JP2004041003A - 新規タンパク質、そのｄｎａおよびその用途 - Google Patents

Abstract

【課題】心疾患、中枢神経疾患または生殖器疾患の予防・治療に有用な、新規タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該タンパク質の活性を調節する化合物のスクリーニング方法、該スクリーニング方法で得られる化合物などの提供。
【解決手段】本発明のタンパク質およびポリヌクレオチドは、心疾患、中枢神経疾患または生殖器疾患などの診断マーカー等として有用であり、該タンパク質、ポリヌクレオチドまたは抗体を用いるスクリーニングにより得られる化合物、該タンパク質の活性を阻害する中和抗体は、例えば、心疾患、中枢神経疾患または生殖器疾患などの予防・治療剤として使用することができる。
【選択図】　なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規タンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該タンパク質の活性を調節する化合物のスクリーニング方法、該スクリーニング方法で得られる化合物等に関する。さらに詳しくは、心疾患の予防・治療剤または診断薬として有用な新規タンパク質等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
心不全は心筋の収縮不全と考えられ、その発症の機序としては、次のようなものが挙げられる。心筋の障害、心臓ポンプの機械的異常、心臓ポンプの機能的異常、高血圧または肺高血圧による圧負荷、および貧血または急性腎炎など容量負荷である。これらが原因となり、生体の需要に応じた血液量を心臓が拍出し得なくなる状態に対して、心臓は交感神経系、神経−体液−内分泌系などの代償機序を作動することにより、生体の恒常性を維持しようとする。その結果として、心筋細胞が肥大することにより心肥大が生じる。しかしながら、前述の障害または負荷が慢性的に継続された場合、その代償機序の破綻が生じる。つまり、肥大した心筋細胞に十分な量の血液が供給されず虚血が生じ、これが原因で心筋収縮不全などの心筋障害が生じ、心拍出量の低下、臓器循環障害、静脈鬱血、体液貯留などを伴う心不全症候群を来すことになる。これに対する治療としては、心筋細胞障害の改善、心保護作用の強化、心筋収縮不全による心機能低下の回復およびその原因である生体の代償破綻の抑制または過剰な代償機序の改善が必要となる。現在、該心不全症候群の治療には、臨床的には強心薬として（１）ジゴキシンなどの強心配糖体、（２）ドブタミンなどの交感神経作動薬、（３）アムリノンなどのホスホジエステラーゼ阻害薬が、また血管拡張薬としてはヒドララジン、カルシウム拮抗薬、アンジオテンシン交換酵素阻害薬、アンジオテンシン受容体拮抗薬などが使用されている。また、他拡張型心筋症の治療には、βブロッカーなどが使用されている。一方で過剰な代償性機序の抑制または代償破綻抑制（アポトーシス抑制を含む）の観点からの治療薬はない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
過剰な代償機序または代償破綻の抑制という観点からの、副作用の少ない優れた心不全治療薬の開発が切望されている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、冠動脈結紮による心筋梗塞モデルラットの心不全発症時において発現が増加する遺伝子を見出した。この知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１）　配列番号：２５、配列番号：２８、配列番号：１３もしくは配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩、
（２）　配列番号：２５で表されるアミノ酸配列を含有する上記（１）記載のタンパク質またはその塩、
（３）　配列番号：２８で表されるアミノ酸配列を含有する上記（１）記載のタンパク質またはその塩、
（４）　配列番号：１３で表されるアミノ酸配列を含有する上記（１）記載のタンパク質またはその塩、
（５）　配列番号：３０で表されるアミノ酸配列を含有する上記（１）記載のタンパク質またはその塩、
（６）　上記（１）記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
（７）　上記（１）記載のタンパク質または上記（６）記載の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（８）　ＤＮＡである上記（７）記載のポリヌクレオチド、
（９）　配列番号：２６、配列番号：２９、配列番号：２７または配列番号：３１で表される塩基配列を含有する上記（８）記載のポリヌクレオチド、
（１０）　上記（７）記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
（１１）　上記（１０）記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
（１２）　上記（１１）記載の形質転換体を培養し、上記（１）記載のタンパク質または上記（６）記載の部分ペプチドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（６）記載の部分ペプチドまたはその塩の製造法、
（１３）　上記（１）記載のタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬、
（１４）　上記（７）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（１５）　上記（７）記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬、
（１６）　上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（６）記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（１７）　上記（１６）記載の抗体を含有してなる診断薬、
（１８）　上記（１６）記載の抗体を含有してなる医薬、
（１９）　上記（７）記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスヌクレオチド、
（２０）　上記（１９）記載のアンチセンスヌクレオチドを含有してなる医薬、（２１）　上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（６）記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（６）記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２２）　上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（６）記載の部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（６）記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（２３）　上記（２１）記載のスクリーニング方法または上記（２２）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（６）記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を調節する化合物またはその塩、
（２４）　上記（２３）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（２５）　上記（７）記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、上記（１）記載のタンパク質遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２６）　上記（７）記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする、上記（１）記載のタンパク質遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（２７）　上記（２５）記載のスクリーニング方法または上記（２６）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、上記（１）記載のタンパク質遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩、
（２８）　上記（２７）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（２９）　上記（１６）記載の抗体を用いることを特徴とする上記（１）記載のタンパク質の定量方法、
（３０）　上記（２９）記載の定量方法を用いることを特徴とする上記（１）記載のタンパク質の機能が関連する疾患の診断法、
（３１）　上記（１６）記載の抗体を用いることを特徴とする、上記（１）記載のタンパク質の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（３２）　上記（１６）記載の抗体を含有してなる、上記（１）記載のタンパク質の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（３３）　上記（３１）記載のスクリーニング方法または上記（３２）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、上記（１）記載のタンパク質の発現を調節する化合物またはその塩、
（３４）　上記（３３）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（３５）　心疾患の予防・治療剤である上記（１３）、（１４）、（１８）、（２０）、（２４）、（２８）または（３４）記載の医薬、
（３６）　化合物が、過剰な代償機序または代償破綻を抑制する化合物である上記（２４）、（２８）または（３４）記載の医薬、
（３７）　心筋症、心筋梗塞、心不全または狭心症の予防・治療剤である上記（３５）または（３６）記載の医薬、
（３８）　心疾患の診断薬である上記（１５）または（１７）記載の診断薬などを提供する。
さらには、
（３９）タンパク質が、（ｉ）配列番号：２５または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：２５または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：２５または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：２５または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｖ）配列番号：２５または配列番号：１３で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖｉ）上記（ｉｉ）〜（ｖ）を組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質である上記（１）記載のタンパク質、
（４０）上記（５）記載のポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドなども提供する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
配列番号：２５、配列番号：２８、配列番号：１３または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、本発明のタンパク質と称することもある）は、ヒトや非ヒト温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
【０００６】
配列番号：２５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：２５で表わされるアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：２５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号：２５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：２５で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：２８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：２８で表わされるアミノ酸配列と７５％以上、好ましくは約８０％以上、約８５％以上、好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：２８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号：２８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：２８で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、好ましくは約７０％以上、約８０％以上、好ましくは約８５％以上、好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、心機能促進または抑制活性、心筋細胞機能活性または不活性化作用などが挙げられる。具体的には、心機能の代償機序のひとつとしての心機能促進活性、過剰な代償機序の作動によって生じる代償破綻による心機能抑制活性などが挙げられる。心筋細胞機能活性化作用には、細胞保護作用も含まれる。
上記の本発明のタンパク質の心機能促進または抑制活性、および心筋細胞機能活性化または不活性化作用は、心機能を測定することにより、測定する。
心機能の測定は、公知の方法またはこれに準じる方法に従って測定することができる。例えば、心エコー測定装置（セル、第９７巻、１８９−１９８頁、１９９９年）または心臓カテーテルによる心機能測定（サーキュレーションリサーチ、第６９巻、３７０−３７７頁、１９９１年）によって行う。更に、例えばアンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）などのレニンアンジオテンシン系（ＲＡＳ）の亢進を市販の測定キット（例、ペニンスラー社製、フェニックス社製など）を用いて測定したり、血中カテコラミンの増加活性（東ソー社製、全自動カテコールアミン分析計）などを指標に心機能を測定する。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を用いて心筋細胞機能活性化または不活性化作用を測定する場合、例えば細胞の呼吸活性を測定する、または心不全マーカー遺伝子〔例、ＡＮＰ（心房性ナトリウム利尿ペプチド）、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチドなど〕の発現変化を測定または心不全マーカー遺伝子産物の産生量を測定する。細胞の呼吸活性は、公知の方法またはこれに準じる方法に従って測定することができる。例えば、ＭＴＴ（３−（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）法やトリパンブルー染色法、ＴＵＮＮＥＬ染色法（Ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｄｅｏｘｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｄＵＴＰ−Ｘ　ｎｉｃｋ　ｅｎｄ　ｌａｂｅｌｉｎｇ，
セル、第９７巻、１８９−１９８頁、１９９９年）などを用いる。
実質的に同質とは、その活性が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、心機能促進または抑制活性、および心筋細胞機能活性化または不活性化作用などが同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、この活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
【０００７】
また、本発明のタンパク質としては、例えば、（１）（ｉ）配列番号：２５で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：２５で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：２５で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：２５で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテイン、
（２）（ｉ）配列番号：２８で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：２８で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：２８で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：２８で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテイン、
