶解させその内５．０μｌをシリカゲルＴＬＣプレート（ＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ_２５４、２０ｃｍ×２０ｃｍ、０．２５ｍｍ厚、メルク社製）にスポットした。該ＴＬＣプレートを、クロロホルム−酢酸−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸：酢酸エチル＝６：１：２）を展開溶媒として約１時間展開した後、溶媒を蒸発させ、イメージングプレート（富士写真フィルム社製）に一晩露光した。次いで、イメージングプレートをイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム社製）で解析し、^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。結果を表６に示す。
【００８１】
【表６】

【００８２】
実施例５　本発明蛋白質（Ａ２）の調製
（１）菌体粗抽出液の調製
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔのグリセロールストックを、１０ｍｌのＡ培地（グルコース０．１％（ｗ／ｖ）、トリプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）、りん酸水素二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．０）を入れた１０ｍｌ容試験管に添加し、３０℃で一晩往復振とう培養して、前培養液を得た。この前培養液８ｍｌを２００ｍｌのＡ培地に植菌し、５００ｍｌ容羽付フラスコ内で３０℃で２日間、旋回培養した。このようにして得られた培養液から遠心分離（３，０００×ｇ、１０分間）によって湿菌体を回収した。この湿菌体を１００ｐｐｍの化合物（ＩＩ）を含む１００ｍｌのＢ培地（グルコース１％（ｗ／ｖ）、牛肉エキス０．１％、トリプトース０．２％（ｗ／ｖ））に懸濁して、５００ｍｌ容坂口フラスコ内で３０℃で２０時間往復振とう培養した。このようにして得られた培養液１０Ｌから遠心分離（３，０００×ｇ、１０分間）によって湿菌体を回収した。得られた湿菌体を１Ｌの０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）にて２回洗浄し、１１９ｇの湿菌体を得た。
この湿菌体を、菌体湿重量１ｇあたり２ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、この懸濁液に、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、５ｍＭ　ベンザミジン塩酸、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、３μｇ／ｍｌ　ロイペプチン、３μｇ／ｍｌ、ペプスタチンＡおよび１ｍＭ　ジチオトレイトールを添加した。これをフレンチプレス（大岳製作所製）で２回繰り返し破砕（１０００ｋｇ／ｃｍ^２）して菌体破砕液を得た。この菌体破砕液を遠心分離（４０，０００×ｇ、３０分間）した後、上清を回収してこれを１５０，０００×ｇで１時間遠心分離し、上清（以下、菌体粗抽出液と記す。）を分取した。
【００８３】
（２）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
^１４Ｃで標識された３ｐｐｍの化合物（ＩＩ）、２．４ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Ａ成分、オリエンタル酵母社製）、０．５ｍｇ／ｍｌ　ホウレンソウ由来のフェレドキシン（Ｂ成分、ＳＩＧＭＡ社製）、１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（Ｃ成分、ＳＩＧＭＡ社製）および実施例５（１）で回収された菌体粗抽出液１８μｌを含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液３０μｌを調製し、３０℃で１時間保温した。また、前記の反応液組成中のＡ成分、Ｂ成分およびＣ成分のうちの１以上の画分を添加しない反応液を調製し、同様に保温した。保温後の各反応液に、３．０μｌの２Ｎ塩酸および９０μｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、８，０００×ｇで遠心分離し７５μｌの酢酸エチル相を回収した。該酢酸エチル相を減圧下で乾固させた後、残渣を６．０μｌの酢酸エチルに溶解させその内５．０μｌをシリカゲルＴＬＣプレート（ＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ_２５４、２０ｃｍ×２０ｃｍ、０．２５ｍｍ厚、メルク社製）にスポットした。該ＴＬＣプレートを、クロロホルム−酢酸−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸：酢酸エチル＝６：１：２）を展開溶媒として約１時間展開した後、溶媒を蒸発させ、イメージングプレート（富士写真フィルム社製）に一晩露光した。次いで、イメージングプレートをイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム社製）で解析し、^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。結果を表７に示す。
【００８４】
【表７】

【００８５】
（３）菌体粗抽出液の分画
実施例５（１）で得られた菌体粗抽出液に４５％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して氷上で攪拌した後、１２，０００×ｇ、３０分間遠心分離して上清を回収した。得られた上清に５５％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して氷上で攪拌した後、１２，０００×ｇ、１０分間遠心分離し、沈殿を回収して２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）に溶解して３２．５ｍｌとした。この溶解液をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ、蛋白質を含む画分（以下、硫安沈殿４５−５５％画分と記す。）４５．５ｍｌを分取した。
【００８６】
（４）本発明蛋白質（Ａ２）の単離
実施例５（３）で調製された硫安沈殿４５−５５％画分を、ＨｉＬｏａｄ２６／１０　Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＨＰカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に注入した。次いで、前記カラムに１００ｍｌの２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）を流した後、塩化ナトリウム直線濃度勾配を付して２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）を流し（塩化ナトリウム濃度勾配０．００４Ｍ／分、塩化ナトリウム濃度範囲　０Ｍから０．５Ｍ、流速８ｍｌ／分）、塩化ナトリウム濃度０．２５Ｍから０．２６Ｍにて溶出された画分３０ｍｌを分取した。さらにこの分取した画分をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ蛋白質を含む画分を回収した。
回収した画分をＰＤ１０カラムに供し、Ａバッファー（１．５ｍＭの塩化カルシウムを含む２ｍＭリン酸カリウムバッファー；ｐＨ７．０）で溶出させ、回収された蛋白質を含む画分を回収した。次いで、該画分をＢｉｏ−Ｓｃａｌｅ　Ｃｅｒａｍｉｃ　Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ，　ＴｙｐｅＩｃｏｌｕｍ　ＣＨＴ１０−Ｉ（バイオラッド社製）に注入し、該カラムに２０ｍｌのＡバッファーを流した。次いで、前記カラムにＢバッファー（０．０３ｍＭの塩化カルシウムを含む１００ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０）の直線濃度勾配を付してＡバッファーを流し（Ａバッファー１００％から開始し、１００分間かけてＢバッファー濃度を５０％にまで増加させる直線濃度勾配、流速２ｍｌ／分）、Ｂバッファー濃度２３％〜２５％にて溶出された画分１０ｍｌを分取した。さらにこの分取された画分をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、０．０５Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ蛋白質を含む画分を回収した。
回収した画分を限外ろ過（マイクロコンフィルターユニットマイクロコン−３０、ミリポア社製）にて約７７０μｌにまで濃縮し、このうち７００μｌをＨｉＬｏａｄ　１６／６０　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　７５　ｐｇ　カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に注入した。前記カラムに、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）を流し（流速１ｍｌ／分）、溶出液を２ｍｌずつ分画し、溶出体積６１ｍｌ前後に溶出した数画分をそれぞれ分取した。各画分に含まれる蛋白質をＳＤＳ−１０％〜２０％ＰＡＧＥで分析した。
分取した各画分を実施例５（２）に記載の反応液における菌体粗抽出液の代わりに添加し、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩ）の存在下に、実施例５（２）と同様に保温した。保温後の反応液をＴＬＣ分析し、^１４Ｃで標識された　化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットの強度を調べた。上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約４７ｋＤａの位置に泳動された蛋白質は、連続した画分における蛋白質バンドの濃さの変動と、^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットの強度の変動がパラレルに観察された。該蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルから回収し、プロテインシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製Ｐｒｏｃｉｓｅ　４９４ＨＴ型、Ｐｕｌｓｅｄ　ｌｉｑｉｄ法で分析）によるＮ末端アミノ酸配列解析に供した。その結果、配列番号２０で示されるアミノ酸配列が読み取られた。また、前記蛋白質をトリプシンにより消化した後、得られた消化物を質量分析した（ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ社製イオントラップ質量分析計ＬＣＱ、カラム：ＬＣ　Ｐａｃｋｉｎｇｓ社製ＰｅｐＭＡＰ　Ｃ１８　７５μｍ×１５０ｍｍ、移動相Ａ：０．１％ＨＯＡｃ−Ｈ_２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＨＯＡｃ−メタノール、グラジエント：移動相Ａ９５％、移動相Ｂ５％の割合で混合された溶出液から開始し、３０分間かけて移動相Ｂを１００％にまで増加させるリニアグラジエント、流速：０．２μｌ／分）。その結果、配列番号２１で示されるアミノ酸配列が読み取られた。
【００８７】
実施例６　本発明ＤＮＡ（Ａ２）の取得
（１）Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔの染色体ＤＮＡの調製
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔを５０ｍｌのＹＥＭＥ培地（酵母エキス　０．３％（ｗ／ｖ）、バクトペプトン　０．５％（ｗ／ｖ）、麦芽エキス　０．３％（ｗ／ｖ）、グルコース１．０％（ｗ／ｖ）、ショ糖３４％（ｗ／ｖ）、２．５Ｍ　ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ　０．２％（ｖ／ｖ））で１日間〜３日間、３０℃で振とう培養した後、集菌した。得られた菌体を、グリシン１．４％（ｗ／ｖ）、６０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む上記ＹＥＭＥ培地に懸濁し、さらに１日間振とう培養した。得られた培養液から菌体を集めて、蒸留水で１回洗浄した後に、菌体２００ｍｇ湿重当り１ｍｌのバッファー（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），　１００ｍＭ　ＥＤＴＡ，　１０ｍＭ　ＮａＣｌ）に再懸濁し、２００μｇ／ｍｌ卵白リゾチームを添加し３０℃で１時間振とうした。さらに、０．５％ＳＤＳ、１ｍｇ／ｍｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋを加えて５５℃で３時間インキュベートした。この菌体懸濁液を、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールで２回抽出してそれぞれ水層を回収し、次いでクロロホルム・イソアミルアルコールで１回抽出して水層を回収し、該水層からエタノール沈殿によって染色体ＤＮＡを得た。
【００８８】
（２）Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔの染色体ＤＮＡライブラリーの調製
実施例６（１）で調製された染色体ＤＮＡ１９μｇを、０．７８Ｕの制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで３７℃で６０分間消化した。得られた消化液を、１％アガロースゲル電気泳動で分画して、約２．０ｋｂｐのＤＮＡをゲルから回収した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて当該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製し、さらにエタノール沈殿によって濃縮して、目的とするＤＮＡを含む溶液１０μｌを得た。得られたＤＮＡ溶液のうち８μｌと、制限酵素ＢａｍＨＩで消化され脱リン酸化処理されたプラスミドベクターｐＵＣ１１８　１００ｎｇとライゲーションキットＶｅｒ．２（宝酒造社製）のＩ液１２μｌとを混合し、１６℃で３時間保温した。このライゲーション液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、５０ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。得られたコロニーを寒天培地上から回収してプラスミドを抽出し、染色体ＤＮＡライブラリーとした。
【００８９】
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ２）の単離
実施例６（１）で調製された染色体ＤＮＡを鋳型としてエキスパンドハイファイＰＣＲシステム（ベーリンガーマンハイム社製）を用いてＰＣＲを行った（図２）。プライマーとしては、配列番号５４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号５５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ（以下、プライマー対６と記す。）を用いた。ここで配列番号５４で示される塩基配列は、配列番号２０で示されるＮ末端アミノ酸配列をコードする塩基配列に基づき設計された。また、配列番号５５で示される塩基配列は、配列番号２１で示される内部アミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列に基づいて設計された。ＰＣＲ反応液は、上記染色体ＤＮＡを３００ｎｇ、２種類のプライマーをそれぞれ７．５ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰミックス（それぞれ２ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を０．２μｌ、１０×バッファー（ＭｇＣｌ_２含有）を２．５μｌ、およびＥｘｐａｎｄ　ＨｉＦｉ酵素ミックスを０．１９μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を２５μｌにした。保温条件は、９７℃で２分間保温した後、９７℃で１５秒間次いで６５℃で３０秒間さらに７２℃で１分間の保温を１サイクルとしてこれを１０サイクル繰り返し、続いて、９７℃で１５秒間次いで６５℃で３０秒間さらに７２℃で１分間（７２℃での保温は１サイクル毎に２０秒間ずつ増加させる）の保温を１サイクルとしてこれを１５サイクル行い、さらに、７２℃で７分間保温した。保温後の反応液を２％のアガロースゲル電気泳動に供し、約８００ｂｐのＤＮＡを含むゲル部分を回収した。回収されたゲルから、ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡを、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に、該ベクターに付属の取扱説明書に従いライゲーションして、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’に導入した。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡＧＥＮ　Ｔｉｐ２０（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、−２１Ｍ１３プライマー（アプライドバイオシステムズジャパン社製）とＭ１３Ｒｅｖプライマー（アプライドバイオシステムズジャパン社製）をプライマーとして、ダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。反応物をＤＮＡシーケンサ３７３Ａ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。その結果、配列番号１０で示される塩基配列の塩基番号３６〜８１９で示される塩基配列が読み取られた。読み取られた塩基配列のうち、配列番号１０に示される塩基配列の塩基番号３７〜６０には、配列番号２０で示されるアミノ酸配列の一部がコードされていた。従って、このＤＮＡは本発明蛋白質（Ａ２）の一部をコードするＤＮＡであると推定された。
【００９０】
次に、実施例６（２）で調製された染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、上記と同様の条件でエキスパンドハイファイＰＣＲシステム（ベーリンガーマンハイム社製）によるＰＣＲを行った。配列番号５６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号５７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ（以下、プライマー対７と記す）をプライマーとしてＰＣＲを行うことにより、配列番号１０で示される塩基配列の塩基番号３６で示される塩基より５’側上流に伸長する塩基配列を有するＤＮＡを増幅した。また、配列番号５８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号５９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ（以下、プライマー対８と記す）をプライマーとしてＰＣＲを行うことにより、配列番号１０で示される塩基配列の塩基番号８１９で示される塩基よりも３’側下流に伸長する塩基配列を有するＤＮＡを増幅した。プライマー対７を用いて増幅された約１．３ｋｂｐのＤＮＡ、およびプライマー対８を用いて増幅された約０．４ｋｂのＤＮＡをそれぞれ、上記と同様にしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクターにクローニングした。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡＧＥＮ　Ｔｉｐ２０（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、−２１Ｍ１３プライマー（アプライドバイオシステムズジャパン社製）とＭ１３Ｒｅｖプライマー（アプライドバイオシステムズジャパン社製）および配列番号６０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。反応物をＤＮＡシーケンサ３７３Ａ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。プライマー対７を用いて増幅された約１．３ｋｂのＤＮＡの塩基配列を解析した結果から、配列番号１０で示される塩基配列の塩基番号１〜３５で示される塩基配列が読み取られた。また、プライマー対８を用いて増幅された約０．４ｋｂのＤＮＡの塩基配列を解析した結果から、配列番号１０で示される塩基配列の塩基番号８１９〜１４１５で示される塩基配列が読み取られた。読み取られた全ての塩基配列を連結した結果、配列番号１０で示される塩基配列が得られた。該配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２０６塩基（終止コドンを含む）からなり４０１アミノ酸残基をコードする塩基配列（配列番号７）と、１９８塩基（終止コドンを含む）からなり６５アミノ酸残基をコードする塩基配列（配列番号１６）とが含まれた。配列番号７で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２）からなる蛋白質の分子量は４３９８３Ｄａと計算された。また、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列には、本発明蛋白質（Ａ２）のＮ末端アミノ酸配列解析から決定されたアミノ酸配列（配列番号２０）とトリプシン消化断片の質量分析によるアミノ酸配列解析から決定されたアミノ酸配列（配列番号２１）とが含まれていた。配列番号１６で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１３）からなる蛋白質の分子量は６７０７Ｄａと計算された。
【００９１】
実施例７　本発明蛋白質（Ａ２）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ２）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例６（１）でＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔから調製された染色体ＤＮＡを鋳型とし、エキスパンドハイファイＰＣＲシステム（ベーリンガーマンハイム社製）を使用してＰＣＲを行った。プライマーとしては、配列番号６１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号６２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合わせ（以下、プライマー対２１と記す。）、または、配列番号６１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号６３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合わせ（以下、プライマー対２２と記す。）を用いた。ＰＣＲ反応液には、２種類のプライマーをそれぞれ３００ｎＭとなるよう添加し、染色体ＤＮＡを５０ｎｇ、ｄＮＴＰミックス（それぞれ２．０ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を５．０μｌ、１０×Ｅｘｐａｎｄ　ＨＦバッファー（ＭｇＣｌ_２含有）を５．０μｌ、およびＥｘｐａｎｄ　ＨｉＦｉ酵素ミックスを０．７５μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を５０μｌとした。保温条件は、９７℃で２分間保温した後、９７℃で１５秒間次いで６０℃で３０秒間さらに７２℃で１分間の保温を１サイクルとしてこれを１０サイクル繰り返し、続いて、９７℃で１５秒間次いで６０℃で３０秒間さらに７２℃で１分間（７２℃での保温は１サイクル毎に２０秒間ずつ増加させる）の保温を１サイクルとしてこれを１５サイクル行い、さらに、７２℃で７分間保温した。保温後の反応液をそれぞれ１％アガロースゲル電気泳動に供し、プライマー対２１を用いた反応液を供したゲルからは約１．２ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出し、プライマー対２２を用いた反応液を供したゲルからは約１．４ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出した。回収されたゲルからそれぞれＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡとｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とを、該ベクター添付の取扱説明書に従ってライゲーションし、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’に導入した。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡＧＥＮ　Ｔｉｐ２０　（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。次いで、該ＤＮＡを鋳型とし−２１Ｍ１３プライマー（アプライドバイオシステムズジャパン社製）、Ｍ１３Ｒｅｖプライマー（アプライドバイオシステムズジャパン社製）、配列番号５６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号６４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。得られた反応物をＤＮＡシーケンサ３７３Ａ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号７で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ９２３とし、配列番号１０で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ９２３Ｆとした。
次に、上記プラスミドｐＣＲ９２３とｐＣＲ９２３Ｆをそれぞれ制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物をアガロースゲル電気泳動に供した。ｐＣＲ９２３の消化物を供したゲルからは約１．２ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出し、ｐＣＲ９２３Ｆの消化物を供したゲルからは約１．４ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出した。得られたゲルからそれぞれＱＩＡ　ｑｕｉｃｋＧｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたそれぞれのＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とを、ライゲーションキットＶｅｒ．１（宝酒造社製）を用い、該キット付属の取扱説明書に従いライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、その構造を解析した。配列番号７で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ２）をコードする上記の約１．２ｋｂｐのＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドをｐＫＳＮ９２３とした。また、配列番号１０で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ２）をコードする上記の約１．４ｋｂｐのＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドをｐＫＳＮ９２３Ｆとした。これらプラスミドｐＫＳＮ９２３およびｐＫＳＮ９２３Ｆをそれぞれ大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をそれぞれＪＭ１０９／ｐＫＳＮ９２３およびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ９２３Ｆとした。また、プラスミドｐＫＳＮ２を大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２とした。
【００９２】
（２）本発明蛋白質（Ａ２）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ９２３、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ９２３Ｆ、およびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２を、それぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＴＢ培地（トリプトン１．２％（ｗ／ｖ）、酵母エキス２．４％（ｗ／ｖ）、グリセロール０．４％（ｖ／ｖ）、リン酸二水素カリウム１７ｍＭ、リン酸水素二カリウム７２ｍＭ）で３７℃で一晩培養し、得られた培養液のうち１ｍｌを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＴＢ培地に植菌して２６℃で培養し、ＯＤ６６０が約０．５になったところで、最終濃度５００μＭになるよう５−アミノレブリン酸　を添加し培養を継続した。その３０分後に最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加しさらに１７時間培養した。
各培養液から菌体を回収し、それぞれ０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄後、１ｍＭ　ＰＭＳＦを含む該バッファー１０ｍｌに懸濁した。得られた菌体懸濁液を超音波破砕機（ＳＯＮＩＦＩＥＲ（Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｓｏｎｉｃ　Ｐｏｗｅｒ　社登録商標））を用いてｏｕｔ　ｐｕｔ　３、ｄｕｔｙ　ｃｙｃｌｅ　３０％の条件で３分間ずつ６回超音波処理して菌体破砕液を得た。得られた破砕液を、遠心分離（１，２００×ｇ、５分間）した後、上清を回収してこれを遠心分離（１５０，０００×ｇ、７０分間）した後、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ９２３から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ９２３、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ９２３Ｆから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ９２３Ｆ、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を回収した。該上清画分のうち１μｌをＳＤＳ−１５％〜２５％ＰＡＧＥで分析し、ＣＢＢ染色した。その結果、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ９２３およびｐＫＳＮ９２３Ｆにおいて分子量約４７ｋＤａに相当する泳動位置に、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２よりも顕著に濃いバンドが検出された。大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ９２３および大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ９２３Ｆは本発明蛋白質（Ａ２）を発現していることが確認された。
【００９３】
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
^１４Ｃで標識された３ｐｐｍの化合物（ＩＩ）、２ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Ａ成分、オリエンタル酵母社製）、２ｍｇ／ｍｌのホウレンソウ由来のフェレドキシン（Ｂ成分、ＳＩＧＭＡ社製）、０．１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（Ｃ成分、ＳＩＧＭＡ社製）および実施例７（２）で回収された上清画分１８μｌを含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。また、前記の反応液組成中のＡ成分、Ｂ成分およびＣ成分のうちの１以上の画分を添加しない反応液を調製し、同様に保温した。保温後の各反応液に、３．０μｌの２Ｎ塩酸および９０μｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、８，０００×ｇで遠心分離し７５μｌの酢酸エチル相を回収した。該酢酸エチル相を減圧下で乾固させた後、残渣を６．０μｌの酢酸エチルに溶解させその内５．０μｌをシリカゲルＴＬＣプレート（ＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ_２５４、２０ｃｍ×２０ｃｍ、０．２５ｍｍ厚、メルク社製）にスポットした。該ＴＬＣプレートを、クロロホルム−酢酸−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸：酢酸エチル＝６：１：２）を展開溶媒として約１時間展開した後、溶媒を蒸発させ、イメージングプレート（富士写真フィルム社製）に一晩露光した。次いで、イメージングプレートをイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム社製）で解析し、^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。結果を表８に示す。
【００９４】
【表８】

【００９５】
実施例８　本蛋白質（Ａ１０）の調製
（１）菌体粗抽出液の調製
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ　　ＡＴＣＣ　１１７９６　のグリセロールストックを、２５０ｍｌのＢ培地（グルコース１％（ｗ／ｖ）、牛肉エキス０．１％、トリプトース０．２％（ｗ／ｖ））を入れた５００ｍｌ容羽付きフラスコに添加し、３０℃で３日間旋回培養して、前培養液を得た。この前培養液４０ｍｌを４００ｍｌのＢ培地に植菌し、１Ｌ容三角フラスコ内で３０℃で２４時間、旋回培養した。培養停止後静置し、上清のみ２２０ｍｌを除去して残りの約２２０ｍｌの培養液に、同様に調製した培養液約２２０ｍｌを加え、合計約４４０ｍｌとした。これに１００ｐｐｍとなるように化合物（ＩＩ）を添加し、１Ｌ容三角フラスコ内で３０℃で４０時間旋回培養した。このようにして得られた培養液約２．６Ｌから遠心分離（３，０００×ｇ、５分間）によって湿菌体を回収した。得られた湿菌体を１Ｌの０．１Ｍ　ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ６．８）にて洗浄し、２６ｇの湿菌体を得た。
この湿菌体を、菌体湿重量１ｇあたり３ｍｌの０．１Ｍ　ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ６．８）に懸濁し、この懸濁液に、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、５ｍＭ　ベンザミジン塩酸、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、３μｇ／ｍｌ　ロイペプチン、３μｇ／ｍｌ、ペプスタチンＡおよび１ｍＭ　ジチオトレイトールを添加した。これをフレンチプレス（大岳製作所製）で２回繰り返し破砕（１０００ｋｇ／ｃｍ^２）して菌体破砕液を得た。この菌体破砕液を遠心分離（４０，０００×ｇ、３０分間）した後、上清を回収してこれを１５０，０００×ｇで１時間遠心分離し、上清（以下、菌体粗抽出液と記す。）を分取した。
【００９６】
（２）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
^１４Ｃで標識された３ｐｐｍの化合物（ＩＩ）、２．４ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Ａ成分、オリエンタル酵母社製）、０．５ｍｇ／ｍｌ　ホウレンソウ由来のフェレドキシン（Ｂ成分、ＳＩＧＭＡ社製）、１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（Ｃ成分、ＳＩＧＭＡ社製）および実施例８（１）で回収された菌体粗抽出液１８μｌを含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液３０μｌを調製し、３０℃で１時間保温した。また、前記の反応液組成中のＡ成分、Ｂ成分およびＣ成分のうちの１以上の画分を添加しない反応液を調製し、同様に保温した。保温後の各反応液に、３．０μｌの２Ｎ塩酸および９０μｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、８，０００×ｇで遠心分離し７５μｌの酢酸エチル相を回収した。該酢酸エチル相を減圧下で乾固させた後、残渣を６．０μｌの酢酸エチルに溶解させその内５．０μｌをシリカゲルＴＬＣプレート（ＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ_２５４、２０ｃｍ×２０ｃｍ、０．２５ｍｍ厚、メルク社製）にスポットした。該ＴＬＣプレートを、クロロホルム−酢酸−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸：酢酸エチル＝６：１：２）を展開溶媒として約１時間展開した後、溶媒を蒸発させ、イメージングプレート（富士写真フィルム社製）に一晩露光した。次いで、イメージングプレートをイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム社製）で解析し、^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。結果を表９に示す。
【００９７】
【表９】

【００９８】
（３）菌体粗抽出液の分画
実施例８（１）で得られた菌体粗抽出液に４５％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して氷上で攪拌した後、１２，０００×ｇ、３０分間遠心分離して上清を回収した。得られた上清に５５％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して氷上で攪拌した後、１２，０００×ｇ、１０分間遠心分離し、沈殿を回収して２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）に溶解して１０ｍｌとした。この溶解液をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ、蛋白質を含む画分（以下、硫安沈殿４５−５５％画分と記す。）１４ｍｌを分取した。
【００９９】
（４）本蛋白質（Ａ１０）の単離
実施例８（３）で調製された硫安沈殿４５−５５％画分を、ＭｏｎｏＱ　ＨＲ　１０／１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に注入した。次いで、前記カラムに１６ｍｌの２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）でカラムを流した後、塩化ナトリウム直線濃度勾配を付して２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）を流し（塩化ナトリウム濃度勾配０．００６２５Ｍ／分、塩化ナトリウム濃度範囲　０Ｍから０．５Ｍ、流速４ｍｌ／分）、塩化ナトリウム濃度０．２８Ｍ〜０．３１Ｍにて溶出された画分１５ｍｌを分取した。さらにこの分取した画分をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ蛋白質を含む画分を回収した。
回収された画分をＰＤ１０カラムに供し、Ａバッファー（１．５ｍＭの塩化カルシウムを含む２ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０）で溶出させ蛋白質を含む画分を回収した。次いで、該画分をＢｉｏ−Ｓｃａｌｅ　Ｃｅｒａｍｉｃ　Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ，　ＴｙｐｅＩｃｏｌｕｍ　ＣＨＴ１０−Ｉ（バイオラッド社製）に注入し、該カラムに５０ｍｌのＡバッファーを流した。次いで、前記カラムにＢバッファー（０．０３ｍＭの塩化カルシウムを含む１００ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０）の直線濃度勾配を付してＡバッファーを流し（Ａバッファー１００％から開始し、４０分間かけてＢバッファー濃度を５０％にまで増加させる直線濃度勾配、流速５ｍｌ／分）、Ｂバッファー濃度１６％〜３１％にて溶出された溶液を５ｍｌずつ分画した。さらにこの分取された画分をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、０．０５Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ蛋白質を含む画分を回収した。各画分に含まれる蛋白質をＳＤＳ−１０％〜２０％ＰＡＧＥで分析した。
分取した各画分を実施例８（２）に記載の反応液における菌体粗抽出液の代わりに添加し、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩ）の存在下に、実施例８（２）と同様に保温した。保温後の反応液をＴＬＣ分析し、^１４Ｃで標識された　化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットの強度を調べた。上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約４５ｋＤａの位置に泳動された蛋白質は、連続した画分における蛋白質バンドの濃さの変動と、^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットの強度の変動がパラレルに観察された。該蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルから回収し、トリプシンにより消化した後、得られた消化断片を質量分析した（ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ社製イオントラップ質量分析計ＬＣＱ、カラム：ＬＣ　Ｐａｃｋｉｎｇｓ社製ＰｅｐＭＡＰ　Ｃ１８　７５μｍ×１５０ｍｍ、移動相Ａ：０．１％ＨＯＡｃ−Ｈ_２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＨＯＡｃ−メタノール、グラジエント：移動相Ａ９５％、移動相Ｂ５％の割合で混合された溶出液から開始し、３０分間かけて移動相Ｂを１００％にまで増加させるリニアグラジエント、流速：０．２μｌ／分間）。その結果、配列番号２２〜３４のいずれかでそれぞれ示されるアミノ酸配列が読み取られた。
【０１００】
実施例９　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ　　ＡＴＣＣ１１７９６の染色体ＤＮＡの調製
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ　　ＡＴＣＣ１１７９６　を　５０ｍｌのＹＥＭＥ培地［酵母エキス　０．３％（ｗ／ｖ）、バクトペプトン　０．５％（ｗ／ｖ）、麦芽エキス　０．３％（ｗ／ｖ）、グルコース１．０％（ｗ／ｖ）、ショ糖３４％（ｗ／ｖ）、２．５Ｍ　ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ　０．２％（ｖ／ｖ）］で１日間〜３日間、３０℃で振とう培養した後、集菌した。得られた菌体を、グリシン１．４％（ｗ／ｖ）、６０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む上記ＹＥＭＥ培地に懸濁し、さらに１日間振とう培養した。得られた培養液から菌体を集めて、蒸留水で１回洗浄した後に、菌体２００ｍｇ当り１ｍｌのバッファー［１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），　１００ｍＭ　ＥＤＴＡ，　１０ｍＭ　ＮａＣｌ］に再懸濁し、２００μｇ／ｍｌ卵白リゾチームを添加し３０℃で１時間振とうした。さらに、０．５％ＳＤＳ、１ｍｇ／ｍｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋを加えて５５℃で３時間インキュベートした。この菌体懸濁液を、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールで２回抽出してそれぞれ水層を回収し、次いでクロロホルム・イソアミルアルコールで１回抽出して水層を回収し、該水層からエタノール沈殿によって染色体ＤＮＡを得た。
【０１０１】
実施例１０　本ＤＮＡ（Ａ１０）をコードするＤＮＡの取得と大腸菌での発現
（１）本ＤＮＡを有する形質転換大腸菌の作製
実施例９でＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ　　ＡＴＣＣ１１７９６　から調製された染色体ＤＮＡを鋳型とし、Ｅｘｐａｎｄ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（ロッシュモレキュラーバイオケミカルズ社製）を使用してＰＣＲを行った。プライマーとしては、配列番号７９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号８０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合わせ（以下、プライマー対２３と記す。）、または、配列番号７９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号８１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合わせ（以下、プライマー対２４と記す。）を用いた。ＰＣＲ反応液には、２種類のプライマーをそれぞれ３００ｎＭとなるよう添加し、染色体ＤＮＡを５０ｎｇ、ｄＮＴＰミックス（それぞれ２．０ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を５．０μｌ、１０×Ｅｘｐａｎｄ　ＨＦバッファー（ＭｇＣｌ_２含有）を５．０μｌ、およびＥｘｐａｎｄ　ＨｉＦｉ酵素ミックスを０．７５μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を５０μｌとした。保温条件は、９７℃で２分間保温した後、９７℃で１５秒間次いで６５℃で３０秒間さらに７２℃で２分間の保温を１サイクルとしてこれを１０サイクル繰り返し、続いて、９７℃で１５秒間次いで６８℃で３０秒間さらに７２℃で２分間（７２℃での保温は１サイクル毎に２０秒間ずつ増加させる）の保温を１サイクルとしてこれを１５サイクル行い、さらに、７２℃で７分間保温した。保温後の反応液をそれぞれ１％アガロースゲル電気泳動に供しプライマー対２３を用いた反応液を供したゲルからは約１．２ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出し、プライマー対２４を用いた反応液を供したゲルからは約１．５ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出した。回収されたそれぞれのゲルから、ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡとｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とを、該ベクター添付の取扱説明書に従ってライゲーションし、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’に導入した。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。次いで、該ＤＮＡを鋳型とし、−２１Ｍ１３プライマー（アプライドバイオシステムズジャパン社製）、Ｍ１３Ｒｅｖプライマー（アプライドバイオシステムズジャパン社製）、配列番号８２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号８３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。得られた反応物をＤＮＡシーケンサ３７３Ａ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号８４で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ１１７９６とし、配列番号８５で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ１１７９６Ｆとした。配列番号８５で示される塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２２１塩基（終止コドンを含む）からなり４０６アミノ酸残基（配列番号５で示されるアミノ酸配列）をコードする塩基配列（配列番号８４）と、２１０塩基（終止コドンを含む）からなり６９アミノ酸残基をコードする塩基配列とが含まれた。
次に、上記のｐＣＲ１１７９６とｐＣＲ１１７９６Ｆをそれぞれ制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物をアガロースゲル電気泳動に供した。ｐＣＲ１１７９６の消化物を供したゲルからは約１．２ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出し、ｐＣＲ１１７９６Ｆの消化物を供したゲルからは約１．５ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出した。得られたゲルからそれぞれ、ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたそれぞれのＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とを、ライゲーションキットＶｅｒ．１（宝酒造社製）を用い、該キット付属の取扱説明書に従いライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、その構造を解析した。配列番号８４で示される塩基配列を含有し本蛋白質（Ａ１０）をコードする上記の約１．２ｋｂｐのＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドをｐＫＳＮ１１７９６とした。また、配列番号８５で示される塩基配列を含有し本蛋白質（Ａ１０）をコードする上記の約１．５ｋｂｐのＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドをｐＫＳＮ１１７９６Ｆとした。これらプラスミドｐＫＳＮ１１７９６およびｐＫＳＮ１１７９６Ｆをそれぞれ大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をそれぞれＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１１７９６およびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１１７９６Ｆとした。また、プラスミドｐＫＳＮ２を大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２とした。
【０１０２】
（２）本蛋白質（Ａ１０）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１１７９６、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１１７９６Ｆ、およびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＴＢ培地（トリプトン１．２％（ｗ／ｖ）、酵母エキス２．４％（ｗ／ｖ）、グリセロール０．４％（ｖ／ｖ）、リン酸二水素カリウム１７ｍＭ、リン酸水素二カリウム７２ｍＭ）で３７℃で一晩培養した。得られた培養液のうち１ｍｌを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＴＢ培地に植菌して２６℃で培養し、ＯＤ６６０が約０．５になったところで、最終濃度５００μＭになるよう５−アミノレブリン酸　を添加し培養を継続した。その３０分後に最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加しさらに１７時間培養した。
各培養液から菌体を回収し、それぞれ０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄後、１ｍＭ　ＰＭＳＦを含む該バッファー１０ｍｌに懸濁した。得られた菌体懸濁液を超音波破砕機（ＳＯＮＩＦＩＥＲ（Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｓｏｎｉｃ　Ｐｏｗｅｒ　社登録商標））を用いてｏｕｔ　ｐｕｔ　３、ｄｕｔｙ　ｃｙｃｌｅ　３０％の条件で３分間ずつ６回超音波処理して菌体破砕液を得た。得られた破砕液を、遠心分離（１，２００×ｇ、５分間）した後、上清を回収してこれを遠心分離（１５０，０００×ｇ、７０分間）した後、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１１７９６から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１１７９６、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１１７９６Ｆから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１１７９６Ｆ、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を回収した。該上清画分のうち１μｌをＳＤＳ−１５％〜２５％ＰＡＧＥで分析し、ＣＢＢ染色した。その結果、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１１７９６、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１１７９６Ｆのいずれにおいても、分子量約４５ｋＤａに相当する泳動位置に、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２よりも顕著に濃いバンドが検出された。このバンドは、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１１７９６Ｆにおいて大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１１７９６よりも、濃く検出された。大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１１７９６Ｆのほうが、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１１７９６よりも本蛋白質（Ａ１０）を多く発現していることが示された。
【０１０３】
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
^１４Ｃで標識された３ｐｐｍの化合物（ＩＩ）、２ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Ａ成分、オリエンタル酵母社製）、２ｍｇ／ｍｌのホウレンソウ由来のフェレドキシン（Ｂ成分、ＳＩＧＭＡ社製）、０．１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（Ｃ成分、ＳＩＧＭＡ社製）および実施例１０（２）で回収された上清画分１８μｌを含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液３０μｌを調製し、３０℃で１時間保温した。また、前記の反応液組成中のＡ成分、Ｂ成分およびＣ成分のうちの１以上の画分を添加しない反応液を調製し、同様に保温した。保温後の各反応液に、３．０μｌの２Ｎ塩酸および９０μｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、８，０００×ｇで遠心分離し７５μｌの酢酸エチル相を回収した。該酢酸エチル相を減圧下で乾固させた後、残渣を６．０μｌの酢酸エチルに溶解させその内５．０μｌをシリカゲルＴＬＣプレート（ＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ_２５４、２０ｃｍ×２０ｃｍ、０．２５ｍｍ厚、メルク社製）にスポットした。該ＴＬＣプレートを、クロロホルム−酢酸−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸：酢酸エチル＝６：１：２）を展開溶媒として約１時間展開した後、溶媒を蒸発させ、イメージングプレート（富士写真フィルム社製）に一晩露光した。次いで、イメージングプレートをイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム社製）で解析し、^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。結果を表１０に示す。
【０１０４】
【表１０】

【０１０５】
実施例１１　本発明ＤＮＡ（Ａ３）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９の染色体ＤＮＡの調製
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９を５０ｍｌのＹＥＭＥ培地（酵母エキス　０．３％（ｗ／ｖ）、バクトペプトン　０．５％（ｗ／ｖ）、麦芽エキス　０．３％（ｗ／ｖ）、グルコース１．０％（ｗ／ｖ）、ショ糖３４％（ｗ／ｖ）、２．５Ｍ　ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ　０．２％（ｖ／ｖ））で１日間、３０℃で振とう培養した後、集菌した。得られた菌体を、グリシン１．４％（ｗ／ｖ）、６０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む上記ＹＥＭＥ培地に懸濁し、さらに１日間振とう培養した。得られた培養液から菌体を集めて、蒸留水で１回洗浄した後に、菌体２００ｍｇ当り１ｍｌのバッファー（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），　１００ｍＭ　ＥＤＴＡ，　１０ｍＭ　ＮａＣｌ）に再懸濁し、２００μｇ／ｍｌ卵白リゾチームを添加し３０℃で１時間振とうした。さらに、０．５％ＳＤＳ、１ｍｇ／ｍｌＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋを加えて５５℃で３時間インキュベートした。この菌体懸濁液を、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールで２回抽出してそれぞれ水層を回収し、次いでクロロホルム・イソアミルアルコールで１回抽出して水層を回収し、該水層からエタノール沈殿によって染色体ＤＮＡを得た。
【０１０６】
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ３）の単離
実施例１１（１）で調製された染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。プライマーとしては、配列番号６５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号６６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ（以下、プライマー対９と記す。）を用いた。ＰＣＲ反応液は、２種類のプライマーをそれぞれ２００ｎＭとなるよう添加し、染色体ＤＮＡを２５０ｎｇ、ｄＮＴＰミックス（それぞれ２．５ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を４μｌ、１０ｘＥｘＴａｑバッファーを５μｌ、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造製）を０．５μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を５０μｌにした。保温条件は９７℃で２分間保温し、９７℃で１５秒間次いで６０℃で３０秒間次いで７２℃で９０秒のサイクルを３０サイクル繰り返し、さらに７２℃で４分間保温した。保温後の反応液を０．８％のアガロースゲル電気泳動に供し、約１．４ｋｂｐのＤＮＡを含むゲル部分を回収した。回収されたゲルからＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡを、ＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に、該ベクターに付属の取扱説明書に従いライゲーションして、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’に導入した。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、配列番号６７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号６８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。反応物をＤＮＡシーケンサ３７３Ａ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。その結果、配列番号６９で示される塩基配列が読み取られた。この塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１１８８塩基（終止コドンを含む）からなり３９５アミノ酸残基をコードする塩基配列と、１９５塩基（終止コドンを含む）からなり６４アミノ酸残基をコードする塩基配列（配列番号１７）とが含まれた。配列番号１７で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質の分子量は６６６６Ｄａと計算された。
【０１０７】
実施例１２　本発明蛋白質（Ａ３）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ３）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例１１（１）で調製された染色体ＤＮＡを鋳型として、上記と同様の条件でＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造製）によるＰＣＲを行った。プライマーとしては配列番号７０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号７１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ（以下、プライマー対１０と記す。）、または、配列番号７０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号７２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ（以下、プライマー対１１と記す。）を用いた。プライマー対１０を用いて増幅された約１．２ｋｂのＤＮＡおよびプライマー対１１を用いて増幅された約１．５ｋｂのＤＮＡは、上記方法にてＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１にクローニングした。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、配列番号６７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、配列番号６８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号７３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。反応物をＤＮＡシーケンサ３７３Ａ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。その結果、プライマー対１０を用いて増幅されたＤＮＡをクローニングしたプラスミドは配列番号８で示される塩基配列を有することが確認され、プライマー対１１を用いて増幅されたＤＮＡをクローニングしたプラスミドは配列番号１１で示される塩基配列を有することが確認された。配列番号１１で示される塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１１８８塩基（終止コドンを含む）からなり３９５アミノ酸残基をコードする塩基配列（配列番号８）と、１９５塩基（終止コドンを含む）からなり６４アミノ酸残基をコードする塩基配列とが含まれた。配列番号８で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質の分子量は４３７５２Ｄａと計算された。得られたプラスミドのうち、配列番号８で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ６７１とし、配列番号１１で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ６７１Ｆとした。
次に、上記のｐＣＲ６７１およびｐＣＲ６７１Ｆをそれぞれ制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物をアガロースゲル電気泳動に供した。ｐＣＲ６７１の消化物を供したゲルからは約１．２ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出し、ｐＣＲ６７１Ｆの消化物を供したゲルからは約１．５ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出した。得られたゲルからそれぞれ、ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたそれぞれのＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とを、ライゲーションキットＶｅｒ．１（宝酒造社製）を用い、該キット付属の取扱説明書に従いライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、その構造を解析した。配列番号８で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ３）をコードする上記の約１２００ｂｐのＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドをｐＫＳＮ６７１とした。また、配列番号１１に示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ３）をコードする上記の約１４００ｂｐのＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドをｐＫＳＮ６５７Ｆとした。これらプラスミドｐＫＳＮ６７１とｐＫＳＮ６７１Ｆをそれぞれ大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をそれぞれＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６７１およびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６７１Ｆとした。また、プラスミドｐＫＳＮ２を大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２とした。
【０１０８】
（２）本発明蛋白質（Ａ３）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６７１、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６７１Ｆ、およびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＴＢ培地（トリプトン１．２％（ｗ／ｖ）、酵母エキス２．４％（ｗ／ｖ）、グリセロール０．４％（ｖ／ｖ）、リン酸二水素カリウム１７ｍＭ、リン酸水素二カリウム７２ｍＭ）で３７℃で一晩培養した。得られた培養液のうち１ｍｌを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＴＢ培地に植菌して２６℃で培養し、ＯＤ６６０が約０．５になったところで、最終濃度５００μＭになるよう５−アミノレブリン酸　を添加し培養を継続した。その３０分後に最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加しさらに１７時間培養した。
各培養液から菌体を回収し、それぞれ０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄後、１ｍＭ　ＰＭＳＦを含む該バッファー１０ｍｌに懸濁した。得られた菌体懸濁液を超音波破砕機（ＳＯＮＩＦＩＥＲ（Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｓｏｎｉｃ　Ｐｏｗｅｒ　社登録商標））を用いてｏｕｔ　ｐｕｔ　３、ｄｕｔｙ　ｃｙｃｌｅ　３０％の条件で３分間×６回超音波処理して菌体破砕液を得た。得られた破砕液を、遠心分離（１，２００×ｇ、５分間）した後、上清を回収してこれを遠心分離（１５０，０００×ｇ、７０分間）し、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６７１から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６７１、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６７１Ｆから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６７１Ｆ、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を回収した。
【０１０９】
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
^１４Ｃで標識された３ｐｐｍの化合物（ＩＩ）、２ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Ａ成分、オリエンタル酵母社製）、２ｍｇ／ｍｌのホウレンソウ由来のフェレドキシン（Ｂ成分、ＳＩＧＭＡ社製）、０．１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（Ｃ成分、ＳＩＧＭＡ社製）および実施例１２（２）で回収した上清画分１８μｌを含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液３０μｌを調製し、３０℃で１時間保温した。また、前記の反応液組成中のＡ成分、Ｂ成分およびＣ成分のうちの１以上の画分を添加しない反応液を調製し、同様に保温した。保温後の各反応液に、３．０μｌの２Ｎ塩酸および９０μｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、８，０００×ｇで遠心分離し７５μｌの酢酸エチル相を回収した。該酢酸エチル相を減圧下で乾固させた後、残渣を６．０μｌの酢酸エチルに溶解させその内５．０μｌをシリカゲルＴＬＣプレート（ＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ_２５４、２０ｃｍ×２０ｃｍ、０．２５ｍｍ厚、メルク社製）にスポットした。該ＴＬＣプレートを、クロロホルム−酢酸−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸：酢酸エチル＝６：１：２）を展開溶媒として約１時間展開した後、溶媒を蒸発させ、イメージングプレート（富士写真フィルム社製）に一晩露光した。次いで、イメージングプレートをイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム社製）で解析し、^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。結果を表１１に示す。
【０１１０】
【表１１】

【０１１１】
実施例１３　本ＤＮＡ（Ａ９）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ　ＳＡＮＫ６２５８５の染色体ＤＮＡの調製
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ　ＳＡＮＫ６２５８５（微工研条寄第１１４５号：ＢＰ−１１４５）を５０ｍｌのＹＥＭＥ培地（酵母エキス　０．３％（ｗ／ｖ）、バクトペプトン　０．５％（ｗ／ｖ）、麦芽エキス　０．３％（ｗ／ｖ）、グルコース１．０％（ｗ／ｖ）、ショ糖３４％（ｗ／ｖ）、２．５Ｍ　ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ　０．２％（ｖ／ｖ））で１日間、３０℃で振とう培養した後、集菌した。得られた菌体を、グリシン１．４％（ｗ／ｖ）、６０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む上記ＹＥＭＥ培地に懸濁し、さらに１日間振とう培養した。得られた培養液から菌体を集めて、蒸留水で１回洗浄した後に、菌体２００ｍｇ当り１ｍｌのバッファー（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），　１００ｍＭ　ＥＤＴＡ，　１０ｍＭ　ＮａＣｌ）に再懸濁し、２００μｇ／ｍｌ卵白リゾチームを添加し３０℃で１時間振とうした。さらに、０．５％ＳＤＳ、１ｍｇ／ｍｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋを加えて５５℃で３時間インキュベートした。この菌体懸濁液を、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールで２回抽出してそれぞれ水層を回収し、次いでクロロホルム・イソアミルアルコールで１回抽出して水層を回収し、該水層からエタノール沈殿によって染色体ＤＮＡを得た。
【０１１２】
（２）本ＤＮＡ（Ａ９）の単離
実施例１３（１）で調製された染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。プライマーとしては、配列番号７４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号７５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ（以下、プライマー対１２と記す。）、または、配列番号７６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号７７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ（以下、プライマー対１３と記す。）を用いた。ＰＣＲ反応液には、２種類のプライマーをそれぞれ２００ｎＭとなるよう添加し、染色体ＤＮＡを２５０ｎｇ、ｄＮＴＰミックス（それぞれ２．５ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を４μｌ、１０ｘＥｘＴａｑバッファーを５μｌおよびＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造製）を０．５μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を５０μｌにした。保温条件は９７℃で２分間保温し、９７℃で１５秒間次いで６０℃で３０秒間次いで７２℃で９０秒のサイクルを３０サイクル繰り返し、さらに７２℃で４分間保温した。保温後の反応液をそれぞれ０．８％のアガロースゲル電気泳動に供し、プライマー対１２を用いたＰＣＲの反応液を分離したゲルからは約５００ｂｐのＤＮＡを含むゲル部分を回収し、プライマー対１３を用いたＰＣＲの反応液を分離したゲルからは約８００ｂｐのＤＮＡを含むゲル部分を回収した。回収された各ゲルからＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたそれぞれのＤＮＡを、ＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に、該ベクターに付属の取扱説明書に従いライゲーションして、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’に導入した。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　ＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、配列番号６７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号６８で示される塩基配列からオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。反応物をＤＮＡシーケンサ３７３Ａ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。その結果、プライマー対１２を用いたＰＣＲにより得られたＤＮＡからは、配列番号７８で示される塩基配列の塩基番号１〜４９８で示される塩基配列が、プライマー対１３を用いたＰＣＲにより得られたＤＮＡからは、配列番号７８で示される塩基配列の塩基番号４６９〜１２３３で示される塩基配列が読み取られた。配列番号７８で示される塩基配列の塩基番号１〜４９８で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲＳＣＡ１、配列番号７８で示される塩基配列の塩基番号４６９〜１２３３で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲＳＣＡ２とした。
【０１１３】
実施例１４　本蛋白質（Ａ９）の大腸菌での発現
（１）本ＤＮＡ（Ａ９）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例１３（２）で得られたプラスミドのうち、上記のプラスミドｐＣＲＳＣＡ１を制限酵素ＮｄｅＩとＮｃｏＩで消化し、また、ｐＣＲＳＣＡ２を制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。それぞれの消化物をアガロースゲル電気泳動に供した。ｐＣＲＳＣＡ２の消化物を供したゲルからは約５００ｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出し、ｐＣＲＳＣＡ２の消化物を供したゲルからは約８００ｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出した。回収されたゲルから、ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡ２種と、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とを、ライゲーションキットＶｅｒ．１（宝酒造社製）を用い、該キット付属の取扱説明書に従いライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、その構造を解析した。配列番号７８に示される塩基配列を含有し本蛋白質（Ａ９）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドをｐＫＳＮＳＣＡとした。
【０１１４】
（２）本蛋白質（Ａ９）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮＳＣＡを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＴＢ培地（トリプトン１．２％（ｗ／ｖ）、酵母エキス２．４％（ｗ／ｖ）、グリセロール０．４％（ｖ／ｖ）、リン酸二水素カリウム１７ｍＭ、リン酸水素二カリウム７２ｍＭ）で３７℃で一晩培養した。得られた培養液を、ＯＤ６６０が約０．２となるように５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＴＢ培地に植菌して２６℃で培養した。ＯＤ６６０が約２．０になったところで、最終濃度５００μＭになるように５−アミノレブリン酸　を添加し培養を継続した。その３０分後に最終濃度２００μＭになるようにＩＰＴＧを添加しさらに５時間培養した。
各培養液から菌体を回収し、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄した後、１ｍＭ　ＰＭＳＦを含む該バッファー１０ｍｌに懸濁した。この菌体懸濁液を超音波破砕機（ＳＯＮＩＦＩＥＲ（Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｓｏｎｉｃ　Ｐｏｗｅｒ　社登録商標））を用いてｏｕｔ　ｐｕｔ　３、ｄｕｔｙ　ｃｙｃｌｅ　３０％の条件で３分間ずつ６回超音波処理して菌体破砕液を得た。得られた破砕液を、遠心分離（１，２００×ｇ、５分間）した後、上清を回収してこれを遠心分離（１５０，０００×ｇ、７０分間）し、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮＳＣＡから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮＳＣＡと記す。）を回収した。
【０１１５】
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
^１４Ｃで標識された３ｐｐｍの化合物（ＩＩ）、２ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Ａ成分、オリエンタル酵母社製）、２ｍｇ／ｍｌのホウレンソウ由来のフェレドキシン（Ｂ成分、ＳＩＧＭＡ社製）、０．１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（Ｃ成分、ＳＩＧＭＡ社製）および実施例１４（２）で回収された上清画分１８μｌを含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。また、前記の反応液組成中のＡ成分、Ｂ成分およびＣ成分のうちの１以上の画分を添加しない反応液を調製し、同様に保温した。保温後の各反応液に、３．０μｌの２Ｎ塩酸および９０μｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、８，０００×ｇで遠心分離し７５μｌの酢酸エチル相を回収した。該酢酸エチル相を減圧下で乾固させた後、残渣を６．０μｌの酢酸エチルに溶解させその内５．０μｌをシリカゲルＴＬＣプレート（ＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ_２５４、２０ｃｍ×２０ｃｍ、０．２５ｍｍ厚、メルク社製）にスポットした。該ＴＬＣプレートを、クロロホルム−酢酸−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸：酢酸エチル＝６：１：２）を展開溶媒として約１時間展開した後、溶媒を蒸発させ、イメージングプレート（富士写真フィルム社製）に一晩露光した。次いで、イメージングプレートをイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム社製）で解析し、^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。結果を表１２に示す。
【０１１６】
【表１２】

【０１１７】
実施例１５　ダイズＲｕＢＰＣ遺伝子の単離
ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）を播種した後、２７℃で３０日間栽培し、緑葉を採取した。採取した緑葉０．２ｇ〜０．３ｇを液体窒素で凍結させ、これを乳鉢と乳棒で磨砕し、該磨砕物から、ＲＮＡ抽出試薬ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いて付属のマニュアルに従って全ＲＮＡを抽出した。さらに、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ＲＴ−ＰＣＲ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて付属のマニュアルに従って操作を行ないｃＤＮＡを合成した。具体的にはプライマーとして前記キットに含まれるＯｌｉｇｏ（ｄＴ）_{１２−１８}　Ｐｒｉｍｅｒを用い、ダイズ全ＲＮＡを鋳型として使用し、前記キットに含まれる逆転写酵素を添加して１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡを合成した。続いて、得られたｃＤＮＡを鋳型にして、配列番号８６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号８７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーに使ってＰＣＲを行い、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のｒｉｂｕｌｏｓｅ−１，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（以下、ＲｕＢＰＣと記す。）小サブユニットの葉緑体トランジットペプチド（以下、ｒＳｔと記すことがある。）とこれに続く成熟タンパク質の１２アミノ酸とをコードする塩基配列を含むＤＮＡ（以下、本ｒＳｔ１２ＤＮＡと記す。）を増幅した。ＰＣＲはＬＡ　Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて、９４℃にて３分間の保温を１回行った後、９８℃にて２５秒間次いで６８℃にて１分間の保温を１サイクルとしてこれを３０回実施し、最後に７２℃にて１０分間の保温を１回行った。増幅されたＤＮＡをプラスミドｐＣＲ２．１（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＰＣＲ産物クローニング部位に挿入することにより、プラスミドｐＣＲｒＳｔ１２（図５）を得た。次いで、該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造社製）に導入し、アンピシリン耐性株を選抜した。さらに、選抜されたアンピシリン耐性株に含まれるプラスミドの塩基配列をＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）およびＤＮＡシークエンサー３７３Ｓ（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結果、配列番号８８で示される塩基配列が明らかとなり、プラスミドｐＣＲｒＳｔ１２は本ｒＳｔ１２ＤＮＡを含むことが確認された。
【０１１８】
実施例１６　本発明ＤＮＡ（Ａ１）を有する直接導入用葉緑体発現プラスミドの構築（１）本発明ＤＮＡ（Ａ１）の単離
実施例３（１）で得られた放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８のゲノムＤＮＡを鋳型にして、配列番号９３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号９４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーに使ってＰＣＲを行い、配列番号６で示される塩基配列を含有するＤＮＡを増幅した。また、配列番号９３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号９５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーに使ってＰＣＲを行い、配列番号９で示される塩基配列を含有するＤＮＡを増幅した。ＰＣＲはＥｘｐａｎｄ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（ベーリンガー社製）を用いて、９７℃にて２分間の保温を１回行った後、９７℃にて１５秒間次いで６０℃にて３０秒間次いで７２℃にて１分間の保温を１サイクルとしてこれを１０回実施し、９７℃にて１５秒間次いで６０℃にて３０秒間次いで７２℃にて１分間（７２℃での保温は１サイクル毎に２０秒間ずつ増加させる）の保温を１サイクルとしてこれを１５回実施し、最後に７２℃にて７分間の保温を１回行った。増幅されたＤＮＡをプラスミドｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＰＣＲ産物クローニング部位に挿入することにより、プラスミドｐＣＲ６５７ＥＴ（図６）およびｐＣＲ６５７ＦＥＴ（図７）を得た。また、ＰＣＲに用いるプライマーを配列番号９６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号９４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドにすることの他は前記した方法と同様の操作でプラスミドｐＣＲ６５７Ｂｓ（図８）を得た。さらに、ＰＣＲに用いるプライマーを配列番号９７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号９６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドにすることの他は前記した方法と同様の操作でプラスミドｐＣＲ６５７ＦＢｓ（図９）を得た。次いで、該プラスミドを大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセル（宝酒造社製）に導入し、アンピシリン耐性株を選抜した。さらに、選抜されたアンピシリン耐性株に含まれるプラスミドの塩基配列をＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｖ２．０（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）およびＤＮＡシークエンサー３１００（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結果、プラスミドｐＣＲ６５７ＥＴおよびｐＣＲ６５７Ｂｓは配列番号６で示される塩基配列を有することが確認された。プラスミドｐＣＲ６５７ＦＥＴおよびｐＣＲ６５７ＦＢｓは配列番号９で示される塩基配列を有することが確認された。
【０１１９】
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ１）を有する直接導入用葉緑体発現プラスミドの構築（１）本発明ＤＮＡ（Ａ１）をパーティクルガン法で植物へ導入するためのプラスミドとして、ダイズ（ｃｖ．Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドをコードする塩基配列（以下、葉緑体トランジットペプチドコード配列と記すことがある。）の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ１）が連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドを構築した。
まず、上記のｐＣＲｒＳｔ１２を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩで消化し、本ｒＳｔ１２ＤＮＡを含むＤＮＡを単離した。一方、ベクタープラスミドｐＵＣ１９（宝酒造社製）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩとで消化することにより約４０ｂｐのＤＮＡを除去して約２６４０ｂｐのＤＮＡを得た。次に仔牛小腸由来のＡｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）で該ＤＮＡの５’末端を脱りん酸化し、ここにｐＣＲｒＳｔ１２から得た本ｒＳｔ１２ＤＮＡを含む上記のＤＮＡを挿入し、ｐＵＣｒＳｔ１２（図１０）を得た。次に、プラスミドｐＣＲ６５７ＥＴおよびｐＣＲ６５７ＦＥＴをそれぞれ制限酵素ＥｃｏＴ２２ＩとＳａｃＩとで消化して本発明ＤＮＡ（Ａ１）を含むＤＮＡを単離した。得られたＤＮＡをそれぞれ、ｐＵＣｒＳｔ１２のＥｃｏＴ２２Ｉ切断部位とＳａｃＩ切断部位との間に挿入することにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ１）が連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドｐＵＣｒＳｔ６５７（図１１）およびｐＵＣｒＳｔ６５７Ｆ（図１２）を得た。
ｐＢＩＣＲ１６Ｇ６ＰＴ（特開２０００−１６６５７７号公報に記載）を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化して約３ｋｂのＤＮＡを単離した（以下、該ＤＮＡに含まれる上記公報記載のプロモーターをＣＲ１６Ｇ６プロモーターと記す。また、該ＤＮＡに含まれる上記公報記載のターミネーターをＣＲ１６ターミネーターと記す。）。ベクタープラスミドｐＵＣ１９（宝酒造社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した後、仔牛小腸由来のＡｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）で該ＤＮＡの５’末端を脱りん酸化し、ここに前記したｐＢＩＣＲ１６Ｇ６ＰＴ由来の約３ｋｂのＤＮＡを挿入して、プラスミドｐＵＣＣＲ１６Ｇ６−ｐ／ｔ（図１３）を得た。ｐＵＣＣＲ１６Ｇ６−ｐ／ｔを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳｃａＩで消化し、ＣＲ１６Ｇ６プロモーターを含むＤＮＡを単離した。一方、ベクタープラスミドｐＵＣ１９（宝酒造社製）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩとで消化することにより５１ｂｐのＤＮＡを除去して残る２６３５ｂｐからなるＤＮＡを得た。次に仔牛小腸由来のＡｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）で該ＤＮＡの５’末端を脱りん酸化し、ここにｐＵＣＣＲ１６Ｇ６−ｐ／ｔから得たＣＲ１６Ｇ６プロモーターを含む上記のＤＮＡと、配列番号８９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号９０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをアニールさせることで得られるリンカーＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ（図１４）とを挿入し、ｐＵＣＣＲ１６Ｇ６−ｐ／ｔΔ（図１５）を得た。ｐＵＣＣＲ１６Ｇ６−ｐ／ｔΔを制限酵素ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＣＲ１６ｔターミネーターの部分塩基配列を有するＤＮＡを単離した。一方、ベクタープラスミドｐＵＣ１９（宝酒造社製）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩとで消化して２６３５ｂｐのＤＮＡを取得した。該ＤＮＡの５’末端を仔牛小腸由来のＡｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）で脱りん酸化し、ここに、ｐＵＣＣＲ１６Ｇ６−ｐ／ｔΔから得たＣＲ１６ｔターミネーターの部分塩基配列を有する上記のＤＮＡと、配列番号９１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号９２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをアニールさせることで得られるリンカーＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ（図１６）とを挿入し、ｐＮｄＧ６−ΔＴ（図１７）を得た。
次に、前記プラスミドｐＵＣｒＳｔ６５７およびｐＵＣｒＳｔ６５７Ｆをそれぞれ制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩとで消化することにより、ダイズ（ｃｖ．Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ１）が連結されてなるキメラＤＮＡを含むＤＮＡを単離した。該ＤＮＡを、プラスミドｐＮｄＧ６−ΔＴの制限酵素ＢｇｌＩＩ切断部位とＳａｃＩ切断部位との間に挿入することにより、それぞれプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７（図１８）およびプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７Ｆ（図１９）を得た。
【０１２０】
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ１）を有する直接導入用葉緑体発現プラスミドの構築（２）本発明ＤＮＡ（Ａ１）をパーティクルガン法で植物に導入するためのプラスミドとして、ダイズ（ｃｖ．Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ１）が連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドを構築した。まず、ベクタープラスミドｐＫＦ１９（宝酒造社製）を制限酵素ＢｓｐＨＩで消化した後、ＫＯＤ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を用いて２本鎖ＤＮＡのギャップにヌクレオチドを付加しＤＮＡ末端を平滑化し、Ｔ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅを用いて自己環化させることによりプラスミドｐＫＦ１９ΔＢｓを得た。実施例１で得られたｐＣＲｒＳｔ１２を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩで消化し、本ｒＳｔ１２ＤＮＡを含むＤＮＡを単離した。ｐＫＦ１９ΔＢｓを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩとで消化して、約２１６０ｂｐのＤＮＡを取得した。該ＤＮＡの５’末端を仔牛小腸由来のＡｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）で脱りん酸化し、ここにｐＣＲｒＳｔ１２から得た本ｒＳｔ１２ＤＮＡを含む上記のＤＮＡを挿入し、ｐＫＦｒＳｔ１２（図２０）を得た。次に、実施例１６（１）で得られたプラスミドｐＣＲ６５７ＢｓおよびｐＣＲ６５７ＦＢｓをそれぞれ制限酵素ＢｓｐＨＩとＳａｃＩとで消化し、それぞれから本発明ＤＮＡ（Ａ１）を含有するＤＮＡを単離した。これらのＤＮＡをそれぞれ、プラスミドｐＫＦｒＳｔ１２のＢｓｐＨＩ切断部位とＳａｃＩ切断部位との間に挿入することにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ１）が連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−６５７（図２１）およびプラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−６５７Ｆ（図２２）を得た。
次に、前記プラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−６５７およびｐＫＦｒＳｔ１２−６５７Ｆをそれぞれ制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩとで消化し、本発明ＤＮＡ（Ａ１）を含有するＤＮＡを取得した。これらのＤＮＡをそれぞれ、実施例１６（２）で得られたプラスミドｐＮｄＧ６−ΔＴの制限酵素ＢｇｌＩＩ切断部位とＳａｃＩ切断部位との間に挿入することにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ１）が連結されてなるキメラＤＮＡがＣＲ１６Ｇ６プロモーターの下流に結合されてなるプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７（図２３）およびｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７Ｆ（図２４）を得た。
【０１２１】
実施例１７　本発明ＤＮＡ（Ａ１）のダイズへの導入
（１）増殖性不定胚の調製
ダイズ（品種；ＦａｙｅｔｔｅおよびＪａｃｋ）のさやを１％次亜塩素酸ナトリウム溶液に浸して殺菌処理した後、未熟種子を取り出した。この種子の種皮を剥離して長径２〜５ｍｍの未熟胚を取り出し、得られた未熟胚の胚軸部をメスで切除して未熟子葉を調製した。この未熟子葉を２枚の子葉部に分け、各子葉部をそれぞれ不定胚誘導培地に置床した。不定胚誘導培地は、１８０μＭの２，４−Ｄと３０ｇ／Ｌのスクロースとを加えｐＨ７．０に調整したＭｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ培地［Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　Ｔ．　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ　Ｆ．，　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｐｌａｎｔ．　（１９６２）　１５，　ｐ４７３に記載。以下、ＭＳ培地と記す。］に、０．２（Ｗ／Ｖ）％のゲルライトを加えて固化した培地である。置床から約１ヶ月後に、形成された球状型胚を不定胚増殖培地に移植した。不定胚増殖培地は、９０μＭの２，４−Ｄと３０ｇ／Ｌのスクロースとを加えてｐＨ５．８に調整したＭＳ培地に、０．２（Ｗ／Ｖ）％のゲルライトを加えて固化した培地である。以後、２〜３週間の間隔で５〜８回、球状型胚を新しい不定胚増殖培地に移植した。上記の不定胚誘導培地または不定胚増殖培地を用いた培養の条件は、いずれも、明期２３時間：暗期１時間、終日２３〜２５℃とした。
【０１２２】
（２）増殖性不定胚への遺伝子導入
実施例１７（１）で得られた球状型胚を新しい不定胚増殖培地に移植し、２〜３日培養した後、これを遺伝子導入の材料とした。実施例１６（２）および（３）で作製されたプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７、ｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７Ｆ、ｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２６５７およびｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２６５７Ｆを直径１．０μｍの金粒子にコートし、パーテイクルガン法を用いて遺伝子の導入を行った。金粒子１ｍｇ当たりのプラスミド量は１．６６μｇとした。遺伝子導入後さらに２日間〜３日間培養した。上記の培養の条件は、いずれも、明期２３時間：暗期１時間、終日２３〜２５℃とした。
【０１２３】
（３）不定胚のハイグロマイシンによる選抜
実施例１７（２）で得られた遺伝子導入後の球状型胚を不定胚選抜培地に移植した。不定胚選抜培地としては、９０μＭの２，４−Ｄと３０ｇ／Ｌのスクロースとを加えｐＨ５．８に調整したＭＳ培地に、１５ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンと０．２（Ｗ／Ｖ）％のゲルライトを加えて固化した培地を用いた。以降、２〜３週間の間隔で５〜８回、生存した球状型胚を新しい不定胚選抜培地に移植した。この場合の不定胚選抜培地は、９０μＭの２，４−Ｄと３０ｇ／Ｌのスクロースとを加えｐＨ５．８に調整したＭＳ培地に、３０ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンと０．２（Ｗ／Ｖ）％のゲルライトを加えて固化した培地である。上記の不定胚選抜培地を用いた培養の条件は、いずれも、明期２３時間：暗期１時間、終日２３〜２５℃とした。
【０１２４】
（４）不定胚の化合物（ＩＩ）による選抜
実施例１７（２）で得られた遺伝子導入後の球状型胚を不定胚選抜培地に移植した。不定胚選抜培地としては、９０μＭの２，４−Ｄと３０ｇ／Ｌのスクロースとを加えｐＨ５．８に調整したＭＳ培地に、０．１ｍｇ／Ｌの化合物（ＩＩ）と０．２（Ｗ／Ｖ）％のゲルライトを加えて固化した培地を用いた。以降、２週間〜３週間の間隔で５〜８回、生存した球状型胚を新しい不定胚選抜培地に移植した。この場合の不定胚選抜培地には、９０μＭの２，４−Ｄと３０ｇ／Ｌのスクロースとを加えｐＨ５．８に調整したＭＳ培地に、０．３〜１．０ｍｇ／Ｌの化合物（ＩＩ）と０．２（Ｗ／Ｖ）％のゲルライトを加えて固化した培地を用いた。上記の不定胚選抜培地を用いた培養の条件は、いずれも、明期２３時間：暗期１時間、終日２３〜２５℃とした。
【０１２５】
（５）不定胚からの個体再生
実施例１７（３）または（４）で選抜された球状型胚を発生培地に移植し、明期２３時間：暗期１時間、終日２３〜２５℃で約４週間培養する。発生培地としては、６０ｇ／Ｌのマルトースを加えｐＨ５．８に調整したＭＳ培地に０．８（Ｗ／Ｖ）％の寒天（和光純薬、植物組織培養用）を添加して固化した培地を用いる。６週間〜８週間後、白〜黄色の子葉型胚が得られる。これらの子葉型胚を発芽培地に移植して２週間培養する。発芽培地には、３０ｇ／Ｌのスクロースを加えｐＨ５．８に調整したＭＳ培地に０．２（ｗ／ｖ）％のゲルライトを加えて固化した培地を用いる。その結果、本葉を展開し発根した個体が得られる。
【０１２６】
（６）再生個体の順化および栽培
実施例１７（５）で得られたダイズ個体を園芸用培土に移植し、明期２３時間：暗期１時間、終日２３〜２５℃の人工気象器内で馴化を行う。２週間後、根が活着した個体を直径９ｃｍの植木鉢に植え替え、温室内で栽培する。温室での栽培条件は自然日長、終日２３〜２５℃とする。２ヵ月〜４ヵ月後、採種する。
【０１２７】
（７）雑草防除活性を有する化合物（ＩＩ）に対する耐性の評価
上記再生植物個体の葉を採取し主葉脈に沿って左右均等に２分割し、一方の葉片に化合物（ＩＩ）を全面に塗布し、他方の葉片は未処理とする。これらの葉片を、０．８％寒天を含むＭＳ培地上に置き、明所、室温にて７日間放置し、次いで、各葉片を、それぞれ乳鉢と乳棒で５ｍｌの８０％アセトン水溶液中で磨砕してクロロフィルを抽出する。抽出液を８０％アセトン水溶液で１０倍に希釈した後、７５０ｎｍ、６６３ｎｍ、６４５ｎｍにおける吸光度を測定し、Ｍａｃｋｎｎｅｙ　Ｇ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　（１９４１）　１４０，　ｐ３１５記載の方法によって総クロロフィル含量を算出する。化合物（ＩＩ）に対する耐性度は、処理した葉片の総クロロフィル含量の、未処理の葉片の総クロロフィル含量に対する百分率で表し評価する。
また、直径１０ｃｍ、深さ１０ｃｍの円筒形プラスチックポットに土壌を詰め、上記植物個体の種子を播種し、温室内で栽培する。化合物（ＩＩ）５部、ソルポール３００５Ｘ（東邦化学）６部およびキシレン８９部をよく混合して乳剤とし、その所定量を、０．１％（Ｖ／Ｖ）の展着剤を含む１ヘクタールあたり１０００リットル相当の水で希釈し、上記のポットで栽培された植物体の上方からその茎葉部全面に均一に噴霧器で散布する。これらの植物体を１６日間温室内で栽培した後、該植物の薬害を調査し、化合物（ＩＩ）に対する耐性度を評価する。
【０１２８】
実施例１８　本発明ＤＮＡ（Ａ１）を有するアグロバクテリウム導入用葉緑体発現プラスミドの構築
本発明ＤＮＡ（Ａ１）をアグロバクテリウム法で植物へ導入するためのプラスミドを構築した。まず、バイナリーベクタープラスミドｐＢＩ１２１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を制限酵素ＮｏｔＩで消化した後、ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｉ（宝酒造社製）を用いて２本鎖ＤＮＡのギャップにヌクレオチドを付加することによりＤＮＡ末端を平滑化し、Ｔ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅを用いて自己環化させた。得られたプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した後、ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｉ（宝酒造社製）を用いて２本鎖ＤＮＡのギャップにヌクレオチドを付加しＤＮＡ末端を平滑化し、Ｔ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅを用いて自己環化させプラスミドｐＢＩ１２１ΔＮｏｔＩＥｃｏＲＩを得た。該プラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、得られたＤＮＡの５’末端を、仔牛小腸由来のＡｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）で脱りん酸化し、配列番号９８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号９９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをアニールさせることで得られるリンカーＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ（図２５）を挿入して環化させ、バイナリーベクタープラスミドｐＢＩ１２１Ｓ（図２６）を得た。該プラスミドは、リンカーＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩが、β−グルクロニダーゼ遺伝子に近い位置からＨｉｎｄＩＩＩ切断部位、ＮｏｔＩ切断部位、ＥｃｏＲＩ切断部位の順に並ぶ方向に挿入された構造を有する。
次に、上記プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７およびｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７Ｆをそれぞれ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ１）が連結されてなるキメラＤＮＡを含むＤＮＡをそれぞれから得た。これらのＤＮＡをそれぞれ、上記バイナリーベクタープラスミドｐＢＩ１２１ＳのＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＥｃｏＲＩ切断部位との間に挿入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７（図２７）およびｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７Ｆ（図２８）を得た。また、上記プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７およびｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７Ｆをそれぞれ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ１）が連結されてなるキメラＤＮＡを含むＤＮＡをそれぞれから得た。これらのＤＮＡをそれぞれ、バイナリーベクタープラスミドｐＢＩ１２１ＳのＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＥｃｏＲＩ切断部位との間に挿入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７（図２９）およびｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７Ｆ（図３０）を得た。
【０１２９】
実施例１９　本発明ＤＮＡ（Ａ１）のタバコへの導入
実施例１８で得られたプラスミド　ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７、プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７Ｆ、プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２６５７ＦおよびプラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２６５７Ｆ　を用いて本発明ＤＮＡ（Ａ１）をアグロバクテリウム法でタバコへ導入した。
まず、プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２６５７、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７ＦおよびｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２６５７Ｆをそれぞれ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４０４　株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　社製）に導入した。これらを、３００ｍｇ／Ｌ　ストレプトマイシン、１００ｍｇ／Ｌリファンピシン、２５ｍｇ／Ｌ　カナマイシンを含むＬＢ　寒天培地（０．５％　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、１．０％　Ｂａｃｔｏ　ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％　ＮａＣｌ）で培養して薬剤耐性コロニーを選抜することによって、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２６５７、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７またはｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２６５７Ｆを持つ組換えアグロバクテリウム株をそれぞれ単離した。
次いで、植物遺伝子操作マニュアル（内宮博文著、講談社サイエンティフィック、１９９２年）に記載されている方法に準じて、タバコへの遺伝子導入を行った。上記のプラスミドを持つ組換えアグロバクテリウム株を、それぞれ、３００ｍｇ／Ｌ　ストレプトマイシン、１００ｍｇ／Ｌ　リファンピシン、２５ｍｇ／Ｌ　カナマイシンを含む　ＬＢ　液体培地中で　２８℃　にて終夜培養し、無菌培養したタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　ｓｔｒａｉｎ　ＳＲ１）より採取した葉片を該培養液に浸漬した。該タバコ葉片を、０．１ｍｇ／Ｌ　ナフタレン酢酸および　１．０ｍｇ／Ｌ　ベンジルアミノプリンを添加した　ＭＳ　寒天培地（ＭＳ　無機塩類、ＭＳ　ビタミン類、３％　蔗糖、０．８％　寒天；　　Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　Ｔ．　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ　Ｆ．，　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｐｌａｎｔ．　（１９６２）　１５，　ｐ４７３）に植え込み、明所・室温で　２日間培養した。次に、該タバコ葉片を滅菌水で洗浄した後、０．１ｍｇ／Ｌ　ナフタレン酢酸、１．０ｍｇ／Ｌ　ベンジルアミノプリン、および、５００ｍｇ／Ｌ　セフォタキシムを添加したＭＳ　寒天培地上で　７日間培養した。次いで、該タバコ葉片を　０．１ｍｇ／Ｌ　ナフタレン酢酸、１．０ｍｇ／Ｌ　ベンジルアミノプリン、５００ｍｇ／Ｌ　セフォタキシム、および、１００ｍｇ／Ｌ　カナマイシンを添加した　ＭＳ　寒天培地に移植し培養した。該培養は、前記タバコ葉片を　４週間毎に同一組成の新鮮な培地に移植しながら継続的に４ヶ月間実施した。この間に、該タバコ葉片から出現した不定芽を、３００ｍｇ／Ｌ　セフォタキシム、および、５０ｍｇ／Ｌ　カナマイシンを添加した　ＭＳ　寒天培地に移植して発根させ再生個体を得た。該再生個体を　５０ｍｇ／Ｌ　カナマイシンを添加した　ＭＳ　寒天培地に移植して培養しｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２６５７、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７ＦまたはｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２６５７Ｆの　Ｔ−ＤＮＡ　領域が組み込まれた組換えタバコ個体をそれぞれ取得した。
また、実施例１８で得られたプラスミドｐＢＩ１２１Ｓをアグロバクテリウム法でタバコへ導入した。プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２６５７、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７ＦおよびｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２６５７Ｆの代わりにプラスミドｐＢＩ１２１Ｓを使用する以外は上記と同様にして、プラスミドｐＢＩ１２１Ｓを持つ組換えアグロバクテリウム株を単離した。次いで、該組換えアグロバクテリウム株を用いて、上記と同様にしてプラスミドｐＢＩ１２１Ｓの　Ｔ−ＤＮＡ　領域が組み込まれた組換えタバコ個体を取得した。
取得した組換えタバコ個体から３枚の葉を切除して、各葉より一片　５〜７ｍｍ　の葉片を　４片採取した。それぞれの葉片を化合物（ＩＩ）を　０．１ｍｇ／Ｌ　添加した　ＭＳ　寒天培地に植え込み、明所・室温で培養した。培養　７日後にそれぞれの葉片の薬害程度を観察した。コントロールＤＮＡ（プラスミドｐＢＩ１２１ＳのＴ−ＤＮＡ領域）が導入されたタバコ由来の葉片は白化し枯死したのに対し、本発明ＤＮＡ（Ａ１）（プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２６５７、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７ＦまたはｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２６５７ＦのＴ−ＤＮＡ領域）が導入されたタバコ由来の葉片は継続的に生育した。
【０１３０】
実施例２０　本発明ＤＮＡ（Ａ２）の植物への導入
本発明ＤＮＡ（Ａ２）をパーティクルガン法で植物へ導入するためのプラスミドおよびアグロバクテリウム法で植物へ導入するためのプラスミドを構築した。まず、実施例６（１）で得られた放線菌Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ９３８３ｔのゲノムＤＮＡを鋳型にして、配列番号１００で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１０１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーに使ってＰＣＲを行い、配列番号７で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ａ２）を増幅した。ＰＣＲはＥｘｐａｎｄ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（ベーリンガー社製）を用いて、９７℃にて２分間の保温を１回行った後、９７℃にて１５秒間次いで６０℃にて３０秒間次いで７２℃にて１分間の保温を１サイクルとしてこれを１０回実施し、９７℃にて１５秒間次いで６０℃にて３０秒間次いで７２℃にて１分間（７２℃での保温は１サイクル毎に２０秒間ずつ増加させる）の保温を１サイクルとしてこれを１５回実施し、最後に７２℃にて７分間の保温を１回行った。増幅されたＤＮＡをプラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＰＣＲ産物クローニング部位に挿入することにより、プラスミドｐＣＲ９２３Ｓｐ（図３１）を得た。次いで、該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造社製）に導入し、アンピシリン耐性株を選抜した。さらに、選抜されたアンピシリン耐性株に含まれるプラスミドの塩基配列をＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）およびＤＮＡシークエンサー３７３Ｓ（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結果、プラスミドｐＣＲ９２３Ｓｐは配列番号７で示される塩基配列を含有することが確認された。
実施例１６（３）で作製されたプラスミドｐＫＦｒＳｔ１２を制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩとで消化し、本ｒＳｔ１２ＤＮＡを含むＤＮＡを単離した。該ＤＮＡを、実施例１６（２）で得られたｐＮｄＧ６−ΔＴのＢｇｌＩＩ切断部位とＳａｃＩ切断部位との間に挿入することにより、プラスミドｐＮｄＧ６−ｒＳｔ１２（図３２）を得た。プラスミドｐＣＲ９２３Ｓｐを制限酵素ＳｐｈＩとＫｐｎＩとで消化することにより、本発明ＤＮＡ（Ａ２）を含むＤＮＡを得た。上記プラスミドｐＮｄＧ６−ｒＳｔ１２を制限酵素ＳｐｈＩとＫｐｎＩとで消化することによりダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの最初の成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードするＤＮＡを除去し、これに換えて、プラスミドｐＣＲ９２３Ｓｐから得た本発明ＤＮＡ（Ａ２）を含む上記ＤＮＡを挿入し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく該ＤＮＡが連結されてなるキメラＤＮＡがＣＲ１６Ｇ６プロモーターの下流に結合されてなるプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−９２３（図３３）を得た。
次に、プラスミドｐＣＲ９２３Ｓｐを制限酵素ＳｐｈＩで消化して得られるＤＮＡの末端をＫＯＤＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて平滑化した後、さらに制限酵素ＫｐｎＩで消化し、本発明ＤＮＡ（Ａ２）を含むＤＮＡを単離した。実施例１６（３）で作製されたプラスミドｐＫＦｒＳｔ１２を制限酵素ＢｓｐＨＩで消化して得られるＤＮＡの末端をＫＯＤ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて平滑化した後、さらに制限酵素ＫｐｎＩで消化し、約２０ｂｐのＤＮＡを除去して、これに替えて、ｐＣＲ９２３Ｓｐから得た本発明ＤＮＡ（Ａ２）を含む上記ＤＮＡを挿入することにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２）が連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−９２３（図３４）を得た。ｐＫＦｒＳｔ１２−９２３を制限酵素ＳｐｈＩとＫｐｎＩとで消化することにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの最初の成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードするＤＮＡと本発明ＤＮＡ（Ａ２）が連結されてなるキメラＤＮＡを得た。上記プラスミドｐＮｄＧ６−ｒＳｔ１２を制限酵素ＳｐｈＩとＫｐｎＩとで消化することによりダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの最初の成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードするＤＮＡを除去し、これに換えて、プラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−９２３から得られる上記キメラＤＮＡを挿入し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２）が連結されてなるキメラＤＮＡがＣＲ１６Ｇ６プロモーターの下流に結合されてなるプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−９２３（図３５）を得た。
得られたプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−９２３およびｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−９２３を用いて、本発明ＤＮＡ（Ａ２）を実施例１７記載の方法と同様の操作で、パーティクルガン法でダイズへ導入した。
【０１３１】
上記プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−９２３を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２）が連結されてなるキメラＤＮＡを含むＤＮＡを単離した。実施例１８でｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７を作成したのと同様に、バイナリーベクターｐＢＩ１２１ＳのＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＥｃｏＲＩ切断部位との間に、プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−９２３から得たキメラＤＮＡを含む上記ＤＮＡを挿入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−９２３　（図３６）を得た。また、上記プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−９２３を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２）が連結されてなるキメラＤＮＡを含むＤＮＡを単離した。バイナリーベクターｐＢＩ１２１ＳのＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＥｃｏＲＩ切断部位との間に、ｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−９２３から得たキメラＤＮＡを含む上記ＤＮＡを挿入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−９２３（図３７）を得た。
該プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−９２３および該プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−９２３を、それぞれＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４０４に導入し、これを３００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌリファンピシン、２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地で培養して形質転換体を選抜することによって、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−９２３を持つアグロバクテリウム株またはｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−９２３を持つアグロバクテリウム株を単離した。ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−９２３を持つアグロバクテリウム株またはｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−９２３を持つアグロバクテリウム株をそれぞれ無菌培養したタバコの葉片に感染させ、実施例１９記載の方法と同様の操作で、本発明ＤＮＡ（Ａ２）が導入されたタバコを取得した。
取得した組換えタバコ個体から３枚の葉を切除して、各葉より一片　５〜７ｍｍ　の葉片を　４片採取した。それぞれの葉片を化合物（ＩＩ）を　０．１ｍｇ／Ｌ　添加した　ＭＳ　寒天培地に植え込み、明所・室温で培養した。培養　７日後にそれぞれの葉片の薬害程度を観察した。コントロールＤＮＡ（プラスミドｐＢＩ１２１ＳのＴ−ＤＮＡ領域）が導入されたタバコ由来の葉片は白化し枯死したのに対し、本発明ＤＮＡ（Ａ２）（プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ９２３、またはｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−９２３のＴ−ＤＮＡ領域）が導入されたタバコ由来の葉片は継続的に生育した。
【０１３２】
実施例２１　本発明ＤＮＡ（Ａ３）の植物への導入
本発明ＤＮＡ（Ａ３）をパーティクルガン法で植物へ導入するためのプラスミドおよびアグロバクテリウム法で植物へ導入するためのプラスミドを構築した。
まず、実施例１１（１）で得た放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９株のゲノムＤＮＡを鋳型にして、配列番号１０２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１０３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーに使ってＰＣＲを行い、配列番号８で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ａ３）を増幅した。ＰＣＲはＥｘｐａｎｄ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（ベーリンガー社製）を用いて、９７℃にて２分間の保温を１回行った後、９７℃にて１５秒間次いで６０℃にて３０秒間次いで７２℃にて１分間の保温を１サイクルとしてこれを１０回実施し、９７℃にて１５秒間次いで６０℃にて３０秒間次いで７２℃にて１分間（７２℃での保温は１サイクル毎に２０秒間ずつ増加させる）の保温を１サイクルとしてこれを１５回実施し、最後に７２℃にて７分間の保温を１回行った。増幅されたＤＮＡをプラスミドｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＰＣＲ産物クローニング部位に挿入することにより、プラスミドｐＣＲ６７１ＥＴ（図３８）を得た。また、ＰＣＲに用いるプライマーを配列番号１０４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１０３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドにすることの他は前記した方法と同様の操作でプラスミドｐＣＲ６７１Ｂｓ（図３９）を得た。次いで、該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造社製）に導入し、アンピシリン耐性株を選抜した。さらに、選抜されたアンピシリン耐性株に含まれるプラスミドの塩基配列をＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｖ２．０（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）およびＤＮＡシークエンサー３１００（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結果、プラスミドｐＣＲ６７１ＥＴおよびｐＣＲ６７１Ｂｓは配列番号８で示される塩基配列を含むことが確認された。
プラスミドｐＣＲ６７１ＥＴを制限酵素ＥｃｏＴ２２ＩとＫｐｎＩとで消化し、本発明ＤＮＡ（Ａ３）を含むＤＮＡを単離した。該ＤＮＡを、実施例３で得たｐＵＣｒＳｔ１２のＥｃｏＴ２２Ｉ切断部位とＫｐｎＩ切断部位との間に挿入することにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ３）が連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドｐＵＣｒＳｔ６７１（図４０）を得た。該プラスミドｐＵＣｒＳｔ６７１を制限酵素ＮｈｅＩとＫｐｎＩとで消化し、本発明ＤＮＡ（Ａ３）を含むＤＮＡを単離した。実施例１６（２）で得たプラスミドｐＮｄＧ６−ｒＳｔ１２を制限酵素ＮｈｅＩとＫｐｎＩとで消化することにより約８０ｂｐのＤＮＡを除去し、これに換えて、プラスミドｐＵＣｒＳｔ６７１から得た本発明ＤＮＡ（Ａ３）を含む上記ＤＮＡを挿入し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ３）が連結されてなるキメラＤＮＡがＣＲ１６Ｇ６プロモーターの下流に結合されてなるプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６７１（図４１）を得た。
プラスミドｐＣＲ６７１Ｂｓを制限酵素ＢｓｐＨＩとＫｐｎＩとで消化し、本発明ＤＮＡ（Ａ３）を含むＤＮＡを単離した。該ＤＮＡを、実施例１６（３）で得られたプラスミドｐＫＦｒＳｔ１２のＢｓｐＨＩ切断部位とＫｐｎＩ切断部位との間に挿入することにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ３）が連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−６７１（図４２）を得た。該プラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−６７１を制限酵素ＮｈｅＩとＫｐｎＩとで消化し、本発明ＤＮＡ（Ａ３）を含むＤＮＡを単離した。実施例２０で得られたプラスミドｐＮｄＧ６−ｒＳｔ１２を制限酵素ＮｈｅＩとＫｐｎＩとで消化することにより約８０ｂｐのＤＮＡを除去し、これに換えて、ｐＫＦｒＳｔ１２−６７１から得た本発明ＤＮＡ（Ａ３）を含む上記ＤＮＡを挿入し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ３）が連結されてなるキメラＤＮＡがＣＲ１６Ｇ６プロモーターの下流に結合されてなるプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６７１（図４３）を得た。
得られたプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６７１およびｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６７１を用いて、本発明ＤＮＡ（Ａ３）を実施例１７記載の方法と同様の操作で、パーティクルガン法でダイズへ導入した。
【０１３３】
上記プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６７１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ３）が連結されてなるキメラＤＮＡを含むＤＮＡを単離した。実施例１８で得られたバイナリーベクタープラスミドｐＢＩ１２１ＳのＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＥｃｏＲＩ切断部位との間に、プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６７１から得たキメラＤＮＡを含む上記ＤＮＡを挿入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６７１　（図４４）を得た。また、上記プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６７１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ３）が連結されてなるキメラＤＮＡを含むＤＮＡを単離した。バイナリーベクタープラスミドｐＢＩ１２１ＳのＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＥｃｏＲＩ切断部位との間に、プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６７１から得たキメラＤＮＡを含む上記ＤＮＡを挿入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６７１（図４５）を得た。
プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６７１および該プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６７１を、それぞれＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４０４に導入し、これを３００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌリファンピシン、２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地で培養して形質転換体を選抜することによって、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６７１を持つアグロバクテリウム株およびｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６７１を持つアグロバクテリウム株を単離した。ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６７１を持つアグロバクテリウム株およびｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６７１を持つアグロバクテリウム株をそれぞれ無菌培養したタバコの葉片に感染させ、実施例１９記載の方法と同様の操作で、本発明ＤＮＡ（Ａ３）が導入されたタバコを取得した。
取得した組換えタバコ個体から３枚の葉を切除して、各葉より一片　５〜７ｍｍ　の葉片を　４片採取する。それぞれの葉片を化合物（ＩＩ）を　０．１ｍｇ／Ｌ　添加した　ＭＳ　寒天培地に植え込み、明所・室温で培養する。培養　７日後にそれぞれの葉片の薬害程度を観察する。
【０１３４】
実施例２２　本発明蛋白質（Ｂ１）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ｂ１）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例３（１）でＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８から調製された染色体ＤＮＡを鋳型としＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液は、配列番号１０５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号５３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをそれぞれ２００ｎＭとなるよう添加し、染色体ＤＮＡを３００ｎｇ、ｄＮＴＰミックス（それぞれ２．５ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を４μｌ、１０ｘＥｘＴａｑバッファーを５μｌ、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造製）を０．５μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を５０μｌにした。保温条件は、９７℃で２分間保温した後、９７℃で１５秒間次いで６０℃で３０秒間さらに７２℃で９０秒間の保温を１サイクルとしてこれを２５サイクル繰り返し、７２℃で４分間保温した。保温後の反応液とｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とを、該ベクター添付の取扱説明書に従ってライゲーションし、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’に導入した。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　ＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。該ＤＮＡを鋳型とし配列番号６７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号６８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。得られた反応物をＤＮＡシーケンサ３７３Ａ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。その結果に基づき、配列番号１５で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ６５７ＦＤとした。
次に、ｐＣＲ６５７ＦＤを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物をアガロースゲル電気泳動に供した。約２００ｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出し、ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。このＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とを、ライゲーションキットＶｅｒ．１（宝酒造社製）を用い、該キット付属の取扱説明書に従いライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、その構造を解析した。配列番号１５で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ｂ１）をコードする上記の約２００ｂｐのＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドをｐＫＳＮ６５７ＦＤとした。該プラスミドｐＫＳＮ６５７ＦＤを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７ＦＤとした。また、プラスミドｐＫＳＮ２を大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２とした。
【０１３５】
（２）本発明蛋白質（Ｂ１）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７ＦＤ、およびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＴＢ培地（トリプトン１．２％（ｗ／ｖ）、酵母エキス２．４％（ｗ／ｖ）、グリセロール０．４％（ｖ／ｖ）、リン酸二水素カリウム１７ｍＭ、リン酸水素二カリウム７２ｍＭ）で３７℃で一晩培養した。得られた培養液のうち１ｍｌを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＴＢ培地に植菌して２６℃で培養し、ＯＤ６６０が約０．５になった３０分後に最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加しさらに２０時間培養した。
各培養液から菌体を回収し、それぞれ０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄後、１ｍＭ　ＰＭＳＦを含む該バッファー１０ｍｌに懸濁した。この菌体懸濁液を超音波破砕機（ＳＯＮＩＦＩＥＲ（Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｓｏｎｉｃ　Ｐｏｗｅｒ　社登録商標））を用いてｏｕｔ　ｐｕｔ　３、ｄｕｔｙ　ｃｙｃｌｅ　３０％の条件で３分間ずつ６回超音波処理して菌体破砕液を得た。得られた破砕液を、遠心分離（１，２００×ｇ、５分間）した後、上清を回収してこれを遠心分離（１５０，０００×ｇ、７０分間）し、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７ＦＤから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７ＦＤ、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を回収した。該上清画分のうち１μｌをＳＤＳ−１５％〜２５％ＰＡＧＥで分析し、ＣＢＢ染色した。その結果、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７ＦＤにおいて、分子量約７ｋＤａに相当する泳動位置に、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２よりも顕著に濃いバンドが検出された。本発明蛋白質（Ｂ１）が大腸菌内で発現したことが確認された。
【０１３６】
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する反応系への本発明蛋白質（Ｂ１）の利用
^１４Ｃで標識された３ｐｐｍの化合物（ＩＩ）、２ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Ａ成分、オリエンタル酵母社製）、実施例２２（２）で回収された大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７ＦＤを９μｌ、０．１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（Ｃ成分、ＳＩＧＭＡ社製）、実施例４（２）で回収された大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７Ｆを１５μｌ（以下、Ｄ成分と記す。）を含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。また、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７ＦＤの代わりに、２ｍｇ／ｍｌのホウレンソウ由来のフェレドキシン（Ｂ成分、ＳＩＧＭＡ社製）を添加する反応液、および大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７ＦＤの代わりに何も添加しない反応液を調製し、同様に保温した。保温後の各反応液に、３．０μｌの２Ｎ塩酸および９０μｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、８，０００×ｇで遠心分離し７５μｌの酢酸エチル相を回収した。該酢酸エチル相を減圧下で乾固させた後、残渣を６．０μｌの酢酸エチルに溶解させその内５．０μｌをシリカゲルＴＬＣプレート（ＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ_２５４、２０ｃｍ×２０ｃｍ、０．２５ｍｍ厚、メルク社製）にスポットした。該ＴＬＣプレートを、クロロホルム−酢酸−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸：酢酸エチル＝６：１：２）を展開溶媒として約１時間展開した後、溶媒を蒸発させ、イメージングプレート（富士写真フィルム社製）に一晩露光した。次いで、イメージングプレートをイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム社製）で解析し、^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。結果を表１３に示す。
【０１３７】
【表１３】

【０１３８】
実施例２３　本発明蛋白質（Ｂ２）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ｂ２）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例６（１）でＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔから調製された染色体ＤＮＡを鋳型としＰＣＲを実施する。ＰＣＲ反応液は、配列番号１０６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号６３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをそれぞれ２００ｎＭとなるよう添加し、染色体ＤＮＡを３００ｎｇ、ｄＮＴＰミックス（それぞれ２．５ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を４μｌ、１０ｘＥｘＴａｑバッファーを５μｌ、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造製）を０．５μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を５０μｌにする。保温条件は、９７℃で２分間保温した後、９７℃で１５秒間次いで６０℃で３０秒間さらに７２℃で９０秒間の保温を１サイクルとしてこれを２５サイクル繰り返し、７２℃で４分間保温する。保温後の反応液とｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とを、該ベクター添付の取扱説明書に従ってライゲーションし、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’に導入する。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製する。該ＤＮＡを鋳型とし配列番号６７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号６８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーとして、ダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行う。得られた反応物をＤＮＡシーケンサ３７３Ａ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析する。その結果に基づき、配列番号１６で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ９２３ＦＤとする。
次に、ｐＣＲ９２３ＦＤを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物をアガロースゲル電気泳動に供す。約２００ｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出し、ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製する。このＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とを、ライゲーションキットＶｅｒ．１（宝酒造社製）を用い、該キット付属の取扱説明書に従いライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９に導入する。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、その構造を解析する。配列番号１６で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ｂ２）をコードする上記の約２００ｂｐのＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドをｐＫＳＮ９２３ＦＤとする。該プラスミドｐＫＳＮ９２３ＦＤを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ９２３ＦＤとする。また、プラスミドｐＫＳＮ２を大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２とする。
【０１３９】
（２）本発明蛋白質（Ｂ２）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ９２３ＦＤおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＴＢ培地（トリプトン１．２％（ｗ／ｖ）、酵母エキス２．４％（ｗ／ｖ）、グリセロール０．４％（ｖ／ｖ）、リン酸二水素カリウム１７ｍＭ、リン酸水素二カリウム７２ｍＭ）で３７℃で一晩培養する。得られる培養液のうち１ｍｌを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＴＢ培地に植菌して２６℃で培養し、ＯＤ６６０が約０．５になった３０分後に最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加しさらに２０時間培養を行う。
各培養液から菌体を回収し、それぞれ０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄後、１ｍＭ　ＰＭＳＦを含む該バッファー１０ｍｌに懸濁する。この菌体懸濁液を超音波破砕機（ＳＯＮＩＦＩＥＲ（Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｓｏｎｉｃ　Ｐｏｗｅｒ　社登録商標））を用いてｏｕｔ　ｐｕｔ　３、ｄｕｔｙ　ｃｙｃｌｅ　３０％の条件で３分間ずつ６回超音波処理して菌体破砕液を得る。得られた破砕液を、遠心分離（１，２００×ｇ、５分間）した後、上清を回収してこれを遠心分離（１５０，０００×ｇ、７０分間）し、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７ＦＤから得られる該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ９２３ＦＤ、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を回収する。該上清画分のうち１μｌをＳＤＳ−１５％〜２５％ＰＡＧＥで分析し、ＣＢＢ染色を行う。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ９２３ＦＤにおいて、分子量約７ｋＤａに相当する泳動位置に、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２よりも顕著に濃いバンドを検出することによって、本発明蛋白質（Ｂ２）の大腸菌内発現が確認可能である。
【０１４０】
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する反応系への本発明蛋白質（Ｂ２）の利用
^１４Ｃで標識された３ｐｐｍの化合物（ＩＩ）、２ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Ａ成分、オリエンタル酵母社製）、実施例２３（２）で回収する大腸菌抽出液ｐＫＳＮ９２３ＦＤを９μｌ、終濃度０．１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（Ｃ成分、ＳＩＧＭＡ社製）、実施例４（２）で回収された大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７Ｆを１５μｌ（以下、Ｄ成分と記す。）を含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温する。また、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ９２３ＦＤの代わりに、終濃度２ｍｇ／ｍｌのホウレンソウ由来のフェレドキシン（Ｂ成分、ＳＩＧＭＡ社製）を添加する反応液、および大腸菌抽出液ｐＫＳＮ９２３ＦＤの代わりに何も添加しない反応液を調製し、同様に保温する。保温後の各反応液に、３．０μｌの２Ｎ塩酸および９０μｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、８，０００×ｇで遠心分離し７５μｌの酢酸エチル相を回収する。該酢酸エチル相を減圧下で乾固させた後、残渣を６．０μｌの酢酸エチルに溶解させその内５．０μｌをシリカゲルＴＬＣプレート（ＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ_２５４、２０ｃｍ×２０ｃｍ、０．２５ｍｍ厚、メルク社製）にスポットする。該ＴＬＣプレートを、クロロホルム−酢酸−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸：酢酸エチル＝６：１：２）を展開溶媒として約１時間展開した後、溶媒を蒸発させ、イメージングプレート（富士写真フィルム社製）に一晩露光する。次いで、イメージングプレートをイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム社製）で解析し、^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）を確認する。Ａ成分、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ９２３ＦＤ、Ｃ成分およびＤ成分を含む反応液での化合物（ＩＩＩ）の生成を確認することにより、本発明蛋白質（Ｂ２）が、化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する反応系において、ホウレンソウ由来のフェレドキシンに替えて利用可能であることを確認することが出来る。
【０１４１】
実施例２４　本発明蛋白質（Ｂ３）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ｂ３）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例１１（１）でＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９から調製された染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１０７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号７２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして使用する以外は、実施例２３（１）に記載の方法と同様にして、ＰＣＲを実施する。得られる反応液を用いて実施例２３（１）に記載の方法と同様にして、配列番号１７で示される塩基配列を有するプラスミドｐＣＲ６７１ＦＤを得る。
次に、該プラスミドを用いて実施例２３（１）に記載の方法と同様にして、本発明ＤＮＡ（Ｂ３）が、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドｐＫＳＮ６７１ＦＤを得る。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入することによって本発明ＤＮＡ（Ｂ３）を有する大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６７１ＦＤを得ることが可能である。
【０１４２】
（２）本発明蛋白質（Ｂ３）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６７１ＦＤを用いて、実施例２３（２）に記載した方法と同様にして、上清画分（以下、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６７１ＦＤと記す。）を回収する。該上清画分のうち１μｌをＳＤＳ−１５％〜２５％ＰＡＧＥで分析し、ＣＢＢ染色を行う。その結果、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６７１ＦＤにおいて、分子量約７ｋＤａに相当する泳動位置に、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２よりも顕著に濃いバンドを検出することによって、本発明蛋白質（Ｂ３）が大腸菌内で発現したことの確認が可能である。
【０１４３】
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する反応系への本発明蛋白質（Ｂ３）の利用
実施例２４（２）で回収する大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６７１ＦＤを使用すること以外は実施例２３（３）に記載した方法と同様にして、^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）を確認する。Ａ成分、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６７１ＦＤ、Ｃ成分およびＤ成分を含む反応液での化合物（ＩＩＩ）の生成を確認することにより、本発明蛋白質（Ｂ３）が、化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する反応系において、ホウレンソウ由来のフェレドキシンに替えて利用可能であることを確認することが出来る。。
【０１４４】
実施例２５　　本発明蛋白質（Ａ４）の調製
（１）菌体粗抽出液の調製
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２７３５株のグリセロールストックを、１０ｍｌのＡ培地（グルコース０．１％（ｗ／ｖ）、トリプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）、りん酸水素二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．０）を入れた大型試験管に添加し、３０℃で一晩旋回培養して、前培養液を得た。この前培養液８ｍｌを２００ｍｌのＡ培地に植菌し、５００ｍｌ容羽付フラスコ内で３０℃で２日間、旋回培養した。このようにして得られた培養液から遠心分離（３，０００×ｇ、１０分間）によって湿菌体を回収した。この湿菌体を１００ｐｐｍの化合物（ＩＩ）を含む１００ｍｌのＢ培地（グルコース１％（ｗ／ｖ）、牛肉エキス０．１％、トリプトース０．２％（ｗ／ｖ））に懸濁して、５００ｍｌ容坂口フラスコ内で３０℃で２０時間往復振とう培養した。このようにして得られた培養液２Ｌから遠心分離（３，０００×ｇ、１０分間）によって湿菌体を回収した。得られた湿菌体を１Ｌの０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）にて２回洗浄し、１３６ｇの湿菌体を得た。
この湿菌体を、菌体湿重量１ｇあたり２〜３ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、この懸濁液に、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、５ｍＭ　ベンザミジン塩酸、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、３μｇ／ｍｌ　ロイペプチン、３μｇ／ｍｌ、ペプスタチンＡ、および１ｍＭ　ジチオトレイトールを添加した。これをフレンチプレス（大岳製作所製）で２回繰り返し破砕（１０００ｋｇ／ｃｍ^２）して菌体破砕液を得た。この菌体破砕液を遠心分離（４０，０００×ｇ、３０分間）した後、上清を回収してこれを１５０，０００×ｇで１時間遠心分離し、上清（以下、菌体粗抽出液と記す。）を分取した。
【０１４５】
（２）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
^１４Ｃで標識された３ｐｐｍの化合物（ＩＩ）、２．４ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Ａ成分、オリエンタル酵母社製）、０．５ｍｇ／ｍｌ　ホウレンソウ由来のフェレドキシン（Ｂ成分、ＳＩＧＭＡ社製）、１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（Ｃ成分、ＳＩＧＭＡ社製）および実施例２５（１）で回収された菌体粗抽出液１５μｌを含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液３０μｌを調製し、３０℃で１時間保温した。また、前記の反応液組成中のＡ成分、Ｂ成分およびＣ成分のうち１以上の画分を添加しない反応液を調製し、同様に保温した。保温後の各反応液に、３．０μｌの２Ｎ塩酸および９０μｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、８，０００×ｇで遠心分離し７５μｌの酢酸エチル相を回収した。該酢酸エチル相を減圧下で乾固させた後、残渣を６．０μｌの酢酸エチルに溶解させその内５．０μｌをシリカゲルＴＬＣプレート（ＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ_２５４、２０ｃｍ×２０ｃｍ、０．２５ｍｍ厚、メルク社製）にスポットした。該ＴＬＣプレートを、クロロホルム−酢酸−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸：酢酸エチル＝６：１：２）を展開溶媒として約１時間展開した後、溶媒を蒸発させ、イメージングプレート（富士写真フィルム社製）に一晩露光した。次いで、イメージングプレートをイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム社製）で解析し、^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。結果を表１４に示す。
【０１４６】
【表１４】

