JP2004049004A

JP2004049004A - 5-oxo-ETE receptor protein and its gene

Info

Publication number: JP2004049004A
Application number: JP2002189777A
Authority: JP
Inventors: Tatsuya Haga; 芳賀　達也; Shigeki Takeda; 武田　茂樹; Atsushi Yamamoto; 山本　篤史
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-05-31
Filing date: 2002-06-28
Publication date: 2004-02-19

Abstract

【課題】生体内情報伝達機構の発見や新規薬物標的蛋白質の同定を可能とすることができる５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質やその遺伝子、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体のアゴニストやアンタゴニストを提供すること。
【解決手段】ヒトゲノム配列からＧ蛋白質共役受容体をコードすると思われる遺伝子を多数検索し、それらのいくつかをクローニングした。クローニングした遺伝子の３’末端部分にＧｉ１のαサブユニットの遺伝子を結合したものを作製し、これらを昆虫細胞に導入し、受容体−Ｇｉ１α融合タンパク質を発現させた。この融合タンパク質の受容体部分にアゴニストが結合するとＧｉ１αの部分に［^３５Ｓ］−ＧＴＰγＳが結合することが、受容体とＧタンパク質の性質から期待できる。そこで作製した融合タンパク質の中に５−ｏｘｏ−ＥＴＥの用量依存的に［^３５Ｓ］−ＧＴＰγＳの結合を増加させるものがあるかどうか検索した。[PROBLEMS] To provide a 5-oxo-ETE receptor protein, a gene thereof, and an agonist or antagonist of a 5-oxo-ETE receptor, which enable discovery of an in vivo signaling mechanism and identification of a novel drug target protein. thing.
Kind Code: A1 A large number of genes suspected to encode G protein-coupled receptors were searched from a human genome sequence, and some of them were cloned. The cloned gene was prepared by linking the gene of the α1 subunit of Gi1 to the 3 ′ terminal portion, and these were introduced into insect cells to express the receptor-Gi1α fusion protein. From the properties of the receptor and the G protein, it can be expected that [ ³⁵ S] -GTPγS will bind to the Gi1α portion when the agonist binds to the receptor portion of this fusion protein. Therefore, we searched whether there is to increase the binding of 5-oxo-ETE in a dose-dependent manner ^[35 S] -GTPyS into the prepared fusion protein.