（３）（ｉ）配列番号：１３で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：１３で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：１３で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：１３で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテイン、
（４）（ｉ）配列番号：３０で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：３０で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：３０で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：３０で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインなども含まれる。
【０００８】
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。本発明のタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ⁻）、アミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ_１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ_１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_１−２アルキル基などのＣ_７−１４アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ_１−６アルカノイルなどのＣ_１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ_１−６アルカノイル基などのＣ_１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明のタンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：２５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：２８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：１３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：３０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる。
【０００９】
本発明のタンパク質の部分ペプチドとしては、前記本発明のタンパク質の部分ペプチドであって、好ましくは、前記した本発明のタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。例えば、本発明のタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、好ましくは７０個以上、好ましくは１００個以上、好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
【００１０】
また、本発明の部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
より具体的には、本発明の部分ペプチドとして、例えば（１）配列番号：２５で表されるアミノ酸配列中、Ｎ末端から第２番目〜第５７番目または第５８番目〜第２４９番目のアミノ酸残基を有する部分アミノ酸配列を有する部分ペプチド、
（２）配列番号：２８で表されるアミノ酸配列中、Ｎ末端から第２番目〜第２３９番目または第２４０番目〜第４８１アミノ酸残基を有する部分アミノ酸配列を有する部分ペプチド、
（３）配列番号：１３で表されるアミノ酸配列中、Ｎ末端から第２番目〜第６４番目または第６５番目〜第２５６番目のアミノ酸残基を有する部分アミノ酸配列を有する部分ペプチド、
（４）配列番号：３０で表されるアミノ酸配列中、Ｎ末端から第２番目〜第２３９番目または第２４０番目〜第４８１アミノ酸残基を有する部分アミノ酸配列を有する部分ペプチドなどがあげられる。
また、本発明の部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ⁻）、アミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
さらに、本発明の部分ペプチドには、前記した本発明のタンパク質と同様に、Ｃ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有しているもの、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明の部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いることができる。本発明のタンパク質または部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００１１】
本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、前述したヒトや非ヒト温血動物の細胞または組織から公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや非ヒト哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや非ヒト哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１２】
本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、またはそのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対応する酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００１３】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
【００１４】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ_１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ_２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００１５】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００１６】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
【００１７】
本発明の部分ペプチドまたはそれらの塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明の部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（ｉ）〜（ｖ）に記載された方法が挙げられる。
（ｉ）Ｍ．　Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ　および　Ｍ．Ａ．　Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス　（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９６６年）
（ｉｉ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ），　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９６５年）
（ｉｉｉ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、　丸善（株）　（１９７５年）
（ｉｖ）矢島治明　および榊原俊平、生化学実験講座　１、　タンパク質の化学ＩＶ、　２０５、（１９７７年）
（ｖ）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００１８】
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、上記した本発明のタンパク質をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、公知の実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」１５（７）、１９９７記載の方法またはそれに準じた方法により、本発明のタンパク質のｍＲＮＡを定量することができる。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、前述した本発明のタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織より全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、（１）配列番号：２６で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２６で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：２５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（２）配列番号：２９で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２９で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：２８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（３）配列番号：２７で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２７で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：１３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、または
（４）配列番号：３１で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：３１で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：３０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：２６で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２６で表される塩基配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９７％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２９で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２９で表される塩基配列と７５％以上、好ましくは約８０％以上、約８５％以上、好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９７％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２７で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２７で表される塩基配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９７％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：３１で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：３１で表される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、好ましくは約７０％以上、約８０％以上、好ましくは約８５％以上、好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９７％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００１９】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行うことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
【００２０】
より具体的には、（１）配列番号：２５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２６で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、（２）配列番号：２８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２９で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、（３）配列番号：１３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２７で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、（４）配列番号：３０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：３１で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した本発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２６、配列番号：２９、配列番号：２７または配列番号：３１で表される塩基配列を有するＤＮＡの一部分を有するＤＮＡ、または配列番号：２６、配列番号：２９、配列番号：２７または配列番号：３１で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：２５、配列番号：２８、配列番号：１３または配列番号：３０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２６、配列番号：２９、配列番号：２７または配列番号：３１で表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
本発明のタンパク質、部分ペプチド（以下、これらをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
【００２１】
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、Ｍｕｔａｎ^ＴＭ−ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ（宝酒造（株））、Ｍｕｔａｎ^ＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ　ＰＣＲ法やＧａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行うことができる。
クローン化されたタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
【００２２】
本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）から目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
【００２３】
本発明のプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰ_Ｌプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ^ｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏ^ｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンが含まれない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
【００２４】
