JP2003520590A - コンドロモジュリンｉ関連ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、コンドロモジュリンＩに構造的に関連するポリペプチドをコードする新規ポリヌクレオチド、ならびにその精製タンパク質自体に関する。本発明はまた、このポリペプチドを産生するためのベクター、宿主細胞、抗体および組換え法に関する。本発明の１つの局面は、コンドロモジュリンＩ関連ペプチドを産生するプロセスであって、このポリペプチドを発現するのに適切な条件下で上記の宿主細胞を培養する工程、および必要に応じて、該培養物から該ポリペプチドを単離する工程を包含するプロセスである。さらに、本発明は、これらおよび関連産物について治療、診断および研究の有用性を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （関連出願） 本出願は、２０００年１１月２８日に出願された米国特許出願第０９／７２４
，３１０号および２０００年１月１９日に出願された米国特許仮出願第６０／１
７６，８９８による優先権を主張する。

【０００２】 （発明の分野） 本発明は、コンドロモジュリン−Ｉ（ＣｈＭＩｒｐと呼ばれる）に関連する新
規のポリペプチド、およびそのペプチドをコードする核酸分子に関する。本発明
はまた、ベクター、宿主細胞、選択結合因子（例えば、抗体）、およびＣｈＭＩ
ｒｐポリペプチドを産生する方法に関する。また、ＣｈＭＩｒｐと関連する障害
の診断および障害のための方法を含む、ＣｈＭＩｒｐの使用のための方法を提供
する。

【０００３】 （発明の背景） 核酸分子の同定、クローニング、発現および操作における技術の進歩は、ヒト
ゲノムの解読に基づいた新規の治療の発見を大いに加速した。急速な核酸配列決
定技術は、現在、空前の速度で配列情報を生じ得、そしてコンピューターを使用
した分析と結び付いて、ゲノム全体への重複配列の組立ておよびポリペプチドコ
ード領域の同定を可能にする。公知のアミノ酸配列のデータベースコンパイルに
対する推定アミノ酸配列の比較は、以前に同定された配列および／または構造の
顕著な特徴に対する相同性の程度を決定することを可能にする。核酸分子のポリ
ペプチドコード領域のクローニングおよび発現は、構造分析および機能分析のた
めのポリペプチド産物を提供する。改変体およびその誘導体を産生するための、
核酸分子およびコードされるポリペプチドの操作は、治療薬剤として使用するた
めの産物に対して有利な特性を与え得る。

【０００４】 過去１０年にわたるゲノム研究におけるかなりの技術進歩にかかわらず、ヒト
ゲノムに基づく新規の治療薬剤の開発能力は、まだ大部分実現されていない。潜
在的に有益なタンパク質治療薬剤をコードする多数の遺伝子、または治療分子に
ついて「標的」として作用し得るポリぺプチドをコードする遺伝子が、組換えＤ
ＮＡ技術を使用して同定されたが、哺乳動物のゲノムにおける多数の遺伝子の構
造および機能は、まだ未知である。

【０００５】 従って、本発明の目的は、診断または治療の利点を有する新規ポリペプチドお
よび新規ポリペプチドをコードする核酸分子を同定することである。

【０００６】 コンドロモジュリン−Ｉ（ＣｈＭ−Ｉ）は、ウサギの培養された成長板軟骨細
胞（ｇｒｏｗｔｈ ｐｌａｔｅ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）のＤＮＡ合成を刺激
する線維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２）の存在下において、胎仔ウシ軟骨抽
出物中のタンパク質成分として、最初に同定された。続いて、この成長刺激因子
を単離し、そしてアミノ酸配列を決定した。このアミノ酸配列に基づいて、縮重
プライマーを、ウシ遺伝子のフラグメントをクローニングするＰＣＲに使用した
。このＤＮＡフラグメントを使用して、ウシ骨端軟骨ｍＲＮＡ中の１．７ｋｂの
バンドを同定し、次いで、このＤＮＡフラグメントを使用して、ウシ骨端軟骨ｃ
ＤＮＡライブラリーからウシコンドロモジュリン−Ｉ遺伝子を単離した。Ｈｉｒ
ａｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．，１７５：９７
１−９７４，１９９９）。次いで、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびニワ
トリからのＣｈＭ−Ｉオーソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ）が単離された；ヒトお
よびウサギのオーソログの単離のために、それぞれ、Ｈｉｒａｋｉら、（Ｅｕｒ
．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６０：８６９−８７８，１９９９）および
ＳｈｕｋｕｎａｍｉおよびＨｉｒａｋｉ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ
ｅｓ．Ｃｏｍ．，２４９：８８５−８９０，１９９８）を参照のこと。ＣｈＭ−
Ｉが軟骨細胞によって発現されることが見出された（Ｈｉｒａｋｉら、Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６０：８６９−８７８，１９９９）。

【０００７】 ＣＨＯ細胞におけるヒトＣｈＭ−Ｉ遺伝子の発現は、分泌成熟タンパク質が軟
骨抽出物から単離されたポリペプチドよりも大きいことを明らかにした（Ｈｉｒ
ａｋｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６０：８６９−８７８，
１９９９）。このタンパク分解性プロセシングはまた、ＣｈＭ−Ｉウサギオルソ
ログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）がサルＣＯＳ細胞において発現された場合に実証され
た（ＳｈｕｋｕｎａｍｉおよびＨｉｒａｋｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ
．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．，２４９：８８５−８９０，１９９８）。成熟タンパク質お
よび前駆体タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントは、成熟タンパク質配列
が、前躯体形態に存在するＲＥＲＲアミノ酸配列の直後に始まることを明らかに
した。ＣｈＭ−Ｉ前駆体は、膜挿入に関与すると考えられる、そのアミノ末端の
近傍の単一の疎水性領域を含有する。ＲＥＲＲ配列は、成熟形態の分泌を生じる
タンパク分解性切断を媒介するプロセシングシグナルとして作用する。このプロ
セシングにより、タンパク質の大部分のアミノ末端部分が、軟骨細胞の細胞膜内
に挿入されたままになる。従って、これらの結果は、ＣｈＭ−Ｉがより大きな膜
貫通前駆体タンパク質として発現され、このタンパク質が、カルボキシ末端成熟
形態へと切断されてそして軟骨に沈着するということを示す（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２５９：１−７，１９９９
に概説される）。

【０００８】 ＣｈＭ−Ｉ ｍＲＮＡの発現は、胚を発生しているヒトおよびウシの軟骨にお
いてのみ検出されている。詳細には、高レベルの発現が、増殖している軟骨帯に
存在する軟骨細胞において検出され、より低いレベルは、隣接する休止帯および
上部過形成性帯に存在する軟骨細胞において検出された。識別可能な発現は、関
節帯および下部石灰化過形成性帯に存在する軟骨細胞において検出されなかった
。ＣｈＭ−Ｉポリペプチドは、増殖帯、休止帯および上部過形成帯の軟骨小腔周
囲間（ｉｎｔｅｒ−ｔｅｒｒｉｔｏｒｉａｌ）領域に局在化された（Ｈｉｒａｋ
ｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６０：８６９−８７８，１９
９９）。

【０００９】 ＣｈＭ−Ｉポリペプチドは、ＦＧＦ−２の存在下または非存在下で、ウサギ培
養成長プレートの軟骨細胞におけるＤＮＡおよびプロテオグリカン合成を刺激し
得る。ＣｈＭ−Ｉは、ウシ頸動脈内皮細胞における増殖および管形態発生を阻害
し（インビトロ）、そしてニワトリ絨毛尿膜アッセイ（インビボ）における毛細
血管形成を阻害する（Ｈｉｒａｋｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
，２６０：８６９−８７８，１９９９）。ＣｈＭ−Ｉポリペプチドは、ＦＧＦ−
２と相乗作用して、培養増殖プレート軟骨細胞の軟質寒天コロニー形成を誘導す
る（Ｉｎｏｕｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．，２４
１：３９５−４００，１９９９）。一次骨芽細胞およびＭＣ３Ｔ３−ｅ１骨芽細
胞様細胞は、ＣｈＭ−Ｉで刺激された場合に増殖する（Ｍｏｒｉら、ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ．，４０６：３１０−３１４，１９９９）。

【００１０】 従って、コンドロモジュリン（ｃｈｏｎｄｒｏｍｏｄｕｌｉｎ）−Ｉの同定は
、骨格成分の発達の媒介に関与するプロセス（骨成長、軟骨形成および軟骨血管
新生の阻害を含む）の良好な理解に至った。本明細書中に記載されるようなコン
ドロモジュリン−Ｉ関連遺伝子およびポリペプチドならびに他のコンドロモジュ
リン関連ポリペプチドの同定は、これらのプロセスの理解をさらに明確にし、そ
して骨格成分の分解および増加した血管新生に関与する病理学的状態のための治
療の開発を促進する。

【００１１】 （発明の要旨） 本発明は、新規なセリン／スレオニンキナーゼファミリーおよびその使用に関
する。より詳細には、本発明は、新規なＣｈＭＩｒｐ核酸分子およびコードされ
るポリペプチド、ならびにそれらの使用に関する。

【００１２】 本発明は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離された
核酸分子を提供する： （ａ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号２に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列； （ｃ）中程度または高度なストリンジェント条件下で、（ａ）または（ｂ）の
相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ここでこのコードされ
るポリペプチドが、配列番号２に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレ
オチド配列；および （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。

【００１３】 本発明はまた、以下の群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された
核酸分子を提供する： （ａ）配列番号２に示されるポリペプチドに対して少なくとも約７０％、約７
５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８
％、または約９９％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であ
り、ここで、このポリペプチドは、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡ
ＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、およびＳｍｉｔｈ−Ｗ
ａｔｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群より選択されるコンピュータープログラ
ムを用いて決定される様に、配列番号２に示されるコードされるポリペプチドの
活性を有する； （ｂ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列の対立遺伝子変異体またはスプ
ライスバリアントをコードするヌクレオチド配列であり、ここで、コードされる
ポリペプチドが、配列番号２に示されるコードされるポリペプチドの活性を有す
る； （ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードす
る、配列番号１のヌクレオチド配列、（ａ）、または（ｂ）であり、ここで、こ
のポリペプチドが、配列番号２に示されるコードされるポリペプチドの活性を有
する； （ｄ）配列番号１〜２のいずれかに示される１〜２５０アミノ酸残基の置換お
よび／または欠損を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、
ここで、コードされるポリペプチドが、配列番号２に示されるコードされるポリ
ペプチドの活性を有する； （ｅ）配列番号１のヌクレオチド配列、または少なくとも約１６ヌクレオチド
のフラグメントを含む（ａ）〜（ｄ）； （ｆ）穏やかなまたは高度にストリンジェントな条件下において（ａ）〜（ｅ
）のいずれかの相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ここで
、コードされるポリペプチドが、配列番号２に示されるコードされるポリペプチ
ドの活性を有する；ならびに （ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。

【００１４】 本発明は、以下の群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸
分子をさらに提供する： （ａ）少なくとも１つの保存的置換アミノ酸を有する、配列番号２に示される
ポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列であって、ここで、コードされる
ポリペプチドが、配列番号２に示されるポリペプチドの活性を有する； （ｂ）少なくとも１つの保存的挿入アミノ酸を有する、配列番号２に示される
ポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列であって、ここで、コードされる
ポリペプチドが、配列番号２に示されるポリペプチドの活性を有する； （ｃ）少なくとも１つの保存的欠損アミノ酸を有する、配列番号２に示される
ポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列であって、ここで、コードされる
ポリペプチドが、配列番号２に示されるポリペプチドの活性を有する； （ｄ）Ｃ末端および／またはＮ末端欠損を有する、配列番号２に示されるポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、コードされるポリペ
プチドが、配列番号２に示されるコードされるポリペプチドの活性を有する； （ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠損、Ｃ末端欠損、およびＮ末
端欠損からなる群から選択される、少なくとも１つの修飾を有する、配列番号２
に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、この
ポリペプチドが、配列番号２に示されるコードされるポリペプチドの活性を有す
る； （ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、（ａ）〜（ｅ）
のヌクレオチド配列； （ｇ）穏やかなまたは高度にストリンジェントな条件下において（ａ）〜（ｆ
）のいずれかの相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ここで
、コードされるポリペプチドが、配列番号２に示されるコードされるポリペプチ
ドの活性を有する；ならびに （ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。

【００１５】 本発明はまた、以下の群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリ
ペプチドを提供する： （ａ）残基１において成熟アミノ酸末端を含み、そしてさらにメチオニンアミ
ノ末端を任意に含む、配列番号２に示される成熟アミノ酸配列； （ｂ）配列番号２のオーソログに対するアミノ酸配列であり、ここで、このポ
リペプチドが、配列番号２に示されるポリペプチドの活性を有する； （ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、約７
５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８
％、または約９９％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であ
り、ここで、このポリペプチドは、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡ
ＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、およびＳｍｉｔｈ−Ｗ
ａｔｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群より選択されるコンピュータープログラ
ムを用いて決定される様に、配列番号２に示されるコードされるポリペプチドの
活性を有する； （ｄ）少なくとも約２５アミノ酸残基を含む、配列番号２に示されるアミノ酸
配列フラグメントであり、ここで、このポリペプチドが、配列番号２に示される
ポリペプチドの活性を有する； （ｅ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、または（ａ）〜（ｅ）の少なくとも
１つに示されるアミノ酸配列の、対立遺伝子変異体またはスプライスバリアント
のいずれかであるアミノ酸配列であり、ここで、このポリペプチドが、配列番号
２に示されるポリペプチドの活性を有する； 本発明は、以下の群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプ
チドをさらに提供する： （ａ）少なくとも１つの保存的置換アミノ酸を有する、配列番号２に示される
アミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドが、配列番号２に示されるポ
リペプチドの活性を有する； （ｂ）少なくとも１つの挿入アミノ酸を有する、配列番号２に示されるアミノ
酸配列であって、ここで、このポリペプチドが、配列番号２に示されるポリペプ
チドの活性を有する； （ｃ）少なくとも１つの欠損アミノ酸を有する、配列番号２に示されるアミノ
酸配列であって、ここで、このポリペプチドが、配列番号２に示されるポリペプ
チドの活性を有する； （ｄ）Ｃ末端および／またはＮ末端欠損を有する、配列番号２に示されるアミ
ノ酸配列であって、ここで、コードされるポリペプチドが、配列番号２に示され
るポリペプチドの活性を有する； （ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠損、Ｃ末端欠損、およびＮ末
端欠損からなる群から選択される、少なくとも１つの修飾を有する、配列番号２
に示されるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドが、配列番号２に
示されるポリペプチドの活性を有する； 前記パラグラフの（ａ）〜（ｅ）のポリペプチド配列を含む融合ポリペプチド
もまた提供される。

【００１６】 本発明はまた、本明細書中に示す単離された核酸分子を含む発現ベクター、本
明細書中に示す組換え核酸分子を含む組換え宿主細胞、ならびにこの宿主細胞を
培養する工程および必要に応じてこのように産生されたポリペプチドを単離する
工程を包含するＣｈＭＩｒｐポリペプチドを産生する方法を提供する。

【００１７】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドをコードする核酸分子を含むトランスジェニック非
ヒト動物もまた本発明によって包含される。ＣｈＭＩｒｐ核酸分子は、発現およ
び増加したレベルのＣｈＭＩｒｐポリペプチド（これは、増加した循環レベルを
含み得る）を可能にする様式で動物中に導入される。トランスジェニック非ヒト
動物は好ましくは、哺乳動物である。

【００１８】 本発明のＣｈＭＩｒｐポリペプチドの誘導体もまた提供される。

【００１９】 本発明中において、配列番号２のＣｈＭＩｒｐポリペプチドの保存的または非
保存的アミノ酸置換から生じる、ＣｈＭＩｒｐのアナログが提供される。このよ
うなアナログは、２７６位におけるアミノ酸が、システイン、セリン、またはア
ラニンからなる群から選択されるＣｈＭＩｒｐポリペプチドを含み、２８０位に
おけるアミノ酸が、システイン、セリン、またはアラニンからなる群から選択さ
れるＣｈＭＩｒｐポリペプチドを含み、２８１位におけるアミノ酸が、グルタミ
ン酸、またはアスパラギン酸からなる群から選択されるＣｈＭＩｒｐポリペプチ
ドを含み、２８５位におけるアミノ酸が、グリシン、プロリン、またはアラニン
からなる群から選択されるＣｈＭＩｒｐポリペプチドを含み、２９７位における
アミノ酸が、アルギニン、リジン、グルタミン、またはアスパラギンからなる群
から選択されるＣｈＭＩｒｐポリペプチドを含み、３００位におけるアミノ酸が
、システイン、セリン、またはアラニンからなる群から選択されるＣｈＭＩｒｐ
ポリペプチドを含み、３０６位におけるアミノ酸が、システイン、セリン、また
はアラニンからなる群から選択されるＣｈＭＩｒｐポリペプチドを含み、そして
３１０位におけるアミノ酸が、バリン、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、
フェニルアラニン、アラニン、またはノルロイシンからなる群から選択されるＣ
ｈＭＩｒｐポリペプチドを含む。

【００２０】 本発明のＣｈＭＩｒｐポリペプチドに特異的に結合する能力のある抗体および
ペプチドのような、選択的結合因子がさらに提供される。このような抗体および
ペプチドは、反発性または拮抗性であり得る。

【００２１】 本発明のヌクレオチド、ポリペプチドまたは選択的結合因子を含有する薬学的
組成物、および１つ以上の薬学的に受容可能な処方因子はまた、本発明によって
含まれる。この薬学的組成物は、本発明の治療学的に有効量のヌクレオチドまた
はポリペプチドを提供するために使用される。本発明はまた、ポリペプチド、核
酸分子および選択的結合因子を使用する方法に関する。本発明はまた、膜内でカ
プセル化されるＣｈＭＩｒｐポリペプチドを投与するためのデバイスを提供する
。

【００２２】 本発明のＣｈＭＩｒｐポリペプチドおよびこれらの生物学的に活性な変異体、
アナログ、相同体およびフラグメントを治療および／または診断目的で使用して
、異常なレベルのＣｈＭＩｒｐポリペプチドから生じる状態または病理学状態に
対する感受性を処置、予防および／または検出し得、この状態は、ｃｈｏｎｄｒ
ｏｍｏｄｕｌｉｎファミリーメンバーに対する宿主の過剰反応または骨格状態（
例えば、骨粗鬆症および矮化）において頻繁に観察されるようなこれらのタンパ
ク質によって制御される自己調節的な網様構造の欠乏、および脈管形成を含む病
理学状態（癌、炎症性疾患（例えば、乾癬および肝硬変）ならびに脈関疾患（例
えば、アテローム性動脈硬化症）、冠状動脈性心臓病および高血圧を含む）に関
与する。

【００２３】 本発明は、生物学的に活性なＣｈＭＩｒｐポリペプチドおよび／または１つ以
上のその生物学的に活性な変異体、フラグメント、相同体もしくは変異体、他の
薬学的因子を単独でかまたは組み合わせてのいずれかによって、哺乳動物に異常
なレベルのＣｈＭＩｒｐポリペプチドから生じる疾患の処置、予防または回復に
ついて提供する。本発明はまた、このような障害／疾患を診断する方法、あるい
はＣｈＭＩｒｐポリペプチドおよび／または抗体および／または体液におけるＣ
ｈＭＩｒｐ遺伝子の量および／または組織を用いることを含む、哺乳動物につい
てのこのような障害／疾患に対する感受性を提供する。本発明はまた、プローブ
として本発明の核酸分子を使用して、ＣｈＭＩｒｐ遺伝子の変異から生じる障害
／疾患を診断する方法を提供する。この動物は、好ましくは哺乳動物であり、さ
らに好ましくはヒトである。

【００２４】 本発明はまた、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの発現の際の分子の衝突を試験する
方法を提供する。発現および変調（つまり、増加するまたは減少する）レベルの
ＣｈＭＩｒｐポリペプチドはまた、本発明によって含まれる。１つの方法はイン
ビボで核酸分子を動物に投与する工程を包含する。別の方法において、ＣｈＭＩ
ｒｐポリペプチドの発現を調節する要素を含む核酸分子は動物に投与され得る。
これらの方法の例としては、遺伝子治療およびアンチセンス療法が挙げられる。

【００２５】 発現を調節し、そしてＣｈＭＩｒｐポリペプチドのレベルを変調する（つまり
、増加するまたは減少する）方法はまた、本発明によって含まれる。１つの方法
は、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドをコードする核酸分子を動物に投与する工程を包
含する。別の方法において、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの発現を調節または変調
する要素を含む核酸分子が投与され得る。これらの方法の例としては、本明細書
中にさらに記載されるように、遺伝子治療、細胞治療およびアンチセンス療法が
挙げられる。

【００２６】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドは、原発性ヒト腫瘍の広範囲においてかなり発現さ
れた。従って、存在するポリペプチドおよびその有用な核酸中間体は、バックグ
ラウンドから形質転換された細胞を分化する際の有用性を示している。

【００２７】 本発明の別の局面において、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドは、そのレセプターま
たは結合パートナー（「ＣｈＭＩｒｐレセプター」または「ＣｈＭＩｒｐ結合パ
ートナー」）を同定するために使用され得る。種々の形態の「発現クローニング
」は、タンパク質または補助因子に対するレセプターをクローン化するために広
範囲に使用されている。例えば、ＳｉｍｏｎｓｅｎおよびＬｏｄｉｓｈ、Ｔｒｅ
ｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１５：４
３７〜４４１、１９９４ならびにＴａｒｔａｇｌｉａら、Ｃｅｌｌ、８３：１２
６３〜１２７１、１９９５を参照のこと。ＣｈＭＩｒｐレセプターまたはＣｈＭ
Ｉｒｐ結合パートナーの単離は、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドシグナル伝達経路の
新規アゴニストおよびアンタゴニストの同定または開発に有用である。

【００２８】 本発明の他の局面において、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドは、その結合パートナ
ー（ＣｈＭＩｒｐレセプターまたは他のＣｈＭＩｒｐ補助因子のような「ＣｈＭ
Ｉｒｐ結合パートナー」）を同定するために使用され得る（Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：９５７８〜９５８３、１９
９１）。ＣｈＭＩｒｐ結合パートナーの単離は、ＣｈＭＩｒｐ活性化の新規アゴ
ニストおよびアンタゴニストの同定または開発に有用である。

【００２９】 このようなアゴニストおよびアンタゴニストとしては、可溶性ＣｈＭＩｒｐリ
ガンド、抗ｈ２５２０−１０９選択的結合因子（例えば、ＣｈＭＩｒｐ抗体およ
びその誘導体）、低分子、ペプチドもしくはＣｈＭＩｒｐポリペプチドを結合す
る能力のあるその誘導体、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられ、
これらのうちのいずれかは、１つ以上の疾患または障害（本明細書中に開示され
るものを含む）の処置に有用であり得る。

【００３０】 特定の実施形態において、ＣｈＭＩｒｐポリヌクレオチドアゴニストまたはア
ンタゴニストは、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、またはその活性化を
調整するようにＣｈＭＩｒｐポリペプチドと相互作用する低分子量の分子であり
得る。

【００３１】 （発明の詳細な説明） 本明細書中で使用される節の表題は、組織的な目的のみのためであり、そして
記載される内容を限定するようには解釈されるべきではない。本願において列挙
される全ての参考文献は、明確に本明細書中に参考として援用される。

【００３２】 （定義） 用語「ＣｈＭＩｒｐをコードする核酸分子」は核酸分子またはポリヌクレオチ
ドのことを呼び、これらは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含むかま
たは本質的にそれからなり、そして／または配列番号２に示されるポリヌクレオ
チドをコードするヌクレオチド配列を含むかまたは本質的にそれからなる。関連
した核酸分子は、配列番号１に示されるとおりのヌクレオチド配列に対して約７
０パーセント同一であるヌクレオチド配列を含むかもしくは本質的にこれからな
るか、または配列番号２に示すとおりのポリペプチドに対しても約７５パーセン
ト同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかもしくは本質
的にこれからなる。好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に
示されるとおりのヌクレオチド配列に対して約７５パーセント、もしくは約８０
パーセント、もしくは約９０パーセント、もしくは約９５、９６、９７、９８、
もしくは９９パーセント同一であるか、またはヌクレオチド配列は、配列番号２
に示されるとおりのポリペプチド配列に対して約７５パーセント、もしくは約８
０パーセント、もしくは約８５パーセント、もしくは約９０パーセント、もしく
は約９５、９６、９７、９８、もしくは９９パーセント同一であるポリペプチド
をコードする。関連した核酸分子は、配列番号２に示されるポリペプチドの少な
くとも１つの活性を保有するポリペプチドをコードする。

【００３３】 関連する核酸分子はまた、上記のＣｈＭＩｒｐ核酸分子のフラグメントを含み
、このフラグメントは、少なくとも約１０の連続するヌクレオチド、もしくは約
１５、もしくは約２０、もしくは約２５、または約５０、もしくは約７５、もし
くは約１００、もしくは約１００より大きい連続するヌクレオチドである。関連
する核酸分子はまた、上記のＣｈＭＩｒｐ核酸分子のフラグメントを含み、この
フラグメントは、少なくとも約２５のアミノ酸残基、または約５０、もしくは約
７５、もしくは約１００、もしくは約１００より大きいアミノ酸残基のポリペプ
チドをコードする。関連する核酸分子はまた、配列番号２のポリペプチドに比較
して、１〜３１７アミノ酸残基の置換および／または欠失を含むか、または本質
的にこれから構成されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。関
連するＦｈｍリガンド核酸分子は、本明細書に規定される中程度または高度にス
トリンジェントな条件下で、任意の上記の核酸分子とハイブリダイズするヌクレ
オチド配列を含むような分子を含む。好ましい実施形態では、関連する核酸分子
は、中程度もしくは高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１に示される
配列と、またはポリペプチド（このポリペプチドは、配列番号２に示されるアミ
ノ酸配列を含む）をコードする分子と、または上記の核酸フラグメントと、また
は上記に規定されるポリペプチドをコードする核酸フラグメントと、ハイブリダ
イズする配列を含む。関連する核酸分子が上記の核酸のいずれかの対立遺伝子改
変体またはスプライス改変体を含むこと、そして上記のヌクレオチド配列のいず
れかに相補的な配列を含むことがまた理解される。

【００３４】 用語「単離された核酸分子」とは、（１）総ＤＮＡが供給源細胞から単離され
る場合に、これが天然で一緒に見出されるタンパク質、脂質、炭水化物、または
他の物質のうち少なくとも約５０パーセントから分離された本発明の核酸分子、
（２）「単離された核酸分子」が天然で連結しているポリヌクレオチドの全てま
たは一部に連結していない本発明の核酸分子、（３）天然では連結しないポリヌ
クレオチドに作動可能に連結した本発明の核酸分子、または（４）より大きなポ
リヌクレオチド配列の一部として、天然には存在しない本発明の核酸分子をいう
。好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、任意の他の混入核酸分子、また
はその天然の環境において見出される他の混入物（これらは、ポリペプチド産生
における使用、または治療的使用、診断的使用、予防的使用、または研究的使用
を妨げる）を実質的に含まない。

【００３５】 本明細書中で使用される場合、用語「核酸」配列または核酸分子は、ＤＮＡま
たはＲＮＡ配列をいう。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログ
のいずれかから形成される分子を含み、例えば、以下であるがこれらに限定され
ない：４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジ
リジニルシトシン、プソイドイソシトシン（ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎ
ｅ）、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル
、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル
、５−カルボキシ−メチルアミノ−メチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシ
ン、Ｎ６−イソ−ペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイ
ドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチル−グ
アニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−
メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミ
ノメチルウラシル、５−メトキシアミノ−メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−
マンノシルキューオシン（β−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’
−メトキシカルボニル−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチ
オ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル
、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン（ｏｘｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎ
ｅ）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−
チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ
−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソ
イドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリ
ン。

【００３６】 用語「作動可能に連結された」は、隣接配列の配置方法をいうために本明細書
中に使用される。ここで、このように記載される隣接配列は、その有用な機能を
実行するように構成されるかまたは組立てられる。従って、コード配列に作動可
能に連結された隣接配列は、コード配列の複製、転写および／または翻訳をもた
らし得る。例えば、プロモーターがコード配列の転写を指向し得る場合、このコ
ード配列は、このプロモーターに作動可能に連結される。隣接配列は、正確に機
能する限り、コード配列と連続している必要はない。従って、例えば、翻訳され
ないが転写される介在配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得
、そして、このプロモーター配列はなお、このコード配列に「作動可能に連結さ
れた」とみなされ得る。

【００３７】 用語「ＣｈＭＩｒｐポリペプチド対立遺伝子改変体」とは、生物体または生物
体の集団の染色体上の所定の遺伝子座を占める、いくつかの可能性のある天然に
存在する別の形態の遺伝子の１つをいう。

【００３８】 用語「ＣｈＭＩｒｐポリペプチドスプライス改変体」とは、核酸分子（通常Ｒ
ＮＡ）をいう。この核酸分子は、ＲＮＡ転写物中のイントロン配列の選択的プロ
セシングによって生成される。

【００３９】 用語「発現ベクター」は、宿主細胞の形質転換に適切であり、そして挿入され
た異種核酸配列の発現を、指示および／または制御する核酸配列を含むベクター
をいう。発現としては、転写、翻訳、およびＲＮＡスプライシング（イントロン
が存在する場合）のようなプロセスが挙げられるがこれらに限定されない。

【００４０】 用語「ベクター」は、宿主細胞にコード情報を移すために使用される任意の分
子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）をいうために使用される。

【００４１】 本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」とは、細胞の遺伝的特徴にお
ける変化をいい、そして細胞は、新しいＤＮＡを含有するように改変された場合
に形質転換される。例えば、細胞は、それがそのネイティブな状態から遺伝的に
改変される場合に形質転換される。トランスフェクションまたは形質導入に続い
て、ＤＮＡの形質転換は、物理的に細胞の染色体に組み込むことにより細胞のＤ
ＮＡと組換わり得るか、複製されることなしにエピソームエレメントとして一過
的に維持され得るか、またはプラスミドとして独立的に複製し得る。ＤＮＡが細
胞分裂と共に複製される場合に、細胞は、安定に形質転換されたとみなされる。

【００４２】 用語「トランスフェクション」は、細胞による異種または外因性ＤＮＡの取り
込みをいうために使用され、そして細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入され
た場合には「トランスフェクト」されている。多数のトランスフェクション技術
は、当該分野で周知であり、そして本明細書中に開示される。例えば、Ｇｒａｈ
ａｍら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６，１９７３；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ，１９８９）；Ｄａｖｉｓら，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８６；およびＣｈｕら，
Ｇｅｎｅ １３：１９７，１９８１を参照のこと。このような技術を使用して、
１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入し得る。

【００４３】 用語「形質導入」とは、通常はファージによる１つの細菌から別の細菌への遺
伝子の移入をいうために使用される。「形質導入」はまた、レトロウイルスによ
る真核生物細胞配列の獲得および移入をいう。

【００４４】 用語「宿主細胞」は、目的の選択された遺伝子を含むベクターによって、核酸
配列で形質転換されたか、または形質転換され得、次いでそのベクターはこの細
胞によって発現される、細胞をいうために使用される。この用語には、選択され
た遺伝子が存在する限り、子孫が形態学または遺伝子構造において本来の親と同
一であろうとなかろうと、親細胞の子孫を含む。

【００４５】 用語「ベクター」は、宿主細胞にコード情報を移すために使用される任意の分
子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）をいうために使用される。

【００４６】 用語「高度にストリンジェントな条件」とは、配列が非常に相補的であるＤＮ
Ａ鎖のハイブリダイゼーションを許容し、かつ顕著に不一致のＤＮＡのハイブリ
ダイゼーションを排除するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーショ
ンのストリンジェンシーは、温度、イオン強度および変性剤（例えば、ホルムア
ミド）の濃度によって主に決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄につ
いての「高度にストリンジェントな条件」の例は、６５〜６８℃での０．０１５
Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、または４２℃での０．
０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび５０％ホル
ムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．１９８９）；Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ 第４章、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒ
ｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。

【００４７】 よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、
より高いホルムアミドまたは他の変性剤）もまた用いられ得るが、ハイブリダイ
ゼーションの速度が影響される。他の薬剤は、非特異的および／またはバックグ
ラウンドのハイブリダイゼーションを減少させる目的のために、ハイブリダイゼ
ーションおよび洗浄の緩衝液中に含まれ得る。例は、０．１％ウシ血清アルブミ
ン、０．１％ポリビニル−ピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１
％ドデシル硫酸ナトリウム、ＮａＤｏｄＳＯ_４、（ＳＤＳ）、フィコール（ｆｉ
ｃｏｌｌ）、デンハルト溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非
相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた用いら
れ得る。これらの添加剤の濃度および種類は、ハイブリダイゼーション条件のス
トリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイ
ゼーション実験は通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施される。しかし、代表的なイ
オン強度の条件では、ハイブリダイゼーションの速度は、ｐＨからほぼ独立する
。Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏ
ｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ
Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。

【００４８】 ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基組成、長さおよび塩
基対の不一致程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、これらの変動
要因を適応させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するの
を可能にするために当業者によって調整され得る。完全に一致したＤＮＡ二重鎖
の融解温度は、以下の方程式によって評価され得る： Ｔ_ｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃ％
）−６００／Ｎ−０．７２（ホルムアミド％） ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼ
ーション溶液または洗浄溶液中でのナトリウムイオンのモル濃度であり、Ｇ＋Ｃ
％は、ハイブリッド中での（グアニン＋シトシン）塩基の百分率である。不完全
に一致したハイブリッドについては、融解温度を、１％の不一致毎に約１℃低下
する。

【００４９】 用語「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな
条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が形成
され得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、５
０〜６５℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウ
ムまたは３７〜５０℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン
酸ナトリウムおよび２０％ホルムアミドである。例示として、０．０１５Ｍナト
リウムイオン中での５０℃という「中程度にストリンジェントな条件」は、約２
１％の不一致を可能にする。

【００５０】 「高度に」ストリンジェントな条件と「中程度に」ストリンジェントな条件と
の間に絶対的な区別が存在しないことが当業者によって認識される。例えば、０
．０１５Ｍナトリウムイオン（ホルムアミドなし）では、完全に一致した長さの
ＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃で（同じイオン強度で）の洗浄を
用いると、このことは、約６％の不一致を可能にする。より遠く関連した配列を
捕獲するために、当業者は、単純に、温度を低くし得るかまたはイオン強度を高
くし得る。

【００５１】 約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについての１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ^＊中での融解温度の良好な評価は、以下によって与えられる： Ｔｍ＝Ａ−Ｔ塩基対あたり２℃ ＋ Ｇ−Ｃ塩基対あたり４℃^＊ ６×塩クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのナトリウムイオン濃度は、１Ｍで
ある。Ｓｕｇｇｓら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｓｉｎ
ｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅｓ ６８３頁，ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）
（１９８１）を参照のこと。

【００５２】 オリゴヌクレオチドについての高度ストリンジェンシー洗浄条件は通常、６×
ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中でのそのオリゴヌクレオチドのＴｍよりも０℃〜５
℃低い温度においてである。

【００５３】 用語「ＣｈＭＩｒｐポリペプチド」とは、配列番号２のアミノ酸配列を含むポ
リペプチド、および本明細書に記載される関連ポリペプチドをいう。関連ポリペ
プチドとしては、以下が挙げられる：ＣｈＭＩｒｐポリペプチド対立遺伝子改変
体、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドアナログ、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドスプライス
改変体、ＣｈＭＩｒｐポリペプチド改変体、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドフラグメ
ント、ＣｈＭＩｒｐポリペプチド誘導体、置換改変体、欠失改変体、および／ま
たは挿入改変体、ＣｈＭＩｒｐ融合ポリペプチド、ならびにＣｈＭＩｒｐポリペ
プチドオルソログ。

【００５４】 用語「ＣｈＭＩｒｐポリペプチドアナログ」とは、保存アミノ酸置換および非
保存アミノ酸置換を有する配列番号２に示されるＣｈＭＩｒｐアミノ酸配列に対
して類似のアミノ酸配列を有する関連ポリペプチドをいう。

【００５５】 用語「ＣｈＭＩｒｐポリペプチドオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」は、配列
番号２に示されるＣｈＭＩｒｐポリペプチドアミノ酸配列に対応する、別の種由
来のポリペプチドをいう。例えば、マウスおよびヒトのＣｈＭＩｒｐポリペプチ
ドは、互いにオルソログであるとみなされる。

【００５６】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドは、本明細書において定義されるように、成熟ポリ
ペプチドであり得、これらのポリペプチドを調製する方法に依存して、アミノ末
端のメチオニン残基を有してもよいし、有しなくてもよい。用語「ＣｈＭＩｒｐ
ポリペプチドフラグメント」とは、配列番号２に示されるようなＣｈＭＩｒｐポ
リペプチドの全長アミノ酸配列よりも少なく含むペプチドまたはポリペプチドを
いう。このようなフラグメントは、例えば、アミノ末端での短縮化（ｔｒｕｎｃ
ａｔｉｏｎ）、カルボキシ末端での短縮化、および／またはアミノ酸配列の内部
欠失によって生じる。ＣｈＭＩｒｐフラグメントは、選択的ＲＮＡスプライシン
グによってかまたはインビボでのプロテアーゼ活性によって生じ得る。

【００５７】 用語「ＣｈＭＩｒｐポリペプチドフラグメント」とは、配列番号２に示される
ようなＣｈＭＩｒｐポリペプチドの全長アミノ酸配列よりも少なく含むポリペプ
チドをいう。このようなＣｈＭＩｒｐフラグメントは、６個以上のアミノ酸長で
あり得、そして例えば、アミノ末端（リーダー配列を有するかまたは有さない）
での短縮化、カルボキシル末端での短縮化および／またはアミノ酸配列からの１
個以上の残基の内部欠失によって生じ得る。ＣｈＭＩｒｐフラグメントは、選択
的ＲＮＡスプライシングによってかまたはインビボでのプロテアーゼ活性によっ
て生じ得る。ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの膜結合形態はまた、本発明によって意
図される。好ましい実施形態において、短縮化および／または欠失は、約１０ア
ミノ酸、または約２０アミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸
、または約１００アミノ酸、または約１００より多くのアミノ酸を含む。このよ
うに生成されるポリペプチドフラグメントは、約２５個連続したアミノ酸、また
は約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約
１５０アミノ酸、または約２００アミノ酸を含む。このようなＣｈＭＩｒｐポリ
ペプチドフラグメントは、必要に応じて、アミノ末端メチオニン残基を含み得る
。このようなフラグメントは、例えば、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドに対する抗体
を生成するために使用され得ることが理解される。

【００５８】 用語「ＣｈＭＩｒｐポリペプチド改変体」は、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドアミ
ノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列の置換、欠失、および／または付
加を有するアミノ酸配列を含むＣｈＭＩｒｐポリペプチドをいう。改変体は、天
然に存在するか、または、組換えＤＮＡ技術を用いて人工的に構築され得る。こ
のようなＣｈＭＩｒｐポリペプチド改変体は、この改変体をコードする対応する
核酸分子から調製され得る。従って、この改変体は、配列番号１に示されるよう
な野生型ＣｈＭＩｒｐポリペプチドについてのＤＮＡ配列から改変されるＤＮＡ
配列を有する。

【００５９】 当業者は、ネイティブ（ｎａｔｉｖｅ）ポリペプチドの適切な改変体を、周知
の技術を使用して、決定し得る。例えば、当業者は、生物学的活性を破壊するこ
となく変化され得る分子の適切な領域を予測し得る。当業者はまた、活性のため
にかまたは構造のために重要であり得る領域が、生物学的活性を破壊することが
ないかまたはポリペプチドの構造に悪影響を及ぼすことのない保存的なアミノ酸
置換を前提とし得ることさえ認識する。

【００６０】 活性を破壊することなく変化され得る分子の適切な領域を予測するために、当
業者は、活性のために重要であるとは考えられない領域を標的化し得る。例えば
、同じ種由来かまたは他の種由来の、類似の活性を有する類似のポリペプチドが
既知である場合には、当業者は、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドのアミノ酸配列を、
このような類似のポリペプチドと比較し得る。このような比較を用いて、類似の
ポリペプチド間で保存される分子の残基および部分を決定し得る。当業者には、
保存されていないＣｈＭＩｒｐ分子の領域における変化が、ＣｈＭＩｒｐポリペ
プチドの生物学的活性および／または構造にさほど不利に影響を与えるようでは
ないことが公知である。当業者にはまた、比較的保存された領域においてさえ、
化学的に類似のアミノ酸で、活性を維持ながら天然に存在する残基に代えて置換
し得ることが公知である（保存的アミノ酸残基置換）。

【００６１】 さらに、当業者は、活性または構造のために重要である、類似のポリペプチド
における残基を同定する、構造−機能研究を再調査し得る。このような比較の観
点において、類似のポリペプチドにおける活性または構造のために重要なアミノ
酸残基に対応するＣｈＭＩｒｐポリペプチドにおける、アミノ酸残基の重要性を
予測し得る。当業者は、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドのこのような予測された重要
なアミノ酸残基に代わる化学的に類似のアミノ酸置換を、選択し得る。

【００６２】 可能な場合、当業者はまた、類似のポリペプチドにおける三次元構造およびそ
の構造に関連するアミノ酸配列を分析し得る。このような情報の観点において、
当業者は、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドのアミノ酸残基のアライメントを、その三
次元構造に関して予測し得る。当業者は、そのタンパク質の表面上に存在すると
予測されるアミノ酸残基に対する急激な変化を起こさないように、選択し得る。
なぜなら、このような残基は、他の分子との重要な相互作用に関与し得るからで
ある。