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、５−ｏｘｏ−ＥＴＥや５−ＨＰＥＴＥに対する受容体（以下、「５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体」という）タンパク質をコードするＤＮＡや、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質や、該５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体のアゴニスト又はアンタゴニスト等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｇ蛋白質共役受容体（ＧＰＣＲ：Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、細胞膜上に存在し、細胞外からのいろいろな情報を受け取る蛋白質である。ＧＰＣＲは膜を７回貫通するという共通構造をもつスーパーファミリーを形成しており、その一つひとつが光、匂い、味といった感覚のセンサーとして働いたり、ホルモン、神経伝達物質、生理活性物質、局所仲介物質等の細胞外リガンドと結合することによって、これら受容体のコンホメーションを変化させて、Ｇｉ、Ｇｔ、Ｇｓ、Ｇｏ、Ｇｑ等のＧ蛋白質（ＧＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を活性化して、細胞内にシグナルを伝達することが知られている。また、各種生体の細胞内や臓器内の複雑な機能を調節する細胞外リガンドは、生体機能を調節する医薬品として活用されており、現在使用されている臨床薬の３０〜５０％はＧＰＣＲを標的とするリガンドではないかと考えられている。近年の遺伝子クローニング技術の発達により、そのリガンドが同定されていない“オーファンＧＰＣＲ”の遺伝子が数多く見つかっており、新規ＧＰＣＲの探索やその機能解明が求められており、かかる新規ＧＰＣＲ遺伝子をクローニングすることは、アゴニストやアンタゴニストなどのＧＰＣＲに特異的なリガンドの探索に有用であることが知られている。しかし、ＧＰＣＲはその全てが明らかとされているわけではなく、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質ＨＥＯＡＤ５４もＧＰＣＲファミリーとして知られている（特開平１１−９８９８８号公報）が、そのリガンドが何であるかは知られていなかった。
【０００３】
一方、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ（５−ｏｘｏ６Ｅ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−ｅｉｃｏｓａ　ｔｅｔｒａｅｎｏｍｉｃ　ａｃｉｄ）、５−ＨＥＴＥ（５（±）−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｉｃｏｓａ−６Ｅ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ　ｔｅｔｒａｅｎｏｍｉｃ　ａｃｉｄ）及び５−ＨＰＥＴＥ（５（Ｓ）−Ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｙｅｉｃｏｓａ−６Ｅ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ　ｔｅｔｒａｅｎｏｍｉｃ　ａｃｉｄ）はロイコトリエンなどの生理活性脂質が生じる過程での代謝中間体として広く理解されている。また、５−ｏｘｏ−ＥＴＥや５−ＨＰＥＴＥの好中球遊走活性が報告され、特に、５−ｏｘｏ−ＥＴＥは、好酸球、単球、及び好中球等で合成され、少なくとも好酸球の組織への浸潤反応を起こし、また、ＰＡＦ、ＬＴＢ４、及びＬＴＤ４より強い遊走活性があると報告されている。５−ｏｘｏ−ＥＴＥや５−ＨＰＥＴＥの受容体の存在も示唆されているが、その具体的な生体内生理活性や受容体の実体は明らかではなく、これらは教科書レベルでは一般に生体内生理活性物質としては認識されていない。
【０００４】
他方、ＳＯＳＵＩ（ｈｔｔｐ：／／ｓｏｓｕｉ．ｐｒｏｔｅｏｍｅ．ｂｉｏ．ｔｕａｔ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉｆｒａｍｅ０．ｈｔｍｌ）は蛋白質の一次構造からアミノ酸ごとの疎水性パラメーターなどを利用して、その膜貫通領域を予想するために開発されたプログラムである。すでに数多くの既知、および未知の蛋白質においてその構造予測に適応され、さらにゲノム遺伝子配列上で膜結合型蛋白質をコードする翻訳領域（ＯＲＦ：ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）を同定することなどに利用されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ＧＰＣＲ及びその内在性リガンドは、これらに作用する薬剤の研究や、当該遺伝子及びその変異体の遺伝治療等への応用など、新たな治療法への応用の可能性が期待される。また、新規ＧＰＣＲ遺伝子の解析を通して新しい生体内情報伝達機構の発見や新規薬物標的蛋白質の同定も期待できる。本発明の課題は、生体内情報伝達機構の発見や新規薬物標的蛋白質の同定を可能とすることができる５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質やその遺伝子、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体のアゴニストやアンタゴニストを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
これまでに５−ｏｘｏ−ＥＴＥは好中球に対して正の走化性を誘導する物質であることが分かっていたが、その情報伝達を担う受容体の構造については不明であった。本発明者らはオーファンＧＰＣＲのリガンド探索法として、受容体とＧαの融合蛋白質を用いる方法を考案した。本発明者らはヒトゲノム配列からＧ蛋白質共役受容体をコードすると思われる遺伝子を多数検索し、それらのいくつかをクローニングした。クローニングした遺伝子の３’末端部分にＧｉ１のαサブユニットの遺伝子を結合したものを作製し、これらを昆虫細胞に導入し、受容体−Ｇｉ１α融合タンパク質を発現させた。この融合タンパク質の受容体部分にアゴニストが結合するとＧｉ１αの部分に［^３５Ｓ］−ＧＴＰγＳが結合することが、受容体とＧタンパク質の性質から期待できる。そこで作製した融合タンパク質の中に５−ｏｘｏ−ＥＴＥの用量依存的に［^３５Ｓ］−ＧＴＰγＳの結合を増加させるものがあるかどうか検索したところ、ある融合タンパク質の作製に利用された遺伝子は、５−ｏｘｏ−ＥＴＥや５−ＨＰＥＴＥに対する受容体の遺伝子であることを確認し、オーファンＧＰＣＲのひとつのリガンドが５−ｏｘｏ−ＥＴＥであることを見い出した。
【０００７】
一方、このオーファンＧＰＣＲは、免疫系組織、血球系組織に高く発現しており、少なくとも各種リンパ球（ヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞、Ｂ細胞）、単球、好酸球、好塩基球、および等に発現していることも明らかにしている。これらの結果から、５−ｏｘｏ−ＥＴＥは、免疫機能のこれら主役細胞に広範に作用する新しいタイプのケモカインと考えられる。今まで見出されているケモカインは内因性の白血球遊走・活性化作用を有する塩基性の強い、ヘパリン結含性活性ポリペプチドの総称であり、その構造から現在４つのサブファミリーに分けられている。今回、本発明者らが新たに見出したオーファンＧＰＣＲの内在性リガンド５−ｏｘｏ−ＥＴＥは、他の脂質性の白血球遊走因子と同じくアラキドン酸代謝物であり、従来のペプチド性ケモカインとは別のタイプのケモカインと見なすことが出来る。
【０００８】
上記融合タンパク質を用いた同様のアゴニストのスクリーニングから、５−ｏｘｏ−ＥＴＥや５−ＨＰＥＴＥに対する受容体には、５−ｏｘｏ−ＥＴＥや５−ＨＰＥＴＥが作用し、そのＥＣ_５０はそれぞれ約１ｎＭ、１７ｎＭであることが分かった。また、これら５−ｏｘｏ−ＥＴＥや５−ＨＰＥＴＥだけでなく、５−ＨＥＴＥやアラキドン酸もアゴニストとして作用し、アラキドン酸は高濃度においてアゴニスト活性を示した。さらにこの融合タンパク質について５−ｏｘｏ−ＥＴＥ存在下での［^３５Ｓ］−ＧＴＰγＳの取込みを阻害するアンタゴニストを検索したところ、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、リノレン酸又はそれらの誘導体がアンタゴニストとして働くことが分かった。
本発明は、以上の知見に基づいて完成されるに至ったものである。
【０００９】
すなわち本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質をコードするＤＮＡ。（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質（請求項１）や、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含む５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質をコードするＤＮＡ（請求項２）や、請求項２記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質をコードするＤＮＡ（請求項３）や、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質（請求項４）や、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質（請求項５）や、請求項４又は５記載の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質（請求項６）や、請求項４又は５記載の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質に特異的に結合する抗５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体抗体（請求項７）や、請求項４又は５記載の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質を産生することができる発現系を含むＤＮＡ（請求項８）や、請求項４又は５記載の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質を発現することができる発現系を含む宿主細胞（請求項９）や、請求項４又は５記載の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損し又は前記遺伝子が過剰発現する非ヒト動物（請求項１０）や、請求項４若しくは５記載の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質又は該５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質を発現している細胞膜と、被検物質とを用いることを特徴とする５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体の機能促進若しくは抑制物質又は５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体の発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法（請求項１１）や、請求項４若しくは５記載の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質又は５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質を発現している細胞膜と、５−ｏｘｏ−ＥＴＥと、被検物質とを用いることを特徴とする５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体の機能促進若しくは抑制物質又は５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体の発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法（請求項１２）や、請求項４若しくは５記載の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質を発現している細胞と、被検物質とを用いることを特徴とする５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体の機能促進若しくは抑制物質又はＧ蛋白質共役受容体の発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法（請求項１３）や、請求項１０記載の非ヒト動物と、被検物質とを用いることを特徴とする５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体の機能促進若しくは抑制物質又は５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体の発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法（請求項１４）や、非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする請求項１４記載の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体の機能促進若しくは抑制物質又は５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体の発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法（請求項１５）に関する。
【００１０】
また本発明は、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体のアゴニスト（請求項１６）や、５−ＨＥＴＥ又はアラキドン酸である請求項１６記載のアゴニスト（請求項１７）や、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体のアンタゴニスト（請求項１８）や、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、リノレン酸又はそれらの誘導体である請求項１８記載のアンタゴニスト（請求項１９）や、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体の機能促進又は発現増強を必要としている患者を治療するのに用いられる医薬組成物であって、有効成分として、請求項４若しくは５記載の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質、請求項１６若しくは１７記載のアゴニスト、又は請求項１〜３のいずれか記載のＤＮＡを含む医薬組成物（請求項２０）や、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体の機能又は発現の抑制を必要としている患者を治療するのに用いられる医薬組成物であって、有効成分として、請求項１８若しくは１９記載のアンタゴニスト、又は請求項１〜３のいずれか記載のＤＮＡの発現を抑制するＤＮＡ若しくはＲＮＡを含む医薬組成物（請求項２１）や、検体中の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、請求項４若しくは５記載の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質をコードするＤＮＡ配列と比較することを特徴とする５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体の機能又は発現に関連する疾病の診断方法（請求項２２）や、請求項４若しくは５記載の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部からなる５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体の機能又は発現に関連する疾病の診断用プローブ（請求項２３）や、請求項２３記載の診断用プローブ及び／又は請求項７記載の抗体を含有する５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体の機能又は発現に関連する疾病の診断薬（請求項２４）に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質や、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質をコードするＤＮＡを挙げることができ、これら５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質をコードするＤＮＡは、そのＤＮＡ配列情報等に基づき、例えばヒト由来の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体遺伝子においてはヒト遺伝子ライブラリーやヒトｃＤＮＡライブラリーなどから公知の方法により調製することができる。
【００１２】
また、本発明の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含むＤＮＡや、これらＤＮＡをプローブとして、ヒト由来のＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし、かつ５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質をコードするＤＮＡを挙げることができる。かかるＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。
【００１３】
本発明の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質や、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる５−ｏｘｏ−ＥＴＥに対するタンパク質や、これらの組換えタンパク質を具体的に挙げることができる。かかる５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質は、そのＤＮＡ配列情報等に基づき公知の方法で調製することができる。
【００１４】
上記配列番号１に示される塩基配列からなる５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質をコードするＤＮＡの等価物として、配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ（３１％）、配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡ（３１％）、配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡ（３２％）、又は配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡ（３％）を挙げることができる（カッコ内の数値は配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡとのホモロジーを示す）。また、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質の等価物として、配列番号４、６、８又は１０にそれぞれ示されるアミノ酸配列からなるＧＰＣＲタンパク質を挙げることができる。
【００１５】
本発明の融合タンパク質とは、本発明の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質に、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグを結合させたものをいい、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であればどのようなものでもよく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質の精製や、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質の検出や、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質に対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００１６】
本発明の抗５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体抗体としては、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質に特異的に結合する抗体であればどのようなものでもよく、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質を抗原として用い、常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質に特異的に結合する抗体は、例えば、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質の変異又は欠失に起因する疾病の診断や５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質の分子機構を明らかにする上で有用である。
【００１７】
上記５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質に対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に該５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質若しくはエピトープを含む断片、又は該タンパク質を膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Ｎａｔｕｒｅ　２５６，　４９５−４９７，　１９７５）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　４，７２，　１９８３）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　ＡＮＤ　ＣＡＮＣＥＲ　ＴＨＥＲＡＰＹ，　ｐｐ．７７−９６，　Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，　Ｉｎｃ．，　１９８５）など任意の方法を用いることができる。以下に５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質として、マウス由来の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質を例に挙げてマウス由来の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質に対して特異的に結合するモノクローナル抗体、すなわち抗マウス５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体モノクローナル抗体の作製方法を説明する。
【００１８】
抗マウス５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体モノクローナル抗体は、抗マウス５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをインビボ又はインビトロで常法により培養することによって生産することができる。例えば、インビボ系においては、齧歯動物、好ましくはマウス又はラットの腹腔内で培養することにより、またインビトロ系においては、動物細胞培養用培地で培養することにより得ることができる。インビトロ系でハイブリドーマを培養するための培地としては、ストレプトマイシンやペニシリン等の抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０又はＭＥＭ等の細胞培養培地を例示することができる。
【００１９】
抗マウス５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、マウス以外の動物種の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、免疫されたマウスの脾臓細胞とマウスＮＳ−１細胞（ＡＴＣＣ　ＴＩＢ−１８）とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリーニングすることにより、抗マウス５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作出することができる。また、かかるモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、タンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、アフィニティークロマトグラフィー等の液体クロマトグラフィーを具体的に例示することができる。
【００２０】
また、上記５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質に対する一本鎖抗体をつくるためには、一本鎖抗体の調製法（米国特許第４，９４６，７７８号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、その５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質を発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質に対する抗体は、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質の分子機構を明らかにする上で有用である。
【００２１】
また上記抗５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体モノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、^１２５Ｉ、^３２Ｐ、^１４Ｃ、^３５Ｓ又は^３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、上記５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質の機能解析を行うことができる。また免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
【００２２】
本発明はまた、上記５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質を産生することができる発現系を含むＤＮＡや、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質を発現することができる発現系を含む宿主細胞に関する。かかる５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡの宿主細胞への導入は、Ｄａｖｉｓら（ＢＡＳＩＣ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，　１９８６）及びＳａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：　Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ，　２ｎｄ　Ｅｄ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｎ．Ｙ．，　１９８９）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング　（ｓｃｒａｐｅ　ｌｏａｄｉｎｇ）、弾丸導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、感染等により行うことができる。そして、宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、卵母細胞等の動植物細胞などを挙げることができる。
【００２３】
また、発現系としては、上記５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質を宿主細胞内で発現させることができる発現系であればどのようなものでもよく、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。これら発現系は、発現を起こさせるだけでなく、発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
【００２４】
上記発現系を含んでなる宿主細胞は、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質の製造に用いることができる。例えば上記宿主細胞を培養し、培養物から５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質を回収し精製することにより製造することができる。５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、抗５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体モノクローナル抗体等の抗５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体抗体を結合させたカラムや、上記５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、かかる５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体を得ることができる。
【００２５】
本発明において、上記５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体をコードする遺伝子が過剰発現する非ヒト動物とは、野生型非ヒト動物に比べてかかる５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質の発現レベルが上昇し、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質を大量に産生する非ヒト動物をいい、また、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物とは、染色体上の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質をコードする遺伝子の一部若しくは全部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質を発現する機能を失なった非ヒト動物をいう。そして、本発明における非ヒト動物としては、ウサギや、マウス、ラット等の齧歯目動物などの非ヒト動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
ところで、メンデルの法則に従い出生してくるホモ接合体非ヒト動物には、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型とが含まれ、これらホモ接合体非ヒト動物における欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型を同時に用いることによって個体レベルで正確な比較実験をすることができることから、野生型の非ヒト動物、すなわち５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物と同種の動物、さらには同腹の動物を、種々の実験等に際して併用することが好ましい。かかる５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質をコードする遺伝子の機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物の作製方法を、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質のノックアウトマウスやトランスジェニックマウスを例にとって以下説明する。
【００２７】
例えば、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質をコードする遺伝子の機能が染色体上で欠損したマウス、すなわち５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質ノックアウトマウスは、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、上記５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質をコードする遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされた５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質をコードする遺伝子を、ウイルスベクター等を用いてサブクローンし、ＤＮＡシーケンシングにより特定する。このクローンの５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質をコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、３’末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲットベクターを作製する。
【００２８】
この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体マウスを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスをインタークロスさせることによって、本発明の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質ノックアウトマウスを作製することができる。また、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質ノックアウトマウスが生起しているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスの発現をウエスタンブロット法等により調べる方法がある。
【００２９】
５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質のトランスジェニックマウスは、上記５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質をコードするｃＤＮＡにチキンβ−アクチン、マウスニューロフィラメント、ＳＶ４０等のプロモーター、及びラビットβ−グロビン、ＳＶ４０等のポリＡ又はイントロンを融合させて導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマウス受精卵の前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、仮親のマウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記ｃＤＮＡを有する仔マウスを選択することによりかかるトランスジェニックマウスを創製することができる。また、ｃＤＮＡを有する仔マウスの選択は、マウスの尻尾等より粗ＤＮＡを抽出し、導入した５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質をコードする遺伝子をプローブとするドットハイブリダイゼーション法や、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法等により行うことができる。
【００３０】
本発明はまた、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体のアゴニストやアンタゴニストに関する。５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体のアゴニスト等の機能促進物質又は５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体のアンタゴニスト等の機能抑制物質のスクリーニング方法としては、前記本発明の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体遺伝子の３’末端部分にＧｉｌのαサブユニットの遺伝子が結合したものを作製し、これらを昆虫細胞に導入し、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質−Ｇｉｌα融合タンパク質を発現させ、この融合タンパク質の受容体部分にＧＤＰ及び［^３５Ｓ］−ＧＴＰγＳ存在下で各種リガンド候補化合物等の被検物質を作用させ、膜画分に取り込まれた［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳの取り込み量を指標に、５−ｏｘｏ−ＥＴＥに対するアゴニストやアンタゴニストのスクリーニングを行うことができる。また、上記スクリーニングの他の態様として、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質又は５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質を発現している細胞膜と、被検物質とを用いる方法や、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質又は５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質を発現している細胞膜と、５−ｏｘｏ−ＥＴＥと、被検物質とを用いる方法や、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質を発現している細胞と、被検物質とを用いる方法や、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質のノックアウトマウスやトランスジェニックマウス等の非ヒト動物と、被検物質とを用いる方法等を挙げることができる。
【００３１】
上記５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質又は５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質を発現している細胞膜と被検物質とを用いたスクリーニング方法としては、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質又は細胞膜表面に発現している５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質と被検物質とを接触せしめ、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質又は細胞膜表面に発現している５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質と、被検物質との結合状態を測定評価する方法を挙げることができる。また、上記５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質又は５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質を発現している細胞膜と、５−ｏｘｏ−ＥＴＥと、被検物質とを用いる方法としては、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質又は細胞膜表面に発現している５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質と５−ｏｘｏ−ＥＴＥと被検物質とを接触せしめ、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質又は細胞膜表面に発現している５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質と、５−ｏｘｏ−ＥＴＥとの結合状態を測定評価する方法を挙げることができる。
【００３２】
上記５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質のノックアウトマウスやトランスジェニックマウス等の非ヒト動物と、被検物質とを用いる方法としては、かかる非ヒト動物から得られる５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質発現細胞と被検物質とをあらかじめインビトロで接触せしめた後、かかる５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質発現細胞を５−ｏｘｏ−ＥＴＥの存在下で培養し、該５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質発現細胞における５−ｏｘｏ−ＥＴＥに対する応答を測定・評価する方法や、前記非ヒト動物から得られる５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質発現細胞と５−ｏｘｏ−ＥＴＥとをあらかじめインビトロで接触せしめた後、該５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質発現細胞を被検物質の存在下で培養し、該５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質発現細胞における５−ｏｘｏ−ＥＴＥとの結合状態等の５−ｏｘｏ−ＥＴＥに対する応答を測定・評価する方法や、前記非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物から得られる５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質発現細胞を５−ｏｘｏ−ＥＴＥの存在下で培養し、該５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質発現細胞における５−ｏｘｏ−ＥＴＥに対する応答を測定・評価する方法を挙げることができる。
【００３３】
本発明の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質のアゴニスト等の機能促進物質若しくは５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質のアンタゴニスト等の機能抑制物質や、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質の発現促進物質若しくは発現抑制物質等は、上記スクリーニング方法により得ることができる。本発明の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体のアゴニストとして、具体的に５−ＨＥＴＥ、アラキドン酸等を挙げることができ、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体のアンタゴニストとして、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、リノレン酸又はそれらの誘導体を挙げることができ、エイコサペンタエン酸の誘導体としては、具体的に５，８，１１，１４−Ｅｉｃｏｓａｔｅｔｒａｙｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、５，８，１１−Ｅｉｃｏｓａｔｒｉｙｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、Ｅｉｃｏｓａ−１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ−ｔｒｉｅｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｓ−ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔａｉｎｅ等を挙げることができる。また、ドコサヘキサエン酸の誘導体としては、ドコサヘキサエン酸のエステル、アミド等を挙げることができる。
【００３４】
また、本発明の医薬組成物、特に、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質の機能促進又は発現増強を必要としている患者を治療するのに用いられる医薬組成物としては、有効成分として５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質や、その部分ペプチドの他、前記５−ＨＰＥＴＥ等のアゴニストなどの５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質の機能促進物質や、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質の発現促進物質を含んでものであれば特に制限されるものではなく、また、他方、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体の機能又は発現の抑制を必要としている患者を治療するのに用いられる医薬組成物としては、有効成分として５，８，１１，１４−Ｅｉｃｏｓａｔｅｔｒａｙｎｏｉｃ　ａｃｉｄ等のアンタゴニストなどの５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質の機能抑制物質や、前記本発明のＤＮＡの発現を抑制するＤＮＡ若しくはＲＮＡなどの発現抑制物質を含んでものであれば特に制限されるものではなく、これら医薬組成物を医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。これら医薬組成物は、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体の機能促進又は発現増強を必要としている疾病や、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体の機能又は発現の抑制を必要としている疾病の予防若しくは治療方法に用いることができる。またこれら予防若しくは治療方法においては、患者の性別・体重・症状に見合った適切な投与量の上記医薬組成物を、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。
【００３５】
本発明の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体の機能又は発現に関連する疾病の診断方法としては、検体中の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、本発明の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質をコードするＤＮＡ配列と比較する方法であればどのような方法でもよく、また、本発明の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体の機能又は発現に関連する疾病の診断用プローブとしては、前記本発明の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部からなるものであれば特に制限されるものではなく、本発明の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体の機能又は発現に関連する疾病の診断薬としては、上記診断用プローブや前記５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体タンパク質を特異的に認識する抗体を含有するものであれば特に制限されるものではない。
【００３６】
【実施例】
以下に、実施例を揚げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例Ａ（材料と方法）
［ヒトゲノムデータからの推定ＧＰＣＲ遺伝子の抽出］
解析が完了した配列（２０００年８月８日現在のもの）を用いて、ＧＰＣＲ遺伝子の候補となりうるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ：Ｏｐｅｎ　Ｒｅａｄｉｎｇ　Ｆｒａｍｅ）を抽出し、ＳＯＳＵＩによる分析を行った。なお、今回用いたヒトゲノムデータには、同一の確定されていない配列を重複して含んでいるため、ヒトゲノム全体が約３Ｇ塩基対であるのに対してこのデータは約４．５Ｇ塩基対からなる。ヒトゲノムデータから、２００〜１５００のアミノ酸残基をコードするＤＮＡからなる約３３万５千個のＯＲＦを抽出し、この中からＤＮＡの繰り返し配列に由来すると思われるＯＲＦや不確定なアミノ酸が多いＯＲＦや、同じアミノ酸を２０％以上含むＯＲＦを排除することによって約２７万個のＯＲＦを得た。
【００３７】
［ホモロジー（ＢＬＡＳＴ）検索］
上記約２７万個のＯＲＦをＳＯＳＵＩにより分析した結果、膜貫通領域を６〜８個含むＯＲＦが７７８０個得られた。得られたＧＰＣＲ候補７７８０個のＯＲＦの配列を、ＢＬＡＳＴを用いて２０００年８月２０日現在のデータベース“ｎｒ”と照会し、既知のＧＰＣＲとの相同性を調べてみた結果、既知のＧＰＣＲとホモロジーを持つものが１７１４個得られた。さらにこれらの配列から重複したものを除くことによって、既知の嗅覚受容体遺伝子４１種類と、既知の味覚受容体遺伝子１１種類と、嗅覚受容体や味覚受容体以外の既知のＧＰＣＲ遺伝子１２８種類を同定することができた。一方、新規の嗅覚受容体遺伝子２８１種類、新規の味覚受容体遺伝子１１種類、嗅覚受容体や味覚受容体以外の新規なＧＰＣＲ遺伝子を５０個同定した。
【００３８】
［ヒトゲノムからのＧＰＣＲ遺伝子のクローニング］
ＰＣＲ法を用いてこれら新規ＧＰＣＲ遺伝子をヒトゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ）からクローニングした。ＰＣＲ増幅の条件としては、始めに９８℃で１分間変性させた後、９８℃で３０秒間変性させ、６５℃で３０秒間アニーリングし、７４℃で９０秒間伸長反応させるというサイクルを３０回繰返し、最後に７４℃で３分間伸長反応を行い、その後４℃にてストックした。プライマーとしては、Ｆ；　５’−ＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＡＣＣＧＴＧＧＴＧＧＣＣ−３’（配列番号１１）とＲ；　５’−ＧＧＣＧＣＴＣＡＧＣＧＴＡＣＡＧＣＣＣＡＴＧＣＣＣＴＧＧＧＡＧＧＡＧＣＣＴＴＣＣＴ−３’（配列番号１２）を用い、またＰＣＲ反応液として以下（表１）の組成のものを用いた。
【００３９】
【表１】

