JP2004049043A - Ｇｐｃｒ遺伝子の単離方法及び新規ｇｐｃｒ遺伝子 - Google Patents
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Abstract
【課題】Ｇタンパク質共役型受容体遺伝子を高効率かつ簡便に単離する方法を提供し、新規なＧタンパク質共役型受容体遺伝子を単離すること。
【解決手段】Ｇタンパク質共役型受容体遺伝子を単離する方法であって、以下のステップ：
（ａ） 既知のＧタンパク質共役型受容体遺伝子若しくはその周辺領域の配列情報、又は推定したＧタンパク質共役型受容体遺伝子の配列情報を基にプライマーを設計するステップ、
（ｂ） 上記設計したプライマーを用いて、該Ｇタンパク質共役型受容体が発現する組織以外の組織に由来するｃＤＮＡライブラリーを鋳型とした増幅反応を行って、得られた増幅断片をクローニングするステップ、及び
（ｃ） 上記クローニングした遺伝子がＧタンパク質共役型受容体としての機能を有するかどうかを確認するステップ、
を含むことを特徴とするＧタンパク質共役型受容体遺伝子の単離方法。
【選択図】 なし
【解決手段】Ｇタンパク質共役型受容体遺伝子を単離する方法であって、以下のステップ：
（ａ） 既知のＧタンパク質共役型受容体遺伝子若しくはその周辺領域の配列情報、又は推定したＧタンパク質共役型受容体遺伝子の配列情報を基にプライマーを設計するステップ、
（ｂ） 上記設計したプライマーを用いて、該Ｇタンパク質共役型受容体が発現する組織以外の組織に由来するｃＤＮＡライブラリーを鋳型とした増幅反応を行って、得られた増幅断片をクローニングするステップ、及び
（ｃ） 上記クローニングした遺伝子がＧタンパク質共役型受容体としての機能を有するかどうかを確認するステップ、
を含むことを特徴とするＧタンパク質共役型受容体遺伝子の単離方法。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＧタンパク質共役型受容体遺伝子の単離方法及び該単離方法により単離された新規Ｇタンパク質共役型受容体遺伝子に関する。また本発明は、該Ｇタンパク質共役型受容体遺伝子を含有するベクター、該ベクターを含む形質転換体、並びに該形質転換体を用いたＧタンパク質共役型受容体タンパク質の製造方法に関する。さらに本発明は、上記Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質に対するリガンド及び該リガンドの決定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生命における遺伝子は、ＤＮＡとして知られる有機化学物質上の４種類の塩基によりコードされた情報である。ＤＮＡ上の遺伝子塩基配列は、各臓器や細胞により特徴的にＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳され、臓器や細胞固有にタンパク質が発現する。このような遺伝情報の流れにより、生物は体を作り、変化する外界に対処しながら生命活動を営み、子孫を作り、やがて死に至る。
【０００３】
近年、ＤＮＡ塩基配列決定技術の発展などより、これらの遺伝情報が担われ、そして全ての遺伝子情報を含むとされているゲノムのＤＮＡ塩基配列や実際に発現している遺伝子の塩基配列データが大量かつ急速に決定されている。その決定された情報を元に遺伝子の医薬品等への利用がなされてきている。
【０００４】
従来、遺伝子を単離、取得し、得られた遺伝子をもとにタンパク質を取得する場合、遺伝子が発現している特定の臓器、細胞又は細胞から得られたゲノムＤＮＡからの遺伝子の取得が、遺伝子を単離・取得する有効な手法となっている。
【０００５】
一方、ヒトゲノムプロジェクトによりヒトの全遺伝子の解読は進んだものの、ゲノム情報のみではタンパク質の構造を解析し、その機能を解析することは極めて困難である。なぜなら、ゲノム上にコードされた遺伝子は、将来、タンパク質をコードしない非翻訳領域のなかに翻訳領域が、あたかも海の上に浮かぶ島、環礁のように存在することが多く、この非翻訳領域にしても、この部分にタンパク質をコードする情報以外にさまざまなシグナルを有することが多いからである。従って、ゲノムが現在のように解読できたとしても、さらにここから、タンパク質をコードする暗号を読み解かなければ今後の研究に使うことは非常に困難である。
【０００６】
しかしながら、Ｇタンパク質共役型受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＧＰＣＲ）の多くはこの非翻訳領域であるイントロンを含まないイントロンレスであることが多い。現在、この特徴を利用して、ヒトゲノムプロジェクトで得られた情報から直接ＧＰＣＲと思われる配列を検索しようとする試みが行われ、成果を上げつつある。ＧＰＣＲは、イントロンレスである他に９００〜１２００塩基前後と比較的短い遺伝子から構成されるため、ＧＰＣＲ遺伝子の単離において有利である。さらに、このＧＰＣＲは細胞上に発現するため、細胞膜上に固定される必要があり、細胞膜を７回貫通する構造をもっている。この膜貫通部位は疎水性のアミノ酸から構成されており、ゲノム情報から得られた塩基配列をもとに、アミノ酸の一次構造を推測し、このアミノ酸配列中に６〜８箇所の疎水部分を持つ塩基配列をＧＰＣＲと考えることができる。このような研究を支援するために東京農工大学からＳＯＳＵｌと銘々されたサイトが存在する。
【０００７】
このようにＧＰＣＲ研究ではデータベースとコンピュータを用いた「ドライ」な研究方法が多数導入されている。また、新しい受容体発見が将来の創薬の原点となることから、製薬会社を中心にＧＰＣＲのクローニングとそのリガンドスクリーニングが行われている。
【０００８】
このようにして研究の効率化が行われている昨今でも、ＧＰＣＲのクローニング法は従来法と変わるところがあまりない。ヒトゲノムプロジェクトによってヒトのゲノム情報は増えたが、ターゲットがヒトであるがゆえに、臓器の入手には困難な面が多い。主要な比較的大きい臓器に発現するＧＰＣＲであれば、市販されているゲノムＤＮＡやＲＮＡを購入して実験に用いれば大きな問題は起こらない。しかし、小さい臓器の場合は、クローニングに必要な量のサンプルを入手することが困難である。例えば、味覚受容体のような場合、味覚受容体を有する味蕾、ひいてはヒトの舌組織を得なければ、ゲノムＤＮＡを用いる以外に研究の伸展は望めない。従って、入手困難な臓器に存在するＧＰＣＲ遺伝子を高効率かつ簡便に単離する方法が望まれていた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体遺伝子を高効率かつ簡便に単離する方法を提供し、新規なＧタンパク質共役型受容体遺伝子を単離することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、単離しようとするＧタンパク質共役型受容体が通常発現する組織以外の組織を遺伝子取得源として利用することにより、現在報告されている大部分の味覚受容体及び新規な味覚受容体ＴＨＴＲ９を含む数種のＧタンパク質共役型受容体を単離することに成功し、この新規なＴＨＴＲ９タンパク質を用いてＴＨＴＲ９に対するリガンドを決定することができるという知見を得て、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体遺伝子の単離方法であって、以下のステップ：
（ａ） 既知のＧタンパク質共役型受容体遺伝子若しくはその周辺領域の配列情報、又は推定したＧタンパク質共役型受容体遺伝子の配列情報を基にプライマーを設計するステップ、
（ｂ） 上記設計したプライマーを用いて、Ｇタンパク質共役型受容体が発現する組織以外の組織由来のｃＤＮＡライブラリーを鋳型とした増幅反応を行って、得られた増幅断片をクローニングするステップ、及び
（ｃ） 上記クローニングした遺伝子がＧタンパク質共役型受容体としての機能を有するかどうかを確認するステップ、
を含む上記単離方法である。
【００１２】
ここで、Ｇタンパク質共役型受容体としては、舌組織で発現するもの、例えば味覚受容体を例示することができる。また上記Ｇタンパク質共役型受容体が発現する組織以外の組織としては、例えば脳組織が挙げられる。
【００１３】
また本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質である。
（ａ） 配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ） 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、Ｇタンパク質共役型受容体として機能するタンパク質
ここで上記タンパク質は、ヒト由来のものであることが好ましい。また上記タンパク質は、味覚受容体である。
【００１４】
さらに本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である。（ａ） 配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ） 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、Ｇタンパク質共役型受容体として機能するタンパク質
【００１５】
上記遺伝子としては、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含むものが挙げられる。
（ａ） 配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ） 配列番号１に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｇタンパク質共役型受容体として機能するタンパク質をコードするＤＮＡ
また本発明は、上記遺伝子を含有する組換えベクターである。さらに本発明は、上記ベクターを含む形質転換体である。
【００１６】
またさらに本発明は、上記形質転換体を培養し、得られる培養物からＧタンパク質共役型受容体タンパク質を採取することを特徴とするＧタンパク質共役型受容体タンパク質の製造方法である。
【００１７】
本発明はまた、上記タンパク質又はその部分ペプチドと試験化合物とを接触させたときの結合量又は細胞刺激活性が、該タンパク質若しくは部分ペプチドと接触させていない場合又はリガンドではない物質と接触させた場合と比較して１２０％以上となる、請求項５〜７のいずれか１項に記載のタンパク質に対するリガンドである。
【００１８】
また本発明は、上記リガンドを含有することを特徴とする食品用組成物である。
さらに本発明は、上記タンパク質又はその部分ペプチドと試験化合物とを接触させ、それらの結合量又は細胞刺激活性を測定することを特徴とする、該タンパク質に対するリガンドの決定方法である。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．Ｇタンパク質共役型受容体の単離方法
本発明のＧタンパク質共役型受容体（以下、「ＧＰＣＲ」ともいう）の単離方法は、通常は大量に入手することができない組織（例えば味蕾細胞を有する舌組織）において発現するＧＰＣＲを、その組織以外の組織から単離することを特徴とするものである。
【００２０】
Ｇタンパク質共役型受容体とは、三量体型Ｇタンパク質と共役して細胞内に外界刺激を伝達する受容体であり、種々のホルモン、オータコイド、神経伝達物質などの受容体や、視覚、嗅覚、味覚などの感覚器の受容体などが含まれることが知られている。構造上の特徴は、細胞膜を７回貫通し、アミノ末端が細胞外にカルボキシル末端が細胞内に存在することである。従って、Ｇタンパク質共役型受容体はＩ〜ＶＩＩの７個の膜貫通部位を有するものであり、この受容体の多くは、Ｎ末端から第ＩＩＩ膜貫通部位にかけてリガンド結合領域を、そして第Ｖと第ＶＩ膜貫通部位の間にＧタンパク質との共役特異性決定領域を有すると考えられている。ＧＰＣＲは、多様な生理現象の調節と関連している場合が多いので、このＧＰＣＲを単離し、詳細に機能研究することが必要とされている。
【００２１】
ＧＰＣＲの研究においては、例えばＧＰＣＲが発現している組織の入手が困難な場合も多い。例えばＧＰＣＲの１つである味覚受容体は、通常舌で発現しているが、ヒト舌組織は入手が非常に困難であり、また味覚受容体が発現すると考えられる味蕾細胞は舌組織においても非常にわずかにしか存在しない。従って、舌を味覚受容体の遺伝子取得源としては使用できない。そこで本発明者は、容易に入手可能な組織を遺伝子取得源として選択し、ＧＰＣＲを単離する方法を試みた。
以下に、本発明のＧタンパク質共役型受容体の単離方法に関して、具体的に説明する。
【００２２】
（１）プライマー設計
本発明のＧＰＣＲ単離方法においては、既に得られている遺伝子情報やその周辺情報、又は推定ＧＰＣＲの配列情報に基づいてプライマーを設計する。
既に得られている遺伝子の情報やその周辺領域の情報を利用する場合には、例えば既知のＧＰＣＲファミリーにおいて保存されている配列、他の種に由来するＧＰＣＲの配列などを基にしてプライマーを設計することができる。例えば、ＧＰＣＲの機能を有するタンパク質間で保存されている領域の配列としては、第ＶＩ膜貫通部位からＣ末端側にある保存領域の配列が挙げられ、そのようなアミノ酸配列を基に縮合プライマー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒ）を設計することが好ましい。
【００２３】
また、ゲノム情報からＧＰＣＲを推定する場合には、公開されているゲノムＤＮＡ情報を利用して、ＧＰＣＲに特徴的な配列からＧＰＣＲを推定し、その配列を基にプライマーを設計することができる。ＧＰＣＲに特徴的な配列とは、限定するものではないが、例えば塩基配列中のＡＴＧ（メチオニンをコードする塩基配列）から約９００〜１２００塩基中に終止コドンが存在せず、さらにその塩基配列をアミノ酸に変換した場合に６〜８箇所の疎水性のアミノ酸が集まった細胞膜貫通部位があることなどが挙げられる。従って、ゲノムＤＮＡ情報から、例えばコンピュータを用いて、ＡＴＧから約８００〜１２００塩基中に終止コドンが存在しない配列を検索することにより、ＧＰＣＲと推定される配列を絞り込むことができる。また、膜貫通部位の疎水性を利用してＧＰＣＲを推定する場合には、アミノ酸配列をヒドロパシーインデックス（疎水性指標）に変換し、ヒドロパシープロットを作成する。ヒドロパシープロットを作成することにより、アミノ酸配列情報から疎水性領域を推測することができる。すなわち、膜貫通部位は疎水性のアミノ酸残基が長く連続して存在する疎水性領域であり、その疎水性領域が５〜７個程度連続して配置されている場合には、それらを含む配列がＧＰＣＲをコードしていると推定できる。
【００２４】
ヒドロパシーインデックスの計算方法及びヒドロパシープロットの作成方法は当技術分野で公知である。具体的に説明すると、各アミノ酸に対し、下記表１に示すヒドロパシーインデックスを割り当て、ｉ番目のアミノ酸残基の前後３残基（すなわちｉ−３からｉ＋３まで）のヒドロパシーインデックスの平均を求め、その値をｉ番目のアミノ酸残基の疎水性とする。
【００２５】
【表１】
【００２６】
各アミノ酸残基の疎水性が−０．４以上の場合には、その残基は疎水性領域を作る可能性があるといえる。十分に長い（例えば約２２〜２４残基の）疎水性領域が存在する場合に、その部分は膜貫通部分と考えることができる。
上述のようにしてヒドロパシーインデックスを計算し、それをグラフにしたものがヒドロパシープロットである。ヒドロパシープロットを作成すると、ヒドロパシーインデックス、すなわち疎水性の高い領域が視覚的に理解できる。従って、膜貫通部位を推測する場合にはヒドロパシープロットを作成することが好ましい。ヒドロパシープロットから膜貫通部位を９０％以上の精度で推測する方法として、ＫＫＤ（Ｋｌｅｉｎ−Ｋａｎｅｈｉｓａ−ＤｅＬｉｓｉ）法が知られている（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ， ２８； ８１５（３）： ４６８−７６参照）。この方法は、判別関数を利用してアミノ酸の疎水性の平均値を変量として計算することによって、膜貫通部位を推測する方法である。また、膜貫通部位を推測するためのプログラムも知られており、例えば、ＳＯＳＵＩ（ｈｔｔｐ：／／ｓｏｓｕｉ．ｐｒｏｔｅｏｍｅ．ｂｉｏ．ｔｕａｔ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉｍｅｎｕ０．ｈｔｍｌより入手可能）、Ｔｈｅ Ｇｅｎｅ ＩｎｓｐｅｃｔｏｒＴＭ（ＨＵＬＩＮＫＳ社）などが一般的に入手可能である。このような方法及びプログラムを利用することによって、７箇所の膜貫通部位を有するＧＰＣＲをより正確に推定することが可能である。
【００２７】
上述のようにして推定されたＧＰＣＲの配列を基にプライマーを設計する場合には、該配列の５’末端から約２０〜３０塩基及び３’の終止コドンを含む上流側の約２０〜３０塩基を選択し、プライマーを設計することが好ましい。
プライマーは、約２０〜３０塩基長、好ましくは約１９〜２６塩基長とし、増幅される断片が約５００〜１５００塩基、好ましくは約８８０〜１０００塩基となるように設計する。
【００２８】
例えば、本発明者は、味覚受容体の候補と考えられるＴＨＴＲ９を基に以下に示すプライマーを設計した。
フォーワードプライマー：ａｔｇａｔａａｃｔｔ ｔｔｃｔａｃｃｃａｔ ｃ（配列番号３）
リバースプライマー：ｃｔａｔｇｇａｇａｔ ｇａａｇｔｃｔｔｃｔ ｃｔｃｃ（配列番号４）
また、既知の味覚受容体であるＴＨＴＲ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿０６９７９０）、ＴＨＴＲ３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿０９０４２４）、ＴＨＴＲ５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿０６９６２６）、Ｔ２Ｒ１、Ｔ２Ｒ３、Ｔ２Ｒ４、Ｔ２Ｒ５、Ｔ２Ｒ７、Ｔ２Ｒ８、Ｔ２Ｒ９、Ｔ２Ｒ１０、Ｔ２Ｒ１３、Ｔ２Ｒ１４、Ｔ２Ｒ１６、ＫＨＲ１、及びＫＨＲ３を基に以下に示すプライマーを設計した。以下に示すプライマーの名称は、味覚受容体名／Ｆ又はＲ（Ｆはフォーワード、Ｒはリバースを表す）で示している。
【００２９】
上述のように設計したプライマーの合成法は、当技術分野で周知である。例えば、ホスホアミダイト法などの一般的なオリゴヌクレオチド合成法を用いることができる。
【００３０】
（２）増幅反応
続いて、上記設計したプライマーを用いて、単離しようとするＧタンパク質共役型受容体が通常発現する組織以外の組織に由来するｃＤＮＡライブラリー又はｍＲＮＡを鋳型として増幅反応を行う。該組織としては、大量に入手可能な組織であることが好ましく、例えば、脳、肺、心臓、胃、膵臓、腎臓、胎盤などが挙げられる。増幅反応としては、限定するものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などが挙げられる。本発明において増幅反応は、ＰＣＲが好ましい。
【００３１】
（２−１）鋳型ＤＮＡの調製
上記組織からのｍＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡライブラリーの作製は常法に従って行うことができる。例えば、ｍＲＮＡの調製は、ヒト組織から、グアニジウムチオシアネート−トリフルオロ酢酸セシウム法などにより全ＲＮＡを抽出した後、オリゴｄＴ−セルロースやポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法により、あるいはバッチ法によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得ることができる。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡをさらに分画してもよい。
【００３２】
このようにして得られたｍＲＮＡを鋳型として、ランダムプライマーと共に逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、該一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成する。次に、得られた二本鎖ｃＤＮＡを適当なクローニングベクターに組み込んで組換えベクターを作製する。そしてこの組換えベクターを用いて大腸菌等を形質転換し、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性等を指標として形質転換体を選択することにより、ｃＤＮＡのライブラリーを得ることができる。
