JP2004041198A

JP2004041198A - Method for analyzing nucleic acid base sequence

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Publication number: JP2004041198A
Application number: JP2003193144A
Authority: JP
Inventors: Nobuko Yamamoto; 山本　伸子; Hisashi Okamoto; 岡本　尚志; Tomohiro Suzuki; 鈴木　智博
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 2003-07-07
Filing date: 2003-07-07
Publication date: 2004-02-12

Abstract

【課題】複雑な解析を必要とせず、正確に遺伝子の配列を決定する方法を提供すること。
【解決手段】該未知の塩基配列の予想される複数の塩基配列の各々に対して相補的な塩基配列を有する１番〜ｎ番（ｎ≧２）の複数種の一本鎖核酸プローブの各々が基体上に互いに隔離されるように配置されているプローブアレイを用意し、複数種の一本鎖核酸プローブ毎にその完全相補一本鎖核酸を反応させた際の蛍光量を測定して、所定の蛍光量の位置をポジティブとしたパターンを作成し、標的一本鎖で同様にして得られるパターンと一致するパターンに用いた完全相補一本鎖核酸の配列から標的一本鎖核酸の配列を特定する。
【選択図】　　図２An object of the present invention is to provide a method for accurately determining a gene sequence without requiring complicated analysis.
Each of a plurality of 1st to nth (n ≧ 2) single-stranded nucleic acid probes having a base sequence complementary to each of a plurality of predicted base sequences of the unknown base sequence. Prepare a probe array that is arranged so as to be isolated from each other on the substrate, measure the amount of fluorescence when reacting the completely complementary single-stranded nucleic acid for each of multiple types of single-stranded nucleic acid probes, Create a pattern where the position of the predetermined amount of fluorescence is positive, and extract the sequence of the target single-stranded nucleic acid from the sequence of the fully complementary single-stranded nucleic acid Identify.
[Selection] Figure 2