【００６３】 本発明のＣｈＭＩｒｐポリペプチドアナログは、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの
アミノ酸配列を関連ファミリーのメンバーと比較することによって決定され得る
。具体的なＣｈＭＩｒｐポリペプチド関連ファミリーメンバーとしては、以下が
挙げられるがこれらに限定されない：ヒトコンドロモデュリン（ｃｈｏｎｄｒｏ
ｍｏｄｕｌｉｎ）Ｉ、マウスＣｈＭＩｒｐ、マウスコンドロモデュリンＩ、ラッ
トコンドロモデュリンＩ、ウシコンドロモデュリンＩ、ウサギコンドロモデュリ
ンＩ。この比較は、Ｐｉｌｅｕｐアライメント（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＧＣＧ
Ｐｒｏｇｒａｍ Ｐａｃｋａｇｅ）または保存領域および非保存領域内の複数フ
ァミリーメンバーとの等価（重複）比較を用いることによって達成され得る。

【００６４】 図４で示されたように、ヒトＣｈＭＩｒｐポリペプチド（配列番号２）の推定
アミノ酸配列はマウスＣｈＭＩｒｐ、マウスコンドロモジュリン Ｉ、ラットコ
ンドロモジュリン Ｉ、ウシコンドロモジュリン Ｉ、ヒトコンドロモジュリン
Ｉ、ウサギコンドロモジュリン Ｉ（配列番号４〜９）と整列される。他のＣ
ｈＭＩｒｐポリペプチドアナログは、これらの、または他の当業者に周知の方法
を用いて、決定され得る。これらの重複配列は、さらなるＣｈＭＩｒｐアナログ
を生じる保存的および非保存的なアミノ酸置換についてガイダンスを提供する。
これらはのアミノ酸置換は、天然に存在するまたは非天然であるアミノ酸からな
ると理解される。例えば、図４で示したように、これらの関連ポリペプチドの整
列は、潜在的なＣｈＭＩｒｐアナログが、配列番号２における第２７６番目の位
置（図４では第２９６番目の位置）でＳｅｒまたはＡｌａ残基と置換されたＣｙ
ｓ残基、配列番号２における第２８０番目（図４では第３００番目の位置）の位
置でＳｅｒまたはＡｌａ残基と置換されたＣｙｓ残基を有し得ること、または、
配列番号２において第２８１番目の位置のグルタミン酸残基（図４では、第３０
１番目の位置）がＡｓｐ残基で置換され得ることを示す。さらに、配列番号２に
おいて第２８５番目の位置にあるグリシン残基（図４では、第３０５番目の位置
）が、ＰｒｏおよびＡｌａで置換され得、配列番号２において第２９７番目の位
置にあるＡｒｇ残基（図４においては、第３１７番目の位置）が、Ｌｙｓ、Ｇｌ
ｎ、またはＡｓｎ残基で置換され得、配列番号２において第３００番目の位置に
あるＣｙｓ残基（図４では、第３２０番目の位置）がＳｅｒまたはＡｌａ残基で
置換され得、、配列番号２において第３０６番目の位置にあるＣｙｓ残基（図４
では、第３２６番目の位置）は、ＳｅｒまたはＡｌａ残基で置換され得、そして
、配列番号２において第３１０番目の位置にあるＶａｌ残基（図４では、第３３
０番目）がＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、ノルロイシンで置換され
得る。

【００６５】 さらに、当業者は、各アミノ酸残基において唯一つのアミノ酸置換を含む試験
変異体を生成し得る。変異体は、本明細書中に記載の活性アッセイを使用してス
クリーニングされ得る。このような変異体を使用して、適切な変異体の情報を集
め得る。例えば、破壊された変異体、所望しない還元がなされた変異体、または
不適切な活性の変異体に生じる特定のアミノ酸に対する変化が発見された場合、
このような変化を有する変異体は回避される。換言すると、このような慣習的な
実験によって収集された情報に基いて、当業者は、さらなる単独または他の変異
の組み合わせのいずれかで置換が避けられるべきアミノ酸を容易に決定し得る。

【００６６】 同等の性質において、このような変化を行う際に、アミノ酸のヒドロパシー指
数（疎水性親水性指標）が考慮され得る。各アミノ酸は、その疎水性および電荷
特性に基づいて、ヒドロパシー指数を割り当てられている。疎水性親水性指標は
、以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋
３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）
；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；ス
レオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チ
ロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタ
ミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；
アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５
）。

【００６７】 タンパク質に対する相互作用的な生物学的機能を確認する際の、疎水性親水性
アミノ酸指数の重要性は、当該分野において一般的に理解されている（Ｋｙｔｅ
ら、１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−３１）。特定のアミノ
酸が類似の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸の代わりに使用
され得、そして依然として類似の生物学的活性を維持し得ることが、公知である
。疎水性親水性指標に基づいて変化を起こす際に、疎水性親水性指標が±２以内
であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、そして
±０．５以内であるものが、なおより特に好ましい。

【００６８】 類似のアミノ酸の置換が親水性に基づいて効果的になされ得ること（特に、本
発明の場合のように、これらにより生成された生物学的機能が同等のタンパク質
またはペプチドが、免疫学的な実施形態における使用において想定された場合に
）もまた、当該分野において理解されている。

【００６９】 米国特許第４，５５４，１０１号で、タンパク質の最も大きな局所的平均親水
性は、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配される場合に、その免疫原性
および抗原性、すなわち、そのタンパク質の生物学的特性に相関することがに記
載されている。米国特許第４，５５４，１０１号で詳述されているように、以下
の親水性の値が、これらのアミノ酸残基に割り当てられた：アルギニン（＋３．
０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（
＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン
（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５
±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．
０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；
イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．
５）；およびトリプトファン（−３．４）。

【００７０】 類似の親水性の値に基づいて変化を行う際に、親水性値が±２以内であるアミ
ノ酸の置換が好ましく、±ｌ以内であるものが特に好ましく、そして±０．５以
内であるものが、なおより特に好ましい。米国特許第４，５５４，１０１号はま
たは、親水性に基く一次アミノ酸配列からエピトープの同定および調製を教示す
る。米国特許第４，５５４，１０１号に記載の方法を通して、当業者は所定のア
ミノ酸配列内からエピトープを同定し得る。これらの領域はまた、「エピトープ
領域」と呼ばれる。

【００７１】 多数の科学刊行物が、アミノ酸分析からの、二次構造の推定およびエピトープ
の同定に充てられてきた。Ｃｈｏｕら、１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
１３：２２２−４５；Ｃｈｏｕら、１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１
３：２１１−２２；Ｃｈｏｕら、１９７８，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａ
ｔ．Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−４８；Ｃｈｏｕら、１９７８
，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６；およびＣｈｏｕら
、１９７９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７−８４を参照のこと。さらに、
コンピュータプログラムが、タンパク質における抗原性部位およびエピトープコ
ア領域の推定を補助するために利用可能である。実施例としては、Ｊａｍｅｓｏ
ｎ−Ｗｏｌｆ分析（Ｊａｍｅｓｏｎら、Ｃｏｍｐｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．
、４（１）：１８１〜１８６、１９９８およびＷｏｌｆら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉ
ｏｓｃｉ．、４（１）：１８７〜１９１、１９８８）；ＰｅｐＰｌｏｔプログラ
ム（Ｂｒｕｔｌａｇら、ＣＡＢＳ、６：２３７〜２４５、１９９０、およびＷｅ
ｉｎｂｅｒｇｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２８：７４０〜７４２、１９８５）お
よびタンパク質三次構造予測のための新規プログラム（Ｆｅｔｒｏｗら、Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：４７９〜４８３、１９９３）に基くプログラムが
挙げられる。

【００７２】 コンピュータプログラムが、二次構造の推定を補助するために、現在利用可能
である。二次構造を推定する１つの方法は、相同性モデリングに基づく。例えば
、３０％より大きな配列同一性または４０％より大きな類似性を有する２つのポ
リペプチドまたはタンパク質は、しばしば、類似の構造トポロジーを有する。タ
ンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の近年の成長は、二次構造（ポリペプチド
またはタンパク質の構造における可能な折り畳みの数を含む）の増強された推定
性を提供してきた。Ｈｏｌｍら、１９９９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．２７：２４４−４７を参照のこと。所定のポリペプチドまたはタンパク質に
おいて制限された数の折り畳みが存在すること、および一旦、臨界数の構造が解
明されると、構造推定は劇的により正確となることが、示唆されてきた（Ｂｒｅ
ｎｎｅｒら、１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３
６９〜３７６）。

【００７３】 二次構造を推定するさらなる方法は、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ
）」（Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．
７（３）：３７７−８７；Ｓｉｐｐｌら、１９９６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４（
１）：１５−１９）、「プロフィール分析」（Ｂｏｗｉｅら、１９９１，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２５３：１６４〜１７０；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９９０，Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：１４６−５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９８
７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４（３）：４３５５
〜４３５８）、および「進化学的連鎖（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｌｉｎｋａ
ｇｅ）」（Ｈｏｌｍら、前出、およびＢｒｅｎｎｅｒら、前出を参照のこと）を
包含する。

【００７４】 好ましい実施形態において、改変体は１〜３、または１〜５、または１〜１０
、または１〜１５、または１〜２０、または１〜２５、または１〜５０、または
１〜７５、または、１〜１００、または１００以上のアミノ酸置換、アミノ酸挿
入、アミノ酸付加および／またはアミノ酸欠失を含み、ここでこの置換は、本明
細書中で示したように、保存的であるか、もしくは非保存的であるか、またはこ
れらの任意の組合せである。さらに、これらの変異体は、カルボキシル末端また
はアミノ末端においてアミノ酸残基の付加を有し得る（リーダー配列を有するか
、またはそれらを有さない）。

【００７５】 好ましいＣｈＭＩｒｐポリペプチド改変体としては、グリコシル化部位の数お
よび／または型が天然のアミノ酸配列と比較して変化している、グリコシル化改
変体が挙げられる。１つの実施形態において、ＣｈＭＩｒｐポリペプチド改変体
は、配列番号２に示されるアミノ酸配列より多いかまたはより少ない数のＮ結合
型グリコシル化部位を含む。Ｎ結合型グリコシル化部位は、配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓ
ｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴付けられ、ここで、Ｘと印されるア
ミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基であり得る。この配列を作製
するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ結合型糖鎖の付加のための潜在的な新たな
部位を提供する。あるいは、この配列を排除する置換は、存在するＮ結合型糖鎖
を除去する。１つ以上のＮ結合グリコシル化部位（代表的に、天然に存在するグ
リコシル化部位）が排除され、そして１つ以上の新たなＮ連結部位が作製される
、Ｎ結合型糖鎖の再配列もまた、提供される。さらなる好ましいＣｈＭＩｒｐポ
リペプチド改変体としては、１つ以上のシステイン残基が、配列番号２に示され
るアミノ酸配列と比較して欠失しているか、または別のアミノ酸（例えば、セリ
ン）で置換されている、システイン改変体が挙げられる。システイン改変体は、
ＣｈＭＩｒｐポリペプチドが、例えば不溶性の封入体の単離の後に、生物学的に
活性な立体構造へとリフォールディングされなければならない場合に、有用であ
る。システイン改変体は、一般に、ネイティブタンパク質より少ないシステイン
残基を有し、そして代表的には偶数のシステイン残基を有し、対合していないシ
ステインから生じる相互作用を最小にする。

【００７６】 用語「ＣｈＭＩｒｐ融合ポリヌクレオチド」は、異質ペプチドまたは異質ポリ
ヌクレオチドとＣｈＭＩｒｐポリペプチド、フラグメントおよび／またはこれら
の改変体との融合を指す。異質ペプチドおよび異質ポリペプチドとしては以下が
含まれるがこれらに限定されない：ＣｈＭＩｒｐ融合ポリペプチドの検出および
／または単離が可能にするエピトープ；膜貫通レセプタータンパク質またはその
部分（例えば、細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン）；
膜貫通レセプタータンパク質に結合する、リガンドまたはその部分；触媒的に活
性である、酵素またはその部分；オリゴマー化を促進するポリペプチドまたはペ
プチド（例えば、ロイシンジッパードメイン）；安定性を増加させるポリペプチ
ドまたはペプチド（例えば、免疫グロブリン定常領域）；ならびに配列番号２に
示されるようなアミノ酸配列を含むポリペプチドあるいはＣｈＭＩｒｐポリペプ
チド改変体とは異なる治療活性を有する、ポリペプチド。

【００７７】 さらに、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドは、それ自身またはフラグメント、改変体
、もしくはこれらの誘導体に融合され得る。融合は、ＣｈＭＩｒｐポリペプチド
の、アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、なされ得る。融合
は、リンカーもしくはアダプター分子を用いずに直接であってもよいし、リンカ
ーもしくはアダプター分子（例えば、１つ以上の約２０アミノ酸までのアミノ酸
残基〜約５０アミノ酸までのアミノ酸残基）を介してであってもよい。リンカー
またはアダプター分子はまた、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼまたはプロテアー
ゼについての切断部位を有して設計されて、融合した部分の分離を可能にし得る
。一旦構築されると、この融合ポリペプチドは、本明細書中に記載の方法に従っ
て誘導体化され得ることが、理解される。

【００７８】 本発明のさらなる実施形態において、フラグメント、改変体、および／または
誘導体を含むＣｈＭＩｒｐポリペプチドは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に融合する。
抗体は、以下の２つの機能的に独立した部分を含む。この独立した部分は、抗原
を結合する「Ｆａｂ」として公知の可変ドメイン、ならびに補体活性化および食
細胞による攻撃のようなエフェクター機能に関与する、「Ｆｃ」として公知の定
常ドメインである。Ｆｃは、長い血清半減期を有し、一方でＦａｂは、短寿命で
ある（Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５〜３１，１９８９）。治療
タンパク質と一緒に構築される場合には、Ｆｃドメインは、より長い半減期を提
供し得るか、またはＦｃレセプター結合、プロテイン結合、補体結合、および恐
らく、胎盤移入のような機能さえも組み込み得る。同書。表Ｉは、当該分野（融
合化ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの産生に適用可能な材料および方法を含む）にお
いて公知の特定のＦｃ融合物の使用を要約する。

【００７９】

【表１】 一つの例において、ヒトＩｇＧヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３領域は、当業
者に公知の方法を使用して、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドのＮ末端またはＣ末端の
いずれかに融合され得る。別の例として、ヒンジの部分領域ならびにＣＨ２領域
およびＣＨ３領域は、融合され得る。得られるＣｈＭＩｒｐＦｃ−融合ポリペプ
チドは、プロテインＡアフィニティーカラムの使用によって精製され得る。Ｆｃ
領域に融合されたペプチドおよびタンパク質は、融合されていない対応物よりも
インビボで実質的に長い半減期を示すことが見出された。また、Ｆｃ領域への融
合は、融合ポリペプチドの二量化／多量体化を可能にする。Ｆｃ領域は、天然に
存在するＦｃ領域であり得るか、または特定の質（例えば、治療的質、循環時間
、凝集の減少など）を改善するために変更され得る。

【００８０】 用語「ＣｈＭＩｒｐポリペプチド誘導体」とは、ＣｈＭＩｒｐポリペプチド、
改変体、またはこれらフラグメントをいい、これは、例えば、１つ以上の水溶性
ポリマー、Ｎ結合型炭水化物、Ｏ結合型炭水化物、糖、リン酸、および／または
他のこのような分子の共有結合によって、化学的に修飾されている。このような
修飾は、精製タンパク質または粗タンパク質の標的アミノ酸残基を有機誘導体化
剤（選択した側鎖または末端残基と反応し得る）と反応させることによって分子
中に導入され得る。得られた共有誘導体は、また、生物学的活性について重要な
残基を同定することを指向するプログラムにおいて有用である。この誘導体は、
ＣｈＭＩｒｐポリペプチドに結合した分子の型または位置のいずれかの点で、天
然に存在するＣｈＭＩｒｐポリペプチドとは異なる様式で改変される。誘導体は
さらに、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドに天然に結合された１つ以上の化学基の欠失
を含む。

【００８１】 例えば、ポリペプチドは、１つ以上のポリマー（水溶性ポリマー、Ｎ結合型炭
水化物、Ｏ結合型炭水化物、糖、リン酸、および／または他のこのような分子が
挙げられるがこれらに限定されない）の共有結合によって改変され得る。例えば
、選択されるポリマーは、典型的には水溶性であり、その結果、そのポリマーに
連結されているタンパク質は、水性環境（例えば、生理学的環境）下で沈殿しな
い。このポリマーは、任意の分子量であり得、そして分枝されていても分枝され
ていなくてもよい。ポリマーの混合物が、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドポリマーの
範囲内に含まれる。好ましくは、最終生成物の調製物の治療的使用のために、こ
のポリマーは、薬学的に受容可能である。

【００８２】 適切な水溶性ポリマーまたはその混合物としては、以下が挙げられるが、これ
らに限定されない：ポリエチレン、グリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ポリ
エチレングリコール、デキストラン（例えば、低分子量（例えば、約６ｋＤのデ
キストラン））、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（
Ｎ−ビニルピロリジン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポ
リマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエ
チル化ポリオール（例えば、グリセロール）、およびビニルアルコール。共有結
合したＣｈＭＩｒｐポリペプチドマルチマーを調製するために使用され得る、二
官能性ＰＥＧ架橋分子もまた、本発明に含まれる。

【００８３】 アシル化反応のために、選択されたポリマーは、単一の反応性エステル基を有
する。還元的アルキル化について、選択されたポリマーは、単一の反応性アルデ
ヒド基を有する。例えば、反応性アルデヒド、ポリエチレングリコールプロピオ
ンアルデヒドであり、これは、水溶性、またはモノＣ_１−Ｃ_１０アルコキシもし
くはそのアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照
のこと）。

【００８４】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドのペギル化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、当該分野
で公知の任意のペギル化反応を使用して特異的に実施され得る。このような反応
は、例えば、以下の参考文献に記載されている：Ｆｒａｎｃｉｓら，１９９２，
Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ３：４−１０；欧州特許第
０１５４３１６号および０４０１３８４号；ならびに米国特許第４，１７９，３
３７号。例えば、ペギル化は、本明細書中に記載されるように、反応性ポリエチ
レングリコール分子（または、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応
またはアルキル化反応を介して実施され得る。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）は、本明細書中での使用に適切な水溶性ポリマーである。本明細書中で使用さ
れる場合、用語「ポリエチレングリコール」および「ＰＥＧ」は、タンパク質（
モノ（Ｃ_１−Ｃ_１０）アルコキシポリエチレングリコールまたはアリールオキシ
ポリエチレングリコールを含む）を誘導化するのに使用されるＰＥＧの任意の形
態を含むことを意味する。

【００８５】 一般に、化学誘導体化は、生物学的に活性な基質を活性化ポリマー分子と反応
させるために使用される任意の適切な条件下で行われ得る。ペギル化ポリペプチ
ドの化学誘導体を調製するための方法は、一般に、以下の工程を包含する：（ａ
）ＣｈＭＩｒｐポリペプチド改変体が、１つ以上のポリマー分子に結合されるよ
うな条件下で、ポリペプチドを、活性化したポリマー分子（例えば、ポリマー分
子の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）と反応させる工程、および（ｂ）
反応生成物を得る工程。一般に、最適な反応条件は、公知のパラメーターおよび
所望の結果に基づいて決定される。例えば、ポリマー分子：タンパク質の比が大
きいほど、結合されるポリマー分子の割合は大きくなる。１つの実施形態におい
て、ＣｈＭＩｒｐポリペプチド誘導体は、そのアミノ末端で単一のポリマー分子
部分を有し得る（例えば、米国特許第５，２３４，７８４号を参照のこと）。

【００８６】 一般に、本発明のＣｈＭＩｒｐポリペプチド誘導体の投与によって、緩和また
は調節され得る状態は、本明細書中に記載されたものを含む。しかし、本明細書
中に開示されるＣｈＭＩｒｐポリペプチド誘導体は、非誘導体化分子と比較した
場合、さらなる活性、増強または減少した生物学的活性、または他の特性（例え
ば、増加または減少した半減期）を有し得る。

【００８７】 用語「生物学的に活性なＣｈＭＩｒｐポリペプチド」、「生物学的に活性なＣ
ｈＭＩｒｐポリペプチドフラグメント」、「生物学的に活性なＣｈＭＩｒｐポリ
ペプチド改変体」、および「生物学的に活性なＣｈＭＩｒｐポリペプチド誘導体
」とは、少なくとも１つのＣｈＭＩｒｐポリペプチドの活性特徴を有するＣｈＭ
Ｉｒｐポリペプチドをいう。ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの免疫原性フラグメント
は、このＣｈＭＩｒｐフラグメントに対して惹起される抗体を宿主動物に誘導し
得るフラグメントである。

【００８８】 「天然に存在する」または「ネイティブの」は、核酸分子、ポリペプチド、宿
主細胞などのような生物学的物質と関連して使用される場合、天然において見出
され、そしてヒトによって操作されていない物質をいう。同様に、「天然に存在
しない」または「ネイティブではない」は、本明細書中で使用される場合、天然
で見出されないか、またはヒトによって構造的に改変もしくは合成された物質を
いう。

【００８９】 用語「単離されたポリペプチド」とは、（１）供給源細胞から単離される場合
に、天然で一緒に見出されるポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または他の物
質の少なくとも約５０％から分離された本発明のポリペプチド、（２）「単離さ
れたポリペプチド」が天然で連結するポリペプチドの全てまたは一部に（共有結
合的もしくは非共有結合的相互作用によって）連結しない、本発明のポリペプチ
ド、（３）天然には連結しないポリペプチドに（共有結合的もしくは非共有結合
的相互作用によって）作動可能に連結する、本発明のポリペプチド、または（４
）天然には存在しない本発明のポリペプチドをいう。好ましくは、この単離され
たポリペプチドは、任意の他の混入ポリペプチドまたはその天然の環境において
見出される他の混入物（これは、その治療的使用、診断的使用、予防的使用、ま
たは研究的使用を妨げる）を実質的に含まない。

【００９０】 用語「成熟ＣｈＭＩｒｐポリペプチド」は、リーダー配列を欠失したポリペプ
チドをいい、そして、成熟ＣｈＭＩｒｐポリペプチドはまた、ポリペプチドの他
の改変（例えば、アミノ末端（リーダー配列を有するかまたは有さない）および
／またはカルボキシ末端のタンパク質分解性プロセシング、より大きな前駆体か
らのより小さなポリペプチドの切断、Ｎ結合型および／またはＯ結合型グリコシ
ル化など）を含み得る。

【００９１】 用語、「ムテイン」は、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの変異体タンパク質、ポリ
ペプチド、改変体、アナログまたはフラグメントをいう。ＣｈＭＩｒｐのムテイ
ンは、欠失、挿入、置換、点変異、短縮化、付加、転位、ＰＣＲ増幅、部位特異
的変異誘発、または当該分野で公知の他の方法によって調製され得る。

【００９２】 用語「有効量」および「治療有効量」とは、意義ある患者利益（すなわち、処
置、治癒、予防、または状態の緩和）をもたらすために、上記のＣｈＭＩｒｐポ
リペプチドの１つ以上の生物学的活性のレベルの観察可能な変化を支持するため
に必要なＣｈＭＩｒｐポリペプチド（またはＣｈＭＩｒｐアンタゴニスト）の量
をいう。個々の活性成分について適用する場合、用語、単独で投与されるとは、
その成分が単独であることをいう。組合せに適用される場合、この用語は、続け
てか、または同時に、組合せて投与した場合、治療効果を生じる活性成分の組合
せた量をいう。本発明を実施する際に用途を有するＣｈＭＩｒｐポリペプチドは
、天然に存在する全長ポリペプチド、または短縮化ポリペプチドまたは改変相同
体またはアナログまたは誘導体またはペプチドフラグメントであり得る。例示的
アナログとしては、２つの種の間の１つ以上の互いに異なるアミノ酸が別の種由
来の互いに異なるアミノ酸で置換されるものが挙げられる。互いに異なるアミノ
酸はまた、任意の他のアミノ酸（これが保存的アミノ酸であっても、非保存的ア
ミノ酸であっても）で置換され得る。

【００９３】 用語「薬学的に受容可能なキャリア」または「生理学的に受容可能なキャリア
」は、本明細書中で使用される場合、薬学的組成物としてのＣｈＭＩｒｐポリペ
プチド、ＣｈＭＩｒｐ核酸分子、またはＣｈＭＩｒｐ選択的結合因子の送達の達
成または増強に適切な１つ以上の処方物質をいう。

【００９４】 用語「選択的結合因子」は、ＣｈＭＩｒｐ分子に特異性を有する分子をいう。
選択的結合因子としては、抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル
抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、可溶性形態もしくは結合
形態で標識され得る抗体に対する抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体）、ならびに
公知の技術（酵素学的切断、ペプチド合成、または組換え技術を含むが、これら
に限定されない）によって提供されるそのフラグメント、領域、または誘導体が
挙げられる。本発明の抗ＣｈＭＩｒｐ選択的結合因子は、例えば、ＣｈＭＩｒｐ
分子の一部を結合し得、これは、ＣｈＭＩｒｐ分子のＣｈＭＩｒｐレセプターへ
の結合を阻害する。

【００９５】 本明細書中で使用される場合、用語「特異的」および「特異性」とは、選択的
結合因子が、ヒトＣｈＭＩｒｐポリペプチドに結合し、かつヒト非ＣｈＭＩｒｐ
ポリペプチドに結合する能力をいう。しかし、選択的結合因子がまた、ＣｈＭＩ
ｒｐポリペプチドのオルソログ（すなわち、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの種間型
（例えば、マウスＣｈＭＩｒｐポリペプチドおよびラットＣｈＭＩｒｐポリペプ
チド））に結合し得ることが、理解される。好ましい実施形態は、ＣｈＭＩｒｐ
ポリペプチドに対して高度に特異的である抗体が、非ＣｈＭＩｒｐポリペプチド
に対して特異的に交差反応しない（すなわち、これらは結合しない）ことに関す
る。

【００９６】 用語「抗原」は、選択的結合因子（例えば、抗体）により結合され得る分子ま
たは分子の一部であって、そしてさらに、その抗原のエピトープに結合し得る抗
体を動物に産生させ得る、分子または分子の一部をいう。抗原は、１つ以上のエ
ピトープを有し得る。上記に参照される特異的な結合反応は、抗原が、高い選択
的な様式でこの対応する抗体と反応し、他の抗原によって惹起され得る多数の他
の抗体とは反応しないことを示すことを意味する。

【００９７】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチド、フラグメント、改変体、および誘導体は、当該分
野で公知の方法を用いてＣｈＭＩｒｐ選択的結合因子を調整するために使用され
得る。従って、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドに結合する抗体および抗体フラグメン
トは、本発明の範囲内である。抗体フラグメントとしては、ＣｈＭＩｒｐポリペ
プチドのエピトープに結合する抗体の一部が挙げられる。このようなフラグメン
トの例としては、全長抗体の酵素学的切断によって生成されるＦａｂフラグメン
トおよびＦ（ａｂ’）フラグメントが挙げられる。他の結合フラグメントとして
は、組換えＤＮＡ技術（例えば、抗体可変領域をコードする核酸配列を含む組換
えプラスミドの発現）によって生成されるフラグメントが挙げられる。これらの
抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、ポリクローナル一重特異的なポリクロー
ナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗
体、単鎖抗体、および二重特異的抗体であり得る。

【００９８】 （核酸分子および／またはポリペプチドの関連性） 用語「同一性」とは、当該分野で公知のように、配列の比較によって決定され
る、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列間の関係をい
う。当該分野では、「同一性」はまた、ポリペプチド配列または核酸分子配列の
間の配列関連性の程度（この場合、おそらく、ヌクレオチド配列またはアミノ酸
配列のストリングの間の一致により決定されるような）を意味する。「同一性」
は、特定の算術モデルのコンピュータープログラム（すなわち、「アルゴリズム
」）によって位置付けられた、ギャップ整列を有する２つ以上の配列の間の同一
性一致のパーセントを測定する。

【００９９】 用語「類似性」は、概念に関するが、「同一性」とは対照的に、同一による一
致および保存的置換の一致の両方を含む類似性の基準をいう。関連する核酸分子
およびポリペプチドの同一性および類似性は、公知の方法によって容易に計算さ
れ得る。このような方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎ
ｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍ
ｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９
９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔ
ａ、Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．
編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏ
ｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；ならびに
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．
およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、１９９１）；ならびにＣａｒｉｌｌｏおよびＬｉｐｍａｎ、ＳＩＡ
Ｍ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３、１９９８に記載される
ものが挙げられるが、これらに限定されない。保存的置換が、ペプチドに適用さ
れ、そして核酸分子に適用されない場合、類似性は、ペプチド配列の比較のみに
関係する。次いで、２つのポリペプチド配列が、例えば１０／２０の同一のアミ
ノ酸を有し、そして残りが全て非保存的置換である場合、パーセント同一性およ
び類似性は、どちらも５０％である。同じ例において、保存的置換であるさらに
５つの位置が存在する場合、パーセント同一性は５０％のままであるが、パーセ
ント類似性は７５％（１５／２０）である。したがって、保存的置換が存在する
場合、２つのポリペプチド配列間の類似性の程度は、これらの２つの配列間のパ
ーセント同一性よりも高い。

【０１００】 関連する核酸分子およびポリペプチドの同一性および類似性は、公知の方法に
よって容易に計算され得る。このような方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ
ａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａ．Ｍ．Ｌｅｓｋ編、Ｏｘｆｏｒ
ｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎ
ｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｄ．
Ｗ．Ｓｍｉｔｈ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９３）；Ｃｏｍｐｕｔ
ｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ（Ｐａｒｔ １，
Ａ．Ｍ．ＧｒｉｆｆｉｎおよびＨ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ
ｅｓｓ １９９４）；Ｇ．ｖｏｎ Ｈｅｉｎｌｅ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌ
ｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ １９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（
Ｍ．ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＪ．Ｄｅｖｅｒｅｕｘ編、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ
Ｐｒｅｓｓ １９９１）；ならびにＣａｒｉｌｌｏら、１９８８，ＳＩＡＭ Ｊ
．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３に記載されるものが挙げられる
が、これらに限定されない。

【０１０１】 この核酸配列における差異は、配列番号２のアミノ酸配列に関連するアミノ酸
配列の、保存的改変および／または非保存的改変を生じうる。

【０１０２】 用語「保存的アミノ酸置換」は、その位置でアミノ酸残基の極性または電荷に
ほとんど影響がないかまたは影響がないような、天然のアミノ酸残基の非天然の
残基での置換をいう。例えば、保存的置換は、ポリペプチド中の非極性残基の他
の任意の非極性残基での置換の結果生じる。さらに、「アラニンスキャニング変
異誘発」として上記されたように、ポリペプチド中の任意の天然の残基をまた、
アラニンで置換し得る。アミノ酸置換についての一般的規則を、以下の表ＩＩに
示す。

【０１０３】 （表ＩＩ）

【０１０４】

【表２】 このアミノ酸配列に対する保存的改変（およびコードするヌクレオチドに対応
する改変）は、天然に存在するＣｈＭＩｒｐのものに類似した機能的特徴および
化学的特徴を有するＣｈＭＩｒｐを生成すると予想される。対照的に、ＣｈＭＩ
ｒｐの機能的特徴および／または化学的特徴における実質的な改変は、（ａ）こ
の置換の領域における分子の骨格の構造（例えば、シート構造またはへリックス
構造）、（ｂ）この標的部位での分子の電荷または疎水性、あるいは（ｃ）この
側鎖のバルクを維持するその効果において、有意に異なる置換を選択することに
よって達成され得る。天然に存在する残基は、一般的な側鎖の属性に基づいて、
以下の分類に分けられ得る： １）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ； ２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ； ３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ； ４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ； ５）鎖の方向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および ６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【０１０５】 非保存的置換は、これらの分類の１つのメンバーの、別の分類からのメンバー
との交換を含み得る。このような置換される残基を、非ヒトＣｈＭＩｒｐに相同
なヒトＣｈＭＩｒｐ分子の領域中に、またはこの分子の非相同な領域中に導入し
得る。

【０１０６】 保存的なアミノ酸置換はまた、生物学的系における合成よりむしろ化学的なペ
プチド合成によって典型的に取り込まれる、非天然に存在するアミノ鎖残基を含
む。これらは、ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）ならびにア
ミノ酸成分の反対または逆の他の形態を含む。

【０１０７】 同一性および／または類似性を決定するための好ましい方法を、試験される配
列間の最大の適合を与えるように設計する。同一性および類似性を決定するため
の方法は、公に入手可能なコンピュータープログラムに体系化される。２つの配
列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム
としては、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ１２（１）：３８７、１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔ
ｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍｅｄ
ｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃ
ｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０．１９９０）を
含むＧＣＧプログラムパッケージが挙げられるが、これに限定されない。このＢ
ＬＡＳＴ Ｘプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源
（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢ ＮＬＭ ＮＩＨ
Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．
Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０．１９９０）から公に入手可能である。十分
に公知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムをまた、同一性を決定する
ために使用し得る。

【０１０８】 ２つのアミノ酸配列を整列させるための特定の整列スキームは、２つの配列の
短い領域のみの適合を生じ得、そしてこの整列された小領域は、２つの全長配列
の間に重大な関連性がない場合でさえ、非常に高い配列の同一性を有し得る。従
って、好ましい実施形態においては、この選択された整列方法（ＧＡＰプログラ
ム）は、特許請求されるポリペプチドの、少なくとも５０の連続するアミノ酸に
わたる整列を生じる。

【０１０９】 例えば、コンピューターアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕ
ｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍｅ
ｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、配列の同一性の割合が決定されるべき２つのポ
リペプチドを、それぞれのアミノ酸の最適な適合（このアルゴリズムによって決
定されるような「適合範囲」）のために整列する。ギャップ開始ペナルティー（
不利益）（平均ダイアゴナル（ｄｉａｇｏｎａｌ）×３として計算する；この「
平均ダイアゴナル」は、使用される比較マトリックスのダイアゴナルの平均であ
り；この「ダイアゴナル」は、特定の比較マトリックスによって完全なアミノ酸
の各適合に割り当てられるスコアまたは数である）およびギャップ拡張ペナルテ
ィー(通常、ギャップ開始ペナルティーの１／１０倍）、ならびにＰＡＭ ２５
０またはＢＬＯＳＵＭ ６２のような比較マトリックスを、このアルゴリズムと
共に使用する。標準的な比較マトリックス（ＰＡＭ２５０比較マトリックスに関
してはＤａｙｈｏｆｆら、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ｖｏｌ．５、補遺３、１９７８中に、ＢＬＯ
ＳＵＭ ６２比較マトリックスに関してはＨｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｌｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、８９：１０９１５−１０９１９、１９９２を
参照のこと。）はまた、このアルゴリズムによって使用される。

【０１１０】 ポリペプチド配列の比較のために好ましいパラメーターとしては、以下： アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．４８：４４３−４５３、１９７０、 比較マトリックス：ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｌｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、８９：１０９１５−１０９１９、１９９２
からＢＬＯＳＵＭ ６２； ギャップペナルティー：１２ ギャップ長ペナルティー：４ 類似性の閾値：０ が挙げられる。

【０１１１】 このＧＡＰプログラムは、これら上記のパラメーターと共に有用である。これ
ら前述のパラメーターは、このＧＡＰアルゴリズムを使用したポリペプチドの比
較のためのデフォルトパラメーター（末端ギャップのためのペナルティーを有さ
ない）である。

【０１１２】 核酸分子配列の比較のための好ましいパラメーターとしては、以下： アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．４８：４４３−４５３、１９７０； 比較マトリックス：適合＝＋１０、不適合＝０ ギャップペナルティー：５０ ギャップ長ペナルティー：３ が挙げられる。

【０１１３】 このＧＡＰプログラムはまた、これら上記のパラメーターと共に有用である。
これら上記のパラメーターは、核酸分子の比較のためのデフォルトパラメーター
である。

【０１１４】 Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅ
ｒｓｉｏｎ９（１９９７年９月）中に示されるものを含む、他の例示的なアルゴ
リズム、ギャップ開始ペナルティー、ギャップ拡張ペナルティー、比較マトリッ
クス、類似性の閾値などは、当業者によって使用され得る。なされるべき特定の
選択は、なされるべき特定の比較（例えば、ＤＮＡ対ＤＮＡ、タンパク質対タン
パク質、タンパク質対ＤＮＡ）に依存し；そしてさらに、この比較が、配列の組
の間（この場合、ＧＡＰまたはＢｅｓｔＦｉｔが一般的に好ましい）であるかま
たは１つの配列と大きい配列のデータベースとの間（この場合、ＦＡＳＴＡまた
はＢＬＡＳＴＡが好ましい））であるかに依存する。

【０１１５】 （合成） 本明細書中に記載される核酸およびポリペプチド分子は、組換えおよび他の手
段によって産生され得ることは、当業者によって理解される。

【０１１６】 （核酸分子） ＣｈＭＩｒｐポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核
酸分子は、種々の様式（化学合成、ｃＤＮＡもしくはゲノムのライブラリーのス
クリーニング、発現ライブラリースクリーニング、および／またはｃＤＮＡのＰ
ＣＲ増幅が挙げられるが、これらに限定されない）で容易に得られ得る。

【０１１７】 本明細書中において使用される組換えＤＮＡ法は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）および／ま
たはＡｕｓｕｂｅｌら編（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．
およびＷｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ １９９４）に記載されているがこれらに
限定されない。

【０１１８】 本発明は、本明細書中に記載されるような核酸分子およびこの分子を得るため
の方法を提供する。「ＣＨＭＩｒｐポリペプチド」またはそのフラグメントをコ
ードする遺伝子またはｃＤＮＡは、ゲノムライブラリーもしくはｃＤＮＡライブ
ラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングによってかまたはＰＣＲ増幅に
によって、得られ得る。ハイブリダイゼーションによって、ライブラリーをスク
リーニングするために有用なプローブまたはプライマーは、例えば、保存された
部位のような、同じまたは関連したファミリーの遺伝子由来の他の既知の遺伝子
または遺伝子フラグメントについての配列情報に基づいて、作製され得る。

【０１１９】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドをコードする遺伝子が、１つの種から同定される場
合、その遺伝子の全てまたは部分が、他の種（オルソログ）から対応する遺伝子
または同一種（ホモログ）から関連した遺伝子を同定するために、プローブとし
て使用され得る。このプローブまたはプライマーは、ＣｈＭＩｒｐ遺伝子を発現
すると考えられている種々の組織供給源からｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングするために使用され得る。

【０１２０】 さらに、配列番号１に示されるような配列を有する核酸分子の部分または全て
を使用して、ゲノムライブラリーをスクリーニングし、ＣｈＭＩｒｐをコードす
る遺伝子を同定および単離し得る。代表的に、中程度または高いストリンジェン
シーの条件が、スクリーニングのために使用されて、このスクリーニングから得
られる誤った陽性の数を最小にする。ＣｈＭＩｒｐをコードするｃＤＮＡの有効
性またはその機能は、ゲノムＤＮＡを得るための必要条件である。ストリンジェ
ントな条件下で、ＤＮＡライブラリーはスクリーニングされ、そして、得られた
クローンを調査して、これらが、コード領域に加えて、遺伝子発現について必要
な制御配列エレメントを含むか否かが分かる（例えば、適切なレポーター遺伝子
のコード領域と融合することによって、プロモーター機能をチェックする）。ス
トリンジェントな条件下でＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための方法
は、例えば、公開された欧州特許出願番号ＥＰＡ ０ １７４ １４３において
教示される。ゲノム配列を得ることは、遺伝子発現（例えば、転写因子またはス
テロイド）を調節する既知の物質との任意のありうる相互作用について、ＣｈＭ
Ｉｒｐをコードしていない領域に位置する（特に５’隣接領域において）調節配
列を調査することを可能にするか、または、おそらく、この遺伝子の発現に特定
の影響を有し得る新しい物質を発見する。このような調査の結果は、ＣｈＭＩｒ
ｐ発現を調節し、それゆえ、コンドロモジュリン（ｃｈｏｎｄｒｏｍｏｄｕｌｉ
ｎ）レセプターと相互作用する細胞の能力に直接影響するための、このような物
質の標的化された使用についての基礎を提供する。結果として、このレセプター
との特定の反応および得られた効果が抑制され得る。

【０１２１】 本発明の範囲はまた、本発明のＣｈＭＩｒｐの性質とは異なった性質を有し得
る、ＣｈＭＩｒｐのサプタイプをコードするＤＮＡを含む。これらは、選択的ス
プライシングによって形成された発現産物であり、そして、特定の領域における
改変された構造（例えば、レセプターについての親和性および特異性の変化また
はシグナル伝達の性質および効率の点での変化をもたらし得る構造）を有する。

【０１２２】 ＣｈＭＩｒｐをコードするｃＤＮＡの助けによって、低いストリンジェンシー
、中程度のストリンジェンシーまたは高いストリンジェンシーの条件下で、ｃＤ
ＮＡまたはそのフラグメントとハイブリダイズし、そして、レセプターを結合し
得るポリペプチドをコードするか、またはこのようなポリペプチドをコードする
配列を含む核酸を得ることが可能である。

【０１２３】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドをコードする核酸分子もまた、発現されたタンパク
質の特性に基づいて陽性クローンの検出を使用する発現クローニングによって、
同定され得る。代表的に、核酸ライブラリーは、抗体または他の結合パートナー
（例えば、レセプターまたはリガンド）を、宿主細胞表面において発現および提
示されたクローンタンパク質に結合させることによって、スクリーニングされる
。抗体または結合パートナーは、所望のクローンを発現する細胞を同定するため
に、検出可能な標識で改変される。