【０１４７】
（３）菌体粗抽出液の分画
実施例２５（１）で得られた菌体粗抽出液に４５％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して氷上で攪拌した後、１２，０００×ｇ、３０分間遠心分離して上清を回収した。得られた上清に５５％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して氷上で攪拌した後、１２，０００×ｇ、１０分間遠心分離し、沈殿を回収して１２．５ｍｌの２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）に溶解した。この溶解液をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ、蛋白質を含む画分（以下、硫安沈殿４５−５５％画分と記す。）１７．５ｍｌを分取した。
【０１４８】
（４）本発明蛋白質（Ａ４）の単離
実施例２５（３）で調製された硫安沈殿４５−５５％画分を、ＨｉＬｏａｄ２６／１０　Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＨＰカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に注入した。次いで、前記カラムに１００ｍｌの２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）を流した後、塩化ナトリウム直線濃度勾配を付して２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）を流し（塩化ナトリウム濃度勾配０．００４Ｍ／分、塩化ナトリウム濃度範囲　０Ｍから１Ｍ、流速４ｍｌ／分）、塩化ナトリウム濃度０．１２Ｍから０．１６５Ｍにて溶出された画分３０ｍｌを分取した。さらにこの分取した画分をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ蛋白質を含む画分を回収した。
回収した画分をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、Ａバッファー（１．５ｍＭの塩化カルシウムを含む２ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０）で溶出させ蛋白質を含む画分を回収した。次いで、該画分をＢｉｏ−Ｓｃａｌｅ　Ｃｅｒａｍｉｃ　Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ，　ＴｙｐｅＩｃｏｌｕｍ　ＣＨＴ１０−Ｉ（バイオラッド社製）に注入し、該カラムに２０ｍｌのＡバッファーを流した。次いで、前記カラムにＢバッファー（０．０３ｍＭの塩化カルシウムを含む１００ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０）の直線濃度勾配を付してＡバッファーを流し（Ａバッファー１００％から開始し、１００分間かけてＢバッファー濃度を５０％にまで増加させる直線濃度勾配、流速２ｍｌ／分）、Ｂバッファー濃度４％〜６％にて溶出された画分２０ｍｌを分取した。さらにこの分取した画分をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、０．０５Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ蛋白質を含む画分を回収した。
回収した画分に、２．０Ｍ硫酸アンモニウムを含む０．０５Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）を等体積添加して混合した後、ＲＥＳＯＵＲＳＥ　ＰＨＥ　１ｍｌカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に注入した。該カラムに１Ｍ硫酸アンモニウムを含む０．０５Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）５ｍｌを流した後、硫酸アンモニウム直線濃度勾配を付して０．０５Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）を流し（硫酸アンモニウム濃度勾配０．１Ｍ／分、塩化ナトリウム濃度範囲　１Ｍから０Ｍ、流速２ｍｌ／分）、硫酸アンモニウム濃度約０．４〜０．５Ｍ付近にて溶出された画分をそれぞれ分取した。各画分に含まれる蛋白質をＳＤＳ−１０％〜２０％ＰＡＧＥで分析した。
分取した画分を実施例２５（２）に記載の反応液における菌体粗抽出液の代わりに添加し、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩ）の存在下に、実施例２５（２）と同様に保温した。保温後の反応液をＴＬＣ分析し、^１４Ｃで標識された　化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットを確認した。上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約４５ｋＤａの位置に泳動された蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルから回収し、プロテインシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製Ｐｒｏｃｉｓｅ　４９４ＨＴ型、Ｐｕｌｓｅｄ　ｌｉｑｉｄ法で分析）によるＮ末端アミノ酸配列の解析に供した。その結果、配列番号１１３で示されるアミノ酸配列が読み取られた。
【０１４９】
実施例２６　本発明ＤＮＡ（Ａ４）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　　ＩＦＯ　１２７３５の染色体ＤＮＡの調製
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　　ＩＦＯ　１２７３５を５０ｍｌのＹＥＭＥ培地（酵母エキス　０．３％（ｗ／ｖ）、バクトペプトン　０．５％（ｗ／ｖ）、麦芽エキス　０．３％（ｗ／ｖ）、グルコース１．０％（ｗ／ｖ）、ショ糖３４％（ｗ／ｖ）、２．５Ｍ　ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ　０．２％（ｖ／ｖ））で１〜３日間、３０℃で振とう培養した後、集菌した。得られた菌体を、グリシン１．４％（ｗ／ｖ）、６０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む上記ＹＥＭＥ培地に懸濁し、さらに１日間振とう培養した。得られた培養液から菌体を集めて、蒸留水で１回洗浄した後に、菌体２００ｍｇ当り１ｍｌのバッファー（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），　１００ｍＭ　ＥＤＴＡ，　１０ｍＭ　ＮａＣｌ）に再懸濁し、２００μｇ／ｍｌ卵白リゾチームを添加し３０℃で１時間振とうした。さらに、０．５％ＳＤＳ、１ｍｇ／ｍｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋを加えて５５℃で３時間インキュベートした。この菌体懸濁液を、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールで２回抽出してそれぞれ水層を回収し、次いでクロロホルム・イソアミルアルコールで１回抽出して水層を回収し、該水層からエタノール沈殿によって染色体ＤＮＡを得た。
【０１５０】
（２）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　　ＩＦＯ　１２７３５の染色体ＤＮＡライブラリーの調製
実施例２６（１）で調製された染色体ＤＮＡ３８μｇを３．２Ｕの制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで３７℃で６０分間消化した。得られた消化液を、１％アガロースゲル電気泳動で分画して、約２．０ｋｂｐのＤＮＡをゲルから回収した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて当該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製し、さらにエタノール沈殿によって濃縮して、目的とするＤＮＡを含む溶液２０μｌを得た。得られたＤＮＡ溶液のうち８μｌと、制限酵素ＢａｍＨＩで消化され脱リン酸化処理されたプラスミドベクターｐＵＣ１１８　１００ｎｇとライゲーションキットＶｅｒ．２（宝酒造社製）のＩ液１６μｌとを混合し、１６℃で４時間保温した。このライゲーション液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、５０ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。得られたコロニーを寒天培地上から回収してプラスミドを抽出し、染色体ＤＮＡライブラリーとした。
【０１５１】
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ４）の単離
実施例２６（２）で調製された染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行った（図３）。プライマーとしては、配列番号１１４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号５７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせを用いた。ここで、配列番号１１４で示される塩基配列は、配列番号１１３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列に基づき設計した。反応液の調製にはエキスパンドハイファイＰＣＲシステム（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた。ＰＣＲ反応液は、上記染色体ＤＮＡライブラリーを２．５μｌ、上記の２種類のプライマーをそれぞれ７．５ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰミックス（それぞれ２ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を０．２μｌ、１０×バッファー（ＭｇＣｌ_２含有）を２．５μｌ、およびＥｘｐａｎｄ　ＨｉＦｉ酵素ミックスを０．３８μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を２５μｌにした。保温条件は、９７℃で２分間保温した後、９７℃で１５秒間次いで６５℃で３０秒間さらに７２℃で１分間の保温を１サイクルとしてこれを１０サイクル繰り返し、続いて、９７℃で１５秒間次いで６５℃で３０秒間さらに７２℃で１分間（７２℃での保温は１サイクル毎に２０秒間ずつ増加させる）の保温を１サイクルとしてこれを１５サイクル行い、さらに、７２℃で７分間保温した。保温後の反応液２．５μｌを鋳型溶液として、再度ＰＣＲを行った。プライマーとしては、配列番号１１５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号５７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせを用いた。ここで、配列番号１１５で示される塩基配列は、配列番号１１３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列に基づき設計した。そして上記の方法と同様にエキスパンドハイファイＰＣＲシステム（ベーリンガーマンハイム社製）を用いてＰＣＲを行った。反応後の反応液を２％のアガロースゲル電気泳動に供し、約８００ｂｐのＤＮＡを含むゲル部分を回収した。ゲルからＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡを、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に、該ベクターに付属の取扱説明書に従いライゲーションして、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’に導入した。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡＧＥＮ　Ｔｉｐ２０（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、配列番号６７で示される塩基配列を有するプライマーまたは配列番号６８で示される塩基配列を有するプライマーを用い、ビッグダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。反応物をＤＮＡシーケンサ３１００（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。その結果、配列番号１１０で示される塩基配列の塩基番号５７〜８３２に示される塩基配列が読み取られた。読み取られた塩基配列のうち、配列番号１１０で示される塩基配列の塩基番号５８〜６０には配列番号１１３で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２０で示されるアミノ酸がコードされていた。
【０１５２】
次に、実施例２６（２）で調製された染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、上記の条件でエキスパンドハイファイＰＣＲシステム（ベーリンガーマンハイム社製）によるＰＣＲを行った。プライマーとしては配列番号１１６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号５９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせを用いた。増幅された約１．４ｋｂｐのＤＮＡは、上記方法にてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクターにクローニングした。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡＧＥＮ　Ｔｉｐ２０（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、配列番号６７に示される配列を持つプライマーと配列番号６８に示される配列を持つプライマーを用い、ビッグダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。反応物をＤＮＡシーケンサ３１００（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。その結果、配列番号１１０で示される塩基配列の塩基番号１〜５８に示される塩基配列が読み取られた。
また、ユニバーサルゲノムウォーカーキット（クロンテック社製）を用い付属の取り扱い説明書に従い、配列番号１１０で示される塩基配列の塩基番号８３２で示される塩基より３’側下流に伸張する塩基配列を有するＤＮＡのクローニングを行った。具体的には、実施例２６（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　　ＩＦＯ　１２７３５の染色体ＤＮＡ１３μｇを、２００Ｕの制限酵素ＨｉｎｃＩＩを用いて３７℃で一晩消化し、フェノール抽出後、エタノール沈殿により精製した。得られたＤＮＡを２０μｌの水溶液とし、そのうちの４μｌと、１５μＭのＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒ　Ａｄａｐｔｏｒを１．９μｌ、１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒを１．６μｌ、および６Ｕ／μｌのＴ４　ｌｉｇａｓｅを０．５μｌを混合し、１６℃で一晩保温した。その後、７０℃で５分間保温して７２μｌの蒸留水を加えてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーとした。該ライブラリーを鋳型とし、Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＧＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＰＣＲ　ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリー１μｌ、プライマーＡＰ１（ユニバーサルゲノムウォーカーキットに付属）と配列番号１１７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをそれぞれ２００ｎＭとなるよう添加し、ｄＮＴＰミックス（それぞれ１０ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を１μｌ、５ｘＧＣゲノミックＰＣＲ反応バッファーを１０μｌ、２５ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）_２を２．２μｌ、５Ｍ　ＧＣ−Ｍｅｌｔを１０μｌおよびＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣゲノミックポリメラーゼミックスを１μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を５０μｌにした。保温条件は、９５℃で１分間保温し、９４℃で１０秒間次いで７２℃で３分間のサイクルを７サイクル、９４℃で１０秒間次いで６８℃で３分間のサイクルを３６サイクル、さらに６８℃で７分間保温した。保温後の溶液を蒸留水で５０倍希釈して一次ＰＣＲ産物とし、これを鋳型にさらにＰＣＲを行った。ＰＣＲは、一次ＰＣＲ産物１μｌ、プライマーＡＰ２（ユニバーサルゲノムウォーカーキットに付属）と配列番号１１８で示されるオリゴヌクレオチドをそれぞれ２００ｎＭとなるよう添加し、ｄＮＴＰミックス（それぞれ１０ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を１μｌ、５ｘＧＣゲノミックＰＣＲ反応バッファーを１０μｌ、２５ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）_２を２．２μｌ、５Ｍ　ＧＣ−Ｍｅｌｔを１０μｌおよびＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣゲノミックポリメラーゼミックスを１μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を５０μｌにした。保温条件は、９５℃で１分間保温し、９４℃で１０秒間次いで７２℃で３分間のサイクルを５サイクル、９４℃で１０秒間次いで６８℃で３分間のサイクルを２０サイクル、さらに６８℃で７分間保温した。保温後の反応液を１％のアガロースゲル電気泳動に供し、約１３００ｂｐのＤＮＡを含むゲル部分を回収した。回収されたゲルからＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡを、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に、該ベクターに付属の取扱説明書に従いライゲーションして、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’に導入した。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡＧＥＮ　Ｔｉｐ２０（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、配列番号６７に示されるオリゴヌクレオチドと配列番号６８に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ビッグダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。反応物をＤＮＡシーケンサ３１００（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。その結果、配列番号１１０で示される塩基配列の塩基番号６４４〜１４５４で示される塩基配列が読み取られた。解析した全ての塩基配列を連結させた結果、配列番号１１０で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２３６塩基（終止コドンを含む）からなり４１１アミノ酸残基（配列番号１０８）をコードする塩基配列（配列番号１０９）と、１９２塩基（終止コドンを含む）からなり６３アミノ酸残基（配列番号１１１）をコードする塩基配列（配列番号１１２）とが含まれた。配列番号１０９で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１０８）からなる蛋白質の分子量は、４５４６５Ｄａと計算された。また、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列には、本発明蛋白質（Ａ４）のＮ末端アミノ酸配列解析から決定されたアミノ酸配列（配列番号１１３）が含まれていた。配列番号１１２で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１１１）からなる蛋白質の分子量は６８７１Ｄａと計算された。
【０１５３】
実施例２７　本発明蛋白質（Ａ４）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ４）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例２６（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　　ＩＦＯ　１２７３５の染色体ＤＮＡを鋳型とし、エキスパンドハイファイＰＣＲシステム（ベーリンガーマンハイム社製）を使用してＰＣＲを行った。プライマーとしては、配列番号１１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合わせ（以下、プライマー対２５と記す。）、または、配列番号１１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合わせ（以下、プライマー対２６と記す。）を用いた。ＰＣＲ反応液には、２種類のプライマーをそれぞれ３００ｎＭとなるよう添加し、染色体ＤＮＡを５０ｎｇ、ｄＮＴＰミックス（それぞれ２．０ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を５．０μｌ、１０×Ｅｘｐａｎｄ　ＨＦバッファー（ＭｇＣｌ_２含有）を５．０μｌ、およびＥｘｐａｎｄ　ＨｉＦｉ酵素ミックスを０．７５μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を５０μｌとした。保温条件は、９７℃で２分間保温した後、９７℃で１５秒間次いで６０℃で３０秒間さらに７２℃で１分間の保温を１サイクルとしてこれを１０サイクル繰り返し、続いて、９７℃で１５秒間次いで６０℃で３０秒間さらに７２℃で１分間（７２℃での保温は１サイクル毎に２０秒間ずつ増加させる）の保温を１サイクルとしてこれを１５サイクル行い、さらに、７２℃で７分間保温した。保温後の反応液を１％アガロースゲル電気泳動に供し、プライマー対２５を用いた反応液を供したゲルからは約１．３ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出し、プライマー対２６を用いた反応液を供したゲルからは約１．６ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出した。回収されたそれぞれのゲルから、ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡとｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とを、該ベクター添付の取扱説明書に従ってライゲーションし、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’に導入した。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡＧＥＮ　Ｔｉｐ２０　（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、配列番号６７と配列番号６８と配列番号１２２と配列番号１２３に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ビッグダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。反応物をＤＮＡシーケンサ３１００（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号１０９で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ６４６とし、配列番号１１０で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ６４６Ｆとした。
次に、ｐＣＲ６４６およびｐＣＲ６４６Ｆをそれぞれ制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物をアガロースゲル電気泳動に供した。ｐＣＲ６４６の消化物を供したゲルからは約１．３ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出し、ｐＣＲ６４６Ｆの消化物を供したゲルからは約１．６ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出した。得られたゲルからそれぞれ、ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。このＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とを、ライゲーションキットＶｅｒ．１（宝酒造社製）を用い、該キット付属の取扱説明書に従いライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、その構造を解析した。配列番号１０９で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ４）をコードする上記の約１．３ｋｂｐのＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドをｐＫＳＮ６４６とした。また、配列番号１１０で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ４）をコードする上記の約１．６ｋｂｐのＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドをｐＫＳＮ６４６Ｆとした。これらプラスミドｐＫＳＮ６４６またはｐＫＳＮ６４６Ｆを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６４６またはＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６４６Ｆとした。また、プラスミドｐＫＳＮ２を大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２とした。
【０１５４】
（２）本発明蛋白質（Ａ４）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６４６、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６４６Ｆ、およびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＴＢ培地（トリプトン１．２％（ｗ／ｖ）、酵母エキス２．４％（ｗ／ｖ）、グリセロール０．４％（ｖ／ｖ）、リン酸二水素カリウム１７ｍＭ、リン酸水素二カリウム７２ｍＭ）で３７℃で一晩培養し、得られた培養液のうち１ｍｌを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＴＢ培地に植菌して２６℃で培養し、ＯＤ６６０が約０．５になったところで、最終濃度５００μＭになるよう５−アミノレブリン酸を添加し培養を継続する。その３０分後に最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加しさらに１７時間培養する。
各培養液から菌体を回収し、それぞれ０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄した後、１ｍＭ　ＰＭＳＦを含む前記バッファー１０ｍｌに懸濁する。この菌体懸濁液を超音波破砕機（ＳＯＮＩＦＩＥＲ（Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｓｏｎｉｃ　Ｐｏｗｅｒ　社登録商標））を用いてｏｕｔ　ｐｕｔ　３、ｄｕｔｙ　ｃｙｃｌｅ　３０％の条件で３分間ずつ６回超音波処理して菌体破砕液を得る。得られた破砕液を、遠心分離（１，２００×ｇ、５分間）した後、上清を回収してこれを遠心分離（１５０，０００×ｇ、７０分間）した後、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６４６から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６４６、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６４６Ｆから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６４６Ｆ、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を回収する。該上清画分のうち１μｌをＳＤＳ−１５％〜２５％ＰＡＧＥで分析し、ＣＢＢ染色する。その結果、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６４６や大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６４６Ｆにおいて、分子量約４５ｋＤａ程度に相当する泳動位置に、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２よりも顕著に濃いバンドを検出することによって、本発明蛋白質（Ａ４）が大腸菌内で発現したことの確認が可能である。
【０１５５】
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
^１４Ｃで標識された３ｐｐｍの化合物（ＩＩ）、２ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Ａ成分、オリエンタル酵母社製）、２ｍｇ／ｍｌのホウレンソウ由来のフェレドキシン（Ｂ成分、ＳＩＧＭＡ社製）、０．１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（Ｃ成分、ＳＩＧＭＡ社製）および実施例２７（２）で回収された上清画分１８μｌを含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温する。また、前記の反応液組成中のＡ成分、Ｂ成分およびＣ成分のうちの１以上の画分を添加しない反応液を調製し、同様に保温する。保温後の各反応液に、３．０μｌの２Ｎ塩酸および９０μｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、８，０００×ｇで遠心分離し７５μｌの酢酸エチル相を回収する。該酢酸エチル相を減圧下で乾固させた後、残渣を６．０μｌの酢酸エチルに溶解させその内５．０μｌをシリカゲルＴＬＣプレート（ＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ_２５４、２０ｃｍ×２０ｃｍ、０．２５ｍｍ厚、メルク社製）にスポットする。該ＴＬＣプレートを、クロロホルム−酢酸−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸：酢酸エチル＝６：１：２）を展開溶媒として約１時間展開した後、溶媒を蒸発させ、イメージングプレート（富士写真フィルム社製）に一晩露光する。次いで、イメージングプレートをイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム社製）で解析し、^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べる。Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６４６を含む反応液、あるいはＡ成分、Ｂ成分、Ｃ成分、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６４６Ｆを含む反応液で化合物（ＩＩＩ）の生成が確認できる。
【０１５６】
実施例２８　本発明蛋白質に関する配列同一性
ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ　Ｖｅｒ．５（ソフトウェア開発株式会社製）」を用い、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法［Ｌｉｐｍａｎ，　Ｄ．　Ｊ．　ａｎｄ　Ｐｅａｒｓｏｎ，　Ｗ．Ｒ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２２７，　１４３５−１４４１，（１９８５）］により相同性解析を行ってアラインメントを作成することにより、本発明の蛋白質および本発明のＤＮＡに関する配列同一性を解析した。
本発明蛋白質（Ａ１）〜（Ａ４）のアミノ酸配列について、相互の配列同一性および最も相同性の高い公知の蛋白質との配列同一性を求めた。結果を表１５に示す。
【０１５７】
【表１５】

＊：配列同一性の値を上段に示し、当該蛋白質のＥｎｔｒｅｚデータベース（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ提供、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／）におけるＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号を下段に示す。
【０１５８】
配列番号６で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ａ１）、配列番号７で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ａ２）、配列番号８で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ａ３）、および配列番号１０９で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ａ４）の塩基配列について、相互の配列同一性および最も相同性の高い公知の遺伝子との配列同一性を求めた。結果を表１６に示す。
【表１６】

＊：配列同一性の値を上段に示し、当該遺伝子のＥｎｔｒｅｚデータベース（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ提供、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／）におけるＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号を下段に示す。
【０１５９】
本発明蛋白質（Ｂ１）〜（Ｂ４）のアミノ酸配列について、相互の配列同一性および最も相同性の高い公知の蛋白質との配列同一性を求めた。結果を表１７に示す。
【表１７】

＊：配列同一性の値を上段に示し、当該蛋白質のＥｎｔｒｅｚデータベース（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ提供、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／）におけるＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号を下段に示す。
【０１６０】
配列番号１５で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ｂ１）、配列番号１６で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ｂ２）、配列番号１７で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ｂ３）、および配列番号１１２で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ｂ４）の塩基配列について、相互の配列同一性および最も相同性の高い公知の遺伝子との配列同一性を求めた。結果を表１８に示す。
【表１８】

＊：配列同一性の値を上段に示し、当該遺伝子のＥｎｔｒｅｚデータベース（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ提供、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／）におけるＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号を下段に示す。
【０１６１】
実施例２９　本発明ＤＮＡ（Ａ）の部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ
実施例２で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２８９８の染色体ＤＮＡ、実施例５で調製されたＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔの染色体ＤＮＡ、実施例９で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ　ＡＴＣＣ　１１７９６の染色体ＤＮＡ、実施例１１で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ　２１４６９の染色体ＤＮＡ、実施例２６で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２７３５の染色体ＤＮＡ、ならびに実施例２と同様の方法で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ　ＩＦＯ　１２８７０ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ　ＩＦＯ　１４２７３ｔ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ　ＩＦＯ　１３４４５のそれぞれの染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。プライマーとしては、表１９に示す５組のプライマー対を用いた。配列番号６に示される塩基配列に基づいてそれぞれのプライマー対を用いたＰＣＲで増幅されると予想されるＤＮＡの大きさを表１９に示した。
【０１６２】
【表１９】

【０１６３】
ＰＣＲ反応液には、表１９に示した組合わせの２種類のプライマーをそれぞれ２００ｎＭとなるよう添加し、染色体ＤＮＡを１０ｎｇ、ｄＮＴＰミックス（それぞれ１０ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を０．５μｌ、５ｘＧＣゲノミックＰＣＲ反応バッファーを５μｌ、２５ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）_２を１．１μｌ、５Ｍ　ＧＣ−Ｍｅｌｔを５μｌおよびＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣゲノミックポリメラーゼミックス（クロンテック社製）を０．５μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を２５μｌにした。保温条件は９５℃で１分間保温し、９４℃で１５秒間次いで６０℃で３０秒間次いで７２℃で１分間のサイクルを３０サイクル繰り返し、さらに７２℃で５分間保温した。保温後の反応液をそれぞれ３％のアガロースゲル電気泳動にて解析した。結果を図４６並びに表２０および表２１に示す。いずれの菌株から調製した染色体ＤＮＡを鋳型に用いた場合にでも、プライマー対１４、１５、１６，１７、１８のいずれかあるいは全ての場合において、予測された大きさのＤＮＡの増幅が観察された。
【０１６４】
【表２０】

（＊；＋は予測される大きさのＤＮＡが検出されたことを示し、−は検出されなかったことを示す。）
【０１６５】
【表２１】

（＊；＋は予測される大きさのＤＮＡが検出されたことを示し、−は検出されなかったことを示す。）
【０１６６】
実施例３０　本発明ＤＮＡ（Ａ）または本発明ＤＮＡ（Ａ）の部分塩基配列からなるＤＮＡをプローブとしたハイブリダイゼーション
（１）プローブの作製
本発明ＤＮＡ（Ａ１）または本発明ＤＮＡ（Ａ１）の部分塩基配列からなるＤＮＡをジゴシキゲニンで標識したプローブ（ＤＩＧ標識プローブ）を作製した。実施例３で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８の染色体ＤＮＡを鋳型として用い、配列番号９３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号９４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲ　ＤＩＧ　Ｐｒｏｂｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＧｍｂＨ製）を用いて添付のマニュアルに従ってＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液には、上記の２種類のプライマーをそれぞれ２００ｎＭとなるよう添加し、染色体ＤＮＡを５０ｎｇ、ｄＮＴＰ　ｓｔｏｃｋ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（それぞれ２．０ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を２．５μｌ、ＰＣＲ　ＤＩＧ　ｍｉｘ（それぞれ２．０ｍＭの４種類のＤＩＧ標識ｄＮＴＰの混合物）を２．５μｌ、１０ｘＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒを５μｌ、およびＥｘｐａｎｄ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ製）を０．７５μｌを添加し、さらに蒸留水を添加して全量を５０μｌにした。保温条件は、９５℃で２分間保温した後、９５℃で１０秒間、次いで６０℃で３０秒間、次いで７２℃で２分間の保温を１サイクルとしてこれを１０サイクル行い、さらに、９５℃で１０秒間、次いで６０℃で３０秒間、次いで７２℃で２分間（７２℃での保温は１サイクル毎に２０秒間ずつ増加させる）の保温を１サイクルとしてこれを１５サイクル行い、さらに７２℃で７分間保温した。保温後の反応液を１％アガロース電気泳動に供した。その結果、約１．３ｋｂのＤＮＡの増幅が確認された。この増幅されたＤＮＡを回収し、配列番号６で示される塩基配列を有しジゴシキゲニンで標識されたＤＮＡを得た。同様の方法で、実施例３で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８の染色体ＤＮＡを鋳型として用い、配列番号１３０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１３１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。該ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを回収し、配列番号６で示される塩基配列の塩基番号５７〜７３０で示される塩基配列を有しジゴシキゲニンで標識されたＤＮＡを得た。
同様の方法で、実施例６で調製されたＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ９３８３ｔの染色体ＤＮＡを鋳型として用い、配列番号６１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号６２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。該ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを回収し、配列番号７で示される塩基配列を有しジゴシキゲニンで標識されたＤＮＡを得た。
さらに同様の方法で、実施例１１で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９の染色体ＤＮＡを鋳型として用い、配列番号７０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号７１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。該ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを回収し、配列番号８で示される塩基配列を有しジゴシキゲニンで標識されたＤＮＡを得た。また、上記染色体ＤＮＡを鋳型として用い、配列番号１３２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１３３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。該ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを回収し、配列番号８で示される塩基配列の塩基番号２１〜６９１で示される塩基配列を有しジゴシキゲニンで標識されたＤＮＡを得た。
【０１６７】
（２）ドットブロットハイブリダイゼーション
実施例４で作製されたｐＫＳＮ６５７のＤＮＡ（本発明ＤＮＡ（Ａ１）を含むＤＮＡ）、実施例７で作製されたｐＫＳＮ９２３のＤＮＡ（本発明ＤＮＡ（Ａ２）を含むＤＮＡ）、実施例１２で作製されたｐＫＳＮ６７１のＤＮＡ（本発明ＤＮＡ（Ａ３）を含むＤＮＡ）、実施例１４で作製されたｐＫＳＮＳＣＡのＤＮＡ（本ＤＮＡ（Ａ９）を含むＤＮＡ）、および実施例１０で作製されたｐＫＳＮ１１７９６のＤＮＡ（本ＤＮＡ（Ａ１０）を含むＤＮＡ）を、それぞれ１００ｎｇ及び１０ｎｇ相当量ずつナイロンメンブレンＨｙｂｏｎｄ　Ｎ＋（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ製）にブロットした。得られたメンブレンにトランスイルミネーターで５分間紫外線を照射した。
ハイブリダイゼーションと検出はＤＩＧ−Ｈｉｇｈ　Ｐｒｉｍｅ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｔａｒｔｅｒ　Ｋｉｔ　ＩＩ（Ｒｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＧｍｂＨ製）を用いて添付のマニュアルに従って行った。プローブとしては、実施例３０（１）で作製されたジゴシキゲニンで標識されたＤＮＡをそれぞれ、１００℃で５分間保温した後、氷上で急冷して用いた（以下、ＤＩＧ標識プローブと記す。）。上記のＤＮＡがブロットされたナイロンメンブレンを、上記キット添付の２．０ｍｌのＤＩＧ　Ｅａｓｙ　Ｈｙｂ中で４２℃にて３０分間振とうした。次いで、２．０ｍｌのＤＩＧ　Ｅａｓｙ　Ｈｙｂ、５．０μｌのＤＩＧ標識プローブ及び上記メンブレンをハイブリバック中に封入し４２℃で１８時間保温した。メンブレンを取り出し、０．１％　ＳＤＳを含む２ＸＳＳＣ中で室温にて５分間の振とうを液を２回行い、次いで０．１％　ＳＤＳ　を含む０．５ＸＳＳＣ中で６５℃にて１５分間の振とうを２回行った。続いてメンブレンを５０ｍｌのＷａｓｈｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ中で２分間振とうし、次いで５０ｍｌのＢｌｏｃｋｉｎｇ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ中で室温にて３０分間振とうし、さらに２．０ｍｌのＡｎｔｉｂｏｄｙ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ中で３０分間振とうした後、５０ｍｌのＷａｓｈｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ中で１５分間の振とうを２回行った。さらに、メンブレンを５０ｍｌのＤｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ中で５分間振とうした後、２．０ｍｌのＣｏｌｏｒ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎとともにハイブリバックに封入し１８時間室温で保温した。いずれのＤＩＧ標識プローブでハイブリダイゼーションを行った場合でも、ｐＫＳＮ６５７、ｐＫＳＮ９２３、ｐＫＳＮ６７１、ｐＫＳＮＳＣＡおよびｐＫＳＮ１１７９６のそれぞれ１００ｎｇ及び１０ｎｇのいずれの試料についてもシグナルが検出された。
【０１６８】
実施例３１　本発明ＤＮＡ（Ａ１１）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｏｒ　ＩＦＯ１３４４５染色体ＤＮＡの調製
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｏｒ　ＩＦＯ１３４４５を５０ｍｌのＴＧＹ培地（酵母エキス　０．５％（ｗ／ｖ）、トリプトン　０．５％（ｗ／ｖ）、グルコース　０．１％（ｗ／ｖ）、Ｋ_２ＨＰＯ_４　０．１％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．０）で３日間、３０℃で振とう培養した後、集菌した。得られた菌体を、グリシン１．４％（ｗ／ｖ）、６０ｍＭ　ＥＤＴＡを添加したＴＧＹ培地に懸濁し、さらに１日間振とう培養した。得られた培養液から菌体を集めて、蒸留水で１回洗浄した後、３．５ｍｌのバッファーＢ１（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ８．０），　５０ｍＭ　ＥＤＴＡ，　０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０，　０．５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）に懸濁した。得られた懸濁液に８０μｌの１００ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液と１００μｌのＱＩＡＧＥＮ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ（６００ｍＡＵ／ｍｌ、キアゲン社製）を添加して、３７℃で１時間保温した。次に１．２ｍｌのバッファーＢ２（３Ｍ　ｇｕａｎｉｄｉｎｅ　ＨＣｌ，　２０％　Ｔｗｅｅｎ−２０）を添加して混合し５０℃で３０分間保温した。得られた溶菌液をバッファーＱＢＴ（７５０ｍＭ　ＮａＣｌ，　５０ｍＭ　ＭＯＰＳ　（ｐＨ７．０），　１５％イソプロパノール，　０．１５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）で平衡化したキアゲンゲノミックチップ１００Ｇ（キアゲン社製）に添加した。次いで、このチップを７．５ｍｌのバッファーＱＣ［５０ｍＭ　ＭＯＰＳ　（ｐＨ７．０），　１５％イソプロパノール］で２回洗浄した後、５ｍｌのバッファーＱＦ［１．２５Ｍ　ＮａＣｌ，　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ８．５），　１５％イソプロパノール］を流してＤＮＡを溶出させた。得られたＤＮＡ溶液に３．５ｍｌのイソプロパノールを混合し、染色体ＤＮＡを沈殿させて回収した。回収された染色体ＤＮＡを７０％エタノールで洗浄した後、１ｍｌのＴＢバッファーに溶解させた。
【０１６９】
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ１１）の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例３１（１）で調製された染色体ＤＮＡを鋳型としプライマー対１４を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡを、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に、該ベクターに付属の取扱説明書に従いライゲーションした後、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’に導入した。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡＧＥＮ　Ｔｉｐ２０（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、配列番号５７で示される塩基配列を有するプライマーまたは配列番号５９で示される塩基配列を有するプライマーを用い、ビッグダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。反応物をＤＮＡシーケンサ３１００（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。その結果、配列番号１３９で示される塩基配列の塩基番号３１６〜１０４８で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例３１（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法に準じてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号１６１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１［ユニバーサルゲノムウォーカーキット（クロンテック社製）に付属］とを用いて実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、１次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１６２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２［ユニバーサルゲノムウォーカーキット（クロンテック社製）に付属］とを用いて実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号１４４で示される塩基配列の塩基番号１〜３３０で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例３１（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｃＩＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。、得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号１６３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、１次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１６４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号１４４で示される塩基配列の塩基番号９８３〜１４４９で示される塩基配列が読み取られた。
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ１１）　の塩基配列解析
実施例３１（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号１４４で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２３０塩基（終止コドンを含む）からなり４０９アミノ酸残基（配列番号１５９）をコードする塩基配列（配列番号１３９）と、２０７塩基（終止コドンを含む）からなり６８アミノ酸残基（配列番号１４９）をコードする塩基配列（配列番号１５４）とが含まれた。配列番号１３９で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１５９）からなる蛋白質の分子量は、４５１７７Ｄａと計算された。また、配列番号１５４で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１４９）からなる蛋白質の分子量は７１４７Ｄａと計算された。
【０１７０】
実施例３２　本発明蛋白質（Ａ１１）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ１１）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例３１（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｏｒ　ＩＦＯ　１３４４５の染色体ＤＮＡを鋳型とし、エキスパンドハイファイＰＣＲシステム（ベーリンガーマンハイム社製）を使用してＰＣＲを行った。プライマーとしては、配列番号１６５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１６６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合わせを用いた。ＰＣＲの反応液組成および保温は実施例２７（１）に記載の条件と同じとした。保温後の反応液を１％アガロースゲル電気泳動に供し、約１．５ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出した。回収されたゲルから、ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡとｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とを、該ベクター添付の取扱説明書に従ってライゲーションした後、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’に導入した。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡＧＥＮ　Ｔｉｐ２０　（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、配列番号５７、５９、１８６に示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ビッグダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。反応物をＤＮＡシーケンサ３１００（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号１４４で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ８４９ＡＦとした。
次に、ｐＣＲ８４９ＡＦを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物をアガロースゲル電気泳動に供し、約１．５ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出した。得られたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。このＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とを、ライゲーションキットＶｅｒ．２（宝酒造社製）を用い、該キット付属の取扱説明書に従いライゲーションした後、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、その構造を解析した。配列番号１４４で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ１１）をコードする上記の約１．５ｋｂｐのＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドをｐＫＳＮ８４９ＡＦとした。このプラスミドｐＫＳＮ８４９ＡＦを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ８４９ＡＦとした。また、プラスミドｐＫＳＮ２を大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２とした。
【０１７１】
（２）本発明蛋白質（Ａ１１）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ８４９ＡＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ８４９ＡＦから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ８４９ＡＦ、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
^１４Ｃで標識された３ｐｐｍの化合物（ＩＩ）、２ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Ａ成分、オリエンタル酵母社製）、２ｍｇ／ｍｌのホウレンソウ由来のフェレドキシン（Ｂ成分、ＳＩＧＭＡ社製）、０．１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（Ｃ成分、ＳＩＧＭＡ社製）および実施例３２（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ８４９ＡＦまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）２３μｌを含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。実施例４（３）と同様にして、保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ８４９ＡＦを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
【０１７２】
実施例３３　本発明ＤＮＡ（Ａ１２）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３７８２染色体ＤＮＡの調製
実施例３１（１）に記載の方法にて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３７８２の染色体ＤＮＡを調製した。
【０１７３】
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ１２）の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例３３（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３７８２の染色体ＤＮＡを鋳型としプライマー対１４を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。実施例３１（２）と同様にして、増幅されたＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした後、その塩基配列を解析した。その結果、配列番号１４０で示される塩基配列の塩基番号３６４〜１０９６で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例３３（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号１６７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１と用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、１次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１６８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号１４５で示される塩基配列の塩基番号１〜３９２で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例３３（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。、得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号１６９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、１次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１７０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号１４５で示される塩基配列の塩基番号１０４８〜１４８０で示される塩基配列が読み取られた。
【０１７４】
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ１２）　の塩基配列解析
実施例３３（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号１４５で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２７８塩基（終止コドンを含む）からなり４２５アミノ酸残基（配列番号１６０）をコードする塩基配列（配列番号１４０）と、１９８塩基（終止コドンを含む）からなり６５アミノ酸残基（配列番号１５０）をコードする塩基配列（配列番号１５５）とが含まれた。配列番号１４０で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１６０）からなる蛋白質の分子量は、４６５４９Ｄａと計算された。配列番号１５５で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１５０）からなる蛋白質の分子量は６５１０Ｄａと計算された。
【０１７５】
実施例３４　本発明ＤＮＡ（Ａ１２）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ１２）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例３３（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３７８２染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１７１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１７２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いる以外は実施例３２（１）と同様にして、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲの反応液から、実施例３２（１）と同様にして、ＤＮＡを精製しｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、配列番号５７、５９、１７１、１７２、１８７で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号１４５で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ１６１８Ｆとした。実施例３２（１）と同様にして、ｐＣＲ１６１８Ｆを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物から約１．５ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号１４５で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ１２）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ１６１８Ｆと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６１８Ｆとした。
【０１７６】
（２）本発明蛋白質（Ａ１２）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６１８ＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６１８Ｆから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６１８Ｆ、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
実施例３４（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６１８Ｆまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）を用いる以外は実施例３２（３）と同様にして反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６１８Ｆを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
【０１７７】
実施例３５　本発明ＤＮＡ（Ａ１３）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｓ　ＩＦＯ　１４２７３ｔ染色体ＤＮＡの調製
実施例３１（１）に記載の方法にて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｓ　ＩＦＯ　１４２７３ｔの染色体ＤＮＡを調製した。
【０１７８】
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ１３）　の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例３５（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｓ　ＩＦＯ　１４２７３ｔの染色体ＤＮＡを鋳型としプライマー対１４を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。実施例３１（２）と同様にして、増幅されたＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした後、その塩基配列を解析した。その結果、配列番号１４１で示される塩基配列の塩基番号２９５〜１０２７で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例３５（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｃＩＩした。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号１７３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１と用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、１次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１７４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。その結果、配列番号１４６で示される塩基配列の塩基番号１〜３７０で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例３５（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号１７５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、１次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１７６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。その結果、配列番号１４６で示される塩基配列の塩基番号９６０〜１４７３で示される塩基配列が読み取られた。
【０１７９】
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ１３）　の塩基配列解析
実施例３５（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号１４６で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２０９塩基（終止コドンを含む）からなり４０２アミノ酸残基（配列番号１３６）をコードする塩基配列（配列番号１４１）と、２５２塩基（終止コドンを含む）からなり８３アミノ酸残基（配列番号１５１）をコードする塩基配列（配列番号１５６）とが含まれた。配列番号１４１で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１３６）からなる蛋白質の分子量は、４４６２９Ｄａと計算された。配列番号１５６で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１５１）からなる蛋白質の分子量は８６３５Ｄａと計算された。
【０１８０】
実施例３６　本発明ＤＮＡ（Ａ１３）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ１３）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例３５（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｓ　ＩＦＯ　１４２７３ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１７７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１７８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いる以外は実施例３２（１）と同様にして、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲの反応液から、実施例３２（１）と同様にして、ＤＮＡを精製しｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、配列番号５７、５９、１７３、１７５、１８８で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号１４６で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ４７４Ｆとした。実施例３２（１）と同様にして、ｐＣＲ４７４Ｆを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物から約１．５ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号１４６で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ１３）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ４７４Ｆと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ４７４Ｆとした。
【０１８１】
（２）本発明蛋白質（Ａ１３）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ４７４ＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ４７４Ｆから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ４７４Ｆ、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
実施例３６（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ４７４Ｆまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）を用いる以外は実施例３２（３）と同様にして反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ４７４Ｆを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
【０１８２】
実施例３７　本発明ＤＮＡ（Ａ１４）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１３６７３ｔ染色体ＤＮＡの調製
実施例３１（１）に記載の方法にて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１３６７３ｔの染色体ＤＮＡを調製した。
【０１８３】
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ１４）　の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例３７（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１３６７３ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマー対１４を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。実施例３１（２）と同様にして、増幅されたＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした後、その塩基配列を解析した。その結果、配列番号１４２で示される塩基配列の塩基番号３１６〜１０４８で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例３７（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号１７９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、１次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１８０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号１４７で示される塩基配列の塩基番号１〜３３０で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例３７（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｃＩＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号１８１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、１次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１８２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号１４７で示される塩基配列の塩基番号９８２〜１４４９で示される塩基配列が読み取られた。
【０１８４】
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ１４）　の塩基配列解析
実施例３７（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号１４７で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２３０塩基（終止コドンを含む）からなり４０９アミノ酸残基（配列番号１３７）をコードする塩基配列（配列番号１４２）と、２０７塩基（終止コドンを含む）からなり６８アミノ酸残基（配列番号１５２）をコードする塩基配列（配列番号１５７）とが含まれた。配列番号１４２で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１３７）からなる蛋白質の分子量は、４５０８９Ｄａと計算された。配列番号１５７で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１５２）からなる蛋白質の分子量は７１７４Ｄａと計算された。
【０１８５】
実施例３８　本発明ＤＮＡ（Ａ１４）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ１４）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例３７（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１３６７３ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１８３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１８４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いる以外は実施例３２（１）と同様にして、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲの反応液から、実施例３２（１）と同様にして、ＤＮＡを精製しｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、配列番号５７、５９、１８９で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号１４７で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ１４９１ＡＦとした。実施例３２（１）と同様にして、ｐＣＲ１４９１ＡＦを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物から約１．５ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号１４７で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ１４）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ１４９１ＡＦと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１４９１ＡＦとした。
【０１８６】
（２）本発明蛋白質（Ａ１４）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１４９１ＡＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１４９１ＡＦから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１４９１ＡＦ、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
【０１８７】
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
実施例３８（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１４９１ＡＦまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）を用いる以外は実施例３２（３）と同様にして反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１４９１ＡＦを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
【０１８８】
実施例３９　本発明ＤＮＡ（Ａ１５）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２４４４染色体ＤＮＡの調製
実施例３１（１）に記載の方法にて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２４４４の染色体ＤＮＡを調製した。
【０１８９】
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ１５）　の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例３９（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２４４４の染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマー対１４を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。実施例３１（２）と同様にして、増幅されたＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした後、その塩基配列を解析した。その結果、配列番号１４３で示される塩基配列の塩基番号３１６〜１０４８で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例３９（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたＤＮＡを鋳型とし、配列番号１７９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、１次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１８０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号１４８で示される塩基配列の塩基番号１〜３３０で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例３９（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号１８１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、１次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１８２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号１４８で示される塩基配列の塩基番号９８２〜１４４９で示される塩基配列が読み取られた。
【０１９０】
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ１５）　の塩基配列解析
実施例３９（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号１４８で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２３０塩基（終止コドンを含む）からなり４０９アミノ酸残基（配列番号１３８）をコードする塩基配列（配列番号１４３）と、２０７塩基（終止コドンを含む）からなり６８アミノ酸残基（配列番号１５３）をコードする塩基配列（配列番号１５８）とが含まれた。配列番号１４３で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１３８）からなる蛋白質の分子量は、４５１１６Ｄａと計算された。配列番号１５８で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１５３）からなる蛋白質の分子量は７１７９Ｄａと計算された。
【０１９１】
実施例４０　本発明ＤＮＡ（Ａ１５）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ１５）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例３９（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２４４４の染色体ＤＮＡを用い、配列番号１８５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１８４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いる以外は実施例３２（１）と同様にして、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲの反応液から、実施例３２（１）と同様にして、ＤＮＡを精製しｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、配列番号５７、５９、１８９で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号１４８で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ１５５５ＡＦとした。実施例３２（１）と同様にして、ｐＣＲ１５５５ＡＦを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物から約１．５ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号１４８で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ１５）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ１５５５ＡＦと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５５５ＡＦとした。
【０１９２】
（２）本発明蛋白質（Ａ１５）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５５５ＡＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５５５ＡＦから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５５５ＡＦ、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
【０１９３】
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
実施例４０（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５５５ＡＦまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）を用いる以外は実施例３２（３）と同様にして反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５５５ＡＦを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
【０１９４】
実施例４１　本発明蛋白質（Ａ１）による化合物の代謝
（１）プラスチド画分の調製
葉ダイコン種子１００ｇ（タキイ種苗社製）をバット中の湿らせた紙ウェス上に播種し、２５℃にて、暗黒下で６日間栽培した後、蛍光灯下で４時間栽培した。緑化した子葉３０ｇを磨砕バッファー［１ｍＭ　塩化マグネシウム、２０ｍＭ　Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸、１０ｍＭ　Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペリジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　システイン、０．５Ｍ　ショ糖；ｐＨ７．７］中にて、Ｎｉｓｓｅｉ　ＡＭ−８　ＨＯＭＯＧＥＮＩＺＥＲ（日本精機製作所製）で磨砕（１８，０００〜２０，０００ｒｐｍ、４℃、５秒間）した。得られた磨砕液を４層のナイロンガーゼでろ過し、得られたろ液を遠心分離（１３，１７０×ｇ、４℃、１分間）した。得られた沈殿画分を６０ｍｌの磨砕バッファーに懸濁し、遠心分離（２，６４０×ｇ、４℃、２分間）した。沈殿画分を再び１０ｍｌの磨砕バッファーに懸濁し、遠心管に入れた２０ｍｌの高密度バッファー［１ｍＭ　塩化マグネシウム、２０ｍＭ　Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸、３０ｍＭ　Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペリジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　システイン、０．６Ｍ　ショ糖；ｐＨ７．７］に重層した。遠心分離（６７５×ｇ、４℃、１５分間）し、沈殿を３ｍｌの懸濁バッファー［１ｍＭ　塩化マグネシウム、２０ｍＭ　Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸、３０ｍＭ　Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペリジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ；ｐＨ７．７］に懸濁し、プラスチド画分とした。
【０１９５】
（２）本発明蛋白質（Ａ１）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
５ｐｐｍの化合物（ＸＩＩ）、３ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Ａ成分、オリエンタル酵母社製）、１ｍｇ／ｍｌホウレンソウ由来のフェレドキシン（Ｂ成分、ＳＩＧＭＡ社製）、０．１５Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（Ｃ成分、ＳＩＧＭＡ社製）および実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液１００μｌを調製し３０℃で１０分間保温した。また、前記の反応液組成中のＡ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４（２）で回収された上清画分を含まない５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液１００μｌを調製し、同様に保温した。保温後の各反応液に１０μｌの２Ｎ塩酸および５００μｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、８０００×ｇで遠心分離し４９０μｌの酢酸エチル層を回収した。該酢酸エチル層を減圧下で乾固させた後、残渣を１００μｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１）と記す。］のうち４０μｌをＨＰＬＣで分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１）では検出されないピークが検出された。該ピークに含まれる化合物の質量分析を行った。該ピークに含まれる化合物の質量は、化合物（ＸＩＩ）の質量に比べて１４小さかった。
【０１９６】
上記（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）の３２倍希釈液２０μｌおよび実施例４１（１）で調製されたプラスチド画分６０μｌを混合し、暗条件下、２０μｌの基質溶液（１０ｍＭ　アデノシン三リン酸、５ｍＭ　アミノレブリン酸、４ｍＭ　還元型グルタチオン、０．６ｍＭ　ＮＡＤ^＋；ｐＨ６．５）（以下、該基質溶液を、ＰＰＯ基質溶液と記す。）を添加して３０℃で１．５時間保温した。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）の３２倍希釈液２０μｌに替えて（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１）の３２倍希釈液２０μｌを添加した反応液を調製し、同様にＰＰＯ基質溶液を添加して保温した。保温後の各反応液に３００μｌのジメチルスルホキシド−メタノール混合液（ジメチルスルホキシド：メタノール＝７：３）を加え、遠心分離（８０００×ｇ、４℃、１０分間）した。上清を回収し、以下の分析条件２にて逆相ＨＰＬＣ分析に供して、ＰＰＩＸ量を測定した。（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）が添加された反応液におけるＰＰＩＸ量は、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１）が添加された反応液におけるＰＰＩＸ量よりも多かった。
【０１９７】
（ＨＰＬＣ分析条件２）
カラム：スミパックスＯＤＳ２１２（住化分析センター製）
流速：２ｍｌ／分
検出波長：蛍光　Ｅｘ＝４１０ｎｍ　Ｅｍ＝６３０ｎｍ
溶出液：メタノール−１Ｍ　酢酸アンモニウム（ｐＨ５．７）混合液（メタノール：１Ｍ　酢酸アンモニウム＝９５：５）
【０１９８】
（３）本発明蛋白質（Ａ１）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
５ｐｐｍの化合物（ＸＩＩ）の代わりに５ｐｐｍの化合物（ＸＩＩＩ）を使用する以外は実施例４１（２）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌのジメチルスルホキシドに溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１）では検出されないピークが検出された。該ピークに含まれる化合物の質量分析を行った。該ピークに含まれる化合物の質量は、化合物（ＸＩＩＩ）の質量に比べて１４小さかった。
【０１９９】
上記（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）の１２８倍希釈液２０μｌおよびプラスチド画分６０μｌを混合し、暗条件下、２０μｌのＰＰＯ基質溶液を添加して３０℃で１．５時間保温した。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）の１２８倍希釈液２０μｌに替えて（ＸＩＩＩ）コントロール（Ａ１）の１２８倍希釈液２０μｌを添加した反応液を調製し、同様にＰＰＯ基質溶液を添加して保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様に処理して上記分析条件２にて逆相ＨＰＬＣ分析に供し、ＰＰＩＸ量を測定した。（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）が添加された反応液におけるＰＰＩＸ量は、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１）が添加された反応液におけるＰＰＩＸ量よりも多かった。
【０２００】
（４）本発明蛋白質（Ａ１）による化合物（ＸＶＩ）の代謝
５ｐｐｍの化合物（ＸＩＩ）の代わりに１２．５ｐｐｍの化合物（ＸＶＩ）を使用する以外は実施例４１（２）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を２００μｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＶＩ）　代謝液（Ａ１）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＶＩ）コントロール液（Ａ１）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＶＩ）コントロール液（Ａ１）から検出された化合物（ＸＶＩ）の濃度と比較して、（ＸＶＩ）代謝液（Ａ１）から検出された化合物（ＸＶＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＶＩ）代謝液（Ａ１）から、（ＸＶＩ）コントロール液（Ａ１）では検出されないピークが検出された。
【０２０１】
上記（ＸＶＩ）代謝液（Ａ１）の８倍希釈液２０μｌおよびプラスチド画分６０μｌを混合し、暗条件下、２０μｌのＰＰＯ基質溶液を添加して３０℃で１．５時間保温した。また、（ＸＶＩ）代謝液（Ａ１）の８倍希釈液２０μｌに替えて（ＸＶＩ）コントロール（Ａ１）の８倍希釈液２０μｌを添加した反応液を調製し、同様にＰＰＯ基質溶液を添加して保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様に処理して上記分析条件２にて逆相ＨＰＬＣ分析に供し、ＰＰＩＸ量を測定した。（ＸＶＩ）代謝液（Ａ１）が添加された反応液におけるＰＰＩＸ量は、（ＸＶＩ）コントロール液（Ａ１）が添加された反応液におけるＰＰＩＸ量よりも多かった。
【０２０２】
（５）本発明蛋白質（Ａ１）による化合物（ＸＶＩＩ）の代謝
５ｐｐｍの化合物（ＸＩＩ）の代わりに１２．５ｐｐｍの化合物（ＸＶＩＩ）を使用する以外は実施例４１（２）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を２００μｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＶＩＩ）　代謝液（Ａ１）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＶＩＩ）コントロール液（Ａ１）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＶＩＩ）コントロール液（Ａ１）から検出された化合物（ＸＶＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＶＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された化合物（ＸＶＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＶＩＩ）代謝液（Ａ１）から、（ＸＶＩＩ）コントロール液（Ａ１）では検出されないピークが検出された。
【０２０３】
上記（ＸＶＩＩ）代謝液（Ａ１）の３２倍希釈液２０μｌおよびプラスチド画分６０μｌを混合し、暗条件下、２０μｌのＰＰＯ基質溶液を添加して３０℃で１．５時間保温した。また、（ＸＶＩＩ）代謝液（Ａ１）の３２倍希釈液２０μｌに替えて（ＸＶＩＩ）コントロール（Ａ１）の３２倍希釈液２０μｌを添加した反応液を調製し、同様にＰＰＯ基質溶液を添加して保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様に処理して上記分析条件２にて逆相ＨＰＬＣ分析に供し、ＰＰＩＸ量を測定した。（ＸＶＩＩ）代謝液（Ａ１）が添加された反応液におけるＰＰＩＸ量は、（ＸＶＩＩ）コントロール液（Ａ１）が添加された反応液におけるＰＰＩＸ量よりも多かった。
【０２０４】
（６）本発明蛋白質（Ａ１）による化合物（ＶＩ）の代謝
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７Ｆを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌのＴＢ培地で３７℃にて一晩培養した。得られた培養液のうち１ｍｌを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＴＢ培地に植菌して２６℃で培養し、ＯＤ６６０が約０．５になったところで、最終濃度５００μＭになるよう５−アミノレブリン酸を添加し培養を継続した。その３０分後に最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加しさらに２０時間培養した。
培養液から菌体を回収し、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄した後、１％グルコースを含む０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー１０ｍｌに懸濁した。得られた菌体懸濁液に終濃度１００ｐｐｍとなるように化合物（ＶＩ）を添加し３０℃で振とう培養した。振とう開始０時間後、１日後に菌体懸濁液２ｍｌを分取してそれぞれに５０μｌの２Ｎ塩酸を添加し、これを２ｍｌの酢酸エチルで抽出した。得られた酢酸エチル層を分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。振とう開始０時間後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から検出された化合物（ＶＩ）の濃度と比較して、振とう開始１日後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から検出された化合物（ＶＩ）の濃度は低かった。また、振とう開始１日後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から、振とう開始０時間後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層では検出されないピークが検出された。該ピークに含まれる化合物の質量分析を行った。該ピークに含まれる化合物の質量は、化合物（ＶＩ）の質量に比べて１４小さかった。
【０２０５】
（７）本発明蛋白質（Ａ１）による化合物（ＶＩＩＩ）の代謝
化合物（ＶＩ）の代わりに化合物（ＶＩＩＩ）を使用する以外は、実施例４１（６）に記載した方法に従って、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７Ｆの培養、菌体懸濁液の調製、該菌体懸濁液に化合物（ＶＩＩＩ）を添加した振とう培養、菌体懸濁液からの試料調製、および該試料のＨＰＬＣ分析を行った。振とう開始０時間後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から検出された化合物（ＶＩＩＩ）の濃度と比較して、振とう開始１日後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から検出された化合物（ＶＩＩＩ）の濃度は低かった。また、振とう開始１日後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から、振とう開始０時間後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層では検出されない２種のピークが検出された。該ピークに含まれる化合物の質量分析を行った。化合物（ＶＩＩＩ）の質量に比べて、１つのピークに含まれる化合物の質量は１４小さく、もう１つのピークに含まれる化合物の質量は２８小さかった。
【０２０６】
（８）本発明蛋白質（Ａ１）による化合物（Ｘ）の代謝
化合物（ＶＩ）の代わりに化合物（Ｘ）を使用する以外は、実施例４１（６）に記載した方法に従って、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７Ｆの培養、菌体懸濁液の調製、該菌体懸濁液に化合物（Ｘ）を添加した振とう培養、菌体懸濁液からの試料調製、および該試料のＨＰＬＣ分析を行った。振とう開始０時間後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から検出された化合物（Ｘ）の濃度と比較して、振とう開始１日後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から検出された化合物（Ｘ）の濃度は低かった。また、振とう開始１日後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から、振とう開始０時間後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層では検出されない２種のピークが検出された。該ピークに含まれる化合物の質量分析を行った。化合物（Ｘ）の質量に比べて、１つのピークに含まれる化合物の質量は４０小さく、もう１つのピークに含まれる化合物の質量は５４小さかった。
【０２０７】
（９）本発明蛋白質（Ａ１）による化合物（ＸＩ）の代謝
化合物（ＶＩ）の代わりに化合物（ＸＩ）を使用する以外は、実施例４１（６）に記載した方法に従って、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７Ｆの培養、菌体懸濁液の調製、該菌体懸濁液に化合物（ＸＩ）を添加した振とう培養、菌体懸濁液からの試料調製、および該試料のＨＰＬＣ分析を行った。振とう開始０時間後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から検出された化合物（ＸＩ）の濃度と比較して、振とう開始１日後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から検出された化合物（ＸＩ）の濃度は低かった。また、振とう開始１日後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から、振とう開始０時間後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層では検出されない２種のピークが検出された。該ピークに含まれる化合物の質量分析を行った。化合物（ＸＩ）の質量に比べて、１つのピークに含まれる化合物の質量は１４小さく、もう１つのピークに含まれる化合物の質量は１６大きかった。
【０２０８】
実施例４２　本発明蛋白質（Ａ１１）による化合物の代謝
（１）本発明蛋白質（Ａ１１）による化合物（Ｘ）の代謝
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ８４９ＡＦまたはＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＴＢ培地で３７℃にて一晩培養した。得られた培養液のうち１ｍｌを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＴＢ培地に植菌して２６℃で培養し、ＯＤ６６０が約０．５になったところで、最終濃度５００μＭになるよう５−アミノレブリン酸を添加し培養を継続した。その３０分後に最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加しさらに１８時間培養した。
各培養液から菌体を回収し、それぞれ０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄した後、１％グルコースを含む０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー１０ｍｌに懸濁した。得られた菌体懸濁液に終濃度２５ｐｐｍとなるように化合物（Ｘ）を添加し３０℃で振とう培養した。振とう開始０時間後、４日後に菌体懸濁液２ｍｌを分取して５０μｌの２Ｎ塩酸を添加し、これを２ｍｌの酢酸エチルで抽出した。得られた酢酸エチル層を分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から検出された化合物（Ｘ）の濃度と比較して、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ８４９ＡＦ菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から検出された化合物（Ｘ）の濃度は低かった。また、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ８４９ＡＦ菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層では検出されない３種のピークが検出された。この３種のピークのうち、１つのピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（８）で検出された化合物（Ｘ）よりも質量が４０小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。また、他の１つのピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（８）で検出された化合物（Ｘ）よりも質量が５４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２０９】
上記のＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層１ｍｌおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ８４９ＡＦ菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層１ｍｌをそれぞれ減圧下で乾固させた後、残渣を１ｍｌのジメチルスルホキシドに溶解させた［以下、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層由来の溶解液を（Ｘ）コントロール液（Ａ１１）と記す。また、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ８４９ＡＦ菌体懸濁液から調製した酢酸エチル層由来の溶解液を（Ｘ）代謝液（Ａ１１）と記す。］。
（Ｘ）代謝液（Ａ１１）の１２８倍希釈液２０μｌおよびプラスチド画分６０μｌを混合し、暗条件下、２０μｌのＰＰＯ基質溶液を添加して３０℃で１．５時間保温した。また、（Ｘ）代謝液（Ａ１１）の１２８倍希釈液２０μｌの代わりに（Ｘ）コントロール液（Ａ１１）の１２８倍希釈液２０μｌを添加した反応液を調製し、同様にＰＰＯ基質溶液を添加して保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様に処理して上記分析条件２にて逆相ＨＰＬＣ分析に供し、ＰＰＩＸ量を測定した。（Ｘ）代謝液（Ａ１１）が添加された反応液におけるＰＰＩＸ量は、（Ｘ）コントロール液（Ａ１１）が添加された反応液におけるＰＰＩＸ量よりも多かった。
【０２１０】
（２）本発明蛋白質（Ａ１１）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例３２（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（２）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３２（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１１）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３２（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１１）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１１）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１１）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１１）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１１）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２１１】
（３）本発明蛋白質（Ａ１１）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例３２（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（３）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌのジメチルスルホキシドに溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３２（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１１）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３２（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１１）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１１）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１１）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１１）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１１）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２１２】
（４）本発明蛋白質（Ａ１１）による化合物（ＸＶＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例３２（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は実施例４１（４）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を２００μｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３２（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＶＩ）代謝液（Ａ１１）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３２（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＶＩ）コントロール液（Ａ１１）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＶＩ）コントロール液（Ａ１１）から検出された化合物（ＸＶＩ）の濃度と比較して、（ＸＶＩ）代謝液（Ａ１１）から検出された化合物（ＸＶＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＶＩ）代謝液（Ａ１１）から、（ＸＶＩ）コントロール液（Ａ１１）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（４）で（ＸＶＩ）代謝液（Ａ１）からは検出され（ＸＶＩ）コントロール液（Ａ１）からは検出されなかったピークの溶出時間と一致した。
【０２１３】
（５）本発明蛋白質（Ａ１１）による化合物（ＸＶＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例３２（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は実施例４１（５）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を２００μｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３２（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＶＩＩ）代謝液（Ａ１１）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３２（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＶＩＩ）コントロール液（Ａ１１）と記す。）を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＶＩＩ）コントロール液（Ａ１１）から検出された化合物（ＸＶＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＶＩＩ）代謝液（Ａ１１）から検出された化合物（ＸＶＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＶＩＩ）代謝液（Ａ１１）から、（ＸＶＩＩ）コントロール液（Ａ１１）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（５）で（ＸＶＩＩ）代謝液（Ａ１）からは検出され（ＸＶＩＩ）コントロール液（Ａ１）からは検出されなかったピークの溶出時間と一致した。
【０２１４】
実施例４３　本発明蛋白質（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ１２）、（Ａ１３）、（Ａ１４）もしくは（Ａ１５）、または本蛋白質（Ａ１０）による化合物の代謝
（１）本発明蛋白質（Ａ２）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例７（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（２）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例７（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例７（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２１５】
（２）本発明蛋白質（Ａ３）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例１２（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（２）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例１２（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ３）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例１２（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ３）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ３）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ３）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ３）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ３）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２１６】
（３）本蛋白質（Ａ１０）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例１０（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（２）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例１０（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１０）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例１２（０）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１０）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１０）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１０）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１０）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１０）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２１７】
（４）本発明蛋白質（Ａ１２）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例３４（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（２）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３４（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１２）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３４（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１２）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１２）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１２）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１２）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１２）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２１８】
（５）本発明蛋白質（Ａ１３）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例３６（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（２）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３６（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１３）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３６（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１３）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１３）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１３）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２１９】
（６）本発明蛋白質（Ａ１４）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例３８（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（２）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３８（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１４）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３８（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１４）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１４）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１４）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１４）から、（ＸＩＩ）コントロール（Ａ１４）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２２０】
（７）本発明蛋白質（Ａ１５）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例４０（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（２）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４０（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１５）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４０（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１５）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１５）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１５）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１５）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１５）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２２１】
（８）本発明蛋白質（Ａ２）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例７（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（３）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌのジメチルスルホキシドに溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例７（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例７（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２２２】
（９）本発明蛋白質（Ａ３）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例１２（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（３）に記載した方法に従って反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌのジメチルスルホキシドに溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例１２（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ３）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例１２（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ３）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ３）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ３）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ３）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ３）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２２３】
（１０）本蛋白質（Ａ１０）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例１０（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（３）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌのジメチルスルホキシドに溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例１０（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１０）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例１０（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１０）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１０）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１０）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１０）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１０）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２２４】
（１１）本発明蛋白質（Ａ１２）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例３４（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（３）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌのジメチルスルホキシドに溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３４（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１２）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３４（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１２）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１２）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１２）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１２）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１２）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）５検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２２５】
（１２）本発明蛋白質（Ａ１３）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例３６（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（３）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌのジメチルスルホキシドに溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３６（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１３）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３６（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１３）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１３）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１３）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１３）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１３）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２２６】
（１３）本発明蛋白質（Ａ１４）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例３８（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（３）に記載した方法に従って反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌのジメチルスルホキシドに溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３８（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１４）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３８（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１４）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１４）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１４）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１４）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１４）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２２７】
（１４）本発明蛋白質（Ａ１５）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例４０（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（３）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌのジメチルスルホキシドに溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４０（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１５）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４０（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１５）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１５）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１５）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１５）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１５）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２２８】
実施例４４　本発明蛋白質（Ａ１）を認識する本発明抗体（Ａ）［以下、本発明抗体（Ａ１）と記す。］の調製
（１）本発明蛋白質（Ａ１）を発現する大腸菌抽出液の調製
実施例４（２）に記載の方法に従い、本発明蛋白質（Ａ１）を発現する大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７Ｆを一晩前培養した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＢ培地１Ｌで培養した。培養液から菌体を回収し、破砕した後、得られた菌体破砕液から上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７Ｆ）を調製した。
（２）本発明蛋白質（Ａ１）の精製
実施例４４（１）で得られた上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７Ｆ）を、実施例２（４）に記載の方法に準じて、ＨｉＬｏａｄ２６／１０　Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＨＰ　カラム、次いで、Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ　Ｃｅｒａｍｉｃ　Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ，　Ｔｙｐｅ　Ｉ　ｃｏｌｕｍｎ　ＣＨＴ１０−１　カラムに供し本発明蛋白質（Ａ１）を精製した。精製された画分をＳＤＳ−１０％〜２０％ＰＡＧＥ解析し、本発明蛋白質（Ａ１）のみを含む画分であることを確認した。
（３）本発明抗体（Ａ１）の調製
実施例４４（２）で精製された本発明蛋白質（Ａ１）を１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように０．０５Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解した。得られた溶液２ｍｌに、あらかじめ４２℃から４３℃にインキュベートされたＲＡＳ〔ＭＰＬ（Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ　Ｌｉｐｉｄ　Ａ）＋ＴＤＭ（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ　Ｄｉｃｏｒｙｎｏｍｙｃｏｌａｔｅ）＋ＣＷＳ（Ｃｅｌｌ　Ｗａｌｌ　Ｓｋｅｌｅｔｏｎ）　アジュバントシステム〕（Ｓｉｇｍａ　社製）４０μｌを加え、よく混合した。得られた混合物を、ニュージーランドホワイト種ウサギ（雌、１４週齢、平均２．４ｋｇ）一羽あたり１ｍｌずつ投与した。その内訳は、１００μｌずつ背部１０ケ所に皮下投与であった。３週間後および５週間後に、それぞれ初回投与量の１／２量を同様に投与した。この間ウサギの耳静脈から少量の血液をサンプリングし、抗体価を測定した。３回目の投与後に抗体価が上昇したため、３回目投与の約２週間後に免疫感作したウサギの頚動脈から全採血した。得られた血液をセパラピットチューブ（積水化学社製）に入れ、３７℃で２時間インキュベートした後、遠心分離（３０００ｒｐｍ　、２０ｍｉｎ、室温）して上清を回収することにより、抗血清［本発明抗体（Ａ１）を含む。］を得た。
【０２２９】
実施例４５　本発明抗体（Ａ１）による本蛋白質の検出および本蛋白質を発現する細胞の検出
各種大腸菌抽出液に対し、実施例４４で得た本発明抗体（Ａ１）を用いてイムノブロッティングを行った。実施例４（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７Ｆ（約０．５ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ１）を含む、約０．７８ｍｇの蛋白質を含む）、実施例４（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２（約０．７８ｍｇの蛋白質を含む）、実施例７（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ９２３Ｆ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ２）を含む）、実施例１２（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６７１Ｆ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ３）を含む）、実施例２７（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６４６Ｆ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ４）を含む）、実施例１０（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１１７９６Ｆ（約２ｐｍｏｌの本蛋白質（Ａ１０）を含む）、実施例１４（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮＳＣＡ（約２ｐｍｏｌの本蛋白質（Ａ９）を含む）、実施例３２（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ８４９ＡＦ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ１１）を含む）、実施例３４（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６１８Ｆ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ１２）を含む）、実施例３６（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ４７４Ｆ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ１３）を含む）、実施例３８（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１４９１ＡＦ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ１４）を含む）、実施例４０（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５５５ＡＦ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ１５）を含む）をＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動（４０ｍＡ、１　時間）した。このゲルにＰＶＤＦ膜を重ね、転写用緩衝液（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、１９２ｍＭ　グリシン、１０％　メタノール）中に浸した状態で、ＢＩＯ−ＲＡＤ　社製のブロッティング装置により、４　℃、３０Ｖ、２時間処理することにより、ゲル中のタンパク質をＰＶＤＦ膜へと移動させた。得られたＰＶＤＦ膜は、ＴＢＳ　＋Ｔｗｅｅｎ２０　溶液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　）で洗浄した後、３％のＢＳＡを含むＴＢＳ　＋Ｔｗｅｅｎ２０　溶液中で、３０分間インキュベートし、その後、３％のＢＳＡを含むＴＢＳ　＋Ｔｗｅｅｎ２０　溶液で３００００倍希釈した上記抗血清と、３０分間反応させた。反応後、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ　＋Ｔｗｅｅｎ２０　溶液で２回洗浄した後、３％のＢＳＡを含むＴＢＳ　＋Ｔｗｅｅｎ２０　溶液にて３０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識した抗ウサギＩｇＧヤギ抗血清（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）と、３０分間反応させた。反応後、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ　＋Ｔｗｅｅｎ２０　で２　回洗浄した後、ＮＢＴ−ＢＣＩＰ溶液（シグマ社製）に浸した。本発明蛋白質（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ１１）、（Ａ１２）、（Ａ１３）、（Ａ１４）および（Ａ１５）、ならびに、本蛋白質（Ａ９）およびＡ１０）にそれぞれ相当するバンドの発色が検出された。実施例４（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２（約０．７８ｍｇの蛋白質を含む）の試料では、発色バンドが検出されなかった。
実施例４６　ダイズでの発現用にコドン使用率が調整された本発明ＤＮＡ（Ａ１）［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓと記す。］の作製と発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓの作製
配列番号１９２で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２１３で示される塩基配列を有するプライマーとを用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（宝酒造社製）を用いて付属の取り扱い説明書に従いＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号１９１で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２１２で示される塩基配列を有するプライマーとを用いて同様にＰＣＲを行った。さらに、このＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号１９０で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２１１で示される塩基配列を有するプライマーとを用いて同様にＰＣＲを行い、得られた反応液を反応液１とした。
配列番号１９５で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２１０で示される塩基配列を有するプライマーとを用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（宝酒造社製）を用いて付属の取り扱い説明書に従いＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号１９４で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２０９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いて同様にＰＣＲを行った。さらに、このＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号１９３で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２０８で示される塩基配列を有するプライマーとを用いて同様にＰＣＲを行い、得られた反応液を反応液２とした。
配列番号１９８で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２０７で示される塩基配列を有するプライマーとを用いＰｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（宝酒造社製）を用いて付属の取り扱い説明書に従いＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号１９７で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２０６で示される塩基配列を有するプライマーとを用いて同様にＰＣＲを行った。さらに、このＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号１９６で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２０５で示される塩基配列を有するプライマーとを用いて同様にＰＣＲを行い、得られた反応液を反応液３とした。
配列番号２０１で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２０４で示される塩基配列を有するプライマーとを用いＰｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（宝酒造社製）を用いて付属の取り扱い説明書に従いＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号２００で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２０３で示される塩基配列を有するプライマーとを用いて同様にＰＣＲを行った。さらに、このＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号１９９で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２０２で示される塩基配列を有するプライマーとを用いて同様にＰＣＲを行い、得られた反応液を反応液４とした。
こうして得られた反応液１〜４を混合し、その一部を鋳型として、配列番号１９０で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２０２で示される塩基配列を有するプライマーとを用いＰｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（宝酒造社製）を用いて付属の取り扱い説明書に従いＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡの塩基配列を確認し、配列番号２１４で示される塩基配列の５’末端上流に塩基配列５’−ｃａｔ−３’が、また３’末端下流に塩基配列５’−ａａｇｃｔｔ−３’がそれぞれ連結されてなる配列を有するＤＮＡを得た。
配列番号６で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ａ１）のコドン使用率（ＧＣ含量７０．５８％）を表２２および表２３に、ダイズのコドン使用率［ＧＣ含量４６．１２％。かずさＤＮＡ研究所ｃｏｄｏｎ　ｕｓａｇｅ　ｄａｔａｂａｓｅ　（ｈｔｔｐ／／：ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）　より引用］を表２４および表２５に、配列番号２１４で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ａ１）のコドン使用率（ＧＣ含量５１．５９％）を表２６および表２７に、それぞれ示す。
【０２３０】
【表２２】

【０２３１】
【表２３】

【０２３２】
【表２４】

【０２３３】
【表２５】

【０２３４】
【表２６】

【０２３５】
【表２７】

（２）本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓを有する形質転換大腸菌の作製
実施例４６（１）で得られた配列番号２１４で示される塩基配列を含むＤＮＡを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。該ＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号２１４で示される塩基配列を有するＤＮＡがｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ６５７ｓｏｙと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７ｓｏｙとした。
（３）本発明蛋白質（Ａ１）の大腸菌での発現と蛋白質の回収
実施例４６（２）で得られた大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７ｓｏｙおよび実施例４（１）で得られた大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７を、実施例４（２）と同様にしてそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７ｓｏｙから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７ｓｏｙ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７と記す。）を調製した。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７ｓｏｙに含まれる蛋白質量あたりのＰ４５０量は、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７に含まれる蛋白質量あたりのＰ４５０量と比較して多かった。
【０２３６】
実施例４７　本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓの植物への導入
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓを有する直接導入用葉緑体発現プラスミドの構築（１）
本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓをパーティクルガン法で植物へ導入するためのプラスミドとして、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドを構築した。
まず、実施例４６（２）で得たｐＫＳＮ６５７ｓｏｙを鋳型にして、配列番号３９４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号３９５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーに使ってＰＣＲを行い、配列番号２１４で示される塩基配列を含有するＤＮＡを増幅した。ＰＣＲはＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用いて、９４℃にて２分間の保温を１回行った後、９４℃にて３０秒間次いで５０℃にて３０秒間次いで６８℃にて６０秒間の保温を１サイクルとしてこれを３０回実施し、最後に６８℃にて３分間の保温を１回行った。増幅されたＤＮＡを、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ　＆　Ｇｅｌ−Ｃｌｅａｎ　ｕｐ−（東洋紡績社製）を用いて付属のマニュアルに従って操作を行うことにより回収精製した。精製されたＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＴ２２ＩとＳａｃＩとで消化した後、配列番号２１４で示される塩基配列を含有するＤＮＡを回収した。実施例１６の（２）で得られたプラスミドｐＵＣｒＳｔ６５７を制限酵素ＥｃｏＴ２２ＩとＳａｃＩで消化した後、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列およびベクタープラスミドｐＵＣ１９由来の塩基配列を含む約２．９ｋｂｐのＤＮＡを単離した。得られたＤＮＡと上記の配列番号２１４で示される塩基配列を含有するＤＮＡとをライゲーションすることにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドｐＵＣｒＳｔ６５７ｓｏｙ（図４８）を得た。
得られたプラスミドｐＵＣｒＳｔ６５７ｓｏｙを制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩとで消化し、配列番号２１４で示される塩基配列を含有するＤＮＡを単離した。該ＤＮＡを、実施例１６（２）で得られたプラスミドｐＮｄＧ６−ΔＴのＢｇｌＩＩ切断部位とＳａｃＩ切断部位との間に挿入することにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく該ＤＮＡが連結されてなるキメラＤＮＡが、ＣＲ１６Ｇ６プロモーターの下流に結合されてなるプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７ｓｏｙ（図４９）を得た。
次いで、該プラスミドを大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセル（宝酒造社製）に導入し、アンピシリン耐性株を選抜した。選抜されたアンピシリン耐性株に含まれるプラスミドの塩基配列をＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｖ３．０（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）およびＤＮＡシークエンサー３１００（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結果、プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７ｓｏｙは配列番号２１４で示される塩基配列を有することが確認された。
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓを有する直接導入用葉緑体発現プラスミドの構築（２）
本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓをパーティクルガン法で植物に導入するためのプラスミドとして、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドを構築した。まず、実施例４６で得られたｐＫＳＮ６５７ｓｏｙを鋳型にして、配列番号３９６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号３９５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーに使ってＰＣＲを行い、配列番号２１４で示される塩基配列を含有するＤＮＡを増幅した。ＰＣＲはＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用いて、９４℃にて２分間の保温を１回行った後、９４℃にて３０秒間次いで４６℃にて３０秒間次いで６８℃にて６０秒間の保温を１サイクルとしてこれを２５回実施し、最後に６８℃にて３分間の保温を１回行った。増幅されたＤＮＡを、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ　＆　Ｇｅｌ−Ｃｌｅａｎ　ｕｐ−（東洋紡績社製）を用いて付属のマニュアルに従って操作を行うことにより回収精製した。得られたＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩで消化し、配列番号２１４で示される塩基配列を含有するＤＮＡを回収した。
次に、実施例１６（３）で得られたプラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−６５７を制限酵素ＢｓｐＨＩで消化した後、ＴａＫａＲａ　ＢＫＬＫｉｔ（宝酒造社製）を用いて付属のマニュアルに従って処理することにより、このＤＮＡの末端平滑化および５’末端のりん酸化を行った。次いで、前記ＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩで消化した後、プラスミドｐＫＦｒＳｔ１２由来のＤＮＡを単離した。このＤＮＡを、上記の配列番号２１４で示される塩基配列を含有するＳａｃＩ消化されたＤＮＡとライゲーションすることにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−６５７ｓｏｙ（図５０）を得た。
得られたプラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−６５７ｓｏｙを制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩとで消化し、配列番号２１４で示される塩基配列を含有するＤＮＡを単離した。該ＤＮＡを、実施例１６（２）で得られたプラスミドｐＮｄＧ６−ΔＴのＢｇｌＩＩ切断部位とＳａｃＩ切断部位との間に挿入することにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく該ＤＮＡが連結されてなるキメラＤＮＡがＣＲ１６Ｇ６プロモーターの下流に結合されてなるプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７ｓｏｙ（図５１）を得た。
次いで、該プラスミドを大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセル（宝酒造社製）に導入し、アンピシリン耐性株を選抜した。選抜されたアンピシリン耐性株に含まれるプラスミドの塩基配列をＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｖ３．０（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）およびＤＮＡシークエンサー３１００（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結果、プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７ｓｏｙは配列番号２１４で示される塩基配列を有することが確認された。
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ２１）Ｓのダイズへの導入
ＭＳ培地のビタミン類をＢ５培地［Ｏ．　Ｌ．　Ｇａｍｂｏｒｇ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｘｐ．　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．　（１９８６）５０　ｐ１５１に記載。］のビタミン類に置換する以外は、実施例１７（１）に記載した方法に従って、ダイズ（品種；ＦａｙｅｔｔｅおよびＪａｃｋ）の球状型胚を調製した。
得られた球状型胚を新しい不定胚増殖培地に移植し、２〜３日培養した。前記球状型胚に、実施例４７（１）で作製されたプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７ｓｏｙまたは実施例４７（２）で作製されたプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７ｓｏｙを、実施例１７（２）に記載の方法に従って導入した。
（４）不定胚のハイグロマイシンによる選抜
ＭＳ培地のビタミン類をＢ５培地のビタミン類に置換する以外は、実施例１７（３）に記載した方法に従って、実施例４７（３）で得られた遺伝子導入後の球状型胚のハイグロマイシンによる選抜を行なった。ただし、移植２回目以降は、不定胚選抜培地として、０．２（Ｗ／Ｖ）％のゲルライトを加えて固化した培地、または、ゲルライトを加えていない液体の培地を用いた。液体の培地の場合は、１分間に９０回程度緩やかに旋回して培養した。
（５）不定胚の化合物（ＩＩ）による選抜
ＭＳ培地のビタミン類をＢ５培地のビタミン類に置換する以外は、実施例１７（４）に記載した方法に従って、実施例４７（３）で得られた遺伝子導入後の球状型胚の化合物（ＩＩ）による選抜を行なう。
（６）不定胚からの個体再生、順化および栽培
実施例１７（５）に記載の方法に準じて、実施例４７（４）または（５）で選抜された球状型胚からの個体再生を行なう。ただし、発生培地の寒天濃度を０．８（Ｗ／Ｖ）％、または、１．０（Ｗ／Ｖ）％とする。また、発芽培地のＭＳ培地のビタミン類をＢ５培地のビタミン類に置換する。
本葉を展開し発根した個体について、実施例１７（６）に記載の方法に従って、順化および栽培を行い、採種する。
（７）雑草防除活性を有する化合物（ＩＩ）に対する耐性の評価
実施例１７（４）に記載した方法に従って、実施例４７（６）で得られた再生植物個体の化合物（ＩＩ）に対する耐性度を評価する。
（８）本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓを有するアグロバクテリウム導入用葉緑体発現プラスミドの構築
本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓをアグロバクテリウム法で植物へ導入するためのプラスミドを構築した。上記プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７ｓｏｙを制限酵素ＮｏｔＩで消化し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むＤＮＡを単離した。このＤＮＡを実施例１８で得たバイナリーベクタープラスミドｐＢＩ１２１ＳのＮｏｔＩ切断部位に挿入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７ｓｏｙ（図５２）を得た。また、上記プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７ｓｏｙを制限酵素ＮｏｔＩで消化し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むＤＮＡを単離した。このＤＮＡを、バイナリーベクタープラスミドｐＢＩ１２１ＳのＮｏｔＩ切断部位に挿入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７ｓｏｙ（図５３）を得た。
（９）本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓのタバコへの導入
実施例４７（８）で得られたプラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７ｓｏｙおよびプラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７ｓｏｙを用いて本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓをアグロバクテリウム法でタバコへ導入した。
まず、実施例１９に記載の方法に従って、プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７ｓｏｙおよびｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７ｓｏｙをそれぞれＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４０４　株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　社製）に導入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７ｓｏｙまたはｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７ｓｏｙを持つ組換えアグロバクテリウム株をそれぞれ単離した。
次いで、上記のプラスミドを持つ組換えアグロバクテリウム株を用いて、これらの株を２５ｍｇ／Ｌ　カナマイシンを含む　ＬＢ　液体培地中で３０℃にて終夜培養した他は実施例１９に記載の方法に従って、タバコへの遺伝子導入を行った。ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７ｓｏｙまたはｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７ｓｏｙのＴ−ＤＮＡ　領域が組み込まれた組換えタバコ個体がそれぞれ取得された。
（１０）本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓ組換えタバコの葉片を用いた耐性の評価
実施例４７（９）で取得された組換えタバコ３５個体から葉を切除して、一片　５〜７ｍｍ　の葉片を採取した。それぞれの葉片を化合物（ＩＩ）を０、０．０５、０．１、または０．２　ｍｇ／Ｌ　添加した　ＭＳ　寒天培地に植え込み、明所・室温で培養し、培養　１１日後にそれぞれの葉片の薬害の程度を観察した。また、それぞれの葉片を化合物（ＸＩＩ）を０、０．０１、０．０２、０．０５、または０．１　ｍｇ／Ｌ　添加したＭＳ　寒天培地に植え込み、明所・室温で培養し、培養　７日後にそれぞれの葉片の薬害の程度を観察した。コントロールとしては、遺伝子導入を行っていないタバコ（以下、野生型タバコと記す。）の葉片を各濃度で２０枚用いた。継続的に生存する葉片を１、薬害認められる半枯死の葉片を０．５、白化して枯死した葉片を０としてスコアリングし、各群のスコアの平均を求めた。本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓ（プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７ｓｏｙまたはｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７ｓｏｙのＴ−ＤＮＡ領域）が導入されたタバコの葉片は、化合物（ＩＩ）および化合物（ＸＩＩ）のいずれに対しても、野生型タバコよりも高いスコアを示した。
実施例４８　本発明ＤＮＡ（Ａ１６）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１３０６９ｔ染色体ＤＮＡの調製
実施例３１（１）に記載の方法にて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１３０６９ｔの染色体ＤＮＡを調製した。
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ１６）の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例４８（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１３０６９ｔの染色体ＤＮＡを鋳型としプライマー対１４を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。実施例３１（２）と同様にして、増幅されたＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした後、その塩基配列を解析した。その結果、配列番号２２５で示される塩基配列の塩基番号３４３〜１０６９で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例４８（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号２６５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号２６６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２３５で示される塩基配列の塩基番号１〜５０１で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例４８（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号２６７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号２６８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２３５で示される塩基配列の塩基番号１０４４〜１４５４で示される塩基配列が読み取られた。
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ１６）の塩基配列解析
実施例４８（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号２３５で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２５１塩基（終止コドンを含む）からなり４１６アミノ酸残基（配列番号２１５）をコードする塩基配列（配列番号２２５）と、１９８塩基（終止コドンを含む）からなり６５アミノ酸残基（配列番号２４５）をコードする塩基配列（配列番号２５５）とが含まれた。配列番号２２５で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２１５）からなる蛋白質の分子量は、４６０１３Ｄａと計算された。配列番号２５５で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２４５）からなる蛋白質の分子量は、６７６８Ｄａと計算された。
実施例４９　本発明蛋白質（Ａ１６）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ１６）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例４８（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１３０６９ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＧｅｎｅＡｍｐハイフィデリティーＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムジャパン社製）を使用してＰＣＲを行った。プライマーとしては、配列番号２６９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２８６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合わせを用いた。ＰＣＲ反応液には、２種類のプライマーをそれぞれ２００ｎＭとなるよう添加し、染色体ＤＮＡを５０ｎｇ、ｄＮＴＰミックス（それぞれ２．０ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を５．０μｌ、１０×バッファー（ＭｇＣｌ_２含有）を５．０μｌ、およびＧｅｎｅＡｍｐ　ＨＦ酵素ミックスを０．５μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量５０μｌとした。保温条件は、９７℃で１分間保温した後、９７℃で１５秒間次いで６０℃で３０秒間さらに７２℃で９０秒間の保温を１サイクルとしてこれを１０サイクル繰り返し、続いて、９７℃で１５秒間次いで６０℃で３０秒間さらに７２℃で９０秒間（７２℃での保温は１サイクル毎に５秒間ずつ増加させる）の保温を１サイクルとしてこれを１５サイクル行い、さらに７２℃で７分間保温した。該ＰＣＲ反応液から、実施例３２（１）と同様にしてＤＮＡを精製し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、配列番号５７、５９、２６７、２８６、２８８で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号２３５で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ４５２Ｆとした。実施例３２（１）と同様にして、ｐＣＲ４５２Ｆを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物から約１．５ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号２３５で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ１６）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ４５２Ｆと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ４５２Ｆとした。
（２）本発明蛋白質（Ａ１６）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ４５２ＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ４５２Ｆから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ４５２Ｆ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
実施例３２（３）と同様にして反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。ただし、上清画分としては、実施例４９（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ４５２Ｆまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）を用いた。保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ４５２Ｆを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
実施例５０　本発明ＤＮＡ（Ａ１７）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＡＴＣＣ　１０１３７染色体ＤＮＡの調製
実施例３１（１）に記載の方法にて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＡＴＣＣ　１０１３７の染色体ＤＮＡを調製した。
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ１７）の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例５０（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＡＴＣＣ　１０１３７の染色体ＤＮＡを鋳型としプライマー対１４を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。実施例３１（２）と同様にして、増幅されたＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした後、その塩基配列を解析した。その結果、配列番号２２６で示される塩基配列の塩基番号３４３〜１０６９で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例５０（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号２７０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号２７１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２３６で示される塩基配列の塩基番号１〜３６１で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例５０（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号２７２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号２７３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２３６で示される塩基配列の塩基番号１０３５〜１４５４で示される塩基配列が読み取られた。
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ１７）の塩基配列解析
実施例５０（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号２３６で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２５１塩基（終止コドンを含む）からなり４１６アミノ酸残基（配列番号２１６）をコードする塩基配列（配列番号２２６）と、１９８塩基（終止コドンを含む）からなり６５アミノ酸残基（配列番号２４６）をコードする塩基配列（配列番号２５６）とが含まれた。配列番号２２６で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２１６）からなる蛋白質の分子量は、４６０８２Ｄａと計算された。配列番号２５６で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２４６）からなる蛋白質の分子量は、６７６８Ｄａと計算された。配列番号２５６で示される塩基配列は、配列番号２５５で示される塩基配列と１００％同一であり、配列番号２４６で示されるアミノ酸配列は、配列番号２４５で示されるアミノ酸配列と１００％同一であった。
実施例５１　本発明蛋白質（Ａ１７）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ１７）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例５０（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＡＴＣＣ　１０１３７の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２７４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２７５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いる以外は実施例３２（１）と同様にしてＰＣＲを行った。該ＰＣＲ反応液から、実施例３２（１）と同様にしてＤＮＡを精製し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、配列番号５７、５９、２７４、２７６、２７７で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号２３６で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ６０８Ｆとした。実施例３２（１）と同様にして、ｐＣＲ６０８Ｆを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物から約１．５ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号２３６で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ１７）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ６０８Ｆと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６０８Ｆとした。
（２）本発明蛋白質（Ａ１７）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６０８ＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６０８Ｆ　から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６０８Ｆ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
実施例３２（３）と同様にして反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。ただし、上清画分としては、実施例５１（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６０８Ｆまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）を用いた。保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６０８Ｆを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
実施例５２　本発明ＤＮＡ（Ａ１８）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２７３５染色体ＤＮＡの調製
実施例３１（１）に記載の方法にて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２７３５の染色体ＤＮＡを調製した。
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ１８）の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例５２（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２７３５の染色体ＤＮＡを鋳型としプライマー対１７を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。実施例３１（２）と同様にして、増幅されたＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした後、その塩基配列を解析した。その結果、配列番号２２７で示される塩基配列の塩基番号５２６〜１０４８で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例５２（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｃＩＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号２７８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号２７９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２３７で示される塩基配列の塩基番号１〜６００で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例５２（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｌＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号１６３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１６４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２３７で示される塩基配列の塩基番号９８３〜１４４９で示される塩基配列が読み取られた。
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ１８）の塩基配列解析
実施例５２（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号２３７で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２３０塩基（終止コドンを含む）からなり４０９アミノ酸残基（配列番号２１７）をコードする塩基配列（配列番号２２７）と、２０７塩基（終止コドンを含む）からなり６８アミノ酸残基（配列番号２４７）をコードする塩基配列（配列番号２５７）とが含まれた。配列番号２２７で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２１７）からなる蛋白質の分子量は、４５０９９Ｄａと計算された。配列番号２５７で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２４７）からなる蛋白質の分子量は、７１９３Ｄａと計算された。
実施例５３　本発明蛋白質（Ａ１８）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ１８）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例５２（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２７３５の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１８３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２８０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いる以外は実施例４９（１）と同様にしてＰＣＲを行った。該ＰＣＲ反応液から、実施例３２（１）と同様にしてＤＮＡを精製し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、配列番号６７、６８、１６３、２７９、２８１で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号２３７で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ６４６ＢＦとした。実施例３２（１）と同様にして、ｐＣＲ６４６ＢＦを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物から約１．５ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号２３７で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ１８）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ６４６ＢＦと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６４６ＢＦとした。
（２）本発明蛋白質（Ａ１８）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６４６ＢＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６４６ＢＦから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６４６ＢＦ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
実施例３２（３）と同様にして反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。ただし、上清画分としては、実施例５３（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６４６ＢＦまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）を用いた。保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６４６ＢＦを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
実施例５４　本発明ＤＮＡ（Ａ１９）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＩＦＯ　１３８４９Ｔ染色体ＤＮＡの調製
実施例３１（１）に記載の方法にて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＩＦＯ　１３８４９Ｔの染色体ＤＮＡを調製した。
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ１９）の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例５４（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＩＦＯ　１３８４９Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型としプライマー対１４を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。実施例３１（２）と同様にして、増幅されたＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした後、その塩基配列を解析した。その結果、配列番号２２８で示される塩基配列の塩基番号３４３〜１０６９で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例５４（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号２８２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号２８３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２３８で示される塩基配列の塩基番号１〜３５８で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例５４（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｃＩＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号２８４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号２８５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２３８で示される塩基配列の塩基番号１００５〜１４５４で示される塩基配列が読み取られた。
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ１９）の塩基配列解析
実施例５４（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号２３８で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２５１塩基（終止コドンを含む）からなり４１６アミノ酸残基（配列番号２１８）をコードする塩基配列（配列番号２２８）と、１５６塩基（終止コドンを含む）からなり５１アミノ酸残基（配列番号２４８）をコードする塩基配列（配列番号２５８）とが含まれた。配列番号２２８で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２１８）からなる蛋白質の分子量は、４５９０３Ｄａと計算された。配列番号２５８で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２４８）からなる蛋白質の分子量は、５１７５Ｄａと計算された。
実施例５５　本発明蛋白質（Ａ１９）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ１９）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例５４（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＩＦＯ　１３８４９Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２８６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２８７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いる以外は実施例４９（１）と同様にしてＰＣＲを行った。該ＰＣＲ反応液から、実施例３２（１）と同様にしてＤＮＡを精製し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、配列番号５７、５９、２８４、２８６、２８８で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号２３８で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ１５０２Ｆとした。実施例３２（１）と同様にして、ｐＣＲ１５０２Ｆを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物から約１．５ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号２３８で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ１９）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ１５０２Ｆと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５０２Ｆとした。
（２）本発明蛋白質（Ａ１９）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５０２ＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５０２Ｆから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５０２Ｆ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
実施例３２（３）と同様にして反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。ただし、上清画分としては、実施例５５（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５０２Ｆまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）を用いた。保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５０２Ｆを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
実施例５６　本発明ＤＮＡ（Ａ２０）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１２７８７Ｔ染色体ＤＮＡの調製
実施例３１（１）に記載の方法にて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１２７８７Ｔの染色体ＤＮＡを調製した。
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ２０）の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例５６（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１２７８７Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型としプライマー対１４を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。実施例３１（２）と同様にして、増幅されたＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした後、その塩基配列を解析した。その結果、配列番号２２９で示される塩基配列の塩基番号３０４〜１０３６で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例５６（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｍａｃＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号２７８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号２８９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２３９で示される塩基配列の塩基番号１〜３１８で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例５６（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｔｕＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号２９０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号２９１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２３９で示される塩基配列の塩基番号９６９〜１４６１で示される塩基配列が読み取られた。
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ２０）の塩基配列解析
実施例５６（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号２３９で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２１８塩基（終止コドンを含む）からなり４０５アミノ酸残基（配列番号２１９）をコードする塩基配列（配列番号２２９）と、２３１塩基（終止コドンを含む）からなり７６アミノ酸残基（配列番号２４９）をコードする塩基配列（配列番号２５９）とが含まれた。配列番号２２９で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２１９）からなる蛋白質の分子量は、４５０７１Ｄａと計算された。配列番号２５９で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２４９）からなる蛋白質の分子量は、７８１６Ｄａと計算された。
実施例５７　本発明蛋白質（Ａ２０）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ２０）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例５６（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１２７８７Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２９２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２９３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いる以外は実施例４９（１）と同様にしてＰＣＲを行った。該ＰＣＲ反応液から、実施例３２（１）と同様にしてＤＮＡを精製し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、配列番号６７、６８、１８８、２７８、２９０で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号２３９で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ１５２５Ｆとした。実施例３２（１）と同様にして、ｐＣＲ１５２５Ｆを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物から約１．５ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号２３９で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ２０）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ１５２５Ｆと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５２５Ｆとした。
（２）本発明蛋白質（Ａ２０）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５２５ＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５２５Ｆ　から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５２５Ｆ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
実施例３２（３）と同様にして反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。ただし、上清画分としては、実施例５７（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５２５Ｆまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）を用いた。保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５２５Ｆを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
実施例５８　本発明ＤＮＡ（Ａ２１）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３８５５Ｔ染色体ＤＮＡの調製
実施例３１（１）に記載の方法にて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３８５５Ｔの染色体ＤＮＡを調製した。
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ２１）の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例５８（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３８５５Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型としプライマー対１４を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。実施例３１（２）と同様にして、増幅されたＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした後、その塩基配列を解析した。その結果、配列番号２３０で示される塩基配列の塩基番号３２８〜１０６３で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例５８（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号２９４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号２９５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２４０で示される塩基配列の塩基番号１〜３４１で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例５８（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｃＩＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号２９６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号２９７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２４０で示される塩基配列の塩基番号１０１７〜１４５８で示される塩基配列が読み取られた。
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ２１）の塩基配列解析
実施例５８（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号２４０で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２４５塩基（終止コドンを含む）からなり４１４アミノ酸残基（配列番号２２０）をコードする塩基配列（配列番号２３０）と、２０１塩基（終止コドンを含む）からなり６６アミノ酸残基（配列番号２５０）をコードする塩基配列（配列番号２６０）とが含まれた。配列番号２３０で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２２０）からなる蛋白質の分子量は、４５８０６Ｄａと計算された。配列番号２６０で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２５０）からなる蛋白質の分子量は、６７１２Ｄａと計算された。
実施例５９　本発明蛋白質（Ａ２１）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ２１）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例５８（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３８５５Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２９８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２９９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いる以外は実施例３２（１）と同様にしてＰＣＲを行った。該ＰＣＲ反応液から、実施例３２（１）と同様にしてＤＮＡを精製し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、配列番号５７、５９、２９６、２９８、３００で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号２４０で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ１５４３ＢＦとした。実施例３２（１）と同様にして、ｐＣＲ１５４３ＢＦを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物から約１．５ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号２４０で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ２１）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ１５４３ＢＦと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５４３ＢＦとした。
（２）本発明蛋白質（Ａ２１）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５４３ＢＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５４３ＢＦから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５４３ＢＦ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
実施例３２（３）と同様にして反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。ただし、上清画分としては、実施例５９（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５４３ＢＦまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）を用いた。保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５４３ＢＦを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
実施例６０　本発明ＤＮＡ（Ａ２２）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ　ＩＦＯ　１３４３４Ｔ染色体ＤＮＡの調製
実施例３１（１）に記載の方法にて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ　ＩＦＯ　１３４３４Ｔの染色体ＤＮＡを調製した。
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ２２）の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例６０（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ　ＩＦＯ　１３４３４Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型としプライマー対１５を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。実施例３１（２）と同様にして、増幅されたＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした後、その塩基配列を解析した。その結果、配列番号２３１で示される塩基配列の塩基番号４８３〜１０４８で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例６０（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号３０１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号３０２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２４１で示される塩基配列の塩基番号６８〜５１６で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例６０（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｃＩＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号３０２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号３０３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２４１で示される塩基配列の塩基番号１〜２７０で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例６０（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｃＩＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号３０４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号３０５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２４１で示される塩基配列の塩基番号９８２〜１４４８で示される塩基配列が読み取られた。
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ２２）の塩基配列解析
実施例６０（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号２４１で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２３０塩基（終止コドンを含む）からなり４０９アミノ酸残基（配列番号２２１）をコードする塩基配列（配列番号２３１）と、１９５塩基（終止コドンを含む）からなり６４アミノ酸残基（配列番号２５１）をコードする塩基配列（配列番号２６１）とが含まれた。配列番号２３１で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２２１）からなる蛋白質の分子量は、４５０５０Ｄａと計算された。配列番号２６１で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２５１）からなる蛋白質の分子量は、６９１４Ｄａと計算された。
実施例６１　本発明蛋白質（Ａ２２）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ２２）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例６０（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ　ＩＦＯ　１３４３４Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３０６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３０７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いる以外は実施例３２（１）と同様にしてＰＣＲを行った。該ＰＣＲ反応液から、実施例３２（１）と同様にしてＤＮＡを精製し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、配列番号６７、６８、３０８で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号２４１で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ１５５８ＢＦとした。実施例３２（１）と同様にして、ｐＣＲ１５５８ＢＦを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物から約１．５ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号２４１で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ２２）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ１５５８ＢＦと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５５８ＢＦとした。
（２）本発明蛋白質（Ａ２２）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５５８ＢＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５５８ＢＦから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５５８ＢＦ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
実施例３２（３）と同様にして反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。ただし、上清画分としては、実施例６１（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５５８ＢＦまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）を用いた。保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５５８ＢＦを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
実施例６２　本発明ＤＮＡ（Ａ２３）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ　ＩＦＯ　１３６８２Ｔ染色体ＤＮＡの調製
実施例３１（１）に記載の方法にて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ　ＩＦＯ　１３６８２Ｔの染色体ＤＮＡを調製した。
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ２３）の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例６２（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ　ＩＦＯ　１３６８２Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型としプライマー対１４を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。実施例３１（２）と同様にして、増幅されたＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした後、その塩基配列を解析した。その結果、配列番号２３２で示される塩基配列の塩基番号２８９〜１０１５で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例６２（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号３０９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号３１０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２４２で示される塩基配列の塩基番号１〜３５４で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例６２（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号３１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号３１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２４２で示される塩基配列の塩基番号９６６〜１４１１で示される塩基配列が読み取られた。
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ２３）の塩基配列解析
実施例６２（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号２４２で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１１９７塩基（終止コドンを含む）からなり３９８アミノ酸残基（配列番号２２２）をコードする塩基配列（配列番号２３２）と、２０１塩基（終止コドンを含む）からなり６６アミノ酸残基（配列番号２５２）をコードする塩基配列（配列番号２６２）とが含まれた。配列番号２３２で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２２２）からなる蛋白質の分子量は、４３６２４Ｄａと計算された。配列番号２６２で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２５２）からなる蛋白質の分子量は、６７９７Ｄａと計算された。
実施例６３　本発明蛋白質（Ａ２３）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ２３）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例６２（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ　ＩＦＯ　１３６８２Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３１３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３１４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いる以外は実施例４９（１）と同様にしてＰＣＲを行った。該ＰＣＲ反応液から、実施例３２（１）と同様にしてＤＮＡを精製し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、配列番号６７、６８、３０９、３１１、３１５で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号２４２で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ１５８４Ｆとした。実施例３２（１）と同様にして、ｐＣＲ１５８４Ｆを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物から約１．５ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号２４２で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ２３）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ１５８４Ｆと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５８４Ｆとした。
（２）本発明蛋白質（Ａ２３）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５８４ＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５８４Ｆ　から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５８４Ｆ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
実施例３２（３）と同様にして反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。ただし、上清画分としては、実施例６３（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５８４Ｆまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）を用いた。保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５８４Ｆを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
実施例６４　本発明ＤＮＡ（Ａ２４）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１５８７５Ｔ染色体ＤＮＡの調製
実施例３１（１）に記載の方法にて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１５８７５Ｔの染色体ＤＮＡを調製した。
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ２４）の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例６４（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１５８７５Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型としプライマー対１４を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。実施例３１（２）と同様にして、増幅されたＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした後、その塩基配列を解析した。その結果、配列番号２３３で示される塩基配列の塩基番号３２２〜１０５７で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例６４（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号３１６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号３１７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２４３で示される塩基配列の塩基番号１〜３８４で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例６４（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＮａｅＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号３１８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号３１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２４３で示される塩基配列の塩基番号９９２〜１４６６で示される塩基配列が読み取られた。
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ２４）の塩基配列解析
実施例６４（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号２４３で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２４５塩基（終止コドンを含む）からなり４１４アミノ酸残基（配列番号２２３）をコードする塩基配列（配列番号２３３）と、１９８塩基（終止コドンを含む）からなり６５アミノ酸残基（配列番号２５３）をコードする塩基配列（配列番号２６３）とが含まれた。配列番号２３３で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２２３）からなる蛋白質の分子量は、４５８３０Ｄａと計算された。配列番号２６３で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２５３）からなる蛋白質の分子量は、７０３４Ｄａと計算された。
実施例６５　本発明蛋白質（Ａ２４）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ２４）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例６４（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１５８７５Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３２０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３２１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いる以外は実施例４９（１）と同様にしてＰＣＲを行った。該ＰＣＲ反応液から、実施例３２（１）と同様にしてＤＮＡを精製し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、配列番号６７、６８、３２２で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号２４３で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ１５８９ＢＦとした。実施例３２（１）と同様にして、ｐＣＲ１５８９ＢＦを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物から約１．５ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号２４３で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ２４）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ１５８９ＢＦと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５８９ＢＦとした。
（２）本発明蛋白質（Ａ２４）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５８９ＢＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５８９ＢＦから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５８９ＢＦ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
実施例３２（３）と同様にして反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。ただし、上清画分としては、実施例６５（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５８９ＢＦまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）を用いた。保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５８９ＢＦを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
実施例６６　本発明ＤＮＡ（Ａ２５）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３４４６Ｔ染色体ＤＮＡの調製
実施例３１（１）に記載の方法にて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３４４６Ｔの染色体ＤＮＡを調製した。
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ２５）の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例６６（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３４４６Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型としプライマー対１４を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。実施例３１（２）と同様にして、増幅されたＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした後、その塩基配列を解析した。その結果、配列番号２３４で示される塩基配列の塩基番号２８９〜１０１５で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例６６（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号３２３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号３２４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２４４で示される塩基配列の塩基番号１〜３０３で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例６６（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｍａｃＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号３１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号３２５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２４４で示される塩基配列の塩基番号９６６〜１４１１で示される塩基配列が読み取られた。
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ２５）の塩基配列解析
実施例６６（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号２４４で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１１９７塩基（終止コドンを含む）からなり３９８アミノ酸残基（配列番号２２４）をコードする塩基配列（配列番号２３４）と、２０１塩基（終止コドンを含む）からなり６６アミノ酸残基（配列番号２５４）をコードする塩基配列（配列番号２６４）とが含まれた。配列番号２３４で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２２４）からなる蛋白質の分子量は、４４１７５Ｄａと計算された。配列番号２６４で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２５４）からなる蛋白質の分子量は、６６８５Ｄａと計算された。
実施例６７　本発明蛋白質（Ａ２５）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ２５）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例６６（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３４４６Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３２６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３２７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いる以外は実施例４９（１）と同様にしてＰＣＲを行った。該ＰＣＲ反応液から、実施例３２（１）と同様にしてＤＮＡを精製し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、配列番号６７、６８、３１１、３１５、３２３で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号２４４で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ１６０９Ｆとした。実施例３２（１）と同様にして、ｐＣＲ１６０９Ｆを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物から約１．５ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号２４４で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ２５）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ１６０９Ｆと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６０９Ｆとした。
（２）本発明蛋白質（Ａ２５）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６０９ＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６０９Ｆ　から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６０９Ｆ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
実施例３２（３）と同様にして反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。ただし、上清画分としては、実施例６７（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６０９Ｆまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）を用いた。保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の^１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６０９Ｆを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
実施例６８　本発明蛋白質（Ａ１６）、（Ａ１７）、（Ａ１８）、（Ａ１９）、（Ａ２０）、（Ａ２１）、（Ａ２２）、（Ａ２３）、（Ａ２４）または（Ａ２５）による化合物の代謝
本発明蛋白質（Ａ１６）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
１２．５ｐｐｍの化合物（ＸＩＩ）、３ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Ａ成分、オリエンタル酵母社製）、１ｍｇ／ｍｌホウレンソウ由来のフェレドキシン（Ｂ成分、ＳＩＧＭＡ社製）、０．１５Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（Ｃ成分、ＳＩＧＭＡ社製）および実施例４９（２）で回収された上清画分２０μｌを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液１００μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。また、前記の反応液組成中のＡ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４９（２）で回収された上清画分を含まない５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液１００μｌを調製し、同様に保温した。保温後の各反応液に、５μｌの２Ｎ塩酸および１００μｌのエタノールを加えて攪拌し、８０００×ｇで遠心分離した上清をウルトラフリー−ＭＣ　０．２２μｍフィルターユニット（ミリポア社製）を用いて濾過した。得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４９（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１６）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４９（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１６）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１６）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１６）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１６）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１６）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（２）本発明蛋白質（Ａ１７）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４９（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例５１（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５１（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１７）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５１（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１７）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１７）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１７）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１７）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１７）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（３）本発明蛋白質（Ａ１８）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４９（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例５３（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５３（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１８）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５３（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１８）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１８）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１８）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１８）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１８）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（４）本発明蛋白質（Ａ１９）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４９（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例５５（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５５（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１９）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５５（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１９）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１９）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１９）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１９）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１９）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（５）本発明蛋白質（Ａ２０）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４９（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例５７（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５７（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２０）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５７（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２０）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２０）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２０）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２０）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２０）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（６）本発明蛋白質（Ａ２１）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４９（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例５９（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５９（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２１）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５９（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２１）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２１）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２１）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２１）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２１）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（７）本発明蛋白質（Ａ２２）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４９（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例６１（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例６１（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２２）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例６１（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２２）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２２）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２２）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２２）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２２）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（８）本発明蛋白質（Ａ２３）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４９（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例６３（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例６３（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２３）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例６３（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２３）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２３）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２３）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２３）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２３）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（９）本発明蛋白質（Ａ２４）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４９（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例６５（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例６５（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２４）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例６５（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２４）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２４）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２４）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２４）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２４）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（１０）本発明蛋白質（Ａ２５）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４９（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例６７（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例６７（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２５）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例６７（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２５）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２５）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２５）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２５）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２５）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（１１）　本発明蛋白質（Ａ１７）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
１２．５ｐｐｍの化合物（ＸＩＩ）の代わりに１２．５ｐｐｍの化合物（ＸＩＩＩ）を用い、実施例６８（２）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５１（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１７）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５１（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１７）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１７）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１７）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１７）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１７）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（１２）　本発明蛋白質（Ａ１８）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
実施例５１（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例５３（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５３（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１８）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５３（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１８）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１８）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１８）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１８）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１８）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（１３）　本発明蛋白質（Ａ１９）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
実施例５１（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例５５（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５５（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１９）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５５（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１９）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１９）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１９）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１９）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１９）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（１４）　本発明蛋白質（Ａ２０）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
実施例５１（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例５７（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５７（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２０）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５７（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２０）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２０）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２０）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２０）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２０）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（１５）　本発明蛋白質（Ａ２１）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
実施例５１（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例５９（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５９（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２１）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５９（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２１）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２１）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２１）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２１）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２１）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（１６）　本発明蛋白質（Ａ２３）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
実施例５１（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例６３（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例６３（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２３）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例６３（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２３）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２３）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２３）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２３）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２３）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（１７）　本発明蛋白質（Ａ２５）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
実施例５１（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例６７（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例６７（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２５）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例６７（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２５）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２５）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２５）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２５）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２５）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
実施例６９　本発明ＤＮＡ（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）または（Ａ４）をプローブとしたハイブリダイゼーション
（１）プローブの調製
実施例３０（１）に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。ただし鋳型として、実施例３（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８の染色体ＤＮＡ　５０ｎｇの代わりに、実施例２６（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　　ＩＦＯ　１２７３５の染色体ＤＮＡ　１０ｎｇを用いた。プライマーとしては、配列番号３２８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。該ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを回収し、配列番号１０９で示される塩基配列を有しジゴキシゲニンで標識されたＤＮＡプローブ（以下、ＤＩＧ標識プローブ（Ａ４）と記す。）を作製した。
（２）プラスミド溶液の調製
実施例３１（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｏｒ　ＩＦＯ１３４４５の染色体ＤＮＡを鋳型に用いて、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣゲノミックポリメラーゼミックス（クロンテック社製）によるＰＣＲを行った。プライマーとしては、配列番号３３０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３３１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを用いた。ＰＣＲ反応液には、２種類のプライマーをそれぞれ２００ｎＭとなるよう添加し、染色体ＤＮＡを１０ｎｇ、ｄＮＴＰミックス（それぞれ２．５ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を４．０μｌ、５×ＧＣバッファーを１０．０μｌ、２５ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）_２を２．２μｌ、５Ｍ　ＧＣ−Ｍｅｌｔを１０．０μｌ、およびＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣゲノミックポリメラーゼミックス（クロンテック社製）を１．０μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を５０μｌにした。ＰＣＲ反応条件は、９４℃で１分間保温した後、９４℃で１０秒間次いで７２℃で３分間の保温を１サイクルとしてこれを７サイクル繰り返し、続いて、９４℃で１０秒間次いで６７℃で３分間の保温を１サイクルとしてこれを３６サイクル繰り返し、さらに６７℃で７分間保温した。該ＰＣＲ反応液から、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、付属の取扱説明書に従ってＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡを、ＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に、該ベクターに付属の取扱説明書に従いライゲーションして、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に導入した。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、本発明ＤＮＡ（Ａ１１）を含むプラスミド溶液を得た。
同様に、実施例３３（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３７８２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３３２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３３３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲで得られたＤＮＡを、上記と同様にベクターとライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドを調製して、本発明ＤＮＡ（Ａ１２）を含むプラスミド液を得た。
同様に、実施例３５（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｓ　ＩＦＯ１４２７３ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３３１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３３４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲで得られたＤＮＡを、上記と同様にベクターとライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドを調製して、本発明ＤＮＡ（Ａ１３）を含むプラスミド液を得た。
同様に、実施例３７（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１３６７３ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３３０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３３１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲで得られたＤＮＡを、上記と同様にベクターとライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドを調製して、本発明ＤＮＡ（Ａ１４）を含むプラスミド液を得た。
同様に、実施例３９（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２４４４の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３３０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３３１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲで得られたＤＮＡを、上記と同様にベクターとライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドを調製して、本発明ＤＮＡ（Ａ１５）を含むプラスミド液を得た。
同様に、実施例４８（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１３０６９ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３３５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３３６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲで得られたＤＮＡを、上記と同様にベクターとライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドを調製して、本発明ＤＮＡ（Ａ１６）を含むプラスミド液を得た。
同様に、実施例５０（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＡＴＣＣ　１０１３７の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３３５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３３６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲで得られたＤＮＡを、上記と同様にベクターとライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドを調製して、本発明ＤＮＡ（Ａ１７）を含むプラスミド液を得た。
同様に、実施例５２（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２７３５の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３３０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３３１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲで得られたＤＮＡを、上記と同様にベクターとライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドを調製して、本発明ＤＮＡ（Ａ１８）を含むプラスミド液を得た。
同様に、実施例５４（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＩＦＯ　１３８４９Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３３３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３３５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲで得られたＤＮＡを、上記と同様にベクターとライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドを調製して、本発明ＤＮＡ（Ａ１９）を含むプラスミド液を得た。
同様に、実施例５６（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１２７８７Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３３１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３３７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲで得られたＤＮＡを、上記と同様にベクターとライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドを調製して、本発明ＤＮＡ（Ａ２０）を含むプラスミド液を得た。
同様に、実施例５８（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３８５５Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３３１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３３８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲで得られたＤＮＡを、上記と同様にベクターとライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドを調製して、本発明ＤＮＡ（Ａ２１）を含むプラスミド液を得た。
同様に、実施例６２（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ　ＩＦＯ　１３６８２Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３３１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３３９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲで得られたＤＮＡを、上記と同様にベクターとライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドを調製して、本発明ＤＮＡ（Ａ２３）を含むプラスミド液を得た。
同様に、実施例６６（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３４４６Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３３１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３３９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲで得られたＤＮＡを、上記と同様にベクターとライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドを調製して、本発明ＤＮＡ（Ａ２５）を含むプラスミド液を得た。
また同様に、実施例６０（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ　ＩＦＯ　１３４３４Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３４０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３４１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行う。該ＰＣＲで得られるＤＮＡを、上記と同様にベクターとライゲーションした後、大腸菌に形質転換する。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドを調製して、本発明ＤＮＡ（Ａ２２）を含むプラスミド液を得る。
同様に、実施例６４（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１５８７５Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３４２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３４３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行う。該ＰＣＲで得られるＤＮＡを、上記と同様にベクターとライゲーションした後、大腸菌に形質転換する。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドを調製して、本発明ＤＮＡ（Ａ２４）を含むプラスミド液を得る。
（３）ドットブロットハイブリダイゼーション
実施例６９（２）で調製された、本発明ＤＮＡ（Ａ１１）を含むプラスミドＤＮＡ、本発明ＤＮＡ（Ａ１２）を含むプラスミドＤＮＡ、本発明ＤＮＡ（Ａ１３）を含むプラスミドＤＮＡ、本発明ＤＮＡ（Ａ１４）を含むプラスミドＤＮＡ、本発明ＤＮＡ（Ａ１５）を含むプラスミドＤＮＡ、本発明ＤＮＡ（Ａ１６）を含むプラスミドＤＮＡ、本発明ＤＮＡ（Ａ１７）を含むプラスミドＤＮＡ、本発明ＤＮＡ（Ａ１８）を含むプラスミドＤＮＡ、本発明ＤＮＡ（Ａ１９）を含むプラスミドＤＮＡ、本発明ＤＮＡ（Ａ２０）を含むプラスミドＤＮＡ、本発明ＤＮＡ（Ａ２１）を含むプラスミドＤＮＡ、本発明ＤＮＡ（Ａ２３）を含むプラスミドＤＮＡおよび本発明ＤＮＡ（Ａ２５）を含むプラスミドＤＮＡを、それぞれ１００ｎｇおよび１０ｎｇ相当量ずつナイロンメンブレンＨｙｂｏｎｄ　Ｎ＋（アマシャムバイオサイエンス社製）にブロットした。得られたメンブレンにトランスイルミネーターで５分間紫外線を照射した。
ハイブリダイゼーションと検出は、実施例３０（２）に記載の方法に従って行った。プローブとしては、実施例３０（１）で作製された配列番号６で示される塩基配列を有しジゴキシゲニンで標識されたＤＮＡ（ＤＩＧ標識プローブ（Ａ１））、配列番号７で示される塩基配列を有しジゴキシゲニンで標識されたＤＮＡ（ＤＩＧ標識プローブ（Ａ２））、配列番号８で示される塩基配列を有しジゴキシゲニンで標識されたＤＮＡ（ＤＩＧ標識プローブ（Ａ３））または実施例６９（１）で作製されたＤＩＧ標識プローブ（Ａ４）を、それぞれ１００℃で５分間保温した後、氷上で急冷したものを用いた。ＤＩＧ標識プローブ（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）または（Ａ４）のいずれを用いてハイブリダイゼーションを行った場合でも、上記のプラスミドＤＮＡのそれぞれ１００ｎｇおよび１０ｎｇのいずれの試料についてもシグナルが検出された。
また同様に、実施例６９（２）で調製される本発明ＤＮＡ（Ａ２２）を含むプラスミドＤＮＡおよび本発明ＤＮＡ（Ａ２４）を含むプラスミドＤＮＡを、それぞれ１００ｎｇおよび１０ｎｇ相当量ずつナイロンメンブレンＨｙｂｏｎｄ　Ｎ＋（アマシャムバイオサイエンス社製）にブロットする。実施例３０（２）に記載した方法に従ってハイブリダイゼーションと検出を行う。
実施例７０　ダイズでの発現用にコドン使用率が調整された本発明ＤＮＡ（Ａ２３）［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓと記す。］の作製
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓの作製
配列番号３４６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３６７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて付属の取扱い説明書に従ってＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３４５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３６６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、同様にＰＣＲを行った。さらに、このＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３４４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３６５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて同様にＰＣＲを行い、得られた反応液を反応液１とした。
また、配列番号３４９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３６４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて付属の取扱い説明書に従ってＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３４８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３６３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、同様にＰＣＲを行った。さらに、このＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３４７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３６２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて同様にＰＣＲを行い、得られた反応液を反応液２とした。
また、配列番号３５２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３６１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて付属の取扱い説明書に従ってＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３５１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３６０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、同様にＰＣＲを行った。さらに、このＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３５０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３５９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて同様にＰＣＲを行い、得られた反応液を反応液３とした。
また、配列番号３５５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３５８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて付属の取扱い説明書に従ってＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３５４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３５７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、同様にＰＣＲを行った。さらに、このＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３５３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３５６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて同様にＰＣＲを行い、得られた反応液を反応液４とした。
上記のようにして得られた反応液１〜４を混合しその一部を鋳型として、配列番号３４４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３５６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて付属の取扱い説明書に従ってＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡの塩基配列を確認し、配列番号３６８で示される塩基配列の５’末端上流に塩基配列５’−ｃａｔ−３’が、また３’末端下流に塩基配列５’−ａａｇｃｔｔ−３’がそれぞれ連結されてなる配列を有するＤＮＡを得た。
配列番号２３２で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ａ２３）のコドン使用率（ＧＣ含量７３．１０％）を表２８および表２９に、ダイズのコドン使用率（ＧＣ含量４６．１２％）を表２４および表２５に、配列番号３６８で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓのコドン使用率（ＧＣ含量５２．３８％）を表３０および表３１に、それぞれ示す。
【表２８】

