【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リンゴ由来のプロアントシアニジン成分を有効成分とする抗腫瘍剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ガンの発生機構は多段階説により説明されている。すなわち、放射線や紫外線、活性酸素や各種発ガン剤などによるＤＮＡレベルでの損傷を受けた後（イニシエーション期）、修復機構や細胞死による修復機構により除去されなかった前ガン細胞が増殖の促進を受け（プロモーション期）、更に、プログレッションの過程を経て悪性なガン細胞になっていく。ガン細胞は増殖のために血管新生や浸潤を引き起こし、更には他臓器へ転移して病気が経過する。ガンの発生部位によってもその経過は異なり、有効な治療法が見いだされていないのが実状である。ガンに対する治療法は大きく、外科的治療法（手術）、放射線治療法、抗ガン剤による化学療法、及び温熱療法の４つに分けられる。これらの治療法は、独立して行われるのではなく、各治療法を組み合わせて行われるが、未だ有効な手段は見いだされていない。また、ガンの予防や進行や転移の遅延させるためにもガンの発生メカニズムを理解し、各段階で有効な手段を講じることが重要である。
【０００３】
化学療法における制ガン剤としては、５−フルオロウラシルなどの代謝拮抗剤、シクロホスファミドのようなアルキル化剤、ブレオマイシンやアドリアマイシンなどの抗生物質、トポイソメラーゼの阻害剤であるエトポシドやカンプトテシンなどが開発されているが、いずれもガン細胞にアポトーシスを誘導していることが知られている。ガン細胞にアポトーシスを起こさせることがガン治療の有効な手段となると考えられている。
【０００４】
植物の二次代謝産物であるポリフェノールは植物界に多種多様な種類が存在しており約数千種に渡ることが知られている。これらのうちのある物質は多様な生理活性を示すことが明らかになっている。特開平７−２８５８７６号公報には、リンゴ、ナシまたはモモの未熟果の抽出物に含有されるポリフェノールが抗酸化、血圧降下、抗変異原性、抗アレルギー、抗う蝕、消臭等の機能を持つことが報告されている。また、プロアントシアニジンを主成分とするブドウ種子抽出物が大腸癌抑制効果を有することが示されている（日本農芸化学会関東支部１９９９年第３回例会講演要旨集、２０００年）。生成されるポリフェノール成分も品種に特異的なものが少なくない。従って、これまで、ポリフェノールは上記の抗酸化性などの様々な生理機能性を有することが示されているが、その機能性のメカニズムもポリフェノールの種類により異なると考えられ、不明な点が多い。これまで、アポトーシス誘導活性を有するポリフェノールとして報告されているのはエピガロカテキンガレート［Ｈ． Ｈｉｂａｓａｍｉ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ｒｅｐｏｒｔｓ， ５， ５２７−５２９， １９９８］やフロレチン［Ｍ． Ｋｏｂｏｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６３， ７１９−７２５， １９９９］以外には報告されていない。また、上記ブドウ抽出物の大腸癌抑制作用のメカニズムも解明されていない。
【０００５】
【本発明が解決しようとする課題】
以上のようにアポトーシスを誘導する物質を見い出せば、ガン細胞に細胞死をもたらし、ガン予防やガン治療に役立てることが期待できる。また、ガン予防として、植物由来のポリフェノール成分を摂取することは安全性の面からもこれまでの食経験があり、毎日摂取することにも問題が少ないと考えられる。したがって、本発明は安全でかつ有効なガン予防剤を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明によれば、リンゴ由来のプロアントシアニジン成分を有効成分として含有することを特徴とする抗腫瘍剤が提供される。さらに、本発明のプロアントシアニジンはアポトーシス誘導活性を有するので、アポトーシス誘導活性を有する抗腫瘍剤が提供される。
【０００７】
これらの抗腫瘍活性を有する物質は医薬品としての形態を与えることによりガン細胞に細胞死や増殖抑制をもたらすガン治療剤やガン予防剤として利用することができる。また、食品としての形態を付与することによりガン予防食品として用いることが可能である。本発明によれば、前記いずれかの抗腫瘍剤を含有することを特徴とするガン予防又は制ガン剤も提供される。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下に本発明について詳細に説明する。本発明において抗腫瘍剤の有効成分として用いられるプロアントシアニジン成分は市販のものや植物から直接抽出・分離したものが利用できる。本発明でいうプロアントシアニジンは、植物体中に存在する縮合型タンニン、すなわちフラバン−３−オールを構成単位として４β→８又は４β→６で縮合もしくは重合により結合した化合物群であって、これらは酸処理によりシアニジン、デルフィニジン、ペラルゴニジン等のアントシアニジンを生成する。本発明では上記構成単位の２量体以上の高分子のプロシアニジン、プロデルフィニジン、プロペラルゴニジン等のプロアントシアニジンである。