【０１２４】 以下に記載される説明に従って実施される組換え発現技術に従って、これらの
ポリヌクレオチドを産生し得、そしてコードされたポリペプチドを発現し得る。
例えば、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列を適切
なベクターに挿入することによって、当業者は、多量の所望のヌクレオチド配列
を容易に生成し得る。次いで、これらの配列を使用して、検出プローブまたは増
幅プライマーを生成し得る。あるいは、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドのアミノ酸配
列をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクターに挿入し得る。発現ベクター
を適切な宿主に導入することによって、コードされたＣｈＭＩｒｐポリペプチド
が、多量に産生され得る。

【０１２５】 適切な核酸配列を得るための別の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で
ある。この方法において、ｃＤＮＡは、酵素逆転写酵素を使用して、ｐｏｌｙ（
Ａ）＋ＲＮＡまたは全ＲＮＡから調製される。次いで、２つのプライマー（代表
的には、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ（オリ
ゴヌクレオチド）の２つの別個の領域に対して相補的である）が、Ｔａｑポリメ
ラーゼのようなポリメラーゼを用いてこのｃＤＮＡに付加され、そしてこのポリ
メラーゼが、このｃＤＮＡのこれら２つのプライマー間の領域を増幅する。

【０１２６】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を調製する別
の手段は、Ｅｎｇｅｌｓら（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．２８：７
１６−３４，１９８９）によって記載されるもののような、当業者に周知の方法
を使用する、化学合成である。これらの方法としては、とりわけ、核酸合成のた
めのリン酸トリエステル、ホスホルアミダイト、およびＨ−ホスホネート方法が
挙げられる。このような化学合成のために好ましい方法は、標準的なホスホルア
ミダイト化学を使用する、ポリマーにより支持される合成である。代表的に、Ｃ
ｈＭＩｒｐポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、数百ヌクレオチ
ド長である。約１００ヌクレオチドより長い核酸は、これらの方法を使用して、
いくつかのフラグメントとして合成され得る。次いで、これらのフラグメントが
一緒に連結されて、ＣｈＭＩｒｐポリヌクレオチドの全長ヌクレオチド配列を形
成し得る。通常、このポリペプチドのアミノ末端をコードするＤＮＡフラグメン
トは、ＡＴＧを有し、これは、メチオニン残基をコードする。このメチオニンは
、宿主細胞において産生されたポリペプチドがその細胞から分泌されるよう設計
されるか否かに依存して、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの成熟形態で存在してもそ
うでなくてもよい。

【０１２７】 いくつかの場合において、ＣｈＭＩｒｐポリペプチド改変体またはムテインを
コードする核酸分子を調製することが所望であり得る。この様式で改変されたＤ
ＮＡが、コンドロモジュリンファミリーの１つ以上のメンバーを結合し得るポリ
ペプチドをコードするという条件で、改変体をコードする核酸分子は、プライマ
ーが所望の点変異を有する部位特異的変異誘発、転移、欠失、付加、短縮、ＰＣ
Ｒ増幅、または他の適切な方法を使用して生成し得る（変異誘発技術の記載に関
しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、およびＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこ
と）。Ｅｎｇｅｌｓら、前出によって記載される方法を使用する化学合成もまた
、このような改変体を調製するために使用され得る。当業者に公知の他の方法が
、同様に使用され得る。

【０１２８】 特定の実施形態において、核酸改変体は、所定の宿主細胞におけるＣｈＭＩｒ
ｐポリペプチドの最適な発現のために変更されたコドンを含む。特定のコドン変
更は、発現のために選択される宿主細胞およびＣｈＭＩｒｐポリペプチドに依存
する。このような「コドン最適化」は、種々の方法によって（例えば、所定の宿
主細胞において高度に発現される遺伝子における使用に好ましいコドンを選択す
ることによって）実施され得る。高度に発現された細菌遺伝子のコドン優先性の
ための「Ｅｃｏ＿ｈｉｇｈ．Ｃｏｄ」のようなコドン度数表を組み込むコンピュ
ータアルゴリズムが使用され得、そしてＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃ
ｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃ
ｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供される。他
の有用なコドン度数表としては、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「
Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｌｏｗ．ｃｏｄ」、「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＿ｈｉｇｈ．ｃ
ｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｍａｉｚｅ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ
」、および「Ｙｅａｓｔ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ．」が挙げられる。

【０１２９】 他の実施形態において、核酸分子は、上記定義されるような保存的なアミノ酸
置換を有するＣｈＭＩｒｐ改変体、１つ以上のＮ連鎖またはＯ連鎖グリコシル化
部位の付加および／または欠失を含むＣｈＭＩｒｐ改変体、または上記のような
ＣｈＭＩｒｐポリペプチドフラグメントをコードする。さらに、この様式で改変
されたＤＮＡが、リガンドおよびレセプターのコンドロモジュリンファミリーの
１つ以上のメンバーを見出し得るポリペプチドをコードし得るという条件で、核
酸分子は、ＣｈＭＩｒｐ改変体、フラグメント、および本明細書中に記載の融合
ポリペプチドの任意の組み合わせをコードし得る。

【０１３０】 （ベクターおよび宿主細胞） ＣｈＭＩｒｐポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を、標準的な
連結技術を使用して適切な発現ベクターに挿入し得る。ベクターは、代表的に、
使用される特定の宿主細胞において機能的であるように選択される（すなわち、
ベクターは、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が生じるように、宿主細
胞機構と適合性である）。ＣｈＭＩｒｐポリペプチドのアミノ酸配列をコードす
る核酸分子は、原核生物宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫（バキュロウイルス系）
宿主細胞および／または真核生物宿主細胞において増幅／発現され得る。宿主細
胞の選択は、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドが翻訳後修飾（例えば、グリコシル化お
よび／またはリン酸化）されるか否かに一部依存する。そうである場合、酵母宿
主細胞、昆虫宿主細胞、または哺乳動物宿主細胞が好ましい。発現ベクターの総
説について、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，ｖｏｌ．１８５（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，
ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９０）を参照のこと。

【０１３１】 代表的に、任意の宿主細胞に使用される発現ベクターは、プラスミド維持のた
めならびに外来性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含
む。このような配列（集合的に、「隣接配列」と呼ばれる）は、特定の実施形態
において、代表的に、以下のヌクレオチド配列の１つ以上を含む：プロモーター
、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセ
プタースプライス部位を含む完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のための
リーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発
現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、な
らびに選択マーカーエレメント。これらの配列のそれぞれが、以下に議論される
。

【０１３２】 必要に応じて、ベクターは、「タグ」コード配列（すなわち、ＣｈＭＩｒｐポ
リペプチドコード配列の５’末端または３’末端に配置されるオリゴヌクレオチ
ド分子）を含み得；オリゴヌクレオチド配列は、ｐｏｌｙＨｉｓ（例えば、ｈｅ
ｘａＨｉｓ）、別の「タグ」（例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ（赤血球凝集素インフル
エンザウイルス）または（これらは、市販の抗体が存在する））ｍｙｃをコード
する。このタグは、代表的には、ポリペプチドの発現の際にポリペプチドに融合
され、宿主細胞からの、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドのアフィニティー精製のため
の手段として役立ち得る。アフィニティー精製は、例えば、アフィニティーマト
リクスとしてタグに対する抗体を使用するカラムクロマトグラフィー（６ｈｉｓ
タグに対して親和性を有するニッケルカラムのような）によって達成され得る。
必要に応じて、タグは、引き続いて、切断のために特定のペプチダーゼを使用す
るような種々の手段によって、精製されたＣｈＭＩｒｐポリペプチドから除去さ
れ得る。

【０１３３】 隣接配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または系統由来）で
あり得るか、異種（すなわち、宿主細胞種または宿主細胞系統以外の種由来）で
あり得るか、ハイブリッド（すなわち、１つより多くの供給源由来の隣接配列の
組み合わせ）であり得るか、または合成であり得るか、あるいは隣接配列は、Ｃ
ｈＭＩｒｐポリペプチド発現を調節するために正常に機能するネイティブな配列
であり得る。このように、隣接配列の供給源は、任意の原核生物または真核生物
、任意の脊椎生物または無脊椎生物、あるいは任意の植物であり得、但し、隣接
配列は、宿主細胞の機構において機能的であり、そして宿主細胞の機構によって
活性化され得る。

【０１３４】 本発明のベクターに有用な隣接配列は、当該分野において周知である任意のい
くつかの方法によって得られ得る。代表的には、ＣｈＭＩｒｐ遺伝子隣接配列以
外の、本明細書中で有用な隣接配列は、マッピングおよび／または制限エンドヌ
クレアーゼ消化によって以前に同定されており、従って、適切な制限エンドヌク
レアーゼを使用して、適切な組織供給源から単離され得る。いくつかの場合にお
いて、1つ以上の隣接配列の全長ヌクレオチド配列は公知であり得る。ここで、
隣接配列は、核酸合成またはクローニングのために本明細書中で記載される方法
を使用して合成され得る。

【０１３５】 隣接配列の全てまたは一部のみが公知である場合、ＰＣＲを使用して、そして
／あるいは適切なオリゴヌクレオチドならびに／または同じもしくは別の種由来
の隣接配列フラグメントを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすること
によって、隣接配列は得られ得る。

【０１３６】 隣接配列が公知でない場合、隣接配列を含むＤＮＡのフラグメントは、例えば
、コード配列または別の遺伝子を含み得る大きなＤＮＡ断片から単離され得る。
単離は、適切なＤＮＡフラグメントを生成するための制限エンドヌクレアーゼ消
化、続くアガロースゲル精製を使用する単離、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラム
クロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）、または当業者に公知の他
の方法によって達成され得る。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、
当業者に容易に明かである。

【０１３７】 複製起点は、代表的に、市販される原核生物発現ベクターの一部であり、この
起点は、宿主細胞においてベクターの増幅に役立つ。特定のコピー数へのベクタ
ーの増幅は、いくつかの場合において、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの最適な発現
に重要であり得る。選択されたベクターが複製起点部位を含まない場合、公知の
配列に基づいて化学的に合成され得、そしてベクターに連結され得る。例えば、
プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅ
ｒｌｙ，ＭＡ）からの複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に適切であり、そし
て種々の起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎
ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶもしくはＢＰＶのようなパピローマウイルス
）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターのために有用である。一般的
に、複製起点の成分は、哺乳動物発現ベクターに必要とされない（例えば、ＳＶ
４０起点は、ただそれが初期プロモーターを含むので、しばしば、使用される）
を必要としない。

【０１３８】 転写終結配列は、代表的にポリペプチドコード領域の末端の３’側に配置され
、そして転写を終結させるのに役立つ。通常、原核生物細胞における転写終結配
列は、Ｇ−Ｃリッチフラグメント、続いてポリ−Ｔ配列である。この配列はライ
ブラリーから容易にクローン化され得るか、またはベクターの一部として市販さ
れるが、これはまた、本明細書中上記のような核酸合成のための方法を使用して
容易に合成され得る。

【０１３９】 選択マーカー遺伝子エレメントは、選択培養培地において増殖される宿主細胞
の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。代表的な選択マーカー遺伝
子は、（ａ）原核生物宿主細胞に対して、抗生物質または他の毒素（例えば、ア
ンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシン）に対する耐性を与えるか
；（ｂ）細胞の栄養要求性の欠損を補うか；あるいは（ｃ）あるいは複合培地か
ら入手可能でない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。好ましい選
択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテト
ラサイクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物宿主
細胞および真核生物宿主細胞における選択のために使用され得る。

【０１４０】 他の選択遺伝子は、発現される遺伝子を増幅するために使用され得る。増幅は
、増殖に重要なタンパク質の産生に、より大きく要求される遺伝子が、組換え細
胞の染色体の連続的な生成内にタンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物
細胞に対する適切な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（Ｄ
ＨＦＲ）およびチミジンキナーゼが挙げられる。哺乳動物細胞形質転換体は、選
択圧下に置かれ、ここで、形質転換体のみが、ベクターに存在する選択遺伝子に
よって生存するように独特に適合される。選択圧は、培地中の選択因子の濃度が
連続的に変化し、それによって選択遺伝子とＣｈＭＩｒｐポリペプチドをコード
するＤＮＡとの両方の増幅を導く条件下で、形質転換された細胞を培養すること
によって課される。結果として、増加した量のＣｈＭＩｒｐポリペプチドが、増
幅されたＤＮＡから合成される。

【０１４１】 リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、そしてシャ
イン・ダルガルノ配列（原核性物）またはコザック配列（真核生物）によって特
徴付けられる。このエレメントは、代表的に、発現されるＣｈＭＩｒｐポリペプ
チドのプロモーターの３’側およびコード配列の５’側に配置される。シャイン
・ダルガルノ配列は、可変であるが、代表的には、ポリプリン（すなわち、高い
Ａ−Ｇ含有量）である。多くのシャイン・ダルガルノ配列は、同定されており、
それぞれが、本明細書中に記載の方法を使用して容易に合成され得、そして原核
生物ベクターにおいて使用され得る。

【０１４２】 リーダー配列、またはシグナル配列は、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドが合成され
る宿主細胞からＣｈＭＩｒｐポリペプチドを指向させるために使用され得る。代
表的には、シグナル配列は、ＣｈＭＩｒｐ核酸分子のコード領域に位置するか、
または直接ＣｈＭＩｒｐポリペプチドコード領域の５’側に位置する。多くのシ
グナル配列が同定されており、選択された宿主細胞において機能性であるいずれ
かのシグナル配列が、ＣｈＭＩｒｐ遺伝子またはｃＤＮＡと組み合わせて使用さ
れ得る。従って、シグナル配列は、ＣｈＭＩｒｐ遺伝子またはｃＤＮＡに対して
同種（天然）または異種であり得る。さらに、シグナル配列は、本明細書中に記
載される方法を使用して化学的に合成され得る。大部分において、シグナルペプ
チドの存在による宿主細胞からのＣｈＭＩｒｐポリペプチドの分泌は、ＣｈＭＩ
ｒｐポリペプチドからのシグナルペプチドの除去を生じる。

【０１４３】 シグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、またはベクターに挿入された
ＣｈＭＩｒｐ ＤＮＡの一部であり得る。ネイティブなＣｈＭＩｒｐ ＤＮＡは
、成熟ＣｈＭＩｒｐポリペプチド産物を形成するために分子の翻訳後処理の間に
切断されるタンパク質のアミノ末端でシグナル配列をコードする。ネイティブな
シグナル配列を有するＣｈＭＩｒｐヌクレオチドならびにネイティブなシグナル
配列が欠失され、異種のシグナル配列で置換されたＣｈＭＩｒｐヌクレオチドが
本発明の範囲内に含まれる。選択された異種シグナル配列は、宿主細胞によって
認識され、プロセスされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断され
る）ものであるべきである。ネイティブなＣｈＭＩｒｐシグナル配列を認識せず
、プロセスしない原核生物宿主細胞について、シグナル配列は、例えば、アルカ
リホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定エンテロトキシンＩＩリーダ
ーのグループから選択される原核生物シグナル配列によって置換される。酵母分
泌について、ネイティブなＣｈＭＩｒｐシグナル配列は、酵母インベルターゼ、
α因子、または酸ホスファターゼシグナル配列によって置換され得る。哺乳動物
細胞発現において、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドのネイティブなシグナル配列が十
分であるが、他の哺乳動物シグナル配列が適切であり得る。

【０１４４】 グリコシル化が真核生物宿主細胞発現系において望ましいようないくつかの場
合において、グリコシル化または収量を改善するために種々の核酸またはポリペ
プチド配列が操作され得る。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切
断部位を変更し得るかまたはプロ配列（ｐｒｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を加え得、
これはまた、グリコシル化に影響し得る。最終タンパク質産物は、１位に（成熟
タンパク質の最初のアミノ酸に対して）、発現に付随して１つ以上のさらなるア
ミノ酸を有し得、これは、完全に除去されないかもしれない。例えば、最終タン
パク質産物は、Ｎ末端に結合される、ペプチダーゼ切断部位において見出される
１つまたは２つのアミノ酸残基を有し得る。あるいは、いくつかの酵素切断部位
の使用は、酵素が成熟ポリペプチド内のこのような領域を切断する場合、所望の
ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの少し短縮した形態を生じ得る。

【０１４５】 多くの場合において、核酸分子の転写は、ベクター内の１つ以上のイントロン
の存在によって増加する；これは、ポリペプチドが真核生物宿主細胞（特に、哺
乳動物宿主細胞）において産生される場合、特に当てはまる。使用されるイント
ロンは、特に使用される遺伝子が全長ゲノム配列またはそのフラグメントである
場合、ＣｈＭＩｒｐ遺伝子内に天然に存在し得る。イントロンが遺伝子内に天然
に存在しない（大部分のｃＤＮＡについて）場合、イントロンは、別の供給源か
ら得られ得る。５’−隣接配列およびＣｈＭＩｒｐ遺伝子に関してイントロンの
位置は、イントロンが効果的に転写されなければならないので、一般的に重要で
ある。従って、ＣｈＭＩｒｐ ｃＤＮＡ分子が転写される場合、イントロンの好
ましい位置は、転写開始部位の３’側で、ポリ−Ａ転写終止配列の５’側である
。好ましくは、イントロンは、コード配列を妨害しないように、ｃＤＮＡの１つ
の側または他の側（すなわち、５’側または３’側）に配置される。任意の供給
源（ウイルス、原核生物および真核生物（植物または動物）を含む）由来の任意
のイントロンを使用して本発明を実行し得るが、但し、このイントロンは、挿入
される宿主細胞に適合性である。合成イントロンもまた本明細書中に含まれる。
必要に応じて、１つより多くのイントロンがベクター内で使用され得る。

【０１４６】 本発明の発現ベクターおよびクローニングベクターは、代表的には、宿主生物
によって認識され、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドをコードする分子に作動可能に連
結されたプロモーターを含む。

【０１４７】 プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する構造遺伝子（一般的に、約１０
０〜１０００ｂｐ内）の開始コドンに対して上流（すなわち、５’側）に配置さ
れる非転写配列である。プロモーターは、通常、２つのクラス（誘導プロモータ
ーおよび構成プロモーター）のうちの１つにグループ化される。誘導プロモータ
ーは、培養条件におけるいくらかの変化（例えば、栄養の存在または非存在、あ
るいは温度の変化）に応答してそれらの制御下で、ＤＮＡからの増加したレベル
の転写を開始する。他方、構成プロモーターは、連続的な遺伝子産物の産生を開
始する；すなわち、遺伝子発現に対して遺伝子をほとんど制御しないかまたは制
御しない。多数のプロモーター（種々の潜在的な宿主細胞によって認識される）
が周知である。適切なプロモーターは、供給源のＤＮＡからプロモーターを制限
酵素消化によって取り出し、そして所望のプロモーター配列をベクターに挿入す
ることによって、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連
結される。ネイティブなＣｈＭＩｒｐプロモーター配列は、ＣｈＭＩｒｐ核酸分
子の増幅および／または発現を指向させるために使用され得る。しかし、ネイテ
ィブなプロモーターと比較して大きい転写および発現タンパク質のより高い産生
が可能である場合、および使用のために選択された宿主細胞系と適合性である場
合、異種プロモーターが好ましい。

【０１４８】 原核生物宿主との使用に適切なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼおよ
びラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ；トリプトファン（ｔｒ
ｐ）プロモーター系；およびハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃプロモ
ーター）が挙げられる。他の公知の細菌プロモーターもまた、適切である。これ
らの配列は、公開されており、その結果、当業者は、任意の有用な制限部位を供
給するのに必要とされるリンカーまたはアダプターを使用して、所望のＤＮＡに
それらの配列を連結し得る。

【０１４９】 酵母宿主との使用に適切なプロモーターはまた、当該分野において周知である
。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に有利に使用される。哺乳動物宿
主細胞との使用に適切なプロモーターは周知であり、限定しないが、ポリオーマ
ウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ２）
、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロ
ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルスおよび最も好ましくはシミアン
ウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター
が挙げられる。他の適切な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモ
ーター（例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーター）が挙げ
られる。

【０１５０】 ＣｈＭＩｒｐ遺伝子転写を制御する際に関心があり得るさらなるプロモーター
としては、限定しないが、以下が挙げられる：ＳＶ４０初期プロモータ領域（Ｂ
ｅｒｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−１
０、１９８０）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’側の長い末端
反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２
２ ：７８７−９７，１９８０）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗ
ａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．７８：１４４４−４５，１９８１）；メタロチオネイン遺伝子の調節配列（
Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２，１９８
２）；β−ラクタマーゼプロモーターのような原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌ
ａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：３７２７−３１，１９７８）；またはｔａｃプロモータ
ー（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
．Ｓ．Ａ．，８０：２１−２５，１９８３）。組織特異性を示し、そしてトラン
スジェニック動物において利用されている以下の動物転写制御領域もまた関心が
ある：膵臓腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３８：６３９−４６，１９８４；Ｏｒｎｉｔｚ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．
Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９，１９８６；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｈｅｐａｔ
ｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５，１９８７）；膵臓β細胞において活性なイン
シュリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−２
２，１９８５）；リンパ球において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒ
ｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３８：６４７−５８，１９８４；
Ａｄａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−３８，１９８５
；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１
４３６−４４，１９８７）；精巣、乳房、リンパ球、および肥満細胞において活
性なマウス乳腺癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４
５：４８５−９５，１９８６）；肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域
（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６
８−７６，１９８７）；肝臓において活性なα−フェトプロテイン遺伝子制御領
域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１
６３９−４８，１９８５；Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３
５：５３−５８，１９８７）；肝臓において活性なα１−抗トリプシン遺伝子制
御領域（Ｋｅｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：
１６１−７１，１９８７）；骨髄性細胞において活性なβ−グロビン遺伝子制御
領域（Ｍｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−４０，１
９８５；Ｋｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４，１９８
６）；脳の稀突起神経膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制
御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４８：７０３−１２，１
９８７）；骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，
Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−８６，１９８５）；ならびに視床下部において
活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．
，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−７８，１９８６）。

【０１５１】 エンハンサー配列は、より高等な真核生物によって本発明のＣｈＭＩｒｐポリ
ペプチドをコードするＤＮＡの転写を増加するように、ベクターに挿入され得る
。エンハンサーは、転写を増加させるためにプロモーターに作用する、通常約１
０〜３００ｂｐの長さのＤＮＡのシス作用エレメントである。エンハンサーは、
相対的な方向および位置が独立している。これらは、転写単位に対して５’側お
よび３’側に見出された。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサ
ー配列が公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェ
トプロテインおよびインシュリン）。しかし、代表的には、ウイルス由来のエン
ハンサーが、使用される。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プ
ロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエン
ハンサーは、真核生物プロモーターの活性化に対する例示的な増強エレメントで
ある。エンハンサーは、ＣｈＭＩｒｐ核酸分子に対して５’位または３’位でベ
クターにスプライシングされ得るが、代表的には、プロモーターから５’位側に
配置される。

【０１５２】 本発明の発現ベクターは、市販のベクターのような開始ベクターから構築され
得る。このようなベクターは、全ての所望な隣接配列を含んでも良いし、含まな
くても良い。所望な隣接配列の１つ以上がすでに使用されるベクター内にない場
合、これらは、個々に得られ得、ベクターに連結され得る。隣接配列のそれぞれ
を得るために使用される方法は、当業者に周知である。

【０１５３】 本発明を実行するために好ましいベクターは、細菌宿主細胞、昆虫宿主細胞、
および哺乳動物宿主細胞と適合性のベクターである。このようなベクターとして
は、特に、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ、Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇ
ｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐ
ａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）、ｐＤＳＲ−ａｌｐｈａ（ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９０／１４３６３）なら
びにｐＦａｓｔＢａｃ１、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴ、およびｐＦａｓｔＢａｃＤｕ
ａｌ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）が挙げられる。

【０１５４】 さらなる適切なベクターとしては、限定しないが、コスミド、プラスミド、ま
たは改変ウイルスが挙げられるが、これらのベクター系は、選択された宿主細胞
と適合性でなければならないことが理解される。このようなベクターとしては、
限定しないが、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高コピー
数ＣｏｌＥｌ−ベースのファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）、Ｔａｑ増幅ＰＣＲ産物をクロー
ニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えば、ＴＯＰＯ ^ＴＭ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ、ＰＣＲ２．１（登録商標）プ
ラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のようなプ
ラスミド、ならびに哺乳動物ベクター、酵母ベクターまたはバキュロウイルス発
現系のようなウイルスベクター（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体、Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）が挙げられる。

【０１５５】 ベクターが構築され、そしてＣｈＭＩｒｐポリペプチドをコードする核酸分子
がベクターの適切な部位に挿入された後に、完全なベクターが増幅および／また
はポリペプチド発現に適切な宿主細胞に挿入され得る。ＣｈＭＩｒｐポリペプチ
ドに対する発現ベクターの選択された宿主細胞への形質転換は、トランスフェク
ション、感染、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェク
ション、リポフェクチン、ＤＥＡＥ−デキストラン法、または他の公知の技術の
ような方法を含む周知の方法によって達成され得る。選択される方法は、一部、
使用される宿主細胞の型に依存する。これらの方法および他の適切な方法は、当
業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記に記載される。

【０１５６】 宿主細胞は、原核生物宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核生物宿主
細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、または脊椎動物細胞）であり得る。宿主細
胞は、適切な条件下で培養される場合、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドを合成し、こ
のポリペプチドは、続いて、培養培地から（宿主細胞がそのポリペプチドを培地
に分泌する場合）収集され得るか、直接そのポリペプチドを産生する宿主細胞か
ら収集される（そのポリペプチドが分泌されない場合）。適切な宿主細胞の選択
は、所望の発現レベル、活性（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に望まし
いかまたは必要なポリペプチド修飾、および生物学的に活性な分子に折り畳まれ
る容易さなどの種々の因子に依存する。

【０１５７】 酵母細胞および哺乳動物細胞は、本発明の好ましい宿主である。このような宿
主の使用は、それらがまたグリコシル化を含む翻訳後ペプチド改変を行い得る実
質的な利点を提供する。多くの組換えＤＮＡストラテジーが存在し、これは、こ
れらの宿主において所望のタンパク質の産生に使用される強力なプロモーター配
列および高コピー数のプラスミドを利用する。

【０１５８】 クローン化された哺乳動物遺伝子産物上の酵母認識リーダー配列は、ペプチド
保有リーダー配列（すなわち、プレペプチド）を産生しそして分泌する。哺乳動
物細胞は、正しい折り畳みまたは正しい部位でのグリコシル化を含むタンパク質
分子に対する翻訳後修飾を提供する。

【０１５９】 宿主として有用であり得る哺乳動物細胞には、線維芽細胞起源の細胞（例えば
、ＶＥＲＯまたはＣＨＯ−Ｋ１）およびそれらの誘導体が含まれる。哺乳動物宿
主については、いくつかの可能なベクター系が所望のＣｈＭＩｒｐポリペプチド
の発現について利用可能である。広範な種々の転写および翻訳調節配列が、宿主
の性質に依存して利用され得る。転写および翻訳の調節シグナルは、調節シグナ
ルが高レベルの発現を有する特定の遺伝子と結合しているアデノウイルス、ウシ
パピローマウイルス、シミアンウイルスなどのようなウイルス供給源から由来し
得る。あるいは、哺乳動物発現産物由来のプロモーター（例えば、アクチン、コ
ラーゲン、ミオシンなど）が利用され得る。抑制または活性化を可能にする転写
開始調節シグナルは、その遺伝子の発現が調節され得るように、選択され得る。
有用なシグナルは、温度感受性である調節シグナルである（その結果、温度を変
化させることにより、発現が抑制もしくは阻害され得る）か、または化学調節（
例えば、代謝産物）に供される。

【０１６０】 広く公知であるように、真核生物ｍＲＮＡの翻訳は、開始メチオニンをコード
するコドンにおいて開始される。この理由のために、真核生物プロモーターと、
メチオニンをコードし得る（すなわち、ＡＵＧ）任意の介在コドンを含まない所
望のレセプター分子をコードするＤＮＡ配列との間の連結を確実にすることが好
ましい。このようなコドンの存在は、結果として、融合タンパク質の形成（ＡＵ
Ｇコドンが、ＤＮＡ配列をコードする所望のレセプター分子として同じリーディ
ングフレーム中に存在する場合）またはフレームシフト変異（ＡＵＧコドンが、
所望のＣｈＭＩｒｐポリペプチドコード配列として同じリーディングフレーム中
に存在しない場合）のどちらかを生じる。

【０１６１】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの発現はまた、原核細胞中で達成され得る。好まし
い原核宿主としては、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、バチルス属、ストレプトミ
セス属、シュードモナス属、サルモネラ属、セラチア属など）が挙げられる。最
も好ましい真核生物宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉである。特別な目的の細菌宿主として
は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ ３１４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１５３７）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（Ｆ￣，Λ￣
，原栄養菌株（ＡＴＣＣ ２７３２５））、および他の腸内細菌（例えば、Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍまたはＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃ
ｅｓｃｅｎｓ）ならびに種々のシュードモナス種が挙げられる。原核宿主は、発
現プラスミド中のレプリコンおよび制御配列と適合しなければならない。

【０１６２】 原核細胞（例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ、枯草菌、シュードモナス属、ストレプト
ミセス属など）中で所望のＣｈＭＩｒｐポリペプチドを発現するために、所望の
レセプター分子をコードする配列を機能性原核プロモーターに作動可能に連結す
ることが必要である。このようなプロモーターとしては、構成的またはより好ま
しくは、調節可能（すなわち、誘導的または抑制解除的）のいずれかであり得る
。構成プロモーターの例としては、バクテリオファージλのｉｎｔプロモーター
、およびｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーターなどが挙
げられる。誘導原核生物プロモーターの例としては、バクテリオファージλ（Ｐ _Ｌ およびＰ_Ｒ）の主要な右プロモーターおよび左プロモーター、ならびにＥ．ｃ
ｏｌｉのｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌａｃＩ、ｇａｌおよびｔａｃプロモー
ター、α−アミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：１
７６−１８２，１９８５）、枯草菌のσ２８−特異的プロモーター（Ｇｉｌｍａ
ら，Ｇｅｎｅ ３２：１１−２０，１９８４）、バチルスのバクテリオファージ
のプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔ．Ｊ．，Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２）、およびストレプトミセス属プロモ
ーター（Ｗａｒｄら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８−４７８
１９８６）が挙げられる。原核生物プロモーターは、Ｇｌｉｃｋ（Ｊ．Ｉｎｄ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２７７−２８２，１９８７）；Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ
，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ６８：５０５−５１６，１９８６）；およびＧｏｔｔｅ
ｓｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−４４２ １９８４）に
より概説される。

【０１６３】 原核生物細胞における適切な発現はまた、遺伝子コード配列から上流のリボソ
ーム結合部位の存在を必要とする。このようなリボソーム結合部位は、例えば、
Ｇｏｌｄら（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３６５−４０４，１
９８１）により開示されている。

【０１６４】 所望のＣｈＭＩｒｐポリペプチドコード配列および作動可能に連結されたプロ
モーターは、非複製ＤＮＡ（またはＲＮＡ）分子（これは、直線状であってもよ
いし、またはより好ましくは閉じられた共有結合環状分子であってもよい）とし
てレシピエントの原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。このような
分子は、自律複製不可能であることから、所望のレセプター分子の発現は、導入
配列の一過性の発現を介して生じ得る。あるいは、持続性発現は、宿主染色体へ
導入された配列の組み込みを介して生じ得る。

【０１６５】 １つの実施形態では、所望の遺伝子配列を宿主細胞染色体へ組み込み得るベク
ターが使用される。細胞の染色体へ導入ＤＮＡを安定に組み込んだ細胞は、発現
ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする１以上のマーカーを導入することに
よっても選択され得る。マーカーは、宿主中に栄養要求性（例えば、共通の酵母
栄養要求性マーカーであるｌｅｕ２１またはｕｒａ３）、殺生剤（ｂｉｏｃｉｄ
ｅ）耐性（例えば、抗生物質）または重金属（例えば、銅）などを補い得る。こ
の選択マーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ遺伝子配列に直接連結されていても
よいし、同時トランスフェクションにより同じ細胞に導入されてもよい。

【０１６６】 好ましい実施形態では、導入された配列は、レシピエント宿主における自律複
製し得るプラスミドベクターまたはウイルスベクターへ組み込まれる。広範な種
々のベクターのいずれかが、この目的のために使用され得る。特定のプラスミド
ベクターまたはウイルスベクターを選択する際の重要な因子（例えば、ベクター
を含むレシピエントな細胞での簡便性）（特定の宿主において所望されるベクタ
ーのコピーの数；および異なる種の宿主細胞間をベクターを「シャトル」し得る
に望ましいか否か）は、認識され得、そしてこれらのベクターを含まないレシピ
エントな細胞から選択され得る。

【０１６７】 一連の酵母遺伝子発現系のいずれかがまた使用され得る。このような発現ベク
ターの例としては、酵母の２ミクロンの環、発現プラスミド（ＹＥＰ１３、ＹＶ
ＰおよびＹＲＰなど）またはそれらの誘導体が挙げられる。このようなプラスミ
ドは当該分野で周知である（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら，Ｍｉａｍｉ Ｗｎｔｒ．Ｓｙ
ｍｐ．１９：２６５−２７４（１９８２）；Ｂｒｏａｃｈ，Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ：Ｌｉｆｅ Ｃｙｃｌｅ ａｎｄ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，４４５−４７０頁（１９８１）；Ｂｒｏａｃｈ，Ｃ
ｅｌｌ ２８：２０３−２０４ １９８２）。

【０１６８】 哺乳動物宿主について、いくつかの可能なベクター系が発現のために利用可能
である。染色体外プラスミドを自律複製を提供するＤＮＡエレメントを使用する
ベクターの１つのクラスは、動物ウイルス（例えば、ウシパピローマウイルス、
ポリオーマウイルス、アデノウイルス、またはＳＶ４０ウイルス）に由来する。
ベクターの第２のクラスは、宿主染色体への所望の遺伝子配列の組み込みに依存
する。導入ＤＮＡがそれらの染色体へ安定に組み込まれた細胞は、発現ベクター
を含む宿主細胞の選択を可能にする１以上のマーカーを組み込むことによっても
選択され得る。マーカーは、栄養要求性宿主に対してプロトトロピー（殺生物剤
耐性（例えば、抗生物質）、または重金属（例えば、銅）など）を提供し得る。
選択マーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に作動可能に連結されていてもよ
いし、または同時形質転換により同じ細胞へ導入されても良い。さらなるエレメ
ントはまた、ｍＲＮＡの最適な合成に必要とされ得る。これらのエレメントは、
スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終結シ
グナルを含み得る。このようなエレメントを組み込んでいるｃＤＮＡ発現ベクタ
ーは、Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０ １９
８３）により記載されるものが含まれる。好ましい真核生物ベクターとしては、
ＰＷＬＮＥＯ、ＰＳＶ２ＣＡＴ、ＰＯＧ４４、ＰＸＴＩ、ｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、
ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられる。

【０１６９】 好ましい原核生物ベクターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ中で複製され得るプラスミ
ドのようなプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥｌ、ｐＳＣ１０１、ｐ
ＡＣＹＣ １８４、πＶＸ、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ９、ｐＢＧ、ｐＤ
１０、Ｐｈａｇｅ ｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉｘｌ７４、ｐｂｍｅｓｃｒｉｐｔ Ｓ
Ｋ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨＩＢａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓ
Ｌ ｒａｒｅ ｇｏｎｅ）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３
−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５）が挙げられる。例えば、このようなプラスミ
ドは、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）
）により開示される。Ｂａｃｉｌｌｕｓプラスミドとしては、ｐＣ１９４、ｐＣ
２２１、ｐＴ１２７などが挙げられる。このようなプラスミドは、Ｇｒｙｃｚａ
ｎ，Ｔ．（Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａ
ｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８２）
３０７−３２９頁）により開示される。適切なストレプトミセス属プラスミドと
しては、ｐＩＳＪ１０１（Ｋｅｎｄａｌｌら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９
：４１７７−４１８３ １９８７）およびΦＣ３１のようなストレプトミセス属
バクテリオファージ（Ｃｈａｔｅｒら，Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ，Ａｋａｄｅｍｉａｉ Ｋａｉｄｏ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ，
１９８６，４５−５４１頁）が挙げられる。ストレプトミセス属プラスミドは、
Ｊｏｈｎら（Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：６９３−７０４，１９８６，
およびＩｚａｋｉ，Ｋ．（Ｊｐｎ．Ｊ．ＢａｃｔｅｒｉｏＬ３３：７２９−７４
２ １９７８）により概説される。しかし、任意の他のプラスミドまたはベクタ
ーは、それらが宿主細胞中で複製可能および生存可能であるかぎり使用され得る
。

【０１７０】 一旦、ベクターまたは構築物を含むＤＮＡ配列が発現のために調製されると、
ＤＡＮ構築物は、適切な宿主へ導入され得る。種々の技術（例えば、プロトプラ
スト融合物、リン酸カルシウム沈澱、エレクトロポレーションまたは他の従来技
術）が、使用され得る。融合後、細胞は、培地中で増殖され、そして適切な活性
についてスクリーニングされる。配列の発現は、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの産
生を生じる。

【０１７１】 適切な宿主細胞または細胞株は、哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムス
ター卵巣細胞（ＣＨＯ；ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）、ＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞（Ｕ
ｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，９７：４
２１６−４２２０，１９８０）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ），２９３細胞もしくは
２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ １５７３），または３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ
番号ＣＣＬ９２））であり得る。

【０１７２】 適切な哺乳動物宿主細胞の選択ならびに形質転換、培養、増幅、スクリーニン
グ、産物産生および精製のための方法は、当該分野で公知である。他の適切な哺
乳動物細胞株は、サルＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ １６５０）およびＣＯ
Ｓ−７（ＡＴＣＣ番号ＣＥＬ １６５１）細胞株ならびにＣＶ−１（ＡＴＣＣ番
号ＣＣＬ７０）細胞株である。さらなる例示的な哺乳宿主細胞としては、形質転
換された細胞株を含む、霊長類細胞株およびげっ歯類細胞株が挙げられる。正常
な二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養に由来する細胞株、ならびに一次外植
片もまた適切である。候補細胞は、選択遺伝子において遺伝子型的に欠損してい
てもよいし、または優性に作用する選択遺伝子を含んでいてもよい。他の適切な
哺乳動物細胞株としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｓｗｉ
ｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃもしくはＮＩＨマウスに由来するマウス神経芽細胞種Ｎ２Ａ
細胞、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ−９２９細胞、３Ｔ３株、またはＢＨＫもしくは
ＨａＫハムスター細胞株（これらはＡＴＣＣから入手可能である）。各々これら
の細胞株は、タンパク質発現の分野の当業者に公知であり、そして利用可能であ
る。

【０１７３】 同様に、本発明に適切な宿主細胞として同様に有用であるのは、細菌細胞であ
る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの種々の株（例えば、ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．
３３６９４）、ＤＨ５α、ＤＨ１０、およびＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．５
３３３８））が、バイオテクノロジーの分野において宿主細胞として周知である
。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、他のＢａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．などの種々の株もまた
、本方法において使用され得る。

【０１７４】 当業者に公知の酵母細胞の多くの株もまた、本発明のポリペプチドの発現のた
めの宿主細胞として利用可能である（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ｉ
ｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、およびＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ
）（Ｂｉｔｔｅｒ，Ｇ．，Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｉｎ：Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．およびＫｉｍｍｅ
ｌ，Ａ．Ｒ．，１５２：６７３−６８４，１９８７）。好ましい酵母株には、例
えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが含まれ、これは、
スフェロプラストの調製によるかまたはアルカリ塩（例えば、ＬｉＣｌ）による
しょりによるかのいずれかででＤＮＡにより容易に形質転換され得る（Ｉｔｏｈ
ら、Ｊ．Ｂａｃｔｒｒｉｏｌ．，１５３：１６３，１９８３）。酵母細胞中で発
現されるいくつかのタンパク質は、培養培地中に効率的にスクリーニングされ一
方、その他は、細胞内に蓄積する。

【０１７５】 さらに、昆虫細胞系が、本発明の方法において利用され得る。このような系は
、例えば、Ｋｉｔｔｓら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：８１０〜８１７
、１９９３）、Ｌｕｃｋｌｏｗ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
４：５６４〜５７２、１９９３）およびＬｕｃｋｌｏｗら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６
７：４５６６〜４５７９、１９９３）に記載される。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ
−９およびＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）である。
好ましくは、その昆虫細胞は、組換えバキュロウイルス粒子に感染し、これはそ
のゲノムに組み込まれているＣｈＭＩｒｐポリペプチド配列を有する。そのバキ
ュロウイルス感染は、組換えＣｈＭＩｒｐの効率的な真核生物発現を導く。この
ようなバキュロウイルス発現系には、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）システ
ム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＢａｃＰＡＫ（登録商標）シ
ステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が含まれる。

【０１７６】 （ポリペプチド産生） ＣｈＭＩｒｐポリペプチド発現ベクターを含む宿主細胞が、当業者に周知の標
準的培地を使用して培養され得る。この培地は、通常、その細胞の増殖および生
存に必要な栄養素すべてを含む。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を培養するのに適切な培地は
、例えば、Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）および／またはＴｅｒｒｉｆｉｃ
Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）である。真核生物細胞を培養するのに適切な培地は、Ｒｏｓ
ｅｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｍｅｄｉａ １６４０（ＲＰＭＩ
１６４０）、最少必須培地（ＭＥＭ）、および／またはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ
Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉａ（ＤＭＥＭ）であり、これらすべて
は、培養される特定の細胞株により示される血清および／または増殖因子が補充
され得る。昆虫培養に適切な培地は、必要な場合にはｙｅａｓｔｏｌａｔｅ、ラ
クトアルブミン加水分解物および／またはウシ胎仔血清を補充した、グレース培
地である。