【表２９】

【表３０】

【表３１】

（２）本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓを有する形質転換大腸菌の作製
実施例７０（１）で得られた配列番号３６８で示される塩基配列を含むＤＮＡを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。該ＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号３６８で示される塩基配列を有するＤＮＡがｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ１５８４ｓｏｙと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５８４ｓｏｙとした。
（３）本発明蛋白質（Ａ２３）の大腸菌での発現と蛋白質の回収
実施例７０（２）で得られた大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５８４ｓｏｙおよび実施例６３（１）で得られた大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５８４Ｆを、実施例４（２）と同様にしてそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５８４ｓｏｙから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５８４ｓｏｙ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５８４Ｆから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５８４Ｆと記す。）を調製した。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５８４ｓｏｙに含まれる蛋白質量あたりのＰ４５０量は、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５８４Ｆに含まれる蛋白質量あたりのＰ４５０量と比較して多かった。
実施例７１　ダイズでの発現用にコドン使用率が調整された本発明ＤＮＡ（Ａ２５）［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓと記す。］の作製と発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓの作製
配列番号３７１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３９２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて付属の取扱い説明書に従ってＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３７０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３９１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、同様にＰＣＲを行った。さらに、このＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３６９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３９０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて同様にＰＣＲを行い、得られた反応液を反応液１とした。
また、配列番号３７４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３８９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて付属の取扱い説明書に従ってＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３７３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３８８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、同様にＰＣＲを行った。さらに、このＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３７２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３８７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて同様にＰＣＲを行い、得られた反応液を反応液２とした。
また、配列番号３７７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３８６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて付属の取扱い説明書に従ってＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３７６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３８５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、同様にＰＣＲを行った。さらに、このＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３７５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３８４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて同様にＰＣＲを行い、得られた反応液を反応液３とした。
また、配列番号３８０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３８３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて付属の取扱い説明書に従ってＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３７９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３８２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、同様にＰＣＲを行った。さらに、このＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３７８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３８１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて同様にＰＣＲを行い、得られた反応液を反応液４とした。
上記のようにして得られた反応液１〜４を混合しその一部を鋳型として、配列番号３６９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３８１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて付属の取扱い説明書に従ってＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡの塩基配列を確認し、配列番号３９３で示される塩基配列の５’末端上流に塩基配列５’−ｃａｔ−３’が、また３’末端下流に塩基配列５’−ａａｇｃｔｔ−３’がそれぞれ連結されてなる配列を有するＤＮＡを得た。
配列番号２３４で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ａ２５）のコドン使用率（ＧＣ含量７１．９３％）を表３２および表３３に、ダイズのコドン使用率（ＧＣ含量４６．１２％）を表２４および表２５に、配列番号３９３で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓのコドン使用率（ＧＣ含量５２．０５％）を表３４および表３５に、それぞれ示す。
【表３２】

【表３３】

【表３４】

【表３５】

（２）本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓを有する形質転換大腸菌の作製
実施例７１（１）で得られた配列番号３９３で示される塩基配列を含むＤＮＡを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。該ＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号３９３で示される塩基配列を有するＤＮＡがｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ１６０９ｓｏｙと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６０９ｓｏｙとした。
（３）本発明蛋白質（Ａ２５）の大腸菌での発現と蛋白質の回収
実施例７１（２）で得られた大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６０９ｓｏｙおよび実施例６７（１）で得られた大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６０９Ｆを、実施例４（２）と同様にしてそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６０９ｓｏｙから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６０９ｓｏｙ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６０９Ｆから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６０９Ｆと記す。）を調製した。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６０９ｓｏｙに含まれる蛋白質量あたりのＰ４５０量は、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６０９Ｆに含まれる蛋白質量あたりのＰ４５０量と比較して多かった。
実施例７２　本発明蛋白質（Ａ２５）を認識する本発明抗体（Ａ）［以下、本発明抗体（Ａ２５）と記す。］の調製
（１）本発明蛋白質（Ａ２５）を発現する大腸菌抽出液の調製
実施例４（２）に記載した方法に従い、実施例７１（２）で作製された本発明蛋白質（Ａ２５）を発現する大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６０９ｓｏｙを一晩前培養した後、得られた培養液を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＢ培地１Ｌに植菌して２６℃で培養し、最終濃度５００μＭの５−アミノレブリン酸、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを同様に添加してさらに培養した。培養液から菌体を回収し、０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄した後、１ｍＭ　ＰＭＳＦを含む前記バッファー１００ｍｌに懸濁した。得られた菌体培養液を、超音波破砕機ＳＯＮＩＦＩＥＲ（Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｓｏｎｉｃ　Ｐｏｗｅｒ社登録商標）を用いて、ｏｕｔ　ｐｕｔ　５、ｄｕｔｙ　ｃｙｃｌｅ　３０％の条件で１０分間ずつ３回超音波処理して菌体破砕液を得た。得られた破砕液を、遠心分離（９，０００×ｇ、１０分間）した後、上清を回収してこれを遠心分離（２００，０００×ｇ、７０分間）し、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６０９ｓｏｙから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６０９ｓｏｙと記す。）を回収した。
（２）本発明蛋白質（Ａ２５）の精製
実施例７２（１）で得られた上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６０９ｓｏｙ）をＨｉＬｏａｄ　１６／１０　Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＨＰ（アマシャムバイオサイエンス社製）に注入した。次いで前記カラムに４０ｍｌの２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）を流した後、塩化ナトリウム直線濃度勾配を付して２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）を流し（塩化ナトリウム濃度勾配０．００１２５Ｍ／分、塩化ナトリウム濃度範囲０Ｍから０．３７５Ｍ、流速３ｍｌ／分）、塩化ナトリウム濃度０．０８８Ｍ〜０．１００Ｍにて溶出された画分１０ｍｌを分取した。
分取した画分をＰＤ−１０カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）に供し、２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ、蛋白質を含む画分を回収した。次いで、該画分をＭｏｎｏＱ　ＨＲ　１０／１０（アマシャムバイオサイエンス社製）に注入し、該カラムに１６ｍｌの２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）を流した。次いで、塩化ナトリウム直線濃度勾配を付して２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）を流し（塩化ナトリウム濃度勾配０．００１０４２Ｍ／分、塩化ナトリウム濃度範囲０Ｍから０．２５Ｍ、流速４ｍｌ／分）、塩化ナトリウム濃度０．０６０Ｍ〜０．０６９Ｍにて溶出された画分８ｍｌを分取した。
分取した画分を２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）で２．５倍に希釈し、ＭｏｎｏＱ　ＨＲ　５／５（アマシャムバイオサイエンス社製）に注入した。次いで、該カラムに２ｍｌの２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）を流した後、塩化ナトリウム直線濃度勾配を付して２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）を流し（塩化ナトリウム濃度勾配０．００８３３３Ｍ／分、塩化ナトリウム濃度範囲０Ｍから０．２５Ｍ、流速１ｍｌ／分）、塩化ナトリウム濃度０．０７３Ｍ〜０．０７７Ｍにて溶出された画分０．５ｍｌを分取した。
上記のように精製された画分を、ＰＡＧミニ「第一」１０／２０（第一化学薬品社製）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析し、本発明蛋白質（Ａ２５）を主要に含む画分であることを確認した。
（３）本発明抗体（Ａ２５）の調製
実施例４４（３）に記載した方法に従って本発明抗体（Ａ２５）の調製を行った。ただし、本発明蛋白質（Ａ１）を用いる代わりに、実施例７２（２）で得られた本発明蛋白質（Ａ２５）を用い、本発明抗体（Ａ２５）を含む抗血清を得た。
実施例７３　本発明抗体（Ａ２５）による本発明蛋白質の検出
各種大腸菌抽出液に対し、実施例７２（３）で得られた本発明抗体（Ａ２５）を用いてイムノブロッティングを行った。実施例４９（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ４５２Ｆ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ１６）を含む）、実施例５１（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６０８Ｆ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ１７）を含む）、実施例５３（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６４６ＢＦ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ１８）を含む）、実施例５５（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５０２Ｆ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ１９）を含む）、実施例５７（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５２５Ｆ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ２０）を含む）、実施例５９（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５４３ＢＦ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ２１）を含む）、実施例６１（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５５８ＢＦ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ２２）を含む）、実施例６３（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５８４Ｆ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ２３）を含む）、実施例６５（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５８９ＢＦ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ２４）を含む）、実施例６７（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６０９Ｆ（約０．５ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ２５）を含む）、実施例７０（３）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５８４ｓｏｙ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ２３）を含む）、実施例７１（３）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６０９ｓｏｙ（約０．５ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ２５）を含む）および実施例６７（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２（約０．８ｍｇの蛋白質を含む）を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動（４０ｍＡ、１時間）した。このゲル中の蛋白質を、実施例４５に記載した方法に従ってＰＶＤＦ膜に転写した。実施例４５で得られたＰＶＤＦ膜（以下、ＰＶＤＦ膜（Ａ）と記す。）、および上記の方法で得られるＰＶＤＦ膜（以下、ＰＶＤＦ膜（Ｂ）と記す。）を、実施例４５に記載した方法に従って、実施例７２（３）で得られた抗血清と反応させた。その後、実施例４５に記載した方法に従って、二次抗体との反応、洗浄、発色を行った。ＰＶＤＦ膜（Ａ）には、本発明蛋白質（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ１１）、（Ａ１２）、（Ａ１３）、（Ａ１４）および（Ａ１５）、ならびに本蛋白質（Ａ９）および（Ａ１０）に相当するバンドの発色が検出された。ＰＶＤＦ膜（Ｂ）には、本発明蛋白質（Ａ１６）、（Ａ１７）、（Ａ１８）、（Ａ１９）、（Ａ２０）、（Ａ２１）、（Ａ２２）、（Ａ２３）、（Ａ２４）および（Ａ２５）に相当するバンドの発色が検出された。ＰＶＤＦ膜（Ａ）の実施例４（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２（約０．７８ｍｇの蛋白質を含む）の試料、ＰＶＤＦ膜（Ｂ）の実施例６７（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２（約０．８ｍｇの蛋白質を含む）の試料では、発色バンドが検出されなかった。
実施例７４　本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓの植物への導入
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓを有する直接導入用葉緑体発現プラスミドの構築（１）
本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓをパーティクルガン法で植物へ導入するためのプラスミドとして、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドを構築した。
まず、実施例７０（２）で得たｐＫＳＮ１５８４ｓｏｙを鋳型にして、配列番号３９７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号３９８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーに使ってＰＣＲを行い、配列番号３６８で示される塩基配列を含有するＤＮＡを増幅した。ＰＣＲはＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用いて、９４℃にて２分間の保温を１回行った後、９４℃にて３０秒間次いで５３℃にて３０秒間次いで６８℃にて９０秒間の保温を１サイクルとしてこれを２０回実施し、最後に６８℃にて３分間の保温を１回行った。増幅されたＤＮＡを、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ　＆　Ｇｅｌ−Ｃｌｅａｎ　ｕｐ−（東洋紡績社製）を用いて付属のマニュアルに従って操作を行うことにより回収精製した。得られたＤＮＡを、ＴａＫａＲａ　ＢＫＬＫｉｔ（宝酒造社製）を用いて付属のマニュアルに従って処理することにより該ＤＮＡの末端平滑化および５’末端のリン酸化を行った後、配列番号３６８で示される塩基配列を含有するＤＮＡを回収した。一方、プラスミドｐＵＣ１９（宝酒造社製）をＳｍａＩ消化した後、仔牛小腸由来のＡｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）を用いて５’末端の脱リン酸化処理を行った。得られた脱リン酸化ＤＮＡと、上記の配列番号３６８で示される塩基配列を含有するＤＮＡとをライゲーションすることによりプラスミドを作製した。得られたプラスミドを制限酵素ＥｃｏＴ２２ＩとＳａｃＩとで消化した後、配列番号３６８で示される塩基配列を含有するＤＮＡを回収した。実施例１６（２）で得られたプラスミドｐＵＣｒＳｔ６５７を制限酵素ＥｃｏＴ２２ＩとＳａｃＩとで消化した後、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列およびベクタープラスミドｐＵＣ１９由来の塩基配列を含む約２．９　ｋｂｐのＤＮＡを単離した。得られたＤＮＡと上記の配列番号３６８で示される塩基配列を含有するＤＮＡとをライゲーションすることにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドｐＵＣｒＳｔ１５８４ｓｏｙ（図５４）を得た。
得られたプラスミドｐＵＣｒＳｔ１５８４ｓｏｙを制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩとで消化し、配列番号３６８で示される塩基配列を含有するＤＮＡを単離した。該ＤＮＡを、実施例１６（２）で得られたプラスミドｐＮｄＧ６−ΔＴのＢｇｌＩＩ切断部位とＳａｃＩ切断部位との間に挿入することにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく該ＤＮＡが連結されてなるキメラＤＮＡがＣＲ１６Ｇ６プロモーターの下流に結合されてなるプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１５８４ｓｏｙ（図５５）を得た。
次いで、該プラスミドを大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセル（宝酒造社製）に導入し、アンピシリン耐性株を選抜した。選抜されたアンピシリン耐性株に含まれるプラスミドの塩基配列をＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｖ３．０（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）およびＤＮＡシークエンサー３１００（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結果、プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１５８４ｓｏｙは配列番号３６８で示される塩基配列を有することが確認された。
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓを有する直接導入用葉緑体発現プラスミドの構築（２）
本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓをパーティクルガン法で植物に導入するためのプラスミドとして、ダイズ（ｃｖ．Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドを構築した。まず、実施例７０で得たｐＫＳＮ１５８４ｓｏｙを鋳型にして、配列番号３９９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号３９８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーに使ってＰＣＲを行い、配列番号３６８で示される塩基配列を含有するＤＮＡを増幅した。ＰＣＲはＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用いて、９４℃にて２分間の保温を１回行った後、９４℃にて３０秒間次いで４６℃にて３０秒間次いで６８℃にて９０秒間の保温を１サイクルとしてこれを２５回実施し、最後に６８℃にて３分間の保温を１回行った。増幅されたＤＮＡを、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ　＆　Ｇｅｌ−Ｃｌｅａｎ　ｕｐ−（東洋紡績社製）を用いて付属のマニュアルに従って操作を行うことにより回収精製した。得られたＤＮＡを、ＴａＫａＲａ　ＢＫＬＫｉｔ（宝酒造社製）を用いて付属のマニュアルに従って処理することにより該ＤＮＡの末端平滑化および５’末端のりん酸化を行った後、配列番号３６８で示される塩基配列を含有するＤＮＡを回収した。一方、実施例１５（３）で得られたプラスミドｐＫＦ１９ΔＢｓをＳｍａＩ消化した後、仔牛小腸由来のＡｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）でを用いて５’末端の脱リン酸化処理を行った。得られた脱リン酸化ＤＮＡと上記の配列番号３６８で示される塩基配列を含有するＤＮＡとをライゲーションすることによりプラスミドを作製した。得られたプラスミドを制限酵素ＢｓｐＨＩとＳａｃＩとで消化した後、配列番号３６８で示される塩基配列を含有するＤＮＡを回収した。次に、実施例１６の（３）で得たプラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−６５７を制限酵素ＢｓｐＨＩとＳａｃＩとで消化して、プラスミドｐＫＦｒＳｔ１２由来のＤＮＡを単離した。このＤＮＡと、上記の配列番号３６８で示される塩基配列を含有する両端が制限酵素ＢｓｐＨＩとＳａｃＩで切断されたＤＮＡとをライゲーションすることにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−１５８４ｓｏｙ（図５６）を得た。
得られたプラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−１５８４ｓｏｙを制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩとで消化し、配列番号３６８で示される塩基配列を含有するＤＮＡを単離した。該ＤＮＡを、実施例１６（２）で得られたプラスミドｐＮｄＧ６−ΔＴのＢｇｌＩＩ切断部位とＳａｃＩ切断部位との間に挿入することにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく該ＤＮＡが連結されてなるキメラＤＮＡがＣＲ１６Ｇ６プロモーターの下流に結合されてなるプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１５８４ｓｏｙ（図５７）を得た。
次いで、該プラスミドを大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセル（宝酒造社製）に導入し、アンピシリン耐性株を選抜した。選抜されたアンピシリン耐性株に含まれるプラスミドの塩基配列をＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｖ３．０（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）およびＤＮＡシークエンサー３１００（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結果、プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１５８４ｓｏｙは配列番号３６８で示される塩基配列を有することが確認された。
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓのダイズへの導入
実施例４７（３）に記載した方法に従って、ダイズ（品種；ＦａｙｅｔｔｅおよびＪａｃｋ）の球状型胚を調製した。
得られた球状型胚を新しい不定胚増殖培地に移植し、２〜３日培養した。この球状型胚に、実施例７４（１）で作製されたプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１５８４ｓｏｙまたは実施例７４（２）で作製されたプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１５８４ｓｏｙを、実施例１７（２）に記載の方法に従って導入した。
（４）不定胚のハイグロマイシンによる選抜
実施例４７（４）に記載した方法に従って、実施例７４（３）で得られた遺伝子導入後の球状型胚のハイグロマイシンによる選抜を行なう。
（５）不定胚の化合物（ＩＩ）による選抜
実施例４７（５）に記載した方法に従って、実施例７４（３）で得られた遺伝子導入後の球状型胚の化合物（ＩＩ）による選抜を行なう。
（６）不定胚からの個体再生、順化および栽培
実施例４７（６）に記載の方法に従って、実施例７４（４）または（５）で選抜された球状型胚からの個体再生を行なう。
本葉を展開し発根した個体について、実施例１７（６）に記載の方法に従って、順化および栽培を行い、採種する。
（７）雑草防除活性を有する化合物（ＩＩ）に対する耐性の評価
実施例１７（４）に記載した方法に従って、実施例７４（６）で得られた再生植物個体の化合物（ＩＩ）に対する耐性度を評価する。
（８）本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓを有するアグロバクテリウム導入用葉緑体発現プラスミドの構築
本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓをアグロバクテリウム法で植物へ導入するためのプラスミドを構築した。上記プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１５８４ｓｏｙを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩとで消化し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むＤＮＡを単離した。このＤＮＡを、実施例１８で得られたバイナリーベクタープラスミドｐＢＩ１２１Ｓの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＥｃｏＲＩ切断部位との間に挿入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１５８４ｓｏｙ（図５８）を得た。また、上記プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１５８４ｓｏｙを制限酵素ＮｏｔＩで消化し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むＤＮＡを単離した。このＤＮＡを上記バイナリーベクタープラスミドｐＢＩ１２１Ｓの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＥｃｏＲＩ切断部位との間に挿入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１５８４ｓｏｙ（図５９）を得た。
（９）本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓのタバコへの導入
実施例７４（８）で得られたプラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１５８４ｓｏｙおよびプラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１５８４ｓｏｙ　を用いて本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓをアグロバクテリウム法でタバコへ導入した。
まず、実施例１９に記載の方法に従って、プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１５８４ｓｏｙおよびｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１５８４ｓｏｙをそれぞれ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４０４　株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　社製）に導入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１５８４ｓｏｙまたはｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１５８４ｓｏｙを持つ組換えアグロバクテリウム株をそれぞれ単離した。
次いで、上記のプラスミドを持つ組換えアグロバクテリウム株を用いて、実施例４７（９）に記載の方法に従って、タバコへの遺伝子導入を行い、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１５８４ｓｏｙまたはｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１５８４ｓｏｙの　Ｔ−ＤＮＡ　領域が組み込まれた組換えタバコ個体をそれぞれ取得する。
（１０）本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓ組換えタバコの葉片を用いた耐性の評価
実施例７４（９）で取得された組換えタバコ３５個体から葉を切除して、一片　５〜７ｍｍ　の葉片を採取する。それぞれの葉片を化合物（ＩＩ）または化合物（ＸＩＩ）を添加したＭＳ寒天培地に植え込み、明所・室温で培養し、数日経過後にそれぞれの葉片の薬害の程度を観察する。コントロールとしては野生型タバコの葉片を用い、継続的に生存する葉片、薬害の認められる半枯死の葉片、白化して枯死した葉片をスコアリングし、組換えタバコの耐性を評価する。
実施例７５　本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓの植物への導入
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓを有する直接導入用葉緑体発現プラスミドの構築（１）
本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓをパーティクルガン法で植物へ導入するためのプラスミドとして、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドを構築した。
まず、実施例７１（２）で得たｐＫＳＮ１６０９ｓｏｙを鋳型にして、配列番号４００で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号４０１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーに使ってＰＣＲを行い、配列番号３９３で示される塩基配列を含有するＤＮＡを増幅した。ＰＣＲはＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用いて、９４℃にて２分間の保温を１回行った後、９４℃にて３０秒間次いで５３℃にて３０秒間次いで６８℃にて９０秒間の保温を１サイクルとしてこれを２０回実施し、最後に６８℃にて３分間の保温を１回行った。増幅された該ＤＮＡを、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ　＆　Ｇｅｌ−Ｃｌｅａｎ　ｕｐ−（東洋紡績社製）を用いて付属のマニュアルに従って操作を行うことにより回収精製した。得られたＤＮＡを、ＴａＫａＲａ　ＢＫＬＫｉｔ（宝酒造社製）を用いて付属のマニュアルに従って処理することにより該ＤＮＡの末端平滑化および５’末端のりん酸化を行った後、配列番号３９３で示される塩基配列を含有するＤＮＡを回収した。一方、プラスミドｐＵＣ１９（宝酒造社製）をＳｍａＩ消化した後、仔牛小腸由来のＡｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）を用いて５’末端の脱リン酸化処理を行った。得られた脱リン酸化ＤＮＡと、上記の配列番号３９３で示される塩基配列を含有するＤＮＡとをライゲーションすることによりプラスミドを作製した。得られたプラスミドを制限酵素ＥｃｏＴ２２ＩとＳａｃＩとで消化した後、配列番号３９３で示される塩基配列を含有するＤＮＡを回収した。実施例１６（２）で得られたプラスミドｐＵＣｒＳｔ６５７を制限酵素ＥｃｏＴ２２ＩとＳａｃＩとで消化した後、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列およびベクタープラスミドｐＵＣ１９由来の塩基配列を含む約２．９　ｋｂｐのＤＮＡを単離した。得られたＤＮＡと上記の配列番号３９３で示される塩基配列を含有するＤＮＡとをライゲーションすることにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドｐＵＣｒＳｔ１６０９ｓｏｙ（図６０）を得た。
得られたプラスミドｐＵＣｒＳｔ１６０９ｓｏｙを制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩとで消化し、配列番号３９３で示される塩基配列を含有するＤＮＡを単離した。該ＤＮＡを、実施例１６（２）で得られたプラスミドｐＮｄＧ６−ΔＴのＢｇｌＩＩ切断部位とＳａｃＩ切断部位との間に挿入することにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく該ＤＮＡが連結されてなるキメラＤＮＡがＣＲ１６Ｇ６プロモーターの下流に結合されてなるプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１６０９ｓｏｙ（図６１）を得た。
次いで、該プラスミドを大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセル（宝酒造社製）に導入し、アンピシリン耐性株を選抜した。さらに、選抜されたアンピシリン耐性株に含まれるプラスミドの塩基配列をＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｖ３．０（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）およびＤＮＡシークエンサー３１００（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結果、プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１６０９ｓｏｙは配列番号３９３で示される塩基配列を有することが確認された。
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓを有する直接導入用葉緑体発現プラスミドの構築（２）
本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓをパーティクルガン法で植物に導入するためのプラスミドとして、ダイズ（ｃｖ．Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドを構築した。まず、実施例７５（１）で得られたプラスミドｐＵＣｒＳｔ１６０９ｓｏｙの制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉ切断部位に、配列番号４０２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号４０３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをアニールさせることで得られるリンカーＥｃｏＴ２２Ｉ−１２ａａ−ＥｃｏＴ２２Ｉ（図６２）を挿入することにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドｐＵＣｒＳｔ１２−１６０９ｓｏｙ（図６３）を得た。
得られたプラスミドｐＵＣｒＳｔ１２−１６０９ｓｏｙを制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩとで消化し、配列番号３９３で示される塩基配列を含有するＤＮＡを単離した。該ＤＮＡを、実施例１６（２）で得られたプラスミドｐＮｄＧ６−ΔＴのＢｇｌＩＩ切断部位とＳａｃＩ切断部位との間に挿入することにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく該ＤＮＡが連結されてなるキメラＤＮＡがＣＲ１６Ｇ６プロモーターの下流に結合されてなるプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１６０９ｓｏｙ（図６４）を得た。
次いで、該プラスミドを大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセル（宝酒造社製）に導入し、アンピシリン耐性株を選抜した。選抜されたアンピシリン耐性株に含まれるプラスミドの塩基配列をＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｖ３．０（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）およびＤＮＡシークエンサー３１００（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結果、プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１６０９ｓｏｙは配列番号３９３で示される塩基配列を有することが確認された。
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓのダイズへの導入
実施例４７（３）に記載した方法に従って、ダイズ（品種；ＦａｙｅｔｔｅおよびＪａｃｋ）の球状型胚を調製した。
得られた球状型胚を新しい不定胚増殖培地に移植し、２〜３日培養した。この球状型胚に、実施例７５（１）で作製されたプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１６０９ｓｏｙまたは実施例７５（２）で作製されたプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１６０９ｓｏｙを、実施例１７（２）に記載の方法に従って導入した。
（４）不定胚のハイグロマイシンによる選抜
実施例４７（４）に記載した方法に従って、実施例７５（３）で得られた遺伝子導入後の球状型胚のハイグロマイシンによる選抜を行なう。
（５）不定胚の化合物（ＩＩ）による選抜
実施例４７（５）に記載した方法に従って、実施例７５（３）で得られた遺伝子導入後の球状型胚の化合物（ＩＩ）による選抜を行なう。
（６）不定胚からの個体再生、順化および栽培
実施例４７（６）に記載の方法に従って、実施例７５（４）または（５）で選抜された球状型胚からの個体再生を行なう。
本葉を展開し発根した個体について、実施例１７（６）に記載の方法に従って、順化および栽培を行い、採種する。
（７）雑草防除活性を有する化合物（ＩＩ）に対する耐性の評価
実施例１７（４）に記載した方法に従って、実施例７５（６）で得られた再生植物個体の化合物（ＩＩ）に対する耐性度を評価する。
（８）本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓを有するアグロバクテリウム導入用葉緑体発現プラスミドの構築
本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓをアグロバクテリウム法で植物へ導入するためのプラスミドを構築した。上記プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１６０９ｓｏｙを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩとで消化し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むＤＮＡを単離した。このＤＮＡを、実施例１８で得られたバイナリーベクタープラスミドｐＢＩ１２１Ｓの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＥｃｏＲＩ切断部位との間に挿入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１６０９ｓｏｙ（図６５）を得た。また、上記プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１６０９ｓｏｙを制限酵素ＮｏｔＩで消化し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むＤＮＡを単離した。このＤＮＡを上記バイナリーベクタープラスミドｐＢＩ１２１Ｓの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＥｃｏＲＩ切断部位との間に挿入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１６０９ｓｏｙ（図６６）を得た。
（９）本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓのタバコへの導入
実施例７５（８）で得たプラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１６０９ｓｏｙおよびプラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１６０９ｓｏｙ　を用いて本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓをアグロバクテリウム法でタバコへ導入した。
まず、実施例１９に記載の方法に従って、プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１６０９ｓｏｙおよびｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１６０９ｓｏｙをそれぞれ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４０４　株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　社製）に導入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１６０９ｓｏｙまたはｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１６０９ｓｏｙを持つ組換えアグロバクテリウム株をそれぞれ単離した。
次いで、上記のプラスミドを持つ組換えアグロバクテリウム株を用いて、実施例４７（９）に記載の方法に従って、タバコへの遺伝子導入を行い、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１６０９ｓｏｙまたはｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１６０９ｓｏｙのＴ−ＤＮＡ　領域が組み込まれた組換えタバコ個体をそれぞれ取得する。
（１０）本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓ組換えタバコの葉片を用いた耐性の評価
実施例７５（９）で取得された組換えタバコ個体から葉片を採取し、これを用いて実施例７４（１０）と同様の方法で、組換えタバコの化合物（ＩＩ）または化合物（ＸＩＩ）に対する耐性を評価する。
【０２３７】
【発明の効果】
本発明により、ＰＰＯ阻害型雑草防除活性化合物を代謝し該化合物を防除活性のより低い化合物に変換する能力を有する蛋白質、前記蛋白質をコードするＤＮＡ、前記蛋白質を発現する雑草防除活性化合物耐性植物等が提供可能となる。
【０２３８】
［配列表フリーテキスト］
配列番号３５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８９
発現ベクター構築のために設計されたオリゴヌクレオチドリンカー
配列番号９０
発現ベクター構築のために設計されたオリゴヌクレオチドリンカー
配列番号９１
発現ベクター構築のために設計されたオリゴヌクレオチドリンカー
配列番号９２
発現ベクター構築のために設計されたオリゴヌクレオチドリンカー
配列番号９３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号９４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号９５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号９６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号９７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号９８
発現ベクター構築のために設計されたオリゴヌクレオチドリンカー
配列番号９９
発現ベクター構築のために設計されたオリゴヌクレオチドリンカー
配列番号１００
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３４
発現ベクター構築のために設計されたオリゴヌクレオチドリンカー
配列番号１３５
発現ベクター構築のために設計されたオリゴヌクレオチドリンカー
配列番号１６１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８６
ＤＮＡ塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８７
ＤＮＡ塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８８
ＤＮＡ塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８９
ＤＮＡ塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２００
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２１０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２１１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２１２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２１３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２１４
配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする設計されたポリヌクレオチド
配列番号２６５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２６６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２６７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２６８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２６９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７６
ＤＮＡ塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７７
ＤＮＡ塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８１
ＤＮＡ塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８８
ＤＮＡ塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３００
ＤＮＡ塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０８
ＤＮＡ塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３１０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３１１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３１２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３１３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３１４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３１５
ＤＮＡ塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３１６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３１７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３１８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３１９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３２０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３２１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３２２
ＤＮＡ塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３２３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３２４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３２５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３２６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３２７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３２８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３２９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３５０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３５１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３５２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３５３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３５４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３５５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３５６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３５７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３５８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３５９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３６０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３６１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３６２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３６３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３６４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３６５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３６６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３６７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３６８
配列番号２２２で示されるアミノ酸配列をコードする設計されたポリヌクレオチド
配列番号３６９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３９０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３９１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３９２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３９３
配列番号２２４で示されるアミノ酸配列をコードする設計されたポリヌクレオチド
配列番号３９４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３９５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３９６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３９７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３９８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３９９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４００
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４０１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４０２
発現ベクター構築のために設計されたオリゴヌクレオチドリンカー
配列番号４０３
発現ベクター構築のために設計されたオリゴヌクレオチドリンカー
【０２３９】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明ＤＮＡ（Ａ１）および本発明ＤＮＡ（Ｂ１）の取得に用いたＰＣＲプライマーのアニーリング位置を示す図である。各数字はプライマーの塩基配列を示す配列番号を示す。矢印はその配列番号で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング位置および該プライマーからのＤＮＡポリメラーゼ反応の伸長方向を示し、点線は前記プライマーを用いたＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを表す。太線は染色体ＤＮＡライブラリー構築に用いられたベクターのＤＮＡ挿入部位近傍領域を表す。
【図２】本発明ＤＮＡ（Ａ２）および本発明ＤＮＡ（Ｂ２）の取得に用いたＰＣＲプライマーのアニーリング位置を示す図である。各数字はプライマーの塩基配列を示す配列番号を示す。矢印はその配列番号で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング位置および該プライマーからのＤＮＡポリメラーゼ反応の伸長方向を示し、点線は前記プライマーを用いたＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを表す。太線は染色体ＤＮＡライブラリー構築に用いられたベクターのＤＮＡ挿入部位近傍領域を表す。
【図３】本発明ＤＮＡ（Ａ４）および本発明ＤＮＡ（Ｂ４）の取得に用いたＰＣＲプライマーのアニーリング位置を示す図である。各数字はプライマーの塩基配列を示す配列番号を示す。矢印はその配列番号で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング位置および該プライマーからのＤＮＡポリメラーゼ反応の伸長方向を示し、点線は前記プライマーを用いたＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを表す。太線は染色体ＤＮＡライブラリー構築に用いられたベクターのＤＮＡ挿入部位近傍領域を表す。ただし、５７で示されるオリゴヌクレオチドプライマーは、染色体ＤＮＡライブラリー構築に用いられたベクターのＤＮＡ挿入部位近傍領域にアニーリングするプライマーであり、本発明ＤＮＡ（Ａ４）にアニーリングするものではない。
【図４】プラスミドｐＫＳＮ２の制限酵素地図を示す図である。
【図５】プラスミドｐＣＲｒＳｔ１２の制限酵素地図を示す図である。
【図６】プラスミドｐＣＲ６５７ＥＴの制限酵素地図を示す図である。
【図７】プラスミドｐＣＲ６５７ＦＥＴの制限酵素地図を示す図である。
【図８】プラスミドｐＣＲ６５７Ｂｓの制限酵素地図を示す図である。
【図９】プラスミドｐＣＲ６５７ＦＢｓの制限酵素地図を示す図である。
【図１０】プラスミドｐＵＣｒＳｔ１２の制限酵素地図を示す図である。
【図１１】プラスミドｐＵＣｒＳｔ６５７の制限酵素地図を示す図である。
【図１２】プラスミドｐＵＣｒＳｔ６５７Ｆの制限酵素地図を示す図である。
【図１３】プラスミドｐＵＣＣＲ１６Ｇ６−ｐ／ｔの制限酵素地図を示す図である。
【図１４】配列番号８９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号９０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとがアニールしてなるリンカーＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩの構造を示す図である。
【図１５】プラスミドｐＵＣＣＲ１６Ｇ６−ｐ／ｔΔの制限酵素地図を示す図である。
【図１６】配列番号９１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号９２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとがアニールしてなるリンカーＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩの構造を示す図である。
【図１７】プラスミドｐＮｄＧ６−ΔＴの制限酵素地図を示す図である。
【図１８】プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７の制限酵素地図を示す図である。
【図１９】プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７Ｆの制限酵素地図を示す図である。
【図２０】プラスミドｐＫＦｒＳｔ１２の制限酵素地図を示す図である。
【図２１】プラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−６５７の制限酵素地図を示す図である。
【図２２】プラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−６５７Ｆの制限酵素地図を示す図である。
【図２３】プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７の制限酵素地図を示す図である。
【図２４】プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７Ｆの制限酵素地図を示す図である。
【図２５】配列番号９８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号９９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとがアニールしてなるリンカーＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩの構造を示す図である。
【図２６】プラスミドｐＢＩ１２１Ｓの制限酵素地図を示す図である。
【図２７】プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７の制限酵素地図を示す図である。
【図２８】プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７Ｆの制限酵素地図を示す図である。
【図２９】プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７の制限酵素地図を示す図である。
【図３０】プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７Ｆの制限酵素地図を示す図である。
【図３１】プラスミドｐＣＲ９２３Ｓｐの制限酵素地図を示す図である。
【図３２】プラスミドｐＮｄＧ６−ｒＳｔ１２の制限酵素地図を示す図である。
【図３３】プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−９２３の制限酵素地図を示す図である。
【図３４】プラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−９２３の制限酵素地図を示す図である。
【図３５】プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−９２３の制限酵素地図を示す図である。
【図３６】プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−９２３の制限酵素地図を示す図である。
【図３７】プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−９２３の制限酵素地図を示す図である。
【図３８】プラスミドｐＣＲ６７１ＥＴの制限酵素地図を示す図である。
【図３９】プラスミドｐＣＲ６７１Ｂｓの制限酵素地図を示す図である。
【図４０】プラスミドｐＵＣｒＳｔ６７１の制限酵素地図を示す図である。
【図４１】プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６７１の制限酵素地図を示す図である。
【図４２】プラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−６７１の制限酵素地図を示す図である。
【図４３】プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６７１の制限酵素地図を示す図である。
【図４４】プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６７１の制限酵素地図を示す図である。
【図４５】プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６７１の制限酵素地図を示す図である。
【図４６】本発明ＤＮＡ（Ａ）の部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲにより増幅されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で検出した結果を示す図面代用写真である。レーン１、７、８、１２、１９、２６、２７、３２、３７、４２、および４７にはＤＮＡマーカー（φ１７４／ＨａｅＩＩＩ分解物）が泳動された。その他のレーンには、表２０および表２１に示される試料が泳動された。
【図４７】配列番号１３４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１３５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとがアニールしてなるリンカーの構造を示す図である。
【図４８】プラスミドｐＵＣｒＳｔ６５７ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図４９】プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図５０】プラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−６５７ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図５１】プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図５２】プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図５３】プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図５４】プラスミドｐＵＣｒＳｔ１５８４ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図５５】プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１５８４ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図５６】プラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−１５８４ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図５７】プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１５８４ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図５８】プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１５８４ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図５９】プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１５８４ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図６０】プラスミドｐＵＣｒＳｔ１６０９ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図６１】プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１６０９ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図６２】配列番号４０２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号４０３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとがアニールしてなるリンカーＥｃｏＴ２２Ｉ−１２ａａ−ＥｃｏＴ２２Ｉの構造を示す図である。
【図６３】プラスミドｐＵＣｒＳｔ１２−１６０９ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図６４】プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１６０９ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図６５】プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１６０９ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図６６】プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１６０９ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【符号の説明】
ＤＮＡ　Ａ１：本発明ＤＮＡ（Ａ１）
ＤＮＡ　Ａ２：本発明ＤＮＡ（Ａ２）
ＤＮＡ　Ａ３：本発明ＤＮＡ（Ａ３）
ＤＮＡ　Ａ４：本発明ＤＮＡ（Ａ４）
ＤＮＡ　Ｂ１：本発明ＤＮＡ（Ｂ１）
ＤＮＡ　Ｂ２：本発明ＤＮＡ（Ｂ２）
ＤＮＡ　Ｂ４：本発明ＤＮＡ（Ｂ４）
ＤＮＡ　Ａ１Ｓ：本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓ
ＤＮＡ　Ａ２３Ｓ：本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓ
ＤＮＡ　Ａ２５Ｓ：本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓ
ｔａｃ　ｐ：ｔａｃ　プロモーター
ｒｒｎＢ　ｔ：ｒｒｎＢ　ターミネーター
ＣｏｌＥ１　ｏｒｉ：プラスミドＣｏｌＥ１の複製開始点
Ａｍｐ^{ｒ ：}アンピシリン耐性遺伝子
ダイズＲｕＢＰＣｓｓＣＴＰ：ダイズ（ｃｖ．Ｊａｃｋ）のｒｉｂｕｌｏｓｅ−１，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ小サブユニットの葉緑体移行ペプチドをコードする塩基配列
１２ａａ：ダイズ（ｃｖ．Ｊａｃｋ）のｒｉｂｕｌｏｓｅ−１，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ小サブユニットの葉緑体移行ペプチドに続く成熟蛋白質の１２アミノ酸をコードする塩基配列
Ｋｍ^ｒ：カナマイシン耐性遺伝子
Ｆ１　ｏｒｉ：プラスミドＦ１の複製開始点
ＣＲ１６Ｇ６ｐ：ＣＲ１６Ｇ６プロモーター
ＣＲ１６ｔ：ＣＲ１６ターミネーター
ＣＲ１６ｔΔ：制限酵素ＳｃａＩ切断部位より下流の塩基配列がＣＲ１６ターミネーターから除去されてなるＤＮＡ
ＣＲ１６Ｇ６ｐΔ：制限酵素ＮｄｅＩ切断部位より上流の塩基配列がＣＲ１６Ｇ６プロモーターから除去されてなるＤＮＡ
ＮＯＳｐ：ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター
ＮＰＴＩＩ：カナマイシン耐性遺伝子
ＮＯＳｔ：ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター
ＧＵＳ：β−グルクロニダーゼ遺伝子
ＲＢ：Ｔ−ＤＮＡの右境界配列
ＬＢ：Ｔ−ＤＮＡの左境界配列
ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｓｐＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＴ２２１、ＳｐｈＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩ、ＢｇｌＩＩ、ＮｏｔＩ、ＳｃａＩ：各々の制限酵素の切断部位[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a protein having the ability to metabolize a weed controlling compound (weed controlling agent metabolizing protein), its gene and its use.
[0002]
[Prior art]
The weed controlling agent is used by diluting a necessary amount at the time of spraying, but sometimes a surplus residual liquid may be generated. In addition, the sprayed weed control agent may remain in plant residues or soil for a while after spraying.
In addition, when a weed controlling agent is used, it may be difficult to clearly distinguish between crops and closely related weeds and selectively control only weeds.
[Non-patent document 1]
Science, 5 (3), 116 (2000)
[Non-patent document 2]
Pesticide Science, 55, 867 (1999)
[Patent Document 1]
U.S. Pat. No. 5,212,296
[Patent Document 2]
U.S. Pat. No. 5,349,127
[Patent Document 3]
U.S. Pat. No. 5,179,013
[Patent Document 4]
Published International Patent Application No. 00/17352
[Patent Document 5]
Published International Patent Application No. 00/00585
[Patent Document 6]
Published International Patent Application No. 00/00502
[Patent Document 7]
International Patent Application No. 99/19493
[Patent Document 8]
U.S. Pat. No. 6,121,512
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
In the former, weed control agents have been originally confirmed to be safe, so a small amount of residual liquid or residue has a small effect on the environment and the growth of the next crop to be cultivated, but is included in these If there is a method for converting a weed controlling compound to a compound having a lower controlling activity, for example, the above-described treatment for inactivating the residual liquid and the residual component can be performed at any time.
In the latter case, development of a new method for imparting a weed control agent resistance to a target plant is desired.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
Under such circumstances, the present inventors have conducted intensive studies, and as a result, it has been found that a specific protein is a protoporphyrinogen oxidase (hereinafter sometimes referred to as PPO) inhibitory type represented by the following general formula (I). The present inventors have found that a weed controlling compound can be metabolized and converted to a compound having a lower weed controlling activity.
That is, the present invention
1. DNA encoding a weed controlling metabolic protein selected from the group consisting of:
<Protein group>
(A1) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(A2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(A3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(A4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108;
(A5) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and the formula (A5) in the presence of an electron transfer system from an electron donor. II)

With a compound of formula (III)

A protein having an ability to convert into a compound represented by the formula:
(A6) an electron donor having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108; A protein having the ability to convert a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system.
(A11) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159;
(A12) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160;
(A13) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136.
(A14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137.
(A15) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138.
(A16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 215.
(A17) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 216.
(A18) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 217.
(A19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 218,
(A20) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 219.
(A21) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 220.
(A22) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 221;
(A23) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222;
(A24) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 223;
(A25) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224;
(A26) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 159, 136, 137, 138, 217, 219, 220, 221 or 223, or SEQ ID NOs: 160, 215, 216; A compound having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 218, 222 or 224, and having the formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor; Having the ability to convert to the compound represented by the above formula (III).
(A27) 90% or more of any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224 A compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor, having an amino acid sequence encoded by a base sequence having the sequence identity of A protein that has the ability to convert to
(A28) Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Streptmyces achromogenes, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces thermocoerulescens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaensis, Streptomyces glomerochromogenes, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces ornatus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomyces misaw nensis, Streptomyces @ pallidus, Streptomyces @ roseoubens, Streptomyces @ rutgersensis, Streptomyces @ steffifiburgensis base sequence which is either a primer or a chromosome with the primers. Having an amino acid sequence encoded by a DNA which can be amplified by a polymerase chain reaction using a compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor. A protein capable of converting into the indicated compound.
2. DNA having a base sequence selected from the following group;
<Base sequence group>
(A1) a base sequence represented by SEQ ID NO: 6;
(A2) the base sequence represented by SEQ ID NO: 7;
(A3) a base sequence represented by SEQ ID NO: 8;
(A4) the base sequence represented by SEQ ID NO: 109;
(A5) the base sequence represented by SEQ ID NO: 139,
(A6) the base sequence represented by SEQ ID NO: 140;
(A7) the base sequence represented by SEQ ID NO: 141
(A8) the base sequence represented by SEQ ID NO: 142,
(A9) the base sequence represented by SEQ ID NO: 143;
(A10) the base sequence represented by SEQ ID NO: 225,
(A11) the base sequence represented by SEQ ID NO: 226,
(A12) the base sequence represented by SEQ ID NO: 227,
(A13) the base sequence represented by SEQ ID NO: 228,
(A14) the base sequence represented by SEQ ID NO: 229,
(A15) the base sequence represented by SEQ ID NO: 230,
(A16) the base sequence represented by SEQ ID NO: 231;
(A17) the base sequence represented by SEQ ID NO: 232;
(A18) the base sequence represented by SEQ ID NO: 233,
(A19) the base sequence represented by SEQ ID NO: 234,
(A20) a base sequence having 80% or more sequence identity with any of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 6, 7, 8, or 109, and the above-described formula in the presence of an electron transfer system from an electron donor. A nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of a protein capable of converting the compound represented by (II) into the compound represented by the formula (III).
(A21) at least 90% sequence identity with any of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 139, 140, 141, 142, 143, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, or 234; An amino acid sequence of a protein having the ability to convert a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system from an electron donor. Encoding base sequence.
3. The codon usage of the base sequence encoding the amino acid sequence of the protein whose GC content is 60% or less and 40% or more is plus or minus the codon usage of the gene of the species to which the host cell into which the DNA is introduced belongs. The DNA according to the above 1, wherein the DNA has a nucleotide sequence within 4%;
4. DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 214;
5. DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 368;
6. DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 393;
7. DNA obtained by linking a DNA having a base sequence encoding a signal sequence for translocation to an intracellular organelle upstream of the DNA according to the above item 1 so as to match its reading frame;
8. DNA obtained by operably linking the DNA according to the above 1 and a promoter operable in a host cell;
9. A vector containing the DNA according to the above 1;
10. A method for producing a vector, comprising a step of incorporating the DNA according to the above item 1 into a vector capable of replicating in a host cell;
11. A transformant obtained by introducing the DNA according to the above 1 into a host cell;
12. 12. The transformant according to item 11, wherein the host cell is a microbial cell or a plant cell;
13. A method for producing a transformant, comprising a step of introducing the DNA according to the above item 1 into a host cell;
14． A method for producing a protein having the ability to convert a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III), wherein the transformant according to the above item 11 is cultured and produced. A method comprising recovering a protein;
15. Use of the DNA according to the above item 1 for producing a protein having an ability to convert the compound represented by the formula (II) into the compound represented by the formula (III);
16. A method for imparting resistance to a weed controlling agent to a plant, comprising a step of introducing and expressing the DNA according to the above item 1 in plant cells;
17. The polynucleotide having a partial nucleotide sequence of the DNA or the nucleotide sequence complementary to the partial nucleotide sequence according to the above-mentioned item 1;
18. 18. A method for detecting a DNA encoding a protein having the ability to convert the compound represented by the formula (II) into the compound represented by the formula (III), wherein the DNA according to the above item 1 or the DNA according to the above item 17 is detected. A method comprising, in hybridization using a polynucleotide as a probe, detecting a DNA to which the probe hybridizes;
19. 18. A method for detecting a DNA encoding a protein capable of converting a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III), wherein the polymerase uses the polynucleotide according to the above item 17 as a primer Detecting a DNA amplified in the chain reaction;
20. At least one of the primers is a polynucleotide selected from the group consisting of a polynucleotide having a base sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 124 to 128 and a polynucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 129. The method according to the preceding clause 19,
21. A method for obtaining a DNA encoding a protein having an ability to convert the compound represented by the formula (II) into the compound represented by the formula (III), wherein the DNA is detected by the method described in the above item 18 or 19. A method comprising recovering DNA;
22. A method for screening a cell having a DNA encoding a protein capable of converting a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III), comprising the steps of: A method comprising the step of detecting the DNA by the method as described above;
23. A weed controlling metabolic protein selected from the group consisting of:
<Protein group>
(A1) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(A2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(A3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(A4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108;
(A5) having the amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and in the presence of an electron transfer system from an electron donor, A protein having the ability to convert the compound represented by (II) into the compound represented by formula (III).
(A6) an electron donor having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, 3, or 108; A protein having the ability to convert a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system.
(A11) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159;
(A12) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160;
(A13) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136.
(A14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137.
(A15) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138.
(A16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 215.
(A17) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 216.
(A18) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 217.
(A19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 218,
(A20) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 219.
(A21) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 220.
(A22) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 221;
(A23) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222;
(A24) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 223;
(A25) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224;
(A26) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 159, 136, 137, 138, 217, 219, 220, 221 or 223, or SEQ ID NOs: 160, 215, 216; A compound having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 218, 222 or 224, and having the formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor; Having the ability to convert to the compound represented by the above formula (III).
(A27) 90% or more of any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224 A compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor, having an amino acid sequence encoded by a base sequence having the sequence identity of A protein that has the ability to convert to
(A28) Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Streptmyces achromogenes, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces thermocoerulescens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaensis, Streptomyces glomerochromogenes, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces ornatus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomyces misaw nensis, Streptomyces @ pallidus, Streptomyces @ roseoubens, Streptomyces @ rutgersensis, Streptomyces @ steffifiburgensis base sequence which is either a primer or a chromosome with the primers. Having an amino acid sequence encoded by a DNA which can be amplified by a polymerase chain reaction using a compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor. A protein capable of converting into the indicated compound.
24. An antibody that recognizes a weed control metabolite protein selected from the group consisting of:
<Protein group>
(A1) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(A2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(A3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(A4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108;
(A5) having the amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and in the presence of an electron transfer system from an electron donor, A protein having an ability to convert the compound represented by (II) into the compound represented by the formula (III).
(A6) an electron donor having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, 3, or 108; A protein having the ability to convert a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system.
(A11) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159;
(A12) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160;
(A13) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136.
(A14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137.
(A15) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138.
(A16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 215.
(A17) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 216.
(A18) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 217.
(A19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 218,
(A20) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 219.
(A21) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 220.
(A22) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 221;
(A23) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222;
(A24) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 223;
(A25) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224;
(A26) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 159, 136, 137, 138, 217, 219, 220, 221 or 223, or SEQ ID NOs: 160, 215, 216; A compound having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 218, 222 or 224, and having the formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor; Having the ability to convert to the compound represented by the above formula (III).
(A27) 90% or more of any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224 A compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor, having an amino acid sequence encoded by a base sequence having the sequence identity of A protein that has the ability to convert to
(A28) Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Streptmyces achromogenes, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces thermocoerulescens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaensis, Streptomyces glomerochromogenes, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces ornatus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomyces misaw nensis, Streptomyces @ pallidus, Streptomyces @ roseoubens, Streptomyces @ rutgersensis, Streptomyces @ steffifiburgensis base sequence which is either a primer or a chromosome with the primers. Having an amino acid sequence encoded by a DNA which can be amplified by a polymerase chain reaction using a compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor. A protein capable of converting into the indicated compound.
25. A method for detecting a weed controlling agent metabolic protein selected from the following group,
(1) contacting an antibody recognizing the protein with a test sample;
(2) detecting a complex between the protein and the antibody produced by the contacting;
How to have:
<Protein group>
(A1) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(A2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(A3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(A4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108;
(A5) having the amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and in the presence of an electron transfer system from an electron donor, A protein having an ability to convert the compound represented by (II) into the compound represented by the formula (III).
(A6) an electron donor having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, 3, or 108; A protein having the ability to convert a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system.
(A11) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159;
(A12) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160;
(A13) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136.
(A14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137.
(A15) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138.
(A16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 215.
(A17) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 216.
(A18) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 217.
(A19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 218,
(A20) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 219.
(A21) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 220.
(A22) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 221;
(A23) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222;
(A24) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 223;
(A25) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224;
(A26) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 159, 136, 137, 138, 217, 219, 220, 221 or 223, or SEQ ID NOs: 160, 215, 216; A compound having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 218, 222 or 224, and having the formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor; Having the ability to convert to the compound represented by the above formula (III).
(A27) 90% or more of any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224 A compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor, having an amino acid sequence encoded by a base sequence having the sequence identity of A protein that has the ability to convert to
(A28) Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Streptmyces achromogenes, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces thermocoerulescens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaensis, Streptomyces glomerochromogenes, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces ornatus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomyces misaw nensis, Streptomyces @ pallidus, Streptomyces @ roseoubens, Streptomyces @ rutgersensis, Streptomyces @ steffifiburgensis base sequence which is either a primer or a chromosome with the primers. Having an amino acid sequence encoded by a DNA which can be amplified by a polymerase chain reaction using a compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor. A protein capable of converting into the indicated compound.
26. An analysis / test kit comprising the antibody according to the above item 24;
27. DNA encoding ferredoxin selected from the group consisting of:
<Protein group>
(B1) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12;
(B2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13;
(B3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14;
(B4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 111;
(B5) A ferredoxin having an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 12, 13, 14 or 111.
(B6) Ferredoxin having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 90% or more sequence identity with any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, 13, 14, or 111.
(B7) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 149;
(B8) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 150;
(B9) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 151;
(B10) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 152.
(B11) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 153;
(B12) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 149, 151, 152, 153, 245, 247, 248, 249, 250, 251, or 253 or SEQ ID NO: 150 Ferredoxin having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 252, 254 or 254.
(B13) 90% or more of any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 149, 150, 151, 152, 153, 245, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, or 254 Ferredoxin having an amino acid sequence encoded by an identical nucleotide sequence.
(B14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 245.
(B15) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 247.
(B16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 248.
(B17) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 249;
(B18) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 250;
(B19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 251;
(B20) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 252;
(B21) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 253;
(B22) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 254.
28. DNA having a base sequence selected from the following group;
<Base sequence group>
(B1) the base sequence represented by SEQ ID NO: 15;
(B2) the base sequence represented by SEQ ID NO: 16;
(B3) a base sequence represented by SEQ ID NO: 17;
(B4) the base sequence represented by SEQ ID NO: 112;
(B5) the base sequence represented by SEQ ID NO: 154;
(B6) the base sequence represented by SEQ ID NO: 155;
(B7) a base sequence represented by SEQ ID NO: 156;
(B8) the base sequence represented by SEQ ID NO: 157
(B9) the base sequence represented by SEQ ID NO: 158,
(B10) the base sequence represented by SEQ ID NO: 255
(B11) the base sequence represented by SEQ ID NO: 257.
(B12) the base sequence represented by SEQ ID NO: 258,
(B13) the base sequence represented by SEQ ID NO: 259;
(B14) the base sequence represented by SEQ ID NO: 260
(B15) the base sequence represented by SEQ ID NO: 261;
(B16) the base sequence represented by SEQ ID NO: 262.
(B17) the base sequence represented by SEQ ID NO: 263.
(B18) the base sequence represented by SEQ ID NO: 264,
(B19) 90% of any of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 112, 154, 155, 156, 157, 158, 255, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, or 264 A base sequence having the above sequence identity.
29. A vector containing the DNA according to the above item 28;
30. A transformant obtained by introducing the DNA according to the above item 28 into a host cell;
31. Ferredoxin selected from the group consisting of:
<Protein group>
(B1) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12;
(B2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13;
(B3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14;
(B4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 111;
(B5) A ferredoxin having an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 12, 13, 14 or 111.
(B6) Ferredoxin having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 90% or more sequence identity with any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, 13, 14, or 111.
(B7) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 149;
(B8) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 150;
(B9) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 151;
(B10) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 152.
(B11) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 153;
(B12) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 149, 151, 152, 153, 245, 247, 248, 249, 250, 251 or 253, or SEQ ID NO: 150; Ferredoxin having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 252 or 254.
(B13) 90% or more of any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 149, 150, 151, 152, 153, 245, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, or 254 Ferredoxin having an amino acid sequence encoded by an identical nucleotide sequence.
(B14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 245.
(B15) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 247.
(B16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 248.
(B17) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 249;
(B18) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 250;
(B19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 251;
(B20) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 252;
(B21) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 253;
(B22) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 254.
32. DNA having a base sequence selected from the following group;
<Base sequence group>
(Ab1) the base sequence represented by SEQ ID NO: 9;
(Ab2) the base sequence represented by SEQ ID NO: 10;
(Ab3) the base sequence represented by SEQ ID NO: 11;
(Ab4) the base sequence represented by SEQ ID NO: 110;
(Ab5) the base sequence represented by SEQ ID NO: 144
(Ab6) the base sequence represented by SEQ ID NO: 145
(Ab7) the base sequence represented by SEQ ID NO: 146,
(Ab8) the base sequence represented by SEQ ID NO: 147,
(Ab9) the base sequence represented by SEQ ID NO: 148
(Ab10) the base sequence represented by SEQ ID NO: 235,
(Ab11) the base sequence represented by SEQ ID NO: 236
(Ab12) the base sequence represented by SEQ ID NO: 237.
(Ab13) the base sequence represented by SEQ ID NO: 238,
(Ab14) the base sequence represented by SEQ ID NO: 239,
(Ab15) the base sequence represented by SEQ ID NO: 240
(Ab16) the base sequence represented by SEQ ID NO: 241
(Ab17) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 242.
(Ab18) the base sequence represented by SEQ ID NO: 243;
(Ab19) a base sequence represented by SEQ ID NO: 244;
33. A vector containing the DNA according to the above item 32;
34. A transformant obtained by introducing the DNA according to the preceding item 32 into a host cell;
35. The transformant according to the above item 34, wherein the host cell is a microorganism cell or a plant cell;
36. 32. A method for producing a transformant, comprising a step of introducing the DNA according to the above item 32 into a host cell;
37. A method for producing a protein having the ability to convert a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III), wherein the transformant according to the above item 34 is cultured and produced. A method comprising recovering a protein;
38. A method for controlling weeds, comprising a step of applying a compound represented by the following general formula (I) to a cultivation area of a plant expressing one or more weed controlling metabolic proteins selected from the following groups;

[In the formula, G represents a group represented by any of the following G-1 to G-9.

Here, X represents an oxygen atom or a sulfur atom,
Y represents an oxygen atom or a sulfur atom,
R¹Represents a hydrogen atom or a halogen atom,
R²Is a hydrogen atom, C₁-C₈Alkyl group, C₁-C₈Haloalkyl group, halogen atom, hydroxyl group, -OR⁹{Group, -SH} group, -S (O) pR⁹Group, -COR⁹Group, -CO₂R⁹Group, -C (O) SR⁹Group, -C (O) NR¹¹R¹²Group, -CONH₂Group, -CHO group, -CR⁹= NOR¹⁸Group, -CH = CR¹⁹CO₂R⁹Group, -CH₂CHR¹⁹CO₂R⁹Group, -CO₂N = CR¹³R¹⁴Group, nitro group, cyano group, -NHSO₂R^FifteenGroup, -NHSO₂NHR^FifteenGroup, -NR⁹R²⁰Group, -NH₂Groups or one or more homologous or heterologous C₁-C₄Represents a phenyl group which may be substituted with an alkyl group,
p} represents {0, 1} or {2},
R³Is C₁-C₂Alkyl group, C₁-C₂Haloalkyl group, -OCH₃Group, -SCH₃Group, -OCHF₂Group, a halogen atom, a cyano group, a nitro group, or a halogen atom on the ring, C₁-C₃Alkyl group, C₁-C₃Haloalkyl group, OR²⁸Group, NR¹¹R²⁸Group, SR²⁸Group, cyano group, CO₂R²⁸C substituted with a phenyl group which may be substituted with at least one substituent selected from the group consisting of₁-C₃Represents an alkoxy group,
R⁴Is a hydrogen atom, C₁-C₃Alkyl group or C₁-C₃を represents a haloalkyl group,
R⁵Is a hydrogen atom, C₁-C₃Alkyl group, C₁-C₃Haloalkyl group, cyclopropyl group, vinyl group, C₂Alkynyl group, cyano group, -C (O) R²⁰Group, -CO₂R²⁰Group, -C (O) NR²⁰R²¹Group, -CR¹⁶R¹⁷CN group, -CR¹⁶R¹⁷C (O) R²⁰Group, -CR¹⁶R¹⁷CO₂R²⁰Group, -CR¹⁶R¹⁷C (O) NR²⁰R²¹Group, -CHR¹⁶OH group, -CHR¹⁶OC (O) R²⁰Group or -OCHR¹⁶OC (O) NR²⁰R²¹Represents a group, or represents a group represented by {R when G} is {G-2} or {G-6}⁴And R⁵And the carbon atom to which they are bonded may represent a {C = O} group,
R⁶Is C₁-C₆Alkyl group, C₁-C₆Haloalkyl group, C₂-C₆Alkoxyalkyl group, C₃-C₆Alkenyl group or C₃-C₆を represents an alkynyl group,
R⁷Is a hydrogen atom, C₁-C₆Alkyl group, C₁-C₆Haloalkyl group, halogen atom, -S (O)₂(C₁-C₆Alkyl) group, or —C (＝ O) R²²Represents a group,
R⁸Is a hydrogen atom, C₁-C₈Alkyl group, C₃-C₈Cycloalkyl group, C₃-C₈Alkenyl group, C₃-C₈Alkynyl group, C₁-C₈Haloalkyl group, C₂-C₈Alkoxyalkyl group, C₃-C₈Alkoxyalkoxyalkyl group, C₃-C₈Haloalkynyl group, C₃-C₈Haloalkenyl group, C₁-C₈Alkylsulfonyl group, C₁-C₈Haloalkylsulfonyl group, C₃-C₈{Alkoxycarbonylalkyl group, -S (O)₂NH (C₁-C₈(Alkyl) group, —C (O) R²³Group or R on the phenyl ring²⁴Represents a benzyl group which may be substituted with,
R⁹Is C₁-C₈Alkyl group, C₃-C₈Cycloalkyl group, C₃-C₈Alkenyl group, C₃-C₈Alkynyl group, C₁-C₈Haloalkyl group, C₂-C₈Alkoxyalkyl group, C₂-C₈Alkylthioalkyl group, C₂-C₈Alkylsulfinylalkyl group, C₂-C₈Alkylsulfonylalkyl group, C₄-C₈Alkoxyalkoxyalkyl group, C₄-C₈Cycloalkylalkyl group, C₄-C₈Cycloalkoxyalkyl group, C₄-C₈Alkenyloxyalkyl group, C₄-C₈Alkynyloxyalkyl group, C₃-C₈Haloalkoxyalkyl group, C₄-C₈Haloalkenyloxyalkyl group, C₄-C₈Haloalkynyloxyalkyl group, C₄-C₈Cycloalkylthioalkyl group, C₄-C₈Alkenylthioalkyl group, C₄-C₈Alkynylthioalkyl group,
A halogen atom on the ring, C₁-C₃Alkyl group and C₁-C₃{C substituted with a phenoxy group optionally substituted with at least one substituent selected from the group consisting of haloalkyl groups₁-C₄Alkyl group, halogen atom on the ring, C₁-C₃Alkyl group and C₁-C₃ＣC substituted with a benzyloxy group optionally substituted with at least one substituent selected from the group consisting of a haloalkyl group₁-C₄Alkyl group,
C₄-C₈Trialkylsilylalkyl group, C₂-C₈Cyanoalkyl group, C₃-C₈Halocycloalkyl group, C₃-C₈Haloalkenyl group, C₅-C₈Alkoxyalkenyl group, C₅-C₈Haloalkoxyalkenyl group, C₅-C₈Alkylthioalkenyl group, C₃-C₈Haloalkynyl group, C₅-C₈Alkoxyalkynyl group, C₅-C₈Haloalkoxyalkynyl group, C₅-C₈Alkylthioalkynyl group, C₂-C₈Alkylcarbonyl group,
A halogen atom on the ring, C₁-C₃Alkyl group, C₁-C₃Haloalkyl group, -OR²⁸Group, -NR¹¹R²⁸Group, -SR²⁸Group, cyano group, -CO₂R²⁸A benzyl group optionally substituted with at least one substituent selected from the group consisting of a group or nitro group,
-CR¹⁶R¹⁷COR¹⁰Group, -CR¹⁶R¹⁷CO₂R²⁰Group, -CR¹⁶R¹⁷P (O) (OR¹⁰)₂Group, -CR¹⁶R¹⁷P (S) (OR¹⁰)₂Group, -CR¹⁶R¹⁷C (O) NR¹¹R¹²Group, -CR¹⁶R¹⁷C (O) NH₂Group, -C (= CR²⁶R²⁷) COR¹⁰Group, -C (= CR²⁶R²⁷) CO₂R²⁰Group, -C (= CR²⁶R²⁷) P (O) (OR¹⁰)₂Group, -C (= CR²⁶R²⁷) P (S) (OR¹⁰)₂Group, -C (= CR²⁶R²⁷) C (O) NR¹¹R¹²Group, -C (= CR²⁶R²⁷) C (O) NH₂Group, halogen atom on the ring, C₁-C₆Alkyl group, C₁-C₆Haloalkyl group, C₂-C₆Alkenyl group, C₂-C₆Haloalkenyl group, C₂-C₆Alkynyl group, C₃-C₆Haloalkynyl group, C₂-C₈Alkoxyalkyl group, -OR²⁸Group, -SR²⁸Group, -NR¹¹R²⁸Group, C₃-C₈Alkoxycarbonylalkyl group, C₂-C₄Carboxyalkyl group, -CO₂R²⁸A ring represented by the following Q-1 to Q-7 which may be substituted with at least one substituent selected from the group consisting of a group and a cyano group,

