JP2003526360A - ＩＬ−１２活性を増加させるＩＬ−１２ｐ４０小単位体突然変異遺伝子及びこれをＤＮＡワクチン免疫増強剤として利用する用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 高い活性をもつヒトとマウスＩＬ−２を生産することが可能なＩＬ−１２ｐ４０小単位体突然変異遺伝子、前記突然変異遺伝子を含む発現ベクトル、及びこれをＤＮＡワクチン免疫増強剤として利用する用途を提供すること。ヒトまたはマウスＩＬ−１２ｐ４０を暗号化する遺伝子において、その分泌に必須的な役割をするＡｓｎ−２２２（ヒト）またはＡｓｎ−２２０（マウス）部分を他のアミノ酸に置換させたヒトまたはマウスＩＬ−１２ｐ４０小単位体の突然変異遺伝子を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

〔発明の属する技術分野〕 本発明は、高い活性をもつヒトとマウスＩＬ−２を生産することが可能なＩＬ
−１２ｐ４０小単位体突然変異遺伝子、前記突然変異遺伝子を含む発現ベクトル
、及びこれをＤＮＡワクチン免疫増強剤として利用する用途に関し、より詳細に
は、活性型のＩＬ−１２の競争的阻害剤として作用するヒトまたはマウスＩＬ−
１２ｐ４０のＡｓｎ−２２２（ヒト）またはＡｓｎ−２２０（マウス）アミノ酸
に突然変異を誘発させることにより、ＩＬ−１２ｐ４０の分泌は阻害し且つＩＬ
−１２の免疫活性を有するＩｌ−１２ｐ７０の分泌は正常的に行われるようにし
たＩＬ−１２ｐ４０突然変異遺伝子；前記突然変異遺伝子を含み、ＤＮＡ免疫化
の増進に使用される発現ベクトル；前記突然変異遺伝子をＡＩＤＳ、Ｃ型及びＢ
型肝炎、癌、インフルエンザ、結核、マラリアなど疾病のＤＮＡワクチン免疫化
のための免疫増強剤及び長期的な免疫活性維持のための免疫増強剤として使用す
る用途に関する。

【０００１】 〔従来の技術〕 ＩＬ−１２は、適切な刺激が与えられた大食細胞(macrophage)、単核球(monoc
yte)のような抗原提供細胞(Antigen presenting cell、ＡＰＣ)によって分泌さ
れ、生体内で起る各種免疫反応を調節する役割をする。具体的に、ＩＬ−１２は
、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞とＮＫ細胞(natural killer cell)の分化、多様
なサイトカイン(cytokine)生成の調節、Ｔｈ１細胞による免疫反応の上昇、ＣＤ
８＋Ｔ細胞の分化、及び造血細胞(hematopoietic cell)の増殖などの広い分野に
わたった機能を有するだけでなく(Hsieh, C. S., et al., Science, 260:547-54
9, 1993)、特にＣＴＬ細胞(cytotoxic T lymphocyte)とＮＫ細胞の加水分解能力
(Robertson, M. J., and J. Ritz., Oncologist, 1:88-97, 1999; Trinchieri,
G., Annu. Rev. Immunol., 13:251-276, 1995)を増進させることにより免疫反応
を調節するのに重要な役割をする。これまでの報告によれば、エイズ（ＡＩＤＳ
）患者の場合は生物学的活性を有するＩＬ−１２の合成が約５倍程度減少してお
り(Chehimi, J. et al., J. Exp. Med., 179:1361-1366, 1994)、且つＩＬ−１
２受容体遺伝子が欠損したヒトの場合はマイコバクテリア(mycobacteria)に対す
る免疫性が相当減少している(de Jong, R. et., Science 280:1435-1438, 1998)
ことが観察された。このようなＩＬ−１２の作用はウィルス、バクテリア及び多
様な腫瘍に対する強力な生体内免疫反応を初期に誘導することができるため、こ
れを用いた様々な治療剤の開発も活発に行われている趨勢である。

【０００２】 ＩＬ−１２が前記で提示したいろいろの細胞性免疫反応を必要とする疾病に効
果的なワクチンまたは治療剤として使用できる別の理由は、ＩＬ−１２が生体内
で記憶Ｔｈ１細胞(memory Th1)及び記憶ＣＴＬ細胞(memory CTL)の増殖に関わっ
ているという仮設に基づいている(Stobie, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci,
USA, 97:8427-8432, 2000; Mortarini, R. et al, Cancer Res., 60:3559-3568
, 2000; Mbawuike, I. N. et al., J. Infect. Dis., 180:1477-1486, 1999)。
特に、多様な腫瘍の治療時に最も問題になっている転移または再発に焦点を合わ
せてみると、記憶免疫反応(memory immune response)の誘導は必須不可欠なもの
であると思われる。しかし、現在までＩＬ−１２がこのような効果を示すことに
対する正確な機序は明らかになっていない。ところが、最近の幾つかの報告によ
れば、ＩＬ−１２によるＴヘルパー細胞１の分化過程中に増加するＩＦＮ−γが
増殖抑制効果(antiproliferative effect)を示すことができるため、ＩＬ−１２
がＣＤ４＋Ｔ細胞(T helper 1)のアポトーシス(apoptosis)を阻害することによ
り記憶免疫反応が誘導できるという機序が提示されている(Fuss, I. K. et al.,
Gastroenterology, 117:1078-1088, 1999; Marth, T. et al., J. Immunol. 16
2L7233-3240, 1999)。また、ＩＬ−１２によって増加するＩＦＮ−γがＣＤ８＋
Ｔ細胞の強力且つ選択的な刺激に関与するＩＬ−１５の発現を刺激することがで
きるので(Zhang, X. et al., Immunity 8:591-599, 1998)、記憶免疫反応が誘導
できるものという仮設も提起されている。このような報告を根拠にすると、ＩＬ
−１２は初期免疫反応だけでなく、記憶免疫反応にも関与することができるので
、ワクチン免疫化に極めて有用に使用される可能性が提起されている。

【０００３】 ＩＬ−１２の生物学的活性形態はヘテロ二量体であって７０ｋＤａのＩＬ−１
２ｐ７０であり、共有結合された２つの小単位体、即ちｐ３５小単位体とｐ４０
小単位体から構成される。ｐ４０小単位体はＩＬ−６受容体と類似のアミノ酸序
列を共有し、よって、サイトカイン受容体のスーパーファミリー(superfamily)
に属する。一方、ｐ３５小単位体は、サイトカイン受容体のスーパーファミリー
とは距離があるが、ＩＬ−６／顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(granulo
cyte colony stimulating factor:ＧＭ−ＣＳＦ)を含むサイトカインファミリー
(Gearing, D. P., and Cosman, D., Cell, 66:9-10, 1991)と密接な関係を有す
る。

【０００４】 試験管内(in vitro)と生体内(in vivo)でＩＬ−１２ｐ７０の発現時、ｐ４０
小単位体ＩＬ−１２ｐ４０は単量体(monomer)とホモ二量体(homodimer)の形態で
共に大量分泌される(Mattner, F. et al., Eur. J. Immunol., 23:2202-2208, 1
993; Heinzel, F. P. et al., Infect. Immun., 62:4244-4249, 1994)。一般に
、ＩＬ−１２ｐ４０はＩＬ−１２ｐ７０より５〜９０倍以上分泌され、ＩＬ−１
２の受容体にＩＬ−１２ｐ７０と競争的に結合することにより、ＩＬ−１２ｐ７
０の活性を大きく阻害すると報告されている(Gillessen, S. et al., Eur. J. I
mmunol., 25:200-206, 1995; Ling, P. et al., J. Immunol., 154:116-127, 19
95)。このような事実は、ＩＬ−１２ｐ４０の形質転換された鼠においてＴｈ１
反応が減少する現象(Yoshimoto, T. et al., J. Immunol., 160:588-594, 1998)
とＩＬ−１２ｐ４０を生成するように製造された筋芽細胞(myoblast)の利殖時に
同種間の拒否現象が起らない現象(Kato, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci, U
SA, 93:9085-9089, 1996)、ＩＬ−１２ｐ４０を発現するアデノウィルス(adenov
irus)によってＩＬ−１２ｐ７０による腫瘍の減少が阻害される現象(Chen L. et
al., J. Immunol., 159:351-359, 1997)などを含む様々な生体内実験結果によ
って裏付けられている。ところが、最近は同種異系抗原に特異的に反応するＴｈ
１の発達を誘発するＩＬ−１２ｐ７０の活性に対するＩＬ−１２ｐ４０の肯定的
効果を明かした報告もあり(Piccotti. J. R. et al., J. Immunol., 157:1951-1
957, 1996)、大食細胞の走化性物質として作用するＩＬ−１２ｐ４０の新しい機
能が本発明者によって明らかになったことがある(Ha, S. J. et al., J. Immuno
l., 163:2902-2908, 1999) 。

【０００５】 現在はＩＬ−１２ｐ７０の抗癌性効果を証明するために多様な生体内(in vivo
)システムが確立された。ところが、ヒト組換えＩＬ−１２ｐ７０蛋白質を癌患
者に直接投与する場合、死亡まで誘発しうる深刻な毒性を示すため(Robertson,
M. J. and Ritz. J., Oncologist, 1:88-97, 1996; Cohen, J., Science, 270:9
08, 1995)、このような副作用を防止し且つ経済的にも効率のよい方法の模索か
ら、ＩＬ−１２遺伝子を用いた遺伝子治療方面に多くの研究が行われることにな
ったが、その結果、非常に効果的で毒性がないことが証明された(Rakhmilevich,
A. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:6291-6296, 1996; Tahara, H
. et al., J. Immunol., 154:6466-6474, 1995; Lotze, M. T. et al., Ann. N.
Y. Acad. Sci., 795:440-454, 1996)。

【０００６】 ＩＬ−１２を用いた遺伝子治療のためには、ＩＬ−１２の生物学的活性型であ
るＩＬ−１２ｐ７０(Gubler, U. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:414
3-4147, 1991)の生産が必須的であり、よって、一つの細胞内でｐ３５とｐ４０
小単位体のｃＤＮＡが同時に発現されることが要求される。ｐ３５小単位体とｐ
４０小単位体を一つの細胞内で同時に発現させるために、これらを同一のプラス
ミド内に連続的に配列させ、ｐ３５とｐ４０遺伝子がそれぞれ発現されるように
発現カセット(expression cassette)を用いる方法(Rakhmilevich, A. L. et al.
, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:6291-6296, 1996)、或いはＥＭＣＶ(enceph
alomyocarditis virus)のＩＲＥＳ(Internal ribosomal entry site)を用いて２
つの遺伝子を同時に発現させる方法が利用されてきた。ところが、このような方
法は、細胞内でＩＬ−１２ｐ７０を成功的に発現させることはできるが、上述し
たように過多な量のＩＬ−１２ｐ４０の持続的な発現によってＩＬ−１２ｐ７０
の生物学的作用を妨害する可能性を除去することはできなかった。

【０００７】 これを克服するために、最近、抗体製造時に一般に用いられる蛋白質リンカー
(linker)をコーディングしているＤＮＡ序列を用いてｐ３５小単位体とｐ４０小
単位体を連結する方法が提示された(Lieschke, G. J. et al., Nat. Biotechnol
., 15:35-40, 1997; Lode, H. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:24
75-2480, 1998; Lee, Y. L. et al., Human Gene Ther., 9:457-46534, 1998)。
前記方法を用いて過量のＩＬ−１２ｐ４０によって、ＩＬ−１２ｐ７０の生物学
的活性が阻害されることは防ぐことができたが、ｐ３５とｐ４０の両小単位体を
連結させることにより誘発される構造の変化によって生成されたＩＬ−１２ｐ７
０の活性度が５〜１００倍以上減少するという問題点のため、十分な効果を得る
ことができなかった。従って、ＩＬ−１２遺伝子を用いた癌または他の疾病に対
する効率的な治療のためには、ＩＬ−１２ｐ４０が分泌されず且つ活性度が維持
されるＩＬ−１２ｐ７０の生成を誘導する方法が必須的な課題として認識されて
いる実状である。

【０００８】 糖鎖化(glycosylation)は蛋白質のフォールディング(folding)、分泌、構成、
安定性及び生物学的活性において重要な役割を行うと知られてきた。ヒトＩＬ−
１２のｐ３５小単位体とｐ４０小単位体はそれぞれ５６個と２２個の親油性信号
序列を有するアミノ酸を含んで２１９個と３２８個のアミノ酸を発現するが、ｐ
３５とｐ４０の小単位体内に存在する３個と４個のＮ−糖鎖化可能部分がヒトＩ
Ｌ−１２アミノ酸序列分析によって明らかになった(Podlasky, F. J. et al., A
rch. Biochem. Biophys., 294:230-237, 1992)。Sternなどはトリフルオロメタ
ンスルホン酸(trifluoromethane-sulfonic acid)または該当酵素Ｆ(glycosidase
F)でヒトＩＬ−１２を処理した後、ＩＬ−１２ｐ３５とＩＬ−１２ｐ４０の分
子量を調査した結果、それぞれ減少した分子量を示すことを報告した(Stern, A.
S. et al., Arch. Biochem. Biophys., 294:230-237, 1992)。これはヒトＩＬ
−１２のｐ３５小単位体とｐ４０小単位体が炭水化物を成分として有することを
示すものである。同報告書において、ノイラミニダーゼ(neuraminidase)と内部
α−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニダーゼ(endo-α-N-acetyl-galactosaminidas
e)を連続してＩＬ−１２ｐ３５に処理した際、ＩＬ−１２ｐ３５の分子量は減少
するが、これに対し、ＩＬ−１２ｐ４０は同処理に影響されないという事実が証
明された。これはＩＬ−１２ｐ３５にはＯ−結合による糖鎖が存在する一方、Ｉ
Ｌ−１２ｐ４０はＯ−結合による糖鎖が存在しないということを意味する。また
、ヒトＩＬ−１２ｐ４０小単位体の４つのＮ−糖鎖化可能部分のうち、Ａｓｎ−
１３５とＡｓｎ−２２２アミノ酸に対するＮ−糖鎖化が分析されたが、Ａｓｎ−
２２２部分に実際Ｎ−糖鎖化が起っていることが明らかになった。しかし、ヒト
ＩＬ−１２ｐ４０小単位体の残部、ヒトＩＬ−１２ｐ３５小単位体、及びマウス
ＩＬ−１２の両小単位体に対するＮ−糖鎖化有無は未だ明らかになっておらず、
且つ糖鎖化部分及び糖鎖化可能部分がＩＬ−１２の合成、分泌、生物学的活性な
どに及ぼす効果は未だ糾明されていない。

【０００９】 一方、多数のウィルス性またはバクテリア性疾病の予防及び治療、癌生成抑制
には体液性免疫反応(humoral immune response)よりは細胞性免疫反応の増加が
要求されるため、ＩＬ−１２遺伝子を利用しようとする研究が活発に行われてい
る。Ｃ型肝炎はウィルスが媒介する代表的な疾病であって、ＨＣＶの感染時に５
０％以上が慢性疾患に進み、究極的に肝硬変または肝癌などの疾病を起こす主要
原因になっている(Alter H. J. et al., N. Engl. J. Med., 321:1494-1500, 19
89)。現在、α−インターフェロンがこれらに対する唯一の治療方法として一般
化されているが、治療効果は僅か１０〜３０％程度に過ぎない(Weiland E. et a
l., J. Virol., 66:3677-3682, 1992)。従って、ＨＣＶに対する効果的なワクチ
ンまたは治療剤の開発が至急要求される実状である。チンパンジーとヒトに対す
る臨床実験報告によれば、ＨＣＶは特異的な体液性免疫反応と細胞性免疫反応の
両方とも起る可能性があり(Prince A. M. et al., J. Infect. Dis., 165:438-4
43, 1992) 、ＨＣＶの構造蛋白質であるＥ１とＥ２が保護免疫(protective immu
nity)の誘発に最も重要な抗原であると窮められた(Choo Q. L. et al., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA, 91:1294-1298, 1994)。また、最近は、前記ウィルスの除
去のためには体液性免疫反応よりはＣＴＬを含んだ細胞媒介性免疫反応が必須的
なものであると報告されたことがある(Cooper S. et al., Immunity, 10:439-44
9, 1999; Rinaldo C. et al., J. Virol., 69:5838-5842, 1995)。

【００１０】 このような細胞性免疫反応を誘導する方法として最近台頭している方法がＤＮ
Ａ免疫方法である。ＤＮＡ免疫方法は、病原体の特定の成分をコーディングする
ＤＮＡを直接人体に注入して免疫化を達成するという点において、弱毒化された
か或いは死なされた病原体または病原体の一部成分を利用する従来の免疫方法と
は区分されるし、免疫化蛋白質の実際的な生産がＤＮＡの注入された宿主内で行
われるため、生菌または死菌を利用する場合に発生する虞のある感染の危険を除
去することができるという長所がある。このようなＤＮＡ免疫方法によってイン
フルエンザウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、ヒト免疫不全ウィルスなどの様々な種
類の伝染性ウィルスに対して強力な免疫性を誘導することができるものと報告さ
れている(Ulmer J. B. et al., Science, 259:1745-1749, 1993; Michel M. L.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:5307-5311, 1995; Irwin M. J. et a
l., J. Virol., 68:5306-5044, 1994)。また、ＨＣＶのカプシド蛋白質(core)と
Ｅ２蛋白質などにもこのようなＤＮＡ免疫方法を適用した結果、これらに対する
特異的な免疫性を誘導したという報告があった(Major M. F. et al., J. Virol.
, 69:5798-5805, 1995; Tedeschi V. et al., Hepatology, 25:459-462, 1997)
。

【００１１】 ところが、このようなＤＮＡ免疫方法は、免疫化蛋白質が生体内で発現される
頻度が低いため、免疫性の低い抗原に対しては強い免疫反応が起せない限界性を
有する。ＤＮＡ免疫方法の効果性を高めるために、幾つかのサイトカイン(cytok
ine)遺伝子または免疫細胞活性化に必要な補助刺激物質(costimulatory molecul
e)遺伝子のような補助因子(adjuvant)を使用し(Geissler M. et al., J. Immuno
l., 159:5107-5113, 1997; Iwasaki A. et al., J. Immunol., 158:4591-4601,
1997; Lee S. W. et al., J. Virol., 72:8430-8436, 1997)、或いはＨＣＶに対
する免疫反応を効率よく誘導するためにＩＬ−１２を使用した例(Lasartte J. J
. et al., J. Immunol., 162:270-5277, 1999)はあるが、ＩＬ−１２を用いて霊
長類及びヒトを対象としたＤＮＡ免疫化においては肯定的な結果が報告されてい
ない状況(Boyer J. et al., Keystone Symposium on DNA vaccines April, 12-1
7, 1998)である。

