JP2004049129A - Bacterium degrading steroid skeleton-containing compound - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ステロイド骨格を有する化合物を分解することができる、新規なＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属に属する菌株、及びその利用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、社会的な問題となっている内分泌攪乱化学物質、いわゆる環境ホルモンは、体内の天然ホルモンの作用を攪乱することによって生体に悪影響を及ぼすと考えられている。この攪乱物質の多くが難生分解性であり、市民生活において極めて身近に存在することから大変深刻な社会問題となっている。
【０００３】
環境ホルモンには水圏生態系に悪影響を及ぼすものも知られており、例えば多摩川に生息している鯉のメス化現象は河川水に含まれるノニルフェノール（ＮＰ）及びエストラジオールが主原因ではないか、とする説が有力になっている（朝日新聞 ２００１年７月６日）。
【０００４】
水生生物に対して内分泌攪乱作用を示す天然エストロゲンの中でも最も強力な作用を有するものはエストラジオールであり、エストラジオールは人及び家畜の排泄物から抱合体（不活性型）として排出されるが、下水中の微生物によって脱抱合されて活性型に戻ることが知られている。
また、人畜が排出する１７β−エストラジオール（以下、本明細書において「Ｅ２」と記載した場合は、１７β−エストラジオールのことを意味する）等も、エストロゲン（女性ホルモン）活性を有するため、水生生物（魚類、両生類等）の生殖機能に影響を与えることが判明している。
【０００５】
そして、エストラジオール類の化合物の１種である、１７α−エチニルエストラジオールは合成卵胞ホルモンの一種であり、従来より避妊薬（ピル）として用いられている。低容量ピルが最近、正式に認可されたことから、今後ピルの使用が飛躍的に上昇することが考えられ、それとともに、ピルに含まれるエストラジオールの廃棄量も増加することが考えられる。
【０００６】
このようなエストロゲンは、都市部での人口増加及び畜産業の規模拡大化によって、最近においては全国の河川から高頻度に検出されており、環境省も産業由来内分泌攪乱化学物質とともに、その環境動態を詳しく調査すべき「要監視物質」として取り扱っている。
【０００７】
上述したように、Ｅ２等のエストロゲンは難生分解性であり、また生殖器官に異常を発生する生物学的影響等も報告されており、従って、バイオレメディエーションに応用できる、新規なエストロゲン（ステロイド骨格を有する化合物）分解菌を単離及び同定することが望まれていた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、ステロイド骨格を有する化合物を分解することができる、新規な微生物を単離及び同定することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、東京都における汚水処理プラントの活性汚泥中に顕著なステロイド骨格含有化合物分解活性が観察されることを見だした。今回、本発明者らは、新規なステロイド骨格含有化合物分解菌（ＡＲＩ−１Ｔと命名）を単離することに成功した。さらに、この単離したステロイド骨格含有化合物分解菌の特徴を分析した結果、この菌が新種の菌であるという知見を得た。本発明は、上記知見に基づいてなされなものである。
【００１０】
すなわち、本発明は、ステロイド骨格含有化合物を分解することができるＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属に属する菌株を提供するものである。なお、ステロイド骨格含有化合物としては、例えばエストラジオール、エストロン、エストリオール等が挙げられる。
本発明の菌株の好ましい具体例としては、ステロイド骨格含有化合物を二酸化炭素に分解するものであり、グルコース、アラビノース、マンノース、マンニトール、Ｎ−アセチル−グルコサミン、マルトース、グルコン酸、アジピン酸及びリンゴ酸からなる群からなる化合物を同化しない菌株である。すなわち、本発明の好ましい菌株としては、ステロイド骨格含有化合物（例えば、エストラジオール、エストロン、エストリオール等）以外の多くの炭素源を資化せず、ステロイド骨格含有化合物のみを特異的に資化する菌株である。
【００１１】
本発明の菌株の好ましい具体例としては、カタラーゼ及びニトレートレダクターゼの酵素活性が陽性で、β−グルコシダーゼ、ゼラチナーゼ及びβ−ガラクトシダーゼの酵素活性が陰性である菌株である。
本発明の菌株の好ましい具体例としては、グラム陰性、好気性、桿状の細菌であり、コロニーが円形、凸状、不透明かつ淡褐色であり、２５℃で生育できるが、４℃又は４２℃では生育できない菌株である。
【００１２】
本発明の菌株の好ましい具体例としては、ＤＮＡのＧ＋Ｃ含有量が約６１％である菌株である。本発明の菌株の好ましい具体例としては、主要な非極性脂肪酸が１８：１であり、主要な２−ヒドロキシ脂肪酸が１４：０ ２−ＯＨであり、３−ヒドロキシ脂肪酸は存在せず、主要なイソプレノイドキノンはユビキノンＱ−１０である菌株である。本発明の菌株の好ましい具体例としては、唯一の炭素源としてエストラジオールを含む培地を用いたスクリーニングにより単離される菌株である。本発明の菌株の好ましい具体例としては、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８９２４を有する菌株である。
【００１３】
また、本発明は、上述の本発明のＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属に属する菌株を用いることを特徴とする、ステロイド骨格含有化合物分解方法を提供するものである。
また、本発明は、上述の本発明のＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属に属する菌株を用いることを特徴とする、廃水処理方法を提供するものである。
また、本発明は、上述の本発明のＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属に属する菌株を用いることを特徴とする、ステロイド骨格含有化合物を分解するためのバイオリアクターを提供するものである。該バイオリアクターは、排水処理用として好適に用いられる。
【００１４】
また、本発明は、上述の本発明のＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属に属する菌株を用いることを特徴とする、ステロイド骨格含有化合物を検出するためのバイオセンサを提供するものである。
また、本発明は、唯一の炭素源としてエストラジオールを含む培地を用いてスクリーニングを行うことを特徴とする、ステロイド骨格含有化合物を分解することができる、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属に属する菌株のスクリーニング方法を提供するものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
先ず、本発明のＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属に属する菌株について説明する。本発明のＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属に属する菌株は、ステロイド骨格含有化合物を分解することのできる菌株であり、以下、本明細書において「ステロイド骨格含有化合物分解菌」ともいう。本発明において、ステロイド骨格含有化合物とは、ステロイド骨格を含有する有機化合物全てを含む概念であり、例えばエストラジオール、エストロン、エストリオール等の化合物を意味する。エストラジオール、エストロン、エストリオールの化学構造を以下に示す。
【００１６】
【化１】
本発明の菌株は、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属に属する菌株であり、本発明者らが単離した一例の菌株（ＡＲＩ−１Ｔ）は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８９２４として寄託されている。上記菌株は、東京の汚水処理プラントの活性汚泥から単離されたものである。ＡＲＩ−１Ｔ株の分離のために、０．１質量％の１７β−エストラジオール（以下、本明細書において「Ｅ２」ともいう）を含むＹＮＢ寒天（ｐＨ７．０；２５℃）（Ｅ２−ＹＮＢ培地）を使用した。
後述する実施例に詳述する通り、得られた微生物の菌学的性質を調べ、新規微生物であることを確認した。得られた菌株の菌学的性質を以下に示す。
【００１８】
〔１〕形態学的性質
（１）細胞の形：桿状
（２）大きさ：長さ１．２μｍ；直径０．８μｍ
（３）グラム染色：陰性
【００１９】
〔２〕生育状態
コロニーは円形、凸状、不透明かつ淡褐色である。
〔３〕生理学的性質
（１）生育温度：２５℃で生育できるが、４℃又は４２℃では生育できない。
（２）酸素要求性：好気的
（３）資化性：エストラジオール、エストロン、エストリオールを同化するが、グルコース、アラビノース、マンノース、マンニトール、Ｎ−アセチル−グルコサミン、マルトース、グルコン酸、アジピン酸及びリンゴ酸を同化しない。
【００２０】
（４）カタラーゼ及びニトレートレダクターゼの酵素活性は陽性である。
（５）β−グルコシダーゼ、ゼラチナーゼ及びβ−ガラクトシダーゼの酵素活性は陰性である。
（６）ＤＮＡのＧ＋Ｃ含有量は約６１％である。
（７）主要な非極性脂肪酸は１８：１であり、主要な２−ヒドロキシ脂肪酸は１４：０ ２−ＯＨであり、３−ヒドロキシ脂肪酸は存在しない。主要なイソプレノイドキノンはユビキノンＱ−１０である。
【００２１】
本発明のステロイド骨格含有化合物を分解することができるＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属に属する菌株は、汚水処理プラントの活性汚泥等から、例えば０．１質量％のＥ２を含むＹＮＢ寒天（ｐＨ７．０；２５℃）（Ｅ２−ＹＮＢ培地）を使用してスクリーニングすることにより単離することができる。Ｅ２を含むＹＮＢ培地は、唯一の炭素源としてＥ２を含む培地である。単離された菌株は、Ｅ２を検出するＨＰＬＣ等の常用手段を用いて培養液を経時的に分析することによって、Ｅ２分解活性を検出することができる。
【００２２】
本発明のステロイド骨格含有化合物を分解することができる菌株を培養するための培地としては、通常、これらの菌株が生育することのできるものであれば、天然培地であっても合成培地であってもよく、いずれも使用することができる。また、培地は固体培地、液体培地のいずれでもよい。用いられる培地には、炭素源、窒素源及び無機物などが含まれる。炭素源としては、エストラジオールが好ましく用いられ、その他の各種炭化水素が含まれていてもよい。窒素源としては、例えば酵母エキス、肉エキス、ペプトン、各種のアミノ酸等の有機窒素類、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素等が挙げられる。炭素源、窒素源、いずれも単独で用いてもよく、又は２種以上を混合して用いてもよい。その他の無機物としては、例えばカリウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、カルシウム塩等を必要に応じて適宜使用する。本発明のステロイド骨格含有化合物分解菌の培養方法としては、通常の方法でよく、例えば培養温度は１５〜３５℃が好ましく、２０〜３０℃が更に好ましい。また、培地のｐＨは６〜８とすることが好ましく、７付近であることが更に好ましい。また、培養は振盪培養を行うか、又は通気撹拌を行い、好気条件下で行うことが好ましい。
【００２３】
次に、本発明のステロイド骨格含有化合物分解方法について説明する。
本発明のステロイド骨格含有化合物分解方法は、本発明のステロイド骨格含有化合物分解菌を用いることを特徴とする。具体的には、本発明のステロイド骨格含有化合物分解菌を、エストラジオール、エストロン、エストリオール等のステロイド骨格含有化合物を含む処理対象（例えば、下水、畜産廃水、井戸水、水道水等）に接触させ、上記分解菌の作用により処理対象物中のステロイド骨格含有化合物を分解し、無毒化する。
【００２４】
次に、本発明の排水処理方法について説明する。
本発明の排水処理は、本発明のステロイド骨格含有化合物分解菌を用いることを特徴とする。具体的には、本発明のステロイド骨格含有化合物分解菌を、エストラジオール、エストロン、エストリオール等のステロイド骨格含有化合物を含む排水（例えば、下水、畜産排水、井戸水、水道水など）に接触させ、上記分解菌の作用により処理対象物中のステロイド骨格含有化合物を分解し、無毒化する。
【００２５】
次に、本発明のバイオリアクターについて説明する。