R¹⁰Is C₁-C₆Alkyl group, C₂-C₆Alkenyl group, C₃-C₆Represents an alkynyl group or a tetrahydrofuranyl group,
R¹¹And R¹³Is independently a hydrogen atom, or C₁-C₄Represents an alkyl group,
R¹²Is C₁-C₆Alkyl group, C₃-C₆Cycloalkyl group, C₃-C₆Alkenyl group, C₃-C₆Alkynyl group, C₂-C₆Alkoxyalkyl group, C₁-C₆Haloalkyl group, C₃-C₆Haloalkenyl group, C₃-C₆Haloalkynyl group, halogen atom on the ring, C₁-C₄Alkyl group and C₁-C₄{A phenyl group optionally substituted with at least one substituent selected from the group consisting of alkoxy groups} or {-C} R¹⁶R¹⁷CO₂R²⁵Represents a group
Or
R¹¹And @R¹²And-(CH₂)₅-,-(CH₂)₄-Or -CH₂CH₂OCH₂CH₂-, And in each ring thus formed, C₁-C₃Alkyl group, may be substituted with a substituent selected from the group consisting of a phenyl group and a benzyl group,
R¹⁴Is C₁-C₄An alkyl group or a halogen atom on the ring, C₁-C₃Alkyl group and C₁-C₃表 し represents a phenyl group which may be substituted with at least one substituent selected from the group consisting of a haloalkyl group,
Or
R¹³And @R¹⁴Is the carbon atom to which they are attached and C₃-C₈May represent a cycloalkyl group,
R^FifteenIs C₁-C₄Alkyl group, C₁-C₄Haloalkyl group or C₃-C₆Represents an alkenyl group,
R¹⁶And R¹⁷Is independently a hydrogen atom or C₁-C₄Alkyl group, C₁-C₄Haloalkyl group, C₂-C₄Alkenyl group, C₂-C₄Haloalkenyl group, C₂-C₄Alkynyl group, C₃-C₄Represents a haloalkynyl group,
Or
R¹⁶And R¹⁷Is C and the carbon atom to which they are attached₃-C₆May represent a cycloalkyl group, and in each ring thus formed, a halogen atom,₁-C₃Alkyl group and C₁-C₃May be substituted with at least one substituent selected from the group consisting of a haloalkyl group,
R¹⁸Is a hydrogen atom, C₁-C₆Alkyl group, C₃-C₆Alkenyl group or C₃-C₆を represents an alkynyl group,
R¹⁹Is a hydrogen atom, C₁-C₄Represents an alkyl group or a halogen atom,
R²⁰Is a hydrogen atom, C₁-C₆Alkyl group, C₃-C₆Cycloalkyl group, C₃-C₆Alkenyl group, C₃-C₆Alkynyl group, C₂-C₆Alkoxyalkyl group, C₁-C₆Haloalkyl group, C₃-C₆Haloalkenyl group, C₃-C₆Haloalkynyl group, halogen atom on the ring, C₁-C₄Alkyl group and -OR²⁸A phenyl group optionally substituted with at least one substituent selected from the group consisting of¹⁶R¹⁷CO₂R²⁵Represents a group,
R²¹Is a hydrogen atom, C₁-C₂Alkyl group or -CO₂(C₁-C₄Alkyl) group,
R²²Is a hydrogen atom, C₁-C₆Alkyl group, C₁-C₆Alkoxy group or NH (C₁-C₆(Alkyl) group,
R²³Is C₁-C₆Alkyl group, C₁-C₆Haloalkyl group, C₁-C₆Alkoxy group, NH (C₁-C₆(Alkyl) group, R²⁴A phenyl group which may be substituted with a group, a benzyl group, or a C group;₂-C₈表 し represents a dialkylamino group,
R²⁴Is C₁-C₆{Alkyl groups, 1} to {2} halogen atoms, C₁-C₆Alkoxy group or CF₃Represents a group,
R²⁵Is a hydrogen atom, C₁-C₆Alkyl group, C₁-C₆Haloalkyl group, C₃-C₆Alkenyl group, C₃-C₆Haloalkenyl group, C₃-C₆Alkynyl group or C₃-C₆Represents a haloalkynyl group,
R²⁶And R²⁷Are each independently a hydrogen atom or C₁-C₄Alkyl group, C₁-C₄Haloalkyl group, C₂-C₄Alkenyl group, C₂-C₄Haloalkenyl group, C₂-C₄Alkynyl group, C₃-C₄Haloalkynyl group, -OR²⁸Group, -NHR²⁸Group, or -SR²⁸Represents a group, or
R²⁶And R²⁷Is C and the carbon atom to which they are attached₃-C₆May represent a cycloalkyl group, and in each ring thus formed, a halogen atom,₁-C₃Alkyl group and C₁-C₃May be substituted with at least one substituent selected from the group consisting of a haloalkyl group,
R²⁸Is a hydrogen atom, C₁-C₆Alkyl group, C₁-C₆Haloalkyl group, C₃-C₆Alkenyl group, C₃-C₆Haloalkenyl group, C₃-C₆Alkynyl group, C₃-C₆Haloalkynyl group, C₂-C₄Carboxyalkyl group, C₃-C₈Alkoxycarbonylalkyl group, C₃-C₈Haloalkoxycarbonylalkyl group, C₅-C₉Alkenyloxycarbonylalkyl group, C₅-C₉Haloalkenyloxycarbonylalkyl group, C₅-C₉Alkynyloxycarbonylalkyl group, C₅-C₉Haloalkynyloxycarbonylalkyl group, C₅-C₉Cycloalkoxycarbonylalkyl group or C₅-C₉Represents a halocycloalkoxycarbonylalkyl group. ]
<Protein group>
(A1) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(A2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(A3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(A4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108;
(A5) having the amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and in the presence of an electron transfer system from an electron donor, A protein having the ability to convert the compound represented by (II) into the compound represented by formula (III).
(A6) an electron donor having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, 3, or 108; A protein having the ability to convert a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system.
(A7) a DNA having a base sequence encoding any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and an amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions, And a protein capable of converting a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system from an electron donor.
(A8) A primer having a base sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 124 to 128 and a primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 129 using chromosomal DNA of a microorganism belonging to the genus Streptomyces or Saccharopolyspora as a template A compound having an amino acid sequence encoded by DNA that can be amplified by a polymerase chain reaction using a compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor. A protein capable of converting into the indicated compound.
(A9) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(A11) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159;
(A12) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160;
(A13) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136.
(A14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137.
(A15) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138.
(A16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 215.
(A17) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 216.
(A18) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 217.
(A19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 218,
(A20) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 219.
(A21) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 220.
(A22) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 221;
(A23) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222;
(A24) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 223;
(A25) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224;
(A26) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 159, 136, 137, 138, 217, 219, 220, 221 or 223, or SEQ ID NOs: 160, 215, 216; A compound having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 218, 222 or 224, and having the formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor; Having the ability to convert to the compound represented by the above formula (III).
(A27) 90% or more of any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224 A compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor, having an amino acid sequence encoded by a base sequence having the sequence identity of A protein that has the ability to convert to
39. A method for controlling weeds, comprising a step of applying a compound represented by the above general formula (I) to a cultivation area of a plant expressing one or more weed controlling agent metabolic proteins selected from the following groups;
<Protein group>
(A1) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(A2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(A3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(A4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108;
(A5) having the amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and in the presence of an electron transfer system from an electron donor, A protein having an ability to convert the compound represented by (II) into the compound represented by the formula (III).
(A6) an electron donor having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, 3, or 108; A protein having the ability to convert a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system.
(A11) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159;
(A12) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160;
(A13) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136.
(A14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137.
(A15) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138.
(A16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 215.
(A17) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 216.
(A18) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 217.
(A19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 218,
(A20) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 219.
(A21) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 220.
(A22) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 221;
(A23) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222;
(A24) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 223;
(A25) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224;
(A26) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 159, 136, 137, 138, 217, 219, 220, 221 or 223, or SEQ ID NOs: 160, 215, 216; A compound having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 218, 222 or 224, and having the formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor; Having the ability to convert to the compound represented by the above formula (III).
(A27) 90% or more of any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224 A compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor, having an amino acid sequence encoded by a base sequence having the sequence identity of A protein that has the ability to convert to
(A28) Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Streptmyces achromogenes, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces thermocoerulescens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaensis, Streptomyces glomerochromogenes, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces ornatus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomyces misaw nensis, Streptomyces @ pallidus, Streptomyces @ roseoubens, Streptomyces @ rutgersensis, Streptomyces @ steffifiburgensis base sequence which is either a primer or a chromosome with the primers. Having an amino acid sequence encoded by a DNA which can be amplified by a polymerase chain reaction using a compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor. A protein capable of converting into the indicated compound.
40. A method for evaluating the degree of resistance of a cell to a compound represented by the general formula (I),
(1) a step of contacting a cell expressing one or more weed control metabolic proteins selected from the following groups with the compound;
(2) a step of evaluating the degree of damage to the cells that have come into contact with the compound in step (1)
A method characterized by having:
<Protein group>
(A1) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(A2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(A3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(A4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108;
(A5) having the amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and in the presence of an electron transfer system from an electron donor, A protein having the ability to convert the compound represented by (II) into the compound represented by formula (III).
(A6) an electron donor having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, 3, or 108; A protein having the ability to convert a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system.
(A7) a DNA having a base sequence encoding any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and an amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions, And a protein capable of converting a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system from an electron donor.
(A8) A primer having a base sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 124 to 128 and a primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 129 using chromosomal DNA of a microorganism belonging to the genus Streptomyces or Saccharopolyspora as a template A compound having an amino acid sequence encoded by DNA that can be amplified by a polymerase chain reaction using a compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor. A protein capable of converting into the indicated compound.
(A9) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(A11) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159;
(A12) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160;
(A13) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136.
(A14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137.
(A15) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138.
(A16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 215.
(A17) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 216.
(A18) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 217.
(A19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 218,
(A20) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 219.
(A21) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 220.
(A22) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 221;
(A23) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222;
(A24) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 223;
(A25) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224;
(A26) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 159, 136, 137, 138, 217, 219, 220, 221 or 223, or SEQ ID NOs: 160, 215, 216; A compound having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 218, 222 or 224, and having the formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor; Having the ability to convert to the compound represented by the above formula (III).
(A27) 90% or more of any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224 A compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor, having an amino acid sequence encoded by a base sequence having the sequence identity of A protein that has the ability to convert to
41. 41. The method according to the above item 40, wherein the cell is a microorganism cell or a plant cell;
42. A method for selecting cells exhibiting resistance to the compound represented by the general formula (I), comprising a step of selecting cells based on the degree of resistance evaluated by the method described in the above item 40. Method;
43. A weed controlling agent-resistant cell or a culture thereof selected by the method according to the preceding item 42;
44. A method for evaluating the degree of plant resistance to a compound represented by the general formula (I),
(1) a step of contacting a plant expressing one or more weed control metabolic proteins selected from the following groups with the compound;
(2) a step of evaluating the degree of injury of the plant that has come into contact with the compound in the step (1)
A method characterized by having:
<Protein group>
(A1) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(A2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(A3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(A4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108;
(A5) having the amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and in the presence of an electron transfer system from an electron donor, A protein having the ability to convert the compound represented by (II) into the compound represented by formula (III).
(A6) an electron donor having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, 3, or 108; A protein having the ability to convert a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system.
(A7) a DNA having a base sequence encoding any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and an amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions, And a protein capable of converting a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system from an electron donor.
(A8) A primer having a base sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 124 to 128 and a primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 129 using chromosomal DNA of a microorganism belonging to the genus Streptomyces or Saccharopolyspora as a template A compound having an amino acid sequence encoded by DNA that can be amplified by a polymerase chain reaction using a compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor. A protein capable of converting into the indicated compound.
(A9) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(A11) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159;
(A12) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160;
(A13) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136.
(A14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137.
(A15) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138.
(A16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 215.
(A17) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 216.
(A18) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 217.
(A19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 218,
(A20) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 219.
(A21) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 220.
(A22) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 221;
(A23) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222;
(A24) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 223;
(A25) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224;
(A26) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 159, 136, 137, 138, 217, 219, 220, 221 or 223, or SEQ ID NOs: 160, 215, 216; A compound having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 218, 222 or 224, and having the formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor; Having the ability to convert to the compound represented by the above formula (III).
(A27) 90% or more of any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224 A compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor, having an amino acid sequence encoded by a base sequence having the sequence identity of A protein that has the ability to convert to
45. A method for selecting a plant showing resistance to the compound represented by the general formula (I), comprising a step of selecting a plant based on the degree of resistance evaluated by the method described in the above item 44. Method;
46. The weed control agent-resistant plant or progeny thereof selected by the method of the preceding item 45;
47. A method for treating a compound represented by the above general formula (I), wherein the compound comprises, in the presence of an electron transfer system from an electron donor, one or more weed-controlling metabolic proteins selected from the following groups: A method characterized by acting
<Protein group>
(A1) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(A2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(A3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(A4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108;
(A5) having the amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and in the presence of an electron transfer system from an electron donor, A protein having the ability to convert the compound represented by (II) into the compound represented by formula (III).
(A6) an electron donor having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, 3, or 108; A protein having the ability to convert a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system.
(A7) a DNA having a base sequence encoding any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and an amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions, And a protein capable of converting a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system from an electron donor.
(A8) A primer having a base sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 124 to 128 and a primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 129 using chromosomal DNA of a microorganism belonging to the genus Streptomyces or Saccharopolyspora as a template A compound having an amino acid sequence encoded by DNA that can be amplified by a polymerase chain reaction using a compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor. A protein capable of converting into the indicated compound.
(A9) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(A11) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159;
(A12) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160;
(A13) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136.
(A14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137.
(A15) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138.
(A16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 215.
(A17) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 216.
(A18) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 217.
(A19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 218,
(A20) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 219.
(A21) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 220.
(A22) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 221;
(A23) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222;
(A24) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 223;
(A25) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224;
(A26) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 159, 136, 137, 138, 217, 219, 220, 221 or 223, or SEQ ID NOs: 160, 215, 216; A compound having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 218, 222 or 224, and having the formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor; Having the ability to convert to the compound represented by the above formula (III).
(A27) 90% or more of any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224 A compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor, having an amino acid sequence encoded by a base sequence having the sequence identity of A protein that has the ability to convert to
48. 47. The method according to the above item 47, wherein the compound is brought into contact with a transformant obtained by introducing a DNA encoding a weed controlling agent metabolic protein into a host cell at a position where the protein can be expressed;
49. Use of a weed controlling metabolic protein selected from the following group for treating the compound represented by the above general formula (I);
<Protein group>
(A1) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(A2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(A3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(A4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108;
(A5) having the amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and in the presence of an electron transfer system from an electron donor, A protein having the ability to convert the compound represented by (II) into the compound represented by formula (III).
(A6) an electron donor having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, 3, or 108; A protein having the ability to convert a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system.
(A7) a DNA having a base sequence encoding any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and an amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions, And a protein capable of converting a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system from an electron donor.
(A8) A primer having a base sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 124 to 128 and a primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 129 using chromosomal DNA of a microorganism belonging to the genus Streptomyces or Saccharopolyspora as a template A compound having an amino acid sequence encoded by DNA that can be amplified by a polymerase chain reaction using a compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor. A protein capable of converting into the indicated compound.
(A9) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(A11) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159;
(A12) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160;
(A13) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136.
(A14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137.
(A15) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138.
(A16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 215.
(A17) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 216.
(A18) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 217.
(A19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 218,
(A20) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 219.
(A21) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 220.
(A22) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 221;
(A23) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222;
(A24) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 223;
(A25) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224;
(A26) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 159, 136, 137, 138, 217, 219, 220, 221 or 223, or SEQ ID NOs: 160, 215, 216; A compound having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 218, 222 or 224, and having the formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor; Having the ability to convert to the compound represented by the above formula (III).
(A27) 90% or more of any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224 A compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor, having an amino acid sequence encoded by a base sequence having the sequence identity of A protein that has the ability to convert to
50. Use of a nucleic acid encoding a weed controlling metabolic protein selected from the following group for treating the compound represented by the above general formula (I);
<Protein group>
(A1) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(A2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(A3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(A4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108;
(A5) having the amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and in the presence of an electron transfer system from an electron donor, A protein having the ability to convert the compound represented by (II) into the compound represented by formula (III).
(A6) an electron donor having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, 3, or 108; A protein having the ability to convert a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system.
(A7) a DNA having a base sequence encoding any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and an amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions, And a protein capable of converting a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system from an electron donor.
(A8) A primer having a base sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 124 to 128 and a primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 129 using chromosomal DNA of a microorganism belonging to the genus Streptomyces or Saccharopolyspora as a template A compound having an amino acid sequence encoded by DNA that can be amplified by a polymerase chain reaction using a compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor. A protein capable of converting into the indicated compound.
(A9) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(A11) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159;
(A12) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160;
(A13) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136.
(A14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137.
(A15) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138.
(A16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 215.
(A17) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 216.
(A18) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 217.
(A19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 218,
(A20) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 219.
(A21) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 220.
(A22) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 221;
(A23) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222;
(A24) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 223;
(A25) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224;
(A26) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 159, 136, 137, 138, 217, 219, 220, 221 or 223, or SEQ ID NOs: 160, 215, 216; A compound having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 218, 222 or 224, and having the formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor; Having the ability to convert to the compound represented by the above formula (III).
(A27) 90% or more of any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224 A compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor, having an amino acid sequence encoded by a base sequence having the sequence identity of A protein that has the ability to convert to
Is provided.
[0005]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
A weed control metabolite protein (hereinafter sometimes referred to as the present protein (A)) selected from the following protein group is a compound represented by the above formula (II) (hereinafter referred to as a compound (II)). Is converted to a compound represented by the above formula (III) (hereinafter sometimes referred to as compound (III)).
<Protein group>
(A1) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(A2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(A3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(A4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108;
(A5) having the amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and in the presence of an electron transfer system from an electron donor, A protein having the ability to convert the compound represented by (II) into the compound represented by formula (III).
(A6) an electron donor having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, 3, or 108; A protein having the ability to convert a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system.
(A11) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159;
(A12) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160;
(A13) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136.
(A14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137.
(A15) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138.
(A16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 215.
(A17) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 216.
(A18) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 217.
(A19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 218,
(A20) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 219.
(A21) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 220.
(A22) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 221;
(A23) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222;
(A24) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 223;
(A25) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224;
(A26) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 159, 136, 137, 138, 217, 219, 220, 221 or 223, or SEQ ID NOs: 160, 215, 216; A compound having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 218, 222 or 224, and having the formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor; Having the ability to convert to the compound represented by the above formula (III).
(A27) 90% or more of any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224 A compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor, having an amino acid sequence encoded by a base sequence having the sequence identity of A protein that has the ability to convert to
(A28) Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Streptmyces achromogenes, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces thermocoerulescens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaensis, Streptomyces glomerochromogenes, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces ornatus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomyces misaw nensis, Streptomyces @ pallidus, Streptomyces @ roseoubens, Streptomyces @ rutgersensis, Streptomyces @ steffifiburgensis base sequence which is either a primer or a chromosome with the primers. Having an amino acid sequence encoded by a DNA which can be amplified by a polymerase chain reaction using a compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor. A protein capable of converting into the indicated compound.
Specific examples of the protein (A) of the present invention include:
A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 [hereinafter sometimes referred to as the present protein (A1). ],
A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 [hereinafter may be referred to as the present protein (A2). ],
A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 [hereinafter sometimes referred to as the present protein (A3). ],
A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108 [hereinafter sometimes referred to as the present protein (A4). ],
A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 159 [hereinafter, may be referred to as the present protein (A11). ],
A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 160 [hereinafter may be referred to as the present protein (A12). ],
A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136 [hereinafter sometimes referred to as the present protein (A13). ],
A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137 [hereinafter, may be referred to as the present protein (A14). ],
A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138 [hereinafter, may be referred to as the present protein (A15). ],
A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 215 [hereinafter, may be referred to as the present protein (A16). ],
A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 216 [hereinafter, may be referred to as the present protein (A17). ],
A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 217 [hereinafter, may be referred to as the present protein (A18). ],
A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 218 [hereinafter, may be referred to as the present protein (A19). ],
A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 219 [hereinafter, may be referred to as the present protein (A20). ],
A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 220 [hereinafter sometimes referred to as the present protein (A21). ],
A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 221 [hereinafter may be referred to as the present protein (A22). ],
A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222 [hereinafter may be referred to as the present protein (A23). ],
A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 223 [hereinafter, may be referred to as the present protein (A24). ],
A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224 [hereinafter, may be referred to as the present protein (A25). ] Etc. can be given.
The compound of the present invention (A) is allowed to act on, for example, a PPO-inhibiting weed controlling activity compound represented by the above general formula (I) (hereinafter sometimes referred to as compound (I)), whereby the compound is converted to the compound. It can be converted to a compound having lower weed control activity.
In the treatment for converting the compound (I) into a compound having a lower weed controlling activity, a weed controlling metabolic protein selected from the following protein group (hereinafter sometimes referred to as the present protein (A)) is used. You can also.
<Protein group>
(A1) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(A2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(A3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(A4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108;
(A5) having the amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and in the presence of an electron transfer system from an electron donor, A protein having the ability to convert the compound represented by (II) into the compound represented by formula (III).
(A6) an electron donor having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, 3, or 108; A protein having the ability to convert a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system.
(A7) a DNA having a base sequence encoding any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and an amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions, And a protein capable of converting a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system from an electron donor.
(A8) A primer having a base sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 124 to 128 and a primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 129 using chromosomal DNA of a microorganism belonging to the genus Streptomyces or Saccharopolyspora as a template A compound having an amino acid sequence encoded by DNA that can be amplified by a polymerase chain reaction using a compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor. A protein capable of converting into the indicated compound.
(A9) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(A11) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159;
(A12) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160;
(A13) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136.
(A14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137.
(A15) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138.
(A16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 215.
(A17) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 216.
(A18) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 217.
(A19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 218,
(A20) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 219.
(A21) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 220.
(A22) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 221;
(A23) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222;
(A24) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 223;
(A25) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224;
(A26) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 159, 136, 137, 138, 217, 219, 220, 221 or 223, or SEQ ID NOs: 160, 215, 216; A compound having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 218, 222 or 224, and having the formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor; Having the ability to convert to the compound represented by the above formula (III).
(A27) 90% or more of any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224 A compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor, having an amino acid sequence encoded by a base sequence having the sequence identity of A protein that has the ability to convert to
Examples of the present protein (A) include the above-mentioned protein (A) of the present invention. Also, as another example,
A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 [hereinafter, may be referred to as the present protein (A9). ],
A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 [hereinafter, may be referred to as the present protein (A10). ] Etc. can be given.
[0006]
In the above protein group, in the amino acid sequence of the protein represented by (A5), (A6), (A7), (A8), (A26), (A27) or (A28), SEQ ID NO: 1, 2, 3 , 108, 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224, the differences that may be observed are: Deletion, substitution, addition, etc. These include, for example, SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 108, 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224 described above. Includes the processing-induced deletion of proteins having an amino acid sequence in cells. In addition, gene mutations that occur naturally due to species differences or individual differences of the organism from which the protein is derived, and gene mutations that are artificially introduced by site-directed mutagenesis, random mutagenesis, mutagenesis, etc. Includes amino acid deletions, substitutions, additions, and the like.
The number of amino acids subject to such deletion, substitution, addition, etc. may be any number as long as the protein (A) can find the ability to convert compound (II) into compound (III). Examples of the amino acid substitution include substitution with an amino acid having similar properties such as hydrophobicity, charge, pK, and steric structure. Specific examples of such substitution include: (1) glycine, alanine; (2) valine, isoleucine, leucine; (3) aspartic acid, glutamic acid, asparagine, glutamine, (4) serine, threonine; (6) Lysine, arginine; (6) Substitution within groups such as phenylalanine, tyrosine and the like. On the other hand, in the present protein (A), cysteine at a position corresponding to cysteine represented by amino acid number 357 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; for example, represented by amino acid number 350 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Cysteine, cysteine represented by amino acid number 344 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, cysteine represented by amino acid number 360 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108, represented by amino acid number 359 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 Cysteine represented by amino acid number 355 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, cysteine represented by amino acid number 358 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 159, and amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 160 Cysteine represented by amino acid number 374, cysteine represented by amino acid number 351 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136, cysteine represented by amino acid number 358 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137, and represented by SEQ ID NO: 138 Cysteine represented by amino acid number 358 in the amino acid sequence, cysteine represented by amino acid number 347 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222, cysteine represented by amino acid number 347 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224, etc. are conserved. (No deletion or substitution).
Techniques for artificially performing such amino acid deletion, addition, or substitution (hereinafter, also referred to as amino acid modification in general) include, for example, SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 108, 159, 160, 136; 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, or 224, a site-directed mutagenesis is performed on the DNA encoding any of the amino acid sequences. A technique of expressing the protein by a conventional method is used. Examples of the site-directed mutagenesis method include a method using an amber mutation (gapped duplex method, Nucleic Acids Res., 12, 9441-9456 (1984)), and a method using PCR using a mutagenesis primer. And the like. Examples of techniques for artificially modifying amino acids include, for example, SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 108, 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221; A method of randomly mutagenizing a DNA encoding any of the amino acid sequences represented by 222, 223 or 224 and then expressing the DNA by a conventional method can also be mentioned. As a method for introducing mutations at random here, for example, a DNA encoding any of the above amino acid sequences is used as a template, a primer pair capable of amplifying the full length of each DNA is used, and dATP, dTTP used as a substrate are used. , DGTP, and dCTP at different addition concentrations than usual, or Mg that promotes the polymerase reaction²⁺And a method in which PCR is carried out under reaction conditions in which the concentration of is higher than usual. Examples of such a PCR technique include the method described in Method in Molecular Biology, (31), {1994, {97-112}. Further, a method described in WO0009682 can also be mentioned.
[0007]
In the present invention, “sequence identity” refers to identity and homology between two base sequences or two amino acid sequences. The “sequence identity” is determined by comparing two optimally aligned sequences over the entire region of the sequence to be compared. Here, in the optimal alignment of the base sequence or amino acid sequence to be compared, addition or deletion (for example, gap or the like) may be allowed. Such sequence identity can be determined by, for example, FASTA [Pearson & Lipman, Proc. {Natl. {Acad. {Sci. USA, 4, 2444-2448 (1988)], BLAST [Altschul et al., Journal of Molecular Biology, 215, 403-410 (1990)], CLUSTAL W [Thompson, Higgins, Gibson, Nic. )], Etc., and homology analysis is performed to create an alignment. The above-mentioned program is, for example, an international DNA bank operated in DNA \ Bank \ of Japan [National Institute of Genetics \ Biological Information / DDBJ Research Center \ (Center \ Information \ Biology \ DNA \ Data \ Bank \ of Japan \; CIB / DDBJ)] On the homepage (http://www.ddbj.nig.ac.jp) or the like. Also, sequence identity can be determined using commercially available sequence analysis software. Specifically, for example, GENETYX-WIN @ Ver. 5 (manufactured by Software Development Co., Ltd.) using the Lipman-Pearson method [Lipman, @D. {J. And Pearson, W. R. , Science, 227, 1435-1441, (1985)], and an alignment is created by performing homology analysis.
[0008]
Examples of the “stringent conditions” described in (A7) include Sambrook @ J. , {Frisch} E. F. , {Maniatis} T. For example, in 6 × SSC (1), for example, in hybridization performed according to a general method described in Molecular Cloning 2nd Edition, published by Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor Laboratory Press), Molecular Cloning 2nd Edition. A solution containing 0.5 M NaCl and 0.15 M trisodium citrate is defined as 10 × SSC) at 45 ° C. and then washed with 2 × SSC at 50 ° C. (Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6) and the like. The salt concentration in the washing step can be selected, for example, from 2 × SSC (low stringency conditions) to 0.2 × SSC (high stringency conditions). The temperature in the washing step can be selected, for example, from room temperature (low stringency conditions) to 65 ° C. (high stringency conditions). Also, both the salt concentration and the temperature can be varied.
Examples of DNA that “hybridizes under stringent conditions with a DNA having a base sequence encoding any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108” include, for example, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 108, 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224; DNA having a base sequence to encode, SEQ ID NO: 6, 7, 8, 78, 84, 109, 139, 140, 141, 142, 143, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233 or DNA having any one of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 234, 234, and 234; 109, 139, 140, 141, 142, 143, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233 or 234, a base showing about 60% or more identity to any of the base sequences DNA having a sequence can also be mentioned.
[0009]
The molecular weight of the present protein (A) is about 30,000 to about 60,000 as a molecular weight detected by polyacrylamide gel electrophoresis containing sodium dodecyl sulfate (hereinafter referred to as SDS-PAGE). A molecular weight of about 40,000 to about 50,000 (for example, SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 108, 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224). The protein (A) may be a protein having an amino acid sequence added from the amino terminal to the upstream or from the carboxy terminal to the downstream as long as the ability to convert the compound (II) to the compound (III) is not lost. It may be used as.
[0010]
As an index of the ability of the present protein (A) to metabolize the PPO-inhibiting weed controlling compound represented by the above general formula, the ability to convert compound (II) to compound (III) can be mentioned. Such ability is confirmed by, for example, allowing the present protein (A) to act on compound (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor such as coenzyme NADPH, and detecting the formed compound (III). can do.
The “electron transfer system from the electron donor” refers to a system in which a redox reaction occurs in a chain to transfer electrons from the electron donor to the present protein (A). Examples of the electron donor include coenzymes NADPH and NADH. For example, proteins constituting an electron transfer system from NADPH to the present protein (A) include ferredoxin and ferredoxin-NADP.⁺Reductase, cytochrome P-450 reductase and the like.
To confirm the ability to convert compound (II) into compound (III), for example, the present protein (A), β-NADPH, ferredoxin, ferredoxin-NADP⁺A reaction solution containing a compound (II) labeled with a reductase, a radioisotope or the like and having a pH of about 7 is kept at about 30 ° C. for about 10 minutes to about 1 hour. Next, hydrochloric acid is added to the reaction solution to make it acidic, and the mixture is extracted with ethyl acetate. The obtained ethyl acetate layer is subjected to thin layer chromatography (hereinafter, referred to as TLC), and then subjected to autoradiography to detect the labeled compound (III), thereby converting the compound (II) to a compound (II). The ability to convert to (III) can be confirmed.
[0011]
To prepare the present protein (A), for example, first, a DNA encoding the present protein (A) (hereinafter sometimes collectively referred to as the present DNA (A)) is prepared by a conventional genetic engineering method ( For example, Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T., Molecular Cloning, 2nd Edition, Molecular Spring Cloning 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory published by Cold Spring Laboratories, etc. Acquire according to.
As an example of the present DNA (A), a DNA encoding the above-mentioned protein (A) of the present invention [hereinafter may be referred to as the present DNA (A). ] Can be given. Specific examples of the DNA (A) of the present invention include:
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 [hereinafter, may be referred to as DNA (A1) of the present invention. ],
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 [hereinafter, may be referred to as DNA of the present invention (A2). ],
A DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 [hereinafter may be referred to as the present DNA (A3). ],
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108 [hereinafter, may be referred to as DNA of the present invention (A4). ],
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 159 [hereinafter, may be referred to as DNA (A11) of the present invention. ],
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 160 [hereinafter, may be referred to as DNA of the present invention (A12). ],
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136 [hereinafter, may be referred to as DNA of the present invention (A13). ],
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137 [hereinafter, may be referred to as DNA of the present invention (A14). ],
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138 [hereinafter, may be referred to as DNA of the present invention (A15). ],
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 215 [hereinafter, may be referred to as DNA of the present invention (A16). ],
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 216 [hereinafter, may be referred to as DNA of the present invention (A17). ],
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 217 [hereinafter, may be referred to as DNA of the present invention (A18). ],
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 218 [hereinafter, may be referred to as DNA of the present invention (A19). ],
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 219 [hereinafter, may be referred to as DNA of the present invention (A20). ],
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 220 [hereinafter, may be referred to as DNA of the present invention (A21). ],
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 221 [hereinafter, may be referred to as DNA of the present invention (A22). ],
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222 [hereinafter, may be referred to as DNA of the present invention (A23). ],
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 223 [hereinafter, may be referred to as DNA of the present invention (A24). ],
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224 [hereinafter, may be referred to as DNA of the present invention (A25). ] Etc. can be given.
Further, more specific examples of the DNA (A) of the present invention include:
DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6,
DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 7,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 10,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 8,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 11,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 109,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 110,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 139,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 144,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 140,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 145,
DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 141,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 146,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 142,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 147,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 143,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 148,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 225,
DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 235,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 226,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 236,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 227,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 237,
DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 228,
DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 238,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 229,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 239,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 230,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 240,
DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 231;
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 241,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 232,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 242,
DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 233,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 243,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 234,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 244,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 214,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 368,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 393,
A base sequence having a sequence identity of 80% or more with any of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 6, 7, 8 or 109, and having the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor. A DNA having a base sequence encoding an amino acid sequence of a protein capable of converting the compound represented by the formula into the compound represented by the formula (III);
A nucleotide sequence having 90% or more sequence identity with any of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 139, 140, 141, 142, 143, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, or 234. And a base encoding an amino acid sequence of a protein capable of converting the compound represented by the formula (II) into the compound represented by the formula (III) in the presence of an electron transfer system from an electron donor. DNA with sequence
Etc. can be given.
Examples of the present DNA (A) include, in addition to the above-described DNA (A) of the present invention,
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 [hereinafter sometimes referred to as the present DNA (A9). ],
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 78,
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 [hereinafter may be referred to as the present DNA (A10). ],
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 84,
DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 85,
And so on.
The DNA (A) may be a DNA cloned from the natural world, or may be a DNA cloned from the natural world by deletion, substitution, or deletion of a base by, for example, site-directed mutagenesis or random mutagenesis. It may be a DNA into which the addition is introduced, or a DNA artificially synthesized. Next, the present DNA (A) is expressed and expressed in accordance with ordinary genetic engineering methods to produce and obtain the present protein (A). Thus, the present protein (A) can be prepared.
[0012]
The present DNA (A) can be prepared, for example, by the following method. First, a microorganism having the ability to convert compound (II) to compound (III), for example, Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Streptmyces achromogenes, Streptomyces griseolus, Streptomyces carbophilus, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces thermocoerulescens, Streptomyces nogalater, Streptomycestsusimaensis, Streptomyces glomerochromogenes, Streptomyces @ olivochromogenes, S reptomyces ornatus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomyces misawanensis, Streptomyces pallidus, Streptomyces roseorubens, Streptomyces rutgersensis, a microorganism belonging to the genus Streptomyces such as Streptomyces steffisburgensis, more specifically, Streptomyces phaeochromogenes IFO12898, Streptomyces testaceus ATCC21469, Streptmyces achromogenes IFO 12735 , Streptomy es griseolus ATCC11796, Streptomyces carbophilus SANK62585, Streptomyces griseofuscus IFO 12870t, Streptomyces thermocoerulescens IFO 14273t, Streptomyces nogalater IFO 13445, Streptomyces tsusimaensis IFO 13782, Streptomyces glomerochromogenes IFO 13673t, Streptomyces olivochromogenes IFO 12444, Streptomyces ornatus IFO 13069t, Streptomyc es griseus ATCC 10137, Streptomyces griseus IFO 13849T, Streptomyces lanatus IFO 12787T, Streptomyces misawanensis IFO 13855T, Streptomyces pallidus IFO 13434T, Streptomyces roseorubens IFO 13682T, Streptomyces rutgersensis IFO 15875T, such as Streptomyces steffisburgensis IFO 13446T, or, Sakkaroporisu such as Saccharopolyspora taberi Microorganisms belonging to the genus Pola, more specifically, Sacch From such ropolyspora taberi JCM 9383t, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, Inc. A chromosomal DNA is prepared by a method according to a general genetic engineering method described in the above. Next, the chromosomal DNA is partially digested with a restriction enzyme such as Sau3AI, and the DNA of about 2 kb is recovered. The recovered DNA is referred to as "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2".^nd"Edition" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, Inc. Cloning into a vector according to a general genetic engineering method described in the above. Specific examples of the vector include pUC # 119 (manufactured by Takara Shuzo), pTV {118N (manufactured by Takara Shuzo), pBluescriptII} (manufactured by Toyobo), pCR2.1-TOPO (manufactured by Invitrogen), pTrc99A (Amersham Pharmacia Biotech). And pKK331-1A (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) and the like. A chromosomal DNA library can be obtained by extracting a plasmid from the obtained clone.
[0013]
The obtained chromosomal DNA library was probed with a DNA consisting of about 20 or more bases having a base sequence encoding any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108 under the following conditions. The present DNA (A) can be obtained by detecting the DNA to which the probe specifically binds and recovering it. Specific examples of the DNA that can be used as the probe include a DNA having any of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 6, 7, 8 or 109; Examples include DNA having a partial base sequence, DNA having a base sequence complementary to the partial base sequence, and the like.
DNA used as a probe is labeled with a radioisotope, a fluorescent dye, or the like. To label DNA with a radioisotope, for example, Random Labeling Kit manufactured by Boehringer or Takara Shuzo can be used. Further, dCTP in a normal PCR reaction solution was replaced with (α-³²P) In place of dCTP, by performing PCR using DNA used as a probe as a template,³²P-labeled DNA can also be prepared. When DNA is labeled with a fluorescent dye, for example, DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II (manufactured by Roche) can be used. A specific example of the preparation of the probe is shown below. For example, using a chromosomal DNA or a chromosomal DNA library prepared from Streptomycesphaeochromogenes @ IFO12898 as described above as a template, an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 93 and an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 94 Is used as a primer, for example, by using PCR DIG Probe Synthesis Kit (manufactured by Roche Diagnostics GmbH) according to the attached manual as described in Examples below, and the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 is obtained. DNA having a full length and labeled with digoshikigenin is obtained. Similarly, using a chromosomal DNA or a chromosomal DNA library prepared from Streptomyces @ phaeochromogenes @ IFO12898 as a template, an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 130 and an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 131 When PCR is carried out using as a primer, DNA having the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 57 to 730 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 and labeled with digoshikigenin is obtained. Further, using as a template a chromosomal DNA or a chromosomal DNA library prepared from the chromosomal DNA of Saccharopolyspora \ taberi \ JCM9383t, an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 61 and an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 62 Is used as a primer to obtain a DNA having the full length of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 and labeled with digoshikigenin. Further, using a chromosomal DNA or a chromosomal DNA library prepared from the chromosomal DNA of Streptomyces @ testaceus @ ATCC21469 as a template, an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 70 and an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 71 When PCR is performed using the primers, a DNA having the full length of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 and labeled with digoshikigenin is obtained. In addition, using a chromosomal DNA or a chromosomal DNA library prepared from the chromosomal DNA of Streptomyces @ testaceus @ ATCC21469 as a template, an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 132 and an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 133 When PCR is performed using the primers, a DNA having the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 21 to 691 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 and labeled with digoshikigenin is obtained.
[0014]
Examples of a method for hybridizing a probe to a chromosomal DNA library include colony hybridization and plaque hybridization, and it is preferable to select a method according to the type of a vector used for preparing the library. If the library to be used is constructed using a plasmid vector, colony hybridization is performed. Specifically, first, the transformant was obtained by introducing the DNA of the library into a microorganism capable of replicating the plasmid vector used for the preparation of the library, and diluting the transformant to obtain an agar medium. And culture until colonies appear. If the library has been prepared using a phage vector, plaque hybridization is performed. Specifically, first, the phage vector used in the preparation of the library was mixed under a condition capable of infecting the replicable microorganism with the phage of the library, and then further mixed with a soft agar medium, and this was mixed with an agar medium. Sprinkle. Thereafter, culture is performed until plaques appear.
Next, in any of the above-mentioned hybridizations, a membrane is placed on the surface of the agar medium on which the above-mentioned culture has been performed, and phage particles in a transformant colony or plaque are transferred to the membrane. After treating the membrane with an alkali, the membrane is neutralized, and then the DNA eluted from the transformant or phage particles is fixed to the membrane. More specifically, for example, in the case of plaque hybridization, a nitrocellulose membrane or a nylon membrane or the like, specifically, for example, Hybond-N⁺(Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd.) and the like are allowed to stand for about 1 minute to allow the phage particles to adsorb to the membrane. Next, the membrane is immersed in an alkaline solution (1.5 M sodium chloride, 0.5 N NaOH) for about 3 minutes to dissolve the phage particles and elute the phage DNA onto the membrane. Soak in sodium chloride, 0.5 M Tris-HCl buffer pH 7.5) for about 5 minutes. The membrane is washed with a washing solution (0.3 M sodium chloride, 30 mM sodium citrate, 0.2 M Tris-HCl buffer pH 7.5) for about 5 minutes, and then kept under reduced pressure at about 80 ° C. for about 90 minutes, for example. To immobilize the phage DNA on the membrane.
Using the thus prepared membrane, hybridization is performed using the DNA as a probe. Hybridization can be performed, for example, by referring to “Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2”.^nd{Edition (1989)}, Cold, Spring, Harbor, Laboratory, Press, etc.
There are various types of reagents and temperature conditions for performing hybridization. For example, the reagent contains 450 mM to 900 mM sodium chloride and 45 mM to 90 mM sodium citrate, and contains 0.1% sodium dodecyl sulfate (hereinafter referred to as SDS). % To 1.0%, containing denatured non-specific DNA at a concentration of 0 μg / ml to 200 μg / ml, and optionally containing 0% to 0.2% of albumin, ficoll, polyvinylpyrrolidone, etc. The pre-hybridization solution which may be contained at a concentration of 1 cm of the membrane prepared as described above is used.²The membrane is immersed in the solution and kept at 42 ° C. to 65 ° C. for about 1 hour to 4 hours. Then, for example, containing 450 mM to 900 mM sodium chloride and 45 mM to 90 mM sodium citrate, containing SDS at a concentration of 0.1% to 1.0%, and denaturing non-specific DNA at 0 μg / ml to 200 μg / ml. And a probe (membrane) prepared by the above-mentioned method, which may contain albumin, ficoll, polyvinylpyrrolidone, etc. in a concentration of 0% to 0.2%. 1cm²1.0x10 per⁴cpm to 2.0 × 10⁶(equivalent amount of cpm) with 1 cm of membrane²The membrane is immersed in the solution and kept at 42 ° C. to 65 ° C. for about 12 hours to 20 hours. Next, the membrane is taken out, and a washing solution at 42 ° C. to 65 ° C. containing 15 mM to 300 mM sodium chloride, 1.5 mM to 30 mM sodium citrate, 0.1% to 1.0% SDS or the like is used for 5 minutes to 5 minutes. The washing for 15 minutes is performed about 2 to 4 times. Further, the membrane is lightly rinsed with a 2 × SSC solution (300 mM sodium chloride, 30 mM sodium citrate) or the like, and then dried. The membrane is subjected to, for example, autoradiography to detect the position of the probe on the membrane, thereby detecting the position of the DNA that hybridizes with the used probe on the membrane. In addition, using a commercially available hybridization kit such as DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II (manufactured by Roche), pre-hybridization and hybridization are performed using a hybridization solution included in the kit. You can also. After hybridization, for example, the membrane is washed twice in 2 × SSC containing 0.1% SDS at room temperature for 5 minutes, and then twice in 0.5 × SSC containing 0.1% SDS at 65 ° C. for 15 minutes. . The washed membrane is sequentially treated with a detection solution contained in the kit to detect the position of the probe on the membrane, thereby detecting the position of the DNA that hybridizes with the used probe on the membrane.
By specifying a clone corresponding to the position on the membrane of the DNA detected as described above on the original agar medium and picking it, a clone having the DNA can be isolated.
[0015]
The present DNA (A) obtained as described above is referred to as “Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2”.^nd"Edition" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, Inc. And the like, and can be cloned into a vector according to a general genetic engineering method described in US Pat. Specific examples of the vector include pUCA119 (manufactured by Takara Shuzo), pTVA118N (manufactured by Takara Shuzo), pBluescript II (manufactured by Toyobo), pCR2.1-TOPO (manufactured by Invitrogen), pTrc99A (manufactured by Pharmacia), pKK331-1A (manufactured by Pharmacia) or the like can be used.
The nucleotide sequence of the DNA (A) obtained as described above is Sanger, {S. Nicklen, A. R. Coulson, Proceeding of National Academy of Science U. S. A. (1977) $ 74: can be analyzed by the dideoxy terminator method described in pages 5463-5467 and the like. For preparation of a sample for nucleotide sequence analysis, a commercially available reagent such as ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Ready Reaction Kit from PerkinElmer may be used.
[0016]
The present DNA (A) can also be prepared as follows. Microorganism having the ability to convert compound (II) to compound (III), for example, Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Streptmyces achromogenes, Streptomyces griseolus, Streptomyces carbophilus, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces thermocoerulescens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaensis, Streptomyces glomerochromogenes, Streptomyces olivochromogenes, Str ptomyces ornatus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomycesmisawanensis, Streptomyces pallidus, Streptomyces roseorubens, Streptomyces rutgersensis, a microorganism belonging to the genus Streptomyces such as Streptomyces steffisburgensis, more specifically, Streptomyces phaeochromogenes IFO12898, Streptomyces testaceus ATCC21469, Streptmyces achromogenes IFO 12735, Streptomyces griseolus ATCC11796, Streptomyces carbophilus SANK62585, Streptomyces griseofuscus IFO 12870t, Streptomyces thermocoerulescens IFO 14273t, Streptomyces nogalater IFO 13445, Streptomyces tsusimaensis IFO 13782, Streptomyces glomerochromogenes IFO 13673t, Streptomyces olivochromogenes IFO 12444, Streptomyces ornatus IFO 13069t, Streptomyces griseus ATCC 10137, Streptomyces griseus IFO 13849T, Streptomyces lanatus IFO 12787T, Streptomyces misawanensis IFO 13855T, Streptomyces pallidus IFO 13434T, Streptomyces roseorubens IFO 13682T, Streptomyces rutgersensis IFO 15875T, such as Streptomyces steffisburgensis IFO 13446T, or, such as Saccharopolyspora taberi Saccharopolyspora Microorganism belonging to the genus, more specifically, Saccharo SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 108, 159, 160, 136, 137, 138, and 215, using chromosomal DNA or a chromosomal DNA library prepared as described above from oligospora @ taberi @ JCM $ 9383t or the like as a template. 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224, an oligonucleotide having a base sequence of about 20 bases or more at the 5 'end of the base sequence encoding any of the amino acid sequences represented by: An oligonucleotide having a base sequence complementary to a base sequence of about 20 bases or more near the 3 ′ end of the base sequence encoding any of the above amino acid sequences or downstream from the 3 ′ end as a primer, By performing PCR under the reaction conditions shown in It can be amplified A (A). In addition, a restriction enzyme recognition sequence or the like may be added to the 5 'end of the primer used for PCR as described above.
More specifically, for example, using a chromosomal DNA or a chromosomal DNA library prepared from Streptomyces @ phaeochromogenes @ IFO12898 as a template, an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 51 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 52 By performing PCR using as primers, DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 6, and the like can be amplified. In addition, by performing PCR using an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 51 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 53 as a primer, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 (SEQ ID NO: 9) is obtained. (Including a base sequence encoding the amino acid sequence represented by No. 1).
For example, using a chromosomal DNA or a chromosomal DNA library prepared from Saccharopolyspora \ taberi \ JCM \ 9383t as a template, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 61 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 62 as primers By performing PCR using the DNA, a DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 7, and the like can be amplified. In addition, by performing PCR using an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 61 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 63 as primers, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 10) is obtained. (Including a base sequence encoding the amino acid sequence represented by No. 2).
For example, using a chromosomal DNA or a chromosomal DNA library prepared from Streptomyces achromogenes IFO 12735 as a template, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 119 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 120 as primers By carrying out PCR, DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108, DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 109, and the like can be amplified. In addition, by performing PCR using an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 119 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 121 as a primer, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 110 (SEQ ID NO: 110) is obtained. (Including the base sequence encoding the amino acid sequence represented by No. 108).
For example, using a chromosomal DNA or a chromosomal DNA library prepared from Streptomyces nogalator IFO 13445 as a template, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 165 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 166 as primers By performing PCR using the DNA, a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 144 (including the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159) can be amplified.
For example, using a chromosomal DNA or a chromosomal DNA library prepared from Streptomyces @ tsusimaensis @ IFO @ 13782 as a template, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 171 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 172 as primers By performing PCR using the DNA, a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 145 (including the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160) can be amplified.
For example, using, as a template, a chromosomal DNA or a chromosomal DNA library prepared from Streptomyces \ thermocoerulescens \ IFO \ 14273t as an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 177 and an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 178 as a primer By performing PCR using the DNA, a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 146 (including the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 136) can be amplified.
For example, using, as a template, a chromosomal DNA or a chromosomal DNA library prepared from Streptomyces glomerochromogenes IFO 13673t as an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 183 and an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 184 as a primer By performing PCR using the DNA, a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 147 (including the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 137) can be amplified.
For example, using a chromosomal DNA or a chromosomal DNA library prepared from Streptomyces ｉolivochromogenes IFOｏ12444 as a template, an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 185 and an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 184 as primers By performing PCR using the DNA, a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 148 (including the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 138) can be amplified.
[0017]
When a DNA library obtained by inserting chromosomal DNA into a vector is used as a template, for example, it is represented by SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 108, 159, 160, 136, 137 or 138. Oligonucleotides having a base sequence selected from base sequences encoding any of the amino acid sequences (for example, a base sequence of about 20 bases or more at the 5 'end of the base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Oligonucleotides having a base sequence complementary to the base sequence in the vicinity of the DNA insertion site of the vector used for the library construction, and a PCR using about 20 bases or more as primers. The present DNA (A) can also be amplified. In addition, a restriction enzyme recognition sequence or the like may be added to the 5 'end of the primer used for PCR in this manner.
[0018]
Specifically, the PCR conditions as described above include, for example, 50 ng of chromosomal DNA, 300 nM of each of the two primers in the above-described combination, and a dNTP mix (each of four types of dNTPs of 2.0 mM each). Mixture) (5.0 μl) and 10 × Expand @ HF buffer (MgCl₂Containing 50 μl of a reaction solution containing 5.0 μl of Expand® HiFi Enzyme Mix (manufactured by Roche Molecular Bio Chemicals) (containing 5.0 μl of Roche Molecular Biochemicals, Inc.), and keeping the mixture at 97 ° C. for 2 minutes. This was repeated for 10 cycles, with a cycle of 15 seconds at 65 ° C. then 30 seconds at 65 ° C. and a further 2 minutes at 72 ° C., followed by 15 seconds at 97 ° C., 30 seconds at 68 ° C. and 2 minutes at 72 ° C. (1 cycle) (Increment of 20 seconds each time) is performed as one cycle, and the cycle is repeated 15 times, and the condition of keeping the temperature at 72 ° C. for 7 minutes can be raised.
It also contains 250 ng of chromosomal DNA, 200 nM of each of the two primers in the above combination, 5.0 μl of dNTP mix (a mixture of 2.5 mM each of four dNTPs), and 10 × ExTaq buffer (MgCl2).₂(Takara Shuzo Co., Ltd.) and 5.0 μl of ExTaq polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) in a reaction volume of 50 μl, and kept at 97 ° C. for 2 minutes, at 97 ° C. for 15 seconds, and then at 60 ° C. for 30 seconds. Then, a cycle of 90 seconds at 72 ° C. may be repeated 30 times, and conditions for keeping the temperature at 72 ° C. for 4 minutes may also be used.
[0019]
In addition, for example, an oligonucleotide for a primer is designed and prepared based on the base sequence of a region having a particularly high sequence identity in the base sequence represented by SEQ ID NO: 6, 7, 8 or 109. Using the obtained oligonucleotide as a primer, a microorganism having the ability to convert compound (II) to compound (III), for example, Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Streptmyces achromogenes, Streptomyces griseolus, Streptomyces carbophilus, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces thermocoerulescens , Streptomyces @ nogalater, Streptomycestusimaimasis, Streptomyces @ glomerochromogenes, Streptom ces olivochromogenes, Streptomyces ornatus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomyces misawanensis, Streptomyces pallidus, Streptomyces roseorubens, Streptomyces rutgersensis, a microorganism belonging to the genus Streptomyces such as Streptomyces steffisburgensis, more specifically, Streptomyces phaeochromogenes IFO12898, Streptomyces testaceus ATCC21469, Streptmyces aromage es IFO 12735, Streptomyces griseolus ATCC11796, Streptomyces carbophilus SANK62585, Streptomyces griseofuscus IFO 12870t, Streptomyces thermocoerulescens IFO 14273t, Streptomyces nogalater IFO 13445, Streptomyces tsusimaensis IFO 13782, Streptomyces glomerochromogenes IFO 13673t, Streptomyces olivochromogenes IFO 12444, Streptomyces ornatu s IFO 13069t, Streptomyces griseus ATCC 10137, Streptomyces griseus IFO 13849T, Streptomyces lanatus IFO 12787T, Streptomyces misawanensis IFO 13855T, Streptomyces pallidus IFO 13434T, Streptomyces roseorubens IFO 13682T, Streptomyces rutgersensis IFO 15875T, such as Streptomyces steffisburgensis IFO 13446T, or, Saccharopolyspora taberi, etc. Saccharopolispo Obtaining the present DNA (A) by performing PCR using a chromosomal DNA or a chromosomal DNA library prepared as described above from a microorganism belonging to the genus, more specifically, Saccharopolyspora \ taberi \ JCM \ 9383t as a template. You can also. Examples of the “region having a particularly high sequence identity in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6, 7, 8 or 109” include, for example, the nucleotide numbers 290 to 315, 458 to 485, and 496 to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 Areas corresponding to the areas indicated by 525, 1046 to 1073, and the like can be given. Examples of the primer designed based on the nucleotide sequence of such a region include a primer having a nucleotide sequence represented by any of SEQ ID NOS: 124 to 129 shown below.
SEQ ID NO: 124; based on a nucleotide sequence of a region corresponding to the region represented by base numbers 290 to 315 described above.
SEQ ID NO: 125; based on a nucleotide sequence of a region corresponding to the region represented by base numbers 458 to 485 described above.
SEQ ID NO: 126; based on a nucleotide sequence of a region corresponding to the region represented by base numbers 458 to 485 described above.
SEQ ID NO: 127: Based on a nucleotide sequence of a region corresponding to the region represented by base numbers 496 to 525 described above.
SEQ ID NO: 128; based on a nucleotide sequence of a region corresponding to the region represented by base numbers 496 to 525 described above.
SEQ ID NO: 129; based on the nucleotide sequence of the region corresponding to the region represented by base numbers 1046 to 1073 described above.
For example, by using a combination of an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 124 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 129 as a primer, a DNA of about 800 bp is amplified. By using a combination of the oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 125 and the oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 129 as a primer, about 600 bp of DNA is amplified. By using a combination of the oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 126 and the oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 129 as a primer, about 600 bp of DNA is amplified. By using a combination of the oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 127 and the oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 129 as a primer, a DNA of about 580 bp is amplified. Further, by using a combination of the oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 128 and the oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 129 as a primer, a DNA of about 580 bp is amplified.
Here, specifically, the PCR conditions include, for example, 10 ng of chromosomal DNA, 200 nM of each of the two types of primers, 0.5 μl of a dNTP mix (a mixture of four types of dNTPs of 10 mM each), and 5 × GC Contains 5 μl of genomic PCR reaction buffer, 25 mM @ Mg (OAc)₂And 1.1 μl of 5M ΔGC-Melt, and 0.5 μl of Advantage-GC Genomic Polymerase Mix (manufactured by Clontech), 25 μl of the reaction solution was incubated at 95 ° C. for 1 minute, and then incubated at 94 ° C. for 15 seconds. A cycle in which the cycle of 60 ° C. for 30 seconds and then 72 ° C. for 1 minute is repeated 30 times, and the condition of keeping the temperature at 72 ° C. for 5 minutes can be mentioned.
[0020]
By recovering the DNA amplified as described above, a DNA having a partial base sequence of the present DNA (A) can be obtained. Then, based on the base sequence of the obtained “DNA having a partial base sequence of the present DNA (A)”, an oligonucleotide having a partial base sequence of about 20 bases or more of the base sequence, An oligonucleotide having a base sequence complementary to a partial base sequence of about 20 bases or more is designed and prepared. Then, for example, using the chromosomal DNA library prepared from a microorganism or the like capable of converting the compound (II) into the compound (III) as described above as a template, the "partial base sequence of the present DNA (A)" An oligonucleotide prepared based on the nucleotide sequence of "DNA having" has an oligonucleotide of about 20 bases or more having a nucleotide sequence near the DNA insertion site of the vector used for the construction of the library, or such a nucleotide sequence. By performing PCR using a primer in combination with an oligonucleotide of about 20 bases or more having a complementary base sequence, the “DNA having the partial base sequence of the present DNA (A)” obtained as described above is obtained. Of the present DNA (A) extending upstream from the 5 'end or downstream from the 3' end It can be obtained a DNA having a. The present DNA (A) can be obtained by ligating the DNA having the partial nucleotide sequence of the present DNA (A) obtained as described above. For such an obtaining method, a commercially available kit such as a universal genome walker kit (manufactured by Clontech) can also be used. Further, a primer is prepared based on the full-length nucleotide sequence of the present DNA (A) obtained by ligating the partial nucleotide sequence of the present DNA (A) obtained as described above, and the chromosome is prepared using the primer. The present DNA (A) can also be obtained by performing PCR using the DNA library as a template.
[0021]
For example, using a chromosomal DNA or a chromosomal DNA library prepared from Streptomyces nogalator IFO 13445 as a template, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 124 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 129 as primers By performing PCR using the DNA, a DNA having a base sequence represented by base numbers 316 to 1048 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 139 (a partial base sequence of the base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 159) is obtained. Obtainable. As described above, based on the nucleotide sequence of the obtained DNA, a DNA having a nucleotide sequence extending upstream from the 5 ′ end or downstream from the 3 ′ end is obtained, and the obtained DNA is ligated. And a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 144 (including the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159 and the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 149).
For example, using as a template a chromosomal DNA or a chromosomal DNA library prepared from Streptomyces \ tsusimaensis \ IFO \ 13782, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 124 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 129 as primers By performing PCR using the DNA, a DNA having a base sequence represented by base numbers 364 to 1096 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 140 (a partial base sequence of the base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 160) is obtained. Obtainable. As described above, based on the nucleotide sequence of the obtained DNA, a DNA having a nucleotide sequence extending upstream from the 5 ′ end or downstream from the 3 ′ end is obtained, and the obtained DNA is ligated. Having a base sequence represented by SEQ ID NO: 145 (including a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 160 and a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 150).
For example, using a chromosomal DNA or a chromosomal DNA library prepared from Streptomyces \ thermocoerulescens \ IFO \ 14273t as a template, an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 124 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 129 as primers By performing PCR using the DNA, a DNA having a base sequence represented by base numbers 295 to 1027 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 141 (a partial base sequence of the base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136) is obtained. Obtainable. As described above, based on the nucleotide sequence of the obtained DNA, a DNA having a nucleotide sequence extending upstream from the 5 ′ end or downstream from the 3 ′ end is obtained, and the obtained DNA is ligated. Having a base sequence represented by SEQ ID NO: 146 (including a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136 and a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 151).
For example, using, as a template, a chromosomal DNA or a chromosomal DNA library prepared from Streptomyces glomerochromogenes IFO 13673t as an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 124 and an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 129 as a primer By performing PCR using the DNA, a DNA having a base sequence represented by base numbers 316 to 1048 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 142 (a partial base sequence of the base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137) is obtained. Obtainable. As described above, based on the nucleotide sequence of the obtained DNA, a DNA having a nucleotide sequence extending upstream from the 5 ′ end or downstream from the 3 ′ end is obtained, and the obtained DNA is ligated. A DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 147 (including the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137 and the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 152) can be obtained.
For example, using a chromosomal DNA or a chromosomal DNA library prepared from Streptomyces ｔｏolivochromogenes IFO 12444 as a template, an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 124 and an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 129 as primers By performing PCR using the DNA, a DNA having a base sequence represented by base numbers 316 to 1048 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 143 (a partial base sequence of the base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138) is obtained. Obtainable. As described above, based on the nucleotide sequence of the obtained DNA, a DNA having a nucleotide sequence extending upstream from the 5 ′ end or downstream from the 3 ′ end is obtained, and the obtained DNA is ligated. A DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 148 (including the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138 and the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 153) can be obtained.
For example, using a chromosomal DNA or a chromosomal DNA library prepared from Streptomyces roseoseubens IFO 13682T as a template, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 124 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 129 as primers By performing PCR using the DNA, a DNA having a base sequence represented by base numbers 289 to 1015 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 232 (a partial base sequence of the base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222) is obtained. Obtainable. As described above, based on the nucleotide sequence of the obtained DNA, a DNA having a nucleotide sequence extending upstream from the 5 ′ end or downstream from the 3 ′ end is obtained, and the obtained DNA is ligated. Having a base sequence represented by SEQ ID NO: 242 (including a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 232 and a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 252).
For example, using, as a template, a chromosomal DNA or a chromosomal DNA library prepared from Streptomyces \ steffisburgensis \ IFO \ 13446T, and an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 124 and an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 129 as primers By performing PCR using the DNA, a DNA having a base sequence represented by base numbers 289 to 1015 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 234 (a partial base sequence of the base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224) is obtained. Obtainable. As described above, based on the nucleotide sequence of the obtained DNA, a DNA having a nucleotide sequence extending upstream from the 5 ′ end or downstream from the 3 ′ end is obtained, and the obtained DNA is ligated. Having a base sequence represented by SEQ ID NO: 244 (including a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 234 and a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 254).
[0022]
The present DNA (A) obtained by using PCR as described above is referred to as “Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2”.^nd"Edition" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, Inc. And the like, can be cloned into a vector by a method according to a conventional genetic engineering method. Specifically, for example, cloning can be performed using a plasmid vector included in a TA cloning kit from Invitrogen or a plasmid vector such as pBluescript II from Stratagene.
[0023]
The DNA (A) can also be prepared, for example, as follows. First, a nucleotide encoding the amino acid sequence of the protein encoded by the present DNA (A), having a GC content of 60% or less and 40% or more, preferably 55% or less and 45% or more, and encoding the amino acid sequence of the protein The base sequence is designed so that the codon usage of the sequence (codon @ usage) is within ± 4% of the codon usage of the gene of the organism to which the host cell into which the DNA (A) is introduced. The DNA (A) can be obtained by preparing a DNA having the designed base sequence according to a general genetic engineering method.
For example, the codon usage of the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the protein (A1) of the present invention (A1) having a GC content of 55% or less and 45% or more and encoding the amino acid sequence of the protein is as follows: A base sequence that is within ± 4% of the codon usage of the soybean gene is designed as follows. First, for example, the codon usage (Tables 22 and 23) of the base sequence (SEQ ID NO: 6) encoding the amino acid sequence of the protein (A1) of the present invention, which can be obtained from Streptomyces @ phaeochromogenes @ IFO12898, and the codon usage of soybean (Table 24) And Table 25). Based on the comparison result, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 so that the GC content is 55% or less and 45% or more and the codon usage is within ± 4% of the soybean codon usage. Base substitution. As such a base substitution, a base substitution that does not cause an amino acid substitution is selected. For example, the usage rate of the CTG codon encoding leucine is 1.22% in the soybean gene, whereas it is 7.09% in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6. Therefore, for example, CTG codons starting from base numbers 106, 163, 181, 226, 289, 292, 544, 1111, and 1210 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 are used as CTT codons, and base numbers 211, 547, and 1084 are used. The CTG codon starting from base number 334 is set to the CTA codon, the CTG codon starting from base number 334 is set to the TTA codon, the CTG codon starting from base numbers 664, 718, 733, 772, 835, 1120, and 1141 are set to the TTG codon, and the base numbers starting from base number 787. The starting CTG codon is replaced with a TTA codon, respectively. An example of the nucleotide sequence thus designed is shown in SEQ ID NO: 214, and the codon usage of the nucleotide sequence is shown in Tables 26 and 27. In the base sequence represented by SEQ ID NO: 214, for example, the usage rate of the CTG codon encoding leucine is 1.71%, and the codon usage rate of soybean (1.22%) is within a range of ± 4%. Inside. DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 214 is described in, for example, Sambrook @ J. , {Frisch} E. F. , {Maniatis} T. The nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 according to the site-directed mutagenesis described in Molecular Cloning 2nd Edition, published by Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor Laboratory Press), and the like. It can be prepared by introducing base substitution into DNA having a sequence. In addition, a DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 214 can be prepared by a DNA synthesis method using PCR as described in Example 46 described below.
Similarly, the codon usage of the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 222) of the protein of the present invention (A23), having a GC content of 55% or less and 45% or more, and encoding the amino acid sequence of the protein However, as an example of designing a base sequence within a range of plus or minus 4% of the codon usage rate of a soybean gene, the base sequence represented by SEQ ID NO: 368 can be mentioned. In addition, the codon usage of the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 224) of the protein of the present invention (A25) is 55% or less and 45% or more, and encodes the amino acid sequence of the protein. As an example of designing a base sequence within the range of plus or minus 4% of the codon usage of the soybean gene, the base sequence shown in SEQ ID NO: 393 can be mentioned.
The present DNA (A) obtained as described above is referred to as “Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2”.^nd"Edition" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, Inc. And the like, and can be cloned into a vector according to a general genetic engineering method described in US Pat. Specific examples of the vector include pUCA119 (manufactured by Takara Shuzo), pTVA118N (manufactured by Takara Shuzo), pBluescript II (manufactured by Toyobo), pCR2.1-TOPO (manufactured by Invitrogen), pTrc99A (manufactured by Pharmacia), pKK331-1A (manufactured by Pharmacia) or the like can be used.
The nucleotide sequence of the present DNA (A) obtained as described above is Sanger, {S. Nicklen, A. R. Coulson, Proceeding of National Academy of Science U. S. A. (1977) $ 74: can be analyzed by the dideoxy terminator method described in pages 5463-5467 and the like.
[0024]
The ability of the present protein (A) encoded by the present DNA (A) obtained as described above to metabolize the PPO-inhibiting weed-controlling compound represented by the above general formula is determined by, for example, the compound ( The ability to convert II) into compound (III) can be confirmed as an index. First, as described below, the DNA is inserted into a vector so as to be connected to a downstream of a promoter operable in a host cell, and this is introduced into a host cell to obtain a transformant. Next, a culture of the transformant or an extract obtained by crushing the culture is allowed to act on compound (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor such as coenzyme NADPH. The resulting reaction product is analyzed to detect compound (III). In this manner, a transformant capable of metabolizing compound (II) to produce compound (III) can be identified, and the transformant is the present DNA (A) encoding a protein having such ability. ) Can be determined. More specifically, for example, a culture or extract of the above transformant, an electron donor such as β-NADPH having a final concentration of about 2 mM, spinach-derived ferredoxin having a final concentration of about 2 mg / ml, a final concentration of 0.1 U / A 30 μl reaction solution containing 0.1 ml of a 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing about 3 ml of ferredoxin reductase and about 3 ppm of the compound (II) labeled with a radioisotope was prepared. Incubate at 40 ° C for 10 minutes to 1 hour. To the reaction solution after the incubation, 3 μl of 2N hydrochloric acid and 90 μl of ethyl acetate are added, stirred, and centrifuged at 8,000 × g to collect a supernatant. After the supernatant is dried under reduced pressure, the residue is dissolved in ethyl acetate, and the obtained solution is developed on a TLC plate of silica gel. The ability to convert compound (II) to compound (III) can be confirmed by radioautographic analysis of the TLC plate to detect spots corresponding to compound (III) labeled with a radioisotope. it can.
[0025]
Compound (II) is obtained by performing the above-described hybridization or PCR using the DNA (A) of the present invention or a polynucleotide having a partial base sequence of the DNA or a base sequence complementary to the partial base sequence. May be further searched for a DNA encoding a protein having the ability to convert a compound into a compound (III) or a microorganism having the DNA.
Specifically, for example, using the DNA (A) of the present invention or a polynucleotide having a partial base sequence of the DNA (A) of the present invention or a base sequence complementary to the partial base sequence as a probe, for example, Streptomyces @ phaeochromogenes , Streptomyces testaceus, Streptmyces achromogenes, Streptomyces griseolus, Streptomyces carbophilus, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces thermocoerulescens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaensis, Streptomyces lomerochromogenes, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces ornatus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomyces misawanensis, Streptomyces pallidus, Streptomyces roseorubens, Streptomyces rutgersensis, a microorganism belonging to the genus Streptomyces such as Streptomyces steffisburgensis, microorganisms belonging to Saccharopolyspora genera such as Saccharopolyspora taberi Genomic DNA derived from a natural microorganism and a hybrida as described above Performed internalization, the probe detects the hybridizing DNA. Specific examples of DNA that can be used as a probe include SEQ ID NOs: 6, 7, 8, 109, 139, 140, 141, 142, 143, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, and 234. DNA having the full length of the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NO: 6, DNA having the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 57 to 730 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6, And DNA having a base sequence represented by -691.
In addition, a polynucleotide having a partial nucleotide sequence of the DNA (A) of the present invention or a nucleotide sequence complementary to the partial nucleotide sequence is used as a primer, for example, Streptomyces @ phaeochromogenes, Streptomyces @ testaceus, Streptomyces @ chromoegenes, Streptomyces, Streptomyces, Streptomyces, Streptomyces @ griseofuscus, Streptomyces @ thermocoerescens, Streptomyces @ nogalator, Streptomyces @ tsusimaensis, Streptomyces @ glomerochromo treptomyces olivochromogenes, Streptomyces ornatus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomyces misawanensis, Streptomyces pallidus, Streptomyces roseorubens, Streptomyces rutgersensis, a microorganism belonging to the genus Streptomyces such as Streptomyces steffisburgensis, naturally occurring microorganisms belonging to Saccharopolyspora genera such as Saccharopolyspora taberi PCR is performed using the genomic DNA derived from the microorganism as a template, and the amplified DNA is detected. It may be. Examples of the primer include primers designed based on the above-described nucleotide sequence of “a region having a particularly high sequence identity in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6, 7, 8, or 109”. More specific examples of the primer include a combination of a primer having the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 124 to 128 and a primer having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 129, and the like.
The DNA thus detected is recovered. When the recovered DNA is less than the full-length nucleotide sequence of the present DNA (A), a DNA corresponding to the full-length nucleotide sequence is prepared using the DNA as described above. The obtained DNA is introduced into a host cell to produce a transformant. By assaying the ability to convert compound (II) into compound (III) using the culture of the obtained transformant as described above, the protein encoded by the DNA introduced into the transformant is determined. And the ability to convert compound (II) to compound (III).
[0026]
In order to express the present DNA (A) in a host cell, the present DNA (A) is introduced into a host cell at a position capable of expression. To introduce the present DNA (A) “at an expressible position” means that the present DNA (A) directs transcription and translation from its base sequence (ie, for example, RNA encoding the present protein (A) and (To promote the production of the present protein (A)).
In order to introduce the present DNA (A) into a host cell so as to be placed at a position where the DNA can be expressed, for example, a promoter operable in the host cell and the present DNA (A) are operably connected. The resulting DNA is introduced into a host cell. Here, “in a operable form” means that the present DNA (A) is linked to a promoter so that it is expressed under the control of the promoter when the DNA is introduced into a host cell. Means
When the host cell is a microbial cell, the operable promoter includes, for example, a promoter of the lactose operon of Escherichia coli, a promoter of the tryptophan operon of Escherichia coli, a T7 phage promoter, or a promoter operable in Escherichia coli such as the tac promoter or the trc promoter. Synthetic promoters and the like. Alternatively, an original promoter present upstream of the present DNA (A) in the chromosome of a microorganism belonging to the genus Streptomyces, Saccharopolyspora or the like may be used.
When the host cell is a plant cell, examples of a functional promoter include a constitutive promoter derived from T-DNA such as a nopaline synthase gene promoter, an octopine synthase gene promoter, a cauliflower mosaic virus-derived 19S promoter or Plant virus-derived promoters such as the 35S promoter, phenylalanine ammonia lyase gene promoter, chalcone synthase gene promoter, inducible promoters such as the Pathogenesis-related @ protein gene promoter, and plant promoters described in JP-A-2000-166577. it can. Further, a terminator operable in a plant cell may be linked to a DNA in which a promoter operable in a plant cell and the present DNA (A) are operably connected as described above. In this case, it is generally better to ligate so that the terminator is located downstream of the present DNA (A). Examples of the functional terminator include a T-DNA-derived constitutive terminator such as a nopaline synthase gene (NOS) terminator, a plant virus-derived terminator such as a garlic virus GV1 and GV2 terminator, and JP-A-2000-166577. And the like.
[0027]
As described above, when the present DNA (A) is introduced into a plant cell so as to be placed at a position where the DNA can be expressed, for example, a DNA having a base sequence encoding a signal sequence for translocation to an intracellular organelle is used. Alternatively, a DNA that is ligated upstream of the present DNA (A) with its reading frame aligned may be used. As used herein, the phrase “connected in reading frame” means that the reading frame encoding the signal sequence for translocation to the intracellular organelle is connected to the reading frame of the present protein (A) encoded by the present DNA (A). Means that they are connected so as to form a continuous reading frame. Examples of the translocation signal sequence that causes translocation and localization of a protein to an intracellular organelle in a plant cell include, for example, those derived from a cytoplasmic precursor protein of a protein localized in a chloroplast of a plant described in US Pat. No. 5,717,084. And a chimeric sequence composed of a plurality of types of transfer signal sequences described in US Pat. No. RE36449. More specifically, a chloroplast transit peptide derived from soybean ribulose-1,5-bisphosphate @ carboxylase small subunit, which can be obtained by the method described in Example 15 described later, and the like can be mentioned.
[0028]
Generally, the present DNA (A), the present DNA (A) ligated as described above with a DNA having a base sequence encoding a signal sequence for translocation to an intracellular organelle, or these DNAs and a host cell, DNA or the like, which is operably connected to a operable promoter, is incorporated into a vector that can be used in a host cell, and is introduced into the host cell. When a vector having a promoter operable in a host cell in advance is used, the present DNA (A) is placed downstream of the promoter so that the promoter having the vector and the present DNA (A) are operably linked. ) Can be inserted.
As a vector, when Escherichia coli is used as a host cell, for example, pUC119 (manufactured by Takara Shuzo), pBluescript II (manufactured by Stratagene), pTVA118N (manufactured by Takara Shuzo), pCR2.1-TOPO (manufactured by Invitrogen), pTrc99A (Amersham Pharmacia Biotech), pKK331-1A (Amersham Pharmacia Biotech), pET11d (Novagen) and the like. When a vector containing a selectable marker gene (for example, a gene providing an antibiotic resistance such as a kanamycin resistance gene or a neomycin resistance gene) is used, the transformant into which the present DNA (A) has been introduced can be used to transform the phenotype of the selectable marker gene. This is convenient when making a selection using the index as an index.
[0029]
Host cells are Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus brevis, Pseudomonas genus, Zymomonas genus, lactic acid bacterium, acetic acid bacterium, Staphylococcus genus, Streptomyces genus; In the case of a microorganism cell such as a mold, the method of introducing the present DNA (A) or a vector containing the present DNA (A) into a host cell may be carried out by a method described in the Biochemical Society of Japan, Shinsei Kagaku, Vol. Chemical Dojin) and the like. Further, for example, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2”^nd"Edition" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, Inc. Or the electroporation method described in "Methods in Electroporation: Gene Pulser / E. Coli Pulser System", Bio-Rad Laboratories, (1993).
The transformant into which the present DNA (A) or the vector containing the present DNA (A) has been introduced can be used, for example, for the phenotype of the selectable marker gene contained in the vector into which the present DNA (A) has been incorporated. It can be selected as an index. Further, the fact that the transformant has the present DNA (A) or a vector containing the present DNA (A) means that after preparing DNA from the transformant, for the prepared DNA, for example, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^nd"Edition" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory, Press, etc. (confirmation of restriction enzyme site, analysis of base sequence, Southern hybridization, PCR, etc.).
[0030]
Further, for example, when the host cell is a plant cell, for example, tobacco, cotton, rape, sugar beet, Arabidopsis, canola, flax, sunflower, potato, alfalfa, lettuce, banana, soybean, peas, other beans, pine, poplar, Monocots such as apple, grape, orange, lemon, other citrus, almond, walnut, and other nuts such as dicotyledonous plants, corn, rice, wheat, barley, rye, oat, sorghum, oats, sugarcane, grass, etc. Plant species such as plants can be mentioned, and as the cells into which the present DNA (A) is introduced, plant tissues, plant individuals, cultured cells, seeds, and the like can be used.
Examples of a method for introducing the present DNA (A) or a vector containing the present DNA (A) into a host cell include Agrobacterium infection method (Japanese Patent Publication No. 2-58917 and JP-A-60-70080) and electroporation to protoplasts. Examples thereof include methods (JP-A-60-251887 and JP-A-5-68575) and particle gun methods (Japanese Patent Laid-Open Publication No. 5-508316 and JP-A-63-258525).
At this time, for example, when a selectable marker gene selected from a hygromycin phosphotransferase gene, a neomycin phosphotransferase gene, a chloramphenicol acetyltransferase gene and the like is introduced into a plant cell simultaneously with the vector containing the present DNA (A), The transformant into which (A) has been introduced can be selected using the phenotype of the selectable marker gene as an index. The selectable marker gene and the present DNA (A) may be incorporated into the same vector for introduction, or the vector having the selectable marker gene and the vector containing the present DNA (A) may be simultaneously introduced. In addition, a clone capable of culturing and growing a plant cell into which the present DNA (A) or a vector containing the present DNA (A) has been introduced is cultured in a medium containing the PPO-inhibiting weed controlling active compound represented by the above general formula (I). , The transformant into which the present DNA (A) has been introduced can also be selected. The fact that the transformant has the present DNA (A) means that after preparing the DNA from the transformant, for the prepared DNA, for example, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2”^ndIt can also be confirmed by performing a genetic engineering analysis method (confirmation of restriction enzyme site, analysis of base sequence, Southern hybridization, PCR, etc.) described in “Edition” (1989), “Cold Spring”, “Laboratory” Press, and the like. The present DNA (A) introduced into a plant cell may be maintained in the cell by being incorporated in DNA contained in an intracellular organelle such as chloroplast, in addition to DNA contained in the nucleus.
From the thus-obtained transformed plant cells, plant cell culture described in, for example, Plant Gene Manipulation Manual: How to Make Transgenic Plants (by Uchimiya, Kodansha Scientific 1990), pp. 27-55, etc. By regenerating the plant by the method, a transformed plant into which the present DNA (A) has been introduced can be obtained. Further, by crossing the transformed plant into which the present DNA (A) has been introduced and a plant of the target variety, the present DNA (A) is introduced into the chromosome of the plant of the target variety, and the present DNA (A) It is also possible to obtain a plant of the target variety into which is introduced.
[0031]
Specifically, for example, the present DNA (A) is introduced and the present protein is introduced by the method described in Chapter 4 of Experimental Protocol for Model Plants, edited by Rice Arabidopsis thaliana (edited by Isao Shimamoto, supervised by Kiyotaka Okada, Shujunsha, 1996). Rice and Arabidopsis thaliana expressing (A) can be obtained. In addition, a soybean expressing the present protein (A) into which the present DNA (A) has been introduced can be obtained by introducing the present DNA (A) into a soybean somatic embryo using a particle gun by a method described in JP-A-3-291501. . Similarly, Fromm, M .; E. FIG. , Et @ al. According to the method described in Bio / Technology, {8; {p838} (1990), the present DNA (A) is introduced into a maize somatic embryo using a particle gun, and the maize expressing the present protein (A) is introduced. Can be obtained. According to the usual method described in Yami et al., Journal of the Japanese Society of Breeding, 1995, Vol. 44, Separate Volume 1, page 57, introduced into a wheat immature scutellum aseptically cultured using a particle gun, A wheat into which the present DNA (A) is introduced and which expresses the present protein (A) can be obtained. Similarly, it was introduced into barley immature scutellum aseptically cultured using a particle gun according to the usual method described in Hagio et al., Journal of the Japanese Society of Breeding, 1995, vol. 44, separate volume 1, page 67. Thus, a barley into which the present DNA (A) is introduced and which expresses the present protein (A) can be obtained.
[0032]
The transformant into which the DNA (A) has been introduced and which expresses the protein (A) can convert the compound (I) into a compound having a lower weed controlling activity in the cell, thereby converting the compound with the weed controlling active compound. Plant injury can be reduced. Specifically, for example, before sowing a seed of a plant of a target variety, a microorganism expressing the present protein (A) is sprayed on a cultivation area soil of the target cultivated plant, so that the microorganism remains in the soil. The above-mentioned weed controlling compound can be metabolized to reduce damage to the target plant caused by the weed controlling compound. In addition, by expressing the present protein (A) in a plant of a target variety, the plant is provided with the ability to metabolize the PPO-inhibiting weed controlling active compound represented by the general formula (I) into a compound having a lower activity. Is done. As a result, plant damage due to the weed controlling compound is reduced in the plant, or resistance to the compound is imparted.
[0033]
The present protein (A) can be prepared, for example, by culturing cells having the present DNA (A). Such cells include microorganisms capable of expressing the present DNA (A) and producing the present protein (A), such as a microorganism strain isolated from nature having the present DNA (A), Mutants and the like induced by treatment with drugs, ultraviolet rays, and the like can be given. More specifically, for example, Streptomyces phaeochromogenes IFO12898, Streptomyces testaceus ATCC21469, Streptmyces achromogenes IFO 12735, Streptomyces griseolus ATCC11796, Streptomyces carbophilus SANK62585, Streptomyces griseofuscus IFO 12870t, Streptomyces thermocoerulescens IFO 14273t, Streptomyces nogalater IFO 13445, Streptomyces tsusimaensis IFO 137 2, Streptomyces glomerochromogenes IFO 13673t, Streptomyces olivochromogenes IFO 12444, Streptomyces ornatus IFO 13069t, Streptomyces griseus ATCC 10137, Streptomyces griseus IFO 13849T, Streptomyces lanatus IFO 12787T, Streptomyces misawanensis IFO 13855T, Streptomyces pallidus IFO 13434T, Streptomyces roseorubens IFO 13682T, Streptomyces utgersensis IFO 15875T, microorganisms and belonging to the genus Streptomyces such as Streptomyces steffisburgensis IFO 13446T, microorganisms, and the like belonging to Saccharopolyspora genera such as Saccharopolyspora taberi JCM 9383t. In addition, a transformant in which the present DNA (A) or a vector containing the present DNA (A) has been introduced into a host cell can also be mentioned. Specifically, for example, there can be mentioned a transformant in which the present DNA (A) operably connected to a tac promoter, trc promoter, lac promoter or T7 phage promoter is introduced into Escherichia coli. Typical examples include E. coli described in Examples below. E. coli @ JM109 / pKSN657, E. coli. E. coli @ JM109 / pKSN657F, E. coli. E. coli @ JM109 / pKSN923, E. coli. coli @ JM109 / pKSN923F, E. coli. E. coli @ JM109 / pKSN11796, E. coli. E. coli @ JM109 / pKSN11796F, E. coli. E. coli @ JM109 / pKSN671, E. coli. coli JM109 / pKSN671F, E. coli. coli @ JM109 / pKSNSCA, E. coli. E. coli @ JM109 / pKSN646, E. coli. coli JM109 / pKSN646F, E. coli. E. coli @ JM109 / pKSN849AF, E. coli. coli @ JM109 / pKSN1618F, E. coli. coli @ JM109 / pKSN474F, E. coli. E. coli @ JM109 / pKSN1491AF, E. coli. E. coli @ JM109 / pKSN1555AF, E. coli. E. coli @ JM109 / pKSN1584F; coli @ JM109 / pKSN1609F.
[0034]
As a medium for culturing a microorganism having the present DNA (A) as described above, various media usually containing a carbon source, a nitrogen source, organic or inorganic salts, and the like, which are commonly used for culturing microorganisms, may be used. it can. Heme precursor compounds such as aminolevulinic acid may be added to the medium.
Examples of the carbon source include sugars such as glucose, fructose, sucrose and dextrin; sugar alcohols such as glycerol and sorbitol; and organic acids such as fumaric acid, citric acid and pyruvic acid. The amount of these carbon sources added to the medium is usually about 0.1% (w / v) to about 10% (w / v) based on the total amount of the medium.
As the nitrogen source, for example, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium salts of inorganic acids such as ammonium phosphate, ammonium fumarate, ammonium salts of organic acids such as ammonium citrate, meat extract, yeast extract, malt extract, soybean powder, Natural organic nitrogen sources such as corn stay liquor, cottonseed flour, dried yeast, casein hydrolyzate and the like, and amino acids. Of these, ammonium salts of organic acids, natural organic nitrogen sources, amino acids and the like can often be used as carbon sources. The addition amount of the nitrogen source is usually about 0.1% (w / v) to about 10% (w / v) based on the total amount of the medium.
Examples of the inorganic salts include phosphates such as monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, monosodium phosphate and disodium phosphate; chloride salts such as potassium chloride, sodium chloride and cobalt chloride hexahydrate; Examples thereof include metal sulfates such as magnesium sulfate, ferrous sulfate heptahydrate, zinc sulfate heptahydrate, and manganese sulfate trihydrate. It is about 0001% (w / v) to about 1% (w / v).
Further, a transformant having the present DNA (A) connected downstream of the T7 phage promoter and a DNA having a nucleotide sequence encoding T7 RNA polymerase (λDE3 lysogen) connected downstream of the lacUV5 promoter is cultured. In this case, usually, for example, isopropyl-β-D-thiogalactoside (hereinafter referred to as IPTG) is added to the medium in a small amount as an inducer for inducing the production of the present protein (A). Culturing a transformant in which a DNA obtained by operably connecting a lactose-inducible promoter such as a tac promoter, a trc promoter, or a lac promoter to the present DNA (A) is introduced into a host cell. In some cases, IPTG may be added to the medium.
[0035]
The cultivation of the microorganism having the DNA (A) can be carried out according to a method usually used for culturing a microorganism, such as vortex shaking culture, reciprocal shaking culture, Jar Fermenter culture or tank culture. , A liquid culture, a solid culture and the like. When a jar fermenter is used, it is necessary to introduce aseptic air into the jar fermenter, and usually, aeration conditions of about 0.1 times to about 2 times / minute of the volume of the culture solution are used. The culture temperature can be appropriately changed within a range in which the microorganism can grow, but the culture temperature is generally in the range of about 15 ° C. to about 40 ° C., and the pH of the medium is preferably in the range of about 6 to about 8. The culturing time varies depending on the culturing conditions, but is usually about 1 day to about 10 days.
[0036]
The present protein (A) produced by a microorganism having the present DNA (A) is, for example, a culture of a microorganism producing the present protein (A), a cell of a microorganism producing the present protein (A), or such a cell. In various forms, such as a treated product, a cell-free extract, a crude protein, a purified protein, and the like, it can be used for treating, for example, the PPO-inhibiting weed controlling active compound represented by the general formula (I). Here, as the processed material of the cells, for example, freeze-dried cells, acetone-dried cells, ground cells, autolysed cells, ultrasonically treated cells, alkali-treated cells, bacteria And organic solvent-treated products of the body. In addition, the protein (A) in various forms as described above can be prepared by, for example, using an inorganic carrier such as silica gel or ceramics, a polysaccharide derivative such as DEAE-cellulose, or Amberlite IRA935 (trade name, Rohm and Haas). Carrier-binding method to adsorb to synthetic polymers such as polyacrylamide, sulfur-containing polysaccharide gel (eg, carrageenan gel), alginate gel or agar gel, etc. It can be immobilized according to a known method and used for the treatment of the weed controlling active compound.
[0037]
As a method for purifying the present protein (A) from a culture of a microorganism having the present DNA (A), a method generally used in protein purification can be applied. For example, the following method can be used. it can.
First, cells are collected from a culture of a microorganism by centrifugation or the like, and then subjected to a physical disruption method such as ultrasonic treatment, dynomill treatment or French press treatment, or a cell lysing enzyme such as a surfactant or lysozyme. Crushing is performed according to the chemical crushing method used. From the obtained crushed liquid, insoluble substances were removed by centrifugation, filtration through a membrane filter, etc. to prepare a cell-free extract, which was then subjected to cation exchange chromatography, anion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography. The protein (A) can be purified by fractionation using a separation and purification method such as chromatography as appropriate. Examples of a carrier used for chromatography include a resin carrier such as cellulose, dextran, or agarose, into which a carboxymethyl (CM) group, a diethylaminoethyl (DEAE) group, a phenyl group, a butyl group, or the like has been introduced. A commercially available column packed with a carrier can also be used. For example, Q-Sepharose @ FF, Phenyl-Sepharose @ HP, PD-10, HiLoad @ 26/10 @ Q Sepharose @ HP (trade names, all manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), TSK-gel G3000SW (trade name, manufactured by Tosoh Corporation) and the like.
[0038]
An example of the procedure for purifying the present protein (A) will be described.
The cells of the microorganism producing the present protein (A) are collected by centrifugation, and then suspended in a buffer such as 0.1 M potassium phosphate (pH 7.0). This was crushed with an ultrasonic crusher, and the obtained cell lysate was centrifuged at about 40,000 × g for about 30 minutes, and the supernatant was recovered and collected at 150,000 × g for 1 minute. Centrifuge for about an hour and collect the supernatant (cell-free extract). The obtained cell-free extract is fractionated with ammonium sulfate to obtain a fraction which is soluble in the presence of 45% saturated ammonium sulfate and precipitates in the presence of 55% saturated ammonium sulfate. After replacing the solvent of this fraction with a buffer solution containing no ammonium sulfate such as 0.1 M potassium phosphate (pH 7.0) using a PD10 column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) or the like, for example, {HiLoad} 26/10 The column was introduced into a Q Sepharose HP column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), and a 20 mM bistrispropane buffer (pH 7.0) having a linear concentration gradient of sodium chloride was passed therethrough to fractionate and collect the eluate. The fraction in which the activity of converting the compound (II) into the compound (III) is detected in the presence of the electron transfer system from the donor is collected. Next, the fraction is subjected to buffer replacement using, for example, a PD10 column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) or the like, and then injected into Bio-Scale Ceramic, for example, Hydroxyapatite, {TypeIcolum} CHT10-I (manufactured by Bio-Rad). After washing the column with A buffer (2 mM potassium phosphate buffer containing 1.5 mM calcium chloride; pH 7.0), B buffer (100 mM potassium phosphate buffer containing 0.03 mM calcium chloride; pH 7.0) A buffer having a linear concentration gradient by the addition of A is flowed, the eluate is fractionated and collected, and compound (II) is converted to compound (III) in the presence of an electron transfer system from an electron donor such as coenzyme NADPH. Collect the fractions where the converting activity is detected. The obtained fraction is subjected to buffer replacement using, for example, a PD10 column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) or the like, and then concentrated by, for example, ultrafiltration (microcon filter unit Microcon-30, manufactured by MILLIPORE). The obtained fraction is injected into, for example, a HiLoad 16/60 Superdex 75 pg column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), and eluted with a 0.05 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.15 M sodium chloride. The eluate is fractionated and collected, and fractions in which the activity of converting compound (II) to compound (III) is detected in the presence of an electron transfer system from an electron donor such as coenzyme NADPH are collected. If necessary, the protein (A) can be purified by fractionation by SDS-PAGE.
[0039]
The protein (A) of the present invention is purified as described above, and the obtained protein (A) of the present invention is used as an immunizing antigen, whereby an antibody recognizing the protein (A) of the present invention (hereinafter referred to as the antibody of the present invention (A ) May be written.)
Specifically, for example, an animal is immunized with the protein (A) of the present invention purified as described above as an antigen. For example, to immunize animals such as mice, hamsters, guinea pigs, chickens, rats, rabbits, dogs, etc. ASSOC. OFF. ANAL. Chem. 70 (6) {1025-1027} (1987). H. The antigen is administered one or more times using conventional immunization methods such as Newsome. The administration schedule includes, for example, administration of 2 or 3 times at intervals of 7 to 30 days, preferably at intervals of 12 to 16 days. Each dose is, for example, about 0.05 mg to about 2 mg of the antigen. The route of administration can be selected from subcutaneous administration, intradermal administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, etc., but intravenous, intraperitoneal or subcutaneous injection is a common administration form. is there. The antigen may be an appropriate buffer, for example, complete Freund's adjuvant (a mixture of Acel @ A. Bayol @ F @ tuberculosis-killed bacterium), RAS [MPL (Monophosphoryl @ lipid @ A) + TDM (Synthetic @ Thalose @ DicolinoWallCell + CollinocelloCell.com / ClonylWalco. It is used by dissolving it in a sodium phosphate buffer containing one kind of a commonly used adjuvant such as aluminum hydroxide, physiological saline, or the like. However, depending on the administration route and conditions, the above adjuvant may be used. Sometimes not. Adjuvants are substances that, when administered together with an antigen, nonspecifically enhance the immune response to that antigen. After the animals to which the antigen has been administered as described above are bred for 0.5 to 4 months, a small amount of blood of the animals is sampled from the ear vein or the like, and the antibody titer is measured. If the antibody titer has increased, the administration of the antigen is further performed an appropriate number of times depending on the situation. For example, another administration of the antigen at a dose of about 100 μg to about 1000 μg. One to two months after the last dose, blood is collected from the immunized animals by conventional methods. The collected blood is, for example, centrifuged, precipitated by using ammonium sulfate or polyethylene glycol, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, by fractionation by conventional methods such as affinity chromatography and the like, The antibody (A) of the present invention can be obtained as a polyclonal antiserum. The complement system may be inactivated by keeping the serum at 56 ° C. for 30 minutes, for example.
Further, the antibody (A) of the present invention can also be prepared by chemically synthesizing a polypeptide having a partial amino acid sequence of the protein (A) of the present invention and administering it to an animal as an immunizing antigen. As the amino acid sequence of the polypeptide used as the immunizing antigen, for example, an amino acid sequence having the lowest possible homology with the amino acid sequences of other proteins is selected from the amino acid sequences of the protein (A) of the present invention. A polypeptide consisting of the selected amino acid sequence and having a length of about 10 to 15 amino acids is chemically synthesized according to a conventional method, and cross-linked with a carrier protein such as Limolus polyhemus hemocyanin by MBS or the like, and then the same as above. To immunize animals such as rabbits.
The antibody (A) of the present invention thus prepared is brought into contact with a test sample, and a complex of the protein and the antibody in the test sample is detected, for example, according to a conventional immunological technique. The polypeptide having the protein (A) of the present invention or a partial amino acid sequence thereof in the test sample can be detected. Specifically, for example, the presence or absence of the protein of the present invention (A) in the test sample is determined by Western blot analysis using the antibody of the present invention (A) as described in Example 45 or 73 described below. It is possible to quantify the protein (A) of the present invention.
Further, for example, the antibody (A) of the present invention is brought into contact with a test cell or a sample prepared from the test cell, and a complex of the test cell or a protein in the sample prepared from the test cell and the antibody is subjected to normal immunization. The cells expressing the protein (A) of the present invention can also be detected by performing detection according to a biological technique. As described above, by detecting cells expressing the protein (A) of the present invention, cells expressing the protein (A) of the present invention can be selected from various cells. For example, a genomic DNA library is prepared by extracting genomic DNA from a cell that expresses the protein (A) of the present invention and inserting it into an expression vector, and introducing them into the cell. By selecting cells expressing the protein (A) of the present invention from the obtained cell population using the antibody (A) of the present invention as described above, DNA encoding the protein (A) of the present invention can be obtained. It is also possible to select and clone the containing clone.
The kit containing the antibody (A) of the present invention can be used, for example, for the detection of the protein (A) of the present invention and the analysis, detection, and inspection of cells expressing the protein (A) of the present invention. it can. Such a kit of the present invention may contain, in addition to the antibody (A) of the present invention, a reagent necessary for the above-described analysis technique, or may be used in combination with such a reagent.
[0040]
When the present protein (A) is allowed to act on the PPO-inhibited weed controlling compound represented by the general formula (I) in the presence of an electron transfer system from an electron donor such as coenzyme NADPH, the compound is metabolized. , Are converted to compounds with lower weed control activity. Specifically, for example, when the present protein (A) is allowed to act on compound (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor such as coenzyme NADPH, compound (II) has a substantial weed control activity. Is converted to the compound (III) not shown in the above. Here, examples of the present protein (A) include the present protein (A). One protein of the present protein (A) may act, or a plurality of proteins may be used in combination.
Specific examples of the uracil compound represented by the general formula (I) include the compound (II) and a compound represented by any of the following formulas (IV) to (IX) [hereinafter, compounds (IV) to (IX), respectively] This is referred to as compound (IX). ] Etc. can be given. Compound (II) and compound (IX) are described in JP-A-2000-319264, compound (IV) and compound (V) are described in U.S. Pat. No. 5,183,492, compound (VI) is described in U.S. Pat. The compound (VII) can be synthesized according to the method described in JP-A-3-204865, and the compound (VIII) can be synthesized according to the method described in JP-A-6-321941.
[0041]

[0042]
In addition, as a specific example of the compound represented by the general formula (I), a compound represented by any of the following formulas (X) to (XVII) [hereinafter, referred to as compound (X) to compound (XVII), respectively. ] Etc. can also be given.

[0043]
The compound that can be a substrate for a metabolic reaction by the present protein (A) is, for example, a compound (II) labeled with a radioisotope or the like in the presence of an electron transfer system from an electron donor such as coenzyme NADPH. ) Is present in a reaction system in which the present protein (A) is allowed to act, whereby the conversion reaction of the present compound (A) from the labeled compound (II) to the labeled compound (III) is inhibited by competition. Can be selected. When the presence or absence of competition inhibition by the test compound is assayed in this way, the test compound is usually added so as to have a molar concentration of about 1 to 100 times that of the labeled compound (II).
[0044]
The reaction that causes the present protein (A) to act on the compound (I) is, for example, an inorganic acid salt such as an alkali metal phosphate such as sodium phosphate or potassium phosphate, or an alkali metal salt such as sodium acetate or potassium acetate. And the like can be carried out in an aqueous buffer containing an organic acid salt or the like. The concentration of the compound represented by the above general formula (I) in the metabolic reaction solution is usually about 30% (w / v) or less, preferably 0.001% (w / v) to 20% (w / v). v) degree. The amount of the electron transfer system from the electron donor such as NADPH and the present protein (A) can be appropriately determined in consideration of, for example, the reaction time. The reaction temperature is generally selected from the range of about 10 ° C to about 70 ° C, and preferably about 20 ° C to about 50 ° C. The pH of the reaction solution is generally selected from the range of about 4 to about 12, and preferably about 5 to about 10. The reaction time can be arbitrarily set, and is usually about 1 hour to about 10 days.
Further, the reaction of the present protein (A) acting on the compound (I) can also be carried out in cells having the present DNA (A). The cell having the present DNA (A) is, for example, a microorganism capable of expressing the present DNA (A) and producing the present protein (A), for example, the present DNA (A) isolated from the natural world. A microorganism strain derived from the microorganism strain, a mutant strain derived from the microorganism strain by treatment with a drug, ultraviolet light, or the like, a transformed microorganism cell obtained by introducing the present DNA (A) or a vector containing the present DNA (A) into a host cell. be able to. In addition, a transformed plant cell into which the present DNA (A) has been introduced and a transformed plant cell into which the present DNA (A) has been introduced can also be mentioned. In such a case, the compound represented by the above general formula (I) may be contained in a culture solution of the cells, soil contacted with the cells, or the like so as to be taken up by the cells having the present DNA (A). May be applied directly to the cells. As the electron transfer system from an electron donor such as NADPH, a system that the cell originally has in the cell may be used, or added from outside the cell.
[0045]
The metabolism of compound (I) by the present protein (A) can be confirmed, for example, by detecting a compound produced by the metabolism of compound (I). Specifically, for example, compound (III) generated by metabolism of compound (II) can be detected by HPLC analysis or TLC analysis as described above.
In addition, the metabolism of compound (I) by the present protein (A) was such that the weed controlling activity of the reaction solution after the present protein (A) was allowed to act on the compound (I) did not cause the present protein (A) to act. It can also be confirmed by the fact that it is lower than the case. As a test method of the weed controlling activity, for example, a method of examining the weed controlling effect by spraying the above-mentioned reaction solution on weeds such as barnyardgrass, locust beetle, American morning glory, ibis, etc. Can be cultivated and the effect of controlling weed control can be examined. Further, a method of dropping the above-mentioned reaction solution on leaf pieces collected from a plant and examining the presence or absence of plant damage (whitening) by the reaction solution can also be mentioned.
In addition, the metabolism of compound (I) by the present protein (A) is such that the PPO inhibitory activity of the reaction solution after the action of the present protein (A) on compound (I) is higher than that of compound (I) by the compound (I). Can be confirmed as an indicator that the activity is reduced as compared with the activity of the reaction solution without the action. PPO is an enzyme that catalyzes the conversion of protoporphyrinogen IX to protoporphyrin IX (hereinafter referred to as PPIX). Therefore, for example, after the above-mentioned reaction solution is added to the reaction system of PPO, protoporphyrinogen IX which is a substrate of PPO is added, and the mixture is kept in a dark place at 30 ° C. for 1 hour to 2 hours. Next, the amount of PPIX in each heat retaining solution is measured using HPLC or the like. The amount of PPIX in the system to which the reaction solution after the present protein (A) was allowed to act on the compound (I) was the same as the amount of PPIX in the system to which the reaction solution in which the present protein (A) was not acted on the compound (I) was added. When the amount is larger than the amount, it is determined that the compound (I) is metabolized by the present protein (A). As the PPO, a protein purified from a plant or the like may be used, or a chloroplast fraction extracted from a plant may be used. When a chloroplast fraction is used, instead of protoporphyrinogen IX, aminolevulinic acid, which is a precursor of protoporphyrinogen IX in the chlorophyll-heme biosynthesis pathway, is used in the PPO reaction system. Is also good. A more specific example is shown in Example 42 described later.
[0046]
By acting the present protein (A) in this way, a treatment is performed to metabolize the PPO-inhibiting weed controlling compound represented by the above general formula (I) and convert the compound into a compound having a lower weed controlling activity. be able to. By treating the compound sprayed in the plant cultivation area, specifically, for example, the compound sprayed in the plant cultivation area and remaining on the soil or plant residue with the present protein (A), Plant damage caused by the compound can also be reduced.
[0047]
Examples of the “electron transfer system from an electron donor” that can be used when allowing the present protein (A) to act on compound (I) include, for example, coenzyme NADPH, ferredoxin and ferredoxin-NADP⁺A system containing a reductase can be mentioned.
Examples of a method for causing an “electron transfer system from an electron donor” to be present in a reaction system in which the present protein (A) acts on the compound (I) include, for example, plants derived from plants such as NADPH and spinach, and plants such as spinach and the like. Ferredoxin-NADP⁺A method of adding a reductase to the above reaction system can be given. Further, a fraction containing a component capable of functioning as an electron transfer system in the reaction system of the present protein (A) may be prepared from a microorganism such as Escherichia coli and added to the reaction system. In order to prepare such a fraction, for example, after collecting cells by centrifugation or the like from a culture of a microorganism or the like as described above, a physical disruption method such as ultrasonic treatment, dynomill treatment or French press treatment is performed. Or a chemical disruption method using a cell lysing enzyme such as a surfactant or lysozyme. Insoluble matter is removed from the obtained crushed liquid by centrifugation, filtration with a membrane filter, etc., to prepare a cell-free extract. The cell-free extract can be used as it is as a fraction containing a component that can function as an electron carrier in the reaction system of the present protein (A), instead of the above ferredoxin. In addition, for example, when a reaction between the present protein (A) and the compound (I) is performed in a cell such as a microorganism or a plant cell, electrons from an electron donor are transferred into the cell of the present protein (A). When there is a system that can transfer electrons to the reaction system, it is not necessary to newly add an electron transfer system to the reaction system.
[0048]
The ferredoxin, for example, Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Streptmyces achromogenes, Streptomyces griseolus, Streptomyces thermocoerulescens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaensis, Streptomyces glomerochromogenes, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces ornatus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomyc s misawanensis, Streptomyces pallidus, Streptomyces roseorubens, Streptomyces rutgersensis, a microorganism belonging to the genus Streptomyces such as Streptomyces steffisburgensis, more specifically, Streptomyces phaeochromogenes IFO12898, Streptomyces testaceus ATCC21469, Streptmyces achromogenes IFO 12735, Streptomyces griseolus ATCC11796, Streptomyces thermocoerulescens IFO14273t, Strep omyces nogalater IFO 13445, Streptomyces tsusimaensis IFO13782, Streptomyces glomerochromogenes IFO 13673t, Streptomyces olivochromogenes IFO 12444, Streptomyces ornatus IFO 13069t, Streptomyces griseus ATCC 10137, Streptomyces griseus IFO 13849T, Streptomyces lanatus IFO12787T, Streptomyces misawanensis IFO 13855T, Streptomyces pallidus IF O13434T, Streptomyces roseorubens IFO 13682T, Streptomyces rutgersensis IFO 15875T, such as Streptomyces steffisburgensis IFO 13446T, or microorganisms belonging to Saccharopolyspora genus Saccharopolyspora Taberi, more specifically, ferredoxin can be prepared from such Saccharopolyspora taberi JCM 9383t [hereinafter , May be collectively referred to as the present protein (B). ] Can also be used. Specifically, for example, a ferredoxin selected from the following group [hereinafter, may be collectively referred to as the present protein (B). ] Can be given.
<Protein group>
(B1) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 [hereinafter sometimes referred to as the present protein (B1). ].
(B2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 [hereinafter sometimes referred to as the present protein (B2). ].
(B3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 [hereinafter sometimes referred to as the present protein (B3). ].
(B4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 111 [hereinafter sometimes referred to as the present protein (B4). ].
(B5) A ferredoxin having an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 12, 13, 14 or 111.
(B6) Ferredoxin having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 90% or more sequence identity with any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, 13, 14, or 111.
(B7) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 149 [hereinafter sometimes referred to as the present protein (B7). ].
(B8) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 150 [hereinafter sometimes referred to as the present protein (B8). ].
(B9) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 151 [hereinafter sometimes referred to as the present protein (B9). ].
(B10) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 152 [hereinafter sometimes referred to as the present protein (B10). ].
(B11) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 153 [hereinafter sometimes referred to as the present protein (B11). ].
(B12) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 149, 151, 152, 153, 245, 247, 248, 249, 250, 251 or 253, or SEQ ID NO: 150; Ferredoxin having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 252 or 254.
(B13) 90% or more of any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 149, 150, 151, 152, 153, 245, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, or 254 Ferredoxin having an amino acid sequence encoded by an identical nucleotide sequence.
(B14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 245.
(B15) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 247.
(B16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 248.
(B17) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 249;
(B18) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 250;
(B19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 251;
(B20) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 252;
(B21) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 253;
(B22) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 254.
[0049]
The DNA encoding the present protein (B) (hereinafter sometimes referred to as the present DNA (B)) is, for example, SEQ ID NO: 12, 13, 14, 111, 149 which is the amino acid sequence of the present protein (B). , 150, 151, 152, 153, 245, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, or 254, based on the base sequence encoding the amino acid sequence, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition” (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, Inc. And the like, and can be obtained by a method according to a general genetic engineering method described in, for example.
[0050]
The DNA encoding the protein (B) of the present invention (hereinafter sometimes collectively referred to as the DNA (B) of the present invention) includes:
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 [hereinafter, may be referred to as DNA (B1) of the present invention. ],
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 [hereinafter, may be referred to as the present DNA (B2). ],
A DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 [hereinafter may be referred to as the present DNA (B3). ],
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 111 [hereinafter may be referred to as the present DNA (B4). ],
DNA encoding ferredoxin having an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 12, 13, 14, or 111;
DNA encoding ferredoxin having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 90% or more sequence identity with any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, 13, 14, or 111;
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 149 [hereinafter, may be referred to as DNA of the present invention (B7). ],
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 150 [hereinafter, may be referred to as DNA (B8) of the present invention. ],
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 151 [hereinafter, may be referred to as DNA of the present invention (B9). ],
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 152 [hereinafter, may be referred to as DNA (B10) of the present invention. ],
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 153 [hereinafter may be referred to as the protein of the present invention (B11). ],
An amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 149, 151, 152, 153, 245, 247, 248, 249, 250, 251 or 253, or SEQ ID NOs: 150, 252 or 254 A DNA encoding ferredoxin having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by
SEQ ID NO: 149, 150, 151, 152, 153, 245, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, or 254 having 90% or more sequence identity with any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence. DNA encoding ferredoxin having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 245,
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 247,
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 248,
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 249,
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 250,
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 251,
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 252,
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 253,
DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 254
Can be given.
More specific examples of the DNA (B) of the present invention include SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 112, 154, 155, 156, 157, 158, 255, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263. Or 264, DNA having any of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 112, 154, 155, 156, 157, 158, 255, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263. Alternatively, a DNA having a nucleotide sequence having 90% or more sequence identity with any of the nucleotide sequences represented by 264 can be mentioned. Such a DNA is prepared by a method such as PCR using a DNA having a partial base sequence of the base sequence as a primer or hybridization using the DNA as a probe in accordance with the conditions and the like described in the method for preparing the present DNA (A). Then, it can be prepared.
Specifically, for example, using a chromosomal DNA or a chromosomal DNA library prepared from Streptomyces @ phaeochromogenes @ IFO12898 as a template, an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 105 and an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 53 By performing PCR using as a primer, a DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 and a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 can be obtained.
Further, using as a template a chromosomal DNA or a chromosomal DNA library prepared from Saccharopolyspora \ taberi \ JCM \ 9383t, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 106 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 63 as primers By performing PCR using the DNA, a DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 and a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 can be obtained.
Further, using a chromosomal DNA or a chromosomal DNA library prepared from Streptomyces @ testaceus @ ATCC21469 as a template, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 107 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 72 as primers By performing the PCR, a DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 and a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 17 can be obtained.
Further, for example, Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Streptmyces achromogenes, Streptomyces thermocoerulescens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaensis, Streptomyces glomerochromogenes, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces ornatus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomyces misawanensis, Streptomyces pal idus, Streptomyces roseorubens, Streptomyces rutgersensis, a microorganism belonging to the genus Streptomyces such as Streptomyces steffisburgensis, more specifically, Streptomyces phaeochromogenes IFO12898, Streptomyces testaceus ATCC21469, Streptmyces achromogenes IFO 12735, Streptomyces thermocoerulescens IFO 14273t, Streptomyces nogalater IFO 13445, Streptomyces tsusimaensis IFO $ 13782, S reptomyces glomerochromogenes IFO 13673t, Streptomyces olivochromogenes IFO 124444, Streptomyces ornatus IFO 13069t, Streptomyces griseus ATCC 10137, Streptomyces griseus IFO 13849T, Streptomyces lanatus IFO 12787T, Streptomyces misawanensis IFO 13855T, Streptomyces pallidus IFO 13434T, Streptomyces roseorubens IFO 13682T, Streptomyces rutg For example, Escherichia coli ISF @ 15875T, Streptomyces steffisburgensis IFO @ 13446T, or a microorganism belonging to the genus Saccharopolyspora such as Saccharopolyspora @ taberi. No. 12, 13, 14, 111, 149, 150, 151, 152 or 153, using as a probe a DNA consisting of about 20 or more bases having a base sequence encoding any of the amino acid sequences described above, under the conditions described above. The DNA of the present invention was obtained by detecting and recovering DNA to which the probe specifically binds. It is also possible to obtain the A (B). Specific examples of the DNA used as such a probe include SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 112, 154, 155, 156, 157, 158, 255, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, and 264. Examples include DNA having any of the base sequences shown, DNA having a partial base sequence of such a base sequence, DNA having a base sequence complementary to the partial base sequence, and the like.
[0051]
In order to express the present DNA (B) in a host cell, for example, a DNA in which a promoter operable in a host cell and the present DNA (B) are operably connected to each other is referred to as “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”. 2nd edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, Inc. And the like, and prepared into a host cell by a method according to a conventional genetic engineering method. The fact that the obtained transformant has the present DNA (B) means that after preparing DNA from the transformant, for the prepared DNA, for example, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2”^nd"Edition" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory, Press, etc. (confirmation of restriction enzyme site, analysis of base sequence, Southern hybridization, PCR, etc.). The present DNA (B) and the present DNA (B) are introduced into a cell having the present DNA (A) by introducing a DNA in which a promoter operable in a host cell and the present DNA (B) are operably connected to each other. A) can also be expressed in the same cell.
[0052]
The present protein (B) can be prepared, for example, by culturing cells having the present DNA (B). Such cells include microorganisms capable of expressing the present DNA (B) and producing the present protein (B), for example, a microorganism strain isolated from nature having the present DNA (B), and a drug from the microorganism strain. And mutant strains induced by treatment with UV light or the like. For example, Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Streptmyces achromogenes, Streptomyces griseolus, Streptomyces thermocoerulescens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaensis, Streptomyces glomerochromogenes, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces ornatus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomyces misawanen is, Streptomyces pallidus, Streptomyces roseorubens, Streptomyces rutgersensis, a microorganism belonging to the genus Streptomyces such as Streptomyces steffisburgensis, more specifically, Streptomyces phaeochromogenes IFO12898, Streptomyces testaceus ATCC21469, Streptmyces achromogenes IFO 12735, Streptomyces griseolus ATCC11796, Streptomyces thermocoerulescens IFO 14273t, Streptomyces @ nog later IFO 13445, Streptomyces tsusimaensis IFO 13782, Streptomyces glomerochromogenes IFO 13673t, Streptomyces olivochromogenes IFO 124444, Streptomyces ornatus IFO 13069t, Streptomyces griseus ATCC 10137, Streptomyces griseus IFO 13849T, Streptomyces lanatus IFO 12787T, Streptomyces misawanensis IFO 13855T, Streptomyces pallidus IFO 13434T , Streptomyces roseorubens IFO 13682T, Streptomyces rutgersensis IFO 15875T, such as Streptomyces steffisburgensis IFO 13446T, or, a microorganism belonging to Saccharopolyspora genera such as Saccharopolyspora taberi, more specifically, such as Saccharopolyspora taberi JCM 9383t, and the like. Further, a transformant into which the present DNA (B) has been introduced into a host cell can also be mentioned. Specifically, for example, there can be mentioned a transformant in which the present DNA (B) operably connected to a tac promoter, trc promoter, lac promoter or T7 phage promoter has been introduced into Escherichia coli. Typical examples include E. coli described in Examples below. E. coli @ JM109 / pKSN657FD, E. coli. E. coli @ JM109 / pKSN923FD, E. coli. coli @ JM109 / pKSN671FD.
[0053]
The cultivation of the microorganism having the present DNA (B) is carried out according to the method usually used for culturing microorganisms, and more specifically, under the conditions described in the method for culturing the microorganism having the present DNA (A). Can be performed in compliance.
The present protein (B) produced by a microorganism having the present DNA (B) is, for example, a culture of a microorganism producing the present protein (B), cells of a microorganism producing the present protein (B), and such cells. , A cell-free extract, a crude protein, a purified protein, and various other forms can be used in the reaction system of the present protein (A). Here, as the processed material of the cells, for example, freeze-dried cells, acetone-dried cells, ground cells, autolysed cells, ultrasonically treated cells, alkali-treated cells, bacteria And organic solvent-treated products of the body. In addition, according to known methods such as a carrier binding method in which the various forms of the present protein (B) as described above are adsorbed to a synthetic polymer or the like, and an entrapment method in which the protein (B) is confined in a polymer network structure. It can be immobilized and used for the reaction system of the present protein (A).
[0054]
As a method for purifying the present protein (B) from a culture of a microorganism having the present DNA (B), a method generally used in protein purification can be applied. For example, the following method may be mentioned. Can be.
First, cells are collected from the culture of the microorganism by centrifugation or the like, and then crushed by a physical crushing method such as ultrasonic treatment or a chemical crushing method using a cell lysing enzyme such as lysozyme. From the obtained crushed liquid, insoluble substances were removed by centrifugation, filtration through a membrane filter, etc. to prepare a cell-free extract, which was then subjected to cation exchange chromatography, anion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography. The protein (B) can be purified by fractionation using an appropriate separation and purification method such as chromatography. The protein (B) can be further purified by fractionating the obtained fraction by SDS-PAGE or the like.
[0055]
The function of the present protein (B) as ferredoxin is based on the fact that ferredoxin-NADP in a reaction system in which the present protein (A) acts on compound (I).⁺It can be confirmed as a function as an electron carrier from the reductase to the present protein (A). Specifically, for example, NADPH, ferredoxin-NADP is added to a reaction system for allowing the present protein (A) to act on the compound (II).⁺It can be confirmed by adding the present protein (B) together with the reductase and the present protein (A), and detecting the conversion of the compound (II) to the compound (III).
[0056]
In the method for controlling weeds of the present invention, the compound (I) is applied to a cultivation area of a plant expressing the protein (A). Such a plant may express one type of the present protein (A) or may express a plurality of types of the present protein (A). As the present protein (A), for example, the present protein (A) can be mentioned. Plants expressing the present protein (A) can be obtained, for example, by introducing the present DNA (A) into plant cells at a position where the DNA can be expressed as described above, By regenerating the body, it can be obtained as a transformed plant into which the present DNA (A) has been introduced. A DNA having a base sequence encoding a signal sequence for translocation to an intracellular organelle may be ligated upstream of the present DNA (A) to be introduced into a plant cell so as to match its reading frame.
In a plant into which the DNA (A) has been introduced and which expresses the protein (A), the compound (I) is metabolized in the cells into a compound having a lower weed controlling activity, and as a result, the compound (I) To reduce plant injury or impart resistance to the compound (I). Therefore, even when the compound (I) is applied to the cultivation area of a plant into which the present DNA (A) has been introduced and which expresses the present protein (A), it can grow well. Therefore, by cultivating a plant into which the present DNA (A) is introduced and expressing the present protein (A) and applying the weed controlling agent to the cultivation area, weeds other than the plant can be efficiently removed. Thus, it is possible to improve the yield of the plant, improve the quality, reduce the amount of the herbicide to be used, save labor, and the like.
[0057]
The evaluation of the degree of resistance of the cell expressing the protein (A) to the compound represented by the above general formula (I) or the weed controlling agent containing the compound was performed by evaluating the cell expressing the gene encoding the protein (A). It can be carried out by contacting the compound or the weed controlling agent and evaluating the degree of cell damage.
Specifically, in order to evaluate the degree of resistance of the microorganism cells expressing the present protein (A) to the compound (I) or a weed controlling agent containing the compound, for example, a method described in Japanese Patent Application No. 11-102534 is described. Recombinant Escherichia coli that can be used to evaluate the ability to inhibit PPO activity, Yamamoto, H .; Inokuti, H .; Ozaki, (1988) Japan {Journal} of Genetics, vol. 63, pp. 237-249, etc., in which the E. coli BT3 strain which has lost the growth ability due to deletion of the PPO gene, for example, US Pat. No. 5,939,602 Wherein the PPO gene of the plant described above is introduced in a operable form, and the DNA (A) is further introduced into recombinant Escherichia coli expressing the gene, whereby the PPO of the plant and the protein (A) ) Is produced. The recombinant Escherichia coli is shake-cultured at 37 ° C for 18 to 24 hours in a culture solution containing 0 to 1.0 ppm of the compound (I) or a weed controlling agent containing the compound, and the growth of the recombinant Escherichia coli is 600 nm. By measuring the absorbance of the compound, the degree of resistance to the compound or the weed controlling agent can be evaluated. As the present protein (A), for example, the present protein (A) can be mentioned.
[0058]
As a method for evaluating the degree of resistance of the plant expressing the protein (A) to the compound represented by the general formula (I) or the weed controlling agent containing the compound, the plant is sprayed with a weed controlling agent. A method for measuring the degree of plant growth can be given. As a method for more quantitative confirmation, for example, first, a leaf piece of the plant is immersed in an aqueous solution containing various concentrations of compound (I), or an aqueous solution of compound (I) is sprayed on the leaf piece of the plant. And leave at room temperature in the light on an agar medium. A few days later, Mackney, {G. , @J. Bol. {Chem. , 140; @p 315 (1941), extracting chlorophyll and measuring the chlorophyll content. Specifically, for example, the leaves of the plant are collected and equally divided into two along the main vein, and a weed control agent is applied to one leaf piece over the entire surface and the other leaf piece is untreated. These leaf pieces are placed on an MS medium containing 0.8% agar and left in the light at room temperature for 7 days. Next, each leaf piece is ground in a 5 ml 80% aqueous acetone solution with a mortar and pestle to extract chlorophyll. After the extract was diluted 10-fold with an 80% acetone aqueous solution, the absorbance at 750 nm, 663 nm, and 645 nm was measured, and Mackney @ G. , @J. {Biol. {Chem. (1941) 140, Calculate the total chlorophyll content by the method described in p315. The degree of resistance to compound (I) can be expressed as a percentage of the total chlorophyll content of the treated leaf pieces relative to the total chlorophyll content of the untreated leaf pieces, and can be compared and evaluated. As the present protein (A), for example, the present protein (A) can be mentioned.
[0059]
Based on the above method for evaluating the degree of resistance to compound (I) or a weed controlling agent containing the compound, a plant or a plant cell showing resistance to the compound (I) or the weed controlling agent containing the compound is selected. be able to. For example, the compound (I) or a weed controlling agent containing the compound is sprayed on a cultivation area of the plant to select a plant showing no phytotoxicity, or the plant cells are cultured in the presence of the compound (I) to continue. Select the cells that will grow. Specifically, for example, soil is packed in a cylindrical plastic pot having a diameter of 10 cm and a depth of 10 cm, seeds of the plant are sown, and cultivated in a greenhouse. 5 parts of a weed controlling agent containing compound (I), 6 parts of Solpol 3005X (Toho Kagaku) and 89 parts of xylene are mixed well to form an emulsion, and a predetermined amount thereof is spread by 0.1% (V / V). It is diluted with water equivalent to 1000 liters per hectare containing the agent, and sprayed uniformly over the entire foliage from above the plant grown in the above pot. After cultivating these plants in a greenhouse for 16 days, the phytotoxicity of the plant may be investigated, and a plant with no phytotoxicity or a plant with reduced phytotoxicity may be selected. Further, by crossing the plants thus selected, progeny plants can be obtained.
[0060]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
[0061]
HPLC for quantitative analysis of the compounds in Examples 1, 41 and 42 and HPLC for fractional purification of the compounds were performed under the following conditions.
(HPLC analysis condition 1)
Column: Sumipacks ODS211 (manufactured by Sumika Chemical Analysis Service)
Column temperature: 35 ° C
Flow rate: 1 ml / min
Detection wavelength: UV 254 nm
Eluent A: 0.01% TFA aqueous solution
Eluent B: acetonitrile
Elution conditions: After injecting a sample into a column equilibrated with an eluate in which eluent A was mixed at 90% and eluate B at 10%, eluent A was 90% and eluent B was 10% The eluate mixed at a rate of 5% is flowed for 5 minutes, and then the mixture of the eluate A and the eluate B is flowed while increasing the rate of the eluate B from 10% to 90% over 20 minutes, and further eluted. The eluate in which the liquid A was mixed at 10% and the eluate B at 90% was flowed for 8 minutes.
[0062]
Example 1 Metabolism of Compound (II) by Microorganism
(1) Metabolism of compound (II)
Various microorganisms shown in Tables 1 and 2 were prepared by using ISP2 agar medium (malt extract 1.0% (w / v), yeast extract 0.4% (w / v), glucose 0.4% (w / v)). , Agar 2.0% (w / v), pH 7.3), and one platinum loop thereof was grown on TGY medium (tryptone 0.5% (w / v), yeast extract 0.5% (w / v). v), glucose 0.1% (w / v), KH₂PO₄0.01% (w / v), pH 7.0), and cultured at 30 ° C. with shaking for 2 to 4 days. 0.1 ml of the obtained culture solution was mixed with 3 ml of a sporulation medium containing 100 ppm of compound (II) (meat extract 0.1% (w / v), tryptose 0.2% (w / v), glucose 1%). (W / v), pH 7.1), and cultured with shaking at 30 ° C for 7 to 8 days. 50 μl of 2N hydrochloric acid was added to the obtained culture solution, which was extracted with 3 ml of ethyl acetate. The obtained ethyl acetate layer was analyzed by HPLC. The concentration of compound (II) (column retention time 23.9 minutes) decreased, while compounds with retention times of 21.6 minutes and 22.2 minutes (hereinafter metabolites (I) and (II), respectively) A new peak was detected. The results are shown in Tables 1 and 2.
[0063]
[Table 1]

[0064]
[Table 2]

Notes in Table 2
1) \ Streptomyces \ argenteolus \ var. toyanokensis ATCC 21468
2) \ Streptomyces \ argenteolus \ var. toyon ATCC 21468t
[0065]
(2) Structure determination of metabolite (I) and metabolite (II)
Glycerol stock of Streptomyces griseus ATCC 11429 was added to 3 ml of bacterial culture medium (polypeptone 0.7% (w / v), yeast extract 0.5% (w / v), glucose 1.0% (w / v), K₂HPO₄(0.5% (w / v), pH 7.2), and cultured in a test tube at 30 ° C. with shaking overnight to obtain a preculture solution. This preculture was inoculated into 300 ml of a bacterial culture medium containing 100 ppm of the compound (II), and 3 ml of the culture was dispensed into 100 small test tubes and cultured at 30 ° C. for 6 days with reciprocal shaking. Hydrochloric acid was added to 250 ml of the culture solution thus obtained to adjust the pH to 2, followed by extraction with 250 ml of ethyl acetate. The solvent was distilled off from the obtained ethyl acetate layer, the residue was dissolved in 3 ml of acetone, and silica gel TLC plate (TLC plate silica gel 60F) was used.₂₅₄, 20 cm × 20 cm, 0.25 mm thickness, manufactured by Merck). The TLC plate was developed using a toluene-ethyl formate-formic acid mixture (toluene: formic acid: ethyl formate = 5: 7: 1) as a developing solvent, and silica gel having an Rf value of about 0.58 was scraped off. Extracted. Acetone was distilled off from the extract, and the residue was dissolved in 10 ml of acetonitrile, fractionated by HPLC, and a fraction containing only metabolite (I) and metabolite (II) was collected. A metabolite (hereinafter, referred to as metabolite A) was obtained.
Mass spectrometry of the obtained metabolite A was performed. Metabolite A was 14 smaller in mass than compound (II). Further, H-NMR analysis revealed that the metabolite A was a compound having the structure represented by the above formula (III).
[0066]
(3) Weed control activity test of compound (III)
The soil was packed in a cylindrical plastic pot having a diameter of 10 cm and a depth of 10 cm, and seeds of rice millet, locust beetle and morning glory were sowed and cultivated in a greenhouse for 10 days. 5 parts of the test compound, 6 parts of Solpol 3005X (Toho Kagaku) and 89 parts of xylene are mixed well to form an emulsion, and a predetermined amount thereof is adjusted to 0.1% (V / V) as a spreading agent (special linole (Nippon Pesticide) (Made by Co., Ltd.)) and diluted with water equivalent to 1000 liters per hectare, and sprayed evenly over the entire foliage of the plant grown in the above pot from above. After cultivating these plants in a greenhouse for 16 days, weed control effects of the test compounds were examined. Table 3 shows the results.
[0067]
[Table 3]

The soil was packed in a cylindrical plastic pot having a diameter of 10 cm and a depth of 10 cm, and seeds of dog millet, locust beetle and morning glory were sowed. An emulsion was prepared by mixing 5 parts of the test compound, 6 parts of Solpol 3005X (Toho Chemical) and 89 parts of xylene, and a predetermined amount thereof was diluted with water equivalent to 1,000 liters per hectare. Sprayed evenly with a sprayer. After cultivating the above plants in these pots in a greenhouse for 19 days, weed control effects were investigated. Table 4 shows the results.
[0068]
[Table 4]