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ），１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ⁻，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、ヨトウガの幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ　Ｆｉｖｅ^ＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ　ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、カイコ由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ　Ｎ　細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，　Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ　Ｖｉｖｏ），１３，　２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁻）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞、Ｈ９ｃ２細胞などが用いられる。
【００２５】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Ｇｅｎｅ），１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行うことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　＆　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行うことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行うことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，　４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行うことができる。動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８　新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行うことができる。
このようにして、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
【００２６】
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，　Ｋ．　Ｌ．　ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，　Ｇ．　Ａ．　ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，　Ｔ．Ｃ．Ｃ．，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２））に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ　１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。
【００２７】
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行うことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００^ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
このようにして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当なタンパク修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
【００２８】
このようにして生成する本発明のタンパク質の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより測定することができる。
本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、抗体の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）に対する抗体は、本発明のタンパク質を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
【００２９】
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６、４９５　（１９７５）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行うことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行うことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ　１６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行うことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００３０】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行うことができる。
【００３１】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
【００３２】
本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、アンチセンスヌクレオチドの説明においては、これらのＤＮＡを本発明のＤＮＡと略記する場合がある）の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスヌクレオチドとしては、本発明のＤＮＡの塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスヌクレオチドであってもよいが、アンチセンスＤＮＡが好ましい。
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発明のタンパク質のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスヌクレオチドが好適である。
具体的には、配列番号：２６、配列番号：２９、配列番号：２７または配列番号：３１で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を含有するアンチセンスヌクレオチド、好ましくは、例えば配列番号：２６、配列番号：２９、配列番号：２７または配列番号：３１で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスヌクレオチド（より好ましくは、配列番号：２６、配列番号：２９、配列番号：２７または配列番号：３１で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスヌクレオチド）などが挙げられる。
【００３３】
アンチセンスヌクレオチドは通常、１０〜４０個程度、好ましくは１５〜３０個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾りん酸残基に置換されていてもよい。これらのアンチセンスヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、本発明のタンパク質遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンスヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決定されたタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。かかるポリヌクレオチド（核酸）は、本発明のタンパク質遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいは本発明のタンパク質関連ＲＮＡとの相互作用を介して本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明のタンパク質関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明のタンパク質関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド（タンパク質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド（タンパク質）のアミノ酸を通常指している。タンパク質遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
【００３４】
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係、または、対象物とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、「アンチセンス」であるということができる。アンチセンスヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【００３５】
本発明のアンチセンスヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており、例えば　Ｊ．　Ｋａｗａｋａｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈａｒｍ　Ｔｅｃｈ　Ｊａｐａｎ，　Ｖｏｌ．　８，　ｐｐ．２４７，　１９９２；　Ｖｏｌ．　８，　ｐｐ．３９５，　１９９２；　Ｓ．　Ｔ．　Ｃｒｏｏｋｅ　ｅｔ　ａｌ．　ｅｄ．，　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，　１９９３　などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端または５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは本発明のタンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸は、公知の各種の方法で細胞に適用できる。
【００３６】
以下に、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある）、本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）、および本発明のＤＮＡのアンチセンスヌクレオチド（以下、本発明のアンチセンスヌクレオチドと略記する場合がある）の用途を説明する。
本発明のタンパク質は、心筋梗塞後の心不全移行期（心不全代償期／心不全非代償期）の心臓に発現が上昇するので、疾患マーカーとして利用することができる。すなわち、例えば心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）、中枢神経疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病など）、生殖器疾患（例、精巣過敏症、卵巣機能不全、不妊症など）などの早期診断、症状の重症度の判定、疾患進行の予測のためのマーカーとして有用である。
本発明のタンパク質をコードする遺伝子（本発明のタンパク質遺伝子）のアンチセンスヌクレオチド、本発明のタンパク質の活性を調節する化合物もしくはその塩、本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節する化合物もしくはその塩、または本発明のタンパク質に対する抗体を含有する医薬は、例えば心機能の低下を特徴とする疾病、例えば心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）、中枢神経疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病など）、生殖器疾患（例、精巣過敏症、卵巣機能不全、不妊症など）などの予防・治療剤、または避妊薬として使用することができる。
【００３７】
〔１〕疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のタンパク質および本発明のタンパク質遺伝子は、心機能低下とともに（心不全代償期／心不全非代償）発現が増加するので、本発明のタンパク質の活性を調節する化合物またはその塩、および本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩は、例えば心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）、中枢神経疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病など）、生殖器疾患（例、精巣過敏症、卵巣機能不全、不妊症など）などの予防・治療剤、または避妊薬などの医薬として使用できる。
したがって、本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質の活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用であり、該タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
すなわち、本発明は、（１）本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本発明のタンパク質の活性（例えば、心機能促進または抑制活性、心筋細胞機能活性化または不活性化作用など）を調節（促進または阻害）する化合物またはその塩のスクリーニング方法、（２）本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節（促進または阻害）する化合物またはその塩のスクリーニング方法、（３）本発明の抗体を用いることを特徴とする本発明のタンパク質の発現を調節（促進または阻害）する化合物またはその塩のスクリーニング方法などを提供する。
【００３８】
（１）本発明のタンパク質を用いる本発明のタンパク質の活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法
スクリーニング方法の具体例としては、（ｉ）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合と（ｉｉ）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物とを培養した場合との比較を行うことを特徴とする調節剤のスクリーニング方法が挙げられる。
上記スクリーニング方法においては、例えば、（ｉ）と（ｉｉ）の場合における、本発明のタンパク質の心機能促進または抑制活性、心筋細胞機能活性化または不活性化作用などを測定し、比較する、
上記の本発明のタンパク質の心機能促進または抑制活性、および心筋細胞機能活性化または不活性化作用は、心機能を測定することにより、測定する。
心機能の測定は、公知の方法またはこれに準じる方法に従って測定することができる。例えば、心エコー測定装置（セル、第９７巻、１８９−１９８頁、１９９９年）または心臓カテーテルによる心機能測定（サーキュレーションリサーチ、第６９巻、３７０−３７７頁、１９９１年）によって行う。更に、例えばアンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）などのレニンアンジオテンシン系（ＲＡＳ）の亢進を市販の測定キット（例、ペニンスラー社製、フェニックス社製など）を用いて測定したり、血中カテコラミンの増加活性（東ソー社製、全自動カテコールアミン分析計）などを指標に心機能を測定する。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を用いる場合、例えば細胞の呼吸活性を測定する、または心不全マーカー遺伝子〔例、ＡＮＰ（心房性ナトリウム利尿ペプチド）、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチドなど〕の発現変化を測定または心不全マーカー遺伝子産物の産生量を測定する。細胞の呼吸活性は、公知の方法またはこれに準じる方法に従って測定することができる。例えば、ＭＴＴ（３−（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）法やトリパンブルー染色法、ＴＵＮＮＥＬ染色法（Ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｄｅｏｘｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄｄＵＴＰ−Ｘ　ｎｉｃｋ　ｅｎｄ　ｌａｂｅｌｉｎｇ，　セル、第９７巻、１８９−１９８頁、１９９９年）などを用いる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファーに浮遊して調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、ほう酸バッファーなどであればいずれでもよい。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、例えば、Ｈ９ｃ２細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のタンパク質を細胞内に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。