【０１７７】 代表的には、形質転換細胞の選択的増殖に有用な抗生物質または他の化合物が
、この培地に補充物として添加される。使用される化合物は、宿主細胞が形質転
換されたプラスミド上に存在する選択マーカーエレメントにより決定される。例
えば、その選択マーカーエレメントがカナマイシン耐性である場合、培養培地に
添加される化合物は、カナマイシンである。選択的増殖培地のための他の化合物
としては、アンピシリン、テトラサイクリンおよびネオマイシンが挙げられる。

【０１７８】 宿主細胞により産生されるＣｈＭＩｒｐポリペプチドの量は、当該分野で公知
の標準的方法を使用して評価され得る。このような方法としては、限定はしない
が、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変
性ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分離、免疫沈降、および／または活性アッセイが挙げ
られる。

【０１７９】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドが宿主細胞から分泌されるように設計された場合、
ポリペプチドの大部分は、細胞培養培地にて見出され得る。しかし、ＣｈＭＩｒ
ｐポリペプチドが宿主細胞から分泌される場合、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドは細
胞質および／または核（真核生物宿主細胞について）あるいは細胞質ゾル（細菌
宿主細胞）に存在する。

【０１８０】 宿主細胞の細胞質および／または核（真核生物宿主について）または細胞質ゾ
ル（細菌宿主細胞について）に存在するＣｈＭＩｒｐポリペプチドについては、
その宿主細胞は、代表的には、まず、機械的に破壊されるか、界面活性剤で破壊
され、細胞内の内容物を緩衝溶液中に放出する。ＣｈＭＩｒｐポリペプチドは、
次いで、この溶液から単離され得る。

【０１８１】 溶液からのＣｈＭＩｒｐポリペプチドの精製は、種々の技術を使用して達成さ
れ得る。そのポリペプチドがそのカルボキシ末端もしくはアミノ末端のいずれか
に、ヘキサヒスチジンのようなタグ（ＣｈＭＩｒｐポリペプチド／ヘキサＨｉｓ
）、または他の小さなペプチド、例えば、ＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａ
ｋ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）もしくはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、または融合されたＩｇＧ Ｆｃフラグメントを
含むように合成されている場合、そのポリペプチドは、カラムマトリックスがそ
のタグに高い親和性を有するかまたはそのポリペプチドに直接高い親和性を有す
るアフィニティーカラム（すなわち、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドを特異的に認識
するモノクローナル抗体）にその溶液を通すことによって、１工程で本質的に精
製され得る。例えば、ポリヒスチジンはニッケルに大きな親和性および特異性で
結合し、従ってニッケルのアフィニティーカラム（例えば、Ｑｉａｇｅｎ（登録
商標）ニッケルカラム）が、ＣｈＭＩｒｐポリペプチド／ポリＨｉｓの精製に使
用され得る。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１０．１１．８節、Ｊｏｈ
ｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３を参照のこと。） さらに、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドは、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドを特異的に
認識し得そして結合し得るモノクローナル抗体の使用を介して、精製され得る。

【０１８２】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドが付着したｔａｇなしに調製される場合、そして抗
体が利用可能でない場合、精製のための他の周知の手順が使用され得る。このよ
うな手順としては、限定はしないが、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふる
いクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ゲル溶出と組み合わせたネイティブゲル電気
泳動、ならびに調製的等電点電気泳導（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」マシーン／技術、
Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が挙げられる。いくつかの場合、２つ以
上のこれらの精製技術が、純度の増加を達成するために組み合わされ得る。

【０１８３】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドが細胞内で産生される場合、その細胞内物質（グラ
ム陰性細菌についての封入体を含む）は、その宿主細胞から、任意の標準的な当
業者に公知の方法を使用して、抽出され得る。例えば、宿主細胞は、界面活性剤
での（例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、フレンチプレス、ホモジナイゼーシ
ョン、および／または超音波処理による溶解およびその後の遠心分離により溶解
され、周辺質／細胞質の内容物を放出し得る。

【０１８４】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドが細胞質内で封入体を形成している場合、その封入
体は、しばしば、細胞膜の内面および／または外面に結合し得、したがって、遠
心分離の後にペレット物質中に主に見出される。そのペレット物質は、次いで、
極端なｐＨかまたはカオトロピック剤（例えば、界面活性剤、グアニジン、グア
ニジン誘導体、尿素、または尿素誘導体）で、還元剤（例えば、アルカリｐＨで
ジチオスレイトール、または酸性ｐＨでカルボキシエチルホスフィン）の存在下
で処理され、封入体を放出、分断、および可溶化する。このように可溶化の形態
となったＣｈＭＩｒｐポリペプチドは、次いで、ゲル電気泳導、免疫沈降などを
使用して分析され得る。ＣｈＭＩｒｐポリペプチドを単離することが所望の場合
、単離は、本明細書に記載されるかまたはＭａｒｓｔｏｎら（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ
．，１８２：２６４−２７５，１９９０）に記載されるような標準的な方法を使
用して、達成され得る。

【０１８５】 いくつかの場合には、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドは、単離の際に生物学的に活
性ではないかもしれない。ポリペプチドをその三次構造に「リフォールディング
」または変換し、ジスルフィド結合を生成するための種々の方法が、生物学的活
性を回復するために使用され得る。このような方法には、可溶化ポリペプチドを
、通常ｐＨ７より高い、そして特定の濃度のカオトロピック剤の存在下で、ｐＨ
に暴露することが含まれる。カオトロピック剤の選択は、封入体の可溶化のため
に使用される選択に非常に類似しているが、通常、カオトロピック剤は、低濃度
で使用され、そして必ずしも、可溶化のために使用されるカオトロピック剤と同
じではない。ほとんどの場合、そのリフォールディング／酸化溶液はまた、還元
剤または還元剤プラスその酸化形態を特定の酸化還元ポテンシャルを生成するた
めの特定の比率で含み、ジスルフィドのシャッフリングがタンパク質のシステイ
ン架橋の形成において生じることを可能にする。一般的に使用される酸化還元の
対のいくつかには、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオ
ビスＧＳＨ、塩化銅、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、２−２
−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）が含まれる。共溶媒は
、リフォールディングの効率を増大させるために使用され得、そしてこの目的の
ために使用されるより一般的な試薬には、グリセロール、種々の分子量のポリエ
チレングリコール、アルギニンなどが含まれる。

【０１８６】 封入体が、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの発現の際に有意な程度まで形成されな
い場合、そのポリペプチドは、細胞ホモジネートの遠心分離の後に、主に、上清
に見出される。そのポリペプチドは、さらに、本明細書に記載されるような方法
を使用して上清から単離され得る。

【０１８７】 夾雑物を部分的にまたは完全に含まないように、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドを
部分的または完全に精製するために好ましい状況では、当業者に公知の標準的な
方法が使用され得る。このような方法には、電気泳導による分離およびその後の
電気溶出、種々のタイプのクロマトグラフィー（アフィニティー、免疫アフィニ
ティー、分子ふるい、および／またはイオン交換）、および／または高圧液体ク
ロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの場合、完全
な精製のためには、これらの方法のうちの１つ以上を使用することが好ましい。

【０１８８】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチド、そのフラグメント、および／または誘導体もまた
、当該分野で公知の技術を使用して化学合成法（例えば、固相ペプチド合成）に
より調製され得、その公知技術は、たとえば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら（Ｊ．Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９、１９３）、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら（Ｐｒ
ｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３２、１９８５）、な
らびにＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉ
ｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃ
ｋｆｏｒｄ、ＩＬ、１９８４）に示される技術である。このようなポリペプチド
は、アミノ末端にメチオニンを含んで合成され得るし、または含まずに合成され
得る。化学合成されたＣｈＭＩｒｐポリペプチドもしくはフラグメントは、これ
らの参考文献に示される方法を使用して、ジスルフィド架橋を形成するように酸
化され得る。化学合成されたＣｈＭＩｒｐポリペプチド、フラグメントもしくは
誘導体は、組換え産生されるかもしくは天然の供給源から精製された対応するＣ
ｈＭＩｒｐポリペプチド、フラグメントもしくは誘導体に匹敵する生物学的活性
を有すると予測され、従って、組換えＣｈＭＩｒｐポリペプチドもしくは天然の
ＣｈＭＩｒｐポリペプチドと互換可能に使用され得る。

【０１８９】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドを得る別の手段は、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドが天
然に見出される供給源の組織および／または流体のような生物学的サンプルから
の精製による。このような精製は、本明細書中に記載されるようなタンパク質精
製のための方法を使用して行われ得る。精製の間、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの
存在が、例えば、組換え的に産生されたＣｈＭＩｒｐポリペプチドまたはそのペ
プチドフラグメントに対して調製される抗体を使用してモニターされ得る。

【０１９０】 核酸およびポリペプチドを産生するための多くのさらなる方法は、当該分野に
おいて公知であり、この方法は、ＣｈＭＩｒｐに対して特異性を有するポリペプ
チドを産生するために使用され得る。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２２９７−１２３０３、１９
９７を参照のこと。これは、ｍＲＮＡとそのコードされるペプチドとの間の融合
タンパク質の産生を記載する。Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｌ ３：２６８−７３，１９９９もまた参照のこと。さらに、米
国特許第５，８２４，４６９号は、特定の生物学的機能を実行し得るオリゴヌク
レオチドを得るための方法を記載する。この手順は、異種プールのオリゴヌクレ
オチドを生成する工程を包含し、それぞれが、５’ランダム化配列、中心予備選
択配列、および３’ランダム化配列を有する。得られる異種プールは、所望の生
物学的機能を示さない細胞の集団に導入される。次いで、細胞の亜集団を、所定
の生物学的機能を示すものについてスクリーニングする。その亜集団から、所望
の生物学的機能を実行し得るオリゴヌクレオチドが単離される。

【０１９１】 米国特許第５，７６３，１９２号；同第５，８１４，４７６号；同第５，７２
３，３２３号；および同第５，８１７，４８３号は、ペプチドまたはポリペプチ
ドを産生するためのプロセスを記載する。これは、確率論的遺伝子またはそのフ
ラグメントを産生し、次いで、確率論的遺伝子によってコードされた１以上のタ
ンパク質を産生する宿主細胞にこれらの遺伝子を導入することによって達成され
る。次いで、この宿主は、所望の活性を有するペプチドまたはポリペプチドを産
生する、これらのクローンを同定するためにスクリーニングされる。

【０１９２】 ペプチドまたはポリペプチドを産生するための別の方法は、Ａｔｈｅｒｓｙｓ
，Ｉｎｃ．によって出願されたＰＣＴ／ＵＳ９８／２００９４（ＷＯ９９／１５
６５０）（「Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」（ＲＡＧＥ−ＧＤ）と
して知られている）に記載されており、このプロセスは、インサイチュ組換え方
法によって、内因性遺伝子の発現または遺伝子の過剰発現の活性化を含む。例え
ば、内因性遺伝子の発現は、非相同性組換えまたは異常な組換えによって、遺伝
子の発現を活性化し得る標的細胞中に、調節配列を組み込むことによって、活性
化または増加される。この標的ＤＮＡは、まず、放射線に供せられ、そして遺伝
子プロモーターに挿入される。このプロモーターは、遺伝子の前方の分岐点に最
終的に配置され、遺伝子の転写を開始する。これは、所望のペプチドまたはポリ
ペプチドの発現より生じる。

【０１９３】 これらの方法はまた、包括的なＣｈＭＩｒｐポリペプチド発現ライブラリーを
作製するために使用され得、これは、続いて、種々のアッセイ（例えば、生化学
的アッセイ、細胞アッセイおよび全生物アッセイ（例えば、植物、マウスなど）
）において、ハイスループット表現型スクリーニングのために使用され得ること
が理解される。

【０１９４】 （ＣｈＭＩｒｐのタンパク質、ポリペプチド、フラグメント、改変体およびム
テイン） 本発明のポリペプチドは、単離されたＣｈＭＩｒｐポリペプチドおよびそれに
関するポリペプチド（本明細書中上記されるような、フラグメント、改変体、融
合ポリペプチドおよび誘導体を含む）を包含する。

【０１９５】 本発明のＣｈＭＩｒｐフラグメントは、そのポリペプチドのアミノ末端での短
縮化（リーダー配列を含むかまたは含まない）、カルボキシ末端での短縮化、お
よび／または内部での欠失から生じ得る。ほとんどの欠失および挿入、ならびに
特に置換は、ＣｈＭＩｒｐタンパク質の特徴での極端な変化を生じると予測され
ない。しかし、実行する前に置換、欠失もしくは挿入の正確な効果を予測するこ
とが困難である場合、当業者は、この効果が慣用的スクリーニングアッセイによ
り評価されることを認識する。例えば、改変体は、代表的には、ＣｈＭＩｒｐポ
リぺプチドをコードする核酸の部位特異的変異誘発、組換え細胞培養物における
その改変体核酸の発現、そして必要に応じてその細胞培養物からの精製により産
生され、その精製は例えば、ポリクローナル抗ＣｈＭＩｒｐ抗体カラム上でのイ
ムノアフィニティー吸着（少なくとも１つの残りの免疫エピトープにその改変体
を結合することによりその改変体を吸着するため）による。好ましい実施形態に
おいて、短縮化および／または欠失は、約１０アミノ酸、または約２０アミノ酸
、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、ま
たは約１００を超えるアミノ酸を含む。そうして産生されたポリペプチドフラグ
メントは、約２５個連続するアミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５ア
ミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１５０アミノ酸、または約２００ア
ミノ酸、または約２５０アミノ酸、または約２７５アミノ酸、または約３００ア
ミノ酸を含む。このようなＣｈＭＩｒｐポリペプチドフラグメントは、必要に応
じて、アミノ末端メチオニン残基を含み得る。

【０１９６】 本発明のＣｈＭＩｒｐポリペプチド改変体は、配列番号２と比較して、１つ以
上のアミノ酸置換、付加および／または欠失を含む。好ましい実施形態において
、この改変体は、１〜３、または１〜５、または１〜１０、または１〜１５、ま
たは１〜２０、または１〜２５、または１〜５０、または１〜７５、または１〜
１００、または１００を超える、アミノ酸置換、挿入、付加および／もしくは欠
失を有し、ここでその置換が、上記のように保存的であり得るか、または非保存
的であり得るか、あるいはその組み合わせであり得る。より詳細には、ＣｈＭＩ
ｒｐ改変体は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み得、この配列において
、アミノ酸２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、
１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、
２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、
３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、
５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、
６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、
７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、
８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、
９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１
０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１
１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１
２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１
３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１
４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１
５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１
６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１
７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１
８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１
８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１
９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２
０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２
１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２
２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２
３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２
４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２
５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２
６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２
７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２
７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２
８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２
９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３
０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３
１５、３１６、または３１７までからなる群からの１つ以上のアミノ酸が別のア
ミノ酸で置換されている。この改変体は、カルボキシ末端またはアミノ末端（リ
ーダー配列を含むかもしくは含まない）のいずれかに、アミノ酸残基の付加を有
し得る。

【０１９７】 好ましいＣｈＭＩｒｐポリペプチド改変体は、ネイティブＣｈＭＩｒｐポリペ
プチドと比較してグリコシル化部位の数および／または型が変化している、グリ
コシル化改変体を含む。１つの実施形態において、ＣｈＭＩｒｐ改変体は、より
多くの数またはより少ない数のＮ結合型グリコシル化部位を含む。Ｎ結合型グリ
コシル化部位は、配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒにより特徴付けられ、ここでＸとして
示されるアミノ酸残基は、プロリンを除く任意の型のアミノ酸であり得る。この
配列を作製するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ結合型等鎖の付加のために可能
な新規な部位を提供する。あるいは、この配列を除去するための置換が、既存の
Ｎ結合型等鎖を除去する。また、１つ以上のＮ結合型グリコシル化部位（代表的
には天然に存在する部位）が除去されかつ１つ以上の新規なＮ結合部位が産生さ
れる、Ｎ結合型等鎖の再構成も提供される。

【０１９８】 当業者は、周知の技術を使用して、ネイティブのＣｈＭＩｒｐポリペプチドの
適切な改変体を決定し得る。例えば、生物学的活性を破壊することなく変化され
得る分子の適切な領域を推定し得る。また、当業者は、生物学的活性または構造
に重要であり得る領域さえも、その生物学的活性を破壊することもしくはそのポ
リペプチド構造に不利に影響することなく、保存的アミノ酸置換に供され得るこ
とを認識する。

【０１９９】 活性を破壊することなく変化され得る分子の適切な領域を予測するために、当
業者は、活性に重要であると考えられる領域を標的とし得る。例えば、同じ種ま
たは他の種由来の類似の活性を有する類似のポリペプチドが公知である場合、当
業者は、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドのアミノ酸配列をそのような類似のポリペプ
チドと比較し得る。このような比較を行った後、当業者は、類似のポリペプチド
間で保存される分子の残基および部分を決定し得る。当業者は、保存されないＣ
ｈＭＩｒｐ分子の領域での変化が生物学的活性および／または構造に不利に影響
しそうにないことを知っている。当業者はまた、比較的保存された領域において
さえ、活性を保持しつつ、天然に存在する残基に代わって化学的に類似するアミ
ノ酸でおそらく置換し得る（例えば、保存的アミノ酸残基置換）。

【０２００】 また、当業者は、活性もしくは構造に重要な類似のポリペプチド中の残基を同
定する構造−機能研究を検討し得る。このような比較を考慮して、当業者は、類
似のポリペプチド中の活性もしくは構造に重要なアミノ酸残基に対応するＣｈＭ
Ｉｒｐ中のアミノ酸残基の重要性を予測し得る。当業者は、ＣｈＭＩｒｐのこの
ような推定された重要なアミノ酸残基に代わる化学的に類似のアミノ酸置換を選
択し得る。

【０２０１】 利用可能な場合、当業者はまた、類似のポリペプチドにおける結晶構造、およ
びその構造に関連するアミノ酸配列を分析し得る。その情報を考慮して、当業者
は、その３次元構造に関するＣｈＭＩｒｐポリペプチドのアミノ酸残基の整列を
予測でき得る。当業者は、そのタンパク質の表面上にあると予測されるアミノ酸
残基に対する急激な変化を作製しないように選択し得る。なぜなら、そのような
残基は、他の分子との重要な相互作用に関与し得るからである。

【０２０２】 さらに、当業者は、各アミノ酸残基で単一アミノ酸置換を含む、試験改変体を
産生し得る。この改変体は、本願に開示される活性アッセイを使用してスクリー
ニングされ得る。このような改変体は、適切な改変体についての情報を集めるた
めに使用される、例えば、特定のアミノ酸残基への変化が活性の破壊を生じたこ
とを発見した場合、このような変化を含む改変体が回避される。従って、このよ
うな実験から収集された情報に基づいて、受容可能なさらなる改変体を見出すよ
うに試みる場合、当業者は、さらなる置換が単独でかもしくは他の変異と組み合
わせてのいずれかで回避されるべきアミノ酸を知っている。

【０２０３】 本発明のＣｈＭＩｒｐ融合ポリペプチドは、ペプチドまたはタンパク質の異種
の機能部分に融合された、ＣｈＭＩｒｐポリペプチド、フラグメント、改変体も
しくは誘導体を含む。異種ペプチドおよびタンパク質としては、ＣｈＭＩｒｐ融
合ポリペプチドの検出および／もしくは単離を可能にするエピトープ、膜貫通レ
セプタータンパク質もしくはその部分（例えば、細胞外ドメイン）、または膜貫
通レセプタータンパク質に結合するリガンドもしくはその部分、触媒活性な酵素
もしくはその部分、オリゴマー化を促進するタンパク質もしくはペプチド（例え
ば、ロイシンジッパードメイン）および安定性を増大させるタンパク質もしくは
ペプチド、または循環の半減期（例えば、免疫グロブリン定常領域）が挙げられ
るが、これらに限定されない。ＣｈＭＩｒｐポリペプチドは、それ自体またはそ
のフラグメント、改変体もしくは誘導体に融合され得る。融合は、ＣｈＭＩｒｐ
ポリペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれかでなされ得、そし
てリンカーまたはアダプター分子なしで直接であり得るし、あるいはリンカーま
たはアダプター分子（例えば、１つ以上のアミノ酸残基〜約２０アミノ酸残基ま
で、もしくは約５０アミノ酸残基まで）を介してであり得る。リンカーまたはア
ダプター分子はまた、融合部分の分離およびその後のフォールディングを可能に
するように、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼについての切断部位もしくはタンパ
ク質分解切断についての切断部位を含んで設計され得る。

【０２０４】 また、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの循環的に入れ換えられた（ｃｉｒｃｕｌａ
ｒｌｙ ｐｅｒｍｕｔｅｄ）構造アナログが、本発明の一部として想像される。

【０２０５】 組換えＤＮＡ方法の開発により、タンパク質のフォールディング、構造および
機能に対する配列転位の効果を研究することが可能になった。新規な配列を作製
する際に使用されるアプローチは、そのアミノ酸配列の線形再構成（ｌｉｎｅａ
ｒ ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）による関連するタンパク質の天然に存在す
る対のアプローチと類似する（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７６：３２１８〜３２２２、１９７９；Ｔｅａ
ｔｈｅｒおよびＥｒｆｌｅ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：３８３７−３８
４１、１９９０；Ｓｃｈｉｍｍｉｎｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０４
：１３−１９、１９９２；ＹａｍｉｕｃｈｉおよびＭｉｎａｍｉｋａｗａ、ＦＥ
ＢＳ Ｌｅｔｔ ２６０：１２７−１３０、１９９１；ＭａｃＧｒｅｇｏｒら、
ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３７８：２６３〜２６６、１９９６）。この型の再構成を
タンパク質に初めてインビトロで適用したことが、Ｇｏｉｄｅｎｂｅｒｇおよび
Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６５：４０７〜４１３、１９８
３）により記載された。新規なＮ末端が、もとの配列の内部部位（区切り点（ｂ
ｒｅａｋｐｏｉｎｔ））に選択され、その新規な配列は、もとのＣ末端もしくは
その付近にあるアミノ酸に到達するまで、その区切り点からもとと同じアミノ酸
順序を有する。この点で、新規な配列は、直接にかもしくはさらなる配列部分（
リンカー）を介してのいずれかで、もとのＮ末端もしくはその付近にあるアミノ
酸に結合され、そしてその新規な配列は、もとの配列の区切り部位のＮ末端側に
あったアミノ酸もしくはその付近点に到達するまで、もとと同じ配列が続き、こ
の残基はその鎖の新規なＣ末端を形成する。

【０２０６】 このアプローチは、５８〜４６２アミノ酸のサイズ範囲のタンパク質に適用さ
れている（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ＆ Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．１６５：４０７−４１３、１９８３；Ｌｉ ＆ Ｃｏｆｆｉｎｏ、Ｍｏｌ
．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：２３７７−２３８３、１９９３）。試験されたタ
ンパク質は、広範な構造的クラスを表し、これらには、主にα−ヘリックスを含
むタンパク質（インターロイキン−４；Ｋｒｅｉｔｍａｎら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ
７：３１１−３１８、１９９５）、主にβ−シートを含むタンパク質（インタ
ーロイキン−１；Ｈｏｒｌｉｃｋら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．５：４２７−４
３１、１９９２）またはこの２つの混合物を含むタンパク質（酵母ホスホリボシ
ルアントラニル酸イソメラーゼ；Ｌｕｇｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：２０
６−２１０、１９８９）が挙げられる。

【０２０７】 好ましい実施形態において、ＣｈＭＩｒｐポリペプチド、フラグメント、改変
体および／または誘導体を、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に融合させる。１つの例にお
いて、当業者に公知の方法を使用して、ヒトＩｇＧのヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ
３領域を、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合さ
せ得る。別の例において、ヒンジ領域の一部ならびにＣＨ２およびＣＨ３領域を
、融合し得る。このように産生されたＣｈＭＩｒｐ Ｆｃ融合ポリペプチドは、
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティーカラム（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、
ＩＬ）を用いて精製され得る。さらに、Ｆｃ領域に融合されたペプチドおよびタ
ンパク質は、その融合されていない対応物よりも実質的に大きい、インビボでの
半減期を示すことが見い出されている。また、Ｆｃ領域への融合は、この融合ポ
リペプチドのダイマー化／マルチマー化を可能にする。このＦｃ領域は、天然に
存在するＦｃ領域であり得るか、または治療的品質、循環時間、凝集の減少など
のような、特定の質を改善するように変更され得る。

【０２０８】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチド誘導体はまた、本発明の範囲に含まれる。本発明の
ＣｈＭＩｒｐタンパク質の共有結合改変は、本発明の範囲内に含まれる。改変体
ＣｈＭＩｒｐタンパク質は、インビトロ合成によって都合よく調製され得る。こ
のような改変は、精製タンパク質または粗タンパク質の標的アミノ酸残基を、選
択した側鎖または末端残基と反応し得る有機誘導体化薬剤と反応させることによ
って、その分子内に導入され得る。得られた共有結合誘導体は、生物学的活性に
ついて重要な残基を同定するためのプログラムにおいて有用である。

【０２０９】 システイン残基は、最も通常には、α−ハロアセテート（および対応するアミ
ン）（例えば、クロロ酢酸またはクロロアセトアミド）と反応させて、カルボキ
シメチル誘導体またはカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイン残基
はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β（５−イミダゾイル）プ
ロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルカリマレイミド、３−ニト
ロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ
メルクリ安息香酸、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ
−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によって誘導体
化される。

【０２１０】 ヒスチジン残基は、ｐＨ５．５〜７．０でのジエチルプロカーボネートとの反
応によって誘導体化される。なぜなら、この薬剤は、ヒスチジン側鎖に比較的特
異的であるからである。ｐ−ブロモフェナシルブロミドもまた有用であり；この
反応は、好ましくは、ｐＨ６．０の０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で行われる
。

【０２１１】 リジン残基およびアミノ末端残基は、コハク酸無水物またはカルボン酸無水物
と反応させる。これらの薬剤での誘導体化は、リジン残基の電荷を逆転させる効
果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬としては
、イミドエステル（例えば、メチルピコリンイミダート）；ピリドキサルホスフ
ェート；ピリドキサル；クロロ水素化ホウ素；トリニトロベンゼンスルホン酸；
Ｏ−メチルイソ尿素；２，４ペンタンジオン；およびトランスアミナーゼ（グリ
オキシレートとの触媒反応）が挙げられる。

【０２１２】 アルギニン残基は、１つまたはいくつかの従来の試薬（とりわけ、フェニルグ
リオキサル、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオンおよびニン
ヒドリン）との反応によって改変される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニ
ジン官能基の高いｐＫ_ａに起因して、その反応が、アルカリ条件で行われること
を必要とする。さらに、これらの試薬は、リジンの官能基およびアルギニンのε
アミノ基と反応し得る。

【０２１３】 チロシン残基の特異的改変は、それ自体、広範に研究されており、特に、芳香
族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応による、チロシン残基
へのスペクトル標識の導入に特に関心が置かれる。最も通常には、Ｎ−アセチル
イミダゾールおよびテトラニトロメタンが、それぞれ、Ｏ−アセチルチロシン種
および３−ニトロ誘導体を形成するために使用される。チロシン残基は、^１２５ Ｉまたは^１３１Ｉを使用してヨウ素化され、ラジオイムイアッセイ（上記のクロ
ラミンＴ法が適切である）における使用のための標識タンパク質を調製する。

【０２１４】 カルボキシル側鎖基（アスパラギン酸またはグルタミン酸）は、カルボジイミ
ド（Ｒ^１）（例えば、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エ
チル）カルボジイミドまたは１−エチル−３（４アゾニア４，４−ジメチルペン
チル）カルボジイミド）との反応によって選択的に改変される。さらに、アスパ
ラギン酸残基およびグルタミン残基は、アンモニウムイオンとの反応によってア
スパラギン酸残基およびグルタミン酸残基に変換される。

【０２１５】 二官能性薬剤を用いた誘導体化は、ＣｈＭＩｒｐポリペプチド融合ポリペプチ
ドを切断して切断されたポリペプチドを放出および回収するための方法において
使用するための、水不溶性の支持体マトリクスまたは表面に対してＣｈＭＩｒｐ
を架橋するために有用である。一般に使用されるか教材としては、１，１−ビス
（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル（例えば、４−アジドサリチル酸を有するエステル）
、ホモ二官能性のイミドエステル（３，３’−ジチオ（スクシンイミジルプロピ
オネートのようなジスクシンイミジルエステルを含む）、およびビス−Ｎ−マレ
イミド−１，８−オクタンのような二官能性マレイミドが挙げられる。メチル−
３−［ｐ−アジドフェニルジチオ］プロピオイミデートのような誘導体化剤は、
光活性化可能な中間体を生成し、この中間体は、光の存在かで架橋を形成し得る
。あるいは、米国特許第３，９６９，２８７号；同第３，６９１，０１６号；同
第４，１９５，１２８号；同第４，２４７，６４２号；同第４，２２９，５３７
号；および同第４，３３０，４４０号に記載される、反応性の水不溶性マトリク
ス（例えば、シアノゲンブロミド活性化炭水化物）および反応性の基質は、タン
パク質の固定に使用される。

【０２１６】 グルタミン残基およびアスパラギン残基は、しばしば対応するグルタミル（グ
ルタミン酸）残基およびアスパルチル（アスパラギン酸）残基へと脱アミド化さ
れる。あるいは、これらの残基は、穏和な酸性条件下で脱アミド化される。これ
らの残基のいずれの形態も、本発明の範囲内にある。

【０２１７】 他の改変としては、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリン残基また
はスレオニン残基の水酸基のリン酸化、リジン、アルギニンのαアミノ酸および
ヒスチジンの側鎖のメチル化（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ
：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ
．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９
−８６，１９８３）、Ｎ末端アミンのアセチル化、およびいくつかの場合におい
て、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。そのような誘導体化は、化
学的に改変されたＣｈＭＩｒｐポリペプチド組成物であり、その組成物において
、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドは、ポリマーに結合している。選択されるポリマー
は、代表的に、水溶性であり、その結果、付着するそのタンパク質は、水性環境
下（例えば、生理学的な環境下）では沈澱しない。選択されるポリマーは、通常
、単一の反応基（たとえば、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化の
ためのアルデヒド）であり、その結果、重合の程度は、本発明の方法において提
供されるように制御され得る。

【０２１８】 このポリマーは、任意の分子量のものであり得、そして分岐していても分岐し
ていなくてもよい。このポリマーは各々、代表的に、２ｋＤａから約１００ｋＤ
ａの間の平均分子量を有する（ここでは、用語「約」とは、水溶性ポリマーの調
製物においては、いくつかの分子が、言及された分子量よりも多いか、いくらか
少ないことをいう）。各ポリマーの平均分子量は、好ましくは、約５ｋＤａと約
５０ｋＤａの間、より好ましくは、約１２ｋＤａと約４０ｋＤａとの間、そして
最も好ましくは、約２０ｋＤａと約３５Ｄａとの間である。適切な水溶性ポリマ
ーまたはその混合物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｎ
結合型炭水化物またはＯ結合型炭水化物、糖、リン酸、ポリエチレン、グリコー
ル（ＰＥＧ）（これは、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）、アルコキシ−ポリエチレング
リコール、またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールを含む、タンパク質
を誘導するために使用されたＰＥＧの形態を含む）、モノメトキシ−ポリエチレ
ングリコール、デキストラン（例えば、低分子量（例えば、約６ｋＤのデキスト
ラン））、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビ
ニルピロリジン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー
、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化
ポリオール（例えば、グリセロール）、およびビニルアルコール。配列番号２の
アミノ酸配列を含むポリペプチドまたはＣｈＭＩｒｐポリペプチド改変体の、共
有結合したポリペプチドのマルチマーを調製するために使用され得る、二官能性
架橋分子もまた、本発明に含まれる。

【０２１９】 一般に、化学的誘導体化は、活性化したポリマー分子とタンパク質を反応させ
るために使用される任意の適切な条件下で、実施され得る。ポリペプチドの化学
的誘導体を調製するための方法は、一般に、以下の工程を包含する：（ａ）配列
番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはＣｈＭＩｒｐポリペプチド改変
体が、１以上のポリマー分子に結合する条件下で、活性化したポリマー分子（例
えば、ポリマー分子の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）とポリペプチド
を反応させる工程、および（ｂ）反応生成物を得る工程。最適の反応条件は、既
知のパラメータおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、ポリマー分子
のタンパク質に対する比が大きくなるほど、結合したポリマー分子の割合も大き
くなる。１実施形態において、ＣｈＭＩｒｐポリペプチド誘導体は、アミノ末端
の単一ポリマー分子部分を有し得る。例えば、米国特許第５，２３４，７８４号
を参照のこと。

【０２２０】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドのＰＥＧ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、当該分野
で公知の任意のペギル化反応を使用して特異的に実施され得る。このような反応
は、例えば、以下の参考文献に記載されている：Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔ
ｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ３：４−１０、ｌ９９２；欧州特許第０１５４３１６号お
よび０４０１３８４号。例えば、ＰＥＧ化は、以下に記載するように、反応性ポ
リエチレングリコール分子（または、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル
化反応またはアルキル化反応を介して実施され得る。

【０２２１】 本明細書における使用のために特に好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレン
グリコール（略称ＰＥＧ）である。本明細書において使用されるように、ポリエ
チレングリコールとは、他のタンパク質を誘導体化させるために使用されてきた
、ＰＥＧの任意の形態（例えば、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−ポリエチレ
ングリコールまたはアリールオキシ−ポリエチレングリコール）を包含すること
が意味される。ＰＥＧは、広範な分子量で入手可能な、直鎖状または分枝状の中
性のポリエーテルであり、水および多くの有機溶媒に可溶性である。ＰＥＧは、
水中に存在する場合、他のポリマーまたはペプチドを排除するのに有効であり、
これは、主に、その高い動的な鎖可動性および親水性性質により、したがって、
他のタンパク質またはポリマー表面に結合した場合に、水のシェルまたは水和球
（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｓｐｈｅｒｅ）を形成する。ＰＥＧは、非毒性であり、
非免疫原性であり、そして内用消費に食品医薬庁（ＦＤＡ）に承認されている。

【０２２２】 ＰＥＧに結合体化されたときにタンパク質または酵素は、動物に投与した場合
に、生体活性、非抗原性特性およびクリアランス速度の減少を示した。Ｆ．Ｍ．
Ｖｅｒｏｎｅｓｅら、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ
ｏｆ Ｍｏｎｏｍｅｔｈｏｘｙｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏ．）
−ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｉｉｓ編、Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ
Ｇｌｙｃｏｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−−Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ
Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １２７−３６、１９９２（
本明細書中に参考として援用される）。これは、免疫系による認識の阻止におけ
る、ＰＥＧの排除特性に起因する。さらに、ＰＥＧは、タンパク質吸着を減少さ
せ、血液適合性を改善するための、表面改変手段に広範に使用されている。Ｓ．
Ｗ．Ｋｉｍら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１６：１１６−３０ １
９８７；Ｊａｃｏｂｓら、Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ １２：５００−５０１，
１９８８；Ｐａｒｋら、Ｊ．Ｐｏｌｙ．Ｓｃｉ，Ｐａｒｔ Ａ ２９：１７２５
−３１，１９９１（本明細書中で参考として援用される）。疎水性ポリマー表面
（例えば、ポリウレタンおよびポリスチレン）は、ＰＥＧ（ＭＷ ３，４００）
のグラフト化によって改変され、非トロンボゲン形成性表面として使用されてい
る。これらの研究において、表面特性（接触角）は、ＰＥＧの水和効果に起因し
て、親水性表面とより一致した。より重要なことに、タンパク質（アルブミンお
よび他の血漿タンパク質）の吸着は、非常に減少され、これは、ＰＥＧの高い鎖
可動性、水和球およびタンパク質排除特性から生じる。

【０２２３】 ＰＥＧ（ＭＷ ３，４０００）は、表面固定研究（Ｐａｒｋら、Ｊ．Ｂｉｏｍ
ｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．２６：７３９−４５，１９９２）において最適なサイズ
として決定され、一方、ＰＥＧ（ＭＷ ５，０００）は、タンパク質抗原性の減
少において最も有利であった（Ｆ．Ｍ．Ｖｅｒｏｎｅｓｅら、Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒ
ｉｓ編、Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−−
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ １２７−３６、前出）。

【０２２４】 一般に、化学誘導体化は、生物学的に活性な物質を活性化ポリマー分子と反応
させるために使用される任意の適切な条件下で行われ得る。ＰＥＧ化ＣｈＭＩｒ
ｐポリペプチドを調製するための方法は、一般に以下の工程を包含する：（ａ）
ＣｈＭＩｒｐポリペプチドが、１以上のＰＥＧ基に結合されるような条件下でポ
リペプチドをポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたは
アルデヒド誘導体）と反応させる工程、および（ｂ）反応生成物を得る工程。一
般に、アシル化反応に最適な反応条件は、公知のパラメーターおよび所望の結果
に基づいて決定される。例えば、ＰＥＧ：タンパク質の比が大きいほど、ポリ−
ペグ化生成物の割合が高くなる。

【０２２５】 好ましい実施形態において、ＣｈＭＩｒｐポリペプチド誘導体は、Ｎ末端で単
一のＰＥＧ部分を有する。米国特許第８，２３４，７８４号（本明細書中で参考
として援用される）を参照のこと。

【０２２６】 別の実施形態において、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドは、ビオチンに化学的に連
結され得る。次いで、このビオチン／Ｃｄｋ１１ポリペプチド分子は、アビジン
に結合され得、その結果、４価のアビジン／ビオチン／Ｃｄｋ１１ポリペプチド
分子が得られる。ＣｈＭＩｒｐポリペプチドはまた、ジニトロフェノール（ＤＮ
Ｐ）またはトリニトロフェノール（ＴＮＰ）に共有結合され得、そして得られた
結合体は、抗−ＤＮＰまたは抗−ＴＮＰ−ＩｇＭと共に沈殿し、１０価の十量体
の結合体を形成する。

【０２２７】 一般に、本発明のＣｈＭＩｒｐポリペプチド誘導体の投与によって緩和または
調節され得る状態としては、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドについて本明細書中で記
載される状態が挙げられる。しかし、本明細書中に開示されるＣｈＭＩｒｐポリ
ペプチド誘導体は、非誘導体化分子と比較して、さらなる活性、増強または減少
された生物学的活性、または他の特徴（例えば、増加または減少された半減期）
を有し得る。

【０２２８】 （マイクロアレイ） ＤＮＡマイクロアレイ技術が、本発明に従って利用され得ることは明らかであ
る。ＤＮＡマイクロアレイは、固体支持体（例えば、ガラス）上に配置された、
核酸の微小の高密度アレイである。このアレイ内の各セルまたはエレメントは、
単一種のＤＮＡの多くのコピーを有し、このＤＮＡは、その同族のｍＲＮＡに対
するハイブリダイゼーションのための標的として作用する。ＤＮＡマイクロアレ
イ技術を使用する発現プロファイリングにおいて、最初に、ｍＲＮＡが、細胞ま
たは組織サンプルから抽出され、次いで、蛍光標識されたｃＤＮＡに酵素的に変
換される。この材料を、マイクロアレイにハイブリダイズさせ、そして未結合ｃ
ＤＮＡを洗浄により除去する。次いで、アレイ上に提示される別々の遺伝子の発
現を、各標的ＤＮＡに特異的に結合された標識ｃＤＮＡの量を定量することによ
って可視化する。このようにして、数千の遺伝子の発現を、生物学的材料の単一
のサンプルから、高スループットの並行様式で定量し得る。

【０２２９】 この高スループット発現プロファイリングは、本発明のＣｈＭＩｒｐ分子に関
する広範な適用を有する。これらの適用としては、以下が挙げられるが、これら
に限定されない：治療用標的としてのＣｈＭＩｒｐ疾患関連遺伝子の同定および
確証；ＣｈＭＩｒｐ分子およびそのインヒビターの分子毒性研究；集団の層別化
および臨床試験用の代理マーカーの作製；ならびに高スループットスクリーニン
グ（ＨＴＳ）における選択的な化合物の同定を補助することによるＣｄｋ１１関
連小分子薬物発見の増大。

【０２３０】 （選択的結合因子） 本明細書中で使用される場合、用語「選択的結合因子」とは、１以上のＣｈＭ
Ｉｒｐポリペプチドに対する特異性を有する分子をいう。適切な選択的結合因子
としては、抗体およびその誘導体、ポリペプチド、ならびに小分子が挙げられる
が、これらに限定されない。適切な選択的結合因子は、当該分野で公知の方法を
使用して調製され得る。本発明の例示的ポリペプチド選択的結合因子は、ＣｈＭ
Ｉｒｐポリペプチドの特定の部分を結合し得、それによって、ＣｈＭＩｒｐポリ
ペプチドの活性または機能を阻害し得る。

【０２３１】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドを結合する選択的結合因子（例えば、抗体および抗
体フラグメント）は、本発明の範囲内にある。抗体は、ポリクローナル（単一特
異的なポリクローナルを含む）抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、組換え抗
体、キメラ抗体、ヒト化抗体（例えば、ＣＤＲグラフト化抗体）、ヒト抗体、単
鎖抗体および／または二特異性抗体、ならびにそれらのフラグメント、改変体ま
たは誘導体であり得る。抗体フラグメントは、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドのエピ
トープに結合する抗体の部分を含む。このようなフラグメントの例としては、全
長抗体の酵素的切断によって生成される、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’
）フラグメントが挙げられる。他の結合フラグメントとしては、組換えＤＮＡ技
術（例えば、抗体可変領域をコードする核酸配列を含む組換えプラスミドの発現
）によって精製されるフラグメントが挙げられる。