本発明のバイオリアクターは、本発明のステロイド骨格含有化合物分解菌を用いることを特徴とする。具体的には、本発明のバイオリアクターは、本発明のステロイド骨格含有化合物分解菌を担体に固定化し、ステロイド骨格含有化合物分解菌固定化担体を得、環境水等の処理対象物を通液するタンク内に、上記ステロイド骨格含有化合物分解菌固定化担体を設置することによって製造することができる。なお、本発明のステロイド骨格含有化合物分解菌が本来の活性を損なわないようにしつつ、動かないように固定することが必要である。また、制御装置、ポンプ、各種センサー等を設置してもよい。用いられる担体としては、本発明のステロイド骨格含有化合物分解菌を固定化することができるものであれば、どのようなものであってもよい。用いられる担体としては、例えばアルギン酸、ポリビニルアルコール、ゲランガム、アガロース、セルロース、デキストラン等のゲル状物質や、ガラス、活性炭、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、木材、シリカゲル等の担体が挙げられる。ステロイド骨格含有化合物分解菌を固定化する方法としては、アルギン酸、ポリビニルアルコール、ゲランガム、アガロース、セルロース、デキストラン等のゲル状物質に包括固定する方法、ガラス、活性炭、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、木材、シリカゲル等の担体に吸着固定する方法が挙げられる。
【００２６】
本発明のステロイド骨格含有化合物分解菌を担体に固定化する方法について簡単に説明すると、例えば菌株の培養液を担体に流し込むことにより固定化する固定法、アスピレーターを用いて担体を減圧下にし、菌株の培養液を流し込むことにより固定化する固定法、菌株の培養液を滅菌した培地と担体との混合物に流し込み、振盪培養を行った後、上記混合物から取り出した担体を自然乾燥する方法等が挙げられる。
【００２７】
本発明のバイオリアクターは、例えば廃水処理用として用いられる。このような排水処理は、例えば回分式、半回分式、連続式等の方法により行うことができる。排水処理は、処理対象物となる排水の温度を、好ましくは１５〜３５℃の温度、更に好ましくは２０〜３０℃の温度に調整して処理を行う。
【００２８】
次に、本発明のバイオセンサについて説明する。
本発明のバイオセンサは、本発明のステロイド骨格含有化合物分解菌を用いることを特徴とする。具体的には、本発明のバイオセンサは、本発明のステロイド骨格含有化合物分解菌を固定化した担体と、例えば酸素電極とを組み合わせて製造される。
【００２９】
ステロイド骨格含有化合物を固定化する担体としては、ニトロセルロース膜等の膜が用いられる。また、アルギン酸カルシウムゲル等のゲルを用いることもでき、この場合には耐久性に優れるとともに、微生物担持ゲルをガラス管内に重点することによりユニット化することができるという利点もある。
本発明のステロイド骨格含有化合物分解菌を担体に固定化する方法については、バイオリアクターの説明において記載したのと同様の方法でよい。
【００３０】
本発明のバイオセンサは、排水（例えば、下水、畜産排水、井戸水、水道水など）中のエストラジオール、エストロン、エストリオール等のステロイド骨格含有化合物の含有量を測定するために用いられる。具体的には、本発明のバイオセンサと、該バイオセンサを一定の温度に保温することのできる恒温槽と、バイオセンサにおける酸素電極の電流の変化を測定する電圧電流計と、測定された電流の変化を記録するための記録計とを備えた装置とし、ステロイド骨格含有化合物分解菌がステロイド骨格含有化合物を分解する時に消費する酸素濃度を測定することにより、排水中のステロイド骨格含有化合物の含有量の測定が可能となる。
【００３１】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例１
ステロイド骨格含有化合物分解菌の単離
東京都の汚水処理プラント（ＳＴＰ）の活性汚泥からステロイド骨格含有化合物分解菌を単離した。活性汚泥からのステロイド骨格含有化合物分解菌の単離のためには、０．１質量％のＥ２を含むＹＮＢ培地（以下、Ｅ２−ＹＮＢ培地という）を使用した。Ｅ２は和光純薬工業（株）から購入したものを用いた。ＹＮＢ培地は、Ｄｉｆｃｏ Ｍａｎｕａｌに記載されている通り、窒素源としての（ＮＨ４）２ＳＯ４、他の塩（ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、ＮａＣｌ及びＣａＣｌ２）、微量の金属及び少量のビタミンを含んでいる。従って、Ｅ２−ＹＮＢ培地には、Ｅ２以外の炭素源は存在せずＥ２がＥ２−ＹＮＢ培地における唯一の炭素源であると考えられる。
【００３２】
活性汚泥を上記Ｅ２−ＹＮＢ培地に接種した。サンプルが液体の場合には１００μｌのサンプルを直接Ｅ２−ＹＮＢ寒天培地に接種した（サンプル量：３０ｍｇ／ｍｌ）。サンプルが沈殿の場合には、接種前に１０ｇのサンプルを１０ｍｌのＹＮＢ培地に懸濁させ、この懸濁液を、上記のようにＥ２−ＹＮＢ培地に接種した。
【００３３】
次いで、サンプルを接種した培地を１５０ｒｐｍで回転しながら２５℃で１４日間培養した。培養終了後、培養物を１２０ｍｌのメタノールと混合し、０．２μｍのポアサイズのフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ ＬＧ１３，ミリポア製）を用いてろ過した。ろ液をＭｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ＧＰオクタデシルシリルカラム（内径：４．６ｍｍ、長さ：１５０ｍｍ）を有するＨＰＬＣシステムで分析を行い、２１０ｎｍにおけるＵＶ吸収を測定することにより、Ｅ２の分解活性を分析した。すなわち、２１０ｎｍにおけるＵＶ吸収の減少によりＥ２の分解活性を確認した。なお、移動相としては８０％メタノール水を用いた。
【００３４】
分析の結果、１つのサンプルがＥ２分解活性を有することが示された。このサンプルは１４日間で６０％のＥ２を分解した。Ｅ２分解菌を分離するため、この寒天培地に増殖した微生物を３回継代培養した。継代培養は栄養寒天培地にて画線培養を行った。培養は２５℃の温度で行い、小さい白褐色のコロニーをひろい、これをＡＲＩ−１Ｔと命名した。このＡＲＩ−１Ｔは独立行政法人産業技術総合研究所特許生物センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８９２４として寄託されている。
【００３５】
実施例２
ＡＲＩ−１ Ｔ 株による、各種ステロイド骨格含有化合物の分解活性
ＡＲＩ−１Ｔのステロイド骨格含有化合物分解活性について、単一コロニーを、エストラジオール、エストロン、エストリオールを含むＹＮＢ寒天培地に接種し、エストラジオール、エストロン、エストリオールを分解するかどうかを調べた。エストラジオール、エストロン、エストリオールの培地中の濃度は、１０ｍｇ／３０ｍｌとした。エストラジオール、エストロン、エストリオールは、いずれも和光純薬工業（株）より購入したものを用いた。培養は、２５℃の温度で行った。培養初日、培養１０日後及び２０日後に、培養物を１２０ｍｌのメタノールと混合し、０．２μｍのポアサイズのフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ ＬＧ１３，ミリポア製）を用いてろ過した。ろ液をＭｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ＧＰオクタデシルシリルカラム（内径：４．６ｍｍ、長さ：１５０ｍｍ）を有するＨＰＬＣシステムで分析を行い、２１０ｎｍにおけるＵＶ吸収を測定することにより、エストラジオール、エストロン、エストリオールの分解活性を分析した。すなわち、２１０ｎｍにおけるＵＶ吸収の減少によりエストラジオール、エストロン、エストリオールの分解活性を確認した。なお、移動相としては８０％メタノール水を用いた。
【００３６】
結果を図１に示す。図１は、ＡＲＩ−１Ｔ株による各種のステロイド骨格含有化合物の分解の時間経過を示すグラフである。図１のグラフにおいて、白丸はエストロン、三角はエストラジオール、四角はエストリオールの分解の時間経過である。図１に示すように、エストロンは１０日培養後には約１０％が分解され、２０日培養後には約５０％が分解された。エストラジオールは、１０日培養後に約７５％が分解され、２０培養後には約８５％が分解された。エストリオールは、１０日培養後に約９０％が分解され、１０日分解後には約９５％が分解された。
【００３７】
実施例３
エストラジオール濃度によるエストラジオール分解活性
培地中のエストラジオールの初濃度を、３０、１０及び５ｍｇ／３０ｍｌとした以外は、実施例２と同様に培養を行い、初濃度が３０ｍｇ／３０ｍｌのものについては、０日目から１０日置きに５０日目まで分解活性を測定し、初濃度が１０ｍｇ／３０ｍｌ濃度のものについては、０日目から５日おきに２５日目まで、初濃度が５ｍｇ／３０ｍｌ濃度のものについては、０日目から４日置きに２０日目まで分解活性を測定した。分解活性の測定は実施例１と同様に行った。
【００３８】
結果を図２に示す。図２は、ＡＲＩ−１Ｔ株による、エストラジオール分解活性の分解の時間経過を示すグラフである。図２において、白丸は初濃度が３０ｍｇ／３０ｍｌ濃度、二重丸は初濃度が１０ｍｇ／３０ｍｌ濃度、黒丸は初濃度が５ｍｇ／３０ｍｌ濃度の場合の結果を示す。図２から明らかなように、初濃度が５ｍｇ／３０ｍｌの場合は２０日でほぼ全てが分解され、１０ｍｇ／３０ｍｌの場合は２５日で約９０％が分解され、３０ｍｇ／３０ｍｌ濃度の場合は５０日で約９０％が分解された。
【００３９】
実施例４
代謝産物の分析
ＡＲＩ−１ＴによるＥ２の代謝産物を以下のようにして調べた。すなわち、ＡＲＩ−１Ｔの培養を、１０ｍｇ／３０ｍｌのＥ２を含有するＹＮＢ寒天培地を用いて行い、０日、５日、１０日、１５日、２０日及び２５日培養後の代謝産物を分析した。分析は以下のように行った。
【００４０】
培養物をヘキサン又はクロロホルムを用いて抽出した。ヘキサン又はクロロホルムを用いたのは、それらが異なるオクタノール−水分配係数を有しており、それらが疎水性の指標として用いられるからである。抽出物をＶａｒｉａｎ３８００ガスクロマトグラフ−質量スペクトル（ＧＣＭＳ）により分析した。分析条件は以下の通りである。
カラム：ＢＰＸ−５キャピラリーカラム（内径：２５ｍ×０．２２ｍｍ、ＳＧＥから購入）
注入量：３μｌ
キャリアーガス：ヘリウム（１．０ｍｌ／分）
温度勾配：５０℃で３．４分、５０〜３７０℃で１０℃／分、３７０℃で１０分。
また、電子衝撃イオン化のイオン化エネルギーは７０ｅＶであった。
【００４１】
図３に、０日及び３０日培養物のクロロホルム抽出物の全イオンガスクロマトグラムを示す。図３は、培養物のクロロホルム抽出物の全イオンクロマトグラムである。図３において、（Ａ）は０日培養物、（Ｂ）は３０日培養物のクロロホルム抽出物の全イオンクロマトグラムである。図３に示すように、０日、３０日培養物のいずれにおいても、Ｅ２のピークのみが検出され、代謝産物と考えられるピークはいっさい検出されなかった。また、培養が進むにつれ、ピークの減少が観察された。
【００４２】
次に、１Ｈ−ＮＭＲを用いてＥ２の代謝運命について検討した。ＧＣＭＳに用いた試料（０日培養物及び３０日培養物）を２５℃の温度の下で濃縮乾固し、重メタノール（ＣＤ３ＯＤ）に再溶解したものを試料として測定した。測定は、ＪＥＯＬ ＪＮＭ−ＥＸ４００ ＮＭＲスペクトロメーターを用い、４００ＭＨＺにおいて５ｍｍの直径の試験管に入れたサンプル溶液を用いて測定した。測定の結果を図４に示す。図４は、培養物のクロロホルム抽出物のＮＭＲスペクトルであり、（ａ）は０日培養物、（ｂ）は３０日培養物のＮＭＲスペクトルであり、（ｃ）はＥ２の化学構造を示す。図に示すように、３０日培養物においては、Ｅ２の芳香族及び非芳香族部分のプロトンのシグナルがほとんど完全に消失していた。このことから、Ｅ２の代謝産物は、二酸化炭素や有機酸等の低分子量化合物にまで分解されていることがわかる。
【００４３】
実施例５
形態学的特性
ＡＲＩ−１Ｔを透過型電子顕微鏡により観察した。電子顕微鏡写真の作製において、３日間培養した細胞を遠心分離して集め、生理食塩水にて洗浄した後、ｆｏｒｍｖａｒでコーティングしたグリッドに細胞を載せ、オスミウム蒸気により数分間固定を行った。次いで、グリッドを蒸留水で洗浄した後、酢酸ウラニル溶液でネガティブに染色し、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈ−３００透過型電子顕微鏡で観察を行った。グラム染色は、Ｙｏｋｏｔａ（１９９９）、「微生物学実験法」の「グラム染色」の章、 １９９． Ｅｄｉｔｅｄｂｙ Ｓｕｇｉｙａｍａ Ｊ．， Ｗａｔａｎａｂｅ Ｓ．， Ｏｏｗａｄａ Ｋ．， Ｋｕｒｏｉｗａ Ｔ．， Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｈ． ＆ Ｔｏｋｕｄａ Ｇ．， Ｔｏｋｙｏ： Ｋｏｄａｎｓｈａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ に記載された方法により行った。
【００４４】
ＡＲＩ−１Ｔ株はグラム陰性、及び桿状（長さ長さ１．２μｍ；直径０．８μｍ）であった。図５はＡＲＩ−１Ｔ株の電子顕微鏡写真を示す。この株は、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ、Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ａｇａｒ又はＴｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ａｇａｒ上で２５℃６〜７日間で淡褐色のコロニーを形成した。コロニーは円形、凸状、不透明であった。コロニーの生育は４℃及び４２℃では観察されなかった。