【００１２】 このような点に着目し、本発明者は、糖鎖化の調節によって活性型のＩＬ−１
２ｐ７０を発現し且つＩＬ−１２による免疫活性を低下させるＩＬ−１２ｐ４０
の分泌を最小化することが可能な遺伝子を製造するための研究を重ねた結果、ヒ
トＩＬ−１２ｐ４０小単位体の糖鎖化部分であるＡｓｎ−２２２アミノ酸とマウ
スＩＬ−１２ｐ４０小単位体の糖鎖化可能部分であるＡｓｎ−２２０アミノ酸の
突然変異化によって得た突然変異遺伝子が、活性型のＩＬ−１２ｐ７０の発現は
増加させるが、ＩＬ−１２ｐ４０の分泌は減少させるという事実を発見し、前記
突然変異遺伝子を小動物モデルのマウスにＨＣＶ Ｅ２遺伝子と共にＤＮＡ免疫
化した場合、最適の細胞媒介性免疫反応、特に長時間の経過後にもこのような免
疫反応が持続的に誘導されるという事実から、本発明の突然変異遺伝子がＤＮＡ
ワクチンの免疫増強剤として有用に使用できることを確認することにより、本発
明を完成した。

【００１３】 〔発明が解決しようとする課題〕 本発明の目的は、ＩＬ−１２ｐ７０の受容体に対する競争的な結合によってＩ
Ｌ−１２ｐ７０の活性を阻害するＩＬ−１２ｐ４０の分泌を減少させるために、
ヒトまたはマウスでＩＬ−１２ｐ４０の分泌に必須的な糖鎖化部分を突然変異化
させることにより、Ｔｈ１細胞による免疫反応の増加またはＣＴＬ細胞の活性化
のようなＩＬ−１２固有の役割を活性化させるＩＬ−１２ｐ４０突然変異遺伝子
を提供することにある。

【００１４】 本発明の他の目的は、前記ＩＬ−１２ｐ４０突然変異遺伝子を含んだ発現ベク
トルをＤＮＡワクチンとともにＤＮＡ免疫化することにより、抗原特異的な細胞
性免疫反応を増進及び維持させる免疫増強剤として使用する用途を提供すること
にある。

【００１５】 〔課題を解決するための手段〕 上記目的を達成するために、本発明は、ヒトまたはマウスＩＬ−１２ｐ４０を
暗号化する遺伝子において、その分泌に必須的な役割をするＡｓｎ−２２２（ヒ
ト）またはＡｓｎ−２２０（マウス）部分を他のアミノ酸に置換させたヒトまた
はマウスＩＬ−１２ｐ４０小単位体の突然変異遺伝子を提供する。

【００１６】 また、本発明は、前記ヒトまたはマウスＩＬ−１２ｐ４０小単位体の突然変異
遺伝子、小単位体の同時発現のためのＩＲＥＳ序列を含む遺伝子コンストラクト
及びこれを含む発現ベクトルを提供する。

【００１７】 また、本発明は、ＨＣＶの外被糖蛋白質２（Ｅ２）遺伝子を含み且つこれらを
発現させ得るＤＮＡワクチンベクトル、Ａｓｎ−２２２（ヒト）とＡｓｎ−２２
０（マウス）部分が突然変異化されたｐ４０小単位体遺伝子を含む遺伝子コンス
トラクト及びこれを含む発現ベクトルを提供する。

【００１８】 また、本発明は、前記遺伝子コンストラクトを免疫増強剤としてＤＮＡワクチ
ン免疫化または遺伝子治療に利用する用途を提供する。

【００１９】 〔発明の実施の形態〕 以下、本発明を詳細に説明する。

【００２０】 本発明は、序列番号１の塩基序列を有するヒトＩＬ−１２ｐ４０、または序列
番号２の塩基序列を有するマウスＩＬ−１２ｐ４０を暗号化する遺伝子において
、その分泌に必須的な役割をするＡｓｎ−２２２（ヒト）またはＡｓｎ−２２０
（マウス）部分を他のアミノ酸に置換したヒトまたはマウスＩＬ−１２ｐ４０小
単位体の突然変異遺伝子を提供する。

【００２１】 マウスとヒトＩＬ−１２ｐ４０に対するアミノ酸序列の相同性を比較すると、
ヒトＩＬ−１２ｐ４０のＡｓｎ−２２２に該当するマウスＩＬ−１２ｐ４０のＡ
ｓｎがアミノ酸序列２２０に位置しており、その周辺のアミノ酸序列が非常に類
似している（図１参照）。

【００２２】 具体的に、ヒトＩＬ−１２ｐ４０小単位体の２２２番目のＡｓｎ（Ａｓｎ−２
２２）を指定するコドンＡＡＣはＣＵＣ、ＣＡＧ、ＡＵＡなどに変異されること
ができる。この際、それぞれに該当するアミノ酸はＬｅＵ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅであ
る。特に、本発明の好適な実施例では、ｃＤＮＡ上でＡＡＣをＣＴＣまたはＣＡ
Ｇに変えることにより、ＡＡＣコドンがＣＵＣまたはＣＡＧコドンに置換され、
結局Ａｓｎ−２２２アミノ酸がＬｅｕ−２２２またはＧｌｎ−２２２アミノ酸に
置換され得る遺伝子（以下、「ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ」及び「ｈｐ４０−Ｎ２２
２Ｑ」と略称する）を提供する。

【００２３】 また、ヒトＩＬ−１２ｐ４０小単位体のＡｓｎ−２２２部位と相同性を有する
マウスＩＬ−１２ｐ４０小単位体においても、２２０番目のＡｓｎ（Ａｓｎ−２
２０）を指定するコドンＡＡＣはＣＵＣ、ＣＡＧ、ＡＵＡなどに変異できる。こ
の際、それぞれに該当するアミノ酸はＬｅＵ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅである。特に、本
発明の好適な実施例では、ｃＤＮＡ上でＡＡＣをＣＴＣに変えることにより、Ａ
ＡＣコドンがＣＵＣコドンに置換され、結局Ａｓｎ−２２０アミノ酸がＬｅｕ−
２２０アミノ酸に置換され得る遺伝子（以下、「ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ」と略称
する）を提供する。

【００２４】 本発明の突然変異遺伝子ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ、ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｑ及びｍ
ｐ４０−Ｎ２２０Ｌは序列番号３、序列番号４及び序列番号５と記載されるアミ
ノ酸序列をコーディングする。

【００２５】 また、本発明は、前記ヒトまたはマウスＩＬ−１２ｐ４０小単位体の突然変異
遺伝子、小単位体の同時発現のためのＩＲＥＳ序列を含む遺伝子コンストラクト
及びこれを含む発現ベクトルを提供する。

【００２６】 まず、本発明は前記遺伝子を含むｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５
、ｈｐ４０−ｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ及びｍｐ３５／ＩＲＥ
Ｓ／ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ遺伝子を提供する。ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ／ＩＲＥＳ
／ｈｐ３５遺伝子及びｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ遺伝子は、Ａ
ｓｎ−２２２がＬｅｕ−２２２に突然変異化されたヒトのｐ４０小単位体遺伝子
と共にｐ３５小単位体をコーディングする遺伝子を含み、ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／
ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ遺伝子はＡｓｎ−２２０部分がＬｅｕ−２２０に突然変異
化されたマウスのｐ４０小単位体遺伝子とともにｐ３５単位体をコーディングす
る遺伝子を含み、それぞれの遺伝子はいずれも小単位体の同時発現のためのＩＲ
ＥＳ序列を含む。ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５、ｈｐ３５／ＩＲ
ＥＳ／ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ及びｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ遺
伝子において、ＩＲＥＳはＥＭＣＶ(encephalomyocarditis)由来のものを使用す
ることが好ましいが、これに限定されるものではない。ＩＲＥＳ序列は前記２つ
の遺伝子の発現時にｐ４０小単位体とｐ３５小単位体をコーディングする遺伝子
の同時発現のために好ましい。

【００２７】 また、本発明は、前記で提供されたｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ／ＩＲＥＳ／ｈｐ３
５、ｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ及びｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ
４０−Ｎ２２０Ｌ遺伝子をそれぞれ含む発現ベクトルとしてのｐＧＸ０−ｈｐ４
０−Ｎ２２２Ｌ／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５、ｐＧＸ０−ｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４
０−Ｎ２２２Ｌ及びｐＴＶ２−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌを提
供する。

【００２８】 本発明では、好適な実施例の一つとしてｐＴＶ２ ＤＮＡワクチンベクトル(So
ng, M. K. et al., J. Virol., 74:2920-2925, 2000)のアンピシリン抵抗性遺伝
子(ampicillin resistant gene)の代りにカナマイシン抵抗性遺伝子(kanamycin
resistant gene)を挿入させることにより、臨床実験可能に考案されたＤＮＡワ
クチンベクトルであるｐＧＸ０プラスミドの外来遺伝子挿入部位にｈｐ４０−Ｎ
２２２Ｌ／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５及びｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ
遺伝子を挿入した。また、ｐＴＶ２ ＤＮＡワクチンベクトルの外来遺伝子挿入
部位にｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ遺伝子を挿入した。ところが
、前記発現ベクトルの製造に用いられたプラスミド以外にも様々な原核細胞用ま
たは真核細胞用ベクトルが知られているので、発現の目的に応じて前記プラスミ
ド以外に他の発現ベクトルを容易に利用することが可能なのは当業者には明らか
なことである。また、発現ベクトルの外来遺伝子挿入部位に挿入される遺伝子の
大きさや塩基序列なども公知の技術によって様々に変化させることができる。

【００２９】 前記発現ベクトルｐＧＸ０−ｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌとｐ
ＧＸ０−ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５は２００１年２月２６日付
で、ｐＴＶ２−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌは２０００年２月２
９日付で韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託された（受託番号：ＫＣＴＣ ０
９６９ＢＰ、ＫＣＴＣ ０９０７０ＢＰ及びＫＣＴＣ ０７４５ＢＰ）。

【００３０】 ｐ３５小単位体とｐ４０小単位体の同時発現は生物学的に活性を有するＩＬ−
１２ｐ７０を得るために必須的なので、本発明ではｈｐ３５及びｈｐ４０小単位
体をそれぞれ発現するようにするｐＣＩＮ−ｈｐ３５及びｐＣＩＮ−ｈｐ４０以
外にもＥＭＣＶのＩＲＥＳを用いたバイシストロニック発現ベクトル(Bicistron
ic Expression Vectors)のｐＧＸ０−ｈｐ４０／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５及びｐＧＸ
０−ｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０を製作した。ヒトＩＬ−１２の合成、分泌、
及び特異的活性にＮ−糖鎖化が及ぼす影響を理解するために、まずｐ３５小単位
体とｐ４０小単位体に存在する潜在的なＮ−糖鎖化部分のＡｓｎ残基を特定部位
の突然変異誘発(site-directed mutagenesis)によって他のアミノ酸残基に置換
し（図２参照）、突然変異蛋白質に対する野生型蛋白質の免疫ブロット結果（図
３ａ、図３ｂ及び図３ｃ参照）、ｈｐ３５小単位体のＡｓｎ−１２７、−１４１
、ｈｐ４０小単位体のＡｓｎ−２２２、−３０３の４つの部分が４−糖鎖化部分
として利用されていることを確認することができる。

【００３１】 また、本発明者は、ｈＩＬ−１２ｐ７０の合成、ヘテロ二量体化(heterodimer
ization)及び分泌に及ぼすｈｐ３５またはｈｐ４０のＮ−糖鎖化効果を調査する
ために、それぞれの野生型遺伝子またはそのＮ−糖鎖化突然変異遺伝子を含むｈ
ＩＬ−１２発現ベクトルで細胞を形質転換させた後、これから得た培養上澄液及
び細胞破砕物を用いてＥＬＩＳＡ分析を行った。

【００３２】 その結果、ｈｐ３５のＡｓｎ−１２７はＩＬ−１２ｐ７０の細胞内ヘテロ二量
体化だけでなく、その分泌の減少にも影響を与えていることが分る。ところが、
ｈｐ３５のＡｓｎ−１４１は、野生型ｈｐ３５と比較したところ、ＩＬ−１２ｐ
４０及びＩＬ−１２ｐ７０のヘテロ二量体化と分泌に大きい影響を与えるとは思
われなかった（表１参照）。

【００３３】 ｈｐ４０のＡｓｎ−１３５とＡｓｎ−２２２の突然変異は、ＩＬ−１２ｐ７０
の分泌には影響を与えないが、ＩＬ−１２ｐ４０の分泌を著しく減少させること
が分った。特に、Ａｓｎ−２２２の場合、ｈｐ４０の分泌が野生型ｈｐ４０に比
べて約１２％程度まで減少したことが分った。ｈｐ４０のＡｓｎ−１３５は免疫
ブロット結果、Ｎ−糖鎖化が行われていない部分であるにもかかわらず、Ａｓｎ
−１３５のアミノ酸から前記効果が観察されたが、これはＡｓｎ−１３５のアス
パラギン（Ａｓｎ）がそれ自体でｈｐ４０の分泌に重要な部分になれることを意
味する。Ａｓｎ−２２２のアミノ酸がグルタミン（Ｇｌｎ）以外にＬｅｕに代替
された場合にも同一の分泌様相を示すことからみて、このような現像はＡｓｎ−
２２２のＮ−糖鎖化の消失によるものと思われる（表１参照）。従って、Ａｓｎ
−２２２におけるＮ−糖鎖化がヘテロ二量体ｈＩＬ−１２、ｈＩＬ−１２ｐ７０
ではなくｈＩＬ−１２ｐ４０の単独分泌に要求されることが分った。

【００３４】 前記結果より、本発明者は、Ａｓｎ−２２２におけるＮ−糖鎖化がｈＩＬ−１
２ｐ７０のヘテロ二量体化と分泌には要求されないが、ｈＩＬ−１２ｐ４０の分
泌には必須的な役割をする一方、Ａｓｎ−１２７におけるｈｐ３５ Ｎ−糖鎖化
がｈＩＬ−１２ｐ７０のヘテロ二量体と分泌に重要な役割をすることを確認した
。

【００３５】 本発明者は、ｈＩＬ−１２の糖鎖化が生物学的活性に及ぼす影響を調査するた
めに、野生型ｈＩＬ−１２と潜在的Ｎ−糖鎖化部位の突然変異を含むその誘導体
らのＩＦＮ−γ誘導能(induction ability)をＥＬＩＳＡで分析した。

【００３６】 その結果、ＩＦＮ−γ誘導能という面において野生型ｈｐ４０、またはＡｓｎ
−１３５及び／またはＡｓｎ−２２２で突然変異されたｈｐ４０誘導体の遺伝子
と野生型ｈｐ３５遺伝子を同時に形質転換させて得られた培養上澄液は、野生型
または他のｈｐ４０突然変異体に比べて増加したＩＦＮ−γ誘導能を示した（表
１参照）。また、前記２つの上澄液に野生型ｈｐ４０に比べて足りないｈｐ４０
の量を補充して同一の実験を行った場合、増加されたＩＦＮ−γ誘導能が野生型
とほぼ同一の水準に減少することを確認した（表１参照）。このような結果はｈ
ＩＬ−１２ｐ７０の拮抗物質(antagonists)として知られているｈＩＬ−１２ｐ
４０の水準がｈｐ４０−Ｎ１３５Ｑ及び／またはｈｐ４０−Ｎ２２２Ｑを含む突
然変異体の培養上澄内の他の突然変異体に比べて相対的に非常に低いためである
ことを提示し、Ａｓｎ−１３５及び／またはＡｓｎ−２２２の突然変異によって
生成されたｈｐ７０が突然変異によってその活性が増加したのではないことを示
している。

【００３７】 また、本発明者は、ｈｐ４０のＡｓｎ−２２２における糖鎖化がどのようにｈ
ＩＬ−１２ｐ４０の分泌を減少させるかを調査するために、一定量の突然変異遺
伝子を含む発現ベクトルを様々な量の野生型ｈｐ３５ ＤＮＡと共に細胞に同時
形質感染させて培養した後、増幅したヒトＩＦＮ−γの量をＥＬＩＳＡで測定し
た。

【００３８】 一般に、ｐ３５小単位体は単独で分泌されず、ｐ４０と結合してＩＬ−１２ｐ
７０の形で分泌される一方、ｐ４０単位体は単量体(monomer)またはホモ二量体(
homodimer)の形で分泌されるが、これはｐ３５小単位体ではなく、ｐ４０小単位
体がＩＬ−１２ｐ７０の分泌において主要要素として作用することを暗示するも
のである。このような事実と一致するように、前記実験結果、ｈＩＬ−１２ｐ７
０の分泌量は野生型ｈｐ４０とｈｐ４０−Ｎ２２２Ｑ突然変異の全てで形質感染
されたｈｐ３５ ＤＮＡの量に比例して増加した（表１参照）。このような結果
は分泌欠陥(secretion defect)を有するｈｐ４０小単位体がｈｐ５小単位体と結
合すると、ＩＬ−１２ｐ７０の形で分泌されることを示すもので、ｈｐ３５小単
位体がｈＩＬ−１２ｐ７０の分泌において別の作用をすることを暗示するもので
ある。最近、ｈｐ４０内の形態的な変化(conformational change)がｈｐ３５と
の結合によるものであることを示す研究が報告され、ＩＬ−１２ｐ７０分泌にお
けるｈｐ３５小単位体の寄与可能性を提示したことがある(Yoon, C et al., EMB
O J., 19:3530-3534, 2000)。前記研究と本発明の結果をまとめると、Ａｓｎ−
２２２における糖鎖化を含むｈｐ４０がそれ自体では分泌に欠陥を有するが、ｈ
ｐ３５との結合によるｈｐ４０部位の形態的な変化に起因してｈｐ７０の形で分
泌できることが分る。