【０２３２】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドに対して指向されるポリクローナル抗体は、一般に
、ＣｈＭＩｒｐおよびアジュバントの複数回の皮下注射または腹腔内注射によっ
て、動物（例えば、ウサギまたはマウス）において産生される。ＣｈＭＩｒｐポ
リペプチドあるいはその改変体、フラグメントまたは誘導体を、キャリアタンパ
ク質に結合体化することが有用であり得、このキャリアタンパク質は、免疫され
る種において免疫原性である（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血
清、アルブミン、ウシサイログロブリンまたはダイズトリプシンインヒビター）
。また、凝集化因子（例えば、ミョウバン）も、免疫応答を増強するために使用
される。免疫後、動物を採血し、そして血清を、抗ＣｈＭＩｒｐ抗体力価につい
てアッセイする。

【０２３３】 ＣｈＭＩｒｐに対して指向されるモノクローナル抗体は、培養物中の継代細胞
株による抗体分子の産生を提供する、任意の方法を使用して産生される。モノク
ローナル抗体を調製するための適切な方法の例としては、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａ
ｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７、１９７５のハイブリドーマ法、およびＫｏ
ｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１、１９８４；Ｂｒｏｄｅｕｒ
ら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１〜６３頁（Ｍａｒｃ
ｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）のヒトＢ細胞ハ
イブリドーマ法が挙げられる。

【０２３４】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドと反応性のモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞株もまた、本発明によって提供される。

【０２３５】 本発明のモノクローナル抗体は、治療剤としての使用のために改変され得る。
１つの実施形態は、「キメラ」抗体であり、ここで、重鎖および／または軽鎖の
一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに
属する抗体における対応する配列と、同一であるかまたは相同であり、鎖の残り
の部分は、別の種に由来するかまたは別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属
する抗体における対応する配列と、同一であるかまたは相同である。このような
抗体のフラグメントもまた、それらが、所望の生物学的活性を示す限り、含まれ
る（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１−６８５５、１９８５（本
明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。

【０２３６】 別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、「ヒト化」抗体であ
る。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で周知である（米国特許第
５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６２号を参照のこと）。一般に
、ヒト化抗体は、非ヒト供給源由来のそのヒト化抗体に１以上のアミノ酸残基が
導入されている。ヒト化は、例えば、齧歯目の相補的決定領域（ＣＤＲ）の少な
くとも一部を、ヒト抗体の対応する領域で置換することによる、当該分野で記載
される方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２、１９８６；
Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７、１９８８；Ｖ
ｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６、１９８８
）によって、行われ得る。

【０２３７】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチド、フラグメント、改変体および／または誘導体を結
合する、完全ヒト抗体もまた、本発明に含まれる。このような抗体は、必要に応
じてキャリアに結合体化されたＣｈＭＩｒｐ抗原（すなわち、少なくとも６個連
続するアミノ酸を有する）で免疫することによって産生される。内因性免疫グロ
ブリン産生の非存在下でヒト抗体のレパートリーを産生し得る、トランスジェニ
ック動物（例えば、マウス）を使用する。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：２５５１−２５５５
、１９９３；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８
、１９９３；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．７：
３３、１９９３を参照のこと。１つの方法において、このようなトランスジェニ
ック動物は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をその中でコードする内因性遺伝
子座を不能とし、ヒト重鎖および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を、その
ゲノム内に導入することによって産生される。次いで、部分的に改変された動物
（完全未満の補体の改変を有する）を交雑育種して、所望の免疫系の改変の全て
を有する動物を得る。免疫原を投与した場合、これらのトランスジェニック動物
は、これらの抗原に免疫特異的な可変領域を含む、（例えば、マウスよりもむし
ろ）ヒトのアミノ酸配列を有する抗体を産生する。ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ
９６／０５９２８およびＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９２６を参照のこと。さらなる
方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／
２４５、ＰＣＴ／ＧＢ８９／０１２０７、ならびにＥＰ５４６０７３Ｂ１および
ＥＰ５４６０７３Ａ１に記載される。ヒト抗体はまた、本明細書中に記載される
ような、宿主細胞における組換えＤＮＡの発現またはハイブリドーマ細胞におけ
る発現によって産生される。

【０２３８】 ヒト抗体はまた、本明細書において記載されるような、宿主細胞における組換
えＤＮＡの発現によるか、またはハイブリドーマ細胞における発現により産生さ
れ得る。代替的な実施形態において、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブ
ラリーにおいて生成され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
．２２７：３８１，１９９１；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：
５８１，１９９１）。これらのプロセスは、繊維状バクテリオファージの表面上
での抗体レパートリーのディスプレイ、引き続いて、選択された抗原に対するそ
れらの結合によるファージの選択によって免疫選択を模倣する。１つのこのよう
な技術は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１７３６４（これは、このような
アプローチを用いたＭＰＬ−レセプターおよびｍｓｋ−レセプターに対する高親
和性でかつ機能的なアゴニスト抗体の単離を記載する）に記載される。

【０２３９】 キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、およびヒト化抗体は、代表的には、組換
え方法により生成される。これらの抗体をコードする核酸は、宿主細胞に導入さ
れ、そして本明細書中に記載される材料および方法を用いて発現される。好まし
い実施形態において、抗体は、哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）におい
て発現される。モノクローナル（例えば、ヒト）抗体は、宿主細胞における組換
えＤＮＡの発現によるか、または本明細書中に記載のハイブリドーマ細胞におけ
る発現により生成され得る。

【０２４０】 診断適用に関しては、抗ＣｈＭＩｒｐ抗体は、代表的には検出可能な部分で標
識され得る。この検出可能な部分は、直接的または間接的のいずれかで検出可能
なシグナルを生じ得る任意の部分である。例えば、検出可能な部分は、放射性同
位体（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓまたは^１２５Ｉ）、蛍光化合物も
しくは化学発光化合物（例えば、フルオロセインイソチオシアネート、ローダミ
ンもしくはルシフェリン）；または酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β
−ガラクトシダーゼまたは西洋ワサビベルオキシダーゼ）であり得る。Ｂａｙｅ
ｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１８４：１３８−１６３，１９９０を参照のこと。

【０２４１】 本発明の抗ＣｈＭＩｒｐ抗体は、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの検出および定量
について、任意の公知のアッセイ方法（例えば、競合結合アッセイ、直接的サン
ドイッチアッセイおよび間接的サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセ
イ（Ｓｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａ
ｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ
，Ｉｎｃ．，１９８７））において用いられ得る。抗体は、使用されるアッセイ
方法に適切な親和性でＣｈＭＩｒｐポリペプチドを結合する。

【０２４２】 次いで、細胞溶解物または精製ＣｈＭＩｒｐタンパク質改変体の活性は、所望
の特徴についての適切なスクリーニングアッセイにおいてスクリーニングされる
。例えば、リガンドに対する結合親和性またはＣｈＭＩｒｐタンパク質の免疫学
的特徴（例えば、所定の抗体に対する親和性）の変化は、競合型のイムノアッセ
イにより測定される。免疫調節活性の変化は、適切なアッセイによって測定され
る。このようなタンパク質特性の改変は、酸化還元または熱安定性、疎水性、タ
ンパク質分解に対する感受性またはキャリアとの凝集傾向またはマルチマーへの
凝集傾向として、当業者に周知の方法によりアッセイされる。競合結合アッセイ
は、限定された量の抗ＣｈＭＩｒｐ抗体との結合について試験サンプル分析物（
ＣｈＭＩｒｐポリペプチド）と競合する標識された標準物質（例えば、ＣｈＭＩ
ｒｐポリペプチドまたはその免疫学的に反応性の部分）の能力に依存する。試験
サンプル中のＣｈＭＩｒｐポリペプチドの量は、この抗体に結合する標準物質の
量に逆比例する。結合する標準物質の量の測定を容易にするために、この抗体は
、一般に、競合の前または後に不溶化され、その結果、この抗体に結合する標準
物質および分析物は、結合しないままの標準物質および分析物から簡単に分離さ
れ得る。

【０２４３】 サンドイッチイムノアッセイは、代表的には、２つの抗体（各々、検出され、
そして／または定量されるタンパク質の異なる免疫原性部分、エピトープに結合
し得る）の使用に関する。サンドイッチアッセイにおいて、この試験サンプル分
析物は、代表的には、固体支持体に固定化された第１の抗体、その後第２の抗体
が分析物に結合し、このようにして不溶性の３部分で構成される複合体を形成す
る。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照のこと。第２の抗体は、そ
れ自体検出可能な部分で標識され得るか（例えば、直接サンドイッチアッセイ）
、または検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定され得
る（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つの型は
、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）であり、この場合、この検
出可能な部分は酵素である。

【０２４４】 選択的結合因子（抗ＣｈＭＩｒｐ抗体を含む）はまた、インビボ画像化のため
に有用である。検出可能な部分で標識された抗体は、動物に（好ましくは、血流
に）投与され得、そして宿主における標識化抗体の存在および位置がアッセイさ
れる。この抗体は、動物において（核磁気共鳴、放射線学または当該分野で公知
の他の検出手段のいずれかで）検出可能な任意の部分で標識され得る。

【０２４５】 選択的結合因子（本発明の抗ＣｈＭＩｒｐ抗体を含む）は、治療剤として使用
され得る。これらの治療的抗体は、一般に、それらがＣｈＭＩｒｐポリペプチド
の生物学的活性の少なくとも１つを増強または減少するかのいずれかであるとい
う点で、それぞれ、アゴニストまたはアンタゴニストである。１つの実施形態に
おいて、本発明のアンタゴニスト抗体は、ＣｈＭＩｒｐポリペプチド、フラグメ
ント、改変体および／または誘導体に特異的に結合し得、そしてＣｈＭＩｒｐポ
リペプチドの機能的活性をインビボまたはインビトロで阻害または排除し得る抗
体またはその結合フラグメントである。好ましい実施形態において、アンタゴニ
スト抗体は、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの機能的活性を少なくとも約５０％、好
ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは９０％、そして最も好ましくは１
００％阻害する。アゴニスト抗ＣｈＭＩｒｐ抗体およびアンタゴニスト抗ＣｈＭ
Ｉｒｐ抗体は、以下に記載のスクリーニングアッセイにより同定される。

【０２４６】 本発明はまた、ＣｈＭＩｒｐ選択的結合因子（例えば、抗体）および生物学的
サンプルにおいてＣｈＭＩｒｐポリペプチドレベルを検出するに有用な他の試薬
を含むキットに関する。このような試薬としては、以下が挙げられ得る：第二活
性、検出可能な標識、ブロッキング血清、陽性コントロールサンプルおよび陰性
コントロールサンプル、ならびに検出試薬。

【０２４７】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドは、「発現クローニング」ストラテジーを用いて、
ＣｈＭＩｒｐ結合パートナーをクローニングするために使用され得る。放射性標
識（^１２５ヨウ素）ＣｈＭＩｒｐポリペプチドまたは親和性／活性タグ化ＣｈＭ
Ｉｒｐポリペプチド（例えば、Ｆｃ部分またはアルカリホスファターゼの融合物
）を結合アッセイに用いて、ＣｈＭＩｒｐ結合パートナーを発現する細胞型また
は細胞株または組織を同定し得る。このような細胞または組織から単離されたＲ
ＮＡは、ｃＤＮＡに変換され、哺乳動物発現ベクターにクローニングされ、そし
て哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞または２９３細胞）にトランスフェクトさ
れて、発現ライブラリーを作製し得る。次いで、放射性標識されたか、またはタ
グ化されたＣｈＭＩｒｐポリペプチドは、親和性リガンドとして用いられて、Ｃ
ｈＭＩｒｐ結合パートナーを発現するこのライブラリー中の細胞のサブセットが
同定および単離され得る。次いで、これらの細胞からＤＮＡが単離され、そして
哺乳動物細胞にトランスフェクトされて、第２の発現ライブラリーが作製され得
る。この第２の発現ライブラリーにおいて、ＣｈＭＩｒｐ結合パートナーを発現
する細胞の割合は、最初のライブラリーの数倍高い。この富化プロセスは、Ｃｈ
ＭＩｒｐ結合パートナーを含む単一の組換えクローンが単離されるまで、繰り返
し反復され得る。ＣｈＭＩｒｐレセプターの単離は、ＣｈＭＩｒｐポリペプチド
シグナル伝達経路の新規なアゴニストおよびアンタゴニストを同定または開発す
るために有用である。このようなアゴニストおよびアンタゴニストとしては、Ｃ
ｈＭＩｒｐ結合パートナー、サイクリン、Ｃｄｋインヒビター、Ｃｄｋ補因子、
抗ＣｄｋＩＩ結合パートナー抗体、低分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドが挙げられる。

【０２４８】 （診断キットおよび試薬） 本発明は、レセプターおよび／または抗体またはリガンドの存在を検出するた
めの種々の診断キットおよび方法におけるＣｈＭＩｒｐポリペプチド、そのフラ
グメント、ペプチド、結合組成物、ならびにその融合産物の使用を企図する。代
表的には、このキットは、ＣｈＭＩｒｐペプチドもしくは遺伝子セグメント、ま
たはその一方もしくは他方を認識する試薬（例えば、結合試薬）を含む区画を有
する。

【０２４９】 ＣｈＭＩｒｐに対するレセプターまたは試験化合物の結合親和性を決定するた
めのキットは、代表的には、レセプター試験化合物；標識化合物（例えば、この
タンパク質に対する公知の結合親和性を有する抗体）；またはリガンドの供給源
（天然に存在するか、または組換え）、および結合した標識化化合物から遊離の
標識化化合物を分離するための手段（例えば、リガンドもしくはそのレセプター
を固定化するための固相）を含む。一旦化合物がスクリーニングされると、リガ
ンドまたはそのレセプターに対する適切な結合親和性を有する化合物を適切な生
物学的アッセイ（当該分野で周知）において評価して、これらの化合物がＣｈＭ
Ｉｒｐ活性のアゴニストまたはアンタゴニストとしてレセプターに働き得るか否
かを決定し得る。組換えレセプターポリペプチドの利用可能性はまた、このよう
なアッセイを較正するためのまたは陽性コントロールサンプルとしての充分に規
定された標準物質を提供する。

【０２５０】 例えば、サンプル中のＣｈＭＩｒｐの濃度を決定するための好ましいキットは
、代表的には、標的に対する公知の結合親和性を有する標識化化合物（例えば、
抗体）、リガンドまたはレセプターの供給源（天然に存在するか、または組換え
）、および結合した標識化化合物を遊離の標識化化合物から分離するための手段
（例えば、リガンドまたはレセプターを固定化するための固相）を含む。通常、
試薬、および使用または廃棄のための説明書を含む区画が提供される。

【０２５１】 抗体（リガンドまたはレセプターに特異的な抗原結合フラグメントを含む）ま
たはフラグメントは、リガンド、レセプターおよび／またはそのフラグメントの
上昇したレベルの存在を検出するための診断適用において有用である。このよう
な診断アッセイは、溶解物、生細胞、固定細胞、免疫蛍光、細胞培養物、体液を
使用し得、そしてさらに、血清などにおいてリガンドまたはレセプターに関連す
る抗原の検出を含む。診断アッセイは、均質系（遊離の試薬と抗原複合体との間
の分離工程が必要ない）であっても、不均質系（分離工程を必要とする）であっ
てもよい。種々の市販のアッセイが存在し、これらとしては、例えば、ラジオイ
ムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、
酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素複合イムノアッセイ技術（ｅｎｚｙｍｅ−
ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）（ＥＭ
ＩＴ）、基質標識蛍光イムノアッセイ（ＳＬＦＩＡ）などが挙げられる。例えば
、非標識抗体は、標識され、かつリガンドもしくはレセプターもしくはその特定
のフラグメントに対する１次抗体を認識する二次抗体を用いることにより使用さ
れ得る。類似のアッセイはまた、文献中で広範に議論されている（例えば、Ｈａ
ｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。

【０２５２】 抗イディオタイプ抗体は、リガンドまたはレセプターに対する抗体の存在を診
断するために類似の用途を有し得、このようにして種々の異常状態を診断し得る
。例えば、リガンドまたはレセプターの過剰生成は、異常な生理的状態（特に種
々の炎症状態またはアレルギー状態において）の診断であり得る種々の免疫学的
反応の生成を生じ得る。

【０２５３】 頻繁には、診断アッセイについての試薬は、アッセイの感度を最適化するため
にキット中で供給される。本発明に関しては、アッセイの性質、プロトコル、お
よび標識、標識抗体もしくは非標識抗体のいずれかまたは標識リガンドもしくは
レセプターに依存して、提供される。これは、通常、他の付加物（例えば、緩衝
液、安定化剤、シグナル生成に必要な材料（例えば、酵素の基質など））と関連
している。好ましくは、キットは、適正な使用および使用後の内容物の廃棄につ
いての説明書もまた含む。代表的には、このキットは、各有用な試薬のための区
画または容器を有する。望ましくは、この試薬は、凍結乾燥粉末として提供され
、ここで、この試薬は、このアッセイを実行するための試薬の適切な濃度を提供
する水性媒体中で再構成され得る。

【０２５４】 薬物スクリーニングおよび診断アッセイの前述の構成成分は、改変されずに使
用されてもよいし、種々の方法で改変されても良い。例えば、標識化は、直接的
または間接的に検出可能なシグナルを提供する部分を共有結合または非共有結合
することにより達成され得る。これらのアッセイのいずれにおいても、リガンド
、試験化合物、レセプター、またはそれらに対する抗体は、直接的または間接的
にかのいずれかで標識され得る。直接標識化の可能性としては、以下の標識群が
挙げられる：放射性標識（例えば、^１２５Ｉ）、ペルオキシダーゼおよびアルカ
リホスファターゼのような酵素（米国特許第３，６４５，０９０号）、および蛍
光強度の変化、波長シフトまたは蛍光分極をモニターし得る蛍光標識（米国特許
第３，９４０，４７５号）。間接標識化の可能性としては、以下が挙げられる：
１つの成分のビオチン化に続き、上記の標識基の１つに結合したアビジンへの結
合。

【０２５５】 結合リガンドを遊離リガンドから分離する方法、あるいは結合試験化合物から
遊離試験化合物を分離する方法もまた多数存在する。このリガンドまたはレセプ
ターは、おそらく界面活性剤または関連する脂質とともに、種々のマトリックス
に固定化され得、続いて洗浄され得る。適切なマトリックスとしては、ＥＬＩＳ
Ａプレート、フィルター、およびビーズのようなプラスチックが挙げられる。リ
ガンドまたはレセプターをマトリックスに固定化する方法としては、以下が挙げ
られるが、これらに限定されない：プラスチックへの直接接着、捕捉抗体の使用
、化学的カップリング、およびビオチン−アビジン。このアプローチの最後の工
程は、いくつかの方法（例えば、ポリエチレングリコールのような有機溶媒また
は硫酸アンモニウムのような塩を利用する方法を含む）のいずれかにより抗原／
抗体複合体の沈降を含み得る。他の適切な分離技術としては、以下が挙げられる
が、これらに限定されない：Ｒａｔｔｌｅら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３０：１
４５７−１４６１，１９８４に記載される蛍光抗体磁性可能粒子法、および米国
特許第４，６５９，６１７８号（本明細書中に参考として援用される）に記載さ
れる二重磁性粒子分離。

【０２５６】 タンパク質またはそれらのフラグメントを種々の標識に連結するための方法は
、文献中に広範に報告されており、本明細書中で詳細に議論する必要はない。こ
の技術の多くは、ペプチド結合を形成するためのカルボジイミドまたは活性エス
テルの使用、メルカプト基と活性化ハロゲン（例えば、クロロアセチル）との反
応によるチオエステルの形成、活性化オレフィン（例えば、マレイミド）、連結
などのいずれかによる活性化カルボキシル基の使用を含む。融合タンパク質はま
た、これらの適用における使用を見出す。

【０２５７】 本発明の核酸分子は、染色体に対するＣｈＭＩｒｐ遺伝子または関連遺伝子の
位置をマッピングするために使用され得る。マッピングは、当該分野で公知の技
術（例えば、ＰＣＲ増幅、インサイチュハイブリダイゼーション、およびＦＩＳ
Ｈ）により行われ得る。

【０２５８】 本発明はまた、変異したＣｈＭＩｒｐ遺伝子の存在に関連した疾患またはこの
疾患に対する感受性を検出するための診断アッセイの一部としてのＣｈＭＩｒｐ
遺伝子の使用に関する。このような疾患は、ＣｈＭＩｒｐの異常な発現（例えば
、腫瘍および癌のような異常な細胞増殖）に関する。

【０２５９】 ヒトＣｈＭＩｒｐ遺伝子において変異を有する個体は、種々の技術によりＤＮ
Ａレベルで検出され得る。診断のための核酸は、例えば、血液、尿、唾液、組織
生検および剖検材料のような患者の細胞から得られ得る。ゲノムＤＮＡを検出の
ために直接用いてもよいし、分析前にＰＣＲを用いて酵素的に増幅してもよい（
Ｓａｉｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ，３２４：１６３−１６６，１９８６）。ＲＮＡま
たはｃＤＮＡはまた、同じ目的で使用され得る。例として、ＣｈＭＩｒｐポリペ
プチドをコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーは、ＣｈＭＩｒｐ変異を同
定および分析するために用いられ得る。例えば、欠失および挿入は、正常遺伝子
型と比較して、増幅産物のサイズの変化により検出され得る。点変異は、増幅し
たＤＮＡを、放射性標識したＣｈＭＩｒｐ ＲＮＡあるいは放射性標識したＣｈ
ＭＩｒｐアンチセンスＤＮＡ配列にハイブリダイズすることにより同定され得る
。完全に適合した配列は、ＲＮａｓｅＡ消化によるか、または融解温度の差異に
より不一致二重鎖から区別され得る。

【０２６０】 ＤＮＡ配列差異に基づく遺伝子試験は、変性剤を伴っても伴わなくても、ゲル
中のＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度の変化の検出により達成され得る。小
さな配列欠失および挿入は、高分解能ゲル電気泳動により可視化され得る。異な
る配列のＤＮＡフラグメントは、変性したホルムアミド勾配ゲル上でのフラグメ
ントに対して区別され得る。ここで、異なるＤＮＡフラグメントの移動度は、そ
れらの特異的融解温度または部分的融解温度に従って異なる位置でゲル中で妨害
される（例えば、Ｍｙｅｒｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１２４２，１９８５
）。

【０２６１】 特異的位置での配列変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａ
ｓｅおよびＳ１保護）または化学的切断方法により明らかにされ得る（例えば、
Ｃｏｔｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８５：４
３９７−４４０１，１９８５）。

【０２６２】 従って、特異的ＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保
護、化学的切断、直接ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用（例えば、制限フラ
グメント長多型（ＲＦＬＰ））およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングのよ
うな方法により達成され得る。

【０２６３】 より多くの従来のゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加えて、変異はまた、
インサイチュ分析により検出され得る。

【０２６４】 本発明はまた、種々の組織におけるＣｈＭＩｒｐタンパク質の変化したレベル
を検出するための診断アッセイに関する。なぜなら、正常コントロール組織サン
プルと比較して、タンパク質の過剰発現は、疾患（例えば、腫瘍、脳マラリアお
よび遺伝性周期熱症候群）の存在または疾患に対する感受性を検出し得るからで
ある。宿主から得られたサンプル中のＣｈＭＩｒｐポリペプチドのレベルを検出
するために用いられるアッセイは、当業者に周知であり、そして以下が挙げられ
る：ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析、ＥＬ
ＩＳＡアッセイおよび「サンドイッチ」アッセイ。ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｃｏｌ
ｉｇａｎら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ，１（２），Ｃｈａｐｔｅｒ ６，１９９１）は、部分的に、ＣｈＭＩｒｐ抗
原に特異的な抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）の調製を包含する。さら
に、レポーター抗体が、モノクローナル抗体に対して調製される。検出可能な試
薬（例えば、放射活性、蛍光、またはこの例では西洋ワサビペルオキシダーゼ酵
素）がレポーター抗体に結合される。ここでサンプルは、宿主から取り出され、
そしてサンプル中のタンパク質を結合する固体支持体（例えば、ポリスチレンデ
ィッシュ）上でインキュベートされる。次いで、このディッシュ上の任意のフリ
ーのタンパク質結合部位は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のような非特異的タ
ンパク質とともにインキュベートすることにより、覆われる。次に、モノクロー
ナル抗体は、ポリスチレンディッシュに結合した任意のＣｈＭＩｒｐタンパク質
にモノクローナル抗体が結合する時間の間に、ディッシュ中でインキュベートさ
れる。全ての非結合モノクローナル抗体は、緩衝液で洗い流される。西洋ワサビ
ペルオキシダーゼに連結したレポーター抗体は、ここでディッシュに入れられ、
ＣｈＭＩｒｐに結合した任意のモノクローナル抗体に対するレポーター抗体の結
合を生じる。次いで、結合していないレポーター抗体は、洗い流される。次いで
、ペルオキシダーゼ基質がディッシュに添加され、そして所定の時間で発色した
呈色の量は、標準曲線に対して比較した場合、所定の用量の患者サンプル中に存
在するＣｈＭＩｒｐポリペプチドの量の測定値である。

【０２６５】 競合アッセイが用いられ得、ここで、ＣｈＭＩｒｐに特異的な抗体は、固体支
持体に結合され、そして標識されたＣｈＭＩｒｐおよび宿主由来のサンプルが、
固体支持体に対して分配され、そして検出された標識の量（例えば、液体シンチ
レーションクロマトグラフィーによる）は、サンプル中のＣｈＭＩｒｐの量と相
関され得る。さらに、上記のサンドイッチイムノアッセイはまた、生物学的サン
プル中のＣｈＭＩｒｐリガンドの量を定量するために行われ得る。

【０２６６】 本発明の配列は、染色体同定およびマッピングについて評価可能である。この
配列は、個々のヒト染色体上の特定位置に特異的に標的化され得、そしてこの位
置とハイブリダイズし得る。さらに、遺伝子が位置し得る染色体上での特定の部
位を同定することが現在必要である。実際の配列データ（反復多型）に基づく染
色体マーキング試薬は、染色体位置をマーキングするには現在ほとんど利用可能
ではない。本発明に従う染色体に対するＤＮＡのマッピングは、配列と、疾患と
関連する遺伝子とを相関させることにおいて重要な第一の工程である。

【０２６７】 簡潔には、配列は、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ましくは、１５〜２５
ｂｐ）を調製することにより染色体にマッピングされ得る。この配列の３’非翻
訳領域のコンピューター分析は、ゲノムＤＮＡ中の１つのエキソンを超えてまた
がらない、従って、増幅プロセスを複雑にするプライマーを迅速に選択するため
に用いられる。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞
ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために用いられる。このプライマーに対
応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。

【０２６８】 体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に特定のＤＮＡを割
り当てるための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーとともに
本発明を用いると、同様な様式で、特定の染色体またはより大きなゲノムクロー
ンのプールからフラグメントのパネルを用いて下位の位置決定が達成され得る。
その染色体に対してＣｈＭＩｒｐをマッピングするために同様に用いられ得る他
のマッピングストラテジーとしては、以下が挙げられる：インサイチュハイブリ
ダイゼーション、フローソーティングされて標識された（ｌａｂｅｌｅｄ ｆｌ
ｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体での予備スクリーニングおよび染色体特異的ｃＤＮ
Ａライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる予備選択。

【０２６９】 ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッドへの蛍光インサイチュハイブリダイ
ゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて、一工程で正確な染色体位置を提供し得る。こ
の技術は、５００または６００塩基程度の短さのｃＤＮＡとともに使用され得る
；しかし、２，０００ｂｐより大きなクローンは、簡単な検出のために十分なシ
グナル強度で独特の染色体位置に結合するという尤度がより高い。ＦＩＳＨは、
ゲノムクローンまたは発現配列タグ（ＥＳＴ）が由来するクローンの使用を必要
とし、そして大きくなるほど、良好になる。例えば、２，０００ｂｐは好ましく
、４，０００ｂｐはより好ましく、そして４，０００を超えるものは、妥当な割
合の時間で良好な結果を得るためにはおそらく必要でない。この技術の総説につ
いては、Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａ
ｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ
，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。

【０２７０】 一旦、配列が正確な染色体の位置にマッピングされると、この染色体上のこの
配列の物理的位置は、遺伝的マップデータと相関され得る。このようなデータは
、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃ
ｅ ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅ
ｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙを介してオンラインで入手可能）にお
いて見出される。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との
間の関連は、連鎖解析（物理的に隣接する遺伝子の共同相続（ｃｏｉｎｈｅｒｉ
ｔａｎｃｅ））を通して同定される。

【０２７１】 次に、罹患した個体と罹患していない個体との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列
における差異を決定することが必要である。変異が、罹患した個体のうちのいく
つかまたは全てにおいて観察されるが、いずれの正常な個体においても観察され
ない場合、この変異は、おそらくこの疾患の原因となる因子である。

【０２７２】 物理的マッピングおよび遺伝的マッピング技術の現在の分解能では、この疾患
に関連する染色体領域に正確に位置するｃＤＮＡは、５０と５００との間の潜在
的な原因となる因子のうちの１つであり得る。（これは、１メガベースのマッピ
ング分解能および２０ｋｂあたり１つの遺伝子を想定する）。

【０２７３】 本発明の核酸分子はまた、ＣｈＭＩｒｐ発現のアンチセンスインヒビターとし
ても有用である。このような阻害は、発現制御配列（三重らせん形成）またはＣ
ｈＭＩｒｐ ｍＲＮＡに相補的でありかつハイブリダイズする核酸分子によって
もたらされ得る。アンチセンスプローブは、本明細書中に開示されるＣｈＭＩｒ
ｐの配列を使用して、利用可能な技術によって設計され得る。アンチセンスイン
ヒビターは、細胞または生物体におけるＣｈＭＩｒｐポリペプチドの減少または
非存在に関連する情報を提供する。

【０２７４】 本発明の核酸分子は、遺伝子治療に使用され得る。インビボでＣｈＭＩｒｐを
発現する核酸分子は、細胞または生物体におけるこのポリペプチドの影響に関連
する情報を提供する。それ自体では生物学的に活性なポリペプチドをコードしな
いＣｈＭＩｒｐ核酸分子、フラグメント、および／または誘導体は、定性的また
は定量的のいずれかで、哺乳動物組織または体液サンプルにおけるＣｈＭＩｒｐ
ＤＮＡまたは対応するＲＮＡの存在について試験するための診断アッセイにお
いてハイブリダイゼーションプローブとして有用であり得る。

【０２７５】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドフラグメント、改変体、および／または誘導体は、
生物学的に活性であろうとなかろうと、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドに結合する抗
体を調製するために有用である。この抗体は、インビボおよびインビトロでの診
断目的に使用され得る（例えば、体液または細胞サンプル中のＣｈＭＩｒｐポリ
ペプチドの存在を検出するための標識化形態において）。この抗体は、ＣｈＭＩ
ｒｐポリペプチドの少なくとも１つの活性特徴を減少またはブロックようにＣｈ
ＭＩｒｐポリペプチドに結合し得るか、または活性を増大するようにポリペプチ
ドに結合し得る。

【０２７６】 （遺伝的に操作された非ヒト動物） マウス、ラット、または他のげっ歯類、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、または他の家
畜のような非ヒト動物が、さらに本発明の範囲内に含まれ、ここで、この遺伝子
はＣｈＭＩｒｐポリペプチドをコードし、この哺乳動物のこの遺伝子の天然の形
態または異種ＣｈＭＩｒｐポリペプチド遺伝子のいずれかが、この哺乳動物によ
って過剰発現され、これによって、「トランスジェニック」哺乳動物を作製する
。このようなトランスジェニック哺乳動物は、米国特許第５，４８９，７４３号
およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２８１２２号に記載されるような周知の方法を
使用して調製され得る。

【０２７７】 マウス、ラット、または他のげっ歯類、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、または他の家
畜のような非ヒト動物が、さらに本発明の範囲内に含まれ、ここで、ネイティブ
のＣｈＭＩｒｐポリペプチドをコードする遺伝子は分裂（「ノックアウト」）さ
れ、この遺伝子の発現レベルは、有意に減少するか、または完全に消滅される。
このような哺乳動物は、米国特許第５，５５７，０３２号（本明細書中に参考と
して援用される）に記載されるような技術および方法を使用して調製され得る。

【０２７８】 本発明は、非ヒト動物をさらに含み、ここで、本発明のＣｈＭＩｒｐポリペプ
チドのうちの１つ以上についてのプロモーターは、（以下に記載されるような相
同的な組換え方法を使用して）活性化されるかまたは不活化されるかのいずれか
であり、ネイティブのＣｈＭＩｒｐポリペプチドの１つ以上の発現のレベルを変
更する。

【０２７９】 これらの非ヒト動物は、薬物候補物のスクリーニングのために使用され得る。
動物におけるこの薬物候補物の影響が測定され得る。例えば、薬物候補物は、Ｃ
ｈＭＩｒｐポリペプチド遺伝子の発現を減少または増加させ得る。特定の実施形
態において、産生されるＣｈＭＩｒｐポリペプチドまたはフラグメントの量は、
哺乳動物をこの薬物候補物に曝露した後に測定され得る。特定の実施形態におい
て、哺乳動物についての薬物候補物の実際の影響を検出し得る。例えば、特定の
遺伝子の過剰発現は、疾患状態または病理学的状態を生じ得るか、またはそれら
に関連し得る。このような場合において、この遺伝子の発現を減少させる薬物候
補物の能力または病理学的状態を予防または阻害するその能力を試験し得る。別
の例において、ポリペプチドのフラグメントのような特定の代謝産物の産生は、
疾患状態または病理学的状態を生じ得るか、またはそれらに関連し得る。このよ
うな場合において、このような代謝産物の産生を減少させる薬物候補物の能力ま
たは病理学的状態を予防または阻害するその能力を試験し得る。

【０２８０】 （内部移行タンパク質） ＴＡＴタンパク質配列（ＨＩＶ由来）が、細胞膜の脂質二分子層成分を標的化
することによってタンパク質を細胞内に内部移行させるために、使用され得る。
例えば、Ｆａｌｗｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：６
６４−６６８、１９９４を参照のこと。例えば、ＨＩＶ ＴＡＴタンパク質の１
１アミノ酸の配列（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号１６）（「タンパク質形
質導入ドメイン」、またはＴＡＴ ＰＤＴと称される）は、β−ガラクトシダー
ゼおよびｐ２７Ｋｉｐのような大きな生理活性タンパク質の、細胞質膜膜および
細胞の核膜を横切る送達を媒介するように示される。Ｓｃｈｗａｒｚｅら，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９−１５７２，１９９９；およびＮａｇａｈａｒａ
ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４：１４４９−１４５２，１９９８を参
照のこと。Ｓｃｈｗａｒｔｚｅら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：１５６９−７２，
１９９９）は、ＴＡＴ ＰＤＴおよびβ−ガラクトシダーゼの融合に暴露される
場合に、培養される細胞がβ−ｇａｌ活性を獲得したことを実証した。マウスへ
のＴＡＴ−β−ｇａｌ融合タンパク質の注入は、多くの組織（肝臓、腎臓、肺、
心臓および脳組織を含む）におけるβ−ｇａｌの発現を生じる。

【０２８１】 従って、ＴＡＴタンパク質配列は、所望のタンパク質またはポリペプチドを細
胞に内部移入させるために使用され得ることが理解される。本発明の状況におい
て、このＴＡＴタンパク質配列は、ＣｈＭＩｒｐアンタゴニスト（すなわち、抗
ＣｈＭＩｒｐ選択的な結合因子または低分子）のような別の分子に融合され得、
そしてＣｈＭＩｒｐ分子の活性を阻害するために細胞内に投与され得る。所望の
場合、ＣｈＭＩｒｐタンパク質自体、あるいはＣｈＭＩｒｐのペプチドフラグメ
ントまたは改変形態は、上記に記載の手順を使用して細胞に投与するための、こ
のようなタンパク質トランスデューサーに融合され得る。

【０２８２】 （ＣｈＭＩｒｐポリペプチド活性の他の修飾因子についてのアッセイ） いくつかの状況において、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの活性の修飾因子である
分子（すなわち、アゴニストまたはアンタゴニスト）を同定することが所望され
得る。ＣｈＭＩｒｐを調節する天然または合成分子は、以下に記載されるスクリ
ーニングアッセイの１つ以上を用いて同定され得る。このような分子は、インビ
ボ様式またはインビトロ様式のいずれかで、局所または静脈内（ｉｖ）注射によ
って、または経口送達、移植デバイスなどによって投与され得る。「試験分子」
とは、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドに結合し、それによってその活性を調節する能
力について評価中の分子をいう。試験分子は、少なくとも約１０^−６Ｍ、好まし
くは約１０^−８Ｍ、より好ましくは約１０^−９Ｍ、そしてなおより好ましくは約
１０^−１０Ｍの親和性定数（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｎｓｔａｎｔ）でＣｈＭＩ
ｒｐポリペプチドに結合する。

【０２８３】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドと相互作用する化合物を同定するための方法は、本
発明に包含される。一般に、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドは、試験分子のＣｈＭＩ
ｒｐポリペプチドへの結合を可能にする条件下で、試験分子と共にインキュベー
トされ、そして結合の程度が測定される。この試験分子は、実質的に精製された
形態または粗製混合物中でスクリーニングされ得る。試験分子は、核酸分子、タ
ンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、または低分子量の有機または無機化合物
であり得る。一旦、試験分子のセットがＣｈＭＩｒｐポリペプチドに結合すると
同定されると、この分子は、ＣｈＭＩｒｐ活性を増加または減少させるその能力
についてさらに評価され得る。

【０２８４】 試験分子とＣｈＭＩｒｐポリペプチドとの相互作用の測定は、いくつかの形態
で実施され得、これには、細胞ベースの結合アッセイ、膜結合アッセイ、液相ア
ッセイ、および免疫アッセイが挙げられる。一般に、試験分子は、特定の期間Ｃ
ｈＭＩｒｐポリペプチドと共にインキュベートされ、そしてＣｈＭＩｒｐポリペ
プチドへの結合の程度が、濾過、電気化学発光（ＩＧＥＮによるＥＣＬ、ＯＲＩ
ＧＥＮシステム）、細胞ベースのアッセイまたは免疫アッセイによって決定され
る。

【０２８５】 放射活性についての均質アッセイ技術（ＳＰＡ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）および時
間分解蛍光（ＨＴＲＦ，Ｐａｃｋａｒｄ）もまた実施される。結合は、放射性同
位体（^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^３Ｈ）、蛍光色素（フルオレセイン）、ランタニド（
例えば、ユーロピウム（Ｅｕ^３＋）キレーターまたはクリプタート）、またはビ
ピリジル−ルテニウム（Ｒｕ^２＋）錯体での標識によって検出され得る。標識さ
れたプローブの選択は、使用される検出システムに依存することが理解される。
あるいは、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドは、非標識エピトープタグ（例えば、ビオ
チン、ペプチド、Ｈｉｓ６、ｍｙｃ、Ｆｃ）を用いて改変され得、そして上記の
ような検出可能な標識を有するタンパク質（例えば、ストレプトアビジン、抗ペ
プチドまたは抗タンパク質抗体）に結合され得る。

【０２８６】 試験分子とＣｈＭＩｒｐポリペプチドとの相互作用はまた、免疫アッセイにお
いて、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用して直接アッセイされ得
る。あるいは、上記のようなエピトープタグを含むＣｈＭＩｒｐポリペプチドの
改変形態は、溶液および免疫アッセイ中で使用され得る。

【０２８７】 １つの実施形態において、ＣｈＭＩｒｐのアゴニストまたはアンタゴニストは
、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、または低分子量の分子であり得、こ
れらは、ＣｈＭＩｒｐと相互作用してその活性を調節する。ＣｈＭＩｒｐの潜在
的なタンパク質アンタゴニストとしては、このポリペプチドの活性領域に結合し
、そしてＣｈＭＩｒｐの少なくとも１つの活性を阻害または排除する抗体が挙げ
られる。ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの発現を調節する分子は、ＣｈＭＩｒｐポリ
ペプチドをコードする核酸と相補的であるか、またはポリペプチドの発現を指向
または制御する核酸配列に対して相補的である核酸分子、および発現のアンチセ
ンス制御因子として作用する核酸分子を含み得る。

【０２８８】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドが、結合パートナー（例えば、レセプターまたはリ
ガンド）との相互作用を介して、生物学的活性を示す場合において、種々のアッ
セイが、対応する結合パートナーへのＣｈＭＩｒｐポリペプチドの結合を測定す
るために使用され得る。これらのアッセイは、その結合パートナーへのＣｈＭＩ
ｒｐポリペプチドの結合の速度および／または程度を増加または減少させるその
能力について、試験分子をスクリーニングするために使用され得る。１つのアッ
セイにおいて、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドは、マイクロタイタープレートのウェ
ルの底への付着によって固定される。次いで、放射標識されたＣｈＭＩｒｐ結合
パートナー（例えば、ヨウ素化されたＣｈＭＩｒｐ結合パートナー）および試験
分子は、このウェルに、一つずつ（いずれかの順序で）または同時にのいずれか
で添加され得る。インキュベーション後に、このウェルは洗浄され得、そしてシ
ンチレーションカウンターを使用して放射活性について計数し、結合パートナー
がＣｈＭＩｒｐポリペプチドに結合する程度を決定する。代表的に、分子は、あ
る範囲の濃度にわたって試験され、そして試験アッセイの１つ以上の要素を欠く
一連のコントロールウェルが、結果の評価の正確性のために使用され得る。この
方法の代替は、タンパク質の「位置」を逆にする工程（すなわち、マイクロタイ
タープレートのウェルにＣｈＭＩｒｐポリペプチド結合パートナーを固定し、試
験分子を放射標識したＣｈＭＩｒｐポリペプチドと共にインキュベートし、そし
てＣｈＭＩｒｐの結合の程度を決定する工程）を包含する（例えば、Ａｕｓｕｂ
ｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，
１９９５の第１８章を参照のこと）。