【００４５】
実施例６
生理学的及び生化学的特徴
本実施例でＡＲＩ−１Ｔとともに使用した細菌株を以下に記載する。これらは、ｔｈｅ Ｊａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ （ＪＣＭ）及びＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した。
生育のための酸素要求は、普通寒天及びＢＢＬ Ｇａｓｐａｋ Ａｎａｅｒｏｂｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ， ＭＤ）を用いて調べた。オキシダーゼ及びカタラーゼの試験は、ｐｏｒｅｍｅｄｉａオキシダーゼ試験指示薬（栄研化学（株）製）及び３．０％過酸化水素により実施した。ＡＰＩ２０ＮＥシステム（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）を用いて試験微生物の生化学的特徴を調べた。
【００４６】
使用した細菌株
Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｕｂａｒｃｔｉｃｕｍ ＪＣＭ １０３９８Ｔ
Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｍ ＡＴＣＣ ７００２７９Ｔ
Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｔｙｇｉｕｍ ＡＴＣＣ ７００２８０Ｔ
Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ ＡＴＣＣ １４６６６Ｔ
Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｒｏｓａＡＴＣＣ ５１８３７Ｔ
Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ ＡＴＣＣ ７００２７８Ｔ
【００４７】
ＡＲＩ−１Ｔ株は好気性の菌株であった。
ＡＲＩ−１Ｔ株及びその他の使用した菌株の特徴を表１に示す。ＡＲＩ−１Ｔ株は本実験で試験した、グルコース、アラビノース、マンノース、マンニトール、Ｎ−アセチル−グルコサミン、マルトース、グルコン酸、アジピン酸及びリンゴ酸のいずれも同化しなかった。これらの実験で用いた、他のＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍに属する菌株は、多数の異なる種類の化合物を同一の実験条件下で同化したので、実験系は正常に機能していると考えられる。
なお、本実施例で用いた菌株は、全て、オキシダーゼ試験、インドール生成、グルコースから酸の生成、アルギニンジヒドロラーゼ活性、ウレアーゼ活性及びｎ−カプリン酸、クエン酸及び酢酸フェニルの同化が陰性であった。
【００４８】
【表１】
実施例７
１６Ｓ−ｒＤＮＡ及びＤＮＡ塩基組成の解析
ＤＮＡの調製
２５℃の温度で４８時間増殖させた培養物から菌株を集菌し、標準手段（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ， 他（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄｎ． ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって染色体ＤＮＡを精製した。すなわち、細菌細胞をＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、リゾチーム（最終濃度：２ｍｇ／ｍｌ）及びドデシル硫酸ナトリウム（最終濃度：０．５％）に溶解し、細菌細胞を溶菌させた。溶菌液からフェノール−クロロホルム抽出によってＤＮＡを回収し、ＲＮａｓｅ処理、ＣＴＡＢ処理及びエタノール沈殿を行い、精製ＤＮＡを得た。なお、ＲＮａｓｅ処理、ＣＴＡＢ処理は２回行った。
【００５０】
ＤＮＡ塩基組成、すなわちグアニン＋シトシン（Ｇ＋Ｃ）含量は、Ｋｕｍａｇａｉ， Ｍ．（１９８０） Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １６，１１１−１２０に記載された方法に従って高速液体クロマトグラフィーにより測定した。
【００５１】
大腸菌１６Ｓ−ｒＤＮＡのナンバリングシステム８−２７及び１４９２−１５１０に対応するユニバーサルプライマーセット及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＰＣＲにより、ほぼ完全な１６Ｓ−ｒＤＮＡを増幅した。温度プロフィールは２５サイクルを含み、９４℃で６０秒、５８℃で６０秒、及び７２℃で９０秒、最終のポリメリゼーションは７２℃で７分である。増幅されたＤＮＡフラグメントの直接配列決定は、
Ｓａｔｏｍｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ４７， ８３２−８３６に記載された方法により実施した。
【００５２】
ＡＲＩ−１Ｔを、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ． ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５， ４０３−４１０）を使用して、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、及びＤＤＢＪデータベース中の既知の全ての配列データと比較した。複合配列、Ｋｉｍｕｒａ， Ｍ． （１９８０） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １６， １１１−１２０に記載されたヌクレオチド置換速度（Ｋｎｕｃ値）の計算及びＮｅｉｇｈｂｏｒ−Ｊｏｉｎｉｎｇ法（Ｓａｉｔｏｕ， Ｎ． ＆ Ｎｅｉ， Ｍ． （１９８７） Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｅｖｏｌ ４， ４０６−４２５）による系統樹の構築は、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗコンピュータープログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２， ４６７３−４６８０）を用いて行った。
【００５３】
ＡＲＩ−１ＴのＧ＋Ｃ含量は６１％と測定された（表２）。この値はＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属の他の菌株について測定される範囲内（すなわち６０〜６６％）である（Ｂａｌｋｗｉｌｌ， Ｄ． Ｌ．， Ｄｒａｋｅ， Ｇ． Ｒ．， Ｒｅｅｖｅｓ， Ｒ． Ｈ．， Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓｏｎ， Ｊ． Ｋ．， Ｗｈｉｔｅ， Ｄ． Ｃ．， Ｒｉｎｇｅｌｂｅｒｇ， Ｄ． Ｂ， Ｃｈａｎｄｌｅｒ， Ｄ． Ｐ．， Ｒｏｍｉｎｅ， Ｍ． Ｆ．， Ｋｅｎｎｅｄｙ， Ｄ． Ｗ． ＆ Ｓｐａｄｏｎｉ， Ｃ． Ｍ． （１９９７） Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａｒｏｍａｔｉｃ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｆｒｏｍ ｄｅｅｐ−ｔｅｒｒｅｓｔｒｉａｌ−ｓｕｂｓｕｒｆａｃｅ ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ ｓｐ． ｎｏｖ．， Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ ｓｐ ｎｏｖ．， ａｎｄ Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｔｙｇｉａ ｓｐ． ｎｏｖ． Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ４７， １９１−２０１、Ｙａｂｕｕｃｈｉ， Ｅ．， Ｙａｎｏ， Ｉ．， Ｏｙａｉｚｕ， Ｈ．， Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ， Ｙ．， Ｅｚａｋｉ， Ｔ． ＆ Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｈ． （１９９０） Ｐｒｏｐｏｓａｌｓ ｏｆ Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ ｇｅｎ． ｎｏｖ． ａｎｄ ｃｏｍｂ． ｎｏｖ．， Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｒａｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ ｓｐ． ｎｏｖ．， Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｙａｎｏｉｋｕｙａｅ ｓｐ． ｎｏｖ．， Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ａｄｈａｅｓｉｖａ ｓｐ． ｎｏｖ．， Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｃａｐｓｕｌａｔａ ｃｏｍｂ． ｎｏｖ．， ａｎｄ ｔｗｏ ｇｅｎｏｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３４， ９９−１１９及びＴａｋｅｕｃｈｉ， Ｍ．， Ｓａｗａｄａ， Ｈ．， Ｙａｎａｇｉ， Ｍ．， Ｙａｍａｓａｔｏ， Ｋ．， Ｈａｍａｎａ， Ｋ． ＆ Ｙｏｋｏｔａ， Ａ．（１９９５） Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔｓ： Ｐｒｏｐｏｓａｌ ｏｆ Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐｒｕｎｉ ｓｐ． ｎｏｖ．， Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ ｓｐ． ｎｏｖ．， ａｎｄ Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｍａｌｉ ｓｐ． ｎｏｖ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ４５， ３３４−３４１）。
表２は、ＡＲＩ−１Ｔ株及び他のＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ種に属する菌株のＤＮＡのＧ＋Ｃ含量及びＤＮＡ−ＤＮＡ相同性の値を示す。
【００５４】
【表２】
図６に、ＡＲＩ−１Ｔ株及び関連細菌の１６Ｓ−ｒＤＮＡ配列に基づく近隣結合法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ−Ｊｏｉｎｉｎｇ法）により構築した系統樹を示す。スケールを示す棒は、進化距離（Ｋｎｕｃ）０．０１を示す。
１６Ｓ−ｒＤＮＡ配列の分析の結果（図６）から、ＡＲＩ−１Ｔ株は、
Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ ＡＴＣＣ ７００２７８Ｔ、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｍ ＡＴＣＣ ７００２７９Ｔ、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｕｂａｒｃｔｉｃｕｍ ＪＣＭ １０３９８Ｔ、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ ＡＴＣＣ １４６６６Ｔ Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｔｙｇｉｕｍ ＡＴＣＣ ７００２８０Ｔと類似性を示した。しかし、これらの菌種との１６Ｓ−ｒＤＮＡの配列類似性は最大でも９７％であったことから、ＡＲＩ−１Ｔとは別種であるとみなすべきである。従って、ＡＲＩ−１Ｔ及び他のＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ種との間の関係の確証的な情報を得るため、基質として１，２−フェニレンジアミン、比色酵素としてストレプタビジン−パーオキシダーゼコンジュゲートによるフォトビオチンラベル及び比色検出を用いたマイクロプレートハイブリダイゼーション法によってＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション実験を行った。表２は、これらの種の間におけるＤＮＡ−ＤＮＡ再会合値を示すが、比較的低レベルのハイブリダイゼーションが示される（最大３６％）。系統発生的に定義される菌種は、７０％以上のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション値を示す株からなることが決定されている（Ｗａｙｎｅ ＬＧ，他（１９８７） Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ３７， ４６３−４６４）。従って、ＡＲＩ−１Ｔ株は既知のＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ種とは別種である。