【０００９】
例えば、リンゴ果実からのプロアントシアニジン成分の抽出・精製は特開平７−２８５８７６号公報、特開２０００−１６９５１号公報および特開２００２−８７９７８号公報に記載の方法を利用することができる。原料であるリンゴは特開平７−２８５８７６号に記載されているようなリンゴ未熟果を利用しても良いし、特願２０００−２７７２２８に記載されているようにリンゴ野生種（Ｃｒａｂ Ａｐｐｌｅ）を利用しても良い。
【００１０】
まず、例えば特開平７−２８５８７６号の方法に基づいて抽出物を得る。具体的には、リンゴ果実を洗浄した後、そのままもしくは亜硫酸を添加しながら破砕、圧搾により果汁を得、遠心分離、濾過などにより清澄果汁を調製できる。清澄果汁は適宜、公知の手法により濃縮しても良い。粗リンゴポリフェノール成分の抽出方法としては、得られた果汁を原料として用いても良いが、果実をアルコール類と混合して破砕し、そのまま浸漬し、圧搾、又は加熱還流しながら抽出し、次いでアルコールを溜去した後、遠心分離及び濾過、又はヘキサン、クロロホルムなどの有機溶媒による分配及び濾過を行い、清澄抽出物を得る方法を挙げることができる。
【００１１】
ついで、特開２０００−１６９５１の方法にて上記抽出物を精製する。具体的には、ポリフェノールを選択的に吸着できる吸着剤、例えばスチレンジビニルベンゼン系の合成吸着樹脂、陰イオン交換樹脂などが充填されたカラムに上記の清澄果汁又は清澄抽出液を通すことによりポリフェノール成分を吸着させる。次いで、蒸留水によってカラムを洗浄した後、２０〜１００％、好ましくは４０〜６０％のアルコール溶液をカラムに通すことによりポリフェノール成分を溶出、回収できる。得られたアルコール溶液画分からアルコールを溜去すると粗リンゴポリフェノール画分となる。この粗リンゴポリフェノール画分には、図１に示されるような成分が含まれている。
【００１２】
更に、粗リンゴポリフェノール画分を特開２００２−８７９７８号公報に開示された方法で処理し、プロアントシアニジン画分を得る。具体的には、得られた粗ポリフェノール画分を酢酸メチルを液相として用いた固液抽出によりプロシアニジン２〜５量体画分と６量体以上画分に分離精製することも可能である。酢酸メチルに抽出されないプロシアニジン６量体以上画分は、公知の方法により酢酸メチルを溜去する。酢酸メチルに抽出されたプロシアニジン２〜５量体画分は公知の方法により抽出溶液を濃縮した後、蒸留水に溶解させる。更に、プロシアニジン２〜５量体画分は順相クロマトグラフィーにより重合度別（分子量別）に分離精製し、重合度数の均一なプロシアニジンオリゴマーを得ることができる。
【００１３】
このようにして調製されたプロアントシアニジン製剤は抗腫瘍剤として医薬品に用いることができる。医薬組成物としては、従来からの抗ガン剤と混合しても良い。抗腫瘍剤を含有する医薬品は、公知の方法により錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤などの経口剤、座剤、軟膏、噴霧剤、注射剤などの非経口剤とすることができる。この際、製薬化において用いられることが知られている、種々の添加剤を用いることもできる。
【００１４】
また、抗腫瘍剤を含有する食品一般として、あるいは、食品一般に添加して抗腫瘍機能を有するガン予防食品として好適に用いることができる。具体例としては、アルコール飲料、炭酸飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料、コーヒーや紅茶などの清涼飲料、アイスクリーム、飴、ガム、菓子、パン、麺類などに用いることができる。
【００１５】
更にまた、皮膚ガンなどの一部のガンに対しては、抗腫瘍剤を化粧品に添加して用いることもできる。添加される化粧品としては、石鹸、洗顔料、クリーム、乳液、化粧水、パウダー、香水、口紅などの皮膚化粧品や浴用化粧品、更にはシャンプー、リンスなどの毛髪用化粧品ならびに歯磨き粉などを挙げることができる。
【００１６】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００１７】
［実施例１］
特開平７−２８５８７６号公報および特開２０００−１６９５１号公報に開示された方法により粗リンゴポリフェノール画分を、特開２００２−８７９７８号公報に開示された方法によりプロアントシアニジン画分を調製した。粗リンゴポリフェノール画分を逆相系高速液体クロマトグラフィーを用いて検定したところ、クロロゲン酸類（約２０％）、フロレチン配糖体類（約５％）、フラボノール類（約１５％）、プロアントシアニジン類（約５０％）及びその他褐変物質（約１０％）からなることが確認できた。更に、このプロアントシアニジン画分には、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（マトリックス支援型レーザー脱離イオン飛行時間型質量分析法）による解析の結果（図２）、フラバン−３−オール類であるカテキンやエピカテキンからなる２量体から１５量体までが存在することが確認され、高分子型のポリフェノールであった［Ｍ． Ｏｈｎｉｓｈｉ−Ｋａｍｅｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ， １１， ３１−３６， １９９７］。こうして得られた粗リンゴポリフェノール画分およびプロアントシアニジン画分を後述する抗腫瘍活性評価のための試料とした。