In Tables 3 and 4 above, the weed control efficacy was such that the germination or growth state of the plants used in the test at the time of the survey was not different or almost completely different from that without treatment with the test compound. 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7, when the plant has completely died or the emergence or growth has been completely suppressed is defined as "10", when there is no difference. It is shown in 11 levels of 8, 9, and 10.
[0069]
Example 2 Preparation of the protein (A1) of the present invention
(1) Preparation of crude cell extract
Glycerol stock of Streptomyces @ phaeochromogenes @ IFO12898 strain was added to 100 ml of A medium (glucose 0.1% (w / v), tryptone 0.5% (w / v), yeast extract 0.5% (w / v), phosphoric acid The mixture was added to a 500 ml Erlenmeyer flask containing 0.1% (w / v) of dipotassium hydrogen (pH 7.0), and subjected to vortex culture at 30 ° C. for one day to obtain a preculture liquid. 8 ml of this preculture solution was inoculated into 200 ml of the A medium, and cultivated by swirling in a 500 ml winged flask at 30 ° C. for 2 days. Wet cells were recovered from the thus obtained culture by centrifugation (3,000 × g, 5 minutes). The wet cells were suspended in 100 ml of a B medium (glucose 1% (w / v), beef extract 0.1%, tryptose 0.2% (w / v)) containing 100 ppm of the compound (II). The cells were reciprocally shake-cultured in a 500 ml Sakaguchi flask at 30 ° C. for 16 hours. Wet cells were collected from 10 L of the culture thus obtained by centrifugation (3,000 × g, 5 minutes). The obtained wet cells were washed twice with 1 L of 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) to obtain 162 g of wet cells.
The wet cells were suspended in 2 ml of 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) per gram of wet cell weight, and 1 mM PMSF, 5 mM benzamidine hydrochloride, 1 mM EDTA and 1 mM dithiothreitol were added to the suspension. Was added. This is repeated twice with a French press (manufactured by Otake Seisakusho) (1000 kg / cm²) To obtain a cell lysate. After centrifugation (40,000 × g, 30 minutes) of the cell lysate, the supernatant was collected and centrifuged at 150,000 × g for 1 hour. This was described as a liquid).
[0070]
(2) Assay for ability to convert compound (II) to compound (III)
¹⁴3 ppm of compound (II) labeled with C, 2.4 mM β-NADPH (hereinafter referred to as A component, manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.), and 0.5 mg / ml of spinach-derived ferredoxin (hereinafter referred to as B component). 0.1 M potassium phosphate buffer containing 1 U / ml ferredoxin reductase (hereinafter, referred to as C component; SIGMA) and 18 μl of the crude cell extract recovered in Example 2 (1) (manufactured by SIGMA) (pH 7.0) was prepared and kept at 30 ° C. for 1 hour. In addition, a reaction solution to which one or more fractions of the component A, component B and component C in the reaction solution composition were not added was prepared and kept warm in the same manner. After the incubation, 3.0 μl of 2N hydrochloric acid and 90 μl of ethyl acetate were added to each reaction solution, stirred, and centrifuged at 8,000 × g to collect 75 μl of an ethyl acetate phase. After the ethyl acetate phase was evaporated to dryness under reduced pressure, the residue was dissolved in 6.0 μl of ethyl acetate, and 5.0 μl of the residue was used on a silica gel TLC plate (TLC plate silica gel 60F).₂₅₄, 20 cm × 20 cm, 0.25 mm thickness, manufactured by Merck). After developing the TLC plate for about 1 hour using a chloroform-acetic acid-ethyl acetate mixed solution (chloroform: acetic acid: ethyl acetate = 6: 1: 2) as a developing solvent, the solvent is evaporated, and an imaging plate (Fuji Photo Film Co., Ltd.) is developed. Was exposed overnight. Next, the imaging plate was analyzed with an image analyzer BAS2000 (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.),¹⁴The presence or absence of spots (Rf values 0.24 and 0.29) corresponding to compound (III) labeled with C was examined. Table 5 shows the results.
[0071]
[Table 5]

[0072]
(3) Fractionation of crude cell extract
Ammonium sulfate was added to the crude extract of the cells obtained in Example 2 (1) so as to be 45% saturated, stirred on ice, and then centrifuged at 12,000 × g for 10 minutes to collect the supernatant. did. Ammonium sulfate was added to the obtained supernatant so as to be 55% saturated, stirred on ice, centrifuged at 12,000 × g for 10 minutes, and the precipitate was collected to collect 27.5 ml of 20 mM bistrispropane buffer. (PH 7.0). This solution is applied to a PD10 column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), eluted with 20 mM bistrispropane buffer (pH 7.0), and a protein-containing fraction (hereinafter referred to as ammonium sulfate precipitation 45-55% fraction). 38.5 ml was collected.
[0073]
(4) Isolation of the protein (A1) of the present invention
The 45-55% fraction of ammonium sulfate precipitate prepared in Example 2 (3) was injected into a HiLoad 26/10 Q Sepharose HP column (Amersham Pharmacia Biotech). Next, 106 ml of 20 mM bistrispropane buffer (pH 7.0) was flowed through the column, and then a 20 mM bistrispropane buffer (pH 7.0) was flowed by applying a linear concentration gradient of sodium chloride. [001415] 25 ml of the fraction eluted at a sodium chloride concentration of 0.21 M to 0.22 M was collected at a sodium chloride concentration of 0.21 M to 0.22 M at a sodium chloride concentration range of 0 M to 0.375 M and a flow rate of 3 ml / min. This fraction was further applied to a PD10 column (Amersham Pharmacia Biotech) and eluted with a 20 mM bistrispropane buffer (pH 7.0) to collect a protein-containing fraction.
The collected fraction was applied to a PD10 column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) and eluted with an A buffer (2 mM potassium phosphate buffer containing 1.5 mM calcium chloride, pH 7.0) to collect a protein-containing fraction. . Next, the fraction was injected into Bio-Scale Ceramic Hydroxypatite, Type Icolum CHT10-I (manufactured by Bio-Rad), and 30 ml of A buffer was passed through the column. Then, the column was subjected to a linear concentration gradient of B buffer (100 mM potassium phosphate buffer containing 0.03 mM calcium chloride, pH 7.0), and A buffer was applied (starting from A buffer 100% and taking 100 minutes). A fraction eluted with a linear concentration gradient of increasing the B buffer concentration to 50%, a flow rate of 2 ml / min) and a B buffer concentration of 17% to 20% was collected. The fraction thus collected was applied to a PD10 column (Amersham Pharmacia Biotech) and eluted with a 0.05M potassium phosphate buffer (pH 7.0) to collect a protein-containing fraction.
The collected fraction was concentrated 20-fold using an ultrafiltration filter (Microcon YM-30, manufactured by Millipore) and injected into a HiLoad 16/60 Superdex 75-pg column (Amersham Pharmacia Biotech). A 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.15 M sodium chloride was passed through the column (flow rate: 1 ml / min), and the eluate was fractionated by 2 ml, and the fraction eluted in an elution volume of 56 to 66 ml. Were separately collected. The protein contained in each fraction was analyzed by SDS-10% -20% PAGE.
Each fraction collected was added in place of the crude cell extract in the reaction solution described in Example 2 (2), and A component, B component, C component and¹⁴The temperature was kept in the same manner as in Example 2 (2) in the presence of the compound (II) labeled with C. TLC analysis of the reaction solution after the incubation was performed,¹⁴The intensity of spots corresponding to compound (III) labeled with C was examined. In the SDS-PAGE, the protein migrated at a position of about 47 kDa showed a change in the concentration of the protein band in the continuous fraction,¹⁴A change in the intensity of the spot corresponding to the compound (III) labeled with C was observed in parallel. The protein was recovered from the SDS-PAGE gel, and subjected to amino-terminal amino acid sequence analysis using a protein sequencer (Procise 494HT, manufactured by Applied Biosystems, analyzed by the Pulsed liquid method). As a result, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 was read. After digestion of the protein with trypsin, the obtained digest was subjected to mass spectrometry (ion trap mass spectrometer LCQ manufactured by ThermoQuest, column: PepMAP C18 75 μm × 150 mm manufactured by LC Packings, mobile phase A: 0.1). % HOAc-H₂O, mobile phase B: 0.1% HOAc-methanol, gradient: starting from an eluate mixed at a ratio of 95% mobile phase A and 5% mobile phase B, to a mobile phase B concentration of 100% over 30 minutes. Increasing linear concentration gradient, flow rate: 0.2 μl / min). As a result, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 was read.
[0074]
Example 3 Acquisition of DNA (A1) of the Present Invention
(1) Preparation of chromosomal DNA of Streptomyces @ phaeochromogenes @ IFO12898
Streptomyces @ phaeochromogenes @ IFO12898 was added to 50 ml of YEME medium (yeast extract 0.3% (w / v), bactopeptone 0.5% (w / v), malt extract 0.3% (w / v), glucose 1.0%. (W / v), 34% sucrose (w / v), 2.5M MgCl₂・ 6H₂After shaking culture at 30 ° C for 1 day to 3 days at O 0.2% (v / v)), the cells were collected. The obtained cells were suspended in the above YEME medium containing 1.4% (w / v) glycine and 60 mM @EDTA, and cultured with shaking for one day. The cells were collected from the obtained culture solution, washed once with distilled water, and then resuspended in 1 ml of a buffer (100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM EDTA, 10 mM NaCl) per 200 mg of wet weight. It became cloudy, 200 μg / ml egg white lysozyme was added and shaken at 30 ° C. for 1 hour. Further, 0.5% SDS, 1 mg / ml {Proteinase} K was added, and the mixture was incubated at 55 ° C. for 3 hours. The cell suspension was extracted twice with phenol / chloroform / isoamyl alcohol to collect an aqueous layer, and then extracted once with chloroform / isoamyl alcohol to recover the aqueous layer and ethanol precipitated from the aqueous layer. As a result, chromosomal DNA was obtained.
[0075]
(2) Preparation of chromosomal DNA library of Streptomyces @ phaeochromogenes @ IFO12898
943 ng of the chromosomal DNA prepared in Example 3 (1) was digested with 1 U of the restriction enzyme Sau3AI at 37 ° C. for 60 minutes. The obtained digested solution was fractionated by 0.7% agarose gel electrophoresis, and about 2.0 kbp of DNA was recovered from the gel. Prep-A-Gene^RThe DNA was purified using DNA Purification Kit (manufactured by BIO-RAD) according to the instruction manual attached to the kit to obtain 10 μl of a solution containing the target DNA. 1 μl of the obtained DNA solution, plasmid vector pUC118 98 ng digested with the restriction enzyme BamHI and dephosphorylated, and the ligation kit Ver. 2 (manufactured by Takara Shuzo) was mixed with 11 μl of solution I, and the mixture was kept at 16 ° C. overnight. Escherichia coli DH5α was transformed using 5 μl of the ligation solution, and the Escherichia coli was cultured with shaking at 30 ° C. overnight. Escherichia coli was collected from the resulting culture to extract a plasmid, which was used as a chromosomal DNA library.
[0076]
(3) Isolation of the DNA (A1) of the present invention
PCR was performed using the chromosomal DNA prepared in Example 3 (1) as a template (FIG. 1). As the primer, a combination of an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 35 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 36 (hereinafter, referred to as primer pair 1) was used. Here, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 35 was designed based on the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18. The base sequence represented by SEQ ID NO: 36 was designed based on a base sequence complementary to the base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19. To the PCR reaction solution, two types of primers were added at 200 nM each, 250 ng of the above chromosomal DNA, 0.5 μl of dNTP mix (mixture of four types of dNTPs of 10 mM each) (manufactured by Clontech), 5 × GC genomic 5 μl of PCR reaction buffer (manufactured by Clontech), 25 mM @ Mg (OAc)₂1.1 μl, 5 μl of 5M GC-Melt (manufactured by Clontech) and 0.5 μl of Advantage-GC Genomic Polymerase Mix (manufactured by Clontech) were added, and distilled water was further added to make a total volume of 25 μl. The PCR reaction conditions were as follows: 1 hour at 95 ° C, 1 cycle at 94 ° C for 15 seconds, then 60 ° C for 30 seconds, then 72 ° C for 1 minute, and this cycle was repeated for 30 cycles, followed by incubation at 72 ° C for 5 minutes. did. The reaction solution after the incubation was subjected to 4% agarose gel electrophoresis, and a gel portion containing about 150 bp DNA was recovered. DNA was purified from the collected gel using QIA quick gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN) according to the attached instruction manual. The obtained DNA was ligated to a TA cloning vector pCR2.1 (manufactured by INVITROGEN) according to the instruction manual attached to the vector, and introduced into Escherichia coli TOP10F '(manufactured by INVITROGEN). Plasmid DNA was prepared from the obtained Escherichia coli transformant using QIAprep \ Spin \ Miniprep \ Kit (manufactured by QIAGEN). Using the obtained plasmid DNA as a template, a dye terminator cycle sequencing FS ready reaction kit (Applied Biosystems Japan) using the -21M13 primer (manufactured by Applied Biosystems Japan) and M13Rev primer (manufactured by Applied Biosystems Japan) as primers Was performed according to the instruction manual attached to the kit. The reaction product was analyzed using DNA sequencer 373A (manufactured by Applied Biosystems Japan). As a result, the base sequence represented by base numbers 36 to 132 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 was read. The base sequence encoded the amino acid sequence represented by amino acid numbers 12 to 23 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18. Therefore, this DNA was presumed to be a DNA encoding a part of the protein (A1) of the present invention.
[0077]
Next, using the chromosomal DNA library prepared in Example 3 (2) as a template, PCR was performed using Advantage-GC genomic polymerase mix (Clontech) under the same conditions as above. As the primer, a combination of an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 37 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 38 (hereinafter, referred to as primer pair 2), or SEQ ID NO: 39 A combination of an oligonucleotide having a base sequence and an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 40 (hereinafter, referred to as primer pair 3) was used.
Next, a reaction solution obtained using the primer pair 2 was used as a template solution, and a combination of an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 41 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 38 (hereinafter, primer By carrying out PCR using primer 4 as a primer, a DNA having a base sequence extending 3 ′ downstream from the base shown by base number 132 in the base sequence shown by SEQ ID NO: 9 was amplified. Similarly, a reaction solution obtained by using the primer pair 3 is used as a template solution, and a combination of an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 42 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 40 (hereinafter, referred to as a combination) , A primer pair 5) was used as a primer to carry out PCR, thereby amplifying a DNA having a base sequence extending 5 ′ upstream of the base shown by base No. 36 in the base sequence shown by SEQ ID No. 9. About 2 kbp of DNA amplified using the primer pair 4 and about 150 bp of DNA amplified using the primer pair 5 were cloned into the TA cloning vector pCR2.1 in the same manner as described above. Plasmid DNA was prepared from the obtained Escherichia coli transformant using QIAprep \ Spin \ Miniprep \ Kit (manufactured by QIAGEN). Using the obtained plasmid DNA as a template, a dye terminator cycle sequence was performed using the -21M13 primer (manufactured by Applied Biosystems Japan) and the M13Rev primer (manufactured by Applied Biosystems Japan) and the oligonucleotides represented by SEQ ID NOS: 43 to 50 as primers. Using a Sing FS Ready Reaction Kit (manufactured by Applied Biosystems Japan), a sequencing reaction was performed according to the instruction manual attached to the kit. The reaction product was analyzed using DNA sequencer 373A (manufactured by Applied Biosystems Japan). As a result of analyzing the base sequence of the DNA of about 2 kbp amplified using the primer pair 4, the base sequence represented by base numbers 133 to 1439 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 was read. From the result of analyzing the base sequence of the DNA of about 150 bp amplified using the primer pair 5, the base sequences represented by base numbers 1 to 35 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 were read. As a result of joining the obtained base sequences, the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 was obtained. There were two open reading frames (ORFs) in the nucleotide sequence. That is, a base sequence consisting of 1227 bases (including a stop codon) and encoding 408 amino acid residues (SEQ ID NO: 6) and a base sequence consisting of 201 bases (including the stop codon) and encoding 66 amino acid residues (SEQ ID NO: 6) 15) were included. The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 was calculated to be 45213 Da. The amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence is determined by analyzing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 18) determined from the N-terminal amino acid sequence analysis of the protein of the present invention (A1) and the amino acid sequence analysis by mass spectrometry of the tryptic digest fragment. Amino acid sequence (SEQ ID NO: 19). The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 12) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 was calculated to be 6818 Da.
[0078]
Example 4 Expression of the protein (A1) of the present invention in Escherichia coli
(1) Preparation of transformed Escherichia coli having the DNA (A1) of the present invention
Using chromosomal DNA prepared from Streptomyces @ phaeochromogenes @ IFO12898 in Example 3 (1) as a template, PCR was performed using Expand @ High Fidelity @ PCR @ System (manufactured by Roche Molecular Biochemicals). As the primer, a combination of an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 51 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 52 (hereinafter, referred to as primer pair 19), or A combination of an oligonucleotide having the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 53 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 53 (hereinafter, referred to as primer pair 20) was used. To the PCR reaction solution, two types of primers were added so that each had a concentration of 300 nM, 50 ng of chromosomal DNA, 5.0 μl of dNTP mix (a mixture of four types of dNTPs of 2.0 mM each), and 10 × Expand @ HF buffer ( MgCl₂5.0 μl) and 0.75 μl of Expand @ HiFi enzyme mix, and further distilled water was added to make a total volume of 50 μl. The heat-retention conditions were as follows: after keeping the temperature at 97 ° C for 2 minutes, the cycle of keeping the temperature at 97 ° C for 15 seconds, then at 65 ° C for 30 seconds, and further at 72 ° C for 2 minutes as one cycle, was repeated for 10 cycles, and then at 97 ° C for 15 seconds Next, 15 cycles were performed with the heat retention at 68 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 2 minutes (the heat retention at 72 ° C. was increased by 20 seconds for each cycle) as one cycle, and the temperature was further kept at 72 ° C. for 7 minutes. . The reaction solution after the incubation was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and a gel containing about 1.2 kbp DNA was cut out from the gel provided with the reaction solution using the primer pair 19, and the reaction solution using the primer pair 20 was used. A gel containing about 1.5 kbp DNA was cut out from the gel provided with the above. From each of the collected gels, DNA was purified using QIA quick gel Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN) according to the instruction manual attached to the kit. The obtained DNA and pCR2.1-TOPO vector (manufactured by Invitrogen) were ligated according to the instruction manual attached to the vector, and introduced into Escherichia coli TOP10F '. Plasmid DNA was prepared from the obtained Escherichia coli transformant using QIAprep \ Spin \ Miniprep \ Kit (manufactured by QIAGEN). Next, using the DNA as a template, a -21M13 primer (manufactured by Applied Biosystems Japan), an M13Rev primer (manufactured by Applied Biosystems Japan), an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 43, and a base sequence represented by 46 Using an oligonucleotide having the above as a primer, a sequencing reaction was carried out using a dye terminator cycle sequencing FS ready reaction kit (manufactured by Applied Biosystems Japan) according to the instruction manual attached to the kit. The obtained reaction product was analyzed using a DNA sequencer 373A (manufactured by Applied Biosystems Japan). Based on the obtained results, the plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 was designated as pCR657, and the plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 was designated as pCR657F.
On the other hand, plasmid pKSN24R2 (described in Akiyoshi-ShibaTa M. et al., Eur. J. Biochem. 224: P335 (1994)) was digested with restriction enzymes HindIII and XmnI. A linker (FIG. 47) obtained by annealing the oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 134 and the oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 135 into the obtained about 3 kb DNA, The obtained plasmid was designated as pKSN2 (FIG. 4).
Next, the above plasmids pCR657 and pCR657F were digested with restriction enzymes NdeI and HindIII, respectively, and the digest was subjected to agarose gel electrophoresis. A gel containing about 1.2 kbp of DNA was cut out from the gel provided with the digested product of pCR657, and a gel containing about 1.5 kbp of DNA was cut out from the gel provided with the digested product of pCR657F. DNA was purified from each of the obtained gels using QIA quick gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN) according to the instruction manual attached to the kit. The obtained DNA and the plasmid pKSN2 digested with NdeI and HindIII were ligated with a ligation kit Ver. 1 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and ligated according to the instruction manual attached to the kit, and introduced into Escherichia coli JM109. Plasmid DNA was prepared from the obtained E. coli transformant, and its structure was analyzed. The plasmid obtained by inserting the above-described DNA of about 1.2 kbp containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 and encoding the protein (A1) of the present invention between the NdeI site and the HindIII site of pKSN2 was designated as pKSN657. . A plasmid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 and encoding the above-described protein of the present invention (A1) of about 1.5 kbp and inserted between the NdeI site and the HindIII site of pKSN2 was replaced with pKSN657F. And These plasmids pKSN657 and pKSN657F were respectively introduced into Escherichia coli JM109, and the resulting Escherichia coli transformants were designated as JM109 / pKSN657 and JM109 / pKSN657F, respectively. Further, the plasmid pKSN2 was introduced into Escherichia coli JM109, and the obtained Escherichia coli transformant was designated as JM109 / pKSN2.
[0079]
(2) Expression of the protein (A1) of the present invention in Escherichia coli and recovery of the protein
Escherichia coli JM109 / pKSN657, JM109 / pKSN657F, and JM109 / pKSN2 were each added to 10 ml of TB medium containing 50 μg / ml ampicillin (tryptone 1.2% (w / v), yeast extract 2.4% (w / v)). Glycerol 0.4% (v / v), potassium dihydrogen phosphate 17 mM, dipotassium hydrogen phosphate 72 mM) at 37 ° C. overnight. 1 ml of the obtained culture solution was inoculated into 100 ml of TB medium containing 50 μg / ml of ampicillin and cultured at 26 ° C. When the OD660 reached about 0.5, the final concentration was adjusted to 500 μM. -Aminolevulinic acid was added and the culture was continued. Thirty minutes later, IPTG was added to a final concentration of 1 mM, and the cells were further cultured for 17 hours.
The cells were collected from each culture, washed with a 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.5), and suspended in 10 ml of the buffer containing 1 mM PMSF. The obtained bacterial cell suspension was ultrasonically treated six times for 3 minutes each under the conditions of out put 3 and duty cycle 30% using an ultrasonic crusher (SONIFIER (registered trademark of Branson Sonic Power Company)). A crushed liquid was obtained. After the obtained crushed liquid is centrifuged (1,200 × g, 5 minutes), the supernatant is collected and centrifuged (150,000 × g, 70 minutes) to obtain a supernatant fraction (hereinafter, referred to as “supernatant”). The supernatant fraction obtained from Escherichia coli JM109 / pKSN657, the supernatant fraction obtained from Escherichia coli extract pKSN657, and the supernatant fraction obtained from JM109 / pKSN657F, the supernatant fraction obtained from Escherichia coli extract pKSN657F, JM109 / pKSN2 Is described as E. coli extract pKSN2). 1 μl of the supernatant fraction was analyzed by SDS-15% to 25% PAGE, and stained with Coomassie-Brilliant Blue (hereinafter referred to as CBB). As a result, in both the Escherichia coli extract pKSN657 and the Escherichia coli extract pKSN657F, a band significantly higher than that of the Escherichia coli extract pKSN2 was detected at the migration position corresponding to a molecular weight of about 47 kDa. This band was detected deeper in E. coli extract pKSN657F than in E. coli extract pKSN657. It was shown that E. coli JM109 / pKSN657F expressed the protein of the present invention (A1) more than JM109 / pKSN657.
[0080]
(3) Assay for ability to convert compound (II) to compound (III)
¹⁴3 ppm of compound (II) labeled with C, 2 mM β-NADPH (A component, manufactured by Oriental Yeast), 2 mg / ml spinach-derived ferredoxin (B component, SIGMA), 0.1 U / ml ferredoxin 30 μl of a reaction solution comprising 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing reductase (C component, manufactured by SIGMA) and 18 μl of the supernatant fraction collected in Example 4 (2) was prepared. Incubated at ℃ for 1 hour. In addition, a reaction solution to which one or more fractions of the component A, component B and component C in the reaction solution composition were not added was prepared and kept warm in the same manner. After the incubation, 3.0 μl of 2N hydrochloric acid and 90 μl of ethyl acetate were added to each reaction solution, stirred, and centrifuged at 8,000 × g to collect 75 μl of an ethyl acetate phase. After the ethyl acetate phase was evaporated to dryness under reduced pressure, the residue was dissolved in 6.0 μl of ethyl acetate, and 5.0 μl of the residue was placed on a silica gel TLC plate (TLC plate silica gel 60F).₂₅₄, 20 cm × 20 cm, 0.25 mm thickness, manufactured by Merck). After developing the TLC plate for about 1 hour using a chloroform-acetic acid-ethyl acetate mixed solution (chloroform: acetic acid: ethyl acetate = 6: 1: 2) as a developing solvent, the solvent is evaporated, and an imaging plate (Fuji Photo Film Co., Ltd.) is developed. Was exposed overnight. Next, the imaging plate was analyzed with an image analyzer BAS2000 (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.),¹⁴The presence or absence of spots (Rf values 0.24 and 0.29) corresponding to compound (III) labeled with C was examined. Table 6 shows the results.
[0081]
[Table 6]

[0082]
Example 5 Preparation of protein (A2) of the present invention
(1) Preparation of crude cell extract
Glycerol stock of Saccharopolyspora taberi JCM 9383t was added to 10 ml of A medium (glucose 0.1% (w / v), tryptone 0.5% (w / v), yeast extract 0.5% (w / v), phosphoric acid The solution was added to a 10-ml test tube containing 0.1% (w / v) of dipotassium hydrogen (pH 7.0), and reciprocally shake-cultured at 30 ° C. overnight to obtain a preculture solution. 8 ml of this preculture solution was inoculated into 200 ml of the A medium, and cultivated by swirling in a 500 ml winged flask at 30 ° C. for 2 days. Wet cells were recovered from the thus obtained culture by centrifugation (3,000 × g, 10 minutes). The wet cells were suspended in 100 ml of a B medium (glucose 1% (w / v), beef extract 0.1%, tryptose 0.2% (w / v)) containing 100 ppm of the compound (II). Reciprocal shaking culture was performed at 30 ° C. for 20 hours in a 500 ml Sakaguchi flask. Wet cells were collected from 10 L of the culture solution thus obtained by centrifugation (3,000 × g, 10 minutes). The obtained wet cells were washed twice with 1 L of 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) to obtain 119 g of wet cells.
The wet cells were suspended in 2 ml of 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) per 1 g of wet cell weight, and 1 mM PMSF, 5 mM benzamidine hydrochloride, 1 mM EDTA, 3 μg / ml leupeptin was added to the suspension. , 3 μg / ml, pepstatin A and 1 mM dithiothreitol. This is repeated twice with a French press (manufactured by Otake Seisakusho) (1000 kg / cm²) To obtain a cell lysate. After centrifugation (40,000 × g, 30 minutes) of the cell lysate, the supernatant was collected and centrifuged at 150,000 × g for 1 hour. This was described as a liquid).
[0083]
(2) Assay for ability to convert compound (II) to compound (III)
¹⁴3 ppm of compound (II) labeled with C, 2.4 mM β-NADPH (A component, manufactured by Oriental Yeast), 0.5 mg / ml @ spinach ferredoxin (B component, manufactured by SIGMA), 1 U / ml 30 μl of a reaction solution composed of 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing ferredoxin reductase (C component, manufactured by SIGMA) and 18 μl of the crude cell extract recovered in Example 5 (1) was prepared. At 30 ° C. for 1 hour. In addition, a reaction solution to which one or more fractions of the component A, component B and component C in the reaction solution composition were not added was prepared and kept warm in the same manner. After the incubation, 3.0 μl of 2N hydrochloric acid and 90 μl of ethyl acetate were added to each reaction solution, stirred, and centrifuged at 8,000 × g to collect 75 μl of an ethyl acetate phase. After the ethyl acetate phase was evaporated to dryness under reduced pressure, the residue was dissolved in 6.0 μl of ethyl acetate, and 5.0 μl of the residue was placed on a silica gel TLC plate (TLC plate silica gel 60F).₂₅₄, 20 cm × 20 cm, 0.25 mm thickness, manufactured by Merck). After developing the TLC plate for about 1 hour using a chloroform-acetic acid-ethyl acetate mixed solution (chloroform: acetic acid: ethyl acetate = 6: 1: 2) as a developing solvent, the solvent is evaporated, and an imaging plate (Fuji Photo Film Co., Ltd.) is developed. Was exposed overnight. Next, the imaging plate was analyzed with an image analyzer BAS2000 (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.),¹⁴The presence or absence of spots (Rf values 0.24 and 0.29) corresponding to compound (III) labeled with C was examined. Table 7 shows the results.
[0084]
[Table 7]

[0085]
(3) Fractionation of crude cell extract
Ammonium sulfate was added to the crude extract of the cells obtained in Example 5 (1) so as to be 45% saturated and stirred on ice, and then centrifuged at 12,000 × g for 30 minutes to collect the supernatant. did. Ammonium sulfate was added to the obtained supernatant so as to be 55% saturated, stirred on ice, centrifuged at 12,000 × g for 10 minutes, and the precipitate was recovered to obtain a 20 mM bistrispropane buffer (pH 7.0). ) To 32.5 ml. This solution is applied to a PD10 column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), eluted with 20 mM bistrispropane buffer (pH 7.0), and a protein-containing fraction (hereinafter referred to as ammonium sulfate precipitation 45-55% fraction). 45.5 ml was collected.
[0086]
(4) Isolation of the protein (A2) of the present invention
The 45-55% fraction of ammonium sulfate precipitate prepared in Example 5 (3) was injected into a HiLoad 26/10 Q Sepharose HP column (Amersham Pharmacia Biotech). Next, 100 ml of 20 mM bistrispropane buffer (pH 7.0) was flowed through the column, and then a 20 mM bistrispropane buffer (pH 7.0) was flowed by applying a linear concentration gradient of sodium chloride. 004M / min, sodium chloride concentration range: 0M to 0.5M, flow rate: 8ml / min), and 30ml fraction eluted at a sodium chloride concentration of 0.25M to 0.26M was collected. The fraction thus collected was applied to a PD10 column (Amersham Pharmacia Biotech), and eluted with a 20 mM bistrispropane buffer (pH 7.0) to collect a protein-containing fraction.
The collected fraction was applied to a PD10 column and eluted with an A buffer (2 mM potassium phosphate buffer containing 1.5 mM calcium chloride; pH 7.0), and the collected protein-containing fraction was collected. Then, the fraction was injected into Bio-Scale Ceramic Ceramic Hydroxyapatite, Type Icolum CHT10-I (manufactured by Bio-Rad), and 20 ml of A buffer was passed through the column. Then, the column was subjected to a linear concentration gradient of B buffer (100 mM potassium phosphate buffer containing 0.03 mM calcium chloride, pH 7.0), and A buffer was applied (starting from A buffer 100% and taking 100 minutes). 10 ml of the fraction eluted at a B buffer concentration of 23% to 25% was collected with a linear concentration gradient increasing the B buffer concentration to 50% at a flow rate of 2 ml / min. This fraction was further applied to a PD10 column (Amersham Pharmacia Biotech), and eluted with a 0.05 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) to collect a protein-containing fraction.
The collected fraction was concentrated to about 770 μl by ultrafiltration (Microcon filter unit Microcon-30, manufactured by Millipore), and 700 μl of this was loaded on a HiLoad 16/60 Superdex 75 pg column (Amersham Pharmacia Biotech). Was injected. A 0.05 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.15 M sodium chloride was passed through the column (flow rate: 1 ml / min), and the eluate was fractionated by 2 ml each, and the number eluted to around 61 ml elution volume. Fractions were separately collected. The protein contained in each fraction was analyzed by SDS-10% -20% PAGE.
The fractions thus collected were added in place of the crude cell extract in the reaction solution described in Example 5 (2), and the A component, B component, C component and¹⁴The temperature was kept in the same manner as in Example 5 (2) in the presence of the compound (II) labeled with C. TLC analysis of the reaction solution after the incubation was performed,¹⁴The intensity of spots corresponding to compound (III) labeled with C was examined. In the SDS-PAGE, the protein migrated at a position of about 47 kDa showed a change in the concentration of the protein band in the continuous fraction,¹⁴A change in the intensity of the spot corresponding to the compound (III) labeled with C was observed in parallel. The protein was recovered from the SDS-PAGE gel, and subjected to N-terminal amino acid sequence analysis using a protein sequencer (Procise 494HT, manufactured by Applied Biosystems, analyzed by the Pulsed liquid method). As a result, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 was read. After digestion of the protein with trypsin, the obtained digest was subjected to mass spectrometry (ion trap mass spectrometer LCQ manufactured by ThermoQuest, column: PepMAP C18 75 μm × 150 mm manufactured by LC Packings, mobile phase A: 0.1). % HOAc-H₂O, mobile phase B: 0.1% HOAc-methanol, gradient: starting from an eluate mixed at a ratio of 95% mobile phase A, 5% mobile phase B, and increasing mobile phase B to 100% over 30 minutes Linear gradient, flow rate: 0.2 μl / min). As a result, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 was read.
[0087]
Example 6 Acquisition of DNA (A2) of the Present Invention
(1) Preparation of chromosomal DNA of Saccharopolyspora \ taberi \ JCM \ 9383t
Saccharopolyspora taberi JCM 9383t was added to 50 ml of YEME medium (yeast extract 0.3% (w / v), bactopeptone 0.5% (w / v), malt extract 0.3% (w / v), glucose 1.0. % (W / v), sucrose 34% (w / v), 2.5M MgCl₂・ 6H₂After shaking culture at 30 ° C for 1 day to 3 days at O 0.2% (v / v)), the cells were collected. The obtained cells were suspended in the above YEME medium containing 1.4% (w / v) glycine and 60 mM @EDTA, and cultured with shaking for one day. The cells were collected from the obtained culture solution, washed once with distilled water, and then resuspended in 1 ml of a buffer (100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM EDTA, 10 mM NaCl) per 200 mg of wet weight. It became cloudy, 200 μg / ml egg white lysozyme was added and shaken at 30 ° C. for 1 hour. Further, 0.5% SDS, 1 mg / ml {Proteinase} K was added, and the mixture was incubated at 55 ° C. for 3 hours. The cell suspension was extracted twice with phenol / chloroform / isoamyl alcohol to collect an aqueous layer, and then extracted once with chloroform / isoamyl alcohol to recover the aqueous layer and ethanol precipitated from the aqueous layer. As a result, chromosomal DNA was obtained.
[0088]
(2) Preparation of chromosomal DNA library of Saccharopolyspora \ taberi \ JCM \ 9383t
19 μg of the chromosomal DNA prepared in Example 6 (1) was digested with 0.78 U of Sau3AI at 37 ° C. for 60 minutes. The obtained digested solution was fractionated by 1% agarose gel electrophoresis, and a DNA of about 2.0 kbp was recovered from the gel. The DNA was purified using QIAquick \ Gel \ Extraction \ Kit (manufactured by Qiagen) according to the instruction manual attached to the kit, and further concentrated by ethanol precipitation to obtain 10 µl of a solution containing the target DNA. 8 μl of the obtained DNA solution, 100 ng of plasmid vector pUC118 @ 100 ng digested with the restriction enzyme BamHI and dephosphorylated, and the ligation kit Ver. 2 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and 12 μl of Solution I were mixed and kept at 16 ° C. for 3 hours. Escherichia coli DH5α was transformed using this ligation solution, applied to an LB agar medium containing 50 mg / L ampicillin, and cultured at 37 ° C. overnight. The obtained colony was recovered from the agar medium, and the plasmid was extracted to obtain a chromosomal DNA library.
[0089]
(3) Isolation of the DNA (A2) of the present invention
Using the chromosomal DNA prepared in Example 6 (1) as a template, PCR was performed using an Expand Hi-Fi PCR system (Boehringer Mannheim) (FIG. 2). As the primer, a combination of an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 54 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 55 (hereinafter, referred to as primer pair 6) was used. Here, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 54 was designed based on the nucleotide sequence encoding the N-terminal amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20. In addition, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 55 was designed based on a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence encoding the internal amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21. The PCR reaction solution was 300 ng of the chromosomal DNA, 7.5 pmol of each of the two types of primers, 0.2 μl of dNTP mix (a mixture of 4 types of dNTPs of 2 mM each), and 10 × buffer (MgCl 2).₂2.5 μl) and 0.19 μl of Expand @ HiFi enzyme mix, and further distilled water was added to make a total volume of 25 μl. The heat retention conditions were as follows: heat retention at 97 ° C. for 2 minutes, and then repeat this for 10 cycles with heat retention at 97 ° C. for 15 seconds, then at 65 ° C. for 30 seconds, and further at 72 ° C. for 1 minute, followed by 15 cycles at 97 ° C. Next, this was repeated 15 times at 65 ° C. for 30 seconds and further at 72 ° C. for 1 minute (the temperature at 72 ° C. was increased by 20 seconds for each cycle), and the heat was kept at 72 ° C. for 7 minutes. . The reaction solution after the incubation was subjected to 2% agarose gel electrophoresis, and a gel portion containing about 800 bp DNA was recovered. From the recovered gel, DNA was purified using QIA quick gel Gel Extraction Kit (manufactured by Qiagen) according to the attached instruction manual. The obtained DNA was ligated to pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by INVITROGEN) according to the instruction manual attached to the vector, and introduced into Escherichia coli TOP10F '. Plasmid DNA was prepared from the obtained Escherichia coli transformant using QIAGEN @ Tip20 (manufactured by QIAGEN), and -21M13 primer (manufactured by Applied Biosystems Japan) and M13Rev primer (manufactured by Applied Biosystems Japan) were used as primers. The sequencing reaction was performed using a dye terminator cycle sequencing FS Ready Reaction Kit (manufactured by Applied Biosystems Japan) according to the instruction manual attached to the kit. The reaction product was analyzed using DNA sequencer 373A (manufactured by Applied Biosystems Japan). As a result, the base sequence represented by base numbers 36 to 819 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 was read. Of the read base sequence, a part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 was encoded by base numbers 37 to 60 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10. Therefore, this DNA was presumed to be a DNA encoding a part of the protein (A2) of the present invention.
[0090]
Next, using the chromosomal DNA library prepared in Example 6 (2) as a template, PCR was performed using an Expand HiFi PCR system (Boehringer Mannheim) under the same conditions as described above. By performing PCR using a combination of the oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 56 and the oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 57 (hereinafter, referred to as primer pair 7) as a primer, SEQ ID NO: 10 A DNA having a base sequence extending 5 ′ upstream from the base indicated by base No. 36 in the indicated base sequence was amplified. Further, by performing PCR using a combination of an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 58 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 59 (hereinafter, referred to as primer pair 8) as a primer, A DNA having a base sequence extending 3 ′ downstream from the base shown by base number 819 in the base sequence shown by No. 10 was amplified. About 1.3 kbp of DNA amplified using the primer pair 7 and about 0.4 kb of DNA amplified using the primer pair 8 were cloned into the pCRII-TOPO cloning vector in the same manner as described above. Plasmid DNA was prepared from the obtained E. coli transformant using QIAGEN @ Tip20 (manufactured by QIAGEN), and -21M13 primer (manufactured by Applied Biosystems Japan) and M13Rev primer (manufactured by Applied Biosystems Japan) and SEQ ID NO: 60 Using an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by the above as a primer, a sequencing reaction was carried out using a dye terminator cycle sequencing FS Ready Reaction Kit (manufactured by Applied Biosystems Japan) according to the instruction manual attached to the kit. The reaction product was analyzed using DNA sequencer 373A (manufactured by Applied Biosystems Japan). From the result of analyzing the base sequence of the approximately 1.3 kb DNA amplified using the primer pair 7, the base sequences represented by base numbers 1 to 35 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 were read. From the result of analyzing the base sequence of the approximately 0.4 kb DNA amplified using the primer pair 8, the base sequence represented by base numbers 819 to 1415 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 was read. As a result of joining all the read base sequences, the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 was obtained. There were two open reading frames (ORFs) in the sequence. That is, a base sequence consisting of 1206 bases (including a stop codon) and encoding 401 amino acid residues (SEQ ID NO: 7) and a base sequence consisting of 198 bases (including a stop codon) and encoding 65 amino acid residues (SEQ ID NO: 7) 16) were included. The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 was calculated to be 43983 Da. In addition, the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence was determined from the amino acid sequence (SEQ ID NO: 20) determined from the N-terminal amino acid sequence analysis of the protein (A2) of the present invention and from the amino acid sequence analysis by mass spectrometry of a tryptic digest fragment. Amino acid sequence (SEQ ID NO: 21). The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 13) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16 was calculated to be 6707 Da.
[0091]
Example 7 Expression of the protein (A2) of the present invention in Escherichia coli
(1) Preparation of transformed Escherichia coli having the DNA (A2) of the present invention
Using the chromosomal DNA prepared from Saccharopolyspora \ taberi \ JCM \ 9383t in Example 6 (1) as a template, PCR was performed using an Expand HiFi PCR system (Boehringer Mannheim). As the primer, a combination of an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 61 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 62 (hereinafter, referred to as primer pair 21), or A combination of an oligonucleotide having the base sequence shown by the nucleotide sequence and an oligonucleotide having the base sequence shown by SEQ ID NO: 63 (hereinafter, referred to as primer pair 22) was used. To the PCR reaction solution, two types of primers were added so that each had a concentration of 300 nM, 50 ng of chromosomal DNA, 5.0 μl of dNTP mix (a mixture of four types of dNTPs of 2.0 mM each), and 10 × Expand @ HF buffer ( MgCl₂5.0 μl) and 0.75 μl of Expand @ HiFi enzyme mix, and further distilled water was added to make a total volume of 50 μl. The heat retention conditions were as follows: heat retention at 97 ° C. for 2 minutes, 10 cycles of heat retention at 97 ° C. for 15 seconds, then 60 ° C. for 30 seconds, and further 72 ° C. for 1 minute, followed by 15 cycles at 97 ° C. Next, this was repeated for 15 cycles at a temperature of 60 ° C. for 30 seconds and a further temperature of 72 ° C. for 1 minute (the temperature at 72 ° C. was increased by 20 seconds for each cycle), and the cycle was repeated 15 times. . Each of the reaction solutions after the incubation was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, a gel containing about 1.2 kbp DNA was cut out from the gel provided with the reaction solution using the primer pair 21, and the reaction solution using the primer pair 22 was used. A gel containing about 1.4 kbp DNA was cut out from the gel subjected to the above. DNA was purified from the collected gels using QIA quick gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN) according to the instruction manual attached to the kit. The obtained DNA and the pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by Invitrogen) were ligated according to the instruction manual attached to the vector, and introduced into Escherichia coli TOP10F '. Plasmid DNA was prepared from the obtained Escherichia coli transformant using QIAGEN {Tip20} (manufactured by QIAGEN). Then, using the DNA as a template, a -21M13 primer (manufactured by Applied Biosystems Japan), an M13Rev primer (manufactured by Applied Biosystems Japan), an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 56, and a base represented by SEQ ID NO: 64 Using an oligonucleotide having a sequence as a primer, a sequencing reaction was performed using a dye terminator cycle sequencing FS Ready Reaction Kit (manufactured by Applied Biosystems Japan) according to the instruction manual attached to the kit. The obtained reaction product was analyzed using a DNA sequencer 373A (manufactured by Applied Biosystems Japan). Based on the obtained results, the plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 was designated as pCR923, and the plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 was designated as pCR923F.
Next, the plasmids pCR923 and pCR923F were digested with restriction enzymes NdeI and HindIII, respectively, and the digest was subjected to agarose gel electrophoresis. A gel containing about 1.2 kbp of DNA was cut out from the gel provided with the digest of pCR923, and a gel containing about 1.4 kbp of DNA was cut out from the gel provided with the digest of pCR923F. DNA was purified from each of the obtained gels using QIA quick gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN) according to the instruction manual attached to the kit. The obtained DNA and the plasmid pKSN2 digested with NdeI and HindIII were ligated with a ligation kit Ver. 1 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and ligated according to the instruction manual attached to the kit, and introduced into Escherichia coli JM109. Plasmid DNA was prepared from the obtained E. coli transformant, and its structure was analyzed. The plasmid obtained by inserting the above-described DNA of about 1.2 kbp containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 and encoding the protein (A2) of the present invention between the NdeI site and the HindIII site of pKSN2 was designated as pKSN923. . In addition, a plasmid comprising the base sequence of SEQ ID NO: 10 and encoding the above-described protein (A2) of the present invention, which is about 1.4 kbp and inserted between the NdeI site and the HindIII site of pKSN2, was replaced with pKSN923F. And These plasmids pKSN923 and pKSN923F were respectively introduced into Escherichia coli JM109, and the resulting Escherichia coli transformants were designated as JM109 / pKSN923 and JM109 / pKSN923F, respectively. Further, the plasmid pKSN2 was introduced into Escherichia coli JM109, and the obtained Escherichia coli transformant was designated as JM109 / pKSN2.
[0092]
(2) Expression of the protein (A2) of the present invention in Escherichia coli and recovery of the protein
Escherichia coli JM109 / pKSN923, JM109 / pKSN923F, and JM109 / pKSN2 were each transferred to 10 ml of TB medium (tryptone 1.2% (w / v), yeast extract 2.4% (w / v) containing 50 μg / ml ampicillin. , Glycerol 0.4% (v / v), potassium dihydrogen phosphate 17 mM, dipotassium hydrogen phosphate 72 mM) at 37 ° C. overnight, and 1 ml of the obtained culture solution was treated with 50 μg / ml ampicillin. And cultured at 26 ° C. at OD660 of about 0.5, 5-aminolevulinic acid was added to a final concentration of 500 μM, and the culture was continued. Thirty minutes later, IPTG was added to a final concentration of 1 mM, and the cells were further cultured for 17 hours.
The cells were collected from each culture, washed with a 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.5), and suspended in 10 ml of the buffer containing 1 mM PMSF. The obtained bacterial cell suspension was ultrasonically treated six times for 3 minutes each under the conditions of out put 3 and duty cycle 30% using an ultrasonic crusher (SONIFIER (registered trademark of Branson Sonic Power Company)). A crushed liquid was obtained. After the obtained crushed liquid was centrifuged (1,200 × g, 5 minutes), the supernatant was recovered and centrifuged (150,000 × g, 70 minutes), and then the supernatant fraction ( Hereinafter, the supernatant fraction obtained from Escherichia coli JM109 / pKSN923 was used as the supernatant fraction obtained from Escherichia coli extract pKSN923, and the supernatant fraction obtained from JM109 / pKSN923F was used as the supernatant fraction obtained from Escherichia coli extract pKSN923F and JM109 / pKSN2. The E. coli extract pKSN2) was collected. 1 μl of the supernatant fraction was analyzed by SDS-15% to 25% PAGE and stained with CBB. As a result, in the E. coli extracts pKSN923 and pKSN923F, a band significantly higher than that in the E. coli extract pKSN2 was detected at the migration position corresponding to a molecular weight of about 47 kDa. It was confirmed that E. coli JM109 / pKSN923 and E. coli JM109 / pKSN923F expressed the protein of the present invention (A2).
[0093]
(3) Assay for ability to convert compound (II) to compound (III)
¹⁴3 ppm of compound (II) labeled with C, 2 mM β-NADPH (A component, manufactured by Oriental Yeast), 2 mg / ml spinach-derived ferredoxin (B component, SIGMA), 0.1 U / ml ferredoxin 30 μl of a reaction solution comprising 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing reductase (C component, manufactured by SIGMA) and 18 μl of the supernatant fraction collected in Example 7 (2) was prepared. Incubated at 10 ° C. for 10 minutes. In addition, a reaction solution to which one or more fractions of the component A, component B and component C in the reaction solution composition were not added was prepared and kept warm in the same manner. After the incubation, 3.0 μl of 2N hydrochloric acid and 90 μl of ethyl acetate were added to each reaction solution, stirred, and centrifuged at 8,000 × g to collect 75 μl of an ethyl acetate phase. After the ethyl acetate phase was evaporated to dryness under reduced pressure, the residue was dissolved in 6.0 μl of ethyl acetate, and 5.0 μl of the residue was placed on a silica gel TLC plate (TLC plate silica gel 60F).₂₅₄, 20 cm × 20 cm, 0.25 mm thickness, manufactured by Merck). After developing the TLC plate for about 1 hour using a chloroform-acetic acid-ethyl acetate mixed solution (chloroform: acetic acid: ethyl acetate = 6: 1: 2) as a developing solvent, the solvent is evaporated, and an imaging plate (Fuji Photo Film Co., Ltd.) is developed. Was exposed overnight. Next, the imaging plate was analyzed with an image analyzer BAS2000 (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.),¹⁴The presence or absence of spots (Rf values 0.24 and 0.29) corresponding to compound (III) labeled with C was examined. Table 8 shows the results.
[0094]
[Table 8]

[0095]
Example 8 Preparation of this protein (A10)
(1) Preparation of crude cell extract
The glycerol stock of Streptomyces griseolus ATCC 11796 was placed in a 500 ml-winged flask containing 250 ml of B medium (glucose 1% (w / v), beef extract 0.1%, tryptose 0.2% (w / v)). The mixture was added and rotated at 30 ° C. for 3 days to obtain a preculture solution. Forty ml of the preculture was inoculated into 400 ml of the B medium and cultivated in a 1 L Erlenmeyer flask at 30 ° C. for 24 hours. After stopping the culture, the culture was allowed to stand, 220 ml of the supernatant alone was removed, and about 220 ml of the culture medium prepared in the same manner was added to the remaining about 220 ml of the culture medium to make about 440 ml in total. Compound (II) was added to the mixture at 100 ppm, and the cells were cultured in a 1 L Erlenmeyer flask at 30 ° C. for 40 hours. Wet cells were collected from about 2.6 L of the culture thus obtained by centrifugation (3,000 × g, 5 minutes). The obtained wet cells were washed with 1 L of 0.1 M @ PIPES-NaOH buffer (pH 6.8) to obtain 26 g of wet cells.
The wet cells were suspended in 3 ml of 0.1 M PIPES-NaOH buffer (pH 6.8) per 1 g of wet weight of cells, and 1 mM of PMSF, 5 mM of benzamidine hydrochloride, 1 mM of EDTA, 3 μg / ml of leupeptin were added to the suspension. , 3 μg / ml, pepstatin A and 1 mM dithiothreitol. This is repeated twice with a French press (manufactured by Otake Seisakusho) (1000 kg / cm²) To obtain a cell lysate. After centrifugation (40,000 × g, 30 minutes) of the cell lysate, the supernatant was collected and centrifuged at 150,000 × g for 1 hour. This was described as a liquid).
[0096]
(2) Assay for ability to convert compound (II) to compound (III)
¹⁴3 ppm of compound (II) labeled with C, 2.4 mM β-NADPH (A component, manufactured by Oriental Yeast), 0.5 mg / ml @ spinach ferredoxin (B component, manufactured by SIGMA), 1 U / ml A reaction solution (30 μl) comprising 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing ferredoxin reductase (C component, manufactured by SIGMA) and 18 μl of the crude cell extract recovered in Example 8 (1) was prepared. At 30 ° C. for 1 hour. In addition, a reaction solution to which one or more fractions of the component A, component B and component C in the reaction solution composition were not added was prepared and kept warm in the same manner. After the incubation, 3.0 μl of 2N hydrochloric acid and 90 μl of ethyl acetate were added to each reaction solution, stirred, and centrifuged at 8,000 × g to collect 75 μl of an ethyl acetate phase. After the ethyl acetate phase was evaporated to dryness under reduced pressure, the residue was dissolved in 6.0 μl of ethyl acetate, and 5.0 μl of the residue was placed on a silica gel TLC plate (TLC plate silica gel 60F).₂₅₄, 20 cm × 20 cm, 0.25 mm thickness, manufactured by Merck). After developing the TLC plate for about 1 hour using a chloroform-acetic acid-ethyl acetate mixed solution (chloroform: acetic acid: ethyl acetate = 6: 1: 2) as a developing solvent, the solvent is evaporated, and an imaging plate (Fuji Photo Film Co., Ltd.) is developed. Was exposed overnight. Next, the imaging plate was analyzed with an image analyzer BAS2000 (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.),¹⁴The presence or absence of spots (Rf values 0.24 and 0.29) corresponding to compound (III) labeled with C was examined. Table 9 shows the results.
[0097]
[Table 9]

[0098]
(3) Fractionation of crude cell extract
Ammonium sulfate was added to the crude extract of the cells obtained in Example 8 (1) so as to be 45% saturated and stirred on ice, and then centrifuged at 12,000 × g for 30 minutes to collect the supernatant. did. Ammonium sulfate was added to the obtained supernatant so as to be 55% saturated, stirred on ice, centrifuged at 12,000 × g for 10 minutes, and the precipitate was recovered to obtain a 20 mM bistrispropane buffer (pH 7.0). ) To 10 ml. This solution is applied to a PD10 column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), eluted with 20 mM bistrispropane buffer (pH 7.0), and a protein-containing fraction (hereinafter referred to as ammonium sulfate precipitation 45-55% fraction). 14 ml was collected.
[0099]
(4) Isolation of the present protein (A10)
The ammonium sulfate precipitation 45-55% fraction prepared in Example 8 (3) was injected into a MonoQ HR 10/10 column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech). Next, the column was flowed through the column with 16 ml of 20 mM bistrispropane buffer (pH 7.0), and then a 20 mM bistrispropane buffer (pH 7.0) was flowed through a linear concentration gradient of sodium chloride. 15 ml of the fraction eluted at 0.00625 M / min, sodium chloride concentration range from 0 M to 0.5 M, flow rate 4 ml / min) and sodium chloride concentration of 0.28 M to 0.31 M were collected. The fraction thus collected was applied to a PD10 column (Amersham Pharmacia Biotech), and eluted with a 20 mM bistrispropane buffer (pH 7.0) to collect a protein-containing fraction.
The collected fraction was applied to a PD10 column and eluted with an A buffer (2 mM potassium phosphate buffer containing 1.5 mM calcium chloride, pH 7.0) to collect a protein-containing fraction. Then, the fraction was injected into Bio-Scale Ceramic Hydroxypatite, Type Icolum CHT10-I (manufactured by Bio-Rad), and 50 ml of A buffer was passed through the column. Then, the column was subjected to a linear concentration gradient of B buffer (100 mM potassium phosphate buffer containing 0.03 mM calcium chloride, pH 7.0), and A buffer was applied (starting from A buffer 100% and taking 40 minutes). The concentration of the B buffer was increased to 50% by a linear concentration gradient at a flow rate of 5 ml / min, and the solution eluted at a B buffer concentration of 16% to 31% was fractionated in 5 ml portions. This fraction was further applied to a PD10 column (Amersham Pharmacia Biotech), and eluted with a 0.05 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) to collect a protein-containing fraction. The protein contained in each fraction was analyzed by SDS-10% -20% PAGE.
Each fraction collected was added in place of the crude extract of the cells in the reaction solution described in Example 8 (2), and the A component, B component, C component and¹⁴The temperature was kept in the same manner as in Example 8 (2) in the presence of the compound (II) labeled with C. TLC analysis of the reaction solution after the incubation was performed,¹⁴The intensity of spots corresponding to compound (III) labeled with C was examined. In the SDS-PAGE, the protein migrated at a position of about 45 kDa shows a change in the concentration of the protein band in the continuous fraction,¹⁴A change in the intensity of the spot corresponding to the compound (III) labeled with C was observed in parallel. The protein was recovered from the SDS-PAGE gel, digested with trypsin, and the obtained digested fragment was analyzed by mass spectrometry (ThermoQuest Co., Ltd. ion trap mass spectrometer LCQ, column: LC Packings PepMAP C18 75 μm × 150 mm, Mobile phase A: 0.1% HOAc-H₂O, mobile phase B: 0.1% HOAc-methanol, gradient: starting from an eluate mixed at a ratio of 95% mobile phase A, 5% mobile phase B, and increasing mobile phase B to 100% over 30 minutes Linear gradient, flow rate: 0.2 μl / min). As a result, the amino acid sequences represented by any of SEQ ID NOs: 22 to 34 were read.
[0100]
Example 9 Preparation of Chromosomal DNA of Streptomyces griseolus ATCC 11796
Streptomyces griseolus ATCC 11796 was added to a 50 ml YEME medium [yeast extract 0.3% (w / v), bactopeptone 0.5% (w / v), malt extract 0.3% (w / v), glucose 1.0%. (W / v), 34% sucrose (w / v), 2.5M MgCl₂・ 6H₂O 0.2% (v / v)] for 1 to 3 days with shaking at 30 ° C., followed by harvesting. The obtained cells were suspended in the above YEME medium containing 1.4% (w / v) glycine and 60 mM @EDTA, and cultured with shaking for one day. The cells were collected from the obtained culture solution, washed once with distilled water, and then resuspended in 1 ml of a buffer [100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM EDTA, 10 mM NaCl] per 200 mg of cells. 200 μg / ml egg white lysozyme was added and shaken at 30 ° C. for 1 hour. Further, 0.5% SDS, 1 mg / ml {Proteinase} K was added, and the mixture was incubated at 55 ° C. for 3 hours. The cell suspension was extracted twice with phenol / chloroform / isoamyl alcohol to collect an aqueous layer, and then extracted once with chloroform / isoamyl alcohol to recover the aqueous layer and ethanol precipitated from the aqueous layer. As a result, chromosomal DNA was obtained.
[0101]
Example 10 Preparation of DNA Encoding the Present DNA (A10) and Expression in E. coli
(1) Preparation of transformed E. coli having the present DNA
Using chromosomal DNA prepared from Streptomyces griseolus ATCC 11796 in Example 9 as a template, PCR was carried out using Expand High Fidelity PCR System (manufactured by Roche Molecular Biochemicals). As the primer, a combination of an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 79 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 80 (hereinafter, referred to as primer pair 23), or A combination of an oligonucleotide having the base sequence shown by SEQ ID NO: 81 and an oligonucleotide having the base sequence shown by SEQ ID NO: 81 (hereinafter, referred to as primer pair 24) was used. To the PCR reaction solution, two types of primers were added so that each had a concentration of 300 nM, 50 ng of chromosomal DNA, 5.0 μl of dNTP mix (a mixture of four types of dNTPs of 2.0 mM each), and 10 × Expand @ HF buffer ( MgCl₂5.0 μl) and 0.75 μl of Expand @ HiFi enzyme mix, and further distilled water was added to make a total volume of 50 μl. The heat-retention conditions were as follows: after keeping the temperature at 97 ° C for 2 minutes, the cycle of keeping the temperature at 97 ° C for 15 seconds, then at 65 ° C for 30 seconds, and further at 72 ° C for 2 minutes as one cycle, was repeated for 10 cycles, and then at 97 ° C for 15 seconds Next, 15 cycles were performed with the heat retention at 68 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 2 minutes (the heat retention at 72 ° C. was increased by 20 seconds for each cycle) as one cycle, and the temperature was further kept at 72 ° C. for 7 minutes. . After the incubation, the reaction solutions were subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and a gel containing about 1.2 kbp of DNA was cut out from the gel provided with the reaction solution using the primer pair 23. A gel containing about 1.5 kbp DNA was cut out from the provided gel. From each of the collected gels, DNA was purified using QIA quick gel Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN) according to the instruction manual attached to the kit. The obtained DNA and pCR2.1-TOPO vector (manufactured by Invitrogen) were ligated according to the instruction manual attached to the vector, and introduced into Escherichia coli TOP10F '. Plasmid DNA was prepared from the obtained Escherichia coli transformant using QIAprepSpin \ Miniprep \ Kit (manufactured by QIAGEN). Next, using the DNA as a template, a -21M13 primer (manufactured by Applied Biosystems Japan), an M13 Rev primer (manufactured by Applied Biosystems Japan), an oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 82, and SEQ ID NO: 83 Using an oligonucleotide having a base sequence as a primer, a sequencing reaction was performed using a dye terminator cycle sequencing FS Ready Reaction Kit (manufactured by Applied Biosystems Japan) according to the instruction manual attached to the kit. The obtained reaction product was analyzed using a DNA sequencer 373A (manufactured by Applied Biosystems Japan). Based on the obtained results, the plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 84 was designated as pCR11796, and the plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 85 was designated as pCR11796F. There were two open reading frames (ORFs) in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 85. That is, a base sequence (SEQ ID NO: 84) consisting of 1221 bases (including the stop codon) and encoding 406 amino acid residues (amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5), and 69 bases consisting of 210 bases (including the stop codon) And the nucleotide sequence encoding the residue.
Next, the above-mentioned pCR11796 and pCR11796F were digested with restriction enzymes NdeI and HindIII, respectively, and the digest was subjected to agarose gel electrophoresis. A gel containing about 1.2 kbp DNA was cut out from the gel provided with the digested product of pCR11796, and a gel containing about 1.5 kbp DNA was cut out from the gel provided with the digested product of pCR11796F. DNA was purified from each of the obtained gels using QIA quick gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN) according to the instruction manual attached to the kit. The obtained DNA and the plasmid pKSN2 digested with NdeI and HindIII were ligated with a ligation kit Ver. 1 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and ligated according to the instruction manual attached to the kit, and introduced into Escherichia coli JM109. Plasmid DNA was prepared from the obtained E. coli transformant, and its structure was analyzed. The plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 84 and encoding the above protein (A10) of about 1.2 kbp inserted between the NdeI site and HindIII site of pKSN2 was designated as pKSN11796. A plasmid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 85 and encoding the above protein (A10) and having the above-described DNA of about 1.5 kbp inserted between the NdeI site and the HindIII site of pKSN2 was called pKSN11796F. did. These plasmids pKSN11796 and pKSN11796F were respectively introduced into Escherichia coli JM109, and the resulting Escherichia coli transformants were designated as JM109 / pKSN11796 and JM109 / pKSN11796F, respectively. Further, the plasmid pKSN2 was introduced into Escherichia coli JM109, and the obtained Escherichia coli transformant was designated as JM109 / pKSN2.
[0102]
(2) Expression of the present protein (A10) in Escherichia coli and recovery of the protein
E. coli JM109 / pKSN11796, JM109 / pKSN11796F, and JM109 / pKSN2 were each added to 50 ml / ml ampicillin in 10 ml of TB medium (tryptone 1.2% (w / v), yeast extract 2.4% (w / v), The cells were cultured overnight at 37 ° C. in glycerol 0.4% (v / v), potassium dihydrogen phosphate 17 mM, dipotassium hydrogen phosphate 72 mM). 1 ml of the obtained culture solution was inoculated into 100 ml of TB medium containing 50 μg / ml of ampicillin and cultured at 26 ° C. When the OD660 reached about 0.5, the final concentration was adjusted to 500 μM. -Aminolevulinic acid 添加 was added and the culture was continued. Thirty minutes later, IPTG was added to a final concentration of 1 mM, and the cells were further cultured for 17 hours.
The cells were collected from each culture, washed with a 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.5), and suspended in 10 ml of the buffer containing 1 mM PMSF. The obtained bacterial cell suspension was ultrasonically treated six times for 3 minutes each under the conditions of out put 3 and duty cycle 30% using an ultrasonic crusher (SONIFIER (registered trademark of Branson Sonic Power Company)). A crushed liquid was obtained. After the obtained crushed liquid was centrifuged (1,200 × g, 5 minutes), the supernatant was recovered and centrifuged (150,000 × g, 70 minutes), and then the supernatant fraction ( Hereinafter, the supernatant fraction obtained from Escherichia coli JM109 / pKSN11796, the supernatant fraction obtained from Escherichia coli extract pKSN11796F, and the supernatant fraction obtained from JM109 / pKSN11796F, the supernatant fraction obtained from Escherichia coli extract pKSN11796F, JM109 / pKSN2 The E. coli extract pKSN2) was collected. 1 μl of the supernatant fraction was analyzed by SDS-15% to 25% PAGE and stained with CBB. As a result, in both the E. coli extract pKSN11796 and the E. coli extract pKSN11796F, a band significantly higher than that of the E. coli extract pKSN2 was detected at the migration position corresponding to a molecular weight of about 45 kDa. This band was detected deeper in the E. coli extract pKSN11796F than in the E. coli extract pKSN11796F. It was shown that Escherichia coli JM109 / pKSN11796F expressed more of this protein (A10) than JM109 / pKSN11796.
[0103]
(3) Assay for ability to convert compound (II) to compound (III)
¹⁴3 ppm of compound (II) labeled with C, 2 mM β-NADPH (A component, manufactured by Oriental Yeast), 2 mg / ml spinach-derived ferredoxin (B component, SIGMA), 0.1 U / ml ferredoxin 30 μl of a reaction solution comprising 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing reductase (C component, manufactured by SIGMA) and 18 μl of the supernatant fraction collected in Example 10 (2) was prepared. Incubated at ℃ for 1 hour. In addition, a reaction solution to which one or more fractions of the component A, component B and component C in the reaction solution composition were not added was prepared and kept warm in the same manner. After the incubation, 3.0 μl of 2N hydrochloric acid and 90 μl of ethyl acetate were added to each reaction solution, stirred, and centrifuged at 8,000 × g to collect 75 μl of an ethyl acetate phase. After the ethyl acetate phase was evaporated to dryness under reduced pressure, the residue was dissolved in 6.0 μl of ethyl acetate, and 5.0 μl of the residue was placed on a silica gel TLC plate (TLC plate silica gel 60F).₂₅₄, 20 cm × 20 cm, 0.25 mm thickness, manufactured by Merck). After developing the TLC plate for about 1 hour using a chloroform-acetic acid-ethyl acetate mixed solution (chloroform: acetic acid: ethyl acetate = 6: 1: 2) as a developing solvent, the solvent is evaporated, and an imaging plate (Fuji Photo Film Co., Ltd.) is developed. Was exposed overnight. Next, the imaging plate was analyzed with an image analyzer BAS2000 (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.),¹⁴The presence or absence of spots (Rf values 0.24 and 0.29) corresponding to compound (II) labeled with C was examined. Table 10 shows the results.
[0104]
[Table 10]

[0105]
Example 11: Obtaining the DNA (A3) of the present invention
(1) Preparation of chromosomal DNA of Streptomyces @ testaceus @ ATCC21469
Streptomyces testaceus ATCC 21469 in 50 ml of YEME medium (yeast extract 0.3% (w / v), bactopeptone 0.5% (w / v), malt extract 0.3% (w / v), glucose 1.0% (W / v), 34% sucrose (w / v), 2.5M MgCl₂・ 6H₂After shaking culture at 30 ° C. for 1 day (O 日間 0.2% (v / v)), the cells were collected. The obtained cells were suspended in the above YEME medium containing 1.4% (w / v) glycine and 60 mM @EDTA, and cultured with shaking for one day. The cells were collected from the obtained culture solution, washed once with distilled water, and then resuspended in 1 ml of a buffer (100 mM @ Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM EDTA, 10 mM NaCl) per 200 mg of cells. 200 μg / ml egg white lysozyme was added and shaken at 30 ° C. for 1 hour. Further, 0.5% SDS and 1 mg / ml Proteinase @ K were added, and the mixture was incubated at 55 ° C. for 3 hours. The cell suspension was extracted twice with phenol / chloroform / isoamyl alcohol to collect an aqueous layer, and then extracted once with chloroform / isoamyl alcohol to recover the aqueous layer and ethanol precipitated from the aqueous layer. As a result, chromosomal DNA was obtained.
[0106]
(2) Isolation of the DNA (A3) of the present invention
PCR was performed using the chromosomal DNA prepared in Example 11 (1) as a template. As the primer, a combination of an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 65 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 66 (hereinafter, referred to as primer pair 9) was used. To the PCR reaction solution, two types of primers were added at 200 nM each, 250 ng of chromosomal DNA, 4 μl of dNTP mix (a mixture of four types of 2.5 mM dNTPs), 5 μl of 10 × ExTaq buffer, and ExTaq polymerase (Takara Shuzo) Was added, and distilled water was further added to make a total volume of 50 μl. The temperature was maintained at 97 ° C. for 2 minutes, 30 cycles of 97 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 90 seconds were repeated 30 times, and further, the temperature was maintained at 72 ° C. for 4 minutes. The reaction solution after the incubation was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis, and a gel portion containing about 1.4 kbp DNA was recovered. DNA was purified from the collected gel using QIA quick gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN) according to the attached instruction manual. The obtained DNA was ligated to a TA cloning vector pCR2.1 (manufactured by INVITROGEN) according to the instruction manual attached to the vector, and introduced into E. coli TOP10F '. Plasmid DNA was prepared from the obtained Escherichia coli transformant using QIAprep \ Spin \ Miniprep \ Kit (manufactured by QIAGEN). Dye terminator cycle sequencing FS Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Inc.) was used as a template, using the resulting plasmid DNA as a template and an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 67 and an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 68 as primers. (Manufactured by Systems Japan) according to the instruction manual attached to the kit. The reaction product was analyzed using DNA sequencer 373A (manufactured by Applied Biosystems Japan). As a result, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 69 was read. There were two open reading frames (ORFs) in this nucleotide sequence. That is, a base sequence consisting of 1188 bases (including the stop codon) and encoding 395 amino acid residues and a base sequence consisting of 195 bases (including the stop codon) and encoding 64 amino acid residues (SEQ ID NO: 17) are included. Was. The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 was calculated to be 6666 Da.
[0107]
Example 12 Expression of the protein (A3) of the present invention in Escherichia coli
(1) Preparation of transformed Escherichia coli having the DNA (A3) of the present invention
Using the chromosomal DNA prepared in Example 11 (1) as a template, PCR was performed with ExTaq polymerase (Takara Shuzo) under the same conditions as above. The primer is a combination of an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 70 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 71 (hereinafter, referred to as primer pair 10), or represented by SEQ ID NO: 70. A combination of an oligonucleotide having a base sequence and an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 72 (hereinafter, referred to as primer pair 11) was used. The approximately 1.2 kb DNA amplified using the primer pair 10 and the approximately 1.5 kb DNA amplified using the primer pair 11 were cloned into the TA cloning vector pCR2.1 by the above method. Plasmid DNA was prepared from the obtained Escherichia coli transformant using QIAprep \ Spin \ Miniprep \ Kit (manufactured by QIAGEN). Using the obtained plasmid DNA as a template, an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 67, an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 68, and an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 73 as a primer Using a dye terminator cycle sequencing FS Ready Reaction Kit (manufactured by Applied Biosystems Japan), a sequencing reaction was performed according to the instruction manual attached to the kit. The reaction product was analyzed using DNA sequencer 373A (manufactured by Applied Biosystems Japan). As a result, it was confirmed that the plasmid in which the DNA amplified using the primer pair 10 was cloned had the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8, and the plasmid in which the DNA amplified using the primer pair 11 was cloned was SEQ ID NO: It was confirmed to have the base sequence represented by No. 11. The base sequence represented by SEQ ID NO: 11 had two open reading frames (ORFs). That is, a base sequence consisting of 1188 bases (including the stop codon) and encoding 395 amino acid residues (SEQ ID NO: 8) and a base sequence consisting of 195 bases (including the stop codon) and encoding 64 amino acid residues are included. Was. The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 was calculated to be 43752 Da. Among the obtained plasmids, the plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 was designated as pCR671, and the plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 was designated as pCR671F.
Next, the above pCR671 and pCR671F were digested with restriction enzymes NdeI and HindIII, respectively, and the digests were subjected to agarose gel electrophoresis. A gel containing about 1.2 kbp of DNA was cut out from the gel provided with the digested product of pCR671, and a gel containing about 1.5 kbp of DNA was cut out from the gel provided with the digested product of pCR671F. DNA was purified from each of the obtained gels using QIA quick gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN) according to the instruction manual attached to the kit. The obtained DNA and the plasmid pKSN2 digested with NdeI and HindIII were ligated with a ligation kit Ver. 1 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and ligated according to the instruction manual attached to the kit, and introduced into Escherichia coli JM109. Plasmid DNA was prepared from the obtained E. coli transformant, and its structure was analyzed. A plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 and encoding the above-described protein (A3) of the present invention of about 1200 bp, which was inserted between the NdeI site and the HindIII site of pKSN2, was designated as pKSN671. The plasmid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 and coding for the protein of the present invention (A3) of about 1400 bp was inserted between the NdeI site and the HindIII site of pKSN2, and was designated as pKSN657F. . These plasmids pKSN671 and pKSN671F were respectively introduced into Escherichia coli JM109, and the resulting E. coli transformants were designated as JM109 / pKSN671 and JM109 / pKSN671F, respectively. Further, the plasmid pKSN2 was introduced into Escherichia coli JM109, and the obtained Escherichia coli transformant was designated as JM109 / pKSN2.
[0108]
(2) Expression of the protein (A3) of the present invention in Escherichia coli and recovery of the protein
Escherichia coli JM109 / pKSN671, JM109 / pKSN671F, and JM109 / pKSN2 were each added to 10 ml of a TB medium (tryptone 1.2% (w / v), yeast extract 2.4% (w / v) containing 50 μg / ml ampicillin. Glycerol 0.4% (v / v), potassium dihydrogen phosphate 17 mM, dipotassium hydrogen phosphate 72 mM) at 37 ° C. overnight. 1 ml of the obtained culture solution was inoculated into 100 ml of TB medium containing 50 μg / ml of ampicillin and cultured at 26 ° C. When the OD660 reached about 0.5, the final concentration was adjusted to 500 μM. -Aminolevulinic acid 添加 was added and the culture was continued. Thirty minutes later, IPTG was added to a final concentration of 1 mM, and the cells were further cultured for 17 hours.
The cells were collected from each culture, washed with a 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.5), and suspended in 10 ml of the buffer containing 1 mM PMSF. The obtained cell suspension was subjected to ultrasonic treatment for 3 minutes × 6 times using an ultrasonic crusher (SONIFIER (Branson Sonic Power Company, Inc.)) under conditions of out put 3 and duty cycle 30% for 3 minutes. A crushed liquid was obtained. After the obtained crushed liquid is centrifuged (1,200 × g, 5 minutes), the supernatant is collected and centrifuged (150,000 × g, 70 minutes) to obtain a supernatant fraction (hereinafter, referred to as “supernatant”). The supernatant fraction obtained from Escherichia coli JM109 / pKSN671 was obtained from Escherichia coli extract pKSN671, and the supernatant fraction obtained from JM109 / pKSN671F was obtained from Escherichia coli extract pKSN671F and JM109 / pKSN2. Is described as E. coli extract pKSN2).
[0109]
(3) Assay for ability to convert compound (II) to compound (III)
¹⁴3 ppm of compound (II) labeled with C, 2 mM β-NADPH (A component, manufactured by Oriental Yeast), 2 mg / ml spinach-derived ferredoxin (B component, SIGMA), 0.1 U / ml ferredoxin 30 μl of a reaction solution containing 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing reductase (C component, manufactured by SIGMA) and 18 μl of the supernatant fraction collected in Example 12 (2) was prepared, and the reaction was performed at 30 ° C. For 1 hour. In addition, a reaction solution to which one or more fractions of the component A, component B and component C in the reaction solution composition were not added was prepared and kept warm in the same manner. After the incubation, 3.0 μl of 2N hydrochloric acid and 90 μl of ethyl acetate were added to each reaction solution, stirred, and centrifuged at 8,000 × g to collect 75 μl of an ethyl acetate phase. After the ethyl acetate phase was evaporated to dryness under reduced pressure, the residue was dissolved in 6.0 μl of ethyl acetate, and 5.0 μl of the residue was placed on a silica gel TLC plate (TLC plate silica gel 60F).₂₅₄, 20 cm × 20 cm, 0.25 mm thickness, manufactured by Merck). After developing the TLC plate for about 1 hour using a chloroform-acetic acid-ethyl acetate mixed solution (chloroform: acetic acid: ethyl acetate = 6: 1: 2) as a developing solvent, the solvent is evaporated, and an imaging plate (Fuji Photo Film Co., Ltd.) is developed. Was exposed overnight. Next, the imaging plate was analyzed with an image analyzer BAS2000 (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.),¹⁴The presence or absence of spots (Rf values 0.24 and 0.29) corresponding to compound (III) labeled with C was examined. Table 11 shows the results.
[0110]
[Table 11]

[0111]
Example 13: Acquisition of the present DNA (A9)
(1) Preparation of chromosomal DNA of Streptomyces @ carbophilus @ SANK62585
Streptomyces carbophilus SANK62585 (Microtechnical Laboratories No. 1145: BP-1145) in 50 ml of YEME medium (yeast extract 0.3% (w / v), bactopeptone 0.5% (w / v), malt extract 0) 0.3% (w / v), glucose 1.0% (w / v), sucrose 34% (w / v), 2.5M MgCl 2₂・ 6H₂After shaking culture at 30 ° C. for 1 day (O 日間 0.2% (v / v)), the cells were collected. The obtained cells were suspended in the above YEME medium containing 1.4% (w / v) glycine and 60 mM @EDTA, and cultured with shaking for one day. The cells were collected from the obtained culture solution, washed once with distilled water, and then resuspended in 1 ml of a buffer (100 mM @ Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM EDTA, 10 mM NaCl) per 200 mg of cells. 200 μg / ml egg white lysozyme was added and shaken at 30 ° C. for 1 hour. Further, 0.5% SDS, 1 mg / ml {Proteinase} K was added, and the mixture was incubated at 55 ° C. for 3 hours. The cell suspension was extracted twice with phenol / chloroform / isoamyl alcohol to collect an aqueous layer, and then extracted once with chloroform / isoamyl alcohol to recover the aqueous layer and ethanol precipitated from the aqueous layer. As a result, chromosomal DNA was obtained.
[0112]
(2) Isolation of the present DNA (A9)
PCR was performed using the chromosomal DNA prepared in Example 13 (1) as a template. As the primer, a combination of an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 74 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 75 (hereinafter, referred to as primer pair 12), or represented by SEQ ID NO: 76 A combination of an oligonucleotide having a base sequence of SEQ ID NO: 77 and an oligonucleotide having a base sequence of SEQ ID NO: 77 (hereinafter, referred to as primer pair 13) was used. To the PCR reaction solution, two types of primers were each added to 200 nM, 250 ng of chromosomal DNA, 4 μl of dNTP mix (a mixture of four types of dNTPs of 2.5 mM each), 5 μl of 10 × ExTaq buffer, and ExTaq polymerase ( (Manufactured by Takara Shuzo) was added, and distilled water was further added to make a total volume of 50 μl. The temperature was maintained at 97 ° C. for 2 minutes, 30 cycles of 97 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 90 seconds were repeated 30 times, and further, the temperature was maintained at 72 ° C. for 4 minutes. The reaction solutions after the incubation were each subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis, and a gel portion containing about 500 bp DNA was recovered from the gel from which the PCR reaction solution using the primer pair 12 was separated. A gel portion containing about 800 bp of DNA was recovered from the gel from which the reaction solution of PCR using was separated. DNA was purified from the collected gels using QIAquickquickGelExtraction Kit (manufactured by QIAGEN) according to the attached instruction manual. Each of the obtained DNAs was ligated to a TA cloning vector pCR2.1 (manufactured by INVITROGEN) according to the instruction manual attached to the vector, and introduced into Escherichia coli TOP10F '. Plasmid DNA was prepared from the obtained Escherichia coli transformant using QIAprep \ Spin \ MiniprepKit (manufactured by QIAGEN). Dye terminator cycle sequencing FS Ready Reaction Kit (Applied Biosystems), using the obtained plasmid DNA as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 67 and an oligonucleotide from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 68 as primers (Manufactured by Japan Co., Ltd.) according to the instruction manual attached to the kit. The reaction product was analyzed using DNA sequencer 373A (manufactured by Applied Biosystems Japan). As a result, from the DNA obtained by PCR using the primer pair 12, the base sequence represented by base numbers 1 to 498 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 78 was obtained by PCR using the primer pair 13. From the DNA, the base sequence represented by base numbers 469 to 1233 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 78 was read. A plasmid having the base sequence represented by base numbers 1 to 498 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 78 is referred to as pCRSCA1, and a plasmid having the base sequence represented by base numbers 469 to 1233 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 78 is referred to as pCRSCA2. did.
[0113]
Example 14 Expression of this protein (A9) in Escherichia coli
(1) Preparation of transformed Escherichia coli having the present DNA (A9)
Of the plasmids obtained in Example 13 (2), the above plasmid pCRSCA1 was digested with restriction enzymes NdeI and NcoI, and pCRSCA2 was digested with restriction enzymes NcoI and HindIII. Each digest was subjected to agarose gel electrophoresis. A gel containing about 500 bp of DNA was cut out from the gel provided with the digestion product of pCRSCA2, and a gel containing about 800 bp of DNA was cut out from the gel provided with the digestion product of pCRSCA2. DNA was purified from the collected gel using QIA quick gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN) according to the instruction manual attached to the kit. The obtained two kinds of DNAs and a plasmid pKSN2 digested with NdeI and HindIII were ligated with a ligation kit Ver. 1 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and ligated according to the instruction manual attached to the kit, and introduced into Escherichia coli JM109. Plasmid DNA was prepared from the obtained E. coli transformant, and its structure was analyzed. A plasmid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 78 and encoding the present protein (A9) inserted between the NdeI site and HindIII site of pKSN2 was designated as pKSSNSCA.
[0114]
(2) Expression of the present protein (A9) in E. coli and recovery of the protein
Escherichia coli JM109 / pKSNSCA was added to 10 ml of TB medium containing 50 μg / ml of ampicillin (tryptone 1.2% (w / v), yeast extract 2.4% (w / v), glycerol 0.4% (v / v) , 17 mM potassium dihydrogen phosphate and 72 mM dipotassium hydrogen phosphate) at 37 ° C. overnight. The obtained culture solution was inoculated into 100 ml of a TB medium containing 50 μg / ml of ampicillin so that OD660 became about 0.2, and cultured at 26 ° C. When OD660 reached about 2.0, 5-aminolevulinic acid was added to a final concentration of 500 μM, and the culture was continued. Thirty minutes later, IPTG was added to a final concentration of 200 μM, and the cells were further cultured for 5 hours.
The cells were collected from each culture, washed with a 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.5), and suspended in 10 ml of the buffer containing 1 mM PMSF. This cell suspension was ultrasonically treated six times for 3 minutes each with an ultrasonic disrupter (SONIFIER (Branson Sonic Power Company, Inc.)) under conditions of out put 3 and duty cycle 30%, and the cell disrupted liquid was obtained. Got. After the obtained crushed liquid is centrifuged (1,200 × g, 5 minutes), the supernatant is collected and centrifuged (150,000 × g, 70 minutes) to obtain a supernatant fraction (hereinafter, referred to as “supernatant”). The supernatant fraction obtained from E. coli JM109 / pKSNSCA was referred to as an E. coli extract pKSSNSCA).
[0115]
(3) Assay for ability to convert compound (II) to compound (III)
¹⁴3 ppm of compound (II) labeled with C, 2 mM β-NADPH (A component, manufactured by Oriental Yeast), 2 mg / ml spinach-derived ferredoxin (B component, SIGMA), 0.1 U / ml ferredoxin 30 µl of a reaction solution comprising 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing reductase (C component, manufactured by SIGMA) and 18 µl of the supernatant fraction collected in Example 14 (2) was prepared. Incubated at 10 ° C. for 10 minutes. In addition, a reaction solution to which one or more fractions of the component A, component B and component C in the reaction solution composition were not added was prepared and kept warm in the same manner. After the incubation, 3.0 μl of 2N hydrochloric acid and 90 μl of ethyl acetate were added to each reaction solution, stirred, and centrifuged at 8,000 × g to collect 75 μl of an ethyl acetate phase. After the ethyl acetate phase was evaporated to dryness under reduced pressure, the residue was dissolved in 6.0 μl of ethyl acetate, and 5.0 μl of the residue was placed on a silica gel TLC plate (TLC plate silica gel 60F).₂₅₄, 20 cm × 20 cm, 0.25 mm thickness, manufactured by Merck). After developing the TLC plate for about 1 hour using a chloroform-acetic acid-ethyl acetate mixed solution (chloroform: acetic acid: ethyl acetate = 6: 1: 2) as a developing solvent, the solvent is evaporated, and an imaging plate (Fuji Photo Film Co., Ltd.) is developed. Was exposed overnight. Next, the imaging plate was analyzed with an image analyzer BAS2000 (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.),¹⁴The presence or absence of spots (Rf values 0.24 and 0.29) corresponding to compound (III) labeled with C was examined. Table 12 shows the results.
[0116]
[Table 12]