【０２８９】 放射性標識に対する代替として、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドまたはその結合パ
ートナーは、ビオチンと結合体化され得、次いで、ビオチン化されたタンパク質
の存在が、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカ
リホスファターゼ（ＡＰ））（これらは、比色定量的に検出され得る）に結合し
たストレプトアビジンを使用して検出され得るか、またはストレプトアビジンの
蛍光タグ化によって検出され得る。ＣｈＭＩｒｐポリペプチドまたはＣｈＭＩｒ
ｐ結合パートナーを指向し、そしてビオチンと結合体化されている抗体もまた使
用され得、そしてこれはＡＰまたはＨＲＰに連結した酵素連結ストレプトアビジ
ンとのインキュベーションの後で検出され得る。

【０２９０】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドおよびＣｈＭＩｒｐ結合パートナーはまた、アガロ
ースビーズ、アクリルビーズ、またはこのような不活性な基材の他の型への付着
によって固定化され得る。基材−タンパク質複合体は、相補タンパク質および試
験化合物を含む溶液内に配置され得；インキュベーション後、これらのビーズは
、遠心分離によって沈澱され得、そしてＣｈＭＩｒｐポリペプチドとその結合パ
ートナーとの間の結合の量が、上記の方法を使用して評価され得る。あるいは、
基材−タンパク質複合体はカラム中に固定され得、そして試験分子および相補タ
ンパク質はこのカラムを通過する。次いで、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドとその結
合パートナーとの間の複合体の形成が、上記の技術のいずれか（すなわち、放射
性標識、抗体結合など）を使用して評価され得る。

【０２９１】 ＣｈＭＩｒｐ結合タンパク質とＣｈＭＩｒｐ結合パートナーとの間の複合体の
形成を増加または減少させる試験分子を同定するのに有用な別のインビトロアッ
セイは、表面プラズモン共鳴検出器システム（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ
システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））である。この
Ｂｉａｃｏｒｅシステムは、製造業者の手順を用いて実施され得る。このアッセ
イは、本質的に、ＣｈＭＩｒｐまたはＣｈＭＩｒｐ結合パートナーのいずれかの
、デキストランでコートされたセンサーチップ（これは、検出器内に位置する）
への共有結合に関与する。次いで、この試験化合物および他の相補タンパク質が
、同時にかまたは連続的にかのいずれかで、センサーチップを含むチャンバーに
注入され得、そして互いに結合する相補タンパク質の量が、センサーチップのデ
キストランコート側面に物理的に関係する分子の質量の変化に基づいて評価され
得；この分子の質量の変化が、検出器システムによって測定される。

【０２９２】 いくつかの場合において、２つ以上の試験化合物を一緒に、ＣｈＭＩｒｐポリ
ペプチドとＣｈＭＩｒｐ結合パートナー複合体との間の複合体の形成を増加また
は減少させるそれらの能力について評価することが所望され得る。これらの場合
において、上記のアッセイは、第一の試験化合物と同時にか、またはそれに続い
てのいずれかで、このようなさらなる試験化合物を添加することによって容易に
改変され得る。このアッセイにおける工程の残りは、上記に記載される通りであ
る。

【０２９３】 上記のアッセイのようなインビトロアッセイは、ＣｈＭＩｒｐとＣｈＭＩｒｐ
結合パートナーによる複合体の形成に対する効果について、多数の化合物を迅速
にスクリーニングするために、有利に使用され得る。これらのアッセイは、ファ
ージディスプレイ、合成ペプチド、および化学合成ライブラリーにおいて生成さ
れた化合物をスクリーニングするために、自動化され得る。

【０２９４】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドとＣｈＭＩｒｐ結合パートナーとの間の複合体の形
成を増加または減少される化合物はまた、ＣｈＭＩｒｐまたはＣｈＭＩｒｐ結合
パートナーのいずれかを発現する細胞および細胞株を使用して、細胞培養物にお
いてスクリーニングされ得る。細胞および細胞株は、任意の哺乳動物から得られ
得るが、好ましくは、ヒト、または他の霊長類、イヌ類またはげっ歯類の供給源
由来である。その表面でＣｈＭＩｒｐ結合パートナーを発現する細胞へのＣｈＭ
Ｉｒｐポリペプチドの結合は、試験化合物の存在または非存在下で評価され、そ
して結合の程度が、例えば、ＣｈＭＩｒｐ結合パートナーに対するビオチン化抗
体を使用するフローサイトメトリーによって決定され得る。細胞培養アッセイは
、上記のタンパク質結合アッセイにおいて、陽性であるとスコア付けされる化合
物をさらに評価するために有利に使用され得る。

【０２９５】 細胞培養物はまた、薬物候補の影響をスクリーニングするために使用され得る
。例えば、薬物候補は、ＣｈＭＩｒｐポリペプチド遺伝子の発現を減少または増
加させ得る。特定の実施形態において、生成されるＣｈＭＩｒｐポリペプチドま
たはフラグメントの量は、細胞培養物の薬物候補への曝露の後に測定され得る。
特定の実施形態において、細胞培養物についての薬物候補の実際の影響が検出さ
れ得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、細胞培養物への特定の影響を有し
得る。このような場合に、この遺伝子の発現を増加または減少させる薬物候補の
能力、または細胞培養物に対する特定の影響を防止または阻害するその能力が試
験され得る。他の例において、特定の代謝産物（例えば、ポリペプチドのフラグ
メント）の生成は、疾患または病理学的状態を生じ得るか、またはそれらと関連
し得る。このような場合、細胞培養物におけるこのような代謝産物の生成を減少
する薬物候補の能力が試験され得る。

【０２９６】 酵母ツーハイブリッド系（Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，８８：９５７８−９５８３，１９９１）は、ＣｈＭＩｒｐポリペ
プチドに結合するか、またはこれと相互作用する新規なポリペプチドを同定する
ために使用され得る。例として、酵母ツーハイブリッド餌（ｂｉｔｅ）構築物が
、ベクター（例えば、ＣｌｏｎｔｅｃｈからのｐＡＳ２−１）において生成され
得、これはＣｈＭＩｒｐポリヌクレオチドに融合した酵母ＧＡＬ４−ＤＮＡ結合
ドメインをコードする。この餌構築物は、ヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリー
ニングするために使用され得、ここでこのｃＤＮＡライブラリーの配列は、ＧＡ
Ｌ４活性化ドメインに融合する。ポジティブな相互作用は、β−Ｇａｌのような
レポーター遺伝子の活性化を生じる。スクリーニングから生じるポジティブクロ
ーンは、相互作用するタンパク質を同定するためにさらに特徴付けられ得る。

【０２９７】 （ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの組成物および投与） コンドロモジュリンファミリーのメンバーは、軟骨形成および骨成長を誘導す
ることが公知である。さらに、これらのタンパク質は、血管新生のインヒビター
であることが示唆されている。新脈管形成は、多くの病理学的状態を媒介する。
これらの記載された生物学的活性は、コンドロモジュリンの投与の可能な治療用
途を示唆する。

【０２９８】 ＣｈＭＩｒｐのポリペプチドの薬学的組成物は、減少したレベルのＣｈＭＩｒ
ｐから生じる適応症に関するヒトおよび動物の予防的および治療処置のため、ま
たはその適応症の改善または治癒をＣｈＭＩｒｐポリペプチドの投与が生じるこ
とを決定する場合、本発明の範囲内である。そのような組成物は、治療有効量の
ＣｈＭＩｒｐポリペプチドおよび／またはその結合パートナー、あるいは治療的
に活性なそのフラグメント、改変体または誘導体を、薬学的に受容可能な添加物
および／またはキャリアと混合されて含み得る。適切な処方物材料または薬学的
に受容可能な因子としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：抗酸化
剤、保存剤、着色料、矯味矯臭剤、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー
、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュ
バント。代表的には、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドを含む治療的化合物は、精製さ
れたポリペプチド、フラグメント、改変体または誘導体を、１つ以上の生理的に
受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与され
る。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液で
あり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充する
ことが可能である。

【０２９９】 中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、例
示の適切なキャリアである。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば
、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、
希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ約
７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝液またはｐＨ約４．０−５．５の酢酸緩衝液を含
み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。その
溶液のｐＨはまた、種々のｐＨにおいて、ＣｈＭＩｒｐリガンドの相対的溶解度
に基づいて選択されるべきである。

【０３００】 組成物における主要な溶媒は、性質が水性または非水性のいずれかであり得る
。さらに、そのビヒクルは、処方物の、ｐＨ、容量オスモル濃度、粘性、明澄性
、色、滅菌性、安定性、等張性、溶解速度、または臭いを改変または維持するた
めの他の処方物材料を含み得る。同様に、その組成物は、ＣｈＭＩｒｐポリペプ
チドの放出速度を改変もしくは維持するため、またはＣｈＭＩｒｐポリペプチド
の吸収もしくは透過を促進するためのさらなる処方物材料を含み得る。

【０３０１】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチド組成物を含む組成物は、非経口的に投与され得る。
あるいは、その組成物は、静脈内または皮下で投与され得る。全身投与される場
合には、本発明における使用のための治療組成物は、発熱物質を含まない、非経
口的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能なタン
パク質溶液の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などに相当な注意を払えば、当該分
野の技術の範囲内である。

【０３０２】 本発明を実施するために有用なＣｈＭＩｒｐポリペプチド組成物の治療処方物
は、任意の生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇ
ｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ａ
．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ
，１９９０）と、所望の程度の純度を有する選択された組成物とを混合すること
によって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で、保存のために調製され
得る。

【０３０３】 受容可能なキャリア、賦形剤または安定剤は、レシピエントに対して非毒性で
あり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、
そして以下が挙げられる：緩衝剤（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、または他の
有機酸）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）；低分子量ポリペプチド；タン
パク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポ
リマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グル
タミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカ
リドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む
）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールま
たはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／ある
いは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニックまたはポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ））。

【０３０４】 治療的に用いられる有効量のＣｈＭＩｒｐポリペプチド組成物は、例えば、治
療目的（例えば、組成物が用いられる適応症、投与経路（例えば、局所投与され
るかまたは全身投与されるか）、および患者の状態（例えば、患者の一般的健康
状態、アナウレウエシス（ａｎａｕｒｅｕｅｓｉｓ）、年齢、体重、性別））に
依存する。治療有効用量を決定する場合、この疾患の原因であるＣｈＭＩｒｐま
たは分泌コンドロモジュリンファミリーの他のメンバーの量および内因性ＣｈＭ
Ｉｒｐの量を考慮することが必須である。従って、治療者は、最適な治療効果を
得るために必要に応じて、投薬量を力価測定することおよび／または投与経路を
インビボで改変することが必要である。代表的な日投薬量は、上記の因子に依存
して約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。代表的に、
臨床医は、所望の効果を達成する投薬量に到達するまで組成物を投与する。それ
ゆえ、この組成物は、単一用量として、または経時的に２以上の用量（これは、
同じ量のＣｈＭＩｒｐポリペプチドを含んでも含まなくてもよい）で、または移
植デバイスもしくはカテーテルを介して連続注入として投与され得る。

【０３０５】 投薬頻度は、用いられる処方物中のＣｈＭＩｒｐ分子の薬物動態学的パラメー
ターに依存する。代表的に、臨床医は、所望の効果を達成する投薬量に到達する
まで組成物を投与する。それゆえ、組成物は、単一用量として、または経時的に
２以上の用量（これは、同じ量の所望の分子を含んでも含まなくてもよい）とし
て、または移植デバイスもしくはカテーテルを介して連続注入として投与され得
る。適切な投薬量のさらなる改善は、当業者によって慣用的に行われ、そして当
業者によって慣用的に行われる作業の範囲内に入る。適切な投薬量は、適切な用
量応答データの使用を通して確認され得る。

【０３０６】 さらなる研究が行われるほど、種々の患者における種々の状態の処置のために
適切な投薬量レベルに関する情報が明らかになり、そして当業者は、治療的状況
、処置されている障害の種類、レシピエントの年齢および一般的健康状態を考慮
して、適切な投薬を確実にし得る。

【０３０７】 インビボでの投与のために用いられるＣｈＭＩｒｐポリペプチド組成物は無菌
でなければならない。このことは、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成
される。組成物が凍結乾燥される場合、これらの方法を用いた滅菌は、凍結乾燥
および再構成の前または後のいずれかで行われ得る。非経口投与のための組成物
は通常、凍結乾燥形態で、または溶液中に保存される。

【０３０８】 治療組成物は一般的に、無菌アクセスポートを有する容器（例えば、皮下注射
針によって穿孔可能なストッパーを有する、静脈内溶液バッグまたはバイアル）
中に入れられる。

【０３０９】 有効投与形態（例えば、（１）徐放（ｓｌｏｗ−ｒｅｌｅａｓｅ）処方物、（
２）吸入ミスト（ｉｎｈａｌａｎｔ ｍｉｓｔ）または（３）経口活性な処方物
）もまた、想定される。治療有効用量のＣｈＭＩｒｐポリペプチドを含む薬学的
組成物もまた、非経口投与のために処方され得る。このような非経口投与される
治療的組成物は代表的に、薬学的に受容可能なビヒクル中にＣｈＭＩｒｐを含む
、発熱物質を含まない、非経口的に受容可能な水溶液の形態である。ＣｈＭＩｒ
ｐの薬学的組成物はまた、ポリマー性化合物（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコー
ル酸など）の粒状調製物またはリポソームへのＣｈＭＩｒｐの導入を含み得る。
ヒアルロン酸もまた用いられ得、そしてこれは、循環中の持続期間を助長する効
果を有し得る。

【０３１０】 非経口注射のために特に適切なビヒクルは、適切に保存された滅菌蒸留水であ
り、ここに、ＣｈＭＩｒｐが無菌の等張性溶液として処方される。なお別の調製
物は、タンパク質産物の制御されたかまたは持続した放出を提供し、次いで、蓄
積注射として送達され得る、因子（例えば、注射可能なミクロスフェア、生体侵
食性（ｂｉｏ−ｅｒｏｄｉｂｌｅ）粒子もしくはビーズ、またはリポソーム）を
伴うＣｈＭＩｒｐの処方物を含み得る。ＣｈＭＩｒｐの導入のための他の適切な
手段としては、ＣｈＭＩｒｐおよび／またはその結合パートナーを含む、移植可
能な薬物送達デバイスが挙げられる。

【０３１１】 本発明の調製物は、当該分野で周知のように、他の成分（例えば、非経口的に
受容可能な保存剤、張度（ｔｏｎｉｃｉｔｙ）剤、共溶媒、湿潤剤、錯化剤、緩
衝剤、抗菌剤、抗酸化剤および界面活性剤）を含み得る。例えば、適切な張度増
強剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）としては、アルカ
リ金属ハロゲン化物（好ましくは、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）、マン
ニトール、ソルビトールなどが挙げられる。適切な保存剤としては、塩化ベンザ
ルコニウム、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピル
パラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸などが挙げられるがこれらに限定され
ない。過酸化水素もまた、保存剤として用いられ得る。適切な共溶媒は、例えば
、グリセリン、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールである。適
切な錯化剤は、例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキス
トリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。適切な界面
活性剤または湿潤剤としては、ソルビタンエステル、ポリソルベート（例えば、
ポリソルベート８０）、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポ
ール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）などが挙げられる。緩衝剤は、従来の緩衝剤（例え
ば、ボレート、シトレート、ホスフェート、ビカーボネートまたはＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ）であり得る。

【０３１２】 処方物成分は、投与部位に受容可能である濃度で存在する。例えば、緩衝剤は
、組成物を生理学的ｐＨにまたはわずかに低いｐＨに（代表的には、約５〜約８
のｐＨ範囲内に）維持するために用いられ得る。

【０３１３】 非経口投与が意図される場合、本発明において使用するための治療的組成物は
、所望のＣｈＭＩｒｐ分子を薬学的に受容可能なビヒクル中に含む、発熱物質を
含まない、非経口的に受容可能な水溶液の形態であり得る。非経口注射のために
特に適切なビヒクルは、適切に保存された無菌蒸留水であり、ここに、ＣｈＭＩ
ｒｐ分子が無菌の等張性溶液として処方される。なお別の調製物は、産物の制御
されたかまたは持続した放出を提供し、次いで、蓄積注射を介して送達され得る
、因子（例えば、注射可能なミクロスフェア、生体侵食性粒子、ポリマー性化合
物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸）またはビーズもしくはリポソーム）とと
もに所望の分子の処方物を含み得る。ヒアルロン酸もまた用いられ得、そしてこ
れは、循環中の持続期間を助長する効果を有し得る。所望の分子の導入のための
他の適切な手段としては、移植可能な薬物送達デバイスが挙げられる。

【０３１４】 １つの実施形態において、薬学的組成物は、吸入のために処方され得る。例え
ば、ＣｈＭＩｒｐ分子は、吸入のための乾燥粉末として処方され得る。ＣｈＭＩ
ｒｐポリペプチドまたはＣｈＭＩｒｐ核酸分子の吸入溶液はまた、エアゾール送
達のためのプロペラントを用いて処方され得る。なお別の実施形態では、溶液が
噴霧化され得る。肺投与はさらに、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７
５号に記載される。ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号は、化学的
に改変されたタンパク質の肺性送達を記載した。

【０３１５】 ＣｈＭＩｒｐを含む特定の処方物が経口投与され得ることもまた意図される。
本発明の１つの実施形態では、この様式で投与されるＣｈＭＩｒｐ分子は、固体
投薬形態の混合物（例えば、錠剤およびカプセル剤）において習慣的に用いられ
るキャリアを伴ってまたは伴わずに処方され得る。例えば、カプセル剤は、胃腸
管にある時点で（このとき、バイオアベイラビリティが最大にされ、そして全身
以前（ｐｒｅ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ）の分解が最少にされる）処方物の活性な部分
を放出するように設計され得る。さらなる薬剤は、ＣｈＭＩｒｐ分子の吸収を促
進するために含まれ得る。希釈剤、矯味矯臭剤、低融点ろう、植物油、滑沢剤、
懸濁剤、錠剤崩壊剤および結合剤もまた用いられ得る。

【０３１６】 別の薬学的組成物は、錠剤の製造に適切である非毒性賦形剤との混合物中で有
効量のＣｈＭＩｒｐ分子を含み得る。滅菌水または他の適切なビヒクル中に錠剤
を溶解することによって、溶液は、単位用量形態で調製され得る。適切な賦形剤
としては、不活性希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは炭
酸水素ナトリウム、ラクトースまたはリン酸カルシウム）；または結合剤（例え
ば、デンプン、ゼラチンまたはアカシア）；または滑沢剤（例えば、ステアリン
酸マグネシウム、ステアリン酸または滑石）が挙げられるがこれらに限定されな
い。

【０３１７】 さらなるＣｈＭＩｒｐの薬学的組成物は、持続送達処方物または制御送達処方
物においてＣｈＭＩｒｐポリペプチドを含む処方物を含めて、当業者には明らか
である。種々の他の持続送達手段または制御送達手段を処方するための技術（例
えば、リポソームキャリア、生体侵食性微粒子または多孔質ビーズおよび蓄積注
射）もまた、当業者に公知である。例えば、薬学的組成物の送達のための制御放
出多孔性ポリマー性微粒子を記載する、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８
２９号を参照のこと。

【０３１８】 一旦、薬学的組成物が処方されると、それは、滅菌バイアル中に溶液、懸濁液
、ゲル、エマルジョン、固体、または乾燥粉末または凍結乾燥粉末として保存さ
れ得る。このような処方物は、すぐに使用できる形態または投与の前に再構築を
必要とする形態（例えば、凍結乾燥された）のいずれかで保存され得る。

【０３１９】 特定の実施形態では、本発明は、単回用量投与単位を産生するためのキットに
関する。このキットは各々、所望のタンパク質を有する第１の容器および水性処
方物を有する第２の容器の両方を備え得る。本発明の範囲内には、単一の室のお
よび複数の室の予め充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよび凍結乾燥
シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含むキットもまた含まれ得る。

【０３２０】 投与形態にかかわらず、特定の用量は、器官の重量、表面積または大きさに従
って計算される。各々の上記処方物を含む処置に適する投薬量を決定するために
必要な計算のさらなる改善は、当業者によって慣用的になされ、そして当業者に
よって慣用的に実施される作業の範囲内である。適切な投薬量は、適切な用量応
答データの使用により決定され得る。

【０３２１】 薬学的組成物の投与経路は、公知の方法（例えば、経口的、静脈内、腹腔内、
大脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内もしくは病変内の経路による
注射を通して、あるいは持続放出系によって、または移植デバイス（これは、必
要に応じて、カテーテルの使用を含み得る）によって）に従う。所望の場合、組
成物は、ボーラス注射によって、または注入によって連続的に、または移植デバ
イスによって投与され得る。あるいは、またはさらに、組成物は、ＣｈＭＩｒｐ
ポリペプチドが吸収された膜、スポンジまたは別の適切な材料の、罹患領域への
移植を介して局所投与され得る。

【０３２２】 本発明の薬学的組成物を、肺投与によってさらに投与し得る。例えば、国際公
開第ＷＯ ９４／２００６９号を参照のこと。国際公開第ＷＯ ９４／２００６
９号は、化学的に改変されたタンパク質肺性送達を開示する。肺性送達について
は、粒子の大きさは、肺の遠位への送達に適切であるべきである。例えば、粒子
の大きさは、１ｍｍ〜５ｍｍであり得るが、例えば、各粒子がかなり多孔性であ
れば、より大きな粒子が用いられ得る。あるいは、またはさらに、この組成物は
、罹患した領域への、レセプターポリペプチドが吸収またはカプセル化された膜
、スポンジまたは他の適切な材料の移植を介して局所投与され得る。移植デバイ
スが用いられる場合、このデバイスは、任意の適切な組織または器官に移植され
得、そして送達は、ボーラスを介して、または連続投与を介して、または連続注
入を用いたカテーテルを介して、デバイスを通して直接的であり得る。

【０３２３】 ＣｈＭＩｒｐ−リガンドポリペプチドおよび／またはその結合パートナーもま
た、持続放出処方物または調製物で投与され得る。適切なポリマー組成物は好ま
しくは、以下であるために固有のおよび制御可能な生分解性を有する：約１週間
から約６週間持続し；有意な毒性モノマーを含まず、そして非毒性成分へと分解
せず、非毒性であり；生体適合性であり、送達されるべき物質と化学的に適合性
であり、そして活性な物質を変性させる傾向はなく；生物学的に活性な分子の取
り込み、その後の拡散、腐食もしくはそれらの組み合わせによるポリマーからの
それらの遊離を可能にするに十分に多孔質であり；接着もしくは幾何学的作用（
ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ｆａｃｔｉｏｎ）によって適用部位に残存し得（例えば、
適所に形成されるかもしくは軟化され、そしてその後、微粒子に成形および形成
され、この微粒子は、所望の位置で捕獲される）；侵襲性が最少の技術によって
（例えば、カテーテル、腹腔鏡または内視鏡によって）送達され得る。持続放出
マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７
７３，９１９号、ＥＰ ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−
グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２
：５４７−５５６，１９８３）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート
）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７
−２７７，１９８１およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−
１０５，１９８２）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら，前出）またはポリ
−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ １３３，９８８）を含む。持続放出組
成物はまた、リポソームを含み得る。リポソームは、当該分野で公知のいくつか
の方法のいずれかによって調製され得る（例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８−３６９２，１９８
５；ＥＰ ３６，６７６；ＥＰ ８８，０４６；ＥＰ １４３，９４９）。

【０３２４】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチド、その改変体、誘導体またはフラグメントは、単独
で、一緒に、または他の薬学的組成物と一緒にかもしくは組み合わせで用いられ
得る。ＣｈＭＩｒｐポリペプチド、フラグメント、改変体および誘導体は、処置
される適応症について適切である場合、サイトカイン、サイトカインインヒビタ
ー、増殖因子、抗生物質、抗炎症剤および／または化学療法剤と組み合わせて用
いられ得る。

【０３２５】 いくつかの場合、ＣｈＭＩｒｐの薬学的組成物をエキソビボの様式で使用する
ことが所望され得る。このような場合には、患者から取り出された細胞、組織ま
たは器官がＣｈＭＩｒｐの薬学的組成物に曝露され、その後、この細胞、組織お
よび／または器官が続いて、その患者に移植し戻される。

【０３２６】 他の場合、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドは、このポリペプチドを発現および分泌
するために、本明細書中に記載されるような方法を用いて、遺伝子操作された特
定の細胞を移植することによって送達され得る。このような細胞は、動物細胞ま
たはヒト細胞であり得、そして自己由来、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）由
来または異種（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）由来であり得る。必要に応じて、この細
胞は、不死化され得る。免疫学的応答の機会を減少するために、この細胞は周辺
組織の浸透を回避するためにカプセル化され得る。カプセル化材料は、代表的に
、生体適合性の半透性ポリマー封入物または膜（これは、タンパク質産物の放出
を可能にするが、患者の免疫系または周辺組織からの他の有害な因子による細胞
の崩壊を防止する）である。

【０３２７】 細胞の膜カプセル化のために使用される方法は、当業者に精通され、そしてカ
プセル化細胞の調製および患者へのそれらの移植は、過度の実験なしに達成され
得る（例えば、米国特許第４，８９２，５３８号；同第５，０１１，４７２号；
および同第５，１０６，６２７号を参照のこと）。生存細胞をカプセル化するた
めの系は、国際出願番号ＷＯ９１／１０４２５に記載される。種々の他の持続送
達手段または制御送達手段（例えば、リポソームキャリア、生体侵食粒子もしく
はビーズ）を処方するための技術はまた、当業者に公知であり、そして例えば、
米国特許第５，６５３，９７５号に記載される。カプセル化有りまたは無しで細
胞は、患者の適切な体組織または器官に移植され得る。

【０３２８】 上記のように、単離された細胞集団（例えば、幹細胞、リンパ球、赤血球、軟
骨細胞、ニューロンなど）を処置すること；適切なように、１つ以上のＣｈＭＩ
ｒｐポリペプチド、改変体、誘導体および／またはフラグメントを添加すること
が、望ましくあり得る。これは、単離された細胞を、ポリペプチド、改変体、誘
導体、またはフラグメント（ここでこれらは、細胞膜に対して透過性の形態であ
る）に直接曝露することによって達成され得る。

【０３２９】 本明細書中にさらなる実施形態は、治療ポリペプチドのインビトロ産生と遺伝
子治療または細胞治療による治療ポリペプチドの産生および送達との両方に関す
る、細胞および方法（例えば、相同組換えおよび／または他の組換え産生方法）
に関する。

【０３３０】 （相同組換え） ＣｈＭＩｒｐポリペプチドが、相同組換えによってか、またはＣｈＭＩｒｐポ
リペプチドをコードするＤＮＡを既に含む細胞に導入された制御エレメントを利
用する組換え産生方法を用いて産生され得ることが、さらに想定される。例えば
、相同組換え方法は、正常に転写的にサイレントなＣｈＭＩｒｐ遺伝子（すなわ
ち、発現抑制されている遺伝子）を含む細胞を改変するために使用され得、そし
てそれによって、治療有効量のＣｈＭＩｒｐを発現する細胞が産生される。相同
組換えは、もともとは、遺伝子を標的化して転写的に活性な遺伝子における変異
を誘導するか、または修正するために開発された技術である（Ｋｕｃｈｅｒｌａ
ｐａｔｉら，１９８９，Ｐｒｏｇ．ｉｎ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．＆ Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６：３０１）。基本的な技術が、特定の変異を哺乳動物ゲノ
ムの特定の領域に導入するため（Ｔｈｏｍａｓら、１９８６，Ｃｅｌｌ ４４：
４１９−４２８；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，１９８７，Ｃｅｌｌ
５１：５０３−５１２；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８５８３−８５８７）、または欠損
遺伝子における特定の変異を修正するため（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９８７
，Ｎａｔｕｒｅ ３３０：５７６−５７８）の方法として、開発された。例示的
な相同組換え技術は、米国特許第５，２７２，０７１号；欧州特許第９１ ９０
３０５１号；欧州公開番号第５０５ ５００号；ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７６４
２；国際公開番号ＷＯ ９１／０９９５５）に記載されている。

【０３３１】 相同組換えによって、ゲノムに挿入されるＤＮＡ配列は、それを標的化ＤＮＡ
に付着させることによって、目的の遺伝子の特定の領域に指向され得る。この標
的化ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの領域に相補的（相同）であるヌクレオチド配列で
ある。ゲノムの特定の領域に対して相補的な標的化ＤＮＡの小さな断片は、ＤＮ
Ａ複製プロセスの間に、親鎖と接触される。これは、ハイブリダイズするために
細胞に挿入されたＤＮＡの一般的な特性であり、従って、共有される相同領域を
介して、内因性ＤＮＡの他の断片と組み換わる。この相補鎖が、変異もしくは異
なる配列またはさらなるヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに付着される場
合には、これはまた、この組換えの結果として新たに合成された鎖に組み込まれ
る。プルーフリーディング機能の結果として、ＤＮＡの新たな配列がテンプレー
トとして作用することが可能である。従って、移入されたＤＮＡは、ゲノムに組
み込まれる。

【０３３２】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドと相互作用し得るかまたはその発現を制御し得るＤ
ＮＡの領域（例えば、隣接配列）が、標的化ＤＮＡのこれらの断片に付着される
。例えば、プロモーター／エンハンサーエレメント、サプレッサ、または外因性
転写調節エレメントが、意図される宿主細胞のゲノムに、所望のＣｈＭＩｒｐポ
リペプチドをコードするＤＮＡの近位で、このＤＮＡの転写に影響を与えるに十
分な配向で、挿入される。制御エレメントは、この宿主細胞ゲノムに存在するＤ
ＮＡの一部を制御する。従って、所望のＣｈＭＩｒｐポリペプチドの発現は、Ｃ
ｈＭＩｒｐ遺伝子自体をコードするＤＮＡのトランスフェクションによってでは
なく、ＣｈＭＩｒｐ遺伝子の転写のための認識可能なシグナルを有する内因性遺
伝子配列を提供するＤＮＡ調節セグメントと結合した標的化ＤＮＡ（目的の内因
性遺伝子と相同の領域を含む）の使用によって、達成され得る。

【０３３３】 例示的な方法において、細胞における所望の標的遺伝子（すなわち、所望の内
因性細胞遺伝子）の発現は、予め選択された部位における細胞ゲノムへの相同組
換えを介して、少なくとも調節配列、エキソン、およびスプライスドナー部位を
含むＤＮＡの導入によって、変更される。これらの構成成分は、新たな転写単位
の産生を実際に生じるような様式で、染色体（ゲノム）ＤＮＡに導入される（こ
こで、ＤＮＡ構築物に存在する調節配列、エキソン、およびスプライスドナー部
位は、内因性遺伝子に作動可能に連結される）。染色体ＤＮＡへのこれらの構成
成分の導入の結果として、所望の内因性遺伝子の発現が変化する。

【０３３４】 本明細書中で記載される場合、変更された遺伝子発現は、得られたときの細胞
において通常はサイレントな（発現されていない）遺伝子の活性化（または発現
させること）、ならびに得られたときの細胞において生理学的に有意なレベルで
は発現されない遺伝子の発現の増加を、包含する。この実施形態はさらに、調節
または誘導のパターンを変化させる工程を包含し、その結果、これは、得られた
ときの細胞において生じる調節または誘導のパターンとは異なり、そして得られ
たときの細胞において発現される遺伝子の発現を減少させる（排除することを含
む）。

【０３３５】 細胞の内因性ＣｈＭＩｒｐ遺伝子からのＣｈＭＩｒｐポリペプチドの産生を増
加するかまたはこれを引き起こすために相同組換えが使用され得る１つの方法は
、最初に、相同組換えを使用して、組換え配列を部位特異的組換え系から（例え
ば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ、ＦＬＰ／ＦＲＴ）（Ｓａｕｅｒら，１９９４，Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５：５２１−５
２７；Ｓａｕｅｒら，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２２
５：８９０−９００）を、細胞の内因性ゲノムＣｈＭＩｒｐポリペプチドコード
領域の上流（すなわち、５’側）に配置することを含む。ゲノムＣｈＭＩｒｐポ
リペプチドコード領域のすぐ上流に配置された部位に対して相同性の組換え部位
を含むプラスミドは、適切なリコンビナーゼ酵素と共に、改変された細胞株に導
入される。このリコンビナーゼによって、このプラスミドの組換え部位を介して
、この細胞株のゲノムＣｈＭＩｒｐポリペプチドコード領域のすぐ上流に位置す
る組換え部位へのプラスミドの組み込みを引き起こす（Ｂａｕｂｏｎｉｓおよび
Ｓａｕｅｒ、１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２０２５
−２９；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−
１３５５）。転写を増加させることが公知の任意の隣接配列（例えば、エンハン
サー／プロモーター、イントロン、翻訳エンハンサー）は、このプラスミド中に
適切に配置される場合、細胞の内因性ＣｈＭＩｒｐ遺伝子からの新規なまたは増
加したＣｈＭＩｒｐポリペプチド産生を生じる新たなまたは改変された転写単位
を作製するような様式で組み込まれる。

【０３３６】 部位特異的組換え配列が細胞の内因性ゲノムＣｈＭＩｒｐポリペプチドコード
領域のすぐ上流に配置された細胞株を使用するさらなる方法は、細胞株のゲノム
の他の位置に第２の組換え部位を導入するために相同組換えを使用することであ
る。適切なレコンビナーゼ酵素は、次いで、二つの組換え部位の細胞株に導入さ
れ、組換え事象（欠失、逆位、および転座）を生じ（Ｓａｕｅｒら，１９９４，
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（前出）
；Ｓａｕｅｒ，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（前出
））、これは、細胞の内因性ＣｈＭＩｒｐ遺伝子からの新規なまたは増加したＣ
ｈＭＩｒｐポリペプチド産生を生じる新規または改変された転写単位を作製する
。

【０３３７】 細胞の内因性ＣｈＭＩｒｐ遺伝子からのＣｈＭＩｒｐポリペプチドの発現を増
加するため、または引き起こすためのさらなるアプローチは、細胞の内因性Ｃｈ
ＭＩｒｐ遺伝子からの新規なまたは増加したＣｈＭＩｒｐポリペプチドの産生を
生じる様式で、遺伝子（単数または複数）（例えば、転写因子）の発現を増加す
るかまたは引き起こし、そして／または遺伝子（単数または複数）（例えば、転
写リプレッサ）の発現を減少する工程を包含する。この方法は、天然には存在し
ないポリペプチド（例えば、転写因子ドメインに融合した部位特異的ＤＮＡ結合
ドメインを含むポリペプチド）を、細胞の内因性ＣｈＭＩｒｐ遺伝子からの新た
なまたは増加したＣｈＭＩｒｐポリペプチドの産生が起こるように、細胞に導入
する工程を包含する。

【０３３８】 本発明はさらに、標的遺伝子の発現を変化させる方法において有用なＤＮＡ構
築物に関する。特定の実施形態において、例示的なＤＮＡ構築物は、以下を含む
：（ａ）１つ以上の標的化配列；（ｂ）制御配列；（ｃ）エキソン；および（ｄ
）不対スプライスドナー部位。ＤＮＡ構築物中の標的化配列は、エレメント（ａ
）〜（ｄ）の細胞中の標的遺伝子への組込みを指向し、その結果、これらのエレ
メント（ｂ）〜（ｄ）は、内因性標的遺伝子の配列に作動可能に連結される。別
の実施形態において、ＤＮＡ構築物は、以下を含む：（ａ）１つ以上の標的化配
列、（ｂ）制御配列、（ｃ）エキソン、（ｄ）スプライスドナー部位、（ｅ）イ
ントロン、および（ｆ）スプライスアクセプター部位。ここで、標的化配列は、
エレメント（ａ）〜（ｆ）の組込みを指向し、その結果、これらのエレメント（
ｂ）〜（ｆ）は、内因性遺伝子に作動可能に連結される。標的配列は、相同組換
えが生じる細胞性染色体ＤＮＡの予め選択された部位に対して相同性である。こ
の構築物において、エキソンは、一般的に、調節配列の３’であり、そしてスプ
ライスドナー部位は、このエキソンの３’である。

【０３３９】 特定の遺伝子の配列（例えば、本明細書中で示されるＣｈＭＩｒｐポリペプチ
ドの核酸配列）が公知である場合、遺伝子の選択された領域に対して相補的なＤ
ＮＡの断片は、合成され得るか、またはそうでなければ、例えば、目的の領域に
結合している特定の認識部位におけるネイティブのＤＮＡの適切な制限によって
得られ得る。この断片は、細胞に挿入された際に、標的化配列として作用し、そ
してそのゲノム内の相同性領域にハイブリダイズする。このハイブリダイゼーシ
ョンが、ＤＮＡ複製の間に生じる場合、このＤＮＡの断片、およびそれに結合し
た任意のさらなる配列は、岡崎フラグメントとして作用し、そしてＤＮＡの新た
に合成された娘鎖に組み込まれる。従って、本発明は、ＣｈＭＩｒｐポリペプチ
ドをコードするヌクレオチドを含み、このヌクレオチドは、標的化配列として使
用され得る。

【０３４０】 あるいは、遺伝子治療が、以下に記載されるように使用され得る。

【０３４１】 （ＣｈＭＩｒｐの細胞治療および遺伝子治療） ＣｈＭＩｒｐ細胞療法（例えば、ＣｈＭＩｒｐを産生する細胞の移植）もまた
企図される。この実施形態は、生物学的に活性な形態のＣｈＭＩｒｐポリペプチ
ドを合成および分泌し得る細胞を患者に移植する工程を包含する。このようなＣ
ｈＭＩｒｐポリペプチド産生細胞は、ＣｈＭＩｒｐの天然のプロデューサーであ
る細胞であり得るか、または組換え細胞であって、そのＣｈＭＩｒｐポリペプチ
ドを産生する能力が、所望のＣｈＭＩｒｐポリペプチドをコードする遺伝子また
はＣｈＭＩｒｐポリペプチドの発現を増大する遺伝子で形質転換することによっ
て増大された、組換え細胞であり得る。このような改変は、遺伝子を送達し、そ
の発現および分泌を促進するのに適切なベクターによって達成され得る。ＣｈＭ
Ｉｒｐポリペプチドを投与されている患者における潜在的な免疫学的反応を最小
化するために、外来種のポリペプチドの投与を伴い得る場合、ＣｈＭＩｒｐポリ
ペプチドを産生する天然の細胞が、ヒト起源であり、そしてヒトＣｈＭＩｒｐポ
リペプチドを産生することが好ましい。同様に、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドを産
生する組換え細胞が、ヒトＣｈＭＩｒｐポリペプチドをコードする遺伝子を含む
発現ベクターで形質転換されることが好ましい。

【０３４２】 移植細胞は、周辺組織の浸潤を回避するようにカプセル化され得る。ヒトまた
は非ヒト動物細胞は、生体適合性の半透性ポリマー封入物または膜（これは、Ｃ
ｈＭＩｒｐポリペプチドの放出を可能にするが、患者の免疫系または周辺組織か
らの他の有害な因子による細胞の崩壊を防止する）で患者に移植され得る。ある
いは、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドをエキソビボで産生するように形質転換された
患者自身の細胞が、このようなカプセル化を伴わずに、患者に直接移植され得る
。

【０３４３】 生存細胞をカプセル化するための技術は当該分野で公知であり、そしてカプセ
ル化された細胞の調製および患者へのそれらの移植は、慣用的に達成され得る。
例えば、Ｂａｅｔｇｅら（国際公開番号ＷＯ９５／０５４５２；国際出願番号Ｐ
ＣＴ／ＵＳ９４／０９２９９）は、生物学的に活性な分子の効率的な送達のため
に遺伝子操作された細胞を含む膜カプセルを記載する。このカプセルは、生体適
合性であり、そして容易に回収可能（ｒｅｔｒｉｅｖａｂｌｅ）である。このカ
プセルは、哺乳動物宿主に移植された際に、インビボでダウンレギュレーション
に供されないプロモーターに作動可能に連結された生物学的に活性な分子をコー
ドするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトされた細胞をカプ
セル化する。このデバイスは、レシピエント内の特定の部位への生存細胞由来の
分子の送達を提供する。さらに、米国特許第４，８９２，５３８号、同第５，０
１１，４７２号、および同第５，１０６，６２７号を参照のこと。生存細胞をカ
プセル化するための系は、国際出願ＷＯ９１／１０４２５（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ
ら）国際出願ＷＯ９１／１０４７０（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）；Ｗｉｎｎら、１
９９１，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１３：３２２−３２９；Ａｅｂｉｓｃｈ
ｅｒら、１９９１，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１１：２６９−２７５；およ
びＴｒｅｓｃｏら、１９９２，ＡＳＡＩＯ ３８：１７−２３に記載される。