【００１８】
［試験例１］（マウスメラノーマ細胞への効果）
予め１０％ＦＣＳ（牛胎児血清）を含むダルベッコ変法イーグル培地で前培養したＢ１６マウスメラノーマ細胞（ＪＣＲＢ０２０２）（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより譲渡）を５×１０６個／ｍＬとなるように調整する。次に、この細胞懸濁液（２００μＬ）をＣ５７ＢＬ／６雄マウスの皮下に注射（１０６個）した。１％粗リンゴポリフェノール画分溶液と蒸留水（対照群）を自由飲水により摂取させ、試料は二日おきに交換し、連日投与した。移植後のマウスの経過観察をし、生存率を比較した（図３）。対照群（Ｄ．Ｗ．）では、移植後１７日目から斃死個体が観察され、移植後２６日目までに１０頭中６頭（６０％）が斃死した。一方、粗リンゴポリフェノール画分（ＡＰＰ）投与群では移植後２０日目から斃死個体が見られ、移植後２６日目までに１１頭中３頭（２７．３％）が斃死したのみで、腫瘍移植後２６日目までに残り８頭が生存した。また、腫瘍の増殖を比較するため、メラノーマ細胞移植後２０日目および２６日目における腫瘍の大きさを測定した（表１）。移植後２６日目でも、粗リンゴポリフェノール画分投与群において１頭腫瘍が確認できない個体が認められた。腫瘍体積の比較では、蒸留水対照群で４０５５．７±２１１６．３ｍｍ３であるのに対し、リンゴポリフェノール投与群では１２４８．１±１０８９．７ｍｍ３であり、有意差が認められた。粗リンゴポリフェノール画分投与群では、腫瘍の増殖を抑制していることが判明した。
【００１９】
［試験例２］（マウス乳ガン細胞への効果）
試験例１のＢ１６メラノーマ細胞と同様の方法で前培養したマウス乳癌細胞株ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２（ＪＣＲＢ０２３３．２）をＢＡＬＢ／Ｃマウスへ皮下注射した。１％粗リンゴポリフェノール画分溶液と蒸留水（対照群）を自由飲水により摂取させ、試料は二日おきに交換し、連日投与した。移植後のマウスの経過観察をし、腫瘍の増殖を比較するため移植後２０、２６、３８及び５０日目における腫瘍の体積を測定した（表２）。
移植後５０日目において、対照群では１０頭中９頭が腫瘍を測定できたのに対し、粗リンゴポリフェノール画分投与群では腫瘍が計測できるほど大きくなっているものは１０頭中２頭しかいなかった。腫瘍の大きさを比較すると、対照群では、１６３．８±４４．２ｍｍ３であるのに対し、粗リンゴポリフェノール画分投与群では３６．３±２３．２ｍｍ３で腫瘍の体積が約１／４と小さかった。対照群では１０頭中９頭が腫瘍を計測できたのに対し、粗リンゴポリフェノール画分投与群では腫瘍が計測できたのは僅かに１０頭中２頭しかいなかった。
【００２０】
［試験例３］（マウス腫瘍細胞の増殖に対する効果）
粗リンゴポリフェノール画分及びプロアントシアニジン画分のマウス腫瘍細胞にＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２細胞に対する増殖抑制効果を調べた。ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２細胞を１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地で２４時間培養後、各濃度の上記試料を含む同培地でさらに２４時間培養し、トリパンブルー法により生細胞数を測定した。粗リンゴポリフェノール画分では５０μｇ／ｍＬ、プロアントシアニジン画分では２５μｇ／ｍＬで増殖が抑制された（図４）。
【００２１】
［試験例４］（アポト−シス誘導遺伝子発現に対する効果）
Ｂ１６メラノーマ細胞あるいはＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２細胞を２４時間培養し、Ｂ１６メラノーマ細胞では最終濃度１００及び２５０μｇ／ｍＬとなるように調整した粗リンゴポリフェノール画分及びプロアントシアニジン画分存在下で２４時間培養した。同様に、ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２細胞では、最終濃度１０及び２５μｇ／ｍＬとなるように調整したリンゴポリフェノール及びプロアントシアニジン画分存在下で培養した。培養後、培養上清を除去し、ＰＢＳ洗浄後、Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎで細胞を剥離し、回収した。