【００４０】
さらにそこから終止コドンを除いた配列とＧｉ１αサブユニットの遺伝子（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　１９７，　１−２，　３０５−３１０，　１９８６）との融合遺伝子を作製し、バキュロウイルスベクターｐＦＡＳＴＢａｃに組み込んだ。この融合遺伝子をもったウイルスを昆虫細胞Ｓｆ９（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１７１１）に感染させ、ＧＰＣＲ−Ｇｉ１α融合タンパク質を発現させた。細胞を回収し、膜画分を調整して、本発明者らが作製したＧｉ１αに対する抗体でウエスタンブロッティングを行い、融合タンパク質の発現を確認した。
【００４１】
［アゴニスト活性物質のスクリーニング］
融合タンパク質にＧＤＰおよび［^３５Ｓ］−ＧＴＰγＳ存在下で各種リガンド候補化合物を作用させ、膜画分に取り込まれた［^３５Ｓ］−ＧＴＰγＳの取り込み量を指標に、各ＧＰＣＲに対するアゴニストのスクリーニングを行った。化合物にアゴニスト活性がある場合は化合物がＧＰＣＲに結合し、結果としてＧｉ１αが活性化されるので［^３５Ｓ］−ＧＴＰγＳの取り込み量が上昇する。各種リガンド候補物質として約１０００種類の化学物質を検索し、９６穴プレートの放射活性を自動測定できるパッカード社の液体シンチレーションカウンター「トップカウント」を用いてハイスループットスクリーニングを行った。
【００４２】
［５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体の発現部位］
以上のスクリーニングとは別に、各ＧＰＣＲに対して各種臓器から調整したｍＲＮＡを鋳型にＲＴ−ＰＣＲを行い、発現部位の分布を調べた。プライマーとしては、Ｆ；　５’−ＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＡＣＣＧＴＧＧＴＧＧＣＣ−３’（配列番号１１）とＲ；　５’−ＧＧＣＧＣＴＣＡＧＣＧＴＡＣＡＧＣＣＣＡＴＧＣＣＣＴＧＧＧＡＧＧＡＧＣＣＴＴＣＣＴ−３’（配列番号１２）を用い、ＰＣＲ増幅の条件としては、始めに９８℃で１分間変性させた後、９８℃で３０秒間変性させ、６５℃で３０秒間アニーリングし、７４℃で９０秒間伸長反応させるというサイクルを３０回繰返し、最後に７４℃で３分間伸長反応を行い、その後４℃にてストックした。またＰＣＲ反応液として以下の組成のものを用いた。
【００４３】
【表２】