【００３３】
また、上記組織由来のｃＤＮＡライブラリーは市販されており、例えば、ヒト脳組織としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ Ｐｒｅｍａｄｅ ｃＤＮＡライブラリー（ヒト脳：カタログ番号１０４１８−０１０）、株式会社エムエステクノシステムズ社製ヒトｃＤＮＡライブラリー（ヒト脳：カタログ番号３８３５６）などを利用することができる。
【００３４】
あるいは、上記組織から得られたｍＲＮＡを鋳型として、ランダムプライマーと共に逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作製することもできる。Ｐｏｌｙ Ａ＋ ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は市販されており、例えばヒト脳組織としては、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ Ｐｏｌｙ Ａ＋ ＲＮＡ（カタログ番号６５１６−１）などが挙げられる。逆転写酵素としては、例えばＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素を利用可能である。
【００３５】
（２−２）増幅
上記のようにして得られる形質転換体又はｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを有する株を選択するには、上記（１）に記載のようにして設計したプライマー、例えば、配列番号３〜３６に示すプライマーを合成し、これを用いて増幅反応を行い、得られた断片をプローブとして、ｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法、あるいはλファージ（λｇｔ１１等）を用いた場合は、λｇｔ１１インサート増幅用のプライマーを用いて増幅反応を行う方法を採用することができる。但し、本発明においてはこれらのプライマーに限定されるものではない。
【００３６】
このようにして得られたＤＮＡ増幅断片を、３２Ｐ、３５Ｓ又はビオチン等で標識してプローブとし、これを形質転換体のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られたポジティブ株を検索することによりスクリーニングすることができる。
【００３７】
次に、得られたクローンから全長のｃＤＮＡをクローニングする。ｃＤＮＡのクローニングには、例えばＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法が用いられる。ＲＡＣＥ法とは、ｃＤＮＡの５’又は３’欠失部位をＰＣＲにより迅速に回収する方法である。なお、ＲＡＣＥ法は、市販のキット（ＭａｒａｔｈｏｎＴＭ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社））を用いて行うこともできる。あるいは、サブクローニング用のキットとしては、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖｅｒｓｉｏｎも利用可能である。上記スクリーニングにおいて得られたｃＤＮＡの単離クローンについて、増幅産物をテンプレートにしてｃＤＮＡの塩基配列を決定する。
【００３８】
塩基配列の決定はマキサム−ギルバートの化学修飾法、又はＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＡＢＩ３７３シークエンサー等）を用いて配列決定が行われる。
【００３９】
（３）ＧＰＣＲとしての機能確認
続いて、上述のようにしてクローニングされた遺伝子がＧＰＣＲとしての機能を有するかどうかを確認する。ＧＰＣＲ機能の確認は当技術分野で公知であり、そのいずれの手法に従って確認してもよい。例えば、後述する「３．ＴＨＴＲ９タンパク質に対するリガンド」の項に記載のように、ＧＰＣＲと結合することにより生じた細胞刺激活性（例えばアラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内カルシウム遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、ｐＨの低下などを促進する活性又は抑制する活性）を測定することにより、ＧＰＣＲの機能を確認することができる。ＧＰＣＲは、通常、アラキドン酸、アセチルコリン、細胞内カルシウム、細胞内ｃＡＭＰ、細胞内ｃＧＭＰ、イノシトールリン酸などのいずれかの細胞刺激活性物質を調節することが知られている（細胞の分子生物学、第３版、Ａｌｂｅｒｔｓ， Ｂ．ら著、株式会社教育社発行、１９９５年、７３４〜７７１頁参照）。従って、既知のＧタンパク質をＧＰＣＲと共役させることにより生じる細胞刺激活性の変化を利用して、ＧＰＣＲの機能を確認することができる。
【００４０】
具体的な手法の１つとして、Ｇタンパク質であるＧ１６を利用する手法を例示する。Ｇ１６は、非特異的にＧＰＣＲと共役して細胞内カルシウムを生じることが知られている。Ｇ１６の塩基配列を配列番号３７に、アミノ酸配列を配列番号３８に示す。
【００４１】
最初に、上記Ｇ１６を、上記（２）でクローニングされたＧＰＣＲ遺伝子の下流に融合した状態で配置するようにベクターを構築する。「融合した状態」とは、Ｇ１６がその終止配列を含有せずに、その直下にＧＰＣＲ遺伝子が配置されることを指す。該ベクターは、哺乳動物において高発現するものが好ましく、例えばｐＥＦ−ＢＯＳベクター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ， Ｓ． ａｎｄ Ｎａｇａｔａ， Ｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９０， １８， １７： ５３２２）が挙げられる。
【００４２】
まず、次の２段階の方法でＧ１６とＧＰＣＲを融合する。はじめに、ＧＰＣＲとＧ１６をＰＣＲ法を用いて増幅する。このとき、Ｇ１６の増幅においては、フォーワードプライマーとして、ＧＰＣＲの３’側から終止コドンを除いてアミノ酸８残基（２４塩基長）の部分とＧ１６の５’側のアミノ酸６残基（１８塩基）の部分の合計４２塩基の長さを持つプライマーを使用する。このように設計したプライマーによって増幅されたＧ１６は、ＧＰＣＲの３’側の構造を持つＰＣＲ産物となる。次にこの構造を持つＧ１６とＧＰＣＲとを、プライマーを用いないで４回程度ＰＣＲを施行する。プライマーを用いないでＰＣＲを行うことによって、ＧＰＣＲの３’末端側とＧ１６の５’末端側がアニーリングし、融合したものを得ることができる。融合した部分は二本鎖になっているため、続いて、ポリメラーゼによってこの部分から増幅反応が起こる。従って、融合の後、ＧＰＣＲの５’側の塩基配列を基に設計したフォーワードプライマーとＧ１６の３’側の塩基配列を基に設計したリバースプライマーを用いてＰＣＲを施行することにより、ＧＰＣＲの下流にＧ１６が融合した塩基配列が増幅されることとなる。ここでフォーワードプライマーに制限酵素Ｓａｌ Ｉサイト、リバースプライマーにＳｐｅ Ｉサイトを付加しておくことにより、ベクターのマルチクローニングサイトをＳａｉ Ｉ及びＳｐｅ Ｉで処理することによって、上記ＧＰＣＲ−Ｇ１６融合ＰＣＲ産物が挿入されやすくなる。
【００４３】
このＧＰＣＲ−Ｇ１６融合ＰＣＲ産物をベクター（例えばｐＥＦ−ＢＯＳ）に挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。ＧＰＣＲは、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、上記ベクターには、プロモーター、Ｇ１６−ＧＰＣＲのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｇ４１８（ジェネチシン）に耐性である）等が挙げられる。
【００４４】
続いて、ＧＰＣＲ−Ｇ１６を組み込んだ発現ベクターを、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などの哺乳動物細胞系に導入する。導入する方法は、限定するものではないが、例えばリポフェクション、遺伝子銃、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００４５】
次に、上記ベクターに含まれる選択マーカーを用いて、発現ベクターが導入された細胞のみを培養する。動物細胞を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で７〜１４日行う。ＣＨＯ細胞を培養する場合には、ＨａｍＦ−１２培地を用いて、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１０〜１４日間培養する。
【００４６】
培養した細胞より調製したＲＮＡを鋳型として、ランダムプライマーと逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを調製する。このｃＤＮＡを鋳型として、上記（１）で設計したプライマーを用いて増幅反応を行い、増幅産物のバンドが電気泳動ゲル上に出現かどうかを調べる。バンドが観察された場合は、ＧＰＣＲが細胞に導入されたものであると判断できる。
【００４７】
次に、Ｇ１６−ＧＰＣＲが導入された細胞の細胞内カルシウム濃度を測定する。細胞内カルシウム濃度の測定は、当技術分野で公知であり、例えばＦｕｒａ−２を用いた蛍光法などが挙げられる。その他、細胞内カルシウムの上昇に伴って細胞内の産生・放出が変化するプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を測定することによって間接的に細胞内カルシウム濃度を測定することができる。この産生が変化したＰＧＥ２は、細胞外に放出されるため、リガンド刺激の４時間後の培養上清を回収し、該上清中のＰＧＥ２濃度を測定する。ＰＧＥ２の測定には、例えばＣａｙｍａｎ社製のＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２
ＥＩＡ測定キットを用いることができる。
Ｇ１６−ＧＰＣＲが導入された細胞の細胞内カルシウム濃度が非導入細胞の細胞内カルシウム濃度と比較して増大している場合には、導入したＧＰＣＲはＧＰＣＲとしての機能を有しているといえる。
【００４８】
（４）種々の組織からのＧＰＣＲの単離
本発明者は、単離しようとするＧタンパク質共役型受容体（味覚受容体）の遺伝子は、通常発現する組織においても発現していると考えた。そこで、舌以外の組織を遺伝子供与源としてＧＰＣＲを単離するために、既知のＧＰＣＲ（味覚受容体：ＴＨＴＲ１、ＴＨＴＲ３、ＴＨＴＲ５；Ｔ２Ｒ１、Ｔ２Ｒ３、Ｔ２Ｒ４、Ｔ２Ｒ５、Ｔ２Ｒ７、Ｔ２Ｒ８、Ｔ２Ｒ９、Ｔ２Ｒ１０、Ｔ２Ｒ１３、Ｔ２Ｒ１４、Ｔ２Ｒ１６）を用いて上記味覚受容体の発現確認を行った（下記実施例１）。その結果、試験した１４種のＧＰＣＲのうち、ＴＨＴＲ１（図３）以外の１３種は脳組織において発現していることが認められた（図３、４、７及び８を参照）。またヒト心臓由来のｃＤＮＡにおいて発現確認を行った４種のＧＰＣＲのうち、１種の発現を検出することができた（図６）。またヒト腎臓由来のｃＤＮＡにおいて発現確認を行った３種のＧＰＣＲのうち、２種（Ｔ２Ｒ１４及びＴ２Ｒ１６）は発現を検出することができた（図７）。さらにヒト血管内皮組織（臍帯）由来のｃＤＮＡにおいて発現確認を行った３種のＧＰＣＲのち、１種（Ｔ２Ｒ１６）は発現を検出することができた（図７）。
【００４９】
一方、ゲノムＤＮＡにおいて発現確認を行った４種のＧＰＣＲのうち、１種類しか発現を検出することができなかった（図５）。
またＴＨＴＲ１及びＴＨＴＲ５に関しては、脳、肺、心臓、胃、膵臓、腎臓及び胎盤においても発現確認を行い（下記実施例１）、ＴＨＴＲ５がそれらの全ての組織において発現していることを確認した（図２Ｂ）。
従って、味覚受容体遺伝子、ＴＨＴＲ１、ＴＨＴＲ３、ＴＨＴＲ５；Ｔ２Ｒ１、Ｔ２Ｒ３、Ｔ２Ｒ４、Ｔ２Ｒ５、Ｔ２Ｒ７、Ｔ２Ｒ８、Ｔ２Ｒ９、Ｔ２Ｒ１０、Ｔ２Ｒ１３、Ｔ２Ｒ１４、Ｔ２Ｒ１６などの単離においては、舌以外の組織が有用な遺伝子供与源であることが確認された。
【００５０】
２．本発明のＴＨＴＲ９タンパク質及びそれをコードする遺伝子
（１）ＴＨＴＲ９タンパク質及びそれをコードする遺伝子
上述のＧタンパク質共役型受容体の単離方法により、本発明者は新規なＧタンパク質共役型受容体をヒト脳組織から単離することに成功した。この受容体のアミノ酸配列と既知味覚受容体のアミノ酸配列との相同性分析から、この新規なＧタンパク質共役型受容体が新規な味覚受容体ＴＨＴＲ９であることが判明した（図１）。
【００５１】
配列番号１に、本発明のＴＨＴＲ９をコードする遺伝子の塩基配列を、配列番号２に本発明のＴＨＴＲ９タンパク質のアミノ酸配列を例示するが、このアミノ酸配列を含むタンパク質がＧタンパク質共役型受容体として機能する限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは１個若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。
【００５２】
「Ｇタンパク質共役型受容体としての機能」としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。「Ｇタンパク質共役型受容体として機能する」とは、例えば配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質とほぼ同等の機能を有することを指す。従って、配列番号２に示すアミノ酸配列において変異が生じたアミノ酸を含むタンパク質のリガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質と同等（０．５〜１．５倍程度）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、当技術分野で公知の方法に従って行なうことができ、例えば、後述するリガンドの決定方法に記載のようにして測定することができる。
【００５３】
例えば、本発明の変異型タンパク質においては、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２で表わされるアミノ酸配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。但し、本発明の変異型タンパク質は、膜貫通部位以外の部分に変異（欠失、置換又は付加）が含まれるものが好ましい。従って、配列番号２に示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号１〜７、３１〜４５、６９〜９０、１１４〜１２７、１５１〜１７９、２０３〜２２８、及び２５２〜３０９に変異が含まれていてもよい。
【００５４】
また、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、ＧＰＣＲとして機能するタンパク質をコードする遺伝子も本発明のＴＨＴＲ９遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸、すなわち６０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。ストリンジェントな条件とは、例えばナトリウム濃度が、１０〜３００ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭであり、温度が２５〜７０℃、好ましくは４２〜５５℃における条件をいう。
【００５５】
なお、ＴＨＴＲ９遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ シリーズキットを用いて変異の導入が行われる。
【００５６】
一旦ＴＨＴＲ９遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又はクローニングされたｃＤＮＡを鋳型とした増幅反応によって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、ＴＨＴＲ９遺伝子を得ることができる。さらに、部位特定変異誘発等によってＴＨＴＲ９タンパク質をコードする修飾されたＤＮＡを合成することもできる。
【００５７】
また、本発明のタンパク質には、ＴＨＴＲ９タンパク質の部分ペプチドも包含される。そのような部分ペプチドとしては、本発明のＴＨＴＲ９タンパク質の部分ペプチドであればいずれのものであってもよいが、例えば、ＴＨＴＲ９タンパク質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、受容体結合活性を有するものなどが用いられる。具体的には、ＴＨＴＲ９タンパク質の部分ペプチドとしては、ヒドロパシープロット解析において細胞外領域（親水性部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでもよい。本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記ＴＨＴＲ９タンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
【００５８】
本発明のＴＨＴＲ９タンパク質又はその部分ペプチドは、前述したヒトや哺乳動物の細胞又は組織から当技術分野で公知のタンパク質の精製方法によって製造することができる。また、ＴＨＴＲ９タンパク質をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体を培養することによっても製造することができる（下記参照）。また、当技術分野で公知の化学的ペプチド合成方法、例えば固相合成法などによって製造することもできる。
【００５９】
（２）組換えベクター及び形質転換体の作製
本発明の組換えベクターは、上記ＴＨＴＲ９遺伝子を適当なベクターに連結することにより得ることができ、形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的の遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。
【００６０】
ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。プラスミド ＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２， ｐＢＲ３２５， ｐＵＣ１１８， ｐＵＣ１１９， ｐＵＣ１８， ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０， ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３， ＹＥｐ２４， ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などを用いて形質転換体を作製することもできる。
ベクターに本発明のＴＨＴＲ９遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター ＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００６１】
本発明のＴＨＴＲ９遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明のＴＨＴＲ９遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。さらに、大腸菌及び酵母などの２種以上の宿主微生物で自律的増殖が可能なベクターのほか、各種のシャトルベクターを使用することもできる。このようなベクターについても、前記制限酵素で切断し、その断片を得ることができる。
【００６２】
ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。そして、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングさせた後に連結させ、組換えベクターを作製する。
形質転換に使用する宿主としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