回収した細胞から、ｍＲＮＡをＡＧＰＣ法により抽出・精製し、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ ＲＴＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）により逆転写させｃＤＮＡを合成し、ＭＰＣＲ Ｋｉｔｓ Ｆｏｒ Ｍｏｕｓｅ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｇｅｎｅｓ ｓｅｔ−１（Ｍａｘｉｍ Ｂｉｏｔｃｈ，Ｉｎｃ）を用いてＰＣＲ法を行い、アガロースゲル電気泳動を行った。同様に、ＧＡＰＤＨ遺伝子について、Ｈｏｔ Ｓｔａｒ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、アポトーシス関連遺伝子ＩＣＥ、ｂｃｌ−２、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃの発現を検討した。
【００２２】
Ｂ１６メラノーマ細胞では、粗リンゴポリフェノール画分の場合、いずれの濃度（１００及び２５０μｇ／ｍＬ）でもバンドの出現がみられず、プロアントシアニジン画分の場合、２５０μｇ／ｍＬにおいてｂｃｌ−２、ｐ５３遺伝子の発現が認められた（図５）。図５において、ＡはＧＡＰＤＨ遺伝子（分子量推定用および対照用遺伝子）のＰＣＲ産物、Ｂはアポトーシス関連遺伝子のＰＣＲ産物であり、レーン１はマーカー、レーン２は対照、レーン３は粗リンゴポリフェノール画分（１００μｇ／ｍＬ）、レーン４は粗リンゴポリフェノール画分（２５０μｇ／ｍＬ）、レーン５はプロアントシアニジン画分（１００μｇ／ｍＬ）、レーン６はプロアントシアニジン画分（２５０μｇ／ｍＬ）である。
【００２３】
同様に、ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２細胞では、粗リンゴポリフェノール画分の場合、２５μｇ／ｍＬでＩＣＥ遺伝子の発現が認められ、プロアントシアニジン画分の場合、２５μｇ／ｍＬでＩＣＥ、ｂｃｌ−２、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ遺伝子の発現が認められた（図６）。図６において、ＡはＧＡＰＤＨ遺伝子（分子量推定用および対照用遺伝子）のＰＣＲ産物、Ｂはアポトーシス関連遺伝子のＰＣＲ産物であり、レーン１はマーカー、レーン２は対照、レーン３は粗リンゴポリフェノール画分（１０μｇ／ｍＬ）、レーン４は粗リンゴポリフェノール画分（２５μｇ／ｍＬ）、レーン５はプロアントシアニジン画分（１０μｇ／ｍＬ）、レーン６はプロアントシアニジン画分（２５μｇ／ｍＬ）である。
【００２４】
【発明の効果】
以上の結果より、リンゴ由来の粗ポリフェノール画分およびプロアントシアニジン画分はマウスに移植した腫瘍細胞の増殖を、アポトーシスを誘導することにより阻害し、その結果、粗リンゴポリフェノール画分およびプロアントシアニジン画分を摂取していたマウスの腫瘍の成長を阻害し、延命したことが明らかとなった。従って、本発明の有効成分として用いられるリンゴ由来のプロアントシアニジン成分は腫瘍細胞に対してアポトーシス誘導活性を有し、抗腫瘍活性を有することからガン治療やガン予防に有効でかつ高い安全性を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】粗リンゴポリフェノール画分に含まれる主な成分を示す。
【図２】プロアントシアニジン画分のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによる解析の結果を示す図である。
【図３】Ｂ１６メラノーマ細胞移植後の宿主（マウス）の生存率を示すグラフである。縦軸は生存率（％）、横軸は飼育日数を示す。また、■は対照群を、●は粗リンゴポリフェノール画分投与群を示す。
【図４】粗リンゴポリフェノール及びプロアントシアニジン画分のＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２細胞の増殖に与える影響を示すグラフである。縦軸は６３０ｎｍにおける吸光度を、横軸は濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。また、■は粗リンゴポリフェノール画分を、●はプロアントシアニジン画分を示す。
【図５】Ｂ１６メラノーマ細胞におけるアポトーシス関連遺伝子の発現を示す電気泳動図である。
【図６】ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２細胞におけるアポトーシス関連遺伝子の発現を示す電気泳動図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an antitumor agent containing an apple-derived proanthocyanidin component as an active ingredient.