【００４４】
実施例Ｂ（結果）
［アゴニストのスクリーニング］
上記スクリーニングにより、ＴＨ２４−Ｇｉと命名した特定の融合タンパク質に対して５−ｏｘｏ−ＥＴＥ［化１］、５−ＨＰＥＴＥ［化２］、５−ＨＥＴＥ［化３］、アラキドン酸などがアゴニストとしての活性を持つことがわかった（図１）。各化合物のおおよそのＥＣ_５０は、アラキドン酸；約１×１０^−６Ｍ、５−ＨＥＴＥ；約１×１０^−６Ｍ、５−ＨＰＥＴＥ；約３×１０^−８Ｍ、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ；約４×１０^−９Ｍであったことから、ＴＨ２４のアミノ酸配列をもつ受容体を５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体と同定した。
【００４５】
【化１】

【００４６】
【化２】

【００４７】
【化３】

【００４８】
これらの物質をＴＨ２４−Ｇｉ融合タンパク質に作用させるとＧｉ１α部分のＧＤＰに対する親和性を減少させることが確認できた。５−ＨＰＥＴＥを用いたときの結果をリガンドが存在しない対照（−）ｌｉｇａｎｄと共に図２に示す。これは５−ＨＰＥＴＥ等の物質が５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体に対してアゴニスト活性を持つことを支持するものである。
【００４９】
［アンタゴニストのスクリーニング］
さらに５−ｏｘｏ−ＥＴＥを用いて５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体に対するアンタゴニストのスクリーニングを行った。その結果、高濃度（約１×１０^−５Ｍ以上）であればアラキドン酸よりさらに炭素鎖の長いエイコサペンタエン酸やその誘導体であるｅｉｃｏｓａｔｒｉｅｎｏｉｃ　ａｃｉｄ（５，８，１１−Ｅｉｃｏｓａｔｒｉｙｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）、ドコサヘキサエン酸などの他、α−リノレン酸（ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ　ａｃｉｄ）もアンタゴニストとして働くことがわかった（図３）。これはこれらの脂肪酸がアラキドン酸と類似する構造をもつ一方で、５−ＨＰＥＴＥ、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ、５−ＨＥＴＥに共通な５位の酸素を持たないことを考えると妥当な結果である。今後、５位に過酸化酸素やカルボニル酸素を導入した化合物は極めて有用な５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体に対するアンタゴニストとして働くことが期待できる。
【００５０】
［５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体の発現分布］
５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体の発現分布をＲＴ−ＰＣＲで確認した結果は、広く全身に発現しているものの、肝臓や結腸などに比較的強く発現していることがわかった（図４）。ＲＴ−ＰＣＲの結果では５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体は全身に発現しているとの結果を得たが、おそらくその活性の性質や他の活性脂質の特性との類似性から、リンパ球、特に好中球に発現して機能していると推察される。我々の予備的な実験もそれを支持しているが、一方で臓器の細胞自身が５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体を発現している可能性も依然として考えるべきである。
【００５１】
［まとめ］
以上のことから５−ＨＰＥＴＥ、５−ｏｘｏ−ＥＴＥに対する受容体の存在が可能性として示唆されてきたが、今回見出された５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体が、５−ｏｘｏ−ＥＴＥや５−ＨＰＥＴＥに対する生体内受容体である可能性が極めて高い。［^３５Ｓ］−ＧＴＰγＳ結合活性から測定したＥＣ_５０の値が、これまで報告されている５−ｏｘｏ−ＥＴＥや５−ＨＰＥＴＥの生理活性のＥＣ_５０の値とよく一致することもその理由の一つとして挙げることができる。
【００５２】
【発明の効果】
本発明により新しく同定された５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体は、５−ｏｘｏ−ＥＴＥや５−ＨＰＥＴＥの好中球遊走活性を調節していると考えられることから、５−ｏｘｏ−ＥＴＥや５−ＨＰＥＴＥの他そのアゴニストなどの５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体の作動剤や、５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体のアンタゴニストなどの作動抑制剤は、各種免疫系細胞の遊走を活性化・不活性化することで、主に免疫系全般の腑活化・失活化を行う可能性があり、炎症やアレルギーの他、腫瘍の治療薬になる可能性が大きく、それらの疾患に関する薬剤の研究や遺伝子治療などによる新しい応用への可能性も期待される。
【００５３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体のアゴニストのスクリーニング結果を示す図である。
【図２】
本発明の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体のアゴニストのスクリーニング結果を示す図である。
【図３】
本発明の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体のアンタゴニストのスクリーニング結果を示す図である。
【図４】
本発明の５−ｏｘｏ−ＥＴＥ受容体の発現分布についてのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention provides a DNA encoding a receptor for 5-oxo-ETE or 5-HPETE (hereinafter, referred to as “5-oxo-ETE receptor”), a 5-oxo-ETE receptor protein, The present invention relates to an oxo-ETE receptor agonist or antagonist and the like.
[0002]
[Prior art]
G protein-coupled receptors (GPCRs) are proteins that exist on cell membranes and receive various information from outside the cells. GPCRs form a superfamily with a common structure that penetrates the membrane seven times, each of which acts as a sensor for the sensation of light, smell, taste, etc., hormones, neurotransmitters, bioactive substances, local mediators By changing the conformation of these receptors by binding to extracellular ligands such as GTP, G proteins such as Gi, Gt, Gs, Go and Gq (GTP-binding proteins) are activated, It is known to transmit signals. In addition, extracellular ligands that regulate complex functions in cells and organs of various living organisms are used as pharmaceuticals that regulate biological functions, and 30 to 50% of currently used clinical drugs target GPCRs. Is considered to be a ligand. With the development of gene cloning technology in recent years, many genes of "orphan GPCRs" whose ligands have not been identified have been found, and there is a need to search for new GPCRs and elucidate their functions, and to clone such new GPCR genes. This is known to be useful for searching for ligands specific to GPCRs such as agonists and antagonists. However, not all GPCRs have been elucidated, and the protein HEOAD54 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is also known as a GPCR family (JP-A-11-98988). What it was was unknown.
[0003]
On the other hand, 5-oxo-ETE (5-oxo6E, 8Z, 11Z, 14Z-eicosatetraenoic acid), 5-HETE (5 (±) -Hydroxyeicosa-6E, 8Z, 11Z, 14Z tetraenoic acid) and 5-HPETE (5) (S) -Hydroxyxyeicosa-6E, 8Z, 11Z, 14Z tetraenomic acid) is widely understood as a metabolic intermediate in the process of producing a bioactive lipid such as leukotriene. In addition, neutrophil migration activity of 5-oxo-ETE and 5-HPETE has been reported. In particular, 5-oxo-ETE is synthesized by eosinophils, monocytes, neutrophils and the like, and at least eosinophils. Has been reported to cause an invasion reaction into tissues and has a higher migration activity than PAF, LTB4, and LTD4. The existence of 5-oxo-ETE and 5-HPETE receptors has also been suggested, but the specific biological activity and the nature of the receptor are not clear, and these are generally bioactive substances at the textbook level. Is not recognized as.
[0004]
On the other hand, SOSUI (http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html) is used to predict the transmembrane region of a protein from the primary structure using the hydrophobicity parameter of each amino acid and the like. It is a program developed in. It has already been applied to the prediction of the structure of many known and unknown proteins, and is used for identifying a translation region (ORF: open reading frame) encoding a membrane-bound protein on a genomic gene sequence.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
GPCRs and their endogenous ligands are expected to be applied to new therapeutic methods, such as research on drugs acting on them and application of the gene and its mutants to genetic therapy. In addition, the discovery of a new in vivo signaling mechanism and the identification of a novel drug target protein can be expected through analysis of a novel GPCR gene. An object of the present invention is to provide a 5-oxo-ETE receptor protein and a gene thereof capable of discovering an in vivo signaling mechanism and identifying a novel drug target protein, and agonists and antagonists of a 5-oxo-ETE receptor. Is to provide.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
Until now, 5-oxo-ETE was known to be a substance that induces positive chemotaxis to neutrophils, but the structure of the receptor responsible for its signal transmission was unknown. The present inventors have devised a method using a fusion protein of a receptor and Gα as a ligand search method for an orphan GPCR. The present inventors have searched a large number of genes that are thought to encode G protein-coupled receptors from the human genome sequence, and cloned some of them. The cloned gene was prepared by linking the gene of the α1 subunit of Gi1 to the 3 ′ terminal portion, and these were introduced into insect cells to express the receptor-Gi1α fusion protein. When an agonist binds to the receptor portion of this fusion protein, the Gi1α portion becomes [ ³⁵ The binding of [S] -GTPγS can be expected from the properties of the receptor and the G protein. The fusion protein thus prepared contained 5-oxo-ETE in a dose-dependent manner [ ³⁵ When a search was made to see if there was one that increases the binding of [S] -GTPγS, it was confirmed that the gene used to produce a certain fusion protein was a receptor gene for 5-oxo-ETE or 5-HPETE. Found that one ligand of the orphan GPCR was 5-oxo-ETE.
[0007]
On the other hand, this orphan GPCR is highly expressed in immune system tissues and blood cell tissues, and at least various lymphocytes (helper T cells, killer T cells, B cells), monocytes, eosinophils, basophils, And that it is also expressed. These results suggest that 5-oxo-ETE is a new type of chemokine that acts extensively on these key cells of immune function. The chemokines discovered so far are a general term for strongly basic, heparin-binding active polypeptides having endogenous leukocyte migration and activation, and are currently divided into four subfamilies based on their structures. . The orphan GPCR endogenous ligand 5-oxo-ETE, which the present inventors have newly found, is an arachidonic acid metabolite like other lipid leukocyte chemotactic factors, and is different from the conventional peptide chemokine. Can be considered as a type of chemokine.
[0008]
From the same agonist screening using the above fusion protein, 5-oxo-ETE and 5-HPETE act on the receptor for 5-oxo-ETE and 5-HPETE. ₅₀ Was about 1 nM and 17 nM, respectively. In addition, not only 5-oxo-ETE and 5-HPETE but also 5-HETE and arachidonic acid acted as agonists, and arachidonic acid showed an agonist activity at a high concentration. In addition, the fusion protein in the presence of 5-oxo-ETE [ ³⁵ When an antagonist that inhibits the uptake of [S] -GTPγS was searched, it was found that eicosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid, linolenic acid, or a derivative thereof worked as an antagonist.
The present invention has been completed based on the above findings.
[0009]
That is, the present invention provides a DNA encoding the following (a) or (b) 5-oxo-ETE receptor protein. (A) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; (b) a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (claim DNA encoding a 5-oxo-ETE receptor protein containing 1) or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a sequence complementary thereto, and a part or all of these sequences (claim 2); DNA that hybridizes with the DNA described under stringent conditions and encodes a 5-oxo-ETE receptor protein (Claim 3), or a 5-oxo-ETE receptor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. In the body protein (claim 4) or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, one or several amino acids are deleted or substituted. Or a 5-oxo-ETE receptor protein comprising an added amino acid sequence (claim 5), the 5-oxo-ETE receptor protein according to claim 4 or 5, and a marker protein and / or a peptide tag. The bound fusion protein (Claim 6), an anti-5-oxo-ETE receptor antibody that specifically binds to the 5-oxo-ETE receptor protein according to Claim 4 or 5, (Claim 7), A DNA comprising an expression system capable of producing the 5-oxo-ETE receptor protein according to claim 4 or 5 (claim 8), or expressing the 5-oxo-ETE receptor protein according to claim 4 or 5. A host cell containing an expression system capable of carrying out the above-mentioned method (claim 9), or a gene function encoding the 5-oxo-ETE receptor protein according to claim 4 or 5 deficient on a chromosome or A non-human animal in which the gene is overexpressed (claim 10), a 5-oxo-ETE receptor protein according to claim 4 or 5, or a cell membrane expressing the 5-oxo-ETE receptor protein; A screening method for a 5-oxo-ETE receptor function promoting or inhibiting substance or a 5-oxo-ETE receptor expression promoting or inhibiting substance, characterized by using a test substance (claim 11), and claim 4. Or 5-oxo using the 5-oxo-ETE receptor protein or the cell membrane expressing the 5-oxo-ETE receptor protein described in 5, a 5-oxo-ETE, and a test substance. A method for screening a substance that promotes or suppresses the function of -ETE receptor or a substance that promotes or suppresses the expression of 5-oxo-ETE receptor (Claim 12); A substance that promotes or suppresses the function of a 5-oxo-ETE receptor or a G protein, comprising using a cell that expresses the 5-oxo-ETE receptor protein according to claim 4 or 5, and a test substance. A method for screening for a substance that promotes or suppresses the expression of a coupled receptor (Claim 13), and uses the non-human animal according to Claim 10 and a test substance to promote the function of a 5-oxo-ETE receptor. Alternatively, the method for screening for a substance that promotes or suppresses the expression of a suppressor or 5-oxo-ETE receptor (Claim 14), and wherein the non-human animal is a mouse, is a mouse. The present invention relates to a method for screening a substance promoting or suppressing the function of a receptor or a substance promoting or suppressing the expression of a 5-oxo-ETE receptor (Claim 15).
[0010]