例えば、上記（ｉｉ）の場合における心筋細胞機能活性化作用を、上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を本発明のタンパク質の活性を促進する化合物またはその塩として選択することができる。上記（ｉｉ）の場合における心筋細胞機能不活性化作用を、上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
【００３９】
（２）本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いる本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法
スクリーニング方法の具体例としては、（ｉｉｉ）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合と（ｉｖ）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を培養した場合における、本発明のタンパク質遺伝子の発現量（具体的には、本発明のタンパク質量または前記タンパク質をコードするｍＲＮＡ量）を測定して、比較する。
例えば、（ｉｉｉ’）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を低酸素条件下で伸展刺激を加えて培養した場合と（ｉｖ’）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を低酸素条件下で伸展刺激を加えて培養した場合における、本発明のタンパク質遺伝子の発現量（具体的には、本発明のタンパク質量または前記タンパク質をコードするｍＲＮＡ量）を測定して、比較する。
上記低酸素条件下とは、例えば、２０％Ｏ_２以下の酸素濃度で例えば２％（ネイチャー、第３９４巻、４８５−４９０頁、１９９８年）の条件を意味する。
上記伸展刺激とは、例えば、目的細胞を伸展可能なシリコン膜上に培養し、シリコン膜を引っ張ることで機械的負荷を加える刺激である（Ｊ．Ｂ．Ｃ．、第２７１巻、３３５９２−３３５９７頁、１９９６年、サーキュレーション、第８９巻、２２０４−２２１１頁、１９９４年、Ｊ．Ｂ．Ｃ．、第２７１巻、３２２１−３２２８頁、１９９６年）。
例えば、（ｉｉｉ’’）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を、致死的な条件下培養した場合と（ｉｖ’’）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を、致死的な条件下培養した場合における、本発明のタンパク質遺伝子の発現量（具体的には、本発明のタンパク質量または前記タンパク質をコードするｍＲＮＡ量）を測定して、比較する。
上記致死的な条件下で培養とは、例えば、血清除去下で培養または抗癌剤（例、心筋細胞に比較的毒性の強いアドリアマイシンなど）を加えて培養することが挙げられる。
本発明のタンパク質量の測定は、公知の方法、例えば、本発明のタンパク質を認識する抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、ウェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
本発明のタンパク質遺伝子発現量は、公知の方法、例えば、ノーザンブロッティングやＲｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ解析システム（ＡＢＩ社製、ＴａｑＭａｎ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）などの方法あるいはそれに準じる方法にしたがって測定することができる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファーに浮遊して調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、ほう酸バッファーなどの、本発明のタンパク質の活性を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、例えば、Ｈ９ｃ２細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のタンパク質を細胞内に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。
例えば、上記（ｉｖ）の場合における本発明のタンパク質遺伝子の発現量を、上記（ｉｉｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を本発明のタンパク質遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩として選択することができる。上記（ｉｖ）の場合における本発明のタンパク質遺伝子の発現量を、上記（ｉｉｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を本発明のタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
【００４０】
（３）本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法
スクリーニング方法の具体例としては、（ｖ）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合と（ｖｉ）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を培養した場合との比較を行う。上記スクリーニング方法においては、本発明の抗体を用いて（ｖ）と（ｖｉ）の場合における、本発明のタンパク質の発現量（具体的には、本発明のタンパク質量）を測定（例、発現の検出、発現量の定量など）して、比較する。
本発明のタンパク質量の測定は、公知の方法、例えば、本発明のタンパク質を認識する抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、ウェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、例えば、Ｈ９ｃ２細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のタンパク質を細胞内に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。
例えば、上記（ｖｉ）の場合における本発明のタンパク質の発現量を、上記（ｖ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を本発明のタンパク質の発現を促進する化合物またはその塩として選択することができる。上記（ｖｉ）の場合における本発明のタンパク質の発現量を、上記（ｖ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を本発明のタンパク質の発現を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
【００４１】
本発明のスクリーニング用キットは、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドをコードするポリペプチド、本発明の抗体または本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドを産生する能力を有する細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物またはその塩であり、本発明のタンパク質の活性（例、心機能促進または抑制活性、心筋細胞機能活性化または不活性化作用など）、本発明のタンパク質遺伝子の発現、または本発明の蛋白質の発現を調節（促進または阻害）する化合物またはその塩である。
該化合物の塩としては、前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用いられる。
【００４２】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子の過剰な発現増強は、細胞の過剰な活性化を引き起こし、細胞の疲弊を加速すると考えられる。一方で適度な発現は代償機序を強化すると考えられる。従って、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現量を適切にコントロールすることが大切であると考えられる。例えば心不全急性期および心不全非代償期のように、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現促進によって細胞障害が生じていると考えられる場合には、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物、本発明のタンパク質遺伝子の発現量を阻害する化合物もしくは本発明のタンパク質の発現量を阻害する化合物またはそれらの塩（阻害剤）を投与し、逆に、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現低下によって細胞障害が生じていると考えられる場合には、本発明のタンパク質の活性を促進する化合物、本発明のタンパク質遺伝子の発現量を促進する化合物もしくは本発明のタンパク質の発現量を促進する化合物またはその塩（促進剤）を投与する。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）は心機能を調節する作用を有するため、極度の本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現低下は細胞機能を障害し、逆に過剰な発現は必要以上の細胞の活性化を惹起し、その結果として細胞障害が生じるものと考えられる。
従って、本発明のタンパク質または本発明のＤＮＡの過剰な発現低下が見出された場合には、本発明のタンパク質もしくは本発明のＤＮＡ、または上記のスクリーニング方法によって得られる促進剤を投与することにより、該細胞機能の障害を予防・治療することができ、逆に本発明のタンパク質または本発明のＤＮＡの過剰な発現が見出された場合には、上記のスクリーニング方法によって得られる阻害剤を投与することにより、該細胞機能の障害を予防・治療することができる。
上記のスクリーニング方法により得られる本発明のタンパク質の活性、本発明のタンパク質遺伝子の発現または本発明の蛋白質の発現を阻害する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）の発現増強が認められる心不全急性期または非代償期期に投与することにより心機能回復効果が期待できる。また、本発明のタンパク質の活性、本発明のタンパク質遺伝子の発現または本発明の蛋白質の発現を促進する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）の発現低下が認められる場合に投与することにより代償機序を強化し、心筋細胞を保護することによる心保護効果（ｈｅａｒｔ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ）が期待できる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、優れた心機能促進活性および心筋細胞機能活性化作用（細胞保護作用など）などを有し、例えば心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）、中枢神経疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病など）、生殖器疾患（例、精巣過敏症、卵巣機能不全、不妊症など）などの予防・治療剤、または避妊薬などの医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、それ自体または適当な医薬として、安全に投与することができる。上記投与に用いられる医薬は、上記化合物またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであり、経口または非経口投与に適する医薬組成物として提供される。
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ　ｃａｓｔｏｒ　ｏｉｌ）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
【００４３】
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記化合物が含有されていることが好ましい。
【００４４】
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
本発明のタンパク質の活性を調節する化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、心不全治療の目的で本発明のタンパク質の活性を調節する化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、心不全治療の目的で本発明のタンパク質の活性を調節する化合物またはその塩を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４５】
〔２〕本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の定量
本発明のタンパク質に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）は、本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のタンパク質の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のタンパク質とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法、および
（ｉｉ）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法を提供する。
上記（ｉｉ）の定量法においては、一方の抗体が本発明のタンパク質のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質のＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称する場合がある）を用いて本発明のタンパク質の定量を行なえるほか、組織染色等による検出を行うこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
【００４６】
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔^１２５Ｉ〕、〔^１３１Ｉ〕、〔^３Ｈ〕、〔^１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。
【００４７】
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタンパク質量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のタンパク質のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
【００４８】
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江　寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江　寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．　７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ａ））、　同書　Ｖｏｌ．　７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｂ））、　同書　Ｖｏｌ．　７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｃ））、　同書　Ｖｏｌ．　８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、　同書　Ｖｏｌ．　９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ））、　同書　Ｖｏｌ．　１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のタンパク質を感度良く定量することができる。