【００５６】
実施例８
脂肪酸組成及び極性脂質
全細胞の脂質を、Ｂｌｉｇｈ， Ｅ． Ｊ． ＆ Ｄｙｅｒ， Ｗ． Ｊ． （１９５９） Ａ ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｌｉｐｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｃａｎ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３７， ９１１−９１７に記載の方法に従い抽出した。抽出した脂質を脂肪酸メチルエステルに転換し、脂肪酸メチルエステルはテフロンキャップ付きの試験管内で１００℃で２４時間、メタノール中の２Ｎ塩酸で抽出した脂質と反応することにより調製した。
【００５７】
得られた脂肪酸メチルエステルをヘキサンで３回抽出し、ヘキサン層を真空遠心分離により完全に蒸発させ、次いで脂肪酸メチルエステルを適当量のヘキサンに再溶解させた。ＢＰＸ７０キャピラリーカラムを備えるＧＣ１７００ガスクロマトグラフ（島津製作所製）により、脂肪酸メチルエステルの分析を行った。キャリアガスとしてはヘリウムを用いた（カラムヘッドの圧力は１３０ｋＰａである）。インジェクター及び検出器を２６０℃に維持し、カラムオーブンを４℃／分の速度で１５５〜２３５℃に上昇するようにプログラムし、２３５℃に１０分間維持した。ピーク面積は、Ｃ−Ｒ８Ａクロマトグラフィーレコーダー（島津製作所）によって定量した。化合物は、既知の標準物質との保持時間の比較により同定し、ＢＰＸ７０キャピラリーカラム（２５ｍ×０．２２ｍｍ）を備えるＶａｒｉａｎ ３８００ ガスクロマトグラフに連結されたＳａｔｕｒｎ ２０００イオントラップ質量分析計（Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｃ．）を用いたガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）により確認した。オーブンは、４℃／分の速度で８０〜２４０℃まで上昇するようにプログラムされた。キャリアーガスとしてヘリウムを用いた（１ｍｌ／分）。ＧＣ／ＭＳは、４０〜４００原子質量単位を有する、７０ｅＶの電離電圧及び２３０℃のトラップ温度で操作される。
【００５８】
ＡＲＩ−１Ｔ株の全細胞脂肪酸プロフィールを表３に示す。検出された主要な非極性脂肪酸は１８：１であり、１４：０ ２−ＯＨが優勢なヒドロキシル化脂肪酸として存在している。しかし、３−ヒドロキシル化脂肪酸は検出されなかった。これらの結果は、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属の説明（Ｙａｂｕｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９０； Ｔａｋｅｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３， １９９４， ２００１； Ｋａｍｐｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７）と一致する。
【００５９】
【表３】
また、極性脂質のプロフィールを、二次元ＴＬＣにより試験した。精製していない脂質を２種類の溶媒システムによるシリカゲル６０ＴＬＣプレート（２０×２０ｃｍ）上で分離した。溶媒システムは、１つはクロロホルム−メタノール−水（６５：２５：４、ｖ／ｖ）であり、もう一方はクロロホルム−メタノール−酢酸−水（８０：１２：１５：４、ｖ／ｖ）である。全ての種類の脂質のスポットを検出するために、５０％溶液を用いた。糖、α−グリコール、リン酸塩及びフリーのアミノ基を検出するために、α−ナフトール／硫酸、過要素酸試薬、ｚｉｎｚａｄｚｅ（Ｄｉｔｔｍｅｒ試薬）、及びニンヒドリン試薬をそれぞれ用いた。試験の結果として、リン脂質、未同定の脂質及び色素に加えてＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属に独特の脂質であるスフィンゴ糖脂質が検出された。
【００６１】
実施例９
イソプレノイドキノン組成
イソプレノイドキノン組成は、Ｙａｍａｄａ， Ｙ． ＆ Ｋｕｒａｉｓｈｉ， Ｉ． （１９８２） Ｇａｋｋａｉ Ｓｈｕｐｐａｎ Ｃｅｎｔｅｒによって記載された方法によって、一次元ＴＬＣ及びＨＰＬＣによって測定した。全細胞の全アセトン溶解抽出物は溶出液としてベンゼンを用いた一次元ＴＬＣによって分離した。イソプレノイドの長さは、逆相カラム（Ｗａｋｏ Ｈａｎｄｙ ＯＤＳ，
２５０ｍｍ×４．６ｍｍ、和光純薬）を用いたＨＰＬＣにより分析した。
主にＱ−１０からなるユビキノンを含む（データは示さず）。優性なイソプレノイドキノンとしてのユビキノンＱ−１０の存在は、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｂｉｕｍ属を含むプロテオバクテリアのアルファブランチのメンバーとして典型的である（Ｙａｂｕｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３４， ９９−１１９； Ｙｒｊａｌａ ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ｉｎｔ ＪＳｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ４８， １０５７−６２； Ｓｔｏｌｚ ｅｔ ａｌ．， （２０００） Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｌｏｂｉｏｌ ５０， ３５−４１； （２００１） Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５１， １４０５−１４１７）。
【００６２】
結論
Ｔａｋｅｕｃｈｉら（Ｔａｋｅｕｃｈｉ， Ｍ．， Ｈａｍａｎａ， Ｋ． ＆ Ｈｉｒａｉｓｈｉ， Ａ． （２００１） Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５１， １４０５−１４１７）は最近Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属をＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ， Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ， Ｓｐｈｉｎｇｏｐｙｘｉｓ及びＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍの４つの新規な種に分離した。Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍは６種のメンバーからなり、この属のいくつかの菌種は芳香族化合物を分解することが知られている。例えば、Ｎ．ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ， Ｎ．ｓｔｙｇｉｕｍ及びＮ．ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｍはベンゾエート、クレオール、ナフタレン又はキシレンを分解することが報告されている（Ｂａｌｋｗｉｌｌ， Ｄ． Ｌ． ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ４７， １９１−２０１）。また、Ｎ．ｓｕｂａｒｃｔｉｕｍはクロロフェノールを分解することができる（Ｎｏｈｙｎｅｋ， Ｌ． Ｊ． ｅｔ ａｌ， （１９９６） Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ４６， １０４２−１０５５）。
【００６３】
１６Ｓ−ｒＤＮＡ配列（図６）、ゲノムＤＮＡのＧ＋Ｃ含量（表２）、イソプレノイドキノン組成、全細胞脂肪酸プロフィール（表３）、及びスフィンゴ糖脂質の存在から、ＡＲＩ−１Ｔ株はＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属に属することが示唆される。また、ＡＲＩ−１Ｔ株と他の既知のＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属に属する菌株との間の１６Ｓ−ｒＤＮＡの類似性から（図６）、ＡＲＩ−１Ｔ株は新種であることが示唆される。また、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション実験（表２）により、ＡＲＩ−１Ｔ株がＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属の新種であることが示唆される。
【００６４】
本発明で得られた菌株の表現型、遺伝型及び系統発生のデータから、ＡＲＩ−１Ｔ株はＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属の新種の分類されると結論付けられる。従って、この新規菌株をＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｔａｒｄａｕｇｅｎｓと命名する。
【００６５】
【発明の効果】
以上詳述した通り、本発明によれば、新規なＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍの属する菌株が提供される。本発明によって提供される菌株は、エストラジオール、エストロン及びエストリオール等のステロイド骨格含有化合物を分解することができる。本発明の菌株を用いて排水処理を行なうことにより環境中のステロイド骨格含有化合物を分解することができ、これによりステロイド骨格含有化合物が環境に蓄積することによって生じる環境汚染を防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＲＩ−１Ｔ株による各種のステロイド骨格含有化合物の分解の時間経過を示すグラフである。
【図２】ＡＲＩ−１Ｔ株による、エストラジオール分解活性の分解の時間経過を示すグラフである。
【図３】培養物のクロロホルム抽出物の全イオンガスクロマトグラムである。
【図４】培養物のクロロホルム抽出物のＮＭＲスペクトルである。
【図５】ＡＲＩ−１Ｔ株の電子顕微鏡写真である。
【図６】ＡＲＩ−１Ｔ株及び関連細菌の１６Ｓ−ｒＤＮＡ配列に基づく近隣結合法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ−Ｊｏｉｎｉｎｇ法）により構築した系統樹である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel strain belonging to the genus Novosphingobium, which can degrade a compound having a steroid skeleton, and a method for using the same.
[0002]
[Prior art]
In recent years, endocrine disrupting chemicals, so-called environmental hormones, which have become a social problem, are considered to adversely affect living bodies by disrupting the action of natural hormones in the body. Many of these disturbing substances are hardly biodegradable and are extremely close to civilian life, which has become a very serious social problem.
[0003]
Some environmental hormones are known to have an adverse effect on aquatic ecosystems. For example, female feminization of carp in the Tama River may be caused mainly by nonylphenol (NP) and estradiol contained in river water. (Asahi Shimbun, July 6, 2001).
[0004]
Among the natural estrogens that have an endocrine disrupting effect on aquatic organisms, estradiol has the strongest effect. Estradiol is excreted as a conjugate (inactive form) from human and livestock excreta, but it is discharged in sewage. Is known to be deconjugated by the microorganism of the present invention to return to the active form.