【００６３】
細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明のＴＨＴＲ９遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５αなどが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００６４】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）などが用いられる。この場合、プロモーターは酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等を用いることができる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００６５】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等が用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００６６】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
形質転換体は、導入する遺伝子内に構成されるマーカー遺伝子の性質を利用して選択される。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を用いた場合には、Ｇ４１８薬剤に抵抗性を示す細胞を選択する。
【００６７】
（３）ＴＨＴＲ９タンパク質の生産
本発明のＴＨＴＲ９タンパク質は味覚受容体であるため、味覚として感知されるリガンド物質を決定するために利用することができる。
本発明において、目的のタンパク質（味覚受容体タンパク質）は、目的遺伝子を保有する前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００６８】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００６９】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、又はその他の含窒素化合物が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００７０】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、約３７℃で約５時間〜３０日間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００７１】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００７２】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で約５時間〜３０日間行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００７３】
培養後、目的のＴＨＴＲ９タンパク質は細胞表面上に生産されるため、菌体又は細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から目的のタンパク質を単離精製することができる。
目的のタンパク質が得られたか否かは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認することができる。
【００７４】
３．ＴＨＴＲ９タンパク質に対するリガンド
ＴＨＴＲ９タンパク質又はその部分ペプチドは、本発明のＴＨＴＲ９に対するリガンドを単離し、決定するための試薬として有用である。すなわち、本発明は、ＴＨＴＲ９タンパク質又はその部分ペプチドと、試験化合物とを接触させることを特徴とするＴＨＴＲ９タンパク質に対するリガンドの決定方法を提供する。試験化合物としては、甘味として例えばショ糖、ブドウ糖、果糖、乳糖、麦芽糖、ソルビトール、グリシン、アラニン、アスパラテート、リゾチーム、ステビオサイト、ＡｃｅｓｕｌｆａｍｅＫなどが用いられ、酸味として例えばクエン酸などが用いられ、塩味として例えば食塩などが用いられ、苦味として例えばキニン、カフェイン、フェニルアラニン、トリプトファン、アルギニン、テオフィリン、イソフムロン、テオプロミンなどが用いられ、旨味として例えばグルタミン酸ソーダ、グアノシン、イノシンなどが用いられる。例えば本発明においては、上述したような試験化合物をＴＨＴＲ９タンパク質に添加し、細胞刺激活性などを測定しながら分画し、最終的に単一のリガンドを得ることができる。また例えば本発明においてはＴＨＴＲ９が脳に多く発現していることから、ウシやブタの脳の熱水抽出物や、乳タンパク質をタンパク質分解酵素によって分解したペプチド等を、ＴＨＴＲ９を発現するＣＨＯ細胞に作用させ、その細胞内カルシウム濃度上昇又はＰＧＥ２産生を指標にして分画し、最終的には単一のリガンドを得ることができる。
【００７５】
具体的に説明すると、本発明のリガンド決定方法は、本発明のＴＨＴＲ９タンパク質又はその部分ペプチドを用いるか、または組換え型ＴＨＴＲ９タンパク質の発現系を構築し、該発現系を用いた受容体結合アッセイ系を用いることによって、ＴＨＴＲ９タンパク質に結合して細胞刺激活性を有する化合物を決定する方法である。細胞刺激活性としては、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内カルシウム遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、ｐＨの低下などを促進する活性又は抑制する活性などが挙げられる。また細胞刺激活性を有する化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられる。本発明のリガンド決定方法においては、ＴＨＴＲ９タンパク質又はその部分ペプチドと試験化合物とを接触させた場合の、例えば、該タンパク質又は該部分ペプチドに対する試験化合物の結合量や、細胞刺激活性などを測定することを特徴とする。
【００７６】
本発明のリガンド決定方法において、ＴＨＴＲ９タンパク質若しくはその部分ペプチドに対する試験化合物の結合量、又は試験化合物による細胞刺激活性は、限定するものではないが、以下の（１）〜（５）に記載するいずれかの手法により測定することができる。すなわち、
（１） 標識した試験化合物を、ＴＨＴＲ９タンパク質又はその部分ペプチドに接触させて、標識した試験化合物と該タンパク質又は該部分ペプチドとの結合量を測定する。
（２） 標識した試験化合物を、ＴＨＴＲ９タンパク質を含有する細胞又は該細胞の膜画分に接触させて、標識した試験化合物と該細胞又は該膜画分との結合量を測定する。
（３） 標識した試験化合物を、ＴＨＴＲ９タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＴＨＴＲ９タンパク質に接触させて、標識した試験化合物と該受容体タンパク質との結合量を測定する。
（４） 試験化合物を、ＴＨＴＲ９タンパク質を含有する細胞に接触させて、ＴＨＴＲ９タンパク質を介した細胞刺激活性を測定する。
（５） 試験化合物を、ＴＨＴＲ９タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した受容体タンパク質に接触させて、ＴＨＴＲ９タンパク質を介する細胞刺激活性を測定する。
特に、上記（１）〜（５）の試験を行ない、試験化合物がＴＨＴＲ９タンパク質に結合することを確認（定性的確認）した後に、改めて、（１）〜（５）の試験方法によりその結合活性又は細胞刺激活性の定量的確認を行なうことが好ましい。
【００７７】
そして、上記（１）〜（３）の試験のいずれかにより測定したＴＨＴＲ９タンパク質又はその部分ペプチドと試験化合物とを接触させた場合の結合量を、該タンパク質又は部分ペプチドとリガンドではない物質とを接触させた場合の結合量（コントロール）と比較する。それにより、試験化合物と接触させた場合の結合量が、リガンドではない物質と接触させた場合の結合量の、約１２０％以上、好ましくは約１５０％以上、例えば１２０〜３００％である場合に、該試験化合物をリガンドと決定する。ここで、「リガンドではない物質」としては、サッカリン、ステビアなどの人工甘味料などを挙げることができる。
【００７８】
あるいは、上記（４）又は（５）の試験により測定したＴＨＴＲ９タンパク質又はその部分ペプチドと試験化合物とを接触させた場合の細胞刺激活性を、リガンドではない物質と接触させた場合又は試験化合物と接触させていない場合の細胞刺激活性（コントロール）と比較する。それにより、試験化合物と接触させた場合の結合量が、リガンドではない物質と接触させた場合又は試験化合物と接触させていない場合の細胞刺激活性の、約１２０％以上、好ましくは約１５０％以上、より好ましくは約３００％以上、例えば１２０〜３００％である場合に、該試験化合物をリガンドと決定する。ここで、試験化合物と接触させない場合の細胞刺激活性は、上記（４）又は（５）の試験において、試験化合物を接触させずに、ＴＨＴＲ９タンパク質を含有する細胞又は該タンパク質を細胞膜上に発現する細胞の細胞刺激活性を測定することにより、決定することができる。
【００７９】
リガンド決定方法に用いるＴＨＴＲ９タンパク質としては、上記した本発明のＴＨＴＲ９タンパク質又はその部分ペプチドを含有するものであればいずれのものであってもよいが、動物細胞を用いて大量発現させたＴＨＴＲ９タンパク質が適している。本発明のＴＨＴＲ９タンパク質の製造方法は、上記「２．本発明のＴＨＴＲ９タンパク質及びそれをコードする遺伝子」の項目の「（３）ＴＨＴＲ９タンパク質の生産」の項に詳述したが、ＴＨＴＲ９タンパク質をコードするＤＮＡを哺乳動物細胞又は昆虫細胞で発現させて製造することが好ましい。
【００８０】
本発明のリガンド決定方法において、ＴＨＴＲ９タンパク質を含有する細胞を用いる場合には、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は、当技術分野で公知の方法に従って行なうことができる。ＴＨＴＲ９タンパク質を含有する細胞としては、ＴＨＴＲ９タンパク質を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、当技術分野で公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＴＨＴＲ９タンパク質と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。ＴＨＴＲ９タンパク質を含有する細胞又はその膜画分中のＴＨＴＲ９タンパク質の量は、１細胞当たり１０３〜１０６分子であるのが好ましく、１０５〜１０７分子であるのがさらに好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
【００８１】
本発明のＴＨＴＲ９タンパク質に対するリガンドを決定する上記の（１）〜（５）の手法を実施するためには、適当なＴＨＴＲ９タンパク質画分と、標識した試験化合物が必要である。ＴＨＴＲ９タンパク質画分としては、天然型のＴＨＴＲ９タンパク質画分、又はそれと同等の活性を有する組換え型ＴＨＴＲ９画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などを示す。標識した試験化合物としては、〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などの放射性同位体、フルオレセイン、スルホローダミン、テトラメチルローダミンなどの蛍光標識、ルシフェリンなどの化学発光標識で標識した呈味物質（例えばショ糖、ブドウ糖、果糖）などが好適である。
【００８２】
本発明のＴＨＴＲ９タンパク質に対するリガンドを決定するには、まずＴＨＴＲ９タンパク質を含有する細胞又は細胞の膜画分を、リガンド決定方法に適したバッファーに懸濁することによりＴＨＴＲ９溶液を調製する。バッファーは、リガンドとＴＨＴＲ９タンパク質との結合を阻害しないものであればいずれでもよい。例えば、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどが挙げられる。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０ＴＭ、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤、ウシ血清アルブミン又はゼラチンなどの各種タンパク質をバッファーに加えてもよい。さらに、プロテアーゼによるＴＨＴＲ９又はリガンドの分解を抑制するために、ＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加してもよい。上記ＴＨＴＲ９溶液に、一定量の標識で標識した試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために、過剰量の未標識の試験化合物を加えた反応チューブも用意する。反応の温度及び時間は、ＴＨＴＲ９量、試験化合物量などを考慮して適宜決定する。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する標識量を計測する。放射性同位体で標識した場合には、放射活性を、例えば液体シンチレーションカウンター、γ−カウンターなどにより計測することができる。蛍光標識した場合には、蛍光強度を、例えば蛍光プレートリーダー、蛍光レーザースキャナーなどにより計測することができる。全結合量（Ｂ）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ−ＮＳＢ）が０ｃｐｍを越える試験化合物を本発明のＴＨＴＲ９タンパク質に対するリガンドとして選択することができる。
【００８３】
本発明のＴＨＴＲ９タンパク質に対するリガンドを決定する上記の（１）〜（５）の手法を実施するためには、該受容体タンパク質を介する細胞刺激活性を公知の方法又は市販の測定用キットを用いて測定することができる。ここで細胞刺激活性としては、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内カルシウム遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性又は抑制する活性などが挙げられる。具体的には、まず、ＴＨＴＲ９タンパク質を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。リガンド決定を行なうにあたっては前もって新鮮な培地又は細胞に毒性を示さない適当なバッファーで交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出又は上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
上述のようにして決定されたリガンドは、ＴＨＴＲ９に結合して味覚として感知されるため、該リガンドを含有する食品用組成物は、食品の分野で、調味料、加工食品などにおいて利用することができる。
【００８４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は下記実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例１〕脳組織由来ＧＰＣＲの発現確認
ヒトゲノムプロジェクトのデータベースより検索された既知の味覚受容体１４種（ＴＨＴＲ１、ＴＨＴＲ３、ＴＨＴＲ５；Ｔ２Ｒ１、Ｔ２Ｒ３、Ｔ２Ｒ４、Ｔ２Ｒ５、Ｔ２Ｒ７、Ｔ２Ｒ８、Ｔ２Ｒ９、Ｔ２Ｒ１０、Ｔ２Ｒ１３、Ｔ２Ｒ１４、Ｔ２Ｒ１６）と、データベースから推定した推定味覚受容体（ＴＨＴＲ９）について、その遺伝子情報を基にプライマーを設計し、ゲノムＤＮＡ、及び種々の組織由来のｃＤＮＡから遺伝子の発現確認を行った。
【００８５】
具体的に説明すると、脳、肺、心臓、胃、膵臓、腎臓及び胎盤組織由来のＲＮＡは市販されているものから得た（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）。これらの組織のＲＮＡから逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ）を用いてｃＤＮＡを作製し、このｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを鋳型として、味覚受容体の５’側及び３’側の塩基配列のそれぞれ１９〜２６塩基を基にしてプライマーを設計した。そのプライマー配列を以下に示す。プライマーの名称は、味覚受容体名／Ｆ又はＲ（Ｆはフォーワード、Ｒはリバースを表す）で記載する。
【００８６】
上記ＰＣＲプライマーとＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて、変性温度９５℃で１分間、アニーリング温度５９℃で１分間、伸長温度７２℃で１分間、反復回数３５回でＰＣＲを行い、標的の味覚受容体遺伝子を増幅した。増幅した遺伝子を、アガロース電気泳動法及びエチジウムブロマイド染色法により染色して紫外線下でゲル画像を得た（図２〜８）。
【００８７】
図２に示すように、脳、肺、心臓、胃、膵臓、腎臓及び胎盤組織より得たｃＤＮＡをＰＣＲ法で増幅した場合には、味覚受容体遺伝子（ＴＨＴＲ５及び推定味覚受容体ＴＨＴＲ９）が増幅されて、味覚受容体遺伝子の存在を確認することができた（図２Ｂ及びＣ）。
また試験した１４種のＧＰＣＲのうち、ＴＨＴＲ１（図３）以外の１３種は脳組織において発現していることが認められた（図３、４、７及び８を参照）。
【００８８】
またヒト心臓由来のｃＤＮＡにおいて発現確認を行った４種のＧＰＣＲのうち、１種（ＴＨＴＲ９）の発現を検出することができた（図６）。またヒト腎臓由来のｃＤＮＡにおいて発現確認を行った３種のＧＰＣＲのうち、２種（Ｔ２Ｒ１４及びＴ２Ｒ１６）は発現を検出することができた（図７）。さらにヒト血管内皮組織（臍帯）由来のｃＤＮＡにおいて発現確認を行った３種のＧＰＣＲのち、１種（Ｔ２Ｒ１６）は発現を検出することができた（図７）。
【００８９】
一方、ゲノムＤＮＡにおいて発現確認を行った４種のＧＰＣＲのうち、１種類しか発現を検出することができなかった（図５）。
従って、通常は舌組織で発現している味覚受容体タンパク質を、その遺伝子に関しては、他の組織においても検出することができた。
【００９０】
〔実施例２〕ＴＨＴＲ９の単離
本実施例は、新規なＧＰＣＲの単離に関するものである。この新規なＧＰＣＲをＴＨＴＲ９と称する。
（１）ＴＨＴＲ９のクローニング
上記実施例１で得られたＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル精製法により精製後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＺｅｒｏＢｌｕｎｔＴＯＰＯクローニングキットを用いて付属のマニュアルに従ってクローニングを行った。
【００９１】
カナマイシンを含むＬＢ平板培地上にできた８９個の大腸菌のコロニーより、１０コロニーをカナマイシンを含んだ液体ＬＢ培地で一晩振盪培養してＴＨＴＲ９が挿入されたベクターを持つ大腸菌を増殖した。増殖した大腸菌は遠心操作によって集め、キアゲン社のＱＩＡｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔを用いてプラスミドの精製を行った。精製したベクター中にＴＨＴＲ９塩基配列の挿入の有無を調べるため、ベクター中のＰＣＲ産物挿入部位の上流及び下流に１つずつ存在する制限酵素ＥｃｏＲＩ部位を利用して、制限酵素ＥｃｏＲＩで３７℃、３時間処理することにより、ベクター中からＰＣＲ産物の切り出しをおこなった。アガロースゲル電気泳動によって目的遺伝子と同等の位置にバンドを確認した。挿入塩基配列の確認を行ったところ、培養した１０コロニー全てにＴＨＴＲ９と思われる長さのバンドが確認できた。「ＴＨＴＲ９−１４」、及び「ＴＨＴＲ９−１５」というクローンを選びだし、塩基配列確認のためＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＡＢＩＰＲＩＳＭ３１０オートシーケンサを用いて塩基配列の確認を行った。シーケンスの結果、そのどちらもＴＨＴＲ９と同じ塩基配列であることが認められた。
【００９２】
（２）塩基配列決定