【００３９】 また、本発明者は、ｐ３５小単位体とｐ４０小単位体の一つの細胞内における
同時発現を誘導することにより、ｐ４０の分泌をさらに減少させようとする目的
と、使用されたベクトル内のサイトメガロウィルスプロモータ(cytomegalovirus
promoter、ＣＭＶ)よりＩＲＥＳを用いた遺伝子の発現水準が低いという事実に
よってｐ４０遺伝子をＩＲＥＳの後ろに位置させることがより低いｐ４０の生成
を誘導することによりその分泌量も低めようとする目的で、ｈｐ４０／ＩＲＥＳ
／ｈｐ３５とｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０コンストラクトを製造した。また、
それぞれのプラスミドにおいてｈｐ４０遺伝子の代りにｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ遺
伝子が置換されているｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５とｈｐ３５／
ＩＲＥＳ／ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌコンストラクトを製造した（表１参照）。ｈｐ
４０／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５とｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５コンス
トラクトを比較してみると、後者においてｈｐ４０の分泌が約７％程度減少する
ことが分かる。これはｈｐ３５コンストラクトとｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌコンスト
ラクトをそれぞれ電気穿孔した時にｈｐ４０の分泌が１２％程度であることを勘
案すると、よりその分泌が減少したことを示す。即ち、ｈｐ３５コンストラクト
とｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌコンストラクトを電気穿孔した時には、２つのプラスミ
ドが全て一つの細胞に形質転換されない場合が発生する可能性がある。従って、
ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ遺伝子単独で細胞に発現すると、ｈｐ７０分泌なしでｈｐ
４０が少量分泌されるので、ｈｐ３５とｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ遺伝子が同時に発
現するｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５遺伝子よりｈｐ４０の分泌が
多少高いものと推測することができる。また、ｈｐ４０／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５コ
ンストラクトとｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０コンストラクトを比較すると、Ｉ
ＲＥＳの後ろにｈｐ４０遺伝子を配列させることによりその発現を低めた場合、
ｈｐ７０の発現及び分泌はその差異が大きくないが、これに対し、ｈｐ４０の発
現及び分泌は非常に減少したことを観察することができる。また、ｈｐ４０遺伝
子の代りにｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ遺伝子をｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０コンス
トラクトに導入してｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌコンストラクト
を製作した場合にはｈｐ４０の分泌水準が０.３程度にさらに減少することが分
かる。本実験では結果的にｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌコンスト
ラクトがｈｐ７０の分泌水準を維持しながらｈｐ４０の分泌を最小化することが
可能なコンストラクトであることを確認することができた。

【００４０】 しかも、本発明は、ＨＣＶ−１ｂのＥ２遺伝子を含み且つこれらを発現させる
ことが可能なＤＮＡワクチンベクトル、及びＡｓｎ−２２２（ヒト）とＡｓｎ−
２２０（マウス）部分が突然変異化されたｐ４０小単位体遺伝子を含む遺伝子コ
ンストラクトを提供する。

【００４１】 まず、本発明者は、本発明のｈＩＬ−１２突然変異遺伝子をＤＮＡワクチンの
ような遺伝子療法(gene therapy)に使用することができるかその可能性を調査す
るために、ｈｐ４０遺伝子のＡｓｎ−２２２に類似したマウスＩＬ−１２ｐ４０
（ｍｐ４０）遺伝子の塩基序列を調査した。その結果、本発明者は、マウスｐ４
０のＡｓｎ−２２０アミノ酸がヒトｐ４０のＡｓｎ−２２２と非常に類似の部分
に存在し、現在までそのアミノ酸序列がＮ−糖鎖化されていると知られていない
ことを確認した（図１参照）。これにより、本発明者は、ｍｐ４０遺伝子の突然
変異、即ちアミノ酸序列の２２０番目のＡｓｎを特定部位の突然変異誘発(site-
directed mutagenesis)によってＬｅｕコドンに置換して、動物細胞に発現可能
なマウスＩＬ−１２ｐ４０突然変異遺伝子の含まれたｐＣＩＮ−ｍｐ４０−Ｎ２
２０Ｌベクトルを完成した。

【００４２】 また、本発明者は、ｐ４０とｐ３５小単位体をコーディングすると同時に、発
現しながらＤＮＡ免疫化に使用することが可能なベクトルを製作するために、既
に小動物でＤＮＡワクチンベクトルとして使用されたことのある真核細胞発現ベ
クトルのｐＴＶ２ベクトル(Lee et al., J. Virol., 72:8430-8436, 1998; Cho
et al., Vaccine, 17:1136-1144, 1999)にｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０断片を
挿入することにより、ｐＴＶ２−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０ベクトルを完成
した。さらに、本発明者は、前記実験より、ｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０−Ｎ
２２２Ｌ遺伝子がｈｐ７０の分泌を維持しながらｈｐ４０の分泌を最小化するこ
とが可能であるという事実を観察したため、これに基づいて、本発明のマウスＩ
Ｌ−１２ｐ４０のＡｓｎ−２２０突然変異遺伝子を含みながらｐ３５を同時に発
現させるベクトルとしてｐＴＶ２−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ
ベクトルを完成した。

【００４３】 前記ｐＴＶ２−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌベクトルは韓国生
命工学研究院遺伝子銀行に２０００年２月２９日付で寄託した（受託番号：ＫＣ
ＴＣ ０７４５ＢＰ）。

【００４４】 最後に、本発明者は、真核細胞にＨＣＶ−Ｅ２が発現しうるように、シミアン
ウィルス４０の複製開始点(simian virus 40 replication origin, SV40 ori)、
サイトメガロウィルスプロモータ(cytomegalovirus promoter,ＣＭＶ)、アデノ
ウィルス(adenovirus)の三重先導序列(tripartite leader sequence,ＴＰＬ)、
多重クローニング序列(multiple cloning sequence,ＭＣＳ)、ＳＶ４０ポリアデ
ニル化序列(polyadenylation sequence, polyＡ)及びアンピシリン抵抗性遺伝子
(ampicilin resistance gene：ＡｍｐＲ)などから構成され、ＨＣＶ−Ｅ２遺伝
子が多重クローニング序列内にクローニングされているｐＴＶ−２−ＨＣＶ−Ｅ
２ ＤＮＡワクチンベクトルを製造した(Song M. K. et al., J. Virol., 74:292
0-2925, 2000)（図４参照）。ここに使用されたＥ２遺伝子は疎水性アミノ残基(
hydrophobic amino acid residue)を含むカルボキシル末端(carboxyl-terminal:
Ｃ-terminal)部位を除去して蛋白質の分泌を容易にし、アミノシル末端(aminocy
l-terminal:Ｎ-terminal)部位にヘルペスウィルス(Herpesvirus:ＨＳＶ)の外被
糖蛋白質Ｄ（glycoprotein D:ｇＤ）の信号序列(signal sequence:ｓ)を連結さ
せて蛋白質の発現及び細胞の分泌を効率化しようとした。

【００４５】 このように製作された発現ベクトルを用いてマウスＩＬ−１２ｐ４０のＡｓｎ
−２２０突然変異化によるＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１２ｐ７０の分泌様相を
確認するために、前記ベクトルを細胞に形質転換させた後、細胞破砕物と細胞倍
溶液を得てマウスＩＬ−１２の分泌量をＥＬＩＳＡ（Pharmigen社）で測定した
。その結果、本発明のｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ突然変異体はＩＬ−１２ｐ４０及び
ＩＬ−１２ｐ７０の分泌及びその生物学的活性という側面からみて、ｈｐ４０の
Ａｓｎ−２２２突然変異体とほぼ類似の特性を示した（表１参照）。

【００４６】 最後に、本発明は、Ａｓｎ−２２２（ヒト）とＡｓｎ−２２０（マウス）部分
が突然変異化されたｐ４０小単位体遺伝子を含む遺伝子コンストラクトを免疫増
強剤としてＤＮＡワクチン免疫化または遺伝子治療に利用する用度を提供する。

【００４７】 前記方法はＡＩＤＳ、Ｃ型及びＢ型肝炎、癌、インフルエンザ、結核、マラリ
アなど人体内の免疫力増加によって治癒できる疾病の予防及び治療に有用に使用
することが可能である。

【００４８】 以前の報告によれば、ＨＣＶ−Ｅ２抗原（ｐＴＶ２−ｇＤｓＥ２ｔ）を暗号化
するプラスミドのＤＮＡ予防接種が接種してから３週後に抗原−特異的な体液性
(antigen-specific humoral)及び細胞−媒介性免疫反応(cell-mediated immune
response)を誘導するのに十分であることが確認された。このため、本発明者は
、本発明の突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子が野生型ｍＩＬ−１２遺伝子と比較して
生体内抗原−特異的な免疫反応に効果的に影響を及ぼすことができるか、そして
そのような効果が何時まで持続的に維持できるかを調査するために、前記で製造
された本発明のＤＮＡワクチンベクトルをマウスに追加接種した後、ＨＣＶ−Ｅ
２特異的な抗体生成有無を精製されたｈＧＨ−Ｅ２蛋白質を用いてＥＬＩＳＡ法
によって調査した。

【００４９】 その結果、ＨＣＶ Ｅ２ ＤＮＡワクチンは陰性対照群の水準より相当高い全身
性(systemic)ＨＣＶ Ｅ２−特異的な全体ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ水準
を誘導した。さらに、突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子または野生型ｍＩＬ−１２遺
伝子との同時注入はＨＣＶ Ｅ２ ＤＮＡワクチンが単独で投与された場合と比較
して多少高い水準の全体ＩｇＧ水準を示した。ＩｇＧ１の水準もＨＣＶ Ｅ２ Ｄ
ＮＡの投与された群に比べて多少高い水準を示した。逆に、ＨＣＶ Ｅ２に対す
るＩｇＧ２ａの水準は野生型ｍＩＬ−１２投与群でやや増加し、ＨＣＶ Ｅ２ Ｄ
ＮＡ単独投与群と比較しては突然変異ｍＩＬ−１２投与群で相当増加した。しか
も、Ｔｈ１免疫反応の間接的なインジケータ(Indicator)として一般に受け入れ
られているＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１の比は、ＩｇＧ２水準の様相が類似した突然変
異ｍＩＬ−１２投与群で最も高かった（図５ａ、図５ｂ、図５ｃ及び図５ｄ参照
）。このような結果は突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子が野生型ｍＩＬ−１２投与群
またはＨＣＶ Ｅ２単独投与群に比べて体液性免疫反応においてＩｇＧ１からＩ
ｇＧ２ａへのＩｇＧ小グループの転移に相当な影響を及ぼすことを示し、突然変
異ＩＬ−１２遺伝子がＴｈ１形態の免疫反応を誘導することを暗示する。また、
このような効果はＤＮＡ追加接種後０、３、６、１０週にもそのまま維持される
様相を示した。

【００５０】 また、本発明者は、細胞−媒介性免疫反応の力価を評価するのに使用されてき
たパラメータの一つであるＴｈ１免疫反応において本発明の突然変異ｍＩＬ−１
２遺伝子の効果を調査するために脾臓細胞からＩＦＮ−γ発現を測定した。

【００５１】 その結果、サイトカイン遺伝子なしでＨＣＶ Ｅ２ ＤＮＡのみ投与された群は
ｈｇｈＥ２ｔ蛋白質の濃度に比例してＩＦＮ−γの水準が増加した反面、模造プ
ラスミド(mock plasmid)接種群は増加しなかった。予想通り、野生型ｍＩＬ−１
２投与群はＩＦＮ−γ誘導水準がＨＣＶ Ｅ２単独投与群に比べてより増強され
たが、突然変異ｍＩＬ−１２投与群は野生型ｍＩＬ−１２投与群に比べて２〜３
倍高いＩＦＮ−γ生産水準を示した（図６ａ、図６ｂ及び図６ｃ参照）。このよ
うな結果はｍＩＬ−１２ｐ７０が抗原−特異的なＴｈ１免疫反応を増加させる役
割をし、ｍＩＬ−１２ｐ４０は生体内ＩＬ−１２Ｐ７０によるＴｈ１免疫反応の
誘導を抑制する役割を果たすことを暗示するものである。このような効果はＤＮ
Ａの追加接種後３週から現れ始め、１０週になっても同様の様相を示すが、これ
はｍＩＬ−１２ｐ７０がＴｈ１免疫反応を初期に誘導するだけでなく、このよう
な免疫反応の持続にも関与することを暗示するものである。

【００５２】 上述したように、本発明の突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子がＨＣＶ Ｅ２ ＤＮＡ
免疫化において長期間Ｔｈ１免疫反応に寄与することを確認した本発明者は、突
然変異ｍＩＬ−１２遺伝子の発現によって誘導されたＴｈ１免疫反応がＣＴＬ免
疫反応及び主要細胞−媒介性免疫反応と連係されており、突然変異ｍＩＬ−１２
遺伝子がＤＮＡ免疫化モデルでＣＴＬ活性の維持に関与するかを調査するために
、追加接種後、多様な週齢でＤＮＡ免疫化マウスから得た脾臓細胞を用いてＣＴ
Ｌ分析を行った。

【００５３】 その結果、追加接種２週後、模造プラスミド投与群を除いた全てのグループで
非常に強い抗原−特異的なＣＴＬ活性を示したが、ＨＣＶ Ｅ２単独投与群、野
生型ｍＩＬ−１２投与群及び突然変異ｍＩＬ−１２投与群の間には殆ど差異をな
かった。野生型ｍＩＬ−１２投与群はＣＴＬ反応が実験期間全体に亘ってＨＣＶ Ｅ２単独投与群に比べて高かったが、これは増加したＣＴＬ形成にｍＩＬ−１
２遺伝子が重要な役割を行うことを示す。興味深く、突然変異ｍＩＬ−１２投与
群と他の２つの群（ＨＣＶ Ｅ２投与群及び野生型ｍＩＬ−１２投与群）間のＣ
ＴＬ活性における差異は追加接種期間が長くなるほど時間経過に伴って段々著し
くなった。特に、１０週後のＣＴＬ反応はＨＣＶ Ｅ２投与群及び野生型ｍＩＬ
−１２投与群で非常に低かったが、これは抗原−特異的なＣＴＬの分泌量(frequ
ency)が長期間後には相当減少するからである。一方、突然変異ｍＩＬ−１２投
与群は抗原−特異的なＣＴＬ反応を維持しながら他の２つのグループより５〜１
０倍高いＣＴＬ活性を示した（図７参照）。対照群として、ＣＴ２６−ｎｅｏ細
胞をターゲット細胞として使用した場合には、すべてのグループでいずれの溶血
現象(cell lysis)も観察されなかったが、これは前記で観察されたＣＴＬ活性が
ＨＣＶ Ｅ２−特異的であることを暗示するものである。

【００５４】 また、本発明者は、ＨＣＶ Ｅ２に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の生体内頻度を測
定することにより、より正確にｍＩＬ−１２投与による抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ
細胞の増殖及び維持の効果を調査しようとした。このため、２つの免疫学的分析
方法が使用されたが、その一つはＣＤ８＋Ｔ細胞内抗原特異的に反応してＩＦＮ
−γを分泌する細胞の個数を測定する方法である。ＣＴＬ活性の増強が特定の抗
原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の分泌によって特異的に現れるかを調査するために、
ＣＤ＋８Ｔ細胞を分離した後、ＰＥ(R-phycoerythrin)接合された抗−マウスＩ
ＦＮ−γ抗体または対照群ＰＥ−接合されたイソタイプ−マッチド(isotype-mat
ched)抗体を添加して細胞を二重染色し、染色された細胞をフローサイトメトリ
ー装置(FACSCalibur flow cytometry)で分析してＩＦＮ−γの増加様相を観察し
た。

【００５５】 その結果、突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子で同時免疫化されたマウスは、追加接
種してから０、３、６、１０、１４週経過後にＨＣＶ Ｅ２単独及び野生型ｍＩ
Ｌ−１２投与群に比べてＣＤ８＋ＩＦＮ−γ生産細胞の分泌量が段々増加するこ
とが見られるが、これはＣＴＬ反応結果と同様の様相を示す。しかし、ＣＴＬ反
応結果に比べて初期にもＨＣＶ Ｅ２単独群より野生型ｍＩＬ−１２投与群で高
いＣＤ８＋Ｔ細胞頻度が高く、突然変異ｍＩＬ−１２群の抗原特異的なＣＤ８＋
Ｔ細胞の頻度が最も高かった。このような頻度の差異は追加接種後１４週目には
著しくなり、ＨＶＤ Ｅ２単独及び野生型ｍＩＬ−１２投与群では抗原特異的な
ＣＤ８＋Ｔ細胞が殆ど観察されないが、これに対し、突然変異ｍＩＬ−１２投与
群ではこのような細胞の頻度数が多少減少するけれども維持されることを観察す
ることができた（表２参照）。このような結果は突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子の
発現が長期間ＤＮＡ免疫化後ＣＤ８＋ＩＦＮ−γ生産Ｔ細胞の分泌量を維持する
ことを立証するものである。

【００５６】 抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞頻度を調査するための別の分析方法である限界希
釈法(limiting dilution assay：ＬＤＡ)によってＨＣＶ Ｅ２特異的なＣＤ８＋
Ｔ細胞の頻度を測定した。即ち、限界希釈法はＤＮＡの追加接種が行われたマウ
スの脾臓細胞を多様な濃度に限界希釈した後、ＣＴＬ免疫反応観察での如く、Ｅ
２を発現するＣＴ２６細胞を用いて前記のように希釈された脾臓細胞と共に培養
した後、抗原特異的に刺激を受けたＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＴＬ活性を測定する方法
である。その結果、限界希釈法によっても、細胞内ＩＦＮ−γ染色法から得られ
た結果と類似の結果が得られた。即ち、免疫化の初期に突然変異ｍＩＬ−１２投
与群から最も高い抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞頻度が観察された。また、追加接種
１４週後にも、ＨＣＶ Ｅ２単独及び野生型ｍＩＬ−１２投与群では、その頻度
が非常に低くなるのに比べ、突然変異ｍＩＬ−１２投与群ではその頻度が持続的
に維持されることが分かった（表２参照）。

【００５７】 また、本発明者はＤＮＡを追加接種せず１回接種した後、時期別にＨＣＶ Ｅ
２特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度変化も観察した。その結果、追加接種時より全
般的に抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は多少減少したが、１回接種時にも突然
変異ｍＩＬ−１２投与群から最も高いＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度が観察された（表２
参照）。

【００５８】 これより、本発明者は、細胞−媒介性免疫反応において、ＩＬ−１２ｐ７０自
体の生体内役割はＴｈ１及びＣＴＬの活性を初期から誘導するだけでなく、長期
間維持することである一方、ＩＬ−１２ｐ４０の役割は生体内拮抗物質としてＩ
Ｌ−１２ｐ７０を抑制することであることを確認した。