In addition, 17β-estradiol (hereinafter referred to as “E2” in the present specification means 17β-estradiol) and the like excreted by humans and the like also have estrogen (female hormone) activity. Fish, amphibians, etc.).
[0005]
17α-ethynylestradiol, a kind of estradiol compound, is a kind of synthetic estrogen and has been used as a contraceptive (pill). With the recent official approval of low-volume pills, it is likely that the use of pills will increase dramatically in the future, and at the same time the amount of estradiol contained in the pills will increase.
[0006]
Such estrogens have recently been frequently detected in rivers nationwide due to population growth in urban areas and the expansion of the livestock industry. Are treated as "substances requiring monitoring" to be investigated in detail.
[0007]
As described above, estrogens such as E2 are hardly biodegradable, and biological effects that cause abnormalities in reproductive organs have been reported. Therefore, novel estrogens (steroid skeletons) that can be applied to bioremediation have been reported. It has been desired to isolate and identify a degrading bacterium.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, an object of the present invention is to isolate and identify a novel microorganism that can degrade a compound having a steroid skeleton.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found that remarkable steroid skeleton-containing compound decomposing activity is observed in activated sludge of a sewage treatment plant in Tokyo. Here, the present inventors have proposed a novel steroid skeleton-containing compound-degrading bacterium (ARI-1).T). Further, as a result of analyzing the characteristics of the isolated steroid skeleton-containing compound-degrading bacterium, it was found that the bacterium was a new kind of bacterium. The present invention has been made based on the above findings.
[0010]
That is, the present invention provides a strain belonging to the genus Novosphingobium which can degrade a steroid skeleton-containing compound. In addition, examples of the steroid skeleton-containing compound include estradiol, estrone, and estriol.
Preferred specific examples of the strain of the present invention are those that degrade a steroid skeleton-containing compound into carbon dioxide, from glucose, arabinose, mannose, mannitol, N-acetyl-glucosamine, maltose, gluconic acid, adipic acid and malic acid. A strain that does not assimilate a compound from the group That is, a preferred strain of the present invention is a strain that specifically assimilates only a steroid skeleton-containing compound without utilizing many carbon sources other than a steroid skeleton-containing compound (eg, estradiol, estrone, estriol, etc.). It is.
[0011]
Preferred specific examples of the strain of the present invention are strains having positive enzyme activities of catalase and nitrite reductase and negative enzyme activities of β-glucosidase, gelatinase and β-galactosidase.
Preferred specific examples of the strain of the present invention are gram-negative, aerobic, rod-shaped bacteria, and the colonies are circular, convex, opaque and light brown, and can grow at 25 ° C, but at 4 ° C or 42 ° C. It is a strain that cannot grow.
[0012]
A preferred specific example of the strain of the present invention is a strain having a G + C content of DNA of about 61%. In a preferred embodiment of the strain of the present invention, the main non-polar fatty acid is 18: 1, the main 2-hydroxy fatty acid is 14: 0 2-OH, the 3-hydroxy fatty acid is absent, Isoprenoid quinone is a strain that is ubiquinone Q-10. A preferred specific example of the strain of the present invention is a strain isolated by screening using a medium containing estradiol as a sole carbon source. A preferred specific example of the strain of the present invention is a strain having accession number FERM @ P-18924.
[0013]
The present invention also provides a method for degrading a steroid skeleton-containing compound, which comprises using the above-described strain belonging to the genus Novosphingobium of the present invention.
The present invention also provides a wastewater treatment method characterized by using the above-mentioned strain belonging to the genus Novosphingobium of the present invention.
The present invention also provides a bioreactor for decomposing a steroid skeleton-containing compound, characterized by using the above-mentioned strain belonging to the genus Novosphingobium of the present invention. The bioreactor is suitably used for wastewater treatment.
[0014]
The present invention also provides a biosensor for detecting a steroid skeleton-containing compound, characterized by using the above-described strain belonging to the genus Novosphingobium of the present invention.
Further, the present invention provides a method for screening a strain belonging to the genus Novosphingobium, which is capable of degrading a steroid skeleton-containing compound, characterized in that screening is performed using a medium containing estradiol as a sole carbon source. It is.
[0015]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
First, a strain belonging to the genus Novosphingobium of the present invention will be described. The strain belonging to the genus Novosphingobium of the present invention is a strain that can degrade a steroid skeleton-containing compound, and is hereinafter also referred to as a “steroid skeleton-containing compound-degrading bacterium” in the present specification. In the present invention, the steroid skeleton-containing compound is a concept including all organic compounds having a steroid skeleton, and means, for example, compounds such as estradiol, estrone, and estriol. The chemical structures of estradiol, estrone, and estriol are shown below.