ＴＨＴＲ９の塩基配列の決定には、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０オートシーケンサを用いた。キアゲン社のＱＩＡｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔによって精製されたプラスミドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のラベリングキット（ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｏｎ）とＰＣＲに使用するサーマルサイクラーを用いてラベリングした。使用するプライマーは、ＴＨＴＲ９を増幅する時に用いたプライマー（ＴＨＴＲ９／Ｆ：配列番号３、ＴＨＴＲ９／Ｒ：配列番号４）とともに、使用したｐＣＲ ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ ベクター中にあるＭ１３系のプライマー（Ｍ１３ ｐｒｉｍｅｒ，ＲＶ， Ｍ１３ ｐｒｉｍｅｒ Ｍ３）の４種類のプライマーを用いてラベリングを行った。プライマーの配列を以下に示す：
ラベリングされた遺伝子は付属のマニュアルに従い調製され、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０オートシーケンサにセットされ、塩基配列の決定を行った。決定したＴＨＴＲ９の塩基配列を配列番号１に示す。
【００９３】
（３）既知味覚受容体との相同性分析
ＴＨＴＲ９と他の味覚受容体との相同性についてはＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／）のサイトを利用した。ＴＨＴＲ９とＴ２Ｒ受容体（Ｔ２Ｒ１，Ｔ２Ｒ３，Ｔ２Ｒ４，Ｔ２Ｒ５，Ｔ２Ｒ７，Ｔ２Ｒ８，Ｔ２Ｒ９，Ｔ２Ｒ１０，Ｔ２Ｒ１３，Ｔ２Ｒ１４，Ｔ２Ｒ１６）についてそれぞれのアミノ酸の配列を上記サイトに入力し、マルチプルアライメントによりその相同性の計算を行った。
相同性分析の結果、図１に示すように、ＴＨＴＲ９が既知の味覚受容体と相同性を有することが判明した。
【００９４】
〔実施例３〕ＴＨＴＲ９のＧＰＣＲとしての機能確認とリガンド決定
（１）ＧＰＣＲとしての機能確認
上記実施例２において得られたクローン番号ＴＨＴＲ９−１４遺伝子の下流にＧα１６遺伝子を融合させた。これによってＴＨＴＲ９−１４がどのＧタンパク質と共役しても、受容体遺伝子下流に融合されたＧα１６との共役により、受容体刺激時に細胞内カルシウムの動員がおこることにより、受容体のリガンドが決定できる。
ＴＨＴＲ９−１４にＧタンパク質αサブユニットＧα１６を融合する方法を以下に示す。
【００９５】
ＴＨＴＲ９−１４をテンプレートにプライマーＴＨ９−ＳＡＬ／Ｆ（ＡＣＧ ＣＧＴ ＣＧＡ ＣＡＴ ＧＡＴＡ ＡＣＴ ＴＴＴ ＣＴＡ ＣＣＣ：配列番号４１）とＴＨＴＲ９／Ｒ（配列番号４）を用いてタカラのＥＸ ＴａｑでＰＣＲを施行した。これによってＴＨＴＲ９−１４の５’側には後のクローニングで使用するＳａｌ Ｉ部位が組み込まれた。また上記Ｇα１６をテンプレートにＴＨ９−Ｇ１６（ＡＡＡ ＧＧＡＧＡＧ ＡＡＧ ＡＣＴ ＴＣＡ ＴＣＴ ＣＣＡ ＡＴＧ ＧＣＣ ＣＧＣ ＴＣＧ ＣＴＧ ＡＣＣ：配列番号４２）とＧ１６−３’Ｋ（ＧＧＡ ＣＴＡ ＧＴＴ ＣＡＣ ＡＧＣ ＡＧＧ ＴＴＧ ＡＴＣ ＴＣＧ Ｔ：配列番号４３）の間でＰＣＲを施行した。このＰＣＲによってＧα１６の５’側にはＴＨＴＲ９の３’側の８アミノ酸分の塩基配列（ＴＨＴＲ９−１４の終止コドンは除く）と３’側には後のクローニングで必要になるＳｐｅＩ部位が組み込まれる。ＰＣＲ条件は、はじめに９５℃３分間で変性したのち、９５℃−３０秒、５４℃−３０秒、７２℃−１分の条件を２５回行い、２５回終了した後、７２℃で７分間伸長させた。図９Ａにおいて、ＴＨＴＲ９−１４をテンプレートにし、Ｓａｌ Ｉ部位が組み込まれたＰＣＲ産物とＧα１６にＴＨＴＲ９の３’側の８アミノ酸分の塩基配列とＳｐｅ Ｉ部位が組み込まれたＰＣＲ産物がシングルバンドとして認められた（それぞれレーン３及びレーン２）。
【００９６】
ＴＨＴＲ９−１４とＧα１６との融合において、次に上記で得られたＴＨＴＲ９とＧα１６のＰＣＲ産物（図９Ａ中、レーン２及び３）を混合してＰＣＲをタカラのＥＸ Ｔａｑを用いて施行した。このとき９５℃−３０秒、６０℃−３０秒、７２℃−２分を７回くりかえした。この反応液に上記プライマーＴＨ９−ＳＡＬ／Ｆ（配列番号４１）とＧ１６−３’Ｋ（配列番号４３）を加えて再びＰＣＲを施行した。このときのＰＣＲ条件は９５℃−３０秒、５４℃３０秒、７２℃−２分を２５回くりかえし、その後７２℃で７分間伸長させて終了した。それによって得られたＰＣＲ産物は図９Ｂのレーン２に示した（レーン１はマーカを示している）。
【００９７】
図９Ｂのレーン２のなかで最も濃く、大きさが約２０００ｂｐほどのバンドを精製用アガロースゲルを用いて切り出して、Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社のＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＶＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔを用いてクローニングした。得られたクローンはＴＨＴＲ９−Ｇ１６では９クローンであった。ここで制限酵素ＥｃｏＲＩを用いてインサートチェックをしたところ、６クローン中２クローンにインサートが確認された。
得られたクローンについて、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０を用いてシーケンスを行った。
【００９８】
５μｇのＴＨＴＲ９−Ｇ１６を Ｓｐｅ ＩとＳａｌ Ｉで消化した。これを精製用アガロースゲルに泳動して、約２０００ｂｐ前後のバンドの部分のゲルを、カミソリを用いて切り出した。このゲル小片をＴＡＥとともに数ｃｍの透析チューブに入れ、通常使用する電気泳動装置（ミューピッド）中に置き、ＤＮＡフラグメントが電気泳動によって陽極側に移動することを利用してアガロースゲル小片と、Ｓａｌ Ｉ／Ｓｐｅ Ｉフラグメントに分離した。透析チューブ中のＴＡＥに溶出したフラグメントをエタノール沈殿法によって取り出した。ここで得られたフラグメントは１５μｌのＴＥによって溶解させ、そのうちの２μｌをエチジウムブロマイドを含んだアガロースゲルを用いたミューピッドで電気泳動を行い、ＵＶ光源下で、約２０００ｂｐ付近に目視できるバンドを確認した。
【００９９】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳのマルチクローニングサイトを組み込んだｐＥＦ−ＢＯＳ−ＫＳをＳｐｅＩとＳａｌ Ｉで消化した。これを精製用アガロースゲルで泳動し、約６０００ｂｐ前後のバンドの部分のゲルを、カミソリを用いて切り出し、アガロースゲル小片を上記と同様に処理を行った。エタノール沈殿で得られたフラグメントを上記同様に１５μｌのＴＥに溶解して、上記と同様の方法でそのフラグメントが目視できるか否かを確認した。
【０１００】
それぞれで得られたインサート、ならびにベクターを１μｌづつ混合して、ＴＯＹＯＢＯのＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈを用いて、両フラグメントを１６℃にて１時間反応させた。この反応液１μｌをＴＯＹＯＢＯのコンピテントセル Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＤＨ５αに加え、氷中に３０分放置後４２℃で３０秒間熱ショックをかけて上記ベクターをコンピテントセルに導入した。熱ショック後に９００μｌのＳＯＣを加えて３７℃で４０分間培養した後、アンピシリンを含むＬ／Ｂプレートに塗布して、３７℃で終夜培養した。プレート上にあらわれたコロニーから、１０個を滅菌爪楊枝で取り上げ、そのそれぞれをアンピシリンを含む１０ｍｌのＬ／Ｂ液体培地に加え、終夜３７℃で振盪培養した。増殖した大腸菌液の一部はグリセロールを用いて−２０℃に保存した。残りの大腸菌液は４℃で６０００回転１０分間、遠心分離を行い、そのペレットよりＱｉａｇｅｎ社のＱＩＡｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔを用いてプラスミドを得た。
インサートの確認は、ＴＨ９−ＳＡＬ／Ｆプライマー（配列番号４１）及びＧ１６−３’Ｋプライマー（配列番号４３）にタカラのＥＸ Ｔａｑを用いてＰＣＲを施行した。
【０１０１】
ＰＣＲは、９５℃−３０秒、５４℃３０秒、７２℃−２分を２５回くりかえし、その後７２℃で７分間伸長させて終了した。エチジウムブロマイドを含んだアガロースゲルでＰＣＲ産物を泳動し、ＵＶ光源のもと、約２０００ｂｐのＰＣＲ産物が確認できるプラスミドを得た。
【０１０２】
実験に使用するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌｅｎｅｘａ， ＫＳ）を含むＨａｍ’ｓ Ｆ−１２培地（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）にペニシリン／ストレプトマイシン（それぞれ５０ Ｕ／ｍｌ及び５０μｇ／ｍｌ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を加えて、５％ＣＯ２存在下３７℃で培養した。上記プラスミドのＣＨＯ細胞への導入はＴｒａｎｓＦａｓｔ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用い、方法はそのマニュアルに従った。上記のプラスミド５μｇとｐＥＦ−ＢＯＳのマルチクローニングサイトにネオマイシン耐性遺伝子を組み込んだプラスミドｐＥＦ−ｎｅｏの２μｇを、６０ｍｍのディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ）上で培養したＣＨＯ細胞に加えた。１時間後、培養液を通常使用するＨａｍ’ｓ Ｆ−１２培地に交換して４８時間培養した。その後Ｇ４１８（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ， Ｉｎｃ． Ｋｙｏｔｏ）４００μｇ／ｍｌを含む培養液で１０日間培養を行い、Ｇ４１８に耐性のある細胞を選択し、ＴＨＴＲ９とＧα１６を安定的に発現した細胞を得た。得られた細胞はクローニングシリンダーを用いて、４クローンをクローニングした。細胞中にＴＨＴＲ９−Ｇ１が発現しているか否かを、それらクローンからＴＲＩＺＯＬ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を用いて得られたＴｏｔａｌ ＲＮＡより、ｏｌｉｇｏ−ｄＴと逆転写酵素Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を用いたＲＴ−ＰＣＲを施行した。上記でも使用したＴＨ９−ＳＡＬ／Ｆプライマー（配列番号４１）及びＧ１６−３’Ｋプライマー（配列番号４３）を用いて、タカラのＥＸ Ｔａｑを用いてＰＣＲを施行した。ＰＣＲは９５℃−３０秒、５４℃３０秒、７２℃−２分を２５回くりかえし、その後７２℃で７分間伸長させて終了した。エチジウムブロマイドを含んだアガロースゲルでＰＣＲ産物を泳動し、ＵＶ光源のもと、約２０００ｂｐのＰＣＲ産物が確認できる細胞を得た。得られた細胞は２００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含む培地で培養した。
【０１０３】
細胞に発現したＧα１６をウェスタンブロッティング法によって確認した。６０ｍｍのディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ）上に培養した細胞をダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ）を用いて一回洗浄し、細胞をラバーポリスマンを用いて集め０．２５ｍｌの１×ＳＤＳサンプルバッファー（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ６．８， ６％ ２−メルカプトエタノール， ２％ ＳＤＳ， ０．１％ ブロムフェノールブルー， １０％グリセロール）に溶解した。この細胞溶解液をソニケーター（Ｔｏｍｙ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ）を１０秒間用いて超音波処理を行った。超音波処理を行った細胞溶解液を１５０００ｒｐｍで５分間室温で遠心し、遠心上清を１２％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った。泳動が終了したゲルはポリビニリデンジフルオリド膜（０．２μｍ， ＦｌｕｏｒｏｔｒａｎｓＴＭ， Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．）に電気的に転写した。この膜は５％のスキムミルクと０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）を含むＰＢＳでブロッキングした。マウスのＧα１５のＣ末端側の１７個のアミノ酸（８０２ ＱＥＨＬＧＨＰＬＰＱＱＤＧＨＰＧＲ ８５５：配列番号４４）の配列をもとにして作製されたペプチドに対する家兎抗体（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ Ｃｏ．， Ｎａｇｏｙａ， Ｊａｐａｎ）を１：１，０００に希釈したＰＢＳ（５％のスキムミルクと０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む）中に、ゲルを転写した膜を室温で２時間作用させた。
【０１０４】
その後、この膜は０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳで３回洗い、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）ラベルの抗ウサギＩｇＧ抗体（ＢｉｏＲａｄ， １：５，０００希釈）を含むＰＢＳ（０．５％スキムミルクと０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む）に室温で２時間反応させた。０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳで膜を３回洗い、ＥＣＬ化学発光ウエスタンブロット検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてＧα１６のバンドを確認した。
【０１０５】
（２）リガンド決定
ＴＨＴＲ９発現が確認されたＣＨＯ細胞を２４ウエルのマルチプレートで培養した。２〜４日前後で細胞数がコンフルエントになった。
今まで使っていた培養液を捨てて、０．５ｍｌのＰＢＳで一回ウエルを洗った。ウエルが乾かないうちにグルコースやフルクトースなどの呈味物質を含む培養液（ＣＨＯ細胞ではＨａｍ Ｆ−１２を使用）を０．２ｍｌ、静かに培養細胞を剥がさないように加えた。５％ＣＯ２存在下、３７℃で４時間培養した（リガンドによる４時間の刺激）。４時間後、培養液を回収し、遠心によって細胞残渣を取り除いて遠心上清中のＰＧＥ２をＣａｙｍａｎ社製のＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２ ＥＩＡ測定キットを用いて測定した。結果は、ウエルあたりのＰＧＥ２産生量で比較した。
【０１０６】
ここでコントロール（呈味物質を添加してない、又は水などリガンドとならない物質を添加して培養した細胞群）と比較して、１２０〜１５０％以上ＣＨＯ細胞からのＰＧＥ２産生の増大があった呈味物質について再度同様の測定を行った。その後、濃度応答曲線を作成できるように呈味物質の濃度を変更して再度測定を行った。
【０１０７】
【発明の効果】
本発明によれば、Ｇタンパク質共役型受容体遺伝子単離方法において、該Ｇタンパク質共役型受容体が通常発現している組織以外の組織に由来するＲＮＡを用いることによって、ほとんど入手不可能な組織を用いることなく、ヒトの特定の遺伝子（ＧＰＣＲ）を単離することができる。
また、本発明によれば、将来的に、新規に作成されたデータベースを用いて、既知又は未知を問わずにＧＰＣＲ遺伝子を単離及び取得することができるため、ＧＰＣＲ遺伝子の取得と解析、ＧＰＣＲのリガンド決定に有用である。
【０１０８】
【配列表】
【０１０９】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３〜３６：合成オリゴヌクレオチド
配列番号３７：合成オリゴヌクレオチド
配列番号３８：合成ペプチド
配列番号３９〜４３：合成オリゴヌクレオチド
配列番号４４：合成ペプチド
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】ＴＨＴＲ９のアミノ酸配列と既知の味覚受容体（Ｔ２Ｒ１、Ｔ２Ｒ３、Ｔ２Ｒ４、Ｔ２Ｒ５、Ｔ２Ｒ７、Ｔ２Ｒ８、Ｔ２Ｒ９、Ｔ２Ｒ１０、Ｔ２Ｒ１３、Ｔ２Ｒ１４及びＴ２Ｒ１６）のアミノ酸配列とのマルチプルアライメントを行った結果を示す図である。
【図１Ｂ】ＴＨＴＲ９のアミノ酸配列と既知の味覚受容体（Ｔ２Ｒ１、Ｔ２Ｒ３、Ｔ２Ｒ４、Ｔ２Ｒ５、Ｔ２Ｒ７、Ｔ２Ｒ８、Ｔ２Ｒ９、Ｔ２Ｒ１０、Ｔ２Ｒ１３、Ｔ２Ｒ１４及びＴ２Ｒ１６）のアミノ酸配列とのマルチプルアライメントを行った結果を示す図である。（図１Ａの続き）
【図２】ＴＨＴＲ１（Ａ）、ＴＨＴＲ９（Ｂ）及びＴＨＴＲ５（Ｃ）を基に設計したプライマーを用いて種々の組織由来のｃＤＮＡを鋳型として行ったＰＣＲにより増幅された断片の電気泳動写真を示す図である。
１：脳、２：肺、３：心臓、４：胃、５：膵臓、６：腎臓、及び７：胎盤
【図３】ＴＨＴＲ１及びＴＨＴＲ５、並びにＴ２Ｒ１、Ｔ２Ｒ５及びＴ２Ｒ８を基に設計したプライマーを用いて脳組織由来のｃＤＮＡを鋳型として行ったＰＣＲにより増幅された断片の電気泳動写真を示す図である。
【図４】Ｔ２Ｒ３、Ｔ２Ｒ４、Ｔ２Ｒ７、Ｔ２Ｒ９、Ｔ２Ｒ１０、Ｔ２Ｒ１３、Ｔ２Ｒ１４及びＴ２Ｒ１６を基に設計したプライマーを用いて脳組織由来のｃＤＮＡを鋳型として行ったＰＣＲにより増幅された断片の電気泳動写真を示す図である。
【図５】ＴＨＴＲ１、並びにＴ２Ｒ５、Ｔ２Ｒ１４及びＴ２Ｒ１６を基に設計したプライマーを用いてヒトゲノムＤＮＡを鋳型として行ったＰＣＲにより増幅された断片の電気泳動写真を示す図である。
【図６】ＴＨＴＲ１及びＴＨＴＲ９、並びにＴ２Ｒ１４及びＴ２Ｒ１６を基に設計したプライマーを用いて心臓組織由来のｃＤＮＡを鋳型として行ったＰＣＲにより増幅された断片の電気泳動写真を示す図である。
【図７】ＴＨＴＲ１、ＴＨＴＲ３、ＴＨＴＲ５及びＴＨＴＲ９、並びにＴ２Ｒ１４及びＴ２Ｒ１６を基に設計したプライマーを用いて脳、臍帯及び腎臓組織由来のｃＤＮＡを鋳型として行ったＰＣＲにより増幅された断片の電気泳動写真を示す図である。
レーン１：Ｔ２Ｒ１４（臍帯）、レーン２：Ｔ２Ｒ１６（臍帯）、レーン３：Ｔ２Ｒ１４（腎臓）、レーン４：Ｔ２Ｒ１６（腎臓）、レーン５：ＴＨＴＲ３（脳）、レーン６：ＴＨＴＲ５（脳）、レーン７：ＴＨＴＲ１（臍帯）、レーン８：ＴＨＴＲ１（腎臓）、Ｌ：マーカー
【図８】ＴＨＴＲ１、ＴＨＴＲ３、ＴＨＴＲ５及びＴＨＴＲ９、並びにＴ２Ｒ１４を基に設計したプライマーを用いて脳及び臍帯組織由来のｃＤＮＡを鋳型として行ったＰＣＲにより増幅された断片の電気泳動写真を示す図である。
レーン１：ＴＨＴＲ３（脳）、レーン２：ＴＨＴＲ５（脳）、レーン３：ＴＨＴＲ９（脳）、レーン４：ＴＨＴＲ１（臍帯）、レーン５：ＴＨＴＲ１（腎臓）、レーン６：Ｔ２Ｒ１４（臍帯）、Ｌ：マーカー
【図９】ＴＨＴＲ９−１４とＧα１６との融合において得られたＰＣＲ断片の電気泳動写真を示す図である。
（Ａ）レーン１：マーカー、レーン２：ＳａｌＩ部位が組み込まれたＰＣＲ産物、レーン３：Ｇα１６にＴＨＴＲ９の３’側の８アミノ酸分の塩基配列とＳｐｅＩ部位が組み込まれたＰＣＲ産物
（Ｂ）レーン１：マーカー、レーン２：ＴＨＴＲ９とＧ１６αが融合したＰＣＲ産物
【発明の属する技術分野】