【００５９】 本発明の突然変異ＩＬ−１２遺伝子によって生体内で誘導されたＴｈ１及びＣ
ＴＬ免疫反応を確認し、Ｔｈ１及びＣＴＬ免疫反応と防御的免疫反応の相関関係
を調査するために、ＤＮＡ追加接種後１２週目にｈｇｈＥ２ｔを発現する腫瘍細
胞のＣＴ２６−ｈｇｈＥ２５をマウスに投与した。そして、腫瘍注入２週後にマ
ウスの血清からＨＣＶ Ｅ２特異的な全体ＩｇＧ及びその亜系列ＩｇＧ１、Ｉｇ
Ｇ２ａ抗原の水準及びＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１の比率を調査した（図８ａ及び図８
ｂ参照）。その結果、腫瘍注入前と同様に突然変異ｍＩＬ−１２投与群から最も
高いＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比率が観察されたが、これは腫瘍注入時にも突然変異
ｍＩＬ−１２投与群でＴｈ１免疫反応が発生していることを意味する。

【００６０】 また、腫瘍注入後約３０日間腫瘍の大きさを測定した結果、野生型ｍＩＬ−１
２で免疫化されたマウスのグループはｐＴＶ２−ｇＤｓＥ２ｔ単独で免疫化され
たグループに比べて、遅延した腫瘍成長を示した（図８ｃ参照 ）。また、この
ように腫瘍が注入されたマウスの生存率をグループ間に比較した場合にも、突然
変異ｍＩＬ−１２で免疫化されたグループは約７０日間約９０％のマウスが生存
していることを観察した。これに対し、Ｅ２単独で注入されたグループ、或いは
野生型ｍＩＬ−１２が同時注入されたグループでは、生存率が２０〜３０％に止
まった（図８ｄ参照）。従って、このような結果は本発明の突然変異ｍＩＬ−１
２遺伝子によって誘導されたＨＣＶ Ｅ２−特異的なＴｈ１及びＣＴＬ反応が変
形された腫瘍細胞の発現に特異的な抗原のチャレンジに対する生体内防御を与え
ることを暗示する。

【００６１】 前記実験より、本発明者は本発明のＩＬ−１２ｐ４０の分泌に必須的なＡｓｎ
−２２２（ヒト）またはＡｓｎ−２２０（マウス）を暗号化するコドンが突然変
異化されたヒトまたはマウスのＩＬ−１２のｐ４０小単位体遺伝子が免疫増強剤
としてＤＮＡワクチン免疫化または遺伝子治療に有用に使用できることを確認し
た。これにより、本発明は前記ヒトまたはマウスのＩＬ−１２のｐ４０小単位体
突然変異遺伝子を有効成分とする、抗原−特異的な細胞性免疫反応を増進させて
疾病を予防及び治療するためのＤＮＡ免疫化及び遺伝子治療用免疫増強剤を提供
する。

【００６２】 前記免疫増強剤は、ＩＬ−１２のｐ４０小単位体遺伝子をＤＮＡワクチンと共
に投与する場合、ＣＴＬ(cytotoxic T lymphocytes)細胞の加水分解能力を向上
させ、Ｔヘルパー細胞のＩＦＮ−γの分泌を増加させ、ＣＤ８＋細胞のＩＦＮ−
γの分泌を増加させることにより、免疫反応を増進させることができるという特
徴を有する。

【００６３】 〔実施例〕 以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。但し、下記実施例は本発明を
例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。

【００６４】 ＜実施例１＞ヒトＩＬ−１２発現ベクトルの製作 ＜１−１＞ヒトＩＬ−１２発現ベクトルの製作 ＰＭＡによって活性化されたヒトＢ細胞としてのＮＣ３７細胞から相補的プラ
イマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ(Reverse transcriptase-polymerase chain reacti
on)(PCR System 2400, Perkin Elmer社)方法を用いて８２０ｂｐのヒトｐ３５小
単位体と１０５０ｂｐのｐ４０小単位体のｃＤＮＡをクローニングし、ＰＣＲで
増幅した。増幅されたｃＤＮＡはそれぞれ出発ベクトルのｐＳＫプラスミド(Str
atagene社)に挿入(subcloning)したが、ｐ３５及びｐ４０小単位体遺伝子の両方
ともｐＳＫのＳｍａI部分にそれぞれ挿入することにより、ｐＳＫ−ｈｐ３５と
ｐＳＫ−ｈｐ４０を製造した。

【００６５】 ｐ４０とｐ３５小単位体をコーディングする遺伝子を共に発現するベクトル(b
icistronic vector)を製作するために、まずＥＭＣＶのＩＲＥＳ遺伝子をＲＴ−
ＰＣＲによって得た後、これをｐＳＫプラスミドのＳｍａIとＰｓｔI制限酵素部
位に挿入してｐＳＫ−ＩＲＥＳベクトルを製造した。このベクトルをＥｃｏＲＶ
で切断し、ここにｐＳＫ−ｈｐ４０をＸｂａIとＢａｍＨIで処理して得たｐ４０
ＤＮＡ断片の末端をＴ４ ＤＮＡ重合酵素で満たしてｐＳＫ−ｈｐ４０／ＩＲＥ
Ｓを製作した。最後に、ｐＳＫ−ｈｐ３５に制限酵素ＮｃｏI、ＳａｃIを処理し
て得たｐ３５遺伝子ＤＮＡ断片をＮｃｏI、ＳａｃI処理されたｐＳＫ−ｈｐ４０
／ＩＲＥＳに挿入することにより、結果としてｐ４０、ＩＲＥＳ、ｐ３５遺伝子
が順序通りに配列されたｐＳＫ−ｈｐ４０／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５プラスミドを製
作した。

【００６６】 また、ｐＳＫ−ＩＲＥＳベクトルをＥｃｏＲＶで切断し、ここにｐＳＫ−ｈｐ
４０／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５プラスミドをＮｃｏIとＮｏｔIで切断して得たｈｐ３
５ ＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡ重合酵素で満たして挿入することにより、ｐＳＫ−
ｈｐ３５／ＩＲＥＳプラスミドを製作した。これをさらにＢａｍＨIとＮｃｏIで
切断した部位に、ｐＳＫ−ｈｐ４０をＮｃｏIとＢａｍＨIで切断して得られるｈ
ｐ４０断片を挿入することにより、ｐＳＫ−ｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０プラ
スミドを完成した。前記方法で製造したｈｐ４０／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５遺伝子と
ｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０遺伝子をそれぞれｐＧＸ０ベクトルの制限酵素Ｓ
ｐｅI／ＮｏｔIとＸｈｏI／ＮｏｔI部分に挿入することにより、哺乳動物細胞に
活性型のＩＬ−１２ｐ７０を発現することが可能なｐＧＸ０−ｈｐ４０／ＩＲＥ
Ｓ／ｈｐ３５及びｐＧＸ０−ｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０発現ベクトルを得た
。ｐＧＸ０ベクトルは既存のＤＮＡワクチンベクトルであるｐＴＶ２ベクトル(S
ong, M. K. et al., J. Virol., 74:2920-2925, 2000)のアンピシリン抵抗性遺
伝子内のＸｍｎI部位を切断して両側のブラント末端を作り、ここにＰＣＲによ
ってｐＺＥｒＯ−２ベクトル(Invitrogen社)内のカナマイシン抵抗性遺伝子を挿
入することにより完成した。

【００６７】 ＜１−２＞ｐ４０小単位体発現ベクトルの製作 ｐ４０小単位体を発現するプラスミドの製作のために、ｐＣＩＮ−ｈｐ４０／
ＩＲＥＳ／ｈｐ３５ベクトルを制限酵素ＳａｃIIとＮｏｔIで切断してｐ３５小
単位体をコーディングする遺伝子を除去した後、Ｔ４ ＤＮＡ重合酵素を用いて
末端部を満たすことにより自己結紮(self-ligation)し、これをｐＣＩＮ−ｈｐ
４０と命名した。

【００６８】 ＜１−３＞ｐ３５小単位体発現ベクトルの製作 ｐ３５小単位体を発現するプラスミドの製作のために、ｐＣＩＮ−ｈｐ４０／
ＩＲＥＳ／ｈｐ３５ベクトルをＮｃｏIで切断し、Ｔ４ ＤＮＡ重合酵素を満たし
た後、再び制限酵素ＮｏｔIで切断することによりｐ３５ ＤＮＡ断片を得てｐＣ
I−ｎｅｏベクトルのＸｈｏIとＮｏｔI制限酵素部分に挿入した。これをｐＣＩ
Ｎ−ｈｐ４０と命名した。

【００６９】 ＜実施例２＞マウスＩＬ−１２発現ベクトルの製作 ＜２−１＞マウスＩＬ−１２発現ベクトルの製作 ｐ４０小単位体とｐ３５小単位体をコーディングする遺伝子を共に発現するベ
クトルを製作するために、まずＥＭＣＶのＩＲＥＳが含まれているｐＳＫ−ＩＲ
ＥＳベクトルを制限酵素ＮｃｏIとＢａｍＨIで切断し、ここにマウスＩＬ−１２
ｐ４０ ＰＣＲ生成物(Schoenhaut D. S. et al., J. Immunol., 148:3433-3440,
1999)を同一の制限酵素で切断して得たｐ４０ ＤＮＡ断片を挿入することによ
り、ｐＳＫ−ＩＲＥＳ／ｍｐ４０を製作した。次に、マウスＩＬ−１２ｐ３５生
成物(Schoenhaut D. S. et al., J. Immunol., 148:3433-3440, 1992)をＢａｍ
ＨIで処理し、Ｔ４ ＤＮＡ重合酵素を用いて末端を満たした断片を、ＣｌａI及
びＴ４ ＤＮＡ重合酵素で処理されたｐＳＫ−ＩＲＥＳ／ｍｐ４０に挿入するこ
とにより、結果としてｐ３５、ＩＲＥＳ、ｐ４０遺伝子が順序通りに配列された
ｐＳＫ−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０プラスミドを製造した。前記の方法で製
造したｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０遺伝子をｐＣＩ−ｎｅｏベクトル(Promega
社)の制限酵素ＸｈｏIとＮｏｔI部分に挿入することにより、哺乳動物細胞に活
性型のＩＬ−１２ｐ７０を発現することが可能なｐＣＩＮ−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ
／ｈｐ４０発現ベクトルを得た。

【００７０】 ＜２−２＞ ｐ４０小単位体発現ベクトルの製作 野生型マウスｐ４０小単位体を発現するプラスミドの製作のために、ｐＳＫ−
ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０ベクトルを制限酵素ＮｃｏIとＳａｃIで切断して
生成されたｐ４０断片を、同一の制限酵素で処理されたｐＧＥＸ−ＫＧベクトル
（米国、Clontech社）に挿入した。このように生成されたｐＧＥＸ−ＫＧ−ｍｐ
４０をＥｃｏＲｌとＮｏｔIを処理してＰＣＩ−ｎｅｏベクトルのＥｃｏＲIとＮ
ｏｔI部分に挿入することにより、ｐＣＩＮ−ｍｐ４０発現ベクトルを得た。

【００７１】 ＜２−３＞ ｐ３５小単位体発現ベクトルの製作 野生型マウスｐ３５小単位体を発現するプラスミドの製作のために、ｐＳＫ−
ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０ベクトルを制限酵素ＸｈｏIとＥｃｏＲｌで切断
して生成されたｐ３５断片を、同一の制限酵素で処理されたｐＣＩ−ｎｅｏベク
トルのＸｈｏIとＥｃｏＲｌ制限酵素部分に挿入することにより、 ｐＣＩＮ−ｍ
ｐ３５発現ベクトルを得た。

【００７２】 ＜実施例３＞糖鎖化部分が突然変異されたＩＬ−１２ｐ４０とＩＬ−１２ｐ７
０の製造 ヒトｐ３５小単位体とｐ４０小単位体のＮ糖鎖化部分として利用されるものと
予想される７個のＡｓｎコドンは、特定部位の突然変異誘発(Site-directed mut
agenesis)によって相関性のないコドンに代替された。ｈｐ３５とｈｐ４０小単
位体のＮ−糖鎖化部分として予想される部位に対するグルタミン突然変異遺伝子
のコンストラクトを製造するために、ハラグチ等(Haraguchi, et al., J. Immun
ol., 163:2092-2098, 1999)によって記述された方法でＰＣＲを用いてアミノ酸
置換を行った。この際、突然変異化のための始発体としては、序列番号６と記載
されるＴ７、序列番号７と記載されるＴ３、序列番号８で記載されるｈｐ４０−
Ｎ１２５Ｑ（Ｓ）、序列番号９と記載されるｈｐ４０−Ｎ１２５Ｑ（ＡＳ）、序
列番号１０と記載されるｈｐ４０−Ｎ１３５Ｑ（Ｓ）、序列番号１１と記載され
るｈｐ４０−Ｎ１３５Ｑ（ＡＳ）、序列番号１２と記載されるｈｐ４０−Ｎ２２
２Ｑ（Ｓ）、序列番号１３と記載されるｈｐ４０−Ｎ２２２Ｑ（ＡＳ）、序列番
号１４と記載されるｈｐ４０−Ｎ３０３Ｑ（Ｓ）、序列番号１５と記載されるｈ
ｐ４０−Ｎ３０３Ｑ（ＡＳ）、序列番号１６と記載されるｈｐ４０−Ｎ１２７Ｑ
（Ｓ）、序列番号１７と記載されるｈｐ４０−Ｎ１２７Ｑ（ＡＳ）、序列番号１
８と記載されるｈｐ４０−Ｎ１４１Ｑ（Ｓ）、序列番号１９と記載されるｈｐ４
０−Ｎ１４１Ｑ（ＡＳ）、序列番号２０と記載されるｈｐ４０−Ｎ２５１Ｑ（Ｓ
）、序列番号２１と記載されるｈｐ４０−Ｎ２５１Ｑ（ＡＳ）のヌクレオチドを
合成して利用した（この際、ＳとＡＳはそれぞれセンス始発体とアンチセンス始
発体を意味する。） ｈｐ４０とｈｐ３５の単一グルタミン突然変異遺伝子コンストラクトを製造す
るために、前記実施例＜２−２＞ないし＜２−３＞で製造されたｐＣＩＮ−ｍｐ
４０またはｐＣＩＮ−ｍｐ３５を鋳型(template)とし、Ｔ７始発体とそれぞれの
センス始発体を用いてＰＣＲを行った。これと同様に、Ｔ３始発体とそれぞれの
アンチセンス始発体を用いてＰＣＲを行った。その結果、突然変異地点(mutatio
nal point)を含む共通部位(common site)を共有する２つのＰＣＲ断片が形成さ
れた。２ｎｄ ＰＣＲは前記断片の混合物を鋳型とし、フランキング始発体(flan
king primer)を用いて行った。その結果として、これらの融合断片(fusion prod
uct)が形成された。前記断片をｐＣＩ−ｎｅｏベクトルに挿入した。これと同様
に、二重及び三重突然変異遺伝子は単一または二重突然変異遺伝子をＰＣＲ鋳型
として用いて製作された。突然変異遺伝子はＤＮＡ塩基序列分析によって確認し
た。

【００７３】 ｍｐ４０のＡｓｎ−２２０でＮ−糖鎖化欠陥(N-glycosylation defect)を含む
マウスＩＬ−１２ｐ７０遺伝子コンストラクトを製造するために、前記実施例＜
２−１＞で製造されたｐＣＩＮ−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０内のｍｐ４０遺
伝子部位をｍｐ４０−Ｎ２２２Ｌに置換した。ｐＣＩＮ−ｍｐ４０−Ｎ２２２Ｌ
を製造するためのｍｐ４０の突然変異化ではＳａｃI制限酵素部位を含む序列番
号２２と記載されるｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ（Ｓ）及び序列番号２３と記載される
ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ（ＡＳ）のヌクレオチドを始発体として用いて前記の如く
ＰＣＲを行った。これより得られる、増幅された突然変異遺伝子は突然変異化後
に生成される特定の制限酵素認識部位に対する制限酵素処理及びＤＮＡ塩基序列
分析によって確認した。

【００７４】 図２は本発明に用いられたヒトＩＬ−１２ｐ４０とＩＬ−１２ｐ３５小単位体
の正常遺伝子と変異遺伝子のアミノ酸構成を概略的に示す。Ｎ−糖鎖化可能部分
はその位置のアスパラギン（Ａｓｎ）アミノ酸番号と共にＹ形態で表示し、各変
異遺伝子において置換されたアミノ酸は四角形内に表示した。

【００７５】 ＜実施例４＞ＩＬ−１２ｐ４０の単独分泌に対するヒトＩＬ−１２ｐ４０のＡ
ｓｎ−２２２のＮ−糖鎖化影響 熱で非活性化されたＦＢＳ(fetal bovine serum, GIBCO-BRL社)１０％を含有
しているＤＭＥＭ倍地(Dulbecco's modified Eagle's medium, GIBCO-BRL社)で
培養されたＣＯＳ−７細胞（ＡＴＴＣ）への形質転換は、電気穿孔法(electropo
ration, Biorad社)によって行われた。５×１０⁶個のＣＯＳ−７細胞を含む培養
倍地約３００μｌ、前記実施例＜１−１＞のｐＣＩＮ−ｈｐ４０／ＩＲＥＳ／ｈ
ｐ３５または前記実施例３の突然変異ＩＬ−１２遺伝子を含むプラスミド２０μ
ｇ、そしてアルカリホスファターゼ(alkaline phosphatase)をコーディングする
ことにより対照区の役割を行うことが可能なｐＮＥＢ−ＳＥＡＰ(pNEB-Secreted
Alkaline phosphatase, New England Biolabs)２μｇをキュベットに入れ、２
５０Ｖ、９６０μＦの条件で電気穿孔法を行った。

【００７６】 電気穿孔法による形質転換後２４時間が経過すると、倍地は血清の添加されて
いないＣＨＯ−ＳＦＭII倍地（GIBCO-BRL社）１.５ｍｌに取り替え、実験種類に
よってツニカマイシン(tunicamycin:Sigma社)１μｇ／ｍｌを添加した。倍地交
換２４時間後には細胞を収穫して遠心分離した後、上層液はＳＥＡＰ活性測定に
使用され、ペレット(pellet)は２００μｌの細胞溶血液(cell lysis solution,
Promega社)に懸濁させた。上層液とペレットに存在するＩＬ−１２ｐ７０とＩＬ
−１２ｐ４０の水準はＥＬＩＳＡで測定された(R&D system社)。免疫ブロットの
ために培養上澄液と細胞破砕物をそれぞれ１０％及び１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(s
odium dodecyl-sulfate-polyacryl amide gel electrophoresis)で電気泳動し、
これにより分離された蛋白質はナイロン膜(Amersham社)に電気移動(electrotran
sfer)した。膜に吸着した蛋白質はビオチン(biotin)の付着したヒトＩＬ−１２
抗体(R&D system社)と、ＨＲＰ(Horseradish peroxidase)の付着した ストレプ
トアビジン(streptavidin, Pharmingen社)、及びＥＣＬキット(Amersham社)を用
いて結果を得た。その結果を下記表１に示した。下記表１の数値はＥＬＩＳＡに
よって測定された野生型におけるＩＬ−１２ｐ７０とＩＬ−１２ｐ４０の発現程
度を１００％としたときの相対的な発現量を示したものである。