[0002]
[Prior art]
The mechanism of cancer generation is explained by a multi-stage theory. That is, after being damaged at the DNA level by radiation, ultraviolet rays, active oxygen, and various carcinogens (initiation phase), pre-cancer cells not removed by the repair mechanism or the repair mechanism by cell death promote proliferation. Receiving (promotion period), furthermore, it becomes malignant cancer cells through the process of progression. Cancer cells cause angiogenesis and invasion due to proliferation, and further metastasize to other organs, and the disease progresses. The course varies depending on the site of cancer occurrence, and no effective treatment has been found. Treatment for cancer is broadly divided into four types: surgical treatment (surgery), radiation therapy, chemotherapy with anticancer drugs, and hyperthermia. These treatments are not performed independently, but in combination, but no effective means has yet been found. It is also important to understand the mechanism of cancer development and to take effective measures at each stage in order to prevent cancer and delay the progression and metastasis.
[0003]
As anticancer drugs in chemotherapy, antimetabolites such as 5-fluorouracil, alkylating agents such as cyclophosphamide, antibiotics such as bleomycin and adriamycin, etoposide and camptothecin which are inhibitors of topoisomerase, and the like have been developed. However, it is known that all induce apoptosis in cancer cells. Apoptosis of cancer cells is considered to be an effective means of cancer treatment.
[0004]
Polyphenols, which are secondary metabolites of plants, have a wide variety of species in the plant kingdom, and it is known that there are about several thousand species. Certain of these have been shown to exhibit a variety of biological activities. Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-285876 discloses that polyphenols contained in extracts of immature fruits of apple, pear or peach have functions such as antioxidation, blood pressure lowering, antimutagenicity, antiallergy, anticaries and deodorization. It is reported to have. In addition, it has been shown that grape seed extract containing proanthocyanidin as a main component has a colorectal cancer inhibitory effect (Abstracts of the 3rd Regular Meeting of the Japanese Society of Agricultural Chemistry, Kanto, 1999, 2000). There are many polyphenol components produced that are specific to the variety. Thus, polyphenols have been shown to have various physiological functions such as the above-mentioned antioxidant properties. However, it is considered that the mechanism of the functions also differs depending on the type of polyphenol, and there are many unclear points. Hitherto, a polyphenol having an apoptosis-inducing activity has been reported as epigallocatechin gallate [H. Hibasami et al. , Oncology reports, 5, 527-529, 1998] and phloretin [M. Kobori et al. , Biosci. Biotech. Biochem. , 63, 719-725, 1999]. Further, the mechanism of the colorectal cancer-suppressing action of the above grape extract has not been elucidated.
[0005]
[Problems to be solved by the present invention]
If a substance that induces apoptosis is found as described above, it can be expected to bring about cell death to cancer cells and to be useful for cancer prevention and treatment. In addition, ingestion of a plant-derived polyphenol component for cancer prevention has a dietary experience so far from the viewpoint of safety, and it is considered that there is little problem with ingestion every day. Therefore, an object of the present invention is to provide a safe and effective cancer preventive agent.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
That is, according to the present invention, there is provided an antitumor agent comprising an apple-derived proanthocyanidin component as an active ingredient. Furthermore, since the proanthocyanidins of the present invention have apoptosis-inducing activity, an antitumor agent having apoptosis-inducing activity is provided.