[0117]
Example 15 Isolation of Soybean RuBPC Gene
After soybean (cv. @Jack) was sown, it was cultivated at 27 ° C for 30 days, and green leaves were collected. 0.2 g to 0.3 g of the collected green leaves are frozen with liquid nitrogen, ground with a mortar and a pestle, and the total RNA is extracted from the ground using an RNA extraction reagent ISOGEN (manufactured by Nippon Gene) according to the attached manual. Was extracted. Furthermore, cDNA was synthesized by performing operations according to the attached manual using Superscript First-Strand Synthesis Synthesis System for RT-PCR (manufactured by Invitrogen). Specifically, Oligo (dT) contained in the kit as a primer_12-18Using Primer, soybean total RNA was used as a template, and the reverse transcriptase included in the kit was added to synthesize 1st strand cDNA. Subsequently, PCR was performed using the obtained cDNA as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 86 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 87 as primers, soybean (cv. Jack) ribulose-1,5-bisphosphate @ carboxylase (hereinafter referred to as RuBPC) small subunit chloroplast transit peptide (hereinafter may be referred to as rSt) and the subsequent 12 amino acids of the mature protein. A DNA containing the coding base sequence (hereinafter, referred to as the present rSt12 DNA) was amplified. PCR was performed using LA @ Taq \ polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) once at 94 ° C. for 3 minutes, then at 98 ° C. for 25 seconds and then at 68 ° C. for 1 minute as one cycle. The test was carried out 30 times, and finally, once at 72 ° C. for 10 minutes. Plasmid pCRrSt12 (FIG. 5) was obtained by inserting the amplified DNA into the PCR product cloning site of plasmid pCR2.1 (manufactured by Invitrogen). Next, the plasmid was introduced into competent cells of Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo) to select ampicillin-resistant strains. Furthermore, the nucleotide sequence of the plasmid contained in the selected ampicillin-resistant strain was determined using Dye \ Terminator \ Cycle \ Sequencing \ FS \ Ready \ Reaction \ kit (manufactured by PE Applied Biosystems) and DNA sequencer 373S (manufactured by PE Applied Biosystems). As a result, the base sequence represented by SEQ ID NO: 88 was clarified, and it was confirmed that the plasmid pCRrSt12 contained the present rSt12 DNA.
[0118]
Example 16 Construction of chloroplast expression plasmid for direct introduction having DNA (A1) of the present invention (1) Isolation of DNA (A1) of the present invention
Using as a template the genomic DNA of Streptomyces {phaeochromogenes} IFO12898 obtained in Example 3 (1), an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 93 and an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 94 as primers Was used to amplify a DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6. In addition, PCR was performed using an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 93 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 95 as primers to amplify DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 did. The PCR was carried out once using an Expand High Fidelity PCR System (manufactured by Boehringer) at 97 ° C for 2 minutes, then at 97 ° C for 15 seconds, at 60 ° C for 30 seconds, and then at 72 ° C for 1 second. This was carried out 10 times with 1 minute of heat retention as one cycle, followed by 15 seconds at 97 ° C., then 30 seconds at 60 ° C., then 1 minute at 72 ° C. (The heat retention at 72 ° C. was increased by 20 seconds per cycle. This was carried out 15 times with one cycle of the warming of ()), and finally one warming at 72 ° C. for 7 minutes. Plasmid pCR657ET (FIG. 6) and pCR657FET (FIG. 7) were obtained by inserting the amplified DNA into the PCR product cloning site of plasmid pCR2.1 (manufactured by Invitrogen). The plasmid pCR657Bs (see FIG. 4) was prepared in the same manner as described above, except that the primer used for PCR was an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 96 and an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 94. 8) was obtained. Furthermore, plasmid pCR657FBs (see FIG. 4) was used in the same manner as described above, except that the primers used for PCR were oligonucleotides consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 97 and oligonucleotides consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 96. 9) was obtained. Next, the plasmid was introduced into competent cells of Escherichia coli DH5α strain (Takara Shuzo), and ampicillin-resistant strains were selected. Further, the nucleotide sequence of the plasmid contained in the selected ampicillin-resistant strain was determined using BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Ready Kit v2.0 (manufactured by PE Applied Biosystems) and DNA sequencer 3100 (manufactured by PE Applied Biosystems). did. As a result, it was confirmed that plasmids pCR657ET and pCR657Bs had the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6. It was confirmed that the plasmids pCR657FET and pCR657FBs had the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9.
[0119]
(2) Construction of chloroplast expression plasmid for direct introduction having DNA (A1) of the present invention (1) Soybean (cv. Jack) as a plasmid for introducing DNA (A1) of the present invention into plants by a particle gun method The DNA (A1) of the present invention can be obtained without any change in the codon frame immediately below the base sequence encoding the chloroplast transit peptide of the RuBPC small subunit (hereinafter sometimes referred to as the chloroplast transit peptide coding sequence). A plasmid containing the ligated chimeric DNA was constructed.
First, the above-mentioned pCRrSt12 was digested with restriction enzymes HindIII and KpnI, and a DNA containing the present rSt12 DNA was isolated. On the other hand, the vector plasmid pUC19 (manufactured by Takara Shuzo) was digested with the restriction enzymes HindIII and KpnI to remove about 40 bp of DNA to obtain about 2640 bp of DNA. Next, the 5 'end of the DNA was dephosphorylated with Alkaline @ phosphatase (manufactured by Takara Shuzo) derived from calf small intestine, and the above DNA containing the present rSt12 DNA obtained from pCRrSt12 was inserted into this to obtain pUCrSt12 (FIG. 10). Was. Next, the plasmids pCR657ET and pCR657FET were digested with restriction enzymes EcoT22I and SacI, respectively, to isolate DNA containing the DNA (A1) of the present invention. Each of the obtained DNAs was inserted between the EcoT22I and SacI cleavage sites of pUCrSt12 to obtain a codon frame immediately below the chloroplast transit peptide coding sequence of the RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack). The plasmids pUCrSt657 (FIG. 11) and pUCrSt657F (FIG. 12) containing the chimeric DNA to which the DNA (A1) of the present invention was ligated without change were obtained.
pBICR16G6PT (described in JP-A-2000-166577) was digested with a restriction enzyme EcoRI to isolate a DNA of about 3 kb (hereinafter, the promoter contained in the DNA and described in the above-mentioned publication is referred to as CR16G6 promoter. The terminator described in the above publication contained in DNA is referred to as CR16 terminator.) After digesting the vector plasmid pUC19 (Takara Shuzo) with the restriction enzyme EcoRI, the 5 ′ end of the DNA is dephosphorylated with Alkaline @phosphatase (Takara Shuzo) derived from calf small intestine, and about 3 kb derived from pBICR16G6PT described above. Was inserted to obtain a plasmid pUCCR16G6-p / t (FIG. 13). pUCCR16G6-p / t was digested with restriction enzymes HindIII and ScaI, and DNA containing the CR16G6 promoter was isolated. On the other hand, the vector plasmid pUC19 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was digested with the restriction enzymes HindIII and EcoRI to remove the 51 bp DNA to obtain the remaining 2635 bp DNA. Next, the 5 'end of the DNA was dephosphorylated with Alkaline @ phosphatase (manufactured by Takara Shuzo) derived from calf small intestine, and the above DNA containing the CR16G6 promoter obtained from pUCCR16G6-p / t and the above-mentioned DNA were shown by SEQ ID NO: 89. And a linker NotI-EcoRI (FIG. 14) obtained by annealing the oligonucleotide consisting of the base sequence shown in FIG. 14 and the oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 90, to obtain pUCCR16G6-p / tΔ (FIG. 15). Obtained. pUCCR16G6-p / tΔ was digested with restriction enzymes NdeI and EcoRI, and a DNA having a partial nucleotide sequence of CR16t terminator was isolated. On the other hand, vector plasmid pUC19 (Takara Shuzo) was digested with restriction enzymes HindIII and EcoRI to obtain 2635 bp DNA. The 5 ′ end of the DNA is dephosphorylated with calcine small intestine derived Alkaline @ phosphatase (Takara Shuzo), and the above DNA having a partial base sequence of the CR16t terminator obtained from pUCCR16G6-p / tΔ; An oligonucleotide consisting of the base sequence represented by No. 91 and a linker HindIII-NotI obtained by annealing the oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 92 (FIG. 16) were inserted, and pNdG6-ΔT (FIG. 17) Got.
Next, digestion of the plasmids pUCrSt657 and pUCrSt657F with the restriction enzymes BamHI and SacI, respectively, changes the codon frame immediately below the chloroplast transit peptide coding sequence of the RuBPC small subunit of soybean (cv. Jack). DNA containing a chimeric DNA to which the DNA of the present invention (A1) was ligated was isolated. The DNA was inserted between the BglII and SacI restriction sites of the plasmid pNdG6-ΔT to obtain the plasmid pSUM-NdG6-rSt-657 (FIG. 18) and the plasmid pSUM-NdG6-rSt-657F (FIG. 18), respectively. FIG. 19) was obtained.
[0120]
(3) Construction of chloroplast expression plasmid for direct introduction having DNA (A1) of the present invention (2) Soybean (cv. Jack) as a plasmid for introducing DNA (A1) of the present invention into plants by a particle gun method Plasmid containing a chloroplast transit peptide of RuBPC small subunit and a chimeric DNA obtained by linking the DNA (A1) of the present invention without changing the codon frame immediately below a nucleotide sequence encoding 12 amino acids of the mature protein Was built. First, vector plasmid pKF19 (manufactured by Takara Shuzo) is digested with a restriction enzyme BspHI, and nucleotides are added to the gaps of the double-stranded DNA using KOD DNA Polymerase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) to make the DNA ends blunt. The plasmid pKF19ΔBs was obtained by self-cyclization using ligase. PCRrSt12 obtained in Example 1 was digested with restriction enzymes HindIII and KpnI, and DNA containing the present rSt12 DNA was isolated. pKF19ΔBs was digested with restriction enzymes HindIII and KpnI to obtain a DNA of about 2160 bp. The 5 'end of the DNA was dephosphorylated with Alkaline @ phosphatase (manufactured by Takara Shuzo) derived from calf small intestine, and the above DNA containing the present rSt12 DNA obtained from pCRrSt12 was inserted therein to obtain pKFrSt12 (FIG. 20). Next, plasmids pCR657Bs and pCR657FBs obtained in Example 16 (1) were digested with restriction enzymes BspHI and SacI, respectively, and a DNA containing the DNA (A1) of the present invention was isolated from each. Each of these DNAs was inserted between the BspHI and SacI cleavage sites of the plasmid pKFrSt12 to produce a chloroplast transit peptide of the RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack) followed by 12 amino acids of the mature protein. The plasmid pKFrSt12-657 (FIG. 21) and the plasmid pKFrSt12-657F (FIG. 22) containing the chimeric DNA obtained by linking the DNA (A1) of the present invention without changing the codon frame immediately below the base sequence encoding .
Next, the plasmids pKFrSt12-657 and pKFrSt12-657F were digested with restriction enzymes BamHI and SacI, respectively, to obtain a DNA containing the DNA (A1) of the present invention. By inserting these DNAs between the restriction enzyme BglII cleavage site and the SacI cleavage site of the plasmid pNdG6-ΔT obtained in Example 16 (2), the RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack) was inserted. A chimeric DNA comprising the DNA (A1) of the present invention ligated to the chloroplast transit peptide and the base sequence encoding the 12 amino acids of the mature protein immediately following the codon frame without changing the codon frame is bound downstream of the CR16G6 promoter. The resulting plasmids were pSUM-NdG6-rSt12-657 (FIG. 23) and pSUM-NdG6-rSt12-657F (FIG. 24).
[0121]
Example 17 Introduction of DNA (A1) of the Invention into Soybean
(1) Preparation of proliferative somatic embryo
Soybean (variety: Fayette and Jack) pods were soaked in a 1% sodium hypochlorite solution for sterilization treatment, and then immature seeds were taken out. The seed coat of this seed was peeled off, an immature embryo having a long diameter of 2 to 5 mm was taken out, and the hypocotyl of the obtained immature embryo was cut off with a scalpel to prepare immature cotyledons. This immature cotyledon was divided into two cotyledons, and each cotyledon was placed on a somatic embryo induction medium. The somatic embryo induction medium is a Murashige-Skoog medium [Murashige T.K.] adjusted to pH 7.0 by adding 180 μM 2,4-D and 30 g / L sucrose. And Skoog F. , Physiol. {Plant. (1962) 15, p473. Hereinafter, it is referred to as MS medium. ] To which 0.2% (W / V)% gellite was added. About one month after the implantation, the formed spherical embryos were transferred to a somatic embryo growth medium. The adventitious embryo growth medium is an MS medium adjusted to pH 5.8 by adding 90 μM 2,4-D and 30 g / L sucrose, and solidified by adding 0.2 (W / V)% gel light to MS medium. It is. Thereafter, the spherical embryos were transferred to a new somatic embryo growth medium 5 to 8 times at intervals of 2 to 3 weeks. The culture conditions using the above-described somatic embryo induction medium or somatic embryo growth medium were as follows: light 23 hours: dark 1 hour, all day at 23 to 25 ° C.
[0122]
(2) Gene transfer into proliferative somatic embryos
The globular embryo obtained in Example 17 (1) was transferred to a new somatic embryo growth medium, cultured for 2 to 3 days, and used as a material for gene transfer. Plasmids pSUM-NdG6-rSt657, pSUM-NdG6-rSt657F, pSUM-NdG6-rSt12657 and pSUM-NdG6-rSt12657F prepared in Example 16 (2) and (3) were coated on gold particles having a diameter of 1.0 μm. Gene transfer was performed using the particle gun method. The amount of plasmid per 1 mg of gold particles was 1.66 μg. After the gene transfer, the cells were further cultured for 2 to 3 days. The culture conditions described above were all set to 23 hours in the light period: 1 hour in the dark period, and 23 to 25 ° C. all day.
[0123]
(3) Selection of somatic embryos with hygromycin
The globular embryos after gene transfer obtained in Example 17 (2) were transplanted to a somatic embryo selection medium. As an adventitious embryo selection medium, 15 mg / L of hygromycin and 0.2 (W / V)% were added to an MS medium adjusted to pH 5.8 by adding 90 μM of 2,4-D and 30 g / L of sucrose. A medium solidified by adding gellite was used. Thereafter, the surviving globular embryos were transferred to a new somatic embryo selection medium 5 to 8 times at intervals of 2 to 3 weeks. The adventitious embryo selection medium in this case was prepared by adding 30 mg / L of hygromycin and 0.2 (W / V) to an MS medium adjusted to pH 5.8 by adding 90 μM of 2,4-D and 30 g / L of sucrose. % Of the medium. The culture conditions using the above-mentioned somatic embryo selection medium were as follows: light period 23 hours: dark period 1 hour, all day at 23 to 25 ° C.
[0124]
(4) Selection of somatic embryos by compound (II)
The globular embryos after gene transfer obtained in Example 17 (2) were transplanted to a somatic embryo selection medium. As an adventitious embryo selection medium, 0.1 mg / L of compound (II) and 0.2 (W / W) were added to an MS medium adjusted to pH 5.8 by adding 90 μM of 2,4-D and 30 g / L of sucrose. V) A medium solidified by adding% gellite was used. Thereafter, the surviving globular embryos were transferred to a new somatic embryo selection medium 5 to 8 times at intervals of 2 to 3 weeks. In this case, the adventitious embryo selection medium was prepared by adding 0.3 to 1.0 mg / L of the compound (II) to an MS medium adjusted to pH 5.8 by adding 90 μM of 2,4-D and 30 g / L of sucrose. And a 0.2% (W / V)% gel light medium was added to the medium and solidified. The culture conditions using the above-mentioned somatic embryo selection medium were as follows: light period 23 hours: dark period 1 hour, all day at 23 to 25 ° C.
[0125]
(5) Regeneration of individuals from somatic embryos
The globular embryos selected in Example 17 (3) or (4) are transplanted to a development medium, and cultured at 23 hours in the light period: 1 hour in the dark period, and all day at 23 to 25 ° C. for about 4 weeks. As a development medium, a medium solidified by adding 0.8 (W / V)% agar (Wako Pure Chemical Industries, for plant tissue culture) to an MS medium adjusted to pH 5.8 by adding 60 g / L maltose was used. Used. After 6-8 weeks, white-yellow cotyledon-type embryos are obtained. These cotyledon-type embryos are transferred to a germination medium and cultured for 2 weeks. As the germination medium, a medium obtained by adding 30 g / L sucrose and adjusting the pH to 5.8, and adding 0.2 (w / v)% gellite to an MS medium and solidifying it is used. As a result, individuals that have developed and rooted the true leaves are obtained.
[0126]
(6) Acclimation and cultivation of regenerated individuals
The soybean individual obtained in Example 17 (5) is transplanted to horticultural soil, and acclimatized in an artificial weather vessel at 23 to 25 ° C. for 23 hours in the light period: 1 hour in the dark period. Two weeks later, the rooted plants are replanted in 9 cm diameter flower pots and cultivated in a greenhouse. Cultivation conditions in the greenhouse are natural day length, 23 to 25 ° C. all day. After two to four months, the seeds are harvested.
[0127]
(7) Evaluation of resistance to compound (II) having weed control activity
Leaves of the above-mentioned regenerated plant individuals are collected and equally divided into two along the main leaf vein, and the compound (II) is applied to one leaf piece over the entire surface, and the other leaf piece is untreated. These leaf pieces are placed on an MS medium containing 0.8% agar and left in the light at room temperature for 7 days. Then, each leaf piece is ground in a 5 ml 80% acetone aqueous solution with a mortar and pestle, respectively. To extract chlorophyll. After the extract was diluted 10-fold with an 80% acetone aqueous solution, the absorbance at 750 nm, 663 nm, and 645 nm was measured, and Mackney @ G. , @J. {Biol. {Chem. (1941) 140, Calculate the total chlorophyll content by the method described in p315. The degree of resistance to the compound (II) is evaluated by expressing the total chlorophyll content of the treated leaf pieces as a percentage of the total chlorophyll content of the untreated leaf pieces.
Further, soil is packed in a cylindrical plastic pot having a diameter of 10 cm and a depth of 10 cm, seeds of the above-mentioned individual plant are sown, and cultivated in a greenhouse. 5 parts of Compound (II), 6 parts of Solpol 3005X (Toho Kagaku) and 89 parts of xylene are mixed well to form an emulsion, and a predetermined amount thereof is adjusted per hectare containing 0.1% (V / V) of a spreading agent. It is diluted with water equivalent to 1000 liters, and is evenly sprayed over the entire foliage from above the plant grown in the above pot. After cultivating these plants in a greenhouse for 16 days, the phytotoxicity of the plants is investigated and the degree of resistance to compound (II) is evaluated.
[0128]
Example 18 Construction of Agrobacterium-Introducing Chloroplast Expression Plasmid Having DNA (A1) of the Present Invention
A plasmid for introducing the DNA (A1) of the present invention into plants by the Agrobacterium method was constructed. First, after digesting the binary vector plasmid pBI121 (manufactured by CLONTECH) with the restriction enzyme NotI, the DNA ends are blunted by adding nucleotides to the gaps in the double-stranded DNA using DNA Polymerase I (manufactured by Takara Shuzo). Self-cyclization was carried out using T4 DNA ligase. After the obtained plasmid was digested with the restriction enzyme EcoRI, nucleotides were added to the gap between the double-stranded DNAs using DNA Polymerase I (manufactured by Takara Shuzo) to blunt the DNA ends, and self-cyclization was performed using T4 DNA ligase. This gave the plasmid pBI121ΔNotIEcoRI. After digesting the plasmid with the restriction enzyme HindIII, the 5 'end of the obtained DNA is dephosphorylated with Alkaline @ phosphatase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) derived from calf small intestine, and an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 98 is obtained. And a linker HindIII-NotI-EcoRI (FIG. 25) obtained by annealing an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 99, and cyclized to obtain a binary vector plasmid pBI121S (FIG. 26). The plasmid has a structure in which a linker HindIII-NotI-EcoRI is inserted in a direction in which a HindIII cleavage site, a NotI cleavage site, and an EcoRI cleavage site are arranged in order from a position near the β-glucuronidase gene.
Next, the above plasmids pSUM-NdG6-rSt-657 and pSUM-NdG6-rSt-657F were digested with restriction enzymes HindIII and EcoRI, respectively, and the chloroplast transit peptide coding sequence of the RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack) was digested. DNAs containing chimeric DNAs obtained by linking the DNA of the present invention (A1) without changing the codon frame immediately below were obtained from each. These DNAs were inserted between the HindIII cleavage site and the EcoRI cleavage site of the binary vector plasmid pBI121S, and pBI-NdG6-rSt-657 (FIG. 27) and pBI-NdG6-rSt-657F (FIG. 28). Obtained. In addition, the plasmids pSUM-NdG6-rSt12-657 and pSUM-NdG6-rSt12-657F were digested with the restriction enzymes HindIII and EcoRI, respectively, and the chloroplast transit peptide of the RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack) followed by DNAs including chimeric DNAs obtained by linking the DNA of the present invention (A1) without changing the codon frame immediately below the nucleotide sequence encoding 12 amino acids of the mature protein were obtained from each. These DNAs were respectively inserted between the HindIII cleavage site and the EcoRI cleavage site of the binary vector plasmid pBI121S to obtain pBI-NdG6-rSt12-657 (FIG. 29) and pBI-NdG6-rSt12-657F (FIG. 30). Was.
[0129]
Example 19 Introduction of DNA (A1) of the Invention into Tobacco
Using the plasmids {pBI-NdG6-rSt657, pBI-NdG6-rSt657F, pBI-NdG6-rSt12657F, and plasmid pBI-NdG6-rSt12657F} obtained in Example 18, the DNA (A1) of the present invention was tobacco-produced by the Agrobacterium method. Introduced.
First, the plasmids pBI-NdG6-rSt657, pBI-NdG6-rSt12657, pBI-NdG6-rSt657F and pBI-NdG6-rSt12657F were respectively introduced into Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 (Clontech). These were cultured in an LB agar medium (0.5% Yeast extract, 1.0% Bacto tryptone, 0.5% NaCl) containing 300 mg / L streptomycin, 100 mg / L rifampicin, and 25 mg / L kanamycin, and were drug-resistant colonies. Was isolated to isolate recombinant Agrobacterium strains having pBI-NdG6-rSt657, pBI-NdG6-rSt12657, pBI-NdG6-rSt657 or pBI-NdG6-rSt12657F, respectively.
Next, the gene was introduced into tobacco according to the method described in a plant gene manipulation manual (by Hirofumi Uchimiya, Kodansha Scientific, 1992). The recombinant Agrobacterium strain having the above plasmid was cultured overnight at {28 ° C.} in {LB} liquid medium containing 300 mg / L streptomycin, 100 mg / L rifampicin, and 25 mg / L kanamycin, and aseptically cultured tobacco (Nicotiana) tabacum (strain) (SR1) was immersed in the culture solution. The tobacco leaf pieces were prepared by adding 0.1 mg / L naphthaleneacetic acid and 1.0 mg / L benzylaminopurine to a MS agar medium (MS inorganic salts, MS vitamins, 3% sucrose, 0.8% agar; Murashige T. and agar). Skoog F., Physiol. Plant. (1962) 15, p473) and cultured for 2 days at room temperature in the light. Next, the tobacco leaf pieces were washed with sterile water, and then cultured on MS agar medium supplemented with 0.1 mg / L naphthaleneacetic acid, 1.0 mg / L benzylaminopurine, and 500 mg / L cefotaxime for 7 days. Next, the tobacco leaf pieces were transplanted and cultured on a {MS} agar medium supplemented with {0.1 mg / L} naphthaleneacetic acid, 1.0 mg / L • benzylaminopurine, 500 mg / L • cefotaxime, and 100 mg / L • kanamycin. The cultivation was continuously performed for 4 months while transplanting the tobacco leaf pieces into a fresh medium having the same composition every 4 weeks. During this time, the adventitious buds emerging from the tobacco leaf pieces were transplanted to {MS} agar medium supplemented with 300 mg / L cefotaxime and 50 mg / L kanamycin to root and obtain regenerated individuals. The regenerated individuals were transplanted and cultured on {MS} agar medium supplemented with {50 mg / L} kanamycin, and the {T-DNA} region of pBI-NdG6-rSt657, pBI-NdG6-rSt12657, pBI-NdG6-rSt657F or pBI-NdG6-rSt12657F was incorporated. Each of the obtained recombinant tobacco individuals was obtained.
Further, the plasmid pBI121S obtained in Example 18 was introduced into tobacco by the Agrobacterium method. The recombinant Agrobacterium strain having the plasmid pBI121S in the same manner as described above except that the plasmid pBI121S is used instead of the plasmids pBI-NdG6-rSt657, pBI-NdG6-rSt12657, pBI-NdG6-rSt657F and pBI-NdG6-rSt12657F. Was isolated. Next, using the recombinant Agrobacterium strain, a recombinant tobacco individual in which the {T-DNA} region of the plasmid pBI121S was integrated was obtained in the same manner as described above.
Three leaves were excised from the obtained recombinant tobacco plant, and one leaf of {5-7 mm} was collected from each leaf. Each leaf piece was inoculated on {MS} agar medium supplemented with compound (II) {0.1 mg / L}, and cultured in a light place at room temperature. After 7 days of culture, the degree of phytotoxicity of each leaf piece was observed. Leaf pieces derived from tobacco into which the control DNA (T-DNA region of plasmid pBI121S) was introduced were whitened and died, whereas the DNA (A1) of the present invention (plasmid pBI-NdG6-rSt657, pBI-NdG6-rSt12657, pBI- Leaf pieces derived from tobacco into which NdG6-rSt657F or pBI-NdG6-rSt12657F (the T-DNA region) were introduced continued to grow.
[0130]
Example 20 Introduction of DNA (A2) of the Present Invention into Plant
A plasmid for introducing the DNA (A2) of the present invention into plants by a particle gun method and a plasmid for introducing the DNA (A2) to plants by an Agrobacterium method were constructed. First, using the genomic DNA of the actinomycete Saccharopolyspora @ taberi @ JCM9383t obtained in Example 6 (1) as a template, an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 100 and an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 101 Was used as a primer to perform PCR to amplify the DNA of the present invention (A2) having the base sequence of SEQ ID NO: 7. The PCR was carried out once using an Expand High Fidelity PCR System (manufactured by Boehringer) at 97 ° C for 2 minutes, then at 97 ° C for 15 seconds, at 60 ° C for 30 seconds, and then at 72 ° C for 1 second. This was carried out 10 times with 1 minute of heat retention as one cycle, followed by 15 seconds at 97 ° C., then 30 seconds at 60 ° C., then 1 minute at 72 ° C. (The heat retention at 72 ° C. was increased by 20 seconds per cycle. This was carried out 15 times with one cycle of the warming of ()), and finally one warming at 72 ° C. for 7 minutes. Plasmid pCR923Sp (FIG. 31) was obtained by inserting the amplified DNA into the PCR product cloning site of plasmid pCR2.1-TOPO (manufactured by Invitrogen). Next, the plasmid was introduced into competent cells of Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo) to select ampicillin-resistant strains. Furthermore, the nucleotide sequence of the plasmid contained in the selected ampicillin-resistant strain was determined using Dye \ Terminator \ Cycle \ Sequencing \ FS \ Ready \ Reaction \ kit \ (manufactured by PE Applied Biosystems) and DNA sequencer 373S (manufactured by PE Applied Biosystems). As a result, it was confirmed that plasmid pCR923Sp contained the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7.
Plasmid pKFrSt12 prepared in Example 16 (3) was digested with restriction enzymes BamHI and SacI, and a DNA containing the present rSt12 DNA was isolated. The DNA was inserted between the BglII cleavage site and the SacI cleavage site of pNdG6-ΔT obtained in Example 16 (2) to obtain a plasmid pNdG6-rSt12 (FIG. 32). The plasmid pCR923Sp was digested with restriction enzymes SphI and KpnI to obtain a DNA containing the DNA of the present invention (A2). The above plasmid pNdG6-rSt12 was digested with restriction enzymes SphI and KpnI to remove DNA encoding 12 amino acids of the first mature protein of the small RuBPC subunit of soybean (cv. @Jack). The DNA containing the DNA (A2) of the present invention obtained from pCR923Sp was inserted, and the DNA was inserted without altering the codon frame immediately below the chloroplast transit peptide coding sequence of the small RuBPC subunit of soybean (cv. @Jack). A plasmid pSUM-NdG6-rSt-923 (FIG. 33) was obtained in which the ligated chimeric DNA was ligated downstream of the CR16G6 promoter.
Next, the end of the DNA obtained by digesting the plasmid pCR923Sp with the restriction enzyme SphI was blunt-ended using KOD DNA @ polymerase, and further digested with the restriction enzyme KpnI to isolate DNA containing the DNA (A2) of the present invention. . The end of the DNA obtained by digesting the plasmid pKFrSt12 prepared in Example 16 (3) with the restriction enzyme BspHI was blunt-ended using KOD DNA polymerase, and further digested with the restriction enzyme KpnI to obtain about 20 bp of DNA. The chloroplast transit peptide and subsequent maturation of the RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack) were removed and inserted with the DNA containing the DNA of the present invention (A2) obtained from pCR923Sp instead. A plasmid pKFrSt12-923 (FIG. 34) containing a chimeric DNA obtained by linking the DNA of the present invention (A2) without changing the codon frame immediately below the base sequence encoding 12 amino acids of the protein was obtained. By digesting pKFrSt12-923 with the restriction enzymes SphI and KpnI, the DNA encoding the first mature protein of the RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack) for 12 amino acids and the DNA of the present invention (A2) are ligated. Was obtained. The above plasmid pNdG6-rSt12 was digested with restriction enzymes SphI and KpnI to remove DNA encoding 12 amino acids of the first mature protein of the small RuBPC subunit of soybean (cv. @Jack). The chimeric DNA obtained from pKFrSt12-923 was inserted, and a codon frame immediately below the base sequence encoding the chloroplast transit peptide of the RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack) followed by 12 amino acids of the mature protein was inserted. A plasmid pSUM-NdG6-rSt12-923 (FIG. 35) was obtained in which the chimeric DNA to which the DNA (A2) of the present invention was ligated without change was ligated downstream of the CR16G6 promoter.
Using the obtained plasmids pSUM-NdG6-rSt-923 and pSUM-NdG6-rSt12-923, the DNA (A2) of the present invention was introduced into soybean by the particle gun method in the same operation as described in Example 17. .
[0131]
The plasmid pSUM-NdG6-rSt-923 was digested with the restriction enzymes HindIII and EcoRI, and the present invention was carried out without changing the codon frame immediately below the chloroplast transit peptide coding sequence of the small RuBPC subunit of soybean (cv. @Jack). DNA including chimeric DNA to which DNA (A2) was ligated was isolated. Similar to the construction of pBI-NdG6-rSt657 in Example 18, the above DNA containing the chimeric DNA obtained from plasmid pSUM-NdG6-rSt-923 between the HindIII and EcoRI cleavage sites of binary vector pBI121S. Was inserted to obtain pBI-NdG6-rSt-923 (FIG. 36). The plasmid pSUM-NdG6-rSt12-923 was digested with the restriction enzymes HindIII and EcoRI, and the chloroplast transit peptide of the RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack) and the base encoding the subsequent 12 amino acids of the mature protein were used. A DNA containing a chimeric DNA comprising the DNA of the present invention (A2) ligated without altering the codon frame immediately below the sequence was isolated. The DNA containing the chimeric DNA obtained from pSUM-NdG6-rSt12-923 was inserted between the HindIII cleavage site and the EcoRI cleavage site of the binary vector pBI121S, to obtain pBI-NdG6-rSt12-923 (FIG. 37). .
The plasmid pBI-NdG6-rSt-923 and the plasmid pBI-NdG6-rSt12-923 were respectively introduced into Agrobacterium @ tumefaciens @ LBA4404, and this was added to an LB medium containing 300 μg / ml streptomycin, 100 μg / ml rifampicin, and 25 μg / ml kanamycin. An Agrobacterium strain having pBI-NdG6-rSt-923 or an Agrobacterium strain having pBI-NdG6-rSt12-923 was isolated by culturing and selecting transformants. An Agrobacterium strain having pBI-NdG6-rSt-923 or an Agrobacterium strain having pBI-NdG6-rSt12-923 was respectively infected into aseptically cultured tobacco leaf pieces, and the same operation as described in Example 19 was performed. Thus, tobacco into which the DNA (A2) of the present invention was introduced was obtained.
Three leaves were excised from the obtained recombinant tobacco plant, and one leaf of {5-7 mm} was collected from each leaf. Each leaf piece was inoculated on {MS} agar medium supplemented with compound (II) {0.1 mg / L}, and cultured in a light place at room temperature. After 7 days of culture, the degree of phytotoxicity of each leaf piece was observed. Leaf pieces derived from tobacco, into which the control DNA (T-DNA region of plasmid pBI121S) was introduced, whitened and died, whereas the DNA (A2) of the present invention (plasmid pBI-NdG6-rSt923 or pBI-NdG6-rSt12-923). (T-DNA region) into which tobacco-derived leaf pieces were continuously grown.
[0132]
Example 21 Introduction of DNA (A3) of the Present Invention into Plant
A plasmid for introducing the DNA (A3) of the present invention into a plant by the particle gun method and a plasmid for introducing the DNA (A3) to the plant by the Agrobacterium method were constructed.
First, using the genomic DNA of Streptomyces {testaceus} ATCC 21469 strain obtained in Example 11 (1) as a template, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 102 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 103 Was used as a primer to amplify the DNA of the present invention (A3) having the base sequence of SEQ ID NO: 8. The PCR was carried out once using an Expand High Fidelity PCR System (manufactured by Boehringer) at 97 ° C for 2 minutes, then at 97 ° C for 15 seconds, at 60 ° C for 30 seconds, and then at 72 ° C for 1 second. This was carried out 10 times with 1 minute of heat retention as one cycle, followed by 15 seconds at 97 ° C., then 30 seconds at 60 ° C., then 1 minute at 72 ° C. (The heat retention at 72 ° C. was increased by 20 seconds per cycle. This was carried out 15 times with one cycle of the warming of ()), and finally one warming at 72 ° C. for 7 minutes. Plasmid pCR671ET (FIG. 38) was obtained by inserting the amplified DNA into the PCR product cloning site of plasmid pCR2.1 (manufactured by Invitrogen). The plasmid pCR671Bs (see FIG. 4) was prepared in the same manner as described above, except that the primers used for PCR were oligonucleotides consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 104 and oligonucleotides consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 103. 39). Next, the plasmid was introduced into competent cells of Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo) to select ampicillin-resistant strains. Further, the nucleotide sequence of the plasmid contained in the selected ampicillin-resistant strain was determined using BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Ready Kit v2.0 (manufactured by PE Applied Biosystems) and DNA sequencer 3100 (manufactured by PE Applied Biosystems). did. As a result, it was confirmed that plasmids pCR671ET and pCR671Bs contained the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8.
Plasmid pCR671ET was digested with restriction enzymes EcoT22I and KpnI, and a DNA containing the DNA (A3) of the present invention was isolated. By inserting the DNA between the EcoT22I cleavage site and the KpnI cleavage site of pUCrSt12 obtained in Example 3, the soybean (cv. @Jack) RuBPC small subunit immediately below the chloroplast transit peptide coding sequence. A plasmid pUCrSt671 (FIG. 40) containing a chimeric DNA obtained by linking the DNA of the present invention (A3) without changing the codon frame was obtained. The plasmid pUCrSt671 was digested with restriction enzymes NheI and KpnI, and a DNA containing the DNA (A3) of the present invention was isolated. The plasmid pNdG6-rSt12 obtained in Example 16 (2) was digested with restriction enzymes NheI and KpnI to remove about 80 bp of DNA. In place of this, the DNA of the present invention (A3) obtained from plasmid pUCrSt671 was replaced with the present invention. A chimeric DNA comprising the DNA of the present invention (A3) ligated without altering the codon frame immediately under the chloroplast transit peptide coding sequence of the RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack) A plasmid pSUM-NdG6-rSt-671 (FIG. 41) ligated downstream of the CR16G6 promoter was obtained.
Plasmid pCR671Bs was digested with restriction enzymes BspHI and KpnI, and a DNA containing the present DNA (A3) was isolated. By inserting the DNA between the BspHI and KpnI cleavage sites of the plasmid pKFrSt12 obtained in Example 16 (3), the chloroplast transit peptide of the RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack) was obtained. And a plasmid pKFrSt12-671 (FIG. 42) containing a chimeric DNA in which the DNA (A3) of the present invention is linked without altering the codon frame immediately below the base sequence encoding 12 amino acids of the mature protein. The plasmid pKFrSt12-671 was digested with restriction enzymes NheI and KpnI, and a DNA containing the DNA of the present invention (A3) was isolated. The plasmid pNdG6-rSt12 obtained in Example 20 was digested with restriction enzymes NheI and KpnI to remove about 80 bp of DNA. In place of this, the DNA contained the present DNA (A3) obtained from pKFrSt12-671. The above DNA was inserted into the DNA of the present invention without altering the codon frame immediately below the base sequence encoding the chloroplast transit peptide of the RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack) and the subsequent 12 amino acids of the mature protein (cf. A plasmid pSUM-NdG6-rSt12-671 (FIG. 43) was obtained in which the chimeric DNA linked to A3) was linked downstream of the CR16G6 promoter.
Using the obtained plasmids pSUM-NdG6-rSt-671 and pSUM-NdG6-rSt12-671, the DNA (A3) of the present invention was introduced into soybean by the particle gun method in the same manner as described in Example 17. .
[0133]
The plasmid pSUM-NdG6-rSt-671 was digested with the restriction enzymes HindIII and EcoRI, and the present invention was carried out without changing the codon frame immediately below the chloroplast transit peptide coding sequence of the small subunit of RuBPC of soybean (cv. @Jack). DNA including chimeric DNA to which DNA (A3) was ligated was isolated. The above-mentioned DNA containing the chimeric DNA obtained from the plasmid pSUM-NdG6-rSt-671 was inserted between the HindIII cleavage site and the EcoRI cleavage site of the binary vector plasmid pBI121S obtained in Example 18, and pBI-NdG6-rSt was inserted. −671 ° (FIG. 44). The plasmid pSUM-NdG6-rSt12-671 was digested with the restriction enzymes HindIII and EcoRI, and the chloroplast transit peptide of the RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack) and the base encoding the subsequent 12 amino acids of the mature protein were obtained. DNA containing a chimeric DNA comprising the DNA of the present invention (A3) ligated without altering the codon frame immediately below the sequence was isolated. The DNA containing the chimeric DNA obtained from the plasmid pSUM-NdG6-rSt12-671 was inserted between the HindIII cleavage site and the EcoRI cleavage site of the binary vector plasmid pBI121S, and pBI-NdG6-rSt12-671 (FIG. 45) was inserted. Obtained.
The plasmid pBI-NdG6-rSt-671 and the plasmid pBI-NdG6-rSt12-671 were respectively introduced into Agrobacterium tumefaciens LBA4404, and the LB medium containing 300 μg / ml streptomycin, 100 μg / ml rifampicin, 25 μg / ml kanamycin was introduced. Then, an Agrobacterium strain having pBI-NdG6-rSt-671 and an Agrobacterium strain having pBI-NdG6-rSt12-671 were isolated by selecting transformants. An Agrobacterium strain having pBI-NdG6-rSt-671 and an Agrobacterium strain having pBI-NdG6-rSt12-671 were respectively infected into aseptically cultured tobacco leaf pieces, and the same operation as described in Example 19 was performed. Thus, tobacco into which the DNA (A3) of the present invention was introduced was obtained.
Three leaves are cut off from the obtained recombinant tobacco plant, and one leaf of {5-7 mm} is collected from each leaf. Each leaf piece is inoculated on {MS} agar medium supplemented with compound (II) {0.1 mg / L}, and cultured in a light place at room temperature. After 7 days of culture, the degree of phytotoxicity of each leaf piece is observed.
[0134]
Example 22 Expression of the protein (B1) of the present invention in Escherichia coli
(1) Preparation of transformed Escherichia coli having the DNA (B1) of the present invention
PCR was performed using the chromosomal DNA prepared from Streptomyces @ phaeochromogenes @ IFO12898 in Example 3 (1) as a template. To the PCR reaction solution, an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 105 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 53 were each added to 200 nM, and 300 ng of chromosomal DNA was added to the dNTP mix (2. 4 μl of a mixture of 4 mM 5 mM dNTPs), 5 μl of 10 × ExTaq buffer, 0.5 μl of ExTaq polymerase (Takara Shuzo), and distilled water were added to make a total volume of 50 μl. The heat retention was performed at 97 ° C. for 2 minutes, 25 cycles of 97 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 90 seconds as one cycle, and the temperature was kept at 72 ° C. for 4 minutes. The reaction solution after the incubation and the pCR2.1-TOPO vector (manufactured by Invitrogen) were ligated according to the instruction manual attached to the vector, and introduced into Escherichia coli TOP10F '. Plasmid DNA was prepared from the obtained Escherichia coli transformant using QIAprep \ Spin \ MiniprepKit (manufactured by QIAGEN). Dye terminator cycle sequencing FS Ready Reaction Kit (manufactured by Applied Biosystems Japan) using the DNA as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 67 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 68 as primers. ) Was used to perform a sequencing reaction according to the instruction manual attached to the kit. The obtained reaction product was analyzed using a DNA sequencer 373A (manufactured by Applied Biosystems Japan). Based on the results, a plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 was designated as pCR657FD.
Next, pCR657FD was digested with restriction enzymes NdeI and HindIII, and the digest was subjected to agarose gel electrophoresis. A gel containing about 200 bp of DNA was cut out, and the DNA was purified using QIA quick gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN) according to the instruction manual attached to the kit. This DNA and the plasmid pKSN2 digested with NdeI and HindIII were ligated with the ligation kit Ver. 1 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and ligated according to the instruction manual attached to the kit, and introduced into Escherichia coli JM109. Plasmid DNA was prepared from the obtained E. coli transformant, and its structure was analyzed. A plasmid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 and encoding the above-described protein of the present invention (B1) of about 200 bp inserted between the NdeI site and the HindIII site of pKSN2 was designated as pKSN657FD. The plasmid pKSN657FD was introduced into Escherichia coli JM109, and the resulting Escherichia coli transformant was designated as JM109 / pKSN657FD. Further, the plasmid pKSN2 was introduced into Escherichia coli JM109, and the obtained Escherichia coli transformant was designated as JM109 / pKSN2.
[0135]
(2) Expression of the protein (B1) of the present invention in Escherichia coli and recovery of the protein
Escherichia coli JM109 / pKSN657FD and JM109 / pKSN2 were each added to 10 ml of TB medium containing 50 μg / ml of ampicillin (1.2% (w / v) of tryptone, 2.4% (w / v) of yeast extract, 0.4% of glycerol. The cells were cultured overnight at 37 ° C. in 4% (v / v), 17 mM potassium dihydrogen phosphate and 72 mM dipotassium hydrogen phosphate. 1 ml of the obtained culture solution was inoculated into 100 ml of a TB medium containing 50 μg / ml of ampicillin and cultured at 26 ° C., and the final concentration was 1 mM 30 minutes after the OD660 reached about 0.5. Was added and IPTG was further cultured for 20 hours.
The cells were collected from each culture, washed with a 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.5), and suspended in 10 ml of the buffer containing 1 mM PMSF. This cell suspension was ultrasonically treated six times for 3 minutes each with an ultrasonic disrupter (SONIFIER (Branson Sonic Power Company, Inc.)) under conditions of out put 3 and duty cycle 30%, and the cell disrupted liquid was obtained. Got. After the obtained crushed liquid is centrifuged (1,200 × g, 5 minutes), the supernatant is collected and centrifuged (150,000 × g, 70 minutes) to obtain a supernatant fraction (hereinafter, referred to as “supernatant”). The supernatant fraction obtained from Escherichia coli JM109 / pKSN657FD was referred to as an Escherichia coli extract pKSN657FD, and the supernatant fraction obtained from JM109 / pKSN2 was referred to as an Escherichia coli extract pKSN2). 1 μl of the supernatant fraction was analyzed by SDS-15% to 25% PAGE and stained with CBB. As a result, in the E. coli extract pKSN657FD, a band significantly higher than that in the E. coli extract pKSN2 was detected at the migration position corresponding to a molecular weight of about 7 kDa. It was confirmed that the protein (B1) of the present invention was expressed in Escherichia coli.
[0136]
(3) Use of the protein (B1) of the present invention in a reaction system for converting a compound (II) into a compound (III)
¹⁴9 μl of 3 ppm of compound (II) labeled with C, 2 mM β-NADPH (component A, manufactured by Oriental Yeast), and Escherichia coli extract pKSN657FD recovered in Example 22 (2), 0.1 U / ml ferredoxin 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 15 μl (hereinafter referred to as “D component”) of the reductase (C component, manufactured by SIGMA) and the Escherichia coli extract pKSN657F recovered in Example 4 (2). Was prepared and kept at 30 ° C. for 10 minutes. In addition, a reaction solution in which 2 mg / ml spinach-derived ferredoxin (component B, manufactured by SIGMA) is added in place of the E. coli extract pKSN657FD, and a reaction solution in which nothing is added instead of the E. coli extract pKSN657FD, are prepared. It was kept warm in the same way. After the incubation, 3.0 μl of 2N hydrochloric acid and 90 μl of ethyl acetate were added to each reaction solution, stirred, and centrifuged at 8,000 × g to collect 75 μl of an ethyl acetate phase. After the ethyl acetate phase was evaporated to dryness under reduced pressure, the residue was dissolved in 6.0 μl of ethyl acetate, and 5.0 μl of the residue was placed on a silica gel TLC plate (TLC plate silica gel 60F).₂₅₄, 20 cm × 20 cm, 0.25 mm thickness, manufactured by Merck). After developing the TLC plate for about 1 hour using a chloroform-acetic acid-ethyl acetate mixed solution (chloroform: acetic acid: ethyl acetate = 6: 1: 2) as a developing solvent, the solvent is evaporated, and an imaging plate (Fuji Photo Film Co., Ltd.) is developed. Was exposed overnight. Next, the imaging plate was analyzed with an image analyzer BAS2000 (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.),¹⁴The presence or absence of spots (Rf values 0.24 and 0.29) corresponding to compound (III) labeled with C was examined. Table 13 shows the results.
[0137]
[Table 13]

[0138]
Example 23 Expression of the protein (B2) of the present invention in Escherichia coli
(1) Preparation of transformed Escherichia coli having the DNA (B2) of the present invention
PCR is performed using the chromosomal DNA prepared from Saccharopolyspora \ taberi \ JCM \ 9383t in Example 6 (1) as a template. To the PCR reaction solution, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 106 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 63 were added at 200 nM each, and 300 ng of chromosomal DNA was added to dNTP mix (2. 4 μl of a mixture of four kinds of 5 mM dNTPs), 5 μl of 10 × ExTaq buffer, 0.5 μl of ExTaq polymerase (Takara Shuzo), and further distilled water to make a total volume of 50 μl. The heat retention conditions are as follows. After keeping the temperature at 97 ° C. for 2 minutes, the cycle of keeping the temperature at 97 ° C. for 15 seconds, then at 60 ° C. for 30 seconds, and further at 72 ° C. for 90 seconds as one cycle is repeated 25 times, and the temperature is kept at 72 ° C. for 4 minutes. The reaction solution after the incubation and the pCR2.1-TOPO vector (manufactured by Invitrogen) are ligated according to the instruction manual attached to the vector, and introduced into Escherichia coli TOP10F '. Plasmid DNA is prepared from the obtained E. coli transformant using QIAprep @ Spin \ Miniprep @ Kit (manufactured by QIAGEN). Dye terminator cycle sequencing FS Ready Reaction Kit (Applied Biosystems Japan) using the DNA as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 67 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 68 as primers ) According to the instruction manual attached to the kit. The obtained reaction product is analyzed using a DNA sequencer 373A (manufactured by Applied Biosystems Japan). Based on the result, a plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 is designated as pCR923FD.
Next, pCR923FD is digested with restriction enzymes NdeI and HindIII, and the digest is subjected to agarose gel electrophoresis. A gel containing about 200 bp of DNA is cut out, and the DNA is purified using QIA quick gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN) according to the instruction manual attached to the kit. This DNA and the plasmid pKSN2 digested with NdeI and HindIII were ligated with the ligation kit Ver. 1 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and ligated according to the instruction manual attached to the kit, and introduced into E. coli JM109. A plasmid DNA is prepared from the obtained E. coli transformant, and its structure is analyzed. The plasmid obtained by inserting the above-described DNA of about 200 bp containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 and encoding the protein of the present invention (B2) between the NdeI site and the HindIII site of pKSN2 is designated as pKSN923FD. The plasmid pKSN923FD is introduced into E. coli JM109, and the obtained E. coli transformant is designated as JM109 / pKSN923FD. Further, the plasmid pKSN2 is introduced into E. coli JM109, and the obtained E. coli transformant is designated as JM109 / pKSN2.
[0139]
(2) Expression of the protein (B2) of the present invention in Escherichia coli and recovery of the protein
Escherichia coli JM109 / pKSN923FD and JM109 / pKSN2 were respectively added to 10 ml of a TB medium (tryptone 1.2% (w / v), yeast extract 2.4% (w / v), glycerol 0.4) containing 50 μg / ml ampicillin. % (V / v), 17 mM potassium dihydrogen phosphate, 72 mM dipotassium hydrogen phosphate) at 37 ° C. overnight. 1 ml of the obtained culture solution was inoculated into 100 ml of a TB medium containing 50 μg / ml of ampicillin, and cultured at 26 ° C. so that the final concentration was 1 mM 30 minutes after the OD660 reached about 0.5. IPTG is added and cultivation is further performed for 20 hours.
The cells are collected from each culture, washed with a 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.5), and suspended in 10 ml of the buffer containing 1 mM PMSF. This cell suspension was ultrasonically treated six times for 3 minutes each with an ultrasonic disrupter (SONIFIER (Branson Sonic Power Company, Inc.)) under conditions of out put 3 and duty cycle 30%, and the cell disrupted liquid was obtained. Get. After the obtained crushed liquid is centrifuged (1,200 × g, 5 minutes), the supernatant is collected and centrifuged (150,000 × g, 70 minutes) to obtain a supernatant fraction (hereinafter, referred to as “supernatant”). The supernatant fraction obtained from E. coli JM109 / pKSN657FD is referred to as pKSN923FD of E. coli extract, and the supernatant fraction obtained from JM109 / pKSN2 is referred to as pKSN2 of E. coli extract.). 1 μl of the supernatant fraction is analyzed by SDS-15% to 25% PAGE, and CBB staining is performed. In the Escherichia coli extract pKSN923FD, by detecting a band that is significantly darker than the Escherichia coli extract pKSN2 at an electrophoresis position corresponding to a molecular weight of about 7 kDa, expression of the protein of the present invention (B2) in Escherichia coli can be confirmed.
[0140]
(3) Use of the protein (B2) of the present invention in a reaction system for converting a compound (II) into a compound (III)
¹⁴9 μl of 3 ppm of compound (II) labeled with C, 2 mM β-NADPH (A component, manufactured by Oriental Yeast), and Escherichia coli extract pKSN923FD recovered in Example 23 (2), final concentration 0.1 U / ml 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing ferredoxin reductase (C component, manufactured by SIGMA) and 15 μl of E. coli extract pKSN657F recovered in Example 4 (2) (hereinafter referred to as D component). ) Is prepared and kept at 30 ° C for 10 minutes. In addition, a reaction solution in which spinach-derived ferredoxin (B component, manufactured by SIGMA) having a final concentration of 2 mg / ml is added in place of the E. coli extract pKSN923FD, and a reaction solution in which nothing is added instead of the E. coli extract pKSN923FD are prepared. And keep it warm as well. To each reaction solution after the incubation, 3.0 μl of 2N hydrochloric acid and 90 μl of ethyl acetate are added, stirred, and centrifuged at 8,000 × g to collect 75 μl of an ethyl acetate phase. After the ethyl acetate phase was evaporated to dryness under reduced pressure, the residue was dissolved in 6.0 μl of ethyl acetate, and 5.0 μl of the residue was placed on a silica gel TLC plate (TLC plate silica gel 60F).₂₅₄, 20 cm × 20 cm, 0.25 mm thickness, manufactured by Merck). After developing the TLC plate for about 1 hour using a chloroform-acetic acid-ethyl acetate mixed solution (chloroform: acetic acid: ethyl acetate = 6: 1: 2) as a developing solvent, the solvent is evaporated and an imaging plate (Fuji Photo Film Co., Ltd.) ) Overnight. Next, the imaging plate was analyzed with an image analyzer BAS2000 (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.),¹⁴Confirm spots (Rf values 0.24 and 0.29) corresponding to compound (III) labeled with C. The protein (B2) of the present invention converts the compound (II) to the compound (III) by confirming the production of the compound (III) in the reaction solution containing the component A, the E. coli extract pKSN923FD, the component C and the component D. In this reaction system, it can be confirmed that it can be used in place of spinach-derived ferredoxin.
[0141]
Example 24 Expression of the protein (B3) of the present invention in Escherichia coli
(1) Preparation of transformed E. coli having the DNA (B3) of the present invention
Using the chromosomal DNA prepared from Streptomyces @ testaceus @ ATCC21469 in Example 11 (1) as a template, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 107 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 72 as primers PCR is performed in the same manner as in Example 23 (1) except that the PCR is performed. Using the resulting reaction solution, a plasmid pCR671FD having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 is obtained in the same manner as in the method described in Example 23 (1).
Next, a plasmid pKSN671FD in which the DNA (B3) of the present invention is inserted between the NdeI site and the HindIII site of pKSN2 is obtained in the same manner as in Example 23 (1) using the plasmid. . By introducing the plasmid into Escherichia coli JM109, Escherichia coli JM109 / pKSN671FD having the DNA (B3) of the present invention can be obtained.
[0142]
(2) Expression of the protein (B3) of the present invention in Escherichia coli and recovery of the protein
Using Escherichia coli JM109 / pKSN671FD, a supernatant fraction (hereinafter, referred to as an Escherichia coli extract pKSN671FD) is recovered in the same manner as in Example 23 (2). 1 μl of the supernatant fraction is analyzed by SDS-15% to 25% PAGE, and CBB staining is performed. As a result, in the E. coli extract pKSN671FD, a band remarkably darker than the E. coli extract pKSN2 was detected at the migration position corresponding to a molecular weight of about 7 kDa, thereby confirming that the protein of the present invention (B3) was expressed in E. coli. Is possible.
[0143]
(3) Use of the protein (B3) of the present invention in a reaction system for converting a compound (II) into a compound (III)
Except for using the Escherichia coli extract pKSN671FD recovered in Example 24 (2), in the same manner as described in Example 23 (3),¹⁴Confirm spots (Rf values 0.24 and 0.29) corresponding to compound (III) labeled with C. The protein (B3) of the present invention converts the compound (II) to the compound (III) by confirming the formation of the compound (III) in the reaction solution containing the component A, the E. coli extract pKSN671FD, the component C and the component D. In this reaction system, it can be confirmed that it can be used in place of spinach-derived ferredoxin. .
[0144]
Example 25 Preparation of the protein (A4) of the present invention
(1) Preparation of crude cell extract
Glycerol stock of Streptomyces achromogenes IFO12735 strain was added to 10 ml of A medium (glucose 0.1% (w / v), tryptone 0.5% (w / v), yeast extract 0.5% (w / v), phosphoric acid The solution was added to a large test tube containing 0.1% (w / v) of dipotassium hydrogen (pH 7.0), and the mixture was rotated at 30 ° C. overnight to obtain a preculture solution. 8 ml of this preculture solution was inoculated into 200 ml of the A medium, and cultivated by swirling in a 500 ml winged flask at 30 ° C. for 2 days. Wet cells were recovered from the thus obtained culture by centrifugation (3,000 × g, 10 minutes). The wet cells were suspended in 100 ml of a B medium (glucose 1% (w / v), beef extract 0.1%, tryptose 0.2% (w / v)) containing 100 ppm of the compound (II). Reciprocal shaking culture was performed at 30 ° C. for 20 hours in a 500 ml Sakaguchi flask. Wet cells were collected from 2 L of the culture solution thus obtained by centrifugation (3,000 × g, 10 minutes). The obtained wet cells were washed twice with 1 L of 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) to obtain 136 g of wet cells.
The wet cells were suspended in 2 to 3 ml of 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) per 1 g of wet cell weight, and 1 mM @ PMSF, 5 mM @ benzamidine hydrochloride, 1 mM @ EDTA, 3 µg / g ml leupeptin, 3 μg / ml, pepstatin A, and 1 mM dithiothreitol were added. This is repeated twice with a French press (manufactured by Otake Seisakusho) (1000 kg / cm²) To obtain a cell lysate. After centrifugation (40,000 × g, 30 minutes) of the cell lysate, the supernatant was collected and centrifuged at 150,000 × g for 1 hour. This was described as a liquid).
[0145]
(2) Assay for ability to convert compound (II) to compound (III)
¹⁴3 ppm of compound (II) labeled with C, 2.4 mM β-NADPH (A component, manufactured by Oriental Yeast), 0.5 mg / ml @ spinach ferredoxin (B component, manufactured by SIGMA), 1 U / ml A reaction solution (30 μl) containing 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing ferredoxin reductase (C component, manufactured by SIGMA) and 15 μl of the crude cell extract recovered in Example 25 (1) was prepared. At 30 ° C. for 1 hour. In addition, a reaction solution to which one or more fractions of the component A, component B, and component C in the reaction solution composition were not added was prepared and kept warm in the same manner. After the incubation, 3.0 μl of 2N hydrochloric acid and 90 μl of ethyl acetate were added to each reaction solution, stirred, and centrifuged at 8,000 × g to collect 75 μl of an ethyl acetate phase. After the ethyl acetate phase was evaporated to dryness under reduced pressure, the residue was dissolved in 6.0 μl of ethyl acetate, and 5.0 μl of the residue was placed on a silica gel TLC plate (TLC plate silica gel 60F).₂₅₄, 20 cm × 20 cm, 0.25 mm thickness, manufactured by Merck). After developing the TLC plate for about 1 hour using a chloroform-acetic acid-ethyl acetate mixed solution (chloroform: acetic acid: ethyl acetate = 6: 1: 2) as a developing solvent, the solvent is evaporated, and an imaging plate (Fuji Photo Film Co., Ltd.) is developed. Was exposed overnight. Next, the imaging plate was analyzed with an image analyzer BAS2000 (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.),¹⁴The presence or absence of spots (Rf values 0.24 and 0.29) corresponding to compound (III) labeled with C was examined. Table 14 shows the results.
[0146]
[Table 14]

[0147]
(3) Fractionation of crude cell extract
Ammonium sulfate was added to the crude extract of the cells obtained in Example 25 (1) to a 45% saturation, and the mixture was stirred on ice, and then centrifuged at 12,000 × g for 30 minutes to collect the supernatant. did. Ammonium sulfate was added to the obtained supernatant to 55% saturation, and the mixture was stirred on ice, centrifuged at 12,000 × g for 10 minutes, and the precipitate was collected to obtain 12.5 ml of 20 mM bistrispropane buffer. (PH 7.0). This solution is applied to a PD10 column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), eluted with 20 mM bistrispropane buffer (pH 7.0), and a protein-containing fraction (hereinafter referred to as ammonium sulfate precipitation 45-55% fraction). 17.5 ml was collected.
[0148]
(4) Isolation of the protein (A4) of the present invention
The 45-55% fraction of ammonium sulfate precipitate prepared in Example 25 (3) was injected into a HiLoad 26/10 Q Sepharose HP column (Amersham Pharmacia Biotech). Next, 100 ml of 20 mM bistrispropane buffer (pH 7.0) was flowed through the column, and then a 20 mM bistrispropane buffer (pH 7.0) was flowed by applying a linear concentration gradient of sodium chloride. 30 ml of the fraction eluted at 004 M / min, sodium chloride concentration range of 0 M to 1 M, flow rate of 4 ml / min) and sodium chloride concentration of 0.12 M to 0.165 M were collected. Further, the fraction thus collected was applied to a PD10 column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) and eluted with a 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) to collect a protein-containing fraction.
The collected fraction was applied to a PD10 column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) and eluted with an A buffer (2 mM potassium phosphate buffer containing 1.5 mM calcium chloride, pH 7.0) to collect a protein-containing fraction. Then, the fraction was injected into Bio-Scale Ceramic Ceramic Hydroxyapatite, Type Icolum CHT10-I (manufactured by Bio-Rad), and 20 ml of A buffer was passed through the column. Then, the column was subjected to a linear concentration gradient of B buffer (100 mM potassium phosphate buffer containing 0.03 mM calcium chloride, pH 7.0), and A buffer was applied (starting from A buffer 100% and taking 100 minutes). 20 ml of the fraction eluted at a B buffer concentration of 4% to 6% was collected by a linear gradient in which the B buffer concentration was increased to 50% at a flow rate of 2 ml / min. The fraction thus collected was applied to a PD10 column (Amersham Pharmacia Biotech) and eluted with a 0.05M potassium phosphate buffer (pH 7.0) to collect a protein-containing fraction.
An equal volume of 0.05 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 2.0 M ammonium sulfate was added to the collected fractions, mixed, and then injected into a RESOURCE®PHE 1 ml column (Amersham Pharmacia Biotech). After flowing 5 ml of a 0.05 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 1 M ammonium sulfate through the column, a 0.05 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) was applied with a linear ammonium sulfate concentration gradient (ammonium sulfate concentration). Fractions eluted at a gradient of 0.1 M / min, a sodium chloride concentration range of about 1 M to 0 M, and a flow rate of 2 ml / min) and an ammonium sulfate concentration of about 0.4 to 0.5 M were separately collected. The protein contained in each fraction was analyzed by SDS-10% -20% PAGE.
The fractions collected were added in place of the crude extract of the cells in the reaction solution described in Example 25 (2), and the A component, B component, C component and¹⁴In the presence of the compound (II) labeled with C, the temperature was maintained in the same manner as in Example 25 (2). TLC analysis of the reaction solution after the incubation was performed,¹⁴A spot corresponding to compound (III) labeled with C was confirmed. The protein migrated at a position of about 45 kDa in the SDS-PAGE was recovered from the SDS-PAGE gel, and subjected to analysis of the N-terminal amino acid sequence by a protein sequencer (Procedure 494HT, manufactured by Applied Biosystems, analyzed by Pulsed liquid method). did. As a result, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 113 was read.
[0149]
Example 26: Acquisition of DNA (A4) of the present invention
(1) Preparation of chromosomal DNA of Streptomyces Achromogenes IFO 12735
Streptomyces achromogenes IFO 12735 was added to 50 ml of YEME medium (yeast extract 0.3% (w / v), bactopeptone 0.5% (w / v), malt extract 0.3% (w / v), glucose 1.0. % (W / v), sucrose 34% (w / v), 2.5M MgCl₂・ 6H₂(O 0.2% (v / v)) for 1 to 3 days with shaking culture at 30 ° C., followed by cell collection. The obtained cells were suspended in the above YEME medium containing 1.4% (w / v) glycine and 60 mM @EDTA, and cultured with shaking for one day. The cells were collected from the obtained culture solution, washed once with distilled water, and then resuspended in 1 ml of a buffer (100 mM @ Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM EDTA, 10 mM NaCl) per 200 mg of cells. 200 μg / ml egg white lysozyme was added and shaken at 30 ° C. for 1 hour. Further, 0.5% SDS, 1 mg / ml {Proteinase} K was added, and the mixture was incubated at 55 ° C. for 3 hours. The cell suspension was extracted twice with phenol / chloroform / isoamyl alcohol to collect an aqueous layer, and then extracted once with chloroform / isoamyl alcohol to recover the aqueous layer and ethanol precipitated from the aqueous layer. As a result, chromosomal DNA was obtained.
[0150]
(2) Preparation of a chromosomal DNA library of Streptomyces Achromogenes IFO 12735
38 μg of the chromosomal DNA prepared in Example 26 (1) was digested with 3.2 U of the restriction enzyme Sau3AI at 37 ° C. for 60 minutes. The obtained digested solution was fractionated by 1% agarose gel electrophoresis, and a DNA of about 2.0 kbp was recovered from the gel. The DNA was purified using QIAquick Gel Extraction Kit (manufactured by Qiagen) according to the instruction manual attached to the kit, and concentrated by ethanol precipitation to obtain 20 µl of a solution containing the target DNA. 8 μl of the obtained DNA solution, 100 ng of plasmid vector pUC118 @ 100 ng digested with the restriction enzyme BamHI and dephosphorylated, and the ligation kit Ver. 2 (manufactured by Takara Shuzo) was mixed with 16 µl of solution I, and the mixture was kept at 16 ° C for 4 hours. Escherichia coli DH5α was transformed using this ligation solution, applied to an LB agar medium containing 50 mg / L ampicillin, and cultured at 37 ° C. overnight. The obtained colony was recovered from the agar medium, and the plasmid was extracted to obtain a chromosomal DNA library.
[0151]
(3) Isolation of the DNA (A4) of the present invention
PCR was performed using the chromosomal DNA library prepared in Example 26 (2) as a template (FIG. 3). As the primer, a combination of an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 114 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 57 was used. Here, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 114 was designed based on the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 113. The reaction solution was prepared using an Expand Hi-Fi PCR system (Boehringer Mannheim). The PCR reaction solution was 2.5 μl of the above chromosomal DNA library, 7.5 pmol of each of the above two kinds of primers, 0.2 μl of dNTP mix (mixture of four kinds of dNTPs of 2 mM each), and 10 × buffer (MgCl2).₂2.5 μl) and 0.38 μl of Expand @ HiFi enzyme mix, and further distilled water was added to make a total volume of 25 μl. The heat retention conditions were as follows: heat retention at 97 ° C. for 2 minutes, and then repeat this for 10 cycles with heat retention at 97 ° C. for 15 seconds, then at 65 ° C. for 30 seconds, and further at 72 ° C. for 1 minute, followed by 15 cycles at 97 ° C. Next, this was repeated 15 times at 65 ° C. for 30 seconds and further at 72 ° C. for 1 minute (the temperature at 72 ° C. was increased by 20 seconds for each cycle), and the heat was kept at 72 ° C. for 7 minutes. . PCR was performed again using 2.5 μl of the reaction solution after the incubation as a template solution. As the primer, a combination of an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 115 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 57 was used. Here, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 115 was designed based on the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 113. Then, PCR was performed using an Expand Hi-Fi PCR system (Boehringer Mannheim) in the same manner as described above. The reaction solution after the reaction was subjected to 2% agarose gel electrophoresis, and a gel portion containing about 800 bp DNA was recovered. DNA was purified from the gel using QIAquickquickGelExtraction Kit (manufactured by Qiagen) according to the attached instruction manual. The obtained DNA was ligated to pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by INVITROGEN) according to the instruction manual attached to the vector, and introduced into Escherichia coli TOP10F '. Plasmid DNA was prepared from the obtained Escherichia coli transformant using QIAGEN @ Tip20 (manufactured by QIAGEN). Using the obtained plasmid DNA as a template and a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 67 or a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 68, a big dye terminator cycle sequencing FS Ready Reaction Kit (Applied Biosystems Japan) Was performed according to the instruction manual attached to the kit. The reaction product was analyzed using a DNA sequencer 3100 (manufactured by Applied Biosystems Japan). As a result, the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 57 to 832 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 110 was read. In the read base sequence, the base number 58 to 60 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 110 encoded the amino acid represented by amino acid number 20 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 113.
[0152]
Next, using the chromosomal DNA library prepared in Example 26 (2) as a template, PCR was performed using an Expand Hi-Fi PCR system (Boehringer Mannheim) under the above conditions. As the primer, a combination of an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 116 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 59 was used. The amplified DNA of about 1.4 kbp was cloned into the pCRII-TOPO cloning vector by the above method. Plasmid DNA was prepared from the obtained Escherichia coli transformant using QIAGEN @ Tip20 (manufactured by QIAGEN). Using the obtained plasmid DNA as a template, a primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 67 and a primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 68, a Big Dye Terminator cycle sequencing FS Ready Reaction Kit (manufactured by Applied Biosystems Japan) ) Was used to perform a sequencing reaction according to the instruction manual attached to the kit. The reaction product was analyzed using a DNA sequencer 3100 (manufactured by Applied Biosystems Japan). As a result, the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 58 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 110 was read.
In addition, using a universal genome walker kit (manufactured by Clontech), according to the attached instruction manual, a DNA having a base sequence extending 3 ′ downstream from the base represented by base number 832 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 110 Cloning was performed. Specifically, 13 μg of the chromosomal DNA of Streptomyces achromogenes IFO 12735 prepared in Example 26 (1) was digested with 200 U of restriction enzyme HincII at 37 ° C. overnight, extracted with phenol, and purified by ethanol precipitation. The obtained DNA was made into 20 μl of an aqueous solution, 4 μl of which was mixed with 1.9 μl of 15 μM Genome Walker Adapter, 1.6 μl of 10 × ligation buffer, and 0.5 μl of 6 U / μl T4 ligase. Incubated overnight at ° C. Thereafter, the mixture was kept at 70 ° C. for 5 minutes, and 72 μl of distilled water was added thereto to prepare a Genome @ Walker library. Using this library as a template, PCR was performed using Advantage GC GC Genomic PCR kit (manufactured by Clontech). PCR was performed by adding 1 μl of Genome @ Walker library, primer AP1 (supplied with the universal genome walker kit) and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 117 to 200 nM, respectively, and adding dNTP mix (4 kinds of 10 mM each). dNTP) (1 μl), 5 × GC genomic PCR reaction buffer (10 μl), 25 mM @Mg (OAc)₂Was added to 10 μl of 5M GC-Melt and 1 μl of Advantage-GC Genomic Polymerase Mix, and further distilled water was added to make a total volume of 50 μl. The heat retention conditions were 95 ° C. for 1 minute, 7 cycles of 94 ° C. for 10 seconds, followed by 72 ° C. for 3 minutes, 36 cycles of 94 ° C. for 10 seconds, then 68 ° C. for 3 minutes, and 68 ° C. It was kept warm for 7 minutes. The solution after the incubation was diluted 50-fold with distilled water to obtain a primary PCR product, which was further used as a template for PCR. For the PCR, 1 μl of the primary PCR product, primer AP2 (supplied with the Universal Genome Walker Kit) and the oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 118 were added at 200 nM each, and a dNTP mix (a mixture of four kinds of 10 mM dNTPs) was added. 1 μl, 10 μl of 5 × GC genomic PCR reaction buffer, 25 mM @Mg (OAc)₂Was added to 10 μl of 5M GC-Melt and 1 μl of Advantage-GC Genomic Polymerase Mix, and further distilled water was added to make a total volume of 50 μl. The heat retention conditions were 95 ° C. for 1 minute, 5 cycles of 94 ° C. for 10 seconds followed by 72 ° C. for 3 minutes, 20 cycles of 94 ° C. for 10 seconds and 68 ° C. for 3 minutes, and further 68 ° C. It was kept warm for 7 minutes. The reaction solution after the incubation was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and a gel portion containing about 1300 bp DNA was recovered. DNA was purified from the collected gel using QIA quick gel Gel Extraction Kit (manufactured by Qiagen) according to the attached instruction manual. The obtained DNA was ligated to pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by INVITROGEN) according to the instruction manual attached to the vector, and introduced into Escherichia coli TOP10F '. Plasmid DNA was prepared from the obtained Escherichia coli transformant using QIAGEN @ Tip20 (manufactured by QIAGEN). Using the obtained plasmid DNA as a template and the oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 67 and the oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 68 as primers, using a Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Applied Biosystems Japan) The sequencing reaction was performed according to the instruction manual attached to the kit. The reaction product was analyzed using a DNA sequencer 3100 (manufactured by Applied Biosystems Japan). As a result, the base sequence represented by base numbers 644 to 1454 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 110 was read. As a result of linking all the analyzed base sequences, the base sequence represented by SEQ ID NO: 110 was obtained. There were two open reading frames (ORFs) in the nucleotide sequence. That is, a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 109) consisting of 1236 bases (including a stop codon) and encoding 411 amino acid residues (SEQ ID NO: 108), and 63 amino acid residues (SEQ ID NO :) comprising 192 bases (including a stop codon) 111) (SEQ ID NO: 112). The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 108) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 109 was calculated to be 45465 Da. The amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence contained the amino acid sequence (SEQ ID NO: 113) determined from the N-terminal amino acid sequence analysis of the protein (A4) of the present invention. The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 111) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 112 was calculated to be 6871 Da.
[0153]
Example 27 Expression of the protein (A4) of the present invention in Escherichia coli
(1) Preparation of transformed Escherichia coli having the DNA (A4) of the present invention
Using the chromosomal DNA of Streptomyces achromogenes IFO 12735 prepared in Example 26 (1) as a template, PCR was performed using an Expand HiFi PCR system (Boehringer Mannheim). As the primer, a combination of the oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 119 and the oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 120 (hereinafter, referred to as primer pair 25), or the primer of SEQ ID NO: 119 A combination of an oligonucleotide having the base sequence shown and a oligonucleotide having the base sequence shown by SEQ ID NO: 121 (hereinafter, referred to as primer pair 26) was used. To the PCR reaction solution, two types of primers were added so that each had a concentration of 300 nM, 50 ng of chromosomal DNA, 5.0 μl of dNTP mix (a mixture of four types of dNTPs of 2.0 mM each), and 10 × Expand @ HF buffer ( MgCl₂5.0 μl) and 0.75 μl of Expand @ HiFi enzyme mix, and further distilled water was added to make a total volume of 50 μl. The heat retention conditions were as follows: heat retention at 97 ° C. for 2 minutes, 10 cycles of heat retention at 97 ° C. for 15 seconds, then 60 ° C. for 30 seconds, and further 72 ° C. for 1 minute, followed by 15 cycles at 97 ° C. Next, this was repeated for 15 cycles at a temperature of 60 ° C. for 30 seconds and a further temperature of 72 ° C. for 1 minute (the temperature at 72 ° C. was increased by 20 seconds for each cycle), and the cycle was repeated 15 times. . The reaction solution after the incubation was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, a gel containing about 1.3 kbp of DNA was cut out from the gel provided with the reaction solution using the primer pair 25, and the reaction solution using the primer pair 26 was separated. A gel containing about 1.6 kbp DNA was cut out from the provided gel. From each of the collected gels, DNA was purified using QIA quick gel Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN) according to the instruction manual attached to the kit. The obtained DNA and the pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by Invitrogen) were ligated according to the instruction manual attached to the vector, and introduced into Escherichia coli TOP10F '. Plasmid DNA was prepared from the obtained Escherichia coli transformant using QIAGEN {Tip20} (manufactured by QIAGEN). Using the obtained plasmid DNA as a template and the oligonucleotides shown in SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 122, and SEQ ID NO: 123 as primers, Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (manufactured by Applied Biosystems Japan) ) Was used to perform a sequencing reaction according to the instruction manual attached to the kit. The reaction product was analyzed using a DNA sequencer 3100 (manufactured by Applied Biosystems Japan). Based on the obtained results, the plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 109 was designated as pCR646, and the plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 110 was designated as pCR646F.
Next, pCR646 and pCR646F were digested with restriction enzymes NdeI and HindIII, respectively, and the digests were subjected to agarose gel electrophoresis. A gel containing about 1.3 kbp DNA was cut out from the gel provided with the digest of pCR646, and a gel containing about 1.6 kbp DNA was cut out from the gel provided with the digest of pCR646F. DNA was purified from each of the obtained gels using QIA quick gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN) according to the instruction manual attached to the kit. This DNA and the plasmid pKSN2 digested with NdeI and HindIII were ligated with the ligation kit Ver. 1 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and ligated according to the instruction manual attached to the kit, and introduced into Escherichia coli JM109. Plasmid DNA was prepared from the obtained E. coli transformant, and its structure was analyzed. The plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 109 and encoding the protein of the present invention (A4) of about 1.3 kbp inserted between the NdeI site and the HindIII site of pKSN2 was designated as pKSN646. . Further, a plasmid comprising the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 110 and encoding the protein of the present invention (A4) of about 1.6 kbp and being inserted between the NdeI site and the HindIII site of pKSN2 was replaced with pKSN646F. And These plasmids pKSN646 or pKSN646F were introduced into Escherichia coli JM109, and the resulting Escherichia coli transformant was designated as JM109 / pKSN646 or JM109 / pKSN646F. Further, the plasmid pKSN2 was introduced into Escherichia coli JM109, and the obtained Escherichia coli transformant was designated as JM109 / pKSN2.
[0154]
(2) Expression of the protein (A4) of the present invention in E. coli and recovery of the protein
Escherichia coli JM109 / pKSN646, JM109 / pKSN646F, and JM109 / pKSN2 were each added to 10 ml of a TB medium (tryptone 1.2% (w / v), yeast extract 2.4% (w / v) containing 50 μg / ml ampicillin. , Glycerol 0.4% (v / v), potassium dihydrogen phosphate 17 mM, dipotassium hydrogen phosphate 72 mM) at 37 ° C. overnight, and 1 ml of the obtained culture solution was treated with 50 μg / ml ampicillin. Is inoculated into a 100 ml TB medium containing, and cultured at 26 ° C. When the OD660 reaches about 0.5, 5-aminolevulinic acid is added to a final concentration of 500 µM, and the culture is continued. Thirty minutes later, IPTG was added to a final concentration of 1 mM, and the cells were further cultured for 17 hours.
The cells are collected from each culture, washed with a 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.5), and suspended in 10 ml of the buffer containing 1 mM PMSF. This cell suspension was ultrasonically treated six times for 3 minutes each with an ultrasonic disrupter (SONIFIER (Branson Sonic Power Company, Inc.)) under conditions of out put 3 and duty cycle 30%, and the cell disrupted liquid was obtained. Get. After the obtained crushed liquid was centrifuged (1,200 × g, 5 minutes), the supernatant was recovered and centrifuged (150,000 × g, 70 minutes), and then the supernatant fraction ( Hereinafter, the supernatant fraction obtained from Escherichia coli JM109 / pKSN646 was used as the supernatant fraction obtained from Escherichia coli extract pKSN646, and the supernatant fraction obtained from JM109 / pKSN646F was used as the supernatant fraction obtained from Escherichia coli extract pKSN646F and JM109 / pKSN2. Of the E. coli extract pKSN2). One microliter of the supernatant fraction is analyzed by SDS-15% to 25% PAGE and stained with CBB. As a result, in the E. coli extract pKSN646 and the E. coli extract pKSN646F, a band significantly higher than that of the E. coli extract pKSN2 was detected at an electrophoresis position corresponding to a molecular weight of about 45 kDa, whereby the protein of the present invention (A4) was detected in E. coli. Can be confirmed.
[0155]
(3) Assay for ability to convert compound (II) to compound (III)
¹⁴3 ppm of compound (II) labeled with C, 2 mM β-NADPH (A component, manufactured by Oriental Yeast), 2 mg / ml spinach-derived ferredoxin (B component, SIGMA), 0.1 U / ml ferredoxin 30 μl of a reaction solution comprising 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing reductase (C component, manufactured by SIGMA) and 18 μl of the supernatant fraction collected in Example 27 (2) was prepared, and 30 Incubate at 10 ° C for 10 minutes. Further, a reaction solution to which one or more fractions of the component A, component B and component C in the composition of the reaction solution are not added is prepared and kept warm in the same manner. To each reaction solution after the incubation, 3.0 μl of 2N hydrochloric acid and 90 μl of ethyl acetate are added, stirred, and centrifuged at 8,000 × g to collect 75 μl of an ethyl acetate phase. After the ethyl acetate phase was evaporated to dryness under reduced pressure, the residue was dissolved in 6.0 μl of ethyl acetate, and 5.0 μl of the residue was placed on a silica gel TLC plate (TLC plate silica gel 60F).₂₅₄, 20 cm × 20 cm, 0.25 mm thickness, manufactured by Merck). After developing the TLC plate for about 1 hour using a chloroform-acetic acid-ethyl acetate mixed solution (chloroform: acetic acid: ethyl acetate = 6: 1: 2) as a developing solvent, the solvent is evaporated and an imaging plate (Fuji Photo Film Co., Ltd.) ) Overnight. Next, the imaging plate was analyzed with an image analyzer BAS2000 (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.),¹⁴The presence or absence of spots (Rf values 0.24 and 0.29) corresponding to compound (III) labeled with C is examined. The formation of compound (III) can be confirmed in the reaction solution containing the A component, the B component, the C component, and the E. coli extract pKSN646, or the reaction solution containing the A component, the B component, the C component, and the E. coli extract pKSN646F.
[0156]
Example 28 Sequence identity for the protein of the present invention
GENETYX-WIN @ Ver. 5 (manufactured by Software Development Co., Ltd.) using the Lipman-Pearson method [Lipman, @D. {J. And Pearson, W. R. , Science, 227, 1435-1441, (1985)] to prepare an alignment, thereby analyzing the sequence identity of the protein of the present invention and the DNA of the present invention.
The amino acid sequences of the proteins (A1) to (A4) of the present invention were determined for mutual sequence identity and sequence identity with known proteins having the highest homology. Table 15 shows the results.
[0157]
[Table 15]

*: Sequence identity values are shown in the upper row, and Accession numbers in the Entrez database (provided by National Center for Biotechnology Information, http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/) of the protein are shown in the lower row.
[0158]
DNA of the present invention (A1) having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, DNA of the present invention (A2) having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, DNA of the present invention (A3) having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 And the nucleotide sequence of the DNA of the present invention (A4) having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 109, the mutual sequence identity and the sequence homology with the known gene having the highest homology were determined. Table 16 shows the results.
[Table 16]

*: Sequence identity values are shown in the upper row, and Accession numbers in the Entrez database (provided by National Center for Biotechnology Information, http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/) are shown in the lower row.
[0159]
The amino acid sequences of the proteins (B1) to (B4) of the present invention were determined for mutual sequence identity and sequence identity with a known protein having the highest homology. Table 17 shows the results.
[Table 17]

*: Sequence identity values are shown in the upper row, and Accession numbers in the Entrez database (provided by National Center for Biotechnology Information, http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/) of the protein are shown in the lower row.
[0160]
DNA of the present invention (B1) having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15, DNA of the present invention (B2) having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16, and DNA of the present invention (B3) having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 And the nucleotide sequence of the DNA of the present invention (B4) having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 112, the mutual sequence identity and the sequence identity with the known gene having the highest homology were determined. The results are shown in Table 18.
[Table 18]

*: Sequence identity values are shown in the upper row, and Accession numbers in the Entrez database (provided by National Center for Biotechnology Information, http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/) are shown in the lower row.
[0161]
Example 29 PCR Using Oligonucleotide Having Partial Base Sequence of DNA (A) of the Present Invention as Primer
Chromosomal DNA of Streptomyces phaeochromogenes IFO 12898 prepared in Example 2, chromosome DNA of Saccharopolyspora taberi JCM 9383t prepared in Example 5, Streptomyces chromosomal DNA of Example 11 The chromosomal DNA of Streptomyces @ testaceus @ ATCC # 21469, the Streptomyces @ achromogenes @ IFO @ 12735 prepared in Example 26, and the Streptomyces@griseofuscus.tomofusctomy.multidot.screcus.TM. s thermocoerulescens IFO 14273t, and each of the chromosomal DNA of Streptomyces nogalater IFO 13445 was PCR as a template. Five primer pairs shown in Table 19 were used as primers. Table 19 shows the size of DNA expected to be amplified by PCR using each primer pair based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6.
[0162]
[Table 19]

[0163]
To the PCR reaction solution, two kinds of primers in the combination shown in Table 19 were added so as to be 200 nM each, 10 ng of chromosomal DNA, 0.5 μl of dNTP mix (a mixture of four kinds of dNTPs of 10 mM each), and 5 μl of 5 × GC genomic PCR reaction buffer, 25 mM Mg (OAc)₂1.1 μl, 5 μl of 5M ΔGC-Melt and 0.5 μl of Advantage-GC Genomic Polymerase Mix (manufactured by Clontech) were added, and distilled water was further added to make a total volume of 25 μl. The condition of keeping the temperature was 95 ° C. for 1 minute, a cycle of 94 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 1 minute was repeated 30 times, and further kept at 72 ° C. for 5 minutes. The reaction solution after the incubation was analyzed by 3% agarose gel electrophoresis. The results are shown in FIG. 46 and Tables 20 and 21. In any case where the chromosomal DNA prepared from any of the strains was used as a template, amplification of a DNA having a predicted size was observed in any or all of the primer pairs 14, 15, 16, 17, and 18. .
[0164]
[Table 20]

(*; + Indicates that the expected size of DNA was detected, and-indicates that it was not detected.)
[0165]
[Table 21]

(*; + Indicates that the expected size of DNA was detected, and-indicates that it was not detected.)
[0166]
Example 30 Hybridization using DNA (A) of the present invention or a DNA consisting of a partial base sequence of DNA (A) of the present invention as a probe
(1) Preparation of probe
A probe (DIG-labeled probe) was prepared by labeling the DNA (A1) of the present invention or a DNA consisting of a partial base sequence of the DNA (A1) of the present invention with digoshikigenin. Using the chromosomal DNA of Streptomyces @ phaeochromogenes @ IFO12898 prepared in Example 3 as a template, an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 93 and an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 94 as primers, PCR was performed using PCR \ DIG \ Probe \ Synthesis \ Kit (Roche Diagnostics \ GmbH) according to the attached manual. To the PCR reaction solution, the above two kinds of primers were added at 200 nM each, 50 ng of chromosomal DNA, 2.5 μl of dNTP stock solution (a mixture of four kinds of dNTP of 2.0 mM each), and PCR DIG mix 2.5 μl (mixture of four kinds of DIG-labeled dNTPs of 2.0 mM each), 5 μl of 10 × PCR buffer, and 0.75 μl of Expand High Fidelity Enzyme Mix (manufactured by Boehringer Mannheim), and distilled water was further added. The total volume was adjusted to 50 μl. The heat retention was performed at 95 ° C. for 2 minutes, then at 95 ° C. for 10 seconds, then at 60 ° C. for 30 seconds, and then at 72 ° C. for 2 minutes as one cycle. This is repeated for 15 cycles, each of which is performed at a temperature of 60 ° C. for 30 seconds, and then at 72 ° C. for 2 minutes (the temperature at 72 ° C. is increased by 20 seconds for each cycle). Insulated. After the incubation, the reaction solution was subjected to 1% agarose electrophoresis. As a result, amplification of about 1.3 kb of DNA was confirmed. The amplified DNA was recovered to obtain a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 and labeled with digoshikigenin. In a similar manner, using the chromosomal DNA of Streptomyces @ phaeochromogenes @ IFO12898 prepared in Example 3 as a template, an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 130 and an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 131 PCR was performed using as a primer. The DNA amplified by the PCR was recovered to obtain DNA having the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 57 to 730 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 and labeled with digoshikigenin.
In a similar manner, using the chromosomal DNA of Saccharopolyspora @ taberi @ JCM9383t prepared in Example 6 as a template, an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 61 and an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 62 PCR was performed using as a primer. The DNA amplified by the PCR was recovered to obtain a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 and labeled with digoshikigenin.
Further, in a similar manner, using the chromosomal DNA of Streptomyces @ testaceus @ ATCC21469 prepared in Example 11 as a template, an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 70 and an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 71 PCR was performed using as a primer. The DNA amplified by the PCR was recovered to obtain DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 8 and labeled with digoshikigenin. In addition, PCR was performed using the chromosomal DNA as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 132 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 133 as primers. The DNA amplified by the PCR was recovered to obtain DNA having the nucleotide sequence represented by base numbers 21 to 691 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 and labeled with digoshikigenin.
[0167]
(2) Dot blot hybridization
The pKSN657 DNA (DNA containing the DNA (A1) of the present invention) prepared in Example 4, the DNA of pKSN923 prepared in Example 7 (DNA containing the DNA (A2) of the present invention), and the DNA prepared in Example 12 PKSN671 DNA (DNA containing the DNA (A3) of the present invention), pKSSNSCA DNA prepared in Example 14 (DNA containing the DNA (A9)), and pKSN11796 DNA prepared in Example 10 (DNA DNA (DNA containing A10) was blotted onto nylon membrane Hybond @ N + (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) in an amount of 100 ng and 10 ng respectively. The resulting membrane was irradiated with ultraviolet light for 5 minutes using a transilluminator.
Hybridization and detection were performed using DIG-High Prime DNA DNA Labeling Detection Starter Kit II (Rche Diagnostics GmbH) according to the attached manual. As probes, the DNAs labeled with digoshikigenin prepared in Example 30 (1) were each kept at 100 ° C. for 5 minutes and then rapidly cooled on ice for use (hereinafter referred to as DIG-labeled probes). The nylon membrane on which the DNA was blotted was shaken at 42 ° C. for 30 minutes in 2.0 ml of DIG @ Easy \ Hyb attached to the above kit. Next, 2.0 ml of DIG Easy Easy Hyb, 5.0 μl of the DIG-labeled probe and the above-mentioned membrane were sealed in a hybrid bag, and kept at 42 ° C. for 18 hours. The membrane is removed, and the solution is shaken twice in 2 × SSC containing 0.1% {SDS} at room temperature for 5 minutes, and then shaken in 0.5 × SSC containing 0.1% {SDS} at 65 ° C. for 15 minutes. The crop was performed twice. Subsequently, the membrane was shaken in 50 ml of Washing buffer for 2 minutes, then shaken in 50 ml of Blocking solution for 30 minutes at room temperature, further shaken in 2.0 ml of Antibody solution for 30 minutes, and then shaken in 50 ml of 50 ml of Washing buffer. Shaking was performed twice in a Washing buffer for 15 minutes. Further, the membrane was shaken in 50 ml of Detection Buffer for 5 minutes, then sealed in a hybrid bag together with 2.0 ml of Color Substrate Solution, and kept at room temperature for 18 hours. When hybridization was carried out with any of the DIG-labeled probes, signals were detected for each of 100 ng and 10 ng samples of pKSN657, pKSN923, pKSN671, pKSNSCA and pKSN11796, respectively.
[0168]
Example 31—Acquisition of the DNA (A11) of the present invention
(1) Preparation of Streptomyces nogalator IFO 13445 chromosomal DNA
Streptomyces nogalator IFO 13445 was added to 50 ml of TGY medium (yeast extract 0.5% (w / v), tryptone 0.5% (w / v), glucose 0.1% (w / v), K₂HPO₄After shaking culture at (0.1% (w / v), pH 7.0) at 30 ° C for 3 days, the cells were collected. The obtained cells were suspended in a TGY medium supplemented with 1.4% (w / v) glycine and 60 mM @EDTA, and cultured with shaking for another day. The cells were collected from the obtained culture, washed once with distilled water, and then washed with 3.5 ml of buffer B1 (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM EDTA, 0.5% Tween-20, 0%). 0.5% Triton X-100). 80 μl of a 100 mg / ml lysozyme solution and 100 μl of QIAGEN @ Protease (600 mAU / ml, manufactured by Qiagen) were added to the obtained suspension, and the mixture was kept at 37 ° C. for 1 hour. Next, 1.2 ml of buffer B2 (3M guanidine HCl, 20% Tween-20) was added, mixed, and kept at 50 ° C. for 30 minutes. The resulting lysate was added to Qiagen Genomic Chip 100G (manufactured by Qiagen) equilibrated with buffer QBT (750 mM NaCl, 50 mM MOPS (pH 7.0), 15% isopropanol, 0.15% Triton X-100). Next, the chip was washed twice with 7.5 ml of buffer QC [50 mM MOPS (pH 7.0), 15% isopropanol], and then 5 ml of buffer QF [1.25 M NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8.5). , {15% isopropanol]] to elute the DNA. 3.5 ml of isopropanol was mixed with the obtained DNA solution to precipitate and collect chromosomal DNA. The collected chromosomal DNA was washed with 70% ethanol and then dissolved in 1 ml of TB buffer.
[0169]
(2) Isolation of a DNA having a partial nucleotide sequence of the DNA (A11) of the present invention
PCR was performed according to the method described in Example 29 using the chromosomal DNA prepared in Example 31 (1) as a template and the primer pair 14. The amplified DNA was ligated to a pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by INVITROGEN) according to the instruction manual attached to the vector, and then introduced into E. coli TOP10F '. Plasmid DNA was prepared from the obtained Escherichia coli transformant using QIAGEN @ Tip20 (manufactured by QIAGEN). Using the obtained plasmid DNA as a template and a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 57 or a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 59, a Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Applied Biosystems Japan) Was performed according to the instruction manual attached to the kit. The reaction product was analyzed using a DNA sequencer 3100 (manufactured by Applied Biosystems Japan). As a result, the base sequence represented by base numbers 316 to 1048 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 139 was read.
Further, the chromosomal DNA prepared in Example 31 (1) was digested with the restriction enzyme PvuII. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared according to the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 161 and a primer AP1 [attached to Universal Genome Walker Kit (manufactured by Clontech)] as described in Example 26 (3) PCR was performed under the conditions to obtain a primary PCR product. Subsequently, using the primary PCR product as a template and described in Example 26 (3) using an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 162 and primer AP2 [attached to Universal Genome Walker Kit (Clontech)]. PCR was performed under the following conditions. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 1 to 330 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 144 was read.
Further, the chromosomal DNA prepared in Example 31 (1) was digested with a restriction enzyme HincII. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template and using the oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 163 and primer AP1 under the conditions described in Example 26 (3), PCR was performed to obtain a primary PCR product. Was. Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 164 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 983 to 1449 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 144 was read.
(3) Base sequence analysis of DNA (A11) of the present invention
By linking the nucleotide sequences read from the DNA obtained in Example 31 (2), the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 144 was obtained. There were two open reading frames (ORFs) in the nucleotide sequence. That is, a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 139) consisting of 1230 bases (including a termination codon) and encoding 409 amino acid residues (SEQ ID NO: 159), and a 68 amino acid residue (SEQ ID NO: consisting of 207 bases (including a termination codon)) 149)) (SEQ ID NO: 154). The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 159) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 139 was calculated to be 45177 Da. The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 149) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 154 was calculated to be 7147 Da.
[0170]
Example 32 Expression of the protein of the present invention (A11) in Escherichia coli
(1) Preparation of transformed Escherichia coli having the DNA (A11) of the present invention
Using the chromosomal DNA of Streptomyces nogalator IFO 13445 prepared in Example 31 (1) as a template, PCR was performed using an Expand Hi-Fi PCR system (Boehringer Mannheim). As the primer, a combination of an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 165 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 166 was used. The reaction solution composition and the heat retention of the PCR were the same as the conditions described in Example 27 (1). After the incubation, the reaction solution was subjected to 1% agarose gel electrophoresis to cut out a gel containing about 1.5 kbp of DNA. DNA was purified from the collected gel using QIA quick gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN) according to the instruction manual attached to the kit. The obtained DNA and pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by Invitrogen) were ligated according to the instruction manual attached to the vector, and then ligated into Escherichia coli TOP10F '. Plasmid DNA was prepared from the obtained Escherichia coli transformant using QIAGEN {Tip20} (manufactured by QIAGEN). Using the resulting plasmid DNA as a template and oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 57, 59 and 186 as primers, using a Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (manufactured by Applied Biosystems Japan). The sequencing reaction was performed according to the instruction manual attached to the kit. The reaction product was analyzed using a DNA sequencer 3100 (manufactured by Applied Biosystems Japan). Based on the obtained results, a plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 144 was designated as pCR849AF.
Next, pCR849AF was digested with restriction enzymes NdeI and HindIII, and the digest was subjected to agarose gel electrophoresis to cut out a gel containing about 1.5 kbp DNA. DNA was purified from the obtained gel using QIAquick \ Gel \ Extraction \ Kit (manufactured by QIAGEN) according to the instruction manual attached to the kit. This DNA and the plasmid pKSN2 digested with NdeI and HindIII were ligated with the ligation kit Ver. 2 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and ligated according to the instruction manual attached to the kit, and then introduced into E. coli JM109. Plasmid DNA was prepared from the obtained E. coli transformant, and its structure was analyzed. The plasmid obtained by inserting the above-described DNA of about 1.5 kbp containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 144 and encoding the protein of the present invention (A11) between the NdeI site and the HindIII site of pKSN2 was designated as pKSN849AF. . This plasmid pKSN849AF was introduced into E. coli JM109, and the resulting E. coli transformant was designated as JM109 / pKSN849AF. Further, the plasmid pKSN2 was introduced into Escherichia coli JM109, and the obtained Escherichia coli transformant was designated as JM109 / pKSN2.
[0171]
(2) Expression of the protein (A11) of the present invention in Escherichia coli and recovery of the protein
Escherichia coli JM109 / pKSN849AF and JM109 / pKSN2 were each cultured in the same manner as in Example 4 (2), and then the cells were collected to prepare a cell lysate. From the obtained crushed liquid, a supernatant fraction (hereinafter, the supernatant fraction obtained from E. coli JM109 / pKSN849AF was obtained from E. coli extracts pKSN849AF and JM109 / pKSN2) by the method described in Example 4 (2). The obtained supernatant fraction was referred to as Escherichia coli extract pKSN2).
(3) Assay for ability to convert compound (II) to compound (III)
¹⁴3 ppm of compound (II) labeled with C, 2 mM β-NADPH (A component, manufactured by Oriental Yeast), 2 mg / ml spinach-derived ferredoxin (B component, SIGMA), 0.1 U / ml ferredoxin 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing reductase (C component, manufactured by SIGMA) and 23 μl of the supernatant fraction (E. coli extract pKSN849AF or E. coli extract pKSN2) collected in Example 32 (2). ) Was prepared and kept at 30 ° C for 10 minutes. In the same manner as in Example 4 (3), each reaction solution after keeping the temperature was extracted with ethyl acetate, and the obtained extract was analyzed by TLC. On the TLC plate after development¹⁴The presence or absence of spots (Rf values 0.24 and 0.29) corresponding to compound (III) labeled with C was examined. A spot corresponding to compound (III) was detected from the reaction solution containing the E. coli extract pKSN849AF. On the other hand, in the reaction solution containing the E. coli extract pKSN2, the spot was not detected.
[0172]
Example 33: Acquisition of DNA (A12) of the present invention
(1) Preparation of Streptomyces \ tsusimaensis \ IFO \ 13782 chromosomal DNA
According to the method described in Example 31 (1), chromosomal DNA of Streptomyces @ tsusimaensis @ IFO @ 13782 was prepared.
[0173]
(2) Isolation of a DNA having a partial nucleotide sequence of the DNA (A12) of the present invention
PCR was carried out according to the method described in Example 29 using the chromosomal DNA of Streptomyces tsusimaensis IFO 13782 prepared in Example 33 (1) as a template and primer pair 14. In the same manner as in Example 31 (2), the amplified DNA was cloned into a pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by INVITROGEN), and the nucleotide sequence was analyzed. As a result, the base sequence represented by base numbers 364 to 1096 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 140 was read.
Further, the chromosomal DNA prepared in Example 33 (1) was digested with a restriction enzyme SmaI. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 167 and primer AP1, to obtain a primary PCR product. . Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 168 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 1 to 392 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 145 was read.
Further, the chromosomal DNA prepared in Example 33 (1) was digested with a restriction enzyme PvuII. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template, and using an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 169 and primer AP1 under the conditions described in Example 26 (3), PCR was performed, and a primary PCR product was obtained. Obtained. Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 170 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 1048 to 1480 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 145 was read.
[0174]
(3) Base sequence analysis of DNA (A12) Ａ of the present invention
By linking the base sequences read from the DNA obtained in Example 33 (2), the base sequence represented by SEQ ID NO: 145 was obtained. There were two open reading frames (ORFs) in the nucleotide sequence. That is, a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 140) consisting of 1278 bases (including a stop codon) and encoding 425 amino acid residues (SEQ ID NO: 160), and 65 amino acid residues (SEQ ID NO :) consisting of 198 bases (including a stop codon) 150) (SEQ ID NO: 155). The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 160) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 140 was calculated to be 46549 Da. The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 150) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 155 was calculated to be 6510 Da.
[0175]
Example 34 Expression of DNA (A12) of the Present Invention in Escherichia coli
(1) Preparation of transformed Escherichia coli having the DNA (A12) of the present invention
Using Streptomyces tsusimaensis IFO 13782 chromosomal DNA prepared in Example 33 (1) as a template, an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 171 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 172 are used as primers. PCR was performed in the same manner as in Example 32 (1) except for the above. From the PCR reaction solution, DNA was purified and cloned into pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by Invitrogen) in the same manner as in Example 32 (1). The nucleotide sequence of the obtained plasmid DNA was analyzed using oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 57, 59, 171, 172, and 187 as primers. Based on the obtained results, a plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 145 was designated as pCR1618F. In the same manner as in Example 32 (1), pCR1618F was digested with restriction enzymes NdeI and HindIII, and a DNA of about 1.5 kbp was purified from the digest. By ligating the obtained DNA with the plasmid pKSN2 digested with NdeI and HindIII, the DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 145 and encoding the protein of the present invention (A12) was ligated to the NdeI site of pKSN2. A plasmid (hereinafter, referred to as pKSN1618F) inserted between the HindIII site was obtained. The plasmid was introduced into Escherichia coli JM109, and the obtained Escherichia coli transformant was designated as JM109 / pKSN1618F.
[0176]
(2) Expression of the protein of the present invention (A12) in E. coli and recovery of the protein
After culturing Escherichia coli JM109 / pKSN1618F and JM109 / pKSN2, respectively, in the same manner as in Example 4 (2), the cells were collected, and a cell lysate was prepared. From the obtained crushed liquid, a supernatant fraction (hereinafter, the supernatant fraction obtained from Escherichia coli JM109 / pKSN1618F was obtained from Escherichia coli extracts pKSN1618F and JM109 / pKSN2 by the method described in Example 4 (2). The obtained supernatant fraction was referred to as Escherichia coli extract pKSN2).
(3) Assay for ability to convert compound (II) to compound (III)
Except for using the supernatant fraction (Escherichia coli extract pKSN1618F or Escherichia coli extract pKSN2) recovered in Example 34 (2), 30 μl of the reaction solution was prepared in the same manner as in Example 32 (3), Incubated for minutes. After the incubation, each reaction solution was extracted with ethyl acetate, and the obtained extract was analyzed by TLC. On the TLC plate after development¹⁴The presence or absence of spots (Rf values 0.24 and 0.29) corresponding to compound (III) labeled with C was examined. A spot corresponding to the compound (III) was detected from the reaction solution containing the E. coli extract pKSN1618F. On the other hand, in the reaction solution containing the E. coli extract pKSN2, the spot was not detected.
[0177]
Example 35: Obtaining the DNA (A13) of the present invention
(1) Preparation of Streptomyces \ thermocoerulesces \ IFO \ 14273t chromosomal DNA
According to the method described in Example 31 (1), chromosomal DNA of Streptomyces \ thermocoerulesces \ IFO \ 14273t was prepared.
[0178]
(2) Isolation of DNA having partial nucleotide sequence of DNA (A13) of the present invention
PCR was performed according to the method described in Example 29 using the chromosomal DNA of Streptomyces {thermocoerulesces} IFO} 14273t prepared in Example 35 (1) as a template and the primer pair 14. In the same manner as in Example 31 (2), the amplified DNA was cloned into a pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by INVITROGEN), and the nucleotide sequence was analyzed. As a result, the base sequence represented by base numbers 295 to 1027 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 141 was read.
Further, the chromosomal DNA prepared in Example 35 (1) was subjected to the restriction enzyme HincII. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 173 and primer AP1, to obtain a primary PCR product. . Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 174 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. As a result, the base sequence represented by base numbers 1 to 370 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 146 was read.
Further, the chromosomal DNA prepared in Example 35 (1) was digested with a restriction enzyme SmaI. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 175 and primer AP1 under the conditions described in Example 26 (3), PCR was performed to obtain a primary PCR product. Was. Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 176 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. As a result, the base sequence represented by base numbers 960 to 1473 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 146 was read.
[0179]
(3) Base sequence analysis of DNA (A13) of the present invention
By linking the nucleotide sequences read from the DNA obtained in Example 35 (2), the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 146 was obtained. There were two open reading frames (ORFs) in the nucleotide sequence. That is, a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 141) consisting of 1209 bases (including a stop codon) and encoding 402 amino acid residues (SEQ ID NO: 136), and 83 amino acid residues (sequence number of 252 bases (including a stop codon)) 151) (SEQ ID NO: 156). The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 136) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 141 was calculated to be 44629 Da. The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 151) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 156 was calculated to be 8635 Da.
[0180]
Example 36 Expression of DNA (A13) of the Present Invention in E. coli
(1) Preparation of transformed Escherichia coli having the DNA (A13) of the present invention
Using the chromosomal DNA of Streptomyces @ thermocoerulesces @ IFO @ 14273t prepared in Example 35 (1) as a template, an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 177 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 178 as primers PCR was performed in the same manner as in Example 32 (1) except for using PCR. From the PCR reaction solution, DNA was purified and cloned into pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by Invitrogen) in the same manner as in Example 32 (1). The nucleotide sequence of the obtained plasmid DNA was analyzed using oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 57, 59, 173, 175, and 188 as primers. Based on the obtained results, a plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 146 was designated as pCR474F. In the same manner as in Example 32 (1), pCR474F was digested with restriction enzymes NdeI and HindIII, and about 1.5 kbp of DNA was purified from the digest. By ligating the obtained DNA with the plasmid pKSN2 digested with NdeI and HindIII, the DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 146 and encoding the protein of the present invention (A13) was ligated to the NdeI site of pKSN2. A plasmid (hereinafter, referred to as pKSN474F) inserted between the HindIII site was obtained. The plasmid was introduced into Escherichia coli JM109, and the resulting Escherichia coli transformant was designated as JM109 / pKSN474F.
[0181]
(2) Expression of the protein of the present invention (A13) in E. coli and recovery of the protein
After culturing Escherichia coli JM109 / pKSN474F and JM109 / pKSN2, respectively, in the same manner as in Example 4 (2), the cells were collected, and a cell lysate was prepared. From the obtained crushed liquid, a supernatant fraction (hereinafter, the supernatant fraction obtained from Escherichia coli JM109 / pKSN474F was obtained from Escherichia coli extracts pKSN474F and JM109 / pKSN2) by the method described in Example 4 (2). The obtained supernatant fraction was referred to as Escherichia coli extract pKSN2).
(3) Assay for ability to convert compound (II) to compound (III)
Except for using the supernatant fraction (Escherichia coli extract pKSN474F or Escherichia coli extract pKSN2) recovered in Example 36 (2), 30 μl of the reaction solution was prepared in the same manner as in Example 32 (3), Incubated for minutes. After the incubation, each reaction solution was extracted with ethyl acetate, and the obtained extract was analyzed by TLC. On the TLC plate after development¹⁴The presence or absence of spots (Rf values 0.24 and 0.29) corresponding to compound (III) labeled with C was examined. A spot corresponding to the compound (III) was detected from the reaction solution containing the E. coli extract pKSN474F. On the other hand, in the reaction solution containing the E. coli extract pKSN2, the spot was not detected.
[0182]
Example 37—Acquisition of the DNA (A14) of the present invention
(1) Preparation of Streptomyces \ glomericrogenes \ IFO \ 13673t chromosomal DNA
According to the method described in Example 31 (1), chromosomal DNA of Streptomyces {glomerochromogenes} IFO @ 13673t was prepared.
[0183]
(2) Isolation of DNA having partial nucleotide sequence of DNA (A14) 本 of the present invention
PCR was performed according to the method described in Example 29 using the chromosomal DNA of Streptomyces {glomerochromogenes} IFO} 13673t prepared in Example 37 (1) as a template and primer pair 14 according to the method described in Example 29. In the same manner as in Example 31 (2), the amplified DNA was cloned into a pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by INVITROGEN), and the nucleotide sequence was analyzed. As a result, the base sequence represented by base numbers 316 to 1048 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 142 was read.
The chromosomal DNA prepared in Example 37 (1) was digested with the restriction enzyme SmaI. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 179 and primer AP1, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) to obtain a primary PCR product. Was. Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 180 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 1 to 330 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 147 was read.
Further, the chromosomal DNA prepared in Example 37 (1) was digested with a restriction enzyme HincII. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 181 and primer AP1, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) to obtain a primary PCR product. Was. Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 182 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 982-1449 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 147 was read.
[0184]
(3) Base sequence analysis of DNA (A14) of the present invention
By linking the nucleotide sequences read from the DNA obtained in Example 37 (2), the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 147 was obtained. There were two open reading frames (ORFs) in the nucleotide sequence. That is, a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 142) consisting of 1230 bases (including a stop codon) and encoding 409 amino acid residues (SEQ ID NO: 137), and a 68 amino acid residue (SEQ ID NO:) consisting of 207 bases (including a stop codon) 152) (SEQ ID NO: 157). The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 137) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 142 was calculated to be 45089 Da. The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 152) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 157 was calculated to be 7174 Da.
[0185]
Example 38 Expression of DNA (A14) of the Present Invention in Escherichia coli
(1) Preparation of transformed Escherichia coli having the DNA (A14) of the present invention
Using, as a template, the chromosomal DNA of Streptomyces ｌｏglomerochromogenes IFO 13673t prepared in Example 37 (1) as a primer, an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 183 and an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 184 PCR was performed in the same manner as in Example 32 (1) except for using PCR. From the PCR reaction solution, DNA was purified and cloned into pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by Invitrogen) in the same manner as in Example 32 (1). The nucleotide sequence of the obtained plasmid DNA was analyzed using oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 57, 59 and 189 as primers. Based on the obtained results, a plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 147 was designated as pCR1491AF. In the same manner as in Example 32 (1), pCR1491AF was digested with restriction enzymes NdeI and HindIII, and a DNA of about 1.5 kbp was purified from the digest. By ligating the obtained DNA with the plasmid pKSN2 digested with NdeI and HindIII, the DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 147 and encoding the protein of the present invention (A14) was ligated to the NdeI site of pKSN2. A plasmid (hereinafter, referred to as pKSN1491AF) inserted between the HindIII site was obtained. The plasmid was introduced into Escherichia coli JM109, and the resulting Escherichia coli transformant was designated as JM109 / pKSN1491AF.
[0186]
(2) Expression of the protein (A14) of the present invention in Escherichia coli and recovery of the protein
After culturing Escherichia coli JM109 / pKSN1491AF and JM109 / pKSN2, respectively, in the same manner as in Example 4 (2), the cells were collected, and a cell lysate was prepared. From the obtained crushed liquid, a supernatant fraction (hereinafter, the supernatant fraction obtained from Escherichia coli JM109 / pKSN1491AF was obtained from Escherichia coli extracts pKSN1491AF and JM109 / pKSN2) by the method described in Example 4 (2). The obtained supernatant fraction was referred to as Escherichia coli extract pKSN2).
[0187]
(3) Assay for ability to convert compound (II) to compound (III)
Except for using the supernatant fraction (Escherichia coli extract pKSN1491AF or Escherichia coli extract pKSN2) recovered in Example 38 (2), 30 μl of the reaction solution was prepared in the same manner as in Example 32 (3), Incubated for minutes. After the incubation, each reaction solution was extracted with ethyl acetate, and the obtained extract was analyzed by TLC. On the TLC plate after development¹⁴The presence or absence of spots (Rf values 0.24 and 0.29) corresponding to compound (III) labeled with C was examined. A spot corresponding to compound (III) was detected from the reaction solution containing the E. coli extract pKSN1491AF. On the other hand, in the reaction solution containing the E. coli extract pKSN2, the spot was not detected.
[0188]
Example 39 Acquisition of DNA (A15) of the Present Invention
(1) Preparation of Streptomyces @ olivochromogenes @ IFO @ 12444 chromosomal DNA
According to the method described in Example 31 (1), chromosomal DNA of Streptomyces @ olivochromogenes @ IFO12444 was prepared.
[0189]
(2) Isolation of DNA having partial nucleotide sequence of DNA (A15) of the present invention
PCR was performed according to the method described in Example 29 using the chromosomal DNA of Streptomyces olivochromogenes IFO 12444 prepared in Example 39 (1) as a template and the primer pair 14. In the same manner as in Example 31 (2), the amplified DNA was cloned into a pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by INVITROGEN), and the nucleotide sequence was analyzed. As a result, the base sequence represented by base numbers 316 to 1048 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 143 was read.
In addition, the chromosomal DNA prepared in Example 39 (1) was digested with the restriction enzyme SmaI. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained DNA as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 179 and primer AP1 under the conditions described in Example 26 (3), PCR was performed to obtain a primary PCR product. . Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 180 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 1 to 330 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 148 was read.
Further, the chromosomal DNA prepared in Example 39 (1) was digested with a restriction enzyme SmaI. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 181 and primer AP1, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) to obtain a primary PCR product. Was. Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 182 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 982-1449 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 148 was read.
[0190]
(3) Base sequence analysis of DNA (A15) of the present invention
By linking the nucleotide sequences read from the DNA obtained in Example 39 (2), the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 148 was obtained. There were two open reading frames (ORFs) in the nucleotide sequence. That is, a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 143) consisting of 1230 bases (including a termination codon) and encoding 409 amino acid residues (SEQ ID NO: 138), and a 68 amino acid residue (SEQ ID NO: consisting of 207 bases (including a termination codon)) 153) (SEQ ID NO: 158). The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 138) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 143 was calculated to be 45116 Da. The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 153) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 158 was calculated to be 7179 Da.
[0191]
Example 40 Expression of DNA (A15) of the Present Invention in Escherichia coli
(1) Preparation of transformed Escherichia coli having the DNA (A15) of the present invention
Using the chromosomal DNA of Streptomyces ｉolivochromogenes IFO 12444 prepared in Example 39 (1), an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 185 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 184 are used as primers. PCR was performed in the same manner as in Example 32 (1) except for the above. From the PCR reaction solution, DNA was purified and cloned into pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by Invitrogen) in the same manner as in Example 32 (1). The nucleotide sequence of the obtained plasmid DNA was analyzed using oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 57, 59 and 189 as primers. Based on the obtained results, a plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 148 was designated as pCR1555AF. In the same manner as in Example 32 (1), pCR1555AF was digested with restriction enzymes NdeI and HindIII, and a DNA of about 1.5 kbp was purified from the digest. By ligating the obtained DNA with the plasmid pKSN2 digested with NdeI and HindIII, the DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 148 and encoding the protein of the present invention (A15) was ligated to the NdeI site of pKSN2. A plasmid (hereinafter, referred to as pKSN1555AF) inserted between the HindIII site was obtained. The plasmid was introduced into Escherichia coli JM109, and the resulting Escherichia coli transformant was designated as JM109 / pKSN1555AF.
[0192]
(2) Expression of the protein (A15) of the present invention in Escherichia coli and recovery of the protein
After culturing Escherichia coli JM109 / pKSN1555AF and JM109 / pKSN2, respectively, in the same manner as in Example 4 (2), the cells were collected, and a cell lysate was prepared. From the obtained crushed liquid, a supernatant fraction (hereinafter, the supernatant fraction obtained from Escherichia coli JM109 / pKSN1555AF) was obtained from Escherichia coli extracts pKSN1555AF and JM109 / pKSN2 by the method described in Example 4 (2). The obtained supernatant fraction was referred to as Escherichia coli extract pKSN2).
[0193]
(3) Assay for ability to convert compound (II) to compound (III)
Except for using the supernatant fraction (Escherichia coli extract pKSN1555AF or Escherichia coli extract pKSN2) recovered in Example 40 (2), 30 μl of the reaction solution was prepared in the same manner as in Example 32 (3), Incubated for minutes. After the incubation, each reaction solution was extracted with ethyl acetate, and the obtained extract was analyzed by TLC. On the TLC plate after development¹⁴The presence or absence of spots (Rf values 0.24 and 0.29) corresponding to compound (III) labeled with C was examined. A spot corresponding to compound (III) was detected from the reaction solution containing the E. coli extract pKSN1555AF. On the other hand, in the reaction solution containing the E. coli extract pKSN2, the spot was not detected.
[0194]
Example 41 Metabolism of Compound by Protein (A1) of the Present Invention
(1) Preparation of plastid fraction
100 g of leaf radish seeds (manufactured by Takii Seed Co., Ltd.) were sowed on a moistened paper waste in a vat, cultivated at 25 ° C. in the dark for 6 days, and then cultivated under fluorescent light for 4 hours. 30 g of the greened cotyledons were ground with a grinding buffer [1 mM magnesium chloride, 20 mM N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid, 10 mM N-2-hydroxyethylpiperidine-N'-2-ethanesulfonic acid, 0.1 mM 5 mM EDTA, 5 mM cysteine, 0.5 M sucrose; pH 7.7] with Nissei AM-8 HOMOGENEZER (manufactured by Nippon Seiki Seisakusho) at 18,000 to 20,000 rpm at 4 ° C. for 5 seconds. . The obtained triturated liquid was filtered through four layers of nylon gauze, and the obtained filtrate was centrifuged (13,170 × g, 4 ° C., 1 minute). The obtained precipitate fraction was suspended in 60 ml of a grinding buffer and centrifuged (2,640 × g, 4 ° C., 2 minutes). The precipitate fraction was suspended again in 10 ml of the grinding buffer, and 20 ml of a high-density buffer [1 mM magnesium chloride, 20 mM N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid, 30 mM N-2) placed in a centrifuge tube. -Hydroxyethylpiperidine-N'-2-ethanesulfonic acid, 0.5 mM EDTA, 5 mM cysteine, 0.6 M sucrose; pH 7.7]. After centrifugation (675 × g, 4 ° C., 15 minutes), the precipitate was washed with 3 ml of a suspension buffer [1 mM magnesium chloride, 20 mM N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid, 30 mM N-2-hydroxy Ethyl piperidine-N'-2-ethanesulfonic acid, 0.5 mM @EDTA; pH 7.7] to give a plastid fraction.
[0195]
(2) Metabolism of compound (XII) by protein (A1) of the present invention
5 ppm of compound (XII), 3 mM β-NADPH (A component, manufactured by Oriental Yeast), 1 mg / ml spinach-derived ferredoxin (B component, SIGMA), 0.15 U / ml ferredoxin reductase (C component, 100 μl of a 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 20 μl of the supernatant fraction recovered in Example 4 (2) and the supernatant fraction collected in Example 4 (2) was prepared and kept at 30 ° C. for 10 minutes. Also, 100 μl of a reaction solution comprising 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) not containing the components A, B, and C in the above reaction solution composition and the supernatant fraction collected in Example 4 (2). Was prepared and kept warm in the same manner. After the incubation, 10 μl of 2N hydrochloric acid and 500 μl of ethyl acetate were added to each reaction solution, stirred, and centrifuged at 8000 × g to collect 490 μl of an ethyl acetate layer. After the ethyl acetate layer was dried under reduced pressure, the residue was dissolved in 100 μl of 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). The obtained lysate [hereinafter referred to as the (XII) metabolite (A1)] It is written. The lysate derived from the reaction solution that does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 4 (2) is referred to as (XII) control solution (A1). ] Were analyzed by HPLC. (XII) The concentration of compound (XII) detected from (XII) metabolite (A1) was lower than the concentration of compound (XII) detected from control solution (A1). Further, a peak not detected in the (XII) control solution (A1) was detected from the (XII) metabolite solution (A1). The compound contained in the peak was subjected to mass spectrometry. The mass of the compound contained in the peak was 14 smaller than the mass of compound (XII).
[0196]
20 μl of the 32-fold dilution of the above-mentioned (XII) metabolite (A1) and 60 μl of the plastid fraction prepared in Example 41 (1) were mixed, and 20 μl of a substrate solution (10 mM adenosine triphosphate, 5 mM Aminolevulinic acid, 4mM reduced glutathione, 0.6mM NAD⁺PH 6.5) (hereinafter, the substrate solution is referred to as a PPO substrate solution), and the mixture was kept at 30 ° C for 1.5 hours. Further, a reaction solution was prepared by adding 20 μl of the (XII) control solution (A1) in place of 20 μl of the 32 × dilution solution of the (XII) metabolite (A1), and similarly adding the PPO substrate solution. And kept warm. After the incubation, 300 μl of a dimethyl sulfoxide-methanol mixture (dimethyl sulfoxide: methanol = 7: 3) was added to each reaction solution after centrifugation, followed by centrifugation (8000 × g, 4 ° C., 10 minutes). The supernatant was recovered and subjected to reverse phase HPLC analysis under the following analysis conditions 2 to measure the amount of PPIX. (XII) The amount of PPIX in the reaction solution to which the metabolite (A1) was added was larger than the amount of PPIX in the reaction solution to which (XII) the control solution (A1) was added.
[0197]
(HPLC analysis condition 2)
Column: Sumipacks ODS212 (manufactured by Sumika Chemical Analysis Service)
Flow rate: 2 ml / min
Detection wavelength: fluorescence {Ex = 410 nm} Em = 630 nm
Eluate: mixed solution of methanol-1M / ammonium acetate (pH 5.7) (methanol: 1M / ammonium acetate = 95: 5)
[0198]
(3) Metabolism of compound (XIII) by protein (A1) of the present invention
A reaction solution was prepared and kept warm according to the method described in Example 41 (2) except that 5 ppm of the compound (XIII) was used instead of 5 ppm of the compound (XII). Each reaction solution after keeping the temperature was extracted with ethyl acetate in the same manner as in Example 41 (2), and the obtained residue was dissolved in 100 μl of dimethyl sulfoxide. The obtained lysate [hereinafter, the lysate derived from the reaction solution containing the A component, the B component, the C component, and 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 4 (2) was subjected to (XIII) metabolite (A1) It is written. The lysate derived from the reaction solution which does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 4 (2) is referred to as (XIII) control solution (A1). ] Was analyzed by HPLC under the above analysis conditions 1. (XIII) The concentration of compound (XIII) detected from (XIII) metabolite (A1) was lower than the concentration of compound (XIII) detected from control solution (A1). In addition, a peak that was not detected in the (XIII) control solution (A1) was detected from the (XIII) metabolite (A1). The compound contained in the peak was subjected to mass spectrometry. The mass of the compound contained in the peak was 14 smaller than the mass of compound (XIII).
[0199]
20 μl of the 128-fold diluted solution of the above-mentioned (XIII) metabolite (A1) and 60 μl of the plastid fraction were mixed, and 20 μl of a PPO substrate solution was added thereto in the dark, followed by incubation at 30 ° C. for 1.5 hours. Further, a reaction solution was prepared by adding 20 μl of the 128-fold diluted solution of (XIII) control (A1) instead of 20 μl of the 128-fold diluted solution of (XIII) metabolite (A1), and similarly adding the PPO substrate solution. Insulated. Each reaction solution after the heat retention was treated in the same manner as in Example 41 (2) and subjected to reverse phase HPLC analysis under the above analysis conditions 2 to measure the amount of PPIX. (XIII) The amount of PPIX in the reaction solution to which the metabolite (A1) was added was larger than the amount of PPIX in the reaction solution to which (XIII) the control solution (A1) was added.
[0200]
(4) Metabolism of compound (XVI) by protein (A1) of the present invention
A reaction solution was prepared and kept warm according to the method described in Example 41 (2) except that 12.5 ppm of the compound (XVI) was used instead of 5 ppm of the compound (XII). After the incubation, each reaction solution was extracted with ethyl acetate in the same manner as in Example 41 (2), and the obtained residue was dissolved in 200 μl of a 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). The obtained lysate [hereinafter, the lysate derived from the reaction solution containing the A component, the B component, the C component and 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 4 (2) was subjected to (XVI) metabolite (A1) It is written. The lysate derived from the reaction solution that does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 4 (2) is referred to as (XVI) control solution (A1). ] Was analyzed by HPLC under the above analysis conditions 1. (XVI) The concentration of the compound (XVI) detected from the (XVI) metabolite (A1) was lower than the concentration of the compound (XVI) detected from the control solution (A1). In addition, a peak not detected in the (XVI) control solution (A1) was detected from the (XVI) metabolite (A1).
[0201]
20 μl of the 8-fold dilution of the (XVI) metabolite (A1) and 60 μl of the plastid fraction were mixed, and 20 μl of a PPO substrate solution was added under dark conditions, followed by incubation at 30 ° C. for 1.5 hours. Further, a reaction solution was prepared by adding 20 μl of the (XVI) 8-fold diluted solution of the control (A1) in place of 20 μl of the 8-fold diluted solution of the metabolite (A1), and similarly adding the PPO substrate solution. Insulated. Each reaction solution after the heat retention was treated in the same manner as in Example 41 (2) and subjected to reverse phase HPLC analysis under the above analysis conditions 2 to measure the amount of PPIX. (XVI) The amount of PPIX in the reaction solution to which the metabolite (A1) was added was larger than the amount of PPIX in the reaction solution to which (XVI) the control solution (A1) was added.
[0202]
(5) Metabolism of compound (XVII) by protein (A1) of the present invention
A reaction solution was prepared and kept warm according to the method described in Example 41 (2) except that 12.5 ppm of the compound (XVII) was used instead of 5 ppm of the compound (XII). After the incubation, each reaction solution was extracted with ethyl acetate in the same manner as in Example 41 (2), and the obtained residue was dissolved in 200 μl of a 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). The obtained lysate [hereinafter, the lysate derived from the reaction solution containing A component, B component, C component and 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 4 (2) was subjected to (XVII) metabolite (A1) It is written. The lysate derived from the reaction solution which does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 4 (2) is referred to as (XVII) control solution (A1). ] Was analyzed by HPLC under the above analysis conditions 1. (XVII) The concentration of the compound (XVII) detected from the (XVII) metabolite (A1) was lower than the concentration of the compound (XVII) detected from the control solution (A1). Further, a peak not detected in the (XVII) control solution (A1) was detected from the (XVII) metabolite (A1).
[0203]
20 μl of the 32-fold dilution of the above-mentioned (XVII) metabolite (A1) and 60 μl of the plastid fraction were mixed, and 20 μl of a PPO substrate solution was added under dark conditions, followed by incubation at 30 ° C. for 1.5 hours. In addition, a reaction solution was prepared by adding 20 μl of the (XVII) control (A1) in place of 20 μl of the 32 × dilution of the (XVII) metabolite (A1), and similarly adding the PPO substrate solution. Insulated. Each reaction solution after the heat retention was treated in the same manner as in Example 41 (2) and subjected to reverse phase HPLC analysis under the above analysis conditions 2 to measure the amount of PPIX. (XVII) The amount of PPIX in the reaction solution to which the metabolite (A1) was added was larger than the amount of PPIX in the reaction solution to which (XVII) the control solution (A1) was added.
[0204]
(6) Metabolism of compound (VI) by protein (A1) of the present invention
E. coli JM109 / pKSN657F was cultured overnight at 37 ° C. in 3 ml of TB medium containing 50 μg / ml of ampicillin. 1 ml of the obtained culture solution was inoculated into 100 ml of TB medium containing 50 μg / ml of ampicillin and cultured at 26 ° C. When the OD660 reached about 0.5, the final concentration was adjusted to 500 μM. -Aminolevulinic acid was added and the culture was continued. Thirty minutes later, IPTG was added to a final concentration of 1 mM, and the cells were further cultured for 20 hours.
The cells were collected from the culture solution, washed with a 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.5), and then suspended in 10 ml of a 0.1 M Tris-HCl buffer containing 1% glucose. Compound (VI) was added to the obtained bacterial cell suspension to a final concentration of 100 ppm, followed by shaking culture at 30 ° C. 0 hours after the start of the shaking, and 1 day later, 2 ml of the bacterial cell suspension was collected, 50 μl of 2N hydrochloric acid was added to each, and the mixture was extracted with 2 ml of ethyl acetate. The obtained ethyl acetate layer was analyzed by HPLC under analysis condition 1. Compared with the concentration of compound (VI) detected from the ethyl acetate layer prepared from the cell suspension 0 hour after the start of the shaking, acetic acid prepared from the cell suspension 1 day after the start of the shaking The concentration of compound (VI) detected from the ethyl layer was low. In addition, a peak that was not detected in the ethyl acetate layer prepared from the cell suspension 0 hour after the start of the shaking was detected in the ethyl acetate layer prepared from the cell suspension one day after the start of the shaking. The compound contained in the peak was subjected to mass spectrometry. The mass of the compound contained in the peak was 14 smaller than the mass of compound (VI).
[0205]
(7) Metabolism of compound (VIII) by protein (A1) of the present invention
Cultivation of E. coli JM109 / pKSN657F, preparation of a cell suspension, and suspension of the cell according to the method described in Example 41 (6) except that compound (VIII) is used instead of compound (VI). Was shake-cultured with compound (VIII) added thereto, a sample was prepared from the cell suspension, and the sample was analyzed by HPLC. Compared with the concentration of compound (VIII) detected from the ethyl acetate layer prepared from the cell suspension 0 hour after the start of shaking, acetic acid prepared from the cell suspension 1 day after the start of shaking The concentration of compound (VIII) detected from the ethyl layer was low. Also, two kinds of peaks not detected in the ethyl acetate layer prepared from the cell suspension 0 hour after the start of shaking were detected from the ethyl acetate layer prepared from the cell suspension 1 day after the start of shaking. Was done. The compound contained in the peak was subjected to mass spectrometry. The mass of the compound contained in one peak was smaller by 14 and the mass of the compound contained in the other peak was smaller by 28 than the mass of the compound (VIII).
[0206]
(8) Metabolism of compound (X) by protein (A1) of the present invention
Culture of Escherichia coli JM109 / pKSN657F, preparation of a cell suspension, and suspension of the cell according to the method described in Example 41 (6) except that compound (X) is used instead of compound (VI). Was shake-cultured with compound (X) added thereto, sample preparation from a cell suspension, and HPLC analysis of the sample were performed. Compared with the concentration of compound (X) detected from the ethyl acetate layer prepared from the cell suspension 0 hour after the start of the shaking, the acetic acid prepared from the cell suspension 1 day after the start of the shaking was compared. The concentration of compound (X) detected from the ethyl layer was low. Also, two kinds of peaks not detected in the ethyl acetate layer prepared from the cell suspension 0 hour after the start of shaking were detected from the ethyl acetate layer prepared from the cell suspension 1 day after the start of shaking. Was done. The compound contained in the peak was subjected to mass spectrometry. Compared to the mass of the compound (X), the mass of the compound contained in one peak was 40 smaller and the mass of the compound contained in the other peak was 54 smaller.
[0207]
(9) Metabolism of compound (XI) by protein (A1) of the present invention
Culture of Escherichia coli JM109 / pKSN657F, preparation of a cell suspension, and suspension of the cell according to the method described in Example 41 (6) except that compound (XI) is used instead of compound (VI). Was shake-cultured with compound (XI) added thereto, sample preparation from a cell suspension, and HPLC analysis of the sample were performed. Compared with the concentration of compound (XI) detected from the ethyl acetate layer prepared from the cell suspension 0 hour after the start of shaking, acetic acid prepared from the cell suspension 1 day after the start of shaking The concentration of compound (XI) detected from the ethyl layer was low. Also, two kinds of peaks not detected in the ethyl acetate layer prepared from the cell suspension 0 hour after the start of shaking were detected from the ethyl acetate layer prepared from the cell suspension 1 day after the start of shaking. Was done. The compound contained in the peak was subjected to mass spectrometry. The mass of the compound contained in one peak was smaller by 14 and the mass of the compound contained in the other peak was 16 larger than the mass of the compound (XI).
[0208]
Example 42 Metabolism of Compounds by Protein (A11) of the Present Invention
(1) Metabolism of compound (X) by protein (A11) of the present invention
Escherichia coli JM109 / pKSN849AF or JM109 / pKSN2 was cultured overnight at 37 ° C. in 10 ml of TB medium containing 50 μg / ml of ampicillin. 1 ml of the obtained culture solution was inoculated into 100 ml of TB medium containing 50 μg / ml of ampicillin and cultured at 26 ° C. When the OD660 reached about 0.5, the final concentration was adjusted to 500 μM. -Aminolevulinic acid was added and the culture was continued. Thirty minutes later, IPTG was added to a final concentration of 1 mM, and the cells were further cultured for 18 hours.
The cells were collected from each culture, washed with a 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.5), and suspended in 10 ml of a 0.1 M Tris-HCl buffer containing 1% glucose. Compound (X) was added to the obtained cell suspension to a final concentration of 25 ppm, followed by shaking culture at 30 ° C. 0 hours after the start of the shaking and 4 days later, 2 ml of the cell suspension was collected, 50 μl of 2N hydrochloric acid was added, and this was extracted with 2 ml of ethyl acetate. The obtained ethyl acetate layer was analyzed by HPLC under analysis condition 1. Compound detected from the ethyl acetate layer prepared from the JM109 / pKSN849AF cell suspension, as compared with the concentration of compound (X) detected from the ethyl acetate layer prepared from the JM109 / pKSN2 cell suspension. The concentration of (X) was low. From the ethyl acetate layer prepared from the JM109 / pKSN849AF cell suspension, three types of peaks not detected in the ethyl acetate layer prepared from the JM109 / pKSN2 cell suspension were detected. Among these three peaks, the elution time of one peak by HPLC coincided with the elution time of the peak of a compound having a mass 40 smaller than that of the compound (X) detected in Example 41 (8). The elution time of the other peak by HPLC coincided with the elution time of the peak of the compound having a mass 54 smaller than that of the compound (X) detected in Example 41 (8).
[0209]
After 1 ml of the ethyl acetate layer prepared from the above-mentioned JM109 / pKSN2 cell suspension and 1 ml of the ethyl acetate layer prepared from the JM109 / pKSN849AF cell suspension were each dried under reduced pressure, the residue was concentrated to 1 ml. [Hereinafter, the lysate derived from the ethyl acetate layer prepared from the JM109 / pKSN2 cell suspension was referred to as (X) control solution (A11). The lysate derived from the ethyl acetate layer prepared from the JM109 / pKSN849AF cell suspension is referred to as (X) metabolite (A11). ].
(X) 20 μl of a 128-fold dilution of the metabolite (A11) and 60 μl of the plastid fraction were mixed, and 20 μl of a PPO substrate solution was added under dark conditions, followed by incubation at 30 ° C. for 1.5 hours. Also, a reaction solution was prepared by adding 20 μl of a 128-fold diluted solution of (X) control solution (A11) instead of 20 μl of a 128-fold diluted solution of (X) metabolite (A11), and a PPO substrate solution was similarly added. And kept warm. Each reaction solution after the heat retention was treated in the same manner as in Example 41 (2) and subjected to reverse phase HPLC analysis under the above analysis conditions 2 to measure the amount of PPIX. The amount of PPIX in the reaction solution to which (X) the metabolite (A11) was added was larger than the amount of PPIX in the reaction solution to which (X) the control solution (A11) was added.
[0210]
(2) Metabolism of compound (XII) by protein (A11) of the present invention
The procedure described in Example 41 (2) was followed, except that 20 μl of the supernatant fraction recovered in Example 32 (2) was used instead of 20 μl of the supernatant fraction recovered in Example 4 (2). The reaction solution was prepared and kept warm. Each reaction solution after the incubation was extracted with ethyl acetate in the same manner as in Example 41 (2), and the obtained residue was dissolved in 100 μl of a 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). The obtained lysate [hereinafter, the lysate derived from the reaction solution containing the A component, the B component, the C component, and 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 32 (2) was subjected to (XII) metabolite (A11) It is written. The lysate derived from the reaction solution which does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction recovered in Example 32 (2) is referred to as (XII) control solution (A11). ] Was analyzed by HPLC under the above analysis conditions 1. (XII) The concentration of the compound (XII) detected from the metabolite (A11) was lower than that of the compound (XII) detected from the control solution (A11). Further, a peak not detected in the (XII) control solution (A11) was detected from the (XII) metabolite (A11). The elution time of this peak by HPLC coincided with the elution time of the peak of the compound having a mass 14 smaller than the compound (XII), which was detected from the metabolite (A1) of (XII) in Example 41 (2).
[0211]
(3) Metabolism of compound (XIII) by protein (A11) of the present invention
According to the method described in Example 41 (3), except that 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 32 (2) is used instead of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 4 (2) The reaction solution was prepared and kept warm. Each reaction solution after keeping the temperature was extracted with ethyl acetate in the same manner as in Example 41 (2), and the obtained residue was dissolved in 100 μl of dimethyl sulfoxide. The obtained lysate [hereinafter, the lysate derived from the reaction solution containing the A component, the B component, the C component and 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 32 (2) was subjected to (XIII) metabolite (A11) It is written. The lysate derived from the reaction solution which does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 32 (2) is referred to as (XIII) control solution (A11). ] Was analyzed by HPLC under the above analysis conditions 1. (XIII) The concentration of the compound (XIII) detected from the (XIII) metabolite (A11) was lower than the concentration of the compound (XIII) detected from the control solution (A11). In addition, a peak not detected in the (XIII) control solution (A11) was detected from the (XIII) metabolite (A11). The elution time of this peak by HPLC coincided with the elution time of the peak of the compound having a mass 14 smaller than the compound (XIII), which was detected from the (XIII) metabolite (A1) in Example 41 (3).
[0212]
(4) Metabolism of compound (XVI) by the protein (A11) of the present invention
According to the method described in Example 41 (4), except that 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 32 (2) was used instead of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 4 (2). A reaction solution was prepared and kept warm. After the incubation, each reaction solution was extracted with ethyl acetate in the same manner as in Example 41 (2), and the obtained residue was dissolved in 200 μl of a 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). The obtained lysate [hereinafter, the lysate derived from the reaction solution containing the A component, the B component, the C component and 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 32 (2) was used as a (XVI) metabolite (A11) It is written. The lysate derived from the reaction solution which does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 32 (2) is referred to as (XVI) control solution (A11). ] Was analyzed by HPLC under the above analysis conditions 1. (XVI) The concentration of the compound (XVI) detected from the (XVI) metabolite (A11) was lower than the concentration of the compound (XVI) detected from the control solution (A11). Further, a peak not detected in the (XVI) control solution (A11) was detected from the (XVI) metabolite (A11). The elution time of this peak by HPLC coincided with the elution time of the peak detected in (XVI) metabolite (A1) and not detected in (XVI) control solution (A1) in Example 41 (4). .
[0213]
(5) Metabolism of compound (XVII) by protein (A11) of the present invention
According to the method described in Example 41 (5), except that 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 32 (2) was used instead of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 4 (2). A reaction solution was prepared and kept warm. After the incubation, each reaction solution was extracted with ethyl acetate in the same manner as in Example 41 (2), and the obtained residue was dissolved in 200 μl of a 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). The obtained lysate [hereinafter, the lysate derived from the reaction solution containing the A component, the B component, the C component and 20 μl of the supernatant fraction recovered in Example 32 (2) was subjected to (XVII) metabolite (A11) It is written. The lysate derived from the reaction solution which does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction recovered in Example 32 (2) is referred to as (XVII) control solution (A11). ) Was analyzed by HPLC under the above analysis conditions 1. (XVII) The concentration of the compound (XVII) detected from the (XVII) metabolite (A11) was lower than the concentration of the compound (XVII) detected from the control solution (A11). In addition, a peak that was not detected in the (XVII) control solution (A11) was detected from the (XVII) metabolite (A11). The elution time of this peak by HPLC coincided with the elution time of the peak detected in (XVII) metabolite (A1) and not detected in (XVII) control solution (A1) in Example 41 (5). .
[0214]
Example 43 Metabolism of Compounds of the Present Invention (A2), (A3), (A12), (A13), (A14) or (A15), or the Present Protein (A10)
(1) Metabolism of compound (XII) by protein (A2) of the present invention
According to the method described in Example 41 (2), except that 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 7 (2) is used instead of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 4 (2) The reaction solution was prepared and kept warm. Each reaction solution after the incubation was extracted with ethyl acetate in the same manner as in Example 41 (2), and the obtained residue was dissolved in 100 μl of a 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). The obtained lysate [hereinafter, the lysate derived from the reaction solution containing A component, B component, C component and 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 7 (2) was subjected to (XII) metabolite (A2) It is written. The lysate derived from the reaction solution that does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 7 (2) is referred to as (XII) control solution (A2). ] Was analyzed by HPLC under the above analysis conditions 1. (XII) The concentration of the compound (XII) detected from the (XII) metabolite (A2) was lower than the concentration of the compound (XII) detected from the control solution (A2). In addition, a peak that was not detected in the (XII) control solution (A2) was detected from the (XII) metabolite solution (A2). The elution time of this peak by HPLC coincided with the elution time of the peak of the compound having a mass 14 smaller than the compound (XII), which was detected from the metabolite (A1) of (XII) in Example 41 (2).
[0215]
(2) Metabolism of compound (XII) by protein (A3) of the present invention
According to the method described in Example 41 (2), except that 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 12 (2) is used instead of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 4 (2) The reaction solution was prepared and kept warm. Each reaction solution after the incubation was extracted with ethyl acetate in the same manner as in Example 41 (2), and the obtained residue was dissolved in 100 μl of a 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). The obtained lysate [hereinafter, the lysate derived from the reaction solution containing the A component, the B component, the C component and 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 12 (2) was subjected to (XII) metabolite (A3) It is written. The lysate derived from the reaction solution that does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 12 (2) is referred to as (XII) control solution (A3). ] Was analyzed by HPLC under the above analysis conditions 1. (XII) The concentration of compound (XII) detected from (XII) metabolite (A3) was lower than the concentration of compound (XII) detected from control solution (A3). Further, a peak not detected in the (XII) control solution (A3) was detected from the (XII) metabolite (A3). The elution time of this peak by HPLC coincided with the elution time of the peak of the compound having a mass 14 smaller than the compound (XII), which was detected from the metabolite (A1) of (XII) in Example 41 (2).
[0216]
(3) Metabolism of compound (XII) by the present protein (A10)
According to the method described in Example 41 (2), except that 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 10 (2) is used instead of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 4 (2) The reaction solution was prepared and kept warm. Each reaction solution after the incubation was extracted with ethyl acetate in the same manner as in Example 41 (2), and the obtained residue was dissolved in 100 μl of a 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). The obtained lysate [hereinafter, the lysate derived from the reaction solution containing A component, B component, C component and 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 10 (2) was subjected to (XII) metabolite (A10) It is written. The lysate derived from the reaction solution which does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 12 (0) is referred to as (XII) control solution (A10). ] Was analyzed by HPLC under the above analysis conditions 1. (XII) The concentration of compound (XII) detected from (XII) metabolite (A10) was lower than the concentration of compound (XII) detected from control solution (A10). In addition, a peak that was not detected in the (XII) control solution (A10) was detected from the (XII) metabolite solution (A10). The elution time of this peak by HPLC coincided with the elution time of the peak of the compound having a mass 14 smaller than the compound (XII), which was detected from the metabolite (A1) of (XII) in Example 41 (2).
[0219]
(4) Metabolism of compound (XII) by the protein (A12) of the present invention
According to the method described in Example 41 (2), except that 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 34 (2) is used instead of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 4 (2) The reaction solution was prepared and kept warm. Each reaction solution after the incubation was extracted with ethyl acetate in the same manner as in Example 41 (2), and the obtained residue was dissolved in 100 μl of a 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). The obtained lysate [hereinafter, the lysate derived from the reaction solution containing A component, B component, C component and 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 34 (2) was subjected to (XII) metabolite (A12) It is written. The lysate derived from the reaction solution that does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 34 (2) is referred to as (XII) control solution (A12). ] Was analyzed by HPLC under the above analysis conditions 1. (XII) The concentration of compound (XII) detected from (XII) metabolite (A12) was lower than the concentration of compound (XII) detected from control solution (A12). Further, a peak not detected in the (XII) control solution (A12) was detected from the (XII) metabolite solution (A12). The elution time of this peak by HPLC coincided with the elution time of the peak of the compound having a mass 14 smaller than the compound (XII), which was detected from the metabolite (A1) of (XII) in Example 41 (2).
[0218]
(5) Metabolism of compound (XII) by protein (A13) of the present invention
The procedure described in Example 41 (2) was followed, except that 20 μl of the supernatant fraction recovered in Example 36 (2) was used instead of 20 μl of the supernatant fraction recovered in Example 4 (2). The reaction solution was prepared and kept warm. Each reaction solution after the incubation was extracted with ethyl acetate in the same manner as in Example 41 (2), and the obtained residue was dissolved in 100 μl of a 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). The obtained lysate [hereinafter, the lysate derived from the reaction solution containing the A component, the B component, the C component, and 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 36 (2) was subjected to (XII) metabolite (A13) It is written. The lysate derived from the reaction solution that does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 36 (2) is referred to as (XII) control solution (A13). ] Was analyzed by HPLC under the above analysis conditions 1. (XII) The concentration of compound (XII) detected from (XII) metabolite (A13) was lower than the concentration of compound (XII) detected from control solution (A13). Further, a peak not detected in the (XII) control solution (A2) was detected from the (XII) metabolite (A2). The elution time of this peak by HPLC coincided with the elution time of the peak of the compound having a mass 14 smaller than the compound (XII), which was detected from the metabolite (A1) of (XII) in Example 41 (2).
[0219]
(6) Metabolism of compound (XII) by protein (A14) of the present invention
According to the method described in Example 41 (2), except that 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 38 (2) is used instead of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 4 (2) The reaction solution was prepared and kept warm. Each reaction solution after the incubation was extracted with ethyl acetate in the same manner as in Example 41 (2), and the obtained residue was dissolved in 100 μl of a 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). The obtained lysate [hereinafter, the lysate derived from the reaction solution containing A component, B component, C component and 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 38 (2) was subjected to (XII) metabolite (A14) It is written. The lysate derived from the reaction solution that does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 38 (2) is referred to as (XII) control solution (A14). ] Was analyzed by HPLC under the above analysis conditions 1. (XII) The concentration of the compound (XII) detected from the metabolite (A14) was lower than the concentration of the compound (XII) detected from the control solution (A14). In addition, a peak that was not detected by the (XII) control (A14) was detected from the (XII) metabolite (A14). The elution time of this peak by HPLC coincided with the elution time of the peak of the compound having a mass 14 smaller than the compound (XII), which was detected from the metabolite (A1) of (XII) in Example 41 (2).
[0220]
(7) Metabolism of compound (XII) by protein (A15) of the present invention
According to the method described in Example 41 (2), except that 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 40 (2) is used instead of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 4 (2) The reaction solution was prepared and kept warm. Each reaction solution after the incubation was extracted with ethyl acetate in the same manner as in Example 41 (2), and the obtained residue was dissolved in 100 μl of a 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). The obtained lysate [hereinafter, the lysate derived from the reaction solution containing the A component, the B component, the C component, and 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 40 (2) was subjected to (XII) metabolite (A15) It is written. The lysate derived from the reaction solution that does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 40 (2) is referred to as (XII) control solution (A15). ] Was analyzed by HPLC under the above analysis conditions 1. (XII) The concentration of the compound (XII) detected from the metabolite (A15) was lower than the concentration of the compound (XII) detected from the control solution (A15). Further, a peak not detected in the (XII) control solution (A15) was detected from the (XII) metabolite (A15). The elution time of this peak by HPLC coincided with the elution time of the peak of the compound having a mass 14 smaller than the compound (XII), which was detected from the metabolite (A1) of (XII) in Example 41 (2).
[0221]
(8) Metabolism of compound (XIII) by protein (A2) of the present invention
According to the method described in Example 41 (3), except that 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 7 (2) is used instead of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 4 (2) The reaction solution was prepared and kept warm. Each reaction solution after keeping the temperature was extracted with ethyl acetate in the same manner as in Example 41 (2), and the obtained residue was dissolved in 100 μl of dimethyl sulfoxide. The obtained lysate [hereinafter, the lysate derived from the reaction solution containing the A component, the B component, the C component, and 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 7 (2) is subjected to (XIII) metabolite (A2) It is written. The lysate derived from the reaction solution that does not contain the A component, the B component, the C component, and the supernatant fraction collected in Example 7 (2) is referred to as (XIII) control solution (A2). ] Was analyzed by HPLC under the above analysis conditions 1. (XIII) The concentration of compound (XIII) detected from (XIII) metabolite (A2) was lower than the concentration of compound (XIII) detected from control solution (A2). Further, a peak not detected in the (XIII) control solution (A2) was detected from the (XIII) metabolite (A2). The elution time of this peak by HPLC coincided with the elution time of the peak of the compound having a mass 14 smaller than the compound (XIII), which was detected from the (XIII) metabolite (A1) in Example 41 (3).
[0222]
(9) Metabolism of compound (XIII) by protein (A3) of the present invention
According to the method described in Example 41 (3), except that 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 12 (2) is used instead of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 4 (2) A reaction solution was prepared and kept warm. Each reaction solution after keeping the temperature was extracted with ethyl acetate in the same manner as in Example 41 (2), and the obtained residue was dissolved in 100 μl of dimethyl sulfoxide. The obtained lysate [hereinafter, the lysate derived from the reaction solution containing 20 μl of the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 12 (2) was subjected to (XIII) metabolite (A3) It is written. The lysate derived from the reaction solution that does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 12 (2) is referred to as (XIII) control solution (A3). ] Was analyzed by HPLC under the above analysis conditions 1. (XIII) The concentration of the compound (XIII) detected from the (XIII) metabolite (A3) was lower than the concentration of the compound (XIII) detected from the control solution (A3). In addition, a peak not detected in the (XIII) control solution (A3) was detected from the (XIII) metabolite (A3). The elution time of this peak by HPLC coincided with the elution time of the peak of the compound having a mass 14 smaller than the compound (XIII), which was detected from the (XIII) metabolite (A1) in Example 41 (3).
[0223]
(10) Metabolism of compound (XIII) by the present protein (A10)
According to the method described in Example 41 (3), except that 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 10 (2) is used instead of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 4 (2) The reaction solution was prepared and kept warm. Each reaction solution after keeping the temperature was extracted with ethyl acetate in the same manner as in Example 41 (2), and the obtained residue was dissolved in 100 μl of dimethyl sulfoxide. The obtained lysate [hereinafter, the lysate derived from the reaction solution containing the A component, the B component, the C component, and 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 10 (2) was subjected to (XIII) metabolite (A10) It is written. The lysate derived from the reaction solution which does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 10 (2) is referred to as (XIII) control solution (A10). ] Was analyzed by HPLC under the above analysis conditions 1. (XIII) The concentration of compound (XIII) detected from (XIII) metabolite (A10) was lower than the concentration of compound (XIII) detected from control solution (A10). In addition, a peak not detected in the (XIII) control solution (A10) was detected from the (XIII) metabolite (A10). The elution time of this peak by HPLC coincided with the elution time of the peak of the compound having a mass 14 smaller than the compound (XIII), which was detected from the (XIII) metabolite (A1) in Example 41 (3).
[0224]
(11) Metabolism of compound (XIII) by protein (A12) of the present invention
According to the method described in Example 41 (3), except that 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 34 (2) is used instead of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 4 (2) The reaction solution was prepared and kept warm. Each reaction solution after keeping the temperature was extracted with ethyl acetate in the same manner as in Example 41 (2), and the obtained residue was dissolved in 100 μl of dimethyl sulfoxide. The obtained lysate [hereinafter, the lysate derived from the reaction solution containing the A component, the B component, the C component, and 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 34 (2) was subjected to (XIII) metabolite (A12) It is written. The lysate derived from the reaction solution which does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 34 (2) is referred to as (XIII) control solution (A12). ] Was analyzed by HPLC under the above analysis conditions 1. (XIII) The concentration of the compound (XIII) detected from the (XIII) metabolite (A12) was lower than the concentration of the compound (XIII) detected from the control solution (A12). Further, from XIII) metabolite (A12), a peak not detected in (XIII) control solution (A12) was detected. The elution time of this peak by HPLC coincided with the elution time of the peak of the compound having a mass 14 smaller than that of the compound (XIII), which was detected in Example 41 (3) by (XIII) metabolite (A1) 5.
[0225]
(12) Metabolism of compound (XIII) by protein (A13) of the present invention
According to the method described in Example 41 (3), except that 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 36 (2) is used instead of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 4 (2) The reaction solution was prepared and kept warm. Each reaction solution after keeping the temperature was extracted with ethyl acetate in the same manner as in Example 41 (2), and the obtained residue was dissolved in 100 μl of dimethyl sulfoxide. The obtained lysate [hereinafter, the lysate derived from the reaction solution containing A component, B component, C component and 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 36 (2) was subjected to (XIII) metabolite (A13) It is written. The lysate derived from the reaction solution that does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 36 (2) is referred to as (XIII) control solution (A13). ] Was analyzed by HPLC under the above analysis conditions 1. (XIII) The concentration of the compound (XIII) detected from the (XIII) metabolite (A13) was lower than the concentration of the compound (XIII) detected from the control solution (A13). In addition, a peak not detected in the (XIII) control solution (A13) was detected from the (XIII) metabolite (A13). The elution time of this peak by HPLC coincided with the elution time of the peak of the compound having a mass 14 smaller than the compound (XIII), which was detected from the (XIII) metabolite (A1) in Example 41 (3).
[0226]
(13) Metabolism of compound (XIII) by protein (A14) of the present invention
The procedure described in Example 41 (3) was followed, except that 20 μl of the supernatant fraction recovered in Example 38 (2) was used instead of 20 μl of the supernatant fraction recovered in Example 4 (2). A reaction solution was prepared and kept warm. Each reaction solution after keeping the temperature was extracted with ethyl acetate in the same manner as in Example 41 (2), and the obtained residue was dissolved in 100 μl of dimethyl sulfoxide. The obtained lysate [hereinafter, the lysate derived from the reaction solution containing the A component, the B component, the C component, and 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 38 (2) was subjected to (XIII) metabolite (A14) It is written. The lysate derived from the reaction solution that does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 38 (2) is referred to as (XIII) control solution (A14). ] Was analyzed by HPLC under the above analysis conditions 1. (XIII) The concentration of compound (XIII) detected from (XIII) metabolite (A14) was lower than the concentration of compound (XIII) detected from control solution (A14). In addition, a peak that was not detected in the (XIII) control solution (A14) was detected from the (XIII) metabolite (A14). The elution time of this peak by HPLC coincided with the elution time of the peak of the compound having a mass 14 smaller than the compound (XIII), which was detected from the (XIII) metabolite (A1) in Example 41 (3).
[0227]
(14) Metabolism of compound (XIII) by protein (A15) of the present invention
The procedure described in Example 41 (3) was followed, except that 20 μl of the supernatant fraction recovered in Example 40 (2) was used instead of 20 μl of the supernatant fraction recovered in Example 4 (2). The reaction solution was prepared and kept warm. Each reaction solution after keeping the temperature was extracted with ethyl acetate in the same manner as in Example 41 (2), and the obtained residue was dissolved in 100 μl of dimethyl sulfoxide. The obtained lysate [hereinafter, the lysate derived from the reaction solution containing the A component, the B component, the C component and 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 40 (2) was subjected to (XIII) metabolite (A15) It is written. The lysate derived from the reaction solution that does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 40 (2) is referred to as (XIII) control solution (A15). ] Was analyzed by HPLC under the above analysis conditions 1. (XIII) The concentration of the compound (XIII) detected from the (XIII) metabolite (A15) was lower than the concentration of the compound (XIII) detected from the control solution (A15). In addition, a peak not detected in the (XIII) control solution (A15) was detected from the XIII) metabolite solution (A15). The elution time of this peak by HPLC coincided with the elution time of the peak of the compound having a mass 14 smaller than the compound (XIII), which was detected from the (XIII) metabolite (A1) in Example 41 (3).
[0228]
Example 44: Antibody of the Present Invention (A) Recognizing Protein of the Present Invention (A1) [Hereinafter referred to as antibody of the present invention (A1). Preparation of
(1) Preparation of Escherichia coli extract expressing protein (A1) of the present invention
According to the method described in Example 4 (2), Escherichia coli JM109 / pKSN657F expressing the protein (A1) of the present invention was precultured overnight, and then cultured in 1 L of TB medium containing 50 μg / ml ampicillin. After the cells were collected from the culture and disrupted, a supernatant fraction (Escherichia coli extract pKSN657F) was prepared from the obtained disrupted cells.
(2) Purification of the protein (A1) of the present invention
The supernatant fraction (Escherichia coli extract pKSN657F) obtained in Example 44 (1) was subjected to a HiLoad 26/10 Q Q Sepharose HP column, and then to a Bio-Scale Ceramic, according to the method described in Example 2 (4). The protein (A1) of the present invention was purified by applying to a hydroxyapatite, {Type I} column {CHT10-1} column. The purified fraction was subjected to SDS-10% to 20% PAGE analysis to confirm that the fraction contained only the protein of the present invention (A1).
(3) Preparation of the antibody (A1) of the present invention
The protein of the present invention (A1) purified in Example 44 (2) was dissolved in a 0.05 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) to a concentration of 1 mg / ml. To 2 ml of the obtained solution, RAS [MPL (Monophosphoryl Lipid A) + TDM (Synthetic Trehalose Dicolony mycolate) + CWS (Cell Wall Skelton), which is pre-incubated at 42 ° C. to 43 ° C .; Mixed. The resulting mixture was administered at a rate of 1 ml per New Zealand White rabbit (female, 14 weeks old, average 2.4 kg). The breakdown was subcutaneous administration of 100 μl in 10 places on the back. Three and five weeks later, each dose of 投 与 of the initial dose was similarly administered. During this time, a small amount of blood was sampled from the rabbit ear vein and the antibody titer was measured. Since the antibody titer increased after the third administration, whole blood was collected from the carotid artery of the immunized rabbit approximately two weeks after the third administration. The obtained blood is placed in a Separapit tube (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.), incubated at 37 ° C. for 2 hours, and then centrifuged (3000 rpm, 20 min, room temperature) to collect the supernatant, thereby obtaining an antiserum [the present invention. Antibody (A1). ] Was obtained.
[0229]
Example 45 Detection of the Present Protein Using the Antibody (A1) of the Present Invention and Detection of Cells Expressing the Present Protein
Various E. coli extracts were subjected to immunoblotting using the antibody (A1) of the present invention obtained in Example 44. Escherichia coli extract pKSN657F obtained in Example 4 (2) (containing about 0.78 mg of protein containing about 0.5 pmol of the protein of the present invention (A1)), Escherichia coli obtained in Example 4 (2) Extract pKSN2 (containing about 0.78 mg of protein), Escherichia coli extract pKSN923F obtained in Example 7 (2) (containing about 2 pmol of protein (A2) of the present invention) obtained in Example 12 (2) The obtained E. coli extract pKSN671F (containing about 2 pmol of the protein (A3) of the present invention), the E. coli extract pKSN646F obtained in Example 27 (2) (containing about 2 pmol of the protein (A4) of the present invention), Examples E. coli extract pKSN11796F (containing about 2 pmol of the present protein (A10)) obtained in 10 (2), E. coli extract pKSNSCA obtained in Example 14 (2) ( 2 pmol of the present protein (A9)), the E. coli extract pKSN849AF obtained in Example 32 (2) (containing about 2 pmol of the present protein (A11)), and the E. coli obtained in Example 34 (2) Extract pKSN1618F (containing about 2 pmol of the protein (A12) of the present invention), Escherichia coli extract pKSN474F obtained in Example 36 (2) (containing about 2 pmol of the protein (A13) of the present invention), Example 38 (2) ), PKSN1491AF (containing about 2 pmol of the protein of the present invention (A14)), and Escherichia coli extract pKSN1555AF obtained in Example 40 (2) (containing about 2 pmol of the protein (A15) of the present invention) Was electrophoresed on an SDS polyacrylamide gel (40 mA, 1 hour). This gel is overlaid with a PVDF membrane, and immersed in a transfer buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 10% methanol) and treated at 4 ° C., 30 V for 2 hours using a blotting device manufactured by BIO-RAD. As a result, the proteins in the gel were transferred to the PVDF membrane. The obtained PVDF membrane was washed with a TBS + Tween20 solution (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 200 mM NaCl, 0.05% Tween20) and then incubated in a TBS + Tween20 solution containing 3% BSA for 30 minutes. Then, it was allowed to react with the above antiserum diluted 30,000-fold with a TBSＴ + Tween20 solution containing 3% BSA for 30 minutes. After the reaction, the PVDF membrane was washed twice with a TBS + Tween20 solution, and then diluted 3000 times with a TBS + Tween20 solution containing 3% BSA, and an alkaline phosphatase-labeled anti-rabbit IgG goat antiserum (Santa CruzＳBiotechnology). The reaction was performed for 30 minutes. After the reaction, the PVDF membrane was washed twice with TBS + Tween20, and then immersed in an NBT-BCIP solution (manufactured by Sigma). The present protein (A1), (A2), (A3), (A4), (A11), (A12), (A13), (A14) and (A15), and the present proteins (A9) and A10) Color development of the corresponding bands was detected. No color band was detected in the sample of the E. coli extract pKSN2 (containing about 0.78 mg of protein) obtained in Example 4 (2).
Example 46 DNA of the present invention (A1) whose codon usage was adjusted for expression in soybean [hereinafter referred to as DNA of the present invention (A1) S] Production and expression
(1) Preparation of DNA (A1) S of the present invention
Using a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 192 and a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 213, PCR was carried out using Pyrobest DNA DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo) according to the attached instruction manual. Using a part of the obtained PCR product as a template, PCR was similarly performed using a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 191 and a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 212. Further, using a part of this PCR product as a template, PCR was carried out in the same manner using a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 190 and a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 211, and the obtained reaction solution was obtained. Was designated as reaction solution 1.
Using a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 195 and a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 210, PCR was carried out using Pyrobest DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo) according to the attached instruction manual. Using a part of the obtained PCR product as a template, PCR was performed in the same manner using a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 194 and a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 209. Furthermore, PCR was performed in the same manner using a part of this PCR product as a template and a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 193 and a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 208. Was designated as reaction solution 2.
Using a primer having the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 198 and a primer having the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 207, PCR was performed using Pyrobest DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo) according to the attached instruction manual. Using a part of the obtained PCR product as a template, PCR was similarly performed using a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 197 and a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 206. Furthermore, PCR was performed in the same manner using a part of this PCR product as a template and a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 196 and a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 205, and the reaction solution obtained. Was designated as reaction solution 3.
Using a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 201 and a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 204, PCR was carried out using Pyrobest DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo) according to the attached instruction manual. Using a part of the obtained PCR product as a template, PCR was performed in the same manner using a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 200 and a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 203. Further, PCR was performed in the same manner using a part of this PCR product as a template and a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 199 and a primer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 202, and the reaction solution obtained. Was designated as reaction solution 4.
The reaction solutions 1 to 4 thus obtained are mixed, and a part thereof is used as a template, using a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 190 and a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 202 in Pyrobest {DNA {polymerase} ( (Takara Shuzo) according to the attached instruction manual. The base sequence of the amplified DNA was confirmed, and the base sequence 5′-cat-3 ′ was located 5 ′ upstream of the base sequence represented by SEQ ID NO: 214, and the base sequence 5′-aagcttt-3 was located downstream of the 3 ′ end. 'Were obtained having DNAs each having a sequence formed by ligation.
The codon usage (GC content 70.58%) of the DNA (A1) of the present invention having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 is shown in Tables 22 and 23, and the codon usage of soybean [GC content 46.12%. The DNA of the present invention (A1) having the base sequence represented by SEQ ID NO: 214 in Tables 24 and 25) is described in Kazusa DNA Research Institute codon {usage} database} (http://www.kazusa.or.jp/codon/)}. Are shown in Tables 26 and 27, respectively.
[0230]
[Table 22]