[0016]
Embedded image
The strain of the present invention is a strain belonging to the genus Novosphingobium, and is an example of a strain (ARI-1) isolated by the present inventors.T) Has been deposited under accession number FERM @ P-18924. The above strain was isolated from activated sludge of a sewage treatment plant in Tokyo. ARI-1TFor the isolation of the strain, YNB agar (pH 7.0; 25 ° C.) (E2-YNB medium) containing 0.1% by mass of 17β-estradiol (hereinafter also referred to as “E2” in the present specification) was used. .
As described in detail in Examples described later, the microbiological properties of the obtained microorganism were examined, and it was confirmed that the microorganism was a novel microorganism. The bacteriological properties of the obtained strain are shown below.
[0018]
[1] Morphological properties
(1) Cell shape: rod shape
(2) Size: length 1.2 μm; diameter 0.8 μm
(3) Gram staining: negative
[0019]
[2] Growth state
Colonies are round, convex, opaque and light brown.
[3] Physiological properties
(1) Growth temperature: Can grow at 25 ° C, but cannot grow at 4 ° C or 42 ° C.
(2) Oxygen demand: aerobic
(3) Assimilation: assimilates estradiol, estrone and estriol, but does not assimilate glucose, arabinose, mannose, mannitol, N-acetyl-glucosamine, maltose, gluconic acid, adipic acid and malic acid.
[0020]
(4) Catalase and nitrite reductase have positive enzyme activities.
(5) The enzyme activities of β-glucosidase, gelatinase and β-galactosidase are negative.
(6) The G + C content of the DNA is about 61%.
(7) The major non-polar fatty acid is 18: 1, the major 2-hydroxy fatty acid is 14: 0 @ 2-OH, and no 3-hydroxy fatty acid is present. The major isoprenoid quinone is ubiquinone Q-10.
[0021]
A strain belonging to the genus Novosphingobium capable of degrading the steroid skeleton-containing compound of the present invention is, for example, YNB agar (pH 7.0; 25 ° C.) containing 0.1% by mass of E2 from activated sludge of a sewage treatment plant or the like. (E2-YNB medium). The YNB medium containing E2 is a medium containing E2 as the sole carbon source. The isolated strain can be used to detect the E2 degrading activity by analyzing the culture over time using conventional means such as HPLC for detecting E2.
[0022]
As a medium for culturing a strain capable of degrading the steroid skeleton-containing compound of the present invention, usually, a natural medium or a synthetic medium may be used as long as these strains can grow. Or any of them can be used. The medium may be a solid medium or a liquid medium. The medium used includes a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, and the like. As the carbon source, estradiol is preferably used, and other various hydrocarbons may be contained. Examples of the nitrogen source include organic extracts such as yeast extract, meat extract, peptone and various amino acids, and inorganic nitrogen such as ammonium nitrate and ammonium sulfate. Each of the carbon source and the nitrogen source may be used alone, or two or more of them may be used in combination. As other inorganic substances, for example, potassium salts, magnesium salts, iron salts, calcium salts and the like are appropriately used as needed. The method for culturing the steroid skeleton-containing compound-decomposing bacterium of the present invention may be an ordinary method, and for example, the culturing temperature is preferably from 15 to 35 ° C, more preferably from 20 to 30 ° C. The pH of the medium is preferably 6 to 8, and more preferably around 7. Further, the culture is preferably performed under aerobic conditions by shaking culture or by aeration and stirring.
[0023]
Next, the method for decomposing a steroid skeleton-containing compound of the present invention will be described.
The method for decomposing a steroid skeleton-containing compound of the present invention is characterized by using the steroid skeleton-containing compound-decomposing bacterium of the present invention. Specifically, the steroid skeleton-containing compound-decomposing bacterium of the present invention is brought into contact with a treatment target containing a steroid skeleton-containing compound such as estradiol, estrone, or estriol (for example, sewage, livestock wastewater, well water, tap water, or the like), The steroid skeleton-containing compound in the object to be treated is decomposed and detoxified by the action of the decomposing bacteria.
[0024]
Next, the wastewater treatment method of the present invention will be described.
The wastewater treatment of the present invention is characterized by using the steroid skeleton-containing compound-decomposing bacterium of the present invention. Specifically, the steroid skeleton-containing compound-degrading bacterium of the present invention is brought into contact with wastewater containing a steroid skeleton-containing compound such as estradiol, estrone or estriol (eg, sewage, livestock wastewater, well water, tap water, etc.), and The steroid skeleton-containing compound in the object to be treated is decomposed and detoxified by the action of the decomposing bacteria.
[0025]
Next, the bioreactor of the present invention will be described.
The bioreactor of the present invention is characterized by using the steroid skeleton-containing compound-decomposing bacterium of the present invention. Specifically, the bioreactor of the present invention immobilizes the steroid skeleton-containing compound-decomposing bacterium of the present invention on a carrier, obtains a steroid skeleton-containing compound-decomposing bacterium-immobilized carrier, and allows the liquid to be treated such as environmental water to pass therethrough. It can be produced by installing the steroid skeleton-containing compound-decomposing bacteria-immobilized carrier in a tank. It is necessary to fix the steroid skeleton-containing compound-decomposing bacterium of the present invention so that the bacterium does not lose its original activity and does not move. Further, a control device, a pump, various sensors, and the like may be provided. As the carrier to be used, any carrier can be used as long as the steroid skeleton-containing compound-decomposing bacteria of the present invention can be immobilized thereon. Examples of the carrier used include gel-like substances such as alginic acid, polyvinyl alcohol, gellan gum, agarose, cellulose, and dextran, and carriers such as glass, activated carbon, polystyrene, polyethylene, polypropylene, wood, and silica gel. As a method for immobilizing a steroid skeleton-containing compound-decomposing bacterium, a method for entrapping and immobilizing in a gel substance such as alginic acid, polyvinyl alcohol, gellan gum, agarose, cellulose, dextran, glass, activated carbon, polystyrene, polyethylene, polypropylene, wood, silica gel And the like.
[0026]
The method for immobilizing the steroid skeleton-containing compound-decomposing bacterium of the present invention on a carrier is briefly described, for example, a fixing method in which a culture solution of a strain is poured into the carrier, the carrier is reduced under reduced pressure using an aspirator, and the strain is removed. Immobilization method by pouring a culture solution of the strain, a method of pouring the culture solution of the strain into a mixture of a sterilized medium and a carrier, performing shaking culture, and naturally drying the carrier removed from the mixture. Can be
[0027]
The bioreactor of the present invention is used, for example, for treating wastewater. Such a drainage treatment can be performed by, for example, a batch system, a semi-batch system, a continuous system, or the like. In the wastewater treatment, the temperature of the wastewater to be treated is preferably adjusted to a temperature of 15 to 35 ° C, more preferably to a temperature of 20 to 30 ° C.
[0028]
Next, the biosensor of the present invention will be described.
The biosensor of the present invention is characterized by using the steroid skeleton-containing compound-decomposing bacterium of the present invention. Specifically, the biosensor of the present invention is manufactured by combining a carrier having the steroid skeleton-containing compound-decomposing bacteria of the present invention immobilized thereon, for example, with an oxygen electrode.
[0029]
As a carrier for immobilizing the steroid skeleton-containing compound, a membrane such as a nitrocellulose membrane is used. In addition, a gel such as a calcium alginate gel can be used. In this case, there is an advantage that the durability is excellent and that the microorganism-carrying gel can be unitized by focusing on the glass tube.
The method for immobilizing the steroid skeleton-containing compound-decomposing bacterium of the present invention on a carrier may be the same method as described in the description of the bioreactor.
[0030]
The biosensor of the present invention is used for measuring the content of a steroid skeleton-containing compound such as estradiol, estrone, and estriol in wastewater (for example, sewage, livestock wastewater, well water, tap water, and the like). Specifically, the biosensor of the present invention, a thermostat that can keep the biosensor at a constant temperature, a voltammeter that measures a change in the current of the oxygen electrode in the biosensor, and a measured current And a recorder for recording changes in the steroid skeleton-containing compound in the wastewater by measuring the concentration of oxygen consumed when the steroid skeleton-containing compound-degrading bacteria decompose the steroid skeleton-containing compound. The quantity can be measured.
[0031]
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It goes without saying that the scope of the present invention is not limited to such examples.
Example 1
Isolation of steroid skeleton-containing compound-degrading bacteria
Steroid skeleton-containing compound-decomposing bacteria were isolated from activated sludge of a sewage treatment plant (STP) in Tokyo. For isolation of a steroid skeleton-containing compound-degrading bacterium from activated sludge, a YNB medium containing 0.1% by mass of E2 (hereinafter referred to as an E2-YNB medium) was used. E2 used was purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. YNB medium contains (NH) as a nitrogen source, as described in Difco @ Manual.4)2SO4, Other salts (KH2PO4, MgSO4, NaCl and CaCl2), Contains trace metals and small amounts of vitamins. Therefore, there is no carbon source other than E2 in the E2-YNB medium, and E2 is considered to be the only carbon source in the E2-YNB medium.
[0032]
The activated sludge was inoculated into the E2-YNB medium. When the sample was a liquid, 100 μl of the sample was directly inoculated on an E2-YNB agar medium (sample amount: 30 mg / ml). If the sample was a precipitate, 10 g of the sample was suspended in 10 ml of YNB medium before inoculation, and this suspension was inoculated into E2-YNB medium as described above.
[0033]
Next, the medium inoculated with the sample was cultured at 25 ° C. for 14 days while rotating at 150 rpm. After completion of the culture, the culture was mixed with 120 ml of methanol and filtered using a 0.2 μm pore size filter (Millix LG13, manufactured by Millipore). The filtrate was analyzed by an HPLC system having a Mightysil @ RP-18GP octadecylsilyl column (inner diameter: 4.6 mm, length: 150 mm), and the decomposition activity of E2 was analyzed by measuring UV absorption at 210 nm. That is, E2 degradation activity was confirmed by a decrease in UV absorption at 210 nm. In addition, 80% methanol water was used as a mobile phase.