さらには、本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質の濃度を定量することによって、本発明のタンパク質の濃度の増加が検出された場合、例えば、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）、中枢神経疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病など）、生殖器疾患（例、精巣過敏症、卵巣機能不全、不妊症など）などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパク質を検出するために使用することができる。また、本発明のタンパク質を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のタンパク質の検出、被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動の分析などのために使用することができる。
【００４９】
〔３〕遺伝子診断剤
本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）における本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより発現過多が検出された場合やＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によりＤＮＡの突然変異が検出された場合は、例えば、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）、中枢神経疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病など）、生殖器疾患（例、精巣過敏症、卵巣機能不全、不妊症など）などの疾病である可能性が高いと診断することができる。
【００５０】
〔４〕アンチセンスヌクレオチドを含有する医薬
本発明のＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑制することができる本発明のアンチセンスヌクレオチドは低毒性であり、生体内における本発明のタンパク質または本発明のＤＮＡの機能（例、心機能抑制活性、心筋細胞機能不活性化作用など）を抑制することができるので、例えば、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）、中枢神経疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病など）、生殖器疾患（例、精巣過敏症、卵巣機能不全、不妊症など）などの予防・治療剤、または避妊薬などとして使用することができる。
上記アンチセンスヌクレオチドを上記の予防・治療剤として使用する場合、公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。
例えば、該アンチセンスヌクレオチドを用いる場合、該アンチセンスヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。該アンチセンスヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。
該アンチセンスヌクレオチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、心不全治療の目的で本発明のアンチセンスヌクレオチドを経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ）においては、一日につき該アンチセンスヌクレオチドを約０．１〜１００ｍｇ投与する。
さらに、該アンチセンスヌクレオチドは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
【００５１】
本発明は、さらに
（ｉ）本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡ、（ｉｉ）前記二重鎖ＲＮＡを含有してなる医薬、
（ｉｉｉ）本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイム、（ｉｖ）前記リボザイムを含有してなる医薬を提供する。
これらの二重鎖ＲＮＡ（ＲＮＡｉ；ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ法）、リボザイムなどは、上記アンチセンスヌクレオチドと同様に、本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）の発現を抑制することができ、生体内における本発明のペプチドまたは本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）の活性や機能（例、心機能抑制活性、心筋細胞機能不活性化作用など）を阻害することができるので、例えば、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）、中枢神経疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病など）、生殖器疾患（例、精巣過敏症、卵巣機能不全、不妊症など）などの予防・治療剤、または避妊薬などとして使用することができる。
二重鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、Ｎａｔｕｒｅ，　４１１巻，　４９４頁，　２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リボザイムは、公知の方法（例、ＴＲＥＮＤＳ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，　７巻，　２２１頁，　２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、本発明のペプチドをコードするＲＮＡの一部に公知のリボザイムを連結することによって製造することができる。本発明のペプチドをコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得る本発明のＲＮＡ上の切断部位に近接した部分（ＲＮＡ断片）が挙げられる。
上記の二重鎖ＲＮＡまたはリボザイムを上記予防・治療剤として使用する場合、アンチセンスヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。
【００５２】
〔５〕本発明の抗体を含有する医薬
本発明のタンパク質の活性を中和する作用を有する本発明の抗体は、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）、中枢神経疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病など）、生殖器疾患（例、精巣過敏症、卵巣機能不全、不妊症など）などの疾患に対する医薬として使用することができる。
本発明の抗体を含有する上記疾患の予防・治療剤は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の心不全の治療のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ　ｃａｓｔｏｒ　ｏｉｌ）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【００５３】
〔６〕本発明のタンパク質またはＤＮＡを含有する医薬
本発明のタンパク質または本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）は、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）、中枢神経疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病など）、生殖器疾患（例、精巣過敏症、卵巣機能不全、不妊症など）などの予防・治療剤、または避妊薬などの医薬としても有用である。本発明のタンパク質を上記医薬として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。本発明のＤＮＡを上記予防・治療剤として使用する場合は、本発明のＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
例えば、本発明のタンパク質または本発明のＤＮＡは、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のタンパク質または本発明のＤＮＡを生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
本発明のタンパク質の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、心不全患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、心不全患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のＤＮＡの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、心不全患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、心不全患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００５４】
〔７〕本発明のＤＮＡを有する動物の作出
本発明は、外来性の本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１）記載の動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである上記（２）記載の動物、および
（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターなどを提供する。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ導入動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを導入することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ導入方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを導入し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ導入動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ_１系統，ＢＤＦ_１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ_１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
【００５５】
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のタンパク質を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に導入させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを導入させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ導入哺乳動物を作出することができる。
【００５６】
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、▲１▼ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ導入哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。
【００５７】
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流　に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なポリペプチドの翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域はＤＮＡ導入動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
【００５８】
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ導入動物を用いて、本発明のタンパク質の機能亢進症や、本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを導入させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質に関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
【００５９】
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ導入動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正常タンパク質の機能阻害（ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｎｅｇａｔｉｖｅ作用）を解明するモデルとなる。また、本発明の外来異常ＤＮＡを導入させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質またはその機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ導入動物のその他の利用可能性として、例えば、
（ｉ）組織培養のための細胞源としての使用、
（ｉｉ）本発明のＤＮＡ導入動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析する、またはＤＮＡにより発現されたポリペプチド組織を分析することによる、本発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するタンパク質との関連性についての解析、
（ｉｉｉ）ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
（ｖ）本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ導入動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症などを含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ導入動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ導入細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のタンパク質産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
【００６０】
具体例としては、本発明のＤＮＡ導入動物に試験化合物を投与し、該動物の心機能、心電図、心重量などを測定する。心重量は心肥大のパラメーターである。具体的には体重当たりの心臓重量、体重当たりの左心室重量、右心室重量当たりの左心室重量を算出することによって心臓構造を調べることができる。心肥大が生じると上記パラメーターは増加するため、この増加を抑制することを指標として試験化合物を評価することができる。本発明のＤＮＡ導入動物に試験化合物を投与した後、心筋梗塞形成手術を行い、該動物の心機能、心電図、心重量などを測定する。また心筋梗塞手術を行った後、梗塞層を秤量することによって試験化合物の梗塞進展抑制活性を調べることができる。試験化合物の投与は、梗塞形成手術後であってもよい。また該動物と例えばＳＨＲラットなど遺伝的高血圧モデルラットと交配させ、新しい心不全モデルを作成することができる。このようにして作成した心不全モデルに化合物を投与し、該動物の心機能、心電図、心重量、梗塞進展抑制活性などを調べる。
【００６１】
〔８〕ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された上記（１）記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である上記（１）記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１）記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである上記（４）記載の胚幹細胞、