In addition, the present invention relates to an agonist of 5-oxo-ETE receptor (claim 16), an agonist of claim 16 which is 5-HETE or arachidonic acid (claim 17), and an agonist of 5-oxo-ETE receptor. An antagonist (Claim 18) or an antagonist (Claim 19) according to Claim 18 which is eicosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid, linolenic acid or a derivative thereof, and promotes the function or enhances the expression of 5-oxo-ETE receptor. A pharmaceutical composition used for treating a patient in need thereof, wherein the active ingredient is a 5-oxo-ETE receptor protein according to claim 4 or 5, an agonist according to claim 16 or 17, or a claim. A pharmaceutical composition comprising the DNA of any one of claims 1 to 3 (Claim 20), and the function or expression of 5-oxo-ETE receptor. A pharmaceutical composition used for treating a patient in need of control, which suppresses the expression of the antagonist according to claim 18 or 19 or the DNA according to any one of claims 1 to 3 as an active ingredient. A pharmaceutical composition containing DNA or RNA (Claim 21), or a DNA sequence encoding a 5-oxo-ETE receptor protein in a sample, encoding a 5-oxo-ETE receptor protein according to claim 4 or 5. A method for diagnosing a disease associated with the function or expression of a 5-oxo-ETE receptor, which is characterized by comparing the DNA sequence with the DNA sequence of the 5-oxo-ETE receptor (claim 22), or the 5-oxo-ETE receptor according to claim 4 or 5. Diseases related to the function or expression of 5-oxo-ETE receptor consisting of all or part of antisense strand of DNA or RNA encoding protein A diagnostic probe (Claim 23) or a diagnostic agent for a disease associated with the function or expression of a 5-oxo-ETE receptor containing the diagnostic probe of Claim 23 and / or the antibody of Claim 7. Regarding item 24).
[0011]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The DNA encoding the 5-oxo-ETE receptor protein of the present invention may be a 5-oxo-ETE receptor protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; DNA encoding a 5-oxo-ETE receptor protein consisting of an amino acid sequence in which several amino acids have been deleted, substituted or added can be mentioned, and DNAs encoding these 5-oxo-ETE receptor proteins include: Based on the DNA sequence information and the like, for example, a human-derived 5-oxo-ETE receptor gene can be prepared from a human gene library or a human cDNA library by a known method.
[0012]
Examples of the DNA encoding the 5-oxo-ETE receptor protein of the present invention include a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof, a DNA containing a part or all of these sequences, or a DNA containing these DNAs. Examples of the probe include a DNA that hybridizes with a human-derived DNA library under stringent conditions and encodes a 5-oxo-ETE receptor protein. Hybridization conditions for obtaining such DNA include, for example, hybridization at 42 ° C. and washing at 42 ° C. with a buffer containing 1 × SSC and 0.1% SDS. , 65 ° C., and a washing treatment at 65 ° C. with a buffer containing 0.1 × SSC, 0.1% SDS.
[0013]
The 5-oxo-ETE receptor protein of the present invention includes a 5-oxo-ETE receptor protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Specific examples thereof include a protein against 5-oxo-ETE consisting of an amino acid sequence in which is deleted, substituted or added, and a recombinant protein thereof. Such a 5-oxo-ETE receptor protein can be prepared by a known method based on its DNA sequence information and the like.
[0014]
As an equivalent of the DNA encoding the 5-oxo-ETE receptor protein consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 (31%) is shown in SEQ ID NO: 5. A DNA consisting of the base sequence (31%), a DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 (32%), or a DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 (3%) can be mentioned (in parentheses). Indicates the homology with the DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.) In addition, as an equivalent of the 5-oxo-ETE receptor protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, a GPCR protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, 6, 8 or 10 can be mentioned.
[0015]
The fusion protein of the present invention refers to a protein obtained by binding a marker protein and / or a peptide tag to the 5-oxo-ETE receptor protein of the present invention. The marker protein may be a conventionally known marker protein. Any one may be used, and specific examples thereof include alkaline phosphatase, the Fc region of an antibody, HRP, GFP, and the like. Examples of the peptide tag of the present invention include Myc tag, His tag, FLAG tag, and GST. Conventionally known peptide tags such as tags can be specifically exemplified. Such a fusion protein can be prepared by a conventional method, and purifies 5-oxo-ETE receptor protein using affinity of Ni-NTA and His tag, detects 5-oxo-ETE receptor protein, It is also useful as a quantification of an antibody against the 5-oxo-ETE receptor protein and as a research reagent in other fields.
[0016]
The anti-5-oxo-ETE receptor antibody of the present invention may be any antibody that specifically binds to a 5-oxo-ETE receptor protein, such as a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a chimeric antibody, Specific examples thereof include immunospecific antibodies such as a main chain antibody and a humanized antibody, and these can be prepared by a conventional method using the above-mentioned 5-oxo-ETE receptor protein as an antigen. Among them, a monoclonal antibody is more preferable in terms of its specificity. Antibodies that specifically bind to the 5-oxo-ETE receptor protein, such as the monoclonal antibody, can be used, for example, for diagnosing a disease caused by mutation or deletion of the 5-oxo-ETE receptor protein and for 5-oxo-ETE receptor protein. It is useful for elucidating the molecular mechanism of body proteins.
[0017]
The antibody against the 5-oxo-ETE receptor protein can be obtained by using a conventional protocol to prepare a fragment containing the 5-oxo-ETE receptor protein or epitope in an animal (preferably other than a human), or to apply the protein to a membrane surface. The hybridoma method (Nature 256, 495-497, 1975), the trioma method, which is produced by administering the expressed cells, for example, the preparation of monoclonal antibodies, results in antibodies produced by continuous cell line cultures. B cell hybridoma method (Immunology Today 4, 72, 1983) and EBV-hybridoma method (MONOCRONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp. 77-96, Alan R. Lis, Inc., 1985). Meaning the method can be used. Hereinafter, as a 5-oxo-ETE receptor protein, a monoclonal antibody that specifically binds to a mouse-derived 5-oxo-ETE receptor protein, using a mouse-derived 5-oxo-ETE receptor protein as an example, That is, a method for producing an anti-mouse 5-oxo-ETE receptor monoclonal antibody will be described.
[0018]
The anti-mouse 5-oxo-ETE receptor monoclonal antibody can be produced by culturing an anti-mouse 5-oxo-ETE receptor monoclonal antibody-producing hybridoma in vivo or in vitro by a conventional method. For example, it can be obtained by culturing intraperitoneally in rodents, preferably mice or rats in an in vivo system, and by culturing in an animal cell culture medium in an in vitro system. Examples of a medium for culturing a hybridoma in an in vitro system include a cell culture medium such as RPMI1640 or MEM containing an antibiotic such as streptomycin or penicillin.
[0019]
Anti-mouse 5-oxo-ETE receptor monoclonal antibody-producing hybridomas are obtained, for example, by immunizing BALB / c mice with 5-oxo-ETE receptor protein of an animal species other than mouse, and spleen cells of immunized mice. A mouse NS-1 cell (ATCC TIB-18) is subjected to cell fusion by a conventional method, and screening is performed using an immunofluorescence staining pattern, whereby an anti-mouse 5-oxo-ETE receptor monoclonal antibody-producing hybridoma can be produced. . As a method for separating and purifying such a monoclonal antibody, any method may be used as long as it is a method generally used for protein purification, and specific examples thereof include liquid chromatography such as affinity chromatography. .
[0020]
In addition, in order to prepare a single-chain antibody against the 5-oxo-ETE receptor protein, a method for preparing a single-chain antibody (US Pat. No. 4,946,778) can be applied. Further, in order to express a humanized antibody, a transgenic mouse or another mammal is used, and a clone expressing the 5-oxo-ETE receptor protein is isolated and identified using the above-mentioned antibody. Alternatively, the polypeptide can be purified by affinity chromatography. Antibodies to the 5-oxo-ETE receptor protein are useful for elucidating the molecular mechanism of the 5-oxo-ETE receptor protein.
[0021]
Antibodies such as the above-mentioned anti-5-oxo-ETE receptor monoclonal antibody include, for example, fluorescent substances such as FITC (fluorescein isocyanate) or tetramethylrhodamine isocyanate, ¹²⁵ I, ³² P, ¹⁴ C, ³⁵ S or ³ The use of a fusion protein obtained by fusing a radioisotope such as H, a protein labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase, peroxidase, β-galactosidase or phycoerythrin, or a fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP) is used. Functional analysis of the 5-oxo-ETE receptor protein can be performed. Examples of immunological measurement methods include RIA, ELISA, fluorescent antibody, plaque, spot, hemagglutination, and octalony.
[0022]
The present invention also relates to a DNA containing an expression system capable of producing the above-mentioned 5-oxo-ETE receptor protein and a host cell containing an expression system capable of expressing the 5-oxo-ETE receptor protein. Introduction of the gene DNA encoding the 5-oxo-ETE receptor protein into host cells has been described by Davis et al. (BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986) and Sambrook et al. (MOLECULAR CLONING: ALABORATORY MANUAL. Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), including methods described in many standard laboratory manuals, such as calcium phosphate transfection, DEAE-dextran mediated transfection, transvection, Microinjection, cationic lipid-mediated transfection ® down, electroporation, transduction, (scrape loading), bullet introduced (ballistic introduction), it can be carried out by infection. As host cells, bacterial prokaryotic cells such as Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, Streptococcus, Staphylococcus, yeast, fungal cells such as Aspergillus, insect cells such as Drosophila S2, Spodoptera Sf9, L cells, Animal and plant cells such as CHO cells, COS cells, HeLa cells, C127 cells, BALB / c3T3 cells (including mutants lacking dihydrofolate reductase and thymidine kinase), BHK21 cells, HEK293 cells, Bowes melanoma cells, oocytes, etc. And the like.
[0023]
The expression system may be any expression system capable of expressing the 5-oxo-ETE receptor protein in a host cell, and may be any expression system derived from chromosomes, episomes and viruses, for example, A vector derived from a bacterial plasmid, a yeast plasmid, a papovavirus such as SV40, a vaccinia virus, an adenovirus, a fowlpox virus, a pseudorabies virus, a retrovirus-derived vector, a bacteriophage-derived, a transposon-derived and combinations thereof, Examples include those derived from genetic elements of plasmids and bacteriophages such as cosmids and phagemids. These expression systems may contain control sequences that not only cause expression but also regulate expression.
[0024]
A host cell comprising the above expression system can be used for producing a 5-oxo-ETE receptor protein. For example, it can be produced by culturing the above host cell, collecting and purifying the 5-oxo-ETE receptor protein from the culture. To recover and purify the 5-oxo-ETE receptor protein from cell culture, ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography Known methods including, for example, hydroxyapatite chromatography and lectin chromatography, preferably high performance liquid chromatography are used. In particular, as a column used for affinity chromatography, for example, a column to which an anti-5-oxo-ETE receptor antibody such as an anti-5-oxo-ETE receptor monoclonal antibody is bound, or the above-mentioned 5-oxo-ETE receptor When a normal peptide tag is added, such a 5-oxo-ETE receptor can be obtained by using a column to which a substance having an affinity for the peptide tag is bound.
[0025]
In the present invention, a non-human animal in which the gene encoding the 5-oxo-ETE receptor is overexpressed has an increased expression level of the 5-oxo-ETE receptor protein as compared to a wild-type non-human animal, A non-human animal that produces a large amount of 5-oxo-ETE receptor protein means a non-human animal whose gene function encoding the 5-oxo-ETE receptor protein is defective on the chromosome. Non-human in which part or all of the gene encoding the -oxo-ETE receptor protein has been inactivated by gene mutation such as disruption, deletion, or substitution, and has lost the function of expressing the 5-oxo-ETE receptor protein. An animal. Examples of the non-human animal in the present invention include, but are not limited to, non-human animals such as rabbits and rodents such as mice and rats.
[0026]
By the way, homozygous non-human animals born according to Mendel's law include a 5-oxo-ETE receptor protein-deficient or overexpressed type and its homozygous wild type, By simultaneously using a defective or overexpressed animal and its littermate wild type in animals, an accurate comparative experiment can be performed at the individual level. Therefore, a wild-type non-human animal, that is, a 5-oxo-ETE receptor protein can be used. It is preferable to use an animal of the same species as the non-human animal whose encoded gene function is deficient or overexpressed on the chromosome, or an animal of the same litter in various experiments and the like. The method for producing a non-human animal in which the function of the gene encoding the 5-oxo-ETE receptor protein is deficient or overexpressed on the chromosome will be described by taking a knockout mouse or a transgenic mouse of the 5-oxo-ETE receptor protein as an example. This will be described below.