[0034]
Analysis showed that one sample had E2 degrading activity. This sample degraded 60% of E2 in 14 days. In order to isolate E2-degrading bacteria, the microorganisms grown on this agar medium were subcultured three times. The subculture was performed by streaking on a nutrient agar medium. The cultivation was performed at a temperature of 25 ° C., and small white-brown colonies were picked, and this was used for ARI-1.TIt was named. This ARI-1THas been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) under the accession number FERM @ P-18924.
[0035]
Example 2
ARI-1 T Activity of various steroid skeleton-containing compounds by strains
ARI-1TRegarding the activity of degrading steroid skeleton-containing compounds, a single colony was inoculated on a YNB agar medium containing estradiol, estrone and estriol, and it was examined whether or not estradiol, estrone and estriol were degraded. The concentrations of estradiol, estrone and estriol in the medium were 10 mg / 30 ml. Estradiol, estrone, and estriol were all purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Culture was performed at a temperature of 25 ° C. On the first day of culture, and after 10 and 20 days of culture, the culture was mixed with 120 ml of methanol and filtered using a 0.2 μm pore size filter (Millix LG13, manufactured by Millipore). The filtrate is analyzed by an HPLC system having a Mightysil @ RP-18GP octadecylsilyl column (inner diameter: 4.6 mm, length: 150 mm), and the UV absorption at 210 nm is measured to decompose estradiol, estrone, and estriol. Was analyzed. That is, the degradation activity of estradiol, estrone, and estriol was confirmed by a decrease in UV absorption at 210 nm. In addition, 80% methanol water was used as a mobile phase.
[0036]
The results are shown in FIG. FIG. 1 shows ARI-1TIt is a graph which shows the time course of decomposition | disassembly of various steroid skeleton containing compounds by a strain. In the graph of FIG. 1, white circles indicate estrone, triangles indicate estradiol, and squares indicate the time course of decomposition of estriol. As shown in FIG. 1, about 10% of estrone was degraded after culturing for 10 days, and about 50% was degraded after culturing for 20 days. Estradiol was degraded by about 75% after 10 days of culture and about 85% after 20 days of culture. Estriol was degraded by about 90% after 10 days of culture and about 95% after 10 days of degradation.
[0037]
Example 3
Estradiol degradation activity by estradiol concentration
Culture was carried out in the same manner as in Example 2 except that the initial concentration of estradiol in the medium was 30, 10, and 5 mg / 30 ml. For those having an initial concentration of 30 mg / 30 ml, the culture was carried out every 10 days from
[0038]
FIG. 2 shows the results. FIG. 2 shows ARI-1TIt is a graph which shows the time course of decomposition | disassembly of estradiol decomposition activity by a strain. In FIG. 2, white circles show the results when the initial concentration is 30 mg / 30 ml, double circles show the results when the initial concentration is 10 mg / 30 ml, and black circles show the results when the initial concentration is 5 mg / 30 ml. As is clear from FIG. 2, when the initial concentration is 5 mg / 30 ml, almost all is decomposed in 20 days, when the initial concentration is 10 mg / 30 ml, about 90% is decomposed in 25 days, and when the initial concentration is 30 mg / 30 ml, 50%. About 90% was degraded in a day.
[0039]
Example 4
Analysis of metabolites
ARI-1TWere investigated as follows. That is, ARI-1TWas performed using a YNB agar medium containing 10 mg / 30 ml of E2, and metabolites after 0, 5, 10, 15, 20, and 25 days of culture were analyzed. The analysis was performed as follows.
[0040]
Cultures were extracted using hexane or chloroform. Hexane or chloroform was used because they have different octanol-water partition coefficients and they are used as indicators of hydrophobicity. The extract was analyzed by Varian 3800 gas chromatograph-mass spectrum (GCMS). The analysis conditions are as follows.
Column: BPX-5 capillary column (inner diameter: 25m x 0.22mm, purchased from SGE)
Injection volume: 3 μl
Carrier gas: helium (1.0 ml / min)
Temperature gradient: 50 ° C. for 3.4 minutes, 50-370 ° C. at 10 ° C./min, 370 ° C. for 10 minutes.
The ionization energy of electron impact ionization was 70 eV.
[0041]
FIG. 3 shows the total ion gas chromatograms of the chloroform extracts of the 0-day and 30-day cultures. FIG. 3 is a total ion chromatogram of a chloroform extract of the culture. In FIG. 3, (A) is a total ion chromatogram of a chloroform extract of a 0-day culture, and (B) is a 30-day culture. As shown in FIG. 3, only the peak of E2 was detected in any of the cultures on
[0042]
next,1The metabolic fate of E2 was examined using H-NMR. The samples (0 day culture and 30 day culture) used for GCMS were concentrated to dryness at a temperature of 25 ° C., and deuterated methanol (CD3OD) was measured as a sample. The measurement was carried out using a JEOL {JNM-EX400} NMR spectrometer at 400 MHZ using a sample solution placed in a test tube having a diameter of 5 mm. FIG. 4 shows the measurement results. FIG. 4 shows the NMR spectra of the chloroform extract of the culture, (a) shows the NMR spectrum of the 0-day culture, (b) shows the NMR spectrum of the 30-day culture, and (c) shows the chemical structure of E2. As shown in the figure, in the 30-day culture, the proton signals of the aromatic and non-aromatic portions of E2 almost completely disappeared. This indicates that metabolites of E2 have been decomposed into low molecular weight compounds such as carbon dioxide and organic acids.
[0043]
Example 5
Morphological characteristics
ARI-1TWas observed with a transmission electron microscope. In the preparation of electron micrographs, cells cultured for 3 days were collected by centrifugation, washed with physiological saline, placed on a formvar-coated grid, and fixed with osmium vapor for several minutes. Next, the grid was washed with distilled water, stained negatively with a uranyl acetate solution, and observed with a Hitachi @ H-300 transmission electron microscope. Gram staining is described in Yokota (1999), chapter "Gram staining" in "Microbiological Experiments", {199. {Editedby} Sugiyama @ J. , {Watanabe} S. , {Oowada} K. , {Kuroiwa} T. , {Takahashi} H. & Tokuda G. , {Tokyo: {Kodansha} Scientific}.
[0044]
ARI-1TThe strain was gram negative and rod-shaped (length 1.2 μm; diameter 0.8 μm). FIG. 5 shows ARI-1T2 shows an electron micrograph of the strain. This strain formed light brown colonies on Nutrient Agar, Brain Heart Infusion Agar or Tryptic Soy Agar at 25 ° C for 6-7 days. Colonies were round, convex and opaque. No colony growth was observed at 4 ° C and 42 ° C.
[0045]
Example 6
Physiological and biochemical characteristics
In this embodiment, ARI-1TThe bacterial strains used with are described below. These were obtained from the Japan Collection of Microorganisms (JCM) and American Type Culture Collection (ATCC).
Oxygen demand for growth was determined using normal agar and BBL Gaspak Anaerobic System (Becton Dickinson, Cockeysville, MD). The tests for oxidase and catalase were carried out using poremedia oxidase test indicator (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) and 3.0% hydrogen peroxide. The biochemical characteristics of the test microorganisms were determined using the API20NE system (BioMerieux).
[0046]
Bacterial strain used
Novosphingobium subarcticum JCM 10398T
Novosphingobium \ stygium \ ATCC \ 700280T
Novosphingobium capsulatum ATCC 14666T
Novosphingobium rosaATCC $ 51837T
Novosphingobium aromaticivorans ATCC $ 700278T
[0047]
ARI-1TThe strain was an aerobic strain.
ARI-1TThe characteristics of the strain and other strains used are shown in Table 1. ARI-1TThe strain did not assimilate any of the glucose, arabinose, mannose, mannitol, N-acetyl-glucosamine, maltose, gluconic acid, adipic acid and malic acid tested in this experiment. Since the other strains belonging to Novosphingobium used in these experiments assimilated many different types of compounds under the same experimental conditions, the experimental system is considered to be functioning normally.
In addition, all the strains used in this example were negative for oxidase test, indole production, acid production from glucose, arginine dihydrolase activity, urease activity, and assimilation of n-capric acid, citric acid and phenyl acetate. .
[0048]
[Table 1]
Example 7
Analysis of 16S-rDNA and DNA base composition
Preparation of DNA
The strain was collected from the culture grown at a temperature of 25 ° C. for 48 hours and subjected to standard means (Sambrook J, et al. (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2).ndEdn. Chromosomal DNA was purified by Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory. That is, bacterial cells are suspended in a Tris-EDTA buffer (pH 8.0), dissolved in lysozyme (final concentration: 2 mg / ml) and sodium dodecyl sulfate (final concentration: 0.5%), and the bacterial cells are lysed. Was. DNA was recovered from the lysate by phenol-chloroform extraction and subjected to RNase treatment, CTAB treatment and ethanol precipitation to obtain purified DNA. Note that the RNase treatment and the CTAB treatment were performed twice.
[0050]
DNA base composition, i.e., guanine + cytosine (G + C) content, was determined by Kumagai, {M. (1980) @J. It was measured by high performance liquid chromatography according to the method described in {Mol} Biol 16, 111-120.
[0051]
Nearly complete 16S-rDNA was amplified by PCR using the universal primer set corresponding to the E. coli 16S-rDNA numbering system 8-27 and 1492-1510 and Taq DNA polymerase. The temperature profile includes 25 cycles, 60 seconds at 94 ° C, 60 seconds at 58 ° C, and 90 seconds at 72 ° C, with a final polymerization of 7 minutes at 72 ° C. Direct sequencing of the amplified DNA fragment
Satomi, @M. {Et} al. , {(1997)} Int \ J \ System \ Bacteriol 47, 832- 836.