[0231]
[Table 23]

[0232]
[Table 24]

[0233]
[Table 25]

[0234]
[Table 26]

[0235]
[Table 27]

(2) Preparation of transformed Escherichia coli having the DNA (A1) S of the present invention
The DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 214 obtained in Example 46 (1) was digested with restriction enzymes NdeI and HindIII. By ligating the DNA with the plasmid pKSN2 digested with NdeI and HindIII, a plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 214 inserted between the NdeI and HindIII sites of pKSN2 (hereinafter, referred to as a plasmid) pKSN657soy). This plasmid was introduced into Escherichia coli JM109, and the obtained Escherichia coli transformant was designated as JM109 / pKSN657soy.
(3) Expression of the protein (A1) of the present invention in Escherichia coli and recovery of the protein
Escherichia coli JM109 / pKSN657soy obtained in Example 46 (2) and Escherichia coli JM109 / pKSN657 obtained in Example 4 (1) were cultured in the same manner as in Example 4 (2), and the cells were collected. Then, a cell lysate was prepared. From the obtained crushed liquid, a supernatant fraction (hereinafter, the supernatant fraction obtained from Escherichia coli JM109 / pKSN657soy was purified from Escherichia coli extract pKSN657soy and Escherichia coli JM109 / pKSN657 by the method described in Example 4 (2). The obtained supernatant fraction was referred to as an Escherichia coli extract pKSN657). The amount of P450 per protein amount contained in the E. coli extract pKSN657soy was larger than the amount of P450 per protein amount contained in the E. coli extract pKSN657.
[0236]
Example 47 Introduction of DNA (A1) S of the Present Invention into Plant
(1) Construction of chloroplast expression plasmid for direct introduction having DNA (A1) S of the present invention (1)
As a plasmid for introducing the DNA (A1) S of the present invention into a plant by the particle gun method, the codon frame does not change immediately under the chloroplast transit peptide coding sequence of the RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack). A plasmid containing a chimeric DNA to which the DNA (A1) S of the present invention was linked was constructed.
First, PCR was performed using pKSN657soy obtained in Example 46 (2) as a template and an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 394 and an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 395 as primers. A DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 214 was amplified. PCR was performed using KOD-plus (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) once at 94 ° C. for 2 minutes, then at 94 ° C. for 30 seconds, then at 50 ° C. for 30 seconds, and then at 68 ° C. for 60 seconds. This was carried out 30 times with the heat retention as one cycle, and finally the heat treatment was carried out once at 68 ° C. for 3 minutes. The amplified DNA was recovered and purified by using MagExtractor-PCR & Gel-Clean up- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) according to the attached manual. After the purified DNA was digested with restriction enzymes EcoT22I and SacI, a DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 214 was recovered. After digesting the plasmid pUCrSt657 obtained in (2) of Example 16 with the restriction enzymes EcoT22I and SacI, the chloroplast transit peptide coding sequence of the RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack) and the base derived from the vector plasmid pUC19 About 2.9 kbp of DNA containing the sequence was isolated. By ligating the obtained DNA with a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 214, a codon immediately below the chloroplast transit peptide coding sequence of the RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack) was obtained. A plasmid pUCrSt657soy (FIG. 48) containing a chimeric DNA obtained by linking the DNA (A1) S of the present invention without changing the frame was obtained.
The resulting plasmid pUCrSt657soy was digested with restriction enzymes BamHI and SacI, and a DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 214 was isolated. The DNA was inserted between the BglII cleavage site and the SacI cleavage site of the plasmid pNdG6-ΔT obtained in Example 16 (2) to obtain a chloroplast of the small RuBPC subunit of soybean (cv. @Jack). A plasmid pSUM-NdG6-rSt-657soy (FIG. 49) was obtained in which the chimeric DNA obtained by linking the DNA immediately below the transit peptide coding sequence without changing the codon frame was linked downstream of the CR16G6 promoter.
Next, the plasmid was introduced into competent cells of Escherichia coli DH5α strain (Takara Shuzo), and ampicillin-resistant strains were selected. The nucleotide sequence of the plasmid contained in the selected ampicillin-resistant strain was determined using BigDye \ Terminator \ Cycle \ Sequencing \ Ready \ Reaction \ kit \ v3.0 (manufactured by PE Applied Biosystems) and DNA Sequencer 3100 (manufactured by PE Applied Biosystems). As a result, it was confirmed that the plasmid pSUM-NdG6-rSt-657soy had the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 214.
(2) Construction of chloroplast expression plasmid for direct introduction having DNA (A1) S of the present invention (2)
As a plasmid for introducing the DNA (A1) S of the present invention into a plant by a particle gun method, a chloroplast transit peptide of the RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack) and a base encoding 12 amino acids of the mature protein subsequent thereto A plasmid containing a chimeric DNA in which the DNA (A1) S of the present invention was linked without changing the codon frame immediately below the sequence was constructed. First, using pKSN657soy obtained in Example 46 as a template, PCR was performed using, as primers, an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 396 and an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 395 DNA containing the base sequence represented by No. 214 was amplified. PCR was performed using KOD-plus (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) once at 94 ° C. for 2 minutes, then at 94 ° C. for 30 seconds, then at 46 ° C. for 30 seconds, and then at 68 ° C. for 60 seconds. This was carried out 25 times with the heat retention as one cycle, and finally one heat treatment at 68 ° C. for 3 minutes. The amplified DNA was recovered and purified by using MagExtractor-PCR & Gel-Clean up- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) according to the attached manual. The obtained DNA was digested with a restriction enzyme SacI, and a DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 214 was recovered.
Next, the plasmid pKFrSt12-657 obtained in Example 16 (3) was digested with a restriction enzyme BspHI, and treated with TaKaRa @ BKLKit (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) in accordance with the attached manual to make the DNA blunt. And phosphorylation of the 5 'end. Next, the DNA was digested with the restriction enzyme SacI, and then DNA derived from the plasmid pKFrSt12 was isolated. This DNA was ligated with a SacI-digested DNA containing the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 214 to obtain a chloroplast transit peptide of the RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack) followed by a mature protein A plasmid pKFrSt12-657soy (FIG. 50) containing a chimeric DNA in which the DNA (A1) S of the present invention is linked without changing the codon frame immediately below the base sequence encoding 12 amino acids was obtained.
The obtained plasmid pKFrSt12-657soy was digested with restriction enzymes BamHI and SacI, and a DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 214 was isolated. The DNA was inserted between the BglII cleavage site and the SacI cleavage site of the plasmid pNdG6-ΔT obtained in Example 16 (2) to obtain a chloroplast of the small RuBPC subunit of soybean (cv. @Jack). A plasmid pSUM-NdG6-rSt12-657soy (FIG. 51) was obtained in which the chimeric DNA obtained by ligating the DNA immediately below the transit peptide coding sequence without changing the codon frame was ligated downstream of the CR16G6 promoter.
Next, the plasmid was introduced into competent cells of Escherichia coli DH5α strain (Takara Shuzo), and ampicillin-resistant strains were selected. The nucleotide sequence of the plasmid contained in the selected ampicillin-resistant strain was determined using BigDye \ Terminator \ Cycle \ Sequencing \ Ready \ Reaction \ kit \ v3.0 (manufactured by PE Applied Biosystems) and DNA Sequencer 3100 (manufactured by PE Applied Biosystems). As a result, it was confirmed that the plasmid pSUM-NdG6-rSt-657soy had the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 214.
(3) Introduction of the DNA (A21) S of the present invention into soybean
The vitamins in the MS medium were added to the B5 medium [O. L. {Gamborg et al. , {Exp. {Cell} Res. (1986) 50 p151. ) Was prepared in accordance with the method described in Example 17 (1) except that the globular embryos of soybean (cultivar; Fayette and Jack) were used.
The obtained spherical embryos were transferred to a new somatic embryo growth medium and cultured for 2 to 3 days. The plasmid pSUM-NdG6-rSt-657soy prepared in Example 47 (1) or the plasmid pSUM-NdG6-rSt12-657soy prepared in Example 47 (2) was added to the globular embryo, as in Example 17 (2). ).
(4) Somatic embryo selection with hygromycin
According to the method described in Example 17 (3) except that the vitamins in the MS medium are replaced with the vitamins in the B5 medium, the globular embryos obtained in Example 47 (3) after transfection obtained in Example 47 (3) were treated with hygromycin. Selection was performed. However, from the second transplantation onward, a medium solidified by adding 0.2 (W / V)% gellite or a liquid medium not containing gellite was used as the adventitious embryo selection medium. In the case of a liquid medium, culture was performed by gently swirling about 90 times per minute.
(5) Selection of somatic embryos using compound (II)
Except for replacing the vitamins in the MS medium with the vitamins in the B5 medium, the compound (II) of the transgenic globular embryo obtained in Example 47 (3) obtained in Example 47 (3) according to the method described in Example 17 (4). ).
(6) Individual regeneration, acclimatization and cultivation from somatic embryos
In accordance with the method described in Example 17 (5), an individual is regenerated from the globular embryo selected in Example 47 (4) or (5). However, the agar concentration of the development medium is 0.8 (W / V)% or 1.0 (W / V)%. Further, the vitamins in the MS medium of the germination medium are replaced with the vitamins in the B5 medium.
According to the method described in Example 17 (6), acclimation and cultivation are performed on the individual that has developed and rooted the true leaves, and the seeds are collected.
(7) Evaluation of resistance to compound (II) having weed control activity
According to the method described in Example 17 (4), the degree of resistance to the compound (II) of the regenerated plant individual obtained in Example 47 (6) is evaluated.
(8) Construction of a chloroplast expression plasmid for introducing Agrobacterium having the DNA (A1) S of the present invention
A plasmid for introducing the DNA (A1) S of the present invention into plants by the Agrobacterium method was constructed. The above plasmid pSUM-NdG6-rSt-657soy was digested with the restriction enzyme NotI, and the codon frame of the present invention DNA was changed without changing the codon frame immediately below the chloroplast transit peptide coding sequence of the small RuBPC subunit of soybean (cv. @Jack). A1) DNA containing a chimeric DNA to which S was ligated was isolated. This DNA was inserted into the NotI site of the binary vector plasmid pBI121S obtained in Example 18 to obtain pBI-NdG6-rSt-657soy (FIG. 52). The plasmid pSUM-NdG6-rSt12-657soy was digested with a restriction enzyme NotI, and the chloroplast transit peptide of the RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack) followed by the nucleotide sequence encoding 12 amino acids of the mature protein was digested. A DNA containing a chimeric DNA obtained by linking the DNA (A1) S of the present invention without changing the codon frame immediately below was isolated. This DNA was inserted into the NotI site of the binary vector plasmid pBI121S to obtain pBI-NdG6-rSt12-657soy (FIG. 53).
(9) Introduction of DNA (A1) S of the Present Invention into Tobacco
Using the plasmid pBI-NdG6-rSt-657soy and the plasmid pBI-NdG6-rSt12-657soy obtained in Example 47 (8), the DNA (A1) S of the present invention was introduced into tobacco by the Agrobacterium method.
First, according to the method described in Example 19, plasmids pBI-NdG6-rSt-657soy and pBI-NdG6-rSt12-657soy were respectively introduced into Agrobacterium tumefaciens LBA4404 strain (Clontech) and pBI-NdG6-Sy. Each recombinant Agrobacterium strain having pBI-NdG6-rSt12-657soy was isolated.
Then, using the recombinant Agrobacterium strains having the above plasmid, these strains were cultured overnight at 30 ° C. in {LB} liquid medium containing 25 mg / L kanamycin, according to the method described in Example 19, except that The gene was introduced into tobacco. Recombinant tobacco individuals into which the T-DNA region of pBI-NdG6-rSt657soy or pBI-NdG6-rSt12-657soy was obtained, respectively.
(10) Evaluation of resistance using leaf pieces of the DNA (A1) S recombinant tobacco of the present invention
Leaves were excised from 35 individual recombinant tobacco plants obtained in Example 47 (9), and leaf pieces of {5 to 7 mm} were collected. Each leaf piece was inoculated into {MS} agar medium supplemented with 0, 0.05, 0.1, or 0.2 mg / L of compound (II), cultured at room temperature and room temperature, and cultured for 11 days. The degree of phytotoxicity was observed. In addition, each leaf piece was inoculated on an MS agar medium containing 0, 0.01, 0.02, 0.05, or 0.1 mg / L of the compound (XII), and cultured at room temperature in a light place at room temperature. After a day, the degree of phytotoxicity of each leaf piece was observed. As a control, 20 leaf pieces of tobacco to which no gene was introduced (hereinafter referred to as wild-type tobacco) were used at each concentration. The score of the continuously surviving leaf pieces was set at 1, the half-dead leaf pieces that were found to be phytotoxic were set at 0.5, and the whitened and dead leaf pieces were set at 0, and the scores of each group were averaged. Tobacco leaf pieces into which the DNA (A1) S of the present invention (T-DNA region of plasmid pBI-NdG6-rSt-657soy or pBI-NdG6-rSt12-657soy) has been introduced can be either compound (II) or compound (XII). Also showed higher scores than wild-type tobacco.
Example 48: Acquisition of DNA (A16) of the present invention
(1) Preparation of Streptomyces ornatus IFO 13069t chromosomal DNA
According to the method described in Example 31 (1), chromosomal DNA of Streptomyces ornatus IFO 13069 t was prepared.
(2) Isolation of a DNA having a partial nucleotide sequence of the DNA (A16) of the present invention
PCR was performed according to the method described in Example 29 using the chromosome DNA of Streptomyces ornatus IFOｔ 13069t prepared in Example 48 (1) as a template and primer pair 14. In the same manner as in Example 31 (2), the amplified DNA was cloned into a pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by INVITROGEN), and the nucleotide sequence was analyzed. As a result, the base sequence represented by base numbers 343 to 1069 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 225 was read.
The chromosomal DNA prepared in Example 48 (1) was digested with the restriction enzyme PvuII. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template and using the oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 265 and primer AP1 under the conditions described in Example 26 (3), PCR was performed to obtain a primary PCR product. Was. Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 266 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 1 to 501 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 235 was read.
Further, the chromosomal DNA prepared in Example 48 (1) was digested with a restriction enzyme PvuII. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 267 and primer AP1, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) to obtain a primary PCR product. Was. Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 268 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 1044 to 1454 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 235 was read.
(3) Base sequence analysis of the DNA (A16) of the present invention
By linking the nucleotide sequences read from the DNA obtained in Example 48 (2), the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 235 was obtained. There were two open reading frames (ORFs) in the nucleotide sequence. That is, a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 225) consisting of 1251 bases (including a stop codon) and encoding 416 amino acid residues (SEQ ID NO: 215), and 65 amino acid residues (SEQ ID NO :) comprising 198 bases (including a stop codon) 245) (SEQ ID NO: 255). The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 215) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 225 was calculated to be 4613 Da. The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 245) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 255 was calculated to be 6768 Da.
Example 49 Expression of the protein of the present invention (A16) in Escherichia coli
(1) Preparation of transformed Escherichia coli having the DNA (A16) of the present invention
PCR was performed using the GeneAmp high fidelity PCR system (manufactured by Applied Biosystems Japan) using the chromosomal DNA of Streptomyces ornatus IFO # 13069t prepared in Example 48 (1) as a template. As the primer, a combination of an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 269 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 286 was used. To the PCR reaction solution, two types of primers were added at 200 nM each, 50 ng of chromosomal DNA, 5.0 μl of dNTP mix (a mixture of 2.0 mM each of four types of dNTPs), 10 μl of 10 × buffer (MgCl₂5.0 μl) and 0.5 μl of GeneAmp @ HF enzyme mix, and then distilled water to make a total volume of 50 μl. The heat retention conditions were as follows: heat retention at 97 ° C. for 1 minute, 10 cycles of heat retention at 97 ° C. for 15 seconds, then 60 ° C. for 30 seconds, and further 72 ° C. for 90 seconds as one cycle, followed by 97 ° C. for 15 seconds Subsequently, 15 cycles were carried out with the heat retention at 60 ° C. for 30 seconds and the heat retention at 72 ° C. for 90 seconds (the heat retention at 72 ° C. was increased by 5 seconds for each cycle) as one cycle, and the temperature was further kept at 72 ° C. for 7 minutes. DNA was purified from the PCR reaction solution in the same manner as in Example 32 (1), and cloned into a pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by INVITROGEN). The nucleotide sequence of the obtained plasmid DNA was analyzed using oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 57, 59, 267, 286, and 288 as primers. Based on the obtained results, a plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 235 was designated as pCR452F. In the same manner as in Example 32 (1), pCR452F was digested with restriction enzymes NdeI and HindIII, and a DNA of about 1.5 kbp was purified from the digest. By ligating the obtained DNA with the plasmid pKSN2 digested with NdeI and HindIII, the DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 235 and encoding the protein of the present invention (A16) was ligated to the NdeI site of pKSN2. A plasmid (hereinafter, referred to as pKSN452F) inserted between the HindIII site was obtained. The plasmid was introduced into Escherichia coli JM109, and the obtained Escherichia coli transformant was designated as JM109 / pKSN452F.
(2) Expression of the protein (A16) of the present invention in E. coli and recovery of the protein
Escherichia coli JM109 / pKSN452F and JM109 / pKSN2 were each cultured in the same manner as in Example 4 (2), and then the cells were collected to prepare a cell lysate. From the obtained crushed liquid, a supernatant fraction (hereinafter, the supernatant fraction obtained from Escherichia coli JM109 / pKSN452F was purified from Escherichia coli extract pKSN452F and Escherichia coli JM109 / pKSN2) by the method described in Example 4 (2). The obtained supernatant fraction was referred to as Escherichia coli extract pKSN2).
(3) Assay for ability to convert compound (II) to compound (III)
A reaction solution (30 μl) was prepared in the same manner as in Example 32 (3), and kept at 30 ° C. for 10 minutes. However, the supernatant fraction (E. coli extract pKSN452F or E. coli extract pKSN2) collected in Example 49 (2) was used as the supernatant fraction. After the incubation, each reaction solution was extracted with ethyl acetate, and the obtained extract was analyzed by TLC. On the TLC plate after development¹⁴The presence or absence of spots (Rf values 0.24 and 0.29) corresponding to compound (III) labeled with C was examined. A spot corresponding to the compound (III) was detected from the reaction solution containing the E. coli extract pKSN452F. On the other hand, in the reaction solution containing the E. coli extract pKSN2, the spot was not detected.
Example 50: Acquisition of DNA (A17) of the present invention
(1) Preparation of Streptomyces griseus ATCC 10137 chromosomal DNA
By the method described in Example 31 (1), chromosomal DNA of Streptomyces griseus ATCC 10137 was prepared.
(2) Isolation of a DNA having a partial nucleotide sequence of the DNA (A17) of the present invention
PCR was carried out according to the method described in Example 29 using the chromosomal DNA of Streptomyces griseus ATCC 10137 prepared in Example 50 (1) as a template and primer pair 14. In the same manner as in Example 31 (2), the amplified DNA was cloned into a pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by INVITROGEN), and the nucleotide sequence was analyzed. As a result, the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 343 to 1069 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 226 was read.
Further, the chromosomal DNA prepared in Example 50 (1) was digested with the restriction enzyme SmaI. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 270 and primer AP1, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) to obtain a primary PCR product. Was. Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 271 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 1 to 361 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 236 was read.
Further, the chromosomal DNA prepared in Example 50 (1) was digested with a restriction enzyme PvuII. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 272 and primer AP1 under the conditions described in Example 26 (3), PCR was performed to obtain a primary PCR product. Was. Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 273 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 1035 to 1454 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 236 was read.
(3) Base sequence analysis of DNA (A17) of the present invention
By linking the nucleotide sequences read from the DNA obtained in Example 50 (2), the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 236 was obtained. There were two open reading frames (ORFs) in the nucleotide sequence. That is, a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 226) consisting of 1251 bases (including a stop codon) and encoding 416 amino acid residues (SEQ ID NO: 216), and 65 amino acid residues (SEQ ID NO :) consisting of 198 bases (including a stop codon) 246) (SEQ ID NO: 256). The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 216) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 226 was calculated to be 46082 Da. The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 246) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 256 was calculated to be 6768 Da. The nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 256 was 100% identical to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 255, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 246 was 100% identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 245. .
Example 51 Expression of the protein of the present invention (A17) in Escherichia coli
(1) Preparation of transformed Escherichia coli having the DNA (A17) of the present invention
Using the chromosomal DNA of Streptomyces griseus ATCC 10137 prepared in Example 50 (1) as a template, and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 274 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 275 as primers PCR was performed in the same manner as in Example 32 (1) except that PCR was used. DNA was purified from the PCR reaction solution in the same manner as in Example 32 (1), and cloned into a pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by INVITROGEN). The nucleotide sequence of the obtained plasmid DNA was analyzed using oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 57, 59, 274, 276, and 277 as primers. Based on the obtained results, a plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 236 was designated as pCR608F. In the same manner as in Example 32 (1), pCR608F was digested with restriction enzymes NdeI and HindIII, and a DNA of about 1.5 kbp was purified from the digest. By ligating the obtained DNA with the plasmid pKSN2 digested with NdeI and HindIII, the DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 236 and encoding the protein of the present invention (A17) was ligated to the NdeI site of pKSN2. A plasmid (hereinafter, referred to as pKSN608F) inserted between the HindIII site was obtained. The plasmid was introduced into Escherichia coli JM109, and the resulting Escherichia coli transformant was designated as JM109 / pKSN608F.
(2) Expression of the protein (A17) of the present invention in Escherichia coli and recovery of the protein
After culturing E. coli JM109 / pKSN608F and JM109 / pKSN2, respectively, in the same manner as in Example 4 (2), the cells were collected, and a cell lysate was prepared. From the obtained crushed liquid, a supernatant fraction (hereinafter, the supernatant fraction obtained from Escherichia coli JM109 / pKSN608F) was purified from Escherichia coli extract pKSN608F and Escherichia coli JM109 / pKSN2 by the method described in Example 4 (2). The obtained supernatant fraction was referred to as Escherichia coli extract pKSN2).
(3) Assay for ability to convert compound (II) to compound (III)
A reaction solution (30 μl) was prepared in the same manner as in Example 32 (3), and kept at 30 ° C. for 10 minutes. However, the supernatant fraction (E. coli extract pKSN608F or E. coli extract pKSN2) recovered in Example 51 (2) was used as the supernatant fraction. After the incubation, each reaction solution was extracted with ethyl acetate, and the obtained extract was analyzed by TLC. On the TLC plate after development¹⁴The presence or absence of spots (Rf values 0.24 and 0.29) corresponding to compound (III) labeled with C was examined. A spot corresponding to the compound (III) was detected from the reaction solution containing the E. coli extract pKSN608F. On the other hand, in the reaction solution containing the E. coli extract pKSN2, the spot was not detected.
Example 52: Acquisition of the DNA (A18) of the present invention
(1) Preparation of Streptomyces Achromogenes IFO 12735 chromosomal DNA
According to the method described in Example 31 (1), chromosomal DNA of Streptomyces achromogenes IFO 12735 was prepared.
(2) Isolation of a DNA having a partial nucleotide sequence of the DNA (A18) of the present invention
PCR was performed according to the method described in Example 29 using the chromosomal DNA of Streptomyces achromogenes IFO 12735 prepared in Example 52 (1) as a template and primer pair 17. In the same manner as in Example 31 (2), the amplified DNA was cloned into a pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by INVITROGEN), and the nucleotide sequence was analyzed. As a result, the base sequence represented by base numbers 526 to 1048 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 227 was read.
The chromosomal DNA prepared in Example 52 (1) was digested with the restriction enzyme HincII. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 278 and primer AP1, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) to obtain a primary PCR product. Was. Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 279 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 1 to 600 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 237 was read.
Furthermore, the chromosomal DNA prepared in Example 52 (1) was digested with restriction enzyme BalI. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 163 and primer AP1, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) to obtain a primary PCR product. Was. Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 164 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 983 to 1449 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 237 was read.
(3) Nucleotide sequence analysis of the DNA (A18) of the present invention
By linking the nucleotide sequences read from the DNA obtained in Example 52 (2), the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 237 was obtained. There were two open reading frames (ORFs) in the nucleotide sequence. That is, a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 227) consisting of 1230 bases (including a stop codon) and encoding 409 amino acid residues (SEQ ID NO: 217), and a 68 amino acid residue (SEQ ID NO: 207) consisting of 207 bases (including a stop codon) 247) (SEQ ID NO: 257). The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 217) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 227 was calculated to be 45099 Da. The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 247) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 257 was calculated to be 7193 Da.
Example 53 Expression of the protein of the present invention (A18) in Escherichia coli
(1) Preparation of transformed Escherichia coli having the DNA (A18) of the present invention
Using the chromosomal DNA of Streptomyces achromogenes IFO 12735 prepared in Example 52 (1) as a template, an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 183 and an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 280 as primers PCR was performed in the same manner as in Example 49 (1) except for using PCR. DNA was purified from the PCR reaction solution in the same manner as in Example 32 (1), and cloned into a pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by INVITROGEN). The nucleotide sequence of the obtained plasmid DNA was analyzed using oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 67, 68, 163, 279, and 281 as primers. Based on the obtained results, a plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 237 was designated as pCR646BF. In the same manner as in Example 32 (1), pCR646BF was digested with restriction enzymes NdeI and HindIII, and about 1.5 kbp of DNA was purified from the digest. By ligating the obtained DNA with the plasmid pKSN2 digested with NdeI and HindIII, the DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 237 and encoding the protein of the present invention (A18) was ligated to the NdeI site of pKSN2. A plasmid (hereinafter, referred to as pKSN646BF) inserted between the HindIII site was obtained. The plasmid was introduced into Escherichia coli JM109, and the obtained Escherichia coli transformant was designated as JM109 / pKSN646BF.
(2) Expression of the protein (A18) of the present invention in Escherichia coli and recovery of the protein
After culturing E. coli JM109 / pKSN646BF and JM109 / pKSN2, respectively, in the same manner as in Example 4 (2), the cells were collected, and a cell lysate was prepared. From the obtained crushed liquid, a supernatant fraction (hereinafter, the supernatant fraction obtained from Escherichia coli JM109 / pKSN646BF was purified from Escherichia coli extract pKSN646BFBF and Escherichia coli JM109 / pKSN2) by the method described in Example 4 (2). The obtained supernatant fraction was referred to as Escherichia coli extract pKSN2).
(3) Assay for ability to convert compound (II) to compound (III)
A reaction solution (30 μl) was prepared in the same manner as in Example 32 (3), and kept at 30 ° C. for 10 minutes. However, the supernatant fraction (E. coli extract pKSN646BF or E. coli extract pKSN2) collected in Example 53 (2) was used as the supernatant fraction. After the incubation, each reaction solution was extracted with ethyl acetate, and the obtained extract was analyzed by TLC. On the TLC plate after development¹⁴The presence or absence of spots (Rf values 0.24 and 0.29) corresponding to compound (III) labeled with C was examined. A spot corresponding to the compound (III) was detected from the reaction solution containing the E. coli extract pKSN646BF. On the other hand, in the reaction solution containing the E. coli extract pKSN2, the spot was not detected.
Example 54: Acquisition of DNA (A19) of the present invention
(1) Preparation of Streptomyces griseus IFO 13849T chromosomal DNA
According to the method described in Example 31 (1), chromosomal DNA of Streptomyces griseus IFO 13849T was prepared.
(2) Isolation of a DNA having a partial nucleotide sequence of the DNA of the present invention (A19)
PCR was performed according to the method described in Example 29 using the chromosomal DNA of Streptomyces griseus IFO 13849T prepared in Example 54 (1) as a template and primer pair 14. In the same manner as in Example 31 (2), the amplified DNA was cloned into a pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by INVITROGEN), and the nucleotide sequence was analyzed. As a result, the base sequence represented by base numbers 343 to 1069 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 228 was read.
In addition, the chromosomal DNA prepared in Example 54 (1) was digested with the restriction enzyme SmaI. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 282 and primer AP1, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) to obtain a primary PCR product. Was. Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 283 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 1 to 358 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 238 was read.
Further, the chromosomal DNA prepared in Example 54 (1) was digested with a restriction enzyme HincII. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 284 and primer AP1, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) to obtain a primary PCR product. Was. Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 285 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 1005-1454 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 238 was read.
(3) Base sequence analysis of DNA (A19) of the present invention
By linking the nucleotide sequences read from the DNA obtained in Example 54 (2), the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 238 was obtained. There were two open reading frames (ORFs) in the nucleotide sequence. That is, a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 228) consisting of 1251 bases (including a stop codon) and encoding 416 amino acid residues (SEQ ID NO: 218), and a 51 amino acid residue (SEQ ID NO :) consisting of 156 bases (including a stop codon) 248) (SEQ ID NO: 258). The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 218) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 228 was calculated to be 45903 Da. The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 248) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 258 was calculated to be 5175 Da.
Example 55 Expression of the protein of the present invention (A19) in Escherichia coli
(1) Preparation of transformed Escherichia coli having the DNA (A19) of the present invention
Using the chromosomal DNA of Streptomyces griseus IFO 13849T prepared in Example 54 (1) as a template, an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 286 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 287 as primers PCR was performed in the same manner as in Example 49 (1) except for using PCR. DNA was purified from the PCR reaction solution in the same manner as in Example 32 (1), and cloned into a pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by INVITROGEN). The nucleotide sequence of the obtained plasmid DNA was analyzed using oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 57, 59, 284, 286, and 288 as primers. Based on the obtained results, a plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 238 was designated as pCR1502F. In the same manner as in Example 32 (1), pCR1502F was digested with restriction enzymes NdeI and HindIII, and a DNA of about 1.5 kbp was purified from the digest. By ligating the obtained DNA with the plasmid pKSN2 digested with NdeI and HindIII, the DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 238 and encoding the protein of the present invention (A19) was ligated to the NdeI site of pKSN2. A plasmid (hereinafter, referred to as pKSN1502F) inserted between the HindIII site was obtained. This plasmid was introduced into Escherichia coli JM109, and the obtained Escherichia coli transformant was designated as JM109 / pKSN1502F.
(2) Expression of the protein (A19) of the present invention in E. coli and recovery of the protein
After culturing Escherichia coli JM109 / pKSN1502F and JM109 / pKSN2, respectively, in the same manner as in Example 4 (2), the cells were collected, and a cell lysate was prepared. From the obtained crushed liquid, a supernatant fraction (hereinafter, the supernatant fraction obtained from Escherichia coli JM109 / pKSN1502F was purified from Escherichia coli extract pKSN1502F and Escherichia coli JM109 / pKSN2) by the method described in Example 4 (2). The obtained supernatant fraction was referred to as Escherichia coli extract pKSN2).
(3) Assay for ability to convert compound (II) to compound (III)
A reaction solution (30 μl) was prepared in the same manner as in Example 32 (3), and kept at 30 ° C. for 10 minutes. However, the supernatant fraction (E. coli extract pKSN1502F or E. coli extract pKSN2) recovered in Example 55 (2) was used as the supernatant fraction. After the incubation, each reaction solution was extracted with ethyl acetate, and the obtained extract was analyzed by TLC. On the TLC plate after development¹⁴The presence or absence of spots (Rf values 0.24 and 0.29) corresponding to compound (III) labeled with C was examined. A spot corresponding to the compound (III) was detected from the reaction solution containing the E. coli extract pKSN1502F. On the other hand, in the reaction solution containing the E. coli extract pKSN2, the spot was not detected.
Example 56 Acquisition of DNA (A20) of the Present Invention
(1) Preparation of Streptomyces lanatas IFO 12787T chromosomal DNA
According to the method described in Example 31 (1), chromosomal DNA of Streptomyces lanatas IFO 12787T was prepared.
(2) Isolation of DNA having partial nucleotide sequence of DNA (A20) of the present invention
PCR was performed according to the method described in Example 29 using the chromosome DNA of Streptomyces lanatas IFO 12787T prepared in Example 56 (1) as a template and primer pair 14. In the same manner as in Example 31 (2), the amplified DNA was cloned into a pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by INVITROGEN), and the nucleotide sequence was analyzed. As a result, the base sequence represented by base numbers 304 to 1036 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 229 was read.
The chromosomal DNA prepared in Example 56 (1) was digested with the restriction enzyme PmacI. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 278 and primer AP1, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) to obtain a primary PCR product. Was. Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template, and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 289 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 1 to 318 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 239 was read.
Further, the chromosomal DNA prepared in Example 56 (1) was digested with the restriction enzyme StuI. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 290 and primer AP1 under the conditions described in Example 26 (3), PCR was performed to obtain a primary PCR product. Was. Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 291 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 969 to 1461 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 239 was read.
(3) Base sequence analysis of the DNA (A20) of the present invention
By linking the nucleotide sequences read from the DNA obtained in Example 56 (2), the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 239 was obtained. There were two open reading frames (ORFs) in the nucleotide sequence. That is, a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 229) consisting of 1218 bases (including a stop codon) and encoding 405 amino acid residues (SEQ ID NO: 219), and 76 amino acid residues (SEQ ID NO: 2) consisting of 231 bases (including a stop codon) 249) (SEQ ID NO: 259). The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 219) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 229 was calculated to be 45071 Da. The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 249) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 259 was calculated to be 7816 Da.
Example 57 Expression of the protein (A20) of the present invention in Escherichia coli
(1) Preparation of transformed Escherichia coli having the DNA (A20) of the present invention
Using the chromosomal DNA of Streptomyces lanatas IFO 12787T prepared in Example 56 (1) as a template, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 292 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 293 as primers PCR was performed in the same manner as in Example 49 (1) except for using PCR. DNA was purified from the PCR reaction solution in the same manner as in Example 32 (1), and cloned into a pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by INVITROGEN). The nucleotide sequence of the obtained plasmid DNA was analyzed using oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 67, 68, 188, 278, and 290 as primers. Based on the obtained results, a plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 239 was designated as pCR1525F. In the same manner as in Example 32 (1), pCR1525F was digested with restriction enzymes NdeI and HindIII, and about 1.5 kbp of DNA was purified from the digest. By ligating the obtained DNA with the plasmid pKSN2 digested with NdeI and HindIII, the DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 239 and encoding the protein of the present invention (A20) was ligated to the NdeI site of pKSN2. A plasmid (hereinafter, referred to as pKSN1525F) inserted between the HindIII site was obtained. The plasmid was introduced into Escherichia coli JM109, and the obtained Escherichia coli transformant was designated as JM109 / pKSN1525F.
(2) Expression of the protein (A20) of the present invention in Escherichia coli and recovery of the protein
After culturing E. coli JM109 / pKSN1525F and JM109 / pKSN2, respectively, in the same manner as in Example 4 (2), the cells were collected, and a cell lysate was prepared. From the obtained crushed liquid, a supernatant fraction (hereinafter, the supernatant fraction obtained from Escherichia coli JM109 / pKSN1525F) was purified from Escherichia coli extract pKSN1525F and Escherichia coli JM109 / pKSN2 by the method described in Example 4 (2). The obtained supernatant fraction was referred to as Escherichia coli extract pKSN2).
(3) Assay for ability to convert compound (II) to compound (III)
A reaction solution (30 μl) was prepared in the same manner as in Example 32 (3), and kept at 30 ° C. for 10 minutes. However, the supernatant fraction (E. coli extract pKSN1525F or E. coli extract pKSN2) collected in Example 57 (2) was used as the supernatant fraction. After the incubation, each reaction solution was extracted with ethyl acetate, and the obtained extract was analyzed by TLC. On the TLC plate after development¹⁴The presence or absence of spots (Rf values 0.24 and 0.29) corresponding to compound (III) labeled with C was examined. A spot corresponding to compound (III) was detected from the reaction solution containing the E. coli extract pKSN1525F. On the other hand, in the reaction solution containing the E. coli extract pKSN2, the spot was not detected.
Example 58: Obtaining the DNA (A21) of the present invention
(1) Preparation of Streptomyces \ misawaensis \ IFO \ 13855T chromosomal DNA
According to the method described in Example 31 (1), chromosomal DNA of Streptomyces \ misawaenensis \ IFO \ 13855T was prepared.
(2) Isolation of a DNA having a partial nucleotide sequence of the DNA (A21) of the present invention
PCR was carried out according to the method described in Example 29 using the chromosomal DNA of Streptomyces \ misawaenensis \ IFO \ 13855T prepared in Example 58 (1) as a template and primer pair 14. In the same manner as in Example 31 (2), the amplified DNA was cloned into a pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by INVITROGEN), and the nucleotide sequence was analyzed. As a result, the base sequence represented by base numbers 328 to 1063 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 230 was read.
In addition, the chromosomal DNA prepared in Example 58 (1) was digested with the restriction enzyme SmaI. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template and using the oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 294 and primer AP1 under the conditions described in Example 26 (3), PCR was performed to obtain a primary PCR product. Was. Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 295 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 1-341 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 240 was read.
Further, the chromosomal DNA prepared in Example 58 (1) was digested with the restriction enzyme HincII. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 296 and primer AP1, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) to obtain a primary PCR product. Was. Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 297 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 1017-1458 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 240 was read.
(3) Base sequence analysis of DNA (A21) of the present invention
By ligating the nucleotide sequence read from the DNA obtained in Example 58 (2), the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 240 was obtained. There were two open reading frames (ORFs) in the nucleotide sequence. That is, a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 230) consisting of 1245 bases (including a stop codon) and encoding 414 amino acid residues (SEQ ID NO: 220), and 66 amino acid residues (SEQ ID NO: 2) consisting of 201 bases (including a stop codon) 250) (SEQ ID NO: 260). The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 220) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 230 was calculated to be 45806 Da. The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 250) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 260 was calculated to be 6712 Da.
Example 59 Expression of the protein of the present invention (A21) in Escherichia coli
(1) Preparation of transformed Escherichia coli having the DNA (A21) of the present invention
Using, as a primer, the oligonucleotide having the base sequence shown by SEQ ID NO: 298 and the oligonucleotide having the base sequence shown by SEQ ID NO: 299, using the chromosomal DNA of Streptomyces ｔｏmisawanensis IFO 13855T prepared in Example 58 (1) as a template PCR was performed in the same manner as in Example 32 (1) except that PCR was used. DNA was purified from the PCR reaction solution in the same manner as in Example 32 (1), and cloned into a pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by INVITROGEN). The nucleotide sequence of the obtained plasmid DNA was analyzed using oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 57, 59, 296, 298, and 300 as primers. Based on the obtained results, a plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 240 was designated as pCR1543BF. In the same manner as in Example 32 (1), pCR1543BF was digested with restriction enzymes NdeI and HindIII, and a DNA of about 1.5 kbp was purified from the digest. By ligating the obtained DNA with the plasmid pKSN2 digested with NdeI and HindIII, the DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 240 and encoding the protein of the present invention (A21) was ligated to the NdeI site of pKSN2. A plasmid (hereinafter referred to as pKSN1543BF) inserted between the HindIII site was obtained. The plasmid was introduced into Escherichia coli JM109, and the obtained Escherichia coli transformant was designated as JM109 / pKSN1543BF.
(2) Expression of the protein (A21) of the present invention in Escherichia coli and recovery of the protein
Escherichia coli JM109 / pKSN1543BF and JM109 / pKSN2 were each cultured in the same manner as in Example 4 (2), and then the cells were collected to prepare a cell lysate. From the obtained crushed liquid, a supernatant fraction (hereinafter, the supernatant fraction obtained from Escherichia coli JM109 / pKSN1543BF was purified from Escherichia coli extract pKSN1543BF and Escherichia coli JM109 / pKSN2) by the method described in Example 4 (2). The obtained supernatant fraction was referred to as Escherichia coli extract pKSN2).
(3) Assay for ability to convert compound (II) to compound (III)
A reaction solution (30 μl) was prepared in the same manner as in Example 32 (3), and kept at 30 ° C. for 10 minutes. However, the supernatant fraction (E. coli extract pKSN1543BF or E. coli extract pKSN2) collected in Example 59 (2) was used as the supernatant fraction. After the incubation, each reaction solution was extracted with ethyl acetate, and the obtained extract was analyzed by TLC. On the TLC plate after development¹⁴The presence or absence of spots (Rf values 0.24 and 0.29) corresponding to compound (III) labeled with C was examined. A spot corresponding to the compound (III) was detected from the reaction solution containing the E. coli extract pKSN1543BF. On the other hand, in the reaction solution containing the E. coli extract pKSN2, the spot was not detected.
Example 60: Acquisition of DNA (A22) of the present invention
(1) Preparation of Streptomyces \ pallidus \ IFO \ 13434T chromosomal DNA
According to the method described in Example 31 (1), chromosomal DNA of Streptomyces pallidus IFO 13434T was prepared.
(2) Isolation of a DNA having a partial nucleotide sequence of the DNA of the present invention (A22)
PCR was performed according to the method described in Example 29 using the chromosomal DNA of Streptomyces pallidus IFO 13434T prepared in Example 60 (1) as a template and primer pair 15. In the same manner as in Example 31 (2), the amplified DNA was cloned into a pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by INVITROGEN), and the nucleotide sequence was analyzed. As a result, the base sequence represented by base numbers 483 to 1048 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 231 was read.
Further, the chromosomal DNA prepared in Example 60 (1) was digested with a restriction enzyme SmaI. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 301 and primer AP1, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) to obtain a primary PCR product. Was. Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 302 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 68 to 516 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 241 was read.
Further, the chromosomal DNA prepared in Example 60 (1) was digested with a restriction enzyme HincII. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 302 and primer AP1, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) to obtain a primary PCR product. Was. Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 303 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 1-270 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 241 was read.
Further, the chromosomal DNA prepared in Example 60 (1) was digested with a restriction enzyme HincII. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 304 and primer AP1, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) to obtain a primary PCR product. Was. Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 305 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 982-1448 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 241 was read.
(3) Base sequence analysis of DNA (A22) of the present invention
By linking the nucleotide sequences read from the DNA obtained in Example 60 (2), the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 241 was obtained. There were two open reading frames (ORFs) in the nucleotide sequence. That is, a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 231) consisting of 1230 bases (including a stop codon) and encoding 409 amino acid residues (SEQ ID NO: 221) and 64 amino acid residues (SEQ ID NO: 195) consisting of 195 bases (including a stop codon) 251) (SEQ ID NO: 261). The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 221) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 231 was calculated to be 45050 Da. The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 251) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 261 was calculated to be 6914 Da.
Example 61 Expression of the protein of the present invention (A22) in Escherichia coli
(1) Preparation of transformed Escherichia coli having the DNA (A22) of the present invention
Using, as a template, the chromosomal DNA of Streptomyces pallidus IFO 13434T prepared in Example 60 (1) as a primer, an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 306 and an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 307 PCR was performed in the same manner as in Example 32 (1) except that PCR was used. DNA was purified from the PCR reaction solution in the same manner as in Example 32 (1), and cloned into a pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by INVITROGEN). The nucleotide sequence of the obtained plasmid DNA was analyzed using oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 67, 68, and 308 as primers. Based on the obtained results, a plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 241 was designated as pCR1558BF. In the same manner as in Example 32 (1), pCR1558BF was digested with restriction enzymes NdeI and HindIII, and a DNA of about 1.5 kbp was purified from the digest. By ligating the obtained DNA with the plasmid pKSN2 digested with NdeI and HindIII, the DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 241 and encoding the protein of the present invention (A22) was ligated to the NdeI site of pKSN2. A plasmid (hereinafter, referred to as pKSN1558BF) inserted between the HindIII site was obtained. The plasmid was introduced into Escherichia coli JM109, and the obtained Escherichia coli transformant was designated as JM109 / pKSN1558BF.
(2) Expression of the protein of the present invention (A22) in Escherichia coli and recovery of the protein
After culturing Escherichia coli JM109 / pKSN1558BF and JM109 / pKSN2, respectively, in the same manner as in Example 4 (2), the cells were collected, and a cell lysate was prepared. From the obtained crushed liquid, a supernatant fraction (hereinafter, the supernatant fraction obtained from E. coli JM109 / pKSN1558BF was purified from E. coli extract pKSN1558BF and E. coli JM109 / pKSN2) by the method described in Example 4 (2). The obtained supernatant fraction was referred to as Escherichia coli extract pKSN2).
(3) Assay for ability to convert compound (II) to compound (III)
A reaction solution (30 μl) was prepared in the same manner as in Example 32 (3), and kept at 30 ° C. for 10 minutes. However, the supernatant fraction (E. coli extract pKSN1558BF or E. coli extract pKSN2) collected in Example 61 (2) was used as the supernatant fraction. After the incubation, each reaction solution was extracted with ethyl acetate, and the obtained extract was analyzed by TLC. On the TLC plate after development¹⁴The presence or absence of spots (Rf values 0.24 and 0.29) corresponding to compound (III) labeled with C was examined. A spot corresponding to compound (III) was detected from the reaction solution containing the E. coli extract pKSN1558BF. On the other hand, in the reaction solution containing the E. coli extract pKSN2, the spot was not detected.
Example 62: Acquisition of DNA (A23) of the present invention
(1) Preparation of Streptomyces roseoseubens IFO 13682T chromosomal DNA
According to the method described in Example 31 (1), chromosomal DNA of Streptomyces roseoseubens IFO13682T was prepared.
(2) Isolation of a DNA having a partial nucleotide sequence of the DNA (A23) of the present invention
PCR was carried out according to the method described in Example 29 using the chromosomal DNA of Streptomyces roseoserubens IFO 13682T prepared in Example 62 (1) as a template and primer pair 14. In the same manner as in Example 31 (2), the amplified DNA was cloned into a pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by INVITROGEN), and the nucleotide sequence was analyzed. As a result, the base sequence represented by base numbers 289 to 1015 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 232 was read.
The chromosomal DNA prepared in Example 62 (1) was digested with the restriction enzyme SmaI. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 309 and primer AP1, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) to obtain a primary PCR product. Was. Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 310 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 1 to 354 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 242 was read.
Further, the chromosomal DNA prepared in Example 62 (1) was digested with a restriction enzyme PvuII. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 311 and primer AP1, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) to obtain a primary PCR product. Was. Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 312 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 966 to 1411 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 242 was read.
(3) Base sequence analysis of DNA (A23) of the present invention
By linking the nucleotide sequences read from the DNA obtained in Example 62 (2), the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 242 was obtained. There were two open reading frames (ORFs) in the nucleotide sequence. That is, a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 232) consisting of 1197 bases (including the stop codon) and encoding 398 amino acid residues (SEQ ID NO: 222), and 66 amino acid residues (SEQ ID NO: 2) consisting of 201 bases (including the stop codon) 252) (SEQ ID NO: 262). The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 222) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 232 was calculated to be 43624 Da. The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 252) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 262 was calculated to be 6797 Da.
Example 63 Expression of the protein of the present invention (A23) in Escherichia coli
(1) Preparation of transformed Escherichia coli having the DNA (A23) of the present invention
Using the chromosomal DNA of Streptomyces roseoseubens IFO 13682T prepared in Example 62 (1) as a template, and an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 313 and an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 314 as primers PCR was performed in the same manner as in Example 49 (1) except for using PCR. DNA was purified from the PCR reaction solution in the same manner as in Example 32 (1), and cloned into a pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by INVITROGEN). The nucleotide sequence of the obtained plasmid DNA was analyzed using oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 67, 68, 309, 311, and 315 as primers. Based on the obtained results, a plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 242 was designated as pCR1584F. In the same manner as in Example 32 (1), pCR1584F was digested with restriction enzymes NdeI and HindIII, and a DNA of about 1.5 kbp was purified from the digest. By ligating the obtained DNA with the plasmid pKSN2 digested with NdeI and HindIII, the DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 242 and encoding the protein of the present invention (A23) was ligated to the NdeI site of pKSN2. A plasmid (hereinafter, referred to as pKSN1584F) inserted between the HindIII site was obtained. The plasmid was introduced into E. coli JM109, and the resulting E. coli transformant was designated as JM109 / pKSN1584F.
(2) Expression of the protein (A23) of the present invention in Escherichia coli and recovery of the protein
Escherichia coli JM109 / pKSN1584F and JM109 / pKSN2 were each cultured in the same manner as in Example 4 (2), and then the cells were collected to prepare a cell lysate. From the obtained crushed liquid, a supernatant fraction (hereinafter, the supernatant fraction obtained from Escherichia coli JM109 / pKSN1584F) was purified from Escherichia coli extract pKSN1584F and Escherichia coli JM109 / pKSN2 by the method described in Example 4 (2). The obtained supernatant fraction was referred to as Escherichia coli extract pKSN2).
(3) Assay for ability to convert compound (II) to compound (III)
A reaction solution (30 μl) was prepared in the same manner as in Example 32 (3), and kept at 30 ° C. for 10 minutes. However, the supernatant fraction (E. coli extract pKSN1584F or E. coli extract pKSN2) collected in Example 63 (2) was used as the supernatant fraction. After the incubation, each reaction solution was extracted with ethyl acetate, and the obtained extract was analyzed by TLC. On the TLC plate after development¹⁴The presence or absence of spots (Rf values 0.24 and 0.29) corresponding to compound (III) labeled with C was examined. A spot corresponding to the compound (III) was detected from the reaction solution containing the E. coli extract pKSN1584F. On the other hand, in the reaction solution containing the E. coli extract pKSN2, the spot was not detected.
Example 64: Acquisition of DNA (A24) of the present invention
(1) Preparation of Streptomyces \ ruggersensis \ IFO \ 15875T chromosomal DNA
According to the method described in Example 31 (1), chromosomal DNA of Streptomyces \ rutgersensis \ IFO \ 15875T was prepared.
(2) Isolation of a DNA having a partial nucleotide sequence of the DNA (A24) of the present invention
PCR was carried out according to the method described in Example 29 using the chromosomal DNA of Streptomyces rutgersensis IFO 15875T prepared in Example 64 (1) as a template and the primer pair 14. In the same manner as in Example 31 (2), the amplified DNA was cloned into a pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by INVITROGEN), and the nucleotide sequence was analyzed. As a result, the base sequence represented by base numbers 322 to 1057 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 233 was read.
Further, the chromosomal DNA prepared in Example 64 (1) was digested with a restriction enzyme SmaI. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 316 and primer AP1, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) to obtain a primary PCR product. Was. Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 317 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 1 to 384 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 243 was read.
Further, the chromosomal DNA prepared in Example 64 (1) was digested with restriction enzyme NaeI. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 318 and primer AP1 under the conditions described in Example 26 (3), PCR was performed to obtain a primary PCR product. Was. Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template, and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 319 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 992-1466 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 243 was read.
(3) Base sequence analysis of the DNA (A24) of the present invention
By linking the nucleotide sequences read from the DNA obtained in Example 64 (2), the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 243 was obtained. There were two open reading frames (ORFs) in the nucleotide sequence. That is, a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 233) consisting of 1245 bases (including a stop codon) and encoding 414 amino acid residues (SEQ ID NO: 223), and 65 amino acid residues (SEQ ID NO :) comprising 198 bases (including a stop codon) 253) (SEQ ID NO: 263). The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 223) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 233 was calculated to be 45830 Da. The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 253) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 263 was calculated to be 7034 Da.
Example 65 Expression of the protein of the present invention (A24) in Escherichia coli
(1) Preparation of transformed E. coli having the DNA (A24) of the present invention
Using, as a primer, the oligonucleotide having the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 320 and the oligonucleotide having the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 321 using the chromosomal DNA of Streptomyces ｔ rutgersensis IFO 15875T prepared in Example 64 (1) as a template PCR was performed in the same manner as in Example 49 (1) except for using PCR. DNA was purified from the PCR reaction solution in the same manner as in Example 32 (1), and cloned into a pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by INVITROGEN). The nucleotide sequence of the obtained plasmid DNA was analyzed using oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 67, 68, and 322 as primers. Based on the obtained results, a plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 243 was designated as pCR1589BF. In the same manner as in Example 32 (1), pCR1589BF was digested with restriction enzymes NdeI and HindIII, and about 1.5 kbp of DNA was purified from the digest. By ligating the obtained DNA with the plasmid pKSN2 digested with NdeI and HindIII, the DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 243 and encoding the protein of the present invention (A24) was ligated to the NdeI site of pKSN2. A plasmid (hereinafter, referred to as pKSN1589BF) inserted between the HindIII site was obtained. The plasmid was introduced into Escherichia coli JM109, and the obtained Escherichia coli transformant was designated as JM109 / pKSN1589BF.
(2) Expression of the protein (A24) of the present invention in E. coli and recovery of the protein
After culturing Escherichia coli JM109 / pKSN1589BF and JM109 / pKSN2, respectively, in the same manner as in Example 4 (2), the cells were collected, and a cell lysate was prepared. From the obtained crushed liquid, a supernatant fraction (hereinafter, the supernatant fraction obtained from Escherichia coli JM109 / pKSN1589BF was purified from Escherichia coli extract pKSN1589BF and Escherichia coli JM109 / pKSN2) by the method described in Example 4 (2). The obtained supernatant fraction was referred to as Escherichia coli extract pKSN2).
(3) Assay for ability to convert compound (II) to compound (III)
A reaction solution (30 μl) was prepared in the same manner as in Example 32 (3), and kept at 30 ° C. for 10 minutes. However, the supernatant fraction (E. coli extract pKSN1589BF or E. coli extract pKSN2) recovered in Example 65 (2) was used as the supernatant fraction. After the incubation, each reaction solution was extracted with ethyl acetate, and the obtained extract was analyzed by TLC. On the TLC plate after development¹⁴The presence or absence of spots (Rf values 0.24 and 0.29) corresponding to compound (III) labeled with C was examined. A spot corresponding to the compound (III) was detected from the reaction solution containing the E. coli extract pKSN1589BF. On the other hand, in the reaction solution containing the E. coli extract pKSN2, the spot was not detected.
Example 66: Acquisition of DNA (A25) of the present invention
(1) Preparation of Streptomyces \ steffisburgensis \ IFO \ 13446T chromosomal DNA
According to the method described in Example 31 (1), chromosomal DNA of Streptomyces \ steffisburgensis \ IFO \ 13446T was prepared.
(2) Isolation of DNA having partial nucleotide sequence of DNA (A25) of the present invention
PCR was carried out according to the method described in Example 29 using the chromosomal DNA of Streptomyces \ steffisburgensis \ IFO \ 13446T prepared in Example 66 (1) as a template and primer pair 14. In the same manner as in Example 31 (2), the amplified DNA was cloned into a pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by INVITROGEN), and the nucleotide sequence was analyzed. As a result, the base sequence represented by base numbers 289 to 1015 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 234 was read.
Further, the chromosomal DNA prepared in Example 66 (1) was digested with a restriction enzyme SmaI. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 323 and primer AP1, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) to obtain a primary PCR product. Was. Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 324 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 1 to 303 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 244 was read.
Further, the chromosomal DNA prepared in Example 66 (1) was digested with a restriction enzyme PmacI. Using the obtained DNA, a Genome @ Walker library was prepared by the method described in Example 26 (3). Using the obtained library as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 311 and primer AP1, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) to obtain a primary PCR product. Was. Next, PCR was performed under the conditions described in Example 26 (3) using the primary PCR product as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 325 and primer AP2. The nucleotide sequence of the obtained DNA was analyzed. The base sequence represented by base numbers 966 to 1411 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 244 was read.
(3) Base sequence analysis of the DNA (A25) of the present invention
By linking the nucleotide sequences read from the DNA obtained in Example 66 (2), the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 244 was obtained. There were two open reading frames (ORFs) in the nucleotide sequence. That is, a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 234) consisting of 1197 bases (including a stop codon) and encoding 398 amino acid residues (SEQ ID NO: 224), and 66 amino acid residues (SEQ ID NO :) consisting of 201 bases (including a stop codon) 254) (SEQ ID NO: 264). The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 224) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 234 was calculated to be 44175 Da. The molecular weight of the protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 254) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 264 was calculated to be 6,686 Da.
Example 67 Expression of the protein (A25) of the present invention in Escherichia coli
(1) Preparation of transformed Escherichia coli having the DNA (A25) of the present invention
Using, as a template, the chromosomal DNA of Streptomyces \ steffisburgensis \ IFO \ 13446T prepared in Example 66 (1) as a template, the oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 326 and the oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 327 PCR was performed in the same manner as in Example 49 (1) except for using PCR. DNA was purified from the PCR reaction solution in the same manner as in Example 32 (1), and cloned into a pCRII-TOPO cloning vector (manufactured by INVITROGEN). The nucleotide sequence of the obtained plasmid DNA was analyzed using oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 67, 68, 311, 315, and 323 as primers. Based on the obtained results, a plasmid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 244 was designated as pCR1609F. In the same manner as in Example 32 (1), pCR1609F was digested with restriction enzymes NdeI and HindIII, and a DNA of about 1.5 kbp was purified from the digest. By ligating the obtained DNA with the plasmid pKSN2 digested with NdeI and HindIII, the DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 244 and encoding the protein of the present invention (A25) was ligated to the NdeI site of pKSN2. A plasmid (hereinafter, referred to as pKSN1609F) inserted between the HindIII site was obtained. The plasmid was introduced into Escherichia coli JM109, and the obtained Escherichia coli transformant was designated as JM109 / pKSN1609F.
(2) Expression of the protein (A25) of the present invention in Escherichia coli and recovery of the protein
Escherichia coli JM109 / pKSN1609F and JM109 / pKSN2 were each cultured in the same manner as in Example 4 (2), and then the cells were collected to prepare a cell lysate. From the obtained crushed liquid, a supernatant fraction (hereinafter, the supernatant fraction obtained from Escherichia coli JM109 / pKSN1609F) was purified from Escherichia coli extract pKSN1609F and Escherichia coli JM109 / pKSN2 by the method described in Example 4 (2). The obtained supernatant fraction was referred to as Escherichia coli extract pKSN2).
(3) Assay for ability to convert compound (II) to compound (III)
A reaction solution (30 μl) was prepared in the same manner as in Example 32 (3), and kept at 30 ° C. for 10 minutes. However, the supernatant fraction (E. coli extract pKSN1609F or E. coli extract pKSN2) collected in Example 67 (2) was used as the supernatant fraction. After the incubation, each reaction solution was extracted with ethyl acetate, and the obtained extract was analyzed by TLC. On the TLC plate after development¹⁴The presence or absence of spots (Rf values 0.24 and 0.29) corresponding to compound (III) labeled with C was examined. A spot corresponding to the compound (III) was detected from the reaction solution containing the E. coli extract pKSN1609F. On the other hand, in the reaction solution containing the E. coli extract pKSN2, the spot was not detected.
Example 68 Metabolism of Compounds by the Proteins of the Present Invention (A16), (A17), (A18), (A19), (A20), (A21), (A22), (A23), (A24) or (A25)
Metabolism of compound (XII) by protein (A16) of the present invention
12.5 ppm of compound (XII), 3 mM β-NADPH (A component, manufactured by Oriental Yeast), 1 mg / ml spinach-derived ferredoxin (B component, SIGMA), 0.15 U / ml ferredoxin reductase (C 100 μl of a 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 49 (2) and the supernatant fraction collected in Example 49 (2) was prepared and kept at 30 ° C. for 10 minutes. . Also, 100 μl of a reaction solution comprising the components A, B, and C in the above reaction solution composition and a 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) not containing the supernatant fraction collected in Example 49 (2). Was prepared and kept warm in the same manner. After the incubation, 5 μl of 2N hydrochloric acid and 100 μl of ethanol were added to each reaction solution, and the mixture was stirred. The supernatant obtained by centrifugation at 8000 × g was filtered using an Ultrafree-MC 0.22 μm filter unit (Millipore). did. The obtained filtrate [hereinafter, the filtrate derived from the reaction solution containing the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 49 (2) is referred to as (XII) metabolite (A16). The filtrate derived from the reaction solution which does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 49 (2) is referred to as (XII) control solution (A16). ] Was subjected to HPLC analysis under the HPLC analysis condition 1 described above. (XII) The concentration of compound (XII) detected from (XII) metabolite (A16) was lower than the concentration of compound (XII) detected from control solution (A16). In addition, a peak not detected in the (XII) control solution (A16) was detected from the (XII) metabolite (A16). The elution time of this peak by HPLC coincided with the elution time of the peak of a compound having a mass 14 smaller than that of compound (XII), which was detected in Example 41 (2) from (XII) metabolite (A1). .
(2) Metabolism of compound (XII) by protein (A17) of the present invention
Using 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 51 (2) in place of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 49 (2), the reaction solution was prepared according to the method described in Example 68 (1). Was prepared and kept warm. Each reaction solution after the incubation was prepared in the same manner as in Example 68 (1), and the obtained filtrate [hereinafter referred to as A component, B component, C component and the supernatant fraction recovered in Example 51 (2)] The filtrate derived from the reaction solution containing the fractions is referred to as (XII) metabolite (A17). The filtrate derived from the reaction solution which does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 51 (2) is referred to as (XII) control solution (A17). ] Was subjected to HPLC analysis under the HPLC analysis condition 1 described above. (XII) The concentration of the compound (XII) detected from the (XII) metabolite (A17) was lower than the concentration of the compound (XII) detected from the control solution (A17). In addition, a peak not detected in the (XII) control solution (A17) was detected from the (XII) metabolite (A17). The elution time of this peak by HPLC coincided with the elution time of the peak of a compound having a mass 14 smaller than that of compound (XII), which was detected in Example 41 (2) from (XII) metabolite (A1). .
(3) Metabolism of compound (XII) by protein (A18) of the present invention
Using 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 53 (2) instead of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 49 (2), the reaction solution was prepared according to the method described in Example 68 (1). Was prepared and kept warm. Each reaction solution after the incubation was prepared in the same manner as in Example 68 (1), and the obtained filtrate [hereinafter referred to as A component, B component, C component and the supernatant fraction recovered in Example 53 (2)] The filtrate derived from the reaction solution containing the fractions is referred to as (XII) metabolite (A18). The filtrate derived from the reaction solution which does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 53 (2) is referred to as (XII) control solution (A18). ] Was subjected to HPLC analysis under the HPLC analysis condition 1 described above. (XII) The concentration of the compound (XII) detected from the metabolite (A18) was lower than the concentration of the compound (XII) detected from the control solution (A18). In addition, a peak that was not detected in the (XII) control solution (A18) was detected from the (XII) metabolite solution (A18). The elution time of this peak by HPLC coincided with the elution time of the peak of a compound having a mass 14 smaller than that of compound (XII), which was detected in Example 41 (2) from (XII) metabolite (A1). .
(4) Metabolism of compound (XII) by protein (A19) of the present invention
A reaction solution was prepared according to the method described in Example 68 (1) using 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 55 (2) instead of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 49 (2). Was prepared and kept warm. Each reaction solution after the incubation was prepared in the same manner as in Example 68 (1), and the obtained filtrate [hereinafter referred to as A component, B component, C component and the supernatant fraction collected in Example 55 (2)] The filtrate derived from the reaction solution containing the fractions is referred to as (XII) metabolite (A19). The filtrate derived from the reaction solution which does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 55 (2) is referred to as (XII) control solution (A19). ] Was subjected to HPLC analysis under the HPLC analysis condition 1 described above. (XII) The concentration of compound (XII) detected from (XII) metabolite (A19) was lower than the concentration of compound (XII) detected from control solution (A19). In addition, a peak not detected in the (XII) control solution (A19) was detected from the (XII) metabolite (A19). The elution time of this peak by HPLC coincided with the elution time of the peak of a compound having a mass 14 smaller than that of compound (XII), which was detected in Example 41 (2) from (XII) metabolite (A1). .
(5) Metabolism of compound (XII) by protein (A20) of the present invention
The reaction solution was prepared according to the method described in Example 68 (1) using 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 57 (2) instead of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 49 (2). Was prepared and kept warm. Each reaction solution after the incubation was prepared in the same manner as in Example 68 (1), and the obtained filtrate [hereinafter referred to as A component, B component, C component and the supernatant fraction recovered in Example 57 (2)] The filtrate derived from the reaction solution containing the fractions is referred to as (XII) metabolite (A20). The filtrate derived from the reaction solution which does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 57 (2) is referred to as (XII) control solution (A20). ] Was subjected to HPLC analysis under the HPLC analysis condition 1 described above. (XII) The concentration of the compound (XII) detected from the metabolite (A20) was lower than the concentration of the compound (XII) detected from the control solution (A20). In addition, a peak that was not detected in the (XII) control solution (A20) was detected from the (XII) metabolite solution (A20). The elution time of this peak by HPLC coincided with the elution time of the peak of a compound having a mass 14 smaller than that of compound (XII), which was detected in Example 41 (2) from (XII) metabolite (A1). .
(6) Metabolism of compound (XII) by the protein (A21) of the present invention
The reaction solution was prepared according to the method described in Example 68 (1) using 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 59 (2) instead of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 49 (2). Was prepared and kept warm. Each reaction solution after the incubation was prepared in the same manner as in Example 68 (1), and the obtained filtrate [hereinafter referred to as A component, B component, C component and the supernatant fraction recovered in Example 59 (2)] The filtrate derived from the reaction solution containing the fractions is referred to as (XII) metabolite (A21). The filtrate derived from the reaction solution containing no A component, B component, C component and the supernatant fraction collected in Example 59 (2) is referred to as (XII) control solution (A21). ] Was subjected to HPLC analysis under the HPLC analysis condition 1 described above. (XII) The concentration of the compound (XII) detected from the metabolite (A21) was lower than the concentration of the compound (XII) detected from the control solution (A21). In addition, a peak that was not detected in the (XII) control solution (A21) was detected from the (XII) metabolite (A21). The elution time of this peak by HPLC coincided with the elution time of the peak of a compound having a mass 14 smaller than that of compound (XII), which was detected in Example 41 (2) from (XII) metabolite (A1). .
(7) Metabolism of compound (XII) by the protein (A22) of the present invention
Using 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 61 (2) instead of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 49 (2), the reaction solution was prepared according to the method described in Example 68 (1). Was prepared and kept warm. Each reaction solution after the incubation was prepared in the same manner as in Example 68 (1), and the obtained filtrate [hereinafter referred to as A component, B component, C component and the supernatant fraction recovered in Example 61 (2)] The filtrate derived from the reaction solution containing the fractions is referred to as (XII) metabolite (A22). The filtrate derived from the reaction solution containing no A component, B component, C component and the supernatant fraction collected in Example 61 (2) is referred to as (XII) control solution (A22). ] Was subjected to HPLC analysis under the HPLC analysis condition 1 described above. (XII) The concentration of the compound (XII) detected from the metabolite (A22) was lower than the concentration of the compound (XII) detected from the control solution (A22). Further, a peak not detected in the (XII) control solution (A22) was detected from the (XII) metabolite solution (A22). The elution time of this peak by HPLC coincided with the elution time of the peak of a compound having a mass 14 smaller than that of compound (XII), which was detected in Example 41 (2) from (XII) metabolite (A1). .
(8) Metabolism of compound (XII) by protein (A23) of the present invention
Using 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 63 (2) instead of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 49 (2), the reaction solution was prepared according to the method described in Example 68 (1). Was prepared and kept warm. Each reaction solution after the incubation was prepared in the same manner as in Example 68 (1), and the obtained filtrate [hereinafter referred to as A component, B component, C component and the supernatant fraction recovered in Example 63 (2)] The filtrate derived from the reaction solution containing the fractions is referred to as (XII) metabolite (A23). The filtrate derived from the reaction solution which does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 63 (2) is referred to as (XII) control solution (A23). ] Was subjected to HPLC analysis under the HPLC analysis condition 1 described above. (XII) The concentration of the compound (XII) detected from the metabolite (A23) was lower than that of the compound (XII) detected from the control solution (A23). Further, a peak not detected in the (XII) control solution (A23) was detected from the (XII) metabolite solution (A23). The elution time of this peak by HPLC coincided with the elution time of the peak of a compound having a mass 14 smaller than that of compound (XII), which was detected in Example 41 (2) from (XII) metabolite (A1). .
(9) Metabolism of compound (XII) by protein (A24) of the present invention
A reaction solution was prepared according to the method described in Example 68 (1) using 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 65 (2) instead of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 49 (2). Was prepared and kept warm. Each reaction solution after the incubation was prepared in the same manner as in Example 68 (1), and the obtained filtrate [hereinafter referred to as A component, B component, C component and the supernatant fraction recovered in Example 65 (2)] The filtrate derived from the reaction solution containing the fractions is referred to as (XII) metabolite (A24). The filtrate derived from the reaction solution which does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 65 (2) is referred to as (XII) control solution (A24). ] Was subjected to HPLC analysis under the HPLC analysis condition 1 described above. (XII) The concentration of the compound (XII) detected from the metabolite (A24) was lower than the concentration of the compound (XII) detected from the control solution (A24). In addition, a peak not detected in the (XII) control solution (A24) was detected from the (XII) metabolite (A24). The elution time of this peak by HPLC coincided with the elution time of the peak of a compound having a mass 14 smaller than that of compound (XII), which was detected in Example 41 (2) from (XII) metabolite (A1). .
(10) Metabolism of compound (XII) by protein (A25) of the present invention
The reaction solution was prepared according to the method described in Example 68 (1) using 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 67 (2) instead of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 49 (2). Was prepared and kept warm. Each reaction solution after the incubation was prepared in the same manner as in Example 68 (1), and the obtained filtrate [hereinafter referred to as A component, B component, C component and the supernatant fraction recovered in Example 67 (2)] The filtrate derived from the reaction solution containing the mixture is referred to as (XII) metabolite (A25). The filtrate derived from the reaction solution which does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 67 (2) is referred to as (XII) control solution (A25). ] Was subjected to HPLC analysis under the HPLC analysis condition 1 described above. (XII) The concentration of compound (XII) detected from (XII) metabolite (A25) was lower than the concentration of compound (XII) detected from control solution (A25). In addition, a peak not detected in the (XII) control solution (A25) was detected from the (XII) metabolite (A25). The elution time of this peak by HPLC coincided with the elution time of the peak of a compound having a mass 14 smaller than that of compound (XII), which was detected in Example 41 (2) from (XII) metabolite (A1). .
(11) Metabolism of compound (XIII) by protein (A17) of the present invention
Using 12.5 ppm of compound (XIII) instead of 12.5 ppm of compound (XII), a reaction solution was prepared and kept warm according to the method described in Example 68 (2). Each reaction solution after the incubation was prepared in the same manner as in Example 68 (1), and the obtained filtrate [hereinafter referred to as A component, B component, C component and the supernatant fraction recovered in Example 51 (2)] The filtrate derived from the reaction solution containing the mixture is referred to as (XIII) metabolite (A17). The filtrate derived from the reaction solution which does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 51 (2) is referred to as (XIII) control solution (A17). ] Was subjected to HPLC analysis under the HPLC analysis condition 1 described above. (XIII) The concentration of compound (XIII) detected from (XIII) metabolite (A17) was lower than the concentration of compound (XIII) detected from control solution (A17). In addition, a peak not detected in the (XIII) control solution (A17) was detected from the (XIII) metabolite (A17). The elution time of this peak by HPLC was consistent with the elution time of the peak of a compound having a mass 14 smaller than that of the compound (XIII), which was detected from the (XIII) metabolite (A1) in Example 41 (3). .
(12) Metabolism of compound (XIII) by protein (A18) of the present invention
Using 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 53 (2) in place of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 51 (2), the reaction solution was prepared according to the method described in Example 68 (11). Was prepared and kept warm. Each reaction solution after the incubation was prepared in the same manner as in Example 68 (1), and the obtained filtrate [hereinafter referred to as A component, B component, C component and the supernatant fraction recovered in Example 53 (2)] The filtrate derived from the reaction solution containing the fractions is referred to as (XIII) metabolite (A18). The filtrate derived from the reaction solution which does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 53 (2) is referred to as (XIII) control solution (A18). ] Was subjected to HPLC analysis under the HPLC analysis condition 1 described above. (XIII) The concentration of the compound (XIII) detected from the (XIII) metabolite (A18) was lower than the concentration of the compound (XIII) detected from the control solution (A18). In addition, a peak that was not detected in the (XIII) control solution (A18) was detected from the (XIII) metabolite (A18). The elution time of this peak by HPLC was consistent with the elution time of the peak of a compound having a mass 14 smaller than that of the compound (XIII), which was detected from the (XIII) metabolite (A1) in Example 41 (3). .
(13) Metabolism of compound (XIII) by protein (A19) of the present invention
Using 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 55 (2) in place of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 51 (2), the reaction solution was prepared according to the method described in Example 68 (11). Was prepared and kept warm. Each reaction solution after the incubation was prepared in the same manner as in Example 68 (1), and the obtained filtrate [hereinafter referred to as A component, B component, C component and the supernatant fraction collected in Example 55 (2)] The filtrate derived from the reaction solution containing the fractions is referred to as (XIII) metabolite (A19). The filtrate derived from the reaction solution which does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 55 (2) is referred to as (XIII) control solution (A19). ] Was subjected to HPLC analysis under the HPLC analysis condition 1 described above. (XIII) The concentration of the compound (XIII) detected from the (XIII) metabolite (A19) was lower than the concentration of the compound (XIII) detected from the control solution (A19). In addition, a peak not detected in the (XIII) control solution (A19) was detected from the (XIII) metabolite (A19). The elution time of this peak by HPLC was consistent with the elution time of the peak of a compound having a mass 14 smaller than that of the compound (XIII), which was detected from the (XIII) metabolite (A1) in Example 41 (3). .
(14) Metabolism of compound (XIII) by protein (A20) of the present invention
Using 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 57 (2) instead of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 51 (2), the reaction solution was prepared according to the method described in Example 68 (11). Was prepared and kept warm. Each reaction solution after the incubation was prepared in the same manner as in Example 68 (1), and the obtained filtrate [hereinafter referred to as A component, B component, C component and the supernatant fraction recovered in Example 57 (2)] The filtrate derived from the reaction solution containing the fractions is referred to as (XIII) metabolite (A20). The filtrate derived from the reaction solution which does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 57 (2) is referred to as (XIII) control solution (A20). ] Was subjected to HPLC analysis under the HPLC analysis condition 1 described above. (XIII) The concentration of compound (XIII) detected from (XIII) metabolite (A20) was lower than the concentration of compound (XIII) detected from control solution (A20). In addition, a peak not detected in the (XIII) control solution (A20) was detected from the (XIII) metabolite (A20). The elution time of this peak by HPLC was consistent with the elution time of the peak of a compound having a mass 14 smaller than that of the compound (XIII), which was detected from the (XIII) metabolite (A1) in Example 41 (3). .
(15) Metabolism of compound (XIII) by protein (A21) of the present invention
Using 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 59 (2) in place of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 51 (2), the reaction solution was prepared according to the method described in Example 68 (11). Was prepared and kept warm. Each reaction solution after the incubation was prepared in the same manner as in Example 68 (1), and the obtained filtrate [hereinafter referred to as A component, B component, C component and the supernatant fraction recovered in Example 59 (2)] The filtrate derived from the reaction solution containing the mixture is referred to as (XIII) metabolite (A21). The filtrate derived from the reaction solution which does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 59 (2) is referred to as (XIII) control solution (A21). ] Was subjected to HPLC analysis under the HPLC analysis condition 1 described above. (XIII) The concentration of the compound (XIII) detected from the (XIII) metabolite (A21) was lower than the concentration of the compound (XIII) detected from the control solution (A21). Further, a peak not detected in the (XIII) control solution (A21) was detected from the (XIII) metabolite (A21). The elution time of this peak by HPLC was consistent with the elution time of the peak of a compound having a mass 14 smaller than that of the compound (XIII), which was detected from the (XIII) metabolite (A1) in Example 41 (3). .
(16) Metabolism of compound (XIII) by protein (A23) of the present invention
The reaction solution was prepared according to the method described in Example 68 (11) using 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 63 (2) instead of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 51 (2). Was prepared and kept warm. Each reaction solution after the incubation was prepared in the same manner as in Example 68 (1), and the obtained filtrate [hereinafter referred to as A component, B component, C component and the supernatant fraction recovered in Example 63 (2)] The filtrate derived from the reaction solution containing the metabolite is referred to as (XIII) metabolite (A23). The filtrate derived from the reaction solution which does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 63 (2) is referred to as (XIII) control solution (A23). ] Was subjected to HPLC analysis under the HPLC analysis condition 1 described above. (XIII) The concentration of compound (XIII) detected from (XIII) metabolite (A23) was lower than the concentration of compound (XIII) detected from control solution (A23). Further, a peak not detected in the (XIII) control solution (A23) was detected from the (XIII) metabolite (A23). The elution time of this peak by HPLC was consistent with the elution time of the peak of a compound having a mass 14 smaller than that of the compound (XIII), which was detected from the (XIII) metabolite (A1) in Example 41 (3). .
(17) Metabolism of compound (XIII) by protein (A25) of the present invention
A reaction solution was prepared according to the method described in Example 68 (11) using 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 67 (2) instead of 20 μl of the supernatant fraction collected in Example 51 (2). Was prepared and kept warm. Each reaction solution after the incubation was prepared in the same manner as in Example 68 (1), and the obtained filtrate [hereinafter referred to as A component, B component, C component and the supernatant fraction recovered in Example 67 (2)] The filtrate derived from the reaction solution containing the metabolite is referred to as (XIII) metabolite (A25). The filtrate derived from the reaction solution which does not contain the A component, the B component, the C component and the supernatant fraction collected in Example 67 (2) is referred to as (XIII) control solution (A25). ] Was subjected to HPLC analysis under the HPLC analysis condition 1 described above. (XIII) The concentration of the compound (XIII) detected from the metabolite (A25) was lower than that of the compound (XIII) detected from the control solution (A25). In addition, a peak not detected in the (XIII) control solution (A25) was detected from the (XIII) metabolite solution (A25). The elution time of this peak by HPLC was consistent with the elution time of the peak of a compound having a mass 14 smaller than that of the compound (XIII), which was detected from the (XIII) metabolite (A1) in Example 41 (3). .
Example 69 Hybridization using DNA (A1), (A2), (A3) or (A4) of the present invention as a probe
(1) Preparation of probe
PCR was performed according to the method described in Example 30 (1). However, instead of 50 ng of the chromosomal DNA of Streptomyces @ phaeochromogenes @ IFO12898 prepared in Example 3 (1), 10 ng of the chromosomal DNA of Streptomyces @ achromogenes @ IFO @ 12735 prepared in Example 3 (1) was used. As the primer, an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 328 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 329 were used. The DNA amplified by the PCR was recovered, and a DNA probe having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 109 and labeled with digoxigenin (hereinafter, referred to as DIG-labeled probe (A4)) was prepared.
(2) Preparation of plasmid solution
PCR was performed using Advantage-GC genomic polymerase mix (Clontech) using the chromosomal DNA of Streptomyces nogalator IFO 13445 prepared in Example 31 (1) as a template. As the primer, an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 330 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 331 were used. To the PCR reaction solution, two types of primers were each added to 200 nM, 10 ng of chromosomal DNA, 4.0 μl of dNTP mix (mixture of four types of 2.5 mM dNTPs), 10 μl of 5 × GC buffer were added. 0.0 μl, 25 mM Mg (OAc)₂2.2 μl, 10.0 μl of 5M GC-Melt, and 1.0 μl of Advantage-GC Genomic Polymerase Mix (Clontech) were added, and distilled water was further added to make a total volume of 50 μl. The PCR reaction conditions were as follows: after incubating at 94 ° C. for 1 minute, incubating at 94 ° C. for 10 seconds and then at 72 ° C. for 3 minutes as one cycle, and repeating this for 7 cycles, followed by 94 ° C. for 10 seconds and 67 ° C. for 3 cycles. This was repeated for 36 cycles with one minute of heat retention as one cycle, and further kept at 67 ° C. for 7 minutes. DNA was purified from the PCR reaction solution using QIAquick PCR Purification Kit (manufactured by QIAGEN) according to the attached instruction manual. The obtained DNA was ligated to a TA cloning vector pCR2.1 (manufactured by INVITROGEN) according to the instruction manual attached to the vector, and introduced into Escherichia coli TOP10F '(manufactured by INVITROGEN). Plasmid DNA was prepared from the obtained Escherichia coli transformant using QIAprep \ Spin \ Miniprep \ Kit (manufactured by QIAGEN) to obtain a plasmid solution containing the DNA (A11) of the present invention.
Similarly, an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 332 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 333, using the chromosomal DNA of Streptomyces tsusimaensis IFO 13782 prepared in Example 33 (1) as a template, Was used as a primer to perform PCR. The DNA obtained by the PCR was ligated with a vector in the same manner as described above, and then transformed into Escherichia coli. A plasmid was prepared from the obtained E. coli transformant to obtain a plasmid solution containing the DNA (A12) of the present invention.
Similarly, an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 331 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 334 were obtained using the chromosomal DNA of Streptomyces {thermocoerulesces} IFO14273t prepared in Example 35 (1) as a template. PCR was performed using as primers. The DNA obtained by the PCR was ligated with a vector in the same manner as described above, and then transformed into Escherichia coli. A plasmid was prepared from the obtained Escherichia coli transformant to obtain a plasmid solution containing the DNA (A13) of the present invention.
Similarly, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 330 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 331, using the chromosomal DNA of Streptomyces ｌｏglomeric chromogenes IFO 13673t prepared in Example 37 (1) as a template, Was used as a primer to perform PCR. The DNA obtained by the PCR was ligated with a vector in the same manner as described above, and then transformed into Escherichia coli. A plasmid was prepared from the obtained Escherichia coli transformant to obtain a plasmid solution containing the DNA (A14) of the present invention.
Similarly, an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 330 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 331, using the chromosomal DNA of Streptomyces olivochromogenes IFO 12444 prepared in Example 39 (1) as a template, Was used as a primer to perform PCR. The DNA obtained by the PCR was ligated with a vector in the same manner as described above, and then transformed into Escherichia coli. A plasmid was prepared from the obtained Escherichia coli transformant to obtain a plasmid solution containing the DNA (A15) of the present invention.
Similarly, an oligonucleotide having the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 335 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 336, using the chromosomal DNA of Streptomyces ornatus IFO 13069t prepared in Example 48 (1) as a template, Was used as a primer to perform PCR. The DNA obtained by the PCR was ligated with a vector in the same manner as described above, and then transformed into Escherichia coli. A plasmid was prepared from the resulting E. coli transformant to obtain a plasmid solution containing the DNA (A16) of the present invention.
Similarly, using the chromosomal DNA of Streptomyces griseus ATCC 10137 prepared in Example 50 (1) as a template, an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 335 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 336, Was used as a primer to perform PCR. The DNA obtained by the PCR was ligated with a vector in the same manner as described above, and then transformed into Escherichia coli. A plasmid was prepared from the obtained E. coli transformant to obtain a plasmid solution containing the DNA (A17) of the present invention.
Similarly, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 330 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 331, using the chromosomal DNA of Streptomyces achromogenes IFO 12735 prepared in Example 52 (1) as a template, Was used as a primer to perform PCR. The DNA obtained by the PCR was ligated with a vector in the same manner as described above, and then transformed into Escherichia coli. A plasmid was prepared from the obtained Escherichia coli transformant to obtain a plasmid solution containing the DNA (A18) of the present invention.
Similarly, using the chromosomal DNA of Streptomyces griseus IFO 13849T prepared in Example 54 (1) as a template, an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 333 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 335 Was used as a primer to perform PCR. The DNA obtained by the PCR was ligated with a vector in the same manner as described above, and then transformed into Escherichia coli. A plasmid was prepared from the obtained Escherichia coli transformant to obtain a plasmid solution containing the DNA (A19) of the present invention.
Similarly, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 331 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 337, using the chromosomal DNA of Streptomyces lanatas IFO @ 12787T prepared in Example 56 (1) as a template, Was used as a primer to perform PCR. The DNA obtained by the PCR was ligated with a vector in the same manner as described above, and then transformed into Escherichia coli. A plasmid was prepared from the obtained Escherichia coli transformant to obtain a plasmid solution containing the DNA (A20) of the present invention.
Similarly, an oligonucleotide having the base sequence shown by SEQ ID NO: 331 and an oligonucleotide having the base sequence shown by SEQ ID NO: 338, using the chromosomal DNA of Streptomyces misawaenensis IFO 13855T prepared in Example 58 (1) as a template, Was used as a primer to perform PCR. The DNA obtained by the PCR was ligated with a vector in the same manner as described above, and then transformed into Escherichia coli. A plasmid was prepared from the obtained Escherichia coli transformant to obtain a plasmid solution containing the DNA (A21) of the present invention.
Similarly, an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 331 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 339, using the chromosomal DNA of Streptomyces roseoserubens IFO 13682T prepared in Example 62 (1) as a template, Was used as a primer to perform PCR. The DNA obtained by the PCR was ligated with a vector in the same manner as described above, and then transformed into Escherichia coli. A plasmid was prepared from the obtained Escherichia coli transformant to obtain a plasmid solution containing the DNA (A23) of the present invention.
Similarly, an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 331 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 339, using the chromosomal DNA of Streptomyces steffisburgensis IFO 13446T prepared in Example 66 (1) as a template, Was used as a primer to perform PCR. The DNA obtained by the PCR was ligated with a vector in the same manner as described above, and then transformed into Escherichia coli. A plasmid was prepared from the obtained Escherichia coli transformant to obtain a plasmid solution containing the DNA (A25) of the present invention.
Similarly, using the chromosomal DNA of Streptomyces pallidus IFO 13434T prepared in Example 60 (1) as a template, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 340 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 341 PCR is carried out using as primers. The DNA obtained by the PCR is ligated to a vector in the same manner as described above, and then transformed into Escherichia coli. A plasmid is prepared from the obtained Escherichia coli transformant to obtain a plasmid solution containing the DNA (A22) of the present invention.
Similarly, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 342 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 343, using the chromosomal DNA of Streptomyces ｕ rutgersensis IFO 15875T prepared in Example 64 (1) as a template, Is performed using as a primer. The DNA obtained by the PCR is ligated to a vector in the same manner as described above, and then transformed into Escherichia coli. A plasmid is prepared from the obtained E. coli transformant to obtain a plasmid solution containing the DNA (A24) of the present invention.
(3) Dot blot hybridization
Plasmid DNA containing the DNA of the present invention (A11), plasmid DNA containing the DNA of the present invention (A12), plasmid DNA containing the DNA of the present invention (A13), DNA of the present invention (A14) prepared in Example 69 (2) , A plasmid DNA containing the present DNA (A15), a plasmid DNA containing the present DNA (A16), a plasmid DNA containing the present DNA (A17), a plasmid DNA containing the present DNA (A18), A plasmid DNA containing the invention DNA (A19), a plasmid DNA containing the invention DNA (A20), a plasmid DNA containing the invention DNA (A21), a plasmid DNA containing the invention DNA (A23) and the invention DNA (A25). Plasmid DNA containing 100 ng and 10 ng, respectively. And blotted by eq nylon membrane Hybond N + (manufactured by Amersham Biosciences). The resulting membrane was irradiated with ultraviolet light for 5 minutes using a transilluminator.
Hybridization and detection were performed according to the method described in Example 30 (2). As the probe, a DNA (DIG-labeled probe (A1)) having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 prepared in Example 30 (1) and labeled with digoxigenin, and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 DNA labeled with digoxigenin (DIG-labeled probe (A2)), DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 and labeled with digoxigenin (DIG-labeled probe (A3)) or prepared in Example 69 (1) The obtained DIG-labeled probes (A4) were each kept at 100 ° C. for 5 minutes, and then rapidly cooled on ice. When hybridization was performed using any of the DIG-labeled probes (A1), (A2), (A3) and (A4), a signal was detected for each of the 100 ng and 10 ng samples of the above plasmid DNA. Was.
Similarly, the plasmid DNA containing the DNA of the present invention (A22) and the plasmid DNA containing the DNA of the present invention (A24) prepared in Example 69 (2) were ligated in amounts of 100 ng and 10 ng, respectively, to a nylon membrane Hybond @ N + (Amersham). (Bioscience). Hybridization and detection are performed according to the method described in Example 30 (2).
Example 70 DNA of the present invention (A23) whose codon usage was adjusted for expression in soybean [hereinafter referred to as DNA of the present invention (A23) S] ]
(1) Preparation of DNA (A23) S of the Present Invention
Using an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 346 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 367 as primers, PCR was performed using Pyrobest DNA DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo) according to the attached instruction manual. went. PCR was similarly performed using a part of the obtained PCR product as a template and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 345 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 366 as primers. . Furthermore, PCR was carried out in the same manner using a part of this PCR product as a template and an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 344 and an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 365 as primers. The reaction solution thus obtained was designated as reaction solution 1.
In addition, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 349 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 364 were used as primers and Pyrobest DNA DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo) according to the attached instruction manual. PCR was performed. Using a part of the obtained PCR product as a template, PCR was performed in the same manner using, as primers, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 348 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 363. . Furthermore, PCR was performed using a part of this PCR product as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 347 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 362 as primers. The reaction solution thus obtained was designated as reaction solution 2.
In addition, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 352 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 361 were used as primers, and Pyrobest DNA DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo) according to the attached instruction manual. PCR was performed. Using a part of the obtained PCR product as a template, PCR was similarly performed using, as primers, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 351 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 360. . Furthermore, PCR was performed in the same manner using a part of this PCR product as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 350 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 359 as primers. The reaction solution thus obtained was designated as reaction solution 3.
In addition, using an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 355 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 358 as primers, using Pyrobest DNA DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) according to the attached instruction manual PCR was performed. PCR was similarly performed using a part of the obtained PCR product as a template and an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 354 and an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 357 as primers. . Furthermore, PCR was performed in the same manner using a part of this PCR product as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 353 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 356 as primers. The reaction solution thus obtained was designated as reaction solution 4.
The reaction solutions 1 to 4 obtained as described above are mixed, and a part thereof is used as a template, and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 344 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 356 are used as primers. PCR was performed using Pyrobest DNA DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) according to the attached instruction manual. The base sequence of the amplified DNA was confirmed, and the base sequence 5′-cat-3 ′ was located 5 ′ upstream of the base sequence represented by SEQ ID NO: 368, and the base sequence 5′-aagcttt-3 was located downstream of the 3 ′ end. 'Were obtained having DNAs each having a sequence formed by ligation.
Table 28 and Table 29 show the codon usage (GC content 46.12%) of the soybean codon usage (GC content 46.12%) of the DNA of the present invention (A23) having the base sequence represented by SEQ ID NO: 232. Tables 24 and 25 show the codon usage (GC content 52.38%) of the DNA (A23) S of the present invention having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 368 in Tables 30 and 31, respectively.
[Table 28]