[0027]
For example, a mouse in which the function of the gene encoding the 5-oxo-ETE receptor protein is deficient on the chromosome, that is, a 5-oxo-ETE receptor protein knockout mouse was obtained from a mouse gene library by a method such as PCR. Using the gene fragment, a gene encoding the 5-oxo-ETE receptor protein is screened, and the gene encoding the screened 5-oxo-ETE receptor protein is subcloned using a virus vector or the like, Specified by DNA sequencing. All or part of the gene encoding the 5-oxo-ETE receptor protein of this clone is replaced with a pMC1 neo gene cassette or the like, and the diphtheria toxin A fragment (DT-A) gene or herpes simplex virus A target vector is prepared by introducing a gene such as the thymidine kinase (HSV-tk) gene.
[0028]
The prepared targeting vector is linearized, introduced into ES cells by electroporation (electroporation) or the like, and homologous recombination is performed. Among the homologous recombinants, G418 or ganciclovia (GANC) is used. ES cells that have undergone homologous recombination with the antibiotics are selected. Further, it is preferable to confirm whether the selected ES cells are the desired recombinant cells by Southern blotting or the like. The confirmed ES cell clone is microinjected into a mouse blastocyst, and the blastocyst is returned to a foster parent mouse to produce a chimeric mouse. When this chimeric mouse is crossed with a wild-type mouse, a heterozygous mouse can be obtained, and by intercrossing the heterozygous mouse, the 5-oxo-ETE receptor protein knockout of the present invention can be obtained. A mouse can be made. In addition, as a method for confirming whether or not a 5-oxo-ETE receptor protein knockout mouse has occurred, for example, RNA is isolated from a mouse obtained by the above method and examined by Northern blotting or the like. There is a method of examining the expression of this mouse by Western blotting or the like.
[0029]
The transgenic mouse of the 5-oxo-ETE receptor protein is obtained by adding the above-mentioned cDNA encoding the 5-oxo-ETE receptor protein to a promoter such as chicken β-actin, mouse neurofilament, SV40, and rabbit β-globin, SV40, etc. The transgene is constructed by fusing the poly A or intron of the present invention, the transgene is microinjected into the pronucleus of a mouse fertilized egg, and the obtained oocytes are cultured, transplanted into an oviduct of a foster parent mouse, and then coated. Such transgenic mice can be created by breeding transplanted animals and selecting pups having the cDNA from pups born. In addition, selection of offspring mice having cDNA can be performed by extracting a crude DNA from the tail of the mouse or the like, using a dot hybridization method using a gene encoding the introduced 5-oxo-ETE receptor protein as a probe, or using a specific primer. It can be performed by the used PCR method or the like.
[0030]
The present invention also relates to agonists and antagonists of the 5-oxo-ETE receptor. As a method for screening a function promoting substance such as a 5-oxo-ETE receptor agonist or a function suppressing substance such as a 5-oxo-ETE receptor antagonist, 3 ′ of the 5-oxo-ETE receptor gene of the present invention is used. Those having the gene of the α subunit of Gil bound to the terminal portion were introduced, introduced into insect cells, and expressed as a 5-oxo-ETE receptor protein-Gilα fusion protein. GDP and [ ³⁵ In the presence of [S] -GTPγS, a test substance such as a candidate compound for various ligands was allowed to act, and was incorporated into the membrane fraction [ ³⁵ [S] GTPγS uptake can be used as an index to screen for agonists and antagonists to 5-oxo-ETE. In addition, as another embodiment of the above screening, a method using a test substance and a cell membrane expressing a 5-oxo-ETE receptor protein or a 5-oxo-ETE receptor protein, a method using 5-oxo-ETE receptor protein, A cell membrane expressing a body protein or a 5-oxo-ETE receptor protein, a method using 5-oxo-ETE and a test substance, and a cell expressing a 5-oxo-ETE receptor protein. And a test substance, and a method using a non-human animal such as a knockout mouse or transgenic mouse of a 5-oxo-ETE receptor protein and a test substance.
[0031]
As a screening method using a test substance and a cell membrane expressing the 5-oxo-ETE receptor protein or the 5-oxo-ETE receptor protein, the 5-oxo-ETE receptor protein or the 5-oxo-ETE receptor protein is expressed on the cell membrane surface. Contacting the test substance with the 5-oxo-ETE receptor protein that is present, and then contacting the test substance with the 5-oxo-ETE receptor protein or the 5-oxo-ETE receptor protein expressed on the cell membrane surface. And a method for measuring and evaluating the bonding state of The method using the 5-oxo-ETE receptor protein or the cell membrane expressing the 5-oxo-ETE receptor protein, 5-oxo-ETE, and a test substance includes 5-oxo-ETE. Receptor protein or 5-oxo-ETE receptor protein expressed on the cell membrane surface and 5-oxo-ETE are brought into contact with a test substance to express 5-oxo-ETE receptor protein or the cell membrane surface. A method for measuring and evaluating the binding state between 5-oxo-ETE receptor protein and 5-oxo-ETE can be mentioned.
[0032]
As a method using a test substance and a non-human animal such as a knockout mouse or transgenic mouse of the above-mentioned 5-oxo-ETE receptor protein, a 5-oxo-ETE receptor protein-expressing cell obtained from the non-human animal can be used. And the test substance are contacted in vitro in advance, and then the 5-oxo-ETE receptor protein-expressing cells are cultured in the presence of 5-oxo-ETE, and the 5-oxo-ETE receptor protein-expressing cells A method for measuring / evaluating the response to 5-oxo-ETE, the method comprising contacting 5-oxo-ETE-expressing cells obtained from the non-human animal with 5-oxo-ETE in vitro in advance, -Oxo-ETE receptor protein-expressing cells are cultured in the presence of the test substance, and the 5-oxo-E A method for measuring / evaluating a response to 5-oxo-ETE such as a state of binding to 5-oxo-ETE in an E receptor protein-expressing cell, or a method for administering a test substance to the non-human animal in advance, Is cultured in the presence of 5-oxo-ETE, and the response to 5-oxo-ETE in the 5-oxo-ETE receptor protein-expressing cells is measured and evaluated. Methods can be mentioned.
[0033]
A function-promoting substance such as an agonist of the 5-oxo-ETE receptor protein or a function-suppressing substance such as an antagonist of the 5-oxo-ETE receptor protein of the present invention, or a substance promoting or expressing the 5-oxo-ETE receptor protein An inhibitor or the like can be obtained by the above screening method. Specific examples of the 5-oxo-ETE receptor agonist of the present invention include 5-HETE, arachidonic acid, and the like. Examples of the 5-oxo-ETE receptor antagonist include eicosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid, and linolenic acid. And derivatives thereof. Specific examples of the derivatives of eicosapentaenoic acid include 5,8,11,14-Eicosatetranoic acid, 5,8,11-Eicosatrynoic acid, Eicosa-11Z, 14Z, 17Z-trienoic. acid, N-Acetyl-S-geranyylgeranyl-L-cysteine, and the like. Examples of the derivative of docosahexaenoic acid include esters and amides of docosahexaenoic acid.
[0034]
In addition, the pharmaceutical composition of the present invention, in particular, a pharmaceutical composition used to treat a patient in need of promoting the function of 5-oxo-ETE receptor protein or enhancing the expression of 5-oxo-ETE receptor protein, comprises 5-oxo- as an active ingredient. In addition to the ETE receptor protein and its partial peptide, it may contain a 5-oxo-ETE receptor protein function promoter such as the above-mentioned 5-HPETE agonist or a 5-oxo-ETE receptor protein expression promoter. The pharmaceutical composition used for treating a patient in need of suppressing the function or expression of 5-oxo-ETE receptor is not particularly limited as long as Of 5-oxo-ETE receptor proteins such as antagonists such as, 8,11,14-Eicosatrayanoic acid It is not particularly limited as long as it contains a function-suppressing substance or an expression-suppressing substance such as DNA or RNA that suppresses the expression of the DNA of the present invention. Add various compounding ingredients for preparation such as ordinary carriers, binders, stabilizers, excipients, diluents, pH buffers, disintegrants, solubilizers, solubilizers, isotonic agents, etc. be able to. These pharmaceutical compositions are useful for preventing or treating diseases requiring the promotion of 5-oxo-ETE receptor function or enhancement of expression, or those requiring suppression of the function or expression of 5-oxo-ETE receptor. Can be used. In these prophylactic or therapeutic methods, the above-mentioned pharmaceutical composition can be administered orally or parenterally at a dose appropriate for the sex, weight, and symptoms of the patient. That is, it can be orally administered in a commonly used dosage form, for example, a powder, granule, capsule, syrup, suspension or the like, or, for example, a solution, emulsion, suspension or the like. The preparation can be administered parenterally in the form of an injection, or can be administered intranasally in the form of a spray.
[0035]
As a method for diagnosing a disease associated with the function or expression of the 5-oxo-ETE receptor of the present invention, a DNA sequence encoding a 5-oxo-ETE receptor protein in a sample is obtained by using the 5-oxo-ETE receptor of the present invention. Any method may be used as long as it can be compared with the DNA sequence encoding the receptor protein, and the probe for diagnosing a disease associated with the function or expression of the 5-oxo-ETE receptor of the present invention includes the aforementioned The 5-oxo-ETE receptor of the present invention is not particularly limited as long as it comprises all or part of the antisense strand of DNA or RNA encoding the 5-oxo-ETE receptor protein of the present invention. As diagnostic agents for diseases related to the function or expression of, the above diagnostic probes and the antibodies specifically recognizing the 5-oxo-ETE receptor protein are included. It is not particularly limited as long as it is a shall.
[0036]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the scope of the present invention is not limited to these examples.
Example A (Materials and Methods)
[Extraction of putative GPCR gene from human genome data]
An open reading frame (ORF: Open Reading Frame) that could be a GPCR gene candidate was extracted from the sequence that had been analyzed (as of August 8, 2000) and analyzed by SOSUI. In addition, since the human genome data used this time contains the same undefined sequence redundantly, this data consists of about 4.5 G base pairs, while the whole human genome is about 3 G base pairs. . Approximately 335,000 ORFs consisting of DNA encoding 200 to 1500 amino acid residues are extracted from the human genome data, and ORFs that are thought to be derived from DNA repeating sequences or ORFs containing many uncertain amino acids are extracted from these ORFs. By removing ORFs containing the same amino acid in an amount of 20% or more, about 270,000 ORFs were obtained.
[0037]
[Homology (BLAST) search]
As a result of analyzing about 270,000 ORFs by SOSUI, 7,780 ORFs containing 6 to 8 transmembrane regions were obtained. The sequence of the obtained 7,780 ORFs of the GPCR candidate was referred to the database “nr” as of August 20, 2000 using BLAST, and the homology with the known GPCR was examined. 1714 having homology were obtained. Further, by removing duplicates from these sequences, 41 known olfactory receptor genes, 11 known taste receptor genes, and 128 known GPCR genes other than olfactory receptors and taste receptors were identified. We were able to. On the other hand, 281 new olfactory receptor genes, 11 new taste receptor genes, and 50 new GPCR genes other than olfactory receptors and taste receptors were identified.
[0038]
[Cloning of GPCR gene from human genome]
These novel GPCR genes were cloned from human genomic DNA (genomic cDNA) using the PCR method. As the conditions for the PCR amplification, a cycle of denaturation at 98 ° C. for 1 minute, denaturation at 98 ° C. for 30 seconds, annealing at 65 ° C. for 30 seconds, and extension reaction at 74 ° C. for 90 seconds was repeated 30 times. Lastly, an extension reaction was performed at 74 ° C. for 3 minutes, and thereafter, stocked at 4 ° C. As the primers, F; 5'-AAAGCGGCCGCATGTTGTGTCACCGTGGTGGGCC-3 '(SEQ ID NO: 11) and R; 5'-GGCGGCTCAGCGTACAGCCCATGCCCTGGGAGGAGCTCTCCT-3' (SEQ ID NO: 12) Was used.
[0039]
[Table 1]