[0007]
These substances having an antitumor activity can be used as a cancer therapeutic agent or a cancer preventive agent that gives cancer cells cell death or growth inhibition by giving a form as a pharmaceutical. In addition, it can be used as a cancer-preventive food by giving the form as a food. According to the present invention, there is also provided a cancer preventive or anticancer agent comprising any one of the aforementioned antitumor agents.
[0008]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail. The proanthocyanidin component used as an active ingredient of the antitumor agent in the present invention can be a commercially available product or a product directly extracted and separated from a plant. The proanthocyanidins referred to in the present invention are a group of condensed tannins present in plants, that is, a group of compounds in which flavan-3-ol is a constituent unit and is condensed or polymerized at 4β → 8 or 4β → 6. An acid treatment produces anthocyanidins such as cyanidin, delphinidin and pelargonidin. In the present invention, it is a proanthocyanidin such as procyanidin, prodelphinidin, properargonidin or the like which is a polymer of a dimer or more of the above structural unit.
[0009]
For example, extraction and purification of a proanthocyanidin component from apple fruit can use the methods described in JP-A-7-285876, JP-A-2000-16951, and JP-A-2002-87978. As the raw material apple, unripe apples as described in JP-A-7-285876 may be used, or wild apples (Crab Apple) as described in Japanese Patent Application No. 2000-277228 may be used. You may.
[0010]
First, an extract is obtained based on, for example, the method of JP-A-7-285876. Specifically, after washing the apple fruit, the juice is obtained by crushing and pressing as it is or while adding sulfurous acid, and a clear juice can be prepared by centrifugation, filtration and the like. The clarified fruit juice may be appropriately concentrated by a known technique. As a method for extracting the crude apple polyphenol component, the obtained fruit juice may be used as a raw material, but the fruit is mixed with alcohols, crushed, immersed as it is, extracted while pressing or heating under reflux, and then alcohol. , And then centrifuged and filtered, or partitioned and filtered with an organic solvent such as hexane or chloroform to obtain a clear extract.
[0011]
Next, the extract is purified by the method of JP-A-2000-16951. Specifically, an adsorbent capable of selectively adsorbing polyphenols, for example, a styrene divinyl benzene-based synthetic adsorption resin, an anion exchange resin, or the like, is passed through a column filled with the clarified juice or clarified extract to obtain a polyphenol component. Is adsorbed. Next, after washing the column with distilled water, a polyphenol component can be eluted and recovered by passing a 20 to 100%, preferably 40 to 60% alcohol solution through the column. When alcohol is distilled off from the obtained alcohol solution fraction, a crude apple polyphenol fraction is obtained. The crude apple polyphenol fraction contains components as shown in FIG.
[0012]
Further, the crude apple polyphenol fraction is treated by the method disclosed in JP-A-2002-87978 to obtain a proanthocyanidin fraction. Specifically, the obtained crude polyphenol fraction can be separated and purified into a procyanidin dimer to pentamer fraction and a hexamer or higher fraction by solid-liquid extraction using methyl acetate as a liquid phase. From the fraction of procyanidin hexamer or more which is not extracted with methyl acetate, methyl acetate is distilled off by a known method. The procyanidin 2 to pentamer fraction extracted into methyl acetate is dissolved in distilled water after concentrating the extraction solution by a known method. Further, the procyanidin dimer to pentamer fraction is separated and purified by normal phase chromatography according to the degree of polymerization (by molecular weight) to obtain a procyanidin oligomer having a uniform degree of polymerization.
[0013]
The proanthocyanidin preparation thus prepared can be used as a drug as an antitumor agent. The pharmaceutical composition may be mixed with a conventional anticancer agent. Pharmaceuticals containing antitumor agents can be made into tablets, powders, granules, capsules, syrups and other oral preparations, suppositories, ointments, sprays, injections and other parenteral preparations by known methods. . At this time, various additives that are known to be used in pharmaceutical production can also be used.
[0014]
Further, it can be suitably used as a general food containing an antitumor agent or as a cancer preventive food having an antitumor function by being added to a general food. Specific examples include alcoholic drinks, carbonated drinks, fruit juice drinks, lactic acid bacteria drinks, soft drinks such as coffee and tea, ice cream, candy, gum, confectionery, bread, noodles and the like.
[0015]
Furthermore, an antitumor agent can be added to cosmetics for some cancers such as skin cancer. Examples of the cosmetics to be added include skin cosmetics and bath cosmetics such as soaps, facial cleansers, creams, emulsions, lotions, powders, perfumes, and lipsticks, and hair cosmetics such as shampoos and rinses, and toothpastes. .