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＤＮＡ診断及び治療に使用されるＤＮＡチップを用いた核酸塩基配列を特定する方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
核酸等の物質の配列を決定し、或いはその配列をチェックする手法のひとつにＤＮＡアレイを利用する方法がある。ＵＳＰ５４４５９３４には、１インチ角に１０万個以上のオリゴヌクレオチドプローブを結合したＤＮＡアレイの開示がある。このようなＤＮＡアレイは、少量の検体で一度に多項目を検査できるという利点がある。このようなＤＮＡチップ上に、蛍光標識した検体を流すと、上記ＤＮＡチップ上のプローブと相補的な配列を有するＤＮＡ断片はプローブと結合し、その部分だけが蛍光により識別でき、ＤＮＡ試料中のＤＮＡ断片の配列を解明することができる。
【０００３】
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｂｙ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＳＢＨ）法は、このようなＤＮＡアレイを利用し塩基配列を調べる方法で、ＵＳＰ５２０２２３１にその詳細が記載されている。ＳＢＨ法では、ある長さについて可能なオリゴヌクレオチドの全配列を基板上に並べ、検体ＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応によって形成される完全に相補的なハイブリッド体を検出するもので、完全に相補的なハイブリッド体のセットを得れば、そのセットはある配列について１塩基ずつずれた配列の集合になるはずであり、それらを解析することにより判定を行うものである。
【０００４】
原理的には、検体ＤＮＡ中に、ある特定の配列があるかどうかを調べるためには、その配列と相補的な配列をプローブとしてハイブリダイゼーション反応を行って結合の有無を調べることとなる。しかし、実際には、１種類のプローブでハイブリッドの有無を調べ、それを基にひとつの検査項目として判定することは非常に難しい。なぜなら、完全に相補的なハイブリッド体を比べると、ハイブリッド体由来の蛍光はそれぞれの配列により強度が異なる。特に、塩基配列中のＧＣ含量はハイブリッド体の安定性に大きな影響を与える。しかも、完全に相補的ではなく１塩基のミスマッチを含む配列でも、ハイブリッド体を形成し、蛍光を発する。そのハイブリッド体は、同じ配列間で比較すると、完全マッチのものより安定性が低く蛍光は弱くなるが、完全に相補的な他のハイブリッド体よりも蛍光強度が高いということはよく見られる現象である。また、１塩基ミスマッチとはいっても、ハイブリッド体のどの位置にミスマッチを含むかによってその安定性は大きく変化する。末端にミスマッチを含む場合には、比較的安定なハイブリッド体が得られるが、ハイブリッド体の真ん中に含む場合には相補鎖の連続部分が分割されるために不安定になる。このように、ハイブリッド体の安定性に関してはいろいろな要因が絡み合い、完全に相補的か否かを判定する蛍光強度の絶対値（基準値）というのが得られないのが現状である。また、１塩基ミスマッチを完全に排除し、完全マッチからのみの蛍光を検出しうる条件というものも得られていないといえる。
【０００５】
配列によるハイブリッド体の安定性の違いを解消するための工夫として、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　Ｖｏｌ．８２，　ｐｐ１５８５−１５８８　（１９８５）にはｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅを用いる方法が記載されている。しかし、上記問題点を完全に解消するには至っていない。
【０００６】
そこで、完全マッチか否かを判定する方法として、Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｖｏｌ．２７４　ｐ６１０−６１４，　１９９６には１５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドのプローブ配列の真ん中に１塩基ミスマッチを配した配列を用意し、完全マッチと１塩基ミスマッチとのハイブリッド由来の蛍光強度を比較し、完全マッチの方が強度が強いときにポジティブと判定するような方法が記載されている。
【０００７】
さらに、ＵＳＰ５７３３７２９には上記方法に加えてより正確な判定を行うための方法として、コンピューターを用いて、得られたハイブリッド体の蛍光強度の比較から検体の塩基配列を知るための方法が開示されている。
【０００８】
これらの方法では、調べたい位置の核酸塩基部分をプローブの真ん中に設定し、その位置に必ず４種類のヌクレオチドセットを用意すること、及びそのようなプローブのセットを１塩基ずつずれた配列について用意することが必要とされる。そして上述のような１５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを用い、真ん中に１塩基ミスマッチを有する他の３種類のプローブとの比較を行って完全マッチか否かを判定するという方法で、それぞれの安定性を、理論的に或いは経験的に評価し、より精度を得ることができるとされている。また、調べたい領域の塩基の長さがＬであれば、プローブ数は４×Ｌ（５塩基であれば２０種）になる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
上記のミスマッチを利用する方法は同じ配列の同じ位置の１塩基ミスマッチとの比較を行うことで判定が比較的容易である点、及びプローブ数が少なくて良い（ＳＢＨでは同様な解析に１０２４種のプローブが必要）点において優れた方法ではあるが、同じ領域に２塩基ミスマッチがある場合、或いは、塩基の欠損、挿入がある場合には正確な情報が得られないという重大な欠点がある。
【００１０】
一方、ＳＢＨ法は、上記問題点を解決し、原理的にはどのような変異にも対応可能な方法ではあるが、その判定はかなり難しい。それは、ある配列の完全マッチよりも別の配列の１塩基ミスマッチの方が強度が強いことや、１塩基ミスマッチとはいっても、配列中のどの位置にミスマッチがあるかによって、そのハイブリッド体の安定性が大きく異なることによる。その結果、完全マッチ、１塩基ミスマッチ、２塩基ミスマッチ（連続、不連続）は蛍光強度から単純に判断することはできず、理論的な予測、各種配列との比較、経験的なパラメーターの蓄積といった複雑な解析を必要とする。
【００１１】
さらに、ひとつひとつのプローブに関してそのハイブリッド体の強度を計測し、その値を解析して遺伝子配列を決定、判定するためには、アレイを読みとる検出装置の他に大がかりなコンピューター装置を必要とし、ＤＮＡアレイを利用した簡便な遺伝子診断を行う上で大きな障害となる。
【００１２】
このような問題点に鑑み、本発明では、複雑な解析を必要とせず、正確に遺伝子の配列を決定する方法を提供する。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
上述のように、ハイブリッド体の強度は種々の要因によって支配されており、１５ｍｅｒから２０ｍｅｒ程度の長さのプローブを用いた場合に、１塩基ミスマッチを有するハイブリッド体の蛍光強度を完全に除くことは事実上困難である。それに対し、２塩基ミスマッチを有する配列は、２塩基ミスマッチの位置、連続、不連続にかかわらず、ハイブリッド体の形成を抑制する条件を得ることが比較的容易である。
【００１４】
本発明は、このような発見に基づいてなされたものであって、完全マッチ配列のスポットに加えて、所定のミスマッチ数、例えば１塩基ミスマッチの配列を有するハイブリッド体のスポットも、ポジティブと見なす点にひとつの特徴を有する。
【００１５】
つまり、本発明の一実施態様にかかる標的一本鎖核酸の、所定の部位の、未知の塩基配列を特定する方法は、
（ａ）該未知の塩基配列の予想される複数の塩基配列の各々に対して相補的な塩基配列を有する１番〜ｎ番（ｎ≧２）の複数種の一本鎖核酸プローブの各々が基体上に互いに隔離されるように配置されているプローブアレイを用意する工程；
（ｂ）該一本鎖核酸プローブの内の１つが有する塩基配列に対して完全相補的な塩基配列を有し、かつ蛍光標識が施された標識化一本鎖核酸を含む第１のサンプルと該プローブアレイとを互いに相補的な一本鎖核酸同士が二本鎖核酸を形成する条件下で反応させ、未反応の標識化一本鎖核酸を除去したのちに、該アレイから観察される蛍光強度を該プローブアレイ上の各々の一本鎖核酸プローブについて測定し、該プローブアレイ上の各々の１本鎖核酸プローブの位置とその蛍光特性との関係を示す第１のテンプレートパターンを得る工程；
（ｃ）他の全ての一本鎖核酸プローブのそれぞれについて、該ステップ（ｂ）と同一の操作を行ない、該プローブアレイ上の１本鎖核酸プローブが各々の塩基配列に対して完全相補的な一本鎖核酸と二本鎖核酸を形成したときの該プローブアレイ上の各々の１本鎖核酸プローブの位置とその蛍光特性との関係を示す第２〜第ｎのテンプレートパターンを得る工程；
（ｄ）該プローブアレイと該標的一本鎖核酸を含む第２のサンプルとを該テンプレートパターンを得た条件と同じ条件の下で反応させ、次いで蛍光の有無及び強度を該プローブアレイ上の各々の塩基配列の一本鎖核酸プローブについて測定し、該プローブアレイ上の各々の１本鎖核酸プローブの位置とその蛍光特性との関係を示すサンプルパターンを得る工程；
（ｅ）該サンプルパターンを上記工程（ｂ）及び（ｃ）で得たｎ個のテンプレートパターンと対比し、該パターンと実質的に一致するテンプレートパターンがある場合に、そのテンプレートパターンの作成に用いた一本鎖核酸の塩基配列を該標的一本鎖核酸の、未知の塩基配列として特定する工程、
を有することを特徴とするものである。
【００１６】
また、本発明の他の実施態様は、例えば１塩基ミスマッチと２塩基ミスマッチハイブリッド体の蛍光強度との間にしきい値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を設け、ポジティブとネガティブに区別する点にひとつの特徴を有する。係る他の実施態様は、標的一本鎖核酸の所定の部位の、未知の塩基配列を特定する方法であって、
（ａ）該未知の塩基配列の予想される複数の塩基配列の各々に対して相補的な塩基配列を有する１番〜ｎ番（ｎ≧２）の複数種の一本鎖核酸プローブの各々が基体上に互いに隔離されるように配置されているプローブアレイを用意する工程；
（ｂ）該一本鎖核酸プローブの内の１番目の塩基配列に対して完全相補的な塩基配列を有し、かつ標識が施された一本鎖核酸を含む第１のサンプルと該プローブアレイとを互いに相補的な一本鎖核酸同士が二本鎖核酸を形成する条件下で反応させ、観察される蛍光を該プローブアレイ上の各々の塩基配列の一本鎖核酸プローブについて測定し、該プローブアレイ上の各々の１本鎖核酸プローブの位置とその蛍光特性との関係を示すテンプレートパターンＩを得る工程；
（ｃ）得られた第１のテンプレートパターンを解析し、各位置のプローブとミスマッチ塩基対数（ｉ）を有する二本鎖核酸の蛍光量の平均値（Ｆ_ｉ）を算出する工程；
（ｄ）ミスマッチのない完全相補的な二本鎖核酸の蛍光量（Ｆ_０）と、１塩基ミスマッチを有する二本鎖核酸の蛍光量の平均値（Ｆ_１）との差（Ｆ_１，０）を求め、さらに、（ｉ＋１）塩基ミスマッチを有する二本鎖核酸の蛍光量（Ｆ_ｉ＋１）とｉ塩基ミスマッチの蛍光量（Ｆ_ｉ）の差（Ｆ_{ｉ＋１，ｉ}）を求め、Ｆ_{ｉ，　ｉ＋１}　＜＜Ｆ_{ｉ−１，　ｉ}となるようなｉを設定する工程；
（ｅ）第２番目のプローブの塩基配列に対して、ミスマッチ塩基対の数がｉ以下になる塩基配列を有する一本鎖核酸プローブの基体上の位置をポジティブとし、ｉ＋１以上のミスマッチを有する塩基配列のプローブの基体上の位置をネガティブとし、ポジティブの位置が形成するテンプレートパターンＩＩを得る工程；
（ｆ）（ｅ）と同一の操作を他のすべての一本鎖核酸プローブについて行い、ミスマッチ塩基対の数がｉ以下になる塩基配列を有する一本鎖核酸プローブの基体上の位置が形成するテンプレートパターンＩＩＩ〜ｎを得る工程；
（ｇ）該プローブアレイと該標的一本鎖核酸を含むサンプルとを該第１のテンプレートパターンを得た条件と同じ条件の下で反応させ、蛍光の有無及び強度を該プローブアレイ上の各々の塩基配列の一本鎖核酸プローブについて測定し、該プローブアレイ上の各々の１本鎖核酸プローブの位置とその蛍光特性との関係を示すパターンを得る工程；