本発明はＧタンパク質共役型受容体遺伝子の単離方法及び該単離方法により単離された新規Ｇタンパク質共役型受容体遺伝子に関する。また本発明は、該Ｇタンパク質共役型受容体遺伝子を含有するベクター、該ベクターを含む形質転換体、並びに該形質転換体を用いたＧタンパク質共役型受容体タンパク質の製造方法に関する。さらに本発明は、上記Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質に対するリガンド及び該リガンドの決定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生命における遺伝子は、ＤＮＡとして知られる有機化学物質上の４種類の塩基によりコードされた情報である。ＤＮＡ上の遺伝子塩基配列は、各臓器や細胞により特徴的にＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳され、臓器や細胞固有にタンパク質が発現する。このような遺伝情報の流れにより、生物は体を作り、変化する外界に対処しながら生命活動を営み、子孫を作り、やがて死に至る。
【０００３】
近年、ＤＮＡ塩基配列決定技術の発展などより、これらの遺伝情報が担われ、そして全ての遺伝子情報を含むとされているゲノムのＤＮＡ塩基配列や実際に発現している遺伝子の塩基配列データが大量かつ急速に決定されている。その決定された情報を元に遺伝子の医薬品等への利用がなされてきている。
【０００４】
従来、遺伝子を単離、取得し、得られた遺伝子をもとにタンパク質を取得する場合、遺伝子が発現している特定の臓器、細胞又は細胞から得られたゲノムＤＮＡからの遺伝子の取得が、遺伝子を単離・取得する有効な手法となっている。
【０００５】
一方、ヒトゲノムプロジェクトによりヒトの全遺伝子の解読は進んだものの、ゲノム情報のみではタンパク質の構造を解析し、その機能を解析することは極めて困難である。なぜなら、ゲノム上にコードされた遺伝子は、将来、タンパク質をコードしない非翻訳領域のなかに翻訳領域が、あたかも海の上に浮かぶ島、環礁のように存在することが多く、この非翻訳領域にしても、この部分にタンパク質をコードする情報以外にさまざまなシグナルを有することが多いからである。従って、ゲノムが現在のように解読できたとしても、さらにここから、タンパク質をコードする暗号を読み解かなければ今後の研究に使うことは非常に困難である。
【０００６】
しかしながら、Ｇタンパク質共役型受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＧＰＣＲ）の多くはこの非翻訳領域であるイントロンを含まないイントロンレスであることが多い。現在、この特徴を利用して、ヒトゲノムプロジェクトで得られた情報から直接ＧＰＣＲと思われる配列を検索しようとする試みが行われ、成果を上げつつある。ＧＰＣＲは、イントロンレスである他に９００〜１２００塩基前後と比較的短い遺伝子から構成されるため、ＧＰＣＲ遺伝子の単離において有利である。さらに、このＧＰＣＲは細胞上に発現するため、細胞膜上に固定される必要があり、細胞膜を７回貫通する構造をもっている。この膜貫通部位は疎水性のアミノ酸から構成されており、ゲノム情報から得られた塩基配列をもとに、アミノ酸の一次構造を推測し、このアミノ酸配列中に６〜８箇所の疎水部分を持つ塩基配列をＧＰＣＲと考えることができる。このような研究を支援するために東京農工大学からＳＯＳＵｌと銘々されたサイトが存在する。
【０００７】
このようにＧＰＣＲ研究ではデータベースとコンピュータを用いた「ドライ」な研究方法が多数導入されている。また、新しい受容体発見が将来の創薬の原点となることから、製薬会社を中心にＧＰＣＲのクローニングとそのリガンドスクリーニングが行われている。
【０００８】
このようにして研究の効率化が行われている昨今でも、ＧＰＣＲのクローニング法は従来法と変わるところがあまりない。ヒトゲノムプロジェクトによってヒトのゲノム情報は増えたが、ターゲットがヒトであるがゆえに、臓器の入手には困難な面が多い。主要な比較的大きい臓器に発現するＧＰＣＲであれば、市販されているゲノムＤＮＡやＲＮＡを購入して実験に用いれば大きな問題は起こらない。しかし、小さい臓器の場合は、クローニングに必要な量のサンプルを入手することが困難である。例えば、味覚受容体のような場合、味覚受容体を有する味蕾、ひいてはヒトの舌組織を得なければ、ゲノムＤＮＡを用いる以外に研究の伸展は望めない。従って、入手困難な臓器に存在するＧＰＣＲ遺伝子を高効率かつ簡便に単離する方法が望まれていた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体遺伝子を高効率かつ簡便に単離する方法を提供し、新規なＧタンパク質共役型受容体遺伝子を単離することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、単離しようとするＧタンパク質共役型受容体が通常発現する組織以外の組織を遺伝子取得源として利用することにより、現在報告されている大部分の味覚受容体及び新規な味覚受容体ＴＨＴＲ９を含む数種のＧタンパク質共役型受容体を単離することに成功し、この新規なＴＨＴＲ９タンパク質を用いてＴＨＴＲ９に対するリガンドを決定することができるという知見を得て、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体遺伝子の単離方法であって、以下のステップ：
（ａ） 既知のＧタンパク質共役型受容体遺伝子若しくはその周辺領域の配列情報、又は推定したＧタンパク質共役型受容体遺伝子の配列情報を基にプライマーを設計するステップ、
（ｂ） 上記設計したプライマーを用いて、Ｇタンパク質共役型受容体が発現する組織以外の組織由来のｃＤＮＡライブラリーを鋳型とした増幅反応を行って、得られた増幅断片をクローニングするステップ、及び
（ｃ） 上記クローニングした遺伝子がＧタンパク質共役型受容体としての機能を有するかどうかを確認するステップ、
を含む上記単離方法である。
【００１２】
ここで、Ｇタンパク質共役型受容体としては、舌組織で発現するもの、例えば味覚受容体を例示することができる。また上記Ｇタンパク質共役型受容体が発現する組織以外の組織としては、例えば脳組織が挙げられる。
【００１３】
また本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質である。
（ａ） 配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ） 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、Ｇタンパク質共役型受容体として機能するタンパク質
ここで上記タンパク質は、ヒト由来のものであることが好ましい。また上記タンパク質は、味覚受容体である。
【００１４】
さらに本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である。（ａ） 配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ） 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、Ｇタンパク質共役型受容体として機能するタンパク質
【００１５】
上記遺伝子としては、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含むものが挙げられる。
（ａ） 配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ） 配列番号１に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｇタンパク質共役型受容体として機能するタンパク質をコードするＤＮＡ
また本発明は、上記遺伝子を含有する組換えベクターである。さらに本発明は、上記ベクターを含む形質転換体である。
【００１６】
またさらに本発明は、上記形質転換体を培養し、得られる培養物からＧタンパク質共役型受容体タンパク質を採取することを特徴とするＧタンパク質共役型受容体タンパク質の製造方法である。
【００１７】
本発明はまた、上記タンパク質又はその部分ペプチドと試験化合物とを接触させたときの結合量又は細胞刺激活性が、該タンパク質若しくは部分ペプチドと接触させていない場合又はリガンドではない物質と接触させた場合と比較して１２０％以上となる、請求項５〜７のいずれか１項に記載のタンパク質に対するリガンドである。
【００１８】
また本発明は、上記リガンドを含有することを特徴とする食品用組成物である。
さらに本発明は、上記タンパク質又はその部分ペプチドと試験化合物とを接触させ、それらの結合量又は細胞刺激活性を測定することを特徴とする、該タンパク質に対するリガンドの決定方法である。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．Ｇタンパク質共役型受容体の単離方法
本発明のＧタンパク質共役型受容体（以下、「ＧＰＣＲ」ともいう）の単離方法は、通常は大量に入手することができない組織（例えば味蕾細胞を有する舌組織）において発現するＧＰＣＲを、その組織以外の組織から単離することを特徴とするものである。
【００２０】
Ｇタンパク質共役型受容体とは、三量体型Ｇタンパク質と共役して細胞内に外界刺激を伝達する受容体であり、種々のホルモン、オータコイド、神経伝達物質などの受容体や、視覚、嗅覚、味覚などの感覚器の受容体などが含まれることが知られている。構造上の特徴は、細胞膜を７回貫通し、アミノ末端が細胞外にカルボキシル末端が細胞内に存在することである。従って、Ｇタンパク質共役型受容体はＩ〜ＶＩＩの７個の膜貫通部位を有するものであり、この受容体の多くは、Ｎ末端から第ＩＩＩ膜貫通部位にかけてリガンド結合領域を、そして第Ｖと第ＶＩ膜貫通部位の間にＧタンパク質との共役特異性決定領域を有すると考えられている。ＧＰＣＲは、多様な生理現象の調節と関連している場合が多いので、このＧＰＣＲを単離し、詳細に機能研究することが必要とされている。
【００２１】
ＧＰＣＲの研究においては、例えばＧＰＣＲが発現している組織の入手が困難な場合も多い。例えばＧＰＣＲの１つである味覚受容体は、通常舌で発現しているが、ヒト舌組織は入手が非常に困難であり、また味覚受容体が発現すると考えられる味蕾細胞は舌組織においても非常にわずかにしか存在しない。従って、舌を味覚受容体の遺伝子取得源としては使用できない。そこで本発明者は、容易に入手可能な組織を遺伝子取得源として選択し、ＧＰＣＲを単離する方法を試みた。
以下に、本発明のＧタンパク質共役型受容体の単離方法に関して、具体的に説明する。
【００２２】
（１）プライマー設計
本発明のＧＰＣＲ単離方法においては、既に得られている遺伝子情報やその周辺情報、又は推定ＧＰＣＲの配列情報に基づいてプライマーを設計する。
既に得られている遺伝子の情報やその周辺領域の情報を利用する場合には、例えば既知のＧＰＣＲファミリーにおいて保存されている配列、他の種に由来するＧＰＣＲの配列などを基にしてプライマーを設計することができる。例えば、ＧＰＣＲの機能を有するタンパク質間で保存されている領域の配列としては、第ＶＩ膜貫通部位からＣ末端側にある保存領域の配列が挙げられ、そのようなアミノ酸配列を基に縮合プライマー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒ）を設計することが好ましい。
【００２３】
また、ゲノム情報からＧＰＣＲを推定する場合には、公開されているゲノムＤＮＡ情報を利用して、ＧＰＣＲに特徴的な配列からＧＰＣＲを推定し、その配列を基にプライマーを設計することができる。ＧＰＣＲに特徴的な配列とは、限定するものではないが、例えば塩基配列中のＡＴＧ（メチオニンをコードする塩基配列）から約９００〜１２００塩基中に終止コドンが存在せず、さらにその塩基配列をアミノ酸に変換した場合に６〜８箇所の疎水性のアミノ酸が集まった細胞膜貫通部位があることなどが挙げられる。従って、ゲノムＤＮＡ情報から、例えばコンピュータを用いて、ＡＴＧから約８００〜１２００塩基中に終止コドンが存在しない配列を検索することにより、ＧＰＣＲと推定される配列を絞り込むことができる。また、膜貫通部位の疎水性を利用してＧＰＣＲを推定する場合には、アミノ酸配列をヒドロパシーインデックス（疎水性指標）に変換し、ヒドロパシープロットを作成する。ヒドロパシープロットを作成することにより、アミノ酸配列情報から疎水性領域を推測することができる。すなわち、膜貫通部位は疎水性のアミノ酸残基が長く連続して存在する疎水性領域であり、その疎水性領域が５〜７個程度連続して配置されている場合には、それらを含む配列がＧＰＣＲをコードしていると推定できる。
【００２４】
ヒドロパシーインデックスの計算方法及びヒドロパシープロットの作成方法は当技術分野で公知である。具体的に説明すると、各アミノ酸に対し、下記表１に示すヒドロパシーインデックスを割り当て、ｉ番目のアミノ酸残基の前後３残基（すなわちｉ−３からｉ＋３まで）のヒドロパシーインデックスの平均を求め、その値をｉ番目のアミノ酸残基の疎水性とする。
【００２５】
【表１】
各アミノ酸残基の疎水性が−０．４以上の場合には、その残基は疎水性領域を作る可能性があるといえる。十分に長い（例えば約２２〜２４残基の）疎水性領域が存在する場合に、その部分は膜貫通部分と考えることができる。
上述のようにしてヒドロパシーインデックスを計算し、それをグラフにしたものがヒドロパシープロットである。ヒドロパシープロットを作成すると、ヒドロパシーインデックス、すなわち疎水性の高い領域が視覚的に理解できる。従って、膜貫通部位を推測する場合にはヒドロパシープロットを作成することが好ましい。ヒドロパシープロットから膜貫通部位を９０％以上の精度で推測する方法として、ＫＫＤ（Ｋｌｅｉｎ−Ｋａｎｅｈｉｓａ−ＤｅＬｉｓｉ）法が知られている（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ， ２８； ８１５（３）： ４６８−７６参照）。この方法は、判別関数を利用してアミノ酸の疎水性の平均値を変量として計算することによって、膜貫通部位を推測する方法である。また、膜貫通部位を推測するためのプログラムも知られており、例えば、ＳＯＳＵＩ（ｈｔｔｐ：／／ｓｏｓｕｉ．ｐｒｏｔｅｏｍｅ．ｂｉｏ．ｔｕａｔ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉｍｅｎｕ０．ｈｔｍｌより入手可能）、Ｔｈｅ Ｇｅｎｅ ＩｎｓｐｅｃｔｏｒＴＭ（ＨＵＬＩＮＫＳ社）などが一般的に入手可能である。このような方法及びプログラムを利用することによって、７箇所の膜貫通部位を有するＧＰＣＲをより正確に推定することが可能である。
【００２７】
上述のようにして推定されたＧＰＣＲの配列を基にプライマーを設計する場合には、該配列の５’末端から約２０〜３０塩基及び３’の終止コドンを含む上流側の約２０〜３０塩基を選択し、プライマーを設計することが好ましい。
プライマーは、約２０〜３０塩基長、好ましくは約１９〜２６塩基長とし、増幅される断片が約５００〜１５００塩基、好ましくは約８８０〜１０００塩基となるように設計する。
【００２８】
例えば、本発明者は、味覚受容体の候補と考えられるＴＨＴＲ９を基に以下に示すプライマーを設計した。
フォーワードプライマー：ａｔｇａｔａａｃｔｔ ｔｔｃｔａｃｃｃａｔ ｃ（配列番号３）
リバースプライマー：ｃｔａｔｇｇａｇａｔ ｇａａｇｔｃｔｔｃｔ ｃｔｃｃ（配列番号４）
また、既知の味覚受容体であるＴＨＴＲ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿０６９７９０）、ＴＨＴＲ３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿０９０４２４）、ＴＨＴＲ５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿０６９６２６）、Ｔ２Ｒ１、Ｔ２Ｒ３、Ｔ２Ｒ４、Ｔ２Ｒ５、Ｔ２Ｒ７、Ｔ２Ｒ８、Ｔ２Ｒ９、Ｔ２Ｒ１０、Ｔ２Ｒ１３、Ｔ２Ｒ１４、Ｔ２Ｒ１６、ＫＨＲ１、及びＫＨＲ３を基に以下に示すプライマーを設計した。以下に示すプライマーの名称は、味覚受容体名／Ｆ又はＲ（Ｆはフォーワード、Ｒはリバースを表す）で示している。
【００２９】
【００３０】
（２）増幅反応
続いて、上記設計したプライマーを用いて、単離しようとするＧタンパク質共役型受容体が通常発現する組織以外の組織に由来するｃＤＮＡライブラリー又はｍＲＮＡを鋳型として増幅反応を行う。該組織としては、大量に入手可能な組織であることが好ましく、例えば、脳、肺、心臓、胃、膵臓、腎臓、胎盤などが挙げられる。増幅反応としては、限定するものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などが挙げられる。本発明において増幅反応は、ＰＣＲが好ましい。
【００３１】
（２−１）鋳型ＤＮＡの調製
上記組織からのｍＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡライブラリーの作製は常法に従って行うことができる。例えば、ｍＲＮＡの調製は、ヒト組織から、グアニジウムチオシアネート−トリフルオロ酢酸セシウム法などにより全ＲＮＡを抽出した後、オリゴｄＴ−セルロースやポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法により、あるいはバッチ法によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得ることができる。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡをさらに分画してもよい。
【００３２】
このようにして得られたｍＲＮＡを鋳型として、ランダムプライマーと共に逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、該一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成する。次に、得られた二本鎖ｃＤＮＡを適当なクローニングベクターに組み込んで組換えベクターを作製する。そしてこの組換えベクターを用いて大腸菌等を形質転換し、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性等を指標として形質転換体を選択することにより、ｃＤＮＡのライブラリーを得ることができる。
【００３３】
また、上記組織由来のｃＤＮＡライブラリーは市販されており、例えば、ヒト脳組織としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ Ｐｒｅｍａｄｅ ｃＤＮＡライブラリー（ヒト脳：カタログ番号１０４１８−０１０）、株式会社エムエステクノシステムズ社製ヒトｃＤＮＡライブラリー（ヒト脳：カタログ番号３８３５６）などを利用することができる。
【００３４】
あるいは、上記組織から得られたｍＲＮＡを鋳型として、ランダムプライマーと共に逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作製することもできる。Ｐｏｌｙ Ａ＋ ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は市販されており、例えばヒト脳組織としては、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ Ｐｏｌｙ Ａ＋ ＲＮＡ（カタログ番号６５１６−１）などが挙げられる。逆転写酵素としては、例えばＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素を利用可能である。
【００３５】
（２−２）増幅
上記のようにして得られる形質転換体又はｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを有する株を選択するには、上記（１）に記載のようにして設計したプライマー、例えば、配列番号３〜３６に示すプライマーを合成し、これを用いて増幅反応を行い、得られた断片をプローブとして、ｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法、あるいはλファージ（λｇｔ１１等）を用いた場合は、λｇｔ１１インサート増幅用のプライマーを用いて増幅反応を行う方法を採用することができる。但し、本発明においてはこれらのプライマーに限定されるものではない。
【００３６】
このようにして得られたＤＮＡ増幅断片を、３２Ｐ、３５Ｓ又はビオチン等で標識してプローブとし、これを形質転換体のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られたポジティブ株を検索することによりスクリーニングすることができる。