（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる上記（６）記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（６）記載の非ヒト哺乳動物、
（９）ゲッ歯動物がマウスである上記（８）記載の非ヒト哺乳動物、および
（１０）上記（７）記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害（好ましくは阻害）する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、あるいは該ＤＮＡがコードしている本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のタンパク質の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
【００６２】
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
【００６３】
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知なＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ_１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ_１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０^６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
【００６４】
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０．００１−０．５％トリプシン／０．１−５ｍＭ　ＥＤＴＡ、好ましくは約０．１％トリプシン／１ｍＭ　ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔Ｍ．　Ｊ．　Ｅｖａｎｓ及びＭ．　Ｈ．　Ｋａｕｆｍａｎ，　ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２９２巻、１５４頁、１９８１年；Ｇ．　Ｒ．　Ｍａｒｔｉｎ　プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．）第７８巻、７６３４頁、１９８１年；Ｔ．　Ｃ．　Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ　ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第８７巻、２７頁、１９８５年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のタンパク質の細胞生物学的検討において有用である。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
【００６５】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のタンパク質により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【００６６】
〔８ａ〕本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
例えば、心機能の低下を特徴とする疾病（例、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）、中枢神経疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病など）、生殖器疾患（例、精巣過敏症、卵巣機能不全、不妊症など）など）に対して予防・治療効果を有する化合物をスクリーニングする場合、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の心機能、心電図、心重量などを測定する。心重量は心肥大のパラメーターである。具体的には体重当たりの心臓重量、体重当たりの左心室重量、右心室重量当たりの左心室重量を算出することによって心臓構造を調べることができる。心肥大が生じると上記パラメーターは増加するため、この増加を抑制することを指標として試験化合物を評価することができる。本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与した後、心筋梗塞形成手術を行い、該動物の心機能、心電図、心重量などを測定する。また心筋梗塞手術を行った後、梗塞層を秤量することによって試験化合物の梗塞進展抑制活性を調べることができる。試験化合物の投与は、梗塞形成手術後であってもよい。また該動物と例えばＳＨＲラットなど遺伝的高血圧モデルラットと交配させ、新しい心不全モデルを作成することができる。このようにして作成した心不全モデルに化合物を投与し、該動物の心機能、心電図、心重量、梗塞進展抑制活性などを調べる。
【００６７】
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の心不全患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の心不全患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００６８】
〔８ｂ〕本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
【００６９】
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のタンパク質の発現する組織で、本発明のタンパク質の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のタンパク質欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
【００７０】
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【００７１】
また、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質の発現を阻害し、該タンパク質の機能を阻害することができるので、例えば心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）中枢神経疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病など）、生殖器疾患（例、精巣過敏症、卵巣機能不全、不妊症など）などの予防・治療剤、または避妊薬などの医薬として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の心不全患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の心不全患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００７２】
一方、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の心不全患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の心不全患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のタンパク質のプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子導入動物）を作成すれば、特異的にそのポリペプチドを合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のタンパク質そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
【００７３】
本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ　　　　　：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ　　　　：相補デオキシリボ核酸
Ａ　　　　　　：アデニン
Ｔ　　　　　　：チミン
Ｇ　　　　　　：グアニン
Ｃ　　　　　　：シトシン
Ｒ　　　　　　：アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ）
Ｙ　　　　　　：シトシン（Ｃ）またはチミン（Ｔ）
Ｋ　　　　　　：グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｍ　　　　　　：アデニン（Ａ）またはシトシン（Ｃ）
Ｓ　　　　　　：グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）
Ｗ　　　　　　：アデニン（Ａ）またはチミン（Ｔ）
Ｎ　　　　　　：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
ＲＮＡ　　　　　：リボ核酸
ｍＲＮＡ　　　　：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ　　　　：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ　　　　：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ　　　　：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ　　　　：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ　　　　　：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ　　　　：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ　　　　　：ドデシル硫酸ナトリウム
【００７４】
Ｇｌｙ　　　　　　：グリシン
Ａｌａ　　　　　　　　　：アラニン
Ｖａｌ　　　　　　　　　：バリン
Ｌｅｕ　　　　　　　　　：ロイシン
Ｉｌｅ　　　　　　　　　　：イソロイシン
Ｓｅｒ　　　　　　　　　　：セリン
Ｔｈｒ　　　　　　　　　：スレオニン
Ｃｙｓ　　　　　　　　　　：システイン
Ｍｅｔ　　　　　　　　　　：メチオニン
Ｇｌｕ　　　　　　　　　　：グルタミン酸
Ａｓｐ　　　　　　　　　　：アスパラギン酸
Ｌｙｓ　　　　　　　　　　：リジン
Ａｒｇ　　　　　　　　　　：アルギニン
Ｈｉｓ　　　　　　　　　　：ヒスチジン
Ｐｈｅ　　　　　　　　　　：フェニルアラニン
Ｔｙｒ　　　　　　　　　　：チロシン
Ｔｒｐ　　　　　　　　　　：トリプトファン
Ｐｒｏ　　　　　　　　　　：プロリン
Ａｓｎ　　　　　　　　　　：アスパラギン
Ｇｌｎ　　　　　　　　　　：グルタミン
ｐＧｌｕ　　　　：ピログルタミン酸
【００７５】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。

【００７６】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
実施例１で得られた塩基配列を示す。
〔配列番号：２〕
実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
実施例１で得られた塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
実施例１で得られた塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
実施例１で得られた塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
実施例１〜実施例５、実施例８および実施例９で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
実施例１で得られた塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
実施例１で得られたｒ１６４−１ｈ全長遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
ラット由来新規タンパク質ｒ１６４−１ｈのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１４〕
実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕
実施例１で得られたｒ１６４−１ｈ全長遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
実施例２〜実施例５で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕
実施例２で得られた塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
実施例２で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
実施例２で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕
実施例２で得られた塩基配列を示す。
〔配列番号：２２〕
実施例２で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２３〕
実施例２および実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２４〕
実施例２で得られた塩基配列を示す。
〔配列番号：２５〕
ヒト由来新規タンパク質ｈ１６４−１ｈのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２６〕
ヒト由来新規タンパク質ｈ１６４−１ｈをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２７〕
ラット由来新規タンパク質ｒ１６４−１ｈをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２８〕
ヒト由来新規タンパク質ｈ１６４−１ｂのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２９〕
ヒト由来新規タンパク質ｈ１６４−１ｂをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３０〕
ラット由来新規タンパク質ｒ１６４−１ｂのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３１〕
ラット由来新規タンパク質ｒ１６４−１ｂをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３２〕
実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３３〕
実施例６で得られた塩基配列を示す。
〔配列番号：３４〕
実施例７で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３５〕
実施例７で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３６〕
実施例７で得られた塩基配列を示す。
〔配列番号：３７〕
実施例７で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３８〕
実施例７で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３９〕
実施例７で得られた塩基配列を示す。
〔配列番号：４０〕
実施例７で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４１〕
実施例７で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：４２〕
実施例７で得られた塩基配列を示す。
〔配列番号：４３〕
実施例７で得られた塩基配列を示す。
〔配列番号：４４〕
実施例８および実施例９で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
【００７７】
後述の実施例１で得られた形質転換体　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴＢ２２６８　は、２００２年６月１２日から日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに受託番号　ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０７１として寄託されている。