【００７７】

【表１】

【００７８】 ａ；ＤＮＡコンストラクトは総２０μｇがＣＯＳ−７細胞に電気穿孔法よる形
質転換のために使用された。また、２つのＤＮＡコンストラクトの同時形質転換
のためにはそれぞれ１０μｇのＤＮＡが使用された。

【００７９】 ｂ；ＩＬ−１２ｐ７０またはｐ４０の発現はＥＬＩＳＡで測定し、野生型ＩＬ
−１２含有コンストラクトでｐ４０及びｐ７０の発現及び分泌水準を１００％と
して、これに対する相対的な比率で示した。

【００８０】 ｃ；それぞれの突然変異上澄液内に存在する同量のｐ７０をＩＦＮ−γ誘導能
分析に使用した。誘導されたＩＦＮ−γの水準はＥＬＩＳＡで測定し、野生型Ｉ
Ｌ−１２含有コンストラクトを用いた実験で誘導されたＩＦＮ−γ水準を１００
％とし、これに対する相対的な比率で示した。

【００８１】 ｄ；ＩＬ−１２ｐ４０はＩＬ−１２ｐ７０のｐ４０部分でないＩＬ−１２ｐ４
０の単量体または二量体ｐ４０形態を示す。

【００８２】 ｅ；ＩＬ−１２ｐ７０はＩＬ−１２ｐ３５とＩＬ−１２ｐ４０からなるヘテロ
二量体を示す。

【００８３】 ｆ；２つのＤＮＡコンストラクトの同時形質転換にはプラスミド原形としてｐ
ＣＩ−ｎｅoが使用された。

【００８４】 ｇ；＜１はＥＬＩＳＡの感知水準より低い量の蛋白質が検出されることを意味
する。

【００８５】 ｈ；野生型ｈｐ４０またはｈｐ４０−Ｎ１３５Ｑ、ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｑ Ｄ
ＮＡをそれぞれｈｐ３５ ＤＮＡと同時に形質転換した後、上澄液から検出され
るｐ７０の量を同一にしたとき、野生型ＤＮＡ形質転換時よりｈｐ４０−Ｎ１３
５Ｑとｈｐ４０−Ｎ２２２Ｑ ＤＮＡ形質転換時に上澄液から検出されるｐ４０
の量が相対的に低いが、この上澄液に不足分のｈｐ４０（ｈｐ４０コンストラク
トを形質転換して得た上澄液に存在するｈｐ４０）を添加してＩＦＮ−γ誘導能
分析実験を行った場合を意味する。

【００８６】 ｉ；括弧内に表示された数字は同時に形質転換させたプラスミドｈｐ４０−Ｎ
２２２Ｑとｈｐ３５ ＤＮＡ量（μｇ）を意味する。形質転換時に総２０μｇの
ＤＮＡが利用されたが、不足分はｐＣＩ−ｎｅｏ ＤＮＡで補充された。

【００８７】 ｊ；ｈＩＬ−１２ｐ４０及びその突然変異型とｈＩＬ−１２ｐ３５の同時発現
のために使用されたプラスミドの原形はｐＧＸ０ベクトルである。

【００８８】 ｋ；ｍＩＬ-１２ｐ４０及びその突然変異型とｍＩＬ−１２ｐ３５の同時発現
のために使用されたプラスミドの原形はｐＴＶ２ベクトルである。

【００８９】 表１に示すように、ｐ３５のＡｓｎ−１４１とｐ４０のＡｓｎ−３０３糖鎖化
可能部分の突然変異はＩＬ−１２ｐ７０またはＩＬ−１２ｐ４０の分泌に何の影
響も及ぼさない一方、ｐ４０ Ａｓｎ−１３５の突然変異とｐ４０ Ａｓｎ−２２
２糖鎖化部分の突然変異はＩＬ−１２ｐ４０の分泌のみを減少させることを確認
した。特に、Ａｓｎ−２２２のアミノ酸はルシン（Ｌｅｕ）以外にグルタミン(
Ｇｌｎ)に代替された時にも同一の分泌様相を示すことからみて、このような現
象はＡｓｎ−２２２のＮ−糖鎖化の消失によるものと思われる。

【００９０】 図３ａは正常型ヒトＩＬ−１２ｐ３５遺伝子と糖鎖化可能部分突然変異遺伝子
のＣＯＳ７細胞内形質転換後、細胞破砕物で行った免疫ブロット結果を示す。第
１列と第２列はそれぞれｐＣＩ−ｎｅｏとｐＣＩＮ−ｈｐ３５で形質転換された
細胞破砕物に対する結果であり、第３、４、５及び６列はｈｐ３５のＮ−糖鎖化
可能部分に対する突然変異遺伝子を含む発現ベクトルとしてのｐＣＩＮ−ｈｐ３
５−Ｎ１２７Ｑ、 ｐＣＩＮ−ｈｐ３５−Ｎ１４１Ｑ、 ｐＣＩＮ−ｈｐ３５−Ｎ
２５１Ｑ、 ｐＣＩＮ−ｈｐ３５−Ｎ１２７、２５１Ｑで形質転換された細胞破
砕物に対する結果である。第２及び５列から分子量が約３３.２ｋＤａ程度のバ
ンドが出たが、これはＮ−糖鎖化されたｐ３５小単位体に対する蛋白質を示すも
ので、ツニカマイシンによってｐ３５小単位体のＮ−糖鎖化を阻害させる時に現
れる分子量２８ ｋＤａバンド（第７列）が第３及び４列で現れることからみて
、Ａｓｎ−１２７及びＡｓｎ−１４１アミノ酸がＮ−糖鎖化される部分であると
思われる。

【００９１】 図３ｂは正常型ヒトＩＬ−１２ｐ４０遺伝子と糖鎖化可能部分突然変異遺伝子
のＣＯＳ７細胞内形質転換後、細胞破砕物で行った免疫ブロット結果を示す。第
１列と第２列はそれぞれｐＣＩ−ｎｅｏとｐＣＩＮ−ｈｐ４０で形質転換された
細胞破砕物に対する結果であり、第３、４、５及び６列はｈｐ４０のＮ−糖鎖化
可能部分に対する突然変異遺伝子を含む発現ベクトルとしてのｐＣＩＮ−ｈｐ４
０−Ｎ１２５Ｑ、 ｐＣＩＮ−ｈｐ４０−Ｎ１３５Ｑ、 ｐＣＩＮ−ｈｐ４０−Ｎ
２２２Ｑ、 ｐＣＩＮ−ｈｐ４０−Ｎ３０３Ｑで形質転換された細胞破砕物に対
する結果であり、第７、８、９及び１０列は各Ｎ−糖鎖化可能部分に対する二重
ないし三重突然変異化後にこれを用いて形質転換された細胞破砕物に対する結果
であり、第１１列はｐＣＩＮ−ｈｐ４０で形質転換された細胞にＮ−糖鎖化を阻
害させる試薬、例えばツニカマイシンを処理した細胞破砕物に対する結果である
。

【００９２】 いろいろの報告によれば、ＩＬ−１２ｐ４０の免疫ブロット結果、３〜４個の
バンドが分子量３６〜４５ｋＤａで現れると知られており、本実施例の第２列及
び３列野生型ＩＬ−１２ｐ４０、或いはこれと共にＩＬ−１２ｐ３５を発現する
ようにした細胞破砕物からも３６、３７.５、４０、４３.１ｋＤａ程度の分子量
でバンドが現われている。第１１列のツニカマイシンを処理した細胞破砕物では
、前記３つのバンドがなくなり、３６ｋＤａのバンドのみが残ることからみて、
このバンドはＮ−糖鎖化されていないｐ４０小単位体を示すものである。第３及
び４列のＡｓｎ−１２５及びＡｓｎ−１３５突然変異はバンド様相が野生型とあ
まり相違せず、残りの第５及び６列のＡｓｎ−２２２、Ａｓｎ−３０３突然変異
はバンド様相が変わっていることが分かるが、これは１３５、２２２、３０３位
置のＡｓｎアミノ酸がＮ−糖鎖化部分として使用されていることを意味する。

【００９３】 図３ｃは野生型ヒトＩＬ−１２ｐ４０遺伝子と糖鎖化可能部分突然変異遺伝子
のＣＯＳ７細胞内形質転換後、細胞培養上澄液で行った免疫ブロット結果を示す
。各列に対する説明は図３ｂのそれと同一である。細胞破砕物の結果と同様に３
〜４個のバンドが分子量３６〜４５ｋＤａで現われており、第３及び４列のＡｓ
ｎ−１２５及びＡｓｎ−１３５突然変異はバンド様相が野生型とあまり相違しな
いが、残りの第５及び６列のＡｓｎ−２２２及びＡｓｎ−３０３突然変異はバン
ド様相が変わっていることが分かる。特に、Ａｓｎ−１３５とＡｓｎ−２２２ア
ミノ酸突然変異の場合、細胞破砕物でとは異なり、細胞培養液に殆ど分泌されて
いないことが分かるが、これはＥＬＩＳＡによる定量化結果と一致する。

【００９４】 前記突然変異遺伝子を含む発現ベクトルのうちＩＬ−１２ｐ４０遺伝子の糖鎖
化可能部分Ａｓｎ−２２２がＬｅｕ−２２２に突然変異された遺伝子を含んでい
る発現ベクトルｐＧＸ０−ｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ及びｐＧ
Ｘ０−ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ／ＩＲＥＳ／ｈｐ３５は、韓国生命工学研究院遺伝
子銀行に２００１年２月２９日付で寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ ０９６９Ｂ
Ｐ及びＫＣＴＣ ０９７０ＢＰ）。

【００９５】 ＜４−１＞ｈＩＬ−１２ｐ７０の合成、ヘテロ二量体化及び分泌に及ぼすｈｐ
３５のＮ−糖鎖化効果 本発明者は、ｈＩＬ−１２ｐ７０の合成、ヘテロ二量体(heterodimerization)
及び分泌に及ぼすｈｐ３５のＮ−糖鎖化効果を調査するために、前述したように
野生型ｈｐ３５遺伝子またはそのＮ−糖鎖化突然変異遺伝子を含むｈＩＬ−１２
発現ベクトルで細胞を形質転換させた後、これから得た培養上澄液及び細胞破砕
物を用いてＥＬＩＳＡ分析を行った。

【００９６】 その結果、前記表１に示すように、Ａｓｎ−１２７を除いてｈｐ３５の可能な
Ｎ−糖鎖化残基の除去はｈＩＬ−１２ｐ７０の合成、ヘテロ二量体化及び分泌に
何の効果も及ぼさなかった。ところが、Ａｓｎ−１２７の糖鎖化はｈＩＬ−１２
ｐ７０のヘテロ二量体化と分泌を相当な程度に減少させたが、これは正常的な形
質感染効率を示したｈｐ３５−Ｎ１２７Ｑ及びｈｐ３５−Ｎ１２７、１４１Ｑの
発現水準がウェスタンブロット上で他の突然変異体の発現水準と類似しているか
らである。従って、このような結果はＡｓｎ−１４１のＮ−糖鎖化ではなくｈｐ
３５のＡｓｎ−１２７のＮ−糖鎖化がｈＩＬ−１２ｐ７０のヘテロ二量体と分泌
に非常に重要な役割を行うことを示す。

【００９７】 ＜４−２＞ｈＩＬ−１２ｐ７０の合成、ヘテロ二量体化及び分泌に及ぼすｈｐ
４０のＮ−糖鎖化効果 また、本発明者は、ｈＩＬ−１２ｐ７０の合成、ヘテロ二量体及び分泌に対す
るＮ−糖鎖化の効果を測定するために、前記実施例＜３−１＞と同一の方法で野
生型ｈｐ３５遺伝子またはそのＮ−糖鎖化突然変異遺伝子を含むｈＩＬ−１２発
現ベクトルで形質転換させた後、これにより得られる細胞の培養上澄液及び細胞
破砕物内のｈＩＬ−１２ｐ７０及びｈＩＬ−１２ｐ４０の水準をＥＬＩＳＡで分
析した。

【００９８】 その結果、前記表１に示すように、Ａｓｎ−１３５またはＡｓｎ−２２２の突
然変異は、ｈＩＬ-１２ｐ７０の分泌に殆ど影響を及ぼさなかったが、これは前
記突然変異体におけるｈＩＬ−１２ｐ７０の細胞外水準(extracellular level)
が野生型ｈｐ４０と殆ど類似しているからである。より興味深いことは、Ａｓｎ
−１３５及びＡｓｎ−２２２突然変異体においてｈＩＬ−１２ｐ４０の分泌が相
当減少し、特にＡｓｎ−２２２突然変異体は野生型ｈｐ４０と比較して約１５％
程度減少した分泌水準を示すものである。このような結果はＡｓｎ−２２２にお
けるＮ−糖鎖化がヘテロ二量体形態のｈＩＬ−１２、ｈＩＬ−１２ｐ７０ではな
くｈＩＬ−１２ｐ４０が単独で分泌されるのに要求されることを示す。また、Ａ
ｓｎ−１３５及び／又はＡｓｎ−２２２における突然変異体を含む二重及び三重
突然変異体もｈＩＬ−１２ｐ７０ではなくｈＩＬ−１２ｐ４０より低い水準の分
泌水準を示した。

【００９９】 これとは逆に、他の突然変異体は野生型ｈｐ４０と比較して細胞破砕物内ｈＩ
Ｌ−１２ｐ４０及びｈＩＬ−１２ｐ７０を同等な量だけ生産したが、Ａｓｎ−１
２５及びＡｓｎ−３０３の突然変異体はｈＩＬ−１２ｐ４０及びｈＩＬ−１２ｐ
７０の発現、ヘテロ二量体化、分泌において相当な差異を示した。

【０１００】 前記結果より、本発明者はＡｓｎ−２２２におけるＮ−糖鎖化がｈＩＬ−１２
ｐ７０のヘテロ二量体化と分泌には要求されないが、ｈＩＬ−１２ｐ４０の分泌
には必須的な役割を行う一方、Ａｓｎ−１２７におけるｈｐ３５ Ｎ−糖鎖化が
ｈＩＬ−１２ｐ７０のヘテロ二量体化と分泌に重要な役割を行うことを確認した
。これはまたｈｐ３５のＮ−糖鎖化がｈＩＬ−１２ｐ７０の分泌に必須条件であ
るという以前の報告と一致する結果である(Carra, G. et al., J. Immunol., 16
4:4752-4761, 2000) ＜４−３＞ｈＩＬ−１２の糖鎖化が生物学的活性に及ぼす影響 本発明者は、ｈＩＬ−１２の糖鎖化が生物学的活性に及ぼす影響を調査するた
めに、野生型ｈＩＬ−１２と潜在的Ｎ−糖鎖化部位の突然変異を含むその誘導体
のＩＦＮ−γ誘導能(induction ability)を分析した。このため、野生型ｈＩＬ
−１２とその突然変異体を１００ｎｇ／ｍｌずつ同量含む培養上澄液をヒトＰＢ
Ｌｓと共に培養した後、それぞれの培養上澄液内の誘導されたＩＦＮ−γ水準を
ＥＬＩＳＡで分析した。

【０１０１】 その結果、前記表１に示すように、ＩＦＮ−γ誘導能という面において野生型
とその全ての誘導体との間に著しい差異は見えなかった。ところが、Ａｓｎ−１
３５及び／またはＡｓｎ−２２２で突然変異されたｈｐ４０誘導体は、野生型ま
たは他のｈｐ４０突然変異体に比べてやや増加したＩＦＮ−γ誘導能を示した。
このような結果は、ｈＩＬ−１２ｐ７０の拮抗物質(antagonists)として知られ
ているｈＩＬ−１２ｐ４０の水準がｈｐ４０−Ｎ１３５Ｑ及び／またはｈｐ４０
−Ｎ２２２Ｑを含む突然変異体の培養上澄液内で他の突然変異体に比べて相対的
に非常に低いからである。

【０１０２】 ＜実施例５＞糖鎖化部分が突然変異化されたＩＬ-１２ｐ７０の分泌における
ＩＬ−１２ｐ３５の役割 ｈｐ４０のＡｓｎ−２２２における糖鎖化がどのようにｈＩＬ−１２ｐ４０の
分泌を減少させるかを調査するために、本発明者は一定量のｈｐ４０−Ｎ２２２
Ｑ−発現プラスミドを様々な量の野生型ｈｐ３５ ＤＮＡと共に細胞に同時に形
質感染させた。

【０１０３】 このため、ヒト抹消血単核細胞(human peripheral blood mononuclear cells, ＰＭＢＣ)は、フィコール・ハイパック(Ficoll-Hypaque, Sigma社)濃度差を用
いた遠心分離で血液から分離し、１０％ＦＢＳとペニシリン(penicillin)／スト
レプトマイシン(streptomycin)（GIBCO-BRL社）を含んだＲＰＭＩ−１６４０倍
地（GIBCO-BRL社）に再び懸濁化した。ヒトＩＦＮ−γ増幅量測定のために４×
１０⁵個のヒト抹消血リンパ球を１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２ｐ７０または突
然変異蛋白質を含有する培養上澄液とともに１６時間培養した。

【０１０４】 一方、マウスＩＦＮ−γ増幅量を測定するためには６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／
ｃマウスの脾臓を確保した後、これより得た１×１０⁵個の脾臓細胞(splenocyte
s)を２４時間１００ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ−１２ｐ７０またはこれの突然変異
誘導体を含む培養上澄液と共に培養した。増幅されたヒト及びマウスＩＦＮ−γ
の量はヒト及びマウスＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキット(R&D systems社)を用いて測
定された。その結果は表１に提示されている。表１の数値はＥＬＩＳＡによって
測定された野生型におけるＩＦＮ−γの増幅量を１００％としたときの相対的な
数値である。