[0016]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0017]
[Example 1]
A crude apple polyphenol fraction was prepared by the method disclosed in JP-A-7-285876 and JP-A-2000-16951, and a proanthocyanidin fraction was prepared by the method disclosed in JP-A-2002-87978. When the crude apple polyphenol fraction was assayed using reverse-phase high performance liquid chromatography, chlorogenic acids (about 20%), phloretin glycosides (about 5%), flavonols (about 15%), proanthocyanidins (About 50%) and other browning substances (about 10%). Further, the proanthocyanidin fraction was analyzed by MALDI-TOF / MS (matrix-assisted laser desorption / ion time-of-flight mass spectrometry) (FIG. 2). It was confirmed that dimers consisting of catechin to 15-mers existed, and it was a high-molecular-weight polyphenol [M. Ohnishi-Kameyama et al. , Mass Spectrometry , 11, 31-36, 1997]. The crude apple polyphenol fraction and proanthocyanidin fraction thus obtained were used as samples for evaluating antitumor activity described later.
[0018]
[Test Example 1] (Effect on mouse melanoma cells)
B16 mouse melanoma cells (JCRB0202) (transferred from Human Science Research Resource Bank) pre-cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium containing 10% FCS (fetal calf serum) are adjusted to 5 × 10 6 cells / mL. . Next, the cell suspension (200 μL) was injected subcutaneously (10 6 ) into C57BL / 6 male mice. A 1% crude apple polyphenol fraction solution and distilled water (control group) were ingested by free drinking water, and samples were replaced every two days and administered daily. The mice were observed for follow-up after transplantation, and the survival rates were compared (FIG. 3). In the control group (DW), dead individuals were observed from the 17th day after transplantation, and 6 out of 10 (60%) died by the 26th day after transplantation. On the other hand, in the group to which the crude apple polyphenol fraction (APP) was administered, dead individuals were observed from the 20th day after transplantation, and only 3 out of 11 (27.3%) died by 26th day after transplantation. The remaining eight survived by day 26 after transplantation. In order to compare the growth of the tumor, the size of the tumor was measured on the 20th and 26th days after the melanoma cell transplantation (Table 1). Even on the 26th day after the transplantation, in the group to which the crude apple polyphenol fraction was administered, one individual in which no tumor was confirmed was observed. In comparison of the tumor volume, the difference was 4055.7 ± 216.3 mm 3 in the distilled water control group, while it was 1248.1 ± 1089.7 mm 3 in the apple polyphenol administration group, indicating a significant difference. In the group to which the crude apple polyphenol fraction was administered, it was found that tumor growth was suppressed.
[0019]
[Test Example 2] (Effect on mouse breast cancer cells)
Mouse mammary carcinoma cell line BALB-MC. Pre-cultured in the same manner as B16 melanoma cells of Test Example 1. E12 (JCRB0233.2) was injected subcutaneously into BALB / C mice. A 1% crude apple polyphenol fraction solution and distilled water (control group) were ingested by free drinking water, and samples were replaced every two days and administered daily. After the transplantation, the mice were observed for follow-up, and the volume of the tumor was measured at 20, 26, 38 and 50 days after the transplantation in order to compare the growth of the tumor (Table 2).
On the 50th day after transplantation, 9 out of 10 mice were able to measure tumors in the control group, whereas 2 out of 10 mice whose tumors were large enough to be measurable in the crude apple polyphenol fraction administration group. I didn't. When the size of the tumor was compared, it was 163.8 ± 44.2 mm 3 in the control group, whereas it was 36.3 ± 23.2 mm 3 in the group administered with the crude apple polyphenol fraction, and the tumor volume was about 1 / l. It was as small as 4. In the control group, 9 out of 10 mice could measure the tumor, whereas in the group administered with the crude apple polyphenol fraction, only 2 out of 10 mice could measure the tumor.
[0020]
[Test Example 3] (Effect on growth of mouse tumor cells)
BALB-MC. Was added to the mouse tumor cells of the crude apple polyphenol fraction and the proanthocyanidin fraction. The growth inhibitory effect on E12 cells was examined. BALB-MC. After culturing the E12 cells for 24 hours in a 10% FCS-DMEM medium, the cells were further cultured for 24 hours in the same medium containing the above-described samples at various concentrations, and the number of living cells was measured by the trypan blue method. The growth was suppressed at 50 μg / mL in the crude apple polyphenol fraction and at 25 μg / mL in the proanthocyanidin fraction (FIG. 4).