【００３７】
次に、得られたクローンから全長のｃＤＮＡをクローニングする。ｃＤＮＡのクローニングには、例えばＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法が用いられる。ＲＡＣＥ法とは、ｃＤＮＡの５’又は３’欠失部位をＰＣＲにより迅速に回収する方法である。なお、ＲＡＣＥ法は、市販のキット（ＭａｒａｔｈｏｎＴＭ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社））を用いて行うこともできる。あるいは、サブクローニング用のキットとしては、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖｅｒｓｉｏｎも利用可能である。上記スクリーニングにおいて得られたｃＤＮＡの単離クローンについて、増幅産物をテンプレートにしてｃＤＮＡの塩基配列を決定する。
【００３８】
塩基配列の決定はマキサム−ギルバートの化学修飾法、又はＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＡＢＩ３７３シークエンサー等）を用いて配列決定が行われる。
【００３９】
（３）ＧＰＣＲとしての機能確認
続いて、上述のようにしてクローニングされた遺伝子がＧＰＣＲとしての機能を有するかどうかを確認する。ＧＰＣＲ機能の確認は当技術分野で公知であり、そのいずれの手法に従って確認してもよい。例えば、後述する「３．ＴＨＴＲ９タンパク質に対するリガンド」の項に記載のように、ＧＰＣＲと結合することにより生じた細胞刺激活性（例えばアラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内カルシウム遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、ｐＨの低下などを促進する活性又は抑制する活性）を測定することにより、ＧＰＣＲの機能を確認することができる。ＧＰＣＲは、通常、アラキドン酸、アセチルコリン、細胞内カルシウム、細胞内ｃＡＭＰ、細胞内ｃＧＭＰ、イノシトールリン酸などのいずれかの細胞刺激活性物質を調節することが知られている（細胞の分子生物学、第３版、Ａｌｂｅｒｔｓ， Ｂ．ら著、株式会社教育社発行、１９９５年、７３４〜７７１頁参照）。従って、既知のＧタンパク質をＧＰＣＲと共役させることにより生じる細胞刺激活性の変化を利用して、ＧＰＣＲの機能を確認することができる。
【００４０】
具体的な手法の１つとして、Ｇタンパク質であるＧ１６を利用する手法を例示する。Ｇ１６は、非特異的にＧＰＣＲと共役して細胞内カルシウムを生じることが知られている。Ｇ１６の塩基配列を配列番号３７に、アミノ酸配列を配列番号３８に示す。
【００４１】
最初に、上記Ｇ１６を、上記（２）でクローニングされたＧＰＣＲ遺伝子の下流に融合した状態で配置するようにベクターを構築する。「融合した状態」とは、Ｇ１６がその終止配列を含有せずに、その直下にＧＰＣＲ遺伝子が配置されることを指す。該ベクターは、哺乳動物において高発現するものが好ましく、例えばｐＥＦ−ＢＯＳベクター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ， Ｓ． ａｎｄ Ｎａｇａｔａ， Ｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９０， １８， １７： ５３２２）が挙げられる。
【００４２】
まず、次の２段階の方法でＧ１６とＧＰＣＲを融合する。はじめに、ＧＰＣＲとＧ１６をＰＣＲ法を用いて増幅する。このとき、Ｇ１６の増幅においては、フォーワードプライマーとして、ＧＰＣＲの３’側から終止コドンを除いてアミノ酸８残基（２４塩基長）の部分とＧ１６の５’側のアミノ酸６残基（１８塩基）の部分の合計４２塩基の長さを持つプライマーを使用する。このように設計したプライマーによって増幅されたＧ１６は、ＧＰＣＲの３’側の構造を持つＰＣＲ産物となる。次にこの構造を持つＧ１６とＧＰＣＲとを、プライマーを用いないで４回程度ＰＣＲを施行する。プライマーを用いないでＰＣＲを行うことによって、ＧＰＣＲの３’末端側とＧ１６の５’末端側がアニーリングし、融合したものを得ることができる。融合した部分は二本鎖になっているため、続いて、ポリメラーゼによってこの部分から増幅反応が起こる。従って、融合の後、ＧＰＣＲの５’側の塩基配列を基に設計したフォーワードプライマーとＧ１６の３’側の塩基配列を基に設計したリバースプライマーを用いてＰＣＲを施行することにより、ＧＰＣＲの下流にＧ１６が融合した塩基配列が増幅されることとなる。ここでフォーワードプライマーに制限酵素Ｓａｌ Ｉサイト、リバースプライマーにＳｐｅ Ｉサイトを付加しておくことにより、ベクターのマルチクローニングサイトをＳａｉ Ｉ及びＳｐｅ Ｉで処理することによって、上記ＧＰＣＲ−Ｇ１６融合ＰＣＲ産物が挿入されやすくなる。
【００４３】
このＧＰＣＲ−Ｇ１６融合ＰＣＲ産物をベクター（例えばｐＥＦ−ＢＯＳ）に挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。ＧＰＣＲは、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、上記ベクターには、プロモーター、Ｇ１６−ＧＰＣＲのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｇ４１８（ジェネチシン）に耐性である）等が挙げられる。
【００４４】
続いて、ＧＰＣＲ−Ｇ１６を組み込んだ発現ベクターを、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などの哺乳動物細胞系に導入する。導入する方法は、限定するものではないが、例えばリポフェクション、遺伝子銃、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００４５】
次に、上記ベクターに含まれる選択マーカーを用いて、発現ベクターが導入された細胞のみを培養する。動物細胞を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で７〜１４日行う。ＣＨＯ細胞を培養する場合には、ＨａｍＦ−１２培地を用いて、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１０〜１４日間培養する。
【００４６】
培養した細胞より調製したＲＮＡを鋳型として、ランダムプライマーと逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを調製する。このｃＤＮＡを鋳型として、上記（１）で設計したプライマーを用いて増幅反応を行い、増幅産物のバンドが電気泳動ゲル上に出現かどうかを調べる。バンドが観察された場合は、ＧＰＣＲが細胞に導入されたものであると判断できる。
【００４７】
次に、Ｇ１６−ＧＰＣＲが導入された細胞の細胞内カルシウム濃度を測定する。細胞内カルシウム濃度の測定は、当技術分野で公知であり、例えばＦｕｒａ−２を用いた蛍光法などが挙げられる。その他、細胞内カルシウムの上昇に伴って細胞内の産生・放出が変化するプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を測定することによって間接的に細胞内カルシウム濃度を測定することができる。この産生が変化したＰＧＥ２は、細胞外に放出されるため、リガンド刺激の４時間後の培養上清を回収し、該上清中のＰＧＥ２濃度を測定する。ＰＧＥ２の測定には、例えばＣａｙｍａｎ社製のＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２
ＥＩＡ測定キットを用いることができる。
Ｇ１６−ＧＰＣＲが導入された細胞の細胞内カルシウム濃度が非導入細胞の細胞内カルシウム濃度と比較して増大している場合には、導入したＧＰＣＲはＧＰＣＲとしての機能を有しているといえる。
【００４８】
（４）種々の組織からのＧＰＣＲの単離
本発明者は、単離しようとするＧタンパク質共役型受容体（味覚受容体）の遺伝子は、通常発現する組織においても発現していると考えた。そこで、舌以外の組織を遺伝子供与源としてＧＰＣＲを単離するために、既知のＧＰＣＲ（味覚受容体：ＴＨＴＲ１、ＴＨＴＲ３、ＴＨＴＲ５；Ｔ２Ｒ１、Ｔ２Ｒ３、Ｔ２Ｒ４、Ｔ２Ｒ５、Ｔ２Ｒ７、Ｔ２Ｒ８、Ｔ２Ｒ９、Ｔ２Ｒ１０、Ｔ２Ｒ１３、Ｔ２Ｒ１４、Ｔ２Ｒ１６）を用いて上記味覚受容体の発現確認を行った（下記実施例１）。その結果、試験した１４種のＧＰＣＲのうち、ＴＨＴＲ１（図３）以外の１３種は脳組織において発現していることが認められた（図３、４、７及び８を参照）。またヒト心臓由来のｃＤＮＡにおいて発現確認を行った４種のＧＰＣＲのうち、１種の発現を検出することができた（図６）。またヒト腎臓由来のｃＤＮＡにおいて発現確認を行った３種のＧＰＣＲのうち、２種（Ｔ２Ｒ１４及びＴ２Ｒ１６）は発現を検出することができた（図７）。さらにヒト血管内皮組織（臍帯）由来のｃＤＮＡにおいて発現確認を行った３種のＧＰＣＲのち、１種（Ｔ２Ｒ１６）は発現を検出することができた（図７）。
【００４９】
一方、ゲノムＤＮＡにおいて発現確認を行った４種のＧＰＣＲのうち、１種類しか発現を検出することができなかった（図５）。
またＴＨＴＲ１及びＴＨＴＲ５に関しては、脳、肺、心臓、胃、膵臓、腎臓及び胎盤においても発現確認を行い（下記実施例１）、ＴＨＴＲ５がそれらの全ての組織において発現していることを確認した（図２Ｂ）。
従って、味覚受容体遺伝子、ＴＨＴＲ１、ＴＨＴＲ３、ＴＨＴＲ５；Ｔ２Ｒ１、Ｔ２Ｒ３、Ｔ２Ｒ４、Ｔ２Ｒ５、Ｔ２Ｒ７、Ｔ２Ｒ８、Ｔ２Ｒ９、Ｔ２Ｒ１０、Ｔ２Ｒ１３、Ｔ２Ｒ１４、Ｔ２Ｒ１６などの単離においては、舌以外の組織が有用な遺伝子供与源であることが確認された。
【００５０】
２．本発明のＴＨＴＲ９タンパク質及びそれをコードする遺伝子
（１）ＴＨＴＲ９タンパク質及びそれをコードする遺伝子
上述のＧタンパク質共役型受容体の単離方法により、本発明者は新規なＧタンパク質共役型受容体をヒト脳組織から単離することに成功した。この受容体のアミノ酸配列と既知味覚受容体のアミノ酸配列との相同性分析から、この新規なＧタンパク質共役型受容体が新規な味覚受容体ＴＨＴＲ９であることが判明した（図１）。
【００５１】
配列番号１に、本発明のＴＨＴＲ９をコードする遺伝子の塩基配列を、配列番号２に本発明のＴＨＴＲ９タンパク質のアミノ酸配列を例示するが、このアミノ酸配列を含むタンパク質がＧタンパク質共役型受容体として機能する限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは１個若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。
【００５２】
「Ｇタンパク質共役型受容体としての機能」としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。「Ｇタンパク質共役型受容体として機能する」とは、例えば配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質とほぼ同等の機能を有することを指す。従って、配列番号２に示すアミノ酸配列において変異が生じたアミノ酸を含むタンパク質のリガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質と同等（０．５〜１．５倍程度）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、当技術分野で公知の方法に従って行なうことができ、例えば、後述するリガンドの決定方法に記載のようにして測定することができる。
【００５３】
例えば、本発明の変異型タンパク質においては、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２で表わされるアミノ酸配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。但し、本発明の変異型タンパク質は、膜貫通部位以外の部分に変異（欠失、置換又は付加）が含まれるものが好ましい。従って、配列番号２に示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号１〜７、３１〜４５、６９〜９０、１１４〜１２７、１５１〜１７９、２０３〜２２８、及び２５２〜３０９に変異が含まれていてもよい。
【００５４】
また、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、ＧＰＣＲとして機能するタンパク質をコードする遺伝子も本発明のＴＨＴＲ９遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸、すなわち６０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。ストリンジェントな条件とは、例えばナトリウム濃度が、１０〜３００ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭであり、温度が２５〜７０℃、好ましくは４２〜５５℃における条件をいう。
【００５５】
なお、ＴＨＴＲ９遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ シリーズキットを用いて変異の導入が行われる。
【００５６】
一旦ＴＨＴＲ９遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又はクローニングされたｃＤＮＡを鋳型とした増幅反応によって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、ＴＨＴＲ９遺伝子を得ることができる。さらに、部位特定変異誘発等によってＴＨＴＲ９タンパク質をコードする修飾されたＤＮＡを合成することもできる。
【００５７】
また、本発明のタンパク質には、ＴＨＴＲ９タンパク質の部分ペプチドも包含される。そのような部分ペプチドとしては、本発明のＴＨＴＲ９タンパク質の部分ペプチドであればいずれのものであってもよいが、例えば、ＴＨＴＲ９タンパク質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、受容体結合活性を有するものなどが用いられる。具体的には、ＴＨＴＲ９タンパク質の部分ペプチドとしては、ヒドロパシープロット解析において細胞外領域（親水性部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでもよい。本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記ＴＨＴＲ９タンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
【００５８】
本発明のＴＨＴＲ９タンパク質又はその部分ペプチドは、前述したヒトや哺乳動物の細胞又は組織から当技術分野で公知のタンパク質の精製方法によって製造することができる。また、ＴＨＴＲ９タンパク質をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体を培養することによっても製造することができる（下記参照）。また、当技術分野で公知の化学的ペプチド合成方法、例えば固相合成法などによって製造することもできる。
【００５９】
（２）組換えベクター及び形質転換体の作製
本発明の組換えベクターは、上記ＴＨＴＲ９遺伝子を適当なベクターに連結することにより得ることができ、形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的の遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。
【００６０】
ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。プラスミド ＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２， ｐＢＲ３２５， ｐＵＣ１１８， ｐＵＣ１１９， ｐＵＣ１８， ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０， ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３， ＹＥｐ２４， ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などを用いて形質転換体を作製することもできる。
ベクターに本発明のＴＨＴＲ９遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター ＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００６１】
本発明のＴＨＴＲ９遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明のＴＨＴＲ９遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。さらに、大腸菌及び酵母などの２種以上の宿主微生物で自律的増殖が可能なベクターのほか、各種のシャトルベクターを使用することもできる。このようなベクターについても、前記制限酵素で切断し、その断片を得ることができる。
【００６２】
ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。そして、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングさせた後に連結させ、組換えベクターを作製する。
形質転換に使用する宿主としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
【００６３】
細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明のＴＨＴＲ９遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５αなどが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００６４】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）などが用いられる。この場合、プロモーターは酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等を用いることができる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００６５】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等が用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００６６】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
形質転換体は、導入する遺伝子内に構成されるマーカー遺伝子の性質を利用して選択される。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を用いた場合には、Ｇ４１８薬剤に抵抗性を示す細胞を選択する。
【００６７】
（３）ＴＨＴＲ９タンパク質の生産
本発明のＴＨＴＲ９タンパク質は味覚受容体であるため、味覚として感知されるリガンド物質を決定するために利用することができる。
本発明において、目的のタンパク質（味覚受容体タンパク質）は、目的遺伝子を保有する前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００６８】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００６９】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、又はその他の含窒素化合物が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００７０】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、約３７℃で約５時間〜３０日間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００７１】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００７２】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で約５時間〜３０日間行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００７３】