後述の実施例２で得られた形質転換体　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴＢ２２６９　は、２００２年６月１２日から日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに受託番号　ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０７２として寄託されている。
後述の実施例６で得られた形質転換体　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴＢ２２７０　は、２００２年６月１２日から日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに受託番号　ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０７３として寄託されている。
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１
ｒ１６４−１ｈ遺伝子のクローニング
（１）心筋梗塞モデルラットの作製
渡邉らの報告（サーキュレーションリサーチ、第６９巻、３７０−３７７頁、１９９１年）に従い雄性ウイスターラット（１１週齢：体重３００−４００ｇ）をペントバルビタール（５０　ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）で麻酔し、人工呼吸下で正中にて開胸した。心嚢膜を切開後、心臓を露出させた。冠動脈の左前下行枝起始部で、糸付き縫合針（エルプ社、５−０シルク）にて心筋ごと冠動脈を絹糸で縛った後閉胸した。偽手術群は糸を縛らずに閉胸した。麻酔から回復後、通常飼育した。
（２）Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡの抽出
術後１週経過、８週経過、２０週経過および３０週経過したラットをペントバルビタール麻酔下で開胸し、心臓を摘出した後、生理食塩水で大動脈より逆行性に冠動脈を潅流して血液を洗い流した。摘出した心臓からハサミで左心室以外の組織を取り除いた後、梗塞形成を確認した後に梗塞領域（スカー形成部位）を取り除き、非梗塞領域のみとした。これをハサミで細かく細断した後、ＩＳＯＧＥＮ（和光純薬社製）を用いてＴｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。
【００７８】
（３）ｒ１６４−１ｈ遺伝子のクローニングと発現ベクターの構築
Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡからゲノムＤＮＡを除去する目的でｅｎｚｙｍｅ　ｓｅｔ　ｆｏｒ　ＤＤ（宝酒造社製）を用いてＤＮＡ分解操作を加えた後、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｄｉｓｐｌａｙ　ｋｉｔ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｖｅｒｓｉｏｎ（宝酒造社製）を用いてディファレンシャルディスプレー（ＤＤ）を行った。対象組織として偽手術した後８週経過した左心室由来のＴｏｔａｌ　ＲＮＡを用いた。その結果、対象組織と比較して術後１週、２０週、３０週経過した組織で増加を示すバンドを見出した。このバンドをアクリルアミドゲルからカッターで切り出し、滅菌蒸留水に懸濁し、９５℃、１０分間加熱することによりゲルから遺伝子断片を抽出した。次にＰＣＲで再増幅した後、ＤＮＡ塩基配列を解読した。そこで明らかとなった塩基配列（配列番号：１）を公のデータベースであるＥＳＴデータベースを用いてＢｌａｓｔＮによるホモロジー検索を行ったところ、ＡＷ４３５３２９　ＵＩ−Ｒ−ＢＪ０ｐ−ａｆｃ−ｃ−０５−０−ＵＩ．ｓ１　ＵＩ−Ｒ−ＢＪ０ｐ　Ｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ　ｃＤＮＡ　ｃｌｏｎｅ　ＵＩ−Ｒ−ＢＪ０ｐ−ａｆｃ−ｃ−０５−０−ＵＩ　３’，　ｍＲＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅとほぼ一致することがわかった。そこでこの配列を基に２種のプライマー（配列番号：２および配列番号：３）を設計し、これらのプライマーを用いｒａｔ　ｈｅａｒｔ　Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）に対し、プロトコールに従って５’　ＲＡＣＥ　ＰＣＲを行った。その結果、３’側の配列が一致した２種の塩基配列（配列番号：４および配列番号：５）が得られた。また、得られた配列番号：４で表される塩基配列を公のデータベースであるｎｔデータベースを用いてＢｌａｓｔＮによるホモロジー検索を行ったところ、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＭＧＣ１４１６１　（ＭＧＣ１４１６１）　ｍＲＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ　ＩＤ：ＸＭ＿０３２３７７）と相同性が高いことがわかった。そこで配列番号：４で表される塩基配列を基にフォワードプライマー（配列番号：６）を、配列番号：５で表される塩基配列を基にリバースプライマー（配列番号：７）を作成し、これらのプライマーを用いｒａｔ　ｈｅａｒｔ　Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）に対し、ＰＣＲを行い、配列番号：８で表される塩基配列を得た。また配列番号：４で表される塩基配列を基に２種のプライマー（配列番号：９および配列番号：１０）を設計し、これらのプライマーを用いｒａｔ　ｈｅａｒｔ　Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）に対し、プロトコールに従って再度５’　ＲＡＣＥ　ＰＣＲを行った。その結果、配列番号：１１の塩基配列が得られた。
配列番号：４、配列番号：８および配列番号：１１の３種の塩基配列を合わせることにより、配列番号：１２で表される塩基配列を得、この塩基配列には２５６アミノ酸残基からなるタンパク質（配列番号：１３）をコードする配列番号：２７で表される塩基配列が含まれていた。配列番号：１３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質を、ｒ１６４−１ｈと命名した。
配列番号：１２で表される塩基配列を基に２種のプライマー（配列番号：１４および配列番号：１５）を設計し、これらのプライマーを用いｒａｔ　ｈｅａｒｔ　Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）に対し、ＰＣＲを行い、得られた配列番号：１６で表される塩基配列を有する１０７２ｂｐの断片をｐＴＡＲＧＥＴ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の処方に従いプラスミドベクターｐＴＡＲＧＥＴベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）へサブクローニングした。得られた発現ベクターをｒ１６４１ｈｏｎＴＡＲＧＥと命名した。
ｒ１６４−１ｈ（配列番号：１３）は、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＭＧＣ１４１６１とアミノ酸レベルで７７％の相同性があった。
配列番号：１６で表される塩基配列を含むプラスミドｐＴＢ２２６８を有する形質転換体を、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９／ｐＴＢ２２６８と命名した。
【００７９】
実施例２
ｈ１６４−１ｈ遺伝子のクローニングと発現ベクターの構築
ｒ１６４−１ｈをコードする塩基配列を基に設計したプライマー（配列番号：１７および配列番号：９）を用い、ｈｕｍａｎ　ｈｅａｒｔ　Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）に対し、ＰＣＲを行い、配列番号：１８で表される塩基配列を得た。また配列番号：１８で表される塩基配列を基に２種のプライマー（配列番号：１９および配列番号：２０）を設計し、これらのプライマーを用いｈｕｍａｎ　ｈｅａｒｔ　Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）に対し、プロトコールに従って５’　ＲＡＣＥ　ＰＣＲを行った。その結果、配列番号：２１で表される塩基配列が得られた。配列番号：２１の塩基配列を基に設計したプライマー（配列番号：２２）およびＭＧＣ１４１６１の塩基配列（実施例１参照）を基に設計したプライマー（配列番号：２３）を用い、ｈｕｍａｎ　ｈｅａｒｔ　Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）に対し、ＰＣＲを行い、配列番号：２４で表される塩基配列を得た。この塩基配列には２４９アミノ酸残基からなるタンパク質（配列番号：２５）をコードする配列番号：２６で表される塩基配列が含まれていた。配列番号：２５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質を、ｈ１６４−１ｈと命名した。
得られた断片（配列番号：２４）を再度、２種のプライマー（配列番号：２２および配列番号：２３）を用いてＰＣＲで増幅させ、得られた断片をｐＴＡＲＧＥＴ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の処方に従いプラスミドベクターｐＴＡＲＧＥＴベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）へサブクローニングした。得られた発現ベクターをｈ１６４１ｈｏｎＴＡＲＧＥと命名した。
ｈ１６４−１ｈ（配列番号：２５）は、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＭＧＣ１４１６１とアミノ酸レベルで８２％の相同性があった。また、ｈ１６４−１ｈ（配列番号：２５）と実施例１で得られたｒ１６４−１ｈ（配列番号：１３）とは、アミノ酸レベルで９０％の相同性があった。
配列番号：２４で表される塩基配列を含むプラスミドｐＴＢ２２６９を有する形質転換体を、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９／ｐＴＢ２２６９と命名した。
【００８０】
実施例３
心筋梗塞モデルラットでのｒ１６４−１ｈ遺伝子の経時変化の解析
実施例１（２）に記載した心筋梗塞形成術後１週、８週、２０週および３０週経過ラットの左心室の非梗塞領域由来のＴｏｔａｌ　ＲＮＡと、その対象として偽手術した後１週、８週、２０週および３０週経過ラットの左心室由来のＴｏｔａｌ　ＲＮＡからＴａｑＭａｎ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。次にｒ１６４−１ｈを特異的に増幅できるプライマーである配列番号：１７および配列番号：９でそれぞれ表される塩基配列を有するプライマーを用い、ＰＣＲによるｒ１６４−１ｈ遺伝子のコピー数の定量をＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　７９００　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍによって行った。なお、反応は、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を使用し、その全ての方法は添付されている説明書に従って行った。定量化用スタンダードの調製法を以下に記す。心筋梗塞形成術後１週経過ラット左心室の非梗塞領域由来のＴｏｔａｌ　ＲＮＡをＴａｑＭａｎ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。次にｒ１６４−１ｈを特異的に増幅できるプライマーである配列番号：１７および配列番号：９でそれぞれ表されるプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたｒ１６４−１ｈ遺伝子の部分配列を有する遺伝子断片をそのスタンダードとした。更に算出されたコピー数を内部コントロールとしてｒ１６４−１ｈ遺伝子のコピー数と同様にＴａｑＭａｎ　Ｒｏｄｅｎｔ　ＧＡＰＤＨ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｒｅｇｅｎｔｓ　ＶＩＣ（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて算出したグリセロール３りん酸脱水酵素のコピー数で補正した後、その値を発現量として対象組織と比較し、変動率をデータ化した。
その結果、ｒ１６４−１ｈ遺伝子は術後１週、２０週および３０週でそれぞれ、１．３倍、１．３倍および１．４倍それぞれ発現が増加することが明らかとなった。
【００８１】
実施例４
正常ラットにおけるｒ１６４−１ｈ遺伝子の組織分布の解析
ｒ１６４−１ｈを特異的に増幅できるプライマーとして配列番号：１７および配列番号：９でそれぞれ表される塩基配列を有するプライマーを用い、脳、心臓、腎臓、脾臓、胸腺、肝臓、胃、小腸、筋肉、肺、精巣および皮膚の各臓器由来のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型にＰＣＲを行い、ｒ１６４−１ｈ遺伝子のコピー数の定量をＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　７９００　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍによって行った。なお、反応はＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を使用し、その全ての方法は添付されている説明書に従って行った。定量化用スタンダードの調製法を以下に記す。心筋梗塞形成術後１週経過ラット左心室の非梗塞領域由来のＴｏｔａｌ　ＲＮＡをＴａｑＭａｎ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。次にｒ１６４−１ｈを特異的に増幅できるプライマーである配列番号：１７および配列番号：９でそれぞれ表されるプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたｒ１６４−１ｈ遺伝子の部分配列を有する遺伝子断片をそのスタンダードとした。更に算出されたコピー数を内部コントロールとしてｒ１６４−１ｈ遺伝子のコピー数と同様にＴａｑＭａｎ　Ｒｏｄｅｎｔ　ＧＡＰＤＨ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｒｅｇｅｎｔｓ　ＶＩＣ（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて算出したグリセロール３りん酸脱水酵素のコピー数で補正した後、その値を発現量としてデータ化した。
その結果、ｒ１６４−１ｈ遺伝子の心臓での発現が０．００４１と最大で、精巣では０．０００５の発現が見られた。他の臓器では、ｒ１６４−１ｈ遺伝子の発現は０．０００２以下であり、心臓がｒ１６４−１ｈ遺伝子の主要発現部位であることがわかった。
【００８２】
実施例５
ヒトにおけるｈ１６４−１ｈ遺伝子の組織分布の解析
配列番号：１７および配列番号：９で表される塩基配列をそれぞれ有するプライマーを用いて、脳、心臓、腎臓　、脾臓、胸腺　、肝臓、膵臓、小腸、骨格筋、肺、精巣および大動脈の各臓器由来のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型にＰＣＲを行い、ＰＣＲによるｈ１６４−１ｈ遺伝子のコピー数の定量を、ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　７９００　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍによって行った。なお、反応は、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を使用し、その全ての方法は添付されている説明書に従って行った。定量化用スタンダードの調製法を以下に記す。ｈｕｍａｎ　ｈｅａｒｔ　Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて上記プライマー（配列番号：１７および配列番号：９）でＰＣＲを行い、得られたｈ１６４−１ｈ遺伝子の部分配列を有する遺伝子断片をそのスタンダードとした。更に算出されたコピー数を内部コントロールとしてｈ１６４−１ｈ遺伝子のコピー数と同様にＴａｑＭａｎ　ＧＡＰＤＨ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｒｅｇｅｎｔｓ（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて算出したグリセロール３りん酸脱水酵素のコピー数で補正した後、その値を発現量としてデータ化した。
その結果、心臓でのｈ１６４−１ｈ遺伝子の発現が０．００２１と最大で、精巣では０．０００３の発現が見られた。他の臓器ではｈ１６４−１ｈ遺伝子の発現は０．０００１以下であり、心臓がｈ１６４−１ｈ遺伝子の主要発現部位であることがわかった。
【００８３】
実施例６
ｈ１６４−１ｂ遺伝子のクローニングと発現ベクターの構築