[0021]
[Test Example 4] (Effect on apoptosis-induced gene expression)
B16 melanoma cells or BALB-MC. The E12 cells were cultured for 24 hours, and the B16 melanoma cells were cultured for 24 hours in the presence of a crude apple polyphenol fraction and a proanthocyanidin fraction adjusted to a final concentration of 100 and 250 μg / mL. Similarly, BALB-MC. E12 cells were cultured in the presence of apple polyphenol and proanthocyanidin fractions adjusted to final concentrations of 10 and 25 μg / mL. After culturing, the culture supernatant was removed, and after washing with PBS, the cells were detached and collected with Denaturing solution. From the recovered cells, mRNA is extracted and purified by the AGPC method, reverse-transcribed by Omniscript RTKit (QIAGEN) to synthesize cDNA, and PCR is performed using the MPCR Kits For Mouse Apoptosis Genesset-1 (Maxim Biotch, Inc). And agarose gel electrophoresis was performed. Similarly, for the GAPDH gene, the expression of the apoptosis-related genes ICE , bcl-2 , p53 , and c-myc was examined using Hot Star Taq DNA polymerase (QIAGEN).
[0022]
In the B16 melanoma cells, no band appeared at any concentration (100 and 250 μg / mL) in the crude apple polyphenol fraction, and the bcl-2 and p53 genes at 250 μg / mL in the proanthocyanidin fraction. Expression was observed (FIG. 5). In FIG. 5, A is a PCR product of a GAPDH gene (gene for molecular weight estimation and control), B is a PCR product of an apoptosis-related gene, lane 1 is a marker, lane 2 is a control, and lane 3 is a crude apple polyphenol fraction. (100 μg / mL), lane 4 is a crude apple polyphenol fraction (250 μg / mL), lane 5 is a proanthocyanidin fraction (100 μg / mL), and lane 6 is a proanthocyanidin fraction (250 μg / mL).
[0023]
Similarly, BALB-MC. In E12 cells, in the case of the crude apple polyphenol fraction, the expression of the ICE gene was observed at 25 μg / mL, and in the case of the proanthocyanidin fraction, the expression of the ICE , bcl-2 , p53 and c-myc genes was observed at 25 μg / mL. (Figure 6). In FIG. 6, A is a PCR product of a GAPDH gene (gene for molecular weight estimation and control), B is a PCR product of an apoptosis-related gene, lane 1 is a marker, lane 2 is a control, and lane 3 is a crude apple polyphenol fraction. (10 μg / mL), lane 4 is a crude apple polyphenol fraction (25 μg / mL), lane 5 is a proanthocyanidin fraction (10 μg / mL), and lane 6 is a proanthocyanidin fraction (25 μg / mL).
[0024]
【The invention's effect】
From the above results, the apple-derived crude polyphenol fraction and the proanthocyanidin fraction inhibited the growth of tumor cells transplanted into mice by inducing apoptosis. As a result, the crude apple polyphenol fraction and the proanthocyanidin fraction Inhibition of tumor growth in mice that had been ingested resulted in prolonged life. Therefore, the apple-derived proanthocyanidin component used as the active ingredient of the present invention has apoptosis-inducing activity on tumor cells and has antitumor activity, and thus is effective and highly safe for cancer treatment and prevention. .
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows main components contained in a crude apple polyphenol fraction.
FIG. 2 shows the results of analysis of proanthocyanidin fractions by MALDI-TOF / MS.
FIG. 3 is a graph showing the survival rate of a host (mouse) after B16 melanoma cell transplantation. The vertical axis shows the survival rate (%), and the horizontal axis shows the breeding days. ■ indicates a control group, and ● indicates a group to which a crude apple polyphenol fraction was administered.
FIG. 4. BALB-MC. Fraction of crude apple polyphenol and proanthocyanidin fractions. It is a graph which shows the influence which it has on the proliferation of E12 cell. The vertical axis indicates the absorbance at 630 nm, and the horizontal axis indicates the concentration (μg / ml). ■ indicates a crude apple polyphenol fraction, and ● indicates a proanthocyanidin fraction.
FIG. 5 is an electrophoretogram showing the expression of apoptosis-related genes in B16 melanoma cells.
FIG. 6: BALB-MC. FIG. 2 is an electrophoretogram showing the expression of apoptosis-related genes in E12 cells.