培養後、目的のＴＨＴＲ９タンパク質は細胞表面上に生産されるため、菌体又は細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から目的のタンパク質を単離精製することができる。
目的のタンパク質が得られたか否かは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認することができる。
【００７４】
３．ＴＨＴＲ９タンパク質に対するリガンド
ＴＨＴＲ９タンパク質又はその部分ペプチドは、本発明のＴＨＴＲ９に対するリガンドを単離し、決定するための試薬として有用である。すなわち、本発明は、ＴＨＴＲ９タンパク質又はその部分ペプチドと、試験化合物とを接触させることを特徴とするＴＨＴＲ９タンパク質に対するリガンドの決定方法を提供する。試験化合物としては、甘味として例えばショ糖、ブドウ糖、果糖、乳糖、麦芽糖、ソルビトール、グリシン、アラニン、アスパラテート、リゾチーム、ステビオサイト、ＡｃｅｓｕｌｆａｍｅＫなどが用いられ、酸味として例えばクエン酸などが用いられ、塩味として例えば食塩などが用いられ、苦味として例えばキニン、カフェイン、フェニルアラニン、トリプトファン、アルギニン、テオフィリン、イソフムロン、テオプロミンなどが用いられ、旨味として例えばグルタミン酸ソーダ、グアノシン、イノシンなどが用いられる。例えば本発明においては、上述したような試験化合物をＴＨＴＲ９タンパク質に添加し、細胞刺激活性などを測定しながら分画し、最終的に単一のリガンドを得ることができる。また例えば本発明においてはＴＨＴＲ９が脳に多く発現していることから、ウシやブタの脳の熱水抽出物や、乳タンパク質をタンパク質分解酵素によって分解したペプチド等を、ＴＨＴＲ９を発現するＣＨＯ細胞に作用させ、その細胞内カルシウム濃度上昇又はＰＧＥ２産生を指標にして分画し、最終的には単一のリガンドを得ることができる。
【００７５】
具体的に説明すると、本発明のリガンド決定方法は、本発明のＴＨＴＲ９タンパク質又はその部分ペプチドを用いるか、または組換え型ＴＨＴＲ９タンパク質の発現系を構築し、該発現系を用いた受容体結合アッセイ系を用いることによって、ＴＨＴＲ９タンパク質に結合して細胞刺激活性を有する化合物を決定する方法である。細胞刺激活性としては、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内カルシウム遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、ｐＨの低下などを促進する活性又は抑制する活性などが挙げられる。また細胞刺激活性を有する化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられる。本発明のリガンド決定方法においては、ＴＨＴＲ９タンパク質又はその部分ペプチドと試験化合物とを接触させた場合の、例えば、該タンパク質又は該部分ペプチドに対する試験化合物の結合量や、細胞刺激活性などを測定することを特徴とする。
【００７６】
本発明のリガンド決定方法において、ＴＨＴＲ９タンパク質若しくはその部分ペプチドに対する試験化合物の結合量、又は試験化合物による細胞刺激活性は、限定するものではないが、以下の（１）〜（５）に記載するいずれかの手法により測定することができる。すなわち、
（１） 標識した試験化合物を、ＴＨＴＲ９タンパク質又はその部分ペプチドに接触させて、標識した試験化合物と該タンパク質又は該部分ペプチドとの結合量を測定する。
（２） 標識した試験化合物を、ＴＨＴＲ９タンパク質を含有する細胞又は該細胞の膜画分に接触させて、標識した試験化合物と該細胞又は該膜画分との結合量を測定する。
（３） 標識した試験化合物を、ＴＨＴＲ９タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＴＨＴＲ９タンパク質に接触させて、標識した試験化合物と該受容体タンパク質との結合量を測定する。
（４） 試験化合物を、ＴＨＴＲ９タンパク質を含有する細胞に接触させて、ＴＨＴＲ９タンパク質を介した細胞刺激活性を測定する。
（５） 試験化合物を、ＴＨＴＲ９タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した受容体タンパク質に接触させて、ＴＨＴＲ９タンパク質を介する細胞刺激活性を測定する。
特に、上記（１）〜（５）の試験を行ない、試験化合物がＴＨＴＲ９タンパク質に結合することを確認（定性的確認）した後に、改めて、（１）〜（５）の試験方法によりその結合活性又は細胞刺激活性の定量的確認を行なうことが好ましい。
【００７７】
そして、上記（１）〜（３）の試験のいずれかにより測定したＴＨＴＲ９タンパク質又はその部分ペプチドと試験化合物とを接触させた場合の結合量を、該タンパク質又は部分ペプチドとリガンドではない物質とを接触させた場合の結合量（コントロール）と比較する。それにより、試験化合物と接触させた場合の結合量が、リガンドではない物質と接触させた場合の結合量の、約１２０％以上、好ましくは約１５０％以上、例えば１２０〜３００％である場合に、該試験化合物をリガンドと決定する。ここで、「リガンドではない物質」としては、サッカリン、ステビアなどの人工甘味料などを挙げることができる。
【００７８】
あるいは、上記（４）又は（５）の試験により測定したＴＨＴＲ９タンパク質又はその部分ペプチドと試験化合物とを接触させた場合の細胞刺激活性を、リガンドではない物質と接触させた場合又は試験化合物と接触させていない場合の細胞刺激活性（コントロール）と比較する。それにより、試験化合物と接触させた場合の結合量が、リガンドではない物質と接触させた場合又は試験化合物と接触させていない場合の細胞刺激活性の、約１２０％以上、好ましくは約１５０％以上、より好ましくは約３００％以上、例えば１２０〜３００％である場合に、該試験化合物をリガンドと決定する。ここで、試験化合物と接触させない場合の細胞刺激活性は、上記（４）又は（５）の試験において、試験化合物を接触させずに、ＴＨＴＲ９タンパク質を含有する細胞又は該タンパク質を細胞膜上に発現する細胞の細胞刺激活性を測定することにより、決定することができる。
【００７９】
リガンド決定方法に用いるＴＨＴＲ９タンパク質としては、上記した本発明のＴＨＴＲ９タンパク質又はその部分ペプチドを含有するものであればいずれのものであってもよいが、動物細胞を用いて大量発現させたＴＨＴＲ９タンパク質が適している。本発明のＴＨＴＲ９タンパク質の製造方法は、上記「２．本発明のＴＨＴＲ９タンパク質及びそれをコードする遺伝子」の項目の「（３）ＴＨＴＲ９タンパク質の生産」の項に詳述したが、ＴＨＴＲ９タンパク質をコードするＤＮＡを哺乳動物細胞又は昆虫細胞で発現させて製造することが好ましい。
【００８０】
本発明のリガンド決定方法において、ＴＨＴＲ９タンパク質を含有する細胞を用いる場合には、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は、当技術分野で公知の方法に従って行なうことができる。ＴＨＴＲ９タンパク質を含有する細胞としては、ＴＨＴＲ９タンパク質を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、当技術分野で公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＴＨＴＲ９タンパク質と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。ＴＨＴＲ９タンパク質を含有する細胞又はその膜画分中のＴＨＴＲ９タンパク質の量は、１細胞当たり１０３〜１０６分子であるのが好ましく、１０５〜１０７分子であるのがさらに好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
【００８１】
本発明のＴＨＴＲ９タンパク質に対するリガンドを決定する上記の（１）〜（５）の手法を実施するためには、適当なＴＨＴＲ９タンパク質画分と、標識した試験化合物が必要である。ＴＨＴＲ９タンパク質画分としては、天然型のＴＨＴＲ９タンパク質画分、又はそれと同等の活性を有する組換え型ＴＨＴＲ９画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などを示す。標識した試験化合物としては、〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などの放射性同位体、フルオレセイン、スルホローダミン、テトラメチルローダミンなどの蛍光標識、ルシフェリンなどの化学発光標識で標識した呈味物質（例えばショ糖、ブドウ糖、果糖）などが好適である。
【００８２】
本発明のＴＨＴＲ９タンパク質に対するリガンドを決定するには、まずＴＨＴＲ９タンパク質を含有する細胞又は細胞の膜画分を、リガンド決定方法に適したバッファーに懸濁することによりＴＨＴＲ９溶液を調製する。バッファーは、リガンドとＴＨＴＲ９タンパク質との結合を阻害しないものであればいずれでもよい。例えば、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどが挙げられる。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０ＴＭ、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤、ウシ血清アルブミン又はゼラチンなどの各種タンパク質をバッファーに加えてもよい。さらに、プロテアーゼによるＴＨＴＲ９又はリガンドの分解を抑制するために、ＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加してもよい。上記ＴＨＴＲ９溶液に、一定量の標識で標識した試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために、過剰量の未標識の試験化合物を加えた反応チューブも用意する。反応の温度及び時間は、ＴＨＴＲ９量、試験化合物量などを考慮して適宜決定する。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する標識量を計測する。放射性同位体で標識した場合には、放射活性を、例えば液体シンチレーションカウンター、γ−カウンターなどにより計測することができる。蛍光標識した場合には、蛍光強度を、例えば蛍光プレートリーダー、蛍光レーザースキャナーなどにより計測することができる。全結合量（Ｂ）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ−ＮＳＢ）が０ｃｐｍを越える試験化合物を本発明のＴＨＴＲ９タンパク質に対するリガンドとして選択することができる。
【００８３】
本発明のＴＨＴＲ９タンパク質に対するリガンドを決定する上記の（１）〜（５）の手法を実施するためには、該受容体タンパク質を介する細胞刺激活性を公知の方法又は市販の測定用キットを用いて測定することができる。ここで細胞刺激活性としては、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内カルシウム遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性又は抑制する活性などが挙げられる。具体的には、まず、ＴＨＴＲ９タンパク質を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。リガンド決定を行なうにあたっては前もって新鮮な培地又は細胞に毒性を示さない適当なバッファーで交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出又は上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
上述のようにして決定されたリガンドは、ＴＨＴＲ９に結合して味覚として感知されるため、該リガンドを含有する食品用組成物は、食品の分野で、調味料、加工食品などにおいて利用することができる。
【００８４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は下記実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例１〕脳組織由来ＧＰＣＲの発現確認
ヒトゲノムプロジェクトのデータベースより検索された既知の味覚受容体１４種（ＴＨＴＲ１、ＴＨＴＲ３、ＴＨＴＲ５；Ｔ２Ｒ１、Ｔ２Ｒ３、Ｔ２Ｒ４、Ｔ２Ｒ５、Ｔ２Ｒ７、Ｔ２Ｒ８、Ｔ２Ｒ９、Ｔ２Ｒ１０、Ｔ２Ｒ１３、Ｔ２Ｒ１４、Ｔ２Ｒ１６）と、データベースから推定した推定味覚受容体（ＴＨＴＲ９）について、その遺伝子情報を基にプライマーを設計し、ゲノムＤＮＡ、及び種々の組織由来のｃＤＮＡから遺伝子の発現確認を行った。
【００８５】
具体的に説明すると、脳、肺、心臓、胃、膵臓、腎臓及び胎盤組織由来のＲＮＡは市販されているものから得た（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）。これらの組織のＲＮＡから逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ）を用いてｃＤＮＡを作製し、このｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを鋳型として、味覚受容体の５’側及び３’側の塩基配列のそれぞれ１９〜２６塩基を基にしてプライマーを設計した。そのプライマー配列を以下に示す。プライマーの名称は、味覚受容体名／Ｆ又はＲ（Ｆはフォーワード、Ｒはリバースを表す）で記載する。
【００８６】
【００８７】
図２に示すように、脳、肺、心臓、胃、膵臓、腎臓及び胎盤組織より得たｃＤＮＡをＰＣＲ法で増幅した場合には、味覚受容体遺伝子（ＴＨＴＲ５及び推定味覚受容体ＴＨＴＲ９）が増幅されて、味覚受容体遺伝子の存在を確認することができた（図２Ｂ及びＣ）。
また試験した１４種のＧＰＣＲのうち、ＴＨＴＲ１（図３）以外の１３種は脳組織において発現していることが認められた（図３、４、７及び８を参照）。
【００８８】
またヒト心臓由来のｃＤＮＡにおいて発現確認を行った４種のＧＰＣＲのうち、１種（ＴＨＴＲ９）の発現を検出することができた（図６）。またヒト腎臓由来のｃＤＮＡにおいて発現確認を行った３種のＧＰＣＲのうち、２種（Ｔ２Ｒ１４及びＴ２Ｒ１６）は発現を検出することができた（図７）。さらにヒト血管内皮組織（臍帯）由来のｃＤＮＡにおいて発現確認を行った３種のＧＰＣＲのち、１種（Ｔ２Ｒ１６）は発現を検出することができた（図７）。
【００８９】
一方、ゲノムＤＮＡにおいて発現確認を行った４種のＧＰＣＲのうち、１種類しか発現を検出することができなかった（図５）。
従って、通常は舌組織で発現している味覚受容体タンパク質を、その遺伝子に関しては、他の組織においても検出することができた。
【００９０】
〔実施例２〕ＴＨＴＲ９の単離
本実施例は、新規なＧＰＣＲの単離に関するものである。この新規なＧＰＣＲをＴＨＴＲ９と称する。
（１）ＴＨＴＲ９のクローニング
上記実施例１で得られたＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル精製法により精製後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＺｅｒｏＢｌｕｎｔＴＯＰＯクローニングキットを用いて付属のマニュアルに従ってクローニングを行った。
【００９１】
カナマイシンを含むＬＢ平板培地上にできた８９個の大腸菌のコロニーより、１０コロニーをカナマイシンを含んだ液体ＬＢ培地で一晩振盪培養してＴＨＴＲ９が挿入されたベクターを持つ大腸菌を増殖した。増殖した大腸菌は遠心操作によって集め、キアゲン社のＱＩＡｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔを用いてプラスミドの精製を行った。精製したベクター中にＴＨＴＲ９塩基配列の挿入の有無を調べるため、ベクター中のＰＣＲ産物挿入部位の上流及び下流に１つずつ存在する制限酵素ＥｃｏＲＩ部位を利用して、制限酵素ＥｃｏＲＩで３７℃、３時間処理することにより、ベクター中からＰＣＲ産物の切り出しをおこなった。アガロースゲル電気泳動によって目的遺伝子と同等の位置にバンドを確認した。挿入塩基配列の確認を行ったところ、培養した１０コロニー全てにＴＨＴＲ９と思われる長さのバンドが確認できた。「ＴＨＴＲ９−１４」、及び「ＴＨＴＲ９−１５」というクローンを選びだし、塩基配列確認のためＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＡＢＩＰＲＩＳＭ３１０オートシーケンサを用いて塩基配列の確認を行った。シーケンスの結果、そのどちらもＴＨＴＲ９と同じ塩基配列であることが認められた。
【００９２】
（２）塩基配列決定
ＴＨＴＲ９の塩基配列の決定には、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０オートシーケンサを用いた。キアゲン社のＱＩＡｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔによって精製されたプラスミドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のラベリングキット（ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｏｎ）とＰＣＲに使用するサーマルサイクラーを用いてラベリングした。使用するプライマーは、ＴＨＴＲ９を増幅する時に用いたプライマー（ＴＨＴＲ９／Ｆ：配列番号３、ＴＨＴＲ９／Ｒ：配列番号４）とともに、使用したｐＣＲ ４ Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ ベクター中にあるＭ１３系のプライマー（Ｍ１３ ｐｒｉｍｅｒ，ＲＶ， Ｍ１３ ｐｒｉｍｅｒ Ｍ３）の４種類のプライマーを用いてラベリングを行った。プライマーの配列を以下に示す：
【００９３】
（３）既知味覚受容体との相同性分析
ＴＨＴＲ９と他の味覚受容体との相同性についてはＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／）のサイトを利用した。ＴＨＴＲ９とＴ２Ｒ受容体（Ｔ２Ｒ１，Ｔ２Ｒ３，Ｔ２Ｒ４，Ｔ２Ｒ５，Ｔ２Ｒ７，Ｔ２Ｒ８，Ｔ２Ｒ９，Ｔ２Ｒ１０，Ｔ２Ｒ１３，Ｔ２Ｒ１４，Ｔ２Ｒ１６）についてそれぞれのアミノ酸の配列を上記サイトに入力し、マルチプルアライメントによりその相同性の計算を行った。
相同性分析の結果、図１に示すように、ＴＨＴＲ９が既知の味覚受容体と相同性を有することが判明した。
【００９４】
〔実施例３〕ＴＨＴＲ９のＧＰＣＲとしての機能確認とリガンド決定
（１）ＧＰＣＲとしての機能確認
上記実施例２において得られたクローン番号ＴＨＴＲ９−１４遺伝子の下流にＧα１６遺伝子を融合させた。これによってＴＨＴＲ９−１４がどのＧタンパク質と共役しても、受容体遺伝子下流に融合されたＧα１６との共役により、受容体刺激時に細胞内カルシウムの動員がおこることにより、受容体のリガンドが決定できる。
ＴＨＴＲ９−１４にＧタンパク質αサブユニットＧα１６を融合する方法を以下に示す。
【００９５】