（ｈ）該パターンを上記工程（ｂ）（ｅ）及び（ｆ）で得たｎ個のテンプレートパターンと対比し、該パターンと実質的に一致するテンプレートパターンがある場合に、そのテンプレートパターンに対応する一本鎖核酸の塩基配列を該標的一本鎖核酸の、未知の塩基配列として特定する工程、
を有することを特徴とするものである。
【００１７】
そしてこのような態様を採用することで、上記ポジティブと区別されたスポットが基板上で形成するパターンを画像として得、それを予想パターンと比較することによりその配列を解析することができ、未知の遺伝子配列を容易に特定することができる。
【００１８】
また、本発明においては、さらにこのような１塩基ミスマッチと２塩基ミスマッチを完全に区別するためのハイブリダイゼーション反応条件を提示する。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下本発明について具体的に説明する。
（蛍光像による判定）
本発明の一実施態様では、ミスマッチを起こす可能性のある核酸塩基が近接して存在する場合に特に有効である。ここでは、癌抑制遺伝子ｐ５３の２３８番目、２３９番目のアミノ酸配列に対応する塩基配列を含む^５’ＧＡＴＧＧＧＮＣＴＣＮＮＧＴＴＣＡＴ^３’を例として説明する。上記例は、発明の概要を説明するためのひとつの形態であり、いかなる形態のアレイにおいても、本発明は画像として処理するという点では同様な概念を提示しており、何らアレイの形態、プローブの配置を限定するものではない。また、当然のことながら、ＳＢＨ法も本発明の解析対象である。
【００２０】
上記例において、Ｎで記した各塩基部分を４種の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）に置き換えたプローブの完全セットを用意した場合、つまり、３カ所（連続している必要はない）の塩基について調べる場合には、４^３＝６４種の、５カ所の場合には４^５＝１０２４種のプローブが基板上に並ぶ。
【００２１】
６４種のプローブを用いた場合の配置例を図１に示す。
【００２２】
６４種プローブアレイを４分割した左上の領域には、最初のＮがＡであるプローブ（プローブ番号１〜１６）が配置され、左下にはＧであるようなプローブ（プローブ番号１７〜３２）が配置される。同様に、右上はＣ（プローブ番号３３〜４８）、右下はＴ（プローブ番号４９〜６４）となる。各領域の中で、２番目のＮがＡであるようなプローブは左から数えて１列目、Ｇは２列目、Ｃは３列目、そしてＴは４列目に位置する。また、３番目のＮがＡであるようなプローブは上から数えて１行目、Ｇであるような配列は２行目、同様にＣが３行目、Ｔが４行目に配置される。その結果、例えば、^５’ＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＡＡＧＴＴＣＡＴ^３’といった配列は最も左上のスポットに対応する。また、正常な遺伝子に相当する配列である^５’ＡＴＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＣＡＴＣ^３’は、右から３列目、上から３行目の位置にあるプローブＤＮＡ^５’ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＡＴ^３’とハイブリッドを形成することが期待される。
【００２３】
以下、１塩基ミスマッチをポジティブスポットとして扱う場合について説明する。この場合に、完全マッチ配列が４２番のプローブ（正常遺伝子）であるとすると、ポジティブと判断される１塩基ミスマッチ配列は、塗りつぶされた９カ所となり、完全マッチと合わせて図２に示されるようなパターンを形成することが予想される。
【００２４】
これに対し、標的核酸の特定すべき配列に対する変異配列では例えば図３に示すようなパターンの変化が見られる。
【００２５】
本発明では、このような完全マッチと１塩基ミスマッチからなる予想される蛍光パターン像を予めコンピュータ等の記憶装置に入力しておき、所定の方法で得られる蛍光像との比較により判定を行う。この時、それぞれのポジティブスポットの蛍光強度の詳細な定量データは必要ない。単にあるしきい値に対するポジティブ、ネガティブの判定のみで良く、簡便かつコンピュータ等を使用した自動化された判定が可能となる。
【００２６】
（しきい値の設定）
１８ｍｅｒ程度のプローブを用いる場合には、そのしきい値を通常１塩基ミスマッチの蛍光強度と２塩基ミスマッチによる蛍光強度との間に設定するのが好ましい。蛍光強度はそれぞれの配列組成、反応条件により異なるが、最も高い蛍光強度（通常は完全マッチのもの）の５０％から２５％の値、より好適には３０％から２０％をしきい値として設定すると良い。プローブ長が短い場合には、しきい値はさらに低くなる。
【００２７】
３塩基ミスマッチを含むものは最大値の１割以下の蛍光量であり、完全に区別できる。
【００２８】
しきい値を最大蛍光量の１／４に設定した場合、完全マッチ配列及び１塩基ミスマッチ配列を４，２塩基ミスマッチ配列を１、３塩基ミスマッチ配列を０として蛍光強度の分布を予想すると図４のようになる。
【００２９】
より具体的な判定方法について上記例について説明する。
【００３０】
ハイブリダイゼーション反応が極めて選択的に進行した場合には、強い蛍光は１点（完全マッチ）に集中する。次に感度を徐々に上げると、上記配置例では図３から予想されるように、１塩基ミスマッチは完全マッチを中心に縦横のライン状に並ぶはずである。しかし、実際の蛍光像は必ずしも強いスポットを中心に縦横それぞれ３個ずつライン状に並ぶとは限らない。１塩基ミスマッチ間の安定性の違いにより、６個がすべて同じ程度の強度を有するとは限らないため、検出されないスポットもあるが、少なくともこれらのライン状にいくつかスポットが見えるはずである。その時、残る３個の１塩基ミスマッチも予想される位置に強度の濃淡はあるものの検出できる。
【００３１】
また時には、完全マッチと１塩基ミスマッチが同程度の蛍光強度を与え、最初から完全マッチと１塩基ミスマッチとの１０スポットからなる予想される像に近い画像が得られる。
【００３２】
２塩基ミスマッチは、時としてしきい値を越える場合があるが、そのような場合でも、予想パターンからのずれとして容易に判別できる。
【００３３】
このように予想パターンと実際に得られる蛍光像との比較により判定する本発明の方法は、検体遺伝子中の変異の有無を容易に判定でき、さらにどの塩基（複数でも可）が何に変異しているか変異の内容を同時に判定が可能であるという特徴を持つ。
【００３４】
また、６４種のプローブによるハイブリダイゼーション反応の結果を、パターンで評価するという考えは、１スポットのみで判断する場合に比べ、より確実な判断という点で有利である。６４種のＤＮＡプローブとのハイブリッドは、それぞれの配列により熱安定性が異なるため、必ずしも完全マッチの場合が圧倒的に安定で強い蛍光を発するという保証はない。また、基板上のゴミやハイブリダイゼーション反応時のアーティファクトといったことが原因で、どれが最強のスポットで完全マッチのスポットであるか判断できないことも多い。その点パターンでの判定は、多少の蛍光量のばらつきがあってもそれを補える。
【００３５】
（プローブ長）
本発明に用いられるプローブ長は８ｍｅｒから３０ｍｅｒ程度、より好ましくは、１２ｍｅｒから２５ｍｅｒである。８ｍｅｒ以下では１塩基ミスマッチを有するハイブリッド体の安定性は低く、完全マッチ由来の蛍光量の方が優位である。また、３０ｍｅｒより長いプローブでは２塩基ミスマッチ体の蛍光が、場合によっては（例えば、両末端にミスマッチ箇所が存在する場合）１塩基ミスマッチよりも強くなる。
【００３６】
（ハイブリダイゼーション反応条件）
上記良好なしきい値を与えるハイブリダイゼーション反応の条件としては、基板全体を検体溶液中に浸したまま加熱し、基板上のＤＮＡプローブと検体ＤＮＡの双方を同時に熱変性し、その後徐々に冷却してやや高めの温度でハイブリダイゼーション反応を行う。反応時の塩濃度は１００ｍＭ以下が望ましい。
【００３７】
熱変性を行うための温度としては、６０℃以上、好ましくは８０℃以上が適当である。熱変性のための温度の設定は、ＤＮＡアレイ基板自体の安定性、検体の長さ、濃度、標識化合物の種類に依存して決められる。例えば、樹脂を塗布しその樹脂とＤＮＡとを反応させて結合したような基板では、高温にすることにより、樹脂層が破壊されることがある。それに対し、シランカップリング剤を作製過程で用いた基板は、熱に対し比較的安定であり、さらに高温にすることができる。検体ＤＮＡが一本鎖の場合には、７０℃以上で分子内二本鎖構造はほぼ解消されると考えられるが、二本鎖の場合或いは検体ＤＮＡが長い一本鎖ＤＮＡの場合には、さらに温度を上げたり、ホルムアミド等の変性剤を加えて一本鎖への解離を促進する必要がある。熱変性に要する時間は１０分以上、好ましくは３０分程度が良い。
【００３８】
ハイブリダイゼーション反応の条件は、プローブ長、配列、検体の種類を考慮し、常法に従い温度や塩濃度を変えることによって行われる。本発明のような、極めて類似した配列を区別して認識するための条件として好適に用いられるのは、食塩１００ｍＭを含む溶液中、４５℃で３時間以上である。しかし、反応時間は検体濃度により大きな影響を受け、上記反応条件に限らない。高濃度の検体ならば３時間以内で充分判定が可能であり、また、検体溶液が希薄であれば、１０時間以上の反応時間が必要である。ホルムアミドを加える場合には食塩濃度を高める必要がある。
（ＤＮＡアレイ基板の製法）
本ハイブリダイゼーション反応を良好に進めうるＤＮＡアレイの作製方法として、以下にその例を示す。しかし、本発明の趣旨は、基板上のハイブリダイゼーションパターンを評価し、検体の塩基配列を決めるための簡便な方法を示すことであり、基本的に、基板の作製方法にはこだわらない。
【００３９】
ＤＮＡアレイでは、ＤＮＡプローブを基板表面にある官能基との反応により共有結合により固定する。該官能基とＤＮＡとの結合様式として、例えば、ガラス表面のマレイミド基とＤＮＡ末端のＳＨ基との結合反応を行わせる方法について示す。
【００４０】
マレイミド基の導入方法としては、まず、ガラス基板にアミノシランカップリング剤を反応させ、次にそのアミノ基とＥＭＣＳ試薬（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：Ｄｏｊｉｎ社製）との反応によりマレイミド基を導入する。ＤＮＡへのＳＨ基の導入は、ＤＮＡ自動合成機上５’−Ｔｈｉｏｌ−ＭｏｄｉｆｉｅｒＣ６（Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いる事により行うことができる。
【００４１】
該ＤＮＡ溶液をインクジェット法により基板上にスポットを形成させ、該ＤＮＡ基板上のマレイミド基とＤＮＡ末端のＳＨ基との反応により、プローブＤＮＡを固定化する。
【００４２】
インクジェット法によるマレイミド基を有するガラス基板への吐出に適したＤＮＡ溶液としては、グリセリン、尿素、チオジグリコール又はエチレングリコール、アセチレノールＥＨ（川村ファインケミカル社製）、イソプロピルアルコールを含む溶液が好ましい。特にグリセリン７．５％、尿素７．５％、チオジグリコール７．５％、アセチレノールＥＨ１％（いずれも質量％）を含む溶液が好ましい。
【００４３】
ＤＮＡが結合したアレイ基板は、２％ウシ血清アルブミン水溶液中に２時間浸し、ブロッキング反応を行った後、ハイブリダイゼーション反応に用いられる。
【００４４】
【実施例】
以下に実施例により、より詳細に説明する。
（実施例１：パターン認識　Ｉ）
１．プローブの設計
癌抑制遺伝子であるｐ５３遺伝子の２４８番目、２４９番目のアミノ酸配列に対応する塩基配列ＣＧＧＡＧＧの中での変異の中で頻度が高いのは、１番目のＣがＴに、２番目のＡがＧに、そして２４９番目のアミノ酸３番目のＧがＴに変異している場合であることが知られている。そこで、この３カ所の塩基配列に着目して６４種のプローブを設計した。
【００４５】
つまり、プローブ全長を１８ｍｅｒとし、その真ん中にこの変異を含む６塩基を位置させ、その前後を共通配列で挟んだ構造で、^５’ＡＴＧＡＡＣＮＮＧＡＧＮＣＣＣＡＴＣ^３’である。ここで、Ｎと表した部分が４種の核酸塩基であるＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔに対応する。プローブＤＮＡは、検出したい配列（上記配列）と相補的な配列であるので、実際には、^５’ＧＡＴＧＧＧＮＣＴＣＮＮＧＴＴＣＡＴ^３’となる。
【００４６】
図１には６４種ＤＮＡプローブのＤＮＡアレイ上での配置図を示した。各配列（配列番号：１〜６４）を具体的に表１に示す。
【００４７】
【表１】