【０１０５】 一般に、ｐ３５小単位体は単独で分泌されず、ｐ４０と結合されてＩＬ−１２
ｐ７０の形で分泌される一方、ｐ４０小単位体は単量体(monomer)またはホモ二
量体(homodimer)の形で分泌されるが、これはｐ３５小単位体ではなくｐ４０小
単位体がＩＬ−１２ｐ７０の分泌において主要要素として作用することを暗示す
るものである。表１に示すように、ｈＩＬ−１２ｐ７０の分泌量は、野生型ｈｐ
４０とｈｐ−Ｎ２２２Ｑ突然変異の両方ともにおいて形質感染されたｈｐ３５
ＤＮＡの量に比例して増加した。このような結果は分泌結果(secretion defect)
を有するｈｐ４０小単位体がｈｐ３５小単位体と結合しながらＩＬ−１２ｐ７０
の形で分泌されることを示すもので、ｈｐ３５小単位体もｈＩＬ−１２ｐ７０の
分泌において別の作用を行うことを暗示するものである。最近、ｈｐ４０小単位
体内の形態的な変化(conformational change)がｈｐ３５との結合によることを
示す研究が報告され、ＩＬ-１２ｐ７０分泌においてｈｐ３５小単位体の寄与可
能性を提示したことがある(Yoon, C et al., EMBO J., 19:3530-3534, 2000)。
前記研究と本発明の結果より、本発明者はＡｓｎ−２２２における糖鎖化を含む
ｈｐ４０がそれ自体では分泌に欠陥を有するが、ｈｐ３５との結合によるｈｐ４
０部位の形態的な変化に起因してｈｐ７０の形で分泌できることを確認した。

【０１０６】 ＜実施例６＞マウスＩＬ−１２ｐ４０ Ａｓｎ−２２０糖鎖化部分の突然変異
遺伝子含有発現ベクトル及びＨＣＶ−Ｅ２ ＤＮＡワクチンの製造 ＜６−１＞ｐＣＩＮ−ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌの製造 本発明のｈＩＬ−１２突然変異遺伝子をＤＮＡワクチンのような遺伝子療法(g
ene therapy)に使用することができるかその可能性を調査するために、本発明者
はｈｐ４０遺伝子のＡｓｎ−２２２と類似のマウスＩＬ−１２ｐ４０（ｍｐ４０
）遺伝子の塩基序列を調査した。その結果、本発明者はマウスｐ４０のＡｓｎ−
２２０アミノ酸がヒトｐ４０のＡｓｎ−２２２と非常に類似している部位に存在
し、現在までそのアミノ酸序列がＮ−糖鎖化されていると知られていないことを
確認した。これにより、本発明者はｍｐ４０遺伝子の突然変異、即ちアミノ酸序
列の２２０番目のＡｓｎを特定部位の突然変異誘発(Site-directed mutagenesis
)によってＬｅｕコドンに置換してｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌを製造した。この際、
突然変異化のための始発体としてはｐ４０において序列番号２２及び序列番号２
３と記載されるヌクレオチドを合成して利用した。前記突然変異は遺伝子の識別
を容易にするためのＳａｃI制限酵素認識部位を含んでいる。このように製造さ
れた突然変異は、突然変異化後に生成される特定の制限酵素認識部位に対する制
限酵素処理とＤＮＡ序列確認によって検証された。これにより、動物細胞に発現
可能なマウスＩＬ-１２ｐ４０突然変異遺伝子の含まれたｐＣＩＮ−ｍｐ４０−
Ｎ２２０Ｌベクトルを完成した。

【０１０７】 ＜６−２＞ｐＴＶ２−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌベクトルの
製造 ｐ４０とｐ３５小単位体をコーディングすると共に発現しながらＤＮＡ免疫化
に使用し得るベクトルを製作するために、既に小動物でＤＮＡワクチンベクトル
として使用されたことのある真核細胞発現ベクトルのｐＴＶ２ベクトル(Lee et
al., J. Virol., 72:8430-8436, 1998; Cho et al., Vaccine, 17:1136-1144, 1
999)を制限酵素Ａｓｐ７１８とＮｏｔIで切断し、ここにｐＳＫ−ｍｐ３５／Ｉ
ＲＥＳ／ｍｐ４０を同一の酵素で切断して得たｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０断
片を挿入することにより、ｐＴＶ２−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０ベクトルを
完成した。さらに、マウスＩＬ−１２ｐ４０のＡｓｎ２２０突然変異遺伝子を含
みながらｐ３５を同時に発現させるベクトルの製造のために、まずｐＳＫ−ｍｐ
３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０ベクトルをＮｃｏIとＮｏｔIで切断し、ここにｐＣＩ
Ｎ−ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌを同一の酵素で切断して得た４０−Ｎ２２０Ｌ断片を
挿入することにより、ｐＳＫ−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０−２２０Ｌベクト
ルを製作した。ｐＴＶ２−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０ベクトルをＥｃｏＲＶ
とＮｏｔIで切断してｍｐ４０断片を除去した後、ここにｐＳＫ−ｍｐ３５／Ｉ
ＲＥＳ／ｍｐ４０−２２０Ｌを同一の酵素で切断して得たｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ
断片を挿入することにより、ｐＴＶ２−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０−Ｎ２２
０Ｌベクトルを完成した。

【０１０８】 前記ｐＴＶ２−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌベクトルは韓国生
命工学研究院遺伝子銀行に２０００年２月２９日付で寄託した（受託番号：ＫＣ
ＴＣ ０７４５ＢＰ）。

【０１０９】 ＜６−３＞ｐＴＶ２−ＨＣＶ−Ｅ２ベクトルの製造 本発明者は、真核細胞にＨＣＶ−Ｅ２蛋白質を発現することが可能なｐＴＶ２
−ＨＣＶ−Ｅ２ ＤＮＡワクチンベクトルを製造した(Song M. K. et al., J. Vi
rol., 74:2920-2925, 2000)。図５に示すように、ｐＴＶ２−ＨＣＶ−Ｅ２ ＤＮ
Ａワクチンベクトルはシミアンウィルス４０の複製開始点(simian virus 40 rel
ication origin, SV40 ori)、サイトメガロウィルスプロモータ(cytomegaloviru
s promoter,ＣＭＶ)、アデノウィルス(adenovirus)の三重先導序列(tripartite
leader sequence、ＴＰＬ)、多重クローニング序列(multiple cloning sequence
,ＭＣＳ)、ＳＶ４０ポリアデニル化序列(polyadenylation sequence, polyＡ)及
びアンピシリン抵抗性遺伝子(ampicilin resistance gene：ＡｍｐＲ)などから
構成され、ＨＣＶ−Ｅ２遺伝子が多重クローニング序列内にクローニングされて
いる。本発明に使用されたＥ２遺伝子は疎水性アミノ残基 (hydrophobic amino
acid residue)を含むカルボキシル末端(carboxyl-terminal:Ｃ-terminal)部位を
除去して蛋白質の分泌を容易にし、アミノシル末端(aminocyl-terminal:Ｎ-term
inal)部位にヘルペスウィルス(Herpesvirus:ＨＳＶ)の外被糖蛋白質Ｄ(glycopro
tein D:ｇＤ)の信号序列(signal sequence:ｓ)を連結させて蛋白質の発現及び細
胞の分泌を効率化しようとした。

【０１１０】 ＜６−４＞マウスＩＬ−１２ｐ４０ Ａｓｎ−２２０突然変異化によるＩＬ−
１２ｐ４０及びＩｌ-１２ｐ７０の分泌様相確認 実施例４で使用された方法と同方法によって下記表１に示したベクトルをＣＯ
Ｓ−７細胞に形質転換させた後、細胞破砕物と細胞培養液を得てマウスＩＬ−１
２ＥＬＩＳＡ(Pharmingen社)を行い、ＥＬＩＳＡによって測定された野生型にお
けるＩＬ−１２ｐ７０とｐ４０の発現程度を濃度で表１に示した。ｐＣＩ−ｎｅ
ｏにおいて、＜１の数値はＥＬＩＳＡで検出されない範囲を意味する。

【０１１１】 表１に示すように、ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ突然変異体はＩＬ−１２ｐ４０及び
Ｉｌ−１２ｐ７０の分泌及びその生物学的活性という側面からみて、ｈｐ４０の
Ａｓｎ−２２２突然変異体とほぼ類似の特性を示した。

【０１１２】 また、本発明者は前記ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ突然変異遺伝子がＤＮＡワクチン
として使用できるか或いはＴｈ１及びＣＴＬ免疫反応の誘導においてｍｐ４０−
Ｎ２２０Ｌ突然変異遺伝子と野生型ｍｐ４０遺伝子の活性を比較するために、本
発明のｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ突然変異遺伝子ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０（ｍ
ＩＬ−１２ｗｔ）またはｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ（ｍＩＬ−
１２ｍｕｔ）をｐＴＶ２ ＤＮＡワクチンベクトルに挿入してそれらの試験管内(
in vitro)特性を観察した。その結果、表１に示したように、ｐＴＶ２ベクトル
内ｍＩＬ−１２ｍｕｔ遺伝子ｍｐ４０−Ｎ２２０Ｌ突然変異体はＩＬ−１２ｐ４
０及びＩＬ−１２ｐ７０の分泌及びその生物学的活性という側面からみて、ｈｐ
４０のＡｓｎ−２２２突然変異体とほぼ類似の特性を示した。

【０１１３】 ＜実施例７＞抗原−特異的な体液性免疫反応に対する突然変異ＩＬ−１２の効
果調査 以前の報告によれば、ＨＣＶ−Ｅ２抗原（ｐＴＶ２−ｇＤｓＥ２ｔ）を暗号化
するプラスミドのＤＮＡ予防接種が、接種してから３週後に抗原−特異的な体液
性(antigen-specific humoral)及び細胞−媒介性免疫反応(cell-mediated immun
e response)を誘導するのに十分であることが確認された。このため、本発明者
は本発明の突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子が野生型ｍＩＬ−１２遺伝子と比較して
生体内抗原−特異的な免疫反応に効果的に影響を及ぼすことができるかを調査す
るために、マウスを初期免疫化させた後、ｐＴＶ２−ｇＤｓＥ２ｔプラスミドと
共にｐＴＶ−ｍＩＬ−１２ｍｕｔまたはｐＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｗｔを４週後に
追加接種した。

【０１１４】 具体的に、前記実施例６で製造された本発明の突然変異遺伝子を含んだ発現ベ
クトルによってＤＮＡワクチンによる免疫反応増進を調査するために、ｐＴＶ２
、突然変異ｍＩＬ−１２または野生型ｍＩＬ−１２を有するｐＴＶ２−ｇＤｓＥ
２ｔ ＤＮＡ２００μｇを１００μｌの燐酸塩緩衝溶液(phosphate-buffered sal
ine solution)に溶解させた後、生後約６〜８週年齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの
前脛骨筋(anterior tibialis muscles)に注射した。最初ＤＮＡ注入してから４
週経過後、同一の方法で同一量のＤＮＡを追加接種した。２回のＤＮＡ追加接種
後約０、３、６、１０週が経過してマウスの眼球近くの血筋から採血して血清を
分離し、ＨＣＶ−Ｅ２特異的な抗体生成有無を生成されたｈＧＨ−Ｅ２蛋白質を
用いてＥＬＩＳＡ法によって調査した。使用されたＥ２蛋白質はＣＨＯ細胞株か
ら発現されたｈｇｈ−Ｅ２蛋白質を利用した。９６−ウェルプレートにｈｇｈ−
Ｅ２蛋白質を１００ｎｇずつコーティングした後、免疫されたマウスから得られ
た血清を適当に希釈して蛋白質と反応させた。その後、抗原特異的なＩｇＧにホ
ースラディシュペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase、ＨＲＰ：Chemicon
社)が接合された抗マウスｌｇＧ抗体を反応させた後、ＡＢＴＳ(Sigma社)を添加
することにより、発色反応を行わせ、ＥＬＩＳＡ測定器(BioTek社)によって４５
０ｎｍで分析した。また、Ｅ２蛋白質に対して形成された総ＩｇＧ抗体に対する
亜系列のＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの相対的比率を観察するために、抗マウスＩｇ
Ｇ抗体の代りにそれぞれＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａに特異的に結合する抗マウスＩ
ｇＧ抗体を用いてＥＬＩＳＡを行った。

【０１１５】 その結果、図５ａ、図５ｂ、図５ｃ及び図５ｄに示すように、ＨＣＶ Ｅ２ Ｄ
ＮＡワクチンは陰性対照群の水準より相当高い全身性(systemic)ＨＣＶ Ｅ２−
特異的な全体ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの水準を誘導し、突然変異ｍＩＬ
−１２遺伝子または野生型ｍＩＬ−１２遺伝子との同時注入はＨＣＶ Ｅ２ ＤＮ
Ａワクチンが単独で投与された場合に比べて高い水準の全体ＩｇＧ水準を示した
。ＩｇＧ１の水準はＨＣＶ Ｅ２ ＤＮＡが投与された群と比較して多少高い水準
を示した。逆に、ＨＣＶ Ｅ２に対するＩｇＧ２ａの水準は野生型ｍＩＬ−１２
投与群でやや増加し、ＨＣＶ Ｅ２ ＤＮＡ単独投与群に比べては突然変異ｍＩＬ
−１２投与群で相当増加した。しかも、Ｔｈ１免疫反応の間接的なインジケータ
(Indicator)として一般的に受け入れられているＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１の比はＩ
ｇＧ２水準の様相が類似している突然変異ｍＩＬ−１２投与群で最も高かった。
このような結果は突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子が野生型ｍＩＬ−１２投与群また
はＨＣＶ Ｅ２単独投与群に比べて体液性免疫反応においてＩｇＧ１からＩｇＧ
２ａへのＩｇＧ亜系列の転移に相当関与することを示し、突然変異ＩＬ−１２遺
伝子がＴｈ１形態の免疫反応を誘導することを暗示する。

【０１１６】 ＜実施例８＞免疫化されたマウスからの細胞性免疫反応調査 ＜８−１＞突然変異ＩＬ−１２による抗原−特異的なＴｈ１免疫反応の誘導 本発明者は、細胞−媒介性免疫反応の力価評価に使用されてきたパラメータの
一つであるＴｈ１免疫反応において本発明の突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子の効果
を調査するために、脾臓細胞からＩＦＮ−γ発現を測定した。このために、２回
のＤＮＡ注入後約８週経過したマウスの脾臓から得た脾臓細胞（１×１０⁵）を
Ｕ字底状の９６−ウェルプレートに添加した。その後、ＣＨＯ細胞から精製され
たｈｇｈ−Ｅ２ｔ蛋白質１〜５μｇを各ウェルに添加し、細胞を３７℃、ＣＯ₂
培養器で３日間培養して活性化させた。これより細胞培養液を確保した後、これ
を上層液内に存在するＩＦＮ−γの量をＥＬＩＳＡによって測定するために使用
した。特定の抗原として活性化された後、誘導されたＵＦＮ−γは抗原−特異的
なＣＤ４＋Ｔ細胞から生産されるが、Ｔｈ１免疫反応のインジケータとして使用
できる。

【０１１７】 図６に示すように、サイトカイン遺伝子なしでＨＣＶ Ｅ２ ＤＮＡのみ投与さ
れた群はｈｇｈＥ２ｔ蛋白質の濃度に比例してＩＦＮ−γ水準が増加した反面、
模造プラスミド(mock plasmid)接種群は増加しなかった。予想通りに、野生型ｍ
ＩＬ−１２投与群はＩＦＮ−γ誘導水準がＨＣＶ Ｅ２単独投与群に比べてより
増強され、突然変異ｍＩＬ−１２投与群は野生型ｍＩＬ−１２投与群に比べて２
〜３倍高いＩＦＮ−γ生産水準を示した。このような結果はｍＩＬ−１２ｐ７０
が抗原−特異的なＴｈ１免疫反応を増加させる役割を果たし、ｍＩＬ−１２ｐ４
０は生体内ＩＬ−１２ｐ７０によるＴｈ１免役反応の誘導を抑制する役割を果た
すことを暗示するものである。接種されたグループ間のＩＦＮ−γ誘導水準は追
加接種３週後から差異を示し、１０週以後にも類似の差異を示したが、これはｍ
ＩＬ−１２ｐ７０がＴｈ１免役反応の誘導及び維持に関与することを暗示するも
のである。

【０１１８】 ＜８−２＞突然変異ＩＬ−１２による抗原−特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞機能の長
期間増強効果調査 上述したように、本発明の突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子がＨＣＶ Ｅ２ ＤＮＡ
免役化において長期間Ｔｈ１免役反応に寄与することを確認した本発明者は、突
然変異ｍＩＬ−１２遺伝子の発現によって誘導されたＴｈ１免役反応がＣＴＬ免
役反応及び主要細胞−媒介性免役反応と連係しており、突然変異ｍＩＬ−１２遺
伝子がＤＮＡ免役化モデルでＣＴＬ活性の維持に影響を及ぼすかを調査するため
に、追加接種後様々な週齢においてＤＮＡ免役化マウスから得た脾臓細胞を用い
てＣＴＬ分析を行った。

【０１１９】 このために、Ｓｏｎｇを含んだ本発明者によって製作されて既に報告されたＨ
ＣＶ−Ｅ２発現細胞株のＣＴ２６−ｈｇｈＥ２ｔ細胞(Song M. K. et al., J. V
irol., 74:2920-2925, 2000)にマイトマイシン(mitomycin C、５００μｇ／ｍｌ
)処理によって細胞分裂を抑制させ、これを２回のＤＮＡ注入後約２週が経過し
たマウスの脾臓から得た脾臓細胞とともに試験管内(in vitro)で約５日間活性化
させた。これより得た効果器細胞(effect cell)の細胞毒性分析(cytotoxicity)
を⁵¹Ｃｒで標識されたＣＴ２６−ｈｇｈＥ２ｔまたはＣＴ２６−ｎｅｏのような
互いに異なるターゲット細胞(target cell)を対象として行った。多様な数の効
果器細胞を目的のＥ：Ｔ比率で三重にＵ字底状のウェルプレートにコーティング
した。⁵¹Ｃｒで標識されたターゲット細胞（５×１０³）を前記ウェルプレート
の各ウェルに添加した後、６時間３７℃で培養した。これから上層液を回収して
使用し、反応後得られる⁵¹Ｃｒの放出をγ−測定器(γ-counter, Wallac, Turku
, Finland)で測定することにより、ＣＴＬ免役反応を調査した。特定の溶血比率
(percentage of specific lysis)は下記数式１によって計算した。この際、最小
溶血(minimum lysis)はターゲット細胞を培養倍地のみで培養することにより収
得し、最大溶血(maximum lysis)はターゲット細胞を１％ノニデットＰ４０(Noni
det-P40)に露出させることにより確保した。