[0040]
Furthermore, a fusion gene of the sequence excluding the stop codon and the Gi1α subunit gene (FEBS Lett. 197, 1-2, 305-310, 1986) was prepared and incorporated into the baculovirus vector pFASTBac. The virus having this fusion gene was infected into insect cells Sf9 (ATCC CRL-1711) to express a GPCR-Gilα fusion protein. The cells were collected, the membrane fraction was adjusted, and Western blotting was performed using an antibody against Gi1α prepared by the present inventors to confirm the expression of the fusion protein.
[0041]
[Screening of agonist active substance]
GDP and [ ³⁵ Various ligand candidate compounds were allowed to act in the presence of [S] -GTPγS, and incorporated into the membrane fraction [ ³⁵ An agonist for each GPCR was screened using the amount of [S] -GTPγS taken as an index. If the compound has agonist activity, the compound binds to the GPCR, and as a result, Gi1α is activated, ³⁵ S] -GTPγS uptake increases. About 1000 kinds of chemical substances were searched as various ligand candidate substances, and high-throughput screening was performed using a Packard liquid scintillation counter “Top Count” which can automatically measure the radioactivity of a 96-well plate.
[0042]
[Expression site of 5-oxo-ETE receptor]
Apart from the screening described above, RT-PCR was performed on each GPCR using mRNA prepared from various organs as a template, and the distribution of expression sites was examined. As primers, F; 5'-AAAGCGGCCGCATGTTGTGTCACCGTGGTGGGCC-3 '(SEQ ID NO: 11) and R; 5'-GGCGGCTCAGCGTACAGCCCATGCCCTGGGAGGAGCCTTCCT-3' (SEQ ID NO: 12) were used as the primers. After denaturation, the cycle of denaturation at 98 ° C. for 30 seconds, annealing at 65 ° C. for 30 seconds, and extension reaction at 74 ° C. for 90 seconds was repeated 30 times, and finally extension reaction was performed at 74 ° C. for 3 minutes, followed by 4 minutes Stocked at ° C. Further, a PCR reaction solution having the following composition was used.
[0043]
[Table 2]