正常な遺伝子に相当する配列である^５’ＡＴＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＣＡＴＣ^３’は、右から３列目、上から３行目の位置にある４２番のプローブＤＮＡ^５’ＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＡＴ^３’とハイブリッドを形成することが期待される。
【００４８】
６４種の実験でも、完全マッチ以外に１塩基ミスマッチのハイブリッド体からの蛍光が予想される。完全マッチと１塩基ミスマッチとからなる予想される蛍光パターンを図２に示す。
【００４９】
２．マレイミド基導入基板の作製
（基板洗浄）
１インチ角のガラス板をラックに入れ、超音波洗浄用洗剤に一晩浸した。その後、洗剤中で２０分間超音波洗浄を行い、その後、水洗により洗剤を除去した。蒸留水ですすいだ後、蒸留水のはいった容器中でさらに超音波処理を２０分間行った。次に、あらかじめ加温してあった１Ｎ水酸化ナトリウム溶液に１０分間浸した。引き続き水洗、蒸留水洗浄を行った。
【００５０】
（表面処理）
１％シランカップリング剤水溶液（信越化学工業社製、商品名ＫＢＭ６０３）に室温で２０分浸し、その後、窒素ガスを両面に吹き付けて、水分を飛ばし、乾燥させた。１２０℃に加熱したオーブンで１時間ベークしシランカップリング処理を完結させた。続いて、ＥＭＣＳ（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：Ｄｏｊｉｎ社製）を２．７ｍｇ秤量し、ＤＭＳＯ／エタノールの１：１溶液に溶解した（最終濃度　０．３ｍｇ／ｍｌ）。シランカップリング剤処理を行ったガラス基板をこのＥＭＣＳ溶液に２時間浸し、シランカップリング剤のアミノ基とＥＭＣＳ溶液のカルボキシル基を反応させた。この状態でガラス表面にはＥＭＣＳ由来のマレイミド基が表面に存在することになる。ＥＭＣＳ溶液と反応させたガラス板は蒸留水で洗浄後、窒素ガスで乾燥させ、ＤＮＡとの結合反応に用いられる。
３．ＤＮＡの基板への結合反応
（６４種ＤＮＡプローブの合成）
５’末端にＳＨ基（チオール基）を有する上記６４種のプローブＤＮＡは、（株）ベックスに依頼し合成した。
（ＤＮＡプローブの吐出）
上記６４種のＤＮＡそれぞれ用いて以下の吐出操作を行なった。各ＤＮＡを水に溶解し、ＳＧクリア（グリセリン７．５％、尿素７．５％、チオジグリコール７．５％、アセチレノールＥＨ１％を含む水溶液）を用いて最終濃度８μＭになるよう希釈した。少量のサンプルが吐出できるように改造したＢＪプリンター用ヘッドＢＣ６２（キヤノン社製）のノズルにこのＤＮＡの溶液を１００μｌ充填した。各ヘッドあたり６種のＤＮＡが吐出できるようにして２つヘッドを用い、一度に１２種のＤＮＡを吐出し、ヘッドを６回交換して、６４種のＤＮＡのそれぞれのスポットが独立して形成されるように吐出させた。
【００５１】
各プローブを、スポット径が７０μｍ、ピッチが２００μｍとなるように設定し、８×８のマトリクス状に６４種を並べてスポッティングした。その後、３０分加湿チャンバー中に放置し、プローブＤＮＡを基板に結合させる反応を行った。
・ハイブリダイゼーション反応
（ブロッキング反応）
反応終了後、１ＭＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液にて基板を洗い、ガラス表面のＤＮＡ溶液を完全に洗い流した。その後、２％ウシ血清アルブミン水溶液中に浸し、２時間放置し、ブロッキング反応を行った。
（モデル検体ＤＮＡの合成）
ｐ５３遺伝子の正常な配列を持ち、プローブＤＮＡと同じ領域で同じ長さの標識ＤＮＡＮｏ．１を作製した。配列は下に示す通りで、５’末端にはローダミンを結合してある。
【００５２】
Ｎｏ．１：^５’Ｒｈｏ−ＡＴＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＣＡＴＣ^３’
（ハイブリダイゼーション反応条件）
ＤＮＡアレイ基板の入ったハイブリダイゼーション反応用の袋に１００ｍＭ　ＮａＣｌを含む１０ｎＭモデル検体ＤＮＡ溶液を２ｍｌ入れ、最初に８０℃で１０分加熱後、インキュベーターの温度を４５℃に下げ、そのまま１５時間反応させた。
５．検出
（方法）
検出は、蛍光顕微鏡（ニコン社製）に画像解析処理装置ＡＲＧＵＳ（浜松ホトニクス社製）を接続して行った。
（結果）
モデル系である１８ｍｅｒの標識ＤＮＡ　Ｎｏ．１とのハイブリダイゼーション反応の結果得られた蛍光量を、図４に示す。蛍光量の最大値は完全に相補的である４２番のプローブである。その蛍光量を最大値（１００％）として、その２０％にしきい値を設け、それ以上のところを黒く塗りつぶしてある。
【００５３】
Ｎｏ１０，２６，５８の部分のスポットも蛍光をもち、予想パターン図２と良く一致していることがわかる。更にしきい値を下げることにより、予想パターンと一致する。つまり、上記３スポットに加え、完全マッチを中心に１塩基ミスマッチ配列の部分が縦横のラインに並ぶ。
【００５４】
（実施例２：パターン認識ＩＩ）
実施例と同様に６４種のプローブからなるＤＮＡアレイ基板を作製し、モデル検体としてＮｏ．２の配列を持つローダミン標識ＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応を行った。Ｎｏ．２の配列は図１のＮｏ．４６プローブと相補的である。
【００５５】
Ｎｏ．２：^５’Ｒｈｏ−ＡＴＧＡＡＣＣＡＧＡＧＧＣＣＣＡＴＣ^３’
ハイブリダイゼーション反応条件も実施例１と同様である。
【００５６】
実施例１と同様、予想されるパターンを求めたのが、図５である。それに対し、得られた結果を図６に示す。しきい値を最大値の１０％に設定してハイブリダイゼーション反応の結果を黒ぬりで示す。予想との対応がよい。
【００５７】
（実施例３：パターン認識　ＩＩＩ）
実施例２と同じモデル検体ＤＮＡを用いて実施例２と同様な実験を行った。但し、ハイブリダイゼーション反応に用いる検体ＤＮＡ濃度を５ｎＭとし、４０℃で一晩反応させた。得られた結果を図７に示す。
【００５８】
しきい値を５０％にすると、１塩基ミスマッチの３４及び６２番のプローブの位置（斜線部）に蛍光が現れ、さらに３０％にまでしきい値を下げると、予想パターンに合う結果となる。この場合、ＮＯ．６と２２の２塩基ミスマッチも検出されるが、１塩基ミスマッチが構成するパターンからのずれとして、２塩基ミスマッチであることが判別でき、完全マッチのスポットが４６番であることが判定可能である。
【００５９】
【発明の効果】
このように、単にハイブリッドの有無のみで判定する従来の方法に比べ、本発明の方法はさらに１塩基ミスマッチの蛍光量を考慮に入れることにより精度の良い検出が可能となった。
【００６０】
ＤＮＡプローブとのハイブリッドは、それぞれの配列により熱安定性が異なるため、必ずしも完全マッチの場合が圧倒的に安定で強い蛍光を発するという保証はない。パターンでの判定は、１スポットのみで判断する場合に比べ、より確実な判断という点で有利である。
【００６１】
基板上のゴミやハイブリダイゼーション反応時のアーティファクトといったことが原因で、どれが最強のスポットで完全マッチのスポットであるか判断できないことも多い。その点、本発明におけるパターンでの判定は、多少の蛍光量のばらつきがあってもそれを補えることが可能となる。
【００６２】
従って、本発明によって、遺伝子の変異を、簡便かつ効率的にスクリーニングできる検査方法を提供することができる。
【００６３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】６４種のプローブを用いた場合の配置例を示す。
【図２】標的核酸の配列に対して基板上のポジティブと判断される領域の配置のパターンを示す図である。
【図３】標的核酸に対する変異配列において基板上でポジティブと判断される領域の配置のパターンを示す図である。
【図４】実施例１で得られた蛍光量のパターンを示す図である。
【図５】実施例２において予想されるパターンを示す図である。
【図６】実施例２で得られた蛍光量のしきい値１０％でのパターンを示す図である。
【図７】実施例３で得られた蛍光量のパターンを示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for specifying a nucleic acid base sequence using a DNA chip used for DNA diagnosis and therapy.
[0002]
[Prior art]
One of the techniques for determining the sequence of a substance such as a nucleic acid or checking the sequence is a method using a DNA array. US Pat. No. 5,445,934 discloses a DNA array in which 100,000 or more oligonucleotide probes are bound to one inch square. Such a DNA array has the advantage that a large number of items can be tested at once with a small amount of sample. When a fluorescently labeled sample is flowed on such a DNA chip, a DNA fragment having a sequence complementary to the probe on the DNA chip binds to the probe, and only that portion can be identified by fluorescence, and the DNA fragment in the DNA sample The sequence of the DNA fragment can be elucidated.
[0003]
The Sequencing by Hybridization (SBH) method is a method of examining a base sequence using such a DNA array, and its details are described in US Pat. No. 5,202,231. In the SBH method, all possible oligonucleotide sequences for a certain length are arranged on a substrate, and a completely complementary hybrid formed by a hybridization reaction with a sample DNA is detected. If a set of hybrids is obtained, the set should be a set of sequences that are shifted from each other by one base with respect to a certain sequence, and the determination is made by analyzing them.
[0004]
In principle, in order to check whether or not a specific sequence is present in the sample DNA, a hybridization reaction is performed using a sequence complementary to that sequence as a probe to check for binding. However, in practice, it is very difficult to check for the presence or absence of a hybrid with one type of probe and determine it as one test item based on that. This is because, when completely complementary hybrids are compared, the fluorescence derived from the hybrids differs in intensity depending on each sequence. In particular, the GC content in the nucleotide sequence greatly affects the stability of the hybrid. Moreover, even a sequence that is not completely complementary but contains a mismatch of one base forms a hybrid and emits fluorescence. It is a common phenomenon that the hybrid is less stable and less fluorescent than the perfect match when compared between the same sequences, but has higher fluorescence intensity than other perfectly complementary hybrids. is there. In addition, even though a single base mismatch is present, its stability greatly changes depending on which position of the hybrid contains the mismatch. When a mismatch is contained at the end, a relatively stable hybrid is obtained, but when it is contained in the middle of the hybrid, the stability is unstable because the continuous portion of the complementary strand is split. As described above, various factors are involved in the stability of the hybrid, and at present, it is not possible to obtain an absolute value (reference value) of the fluorescence intensity for judging whether the hybrid is completely complementary or not. In addition, it can be said that no condition has been obtained under which a single base mismatch can be completely eliminated and fluorescence only from a perfect match can be detected.
[0005]
As a device for eliminating the difference in the stability of the hybrid depending on the sequence, Proc. {Natl. {Acad. {Sci. << USA >> Vol. 82, {pp1585-1588} (1985) describes a method using tetramethylammonium chloride. However, the above problems have not been completely solved.
[0006]
Thus, as a method for determining whether or not a perfect match, Science @ vol. For 274 @ p610-614, @ 1996, a sequence having a single base mismatch in the middle of a probe sequence of a 15-mer oligonucleotide was prepared, and the fluorescence intensities derived from a hybrid of a perfect match and a single base mismatch were compared. Is described as a positive when the intensity is high.
[0007]
Further, US Pat. No. 5,733,729 discloses a method for determining the base sequence of a specimen from a comparison of the fluorescence intensities of the obtained hybrids using a computer as a method for performing more accurate determination in addition to the above method. I have.
[0008]
In these methods, the nucleobase portion at the position to be examined is set in the middle of the probe, and four types of nucleotide sets must be prepared at that position, and such a probe set must be prepared for a sequence shifted by one base at a time. Is required. Using a 15-mer oligonucleotide as described above and comparing it with the other three types of probes having a single base mismatch in the middle to determine whether they are perfect matches, the stability of each is theoretically determined. It is said that it is possible to obtain more accuracy by making an empirical or empirical evaluation. Further, if the length of the base in the region to be examined is L, the number of probes is 4 × L (20 kinds for 5 bases).
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
The method using the above-mentioned mismatch is relatively easy to determine by comparing with a single-base mismatch at the same position in the same sequence, and the number of probes may be small. This method is excellent in that a probe is required), but has a serious drawback in that accurate information cannot be obtained when there is a two-base mismatch in the same region, or when there is a base deletion or insertion.
[0010]
On the other hand, the SBH method solves the above-mentioned problems and is in principle a method that can cope with any mutation, but its determination is quite difficult. The stability of the hybrid depends on the fact that a single base mismatch in another sequence is stronger than a perfect match in a certain sequence, and even though it is a single base mismatch, depending on where in the sequence the mismatch is located. This is because the sexes differ greatly. As a result, perfect match, single base mismatch, and double base mismatch (continuous or discontinuous) cannot be simply determined from the fluorescence intensity, and theoretical prediction, comparison with various sequences, accumulation of empirical parameters, etc. Requires complex analysis.
[0011]
Furthermore, in order to measure the strength of the hybrid with respect to each probe and analyze the value to determine and determine the gene sequence, a large-scale computer device is required in addition to a detection device for reading the array, and a DNA array is required. This is a major obstacle to performing simple genetic diagnosis using the method.
[0012]