ＭＧＣ１４１６１をコードする塩基配列を基に設計したプライマー　（配列番号：３２および配列番号：２３）を用い、ｈｕｍａｎ　ｈｅａｒｔ　Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）に対し、ＰＣＲを行い、配列番号：３３で表される塩基配列を得た。この塩基配列には４８１アミノ酸残基からなるタンパク質（配列番号：２８）をコードする配列番号：２９で表される塩基配列が含まれていた。配列番号：２８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質を、ｈ１６４−１ｂと命名した。ｈ１６４−１ｂ（配列番号：２８）は、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＭＧＣ１４１６１とアミノ酸レベルで７４％の相同性があった。
配列番号：３３で表される塩基配列を再度増幅後、得られた断片をｐＴＡＲＧＥＴ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の処方に従いプラスミドベクターｐＴＡＲＧＥＴベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）へサブクローニングした。得られた発現ベクターをｈ１６４１ｂｏｎＴＡＲＧＥと命名した。
配列番号：３３で表される塩基配列を含むプラスミドｐＴＢ２２７０を有する形質転換体を、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９／ｐＴＢ２２７０と命名した。
【００８４】
実施例７
ｒ１６４−１ｂ遺伝子の塩基配列の決定
ＭＧＣ１４１６１をコードする塩基配列を基に設計したプライマー（配列番号：３４）および配列番号：１２で表される塩基配列を基に設計したプライマー（配列番号：３５）を用い、ｒａｔ　ｂｒａｉｎ　Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）に対し、ＰＣＲを行い、配列番号：３６で表される塩基配列を得た。ＭＧＣ１４１６１をコードする塩基配列を基に設計したプライマー（配列番号：３７）および配列番号：１２で表される塩基配列を基に設計したプライマー（配列番号：３８）を用い、ｒａｔ　ｂｒａｉｎ　Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）に対し、ＰＣＲを行い、配列番号：３９で表される塩基配列を得た。また配列番号：３９で表される塩基配列を基に２種のプライマー（配列番号：４０および配列番号：４１）を設計し、これらのプライマーを用いｒａｔ　ｂｒａｉｎ　Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）、ｒａｔ　ｈｅａｒｔ　Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）、ｒａｔ　ｔｅｓｔｉｓ　Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）、に対し、プロトコールに従って５’　ＲＡＣＥ　ＰＣＲを行った。その結果、配列番号：４２で表される塩基配列が得られた。配列番号１２、配列番号：３６、配列番号：３９、および配列番号：４２の塩基配列を合わせることにより、配列番号：４３の塩基配列を得た。この塩基配列には４８１アミノ酸残基からなるタンパク質（配列番号：３０）をコードする配列番号：３１の塩基配列が含まれていた。配列番号：３０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質を、ｒ１６４−１ｂと命名した。
ｒ１６４−１ｂ（配列番号：３０）は、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＭＧＣ１４１６１とアミノ酸レベルで４８％の相同性があった。また、ｒ１６４−１ｂ（配列番号：３０）と実施例１で得られたｒ１６４−１ｈ（配列番号：１３）とは、アミノ酸レベルで７８％の相同性があった。また、ｒ１６４−１ｂ（配列番号：３０）と実施例６で得られたｈ１６４−１ｂ（配列番号：２８）とは、アミノ酸レベルで９８％の相同性があった。
【００８５】
実施例８
心筋梗塞モデルラットでのｒ１６４−１ｂ遺伝子の経時変化の解析
実施例１（２）に記載した心筋梗塞形成術後１週、８週、２０週および３０週経過ラットの左心室の非梗塞領域由来のＴｏｔａｌ　ＲＮＡと、その対象として偽手術した後１週、８週、２０週および３０週経過ラットの左心室由来のＴｏｔａｌ　ＲＮＡからＴａｑＭａｎ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。次にｒ１６４−１ｂを特異的に増幅させるプライマーとして、配列番号：４４および配列番号：９でそれぞれ表される塩基配列を有するプライマーを用い、ＰＣＲによるｒ１６４−１ｂ遺伝子のコピー数の定量をＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　７９００　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍによって行った。なお、反応は、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を使用し、その全ての方法は添付されている説明書に従って行った。定量化用スタンダードの調製法を以下に記す。Ｒａｔ　Ｂｒａｉｎ　Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）と、配列番号：４４および配列番号：９でそれぞれ表される塩基配列を有するプライマーとを用いてＰＣＲを行い、得られたｒ１６４−１ｂ遺伝子の部分配列を有する遺伝子断片をそのスタンダードとした。更に算出されたコピー数を内部コントロールとしてｒ１６４−１ｂ遺伝子のコピー数と同様にＴａｑＭａｎ　Ｒｏｄｅｎｔ　ＧＡＰＤＨ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｒｅｇｅｎｔｓ　ＶＩＣ（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて算出したグリセロール３りん酸脱水酵素のコピー数で補正した後、その値を発現量として対象組織と比較し、変動率をデータ化した。
その結果、ｒ１６４−１ｂ遺伝子は術後１週、８週、２０週および３０週でそれぞれ、２．２倍、２．２倍、２．７倍および３．３倍それぞれ発現が増加することが明らかとなった。
【００８６】
実施例９
正常ラットにおけるｒ１６４−１ｂ遺伝子の組織分布の解析
ｒ１６４−１ｂを特異的に増幅させるプライマーとして配列番号：４４および配列番号：９でそれぞれ表される塩基配列を有するプライマーを用い、脳、心臓、腎臓、脾臓、胸腺、肝臓、胃、小腸、筋肉、肺、精巣および皮膚の各臓器由来のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型にＰＣＲを行い、ｒ１６４−１ｂ遺伝子のコピー数の定量をＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　７９００　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍによって行った。なお、反応はＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を使用し、その全ての方法は添付されている説明書に従って行った。定量化用スタンダードの調製法を以下に記す。Ｒａｔ　Ｂｒａｉｎ　Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）と配列番号：４４および配列番号：９でそれぞれ表される塩基配列を有するプライマーとを用いてＰＣＲを行い、得られたｒ１６４−１ｂ遺伝子の部分配列を有する遺伝子断片をそのスタンダードとした。更に算出されたコピー数を内部コントロールとしてｒ１６４−１ｂ遺伝子のコピー数と同様にＴａｑＭａｎ　Ｒｏｄｅｎｔ　ＧＡＰＤＨ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｒｅｇｅｎｔｓ　ＶＩＣ（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて算出したグリセロール３りん酸脱水酵素のコピー数で補正した後、その値を発現量としてデータ化した。
その結果、ｒ１６４−１ｂ遺伝子発現は精巣での発現が０．００３９と最大で、脳では０．０００５の発現が見られた。心臓での発現は０．００００２であり、他の臓器では、ｒ１６４−１ｂ遺伝子の発現は０．０００１以下であった。精巣と脳がｒ１６４−１ｂ遺伝子の主要発現部位であることがわかった。
【００８７】
【発明の効果】
本発明のタンパク質およびポリヌクレオチドは、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）、中枢神経疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病など）、生殖器疾患（例、精巣過敏症、卵巣機能不全、不妊症など）などの診断マーカー等として有用であり、該タンパク質、ポリヌクレオチドまたは該タンパク質に対する抗体を用いるスクリーニングにより得られる化合物またはその塩、該タンパク質の活性を阻害する中和抗体などは、例えば、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）、中枢神経疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病など）、生殖器疾患（例、精巣過敏症、卵巣機能不全、不妊症など）などの予防・治療剤、または避妊薬として使用することができる。
また、本発明のアンチセンスヌクレオチドは、本発明のタンパク質の発現を抑制することができ、例えば、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）、中枢神経疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病など）、生殖器疾患（例、精巣過敏症、卵巣機能不全、不妊症など）などの予防・治療剤、または避妊薬などとして使用することができる。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、例えば心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）中枢神経疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、精神分裂病など）、生殖器疾患（例、精巣過敏症、卵巣機能不全、不妊症など）などの診断、予防または治療に有用である。
【００８８】
【配列表】

Claims (38)

1. 配列番号：２５、配列番号：２８、配列番号：１３もしくは配列番号：３０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩。
2. 配列番号：２５で表されるアミノ酸配列を含有する請求項１記載のタンパク質またはその塩。
3. 配列番号：２８で表されるアミノ酸配列を含有する請求項１記載のタンパク質またはその塩。
4. 配列番号：１３で表されるアミノ酸配列を含有する請求項１記載のタンパク質またはその塩。
5. 配列番号：３０で表されるアミノ酸配列を含有する請求項１記載のタンパク質またはその塩。
6. 請求項１記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩。
7. 請求項１記載のタンパク質または請求項６記載の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
8. ＤＮＡである請求項７記載のポリヌクレオチド。
9. 配列番号：２６、配列番号：２９、配列番号：２７または配列番号：３１で表される塩基配列を含有する請求項８記載のポリヌクレオチド。
10. 請求項７記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
11. 請求項１０記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
12. 請求項１１記載の形質転換体を培養し、請求項１記載のタンパク質または請求項６記載の部分ペプチドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする請求項１記載のタンパク質もしくは請求項６記載の部分ペプチドまたはその塩の製造法。
13. 請求項１記載のタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬。
14. 請求項７記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
15. 請求項７記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬。
16. 請求項１記載のタンパク質もしくは請求項６記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
17. 請求項１６記載の抗体を含有してなる診断薬。
18. 請求項１６記載の抗体を含有してなる医薬。
19. 請求項７記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスヌクレオチド。
20. 請求項１９記載のアンチセンスヌクレオチドを含有してなる医薬。
21. 請求項１記載のタンパク質もしくは請求項６記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、請求項１記載のタンパク質もしくは請求項６記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
22. 請求項１記載のタンパク質もしくは請求項６記載の部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、請求項１記載のタンパク質もしくは請求項６記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
23. 請求項２１記載のスクリーニング方法または請求項２２記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、請求項１記載のタンパク質もしくは請求項６記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を調節する化合物またはその塩。
24. 請求項２３記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
25. 請求項７記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、請求項１記載のタンパク質遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
26. 請求項７記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする、請求項１記載のタンパク質遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
27. 請求項２５記載のスクリーニング方法または請求項２６記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、請求項１記載のタンパク質遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩。
28. 請求項２７記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
29. 請求項１６記載の抗体を用いることを特徴とする請求項１記載のタンパク質の定量方法。
30. 請求項２９記載の定量方法を用いることを特徴とする請求項１記載のタンパク質の機能が関連する疾患の診断法。
31. 請求項１６記載の抗体を用いることを特徴とする、請求項１記載のタンパク質の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
32. 請求項１６記載の抗体を含有してなる、請求項１記載のタンパク質の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
33. 請求項３１記載のスクリーニング方法または請求項３２記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、請求項１記載のタンパク質の発現を調節する化合物またはその塩。
34. 請求項３３記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
35. 心疾患の予防・治療剤である請求項１３、１４、１８、２０、２４、２８または３４記載の医薬。
36. 化合物が、過剰な代償機序または代償破綻を抑制する化合物である請求項２４、２８または３４記載の医薬。
37. 心筋症、心筋梗塞、心不全または狭心症の予防・治療剤である請求項３５または請求項３６記載の医薬。
38. 心疾患の診断薬である請求項１５または請求項１７記載の診断薬。