【０１２０】

【数１】

【０１２１】 その結果、図７に示すように、追加接種２週後、模造プラスミド投与群を除い
た全てのグループで非常に強い抗原−特異的なＣＴＬ活性が観察されたが、ＨＣ
Ｖ Ｅ２単独投与群、野生型ｍＩＬ−１２投与群及び突然変異ｍＩＬ−１２投与
群の間ではほぼ差異がなかった。野生型ｍＩＬ−１２投与群ではＣＴＬ反応が実
験期間全体に亘ってＨＣＶ Ｅ２単独投与群に比べて高く出たが、これは増加し
たＣＴＬ形成にｍＩＬ−１２遺伝子が重要な役割を行うことを示す。興味深く、
突然変異ｍＩＬ−１２投与群と他の２つの群（ＨＣＶ Ｅ２投与群及び野生型ｍ
ＩＬ−１２投与群）間のＣＴＬ活性における差異は、追加接種期間が長くなるほ
ど時間経過に伴って段々著しくなった。特に、１０週後のＣＴＬ反応はＨＣＶ
Ｅ２投与群及び野生型ｍＩＬ−１２投与群で非常に低かったが、これは抗原−特
異的なＣＴＬの分泌量(frequency)が長期間後には相当減少するからである。一
方、突然変異ｍＩＬ−１２投与群は抗原−特異的なＣＴＬ反応を維持しながら、
異なる２つのグループより５〜１０倍高いＣＴＬ活性を示した。対照群として、
ＣＴ２６−ｎｅｏ細胞をターゲット細胞として使用した場合には、全てのグルー
プにおいていずれの溶血現象(cell lysis)も観察されなかったが、これは前記で
観察されたＣＴＬ活性がＨＣＶ Ｅ２−特異的であることを暗示するものである
。

【０１２２】 ＜８−３＞免役化されたマウスのＣＤ８＋細胞における抗原−特異的ＩＦＮ−
γ生成に対するフローサイトメトリー ＣＴＬ活性の長期間増強が特定の抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の分泌によって
特異的に現れるか、及び生体内ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を確認するために、２回の
ＤＮＡ注入後約２週が経過したマウスの脾臓から得た脾臓細胞と、マイトマイシ
ンＣ（５００μｇ／ｍｌ）の処理されたＣＴ２６−ｈｇｈＥ２ｔ細胞を４０時間
培養した。 磁気細胞分離装置(magnetic cell sorting:ＭＡＣＳ)によってＣＤ
８＋Ｔ細胞を分離した後、これを前記で培養されたＣＴ２６−ｈｇｈＥ２ｔ細胞
（１×１０⁶）と１０Ｕ／ｍｌ組換え型(recombinant)ＩＬ−１２を添加して４０
時間培養した。この際、４μｌGlogiStop(Pharmingen社)を処理してＣＤ８＋Ｔ
細胞から生成されるサイトカインの分泌を阻害させた後、細胞を３７℃で８時間
さらに培養した。

【０１２３】 ＣＤ８＋Ｔ細胞を直接的に分離するために、活性化された脾臓細胞を抗−ＣＤ
８マイクロビード(microbead, Miltenyi Biotec, Inc.社)と培養した後、ｍｉｎ
ｉＭＡＣＳシステムのカラム(microbead, Miltenyi Biotec, Inc.社)を通過させ
、残存するＣＤ８＋Ｔ細胞を分離した。非特異的染色を防止するために、細胞を
Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ^TM（PharMingen社）とともに前培養した後ＦＩＴＣ(fluorescei
n isothiocyanate)接合された抗ＣＤ８抗体で染色した。培養後、細胞をまずCyt
ofix/Cytoperm^TM(PharMingen社)で固定し透過させた後、ＰＥ(R-phycoerythrin)
接合された抗−マウスＩＦＮ−γ抗体または対照群ＰＥ−接合されたイソタイプ
−マッチド(iostype−matched)抗体を添加して細胞を二重染色した。染色された
細胞はＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用するフローサイトメトリー(FACSC
alibur flow cytometry, Becton Dickinson社)を用いて分析し、ＩＦＮ−γの増
加様相を観察した。

【０１２４】

【表２】

【０１２５】 ａ：６週〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに本発明の多様なプラスミドを４週
間隔で１回または２回接種した。

【０１２６】 ｂ：各群の発現は次の通りである。グループI：ｐＴＶ２、グループII：ｐＴ
Ｖ２-ＨＣＶ−Ｅ２ｔ＋ｐＴＶ２、グループIII：ｐＴＶ２−ＨＣＶ−Ｅ２ｔ＋ｐ
ＴＶ２−ｍＩＬ−１２ｗｔ、グループIV：ｐＴＶ２−ＨＣＶ−Ｅ２ｔ＋ｐＴＶ２
−ｍＩＬ−１２ｍｕｔ。

【０１２７】 ｃ：生きているＣＤ８＋Ｔ細胞をＦＳＣとＣＤ８図面を用いてゲーティング(g
ating)することにより選択し、生きているＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ８とＩＦＮ−γ
図面を用いて再びゲーティングすることにより選択した後、この図面で、生きて
いるＣＤ８＋Ｔ細胞のうちＩＦＮ−γを生成するＣＤ８＋Ｔ細胞の比率をパーセ
ントで計算した。この実験はグループ当たり２〜３匹のマウスを用いて行われた
。

【０１２８】 ｄ：ＧＩマウスから得られた（平均溶血値＋３×標準偏差）値を超えるプレー
トのウェルを陽性(positive)として見なすことにより、限界希釈法を用いたＣＴ
Ｌ頻度計算を行い、反応細胞(responder cell)の各希釈時に陰性(negative)ウェ
ルの個数を回帰曲線で分析することにより、１０⁷個の脾臓細胞当たりＣＴＬの
頻度数を示した。この実験はグループ当たり２〜３匹のマウスを用いて行われた
。

【０１２９】 表２に示すように、突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子で同時免役化されたマウスは
追加接種してから０、３、６、１０及び１４週経過後にＨＣＶ Ｅ２単独及び野
生型ｍＩＬ−１２投与群に比べてＣＤ８＋ＩＦＮ−γ生産細胞の分泌量が全般的
に増加していたが、これはＣＴＬ反応結果と一致するものである。このような差
異は初期には微々であるが、段々大きくなり、１０週及び１４週目にはＨＣＶ
Ｅ２単独及び野生型ｍＩＬ−１２投与群ではその頻度が殆ど観察されず、これに
対し、突然変異ｍＩＬ−１２投与群ではその頻度がそのまま維持されることを観
察することができる。また、ＤＮＡの追加接種なしで１回接種した時にもグルー
プ間の様相は類似であった。このような結果は、発現された突然変異ｍＩＬ−１
２遺伝子が初期及び長い期間ＤＮＡ免役化後ＣＤ８＋ＩＦＮ−γ生産Ｔ細胞の頻
度を維持することを立証するものである。これより、本発明者は、細胞−媒介性
免役反応においてＩＬ−１２ｐ７０自体の生体内役割はＴｈ１及びＣＴＬの活性
を長期間維持することであるが、これに対し、ＩＬ−１２ｐ４０の役割は生体内
拮抗物質として作用してＩＬ−１２ｐ７０を抑制することであるという事実を確
認した。

【０１３０】 ＜８−４＞免役化されたマウスの脾臓細胞における抗原−特異的ＣＤ８＋Ｔ細
胞の頻度分析 他の抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞頻度を確認するための限界希釈法(limiting
dilution assay:ＬＤＡ)によってＨＣＶ Ｅ２特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の溶血能
力を用いた抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を測定した(Kuzushima, K. et al
., Blood, 94:3094-3100, 1999)。即ち、ＤＮＡの追加接種が行われたマウスの
脾臓細胞を様々な濃度に限界希釈した後、Ｕ字底状の９６−ウェルプレートに希
釈当たり２０個ずつのウェルとなるようにした。ＣＴＬ免役反応観察での如くＥ
２を発現するＣＴ２６細胞をマイトマイシンＣ(mitomycin C, 500μｇ／ｍｌ)処
理によって細胞分裂を抑制させ、希釈された脾臓細胞とともに約５日間活性化さ
せた。ＣＴＬ頻度を測定するために、５日間活性化させた各ウェルの脾臓細胞の
１／３と⁵¹Ｃｒで標識されたターゲット細胞（５×１０³）を前記ウェルプレー
トの各ウェルに添加した後、６時間３７℃で培養した。これより上層液を回収し
て使用し、反応後得られる⁵¹Ｃｒの放出をγ−測定器(γ-counter, Wallac, Tur
ku, Finland)で測定することにより、ＣＴＬ免役反応を調査した。特定溶血の水
準が最小溶血の平均値とその標準偏差の３倍を加算した値を超過する場合、陽性
として見なしてＣＴＬの頻度を計算した(Kuzushima, K. et al., Blood, 94:309
4-3100, 1999)。

【０１３１】 限界希釈法によっても細胞内ＩＦＮ−γ染色法で得られた結果と類似の結果が
得られた。即ち、免役化初期にも突然変異ｍＩＬ−１２投与群から最も高い抗原
特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞頻度が観察されたが、このような頻度は追加接種１４週後
にも持続的に維持されることが分かった（表２参照）。

【０１３２】 ＜８−５＞突然変異ＩＬ−１２による防御的免役反応の増強分析 本発明の突然変異ＩＬ−１２遺伝子によって生体内で誘導されたＴｈ１及びＣ
ＴＬ免役反応を確認し、Ｔｈ１及びＣＴＬ免役反応と防御的免役反応との相関関
係を調査するためにｈｇｈＥ２ｔを発現する腫瘍細胞のＣＴ２６−ｈｇｈＥ２ｔ
を、ＤＮＡ追加接種してから１２週が経過したマウスに投与し、これから２週後
に血清より抗原特異的な全体ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ａ／Ｉ
ｇＧ１比率を決定したうえ、約３０日間腫瘍の大きさを測定した。具体的に、免
役化後１２週が経過した０.１μｌの無血清倍地内１×１０⁶ＣＴ２６−ｈｇｈＥ
２ｔ細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスの毛が剃られた背側に皮下注射した後、地域的腫
瘍成長(local tumor growth)を３日毎にキャリパー(calipers)用いて腫瘍の直径
と体積を測定することにより決定した。また、このマウスを約７０日間観察して
生存率を決定した。

【０１３３】 図８ａ、図８ｂ及び図８ｃに示すように、突然変異ｍＩＬ−１２で免役化され
たグループにおいて強力なＴｈ１免役反応が誘導された。また、野生型ｍＩＬ−
１２で免役化されたマウスのグループはｐＴＶ２−ｇＤｓＥ２ｔ単独で免役化さ
れたグループに比べて、遅延した腫瘍成長を示した。突然変異ｍＩＬ−１２で免
役化されたグループは相当遅延した腫瘍の成長を示し、対照群グループの大部分
のマウスが腫瘍をもっており、５０余日内に全て死んだが、突然変異ｍＩＬ−１
２グループでは７０余日まで約９０％のマウスが生きていた。このような結果は
本発明の突然変異ｍＩＬ−１２遺伝子によって誘導されたＨＣＶ Ｅ２−特異的
なＴｈ１及びＣＴＬ反応が変形された腫瘍細胞発現特異抗原のチャレンジに対す
る生体内防御を与えることを暗示する。生体内腫瘍防御に対するＴｈ１及びＣＴ
Ｌ反応の相対的な効果を評価することが容易でないとしても、これはＥ２−特異
的ＣＤ８＋ＣＴＬ及びＴｈ1細胞がＣＴ２６−ｈｇｈＥ２ｔ細胞を直接死滅させ
ることができ、試験管内Ｔｈ１及びＣＴＬ分析からそれぞれ観察されたようにＣ
ＴＬｓの作用を補助するものと判断される。また、大食細胞(marcrophages)及び
ナチュラルキラー細胞(natural killer cell)上のＦｃγＲに強く結合するＩｇ
Ｇ２ａ抗体が抗体−依存性細胞−媒介性細胞毒性(antibody-dependent cell med
iated cytitoxicity)を媒介する。

【０１３４】 〔発明の効果〕 以上説明したように、本発明は、活性型のインタロイキン−１２（ＩＬ−１２
）の競争的阻害剤として作用するヒトまたはマウスＩＬ−１２ｐ４０のＡｓｎ−
２２２（ヒト）またはＡｓｎ−２２０（マウス）アミノ酸に突然変異を誘発させ
ることにより、ＩＬ−１２ｐ４０の分泌は阻害し且つＩＬ−１２の免役活性を有
するＩＬ−１２ｐ７０の分泌は正常的に行われるようにしたＩＬ−１２ｐ４０突
然変異遺伝子を提供する。本発明のＩＬ−１２ｐ４０突然変異遺伝子はＤＮＡワ
クチンを用いた免役化に共に使用する場合、初期及び長期間にわたって最適の細
胞性免役反応を誘導することができるので、細胞性免役反応が必須不可欠なもの
と知られているＡＩＤＳ、Ｃ型及びＢ型肝炎、癌、インフルエンザ、結核、マラ
リアなどを予防及び治療するための遺伝子治療などに免役増強剤として使用でき
るという利点がある。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒトとマウスのＩＬ−１２ｐ４０アミノ酸序列の相同性を比較した図である。

【図２】 本発明で野生型ヒトＩＬ−１２のｐ４０小単位体とｐ３５小単位体、及び両小
単位体のＮ−糖鎖化可能部分を突然変異化させた誘導体の蛋白質構成を示す図で
ある。

【図３ａ】 本発明で野生型ヒトＩＬ−１２ｐ３５と糖鎖化部分突然変異に対して細胞破砕
物(cell lysate)で行った免疫ブロット(immunoblot)結果である。

【図３ｂ】 本発明で野生型ヒトＩＬ−１２ｐ４０と糖鎖化部分突然変異に対して細胞破砕
物で行った免疫ブロット結果である。

【図３ｃ】 本発明で野生型ヒトＩＬ−１２ｐ４０と糖鎖化部分突然変異に対して細胞培養
上澄液(supernatant)で行った免疫ブロット結果である。

【図４】 Ｃ型肝炎ウイルス(Hepatitis C Virus、ＨＣＶ)の外被糖蛋白質２(Envelope g
lycoprotein 2、Ｅ２)遺伝子とマウスＩＬ−１２の正常または変異遺伝子を挿入
させた本発明の発現ベクトルを示す図である。

【図５ａ】 本発明のＤＮＡベクトルで免疫化されたマウスの血清から時間別にＨＣＶ Ｅ
２に対する全体ＩｇＧ抗原力価を測定した結果である。 （ＧI：２００μｇの模造プラスミドｐＴＶ２で免疫化されたマウス、 ＧII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２
で免疫化されたマウス、 ＧIII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ
２−ｍＩＬ−１２ｗｔで免疫化されたマウス、 ＧIV：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔとｐＴＶ２−ｍＩＬ−１
２ｍｕｔで免疫化されたマウス。）

【図５ｂ】 本発明のＤＮＡベクトルで免疫化されたマウスの血清から時間別にＨＣＶ Ｅ
２に対するＩｇＧ１抗原力価を測定した結果である。 （ＧI：２００μｇの模造プラスミドｐＴＶ２で免疫化されたマウス、 ＧII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２
で免疫化されたマウス、 ＧIII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ
２−ｍＩＬ−１２ｗｔで免疫化されたマウス、 ＧIV：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔとｐＴＶ２−ｍＩＬ−１
２ｍｕｔで免疫化されたマウス。）

【図５ｃ】 本発明のＤＮＡベクトルで免疫化されたマウスの血清から時間別にＨＣＶ Ｅ
２に対するＩｇＧ２ａ抗原力価を測定した結果である。 （ＧI：２００μｇの模造プラスミドｐＴＶ２で免疫化されたマウス、 ＧII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２
で免疫化されたマウス、 ＧIII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ
２−ｍＩＬ−１２ｗｔで免疫化されたマウス、 ＧIV：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔとｐＴＶ２−ｍＩＬ−１
２ｍｕｔで免疫化されたマウス。）

【図５ｄ】 本発明のＤＮＡベクトルで免疫化されたマウスの血清から時間別にＨＣＶ Ｅ
２に対するＩｇＧ２ａ抗原力価とＩｇＧ１抗原力価の比率（ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ
１）を測定した結果である。 （ＧI：２００μｇの模造プラスミドｐＴＶ２で免疫化されたマウス、 ＧII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２
で免疫化されたマウス、 ＧIII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ
２−ｍＩＬ−１２ｗｔで免疫化されたマウス、 ＧIV：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔとｐＴＶ２−ｍＩＬ−１
２ｍｕｔで免疫化されたマウス。）

【図６ａ】 本発明のＤＮＡベクトルで免疫化し、３週後にマウスの脾臓からＨＣＶ Ｅ２
蛋白質によって刺激を受けて脾臓の免疫細胞で生成されるＩＦ−Ｎ−γの生産水
準を測定した結果である。 （ＧI：２００μｇの模造プラスミドｐＴＶ２で免疫化されたマウス、 ＧII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２
で免疫化されたマウス、 ＧIII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ
２−ｍＩＬ−１２ｗｔで免疫化されたマウス、 ＧIV：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔとｐＴＶ２−ｍＩＬ−１
２ｍｕｔで免疫化されたマウス。）

【図６ｂ】 本発明のＤＮＡベクトルで免疫化し、６週後にマウスの脾臓からＨＣＶ Ｅ２
蛋白質によって刺激を受けて脾臓の免疫細胞で生成されるＩＦ−Ｎ−γの生産水
準を測定した結果である。 （ＧI：２００μｇの模造プラスミドｐＴＶ２で免疫化されたマウス、 ＧII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２
で免疫化されたマウス、 ＧIII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ
２−ｍＩＬ−１２ｗｔで免疫化されたマウス、 ＧIV：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔとｐＴＶ２−ｍＩＬ−１
２ｍｕｔで免疫化されたマウス。）

【図６ｃ】 本発明のＤＮＡベクトルで免疫化し、１０週後にマウスの脾臓からＨＣＶ Ｅ
２蛋白質によって刺激を受けて脾臓の免疫細胞で生成されるＩＦＮ−γの生産水
準を測定した結果である。 （ＧI：２００μｇの模造プラスミドｐＴＶ２で免疫化されたマウス、 ＧII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２
で免疫化されたマウス、 ＧIII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ
２−ｍＩＬ−１２ｗｔで免疫化されたマウス、 ＧIV：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔとｐＴＶ２−ｍＩＬ−１
２ｍｕｔで免疫化されたマウス。）