【０３４４】 ＣｈＭＩｒｐの、インビボおよびインビトロでの遺伝子治療送達もまた、本発
明に含まれる。インビボ遺伝子治療は、ＣｈＭＩｒｐをコードする遺伝子を、ポ
リヌクレオチド分子または他の適切な送達ベクターの局所的注射によって、細胞
に導入することによって、達成され得る（Ｈｅｆｔｉ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ，２５：１４１８−１４３５，１９９４）。例えば、ＣｈＭＩｒｐをコー
ドするポリヌクレオチド分子は、標的化された細胞への送達のために、アデノ随
伴ウイルスベクターに含まれ得る（国際公開番号ＷＯ ９５／３４６７０；国際
出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７１７８）。組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ
）ゲノムは、代表的に、機能的プロモーターに作動可能に連結したＣｈＭＩｒｐ
をコードするＤＮＡ配列に隣接するＡＡＶ逆方向末端反復、およびポリアデニル
化配列を含む。

【０３４５】 代替のウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルス
ベクター、単純ヘルペスウイルスベクターおよびパピローマウイルスベクターが
挙げられるが、これらに限定されない。米国特許第５，６７２，３４４号は、組
換え神経栄養性ＨＳＶ−１ベクターを含む、インビボのウイルスにより媒介され
る遺伝子移入系を記載する。米国特許第５，３９９，３４６号は、治療タンパク
質をコードするＤＮＡセグメントを挿入するようインビトロで処理されたヒト細
胞の送達によって、患者に治療タンパク質を提供するためのプロセスの例を、提
供する。遺伝子治療技術の実施のためのさらなる方法および材料は、米国特許第
５，６３１，２３６号に記載され；アデノウイルスベクターを含む遺伝子治療は
、米国特許第５，６７２，５１０号に記載され；そしてレトロウイルスベクター
の使用を含む遺伝子治療は、米国特許第５，６３５，３９９号に記載されている
。

【０３４６】 非ウイルス送達方法としては、リポソーム媒介移入、裸のＤＮＡ送達（直接注
射）、レセプター媒介移入（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーショ
ン、リン酸カルシウム沈降および微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃）
が挙げられる。遺伝子治療の材料および方法としてはまた、誘導的プロモーター
、組織特異的エンハンサー−プロモーター、部位特異的取り込みのために設計さ
れたＤＮＡ配列、親細胞よりも優れた選択的利点を提供し得るＤＮＡ配列、形質
転換された細胞を同定するための標識、ネガティブ選択系および発現制御系（安
全性の尺度）、細胞特異的結合因子（細胞標的化のため）、細胞特異的インター
ナリゼーション因子、ベクターによる発現を増強するための転写因子、ならびに
ベクター作製の方法が挙げられ得る。遺伝子治療技術の実施のための、このよう
なさらなる方法および材料は、米国特許第４，９７０，１５４号、国際出願番号
ＷＯ ９６４０９５８；米国特許第５，６７９，５５９号；Ｕ．Ｓ．５，６７６
，９５４号；米国特許第５，５９３，８７５号；および米国特許第４，９４５，
０５０号に記載されている。発現制御技術としては、化学的に誘導される調節（
例えば、国際出願番号ＷＯ ９６４１８６５およびＷＯ ９７３１８９９）、改
変されたステロイドホルモンレセプター系におけるプロゲステロンアンタゴニス
トの使用（例えば、米国特許第５，３６４，７９１号）、エクジソン制御系（例
えば、国際出願番号ＷＯ ９６３７６０９）ならびにポジティブテトラサイクリ
ン制御可能トランスアクチベーター（例えば、米国特許第５，５８９，３６２号
；同第５，６５０，２９８号；および同第５，６５４，１６８号）が挙げられる
。

【０３４７】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドのインビボおよびインビトロ遺伝子治療送達がまた
、想定される。遺伝子治療技術の１つの例は、構成的プロモーターまたは誘導的
プロモーターに作動可能に連結され得るＣｈＭＩｒｐ遺伝子（ＣｈＭＩｒｐポリ
ペプチドをコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および／または合成ＤＮＡ、あ
るいはそのフラグメント、改変体、または誘導体のいずれか）を使用して、「遺
伝子治療ＤＮＡ構築物」を形成することである。このプロモーターは、内因性Ｃ
ｈＭＩｒｐ遺伝子に対して同種であっても異種であってもよいが、但し、この構
築物が挿入される細胞または組織型において、このプロモーターは活性である。
遺伝子治療ＤＮＡ構築物の他の成分は、必要に応じて、部位特異的取り込みのた
めに設計されたＤＮＡ分子（例えば、相同組換えのために有用な内因性隣接配列
）、組織特異的なプロモーター、エンハンサー、またはサイレンサー、親細胞よ
りも優れた選択的利点を提供し得るＤＮＡ分子、形質転換された細胞を同定する
ための標的として有用なＤＮＡ分子、ネガティブ選択系、細胞特異的結合因子（
例えば、細胞標的化のため）、細胞特異的インターナリゼーション因子、および
ベクターによる発現を増強するための転写因子、ならびにベクターの製造を可能
にする因子を含み得る。

【０３４８】 次いで、遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベク
ターを使用して細胞に導入され得る（エキソビボまたはインビボのいずれか）。
遺伝子治療ＤＮＡ構築物を導入するための１つの方法は、ウイルスベクターによ
る。適切なウイルスベクターは、本明細書において記載されるウイルスベクター
の手段によって、代表的に遺伝子治療ＤＮＡ構築物の送達のための遺伝子治療に
おいて用いられる。特定のレトロウイルスベクターは、ＤＮＡ構築物を細胞の染
色体ＤＮＡに送達し、そしてこのＤＮＡ構築物は、染色体ＤＮＡに組み込まれ得
る。他のベクターは、エピソームとして機能し、そして遺伝子治療ＤＮＡ構築物
は、細胞質中に残る。

【０３４９】 さらに他の実施形態において、制御エレメントを、標的細胞におけるＣｈＭＩ
ｒｐ遺伝子の制御された発現のために含み得る。このようなエレメントは、適切
なエフェクターに応答してオンになる（ｔｕｒｎ ｏｎ）。このようにして、治
療的ポリペプチドは、所望の場合に発現され得る。１つの従来の制御手段は、低
分子結合ドメインおよび生物学的プロセスを開始し得るドメインを含むキメラタ
ンパク質（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質または転写活性化タンパク質）を二量
化するために用いられる、低分子二量化剤またはラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）の
使用を包含する（ＰＣＴ公開ＷＯ９６４１８６５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０９９４
８６）；ＷＯ９７３１８９８（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０３１３７）および、ＷＯ９
７３１８９９（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０３１５７）を参照のこと）。タンパク質の
二量化は、導入遺伝子の転写を開始するために使用され得る。

【０３５０】 代替の調節技術は、目的の遺伝子から発現されたタンパク質を、凝集体または
クラスターとして細胞の内側に貯蔵する方法を使用する。目的の遺伝子は、条件
的凝集ドメインを含む融合タンパク質として発現されて、小胞体における凝集タ
ンパク質の保持を生じる。貯蔵されたタンパク質は安定であり、そして細胞の内
側で不活性である。しかし、このタンパク質は、条件的凝集ドメインを除去する
薬物（例えば、低分子リガンド）を投与することによって放出され得、それによ
り、凝集体またはクラスターを特異的に破壊し、その結果、このタンパク質は細
胞から分泌され得る。Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：８１６−１７および８２６−３
０を参照のこと。

【０３５１】 他の適切な制御手段または遺伝子スイッチとしては、以下の系が挙げられるが
、これに限定されない。ミフェプリストン（ＲＵ４８６）は、プロゲステロンア
ンタゴニストとして使用される。改変されたプロゲステロンレセプターリガンド
結合ドメインのプロゲステロンアンタゴニストへの結合は、２つの転写因子のダ
イマーを形成することによって、転写を活性化し、次いで、これは核に至り、Ｄ
ＮＡに結合する。このリガンド結合ドメインは、レセプターの能力が、天然のリ
ガンドに結合する排除するように改変される。改変されたステロイドホルモンレ
セプター系はさらに、米国特許第５，３６４，７９１号、ならびにＷＯ９６４０
９１１およびＷＯ９７１０３３７に記載される。

【０３５２】 さらに別の制御系は、エクジソンレセプター（細胞質レセプター）に結合し、
そしてこれを活性化するエクジソン（ショウジョウバエステロイドホルモン）を
使用する。次いで、このレセプターは核にトランスロケーションし、特定のＤＮ
Ａ応答エレメント（エクジソン応答性遺伝子由来のプロモーター）に結合する。
エクジソンレセプターは、トランス活性化ドメイン／ＤＮＡ結合ドメイン／リガ
ンド結合ドメインを含み、転写を開始する。エクジソン系はさらに、米国特許第
５，５１４，５７８号、およびＷＯ９７３８１１７、ＷＯ９６３７６０９；およ
びＷＯ９３０３１６２に記載される。

【０３５３】 別の制御手段は、陽性テトラサイクリン制御可能トランス活性化因子を使用す
る。この系は、転写を活性化するポリペプチドに連結された変異ｔｅｔレプレッ
サタンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（逆テトラサイクリン制御トランス活性化因子
タンパク質を生じさせる（すなわち、これは、テトラサイクリンの存在下でｔｅ
ｔオペレーターに結合する）変異ｔｅｔＲ−４アミノ酸の変化）を含む。このよ
うな系は、米国特許第５，４６４，７５８号；同第５，６５０，２９８号、およ
び同第５，６５４，１６８号に記載される。

【０３５４】 さらなる発現制御系および核酸構築物は、米国特許第５，７４１，６７９号お
よび同第５，８３４，１８６号（Ｉｎｎｏｖｉｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
Ｉｎｃ．）に記載される。

【０３５５】 インビボ遺伝子治療は、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドをコードする遺伝子を、Ｃ
ｈＭＩｒｐ核酸分子の局所的注射によって、または他の適切なウイルスもしくは
非ウイルス性の送達ベクターによって、細胞に導入することにより達成され得る
。（Ｈｅｆｔｉ，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２５：１４１８−３５，１９９４
）。例えば、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドをコードする核酸分子は、標的細胞への
送達のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに含まれ得る（例えば、Ｊ
ｏｈｎｓｏｎ，国際公開番号ＷＯ９５／３４６７０；国際出願公開ＰＣＴ／ＵＳ
９５／０７１７８）。組換えＡＡＶゲノムは、典型的に、機能的プロモーターお
よびポリアデニル化配列に作動可能に連結した、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列に隣接するＡＡＶ逆末端反復を含む。

【０３５６】 代替の適切なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、
単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、肝炎ウイルス、パルボウイルス、パポ
バウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、コロナウイルス、ラブドウ
イルス、パラミクソウイルス、およびパピローマウイルスのベクターが挙げられ
るが、これらに限定されない。米国特許第５，６７２，３４４号は、組換え神経
栄養性ＨＳＶ−１ベクターを含むインビボウイルス媒介遺伝子移入系を記載する
。米国特許第５，３９９，３４６号は、治療タンパク質をコードするＤＮＡセグ
メントを挿入するためにインビトロで処理されたヒト細胞の送達によって、治療
タンパク質を患者に提供するためのプロセスの例を提供する。遺伝子治療技術の
実施のためのさらなる方法および材料は、米国特許第５，６３１，２３６号（ア
デノウイルスベクターに関する）、同第５，６７２，５１０号（レトロウイルス
ベクターに関する）、同第５，６３５，３９９号（サイトカインを発現するレト
ロウイルスベクターに関する）に記載される。

【０３５７】 非ウイルス送達法としては、リポソーム媒介移入、裸のＤＮＡの直接注射、レ
セプター媒介移入（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン
酸カルシウム沈降、および微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃）が挙げ
られるが、これらに限定されない。遺伝子治療の材料および方法はまた、誘導的
プロモーター、組織特異的エンハンサー−プロモーター、部位特異的組込みのた
めに設計されたＤＮＡ配列、親細胞を超える選択的利点を提供し得るＤＮＡ配列
、形質転換された細胞を同定するための標識、ネガティブな選択系および発現制
御系（安全性の指標）、細胞特異的結合因子（細胞標的化のため）、細胞特異的
インターナリゼーション因子、およびベクターによる発現を増大する転写因子な
らびにベクターの製造方法を含み得る。遺伝子治療技術の実施のためのこのよう
なさらなる方法および材料は、米国特許第４，９７０，１５４号（エレクトロポ
レーション技術に関する）；ＷＯ９６／４０９５８（核リガンドに関する）；同
第５，６７９，５５９号（遺伝子送達のためのリポタンパク質含有系を記載する
）；同第５，６７６，９５４号（リポソームキャリアに関する）；同第５，５９
３，８７５号（リン酸カルシウムトランスフェクションのための方法を記載する
）、および同第４，９４５，０５０号（生物学的に活性な粒子が一定の速度で細
胞に噴霧され、それによりこの粒子がこの細胞の表面に浸透し、そしてこの細胞
の内側に組み込まれるプロセスを記載する）に記載される。

【０３５８】 ＣｈＭＩｒｐ遺伝子治療または細胞治療はさらに、同一または異なる細胞（単
数または複数）における１つ以上のさらなるポリペプチドの送達を含み得ること
もまた企図される。このような細胞は、患者に別々に導入され得るか、またはこ
の細胞は、単一の移植可能デバイス（例えば、上記のカプセル化膜）に含められ
得るか、あるいはこの細胞は、ウイルスベクターによって別々に改変され得る。

【０３５９】 遺伝子治療による細胞における内因性ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの発現を増加
する別の手段は、ＣｈＭＩｒｐ遺伝子のプロモーターに１つ以上のエンハンサー
エレメントを挿入することであり、ここでエンハンサーエレメントは、ＣｈＭＩ
ｒｐポリペプチド遺伝子の転写活性を増加させるように作用し得る。使用される
エンハンサーエレメントは、遺伝子を活性化することを所望する組織に基づいて
選択される−その組織においてプロモーター活性化を与えることが知られている
エンハンサーエレメントが選択される。例えば、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドをコ
ードする遺伝子がＴ細胞において「オンに変わる（ｔｕｒｎ ｏｎ）」場合、ｌ
ｃｋプロモーターエンハンサーエレメントが使用され得る。ここで、付加される
転写エレメントの機能的部分は、標準的なクローニング技術を使用して、ＣｈＭ
Ｉｒｐポリペプチドプロモーターを含むＤＮＡのフラグメントに挿入され得る（
そして必要に応じて、ベクターおよび／または５’および／または３’隣接配列
などに挿入される）。「相同組換え構築物」として公知のこの構築物は、次いで
、エキソビボまたはインビボのいずれかで、所望の細胞に導入され得る。

【０３６０】 遺伝子治療を用いてまた、内因性プロモーターのヌクレオチド配列を改変する
ことによって、ＣｈＭＩｒｐポリペプチド発現を減少させ得る。このような改変
は、典型的に、相同組換え方法によって達成される。例えば、不活性化のために
選択されたＣｈＭＩｒｐ遺伝子のプロモーターの全てまたは一部を含むＤＮＡ分
子は、転写を調節するプロモーターの断片を除去および／または置換するように
操作され得る。例えば、プロモーターの転写活性化因子のＴＡＴＡボックスおよ
び／または結合部位は、標準的な分子生物学的技術を使用して欠失され得；この
ような欠失は、プロモーター活性を阻害し得、それによって、対応するＣｈＭＩ
ｒｐ遺伝子の転写を阻止し得る。プロモーターにおけるＴＡＴＡボックスまたは
転写活性化因子結合部位の欠失は、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドプロモーター（調
節されるＣｈＭＩｒｐ遺伝子と同じかまたは関連の種由来）のすべてまたは関連
の部分を含むＤＮＡ構築物を生成することによって達成され得、ここで、１つ以
上のＴＡＴＡボックスおよび／または転写活性化因子結合部位のヌクレオチドは
、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、および／または挿入によって変異され
る。結果として、ＴＡＴＡボックスおよび／または活性化因子結合部位は、活性
を減少するか、または完全に不活化される。この構築物はまた、典型的に、改変
されたプロモーターセグメントに隣接したネイティブの（内因性）５’および３
’ＤＮＡ配列に対応する少なくとも約５００塩基のＤＮＡを含む。この構築物は
、直接または本明細書中に記載されるようなウイルスベクターを介してのいずれ
かで、適切な細胞に（エキソビボまたはインビボのいずれかで）導入され得る。
典型的に、細胞のゲノムＤＮＡへのこの構築物の組込みは、相同組換えによって
であり、ここで、このプロモーター構築物の５’および３’ＤＮＡ配列は、内因
性染色体ＤＮＡへのハイブリダイゼーションによって、改変プロモーター領域を
組み込むのを補助するように作用し得る。

【０３６１】 （ＣｈＭＩｒｐ核酸およびポリペプチドのさらなる用途） 本発明の核酸分子（それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしない
核酸分子を含む）を使用して、ＣｈＭＩｒｐ遺伝子および関連遺伝子の染色体上
の位置をマッピングし得る。マッピングは、当該分野で公知の技術（例えば、Ｐ
ＣＲ増幅およびインサイチュハイブリダイゼーション）により行われ得る。

【０３６２】 ＣｈＭＩｒｐ核酸分子（それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードし
ない核酸分子を含む）は、哺乳動物組織または体液サンプル中のＣｈＭＩｒｐＤ
ＮＡまたは対応するＲＮＡの存在について、定性的または定量的のいずれかで試
験するための、診断アッセイにおけるハイブリダイゼーションプローブとして有
用であり得る。ＣｈＭＩｒｐは、診断／予測マーカーとして働き得るか、または
広範な種々のヒト癌をアッセイし得る。癌処置の間のＣｈＭＩｒｐの発現におけ
るモニタリングの変化は、腫瘍増殖および処置の成功をモニターするための代理
マーカーとして用いられ得る。

【０３６３】 ＣＨＭＩｒｐポリペプチドは、処置される状態に適切である場合、１つ以上の
サイトカイン、増殖因子、抗生物質、抗炎症剤および／または化学療法剤と組み
合わせて（同時にかまたは引き続き）使用され得る。ＣｈＭＩｒｐは、低分子イ
ンヒビターとして有用であり得る。さらに、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドから設計
されたペプチドインヒビターは、ＣｈＭＩｒｐポリペプチド活性を調節する治療
物質または同定物質として用いられ得る。

【０３６４】 他の方法はまた、１つ以上のＣｈＭＩｒｐポリペプチドの活性を阻害すること
が所望される場合に使用され得る。このような阻害は、発現制御配列（三重らせ
ん形成）またはＣｈＭＩｒｐ ｍＲＮＡに相補的でありかつ発現制御配列（三重
らせん形成）またはＣｈＭＩｒｐ ｍＲＮＡにハイブリダイズする核酸分子によ
りもたらされ得る。例えば、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ分子（これらは、
選択されたＣｈＭＩｒｐ遺伝子の少なくとも一部に相補的である配列を有する）
は、細胞中に導入され得る。アンチセンスプローブは、本明細書中に開示される
ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの配列を使用して、利用可能な技術により設計され得
る。代表的には、このようなアンチセンス分子の各々は、選択された各ＣｈＭＩ
ｒｐ遺伝子の開始部位（５’末端）に相補的である。このアンチセンス分子が次
いで、対応するＣｈＭＩｒｐ ｍＲＮＡにハイブリダイズする場合、このｍＲＮ
Ａの翻訳は、防止されるかまたは低減される。アンチセンスインヒビターは、細
胞または生物におけるＣｈＭＩｒｐポリペプチドの減少または不在に関連する情
報を提供する。

【０３６５】 あるいは、遺伝子治療を使用して、１つ以上のＣｈＭＩｒｐポリペプチドのド
ミナントネガティブインヒビターを作製し得る。この状況において、各選択され
たＣｈＭＩｒｐポリペプチドの変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡが、調製
され得、そして本明細書中に記載されるウイルス性または非ウイルス性のいずれ
かの方法を使用して患者の細胞中に導入され得る。このような変異体の各々は、
代表的にはその生物学的役割において内因性ポリペプチドと競合するように設計
される。詳細には、ＣｈＭＩｒｐは、広範な種々の腫瘍における処置のためのド
ミナントネガティブな遺伝子治療を設計するのに有用であり得るキナーゼドメイ
ンを含む。

【０３６６】 さらに、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドは（生物学的に活性でも活性でなくても）
免疫原として使用され得、すなわち、これらのポリペプチドは、それに対して抗
体が惹起され得る少なくとも１つのエピトープを含有する。ＣｈＭＩｒｐポリペ
プチド（本明細書中に記載されるような）に結合する選択的結合因子は、インビ
ボおよびインビトロでの診断目的のために使用され得、これらの目的としては、
体液サンプルまたは細胞サンプル中のＣｈＭＩｒｐポリペプチドの存在を検出す
るための標識された形態での使用を含むが、これに限定されない。これらの抗体
をまた使用して、本明細書中に列挙される疾患および障害を含む多数の疾患およ
び障害を、予防、処置、または診断し得る。これらの抗体は、ＣｈＭＩｒｐポリ
ペプチドの少なくとも１つの活性特徴を低減するかまたは遮断するように、Ｃｈ
ＭＩｒｐポリペプチドに結合し得るか、またはポリペプチドに結合してＣｈＭＩ
ｒｐポリペプチドに特有の少なくとも１つの活性（ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの
薬物動態を増加させることによるものを含む）を増加し得る。

【０３６７】 本発明の被験物質は、以下の実施例によってさらに記載される。以下の実施例
は、例示目的のみを意図しており、どのような方法でも本発明を限定すると解釈
されるべきではない。

【０３６８】 （実施例１） （コンドロモジュリン（Ｃｈｏｎｄｒｏｍｏｄｕｌｉｎ）−Ｉ関連遺伝子をコ
ードするマウスｃＤＮＡの単離） 製造業者の指示に従って、市販のＲＮＡ抽出キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ，Ｐｓｉｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて、オステオプロゲリン（
Ｏｓｔｅｏｐｒｏｇｅｒｉｎ）トランスジェニックマウス（Ｓｉｍｏｎｅｔら、
Ｃｅｌｌ、８９：３０９〜３１９，１９９７）の大理石骨病の骨から抽出した総
ＲＮＡから、マウスｃＤＮＡライブラリーを作製した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｏ
ｌｉｇｏ（ｄＴ）２５カラム（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を用いて
、ポリＡ＋ＲＮＡを選択した。製造業者のプロトコールに従って、ｃＤＮＡ合成
およびプラスミドクローニング用のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ
Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いて、こ
のｃＤＮＡを、合成した。得られたｃＤＮＡをＳａｌＩ制限酵素およびＮｏｔＩ
制限酵素（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉ
ｓ，ＩＮ）を用いて消化し、ベクターへの連結を補助するための粘着末端を作製
した。設計したｃＤＮＡを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉ
ｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、ＳＡＬＩ／ＮＯＴＩ事前設計ｐＳＰＯＲＴベクター（
Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中に連結した。連結した産物を、エレクトロポレーション
によって、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＢ１０Ｂエレクトロコンピテント菌（Ｇｉｂｃｏ−
ＢＲＬ）に形質転換した。形質転換した細菌を、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含有するＬＢアガロースプレート上にプレートした。配列決定用にクローン
を無作為に選択した。

【０３６９】 上記のマウスｃＤＮＡライブラリーから生成したクローンの配列決定により、
ＥＳＴ配列であるｓｍｂｏ２−０００２９−ｈ３に対応するＤＮＡを同定した。
これは、コンドロモジュリン（ｃｈｏｎｄｒｏｍｏｄｕｌｉｎ）−１関連ペプチ
ド（ＣｈＭＩｒｐ）と現在呼ばれている。ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースの
ＢＬＡＳＴ分析により、配列番号３に示されるマウスＣｈＭＩｒｐ ｃＤＮＡが
、ウシコンドロモジュリン−Ｉポリペプチド（配列番号７）のアミノ末端部分に
、１１６アミノ酸にわたって３２％同一性を示すタンパク質をコードしているこ
とが確認された。コンドロモジュリン−Ｉに対する相同性によって、ＣｈＭＩｒ
ｐインサート全体の両方の鎖の決定が可能になった。図１に示すように、マウス
ＣｈＭＩｒｐのポリヌクレオチド配列（配列番号３）は、９５１ヌクレオチド
のオープンリーディングフレームを有する。マウスＣｈＩｒｐポリヌクレオチド
配列は、ブダペスト条約に従って、２０００年８月８日に、アメリカンタイプカ
ルチャーコレクション（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒ
ｄ Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に寄託され、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２３２９
を与えられた。

【０３７０】 （実施例２） （マウスＣｈＭＩｒｐのヒトオルソログの同定） 全長マウスＣｈＭＩｒｐヌクレオチド配列（配列番号３）を用いたＧｅｎｅｂ
ａｎｋ ＥＳＴデータベースのＢＬＡＳＴ分析により、ＣｈＭＩｒｐのヒトオル
ソログをコードしている、７つのヒトＥＳＴ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号 ａａ
２９７２３１、ｔ１２１２８０、ｔ１２１７９、ａｉ１２３８３９、ａｉ１４６
２８０、１１４５３６９５、およびａｉ１４７０４４）が示された。以下表１に
示される、プライマーを用いて３’ＲＡＣＥおよび５’ＲＡＣＥによって、全長
ヒトｃＤＮＡを生成した。このプライマー配列は、７つのヒトＥＳＴの比較に由
来するコンセンサス配列に基づく。

【０３７１】

【表３】 ヒト骨格筋マラソン準備（Ｈｕｍａｎ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｍ
ａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ）ｃＤＮＡおよびヒト心臓マラソン準備（Ｈｕｍａ
ｎ Ｈｅａｒｔ Ｍａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ）ｃＤＮＡを、５’ＲＡＣＥの
ためのテンプレートＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）と
して用いた。なぜなら、ノーザンブロット分析（以下、実施例３を参照）により
、ヒト骨格筋およびヒト心臓においてＣｈＭＩｒｐが検出されたからである。５
’ＰＣＲプライマーとしてＡＰ−１プライマー（配列番号１５）、そして３’Ｐ
ＣＲプライマーとしてプライマー２２４４〜１９（配列番号１３）を用いて、ヒ
ト骨格筋マラソン準備ｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ
Ｍａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ）由来の５’ＲＡＣＥを生成した。
５’ＰＣＲプライマーとしてＡＰ１（配列番号１５）、そして３’ＰＣＲプライ
マーとしてプライマー２２４４〜２３（配列番号１１）を用いて、ヒト骨格筋マ
ラソン準備ｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｍａｒａ
ｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ）由来の５’ＲＡＣＥを生成した。製造業者（
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコールに従って、第一回のＲＡＣＥ反応を実施した
。第一５’ＲＡＣＥ産物の１：５０希釈の１ミリリットルを、ネスト化５’ＲＡ
ＣＥのためのテンプレートとして用いた。骨格筋用のネスト化５’ＲＡＣＥ反応
プライマーは、５’プライマーの場合ＡＰ−２（配列番号１６）、そして３’プ
ライマーの場合プライマー２２４４〜２０（配列番号１４）であった。ヒト心臓
ネスト化５’ＲＡＣＥにおいて、ＡＰ−２（配列番号１６）を、５’ＰＣＲネス
ト化プライマーとして用い、そして２２４４−２２を、３’ネスト化プライマー
として用いた。製造業者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコールに従って、ネスト
化ＰＣＲ反応を実施した。

【０３７２】 ヒト骨格筋マラソン準備ｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃ
ｌｅ Ｍａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ）を３’ＲＡＣＥのためのテン
プレートＤＮＡとして用いた。５’プライマーとしてプライマー２３１１−２０
（配列番号１４）を用い、そして３’ＰＣＲプライマーとして、ＡＰ−１（配列
番号１５）を用いて、３’ＲＡＣＥ産物を生成した。最初の３’ＲＡＣＥ反応を
製造業者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコールに従って実行した。最初の３’Ｒ
ＡＣＥ産物の１：５０希釈の１マイクロリットルを、ネスト化３’ＲＡＣＥ反応
のテンプレートＤＮＡとして用いた。プライマー２３１１−２１（配列番号１８
）を５’ＰＣＲネスト化プライマーとして用い、そしてＡＰ−２（配列番号１６
）を３’ＰＣＲネスト化プライマーとして用いた。ネスト化ＰＣＲ反応を製造業
者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコールに従って実施した。

【０３７３】 ５’ＲＡＣＥおよび３’ＲＡＣＥ反応の産物を１％アガロースゲル上の電気泳
動によって分離した。適切にサイズ化したバンドをこのアガロースゲルから切り
出して、製造業者の指示に従って、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇ
ｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって精製した。抽出したＤＮＡをＴａｑポ
リメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含有する１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２，５０ｍＭ ＫＣｌ
、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ’ｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）とと
もに、３７℃で５分間インキュベートした。次いで、ＤＮＡをＰＣＲ２．１ベク
ター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に連結して、製造業
者の指示に従って細菌中に形質転換した。インサート（挿入物）のサイズを、Ｅ
ｃｏＲＩ制限酵素（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）消化によって、
続いて１％アガロースゲルでの電気泳動によって決定した。配列決定を行い、ｐ
ＣＲ２．１ベクターによって発現された５’ＲＡＣＥおよび３’ＲＡＣＥ産物の
同定を確実にした。

【０３７４】 図２に示されるように、ヒトＣｈＭＩｒｐ ｃＤＮＡ（配列番号１）は、５’
非翻訳領域における８６ｂｐおよび３’非翻訳領域における１８２ｂｐに加えて
、９５３ヌクレオチド（配列番号２）のオープンリーディングフレームを構成す
る。ヒト（ｈｕＣｈＩｒｐ）およびマウス（ｍｕＣｈＩｒｐ）アミノ酸配列（そ
れぞれ、配列番号２および４）の配列（図３）は、９７％の同一性を示す。ヒト
ＣｈＭＩｒｐポリペプチド配列は、ブダペスト条約に基づいて、アメリカンタイ
プカルチャーコレクション（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖ
ａｒｄ Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に、２０００年８月８日に寄託され、そして
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−２３２８を与えられた。

【０３７５】 図４に示されるように、ｈｕＣｈＭＩｒｐおよびｍｕＣｈＭＩｒｐは、マウス
（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号：Ｕ４３５０９）、ラット（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録
番号：ＡＦ０５１４２５）、ウシ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号：ＣＨＭ１ ＢＯＶＩＮ）、ヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＡＢ００６０００）、およびウ
サギ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号：ＡＦ０７２１２９）（それぞれ、配列番号５
〜９）を含むいくつかの種由来のコンドロムジュリン−Ｉ（ｃｈｏｎｄｒｏｍｏ
ｄｕｌｉｎ−Ｉ）の配列と比較した。ＢＬＡＳＴ分析は、ｍｕＣｈＭＩｒｐオー
プンリーディングフレームがラットコンドロムジュリン−Ｉの２８９アミノ酸に
わたって３９％の同一性を示すことを決定した。さらに、ヒト、マウス、ウシお
よびウサギのコンドロムジュリン−Ｉとの一致は、約３５％の同一性を示した。
ＢＬＡＳＴ分析は、ｍｕＣｈＭＩｒｐのオープンリーディングフレームが、ラッ
トコンドロムジュリン−Ｉポリペプチドについて、２６２アミノ酸にわたって４
１％の同一性を示し、マウスコンドロムジュリン−Ｉポリペプチドについて、２
６２アミノ酸にわたって４０％の同一性を示し、ウシコンドロムジュリン−Ｉポ
リペプチドについて、３１４アミノ酸にわたって３６％の同一性を示し、ウサギ
コンドロムジュリン−Ｉポリペプチドについて、２６２アミノ酸にわたって３７
％の同一性を示し、そしてヒトコンドロムジュリン−Ｉポリペプチドについて、
２６０アミノ酸にわたって３７％の同一性を示すことを決定した。さらに、マウ
スＣｈＭＩｒｐは、ニワトリコンドロムジュリン−Ｉポリペプチドについて、２
８９アミノ酸にわたって３９％の同一性を示す（示さず）。ヒトＣｈＭＩｒｐと
マウスＣｈＭＩｒｐとの間の保存性は非常に高いため、ｈｕＣｈＭＩｒｐと他の
種のコンドロムジュリン−Ｉとの間のＢＬＡＳＴ分析データは、上記のｍｕＣｈ
ＭＩｒｐ同一性と比較可能であった。

【０３７６】 （実施例３） （ＣｈＭＩｒｐの組織特異的発現） ＣｈＭＩｒｐ遺伝子の組織特異的発現パターンを、ノーザンブロッドによって
研究した。ＰＣＲ産生^３２Ｐ標識プローブを使用して、ヒトおよびマウスの両方
由来の様々な組織におけるＣｈＭＩｒｐ転写物の存在を検出した。ｐＳＰＯＲＴ
ベクター（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）に挿入したマウスＣｈＭＩｒｐ ｃＤＮＡ（配
列番号３）を、テンプレートとして使用して、コード領域全体をＰＣＲ増幅して
、ノーザンブロット分析のためのプローブとして使用した。５’プライマーを、
Ｐｒｉｍｅｒ２２４５−７８として定義し、そしてこれは配列ＡＴＧＧＣＡＡＡ
ＧＡＡＴＣＣＴＣＣＡＧＡＧＡＡＣ（配列番号１９）からなり、そして３’プラ
イマーは、Ｐｒｉｍｅｒ２２４５−７９と命名し、そしてこれは、配列ＣＴＡＴ
ＴＡＧＡＣＴＣＴＣＣＣＡＡＧＣＡＴＧＣＧ（配列番号２０）からなった。１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｍＭ
ＫＣｌ、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ、０．０１ｍＭのｄＣ
ＴＰ、０．１７ｍＭ（α−^３２Ｐ）ｄＣＴＰ、０．４ｍＭの各プライマーおよび
１０ｎｇのｍｕＣｈＭＩｒｐテンプレートＤＮＡを含む１００ｍｌ容量中で、Ｐ
ＣＲ反応を行った。ＰＣＲパラメーターは、９４℃で３０秒間、４０回循環する
２分間、９４℃の変性工程、３０秒間７０℃のアニーリング、および７２℃で１
分間の伸長を含んだ。このプローブは、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｇ５０カラム（５
’−３’Ｉｎｃ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）で精製した。

【０３７７】 ヒト、胎児マウスおよび成体マウス組織を含む市販の多組織ノーザンブロット
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ならびに市販のＺｏｏ Ｂ
ｌｏｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ｍｕＣｈＭＩｒｐを用いて調査した。さらに、
標準的な技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）によって、ＲＮＡを、Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅ
ｒｉｎ（ＯＰＧ）トランスジェニックマウス、ＯＰＧノックアウトマウス（Ｂｕ
ｃａｙら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１２：１２６０−１２６８）および正常なＣ
Ｄ−１マウスから単離した。組織を２０ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ−
ＢＲＬ）で溶解し、３０秒間ホモジナイズし、そして４０ｍｌのクロロホルムで
抽出した。チューブを４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、そして水相を新し
いチューブに移した。１０ｍｌのイソプロパノールを添加し、混合し、そして４
２００ｒｐｍで３０分間遠心分離することによって、ＲＮＡを沈殿させた。この
ＲＮＡペレットを、１０ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、穏やかに乾燥し、そ
して０．５ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。ＲＮＡを、ホルムアルデヒド／アガ
ロースゲル電気泳動システムを使用して画分化した。電気泳動の後、このゲルを
処理し、そして ＲＮＡをナイロンメンブレンに移した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
前出を参照のこと）。

【０３７８】 ノーザンブロットを、Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆ
ｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）中、６５
℃で３０秒間プレハイブリダイゼーションした。このブロットを、次いで、^３２ Ｐ−標識したｍｕＣｈＭＩｒｐプローブを添加した同じ溶液中で、６５℃で２時
間ハイブリダイズした。フィルターを、最初に２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳで
、室温で５分間洗浄し、次いで、０．１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳで２回、５
５℃で１５分間洗浄した。これらのブロットを、Ｘ線フィルムに−８０℃で４日
間暴露した。

【０３７９】 ストリンジェントな条件下におけるマウス胎児組織のノーザンブロット分析は
、１５日および１７日の全胎児において、１．２ｋｂの転写物を検出した。低レ
ベルの発現は、１１日目の胎児において検出されたが、１５日および１７日の胎
児では高レベルに発現されなかった。マウス多組織ブロットは、骨格筋において
、類似のサイズの転写物を検出した。

【０３８０】 ｍｕＣｈＭＩｒｐプローブはまた、複数の組織由来のヒトｍＲＮＡにおいて、
１．２ｋｂの転写物を検出した。発現は、ヒト卵巣において検出され、より低い
程度で、骨格筋、前立腺、および心臓において検出された。

【０３８１】 コントロールＣＤ−１マウス由来の大腿骨および脛骨、ならびにＯＰＧトラン
スジェニックマウスの大理石骨病の大腿骨および脛骨由来のＲＮＡは、弱いレベ
ルのｍｕＣｈＭＩｒｐを発現したが、ＯＰＧノックアウトマウス由来の大理石骨
病の大腿骨および脛骨において、発現は検出されなかった。

【０３８２】 Ｚｏｏ Ｂｌｏｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ緩衝液（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、６５℃で３０秒間、プレハイ
ブリダイズした。次いで、ブロットを、^３２Ｐ−標識ｍｕＣｈＭＩｒｐプローブ
を添加した同じ溶液中、６５℃で２時間ハイブリダイズした。このフィルターを
、初めに２×ＳＳＣで１５分間室温で２回洗浄し、次いで、０．１×ＳＳＣ／０
．１％ ＳＤＳで、１５分間５５℃で２回洗浄した。ブロットを、Ｘ線フィルム
に−８０℃で３日間暴露した。

【０３８３】 このｍｕＣｈＭＩｒｐプローブは、Ｚｏｏ Ｂｌｏｔにおいて、マウス、ラッ
ト、ウサギおよびウシＤＮＡから、２つのバンドを検出した。サザンブロット分
析は、高ストリンジェンシーの洗浄を用いて実施され、これはｍｕＣｈＭＩｒｐ
とラット、ウサギおよびウシ由来のＣｈＭＩｒｐとの間の相同性が高くなければ
ならないことを示した。

【０３８４】 インサイチュハイブリダイゼーションを、ＣｈＭＩｒｐ発現の組織部位を決定
するために行った。正常な胎児（Ｅ８．５〜Ｅ１８．５）および成体マウスおよ
びラット組織のパネルを、４％パラホルムアルデヒドに固定し、パラフィン中に
包埋し、そして５マイクロメートルに切り出した。インサイチュハイブリダイゼ
ーションの前に、組織に０．２Ｍ ＨＣｌを透過させ、続いて、１０ｍｇ／ｍｌ
プロテイナーゼＫで消化し、そしてトリエタノールアミンおよび無水酢酸でアセ
チル化した。切片を、全長ＣｈＭＩｒｐに相補的な^３３Ｐ標識アンチセンスＲＮ
Ａプローブおよびセンス（コントロール）プローブで、５５℃で一晩ハイブリダ
イズした。このアンチセンスおよびセンス^３３Ｐ−標識プローブを、ｍｕＣｈＭ
Ｉｒｐ ｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡのインビトロ転写によって得た。ハイ
ブリダイゼーションの後、切片を、５５℃で、４×ＳＳＣで２回洗浄し、２０ｍ
ｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａで処理して、ハイブリダイズしたプローブを除去し、
次いで、０．１×ＳＳＣ中、５５℃の高ストリンジェンシーの洗浄に供した。ス
ライドをＫｏｄａｋ ＮＴＢ２エマルジョンに浸漬し、４４℃で２〜３週間暴露
し、発色させ、そして濃縮した。切片を、暗視野照明法および標準的な照明法を
使用して試験して、組織形態学およびハイブリダイゼーションシグナルの同時評
価を行った。次いで、以下の組織を試験した：脳、耳下線、顎下腺および舌下腺
、食道、胃、十二指腸、空腸、近位結腸および遠位結腸、肝臓、膵臓、心臓、肺
、気管、血管、リンパ節、脾臓、胸腺、骨髄、腎臓、膀胱、甲状腺、副腎、精巣
、前立腺、卵巣、子宮、卵管、胎盤、骨、骨格筋、皮膚、および脂肪組織。

【０３８５】 ｍｕＣｈＭＩｒｐアンチセンスプローブは、センスコントロールプローブを用
いて見られるバックグラウンドの非常に低いレベルより上で検出可能な明確なシ
グナルを生成した。Ｅ８．５、１０．５または１１．５の切片において、シグナ
ルは検出されなかった。Ｅ１３．５〜成体切片の発現は、腱、おそらく筋膜にお
いて検出された。識別可能な腱の全てにおいて明確なシグナルが存在したが、筋
肉、骨または軟骨においてシグナルは検出されなかった。シグナルはまた、皮膚
の毛包に隣接する細胞、およびＭ細胞として公知の腸内のリンパ球斑上に存在す
る特殊な上皮細胞において検出された。発現のさらなる部位は、胸腺髄質、脳の
脳梁のすぐ上の大脳皮質、および卵巣中の発生中の卵胞を取りまく顆粒細胞にお
いて検出された。

【０３８６】 （実施例４） （ＣｈＭＩｒｐゲノムＤＮＡの特徴付け） ＢＬＡＳＴ分析は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＬ０３５６０８が、ヒトＣｈＭ
Ｉｒｐゲノム配列を含むことを同定した。この配列は、染色体Ｘｑ２１．３３−
２３由来のヒトゲノムＤＮＡを含むクローン４７９Ｊ７由来であった。このヒト
ＣｈＭＩｒｐゲノムＤＮＡ（配列番号１０）は、７個のエキソンおよび６このイ
ントロンを含み、そして図５に示される。