[0044]
Example B (Results)
[Agonist screening]
As a result of the above screening, 5-oxo-ETE [Chemical Formula 1], 5-HPETE [Chemical Formula 2], 5-HETE [Chemical Formula 3], arachidonic acid, and the like are used as agonists for a specific fusion protein named TH24-Gi. It was found to have activity (FIG. 1). Approximate EC for each compound ₅₀ Is arachidonic acid; about 1 × 10 ^-6 M, 5-HETE; about 1 × 10 ^-6 M, 5-HPETE; about 3 × 10 ^-8 M, 5-oxo-ETE; about 4 × 10 ^-9 M, the receptor having the amino acid sequence of TH24 was identified as a 5-oxo-ETE receptor.
[0045]
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[0046]
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[0047]
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[0048]
It was confirmed that when these substances were allowed to act on the TH24-Gi fusion protein, the affinity of the Gi1α portion for GDP was reduced. The results using 5-HPETE are shown in FIG. 2 along with a control (-) ligand in the absence of ligand. This supports that a substance such as 5-HPETE has an agonist activity for a 5-oxo-ETE receptor.
[0049]
[Screening for antagonists]
Further, 5-oxo-ETE was used to screen for antagonists to the 5-oxo-ETE receptor. As a result, a high concentration (about 1 × 10 ^-5 M or more), eicosapentaenoic acid having a longer carbon chain than arachidonic acid and its derivative eicosatrienoic acid (5,8,11-Eicosatrinoic acid), docosahexaenoic acid, etc., and also α-linolenic acid (linolenic acid) It was found to work as an antagonist (FIG. 3). This is a reasonable result considering that these fatty acids have a structure similar to arachidonic acid, but do not have oxygen at the 5-position common to 5-HPETE, 5-oxo-ETE, and 5-HETE. In the future, compounds in which oxygen peroxide or carbonyl oxygen is introduced at the 5-position can be expected to function as an extremely useful antagonist for 5-oxo-ETE receptor.
[0050]
[Expression distribution of 5-oxo-ETE receptor]
As a result of confirming the expression distribution of the 5-oxo-ETE receptor by RT-PCR, it was found that the 5-oxo-ETE receptor was widely expressed throughout the body, but was relatively strongly expressed in the liver and colon (FIG. 4). RT-PCR results indicated that the 5-oxo-ETE receptor was expressed systemically, but probably due to its activity and similarity to other active lipid properties, lymphocytes, especially lymphocytes, It is presumed that it is expressed and functions in neutrophils. While our preliminary experiments support this, the possibility that organ cells themselves express the 5-oxo-ETE receptor should still be considered.
[0051]
[Summary]
From the above, the existence of a receptor for 5-HPETE and 5-oxo-ETE has been suggested as a possibility. It is very likely to be an in vivo receptor for HPETE. [ ³⁵ EC measured from [S] -GTPγS binding activity ₅₀ Is the EC of the physiological activity of 5-oxo-ETE or 5-HPETE which has been reported so far. ₅₀ Can be cited as one of the reasons.
[0052]
【The invention's effect】
The 5-oxo-ETE receptor newly identified by the present invention is considered to regulate the neutrophil migration activity of 5-oxo-ETE and 5-HPETE, and thus 5-oxo-ETE and 5-OTE Agonists of 5-oxo-ETE receptor, such as HPETE and its agonists, and agonists of 5-oxo-ETE receptor, such as antagonists, activate and inactivate the migration of various immune system cells. Therefore, it may mainly activate and inactivate the entire immune system, and is likely to be used as a therapeutic agent for tumors in addition to inflammation and allergies. Potential for new applications is also expected.
[0053]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG.
It is a figure which shows the screening result of the agonist of the 5-oxo-ETE receptor of this invention.
FIG. 2
It is a figure which shows the screening result of the agonist of the 5-oxo-ETE receptor of this invention.
FIG. 3
It is a figure which shows the screening result of the antagonist of the 5-oxo-ETE receptor of this invention.
FIG. 4
It is a figure which shows the result of RT-PCR about the expression distribution of the 5-oxo-ETE receptor of this invention.

Claims

DNA encoding the following 5-oxo-ETE receptor protein (a) or (b).
(A) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (b) a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2

DNA encoding a 5-oxo-ETE receptor protein comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a sequence complementary thereto, and a part or all of these sequences.

A DNA which hybridizes with the DNA of claim 2 under stringent conditions and encodes a 5-oxo-ETE receptor protein.

A 5-oxo-ETE receptor protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.

A 5-oxo-ETE receptor protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, wherein one or several amino acids are deleted, substituted, or added.

A fusion protein in which the 5-oxo-ETE receptor protein according to claim 4 or 5 is linked to a marker protein and / or a peptide tag.

An anti-5-oxo-ETE receptor antibody that specifically binds to the 5-oxo-ETE receptor protein according to claim 4 or 5.

A DNA comprising an expression system capable of producing the 5-oxo-ETE receptor protein according to claim 4 or 5.

A host cell comprising an expression system capable of expressing the 5-oxo-ETE receptor protein according to claim 4 or 5.

A non-human animal in which the function of the gene encoding the 5-oxo-ETE receptor protein according to claim 4 or 5 is defective on the chromosome or the gene is overexpressed.

A 5-oxo-ETE receptor comprising using the 5-oxo-ETE receptor protein according to claim 4 or 5, or a cell membrane expressing the 5-oxo-ETE receptor protein, and a test substance. A method for screening a substance promoting or suppressing body function or a substance promoting or suppressing the expression of 5-oxo-ETE receptor.

A method comprising using a 5-oxo-ETE receptor protein according to claim 4 or 5, or a cell membrane expressing the 5-oxo-ETE receptor protein, 5-oxo-ETE, and a test substance. A method for screening a 5-oxo-ETE receptor function promoting or suppressing substance or a 5-oxo-ETE receptor expression promoting or suppressing substance.

A substance that promotes or suppresses the function of a 5-oxo-ETE receptor or a G protein, comprising using a cell that expresses the 5-oxo-ETE receptor protein according to claim 4 or 5, and a test substance. A method for screening a substance that promotes or suppresses the expression of a coupled receptor.

A screening for a 5-oxo-ETE receptor function promoting or suppressing substance or a 5-oxo-ETE receptor expression promoting or suppressing substance, comprising using the non-human animal according to claim 10 and a test substance. Method.

The method for screening a 5-oxo-ETE receptor function promoting or suppressing substance or a 5-oxo-ETE receptor expression promoting or suppressing substance according to claim 14, wherein the non-human animal is a mouse.

Agonists of the 5-oxo-ETE receptor.

The agonist according to claim 16, which is 5-HETE or arachidonic acid.

An antagonist of the 5-oxo-ETE receptor.

19. The antagonist according to claim 18, which is eicosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid, linolenic acid or a derivative thereof.

A pharmaceutical composition used for treating a patient in need of promoting the function of 5-oxo-ETE receptor or enhancing the expression thereof, wherein the 5-oxo-ETE receptor according to claim 4 or 5 is used as an active ingredient. A pharmaceutical composition comprising a protein, the agonist according to claim 16 or 17, or the DNA according to any one of claims 1 to 3.

A pharmaceutical composition used for treating a patient in need of suppression of the function or expression of 5-oxo-ETE receptor, wherein the active ingredient is the antagonist according to claim 18 or 19, or the pharmaceutical composition according to claim 1. 4. A pharmaceutical composition comprising DNA or RNA that suppresses the expression of the DNA according to any one of 3.

A DNA sequence encoding a 5-oxo-ETE receptor protein in a sample is compared with a DNA sequence encoding a 5-oxo-ETE receptor protein according to claim 4 or 5. A method for diagnosing a disease associated with the function or expression of an ETE receptor.

A diagnostic method for a disease associated with the function or expression of a 5-oxo-ETE receptor comprising all or a part of an antisense strand of DNA or RNA encoding the 5-oxo-ETE receptor protein according to claim 4 or 5. probe.

A diagnostic agent for a disease associated with the function or expression of a 5-oxo-ETE receptor, comprising the diagnostic probe according to claim 23 and / or the antibody according to claim 7.