[0052]
ARI-1TUsing the BLAST algorithm (Altschul, S. F. et al., (1990) J Mol Biol 215, 403-410).Genbank, EMBL, and all known sequence data in the DDBJ database. Composite sequence, Kimura, {M. (1980) Calculation of nucleotide substitution rate (Knuc value) described in J Mol Biol 16, 111-120 and Neighbor-Joining method (Saitou, N & M Nei, M M (1987)
[0053]
ARI-1TWas determined to be 61% (Table 2). This value is in the range measured for other strains of the genus Novosphingobium (ie, 60-66%) (Balkwill, D. L., Drake, G. R., Reeves, R. H., Fredrickson, J. K., White, D. C., ｉｎｇRingelberg, D. B, Chandler, D. P., Romine, M. F., Kennedy, D. W. & Spadoni, C. M. (1997) Ticosonic −degrading bacteria from dep-terrestrial-subsurface sediments and description of Sp ingomonas @ aromaticivorans @ sp. @ nov., @ Sphingomonas @ subteranea @ sp @ nov., @ and @ Sphingomonas @ stygia @ sp. @ nov, Yin @ J.Yt. @ Y @, @ J. Ezaki, T. & Yamamoto, H. (1990) Proposals of Sphingomonas paucimobilis gen. Nov. And com. nas yanoikuyae sp. nov., Sphingomonas adhaesiva sp. nov., Sphingomonas capsulata comb. nov., and two genospecies of the genus Sphingomonas. Microbiol Immunol 34, 99-119 and Takeuchi, M., Sawada, H., Yanagi, M Yamato, K., Hamana, K. & Yokota, A. (1995) Taxonomic study of bacteria isolated from plant: Plants: Proposal of sponhomonas. sp. {Nov. , {Sphingomonas} asaccharolytica} sp. {Nov. , And Sphingomonas mali sp. {Nov. , Int J System Bacteriol 45, 334-341).
Table 2 shows ARI-1TThe G + C content and DNA-DNA homology values of the DNA of the strain and other Novosphingobium species are shown.
[0054]
[Table 2]
FIG. 6 shows ARI-1T1 shows a phylogenetic tree constructed by the neighbor-joining method based on the 16S-rDNA sequence of strains and related bacteria. The bar indicating the scale is the evolution distance (Knuc) Indicates 0.01.
From the result of the analysis of the 16S-rDNA sequence (FIG. 6), ARI-1TThe stock is
Novosphingobium aromaticivorans ATCC $ 700278T, Novosphingobium \ subterraneum
[0056]
Example 8
Fatty acid composition and polar lipids
Whole cell lipids were collected using the method of Bright, ΔE. {J. & Dyer, W. {J. (1959) A rapid method of total lipid extraction and purification. Extracted according to the method described in {Can \ J \ Biochem \ Physiol 37, 911-917. The extracted lipids were converted to fatty acid methyl esters, which were prepared by reacting with lipids extracted with 2N hydrochloric acid in methanol at 100 ° C. for 24 hours in Teflon-capped test tubes.
[0057]
The resulting fatty acid methyl ester was extracted three times with hexane, the hexane layer was completely evaporated by vacuum centrifugation, and the fatty acid methyl ester was redissolved in an appropriate amount of hexane. Fatty acid methyl esters were analyzed by GC1700 gas chromatograph (manufactured by Shimadzu Corporation) equipped with a BPX70 capillary column. Helium was used as the carrier gas (the pressure of the column head was 130 kPa). The injector and detector were maintained at 260 ° C and the column oven was programmed to ramp to 155-235 ° C at a rate of 4 ° C / min and maintained at 235 ° C for 10 minutes. The peak area was quantified using a C-R8A chromatography recorder (Shimadzu Corporation). Compounds were identified by retention time comparison with known standards and used on a Saturn @ 2000 ion trap mass spectrometer (Varian Inc) connected to a Varian {3800} gas chromatograph equipped with a BPX70 capillary column (25m x 0.22mm). It was confirmed by gas chromatography / mass spectrometry (GC / MS). The oven was programmed to ramp at a rate of 4 ° C / min to 80-240 ° C. Helium was used as a carrier gas (1 ml / min). The GC / MS is operated with an ionization voltage of 70 eV and a trap temperature of 230 ° C., having 40-400 atomic mass units.
[0058]
ARI-1TTable 3 shows the whole cell fatty acid profile of the strain. The major non-polar fatty acid detected was 18: 1, with 14: 0 @ 2-OH present as the predominant hydroxylated fatty acid. However, no 3-hydroxylated fatty acids were detected. These results are consistent with the description of the genus Novosphingobium (Yabuchi et al., 1990; @Takeuchi et al., 1993, 1994, 2001; Kampffer et al., 1997).
[0059]
[Table 3]
The polar lipid profile was also examined by two-dimensional TLC. Unpurified lipids were separated on silica gel 60 TLC plates (20 × 20 cm) with two solvent systems. The solvent system was one with chloroform-methanol-water (65: 25: 4, v / v) and the other with chloroform-methanol-acetic acid-water (80: 12: 15: 4, v / v). is there. A 50% solution was used to detect all kinds of lipid spots. To detect sugars, α-glycols, phosphates and free amino groups, α-naphthol / sulfuric acid, peracid reagent, zinzadze (Dittmer reagent), and ninhydrin reagent were used, respectively. As a result of the test, glycosphingolipid, a lipid unique to the genus Novosphingobium, was detected in addition to phospholipids, unidentified lipids and pigments.
[0061]
Example 9
Isoprenoid quinone composition
The isoprenoid quinone composition is described in Yamada, {Y. & Kuraishi, I. The measurements were made by one-dimensional TLC and HPLC according to the method described by {(1982)} Gakkai {Suppan} Center. Total acetone-soluble extracts of all cells were separated by one-dimensional TLC using benzene as eluent. The length of the isoprenoid was determined using a reverse phase column (Wako Handy ODS,
(250 mm × 4.6 mm, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
Contains ubiquinone consisting mainly of Q-10 (data not shown). The presence of ubiquinone Q-10 as the dominant isoprenoid quinone is typical as a member of the alpha branch of proteobacteria, including the genus Novosphingbium (Yabuchi et al., (1990) Microbiol Immunol 34, 99-119; Yrjala et al. , (1998) Int J Syst Bacteriol 48, 1057-62; Stolz et al., (2000) Int J Syst Evol Microbial 50, 35-41; (2001) Int J Syst Evoli 14-Microb.
[0062]
Conclusion
Takeuchi, et al. (Takeuchi, M., Hamana, K. & Hiraishi, A. A (2001) Int J System Evol Microbiol 51, 1405-1417 of the species Sphingomopsia and Sphingopshombos sp. separated. Novosphingobium is composed of six members, and several species of this genus are known to degrade aromatic compounds. For example, N. aromaticivorans, @N. stygium and N.M. It has been reported that subterraneum degrades benzoate, creol, naphthalene or xylene (Balkwill, D. L. et al., (1997) Int J System Bacteriol 47, 191-201). Also, N.I. It is capable of decomposing chlorophenol (Nohynek, L. J. et al, (1996) Int J Syst Bacteriol 46, 1042-1055).
[0063]
From the 16S-rDNA sequence (FIG. 6), the G + C content of the genomic DNA (Table 2), the isoprenoid quinone composition, the whole cell fatty acid profile (Table 3), and the presence of glycosphingolipids, ARI-1TIt is suggested that the strain belongs to the genus Novosphingobium. Also, ARI-1TDue to the similarity of 16S-rDNA between the strain and other known strains belonging to the genus Novosphingobium (FIG. 6), ARI-1TIt is suggested that the strain is a new species. In addition, ARI-1 was determined by a DNA-DNA hybridization experiment (Table 2).TIt is suggested that the strain is a new species of the genus Novosphingobium.
[0064]
From the phenotype, genotype and phylogenetic data of the strain obtained in the present invention, ARI-1TIt is concluded that the strain is classified as a new species of the genus Novosphingobium. Therefore, this new strain is named Novosphingobium @ tardaugens.
[0065]
【The invention's effect】
As described above in detail, according to the present invention, a novel strain belonging to Novosphingobium is provided. The strain provided by the present invention is capable of degrading steroid skeleton-containing compounds such as estradiol, estrone and estriol. By performing wastewater treatment using the strain of the present invention, the steroid skeleton-containing compound in the environment can be decomposed, thereby preventing environmental pollution caused by accumulation of the steroid skeleton-containing compound in the environment.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1. ARI-1TIt is a graph which shows the time course of decomposition | disassembly of various steroid skeleton containing compounds by a strain.
FIG. 2. ARI-1TIt is a graph which shows the time course of decomposition | disassembly of estradiol decomposition activity by a strain.
FIG. 3 is a total ion gas chromatogram of a chloroform extract of the culture.
FIG. 4 is an NMR spectrum of a chloroform extract of a culture.
FIG. 5: ARI-1TIt is an electron micrograph of a strain.
FIG. 6: ARI-1TIt is a phylogenetic tree constructed by a neighbor-joining method based on the 16S-rDNA sequence of the strain and related bacteria.
Claims (18)
コロニーが円形、凸状、不透明かつ淡褐色であり、２５℃で生育できるが、４℃又は４２℃では生育できない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の菌株。Gram-negative, aerobic, rod-shaped bacteria,
The strain according to any one of claims 1 to 3, wherein the colony is circular, convex, opaque and light brown and can grow at 25C, but cannot grow at 4C or 42C.
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