[Table 29]

[Table 30]

[Table 31]

(2) Preparation of transformed Escherichia coli having the DNA (A23) S of the present invention
DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 368 obtained in Example 70 (1) was digested with restriction enzymes NdeI and HindIII. By ligating the DNA with the plasmid pKSN2 digested with NdeI and HindIII, a plasmid comprising the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 368 inserted between the NdeI and HindIII sites of pKSN2 (hereinafter, referred to as a plasmid) pKSN1584soy). The plasmid was introduced into Escherichia coli JM109, and the resulting Escherichia coli transformant was designated as JM109 / pKSN1584soy.
(3) Expression of the protein of the present invention (A23) in E. coli and recovery of the protein
The E. coli JM109 / pKSN1584 soy obtained in Example 70 (2) and the E. coli JM109 / pKSN1584F obtained in Example 63 (1) were cultured in the same manner as in Example 4 (2), and the cells were collected. Then, a cell lysate was prepared. From the obtained crushed liquid, a supernatant fraction (hereinafter, the supernatant fraction obtained from Escherichia coli JM109 / pKSN1584soy was purified from Escherichia coli extract pKSN1584soy and Escherichia coli JM109 / pKSN1584F) by the method described in Example 4 (2). The obtained supernatant fraction was referred to as an E. coli extract pKSN1584F). The amount of P450 per protein contained in the E. coli extract pKSN1584soy was larger than the amount of P450 per protein contained in the E. coli extract pKSN1584F.
Example 71 DNA of the present invention (A25) whose codon usage was adjusted for expression in soybean [hereinafter referred to as DNA of the present invention (A25) S] Production and expression
(1) Preparation of DNA (A25) S of the Present Invention
Using the oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 371 and the oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 392 as primers, PCR was performed using Pyrobest DNA DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo) according to the attached instruction manual. went. Using a part of the obtained PCR product as a template, PCR was performed in the same manner using an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 370 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 391 as primers . Furthermore, PCR was performed in the same manner using a part of this PCR product as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 369 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 390 as primers. The reaction solution thus obtained was designated as reaction solution 1.
In addition, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 374 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 389 were used as primers, and Pyrobest DNA DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo) according to the attached instruction manual. PCR was performed. Using a part of the obtained PCR product as a template, PCR was similarly performed using, as primers, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 373 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 388. . Furthermore, PCR was performed in the same manner using a part of this PCR product as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 372 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 387 as primers. The reaction solution thus obtained was designated as reaction solution 2.
In addition, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 377 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 386 were used as primers, and Pyrobest DNA DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo) according to the attached instruction manual. PCR was performed. PCR was similarly performed using a part of the obtained PCR product as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 376 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 385 as primers. . Furthermore, PCR was performed in the same manner using a part of this PCR product as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 375 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 384 as primers. The reaction solution thus obtained was designated as reaction solution 3.
In addition, using an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 380 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 383 as primers, using Pyrobest DNA DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) according to the attached instruction manual PCR was performed. PCR was similarly performed using a part of the obtained PCR product as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 379 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 382 as primers. . Furthermore, PCR was carried out in the same manner using a part of this PCR product as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 378 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 381 as primers. The reaction solution thus obtained was designated as reaction solution 4.
The reaction solutions 1 to 4 obtained as described above are mixed, and a part thereof is used as a template, and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 369 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 381 are used as primers. PCR was performed using Pyrobest DNA DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) according to the attached instruction manual. The base sequence of the amplified DNA was confirmed, and the base sequence 5′-cat-3 ′ was located upstream of the base sequence represented by SEQ ID NO: 393 and the base sequence 5′-aagcttt-3 was located downstream of the base sequence 3 ′. 'Were obtained having DNAs each having a sequence formed by ligation.
The codon usage (GC content 71.93%) of the DNA of the present invention (A25) having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 234 is shown in Tables 32 and 33, and the codon usage of GC (46.12%) in soybean is shown. Tables 24 and 25 show the codon usage (GC content 52.05%) of the DNA (A25) S of the present invention having the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 393 in Tables 34 and 35, respectively.
[Table 32]

[Table 33]

[Table 34]

[Table 35]

(2) Preparation of transformed Escherichia coli having the DNA (A25) S of the present invention
DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 393 obtained in Example 71 (1) was digested with restriction enzymes NdeI and HindIII. By ligating the DNA with the plasmid pKSN2 digested with NdeI and HindIII, a plasmid having the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 393 inserted between the NdeI and HindIII sites of pKSN2 (hereinafter, referred to as a plasmid) pKSN1609 soy). This plasmid was introduced into Escherichia coli JM109, and the obtained Escherichia coli transformant was designated as JM109 / pKSN1609soy.
(3) Expression of the protein (A25) of the present invention in Escherichia coli and recovery of the protein
The Escherichia coli JM109 / pKSN1609soy obtained in Example 71 (2) and the Escherichia coli JM109 / pKSN1609F obtained in Example 67 (1) were cultured in the same manner as in Example 4 (2), and the cells were collected. Then, a cell lysate was prepared. From the obtained crushed liquid, a supernatant fraction (hereinafter, the supernatant fraction obtained from Escherichia coli JM109 / pKSN1609soy was purified from Escherichia coli extract pKSN1609soy and Escherichia coli JM109 / pKSN1609F) by the method described in Example 4 (2). The obtained supernatant fraction was referred to as an E. coli extract pKSN1609F). The amount of P450 per protein contained in the E. coli extract pKSN1609 soy was larger than the amount of P450 per protein contained in the E. coli extract pKSN1609F.
Example 72 Inventive Antibody (A) Recognizing the Inventive Protein (A25) [Hereinafter referred to as the present antibody (A25). Preparation of
(1) Preparation of Escherichia coli extract expressing the protein (A25) of the present invention
According to the method described in Example 4 (2), Escherichia coli JM109 / pKSN1609soy expressing the protein of the present invention (A25) prepared in Example 71 (2) was pre-cultured overnight, and 50 μg of the obtained culture solution was used. The cells were inoculated into 1 L of TB medium containing 1 / ml ampicillin, cultured at 26 ° C., and further supplemented with 5-aminolevulinic acid at a final concentration of 500 μM and IPTG at a final concentration of 1 mM in the same manner. The cells were collected from the culture solution, washed with a 0.05 M Tris-HCl buffer (pH 7.5), and then suspended in 100 ml of the buffer containing 1 mM PMSF. The obtained cell culture was sonicated three times for 10 minutes using an ultrasonic crusher SONIFIER (registered trademark of Branson Sonic Power Company) under conditions of out put 5 and duty cycle 30% three times to crush the cells. A liquid was obtained. After the obtained crushed liquid is centrifuged (9,000 × g, 10 minutes), the supernatant is collected and centrifuged (200,000 × g, 70 minutes) to obtain a supernatant fraction (hereinafter, referred to as “supernatant”). The supernatant fraction obtained from Escherichia coli JM109 / pKSN1609soy was referred to as an Escherichia coli extract pKSN1609soy).
(2) Purification of the protein of the present invention (A25)
The supernatant fraction (Escherichia coli extract pKSN1609soy) obtained in Example 72 (1) was injected into HiLoad 16/10 Q Sepharose HP (manufactured by Amersham Bioscience). Next, 40 ml of 20 mM bistrispropane buffer (pH 7.0) was flowed through the column, and a 20 mM bistrispropane buffer (pH 7.0) was flowed with a linear concentration gradient of sodium chloride (sodium chloride concentration gradient 0.00125 M). / Min, a sodium chloride concentration range of 0 M to 0.375 M, a flow rate of 3 ml / min), and a 10 ml fraction eluted at a sodium chloride concentration of 0.088 M to 0.100 M was collected.
The collected fraction was applied to a PD-10 column (manufactured by Amersham Bioscience) and eluted with a 20 mM bistrispropane buffer (pH 7.0) to collect a protein-containing fraction. Subsequently, the fraction was injected into MonoQ HR 10/10 (manufactured by Amersham Bioscience), and 16 ml of 20 mM bistrispropane buffer (pH 7.0) was passed through the column. Then, a 20 mM bistrispropane buffer (pH 7.0) was flowed with a sodium chloride linear concentration gradient (sodium chloride concentration gradient 0.001042 M / min, sodium chloride concentration range 0 M to 0.25 M, flow rate 4 ml / min), 8 ml of the fraction eluted at a sodium chloride concentration of 0.060 M to 0.069 M was collected.
The collected fraction was diluted 2.5-fold with 20 mM bistrispropane buffer (pH 7.0) and injected into MonoQ HR 5/5 (Amersham Bioscience). Next, after flowing 2 ml of 20 mM bistrispropane buffer (pH 7.0) through the column, a 20 mM bistrispropane buffer (pH 7.0) was applied by applying a linear concentration gradient of sodium chloride, and a 20 mM bistrispropane buffer (pH 7.0) was supplied (sodium chloride concentration gradient 0. (008333 M / min, sodium chloride concentration range 0 M to 0.25 M, flow rate 1 ml / min), and 0.5 ml fraction eluted at a sodium chloride concentration of 0.073 M to 0.077 M was collected.
The fraction purified as described above was subjected to SDS-PAGE analysis using a PAG mini “Daiichi” 10/20 (manufactured by Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.), and a fraction mainly containing the protein of the present invention (A25) was obtained. I confirmed that there is.
(3) Preparation of the antibody (A25) of the present invention
The antibody of the present invention (A25) was prepared according to the method described in Example 44 (3). However, instead of using the protein of the present invention (A1), the protein of the present invention (A25) obtained in Example 72 (2) was used to obtain an antiserum containing the antibody of the present invention (A25).
Example 73 Detection of the protein of the present invention by the antibody (A25) of the present invention
Various E. coli extracts were subjected to immunoblotting using the antibody of the present invention (A25) obtained in Example 72 (3). Escherichia coli extract pKSN452F (containing about 2 pmol of the protein of the present invention (A16)) obtained in Example 49 (2), and Escherichia coli extract pKSN608F (about 2 pmol of the present protein (containing about 2 pmol of the present protein (A16)) obtained in Example 51 (2) A17)), the E. coli extract pKSN646BFBF obtained in Example 53 (2) (containing about 2 pmol of the protein of the present invention (A18)), and the E. coli extract pKSN1502F obtained in Example 55 (2) (about 2 pmol of the protein of the present invention (A19)), the E. coli extract pKSN1525F obtained in Example 57 (2) (containing about 2 pmol of the protein of the present invention (A20)), obtained in Example 59 (2). Escherichia coli extract pKSN1543BF (containing about 2 pmol of the protein of the present invention (A21)), Escherichia coli extract pKS obtained in Example 61 (2) 1558BF (containing about 2 pmol of the protein of the present invention (A22)), the Escherichia coli extract pKSN1584F obtained in Example 63 (2) (containing about 2 pmol of the protein of the present invention (A23)), and Example 65 (2) The obtained Escherichia coli extract pKSN1589BF (containing about 2 pmol of the protein of the present invention (A24)) and the Escherichia coli extract pKSN1609F obtained in Example 67 (2) (containing about 0.5 pmol of the present protein (A25)) Escherichia coli extract pKSN1584 soy obtained in Example 70 (3) (containing about 2 pmol of the protein of the present invention (A23)), Escherichia coli extract pKSN1609 soy obtained in Example 71 (3) (about 0.5 pmol of this product). Invention protein (A25)) and the E. coli extract pKSN2 (about 0.8 mg) obtained in Example 67 (2). The containing protein) was electrophoresed (40 mA, 1 hour) at SDS- polyacrylamide gel. The protein in this gel was transferred to a PVDF membrane according to the method described in Example 45. The PVDF film obtained in Example 45 (hereinafter, referred to as PVDF film (A)) and the PVDF film obtained by the above method (hereinafter, referred to as PVDF film (B)) are described in Example 45. The antiserum obtained in Example 72 (3) was reacted according to the method described above. Thereafter, according to the method described in Example 45, reaction with a secondary antibody, washing, and color development were performed. The PVDF membrane (A) contains the protein of the present invention (A1), (A2), (A3), (A4), (A11), (A12), (A13), (A14) and (A15), and the protein of the present invention. Color development of bands corresponding to (A9) and (A10) was detected. The PVDF membrane (B) contains the protein of the present invention (A16), (A17), (A18), (A19), (A20), (A21), (A22), (A23), (A24) and (A25). The color development of the band corresponding to. A sample of the E. coli extract pKSN2 (containing about 0.78 mg of protein) obtained in Example 4 (2) of the PVDF membrane (A), and the E. coli obtained in Example 67 (2) of the PVDF membrane (B) No color band was detected in the sample of the extract pKSN2 (containing about 0.8 mg of protein).
Example 74: Introduction of DNA (A23) S of the Present Invention into Plant
(1) Construction of chloroplast expression plasmid for direct introduction having DNA (A23) S of the present invention (1)
As a plasmid for introducing the DNA (A23) S of the present invention into a plant by the particle gun method, the codon frame does not change immediately under the chloroplast transit peptide coding sequence of the small RuBPC subunit of soybean (cv. @Jack). A plasmid containing the chimeric DNA to which the DNA (A23) S of the present invention was linked was constructed.
First, PCR was performed using pKSN1584soy obtained in Example 70 (2) as a template and an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 397 and an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 398 as primers. A DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 368 was amplified. PCR was performed using KOD-plus (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) once at 94 ° C. for 2 minutes, then at 94 ° C. for 30 seconds, at 53 ° C. for 30 seconds, and then at 68 ° C. for 90 seconds. This was carried out 20 times with the heat retention as one cycle, and finally the heat treatment was performed once at 68 ° C. for 3 minutes. The amplified DNA was recovered and purified by using MagExtractor-PCR & Gel-Clean up- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) according to the attached manual. The obtained DNA was treated with TaKaRa @ BKLKit (Takara Shuzo) according to the attached manual to blunt the end of the DNA and phosphorylate the 5 ′ end, and then the base sequence represented by SEQ ID NO: 368 Was recovered. On the other hand, after digesting plasmid pUC19 (manufactured by Takara Shuzo) with SmaI, dephosphorylation of the 5 'end was performed using Alkaline @ phosphatase (manufactured by Takara Shuzo) derived from calf small intestine. A plasmid was prepared by ligating the obtained dephosphorylated DNA and a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 368 above. After the obtained plasmid was digested with restriction enzymes EcoT22I and SacI, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 368 was recovered. After digesting the plasmid pUCrSt657 obtained in Example 16 (2) with restriction enzymes EcoT22I and SacI, the chloroplast transit peptide coding sequence of the RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack) and the base derived from the vector plasmid pUC19 About 2.9 kbp of DNA containing the sequence was isolated. By ligating the obtained DNA with a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 368 above, a codon immediately below the chloroplast transit peptide coding sequence of the RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack) was obtained. A plasmid pUCrSt1584soy (FIG. 54) containing a chimeric DNA obtained by linking the DNA (A23) S of the present invention without changing the frame was obtained.
The resulting plasmid pUCrSt1584soy was digested with restriction enzymes BamHI and SacI, and a DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 368 was isolated. The DNA was inserted between the BglII cleavage site and the SacI cleavage site of the plasmid pNdG6-ΔT obtained in Example 16 (2) to obtain a chloroplast of the small RuBPC subunit of soybean (cv. @Jack). A plasmid pSUM-NdG6-rSt-1584 soy (FIG. 55) was obtained in which the chimeric DNA obtained by linking the DNA without changing the codon frame immediately below the transit peptide coding sequence was ligated downstream of the CR16G6 promoter.
Next, the plasmid was introduced into competent cells of Escherichia coli DH5α strain (Takara Shuzo), and ampicillin-resistant strains were selected. The nucleotide sequence of the plasmid contained in the selected ampicillin-resistant strain was determined using BigDye \ Terminator \ Cycle \ Sequencing \ Ready \ Reaction \ kit \ v3.0 (manufactured by PE Applied Biosystems) and DNA Sequencer 3100 (manufactured by PE Applied Biosystems). As a result, it was confirmed that the plasmid pSUM-NdG6-rSt-1584soy had the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 368.
(2) Construction of chloroplast expression plasmid for direct introduction having DNA (A23) S of the present invention (2)
As a plasmid for introducing the DNA (A23) S of the present invention into a plant by a particle gun method, a chloroplast transit peptide of the RuBPC small subunit of soybean (cv. Jack) and a base encoding 12 amino acids of the mature protein following it A plasmid containing a chimeric DNA in which the DNA (A23) S of the present invention was linked without changing the codon frame immediately below the sequence was constructed. First, PCR was performed using pKSN1584soy obtained in Example 70 as a template and an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 399 and an oligonucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 398 as primers. DNA containing the base sequence represented by 368 was amplified. PCR was performed using KOD-plus (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) once at 94 ° C. for 2 minutes, then at 94 ° C. for 30 seconds, then at 46 ° C. for 30 seconds, and then at 68 ° C. for 90 seconds. This was carried out 25 times, with the heat retention as one cycle, and finally, once at 68 ° C. for 3 minutes. The amplified DNA was recovered and purified by using MagExtractor-PCR & Gel-Clean up- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) according to the attached manual. The resulting DNA was treated with TaKaRa @ BKLKit (Takara Shuzo) according to the attached manual to blunt the ends of the DNA and phosphorylate the 5 ′ end, and then the base sequence represented by SEQ ID NO: 368 Was recovered. On the other hand, the plasmid pKF19ΔBs obtained in Example 15 (3) was digested with SmaI, and dephosphorylated at the 5 ′ end using Alkaline @ phosphatase (Takara Shuzo) derived from calf small intestine. A plasmid was prepared by ligating the obtained dephosphorylated DNA and a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 368 above. After the obtained plasmid was digested with restriction enzymes BspHI and SacI, a DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 368 was recovered. Next, plasmid pKFrSt12-657 obtained in (3) of Example 16 was digested with restriction enzymes BspHI and SacI to isolate DNA derived from plasmid pKFrSt12. This DNA was ligated with the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 368 and cut at both ends with restriction enzymes BspHI and SacI to obtain a leaf green of RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack). Plasmid pKFrSt12-1584 soy containing a chimeric DNA in which the DNA (A23) S of the present invention is linked without altering the codon frame immediately below the base sequence encoding the body transit peptide and the subsequent 12 amino acids of the mature protein (FIG. 56) Got.
The resulting plasmid pKFrSt12-1584soy was digested with restriction enzymes BamHI and SacI, and a DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 368 was isolated. The DNA was inserted between the BglII cleavage site and the SacI cleavage site of the plasmid pNdG6-ΔT obtained in Example 16 (2) to obtain a chloroplast of the small RuBPC subunit of soybean (cv. @Jack). A plasmid pSUM-NdG6-rSt12-1584 soy (FIG. 57) was obtained in which a chimeric DNA obtained by linking the DNA without changing the codon frame immediately below the transit peptide coding sequence was linked downstream of the CR16G6 promoter.
Next, the plasmid was introduced into competent cells of Escherichia coli DH5α strain (Takara Shuzo), and ampicillin-resistant strains were selected. The nucleotide sequence of the plasmid contained in the selected ampicillin-resistant strain was determined using BigDye \ Terminator \ Cycle \ Sequencing \ Ready \ Reaction \ kit \ v3.0 (manufactured by PE Applied Biosystems) and DNA Sequencer 3100 (manufactured by PE Applied Biosystems). As a result, it was confirmed that the plasmid pSUM-NdG6-rSt-1584soy had the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 368.
(3) Introduction of the DNA (A23) S of the present invention into soybean
According to the method described in Example 47 (3), spherical embryos of soybean (variety: Fayette and Jack) were prepared.
The obtained spherical embryos were transferred to a new somatic embryo growth medium and cultured for 2 to 3 days. The plasmid pSUM-NdG6-rSt-1584soy prepared in Example 74 (1) or the plasmid pSUM-NdG6-rSt12-1584soy prepared in Example 74 (2) was added to this globular embryo, and the plasmid was prepared in Example 17 (2). ).
(4) Somatic embryo selection with hygromycin
According to the method described in Example 47 (4), the globular embryos after gene transfer obtained in Example 74 (3) are selected with hygromycin.
(5) Selection of somatic embryos using compound (II)
According to the method described in Example 47 (5), the globular embryos after gene transfer obtained in Example 74 (3) are selected using the compound (II).
(6) Individual regeneration, acclimatization and cultivation from somatic embryos
In accordance with the method described in Example 47 (6), an individual is regenerated from the globular embryo selected in Example 74 (4) or (5).
According to the method described in Example 17 (6), acclimation and cultivation are performed on the individual that has developed and rooted the true leaves, and the seeds are collected.
(7) Evaluation of resistance to compound (II) having weed control activity
According to the method described in Example 17 (4), the degree of resistance to the compound (II) of the individual regenerated plant obtained in Example 74 (6) is evaluated.
(8) Construction of Agrobacterium-introduced chloroplast expression plasmid having DNA (A23) S of the present invention
A plasmid for introducing the DNA (A23) S of the present invention into plants by the Agrobacterium method was constructed. The above plasmid pSUM-NdG6-rSt-1584soy was digested with restriction enzymes HindIII and EcoRI, and the codon frame was not changed immediately under the chloroplast transit peptide coding sequence of the RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack). DNA including a chimeric DNA to which the invention DNA (A23) S was ligated was isolated. This DNA was inserted between the restriction enzyme HindIII site and the EcoRI site of the binary vector plasmid pBI121S obtained in Example 18 to obtain pBI-NdG6-rSt-1584soy (FIG. 58). The plasmid pSUM-NdG6-rSt12-1584soy was digested with the restriction enzyme NotI, and the base sequence of the chloroplast transit peptide of the RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack) and the subsequent 12 amino acids of the mature protein were encoded. A DNA containing a chimeric DNA obtained by linking the DNA of the present invention (A23) S without changing the codon frame immediately below was isolated. This DNA was inserted between the restriction enzyme HindIII site and the EcoRI site of the binary vector plasmid pBI121S to obtain pBI-NdG6-rSt12-1584 soy (FIG. 59).
(9) Introduction of the DNA (A23) S of the present invention into tobacco
DNA (A23) S of the present invention was introduced into tobacco by the Agrobacterium method using plasmid pBI-NdG6-rSt-1584soy and plasmid pBI-NdG6-rSt12-1584soy obtained in Example 74 (8).
First, according to the method described in Example 19, the plasmids pBI-NdG6-rSt-1584soy and pBI-NdG6-rSt12-1584soy were respectively introduced into Agrobacterium tumefaciens LBA4404 strain (manufactured by Clontech), and pBI-NdG6-Sy. Alternatively, a recombinant Agrobacterium strain having pBI-NdG6-rSt12-1584soy was isolated.
Next, the gene was introduced into tobacco using the recombinant Agrobacterium strain having the above plasmid according to the method described in Example 47 (9), and pBI-NdG6-rSt-1584soy or pBI-NdG6-rSt12 was obtained. Recombinant tobacco individuals into which the -1584 soy {T-DNA} region has been incorporated are obtained.
(10) Evaluation of resistance using leaf pieces of the DNA (A23) S recombinant tobacco of the present invention
The leaves are excised from 35 recombinant tobacco plants obtained in Example 74 (9), and leaf pieces of {5-7 mm} are collected. Each leaf piece is inoculated on a MS agar medium supplemented with compound (II) or compound (XII), cultured at a light place and at room temperature, and after several days, the degree of phytotoxicity of each leaf piece is observed. Leaf pieces of wild-type tobacco are used as controls, and leaf pieces that survive continuously, half-dead leaf pieces that are phytotoxic, and leaf pieces that are whitened and dead are scored to evaluate the resistance of the recombinant tobacco.
Example 75 Introduction of DNA (A25) S of the Present Invention into Plant
(1) Construction of chloroplast expression plasmid for direct introduction having DNA (A25) S of the present invention (1)
As a plasmid for introducing the DNA (A25) S of the present invention into a plant by a particle gun method, the codon frame is not changed immediately under the chloroplast transit peptide coding sequence of the small RuBPC subunit of soybean (cv. @Jack). A plasmid containing the chimeric DNA to which the DNA (A25) S of the present invention was linked was constructed.
First, PCR was performed using pKSN1609soy obtained in Example 71 (2) as a template and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 400 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 401 as primers. A DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 393 was amplified. PCR was performed using KOD-plus (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) once at 94 ° C. for 2 minutes, then at 94 ° C. for 30 seconds, at 53 ° C. for 30 seconds, and then at 68 ° C. for 90 seconds. This was carried out 20 times with the heat retention as one cycle, and finally the heat treatment was performed once at 68 ° C. for 3 minutes. The amplified DNA was recovered and purified by using MagExtractor-PCR & Gel-Clean up- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) according to the attached manual. The obtained DNA was treated with TaKaRa @ BKLKit (Takara Shuzo) according to the attached manual to blunt the end of the DNA and phosphorylate the 5 ′ end, and then the base sequence represented by SEQ ID NO: 393 Was recovered. On the other hand, after digesting plasmid pUC19 (manufactured by Takara Shuzo) with SmaI, dephosphorylation of the 5 'end was performed using Alkaline @ phosphatase (manufactured by Takara Shuzo) derived from calf small intestine. A plasmid was prepared by ligating the obtained dephosphorylated DNA and a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 393 described above. After the obtained plasmid was digested with restriction enzymes EcoT22I and SacI, DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 393 was recovered. After digesting the plasmid pUCrSt657 obtained in Example 16 (2) with restriction enzymes EcoT22I and SacI, the chloroplast transit peptide coding sequence of the RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack) and the base derived from the vector plasmid pUC19 About 2.9 kbp of DNA containing the sequence was isolated. By ligating the obtained DNA with a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 393, a codon immediately below the chloroplast transit peptide coding sequence of the RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack) was obtained. A plasmid pUCrSt1609soy (FIG. 60) containing a chimeric DNA obtained by linking the DNA (A25) S of the present invention without changing the frame was obtained.
The resulting plasmid pUCrSt1609soy was digested with restriction enzymes BamHI and SacI, and a DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 393 was isolated. The DNA was inserted between the BglII cleavage site and the SacI cleavage site of the plasmid pNdG6-ΔT obtained in Example 16 (2) to obtain a chloroplast of the small RuBPC subunit of soybean (cv. @Jack). A plasmid pSUM-NdG6-rSt-1609 soy (FIG. 61) was obtained in which a chimeric DNA obtained by linking the DNA without changing the codon frame immediately below the transit peptide coding sequence was ligated downstream of the CR16G6 promoter.
Next, the plasmid was introduced into competent cells of Escherichia coli DH5α strain (Takara Shuzo), and ampicillin-resistant strains were selected. Furthermore, the nucleotide sequence of the plasmid contained in the selected ampicillin resistant strain was determined using BigDye \ Terminator \ Cycle \ Sequencing \ Ready \ Reaction \ kit \ v3.0 (manufactured by PE Applied Biosystems) and DNA sequencer 3100 (manufactured by PE Applied Biosystems). did. As a result, it was confirmed that the plasmid pSUM-NdG6-rSt-1609soy had the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 393.
(2) Construction of chloroplast expression plasmid for direct introduction having DNA (A25) S of the present invention (2)
As a plasmid for introducing the DNA (A25) S of the present invention into a plant by a particle gun method, a chloroplast transit peptide of a RuBPC small subunit of soybean (cv. Jack) and a base encoding 12 amino acids of a mature protein subsequent thereto A plasmid containing a chimeric DNA in which the DNA (A25) S of the present invention was ligated without changing the codon frame immediately below the sequence was constructed. First, an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 402 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 403 are annealed to the restriction site EcoT22I of the plasmid pUCrSt1609 soy obtained in Example 75 (1). By inserting the thus obtained linker EcoT22I-12aa-EcoT22I (FIG. 62), a nucleotide sequence encoding a chloroplast transit peptide of the RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack) followed by 12 amino acids of the mature protein A plasmid pUCrSt12-1609soy (FIG. 63) containing a chimeric DNA comprising the DNA (A25) S of the present invention ligated without altering the codon frame immediately below the.
The resulting plasmid pUCrSt12-1609soy was digested with restriction enzymes BamHI and SacI, and a DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 393 was isolated. The DNA was inserted between the BglII cleavage site and the SacI cleavage site of the plasmid pNdG6-ΔT obtained in Example 16 (2) to obtain a chloroplast of the small RuBPC subunit of soybean (cv. @Jack). A plasmid pSUM-NdG6-rSt12-1609 soy (FIG. 64) was obtained in which the chimeric DNA obtained by linking the DNA without changing the codon frame immediately below the transit peptide coding sequence was ligated downstream of the CR16G6 promoter.
Next, the plasmid was introduced into competent cells of Escherichia coli DH5α strain (Takara Shuzo), and ampicillin-resistant strains were selected. The nucleotide sequence of the plasmid contained in the selected ampicillin-resistant strain was determined using BigDye \ Terminator \ Cycle \ Sequencing \ Ready \ Reaction \ kit \ v3.0 (manufactured by PE Applied Biosystems) and DNA Sequencer 3100 (manufactured by PE Applied Biosystems). As a result, it was confirmed that the plasmid pSUM-NdG6-rSt-1609soy had the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 393.
(3) Introduction of the DNA (A25) S of the present invention into soybean
According to the method described in Example 47 (3), spherical embryos of soybean (variety: Fayette and Jack) were prepared.
The obtained spherical embryos were transferred to a new somatic embryo growth medium and cultured for 2 to 3 days. The plasmid pSUM-NdG6-rSt-1609soy prepared in Example 75 (1) or the plasmid pSUM-NdG6-rSt12-1609soy prepared in Example 75 (2) was added to this globular embryo, and the plasmid was prepared in Example 17 (2). ).
(4) Somatic embryo selection with hygromycin
According to the method described in Example 47 (4), the globular embryos after gene transfer obtained in Example 75 (3) are selected with hygromycin.
(5) Selection of somatic embryos using compound (II)
According to the method described in Example 47 (5), the globular embryos after gene transfer obtained in Example 75 (3) are selected using the compound (II).
(6) Individual regeneration, acclimatization and cultivation from somatic embryos
In accordance with the method described in Example 47 (6), an individual is regenerated from the globular embryo selected in Example 75 (4) or (5).
According to the method described in Example 17 (6), acclimation and cultivation are performed on the individual that has developed and rooted the true leaves, and the seeds are collected.
(7) Evaluation of resistance to compound (II) having weed control activity
According to the method described in Example 17 (4), the degree of resistance to the compound (II) of the regenerated plant individual obtained in Example 75 (6) is evaluated.
(8) Construction of a chloroplast expression plasmid for introducing Agrobacterium having the DNA (A25) S of the present invention
A plasmid for introducing the DNA (A25) S of the present invention into plants by the Agrobacterium method was constructed. The above plasmid pSUM-NdG6-rSt-1609soy was digested with the restriction enzymes HindIII and EcoRI, and the codon frame was not changed immediately under the chloroplast transit peptide coding sequence of the RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack). DNA containing a chimeric DNA to which invention DNA (A25) S was ligated was isolated. This DNA was inserted between the restriction enzyme HindIII site and the EcoRI site of the binary vector plasmid pBI121S obtained in Example 18 to obtain pBI-NdG6-rSt-1609 soy (FIG. 65). The plasmid pSUM-NdG6-rSt12-1609soy was digested with the restriction enzyme NotI, and the chloroplast transit peptide of the RuBPC small subunit of soybean (cv. @Jack) and the nucleotide sequence encoding the subsequent 12 amino acids of the mature protein were digested. A DNA containing a chimeric DNA obtained by linking the DNA of the present invention (A25) S without changing the codon frame immediately below was isolated. This DNA was inserted between the restriction enzyme HindIII site and the EcoRI site of the binary vector plasmid pBI121S to obtain pBI-NdG6-rSt12-1609soy (FIG. 66).
(9) Introduction of DNA (A25) S of the Present Invention into Tobacco
DNA (A25) S of the present invention was introduced into tobacco using the plasmid pBI-NdG6-rSt-1609soy and the plasmid pBI-NdG6-rSt12-1609soy obtained in Example 75 (8) by the Agrobacterium method.
First, according to the method described in Example 19, plasmids pBI-NdG6-rSt-1609soy and pBI-NdG6-rSt12-1609soy were respectively introduced into Agrobacterium tumefaciens {LBA4404} strain (manufactured by Clontech), and pBI-NdGs-r9-r9-r9 Alternatively, a recombinant Agrobacterium strain having pBI-NdG6-rSt12-1609 soy was isolated, respectively.
Next, the gene was introduced into tobacco using the recombinant Agrobacterium strain having the above-described plasmid according to the method described in Example 47 (9), and pBI-NdG6-rSt-1609soy or pBI-NdG6-rSt12 was obtained. Recombinant tobacco individuals in which the T-DNAｓ region of -1609 soy has been integrated are obtained.
(10) Evaluation of resistance using leaf pieces of the DNA (A25) S recombinant tobacco of the present invention
Leaf pieces were collected from the recombinant tobacco plant obtained in Example 75 (9), and the obtained leaf fragments were used in the same manner as in Example 74 (10) to obtain a recombinant tobacco compound (II) or compound (XII). Evaluate resistance.
[0237]
【The invention's effect】
INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a protein having the ability to metabolize a PPO-inhibited weed controlling compound and convert the compound into a compound having a lower controlling activity, a DNA encoding the protein, a plant resistant to a weed controlling compound expressing the protein, and the like. Can be provided.
[0238]
[Sequence List Free Text]
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A designed polynucleotide encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
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Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 367
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 368
Designed polynucleotide encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222
SEQ ID NO: 369
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 370
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 371
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 372
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 373
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 374
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 375
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 376
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 377
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 378
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 379
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 380
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 381
Oligonucleotide primers designed for PCR
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Oligonucleotide primers designed for PCR
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Oligonucleotide primers designed for PCR
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Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 385
Oligonucleotide primers designed for PCR
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Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 387
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 388
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 389
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 390
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 391
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 392
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 393
A designed polynucleotide encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224
SEQ ID NO: 394
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 395
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 396
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 397
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 398
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 399
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 400
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 401
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 402
Oligonucleotide linkers designed for expression vector construction
SEQ ID NO: 403
Oligonucleotide linkers designed for expression vector construction
[0239]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing annealing positions of PCR primers used for obtaining the DNA of the present invention (A1) and the DNA of the present invention (B1). Each number indicates a sequence number indicating the base sequence of the primer. Arrows indicate the annealing position of the oligonucleotide primer having the nucleotide sequence represented by the SEQ ID NO and the direction of extension of the DNA polymerase reaction from the primer, and dotted lines indicate DNA amplified by PCR using the primer. The thick line represents the region near the DNA insertion site of the vector used for the construction of the chromosomal DNA library.
FIG. 2 is a view showing annealing positions of PCR primers used for obtaining the DNA of the present invention (A2) and the DNA of the present invention (B2). Each number indicates a sequence number indicating the base sequence of the primer. Arrows indicate the annealing position of the oligonucleotide primer having the nucleotide sequence represented by the SEQ ID NO and the direction of extension of the DNA polymerase reaction from the primer, and dotted lines indicate DNA amplified by PCR using the primer. The thick line represents the region near the DNA insertion site of the vector used for the construction of the chromosomal DNA library.
FIG. 3 is a view showing annealing positions of PCR primers used for obtaining the DNA of the present invention (A4) and the DNA of the present invention (B4). Each number indicates a sequence number indicating the base sequence of the primer. Arrows indicate the annealing position of the oligonucleotide primer having the nucleotide sequence represented by the SEQ ID NO and the direction of extension of the DNA polymerase reaction from the primer, and dotted lines indicate DNA amplified by PCR using the primer. The thick line represents the region near the DNA insertion site of the vector used for the construction of the chromosomal DNA library. However, the oligonucleotide primer denoted by 57 is a primer that anneals to the region near the DNA insertion site of the vector used for the construction of the chromosomal DNA library, and does not anneal to the DNA (A4) of the present invention.
FIG. 4 is a diagram showing a restriction map of plasmid pKSN2.
FIG. 5 shows a restriction map of plasmid pCRrSt12.
FIG. 6 is a diagram showing a restriction map of plasmid pCR657ET.
FIG. 7 is a diagram showing a restriction map of plasmid pCR657FET.
FIG. 8 is a diagram showing a restriction map of plasmid pCR657Bs.
FIG. 9 is a diagram showing a restriction map of plasmid pCR657FBs.
FIG. 10 is a diagram showing a restriction map of a plasmid pUCrSt12.
FIG. 11 shows a restriction map of plasmid pUCrSt657.
FIG. 12 shows a restriction map of plasmid pUCrSt657F.
FIG. 13 is a diagram showing a restriction map of a plasmid pUCCR16G6-p / t.
FIG. 14 is a view showing a structure of a linker NotI-EcoRI obtained by annealing an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 89 and an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 90.
FIG. 15 is a view showing a restriction map of a plasmid pUCCR16G6-p / tΔ.
FIG. 16 is a view showing a structure of a linker HindIII-NotI obtained by annealing an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 91 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 92.
FIG. 17 shows a restriction map of plasmid pNdG6-ΔT.
FIG. 18 is a view showing a restriction map of a plasmid pSUM-NdG6-rSt657.
FIG. 19 is a view showing a restriction map of a plasmid pSUM-NdG6-rSt657F.
FIG. 20 is a diagram showing a restriction map of plasmid pKFrSt12.
FIG. 21 shows a restriction map of plasmid pKFrSt12-657.
FIG. 22 shows a restriction map of plasmid pKFrSt12-657F.
FIG. 23 shows a restriction map of plasmid pSUM-NdG6-rSt12-657.
FIG. 24 shows a restriction map of a plasmid pSUM-NdG6-rSt12-657F.
FIG. 25 is a view showing the structure of a linker HindIII-NotI-EcoRI obtained by annealing an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 98 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 99.
FIG. 26 is a diagram showing a restriction map of plasmid pBI121S.
FIG. 27 shows a restriction map of plasmid pBI-NdG6-rSt-657.
FIG. 28 shows a restriction map of plasmid pBI-NdG6-rSt-657F.
FIG. 29 shows a restriction map of plasmid pBI-NdG6-rSt12-657.
FIG. 30 shows a restriction map of plasmid pBI-NdG6-rSt12-657F.
FIG. 31 shows a restriction map of plasmid pCR923Sp.
FIG. 32 is a view showing a restriction map of a plasmid pNdG6-rSt12.
FIG. 33 shows a restriction map of plasmid pSUM-NdG6-rSt-923.
FIG. 34 shows a restriction map of plasmid pKFrSt12-923.
FIG. 35 shows a restriction map of plasmid pSUM-NdG6-rSt12-923.
FIG. 36 shows a restriction map of plasmid pBI-NdG6-rSt-923.
FIG. 37 shows a restriction map of plasmid pBI-NdG6-rSt12-923.
FIG. 38 is a diagram showing a restriction map of a plasmid pCR671ET.
FIG. 39 shows a restriction map of plasmid pCR671Bs.
FIG. 40 is a diagram showing a restriction map of a plasmid pUCrSt671.
FIG. 41 is a diagram showing a restriction map of a plasmid pSUM-NdG6-rSt-671.
FIG. 42 shows a restriction map of plasmid pKFrSt12-671.
FIG. 43 shows a restriction map of plasmid pSUM-NdG6-rSt12-671.
FIG. 44 shows a restriction map of plasmid pBI-NdG6-rSt-671.
FIG. 45 shows a restriction map of plasmid pBI-NdG6-rSt12-671.
FIG. 46 is a photograph as a substitute for a drawing, showing the result of detecting, by agarose gel electrophoresis, DNA amplified by PCR using an oligonucleotide having a partial base sequence of the DNA (A) of the present invention as a primer. In lanes 1, 7, 8, 12, 19, 26, 27, 32, 37, 42, and 47, DNA markers (φ174 / HaeIII digest) were electrophoresed. In the other lanes, the samples shown in Tables 20 and 21 were electrophoresed.
FIG. 47 is a view showing a structure of a linker formed by annealing an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 134 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 135.
FIG. 48 is a view showing a restriction map of a plasmid pUCrSt657soy.
FIG. 49 is a view showing a restriction map of a plasmid pSUM-NdG6-rSt-657soy.
FIG. 50 is a view showing a restriction map of a plasmid pKFrSt12-657soy.
FIG. 51 shows a restriction map of plasmid pSUM-NdG6-rSt12-657soy.
FIG. 52 shows a restriction map of plasmid pBI-NdG6-rSt-657soy.
FIG. 53 shows a restriction map of a plasmid pBI-NdG6-rSt12-657soy.
FIG. 54 is a view showing a restriction map of a plasmid pUCrSt1584soy.
FIG. 55 is a view showing a restriction map of a plasmid pSUM-NdG6-rSt-1584soy.
FIG. 56 shows a restriction map of plasmid pKFrSt12-1584soy.
FIG. 57 shows a restriction map of plasmid pSUM-NdG6-rSt12-1584soy.
FIG. 58 is a view showing a restriction map of a plasmid pBI-NdG6-rSt-1584soy.
FIG. 59 is a view showing a restriction map of a plasmid pBI-NdG6-rSt12-1584soy.
FIG. 60 shows a restriction map of plasmid pUCrSt1609soy.
FIG. 61 is a view showing a restriction map of a plasmid pSUM-NdG6-rSt-1609soy.
FIG. 62 is a diagram showing a structure of a linker EcoT22I-12aa-EcoT22I obtained by annealing an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 402 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 403.
FIG. 63 shows a restriction map of plasmid pUCrSt12-1609soy.
FIG. 64 is a view showing a restriction map of a plasmid pSUM-NdG6-rSt12-1609soy.
FIG. 65 shows a restriction map of plasmid pBI-NdG6-rSt-1609soy.
FIG. 66 shows a restriction map of plasmid pBI-NdG6-rSt12-1609soy.
[Explanation of symbols]
DNAΔA1: DNA of the present invention (A1)
DNAΔA2: DNA of the present invention (A2)
DNAΔA3: DNA of the present invention (A3)
DNA A4: DNA of the present invention (A4)
DNA B1: DNA of the present invention (B1)
DNA B2: DNA of the present invention (B2)
DNA B4: DNA of the present invention (B4)
DNA @ A1S: DNA (A1) S of the present invention
DNA @ A23S: DNA of the present invention (A23) S
DNA @ A25S: DNA of the present invention (A25) S
tac @ p: tac @ promoter
rrnB @ t: rrnB @ terminator
ColE1 @ ori: origin of replication of plasmid ColE1
Amp^{r :}Ampicillin resistance gene
Soybean RuBPCssCTP: base sequence encoding chloroplast transit peptide of small subunit of ribulose-1,5-bisphosphate @ carboxylase of soybean (cv. Jack)
12aa: nucleotide sequence encoding 12 amino acids of mature protein following chloroplast transit peptide of small subunit of ribulose-1,5-bisphosphate @ carboxylase of soybean (cv. Jack)
Km^r: Kanamycin resistance gene
F1 @ ori: origin of replication of plasmid F1
CR16G6p: CR16G6 promoter
CR16t: CR16 terminator
CR16tΔ: DNA obtained by removing the base sequence downstream of the ScaI restriction site from the CR16 terminator
CR16G6pΔ: DNA obtained by removing the base sequence upstream of the NdeI restriction site from the CR16G6 promoter
NOSp: promoter of nopaline synthase gene
NPTII: Kanamycin resistance gene
NOSt: Terminator of nopaline synthase gene
GUS: β-glucuronidase gene
RB: right border sequence of T-DNA
LB: left border sequence of T-DNA
NdeI, HindIII, BspHI, EcoRI, BamHI, EcoT221, SphI, KpnI, SacI, BglII, NotI, ScaI: cleavage site of each restriction enzyme

Claims (50)

A DNA encoding a weed controlling metabolic protein selected from the following group:
<Protein group>
(A1) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(A2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(A3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(A4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108;
(A5) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and the formula (A5) in the presence of an electron transfer system from an electron donor. II)

With a compound of formula (III)

A protein having an ability to convert into a compound represented by the formula:
(A6) an electron donor having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108; A protein having the ability to convert a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system.
(A11) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159;
(A12) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160;
(A13) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136.
(A14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137.
(A15) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138.
(A16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 215.
(A17) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 216.
(A18) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 217.
(A19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 218,
(A20) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 219.
(A21) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 220.
(A22) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 221;
(A23) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222;
(A24) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 223;
(A25) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224;
(A26) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 159, 136, 137, 138, 217, 219, 220, 221 or 223, or SEQ ID NOs: 160, 215, 216; A compound having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 218, 222 or 224, and having the formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor; Having the ability to convert to the compound represented by the above formula (III).
(A27) 90% or more of any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224 A compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor, having an amino acid sequence encoded by a base sequence having the sequence identity of A protein that has the ability to convert to
(A28) Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Streptmyces achromogenes, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces thermocoerulescens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaensis, Streptomyces glomerochromogenes, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces ornatus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomyces misawanensis, S Nucleotide sequence having nucleotide number of nucleotides 1 to 29. The compound represented by the above formula (II) having the amino acid sequence encoded by DNA which can be amplified by the polymerase chain reaction used in the presence of an electron transfer system from an electron donor is represented by the above formula (III) A protein capable of converting into a compound. DNA having a base sequence selected from the following group:
<Base sequence group>
(A1) a base sequence represented by SEQ ID NO: 6;
(A2) the base sequence represented by SEQ ID NO: 7;
(A3) a base sequence represented by SEQ ID NO: 8;
(A4) the base sequence represented by SEQ ID NO: 109;
(A5) the base sequence represented by SEQ ID NO: 139,
(A6) the base sequence represented by SEQ ID NO: 140;
(A7) the base sequence represented by SEQ ID NO: 141
(A8) the base sequence represented by SEQ ID NO: 142,
(A9) the base sequence represented by SEQ ID NO: 143;
(A10) the base sequence represented by SEQ ID NO: 225,
(A11) the base sequence represented by SEQ ID NO: 226,
(A12) the base sequence represented by SEQ ID NO: 227,
(A13) the base sequence represented by SEQ ID NO: 228,
(A14) the base sequence represented by SEQ ID NO: 229,
(A15) the base sequence represented by SEQ ID NO: 230,
(A16) the base sequence represented by SEQ ID NO: 231;
(A17) the base sequence represented by SEQ ID NO: 232;
(A18) the base sequence represented by SEQ ID NO: 233,
(A19) the base sequence represented by SEQ ID NO: 234,
(A20) a base sequence having 80% or more sequence identity with any of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 6, 7, 8, or 109, and the above-described formula in the presence of an electron transfer system from an electron donor. A nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of a protein capable of converting the compound represented by (II) into the compound represented by the formula (III).
(A21) at least 90% sequence identity with any of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 139, 140, 141, 142, 143, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, or 234; An amino acid sequence of a protein having the ability to convert a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system from an electron donor. Encoding base sequence. The codon usage of the base sequence encoding the amino acid sequence of the protein whose GC content is 60% or less and 40% or more is plus or minus the codon usage of the gene of the species to which the host cell into which the DNA is introduced belongs. 2. The DNA according to claim 1, which has a nucleotide sequence within 4%. A DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 214. A DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 368. A DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 393. A DNA comprising a DNA having a base sequence encoding a signal sequence for translocation to an intracellular organelle upstream of the DNA according to claim 1 and ligated in reading frame. A DNA comprising the DNA according to claim 1 and a promoter operable in a host cell, operably linked. A vector containing the DNA according to claim 1. A method for producing a vector, comprising a step of incorporating the DNA according to claim 1 into a vector that can replicate in a host cell. A transformant obtained by introducing the DNA according to claim 1 into a host cell. The transformant according to claim 11, wherein the host cell is a microorganism cell or a plant cell. A method for producing a transformant, comprising a step of introducing the DNA according to claim 1 into a host cell. A method for producing a protein having an ability to convert the compound represented by the formula (II) into the compound represented by the formula (III), wherein the protein is produced by culturing the transformant according to claim 11. A method comprising recovering the protein. The use of the DNA according to claim 1, for producing a protein having an ability to convert the compound represented by the formula (II) into the compound represented by the formula (III). A method for imparting resistance to a weed controlling agent to a plant, comprising a step of introducing and expressing the DNA according to claim 1 into plant cells. A polynucleotide having a partial nucleotide sequence of the DNA according to claim 1 or a nucleotide sequence complementary to the partial nucleotide sequence. 18. A method for detecting a DNA encoding a protein capable of converting the compound represented by the formula (II) into the compound represented by the formula (III), wherein the DNA according to claim 1 or the DNA according to claim 17 is detected. A method comprising the step of detecting DNA to which the probe hybridizes in hybridization using the polynucleotide as a probe. A method for detecting a DNA encoding a protein having an ability to convert the compound represented by the formula (II) into the compound represented by the formula (III), wherein the polynucleotide according to claim 17 is used as a primer. A method comprising a step of detecting DNA amplified in a polymerase chain reaction. At least one of the primers is a polynucleotide selected from the group consisting of a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 124 to 128 and a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 129. 20. The method of claim 19, wherein: A method for obtaining a DNA encoding a protein capable of converting the compound represented by the formula (II) to the compound represented by the formula (III), wherein the DNA is detected by the method according to claim 18 or 19. A method for recovering DNA. 20. A method for screening a cell having a DNA encoding a protein capable of converting a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III), wherein the cell is a test cell. 14. A method comprising detecting the DNA by the method according to item 5. A weed controlling metabolic protein selected from the following group.
<Protein group>
(A1) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(A2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(A3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(A4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108;
(A5) having the amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and in the presence of an electron transfer system from an electron donor, A protein having the ability to convert the compound represented by (II) into the compound represented by formula (III).
(A6) an electron donor having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108; A protein having the ability to convert a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system.
(A11) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159;
(A12) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160;
(A13) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136.
(A14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137.
(A15) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138.
(A16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 215.
(A17) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 216.
(A18) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 217.
(A19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 218,
(A20) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 219.
(A21) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 220.
(A22) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 221;
(A23) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222;
(A24) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 223;
(A25) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224;
(A26) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 159, 136, 137, 138, 217, 219, 220, 221 or 223, or SEQ ID NOs: 160, 215, 216; A compound having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 218, 222 or 224, and having the formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor; Having the ability to convert to the compound represented by the above formula (III).
(A27) 90% or more of any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224 A compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor, having an amino acid sequence encoded by a base sequence having the sequence identity of A protein that has the ability to convert to
(A28) Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Streptmyces achromogenes, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces thermocoerulescens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaensis, Streptomyces glomerochromogenes, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces ornatus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomyces misawanensis, S Nucleotide sequence having nucleotide number of nucleotides 1 to 29. The compound represented by the above formula (II) having the amino acid sequence encoded by DNA which can be amplified by the polymerase chain reaction used in the presence of an electron transfer system from an electron donor is represented by the above formula (III) A protein capable of converting into a compound. An antibody that recognizes a weed control metabolite protein selected from the following groups.
<Protein group>
(A1) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(A2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(A3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(A4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108;
(A5) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and the above formula in the presence of an electron transfer system from an electron donor. A protein having an ability to convert the compound represented by (II) into the compound represented by the formula (III).
(A6) an electron donor having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108; A protein having the ability to convert a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system.
(A11) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159;
(A12) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160;
(A13) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136.
(A14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137.
(A15) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138.
(A16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 215.
(A17) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 216.
(A18) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 217.
(A19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 218,
(A20) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 219.
(A21) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 220.
(A22) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 221;
(A23) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222;
(A24) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 223;
(A25) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224;
(A26) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 159, 136, 137, 138, 217, 219, 220, 221 or 223, or SEQ ID NOs: 160, 215, 216; A compound having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 218, 222 or 224, and having the formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor; Having the ability to convert to the compound represented by the above formula (III).
(A27) 90% or more of any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224 A compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor, having an amino acid sequence encoded by a base sequence having the sequence identity of A protein that has the ability to convert to
(A28) Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Streptmyces achromogenes, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces thermocoerulescens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaensis, Streptomyces glomerochromogenes, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces ornatus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomyces misawanensis, S Nucleotide sequence having nucleotide number of nucleotides 1 to 29. The compound represented by the above formula (II) having the amino acid sequence encoded by DNA which can be amplified by the polymerase chain reaction used in the presence of an electron transfer system from an electron donor is represented by the above formula (III) A protein capable of converting into a compound. A method for detecting a weed controlling agent metabolic protein selected from the following group,
A method comprising: (1) contacting an antibody recognizing the protein with a test sample; and (2) detecting a complex of the protein and the antibody generated by the contact.
<Protein group>
(A1) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(A2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(A3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(A4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108;
(A5) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and the above formula in the presence of an electron transfer system from an electron donor. A protein having an ability to convert the compound represented by (II) into the compound represented by the formula (III).
(A6) an electron donor having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108; A protein having the ability to convert a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system.
(A11) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159;
(A12) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160;
(A13) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136.
(A14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137.
(A15) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138.
(A16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 215.
(A17) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 216.
(A18) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 217.
(A19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 218,
(A20) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 219.
(A21) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 220.
(A22) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 221;
(A23) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222;
(A24) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 223;
(A25) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224;
(A26) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 159, 136, 137, 138, 217, 219, 220, 221 or 223, or SEQ ID NOs: 160, 215, 216; A compound having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 218, 222 or 224, and having the formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor; Having the ability to convert to the compound represented by the above formula (III).
(A27) 90% or more of any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224 A compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor, having an amino acid sequence encoded by a base sequence having the sequence identity of A protein that has the ability to convert to
(A28) Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Streptmyces achromogenes, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces thermocoerulescens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaensis, Streptomyces glomerochromogenes, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces ornatus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomyces misawanensis, S Nucleotide sequence having nucleotide number of nucleotides 1 to 29. The compound represented by the above formula (II) having the amino acid sequence encoded by DNA which can be amplified by the polymerase chain reaction used in the presence of an electron transfer system from an electron donor is represented by the above formula (III) A protein capable of converting into a compound. An analysis / test kit comprising the antibody according to claim 24. DNA encoding ferredoxin selected from the following group:
<Protein group>
(B1) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12;
(B2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13;
(B3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14;
(B4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 111;
(B5) Ferredoxin having an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 12, 13, 14 or 111.
(B6) Ferredoxin having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 90% or more sequence identity to any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, 13, 14, or 111.
(B7) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 149;
(B8) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 150;
(B9) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 151;
(B10) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 152.
(B11) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 153;
(B12) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 149, 151, 152, 153, 245, 247, 248, 249, 250, 251, or 253 or SEQ ID NO: 150 Ferredoxin having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 252, 254 or 254.
(B13) 90% or more of any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 149, 150, 151, 152, 153, 245, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, or 254 Ferredoxin having an amino acid sequence encoded by an identical nucleotide sequence.
(B14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 245.
(B15) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 247.
(B16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 248.
(B17) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 249;
(B18) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 250;
(B19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 251;
(B20) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 252;
(B21) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 253;
(B22) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 254. DNA having a base sequence selected from the following group:
<Base sequence group>
(B1) the base sequence represented by SEQ ID NO: 15;
(B2) the base sequence represented by SEQ ID NO: 16;
(B3) a base sequence represented by SEQ ID NO: 17;
(B4) the base sequence represented by SEQ ID NO: 112;
(B5) the base sequence represented by SEQ ID NO: 154;
(B6) the base sequence represented by SEQ ID NO: 155;
(B7) a base sequence represented by SEQ ID NO: 156;
(B8) the base sequence represented by SEQ ID NO: 157
(B9) the base sequence represented by SEQ ID NO: 158,
(B10) the base sequence represented by SEQ ID NO: 255
(B11) the base sequence represented by SEQ ID NO: 257.
(B12) the base sequence represented by SEQ ID NO: 258,
(B13) the base sequence represented by SEQ ID NO: 259;
(B14) the base sequence represented by SEQ ID NO: 260
(B15) the base sequence represented by SEQ ID NO: 261;
(B16) the base sequence represented by SEQ ID NO: 262.
(B17) the base sequence represented by SEQ ID NO: 263.
(B18) the base sequence represented by SEQ ID NO: 264,
(B19) 90% of any of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 112, 154, 155, 156, 157, 158, 255, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, or 264 A base sequence having the above sequence identity. A vector containing the DNA according to claim 28. A transformant obtained by introducing the DNA according to claim 28 into a host cell. Ferredoxin selected from the following group:
<Protein group>
(B1) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12;
(B2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13;
(B3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14;
(B4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 111;
(B5) Ferredoxin having an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 12, 13, 14 or 111.
(B6) Ferredoxin having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 90% or more sequence identity to any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, 13, 14, or 111.
(B7) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 149;
(B8) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 150;
(B9) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 151;
(B10) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 152.
(B11) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 153;
(B12) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 149, 151, 152, 153, 245, 247, 248, 249, 250, 251 or 253, or SEQ ID NO: 150; Ferredoxin having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 252 or 254.
(B13) 90% or more of any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 149, 150, 151, 152, 153, 245, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, or 254 Ferredoxin having an amino acid sequence encoded by an identical nucleotide sequence.
(B14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 245.
(B15) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 247.
(B16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 248.
(B17) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 249;
(B18) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 250;
(B19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 251;
(B20) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 252;
(B21) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 253;
(B22) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 254. DNA having a base sequence selected from the following group:
<Base sequence group>
(Ab1) the base sequence represented by SEQ ID NO: 9;
(Ab2) the base sequence represented by SEQ ID NO: 10;
(Ab3) the base sequence represented by SEQ ID NO: 11;
(Ab4) the base sequence represented by SEQ ID NO: 110;
(Ab5) the base sequence represented by SEQ ID NO: 144
(Ab6) the base sequence represented by SEQ ID NO: 145
(Ab7) the base sequence represented by SEQ ID NO: 146,
(Ab8) the base sequence represented by SEQ ID NO: 147,
(Ab9) the base sequence represented by SEQ ID NO: 148
(Ab10) the base sequence represented by SEQ ID NO: 235,
(Ab11) the base sequence represented by SEQ ID NO: 236
(Ab12) the base sequence represented by SEQ ID NO: 237.
(Ab13) the base sequence represented by SEQ ID NO: 238,
(Ab14) the base sequence represented by SEQ ID NO: 239,
(Ab15) the base sequence represented by SEQ ID NO: 240
(Ab16) the base sequence represented by SEQ ID NO: 241
(Ab17) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 242.
(Ab18) the base sequence represented by SEQ ID NO: 243;
(Ab19) a base sequence represented by SEQ ID NO: 244; A vector containing the DNA according to claim 32. A transformant obtained by introducing the DNA according to claim 32 into a host cell. The transformant according to claim 34, wherein the host cell is a microorganism cell or a plant cell. A method for producing a transformant, comprising a step of introducing the DNA according to claim 32 into a host cell. A method for producing a protein having an ability to convert the compound represented by the formula (II) into the compound represented by the formula (III), wherein the protein is produced by culturing the transformant according to claim 34. A method comprising recovering the protein. A method for controlling weeds, comprising a step of applying a compound represented by the following general formula (I) to a cultivation area of a plant expressing one or more weed controlling agent metabolic proteins selected from the following groups.

[In the formula, G represents a group represented by any of the following G-1 to G-9.

Here, X represents an oxygen atom or a sulfur atom,
Y represents an oxygen atom or a sulfur atom,
R ¹ represents a hydrogen atom or a halogen atom,
R ² represents a hydrogen atom, a C ₁ -C ₈ alkyl group, a C ₁ -C ₈ haloalkyl group, a halogen atom, a hydroxyl group, a —OR ⁹ group, a —SH group, a —S (O) pR ⁹ group, a —COR ⁹ group, -CO ₂ R ⁹ groups, -C (O) SR ⁹ groups, -C (O) NR ¹¹ R ¹² groups, -CONH ₂ groups, -CHO groups, -CR ⁹ = NOR ¹⁸ groups, -CH = CR ¹⁹ CO ₂ R ^{9 _{group, -CH 2 CHR 19 CO 2 R}} 9 _{^{group, -CO 2 N = CR 13 R}} 14 group, a nitro group, a cyano group, -NHSO ₂ R ¹⁵ _group, -NHSO 2 ^{NHR 15} group, -NR ⁹ radicals R ^20, -NH ₂ group, or represents one or more identical or different C ₁ -C ₄ alkyl phenyl group which may be substituted with a group of,
p represents 0, 1 or 2;
R ³ is a C ₁ -C ₂ alkyl group, a C ₁ -C ₂ haloalkyl group, a —OCH ₃ group, a —SCH ₃ group, a —OCHF ₂ group, a halogen atom, a cyano group, a nitro group, or a halogen atom on a ring; C ₁ -C ₃ alkyl _group, C 1 -C ₃ haloalkyl group, ^{oR 28 group, NR} 11 ^{R 28} group, ^{SR 28} group is selected from the group consisting of cyano _group, CO ^{2 R 28} group or a nitro group Represents a C ₁ -C ₃ alkoxy group substituted with a phenyl group which may be substituted with at least one substituent,
R ⁴ represents a hydrogen atom, a C ₁ -C ₃ alkyl group, or a C ₁ -C ₃ haloalkyl group;
R ⁵ is a hydrogen atom, a C ₁ -C ₃ alkyl group, a C ₁ -C ₃ haloalkyl group, a cyclopropyl group, a vinyl group, a C ₂ alkynyl group, a cyano group, a —C (O) R ²⁰ group, a —CO ₂ R ^{20 groups, -C (O) NR 20 R} 21 ^group, -CR ^{16 R} 17 CN ^{group, -CR 16 R 17 C (O} ) R 20 _{^{group, -CR 16 R 17 CO 2 R}} 20 group, ^{-CR 16} R ^{17 C (O) NR 20 R} 21 ^{group, -CHR} 16 OH ^{groups, -CHR 16 OC (O) R} 20 group, or represents a ^{-OCHR 16 OC (O) NR 20} R 21 group, or, G is G In the case of -2 or G-6, R ⁴ and R ⁵ together with the carbon atom to which they are bonded may represent a C ＝ O group,
R ⁶ represents a C ₁ -C ₆ alkyl group, a C ₁ -C ₆ haloalkyl group, a C ₂ -C ₆ alkoxyalkyl group, a C ₃ -C ₆ alkenyl group, or a C ₃ -C ₆ alkynyl group;
R ⁷ is a hydrogen atom, a C ₁ -C ₆ alkyl group, a C ₁ -C ₆ haloalkyl group, a halogen atom, a —S (O) ₂ (C ₁ -C ₆ alkyl) group, or —C (＝ O) R ²² Represents a group,
R ⁸ is a hydrogen _atom, C 1 -C ₈ alkyl _group, C 3 -C ₈ cycloalkyl _group, C 3 -C ₈ alkenyl _group, C 3 -C ₈ alkynyl _group, C 1 -C ₈ haloalkyl group, _{C 2} - C ₈ alkoxyalkyl _group, C 3 -C ₈ alkoxyalkoxyalkyl _group, C 3 -C ₈ haloalkynyl _group, C 3 -C ₈ haloalkenyl _group, C 1 -C ₈ alkylsulfonyl _group, C 1 -C ₈ haloalkylsulfonyl _group, optionally substituted with C 3 -C ₈ alkoxycarbonylalkyl _{group, -S (O) 2 NH (} C 1 -C 8 alkyl) group, -C ^{(O) R 23} group or R ²⁴ on the phenyl ring, Represents a good benzyl group,
R ⁹ is a C ₁ -C ₈ alkyl group, a C ₃ -C ₈ cycloalkyl group, a C ₃ -C ₈ alkenyl group, a C ₃ -C ₈ alkynyl group, a C ₁ -C ₈ haloalkyl group, a C ₂ -C ₈ alkoxy alkyl _group, C 2 -C ₈ alkylthioalkyl _group, C 2 -C ₈ alkylsulfinylalkyl _group, C 2 -C ₈ alkylsulfonyl _group, C 4 -C ₈ alkoxyalkoxyalkyl _group, C 4 -C ₈ cycloalkylalkyl _group, C 4 -C ₈ cycloalkoxy _group, C 4 -C ₈ alkenyloxy _group, C 4 -C ₈ alkynyloxy _group, C 3 -C ₈ haloalkoxyalkyl _group, C 4 -C ₈ haloalkenyloxy alkyl _group, C 4 -C ₈ haloalkynyloxy alkyl _group, C 4 -C ₈ cycloalkylthio alkyl , _C 4 -C ₈ alkenylene thio alkyl _group, C 4 -C ₈ alkynylene thio alkyl group,
Halogen atoms on the ring, C ₁ -C ₃ alkyl group and C ₁ -C ₃ C ₁ substituted with even better phenoxy group substituted with at least one substituent selected from the group consisting of haloalkyl groups -C ₄ alkyl group, a halogen atom, C ₁ -C ₃ alkyl group and C ₁ -C ₃ at least one good-benzyloxy optionally substituted with substituents selected from the group consisting of haloalkyl groups on a ring A C ₁ -C ₄ alkyl group substituted with a group,
C ₄ -C ₈ trialkylsilylalkyl _group, C 2 -C ₈ cyanoalkyl _group, C 3 -C ₈ halocycloalkyl _group, C 3 -C ₈ haloalkenyl _group, C 5 -C ₈ alkoxyalkenyl group, _{C 5} -C ₈ haloalkoxyalkenyl _group, C 5 -C ₈ alkylthio alkenyl _group, C 3 -C ₈ haloalkynyl _group, C 5 -C ₈ alkoxy alkynyl _group, C 5 -C ₈ haloalkoxyalkynyl _group, C 5 -C ₈ alkylthioalkynyl _group, C 2 -C ₈ alkylcarbonyl group,
A halogen atom, a C ₁ -C ₃ alkyl group, a C ₁ -C ₃ haloalkyl group, a —OR ²⁸ group, a —NR ¹¹ R ²⁸ group, a —SR ²⁸ group, a cyano group, a —CO ₂ R ²⁸ group or a nitro group on the ring A benzyl group optionally substituted with at least one substituent selected from the group consisting of
-CR ¹⁶ R ¹⁷ COR ^{10 _{group, -CR 16 R 17 CO 2 R}} 20 ^{group, -CR 16 R 17 P (O} ) (OR 10) 2 ^{group, -CR 16 R 17 P (S} ) (OR 10) 2 ^{group, -CR 16 R 17 C (O} ) NR 11 R 12 ^{group, -CR 16 R 17 C (O} ) NH 2 ^{group, -C (= CR 26 R 27} ) COR 10 group, -C (= ^{CR 26} R ²⁷⁾ _CO 2 ^{R 20 group, -C (= CR 26 R 27} ) P (O) (OR 10) 2 ^{group, -C (= CR 26 R 27} ) P (S) (OR 10) 2 group, -C (= CR ²⁶ R ²⁷ ) C (O) NR ¹¹ R ¹² groups, —C (＝ CR ²⁶ R ²⁷ ) C (O) NH ₂ groups, halogen atoms on the ring, C ₁ -C ₆ alkyl groups, C ₁ -C ₆ haloalkyl _group, C 2 -C ₆ alkenyl _group, C 2 -C ₆ Haroarukeni _Group, C 2 -C ₆ alkynyl _group, C 3 -C ₆ haloalkynyl _group, C 2 -C ₈ alkoxyalkyl group, ^{-OR 28} groups, ^{-SR 28 groups, -NR} 11 ^{R 28} _group, C 3 -C ₈ alkoxycarbonylalkyl group, a C ₂ -C ₄ carboxyalkyl group, -CO ₂ R ²⁸ group and at least one of the following optionally substituted with a substituent Q-1 is selected from the group consisting of cyano group Represents any ring up to Q-7,

R ¹⁰ represents a C ₁ -C ₆ alkyl group, a C ₂ -C ₆ alkenyl group, a C ₃ -C ₆ alkynyl group, or a tetrahydrofuranyl group,
R ¹¹ and R ¹³ independently represent a hydrogen atom or a C ₁ -C ₄ alkyl group,
R ¹² is _C 1 -C ₆ alkyl _group, C 3 -C ₆ cycloalkyl _group, C 3 -C ₆ alkenyl _group, C 3 -C _{6 alkynyl,} C 2 -C ₆ alkoxyalkyl _group, C 1 -C ₆ haloalkyl groups _are selected from among C 3 -C ₆ haloalkenyl _group, C 3 -C ₆ haloalkynyl group, ring on the halogen _atom, C 1 -C ₄ alkyl and C ₁ -C ₄ group consisting of an alkoxy group that represents at least one phenyl group optionally substituted with a substituent or _{^{-C R 16 R 17 CO 2 R}} 25 group, or,
R ¹¹ and R ¹² may represent — (CH ₂ ) ₅ —, — (CH ₂ ) ₄ —, or —CH ₂ CH ₂ OCH ₂ CH ₂ —, and each of the thus formed The ring may be substituted with a substituent selected from the group consisting of a C ₁ -C ₃ alkyl group, a phenyl group, and a benzyl group;
R ¹⁴ is substituted with a C ₁ -C ₄ alkyl group or at least one substituent selected from the group consisting of a halogen atom, a C ₁ -C ₃ alkyl group and a C ₁ -C ₃ haloalkyl group on the ring. Represents a phenyl group which may be
Or
R ¹³ and R ¹⁴ may represent a C ₃ -C ₈ cycloalkyl group together with the carbon atom to which they are bonded,
R ¹⁵ represents a C ₁ -C ₄ alkyl group, a C ₁ -C ₄ haloalkyl group, or a C ₃ -C ₆ alkenyl group,
R ¹⁶ and R ¹⁷ are independently a hydrogen atom or a C ₁ -C ₄ alkyl group, a C ₁ -C ₄ haloalkyl group, a C ₂ -C ₄ alkenyl group, a C ₂ -C ₄ haloalkenyl group, a C ₂ -C ₄ An alkynyl group, a C ₃ -C ₄ haloalkynyl group,
Or
R ¹⁶ and R ¹⁷ together with the carbon atom to which they are attached may represent a C ₃ -C ₆ cycloalkyl group; in each ring thus formed, a halogen atom, C ₁ -C 6 May be substituted with at least one substituent selected from the group consisting of a ₃ alkyl group and a C ₁ -C ₃ haloalkyl group,
R ¹⁸ represents a hydrogen atom, a C ₁ -C ₆ alkyl group, a C ₃ -C ₆ alkenyl group, or a C ₃ -C ₆ alkynyl group,
R ¹⁹ represents a hydrogen atom, a C ₁ -C ₄ alkyl group, or a halogen atom;
R ²⁰ is a hydrogen _atom, C 1 -C _{6 alkyl,} C 3 -C ₆ cycloalkyl _group, C 3 -C ₆ alkenyl _group, C 3 -C _{6 alkynyl,} C 2 -C ₆ alkoxyalkyl group, _{C 1} -C ₆ haloalkyl _group, selected C 3 -C ₆ haloalkenyl _group, C 3 -C ₆ haloalkynyl group, ring on a halogen _atom, from among the C 1 -C ₄ alkyl and the group consisting of ^{-OR 28} groups A phenyl group which may be substituted with at least one substituent, or a -CR ¹⁶ R ¹⁷ CO ₂ R ²⁵ group,
R ²¹ represents a hydrogen atom, a C ₁ -C ₂ alkyl group, or a —CO ₂ (C ₁ -C ₄ alkyl) group;
R ²² represents a hydrogen atom, a C ₁ -C ₆ alkyl group, a C ₁ -C ₆ alkoxy group, or an NH (C ₁ -C ₆ alkyl) group,
R ²³ is C ₁ -C ₆ alkyl _group, C 1 -C ₆ haloalkyl _group, C 1 -C ₆ alkoxy group, NH _(C 1 -C ₆ alkyl) ^group, phenyl group which may be substituted with ^{R 24} groups , a benzyl group, or a C ₂ -C ₈ dialkylamino group,
R ²⁴ represents a C ₁ -C ₆ alkyl group, one or two halogen atoms, a C ₁ -C ₆ alkoxy group, or a CF ₃ group,
R ²⁵ is a hydrogen _atom, C 1 -C _{6 alkyl,} C 1 -C ₆ haloalkyl _group, C 3 -C ₆ alkenyl _group, C 3 -C ₆ haloalkenyl _group, C 3 -C ₆ alkynyl or _{C 3,} Represents a -C ₆ haloalkynyl group,
Each R ²⁶ and R ²⁷ are independently hydrogen or C ₁ -C ₄ alkyl _group, C 1 -C ₄ haloalkyl _groups, C 2 -C ₄ alkenyl _group, C 2 -C ₄ haloalkenyl _group, C 2 -C Represents a ₄ alkynyl group, a C ₃ -C ₄ haloalkynyl group, a —OR ²⁸ group, a —NHR ²⁸ group, or a —SR ²⁸ group, or
R ²⁶ and R ²⁷ together with the carbon atom to which they are attached may represent a C ₃ -C ₆ cycloalkyl group, and in each ring thus formed, a halogen atom, C ₁ -C 6 May be substituted with at least one substituent selected from the group consisting of a ₃ alkyl group and a C ₁ -C ₃ haloalkyl group,
R ²⁸ is a hydrogen _atom, C 1 -C _{6 alkyl,} C 1 -C ₆ haloalkyl _group, C 3 -C ₆ alkenyl _group, C 3 -C ₆ haloalkenyl _group, C 3 -C ₆ alkynyl group, _{C 3} - C ₆ haloalkynyl group, C ₂ -C ₄ carboxyalkyl group, C ₃ -C ₈ alkoxycarbonylalkyl group, C ₃ -C ₈ haloalkoxycarbonylalkyl group, C ₅ -C ₉ alkenyloxycarbonylalkyl group, C ₅ -C ₉ halo alkenyloxycarbonyl _group, C 5 -C ₉ alkynyloxycarbonyl alkyl _group, C 5 -C ₉ haloalkynyloxy carbonyl _group, C 5 -C ₉ cycloalkoxy carbonyl group, or C ₅ -C ₉ halo Represents a cycloalkoxycarbonylalkyl group. ]
<Protein group>
(A1) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(A2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(A3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(A4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108;
(A5) having the amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and in the presence of an electron transfer system from an electron donor, A protein having the ability to convert the compound represented by (II) into the compound represented by formula (III).
(A6) an electron donor having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108; A protein having the ability to convert a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system.
(A7) a DNA having a base sequence encoding any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and an amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions, And a protein capable of converting a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system from an electron donor.
(A8) A primer having a base sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 124 to 128 and a primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 129 using chromosomal DNA of a microorganism belonging to the genus Streptomyces or Saccharopolyspora as a template A compound having an amino acid sequence encoded by DNA that can be amplified by a polymerase chain reaction using a compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor. A protein capable of converting into the indicated compound.
(A9) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(A11) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159;
(A12) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160;
(A13) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136.
(A14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137.
(A15) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138.
(A16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 215.
(A17) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 216.
(A18) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 217.
(A19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 218,
(A20) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 219.
(A21) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 220.
(A22) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 221;
(A23) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222;
(A24) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 223;
(A25) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224;
(A26) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 159, 136, 137, 138, 217, 219, 220, 221 or 223, or SEQ ID NOs: 160, 215, 216; A compound having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 218, 222 or 224, and having the formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor; Having the ability to convert to the compound represented by the above formula (III).
(A27) 90% or more of any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224 A compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor, having an amino acid sequence encoded by a base sequence having the sequence identity of A protein that has the ability to convert to A method for controlling weeds, comprising a step of applying a compound represented by the above general formula (I) to a cultivation area of a plant expressing one or more weed controlling metabolic proteins selected from the following groups.
<Protein group>
(A1) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(A2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(A3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(A4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108;
(A5) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and the above formula in the presence of an electron transfer system from an electron donor. A protein having an ability to convert the compound represented by (II) into the compound represented by the formula (III).
(A6) an electron donor having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108; A protein having the ability to convert a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system.
(A11) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159;
(A12) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160;
(A13) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136.
(A14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137.
(A15) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138.
(A16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 215.
(A17) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 216.
(A18) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 217.
(A19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 218,
(A20) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 219.
(A21) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 220.
(A22) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 221;
(A23) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222;
(A24) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 223;
(A25) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224;
(A26) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 159, 136, 137, 138, 217, 219, 220, 221 or 223, or SEQ ID NOs: 160, 215, 216; A compound having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 218, 222 or 224, and having the formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor; Having the ability to convert to the compound represented by the above formula (III).
(A27) 90% or more of any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224 A compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor, having an amino acid sequence encoded by a base sequence having the sequence identity of A protein that has the ability to convert to
(A28) Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces testaceus, Streptmyces achromogenes, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces thermocoerulescens, Streptomyces nogalater, Streptomyces tsusimaensis, Streptomyces glomerochromogenes, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces ornatus, Streptomyces griseus, Streptomyces lanatus, Streptomyces misawanensis, S Nucleotide sequence having nucleotide number of nucleotides 1 to 29. The compound represented by the above formula (II) having the amino acid sequence encoded by DNA which can be amplified by the polymerase chain reaction used in the presence of an electron transfer system from an electron donor is represented by the above formula (III) A protein capable of converting into a compound. A method for evaluating the degree of resistance of a cell to the compound represented by the general formula (I),
(1) a step of contacting a cell expressing one or more weed control metabolic proteins selected from the following groups with the compound;
(2) A method comprising the step of evaluating the degree of damage to cells contacted with the compound in the step (1).
<Protein group>
(A1) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(A2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(A3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(A4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108;
(A5) having the amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and in the presence of an electron transfer system from an electron donor, A protein having the ability to convert the compound represented by (II) into the compound represented by formula (III).
(A6) an electron donor having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108; A protein having the ability to convert a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system.
(A7) a DNA having a base sequence encoding any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and an amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions, And a protein capable of converting a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system from an electron donor.
(A8) A primer having a base sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 124 to 128 and a primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 129 using chromosomal DNA of a microorganism belonging to the genus Streptomyces or Saccharopolyspora as a template A compound having an amino acid sequence encoded by DNA that can be amplified by a polymerase chain reaction using a compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor. A protein capable of converting into the indicated compound.
(A9) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(A11) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159;
(A12) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160;
(A13) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136.
(A14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137.
(A15) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138.
(A16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 215.
(A17) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 216.
(A18) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 217.
(A19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 218,
(A20) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 219.
(A21) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 220.
(A22) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 221;
(A23) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222;
(A24) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 223;
(A25) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224;
(A26) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 159, 136, 137, 138, 217, 219, 220, 221 or 223, or SEQ ID NOs: 160, 215, 216; A compound having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 218, 222 or 224, and having the formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor; Having the ability to convert to the compound represented by the above formula (III).
(A27) 90% or more of any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224 A compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor, having an amino acid sequence encoded by a base sequence having the sequence identity of A protein that has the ability to convert to 41. The method according to claim 40, wherein the cells are microbial cells or plant cells. A method for selecting cells showing resistance to the compound represented by the general formula (I), comprising a step of selecting cells based on the degree of resistance evaluated by the method according to claim 40. how to. A weed control agent-resistant cell selected by the method according to claim 42 or a culture thereof. A method for evaluating the degree of plant resistance to a compound represented by the general formula (I),
(1) a step of contacting a plant expressing one or more weed control metabolic proteins selected from the following groups with the compound;
(2) A method comprising the step of evaluating the degree of injury of a plant contacted with the compound in the step (1).
<Protein group>
(A1) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(A2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(A3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(A4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108;
(A5) having the amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and in the presence of an electron transfer system from an electron donor, A protein having the ability to convert the compound represented by (II) into the compound represented by formula (III).
(A6) an electron donor having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108; A protein having the ability to convert a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system.
(A7) a DNA having a base sequence encoding any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and an amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions, And a protein capable of converting a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system from an electron donor.
(A8) A primer having a base sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 124 to 128 and a primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 129 using chromosomal DNA of a microorganism belonging to the genus Streptomyces or Saccharopolyspora as a template A compound having an amino acid sequence encoded by DNA that can be amplified by a polymerase chain reaction using a compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor. A protein capable of converting into the indicated compound.
(A9) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(A11) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159;
(A12) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160;
(A13) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136.
(A14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137.
(A15) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138.
(A16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 215.
(A17) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 216.
(A18) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 217.
(A19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 218,
(A20) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 219.
(A21) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 220.
(A22) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 221;
(A23) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222;
(A24) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 223;
(A25) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224;
(A26) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 159, 136, 137, 138, 217, 219, 220, 221 or 223, or SEQ ID NOs: 160, 215, 216; A compound having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 218, 222 or 224, and having the formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor; Having the ability to convert to the compound represented by the above formula (III).
(A27) 90% or more of any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224 A compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor, having an amino acid sequence encoded by a base sequence having the sequence identity of A protein that has the ability to convert to A method for selecting a plant showing resistance to the compound represented by the general formula (I), comprising a step of selecting a plant based on the degree of resistance evaluated by the method according to claim 44. how to. 46. A weed-controlling agent-resistant plant or progeny selected by the method of claim 45. A method for treating a compound represented by the above general formula (I), wherein the compound comprises, in the presence of an electron transfer system from an electron donor, one or more weed-controlling metabolic proteins selected from the following groups: A method characterized by acting.
<Protein group>
(A1) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(A2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(A3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(A4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108;
(A5) having the amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and in the presence of an electron transfer system from an electron donor, A protein having the ability to convert the compound represented by (II) into the compound represented by formula (III).
(A6) an electron donor having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108; A protein having the ability to convert a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system.
(A7) a DNA having a base sequence encoding any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and an amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions, And a protein capable of converting a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system from an electron donor.
(A8) A primer having a base sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 124 to 128 and a primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 129 using chromosomal DNA of a microorganism belonging to the genus Streptomyces or Saccharopolyspora as a template A compound having an amino acid sequence encoded by DNA that can be amplified by a polymerase chain reaction using a compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor. A protein capable of converting into the indicated compound.
(A9) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(A11) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159;
(A12) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160;
(A13) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136.
(A14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137.
(A15) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138.
(A16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 215.
(A17) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 216.
(A18) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 217.
(A19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 218,
(A20) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 219.
(A21) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 220.
(A22) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 221;
(A23) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222;
(A24) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 223;
(A25) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224;
(A26) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 159, 136, 137, 138, 217, 219, 220, 221 or 223, or SEQ ID NOs: 160, 215, 216; A compound having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 218, 222 or 224, and having the formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor; Having the ability to convert to the compound represented by the above formula (III).
(A27) 90% or more of any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224 A compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor, having an amino acid sequence encoded by a base sequence having the sequence identity of A protein that has the ability to convert to 48. 48. The method according to claim 47, wherein the compound is caused to act on the compound by contacting the compound with a transformant obtained by introducing a DNA encoding a weed controlling metabolic protein into a host cell at a position capable of expression. . Use of a weed controlling metabolic protein selected from the following group for treating the compound represented by the above general formula (I).
<Protein group>
(A1) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(A2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(A3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(A4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108;
(A5) having the amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and in the presence of an electron transfer system from an electron donor, A protein having the ability to convert the compound represented by (II) into the compound represented by formula (III).
(A6) an electron donor having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108; A protein having the ability to convert a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system.
(A7) a DNA having a base sequence encoding any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and an amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions, And a protein capable of converting a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system from an electron donor.
(A8) A primer having a base sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 124 to 128 and a primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 129 using chromosomal DNA of a microorganism belonging to the genus Streptomyces or Saccharopolyspora as a template A compound having an amino acid sequence encoded by DNA that can be amplified by a polymerase chain reaction using a compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor. A protein capable of converting into the indicated compound.
(A9) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(A11) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159;
(A12) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160;
(A13) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136.
(A14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137.
(A15) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138.
(A16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 215.
(A17) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 216.
(A18) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 217.
(A19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 218,
(A20) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 219.
(A21) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 220.
(A22) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 221;
(A23) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222;
(A24) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 223;
(A25) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224;
(A26) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 159, 136, 137, 138, 217, 219, 220, 221 or 223, or SEQ ID NOs: 160, 215, 216; A compound having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 218, 222 or 224, and having the formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor; Having the ability to convert to the compound represented by the above formula (III).
(A27) 90% or more of any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224 A compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor, having an amino acid sequence encoded by a base sequence having the sequence identity of A protein that has the ability to convert to Use of a nucleic acid encoding a weed controlling metabolic protein selected from the following group for treating the compound represented by the above general formula (I).
<Protein group>
(A1) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(A2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(A3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(A4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 108;
(A5) having the amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and in the presence of an electron transfer system from an electron donor, A protein having the ability to convert the compound represented by (II) into the compound represented by formula (III).
(A6) an electron donor having an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with any of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108; A protein having the ability to convert a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system.
(A7) a DNA having a base sequence encoding any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 108, and an amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions, And a protein capable of converting a compound represented by the above formula (II) into a compound represented by the above formula (III) in the presence of an electron transfer system from an electron donor.
(A8) A primer having a base sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 124 to 128 and a primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 129 using chromosomal DNA of a microorganism belonging to the genus Streptomyces or Saccharopolyspora as a template A compound having an amino acid sequence encoded by DNA that can be amplified by a polymerase chain reaction using a compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor. A protein capable of converting into the indicated compound.
(A9) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(A11) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 159;
(A12) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160;
(A13) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 136.
(A14) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 137.
(A15) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 138.
(A16) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 215.
(A17) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 216.
(A18) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 217.
(A19) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 218,
(A20) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 219.
(A21) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 220.
(A22) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 221;
(A23) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 222;
(A24) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 223;
(A25) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 224;
(A26) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 159, 136, 137, 138, 217, 219, 220, 221 or 223, or SEQ ID NOs: 160, 215, 216; A compound having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with any of the amino acid sequences represented by 218, 222 or 224, and having the formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor; Having the ability to convert to the compound represented by the above formula (III).
(A27) 90% or more of any one of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 159, 160, 136, 137, 138, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 or 224 A compound represented by the above formula (II) in the presence of an electron transfer system from an electron donor, having an amino acid sequence encoded by a base sequence having the sequence identity of A protein that has the ability to convert to

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