In view of such problems, the present invention provides a method for accurately determining a gene sequence without requiring complicated analysis.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
As described above, the intensity of the hybrid is governed by various factors. When a probe having a length of about 15 mer to 20 mer is used, it is impossible to completely eliminate the fluorescence intensity of the hybrid having a single base mismatch. Practically difficult. On the other hand, for a sequence having a two-base mismatch, it is relatively easy to obtain conditions for suppressing the formation of a hybrid, regardless of the position, continuity, or discontinuity of the two-base mismatch.
[0014]
The present invention has been made based on such a finding, and in addition to spots of perfect match sequences, spots of a hybrid having a predetermined number of mismatches, for example, hybrids having a sequence of one base mismatch, are regarded as positive. Has one feature.
[0015]
That is, the method of specifying an unknown base sequence of a predetermined site of a target single-stranded nucleic acid according to one embodiment of the present invention comprises:
(A) each of a plurality of types of single-stranded nucleic acid probes of Nos. 1 to n (n ≧ 2) having a base sequence complementary to each of a plurality of predicted base sequences of the unknown base sequence; Providing a probe array arranged on the substrate so as to be isolated from each other;
(B) a first sample containing a labeled single-stranded nucleic acid having a nucleotide sequence completely complementary to a nucleotide sequence of one of the single-stranded nucleic acid probes and having been subjected to fluorescent labeling; After reacting the probe array with the single-stranded nucleic acids complementary to each other under conditions that form double-stranded nucleic acids, and removing unreacted labeled single-stranded nucleic acids, the fluorescence observed from the array Measuring the intensity of each single-stranded nucleic acid probe on the probe array to obtain a first template pattern indicating the relationship between the position of each single-stranded nucleic acid probe on the probe array and its fluorescence property;
(C) The same operation as in the step (b) is performed for each of all other single-stranded nucleic acid probes, so that the single-stranded nucleic acid probes on the probe array are completely complementary to each base sequence. A step of obtaining second to n-th template patterns indicating the relationship between the position of each single-stranded nucleic acid probe on the probe array when the single-stranded nucleic acid and the double-stranded nucleic acid are formed and their fluorescence characteristics;
(D) reacting the probe array with a second sample containing the target single-stranded nucleic acid under the same conditions as those for obtaining the template pattern, and then determining the presence or absence of fluorescence and the intensity on each of the probe arrays Measuring a single-stranded nucleic acid probe of the base sequence of (i) and obtaining a sample pattern indicating the relationship between the position of each single-stranded nucleic acid probe on the probe array and its fluorescence property;
(E) Compare the sample pattern with the n template patterns obtained in the above steps (b) and (c), and if there is a template pattern that substantially matches the pattern, use the template pattern to generate the template pattern. Identifying the base sequence of the single-stranded nucleic acid as the unknown base sequence of the target single-stranded nucleic acid,
Which is characterized by having
[0016]
Another embodiment of the present invention has one feature in that, for example, a threshold is provided between the fluorescence intensity of a single-base mismatch and the fluorescence intensity of a two-base mismatch hybrid to discriminate between positive and negative. Another such embodiment is a method of identifying an unknown base sequence at a predetermined site of a target single-stranded nucleic acid,
(A) each of a plurality of types of single-stranded nucleic acid probes of Nos. 1 to n (n ≧ 2) having a base sequence complementary to each of a plurality of predicted base sequences of the unknown base sequence; Providing a probe array arranged on the substrate so as to be isolated from each other;
(B) a first sample containing a labeled single-stranded nucleic acid having a base sequence completely complementary to the first base sequence of the single-stranded nucleic acid probe and the probe array Are reacted under conditions in which single-stranded nucleic acids complementary to each other form double-stranded nucleic acids, and the observed fluorescence is measured for single-stranded nucleic acid probes of each base sequence on the probe array, Obtaining a template pattern I indicating the relationship between the position of each single-stranded nucleic acid probe on the probe array and its fluorescence property;
(C) Analyzing the obtained first template pattern, the average value (F) of the amount of fluorescence of the double-stranded nucleic acid having the number of mismatched base pairs (i) with the probe at each position._i) Calculating;
(D) The amount of fluorescence (F₀) And the average value of the fluorescence amounts of the double-stranded nucleic acids having a single base mismatch (F₁) And the difference (F_1,0), And the fluorescence amount (F) of the double-stranded nucleic acid having (i + 1) base mismatch_{i + 1}) And i-base mismatch fluorescence (F_i) Difference (F_{i + 1, i}), And F_{i, i + 1}<<F_{i-1, i}Setting i such that
(E) The position on the substrate of a single-stranded nucleic acid probe having a base sequence in which the number of mismatched base pairs is i or less with respect to the base sequence of the second probe is positive, and a base having i + 1 or more mismatches Making the position of the probe of the sequence on the substrate negative and obtaining a template pattern II formed by the positive position;
(F) The same operation as in (e) is performed for all other single-stranded nucleic acid probes to form a position on the substrate of the single-stranded nucleic acid probe having a base sequence in which the number of mismatched base pairs is i or less. Obtaining template patterns III-n;
(G) reacting the probe array with a sample containing the target single-stranded nucleic acid under the same conditions as those under which the first template pattern was obtained; Measuring a single-stranded nucleic acid probe of the base sequence to obtain a pattern indicating the relationship between the position of each single-stranded nucleic acid probe on the probe array and its fluorescence property;
(H) comparing the pattern with the n template patterns obtained in the above steps (b), (e) and (f), and, when there is a template pattern substantially matching the pattern, corresponding to the template pattern; Identifying the base sequence of the target single-stranded nucleic acid as an unknown base sequence,
Which is characterized by having
[0017]
And by adopting such an aspect, the pattern formed on the substrate by the spot distinguished from the positive can be obtained as an image, and the sequence can be analyzed by comparing it with the expected pattern, and the unknown sequence can be analyzed. The gene sequence can be easily specified.
[0018]
In the present invention, a hybridization reaction condition for completely discriminating between such a one-base mismatch and a two-base mismatch is also provided.
[0019]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described specifically.
(Judgment by fluorescent image)
One embodiment of the present invention is particularly effective when nucleobases that may cause a mismatch are present in close proximity. Here, it contains the nucleotide sequence corresponding to the amino acid sequence at positions 238 and 239 of the tumor suppressor gene p53.^{5 '}GATGGGNCCTCNNGTTCAT^{3 '}Will be described as an example. The above example is one form for explaining the outline of the invention, and in any form of array, the present invention presents a similar concept in terms of processing as an image. Is not limited. Naturally, the SBH method is also an analysis target of the present invention.
[0020]
In the above example, when a complete set of probes was prepared in which each base portion denoted by N was replaced with four types of bases (A, G, C, T), that is, three sets (need not be continuous) When examining the base of³= 64 kinds, 4 in case of 5 places⁵= 1024 kinds of probes are arranged on the substrate.
[0021]
FIG. 1 shows an arrangement example when 64 types of probes are used.
[0022]
In the upper left area obtained by dividing the 64-type probe array into four parts, probes (probe numbers 1 to 16) in which the first N is A are arranged, and probes such as G (probe numbers 17 to 32) are arranged in the lower left. Be placed. Similarly, the upper right is C (probe numbers 33 to 48) and the lower right is T (probe numbers 49 to 64). In each region, the probe in which the second N is A is located in the first column, G is located in the second column, C is located in the third column, and T is located in the fourth column. The third probe in which N is A is arranged in the first row counted from the top, the array in which G is G is arranged in the second row, and similarly, C is arranged in the third row and T is arranged in the fourth row. . As a result, for example,^{5 '}GATGGGACTCAAGTTCAT^{3 '}Corresponds to the upper left spot. It is a sequence corresponding to a normal gene^{5 '}ATGAACCGGAGGCCCATC^{3 '}Is the probe DNA in the third column from the right and the third row from the top^{5 '}GATGGGCCTCCCGGTTCAT^{3 '}And is expected to form a hybrid.
[0023]
Hereinafter, a case where a single base mismatch is treated as a positive spot will be described. In this case, assuming that the perfect match sequence is the 42nd probe (normal gene), the single base mismatch sequence judged to be positive is 9 places filled in, as shown in FIG. 2 together with the perfect match. It is expected that a simple pattern will be formed.
[0024]