ＴＨＴＲ９−１４をテンプレートにプライマーＴＨ９−ＳＡＬ／Ｆ（ＡＣＧ ＣＧＴ ＣＧＡ ＣＡＴ ＧＡＴＡ ＡＣＴ ＴＴＴ ＣＴＡ ＣＣＣ：配列番号４１）とＴＨＴＲ９／Ｒ（配列番号４）を用いてタカラのＥＸ ＴａｑでＰＣＲを施行した。これによってＴＨＴＲ９−１４の５’側には後のクローニングで使用するＳａｌ Ｉ部位が組み込まれた。また上記Ｇα１６をテンプレートにＴＨ９−Ｇ１６（ＡＡＡ ＧＧＡＧＡＧ ＡＡＧ ＡＣＴ ＴＣＡ ＴＣＴ ＣＣＡ ＡＴＧ ＧＣＣ ＣＧＣ ＴＣＧ ＣＴＧ ＡＣＣ：配列番号４２）とＧ１６−３’Ｋ（ＧＧＡ ＣＴＡ ＧＴＴ ＣＡＣ ＡＧＣ ＡＧＧ ＴＴＧ ＡＴＣ ＴＣＧ Ｔ：配列番号４３）の間でＰＣＲを施行した。このＰＣＲによってＧα１６の５’側にはＴＨＴＲ９の３’側の８アミノ酸分の塩基配列（ＴＨＴＲ９−１４の終止コドンは除く）と３’側には後のクローニングで必要になるＳｐｅＩ部位が組み込まれる。ＰＣＲ条件は、はじめに９５℃３分間で変性したのち、９５℃−３０秒、５４℃−３０秒、７２℃−１分の条件を２５回行い、２５回終了した後、７２℃で７分間伸長させた。図９Ａにおいて、ＴＨＴＲ９−１４をテンプレートにし、Ｓａｌ Ｉ部位が組み込まれたＰＣＲ産物とＧα１６にＴＨＴＲ９の３’側の８アミノ酸分の塩基配列とＳｐｅ Ｉ部位が組み込まれたＰＣＲ産物がシングルバンドとして認められた（それぞれレーン３及びレーン２）。
【００９６】
ＴＨＴＲ９−１４とＧα１６との融合において、次に上記で得られたＴＨＴＲ９とＧα１６のＰＣＲ産物（図９Ａ中、レーン２及び３）を混合してＰＣＲをタカラのＥＸ Ｔａｑを用いて施行した。このとき９５℃−３０秒、６０℃−３０秒、７２℃−２分を７回くりかえした。この反応液に上記プライマーＴＨ９−ＳＡＬ／Ｆ（配列番号４１）とＧ１６−３’Ｋ（配列番号４３）を加えて再びＰＣＲを施行した。このときのＰＣＲ条件は９５℃−３０秒、５４℃３０秒、７２℃−２分を２５回くりかえし、その後７２℃で７分間伸長させて終了した。それによって得られたＰＣＲ産物は図９Ｂのレーン２に示した（レーン１はマーカを示している）。
【００９７】
図９Ｂのレーン２のなかで最も濃く、大きさが約２０００ｂｐほどのバンドを精製用アガロースゲルを用いて切り出して、Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社のＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＶＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔを用いてクローニングした。得られたクローンはＴＨＴＲ９−Ｇ１６では９クローンであった。ここで制限酵素ＥｃｏＲＩを用いてインサートチェックをしたところ、６クローン中２クローンにインサートが確認された。
得られたクローンについて、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０を用いてシーケンスを行った。
【００９８】
５μｇのＴＨＴＲ９−Ｇ１６を Ｓｐｅ ＩとＳａｌ Ｉで消化した。これを精製用アガロースゲルに泳動して、約２０００ｂｐ前後のバンドの部分のゲルを、カミソリを用いて切り出した。このゲル小片をＴＡＥとともに数ｃｍの透析チューブに入れ、通常使用する電気泳動装置（ミューピッド）中に置き、ＤＮＡフラグメントが電気泳動によって陽極側に移動することを利用してアガロースゲル小片と、Ｓａｌ Ｉ／Ｓｐｅ Ｉフラグメントに分離した。透析チューブ中のＴＡＥに溶出したフラグメントをエタノール沈殿法によって取り出した。ここで得られたフラグメントは１５μｌのＴＥによって溶解させ、そのうちの２μｌをエチジウムブロマイドを含んだアガロースゲルを用いたミューピッドで電気泳動を行い、ＵＶ光源下で、約２０００ｂｐ付近に目視できるバンドを確認した。
【００９９】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳのマルチクローニングサイトを組み込んだｐＥＦ−ＢＯＳ−ＫＳをＳｐｅＩとＳａｌ Ｉで消化した。これを精製用アガロースゲルで泳動し、約６０００ｂｐ前後のバンドの部分のゲルを、カミソリを用いて切り出し、アガロースゲル小片を上記と同様に処理を行った。エタノール沈殿で得られたフラグメントを上記同様に１５μｌのＴＥに溶解して、上記と同様の方法でそのフラグメントが目視できるか否かを確認した。
【０１００】
それぞれで得られたインサート、ならびにベクターを１μｌづつ混合して、ＴＯＹＯＢＯのＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈを用いて、両フラグメントを１６℃にて１時間反応させた。この反応液１μｌをＴＯＹＯＢＯのコンピテントセル Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＤＨ５αに加え、氷中に３０分放置後４２℃で３０秒間熱ショックをかけて上記ベクターをコンピテントセルに導入した。熱ショック後に９００μｌのＳＯＣを加えて３７℃で４０分間培養した後、アンピシリンを含むＬ／Ｂプレートに塗布して、３７℃で終夜培養した。プレート上にあらわれたコロニーから、１０個を滅菌爪楊枝で取り上げ、そのそれぞれをアンピシリンを含む１０ｍｌのＬ／Ｂ液体培地に加え、終夜３７℃で振盪培養した。増殖した大腸菌液の一部はグリセロールを用いて−２０℃に保存した。残りの大腸菌液は４℃で６０００回転１０分間、遠心分離を行い、そのペレットよりＱｉａｇｅｎ社のＱＩＡｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔを用いてプラスミドを得た。
インサートの確認は、ＴＨ９−ＳＡＬ／Ｆプライマー（配列番号４１）及びＧ１６−３’Ｋプライマー（配列番号４３）にタカラのＥＸ Ｔａｑを用いてＰＣＲを施行した。
【０１０１】
ＰＣＲは、９５℃−３０秒、５４℃３０秒、７２℃−２分を２５回くりかえし、その後７２℃で７分間伸長させて終了した。エチジウムブロマイドを含んだアガロースゲルでＰＣＲ産物を泳動し、ＵＶ光源のもと、約２０００ｂｐのＰＣＲ産物が確認できるプラスミドを得た。
【０１０２】
実験に使用するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌｅｎｅｘａ， ＫＳ）を含むＨａｍ’ｓ Ｆ−１２培地（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）にペニシリン／ストレプトマイシン（それぞれ５０ Ｕ／ｍｌ及び５０μｇ／ｍｌ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を加えて、５％ＣＯ２存在下３７℃で培養した。上記プラスミドのＣＨＯ細胞への導入はＴｒａｎｓＦａｓｔ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用い、方法はそのマニュアルに従った。上記のプラスミド５μｇとｐＥＦ−ＢＯＳのマルチクローニングサイトにネオマイシン耐性遺伝子を組み込んだプラスミドｐＥＦ−ｎｅｏの２μｇを、６０ｍｍのディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ）上で培養したＣＨＯ細胞に加えた。１時間後、培養液を通常使用するＨａｍ’ｓ Ｆ−１２培地に交換して４８時間培養した。その後Ｇ４１８（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ， Ｉｎｃ． Ｋｙｏｔｏ）４００μｇ／ｍｌを含む培養液で１０日間培養を行い、Ｇ４１８に耐性のある細胞を選択し、ＴＨＴＲ９とＧα１６を安定的に発現した細胞を得た。得られた細胞はクローニングシリンダーを用いて、４クローンをクローニングした。細胞中にＴＨＴＲ９−Ｇ１が発現しているか否かを、それらクローンからＴＲＩＺＯＬ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を用いて得られたＴｏｔａｌ ＲＮＡより、ｏｌｉｇｏ−ｄＴと逆転写酵素Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を用いたＲＴ−ＰＣＲを施行した。上記でも使用したＴＨ９−ＳＡＬ／Ｆプライマー（配列番号４１）及びＧ１６−３’Ｋプライマー（配列番号４３）を用いて、タカラのＥＸ Ｔａｑを用いてＰＣＲを施行した。ＰＣＲは９５℃−３０秒、５４℃３０秒、７２℃−２分を２５回くりかえし、その後７２℃で７分間伸長させて終了した。エチジウムブロマイドを含んだアガロースゲルでＰＣＲ産物を泳動し、ＵＶ光源のもと、約２０００ｂｐのＰＣＲ産物が確認できる細胞を得た。得られた細胞は２００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含む培地で培養した。
【０１０３】
細胞に発現したＧα１６をウェスタンブロッティング法によって確認した。６０ｍｍのディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ）上に培養した細胞をダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ）を用いて一回洗浄し、細胞をラバーポリスマンを用いて集め０．２５ｍｌの１×ＳＤＳサンプルバッファー（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ６．８， ６％ ２−メルカプトエタノール， ２％ ＳＤＳ， ０．１％ ブロムフェノールブルー， １０％グリセロール）に溶解した。この細胞溶解液をソニケーター（Ｔｏｍｙ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ）を１０秒間用いて超音波処理を行った。超音波処理を行った細胞溶解液を１５０００ｒｐｍで５分間室温で遠心し、遠心上清を１２％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った。泳動が終了したゲルはポリビニリデンジフルオリド膜（０．２μｍ， ＦｌｕｏｒｏｔｒａｎｓＴＭ， Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．）に電気的に転写した。この膜は５％のスキムミルクと０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）を含むＰＢＳでブロッキングした。マウスのＧα１５のＣ末端側の１７個のアミノ酸（８０２ ＱＥＨＬＧＨＰＬＰＱＱＤＧＨＰＧＲ ８５５：配列番号４４）の配列をもとにして作製されたペプチドに対する家兎抗体（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ Ｃｏ．， Ｎａｇｏｙａ， Ｊａｐａｎ）を１：１，０００に希釈したＰＢＳ（５％のスキムミルクと０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む）中に、ゲルを転写した膜を室温で２時間作用させた。
【０１０４】
その後、この膜は０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳで３回洗い、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）ラベルの抗ウサギＩｇＧ抗体（ＢｉｏＲａｄ， １：５，０００希釈）を含むＰＢＳ（０．５％スキムミルクと０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む）に室温で２時間反応させた。０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳで膜を３回洗い、ＥＣＬ化学発光ウエスタンブロット検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてＧα１６のバンドを確認した。
【０１０５】
（２）リガンド決定
ＴＨＴＲ９発現が確認されたＣＨＯ細胞を２４ウエルのマルチプレートで培養した。２〜４日前後で細胞数がコンフルエントになった。
今まで使っていた培養液を捨てて、０．５ｍｌのＰＢＳで一回ウエルを洗った。ウエルが乾かないうちにグルコースやフルクトースなどの呈味物質を含む培養液（ＣＨＯ細胞ではＨａｍ Ｆ−１２を使用）を０．２ｍｌ、静かに培養細胞を剥がさないように加えた。５％ＣＯ２存在下、３７℃で４時間培養した（リガンドによる４時間の刺激）。４時間後、培養液を回収し、遠心によって細胞残渣を取り除いて遠心上清中のＰＧＥ２をＣａｙｍａｎ社製のＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２ ＥＩＡ測定キットを用いて測定した。結果は、ウエルあたりのＰＧＥ２産生量で比較した。
【０１０６】
ここでコントロール（呈味物質を添加してない、又は水などリガンドとならない物質を添加して培養した細胞群）と比較して、１２０〜１５０％以上ＣＨＯ細胞からのＰＧＥ２産生の増大があった呈味物質について再度同様の測定を行った。その後、濃度応答曲線を作成できるように呈味物質の濃度を変更して再度測定を行った。
【０１０７】
【発明の効果】
本発明によれば、Ｇタンパク質共役型受容体遺伝子単離方法において、該Ｇタンパク質共役型受容体が通常発現している組織以外の組織に由来するＲＮＡを用いることによって、ほとんど入手不可能な組織を用いることなく、ヒトの特定の遺伝子（ＧＰＣＲ）を単離することができる。
また、本発明によれば、将来的に、新規に作成されたデータベースを用いて、既知又は未知を問わずにＧＰＣＲ遺伝子を単離及び取得することができるため、ＧＰＣＲ遺伝子の取得と解析、ＧＰＣＲのリガンド決定に有用である。
【０１０８】
【配列表】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３〜３６：合成オリゴヌクレオチド
配列番号３７：合成オリゴヌクレオチド
配列番号３８：合成ペプチド
配列番号３９〜４３：合成オリゴヌクレオチド
配列番号４４：合成ペプチド
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】ＴＨＴＲ９のアミノ酸配列と既知の味覚受容体（Ｔ２Ｒ１、Ｔ２Ｒ３、Ｔ２Ｒ４、Ｔ２Ｒ５、Ｔ２Ｒ７、Ｔ２Ｒ８、Ｔ２Ｒ９、Ｔ２Ｒ１０、Ｔ２Ｒ１３、Ｔ２Ｒ１４及びＴ２Ｒ１６）のアミノ酸配列とのマルチプルアライメントを行った結果を示す図である。
【図１Ｂ】ＴＨＴＲ９のアミノ酸配列と既知の味覚受容体（Ｔ２Ｒ１、Ｔ２Ｒ３、Ｔ２Ｒ４、Ｔ２Ｒ５、Ｔ２Ｒ７、Ｔ２Ｒ８、Ｔ２Ｒ９、Ｔ２Ｒ１０、Ｔ２Ｒ１３、Ｔ２Ｒ１４及びＴ２Ｒ１６）のアミノ酸配列とのマルチプルアライメントを行った結果を示す図である。（図１Ａの続き）
【図２】ＴＨＴＲ１（Ａ）、ＴＨＴＲ９（Ｂ）及びＴＨＴＲ５（Ｃ）を基に設計したプライマーを用いて種々の組織由来のｃＤＮＡを鋳型として行ったＰＣＲにより増幅された断片の電気泳動写真を示す図である。
１：脳、２：肺、３：心臓、４：胃、５：膵臓、６：腎臓、及び７：胎盤
【図３】ＴＨＴＲ１及びＴＨＴＲ５、並びにＴ２Ｒ１、Ｔ２Ｒ５及びＴ２Ｒ８を基に設計したプライマーを用いて脳組織由来のｃＤＮＡを鋳型として行ったＰＣＲにより増幅された断片の電気泳動写真を示す図である。
【図４】Ｔ２Ｒ３、Ｔ２Ｒ４、Ｔ２Ｒ７、Ｔ２Ｒ９、Ｔ２Ｒ１０、Ｔ２Ｒ１３、Ｔ２Ｒ１４及びＴ２Ｒ１６を基に設計したプライマーを用いて脳組織由来のｃＤＮＡを鋳型として行ったＰＣＲにより増幅された断片の電気泳動写真を示す図である。
【図５】ＴＨＴＲ１、並びにＴ２Ｒ５、Ｔ２Ｒ１４及びＴ２Ｒ１６を基に設計したプライマーを用いてヒトゲノムＤＮＡを鋳型として行ったＰＣＲにより増幅された断片の電気泳動写真を示す図である。
【図６】ＴＨＴＲ１及びＴＨＴＲ９、並びにＴ２Ｒ１４及びＴ２Ｒ１６を基に設計したプライマーを用いて心臓組織由来のｃＤＮＡを鋳型として行ったＰＣＲにより増幅された断片の電気泳動写真を示す図である。
【図７】ＴＨＴＲ１、ＴＨＴＲ３、ＴＨＴＲ５及びＴＨＴＲ９、並びにＴ２Ｒ１４及びＴ２Ｒ１６を基に設計したプライマーを用いて脳、臍帯及び腎臓組織由来のｃＤＮＡを鋳型として行ったＰＣＲにより増幅された断片の電気泳動写真を示す図である。
レーン１：Ｔ２Ｒ１４（臍帯）、レーン２：Ｔ２Ｒ１６（臍帯）、レーン３：Ｔ２Ｒ１４（腎臓）、レーン４：Ｔ２Ｒ１６（腎臓）、レーン５：ＴＨＴＲ３（脳）、レーン６：ＴＨＴＲ５（脳）、レーン７：ＴＨＴＲ１（臍帯）、レーン８：ＴＨＴＲ１（腎臓）、Ｌ：マーカー
【図８】ＴＨＴＲ１、ＴＨＴＲ３、ＴＨＴＲ５及びＴＨＴＲ９、並びにＴ２Ｒ１４を基に設計したプライマーを用いて脳及び臍帯組織由来のｃＤＮＡを鋳型として行ったＰＣＲにより増幅された断片の電気泳動写真を示す図である。
レーン１：ＴＨＴＲ３（脳）、レーン２：ＴＨＴＲ５（脳）、レーン３：ＴＨＴＲ９（脳）、レーン４：ＴＨＴＲ１（臍帯）、レーン５：ＴＨＴＲ１（腎臓）、レーン６：Ｔ２Ｒ１４（臍帯）、Ｌ：マーカー
【図９】ＴＨＴＲ９−１４とＧα１６との融合において得られたＰＣＲ断片の電気泳動写真を示す図である。
（Ａ）レーン１：マーカー、レーン２：ＳａｌＩ部位が組み込まれたＰＣＲ産物、レーン３：Ｇα１６にＴＨＴＲ９の３’側の８アミノ酸分の塩基配列とＳｐｅＩ部位が組み込まれたＰＣＲ産物
（Ｂ）レーン１：マーカー、レーン２：ＴＨＴＲ９とＧ１６αが融合したＰＣＲ産物
Claims (15)
- Ｇタンパク質共役型受容体遺伝子を単離する方法であって、以下のステップ：
（ａ） 既知のＧタンパク質共役型受容体遺伝子若しくはその周辺領域の配列情報、又は推定したＧタンパク質共役型受容体遺伝子の配列情報を基にプライマーを設計するステップ、
（ｂ） 上記設計したプライマーを用いて、該Ｇタンパク質共役型受容体が発現する組織以外の組織に由来するｃＤＮＡライブラリーを鋳型とした増幅反応を行って、得られた増幅断片をクローニングするステップ、及び
（ｃ） 上記クローニングした遺伝子がＧタンパク質共役型受容体としての機能を有するかどうかを確認するステップ、
を含むことを特徴とするＧタンパク質共役型受容体遺伝子の単離方法。 - Ｇタンパク質共役型受容体が舌組織で発現するものである請求項１記載の方法。
- Ｇタンパク質共役型受容体が味覚受容体である請求項１又は２記載の方法。
- Ｇタンパク質共役型受容体が発現する組織以外の組織が脳組織である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ） 配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ） 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、Ｇタンパク質共役型受容体として機能するタンパク質 - ヒト由来のものである請求項５記載のタンパク質。
- 味覚受容体である請求項５又は６記載のタンパク質。
- 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ） 配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ） 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、Ｇタンパク質共役型受容体として機能するタンパク質 - 以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ） 配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ） 配列番号１に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｇタンパク質共役型受容体として機能するタンパク質をコードするＤＮＡ - 請求項８又は９記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求項１０記載のベクターを含む形質転換体。
- 請求項１１記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からＧタンパク質共役型受容体タンパク質を採取することを特徴とするＧタンパク質共役型受容体タンパク質の製造方法。
- 請求項５〜７のいずれか１項に記載のタンパク質又はその部分ペプチドと試験化合物とを接触させたときの結合量又は細胞刺激活性が、
該タンパク質若しくは部分ペプチドと接触させていない場合又はリガンドではない物質と接触させた場合と比較して１２０％以上となる、請求項５〜７のいずれか１項に記載のタンパク質に対するリガンド。 - 請求項１３記載のリガンドを含有することを特徴とする食品用組成物。
- 請求項５〜７のいずれか１項に記載のタンパク質又はその部分ペプチドと試験化合物とを接触させ、それらの結合量又は細胞刺激活性を測定することを特徴とする、請求項５〜７のいずれか１項に記載のタンパク質に対するリガンドの決定方法。
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