【図７】 本発明のＤＮＡベクトルで免疫化されたマウスの脾臓から、免疫化した後多様
な時期にｈｇｈＥ２ｔを発現する変形されたＣＴ２６腫瘍細胞を用いてＨＣＶ
Ｅ２に特異的なＣＴＬ反応を測定した結果である。 （ＧI：２００μｇの模造プラスミドｐＴＶ２で免疫化されたマウス、 ＧII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２
で免疫化されたマウス、 ＧIII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ
２−ｍＩＬ−１２ｗｔで免疫化されたマウス、 ＧIV：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔとｐＴＶ２−ｍＩＬ−１
２ｍｕｔで免疫化されたマウス、 ａ：免疫化直後（０週目）、 ｂ：免疫化後３週経過、 ｃ：免疫化後６週経過、 ｄ：免疫化後１０週経過、 ｅ：免疫化後１４週経過、 ｆ：免疫化後１４週経過時、対照群（ＣＴ２６−ｎｅｏ細胞）。）

【図８】 図８ａは、本発明のＤＮＡベクトルで免疫化されたマウスに、ｈｇｈＥ２ｔを
発現する変形されたＣＴ２６腫瘍細胞を注入し、２週後にマウスの血清からＨＣ
Ｖ Ｅ２に対する全体ＩｇＧ抗原とその亜系列ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの水準を
測定した結果である。 （ＧI：２００μｇの模造プラスミドｐＴＶ２で免疫化されたマウス、 ＧII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２
で免疫化されたマウス、 ＧIII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ
２−ｍＩＬ−１２ｗｔで免疫化されたマウス、 ＧIV：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔとｐＴＶ２−ｍＩＬ−１
２ｍｕｔで免疫化されたマウス。） 図８ｂは、本発明のＤＮＡベクトルで免疫化されたマウスにｈｇｈＥ２ｔを発
現する変形されたＣＴ２６腫瘍細胞を注入し、２週後にマウスの血清からＨＣＶ Ｅ２に対するＩｇＧ２ａ抗原力価とＩｇＧ１抗原力価の比率（ＩｇＧ２ａ／Ｉ
ｇＧ１）を測定した結果である。 （ＧI：２００μｇの模造プラスミドｐＴＶ２で免疫化されたマウス、 ＧII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２
で免疫化されたマウス、 ＧIII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ
２−ｍＩＬ−１２ｗｔで免疫化されたマウス、 ＧIV：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔとｐＴＶ２−ｍＩＬ−１
２ｍｕｔで免疫化されたマウス。） 図８ｃは、本発明のＤＮＡベクトルで免疫化されたマウスにｈｇｈＥ２ｔを発
現する変形されたＣＴ２６腫瘍細胞を注入した後、腫瘍の体積変化を測定した結
果である。 （ＧI：２００μｇの模造プラスミドｐＴＶ２で免疫化されたマウス、 ＧII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２
で免疫化されたマウス、 ＧIII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ
２−ｍＩＬ−１２ｗｔで免疫化されたマウス、 ＧIV：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔとｐＴＶ２−ｍＩＬ−１
２ｍｕｔで免疫化されたマウス。） 図８ｄは、本発明のＤＮＡベクトルで免疫化されたマウスにｈｇｈＥ２ｔを発
現する変形されたＣＴ２６腫瘍細胞を注入した後、マウスの生存率を測定した結
果である。 （ＧI：２００μｇの模造プラスミドｐＴＶ２で免疫化されたマウス、 ＧII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ２
で免疫化されたマウス、 ＧIII：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔと１００μｇのｐＴＶ
２−ｍＩＬ−１２ｗｔで免疫化されたマウス、 ＧIV：１００μｇのｐＴＶ２−ＨＣＶ−ｇＤｓＥ２ｔとｐＴＶ２−ｍＩＬ−１
２ｍｕｔで免疫化されたマウス。）

【図９】 ＩＬ−１２の生体内生物学的機能を示す模式図である。 （▲：ｐ３５、○：ｐ４０、

【数２】 は（ｐ４０）₂、

【数３】 はＩＬ−１２（ｐ７０））

【配列表】

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年９月２１日（２００１．９．２１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図７】

【手続補正書】

【提出日】平成１４年９月１８日（２００２．９．１８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１３４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１３４】 〔発明の効果〕 以上説明したように、本発明は、活性型のインタロイキン−１２（ＩＬ−１２
）の競争的阻害剤として作用するヒトまたはマウスＩＬ−１２ｐ４０のＡｓｎ−
２２２（ヒト）またはＡｓｎ−２２０（マウス）アミノ酸に突然変異を誘発させ
ることにより、ＩＬ−１２ｐ４０の分泌は阻害し且つＩＬ−１２の免役活性を有
するＩＬ−１２ｐ７０の分泌は正常的に行われるようにしたＩＬ−１２ｐ４０突
然変異遺伝子を提供する。本発明のＩＬ−１２ｐ４０突然変異遺伝子はＤＮＡワ
クチンを用いた免役化に共に使用する場合、初期及び長期間にわたって最適の細
胞性免役反応を誘導することができるので、細胞性免役反応が必須不可欠なもの
と知られているＡＩＤＳ、Ｃ型及びＢ型肝炎、癌、インフルエンザ、結核、マラ
リアなどを予防及び治療するための遺伝子治療などに免役増強剤として使用でき
るという利点がある。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Pohang University of Science and Technology et al. <120> Genes of IL-12p40 subunit mutated for improving the activity of IL-12 and use thereof for DNA vaccine adjuvant <130> 1p-02-14 <150> KR 2000-13133 <151> 2000-03-15 <160> 23 <170> KopatentIn 1.55 <210> 1 <211> 1007 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 agcaagatgt gtcaccagca gttggtcatc tcttggtttt ccctggtttt tctggcatct 60 cccctcgtgg ccatatggga actgaagaaa gatgtttatg tcgtagaatt ggattggtat 120 ccggatgccc ctggagaaat ggtggtcctc acctgtgaca cccctgaaga agatggtatc 180 acctggacct tggaccagag cagtgaggtc ttaggctctg gcaaaaccct gaccatccaa 240 gtcaaagagt ttggagatgc tggccagtac acctgtcaca aaggaggcga ggttctaagc 300 cattcgctcc tgctgcttca caaaaaggaa gatggaattt ggtccactga tattttaaag 360 gaccagaaag aacccaaaaa taagaccttt ctaagatgcg aggccaagaa ttattctgga 420 cgtttcacct gctggtggct gacgacaatc agtactgatt tgacattcag tgtcaaaagc 480 agcagaggct cttctgaccc ccaaggggtg acgtgcggag ctgctacact ctctgcagag 540 agagtcagag gggacaacaa ggagtatgag tactcagtgg agtgccagga ggacagtgcc 600 tgcccagctg ctgaggagag tctgcccatt gaggtcatgg tggatgccgt tcacaagctc 660 aagtatgaaa actacaccag cagcttcttc atcagggaca tcatcaaacc tgacccaccc 720 aagaacttgc agctgaagcc attaaagaat tctcggcagg tggaggtcag ctgggagtac 780 cctgacacct ggagtactcc acattcctac ttctccctga cattctgcgt tcaggtccag 840 ggcaagagca agagagaaaa gaaagataga gtcttcacgg acaagacctc agccacggtc 900 atctgccgca aaaatgccag cattagcgtg cgggcccagg accgctacta tagctcatct 960 tggagcgaat gggcatctgt gccctgcagt taggttctga tccagga 1007 <210> 2 <211> 900 <212> DNA <213> mouse <400> 2 cccaaaagag tgacctttga atcatctgta cgcttgccta tgtctagctc agttcatgct 60 gctatcaatc catgagtaag gacctataag cataagagac gccctcaaaa cactatgact 120 tttattagtt attcacctcc ccagagctgt ccctggatac agacaacata ggtatgaggt 180 agggggtacg tggagccaaa caggaggtaa taccttctga atttagatgc taacaagaaa 240 acatggggaa aggtggccca gatacactag gccctttatt ctttgggcct gtaacaccta 300 cttatttgat tgtggcatga accatgaact cggtttgggg caagtccttc ctttttctgc 360 agtctgtgga atcgggagag gttagccatt gccgcctcta ttcaccttag gcatgatgta 420 aacagaaatt agtatctctg cctccttcct ttttccacac cccgaagtca tttcctctta 480 acctgggatt tcgacgtcta tattccctct gtatgataga tgcactcagg gaggcaaggg 540 ggggagggag gaacttctta aaattccccc agaatgtttt gacactagtt ttcagtgttg 600 caattgagac tagtcagttt ctactttggg tttccatcag aaagttctgt aggagtagag 660 tatataagca ccaggagcag ccaaggcagc agaaggaaca gtgggtgtcc aggcacatca 720 gaccaggcag ctcgcagcaa agcaaggtaa gttctctcct cttccctgtc gctaactccc 780 tgcatctaga ggctgtccag attcagactc caggggacag gctacccctg aaccaggcag 840 cgtgggagtg gggtaagtgg attctgggag catctcggat ggctttcccc gctggtggaa 900 900 <210> 3 <211> 328 <212> PRT <213> human IL-12p40-N222L <400> 3 Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu 1 5 10 15 Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu 35 40 45 Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln 50 55 60 Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys 65 70 75 80 Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val 85 90 95 Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp 100 105 110 Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe 115 120 125 Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp 130 135 140 Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg 145 150 155 160 Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser 165 170 175 Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu 180 185 190 Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile 195 200 205 Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Leu Tyr Thr 210 215 220 Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn 225 230 235 240 Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp 245 250 255 Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr 260 265 270 Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg 275 280 285 Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala 290 295 300 Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser 305 310 315 320 Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser 325 <210> 4 <211> 328 <212> PRT <213> human IL-12p40-N222Q <400> 4 Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu 1 5 10 15 Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu 35 40 45 Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln 50 55 60 Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys 65 70 75 80 Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val 85 90 95 Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp 100 105 110 Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe 115 120 125 Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp 130 135 140 Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg 145 150 155 160 Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser 165 170 175 Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu 180 185 190 Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile 195 200 205 Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Gln Tyr Thr 210 215 220 Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn 225 230 235 240 Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp 245 250 255 Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr 260 265 270 Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg 275 280 285 Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala 290 295 300 Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser 305 310 315 320 Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser 325 <210> 5 <211> 335 <212> PRT <213> mouse IL-12p40-N220L <400> 5 Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu 35 40 45 Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln 50 55 60 Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys 65 70 75 80 Glu Phe Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr 85 90 95 Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp 100 105 110 Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys 115 120 125 Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln 130 135 140 Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro 145 150 155 160 Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys 165 170 175 Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln 180 185 190 Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu 195 200 205 Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Leu Tyr Ser Thr Ser 210 215 220 Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln 225 230 235 240 Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro 245 250 255 Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val 260 265 270 Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys 275 280 285 Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln 290 295 300 Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn 305 310 315 320 Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser 325 330 335 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 primer <400> 6 gtacttaata cgactcacta tagg 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T3 primer <400> 7 gaagcattaa ccctcactaa aggg 24 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hp40-N125Q sense primer <400> 8 cccaaacaga aaacgtttct a 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hp40-N125Q antisense primer <400> 9 cgttttctgt ttgggttctt t 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hp40-N135Q sense primer <400> 10 gccaagcagt attctggacg t 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ho40-N135Q antisense primer <400> 11 agaatactgc ttggcctcgc a 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hp40-N222Q sense primer <400> 12 tatgaacagt acaccagcag c 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hp40-N222Q antisense primer <400> 13 ggtgtactgt tcatacttga g 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hp40-N303Q sense primer <400> 14 cgcaaacagg ccagcattag c 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hp40-N303Q antisense primer <400> 15 gctggcctgt ttgcggcaga t 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hp40-N127Q sense primer <400> 16 accaagcagg agagttgcct a 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hp40-N127Q antisense primer <400> 17 actctcctgc ttggttaatt c 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hp40-N141Q sense primer <400> 18 ataactcagg ggagttgcct g 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hp40-N141Q antisense primer <400> 19 actcccctga gttatgaaag a 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hp40-N251Q sense primer <400> 20 tatctgcagg cttcctaaaa a 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hp40-N251Q antisense primer <400> 21 ggaagcctgc agatagctca t 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mp40-N220L sense primer <400> 22 tatgagctct acagcaccag c 21
<210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mp40-N220L antisense primer <400> 23 gctgtagagc tcatattttt actg 24

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/21 Ａ６１Ｋ 39/29 39/29 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 31/14 Ａ６１Ｐ 31/14 31/16 31/16 31/18 31/18 31/20 31/20 33/06 33/06 35/00 35/00 37/04 37/04 39/04 39/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ソン，ヨン，チュル 大韓民国 790−310 キョンサンブク−ド ポハン−シ ナムーク デザム−ドン ヒョンデ−リードン アパートメント ＃101−601 (72)発明者 リー，ソン，ヒー 大韓民国 151−056 ソウル クァナック −ク ボンチョン ６ ドン 148−148 ソンイー マンション ＃ナ−101 (72)発明者 ハ，サング，ジュン 大韓民国 790−390 キョンサンブク−ド ポハン−シ ナム−ク ジゴック−ドン グリーン アパートメント ＃236−702 (72)発明者 ソン，マン，キ 大韓民国 790−390 キョンサンブク−ド ポハン−シ ナム−ク ジゴック−ドン デハクウォン アパートメント (72)発明者 チャン，ジュン 大韓民国 790−330 キョンサンブク−ド ポハン−シ ヒョジャ−ドン サン 31，ポハン ユニバーシティー オブ サ イエンス アンド テクノロジー デパー トメント オブ ライフ サイエンス内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 EA02 EA04 FA02 FA20 GA11 GA14 GA25 HA08 HA09 HA17 4C084 AA13 MA02 ZA75 ZB03 ZB09 ZB26 ZB33 ZB35 ZB38 ZC55 4C085 AA03 BA09 BA55 BA89 BA92 BB01 BB11

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトＩＬ−１２のｐ４０小単位体をコーディングする序列番号１の塩基序列を
   有する遺伝子において、ＩＬ−１２ｐ４０の分泌に必須的なＡｓｎ−２２２を暗
   号化するコドンが突然変異化されたｐ４０小単位体遺伝子。
2. 【請求項２】 マウスＩＬ−１２のｐ４０小単位体をコーディングする序列番号２の塩基序列
   を有する遺伝子において、ＩＬ−１２ｐ４０の分泌に必須的なＡｓｎ−２２０を
   暗号化するコドンが突然変異化されたｐ４０小単位体遺伝子。
3. 【請求項３】 突然変異化されたヒトｐ４０小単位体遺伝子は、自然型のＡｓｎ−２２２を暗
   号化するコドンが、Ｌｅｕ−２２２、Ｇｌｎ-２２２またはＩｌｅ−２２２を暗
   号化するコドンに置換されたことを特徴とする請求項１記載の遺伝子。
4. 【請求項４】 突然変異化されたマウスｐ４０小単位体遺伝子は、自然型のＡｓｎ−２２０を
   暗号化するコドンが、Ｌｅｕ−２２０またはＩｌｅ−２２０を暗号化するコドン
   に置換されたことを特徴とする請求項２記載の遺伝子。
5. 【請求項５】 請求項１の遺伝子とヒトＩＬ−１２ｐ３５小単位体をコーディングする遺伝子
   との間にＩＲＥＳ(Internal ribosome entry site)を含む遺伝子コンストラクト
   。
6. 【請求項６】 請求項２の遺伝子とマウスＩＬ−１２ｐ３５小単位体をコーディングする遺伝
   子との間にＩＲＥＳ(Internal ribosome entry site)を含む遺伝子コンストラク
   ト。
7. 【請求項７】 請求項５の遺伝子コンストラクトを含む発現ベクトル。
8. 【請求項８】 遺伝子コンストラクトはヒトのＩＬ−１２ｐ４０のＡｓｎ−２２２を暗号化す
   るコドンがＬｅｕ−２２２に突然変異化された遺伝子を含むことを特徴とする請
   求項７記載の発現ベクトルｐＧＸ０−ｈｐ３５／ＩＲＥＳ／ｈｐ４０−Ｎ２２２
   Ｌ（受託番号：ＫＣＴＣ ０９６９ＢＰ）。
9. 【請求項９】 遺伝子コンストラクトはヒトのＩＬ−１２ｐ４０のＡｓｎ−２２２を暗号化す
   るコドンがＬｅｕ−２２２に突然変異化された遺伝子を含むことを特徴とする請
   求項７記載の発現ベクトルｐＧＸ０−ｈｐ４０−Ｎ２２２Ｌ／ＩＲＥＳ／ｈｐ３
   ５（受託番号：ＫＣＴＣ ０９７０ＢＰ）。
10. 【請求項１０】 請求項６の遺伝子コンストラクトを含む発現ベクトル。
11. 【請求項１１】 遺伝子コンストラクトはマウスのＩＬ−１２ｐ４０のＡｓｎ−２２０を暗号化
    するコドンがＬｅｕ−２２０に突然変異化された遺伝子を含むことを特徴とする
    請求項１０記載の発現ベクトルｐＴＶ２−ｍｐ３５／ＩＲＥＳ／ｍｐ４０−Ｎ２
    ２０Ｌ（受託番号：ＫＣＴＣ ０７４５ＢＰ）。
12. 【請求項１２】 ｌＬ−１２ｐ４０の分泌に必須的なＡｓｎ−２２２（ヒト）またはＡｓｎ−２
    ２０（マウス）を暗号化するコドンが突然変異化されたヒトまたはマウスのＩＬ
    −１２のｐ４０小単位体遺伝子を有効成分とする、疾病の予防と治療のためのＤ
    ＮＡ免役化及び遺伝子治療用免役化増強剤。
13. 【請求項１３】 ＩＬ−１２のｐ４０小単位体遺伝子をＤＮＡワクチンと共に投与する際、ＣＴ
    Ｌ(cytotoxic T lymphocytes)細胞の加水分解能力を向上させることにより、免
    役反応を増進させることを特徴とする請求項１２記載の免役増強剤。
14. 【請求項１４】 ＩＬ−１２のｐ４０小単位体遺伝子をＤＮＡワクチンと共に投与する際、Ｔヘ
    ルパー(T helper)細胞のインターフェロン−γ(ＩＦＮ−γ)の分泌を増加させる
    ことにより免役反応を増進させることを特徴とする請求項１２記載の免役増強剤
    。
15. 【請求項１５】 ＩＬ−１２のｐ４０小単位体遺伝子をＤＮＡワクチンと共に投与する際、ＣＤ
    ８＋細胞のインターフェロン−γ(ＩＦＮ−γ)の分泌を増加させることにより免
    役反応を増進させることを特徴とする請求項１２記載の免役増強剤。
16. 【請求項１６】 疾病は癌、ＡＩＤＳ、Ｃ型及びＢ型肝炎、インフルエンザ、結核またはマラリ
    アであることを特徴とする請求項１２記載の免役増強剤。