On the other hand, in the mutant sequence corresponding to the sequence to be specified of the target nucleic acid, for example, a pattern change as shown in FIG. 3 is observed.
[0025]
In the present invention, the expected fluorescent pattern image composed of such a perfect match and a single base mismatch is input in advance to a storage device such as a computer, and the determination is made by comparing with a fluorescent image obtained by a predetermined method. At this time, detailed quantitative data of the fluorescence intensity of each positive spot is not required. Only a positive or negative determination for a certain threshold value is sufficient, and simple and automated determination using a computer or the like is possible.
[0026]
(Set threshold)
When a probe of about 18 mer is used, it is usually preferable to set the threshold value between the fluorescence intensity of a one-base mismatch and the fluorescence intensity of a two-base mismatch. The fluorescence intensity varies depending on the sequence composition and reaction conditions, but the threshold value is set to a value of 50% to 25%, more preferably 30% to 20%, of the highest fluorescence intensity (usually a perfect match). Good. If the probe length is short, the threshold will be even lower.
[0027]
Those containing a three-base mismatch have a fluorescence amount of 10% or less of the maximum value and can be completely distinguished.
[0028]
When the threshold value is set to 1/4 of the maximum fluorescence amount, the distribution of the fluorescence intensity is predicted with the perfect match sequence and the single base mismatch sequence being 4, the 2 base mismatch sequence being 1, the 3 base mismatch sequence being 0, and FIG. become that way.
[0029]
The above example will be described for a more specific determination method.
[0030]
When the hybridization reaction proceeds very selectively, strong fluorescence concentrates at one point (perfect match). Next, when the sensitivity is gradually increased, in the above arrangement example, as expected from FIG. 3, the single base mismatches should be arranged in a vertical and horizontal line around the perfect match. However, an actual fluorescent image is not always lined up in three lines each vertically and horizontally around a strong spot. Due to differences in stability between single base mismatches, not all six have the same degree of intensity, so some spots are not detected, but at least some spots should be visible in these lines. At that time, the intensity of the intensity can be detected at positions where the remaining three single-base mismatches are also expected, although the intensity is different.
[0031]
Sometimes, a perfect match and a single base mismatch give the same level of fluorescence intensity, and an image close to the expected image consisting of 10 spots of a perfect match and a single base mismatch is obtained from the beginning.
[0032]
The two-base mismatch sometimes exceeds the threshold, but even in such a case, it can be easily determined as a deviation from the expected pattern.
[0033]
As described above, the method of the present invention, which is determined by comparing the expected pattern with the actually obtained fluorescent image, can easily determine the presence or absence of a mutation in the sample gene, and furthermore, which base (or a plurality of bases) is mutated to what. It is characterized in that it is possible to simultaneously determine the contents of the mutation.
[0034]
Further, the idea of evaluating the results of the hybridization reaction using 64 types of probes by a pattern is advantageous in that the determination is more reliable than the case where the determination is made using only one spot. Hybrids with 64 types of DNA probes have different thermal stability depending on their sequences, and therefore, there is no guarantee that a perfect match will always yield overwhelmingly stable and strong fluorescence. Further, it is often impossible to determine which is the strongest spot and a perfect match spot due to dust on the substrate or an artifact at the time of the hybridization reaction. Judgment based on the point pattern can compensate for any variation in the amount of fluorescence.
[0035]
(Probe length)
The probe length used in the present invention is about 8 mer to 30 mer, more preferably 12 mer to 25 mer. At 8 mer or less, the stability of the hybrid having a single base mismatch is low, and the amount of fluorescence derived from a perfect match is superior. In the case of a probe longer than 30 mer, the fluorescence of the two-base mismatch is stronger than the one-base mismatch in some cases (for example, when there is a mismatch at both ends).
[0036]
(Hybridization reaction conditions)
The conditions for the hybridization reaction that gives a good threshold are as follows: the entire substrate is heated while being immersed in the sample solution, and both the DNA probe and the sample DNA on the substrate are simultaneously thermally denatured, and then gradually cooled. Perform the hybridization reaction at an elevated temperature. The salt concentration during the reaction is desirably 100 mM or less.
[0037]
The temperature for performing the heat denaturation is suitably 60 ° C. or higher, preferably 80 ° C. or higher. The setting of the temperature for thermal denaturation is determined depending on the stability of the DNA array substrate itself, the length of the sample, the concentration, and the type of the labeling compound. For example, on a substrate in which a resin is applied and the resin is combined with the DNA by reacting the resin, the resin layer may be broken by the high temperature. On the other hand, a substrate using a silane coupling agent in a manufacturing process is relatively stable to heat and can be heated to a higher temperature. When the sample DNA is single-stranded, it is considered that the intramolecular double-stranded structure is almost completely eliminated at 70 ° C. or higher, but when the sample DNA is double-stranded or the sample DNA is long single-stranded DNA, It is necessary to further raise the temperature or to add a denaturing agent such as formamide to promote dissociation into single strands. The time required for heat denaturation is 10 minutes or more, preferably about 30 minutes.
[0038]
The conditions for the hybridization reaction are performed by changing the temperature and salt concentration according to a conventional method, taking into account the length of the probe, the sequence, and the type of the sample. As a condition for distinguishing and recognizing extremely similar sequences as in the present invention, a solution containing 100 mM of sodium chloride at 45 ° C. for 3 hours or more is suitably used. However, the reaction time is greatly affected by the analyte concentration and is not limited to the above reaction conditions. In the case of a high-concentration sample, a sufficient judgment can be made within 3 hours. When the sample solution is diluted, a reaction time of 10 hours or more is required. When formamide is added, it is necessary to increase the salt concentration.
(Method for producing DNA array substrate)
The following is an example of a method for producing a DNA array that can favorably proceed with the present hybridization reaction. However, the gist of the present invention is to show a simple method for evaluating a hybridization pattern on a substrate and determining a base sequence of a sample, and is basically not limited to a method for producing a substrate.
[0039]
In a DNA array, a DNA probe is immobilized by a covalent bond by a reaction with a functional group on the substrate surface. As a mode of bonding between the functional group and DNA, for example, a method of performing a bonding reaction between a maleimide group on the glass surface and an SH group at the end of DNA will be described.
[0040]
As a method for introducing a maleimide group, first, an aminosilane coupling agent is reacted on a glass substrate, and then the maleimide group is reacted with an EMCS reagent (N- (6-maleimidocaprooxyl) succinimide: manufactured by Dojin). Introduce. The SH group can be introduced into DNA by using 5'-Thiol-Modifier C6 (Glen @ Research) on an automatic DNA synthesizer.
[0041]
The DNA solution is spot-formed on a substrate by an ink-jet method, and a probe DNA is immobilized by a reaction between a maleimide group on the DNA substrate and an SH group at a DNA end.
[0042]
As a DNA solution suitable for discharging onto a glass substrate having a maleimide group by an inkjet method, a solution containing glycerin, urea, thiodiglycol or ethylene glycol, acetylenol EH (manufactured by Kawamura Fine Chemical Co., Ltd.), or isopropyl alcohol is preferable. In particular, a solution containing 7.5% glycerin, 7.5% urea, 7.5% thiodiglycol, and 1% acetylenol EH (all by mass) is preferable.
[0043]
The DNA-bound array substrate is immersed in a 2% bovine serum albumin aqueous solution for 2 hours to perform a blocking reaction, and then used for a hybridization reaction.
[0044]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
(Example 1: Pattern recognition I)
1. Probe design
Among the mutations in the base sequence CGGAGG corresponding to the amino acid sequence at positions 248 and 249 of the p53 gene which is a tumor suppressor gene, the first C is T and the second A is G And the third G at the 249th amino acid is mutated to T. Thus, 64 types of probes were designed by focusing on these three base sequences.
[0045]
In other words, the total length of the probe is 18mer, 6 bases containing this mutation are located in the middle of the probe, and a structure in which the front and rear are sandwiched by a common sequence,^{5 '}ATGAACNNGAGNCCCATC^{3 '}It is. Here, the portion represented by N corresponds to four types of nucleic acid bases, A, G, C, and T. Since the probe DNA is a sequence complementary to the sequence to be detected (the above sequence),^{5 '}GATGGGNCCTCNNGTTCAT^{3 '}It becomes.
[0046]
FIG. 1 shows an arrangement diagram of 64 types of DNA probes on a DNA array. Each sequence (SEQ ID NOs: 1 to 64) is specifically shown in Table 1.
[0047]
[Table 1]