【０３８７】 （実施例５） （ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの産生） （Ａ．細菌中のＣｈＭＩｒｐポリペプチドの発現） ＰＣＲを使用して、配列の５’および３’末端に対応するプライマーを使用し
てＣｈＭＩｒｐポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を増幅した。
この増幅したＤＮＡ産物を、制限酵素部位を含むように改変し、標準的な組換え
ＤＮＡ方法を使用して発現ベクターに挿入し得る。ｌｕｘプロモーターおよびカ
ンママイシン耐性をコードする遺伝子を含む代表的なベクター（例えば、ｐＡＭ
Ｇ２１（ＡＴＣＣ ＮＯ：９８１１３）を、挿入されたＤＮＡの指向性クローニ
ングのために、ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩで消化した。連結混合物を、電気泳動
およびカンナマイシン耐性について選択された形質転換体により、Ｅ．ｃｏｌｉ
宿主株Ｔｏｐ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。選択したコロニー
由来のプラスミドＤＮＡを単離し、そして配列決定に供して、挿入物の存在を確
認した。

【０３８８】 ３０ｍｇ／ｍｌのカンナマイシンを含む２×ＹＴ培地中で、形質転換した宿主
細胞を、インキュベーションの前に、３０分間インキュベーションした。Ｎ−（
３−オキソヘキサノイル）−Ｄ１−ホモセリンラクトースを３０ｎｇ／ｍｌの最
終濃度まで添加し、続いて３０℃または３７℃のいずれかで６時間インキュベー
ションすることによって、遺伝子発現を誘導する。この培養液を遠心分離し、細
菌ペレットを再懸濁および溶解し、そしてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により宿主細胞タンパク質を分析することによって、Ｃ
ｈＭＩｒｐポリペプチドの発現を評価する。

【０３８９】 ＣｈＭＩｒｐを含む封入体を、以下のように精製した：細菌細胞を、遠心分離
によりペレット化し、そして水に再懸濁した。この細胞懸濁物を、超音波処理に
よって溶解し、そして１９５，０００×ｇで５〜１０分間遠心分離することによ
ってペレット化した。この上清を捨て、そしてこのペレットを洗浄し、そしてホ
モジナイザーに移した。このペレットを、５ｍｌのＰｅｒｃｏｌｌ溶液（７５％
液体Ｐｅｒｃｏｌｌ／０．１５Ｍ ＮａＣｌ）中で、均一に懸濁されるまでホモ
ジナイズし、次いで希釈し、そして２１，６００×ｇで３０分間遠心分離する。
封入体を含む勾配画分を回収し、そしてプールする。この単離した封入体を、次
いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。

【０３９０】 Ｅ．ｃｏｌｉが産生するＣｈＭＩｒｐポリペプチドに対応するＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅのシグナルバンドをゲルから切り取り、そしてＮ−末端アミノ酸配列を、本質
的に、Ｍａｔｓｕｄａｒｉｒａら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：１０−
３５，１９８７）に記載されるようにして決定する。

【０３９１】 （Ｂ．哺乳動物細胞におけるＣｈＭＩｒｐポリペプチドの発現） ＰＣＲを使用して、配列の５’および３’末端に対応するプライマーを使用し
て、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を増幅する
。この増幅されたＤＮＡ産物を、制限酵素部位を含むように改変して、発現ベク
ターに挿入する。ＰＣＲ産物をゲル精製し、そして標準的な組換えＤＮＡ方法を
使用して発現ベクターに挿入する。代表的なベクターのｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ）（これは、複製のＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス起点を含む）
を、ＣＯＳ細胞におけるＣｈＭＩｒｐの発現のために使用し得る。増幅しゲル精
製したＰＣＲ産物を、ｐＣＥＰ４に連結し、そしてＣＯＳ細胞にリポフェクショ
ンする。トランスフェクトした細胞を、１００ｍｇ／ｍｌハイグロマイシン中で
選択し、そして得られた薬物耐性培養物をコンフルーエンスまで増殖させる、次
いで、この細胞を、血清を含まない培地で７２時間培養し、馴化培地を除去し、
そしてＣｈＭＩｒｐポリペプチド発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。

【０３９２】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの発現は、例えば、銀染色によって検出され得る。
あるいは、ＣｈＭＩｒｐは、エピトープタグ（例えば、ＩｇＧ接触ドメインまた
はＦＬＡＧエピトープ）を有する融合タンパク質として産生され、これは、タグ
ペプチドに対する抗体を使用するウエスタンブロット分析によって検出され得る
。

【０３９３】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから取り出されるか、ま
たはＣｈＭＩｒｐ融合タンパク質がこのエピトープタグに対するアフィニティク
ロマトグラフィーによって精製され、そして上記のように、Ｎ−末端アミノ酸配
列分析に供され得る。

【０３９４】 （実施例６） （ＣｈＭＩｒｐ抗体の産生） ＣｈＭＩｒｐポリペプチドに対する抗体は、精製したタンパク質で免疫化する
ことによって、または生物学的合成もしくは化学的合成により生成されるＣｈＭ
Ｉｒｐペプチドで免疫化することによって得られ得る。実質的に純粋なＣｈＭＩ
ｒｐポリペプチドまたはポリペプチドは、実施例５に記載されるように、トラン
スフェクトした細胞から単離され得る。最終調製物中のタンパク質の濃度は、例
えば、Ａｍｉｃｏｎフィルターデバイスで濃縮することによって、数μｇ／ｍｌ
のレベルまで調整され得る。このタンパク質に対するモノクローナル抗体または
ポリクローナル抗体は、次いで、抗体を生成するために、当該分野で公知の手順
（例えば、ＨｕｄｓｏｎおよびＢａｙに記載される方法（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 第２版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓ）のいずれかによって調製され得る。

【０３９５】 （Ａ．抗ＣｈＭＩｒｐモノクローナル抗体産生） 上記のように同定および単離された任意のペプチドのエピトープに対するモノ
クローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ, ２
５６：４９５，１９７５）の古典的方法またはその派生的方法に従って、マウス
ハイブリドーマから調製され得る。手短には、マウスに、数週間にわたって数μ
ｇの選択したタンパク質を繰り返して播種する。次いで、このマウスを屠殺し、
そして脾臓の抗体産生細胞を単離する。これらの脾臓細胞を、マウス黒色腫細胞
（例えば、ＮＳ−１細胞）と共に、ポリエチレングリコールによって融合し、そ
して過剰の融合されなかった細胞を、ヒポキサンチン；アミノプテリン；および
チミジンを含有する選択培地（ＨＡＴ培地）上でのこの系の増殖によって破壊す
る。首尾よく融合された細胞を希釈し、そしてこの希釈物のアリコートを、マイ
クロタイタープレートのウェルに置き、ここで、培養物の増殖を継続する。選択
後、組織培養上清を、各融合体のウェルから採取し、そしてＥＩＡによるＣｈＭ
Ｉｒｐ抗体産生について試験する。選択陽性クローンを拡大し得、そしてそれら
のモノクローナル抗体産物を、使用のために回収し得る。モノクローナル抗体産
生のための詳細な手順は、Ｄａｖｉｓら（Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ２１−２，Ｅｌｓｅｖ
ｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）に記載される。

【０３９６】 （Ｂ．ポリクローナルＣｈＭＩｒｐ抗体産生） 単一のタンパク質の異種エピトープに対する抗体を含有するポリクローナル抗
血清を、上記のように、発現されたタンパク質で適切な動物を免疫することによ
って調製され得る。効果的なポリクローナル抗体産生は、抗原および宿主種の両
方に関連する多くの因子によって影響される。例えば、小さい分子は、大きい分
子よりも免疫原性がより低い傾向にあり、そしてキャリアアジュバントの使用を
必要とし得る。また、宿主動物は、播種の部位および用量に応答して変化し、不
十分かまたは過剰な用量の抗原のいずれもが、低力価の抗血清を生じる。複数の
皮内部位に投与される少ない用量（ｎｇレベル）の抗原が、最も確実であるよう
である。ウサギについての効果的な免疫プロトコルは、Ｖａｉｔｕｋａｉｔｉｓ
ら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，３３：９８８−９９
１，１９７１）に見出され得る。

【０３９７】 ブースター注射が、定期的間隔で与えられ得、抗血清を、その抗体力価が半定
量的に決定した場合（例えば、既知の濃度の抗原に対するアガー中での二重免疫
拡散法によって）に降下し始めたときに、回収し得る。例えば、Ｏｕｃｈｔｅｒ
ｌｏｎｙら（Ｃｈａｐ．１９：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｄ．Ｗｅｉｒ（編）、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，１９
７３）を参照のこと。抗体のプラトー濃度は、通常、０．１〜０．２ｍｇ／１ｍ
ｌ血清（約１２ｍＭ）の範囲にある。抗原に対する抗血清の親和性は、競合結合
曲線を作成することによって（例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．，（Ｃｈａｐ．４
２：Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版（
ＲｏｓｅおよびＦｒｉｅｄｍａｎ編）Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８０）に記載されるように）決
定する。

【０３９８】 抗ＣｈＭＩｒｐ抗体を得るための代替的手順（例えば、完全なヒト抗体の産生
のためのヒトＩｇＧ遺伝子座を有するトランスジェニックマウスの免疫、および
合成抗体ライブラリー（抗体可変ドメインの変異誘発によって作製されるような
）のスクリーニング）もまた、使用され得る。

【０３９９】 （実施例７） （ＣｈＭＩｒｐの役割の機能分析） インビボにおけるＣｈＭＩｒｐの機能的役割を決定するために、ＣｈＭＩｒｐ
遺伝子を、動物の生殖系列において過剰発現させるか、または相同組換えにより
哺乳動物の生殖系列において不活化させる。この遺伝子が外因性もしくは内因性
プロモーターエレメントの調節制御下で過剰発現される動物は、トランスジェニ
ック動物として知られる。内因性遺伝子が相同組換えにより不活化されている動
物もまた、「ノックアウト」動物として知られている。代表的な哺乳動物には、
ウサギおよびげっ歯類の種（例えば、マウス）が含まれる。例示的手順は、米国
特許第５,４８９,７４３号および国際特許公開第ＷＯ９４／２８１２２号に記載
される。

【０４００】 トランスジェニック動物は、発生および疾患プロセスに対する、ＣｈＭＩｒｐ
の過剰発現または不適切な発現の効果の決定を可能にする。ＣｈＭＩｒｐトラン
スジェニック動物はまた、レセプター活性を調節し得る化合物を試験するための
モデル系として使用され得る。

【０４０１】 「ノックアウト」動物は、胚発生ならびに免疫応答および増殖応答におけるＣ
ｈＭＩｒｐポリペプチドの役割の決定を可能にする。発生および増殖応答におけ
るＣｈＭＩｒｐポリペプチドの役割は、これらの動物において、胚の発生ならび
に種々の器官および組織（例えば、骨および軟骨のような骨格成分）の発生およ
び分化に対する遺伝子ノックアウトの効果の分析により決定される。

【０４０２】 （実施例８） （ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの生物学的活性） 増殖および形態学的アッセイを、ＣｈＭＩｒｐ生物学的活性が、コンドロモジ
ュリン−Ｉの活性に類似するか否かを決定するために行い得る。全てのアッセイ
について、組換えＣｈＭＩｒｐ（実施例５に記載のように調製および精製したＣ
ＯＳ細胞由来）を使用する。

【０４０３】 （Ａ．軟骨細胞の刺激） ＣｈＭＩｒｐが軟骨細胞においてＤＮＡおよびプロテオグリカン合成を刺激す
る能力を、コンドロモジュリンファミリー活性として調べ得る。軟骨細胞を、Ｓ
ｈｉｍｏｍｕｒａら（Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．１９：１７９−１
８７，１９７５）に記載されるように若年ウサギ由来の肋骨の増殖プレート軟骨
から単離する。単離した軟骨細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレート中に
１×１０^４細胞／ウェルでプレートし、そして１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を
補充した改変イーグル培地（ＭＥＭ）中で培養する。コンフルエント時に、プロ
テオグリカン合成を、Ｈｉｒａｋｉら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６０
：８６９−８７８，１９９９）に記載のように測定する。手短には、軟骨細胞を
、０．３％の血清中でプレインキュベートする。２４時間後、培地を、０．３％
血清および組換えＣｈＭＩｒｐポリペプチド（１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ）を含
有する培地と置換する。３時間後、細胞を、５ｍＣｉ／ｍｌ［^３５Ｓ］−スルフ
ェートでさらに１７時間標識する。その後、プロテオグリカンを、１％セチルピ
リジニウムクロリドによって沈殿し、そして取り込まれた放射活性を測定する。
インスリン様増殖因子ＩまたはＩＩを、ポジティブコントロールとして使用し得
る。

【０４０４】 ＤＮＡ合成がＣｈＭＩｒｐポリペプチドによって刺激されるか否かを決定する
ために、単離した軟骨細胞を、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地中に、９６ウェル
マイクロタイタープレート中１×１０^４細胞／ウェルでプレートする。２４時間
後、培地を、０．３％血清＋組換えＣｈＭＩｒｐポリペプチド（１０〜１０００
ｎｇ／ｍｌ）を含む培地と交換し、そして細胞を、２０時間インキュベートする
。次いで、細胞を、［^３Ｈ］−チミジン（５ｍＣｉ／ｍｌ）でさらに４時間標識
する。その後、細胞を、ＰＢＳで洗浄しそして冷１００％メタノールで１０分間
固定する。固定後、取り込まれた放射活性を、１０％トリクロロ酢酸で沈殿しそ
してカウントする。

【０４０５】 コンドロモジュリン−Ｉは、ＦＧＦ−２と協同して、ソフトアガー中で軟骨細
胞のコロニー形成を誘導する。ＣｈＭＩｒｐポリペプチドがこの活性を示すか否
かを決定するために、単離した軟骨細胞（５×１０^３細胞／ウェル）を、Ｉｎｏ
ｕｅら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２４１：３９
５−４００，１９９７）に記載されるように５％ ＦＢＳ、０．２ｍＭヒドロコ
ルチゾン、および６０ｍｇ／ｍｌトランスフェリンを補充したＨＡＭ Ｆ−１２
培地中の０．５ｍｌの０．４１％アガロースに懸濁する。この細胞懸濁物を、０
．７２％アガロースの基底層に注ぎ、そして一晩インキュベートする。漸増濃度
の組換えＣｈＭＩｒｐポリペプチド（１〜１０００ｎｇ／ｍｌ）および１ｎｇ／
ｍｌ ＦＧＦ−２を、０．５％ウシ血清アルブミンを含む無血清Ｆ−１２培地中
に希釈する。この混合物を、ウェルの上層に均一に添加する。１０日後、コロニ
ーを、位相差顕微鏡下でカウントする。

【０４０６】 （Ｂ．内皮細胞刺激） ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの存在下での内皮細胞の増殖および形態発生をアッ
セイし、内皮細胞増殖および管形成の阻害が、コンドロモジュリン−Ｉの存在下
のそれらと類似して生じるか否かを決定する。インビトロでのウシ頚動脈内皮細
胞における増殖および管形態発生を、Ｈｉｒａｋｉら（ＦＥＢＳ、４１５：３２
１−３２４，１９９７）によって記載されるように測定する。手短には、ウシ頚
動脈（ＢＣＡＥ）細胞を、頚動脈の内側表面を穏やかに掻き取ることによって単
離する。この単離したＢＣＡＥ細胞を、１０％ ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１
６４０中で増殖および拡大させる。組換えＣｈＭＩｒｐがＢＣＡＥ細胞の増殖を
阻害し得るか否かを決定するために、［^３Ｈ］−チミジンの取り込みを、上記の
ように測定する。内皮細胞の管形態発生に対するＣｈＭＩｒｐの効果を試験する
ために、ＢＣＡＥ細胞（１×１０^５細胞／ウェル）を、０．１Ｍ ＮａＯＨおよ
び１０×ＭＥＭ培地中に希釈した０．３％Ｉ型コラーゲンゲルを含有する１２ウ
ェルプレート中で増殖させる。２４時間後、培地を吸引し、そして組換えＣｈＭ
Ｉｒｐポリペプチド（１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ）を含む水性混合物（７０ｍｌ
）を添加する。次いで、コラーゲン溶液を重層して、上層を作製する。３日後、
管様網への細胞の形態学的変化を、位相差顕微鏡下で観察する。内皮細胞血管新
生を測定するためのインビボアッセイは、Ｈｉｒａｋｉら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．２６０：８６９−８７８，１９９９）によって記載されるような、ニ
ワトリ絨毛尿膜アッセイである。手短には、受精白色レグホンニワトリ卵を、３
７．８℃でインキュベートする。５日目に、気腔を穿刺し、そして１ｃｍ^２のウ
ィンドウをこの卵に開ける。組換えＣｈＭＩｒｐポリペプチド（５００ｎｇ／ｍ
ｌ）を、０．７５％アガロース中に希釈した。この固定したゲルを、この卵内の
絨毛尿膜上に２４時間置く。この膜を、微細な毛細管形成について、解剖顕微鏡
下で調べる。

【０４０７】 （Ｃ．骨芽細胞刺激） 骨芽細胞増殖に対するＣｈＭＩｒｐの効果もまた、Ｍｏｒｉら（ＦＥＢＳ ４
０６：３１０−３１４，１９９７）によって記載のように、コンドロモジュリン
−Ｉ活性の指標として測定し得る。クローン骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を、漸
増濃度の組換えＣｈＭＩｒｐ（１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ）で処理する。ＤＮＡ
合成の尺度として、骨芽細胞の［^３Ｈ］−チミジンの取り込みを、上記のように
測定する。

【０４０８】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドのこの想定された生物学的機能は、コンドロモジュ
リン−Ｉの機能に類似する。とりわけ、コンドロモジュリン−Ｉは、軟骨細胞の
増殖および分化を刺激することが公知である。さらに、コンドロモジュリン−Ｉ
は、インビボで、内皮細胞増殖および微細な毛細管形成を阻害するので、コンド
ロモジュリン−Ｉは、抗脈管形成活性を有する。ＣｈＭＩｒｐは、それ自体で、
軟骨の発生および血管の形成における役割を果し得る。

【０４０９】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドが、腱、骨格筋、胸腺、卵巣、脳の大脳皮質、腸の
Ｍ細胞、および毛包に隣接する細胞において発現されることが、ノーザンブロッ
ト分析およびインサイチュハイブリダイゼーションによって決定された。腱およ
び筋肉における発現は、ＣｈＭＩｒｐが、腱および筋肉の発生および骨への筋肉
の付着における役割を果たし得ることを示す。胸線、毛包および腸のＭ細胞にお
ける発現は、免疫機能におけるＣｈＭＩｒｐの潜在的な役割を示す。ＣｈＭＩｒ
ｐは、腱、骨格筋、胸腺、卵巣、脳、腸および毛包に存在する組織および特定の
細胞型の再生（増殖および発生）において関与する増殖因子として作用し得る。

【０４１０】 これらの潜在的な機能に基づいて、ＣｈＭＩｒｐは、腱疾患（例えば、腱炎お
よび腱の断裂）、骨格筋疾患（例えば、悪液質および筋ジストロフィー）、免疫
系機能不全疾患（例えば、炎症およびアレルギー、乏しい創傷治癒、関節炎およ
びアレルギー）、ならびに不妊疾患の診断および／または処置に有用であり得る
。

【０４１１】 本発明を好ましい実施形態に関して記載してきたが、バリエーションおよび改
変が当業者に想到することが理解される。従って、添付の特許請求の範囲が、特
許請求される本発明の範囲内に生じるこのような等価的バリエーションを全て包
含することが、意図される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、オープンリーディングフレーム（配列番号４）を含むマウスＣｈＭＩ
ｒｐ ｃＤＮＡの全コード領域を表す配列番号３として示されるポリヌクレオチ
ド配列を示す。

【図２】 図２は、オープンリーディングフレーム（配列番号２）を含むヒトＣｈＭＩｒ
ｐ ｃＤＮＡの全コード領域を表す配列番号１として示されるポリヌクレオチド
配列を示す。

【図３】 図３は、ヒトＣｈＭＩｒｐポリペプチド配列（配列番号２）およびマウスＣｈ
ＭＩｒｐポリペプチド配列（配列番号４）の配列を示す。

【図４】 図４は、ヒトとマウスＣｈＭＩｒｐポリペプチド配列（それぞれ、配列番号２
および配列番号４）との間の相同性および種々の哺乳類種（配列番号５〜９）由
来のｃｈｏｎｄｒｏｍｏｄｕｌｉｎ−Ｉポリペプチドを示す。

【図５】 図５は、ボールドにおいて下線を引いたエキソンおよびスプライスアクセプタ
ー／ドナー部位を有する、配列番号１０として示されるヒトＣｈＭＩｒｐの完全
ゲノムＤＮＡ配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ ４Ｂ０６４ 38/22 45/00 ４Ｂ０６５ 39/395 47/48 ４Ｃ０７６ 48/00 ４Ｃ０８４ 45/00 Ａ６１Ｐ 1/16 ４Ｃ０８５ 47/48 9/00 ４Ｃ０８６ 48/00 9/10 １０１ ４Ｃ０８７ Ａ６１Ｐ 1/16 9/12 ４Ｈ０４５ 9/00 17/06 9/10 １０１ 19/10 9/12 29/00 17/06 35/00 19/10 Ｃ０７Ｋ 16/40 29/00 16/42 35/00 16/46 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/42 1/19 16/46 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/15 9/12 1/19 11/04 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/48 Ｚ 9/12 1/68 Ａ 11/04 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｍ 1/48 33/566 1/68 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/58 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/08 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/577 5/00 Ａ 33/58 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/24 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ユン， ジーニー アメリカ合衆国 カリフォルニア 91316， エンシノ， ニューキャッスル アベニ ュー 5348， アパートメント 227 (72)発明者 クラーキン， クリスティー アメリカ合衆国 カリフォルニア 93030， オックスナード， イーグル クリーク レーン 2318 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB07 BB20 BB50 CB01 DA13 DA36 FA16 FB02 FB03 FB08 4B024 AA01 AA11 BA10 BA41 CA04 CA07 CA09 CA11 DA02 DA06 EA02 EA04 GA01 GA11 GA18 GA19 HA03 HA14 HA17 4B033 NA16 NA25 NB58 NC06 ND12 NF06 4B050 CC01 CC03 DD11 FF13E LL03 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ03 QQ27 QQ42 QR32 QR38 QR41 QR55 QR69 QR77 QR82 QS12 QS25 QS34 QS39 QX07 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA26X AA90X AA91X AA93Y AB02 AC14 BA02 BA08 CA25 CA29 CA44 CA46 4C076 AA94 BB11 BB16 BB32 CC04 CC11 CC27 EE59 4C084 AA01 AA02 AA03 AA06 AA13 AA16 BA01 BA02 BA08 CA17 CA23 DB52 DB60 MA17 MA22 MA24 MA27 MA37 MA43 MA44 MA55 MA56 MA65 MA66 MA67 NA14 ZA362 ZA422 ZA452 ZA752 ZA972 ZB112 4C085 AA13 AA14 AA15 AA16 BB41 BB43 BB44 CC22 CC23 EE01 GG02 GG04 4C086 AA02 AA03 EA16 MA01 MA05 MA17 MA22 MA23 MA24 MA35 MA37 MA44 MA52 MA55 MA56 MA65 MA66 MA67 NA14 ZA26 ZA36 ZA45 ZA75 ZA89 ZA97 ZB11 4C087 BB33 BC83 MA22 MA23 MA24 MA27 MA35 MA37 MA43 MA44 MA52 MA56 MA58 MA65 MA66 NA14 ZA26 ZA36 ZA42 ZA75 ZA89 ZA97 ZB11 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 DA75 DA76 DA86 DA89 EA50 FA72 FA74 【要約の続き】

Claims (73)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 単離された核酸分子であって、該核酸分子は、以下： （ａ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号２に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列； （ｃ）（ａ）または（ｂ）の相補体に中程度または高度にストリンジェントな
   条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、そのコードされるポリ
   ペプチドは、配列番号２に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド
   配列；および （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列 からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、 核酸分子。
2. 【請求項２】 単離された核酸分子であって、該核酸分子は、以下： （ａ）配列番号２に示されるポリペプチドに少なくとも約７０％同一であるポ
   リペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該ポリペプチドは、配列番
   号２に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体またはスプ
   ライス改変体をコードするヌクレオチド配列であって、そのコードされるポリペ
   プチドは、配列番号２に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配
   列； （ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードす
   る、配列番号１、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列であって、該ポリペプ
   チドは、配列番号２に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列
   ； （ｄ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号１また
   は（ａ）〜（ｃ）のヌクレオチド配列； （ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかの相補体に中程度または高度にストリンジェ
   ントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、そのポリペプチ
   ドは、配列番号２に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
   および （ｆ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列 からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、 核酸分子。
3. 【請求項３】 単離された核酸分子であって、該核酸分子は、以下： （ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号２に示されるポ
   リペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該ポリペプチドは、配列番
   号２に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列； （ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号２に示されるポリペプ
   チドをコードするヌクレオチド配列であって、該ポリペプチドは、配列番号２に
   示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列； （ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号２に示されるポリペプ
   チドをコードするヌクレオチド配列であって、該ポリペプチドは、配列番号２に
   示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列； （ｄ）Ｃ末端切断および／またはＮ末端切断を有する配列番号２に示されるポ
   リペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該ポリペプチドは、配列番
   号２に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列； （ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端切断およびＮ末端
   切断からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する配列番号２に示さ
   れるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該ポリペプチドは、
   配列番号２に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列； （ｆ）少なくとも１６ヌクレオチドのフラグメントを含む（ａ）〜（ｅ）のヌ
   クレオチド配列； （ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの相補体に中程度または高度にストリンジェ
   ントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、そのポリペプチ
   ドは、配列番号２に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
   および （ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列 からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、 核酸分子。
4. 【請求項４】 請求項１、２または３に記載の核酸分子を含む、ベクター。
5. 【請求項５】 請求項４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
6. 【請求項６】 真核生物細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
7. 【請求項７】 原核生物細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
8. 【請求項８】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドを産生するプロセスであって、請
   求項５に記載の宿主細胞を該ポリペプチドを発現するのに適切な条件下で培養す
   る工程、および必要に応じて、該培養物から該ポリペプチドを単離する工程を包
   含する、プロセス。
9. 【請求項９】 請求項８に記載のプロセスによって産生された、ポリペプチ
   ド。
10. 【請求項１０】 請求項８に記載のプロセスであって、前記核酸分子は、ネ
    イティブＣｈＭＩｒｐポリペプチドについてのプロモーターＤＮＡ以外のプロモ
    ーターＤＮＡを含み、該プロモーターは、該ＣｈＭＩｒｐポリペプチドをコード
    するＤＮＡに作動可能に連結されている、プロセス。
11. 【請求項１１】 請求項２に記載の単離された核酸分子であって、ここで、
    前記同一性パーセントが、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、
    ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔおよびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍ
    ａｎアルゴリズムからなる群より選択されるコンピュータープログラムを使用し
    て決定される、核酸分子。
12. 【請求項１２】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの活性または産生の候補インヒ
    ビターを同定するためのプロセスであって、該プロセスは、請求項５，６または
    ７に記載の細胞を該候補インヒビターに曝露する工程、該細胞におけるＣｈＭＩ
    ｒｐポリペプチドの活性または産生を測定する工程、および該候補インヒビター
    に曝露された細胞におけるＣｈＭＩｒｐ活性を該候補インヒビターに曝露されな
    かった細胞における活性と比較する工程を包含する、プロセス。
13. 【請求項１３】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの活性または産生の候補刺激因
    子を同定するためのプロセスであって、該プロセスは、請求項 ５、６または７に記載の細胞を該候補刺激因子に曝露する工程、該細胞における
    ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの活性または産生を測定する工程、および該候補刺激
    因子に曝露された細胞におけるＣｈＭＩｒｐ活性を該刺激因子に曝露されなかっ
    た細胞における活性と比較する工程を包含する、プロセス。
14. 【請求項１４】 配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、単離されたポ
    リペプチド。
15. 【請求項１５】 単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以
    下： （ａ）配列番号２に示される成熟アミノ酸配列であって、残基１で成熟アミノ
    末端を含み、必要に応じてさらに、アミノ末端メチオニンを含む、アミノ酸配列
    ； （ｂ）配列番号２のオルソログのアミノ酸配列であって、そのコードされるポ
    リペプチドは、配列番号２に示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配
    列； （ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に少なくとも約７０％同一であるア
    ミノ酸配列であって、そのポリペプチドは、配列番号２に示されるポリペプチド
    の活性を有する、アミノ酸配列； （ｄ）少なくとも約２５アミノ酸残基を含む配列番号２に示されるアミノ酸配
    列のフラグメントであって、そのポリペプチドは、配列番号２に示されるポリペ
    プチドの活性を有する、フラグメント； （ｅ）配列番号２あるいは（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つに示されるいずれ
    かのアミノ酸配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体のアミノ酸配列で
    あって、そのポリペプチドは、配列番号２に示されるポリペプチドの活性を有す
    る、アミノ酸配列 からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、 ポリペプチド。
16. 【請求項１６】 単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以
    下： （ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号２に示されるア
    ミノ酸配列であって、そのポリペプチドは、配列番号２に示されるポリペプチド
    の活性を有する、アミノ酸配列； （ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号２に示されるアミノ酸
    配列であって、そのポリペプチドは、配列番号２に示されるポリペプチドの活性
    を有する、アミノ酸配列； （ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号２に示されるアミノ酸
    配列であって、そのポリペプチドは、配列番号２に示されるポリペプチドの活性
    を有する、アミノ酸配列； （ｄ）Ｃ末端切断および／またはＮ末端切断を有する配列番号２に示されるア
    ミノ酸配列であって、そのポリペプチドは、配列番号２に示されるポリペプチド
    の活性を有する、アミノ酸配列；ならびに （ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端切断およびＮ末端
    切断からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する配列番号２に示さ
    れるアミノ酸配列であって、そのポリペプチドは、配列番号２に示されるポリペ
    プチドの活性を有する、アミノ酸配列 からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、 ポリペプチド。
17. 【請求項１７】 配列番号２の第２７６位のアミノ酸が、システイン、セリ
    ンまたはアラニンである、請求項１５または１６に記載のポリペプチド。
18. 【請求項１８】 配列番号２の第２８０位のアミノ酸が、システイン、セリ
    ンまたはアラニンである、請求項１５または１６に記載のポリペプチド。
19. 【請求項１９】 配列番号２の第２８１位のアミノ酸が、グルタミン酸また
    はアスパラギン酸である、請求項１５または１６に記載のポリペプチド。
20. 【請求項２０】 配列番号２の第２８５位のアミノ酸が、グリシン、プロリ
    ンまたはアラニンである、請求項１５または１６に記載のポリペプチド。
21. 【請求項２１】 配列番号２の第２９７位のアミノ酸が、アルギニン、リジ
    ン、グルタミンまたはアスパラギンである、請求項１５または１６に記載のポリ
    ペプチド。
22. 【請求項２２】 配列番号２の第３００位のアミノ酸が、システイン、セリ
    ンまたはアラニンである、請求項１５または１６に記載のポリペプチド。
23. 【請求項２３】 配列番号２の第３０６位のアミノ酸が、システイン、セリ
    ンまたはアラニンである、請求項１５または１６に記載のポリペプチド。
24. 【請求項２４】 配列番号２の第３１０位のアミノ酸が、バリン、イソロイ
    シン、メチオニン、ロイシン、フェニルアラニン、アラニンまたはノルロイシン
    である、請求項１５または１６に記載のポリペプチド。
25. 【請求項２５】 請求項１、２または３に記載の核酸分子によってコードさ
    れる、単離されたポリペプチド。
26. 【請求項２６】 請求項１５に記載の単離されたポリペプチドであって、こ
    こで、前記同一性パーセントが、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳ
    ＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔおよびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔ
    ｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群より選択されるコンピュータープログラムを
    使用して決定される、ポリペプチド。
27. 【請求項２７】 配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドで動物を免疫す
    ることによって産生された、抗体。
28. 【請求項２８】 請求項１４、１５または１６に記載のポリペプチドを特異
    的に結合する、抗体またはそのフラグメント。
29. 【請求項２９】 モノクローナル抗体である、請求項２８に記載の抗体。
30. 【請求項３０】 配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドに結合するモノ
    クローナル抗体を産生する、ハイブリドーマ。
31. 【請求項３１】 サンプル中のＣｈＭＩｒｐの量を検出または定量する方法
    であって、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドを含むことが疑われるサンプルに請求項２
    ７、２８または２９に記載の抗ｈ２５２０−１０９抗体またはそのフラグメント
    を接触させる工程、および該抗体またはフラグメントの結合を検出する工程を包
    含する、方法。
32. 【請求項３２】 少なくとも１つのポリペプチドを特異的に結合する選択的
    結合因子またはそのフラグメントであって、該ポリペプチドは、以下： （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列； （ｂ）配列番号２の少なくとも１つに示されるアミノ酸配列のフラグメント；
    および （ｃ）（ａ）または（ｂ）の天然に存在する改変体 からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、 選択的結合因子。
33. 【請求項３３】 抗体またはそのフラグメントである、請求項３２に記載の
    選択的結合因子。
34. 【請求項３４】 ヒト化抗体である、請求項３２に記載の選択的結合因子。
35. 【請求項３５】 ヒト抗体またはそのフラグメントである、請求項３２に記
    載の選択的結合因子。
36. 【請求項３６】 ポリクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求
    項３２に記載の選択的結合因子。
37. 【請求項３７】 モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求
    項３２に記載の選択的結合因子。
38. 【請求項３８】 キメラ抗体またはそのフラグメントである、請求項３２に
    記載の選択的結合因子。
39. 【請求項３９】 ＣＤＲグラフト化抗体またはそのフラグメントである、請
    求項３２に記載の選択的結合因子。
40. 【請求項４０】 抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントである、請
    求項３２に記載の選択的結合因子。
41. 【請求項４１】 可変領域フラグメントである、請求項３２に記載の選択的
    結合因子。
42. 【請求項４２】 ＦａｂフラグメントまたはＦａｂ’フラグメントである、
    請求項４１に記載の可変領域フラグメント。
43. 【請求項４３】 選択的結合因子またはそのフラグメントであって、配列番
    号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する特異性を有する、少なくとも
    １つの相補性決定領域を含む、選択的結合因子。
44. 【請求項４４】 検出可能な標識が結合されている、請求項３２に記載の選
    択的結合因子。
45. 【請求項４５】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドの生物学的活性をアンタゴナイ
    ズする、請求項３２に記載の選択的結合因子。
46. 【請求項４６】 疾患、状態または障害を、処置、予防または改善するため
    の方法であって、請求項３２に記載の選択的結合因子の有効量を患者に投与する
    工程を包含する、方法。
47. 【請求項４７】 配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドで動
    物を免疫することによって産生された、選択的結合因子。
48. 【請求項４８】 請求項１４、１５または１６に記載のポリペプチドを結合
    し得る選択的結合因子を産生する、ハイブリドーマ。
49. 【請求項４９】 請求項１４、１５または１６に記載のポリペプチドおよび
    薬学的に受容可能な処方剤を含む、組成物。
50. 【請求項５０】 前記薬学的に受容可能な処方剤が、キャリア、アジュバン
    ト、可溶化剤、安定剤、または抗酸化剤である、請求項４９に記載の組成物。
51. 【請求項５１】 前記ポリペプチドが、配列番号２に示される成熟アミノ酸
    配列を含む、請求項５０に記載の組成物。
52. 【請求項５２】 請求項１４、１５または１６に記載のポリペプチドの誘導
    体を含む、ポリペプチド。
53. 【請求項５３】 水溶性ポリマーで共有結合的に改変されている、請求項５
    ２に記載のポリペプチド。
54. 【請求項５４】 請求項５３に記載のポリペプチドであって、前記水溶性ポ
    リマーが、ポリエチレングリコール、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、
    デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリ
    コール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレ
    ンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、およびポリビニルアル
    コールからなる群より選択される、ポリペプチド。
55. 【請求項５５】 請求項１、２または３に記載の核酸分子および薬学的に受
    容可能な処方剤を含む、組成物。
56. 【請求項５６】 前記核酸分子が、ウイルスベクター中に含まれる、請求項
    ５５に記載の組成物。
57. 【請求項５７】 請求項１、２または３に記載の核酸分子を含む、ウイルス
    ベクター。
58. 【請求項５８】 異種アミノ酸配列に融合された請求項１４、１５または１
    ６に記載のポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。
59. 【請求項５９】 前記異種アミノ酸配列が、ＩｇＧ定常ドメインまたはその
    フラグメントである、請求項５８に記載の融合ポリペプチド。
60. 【請求項６０】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチドレベルの減少から生じる哺乳動
    物における医学的状態を、処置、予防または改善するための方法であって、請求
    項１４、１５または１６に記載のポリペプチドあるいは請求項１、２または３に
    記載の核酸によってコードされるポリペプチドを、該哺乳動物に投与する工程を
    包含する、方法。
61. 【請求項６１】 異常なレベルのＣｈＭＩｒｐポリペプチドによって引き起
    こされるかまたはそれから生じる、被験体における病理学的状態または病理学的
    状態に対する感受性を診断する方法であって、以下： （ａ）サンプル中の請求項１４、１５または１６に記載のポリペプチドあるい
    は請求項１、２または３に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドの
    発現の存在または発現量を決定する工程；および （ｂ）正常な被験体または早期の被験体由来の生物学的サンプル、組織サンプ
    ルまたは細胞サンプルにおけるＣｈＭＩｒｐポリペプチドのレベルを比較する工
    程であって、ここで、病理学的状態に対する感受性は、該ポリペプチドの発現の
    存在または発現量に基づく、工程 を包含する、方法。
62. 【請求項６２】 デバイスであって、以下： （ａ）移植に適合性の膜；および （ｂ）該膜内にカプセル化された細胞、 含み、ここで、該細胞は、請求項１４、１５または１６に記載のポリペプチドを
    分泌し、そして該膜は、該タンパク質に対して透過性でありかつ該細胞に有害な
    物質に対して不透過性である、デバイス。
63. 【請求項６３】 デバイスであって、以下： （ａ）移植に適合性の膜；および （ｂ）該膜内にカプセル化されたＣｈＭＩｒｐポリペプチド を含み、ここで、該膜は、該ポリペプチドに対して透過性である、デバイス。
64. 【請求項６４】 ポリペプチドに結合する化合物を同定する方法であって、
    以下： （ａ）請求項１４、１５または１６に記載のポリペプチドに化合物を接触させ
    る工程；および （ｂ）該化合物に対する該ポリペプチドの結合の程度を決定する工程、 を包含する、方法。
65. 【請求項６５】 動物におけるポリペプチドのレベルを調節する方法であっ
    て、請求項１、２または３に記載の核酸分子を該動物に投与する工程を包含する
    、方法。
66. 【請求項６６】 請求項１、２または３に記載の核酸分子を含む、トランス
    ジェニック非ヒト哺乳動物。
67. 【請求項６７】 診断試薬であって、配列番号２に示されるアミノ酸配列、
    あるいはそれらの対立遺伝子改変体およびスプライス改変体を含む、それらのフ
    ラグメント、改変体またはホモログをコードする、検出可能に標識されたポリヌ
    クレオチドを含む、診断試薬。
68. 【請求項６８】 前記標識されたポリヌクレオチドが、一本鎖ｃＤＮＡであ
    る、請求項６７に記載の診断試薬。
69. 【請求項６９】 生物学的サンプル中のＣｈＭＩｒｐ核酸の存在を決定する
    ための方法であって、以下の工程： （ａ）ＣｈＭＩｒｐ核酸を含むことが疑われる生物学的サンプルを提供する工
    程； （ｂ）該生物学的サンプルに請求項８４に記載の診断試薬を接触させる工程で
    あって、該工程は、該診断試薬が、該生物学的サンプル中に含まれるｈ２５２０
    −１０９核酸とハイブリダイズする条件下で行う、工程； （ｃ）該生物学的サンプル中のＣｈＭＩｒｐ核酸と該診断試薬との間のハイブ
    リダイゼーションを検出する工程；および （ｄ）該生物学的サンプルと該診断試薬との間のハイブリダイゼーションのレ
    ベルを、既知の濃度のＣｈＭＩｒｐ核酸と該診断試薬との間のハイブリダイゼー
    ションのレベルと比較する工程、 を包含する、方法。
70. 【請求項７０】 組織サンプルまたは細胞サンプル中のＣｈＭＩｒｐ核酸の
    存在を決定するための方法であって、以下の工程： （ａ）ＣｈＭＩｒｐ核酸を含むことが疑われる組織サンプルまたは細胞サンプ
    ルを提供する工程； （ｂ）該組織サンプルまたは細胞サンプルに請求項６８に記載の診断試薬を接
    触させる工程であって、該工程は、該診断試薬が、ＣｈＭＩｒｐ核酸とハイブリ
    ダイズする条件下で行う、工程； （ｃ）該組織サンプルまたは細胞サンプル中のＣｈＭＩｒｐ核酸と該診断試薬
    との間のハイブリダイゼーションを検出する工程；および （ｄ）該組織サンプルまたは細胞サンプルと該診断試薬との間のハイブリダイ
    ゼーションのレベルを、既知の濃度のＣｈＭＩｒｐ核酸と該診断試薬との間のハ
    イブリダイゼーションのレベルと比較する工程、 を包含する、方法。
71. 【請求項７１】 前記ＣｈＭＩｒｐポリヌクレオチド分子が、ＤＮＡである
    、請求項７０または７１に記載の方法。
72. 【請求項７２】 前記ＣｈＭＩｒｐポリヌクレオチド分子が、ＲＮＡである
    、請求項７０または７１に記載の方法。
73. 【請求項７３】 ＣｈＭＩｒｐポリペプチド活性のアンタゴニストであって
    、該アンタゴニストは、ＣｈＭＩｒｐポリペプチドに対する特異性を有する、Ｃ
    ｈＭＩｒｐ選択的結合因子、低分子、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびペ
    プチドまたはそれらの誘導体からなる群より選択される、アンタゴニスト。