Sequence corresponding to a normal gene^{5 '}ATGAACCGGAGGCCCATC^{3 '}Is the 42nd probe DNA in the third column from the right and the third row from the top^{5 '}GATGGGCCTCCCGGTTCAT^{3 '}And is expected to form a hybrid.
[0048]
Even in the 64 experiments, fluorescence from a hybrid having a single base mismatch other than a perfect match is expected. The expected fluorescence pattern consisting of a perfect match and a single base mismatch is shown in FIG.
[0049]
2. Preparation of maleimide group-introduced substrate
(Substrate cleaning)
A 1-inch square glass plate was placed in a rack and immersed in an ultrasonic cleaning detergent overnight. Thereafter, ultrasonic cleaning was performed in a detergent for 20 minutes, and then the detergent was removed by washing with water. After rinsing with distilled water, sonication was further performed for 20 minutes in a container filled with distilled water. Next, it was immersed in a 1N sodium hydroxide solution that had been heated in advance for 10 minutes. Subsequently, washing with water and washing with distilled water were performed.
[0050]
(surface treatment)
It was immersed in a 1% silane coupling agent aqueous solution (trade name: KBM603, manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) at room temperature for 20 minutes. Baking was performed for 1 hour in an oven heated to 120 ° C. to complete the silane coupling treatment. Subsequently, 2.7 mg of EMCS (N- (6-Maleimidocaproyloxy) succinimide: manufactured by Dojin) was weighed and dissolved in a 1: 1 solution of DMSO / ethanol (final concentration 0.3 mg / ml). The glass substrate that had been treated with the silane coupling agent was immersed in this EMCS solution for 2 hours to cause the amino groups of the silane coupling agent to react with the carboxyl groups of the EMCS solution. In this state, a maleimide group derived from EMCS exists on the surface of the glass. The glass plate reacted with the EMCS solution is washed with distilled water, dried with nitrogen gas, and used for a binding reaction with DNA.
3. Binding reaction of DNA to substrate
(Synthesis of 64 DNA probes)
The above-mentioned 64 types of probe DNAs having an SH group (thiol group) at the 5 'end were requested to Vex Co., Ltd. and synthesized.
(Discharge of DNA probe)
The following ejection operation was performed using each of the 64 DNAs. Each DNA was dissolved in water and diluted to a final concentration of 8 μM using SG Clear (an aqueous solution containing 7.5% glycerin, 7.5% urea, 7.5% thiodiglycol, and 1% acetylenol EH). 100 μl of this DNA solution was filled into the nozzle of a modified BC head BC62 (manufactured by Canon Inc.) so as to discharge a small amount of sample. Using two heads so as to discharge six types of DNA per head, discharging 12 types of DNA at a time, and exchanging the heads 6 times, each spot of 64 types of DNA is independently formed. Was discharged.
[0051]
Each probe was set so as to have a spot diameter of 70 μm and a pitch of 200 μm, and spotted 64 types in an 8 × 8 matrix. Thereafter, the substrate was left in a humidified chamber for 30 minutes to perform a reaction for binding the probe DNA to the substrate.
・ Hybridization reaction
(Blocking reaction)
After the completion of the reaction, the substrate was washed with a 1 M NaCl / 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.0), and the DNA solution on the glass surface was completely washed away. Then, it was immersed in a 2% bovine serum albumin aqueous solution and left for 2 hours to perform a blocking reaction.
(Synthesis of model sample DNA)
It has a normal sequence of the p53 gene, and has the same region as the labeled DNA No. 1 was produced. The sequence is shown below, with rhodamine attached to the 5 'end.
[0052]
No. 1:^{5 '}Rho-ATGAACCGGGAGGCCCATC^{3 '}
(Hybridization reaction conditions)
2 ml of a 10 nM model specimen DNA solution containing 100 mM NaCl was placed in a hybridization reaction bag containing a DNA array substrate, heated at 80 ° C. for 10 minutes, then lowered to 45 ° C. in the incubator, and allowed to react for 15 hours. Was.
5. detection
(Method)
Detection was performed by connecting an image analysis processor ARGUS (Hamamatsu Photonics) to a fluorescence microscope (Nikon).
(result)
The 18-mer labeled DNA {No. The amount of fluorescence obtained as a result of the hybridization reaction with No. 1 is shown in FIG. The maximum value of the amount of fluorescence is the perfectly complementary probe No. 42. With the amount of fluorescence as the maximum value (100%), a threshold value is provided for 20% of the threshold value, and the remaining portions are blacked out.
[0053]
It can be seen that the spots of Nos. 10, 26, and 58 also have fluorescence, and match well with the expected pattern of FIG. By further lowering the threshold, it matches the expected pattern. In other words, in addition to the above three spots, a one-base mismatched sequence centered on a perfect match is arranged in vertical and horizontal lines.
[0054]
(Example 2: Pattern recognition II)
A DNA array substrate comprising 64 types of probes was prepared in the same manner as in the example, and No. 1 was used as a model sample. A hybridization reaction with rhodamine-labeled DNA having the sequence of No. 2 was performed. No. The sequence of No. 2 in FIG. Complementary to 46 probes.
[0055]
No. 2:^{5 '}Rho-ATGAACCAGAGGCCCCATC^{3 '}
Hybridization reaction conditions are the same as in Example 1.
[0056]
As in the first embodiment, an expected pattern is obtained in FIG. In contrast, the results obtained are shown in FIG. The threshold value is set to 10% of the maximum value, and the result of the hybridization reaction is shown in black. Good correspondence with expectations.
[0057]
(Example 3: Pattern recognition III)
The same experiment as in Example 2 was performed using the same model sample DNA as in Example 2. However, the concentration of the sample DNA used for the hybridization reaction was 5 nM, and the reaction was carried out at 40 ° C. overnight. FIG. 7 shows the obtained results.
[0058]
When the threshold value is set to 50%, fluorescence appears at the positions of the 34th and 62nd probes of the single base mismatch (hatched portion), and when the threshold value is further reduced to 30%, the result matches the expected pattern. In this case, NO. A two-base mismatch of 6 and 22 is also detected, but as a deviation from the pattern formed by the one-base mismatch, it can be determined that the mismatch is a two-base mismatch, and it can be determined that the spot of the perfect match is No. 46. .
[0059]
【The invention's effect】
As described above, the method of the present invention enables more accurate detection by taking into account the amount of fluorescence of a single-base mismatch, as compared with the conventional method of simply determining the presence or absence of a hybrid.
[0060]
Since a hybrid with a DNA probe has different thermal stability depending on each sequence, there is no guarantee that a perfect match will be overwhelmingly stable and emit strong fluorescence. The determination based on the pattern is advantageous in that the determination is more reliable than the determination based on only one spot.
[0061]
It is often not possible to determine which is the strongest spot and a perfect match due to dust on the substrate or artifacts during the hybridization reaction. In this regard, the determination using the pattern according to the present invention can compensate for a slight variation in the amount of fluorescence.
[0062]
Therefore, according to the present invention, it is possible to provide a test method capable of screening gene mutations simply and efficiently.
[0063]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows an arrangement example when 64 types of probes are used.
FIG. 2 is a view showing a pattern of arrangement of a region determined to be positive on a substrate with respect to a sequence of a target nucleic acid.
FIG. 3 is a view showing a pattern of arrangement of regions determined to be positive on a substrate in a mutant sequence for a target nucleic acid.
FIG. 4 is a diagram showing a pattern of the amount of fluorescence obtained in Example 1.
FIG. 5 is a diagram showing a pattern expected in Example 2.
FIG. 6 is a diagram showing a pattern at a threshold value of 10% of the amount of fluorescence obtained in Example 2.
FIG. 7 is a diagram showing a pattern of the amount of fluorescence obtained in Example 3.

Claims

A method for specifying a base sequence of a predetermined site of a target single-stranded nucleic acid,
(A) a step of preparing a probe array in which each of a plurality of single-stranded nucleic acid probes of Nos. 1 to n (n ≧ 2) is arranged on a substrate so as to be isolated from each other;
(B) a first sample containing a labeled single-stranded nucleic acid having a nucleotide sequence completely complementary to a nucleotide sequence of one of the single-stranded nucleic acid probes and having been subjected to fluorescent labeling; After reacting the probe array with the single-stranded nucleic acids complementary to each other under conditions that form double-stranded nucleic acids, and removing unreacted labeled single-stranded nucleic acids, the fluorescence observed from the array Measuring the intensity and obtaining a first template pattern indicating the relationship between the position of each single-stranded nucleic acid probe on the probe array and its fluorescence property;
(C) performing the same operation as in step (b) for each of the other single-stranded nucleic acid probes to show the relationship between the position of each single-stranded nucleic acid probe on the probe array and its fluorescence property. Obtaining a second to n-th template patterns;
(D) reacting the probe array with a second sample containing the fluorescently labeled target single-stranded nucleic acid under the same conditions as those under which the template pattern was obtained; Measuring the fluorescence intensity observed from the array after removing the nucleic acids and obtaining a sample pattern indicating the relationship between the position of each single-stranded nucleic acid probe on the probe array and its fluorescence property;
(E) Compare the sample pattern with the n template patterns obtained in the above steps (b) and (c), and if there is a template pattern that substantially matches the pattern, use the template pattern to generate the template pattern. Identifying the base sequence of the target single-stranded nucleic acid as a base sequence of the predetermined site of the target single-stranded nucleic acid. .

The method according to claim 1, wherein the template pattern and the sample pattern are image patterns obtained as a fluorescent image.

The method according to claim 1, wherein the second sample has a plurality of target single-stranded nucleic acids having different base sequences, and the plurality of base sequences are simultaneously determined in the step (e).

The method according to claim 1, wherein the length of the probe on the probe array is 8 mer to 30 mer.

5. The method according to claim 4, wherein the length of the probe on the probe array is 12 mer to 25 mer.

A first sample and a target single-stranded nucleic acid containing a fluorescently-labeled single-stranded nucleic acid having a base sequence completely complementary to the first base sequence to obtain a first template pattern In the step of reacting the sample containing the sample with the probe array, the probe array substrate is thermally denatured in a solution containing the sample, and then, while the substrate is immersed in the sample solution, the temperature is lowered to a temperature suitable for the duplex formation reaction. The reaction according to any one of claims 1 to 5, further comprising a step of performing hybridization.

The length of the probe on the probe array is 18mer, the temperature for performing thermal denaturation is 70 ° C or higher, the temperature for performing the duplex formation reaction is 40 ° C or higher, and the sample solution at that time contains 100 mM salt. 7. The method of claim 6, wherein the method comprises: